腸管幹／前駆細胞の取得方法
【課題】 腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の取得及び培養方法の提供、ならびに腸管上皮細胞の幹／前駆細胞から腸上皮組織を構築する細胞への分化を誘導する方法の提供。
【解決手段】 腸管細胞の凝集体を培養すること、好ましくは該凝集体をＥＧＦを含有する培養液中で培養することを含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の取得及び培養方法、ならびに該細胞の培養液中からＥＧＦを除去することを含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞から、腸上皮組織を構築する細胞への分化を誘導する方法。
【解決手段】 腸管細胞の凝集体を培養すること、好ましくは該凝集体をＥＧＦを含有する培養液中で培養することを含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の取得及び培養方法、ならびに該細胞の培養液中からＥＧＦを除去することを含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞から、腸上皮組織を構築する細胞への分化を誘導する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は腸管上皮細胞の幹／前駆細胞を取得し効率的に培養する方法、該方法によって得られる幹／前駆細胞に関する。さらに本発明は腸管上皮細胞の幹／前駆細胞から腸上皮組織を構築する細胞への分化を誘導する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬剤の吸収試験やその他の薬学研究では腸上皮細胞の初代培養細胞を使用することが多い。これまでの培養系では、腸上皮細胞は数日の間に淘汰されてしまい、常に新しい細胞を調製し使用する必要があった。そのため、腫瘍組織由来の細胞株が用いられているが、信頼性の高いデータを得るためには正常細胞を使用する必要があり、正常な腸上皮細胞を簡便に使用できることが望まれている。この場合、培養下で長期間細胞を維持するためには、成熟した腸上皮細胞に加え、それらを常に産生する幹/前駆細胞を培養下で維持する必要があると言える。
【０００３】
食物の消化吸収を担う臓器である腸管には、機能的役割の異なる腸上皮細胞群の根幹に位置する幹細胞（腸管幹細胞）が存在し、幹細胞の分裂と維持により腸上皮細胞が継続して供給される。このように、腸管幹細胞は旺盛な増殖能を有するが、その能力を人為的に培養下で保持させ続けることは極めて難しく、これまでに腸管幹細胞の培養に成功した例はない。腸管幹細胞の増殖や分化を培養下で制御できれば、腸管の幹細胞システムに対する基礎研究用ツールとして利用できるだけでなく、薬剤吸収・代謝試験など創薬過程におけるスクリーニング用ツールとして利用できる。また、組織工学的に移植可能な腸上皮組織を供給することができる。
【０００４】
一方、初期胚に由来する、多能性の幹細胞株である胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、多能性を有するが故に、通常の培養方法では細胞が徐々に分化していってしまう。そのため、ＥＳ細胞を効率よく増やすためにはＥＳ細胞を未分化状態のままで増殖させる必要がある。マウスのＥＳ細胞の場合には白血病阻害因子（ＬＩＦ）を培地に添加することにより未分化状態を維持できることが知られている（非特許文献１）が、組織幹細胞である腸管幹細胞ではＬＩＦの代替となるような添加因子は知られていない。またＥＳ細胞では分化誘導の際に胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ）と呼ばれる細胞凝集体を作らせることが一般的に知られているが、腸管幹細胞の分化を制御する方法は未だ確立されていない。
【非特許文献１】Smith AG, Heath JK, Donaldson DD, Wong GG, Moreau J, Stahl M, Rogers D. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 1988 Dec 15;336(6200):688-90.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の取得を目的とし、さらに該幹／前駆細胞を効率的に培養することを目的とする。さらに本発明の別の目的は、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞から腸上皮組織を構築する細胞への分化を誘導する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討を行った結果、腸管由来の細胞（腸管細胞）を浮遊培養することによって細胞凝集体を得て、当該凝集体を、上皮増殖因子（ＥＧＦ）を含有する培養液中で培養することによって、腸管の幹／前駆細胞を選択的に取得、増殖させることができることを見出した。さらに、得られた幹／前駆細胞を適当な分化誘導条件下で腸上皮組織を構築する細胞へと分化させることに成功して本発明を完成するに至った。すなわち本発明は以下の通りである。
【０００７】
［１］腸管細胞の凝集体を培養することを含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の取得方法。
［２］腸管細胞の凝集体を、ＥＧＦを含有する培養液中で培養することを含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の取得方法。
［３］凝集体が腸管細胞を浮遊培養することによって得られるものである、上記［１］又は［２］記載の方法。
［４］以下の工程を含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の取得方法。
（１）腸管から腸管細胞を採取する工程
（２）腸管細胞を浮遊培養することによって細胞塊（凝集体）を調製する工程
（３）腸管細胞の凝集体を、ＥＧＦを含有する培養液中で培養する工程
（４）腸管上皮細胞の幹／前駆細胞マーカーを発現している細胞を腸管上皮細胞の幹／前駆細胞として回収する工程
［５］腸管上皮細胞の幹／前駆細胞マーカーがＭｕｓａｓｈｉ−１である、上記［４］記載の方法。
［６］腸管細胞を、血清、インスリン、デキサメサゾン、ニコチンアミド、Ｌ−グルタミン、β−メルカプトエタノール及びＥＧＦを含有する培養液中で培養することを含む腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の取得方法。
［７］腸管細胞を、ＥＧＦを含有する培養液中、高密度で培養することを含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の取得方法。
［８］以下の工程を含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の取得方法。
（１）腸管から腸管細胞を採取する工程
（２）腸管細胞を、ＥＧＦを含有する培養液中、高密度で培養する工程
（３）腸管上皮細胞の幹／前駆細胞マーカーを発現している細胞を腸管上皮細胞の幹／前駆細胞として回収する工程
［９］腸管上皮細胞の幹／前駆細胞マーカーがＭｕｓａｓｈｉ−１である、上記［８］記載の方法。
［１０］上記［１］〜［９］のいずれか１項に記載の方法によって得られた腸管上皮細胞の幹／前駆細胞。
［１１］腸管細胞の凝集体を培養することを含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の培養方法。
［１２］腸管細胞の凝集体を、ＥＧＦを含有する培養液中で培養することを含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の培養方法。
［１３］凝集体が腸管細胞を浮遊培養することによって得られるものである、上記［１１］又は［１２］記載の方法。
［１４］腸管細胞を、血清、インスリン、デキサメサゾン、ニコチンアミド、Ｌ−グルタミン、β−メルカプトエタノール及びＥＧＦを含有する培養液中で培養することを含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の培養方法。
［１５］腸管細胞を、ＥＧＦを含有する培養液中、高密度で培養することを含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の培養方法。
［１６］腸管上皮細胞の幹／前駆細胞から腸上皮組織を構築する細胞への分化を誘導する方法であって、該幹／前駆細胞の培養液からＥＧＦを除去することを特徴とする方法。
［１７］腸上皮組織を構築する細胞が、腸内分泌細胞又は粘液分泌細胞である、上記［１６］記載の方法。
［１８］血清、インスリン、デキサメサゾン、ニコチンアミド、Ｌ−グルタミン、β−メルカプトエタノール及びＥＧＦを含有する、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞培養用培地。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によって得られる腸管上皮細胞の幹／前駆細胞及び該細胞から腸上皮組織を構築する細胞への分化を誘導する方法は、腸組織の発生・分化を理解するための基礎研究用ツールとして有用であり、又、組織工学的に移植可能な腸上皮組織の供給を可能とする。さらに該幹／前駆細胞に由来する腸上皮細胞を用いて薬物の腸管における吸収実験などを効率的に行うことが期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと同様又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及したすべての刊行物及び特許は、例えば、記載された発明に関連して使用されうる刊行物に記載されている、構築物及び方法論を記載及び開示する目的で、参照として本明細書に組み入れられる。
【００１０】
本発明の取得方法及び培養方法の対象となる腸管上皮細胞の幹／前駆細胞は、任意の哺乳動物の腸管細胞に由来する。ここで「哺乳動物」とは、具体的にはヒトをはじめウシ、ウマ、イヌ、モルモット、マウス、ラット等が挙げられる。好ましくはヒトであるが、薬物の吸収実験等の研究用ツールとしての利用を考えた場合、マウスやラット等の実験動物としてよく用いられる動物も又、好ましい。
【００１１】
腸は、大きく小腸と大腸の２つに分けることができる。小腸は更に口側から、十二指腸、空腸、回腸に分けられ、大腸は盲腸、結腸（上行結腸、横行結腸、下行結腸、Ｓ状結腸）、直腸に分けられる。成体の腸は、広範にわたって腺窩と絨毛に折り畳まれている上皮層及び支持間葉系組織によって取り囲まれているルーメンから構成されている。腸の上皮細胞は常に新生され、古くなったものは剥離してゆく。腸上皮細胞の新生は、腸上皮組織中に、幹細胞による細胞再生系が存在するからである。幹細胞は、小腸の絨毛の根元が窪んだ陰窩（ｃｒｙｐｔ）の底のほうに存在する。また、胎児においては、内胚葉細胞層が腸上皮となるよう運命付けられ、重層細胞層が分化した偏極上皮単層へと転換する。腸上皮の形態及び恒常性は細胞増殖、移動、分化及びアポトーシス間での高度に制御された均衡の結果である。本発明の取得方法及び培養方法の対象となる「腸管上皮細胞の幹／前駆細胞」とは、腸上皮細胞へと分化し得る、及び／又は分化することが運命づけられている細胞である。「幹細胞」は自己複製能と多分化能をあわせもつ細胞であって、分化運命が限定されている「前駆細胞」と完全に一致するものではないが、腸上皮細胞へと分化する細胞という点では同一であり、従って、本願発明では特に区別することなく「幹／前駆細胞」と称する。また、「腸管上皮細胞の幹／前駆細胞」を、便宜上「腸管幹／前駆細胞」と称することもある。
【００１２】
本明細書中、「腸管細胞」とは、成体あるいは胎児から採取される腸由来の細胞であって、分裂能力を有する腸上皮細胞あるいは腸上皮細胞となり得る細胞の総称である。具体的には、腸管、好ましくは小腸部分を取り出し細かく切り刻んで、振動等の物理的な手段によって、ＥＧＴＡあるいはＥＤＴＡ等を用いた化学的な処理によって、あるいはコラゲナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン等のプロテアーゼ（好ましくはコラゲナーゼ）を用いた酵素的な処理によって細胞を分散することによって得ることができる。上記処理は単独で行っても、複数の処理を組み合わせて行っても良い。胎児の腸管を用いる場合には、円筒状の腸構造から、腸上皮組織中に凸凹が生じ始める時期のものを用いることが好ましい。例えばマウスでは、胎生１２〜１７日目、好ましくは１４．５日の胎児から採取する。また、本発明において用いられる「腸管細胞」は、上記の如く腸管から採取されるものであってもよいが、分裂能力を有する腸上皮細胞あるいは腸上皮細胞となり得る細胞を含有する市販の腸管由来の細胞であってもよい。かかる市販の腸管由来の細胞としては、ＡＣＢＲＩ（Applied Cell Biology Research Institute）により分離され（ACBRI 519）、日本では大日本住友製薬株式会社から入手可能なヒト小腸上皮細胞（human intestinal epithelial cells, cat No. CS-ABI-519）が挙げられる。
【００１３】
本発明の第一の特徴は、腸管細胞に凝集体をつくらせ、それを培養することにある。凝集体を形成させることによって、より生体内に近い環境に細胞をおくことができる。ここで、「凝集体」とは、細胞が多数集合して形成された三次元構造（球状やぶどうの房状）を有する細胞の塊である。例えば、後述するが、２０〜４０万細胞／ウェルの濃度で低接着性の９６ウェル丸底ディッシュに播種した場合、１０〜２０個程度の直径２００〜５００μｍ程度の凝集体が形成される。凝集体の最外部に細胞のシート状構造が見られる。より生体内に近い環境を提供することが可能な範囲で、凝集体を構成する細胞の数及び大きさは、細胞の状態や培養条件によって変わり得る。
【００１４】
腸管細胞の凝集体は、具体的には以下のようにして調製することができる。まず、腸管細胞を適当な媒体中、低接着性の培養容器上で浮遊培養する。例えば低接着性の培養容器として９６ウェルの丸底ディッシュを用いた場合には、１ウェルあたり２０〜４０万細胞を播種し、形成した凝集体を低接着性の６ｃｍディッシュ等に移したりしながら、３７℃で、２〜１０日間、好ましくは７日間、適当な媒体中で培養する。低接着性の培養容器としては、通常、当分野で用いられている培養容器に低接着性となるような処理を施したものが例示される。培養容器としては、培養ディッシュ、培養フラスコ、回転培養用器具（スピナーフラスコ等）等が挙げられる。低接着性となるような処理としては、ハイドロゲルを共有結合させること（コーティング）によって蛋白質や細胞の接着を抑制するような処理が用いられる。又、市販されているものを用いることもできる。
【００１５】
成体由来の腸管細胞は凝集体を形成しにくいが、該腸管細胞を高密度で培養することによって、同様の効果（生体内に近い環境を作り出すという効果）を得ることができる。例えば直径６ｃｍ（媒体の量：３．５ｍＬ）のペトリディッシュ（接着細胞用の処理を行っていない（しかし低接着性処理も行っていない）普通のペトリディッシュ；以下、単に普通のペトリディッシュともいう）で培養する場合には、１〜５×１０６細胞を播種し、３７℃で、１〜５日間、好ましくは３日間、適当な媒体中で培養することによって高密度培養を達成することができる。
【００１６】
上記した、凝集体の培養及び高密度培養において使用可能な媒体としては、腸管細胞が生存し得て、且つ分化やアポトーシスの誘導が抑制されている状態を維持できるものであれば特に限定されず、当分野で通常用いられる細胞培養用培地（ダルベッコ改変イーグル培地、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０培地、ハムＦ−１２培地等）をベースとし、必要に応じて各種の成分を補充したものが用いられる。特に、血清、抗生物質、増殖因子等の成分を補充することが好ましい。
【００１７】
媒体中に含められる好適な成分としては、５〜２０％、好ましくは１０％の血清、０．５〜２μｇ／ｍＬ、好ましくは１μｇ／ｍＬのインスリン、１×１０−８〜１×１０−６ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１×１０−７ｍｏｌ／Ｌのデキサメサゾン、５〜１５ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１０ｍｍｏｌ／Ｌのニコチンアミド、１〜５ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン、１０〜１００μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは５０μｍｏｌ／Ｌのβ−メルカプトエタノール、ペニシリン／ストレプトマイシン等が挙げられる。いずれも商業的に入手可能である。血清としては、ウマ、ウシ由来の血清等が使用され、好ましくは胎児血清である。インスリンとしては、ウシ、ブタの膵臓から生産されたインスリンや、遺伝子組み換え技術により生産されたインスリンのいずれも使用できるが、安定な品質と供給という点から組換え型インスリンを用いることが好ましい。
【００１８】
本発明の第２の特徴は、選択的に腸管幹／前駆細胞を増殖、取得又は培養するために、腸管細胞の培養を、ＥＧＦ（上皮増殖因子）存在下で行うことである。
【００１９】
ＥＧＦは、Ｃｏｈｅｎらによってマウス胎児の早期眼開裂作用を持つ物質としてマウス顎下腺より単離同定され、ついで尿よりヒトＥＧＦが発見された(S. Cohen and G. Carpenteret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 72, 1317, 1975; H. Gregory, Nature, 257, 325, 1975)。遺伝子構造も詳細に解明されている(G. I. Bell et al., Nucleic Acids Res., 14, 8427, 1986)。ＥＧＦは、５３アミノ酸残基及び３つの分子内ジスルフィド結合からなる６０４５Ｄａの蛋白質であり、細胞表面に存在するＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）にリガンドとして結合し、細胞の成長と増殖の調節に重要な役割を果たす。本発明で用いるＥＧＦは選択的に腸管幹／前駆細胞を増殖、取得又は培養することを可能にする限り、その由来は特に限定されず、天然由来のものであっても公知の遺伝子配列やアミノ酸配列等の情報に基づいて合成又は半合成して製造されるものであってもよい。商業的に入手可能なものであってもよい。マウスの幹／前駆細胞を対象とする場合にはマウスの、ヒトの幹／前駆細胞を対象とする場合にはヒトのＥＧＦをそれぞれ用いることが好ましいが、必ずしも動物種を一致させる必要はない。腸管幹／前駆細胞を選択的に増殖、取得又は培養することが可能な範囲で、ＥＧＦは改変されたものであってもよい。このような改変には、１個又は複数個のヌクレオチドあるいはアミノ酸の変異、挿入、欠失及び置換が含まれる。改変されたＥＧＦは、当分野で通常実施される手段によって調製することができる。例えば、エキソヌクレアーゼを用いる欠失変異株（ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ）作製法、カセット変異法等の部位特異的変異（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によってＥＧＦ ＤＮＡを人為的に改変させ、該改変ＥＧＦ ＤＮＡを用いて、所望蛋白質を調製することができる。
【００２０】
ＥＧＦは、腸管幹／前駆細胞を取得するために腸管細胞を培養する過程を通じて持続的に媒体中に含めておくことが好ましいが、特に凝集体を形成し、その後長期間培養し増殖させる間は必須的に媒体中に含める。ＥＧＦの媒体中の濃度は、２０〜４０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ程度である。
【００２１】
ＥＧＦを含有する培養液中で培養することによって、市販の腸管細胞、例えば上述のヒト小腸上皮細胞（Cat No. CS-ABI-519）からもまた、腸管幹／前駆細胞を得ることができる。市販されているヒト小腸上皮細胞を用いた場合には、凝集体の形成や高密度での培養を必要とすることなく、ＥＧＦを含有する培養液、特に２０〜４０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦに加えて、５〜２０％、好ましくは１０％の血清、０．５〜２μｇ／ｍＬ、好ましくは１μｇ／ｍＬのインスリン、１×１０−８〜１×１０−６ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１×１０−７ｍｏｌ／Ｌのデキサメサゾン、５〜１５ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１０ｍｍｏｌ／Ｌのニコチンアミド、１〜５ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン、１０〜１００μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは５０μｍｏｌ／Ｌのβ−メルカプトエタノールを含む培養液を用いて継代培養することによって腸管幹／前駆細胞を取得することができる。
【００２２】
１０％ウシ胎児血清、インスリン（１μｇ／ｍＬ）、デキサメサゾン（１×１０−７ｍｏｌ／Ｌ）、ニコチンアミド（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）、Ｌ−グルタミン（２ｍｍｏｌ／Ｌ）、β−メルカプトエタノール（５０μｍｏｌ／Ｌ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）＋ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）及びＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）を補充したダルベッコ改変培地−ハムＦ１２の混合培地（１：１）は、腸管細胞を培養する為の媒体（培養液）の好適な一例である。
【００２３】
上記で得られた、細胞凝集体を普通のペトリディッシュに再播種し、ＥＧＦを含有する媒体（培養液）中で３７℃で、２〜６ヶ月、好ましくは３ヶ月程度培養する。成体の腸管由来の細胞は凝集体を形成しにくいので、高密度培養によって細胞を凝集しているのに等しい状態にする。成体の腸管に由来する細胞は、ＥＧＦを含有する培養液中で３７℃で、６〜１２ヶ月、好ましくは８ヶ月程度高密度培養する。
【００２４】
長期にわたる凝集体の培養あるいは高密度培養を続けると、線維芽細胞様の細胞に対し上皮細胞様の細胞が多く見られるようになる。もし線維芽細胞様の細胞が残存している場合には、１〜１０μｇ／ｍＬ、好ましくは４μｇ／ｍＬ程度のモノヨード酢酸で３〜５時間程度処理することによって線維芽細胞様の細胞のみを死滅させることができる。上皮細胞様の細胞の増殖が観察されれば、その後は、細胞培養用の培養容器にて継代し、解析に用いたり、使用時まで凍結保存したりする。
【００２５】
長期にわたる凝集体の培養あるいは高密度培養を続けることによって得られる細胞、あるいはCat No. CS-ABI-519等の市販のヒト小腸上皮細胞をＥＧＦを含有する培養液で継代培養することによって得られる細胞が腸管上皮細胞あるいは腸管幹／前駆細胞であるかの判断は、それらの細胞におけるマーカー蛋白質の発現の有無を調べることによって行うことができる。本明細書中、「マーカー」とは特にことわりのない限り、腸管上皮細胞あるいは腸管幹／前駆細胞に特有な発現様式を示す一連の蛋白質又はそれをコードする遺伝子から構成される群の各々を意味する。かかるマーカー蛋白質は哺乳動物の種類等によってそのアミノ酸配列が異なる場合があるが、本発明においてはその対象となる細胞における発現様式が同じである限り、そのような蛋白質もマーカー蛋白質として使用することができる。上皮細胞のマーカー蛋白質としては、Ｅ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）やＺｏ−１(Laprise P, et al., J Biol Chem. 2004 Mar 12; 279(11):10157-66. Epub 2003 Dec 29.;Escaffit F, et al., Exp Cell Res. 2005 Jan 15;302(2):206-20.)、腸上皮細胞のマーカー蛋白質としては、ビリン（Ｖｉｌｌｉｎ）(Maunoury, R. et al., EMBO J. 7, 3321-3329 (1988).)が挙げられる。腸管幹／前駆細胞のマーカー蛋白質としては、Ｍｕｓａｓｈｉ−１(Potten CS, et al., Differentiation. 2003 Jan;71(1):28-41.)、Ｍａｔｈ−１(Yang Q, et al., Science 294:2155-2158)、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３(Ngn3、Jenny M, et al., EMBO J. 2002 Dec 2;21(23):6338-47.)が挙げられる。
【００２６】
Ｅ−カドヘリンは、上皮系の細胞上に発現しているカルシウム依存性の細胞間接着分子であり、それ同士が結合するホモフィリックな接着により上皮組織の形成、維持に重要な働きをする。Ｚｏ−１は、上皮細胞や内皮細胞に必須である細胞間接着装置タイトジャンクション（ＴＪ）の裏打ち蛋白質として知られており、接着装置の形成やそこを介して細胞増殖の調節に関与していると考えられている蛋白質である。ビリンは、小腸上皮細胞の微絨毛の構成成分であり、フィブリンとともにアクチンを束ねる働きを有している。ビリンは微絨毛にのみ見出される。Ｍｕｓａｓｈｉ−１は、神経系前駆細胞によって発現されるＲＮＡ結合蛋白質であり、腸管の幹／前駆細胞にも発現しているという報告がある。Ｍａｔｈ−１は、ｂＨＬＨ型の転写因子であり、マウス腸管における分泌細胞系への分化に必要であることが知られ、腸管幹／前駆細胞に発現している。同様にｂＨＬＨ型転写因子であるＮｇｎ３は膵内分泌細胞、胃腸管組織の発生に重要であり、腸管幹／前駆細胞に発現している。
【００２７】
本発明において、腸管上皮細胞又は腸管幹／前駆細胞であることの確認は、これらのマーカー蛋白質及び／又はそれをコードする遺伝子の発現を、各マーカー蛋白質又はそれをコードする遺伝子に特異的親和性を有する物質を用いて解析する工程を含むことによって行うことができる。本明細書中、「用いて」という用語について、その方法は特に限定されず、具体的には、例えばマーカー蛋白質に特異的親和性を有する物質を用いる場合であれば該マーカー蛋白質の抗体との抗原抗体反応を利用する方法が挙げられ、又、マーカー蛋白質をコードする遺伝子に特異的親和性を有する物質を用いる場合であればハイブリダイゼーション反応を利用する方法が挙げられる。
【００２８】
マーカー蛋白質に特異的親和性を有する物質としては例えば当該蛋白質に特異的親和性を有する抗体又はその断片が挙げられ、その特異的親和性とは抗原・抗体反応により該蛋白質を特異的に認識し、結合する能力のことである。該抗体又はその断片は、当該蛋白質と特異的に結合可能なものであれば特に限定されず、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びそれらの機能的断片のいずれであってもよい。これらの抗体あるいはその機能的断片は、通常当分野で行なわれている方法によって製せられる。例えばポリクローナル抗体を用いる場合であれば、該蛋白質をマウスやウサギといった動物の背部皮下あるいは腹腔内あるいは静脈等に注射して免疫し、抗体価が上昇するのを待った後に抗血清を採取する方法が挙げられ、またモノクローナル抗体を用いる場合であれば、常法に従いハイブリドーマを作製して、その分泌液を採取する方法が挙げられる。抗体断片を製造する方法としてはクローニングした抗体遺伝子断片を微生物等に発現させる方法がよく用いられている。当該抗体、抗体断片等の純度は、当該蛋白質に対する特異的親和性を保持している限り、特に限定されない。これらの抗体又はその断片は、蛍光物質、酵素やラジオアイソトープ等で標識されていてもよい。
さらに、これらは市販されているものを用いても良い。
【００２９】
マーカー蛋白質をコードする遺伝子に特異的親和性を有する物質としては、例えば当該遺伝子に特異的親和性を有するオリゴ又はポリヌクレオチドプローブ（以下、便宜上単にプローブともいう）、ならびにオリゴ又はポリヌクレオチドプライマー対（以下、便宜上単にプライマー対ともいう）が挙げられ、その特異的親和性とは、目的の遺伝子にのみハイブリダイズする性質を意味し、従って当該遺伝子の全部もしくは一部に完全相補的なものか、もしくは上記性質を満たす範囲で１乃至数個のミスマッチを含んでいても良い。該プローブ、プライマー対は、当該遺伝子に特異的親和性を有するものであれば特に限定されないが、例えば当該遺伝子の塩基配列の全部もしくは一部、ならびにそれらの相補配列を含むオリゴ又はポリヌクレオチド等が挙げられ、検出すべき遺伝子の形態に応じて適宜選択する。当該オリゴ又はポリヌクレオチドは当該遺伝子に対する特異的親和性を有している限りはその由来は特に限定されず、合成されたものであっても、当該遺伝子から必要な部分を切り出し、通常行なわれる方法によって精製されたものであってもよい。これらのオリゴ又はポリヌクレオチドは、蛍光物質、酵素やラジオアイソトープ等で標識されていてもよい。
【００３０】
又、腸管幹／前駆細胞ではβ−カテニンの転写活性がみられる(He XC, et al., Nat Genet. 2004 Oct;36(10):1117-21.)ので、この活性を指標に幹／前駆細胞であることを確認することもできる。例えば、ＴＣＦ／ｂ−ｃａｔｅｎｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅによってβガラクトシダーゼ遺伝子がドライブされるコンストラクト（ＴＯＰＧＡＬ）を細胞に導入し、Ｘ−ｇａｌ染色により陽性細胞を検出する方法が利用できる。
【００３１】
本発明では、腸管細胞の凝集体（あるいは高密度培養した細胞）をＥＧＦを含有する培養液中で培養することによって、腸管幹／前駆細胞を選択的に増殖させることができ、すなわち該幹／前駆細胞を効率よく取得することができる。さらに該幹／前駆細胞の自己複製能及び多分化能は長期間安定に維持される。本発明の方法により得られた腸管幹／前駆細胞が自己複製能を維持していることは、細胞数の計測、光学顕微鏡下での観察等、細胞増殖を測定し得る種々の公知技術を用いて、培養容器中での腸管幹／前駆細胞の増殖を観察することによって容易に判断することができる。腸管幹／前駆細胞が多分化能を維持していることは、該幹／前駆細胞を分化誘導した場合に腸上皮組織を構築する複数種の細胞が得られるかどうかで判断することができる。腸上皮組織を構築する細胞としては、腸内分泌細胞（ガストリン分泌細胞、セロトニン分泌細胞、クロモグラニンＡ分泌細胞、セクレチン分泌細胞、ソマトスタチン分泌細胞、ＧＩＰ（ｇａｓｔｒｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）分泌細胞、ＣＣＫ（ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ）分泌細胞等）及び粘液分泌細胞（ゴブレット細胞、パネート細胞等）、栄養素の吸収作用を担う腸細胞が挙げられる。各細胞に特異的に発現している成分を該成分に特異的な親和性を有する物質を用いて検出することによって、あるいは分泌成分を直接解析することによって目的の細胞であるか否かを判定することができる。「特異的な親和性を有する物質」としては、各分泌成分に特異的親和性を有する抗体又はその断片や、各分泌成分をコードする遺伝子に特異的親和性を有するオリゴ又はポリヌクレオチドプローブが挙げられる。「抗体又はその断片」及び「オリゴ又はポリヌクレオチドプローブ」の詳細は上記に準じる。
ゴブレット細胞に関しては、ＰＡＳ染色やアルシアンブルー染色等の染色法によっても判定することができる。
【００３２】
腸管幹／前駆細胞の、腸管上皮組織を構築する細胞への分化誘導は、培養液中からＥＧＦを除去することによって簡便に実施することができる。具体的にはＥＧＦを含有する培養液をＥＧＦを含有しない培養液と培地交換することによって行うことができる。培地交換しておよそ１週間程度で細胞の分化誘導を確認することができるが、分化誘導に要する期間は、細胞の状態や、分化する細胞のタイプ等によって変動し得る。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例にそって本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。また、本発明において使用する試薬や装置、材料は特に言及されない限り、商業的に入手可能である。
【００３４】
実施例１：胎児腸管由来の腸管幹／前駆細胞の取得
胎生１４．５日のマウス胎児から腸管を取り出し、メスで細かく切り刻み腸組織片とした。得られた腸組織片を、１ｍＭ ＥＧＴＡの入ったＨａｎｋ’ｓ溶液に入れ、３７℃のウォーターバスで１０分間振とうした後、遠心分離によってＰＢＳで１回洗浄した。遠心分離した後、腸組織片を、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ溶液（５ｍＭ ＣａＣｌ２の入ったＨａｎｋ’ｓ溶液に溶解したもの）を加え、３７℃のウォーターバスで１５〜２０分間振とうした。軽くピペッティングした後にメッシュを通して未消化組織を除いて細胞分散液を得た（マウス胎児由来の腸管細胞）。
調製したマウス胎児由来の腸管細胞を２〜４×１０５細胞／ウェルの濃度で低接着性の９６ウェル丸底ディッシュ（Ｌｏｗ Ｃｅｌｌ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｌａｔｅｓ，ｃａｔ ｎｏ：１４５３９９；Ｎｕｎｃ）に播種し、ダルベッコ改変イーグル培地とＦ−１２培地とを１：１の割合で含有する培養液〔１０％ウシ胎仔血清、１μｇ／ｍＬ インスリン、１×１０−７ｍｏｌ／Ｌ デキサメサゾン、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ニコチンアミド、２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ−グルタミン、５０μｍｍｏｌ／Ｌ β−メルカプトエタノール、ペニシリン／ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬ（ペニシリン）＋１００μｇ／ｍＬ（ストレプトマイシン））、２０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ，Ｅ９６４４）を含む〕中で、３７℃、５％ＣＯ２存在下、インキュベーター内で培養した。以後、ＥＧＦを含有するこの培地をＥＧＦ（＋）培地、あるいは腸管幹／前駆細胞培養用培地とも称する。
２日後、９６ウェル丸底ディッシュに播種したマウス胎児腸管細胞が集合して細胞塊を形成した（図１ａ）。その後、形成した細胞塊を低接着性の６ｃｍディッシュ等に移したりしながら、さらに５日間程度培養後、それら細胞塊をペトリディッシュ（ＢＤ，３５−１００７）に移し、上記ＥＧＦ（＋）培地中、３７℃、５％ＣＯ２存在下、インキュベーター内で培養を続けた（図１ｂ）。ここで用いたペトリディッシュは、接着細胞用の処理を行っていない（しかし低接着性処理も行っていない）普通のペトリディッシュである。一方低接着性ディッシュを用いず、細胞分散液をすぐに接着性のペトリディッシュに播種し、上記ＥＧＦ（＋）培地中で培養した場合には線維芽細胞様の細胞のみディッシュに残った（図１ｃ）。
凝集体を普通のペトリディッシュに移して３ヶ月程度培養を続けると、線維芽細胞様の細胞に対し、上皮細胞様の細胞が多く見られるようになった。もし線維芽細胞様の細胞が残存している場合は、モノヨード酢酸（４μｇ／ｍＬ）で３〜５時間程度処理することで線維芽細胞様の細胞を死滅させることができる。
得られた上皮細胞様の細胞は、細胞培養用ディッシュにて継代し（図２）、解析（後述する）や凍結保存に用いた。
又、後述の実施例からも明らかなように、この上皮細胞様の細胞は、自己複製能、多分化能を有する幹／前駆細胞を含んでいることから、便宜上、ＦＩＰ（Ｆｅｔａｌ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）細胞とも、以後、称する。
【００３５】
実施例２：成体腸管由来の腸管幹／前駆細胞の取得
成体マウスから取り出した腸管の内部を、２３Ｇの針を使ってＰＢＳで洗浄し、その後、腸管にハサミを入れて管を開き、シート状にし、さらにハサミで５ｍｍ四方程度に切り分けた（腸組織片）。得られた腸組織片を用いて実施例１と同様にして、ＥＧＴＡ、コラゲナーゼ及びピペッティング処理によって細胞分散液を得た（成体マウス腸管細胞）。
成体由来の腸管細胞は、細胞塊を形成しにくいので、単層で凝集させて培養した。すなわち、直径６ｃｍのペトリディッシュ（接着細胞用の処理を行っていない（しかし低接着性処理も行っていない）普通のペトリディッシュ）に１〜５×１０６細胞を播種して、高密度培養を行った。実施例１と同組成の培養液を用い３７℃、５％ＣＯ２存在下、インキュベーター内で培養した。
高密度培養を８ヶ月程度続けると、線維芽細胞様の細胞に対し、上皮細胞様の細胞が多く見られるようになった。もし線維芽細胞様の細胞が残存している場合は、モノヨード酢酸（４μｇ／ｍＬ）で３〜５時間程度処理することで線維芽細胞様の細胞を死滅させることができる。
得られた上皮細胞様の細胞は、細胞培養用ディッシュにて継代し、解析や凍結保存に用いた。
【００３６】
実施例３：増殖能
ＦＩＰ細胞の増殖能について調べた。ＦＩＰ細胞を、種々の濃度（０ｎｇ／ｍＬ〜８０ｎｇ／ｍＬ）でＥＧＦを含有する培養液中で培養した。培養液は、ＥＧＦの濃度が異なること以外は、実施例１で用いた培養液と同じ組成である。ＥＧＦを含まない培養液中で２日間培養した細胞（図３ａ）、ＥＧＦを２０ｎｇ／ｍＬの濃度で含む培養液中で２日間培養した細胞（図３ｂ）を示す。又、１２ウェルの培養プレートに播種し、各種濃度でＥＧＦを含む培養液中で１日間培養した細胞をトリプシン−ＥＤＴＡではがしてその数を血球計算板により計測した（図３ｃ）。
腸管細胞由来の上皮細胞様の細胞の増殖がＥＧＦ依存性であることが示された。
【００３７】
実施例４：増殖とアポトーシス
ＦＩＰ細胞をＥＧＦ（＋）培地（ＥＧＦ濃度２０ｎｇ／ｍＬ）中、細胞培養用ディッシュ上で２日間培養した（図４ａ）。同じ状態のものを２セット用意した。ＥＧＦ存在下で２日間培養した後、一方は、同じＥＧＦ（＋）培地で培地交換してさらに１日間培養し（図４ｂ）、もう一方はＥＧＦを含まない培養液に培地交換してさらに１日間培養した（図４ｃ）。ＥＧＦ存在下では細胞は増殖を続けたが、ＥＧＦ非存在下では細胞の増殖は抑えられ、死ぬ細胞が確認された。一連の過程における細胞の増殖能の変化を、ＢｒｄＵ免疫染色法により確認した。核染色剤であるＤＡＰＩを用いて二重染色した（図５ａ〜ｆ）。
ＥＧＦ存在下で２日間培養した後、一方は、ＥＧＦを含まない培養液に培地交換してさらに１日間培養し、もう一方は同じＥＧＦ（＋）培地で培地交換してさらに１日間培養した。その後、ＢｒｄＵ（１０μＭ）（Ｓｉｇｍａ，Ｂ９２８５）を培地に添加し、１．５時間経過後にＢｒｄＵを取り込んだ増殖細胞の割合をフローサイトメトリーおよび免疫染色にて解析した。フローサイトメトリー解析は、ＢｒｄＵ Ｆｌｏｗ Ｋｉｔ （ＢＤ，５５２５９８）のマニュアルに沿って細胞を標識後、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＢＤ）を用いて行った。この際、ゲートの設定はネガティブコントロールを指標にして行った。ＢｒｄＵの免疫染色は、ＢｒｄＵ Ｆｌｏｗ Ｋｉｔの試薬と抗ＢｒｄＵ抗体（×５０）（ＢＤ，３４７５８０）、Ｃｙ３をコンジュゲートしたロバ抗マウスＩｇＧ抗体（×２００）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ｃａｔ ｎｏ．７１５−１６５−１５０）、およびＤＡＰＩ（１μｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ，Ｄ９５４２）を用いて行い、蛍光顕微鏡で観察した。ＥＧＦ非存在下で培養した細胞についてはＢｒｄＵの取り込みが顕著に減少しており、増殖能が低下したことが明らかとなった（図５ａ〜ｆ）。
また、ＥＧＦを培養液から除くと、死ぬ細胞が確認されたことから、ＥＧＦ非存在下でのアポトーシス誘導について調べた（図５ｇ〜ｈ）。
ＢｒｄＵの解析時と同様に細胞を培養した。細胞をディッシュから回収した後、冷ＰＢＳにて細胞を１回洗い、アネキシンＶ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（１×）（ＢＤ，５５６４５４）にて細胞懸濁液を調製した。そこへ７−ＡＡＤ（５μＬ；ＢＤ，５５９９２５）とＡＰＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ アネキシンＶ（５μＬ；ＢＤ，５５０４７４）を添加し、室温にて１５分間反応させた（遮光）。染色した細胞はＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＢＤ）を用いて解析した。ゲートの設定はネガティブコントロールを指標にして行った。アネキシンＶはリン脂質結合性タンパク質である。アポトーシスを起こした細胞は細胞膜表面にホスファチジルセリンを露出するようになり、そこにアネキシンＶが結合する。従ってアネキシンＶはアポトーシス細胞に強い親和性を有する。ＥＧＦ非存在下ではアネキシンＶが結合する細胞が顕著に増加しており、アポトーシス誘導が起こっていることが示された（図５ｇ〜ｈ）。
ＦＩＰ細胞は、ＥＧＦの存在下、活発に分裂増殖したが、ＥＧＦを含まない培養条件では増殖活性が著しく減少し、アポトーシスを起こす細胞が増加した。
【００３８】
実施例５：マーカー蛋白質の発現
ＦＩＰ細胞における種々のマーカー蛋白質の発現について調べた。各マーカー蛋白質の発現は、各蛋白質の抗体をそれぞれ用いて免疫染色法により調べた。尚、細胞の存在を示す為に、核染色剤であるＤＡＰＩで二重染色した。
細胞をＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（ＰＢＳ中）で５分間、室温で固定した。続いて、２５％アセトン（メタノール中）で１分間、室温で処理した。固定後、細胞を０．０５％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ ２０）（Ｗａｋｏ）を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で洗浄し、続いて、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）で１時間、室温で処理した。非特異的な結合は、１０％のロバ血清（Ｓｉｇｍａ，Ｄ９６６３）で１時間、室温で処理することによりブロッキングした。固定した細胞を１次抗体と湿室内で１６時間、４℃でインキュベートした。細胞を、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、ブロッキングした後、さらに２次抗体と４時間、４℃でインキュベートした。室温でＤＡＰＩと５分間インキュベートし、洗浄後、細胞を蛍光顕微鏡で観察した。
用いた抗体は以下の通り。
（１次抗体）
抗Ｅ−カドヘリン抗体：ＢＤ，６１０１８１（２次抗体、マウス用）；×１００
抗Ｚｏ−１抗体：Ｚｙｍｅｄ，６１−７３００（２次抗体、ウサギ用）；×１００
抗ビリン抗体：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ｓｃ−７６７２（２次抗体，ヤギ用）；×１０
抗Ｍｕｓａｓｈｉ−１抗体： Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＡＢ５９７７（２次抗体、ウサギ用）；×１００
（２次抗体）
マウス用：Ａｌｅｘａ ４８８が結合したロバ抗マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ａ２１２０２）；×２００
ウサギ用：Ａｌｅｘａ ４８８が結合したロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ａ２１２０６）；×２００
ヤギ用：Ａｌｅｘａ ４８８が結合したロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ａ１１０５５）；×２００
ＦＩＰ細胞は、全細胞において上皮細胞のマーカーであるＥ−カドヘリンやＺｏ−１、及び、腸上皮細胞のマーカーであるビリンを発現していた。また、一部の細胞は腸管幹／前駆細胞マーカーと考えられているＭｕｓａｓｈｉ−１を発現していた（図６）。
【００３９】
実施例６：βカテニン転写活性化
ＴＣＦ／ｂ−ｃａｔｅｎｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅによってβガラクトシダーゼ遺伝子がドライブされるコンストラクト（ＴＯＰＧＡＬ）をリポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１１６６８）を用いて細胞に導入し、Ｘ−ｇａｌ染色により陽性細胞を検出した。具体的には以下の手順で行った。
（１） 細胞をＰＢＳで洗浄（×２）
（２） 固定液（２％ＰＦＡ／０．２％グルタルアルデヒド（ＧＡ）／０．０５％ＮＰ−４０／ＰＢＳ）を添加（６ウェルプレートの１ウェルあたり１．５〜２ｍＬ）
（３） １分間室温で放置
（４） ＰＢＳで洗浄（×２）
（５） Ｘ−ｇａｌ溶液を添加（６ウェルプレートの１ウェルあたり１．５〜２ｍＬ）
（６） ３７℃のインキュベーター中で放置（少なくとも３時間〜一晩）
（７） ＰＢＳで洗浄（×２）することで反応を停止させる
（８） 観察（写真撮影）、ＰＢＳ中４℃で保存
（固定液の調製）
以下の割合で各成分を混合して固定液を調製した。
２０％ ＰＦＡ／ＰＢＳ １ｍＬ（−２０℃保存）
２５％ ＧＡ ８０μＬ（−２０℃保存）
５％ ＮＰ−４０ ８０μＬ（室温保存）
ＰＢＳ ９ｍＬ（室温保存）
（Ｘ−ｇａｌ溶液の調製）
以下の割合で各成分を混合してＸ−ｇａｌ溶液を調製した。
５００ｍＭ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６ ５０μｌ（室温保存、遮光保存）
５００ｍＭ Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６ ５０μｌ（室温保存、遮光保存）
１Ｍ ＭｇＣｌ２ １０μｌ（室温保存）
２０ｍｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌ ２５０μｌ（−２０℃保存、遮光保存）
ＰＢＳ ４．７ｍｌ（室温保存）
Ｘ−ｇａｌ陽性細胞が検出され、βカテニンの転写活性化が確認された（図７）。
【００４０】
実施例７：腸上皮組織を構築する細胞への分化誘導
ＦＩＰ細胞をコンフルエントな状態になるまで培養した。コンフルエントになった状態からＥＧＦを除くと、アポトーシスを起こす細胞の中で生き残る細胞が存在した。これら生き残った細胞をＥＧＦ非存在下で培養し続けると分化した腸上皮様細胞の特徴を示す細胞が出現してきた（図８）。
この状態の細胞をＰＡＳ染色すると、ＥＧＦ非存在下で培養し続けた細胞において赤紫色に染色される細胞が多数出現した（図９）。ＰＡＳ染色は、糖質に含まれる１，２グリコール基群を過ヨウ素酸で酸化し、生じた２分子のアルデヒド基がシッフ試薬１分子と結合して、赤紫色の化合物を形成する２つの反応を利用したものであり、グリコーゲン、中性粘液多糖類、糖蛋白質、粘液蛋白質、糖脂質等の検出に用いられる。腸上皮組織においては、粘液分泌細胞の１種であるゴブレット細胞を染め分けることが知られている。具体的には以下の手順で行った。尚、各試薬については当分野で通常ＰＡＳ染色を行う際に用いられている試薬を使用することができる。
（１） 細胞をＰＢＳで洗浄（×１）
（２） ０．５％過ヨウ素酸で室温７分間処理
（３） ミリＱ水で洗浄（×５）
（４） シッフ試薬で室温７〜１０分間処理
（５） 亜硫酸水で処理（室温１分間処理を３回繰り返す）
（６） ミリＱ水で洗浄（×５）
（７） ヘマトキシレンで処理（室温で１分間）
（８） ミリＱ水で洗浄（×５）
又、各腸上皮組織において分泌、発現している蛋白質に対する抗体を用いて免疫染色を行い、該蛋白質の発現状況を解析した。用いた各蛋白質の抗体は以下の通り。尚、細胞の存在を示す為に、核染色剤であるＤＡＰＩで二重染色した。
（１次抗体）
抗セロトニン抗体：Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｒ，２００８０（２次抗体、ウサギ用）；×１０
抗クロモグラニンＡ抗体：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ｓｃ−１４８８（２次抗体、ヤギ用）；×１０
抗ガストリン抗体：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ｓｃ−７７８３（２次抗体、ヤギ用）；×１０
抗セクレチン抗体：Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＡＢ９８１（２次抗体、ウサギ用）；×１００
抗ソマトスタチン抗体：ＡＦＦＩＮＩＴＩ，ＳＡ１２６８（２次抗体、ウサギ用）；×１０
抗ＧＩＰ抗体：Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＡＢ９５３（２次抗体、ウサギ用）；×１０
抗リゾチーム抗体：Ｄａｋｏ，Ａ００９９（２次抗体、ウサギ用）；×１００
抗シナプトフィジン抗体：Ｄａｋｏ，Ａ００１０（２次抗体，ウサギ用）；×１０
（２次抗体）
ウサギ用：Ａｌｅｘａ ４８８が結合したロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ａ２１２０６）；×２００
ヤギ用：Ａｌｅｘａ ４８８が結合したロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ａ１１０５５）；×２００
結果、ＥＧＦ非存在下で培養すると、腸内分泌細胞に特徴的なセロトニン、クロモグラニンＡ、ガストリン、セクレチン、ソマトスタチン、ＧＩＰを発現している細胞が検出され、粘液分泌細胞の１種であるパネート細胞に特徴的なリゾチーム及びシナプトフィジンを発現している細胞が検出された。これらの結果より、ＦＩＰ細胞の培養液からＥＧＦを除去することにより腸内分泌細胞への分化が誘導されたことがわかる。
【００４１】
実施例８：ＲＴ−ＰＣＲによる解析
上記した実施例より、ＦＩＰ細胞には、腸管幹／前駆細胞が含まれていることが示され、さらにＥＧＦ存在下で、該幹／前駆細胞は増殖を続け、ＥＧＦを培養液中から除去することにより、細胞はアポトーシスを引き起こし、又、種々の腸上皮組織を構築する細胞へと分化することがわかった（模式図を図１０に示す）。
ＦＩＰ細胞、及び各発生段階（胎生１４．５日目、新生児、成体）にあるマウスの腸組織を用いて、腸管の細胞分化に関与すると考えられる遺伝子の発現プロファイルをＲＴ−ＰＣＲによって解析した。
ＦＩＰ細胞をＥＧＦ（＋）培地で培養後、コンフルエントになった時点でＥＧＦを含まない培地に培地交換し、その後１週間培養した。その細胞からＲＮＡを抽出（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ；ＱＩＡＧＥＮ）し、逆転写酵素反応（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ）によりｃＤＮＡを得た。腸組織からのＲＮＡ抽出では、ホモジナイザー（ポリトロン）を用いて組織を破砕後に同様の方法で抽出と逆転写酵素反応を行った。続いて、それらのｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、各種分化マーカーの発現を解析した。
目的とするマーカーならびにそのプライマーを表１に示す。
【００４２】
【表１】
【００４３】
ＰＣＲサイクルは、９５℃（４分間）→［９４℃（１分間）→５６℃（１分間）→７２℃（１分間）］×４５サイクル→７２℃（１０分間）である。ＰＣＲにより産生された核酸は、２％アガロースゲルにて展開し、解析した。結果を図１１に示す。
【００４４】
実施例９：単一細胞レベルでの解析
上記した実施例３〜７での実験はｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓな細胞集団での解析であったので、腸管幹／前駆細胞の解析を厳密に行うためには、単一細胞レベルでの解析が必要であると考えた。そこで、フローサイトメトリーを用いてＦＩＰ細胞をクローンソーティングし、９６ウェルディッシュの各ウェルにて単一細胞培養を試みた。増殖してきたクローンのひとつを用いて同様にして、増殖能、マーカー蛋白質の発現及び分化誘導について調べた。
その結果、単一コロニーから増殖させた細胞についても、Ｅ−カドヘリンやＺｏ−１、ビリンを全細胞で発現し、また一部のコロニーについてはＭｕｓａｓｈｉ−１を発現していた。さらにＥＧＦ依存的な増殖活性や細胞死抑制を示し、さらに、ＥＧＦ非存在下で複数の腸上皮細胞マーカーを発現するようになった。このように、単一細胞レベルの解析においても増殖能や多分化能が示されたことで、ＦＩＰ細胞には腸管幹／前駆細胞が含まれることが確認された。
以上の結果より、ＦＩＰ細胞集団には、自己複製能及び多分化能を有する幹／前駆細胞が含まれ、長期間安定に維持され得ることが示された。本願発明の方法を用いることによって腸管上皮細胞の幹／前駆細胞を選択的に増殖させることが可能となった。かかる選択的増殖によって、効率的に腸管幹／前駆細胞を取得・培養することができる。
【００４５】
実施例１０：ヒト小腸上皮細胞からの腸管幹／前駆細胞の取得
本実施例では、ＡＣＢＲＩにより分離され、日本では大日本住友製薬株式会社から供給されているヒト小腸上皮細胞（Cat No. CS-ABI-519）を用いた。この細胞を添付のデータシートに記載された方法に従って培養ディッシュに播種し培養した（図１２ａ）。培養ディッシュは、タイプＩＶコラーゲンコートされたディッシュを用いた。培養液として、データシートに記載され、添付されている培地、すなわちＣＳ−２．０基礎培地に添加剤を加えたもの（以下、CS-2.0 + supplement）を用いた。当該処理は、２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ存在下で行なった。
CS-2.0 + supplementを用いて培養したところ継代を２回行なった時点で細胞は培養ディッシュに接着せず、全て死滅してしまった（図１２ｃ，ｅ）。
そこで、実施例１で調製した、マウス胎児由来の腸管細胞を培養するのに用いたＥＧＦを含有する培地（腸管幹／前駆細胞培養用培地）を用いて同様にして継代培養したところ、継代を重ねても培養ディッシュに接着し、増殖維持することができる細胞が得られた（図１２ｂ，ｄ）。
これらの細胞は、購入したヒト上皮細胞集団中に含まれる腸管幹／前駆細胞であると考えられたので、便宜上、ｈＡＩＰ（human adult intestine progenitor）細胞とも、以後、称する。
【００４６】
実施例１１：マーカータンパク質の発現とβカテニン転写活性化
ｈＡＩＰ細胞について、実施例５と同様にしてマーカータンパク質の発現について調べた。
【００４７】
ｈＡＩＰ細胞は、全細胞において上皮細胞のマーカーであるＥ−カドヘリンやＺｏ−１、及び、腸上皮細胞のマーカーであるビリンを発現していた。また、一部の細胞は腸管幹／前駆細胞マーカーと考えられているＭｕｓａｓｈｉ−１を発現していた（図１３、上段）。
また、ｈＡＩＰ細胞について、実施例６と同様にして、βカテニンの転写活性化の有無を確認した。Ｘ−ｇａｌ陽性細胞が検出され、βカテニンの転写活性化が確認された（図１３、下段）。
【００４８】
実施例１２：増殖能
実施例３と同様にしてｈＡＩＰ細胞の増殖能について調べた。実施例１で用いたＥＧＦ（＋）培地、及びＥＧＦを含まない以外は同じ組成のＥＧＦ（−）培地でそれぞれ４日間培養した。ＥＧＦの存在下ではｈＡＩＰ細胞は活発に分裂増殖するが、ＥＧＦを含まない培養条件では増殖活性が低下し、アポトーシスを起こす細胞が増加した（図１４）。
この結果から、ＥＧＦはｈＡＩＰ細胞の自己複製を促進し、細胞死を抑制することで、培養下における維持を可能にしていることがわかる。
【００４９】
実施例１３：増殖とアポトーシス
ｈＡＩＰ細胞をＥＧＦ（＋）培地（ＥＧＦ濃度２０ｎｇ／ｍＬ）中、４日間培養した。同じ状態のものを２セット用意した。ＥＧＦ存在下で４日間培養した後、一方は、同じＥＧＦ（＋）培地で培地交換してさらに１日間培養し（図１５Ａ，左）、もう一方はＥＧＦを含まない培養液に培地交換してさらに１日間培養した（図１５Ａ，右）。ＥＧＦ存在下では細胞は増殖を続けたが、ＥＧＦ非存在下では細胞の増殖は抑えられ、死ぬ細胞が確認された。一連の過程における細胞の増殖能の変化を、ＢｒｄＵ免疫染色法により確認した。核染色剤であるＤＡＰＩを用いて二重染色した（図１５Ａ）。
ＥＧＦ存在下で４日間培養した後、一方は、ＥＧＦを含まない培養液に培地交換してさらに１日間培養し、もう一方は同じＥＧＦ（＋）培地で培地交換してさらに１日間培養した。その後、ＢｒｄＵ（１０μＭ）（Ｓｉｇｍａ，Ｂ９２８５）を培地に添加し、１．５時間経過後にＢｒｄＵを取り込んだ増殖細胞の割合をフローサイトメトリーおよび免疫染色にて解析した。フローサイトメトリー解析は、実施例４で記載した方法に従って行なった（図１５Ｂ，左）。ＢｒｄＵの解析時と同様に細胞を培養し、アネキシンＶとの結合を実施例４で記載した方法に従って解析した。アネキシンＶが結合する細胞をアポトーシスを起こしている細胞とみなし、その割合を調べた（図１５Ｂ，右）。ＥＧＦを培養液中から除くことによって、ＢｒｄＵの取り込みが減少し、すなわち増殖能が低下することがわかる。さらに、ＥＧＦを培養液中から除くことによって、アポトーシスを起こす細胞が増加した。
ｈＡＩＰ細胞の増殖あるいはアポトーシスに及ぼすＥＧＦの影響を確認するために、ＥＧＦを含有する培養液中に、ＥＧＦシグナル伝達系を阻害するＡＧ１４７８、ＰＤ９８０５９、あるいはＬＹ２９４００２を添加した培養液を用いて同様にＢｒｄＵの取り込みとアポトーシス誘導について調べた。
ＰＤ９８０５９（２’−アミノ−３’−メトキシフラボン）は、ＭＥＫ１（ＭＡＰキナーゼ・キナーゼ）に対する選択的で細胞透過性の阻害剤であり、ＭＥＫ１の活性化を阻害する結果、続いて起こるＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２）のリン酸化−活性化を阻害する。使用濃度：１００μＭ。
ＬＹ２９４００２（［２−（４−モルホリニル）−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン］はホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）に対する強力で特異的な細胞透過性阻害剤である。使用濃度：１００μＭ
【００５０】
実施例１４：腸上皮組織を構築する細胞への分化誘導
ｈＡＩＰ細胞は上記した培養条件下で自然に分化誘導され、腸上皮様細胞の特徴を示す細胞が出現してくる。この状態の細胞を実施例７に記載する方法に従ってＰＡＳ染色すると、赤紫色に染色される細胞が多数出現したことから、腸上皮組織であるゴブレット細胞の存在を確認することができた（図１６Ｂ）。
さらに、実施例８と同様な手法で、腸上皮組織を構築する細胞への分化誘導をＲＴ−ＰＣＲ解析により調べた。誘導される腸上皮組織の種類は、図１０に示されている。
ｈＡＩＰ細胞、及びヒト成体小腸からの組織を用いて、腸管の細胞分化に関与すると考えられる遺伝子の発現プロファイルをＲＴ−ＰＣＲによって解析した。目的とするマーカー及びそのためのプライマーは、下記表２に示すヒト用のものを用いた。
【００５１】
【表２】
【００５２】
結果を図１６Ａに示す。
ｈＡＩＰ細胞培養中には、腸上皮組織を構築する複数の腸内分泌細胞や粘液分泌細胞の特徴を示す細胞が観察された。従ってｈＡＩＰ細胞は、培養下で増殖し続けるのと同時に、腸を構成する様々な細胞に分化する多分化能を有することが判明した。
【配列表フリーテキスト】
【００５３】
配列番号１：ビリン（マウス）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号２：ビリン（マウス）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号３：Ｌｆａｂｐ（マウス）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号４：Ｌｆａｂｐ（マウス）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号５：クロモグラニンＡ（マウス）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号６：クロモグラニンＡ（マウス）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号７：Ｔｒｅｆｏｉｌ ｆａｃｔｏｒ−３（マウス）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号８：Ｔｒｅｆｏｉｌ ｆａｃｔｏｒ−３（マウス）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号９：リゾチーム（マウス）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号１０：リゾチーム（マウス）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号１１：シナプトフィジン（マウス）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号１２：シナプトフィジン（マウス）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号１３：Ｍｕｓａｓｈｉ−１（マウス）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号１４：Ｍｕｓａｓｈｉ−１（マウス）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号１５：Ｍａｔｈ−１（マウス）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号１６：Ｍａｔｈ−１（マウス）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号１７：ビリン（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号１８：ビリン（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号１９：Ｌｆａｂｐ（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号２０：Ｌｆａｂｐ（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号２１：シュクラーゼ−イソマルターゼ（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号２２：シュクラーゼ−イソマルターゼ（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号２３：セクレチン（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号２４：セクレチン（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号２５：ＧＩＰ（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号２６：ＧＩＰ（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号２７：ガストリン（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号２８：ガストリン（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号２９：クロモグラニンＡ（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号３０：クロモグラニンＡ（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号３１：ＣＣＫ（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号３２：ＣＣＫ（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号３３：ソマトスタチン（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号３４：ソマトスタチン（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号３５：Ｔｒｅｆｏｉｌ ｆａｃｔｏｒ−３（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号３６：Ｔｒｅｆｏｉｌ ｆａｃｔｏｒ−３（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号３７：リゾチーム（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号３８：リゾチーム（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号３９：シナプトフィジン（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号４０：シナプトフィジン（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号４１：Ｍｕｓａｓｈｉ−１（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号４２：Ｍｕｓａｓｈｉ−１（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号４３：Ｍａｔｈ−１（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号４４：Ｍａｔｈ−１（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号４５：Ｎｇｎ３（Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ−３）（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号４６：Ｎｇｎ３（Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ−３）（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号４７：ＨＰＲＴ（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号４８：ＨＰＲＴ（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】腸管細胞培養の簡単な手順を示す図である。ａは、非接着性培養容器上で形成させた凝集体を示す図（位相差像）である。ｂは、形成させた凝集体を接着細胞用の処理を行っていない（しかし低接着性処理も行っていない）普通のペトリディッシュ上で培養した状態を示す図（位相差像）である。ｃは、凝集体を形成させず、腸管細胞を接着性培養容器上で培養した状態を示す図（位相差像）である。
【図２】一連の操作によって得られた腸管細胞由来の、上皮細胞様の細胞を継代培養して増殖させた状態を示す図（位相差像）である。
【図３】ＦＩＰ細胞のＥＧＦ依存性の増殖能を示した図（位相差像）である。ａはＥＧＦ非存在下で、ｂはＥＧＦ存在下でそれぞれ２日間培養した状態を示す。ｃは細胞をトリプシン−ＥＤＴＡではがして血球計算板により計測した結果を示す。横軸は添加したＥＧＦの濃度を、縦軸は細胞数を示す。
【図４】ＥＧＦ存在下で培養していたＦＩＰ細胞をＥＧＦ非存在下又は引き続きＥＧＦ存在下で培養した場合の細胞の状態を示す図（位相差像）である。ａはＥＧＦ存在下で２日間ＦＩＰ細胞を培養した状態を示す。ＥＧＦ存在下での２日間の培養後、さらにＥＧＦを含む培養液中で１日間（ｂ）、あるいはＥＧＦを含まない培養液中で１日間（ｃ）、それぞれ培養した。
【図５】ＥＧＦ存在下で培養していたＦＩＰ細胞を引き続きＥＧＦ存在下で培養した場合又はＥＧＦ非存在下で培養した場合の細胞の状態を示す図である。ａ及びｂは、それぞれの細胞のＢｒｄＵ取り込みの様子をＢｒｄＵ免疫染色法により調べた結果を表す図（蛍光顕微鏡像）である。ｃ及びｄは、それぞれの細胞をＢｒｄＵ／ＤＡＰＩの二重染色により染色した結果を表す図である（蛍光顕微鏡像）。ｅ及びｆは、ＥＧＦ存在下、あるいは非存在下でのＢｒｄＵの取り込みをＦＡＣＳ解析した結果を表すグラフである。ｇ及びｈは、ＥＧＦ存在下、あるいは非存在下でのアネキシンＶの結合をＦＡＣＳ解析した結果を表すグラフである。
【図６】ＥＧＦ存在下で培養を続けたＦＩＰ細胞における各種マーカー蛋白質（Ｅ−カドヘリン、Ｚｏ−１、ビリン及びＭｕｓａｓｈｉ−１）の発現を調べた結果を示す図である（蛍光顕微鏡像）。
【図７】ＴＣＦ／ｂ−ｃａｔｅｎｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅによってβガラクトシダーゼ遺伝子がドライブされるコンストラクト（ＴＯＰＧＡＬ）を細胞に導入し、Ｘ−ｇａｌ染色により陽性細胞を検出した結果を示す図である。
【図８】ＥＧＦ存在下で培養していたＦＩＰ細胞（ａ，ｃ）からＥＧＦを除去し、さらにＥＧＦ非存在下で７日間培養した細胞（ｂ，ｄ）の状態を示す図（位相差像）である。
【図９】ＦＩＰ細胞をＥＧＦ非存在下で培養し続けた細胞（腸上皮細胞様の細胞）をＰＡＳ染色した像である。ａはコンフルエントな状態になったＦＩＰ細胞を示し、ｂはＥＧＦ非存在下で７日間培養した細胞を示す。
【図１０】ＦＩＰ細胞とＥＧＦとの関係を模式的に示した図である。
【図１１】ＦＩＰ細胞、胎生１４．５日のマウス腸組織、新生児腸組織、成体腸組織における種々の遺伝子発現プロファイルをＲＴ−ＰＣＲ法により調べた結果を示す図である。
【図１２】ヒト小腸上皮細胞（Cat No. CS-ABI-519）をCS-2.0+supplement培地あるいは腸管幹／前駆細胞培養用の培地で継代培養した場合の細胞の様子を示す図である。ａは、CS-2.0+supplement培地中に播種した継代１回目の細胞の様子を、ｂ及びｄは、腸管幹／前駆細胞培養用の培地で２回継代培養を行なった細胞の様子を示している。播種後１日目（ｂ）と５日目（ｄ）の様子である。ｃ及びｅは、CS-2.0+supplement培地で２回継代培養を行なった細胞の様子を示している。播種後１日目（ｃ）と５日目（ｅ）の様子である。位相差像である。
【図１３】上段は、ＥＧＦ存在下で培養を続けたｈＡＩＰ細胞における各種マーカー蛋白質（Ｅ−カドヘリン、Ｚｏ−１、ビリン及びＭｕｓａｓｈｉ−１）の発現を調べた結果を示す図（蛍光顕微鏡像）である。下段は、ＴＣＦ／ｂ−ｃａｔｅｎｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅによってβガラクトシダーゼ遺伝子がドライブされるコンストラクト（ＴＯＰＧＡＬ）を細胞に導入し、Ｘ−ｇａｌ染色により陽性細胞を検出した結果を示す図である。
【図１４】ｈＡＩＰ細胞のＥＧＦ依存性の増殖能を示した図（位相差像）である。ａ及びｃはＥＧＦ存在下で、ｂ及びｄはＥＧＦ非存在下でそれぞれ４日間培養した状態を示す。ｃ及びｄは、それぞれａ及びｂの高倍率像である。
【図１５】ｈＡＩＰ細胞の増殖とアポトーシスに及ぼすＥＧＦの影響を解析した結果を示す図である。図１５ＡはＥＧＦ存在下で培養していたｈＡＩＰ細胞を引き続きＥＧＦ存在下で培養した場合又はＥＧＦ非存在下で培養した場合の細胞の状態を示す図である。それぞれの細胞をＢｒｄＵ／ＤＡＰＩの二重染色により染色した結果を表す（蛍光顕微鏡像）。図１５Ｂは、ＥＧＦ存在下、あるいは非存在下、あるいは種々の阻害剤を用いた場合の、ＢｒｄＵの取り込みをＦＡＣＳ解析した結果、あるいはアポトーシスを起こした細胞をＦＡＣＳ解析した結果を表すグラフである。
【図１６】図１６Ａは、ｈＡＩＰ細胞、ヒト成体腸組織における種々の遺伝子発現プロファイルをＲＴ−ＰＣＲ法により調べた結果を示す図である。図１６ＢはｈＡＩＰ細胞をＰＡＳ染色した像である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は腸管上皮細胞の幹／前駆細胞を取得し効率的に培養する方法、該方法によって得られる幹／前駆細胞に関する。さらに本発明は腸管上皮細胞の幹／前駆細胞から腸上皮組織を構築する細胞への分化を誘導する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬剤の吸収試験やその他の薬学研究では腸上皮細胞の初代培養細胞を使用することが多い。これまでの培養系では、腸上皮細胞は数日の間に淘汰されてしまい、常に新しい細胞を調製し使用する必要があった。そのため、腫瘍組織由来の細胞株が用いられているが、信頼性の高いデータを得るためには正常細胞を使用する必要があり、正常な腸上皮細胞を簡便に使用できることが望まれている。この場合、培養下で長期間細胞を維持するためには、成熟した腸上皮細胞に加え、それらを常に産生する幹/前駆細胞を培養下で維持する必要があると言える。
【０００３】
食物の消化吸収を担う臓器である腸管には、機能的役割の異なる腸上皮細胞群の根幹に位置する幹細胞（腸管幹細胞）が存在し、幹細胞の分裂と維持により腸上皮細胞が継続して供給される。このように、腸管幹細胞は旺盛な増殖能を有するが、その能力を人為的に培養下で保持させ続けることは極めて難しく、これまでに腸管幹細胞の培養に成功した例はない。腸管幹細胞の増殖や分化を培養下で制御できれば、腸管の幹細胞システムに対する基礎研究用ツールとして利用できるだけでなく、薬剤吸収・代謝試験など創薬過程におけるスクリーニング用ツールとして利用できる。また、組織工学的に移植可能な腸上皮組織を供給することができる。
【０００４】
一方、初期胚に由来する、多能性の幹細胞株である胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、多能性を有するが故に、通常の培養方法では細胞が徐々に分化していってしまう。そのため、ＥＳ細胞を効率よく増やすためにはＥＳ細胞を未分化状態のままで増殖させる必要がある。マウスのＥＳ細胞の場合には白血病阻害因子（ＬＩＦ）を培地に添加することにより未分化状態を維持できることが知られている（非特許文献１）が、組織幹細胞である腸管幹細胞ではＬＩＦの代替となるような添加因子は知られていない。またＥＳ細胞では分化誘導の際に胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ）と呼ばれる細胞凝集体を作らせることが一般的に知られているが、腸管幹細胞の分化を制御する方法は未だ確立されていない。
【非特許文献１】Smith AG, Heath JK, Donaldson DD, Wong GG, Moreau J, Stahl M, Rogers D. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 1988 Dec 15;336(6200):688-90.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の取得を目的とし、さらに該幹／前駆細胞を効率的に培養することを目的とする。さらに本発明の別の目的は、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞から腸上皮組織を構築する細胞への分化を誘導する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討を行った結果、腸管由来の細胞（腸管細胞）を浮遊培養することによって細胞凝集体を得て、当該凝集体を、上皮増殖因子（ＥＧＦ）を含有する培養液中で培養することによって、腸管の幹／前駆細胞を選択的に取得、増殖させることができることを見出した。さらに、得られた幹／前駆細胞を適当な分化誘導条件下で腸上皮組織を構築する細胞へと分化させることに成功して本発明を完成するに至った。すなわち本発明は以下の通りである。
【０００７】
［１］腸管細胞の凝集体を培養することを含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の取得方法。
［２］腸管細胞の凝集体を、ＥＧＦを含有する培養液中で培養することを含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の取得方法。
［３］凝集体が腸管細胞を浮遊培養することによって得られるものである、上記［１］又は［２］記載の方法。
［４］以下の工程を含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の取得方法。
（１）腸管から腸管細胞を採取する工程
（２）腸管細胞を浮遊培養することによって細胞塊（凝集体）を調製する工程
（３）腸管細胞の凝集体を、ＥＧＦを含有する培養液中で培養する工程
（４）腸管上皮細胞の幹／前駆細胞マーカーを発現している細胞を腸管上皮細胞の幹／前駆細胞として回収する工程
［５］腸管上皮細胞の幹／前駆細胞マーカーがＭｕｓａｓｈｉ−１である、上記［４］記載の方法。
［６］腸管細胞を、血清、インスリン、デキサメサゾン、ニコチンアミド、Ｌ−グルタミン、β−メルカプトエタノール及びＥＧＦを含有する培養液中で培養することを含む腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の取得方法。
［７］腸管細胞を、ＥＧＦを含有する培養液中、高密度で培養することを含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の取得方法。
［８］以下の工程を含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の取得方法。
（１）腸管から腸管細胞を採取する工程
（２）腸管細胞を、ＥＧＦを含有する培養液中、高密度で培養する工程
（３）腸管上皮細胞の幹／前駆細胞マーカーを発現している細胞を腸管上皮細胞の幹／前駆細胞として回収する工程
［９］腸管上皮細胞の幹／前駆細胞マーカーがＭｕｓａｓｈｉ−１である、上記［８］記載の方法。
［１０］上記［１］〜［９］のいずれか１項に記載の方法によって得られた腸管上皮細胞の幹／前駆細胞。
［１１］腸管細胞の凝集体を培養することを含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の培養方法。
［１２］腸管細胞の凝集体を、ＥＧＦを含有する培養液中で培養することを含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の培養方法。
［１３］凝集体が腸管細胞を浮遊培養することによって得られるものである、上記［１１］又は［１２］記載の方法。
［１４］腸管細胞を、血清、インスリン、デキサメサゾン、ニコチンアミド、Ｌ−グルタミン、β−メルカプトエタノール及びＥＧＦを含有する培養液中で培養することを含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の培養方法。
［１５］腸管細胞を、ＥＧＦを含有する培養液中、高密度で培養することを含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の培養方法。
［１６］腸管上皮細胞の幹／前駆細胞から腸上皮組織を構築する細胞への分化を誘導する方法であって、該幹／前駆細胞の培養液からＥＧＦを除去することを特徴とする方法。
［１７］腸上皮組織を構築する細胞が、腸内分泌細胞又は粘液分泌細胞である、上記［１６］記載の方法。
［１８］血清、インスリン、デキサメサゾン、ニコチンアミド、Ｌ−グルタミン、β−メルカプトエタノール及びＥＧＦを含有する、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞培養用培地。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によって得られる腸管上皮細胞の幹／前駆細胞及び該細胞から腸上皮組織を構築する細胞への分化を誘導する方法は、腸組織の発生・分化を理解するための基礎研究用ツールとして有用であり、又、組織工学的に移植可能な腸上皮組織の供給を可能とする。さらに該幹／前駆細胞に由来する腸上皮細胞を用いて薬物の腸管における吸収実験などを効率的に行うことが期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと同様又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及したすべての刊行物及び特許は、例えば、記載された発明に関連して使用されうる刊行物に記載されている、構築物及び方法論を記載及び開示する目的で、参照として本明細書に組み入れられる。
【００１０】
本発明の取得方法及び培養方法の対象となる腸管上皮細胞の幹／前駆細胞は、任意の哺乳動物の腸管細胞に由来する。ここで「哺乳動物」とは、具体的にはヒトをはじめウシ、ウマ、イヌ、モルモット、マウス、ラット等が挙げられる。好ましくはヒトであるが、薬物の吸収実験等の研究用ツールとしての利用を考えた場合、マウスやラット等の実験動物としてよく用いられる動物も又、好ましい。
【００１１】
腸は、大きく小腸と大腸の２つに分けることができる。小腸は更に口側から、十二指腸、空腸、回腸に分けられ、大腸は盲腸、結腸（上行結腸、横行結腸、下行結腸、Ｓ状結腸）、直腸に分けられる。成体の腸は、広範にわたって腺窩と絨毛に折り畳まれている上皮層及び支持間葉系組織によって取り囲まれているルーメンから構成されている。腸の上皮細胞は常に新生され、古くなったものは剥離してゆく。腸上皮細胞の新生は、腸上皮組織中に、幹細胞による細胞再生系が存在するからである。幹細胞は、小腸の絨毛の根元が窪んだ陰窩（ｃｒｙｐｔ）の底のほうに存在する。また、胎児においては、内胚葉細胞層が腸上皮となるよう運命付けられ、重層細胞層が分化した偏極上皮単層へと転換する。腸上皮の形態及び恒常性は細胞増殖、移動、分化及びアポトーシス間での高度に制御された均衡の結果である。本発明の取得方法及び培養方法の対象となる「腸管上皮細胞の幹／前駆細胞」とは、腸上皮細胞へと分化し得る、及び／又は分化することが運命づけられている細胞である。「幹細胞」は自己複製能と多分化能をあわせもつ細胞であって、分化運命が限定されている「前駆細胞」と完全に一致するものではないが、腸上皮細胞へと分化する細胞という点では同一であり、従って、本願発明では特に区別することなく「幹／前駆細胞」と称する。また、「腸管上皮細胞の幹／前駆細胞」を、便宜上「腸管幹／前駆細胞」と称することもある。
【００１２】
本明細書中、「腸管細胞」とは、成体あるいは胎児から採取される腸由来の細胞であって、分裂能力を有する腸上皮細胞あるいは腸上皮細胞となり得る細胞の総称である。具体的には、腸管、好ましくは小腸部分を取り出し細かく切り刻んで、振動等の物理的な手段によって、ＥＧＴＡあるいはＥＤＴＡ等を用いた化学的な処理によって、あるいはコラゲナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン等のプロテアーゼ（好ましくはコラゲナーゼ）を用いた酵素的な処理によって細胞を分散することによって得ることができる。上記処理は単独で行っても、複数の処理を組み合わせて行っても良い。胎児の腸管を用いる場合には、円筒状の腸構造から、腸上皮組織中に凸凹が生じ始める時期のものを用いることが好ましい。例えばマウスでは、胎生１２〜１７日目、好ましくは１４．５日の胎児から採取する。また、本発明において用いられる「腸管細胞」は、上記の如く腸管から採取されるものであってもよいが、分裂能力を有する腸上皮細胞あるいは腸上皮細胞となり得る細胞を含有する市販の腸管由来の細胞であってもよい。かかる市販の腸管由来の細胞としては、ＡＣＢＲＩ（Applied Cell Biology Research Institute）により分離され（ACBRI 519）、日本では大日本住友製薬株式会社から入手可能なヒト小腸上皮細胞（human intestinal epithelial cells, cat No. CS-ABI-519）が挙げられる。
【００１３】
本発明の第一の特徴は、腸管細胞に凝集体をつくらせ、それを培養することにある。凝集体を形成させることによって、より生体内に近い環境に細胞をおくことができる。ここで、「凝集体」とは、細胞が多数集合して形成された三次元構造（球状やぶどうの房状）を有する細胞の塊である。例えば、後述するが、２０〜４０万細胞／ウェルの濃度で低接着性の９６ウェル丸底ディッシュに播種した場合、１０〜２０個程度の直径２００〜５００μｍ程度の凝集体が形成される。凝集体の最外部に細胞のシート状構造が見られる。より生体内に近い環境を提供することが可能な範囲で、凝集体を構成する細胞の数及び大きさは、細胞の状態や培養条件によって変わり得る。
【００１４】
腸管細胞の凝集体は、具体的には以下のようにして調製することができる。まず、腸管細胞を適当な媒体中、低接着性の培養容器上で浮遊培養する。例えば低接着性の培養容器として９６ウェルの丸底ディッシュを用いた場合には、１ウェルあたり２０〜４０万細胞を播種し、形成した凝集体を低接着性の６ｃｍディッシュ等に移したりしながら、３７℃で、２〜１０日間、好ましくは７日間、適当な媒体中で培養する。低接着性の培養容器としては、通常、当分野で用いられている培養容器に低接着性となるような処理を施したものが例示される。培養容器としては、培養ディッシュ、培養フラスコ、回転培養用器具（スピナーフラスコ等）等が挙げられる。低接着性となるような処理としては、ハイドロゲルを共有結合させること（コーティング）によって蛋白質や細胞の接着を抑制するような処理が用いられる。又、市販されているものを用いることもできる。
【００１５】
成体由来の腸管細胞は凝集体を形成しにくいが、該腸管細胞を高密度で培養することによって、同様の効果（生体内に近い環境を作り出すという効果）を得ることができる。例えば直径６ｃｍ（媒体の量：３．５ｍＬ）のペトリディッシュ（接着細胞用の処理を行っていない（しかし低接着性処理も行っていない）普通のペトリディッシュ；以下、単に普通のペトリディッシュともいう）で培養する場合には、１〜５×１０６細胞を播種し、３７℃で、１〜５日間、好ましくは３日間、適当な媒体中で培養することによって高密度培養を達成することができる。
【００１６】
上記した、凝集体の培養及び高密度培養において使用可能な媒体としては、腸管細胞が生存し得て、且つ分化やアポトーシスの誘導が抑制されている状態を維持できるものであれば特に限定されず、当分野で通常用いられる細胞培養用培地（ダルベッコ改変イーグル培地、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０培地、ハムＦ−１２培地等）をベースとし、必要に応じて各種の成分を補充したものが用いられる。特に、血清、抗生物質、増殖因子等の成分を補充することが好ましい。
【００１７】
媒体中に含められる好適な成分としては、５〜２０％、好ましくは１０％の血清、０．５〜２μｇ／ｍＬ、好ましくは１μｇ／ｍＬのインスリン、１×１０−８〜１×１０−６ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１×１０−７ｍｏｌ／Ｌのデキサメサゾン、５〜１５ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１０ｍｍｏｌ／Ｌのニコチンアミド、１〜５ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン、１０〜１００μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは５０μｍｏｌ／Ｌのβ−メルカプトエタノール、ペニシリン／ストレプトマイシン等が挙げられる。いずれも商業的に入手可能である。血清としては、ウマ、ウシ由来の血清等が使用され、好ましくは胎児血清である。インスリンとしては、ウシ、ブタの膵臓から生産されたインスリンや、遺伝子組み換え技術により生産されたインスリンのいずれも使用できるが、安定な品質と供給という点から組換え型インスリンを用いることが好ましい。
【００１８】
本発明の第２の特徴は、選択的に腸管幹／前駆細胞を増殖、取得又は培養するために、腸管細胞の培養を、ＥＧＦ（上皮増殖因子）存在下で行うことである。
【００１９】
ＥＧＦは、Ｃｏｈｅｎらによってマウス胎児の早期眼開裂作用を持つ物質としてマウス顎下腺より単離同定され、ついで尿よりヒトＥＧＦが発見された(S. Cohen and G. Carpenteret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 72, 1317, 1975; H. Gregory, Nature, 257, 325, 1975)。遺伝子構造も詳細に解明されている(G. I. Bell et al., Nucleic Acids Res., 14, 8427, 1986)。ＥＧＦは、５３アミノ酸残基及び３つの分子内ジスルフィド結合からなる６０４５Ｄａの蛋白質であり、細胞表面に存在するＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）にリガンドとして結合し、細胞の成長と増殖の調節に重要な役割を果たす。本発明で用いるＥＧＦは選択的に腸管幹／前駆細胞を増殖、取得又は培養することを可能にする限り、その由来は特に限定されず、天然由来のものであっても公知の遺伝子配列やアミノ酸配列等の情報に基づいて合成又は半合成して製造されるものであってもよい。商業的に入手可能なものであってもよい。マウスの幹／前駆細胞を対象とする場合にはマウスの、ヒトの幹／前駆細胞を対象とする場合にはヒトのＥＧＦをそれぞれ用いることが好ましいが、必ずしも動物種を一致させる必要はない。腸管幹／前駆細胞を選択的に増殖、取得又は培養することが可能な範囲で、ＥＧＦは改変されたものであってもよい。このような改変には、１個又は複数個のヌクレオチドあるいはアミノ酸の変異、挿入、欠失及び置換が含まれる。改変されたＥＧＦは、当分野で通常実施される手段によって調製することができる。例えば、エキソヌクレアーゼを用いる欠失変異株（ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ）作製法、カセット変異法等の部位特異的変異（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によってＥＧＦ ＤＮＡを人為的に改変させ、該改変ＥＧＦ ＤＮＡを用いて、所望蛋白質を調製することができる。
【００２０】
ＥＧＦは、腸管幹／前駆細胞を取得するために腸管細胞を培養する過程を通じて持続的に媒体中に含めておくことが好ましいが、特に凝集体を形成し、その後長期間培養し増殖させる間は必須的に媒体中に含める。ＥＧＦの媒体中の濃度は、２０〜４０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ程度である。
【００２１】
ＥＧＦを含有する培養液中で培養することによって、市販の腸管細胞、例えば上述のヒト小腸上皮細胞（Cat No. CS-ABI-519）からもまた、腸管幹／前駆細胞を得ることができる。市販されているヒト小腸上皮細胞を用いた場合には、凝集体の形成や高密度での培養を必要とすることなく、ＥＧＦを含有する培養液、特に２０〜４０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦに加えて、５〜２０％、好ましくは１０％の血清、０．５〜２μｇ／ｍＬ、好ましくは１μｇ／ｍＬのインスリン、１×１０−８〜１×１０−６ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１×１０−７ｍｏｌ／Ｌのデキサメサゾン、５〜１５ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１０ｍｍｏｌ／Ｌのニコチンアミド、１〜５ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン、１０〜１００μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは５０μｍｏｌ／Ｌのβ−メルカプトエタノールを含む培養液を用いて継代培養することによって腸管幹／前駆細胞を取得することができる。
【００２２】
１０％ウシ胎児血清、インスリン（１μｇ／ｍＬ）、デキサメサゾン（１×１０−７ｍｏｌ／Ｌ）、ニコチンアミド（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）、Ｌ−グルタミン（２ｍｍｏｌ／Ｌ）、β−メルカプトエタノール（５０μｍｏｌ／Ｌ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）＋ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）及びＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）を補充したダルベッコ改変培地−ハムＦ１２の混合培地（１：１）は、腸管細胞を培養する為の媒体（培養液）の好適な一例である。
【００２３】
上記で得られた、細胞凝集体を普通のペトリディッシュに再播種し、ＥＧＦを含有する媒体（培養液）中で３７℃で、２〜６ヶ月、好ましくは３ヶ月程度培養する。成体の腸管由来の細胞は凝集体を形成しにくいので、高密度培養によって細胞を凝集しているのに等しい状態にする。成体の腸管に由来する細胞は、ＥＧＦを含有する培養液中で３７℃で、６〜１２ヶ月、好ましくは８ヶ月程度高密度培養する。
【００２４】
長期にわたる凝集体の培養あるいは高密度培養を続けると、線維芽細胞様の細胞に対し上皮細胞様の細胞が多く見られるようになる。もし線維芽細胞様の細胞が残存している場合には、１〜１０μｇ／ｍＬ、好ましくは４μｇ／ｍＬ程度のモノヨード酢酸で３〜５時間程度処理することによって線維芽細胞様の細胞のみを死滅させることができる。上皮細胞様の細胞の増殖が観察されれば、その後は、細胞培養用の培養容器にて継代し、解析に用いたり、使用時まで凍結保存したりする。
【００２５】
長期にわたる凝集体の培養あるいは高密度培養を続けることによって得られる細胞、あるいはCat No. CS-ABI-519等の市販のヒト小腸上皮細胞をＥＧＦを含有する培養液で継代培養することによって得られる細胞が腸管上皮細胞あるいは腸管幹／前駆細胞であるかの判断は、それらの細胞におけるマーカー蛋白質の発現の有無を調べることによって行うことができる。本明細書中、「マーカー」とは特にことわりのない限り、腸管上皮細胞あるいは腸管幹／前駆細胞に特有な発現様式を示す一連の蛋白質又はそれをコードする遺伝子から構成される群の各々を意味する。かかるマーカー蛋白質は哺乳動物の種類等によってそのアミノ酸配列が異なる場合があるが、本発明においてはその対象となる細胞における発現様式が同じである限り、そのような蛋白質もマーカー蛋白質として使用することができる。上皮細胞のマーカー蛋白質としては、Ｅ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）やＺｏ−１(Laprise P, et al., J Biol Chem. 2004 Mar 12; 279(11):10157-66. Epub 2003 Dec 29.;Escaffit F, et al., Exp Cell Res. 2005 Jan 15;302(2):206-20.)、腸上皮細胞のマーカー蛋白質としては、ビリン（Ｖｉｌｌｉｎ）(Maunoury, R. et al., EMBO J. 7, 3321-3329 (1988).)が挙げられる。腸管幹／前駆細胞のマーカー蛋白質としては、Ｍｕｓａｓｈｉ−１(Potten CS, et al., Differentiation. 2003 Jan;71(1):28-41.)、Ｍａｔｈ−１(Yang Q, et al., Science 294:2155-2158)、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３(Ngn3、Jenny M, et al., EMBO J. 2002 Dec 2;21(23):6338-47.)が挙げられる。
【００２６】
Ｅ−カドヘリンは、上皮系の細胞上に発現しているカルシウム依存性の細胞間接着分子であり、それ同士が結合するホモフィリックな接着により上皮組織の形成、維持に重要な働きをする。Ｚｏ−１は、上皮細胞や内皮細胞に必須である細胞間接着装置タイトジャンクション（ＴＪ）の裏打ち蛋白質として知られており、接着装置の形成やそこを介して細胞増殖の調節に関与していると考えられている蛋白質である。ビリンは、小腸上皮細胞の微絨毛の構成成分であり、フィブリンとともにアクチンを束ねる働きを有している。ビリンは微絨毛にのみ見出される。Ｍｕｓａｓｈｉ−１は、神経系前駆細胞によって発現されるＲＮＡ結合蛋白質であり、腸管の幹／前駆細胞にも発現しているという報告がある。Ｍａｔｈ−１は、ｂＨＬＨ型の転写因子であり、マウス腸管における分泌細胞系への分化に必要であることが知られ、腸管幹／前駆細胞に発現している。同様にｂＨＬＨ型転写因子であるＮｇｎ３は膵内分泌細胞、胃腸管組織の発生に重要であり、腸管幹／前駆細胞に発現している。
【００２７】
本発明において、腸管上皮細胞又は腸管幹／前駆細胞であることの確認は、これらのマーカー蛋白質及び／又はそれをコードする遺伝子の発現を、各マーカー蛋白質又はそれをコードする遺伝子に特異的親和性を有する物質を用いて解析する工程を含むことによって行うことができる。本明細書中、「用いて」という用語について、その方法は特に限定されず、具体的には、例えばマーカー蛋白質に特異的親和性を有する物質を用いる場合であれば該マーカー蛋白質の抗体との抗原抗体反応を利用する方法が挙げられ、又、マーカー蛋白質をコードする遺伝子に特異的親和性を有する物質を用いる場合であればハイブリダイゼーション反応を利用する方法が挙げられる。
【００２８】
マーカー蛋白質に特異的親和性を有する物質としては例えば当該蛋白質に特異的親和性を有する抗体又はその断片が挙げられ、その特異的親和性とは抗原・抗体反応により該蛋白質を特異的に認識し、結合する能力のことである。該抗体又はその断片は、当該蛋白質と特異的に結合可能なものであれば特に限定されず、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びそれらの機能的断片のいずれであってもよい。これらの抗体あるいはその機能的断片は、通常当分野で行なわれている方法によって製せられる。例えばポリクローナル抗体を用いる場合であれば、該蛋白質をマウスやウサギといった動物の背部皮下あるいは腹腔内あるいは静脈等に注射して免疫し、抗体価が上昇するのを待った後に抗血清を採取する方法が挙げられ、またモノクローナル抗体を用いる場合であれば、常法に従いハイブリドーマを作製して、その分泌液を採取する方法が挙げられる。抗体断片を製造する方法としてはクローニングした抗体遺伝子断片を微生物等に発現させる方法がよく用いられている。当該抗体、抗体断片等の純度は、当該蛋白質に対する特異的親和性を保持している限り、特に限定されない。これらの抗体又はその断片は、蛍光物質、酵素やラジオアイソトープ等で標識されていてもよい。
さらに、これらは市販されているものを用いても良い。
【００２９】
マーカー蛋白質をコードする遺伝子に特異的親和性を有する物質としては、例えば当該遺伝子に特異的親和性を有するオリゴ又はポリヌクレオチドプローブ（以下、便宜上単にプローブともいう）、ならびにオリゴ又はポリヌクレオチドプライマー対（以下、便宜上単にプライマー対ともいう）が挙げられ、その特異的親和性とは、目的の遺伝子にのみハイブリダイズする性質を意味し、従って当該遺伝子の全部もしくは一部に完全相補的なものか、もしくは上記性質を満たす範囲で１乃至数個のミスマッチを含んでいても良い。該プローブ、プライマー対は、当該遺伝子に特異的親和性を有するものであれば特に限定されないが、例えば当該遺伝子の塩基配列の全部もしくは一部、ならびにそれらの相補配列を含むオリゴ又はポリヌクレオチド等が挙げられ、検出すべき遺伝子の形態に応じて適宜選択する。当該オリゴ又はポリヌクレオチドは当該遺伝子に対する特異的親和性を有している限りはその由来は特に限定されず、合成されたものであっても、当該遺伝子から必要な部分を切り出し、通常行なわれる方法によって精製されたものであってもよい。これらのオリゴ又はポリヌクレオチドは、蛍光物質、酵素やラジオアイソトープ等で標識されていてもよい。
【００３０】
又、腸管幹／前駆細胞ではβ−カテニンの転写活性がみられる(He XC, et al., Nat Genet. 2004 Oct;36(10):1117-21.)ので、この活性を指標に幹／前駆細胞であることを確認することもできる。例えば、ＴＣＦ／ｂ−ｃａｔｅｎｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅによってβガラクトシダーゼ遺伝子がドライブされるコンストラクト（ＴＯＰＧＡＬ）を細胞に導入し、Ｘ−ｇａｌ染色により陽性細胞を検出する方法が利用できる。
【００３１】
本発明では、腸管細胞の凝集体（あるいは高密度培養した細胞）をＥＧＦを含有する培養液中で培養することによって、腸管幹／前駆細胞を選択的に増殖させることができ、すなわち該幹／前駆細胞を効率よく取得することができる。さらに該幹／前駆細胞の自己複製能及び多分化能は長期間安定に維持される。本発明の方法により得られた腸管幹／前駆細胞が自己複製能を維持していることは、細胞数の計測、光学顕微鏡下での観察等、細胞増殖を測定し得る種々の公知技術を用いて、培養容器中での腸管幹／前駆細胞の増殖を観察することによって容易に判断することができる。腸管幹／前駆細胞が多分化能を維持していることは、該幹／前駆細胞を分化誘導した場合に腸上皮組織を構築する複数種の細胞が得られるかどうかで判断することができる。腸上皮組織を構築する細胞としては、腸内分泌細胞（ガストリン分泌細胞、セロトニン分泌細胞、クロモグラニンＡ分泌細胞、セクレチン分泌細胞、ソマトスタチン分泌細胞、ＧＩＰ（ｇａｓｔｒｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）分泌細胞、ＣＣＫ（ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ）分泌細胞等）及び粘液分泌細胞（ゴブレット細胞、パネート細胞等）、栄養素の吸収作用を担う腸細胞が挙げられる。各細胞に特異的に発現している成分を該成分に特異的な親和性を有する物質を用いて検出することによって、あるいは分泌成分を直接解析することによって目的の細胞であるか否かを判定することができる。「特異的な親和性を有する物質」としては、各分泌成分に特異的親和性を有する抗体又はその断片や、各分泌成分をコードする遺伝子に特異的親和性を有するオリゴ又はポリヌクレオチドプローブが挙げられる。「抗体又はその断片」及び「オリゴ又はポリヌクレオチドプローブ」の詳細は上記に準じる。
ゴブレット細胞に関しては、ＰＡＳ染色やアルシアンブルー染色等の染色法によっても判定することができる。
【００３２】
腸管幹／前駆細胞の、腸管上皮組織を構築する細胞への分化誘導は、培養液中からＥＧＦを除去することによって簡便に実施することができる。具体的にはＥＧＦを含有する培養液をＥＧＦを含有しない培養液と培地交換することによって行うことができる。培地交換しておよそ１週間程度で細胞の分化誘導を確認することができるが、分化誘導に要する期間は、細胞の状態や、分化する細胞のタイプ等によって変動し得る。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例にそって本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。また、本発明において使用する試薬や装置、材料は特に言及されない限り、商業的に入手可能である。
【００３４】
実施例１：胎児腸管由来の腸管幹／前駆細胞の取得
胎生１４．５日のマウス胎児から腸管を取り出し、メスで細かく切り刻み腸組織片とした。得られた腸組織片を、１ｍＭ ＥＧＴＡの入ったＨａｎｋ’ｓ溶液に入れ、３７℃のウォーターバスで１０分間振とうした後、遠心分離によってＰＢＳで１回洗浄した。遠心分離した後、腸組織片を、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ溶液（５ｍＭ ＣａＣｌ２の入ったＨａｎｋ’ｓ溶液に溶解したもの）を加え、３７℃のウォーターバスで１５〜２０分間振とうした。軽くピペッティングした後にメッシュを通して未消化組織を除いて細胞分散液を得た（マウス胎児由来の腸管細胞）。
調製したマウス胎児由来の腸管細胞を２〜４×１０５細胞／ウェルの濃度で低接着性の９６ウェル丸底ディッシュ（Ｌｏｗ Ｃｅｌｌ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｌａｔｅｓ，ｃａｔ ｎｏ：１４５３９９；Ｎｕｎｃ）に播種し、ダルベッコ改変イーグル培地とＦ−１２培地とを１：１の割合で含有する培養液〔１０％ウシ胎仔血清、１μｇ／ｍＬ インスリン、１×１０−７ｍｏｌ／Ｌ デキサメサゾン、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ニコチンアミド、２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ−グルタミン、５０μｍｍｏｌ／Ｌ β−メルカプトエタノール、ペニシリン／ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬ（ペニシリン）＋１００μｇ／ｍＬ（ストレプトマイシン））、２０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ，Ｅ９６４４）を含む〕中で、３７℃、５％ＣＯ２存在下、インキュベーター内で培養した。以後、ＥＧＦを含有するこの培地をＥＧＦ（＋）培地、あるいは腸管幹／前駆細胞培養用培地とも称する。
２日後、９６ウェル丸底ディッシュに播種したマウス胎児腸管細胞が集合して細胞塊を形成した（図１ａ）。その後、形成した細胞塊を低接着性の６ｃｍディッシュ等に移したりしながら、さらに５日間程度培養後、それら細胞塊をペトリディッシュ（ＢＤ，３５−１００７）に移し、上記ＥＧＦ（＋）培地中、３７℃、５％ＣＯ２存在下、インキュベーター内で培養を続けた（図１ｂ）。ここで用いたペトリディッシュは、接着細胞用の処理を行っていない（しかし低接着性処理も行っていない）普通のペトリディッシュである。一方低接着性ディッシュを用いず、細胞分散液をすぐに接着性のペトリディッシュに播種し、上記ＥＧＦ（＋）培地中で培養した場合には線維芽細胞様の細胞のみディッシュに残った（図１ｃ）。
凝集体を普通のペトリディッシュに移して３ヶ月程度培養を続けると、線維芽細胞様の細胞に対し、上皮細胞様の細胞が多く見られるようになった。もし線維芽細胞様の細胞が残存している場合は、モノヨード酢酸（４μｇ／ｍＬ）で３〜５時間程度処理することで線維芽細胞様の細胞を死滅させることができる。
得られた上皮細胞様の細胞は、細胞培養用ディッシュにて継代し（図２）、解析（後述する）や凍結保存に用いた。
又、後述の実施例からも明らかなように、この上皮細胞様の細胞は、自己複製能、多分化能を有する幹／前駆細胞を含んでいることから、便宜上、ＦＩＰ（Ｆｅｔａｌ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）細胞とも、以後、称する。
【００３５】
実施例２：成体腸管由来の腸管幹／前駆細胞の取得
成体マウスから取り出した腸管の内部を、２３Ｇの針を使ってＰＢＳで洗浄し、その後、腸管にハサミを入れて管を開き、シート状にし、さらにハサミで５ｍｍ四方程度に切り分けた（腸組織片）。得られた腸組織片を用いて実施例１と同様にして、ＥＧＴＡ、コラゲナーゼ及びピペッティング処理によって細胞分散液を得た（成体マウス腸管細胞）。
成体由来の腸管細胞は、細胞塊を形成しにくいので、単層で凝集させて培養した。すなわち、直径６ｃｍのペトリディッシュ（接着細胞用の処理を行っていない（しかし低接着性処理も行っていない）普通のペトリディッシュ）に１〜５×１０６細胞を播種して、高密度培養を行った。実施例１と同組成の培養液を用い３７℃、５％ＣＯ２存在下、インキュベーター内で培養した。
高密度培養を８ヶ月程度続けると、線維芽細胞様の細胞に対し、上皮細胞様の細胞が多く見られるようになった。もし線維芽細胞様の細胞が残存している場合は、モノヨード酢酸（４μｇ／ｍＬ）で３〜５時間程度処理することで線維芽細胞様の細胞を死滅させることができる。
得られた上皮細胞様の細胞は、細胞培養用ディッシュにて継代し、解析や凍結保存に用いた。
【００３６】
実施例３：増殖能
ＦＩＰ細胞の増殖能について調べた。ＦＩＰ細胞を、種々の濃度（０ｎｇ／ｍＬ〜８０ｎｇ／ｍＬ）でＥＧＦを含有する培養液中で培養した。培養液は、ＥＧＦの濃度が異なること以外は、実施例１で用いた培養液と同じ組成である。ＥＧＦを含まない培養液中で２日間培養した細胞（図３ａ）、ＥＧＦを２０ｎｇ／ｍＬの濃度で含む培養液中で２日間培養した細胞（図３ｂ）を示す。又、１２ウェルの培養プレートに播種し、各種濃度でＥＧＦを含む培養液中で１日間培養した細胞をトリプシン−ＥＤＴＡではがしてその数を血球計算板により計測した（図３ｃ）。
腸管細胞由来の上皮細胞様の細胞の増殖がＥＧＦ依存性であることが示された。
【００３７】
実施例４：増殖とアポトーシス
ＦＩＰ細胞をＥＧＦ（＋）培地（ＥＧＦ濃度２０ｎｇ／ｍＬ）中、細胞培養用ディッシュ上で２日間培養した（図４ａ）。同じ状態のものを２セット用意した。ＥＧＦ存在下で２日間培養した後、一方は、同じＥＧＦ（＋）培地で培地交換してさらに１日間培養し（図４ｂ）、もう一方はＥＧＦを含まない培養液に培地交換してさらに１日間培養した（図４ｃ）。ＥＧＦ存在下では細胞は増殖を続けたが、ＥＧＦ非存在下では細胞の増殖は抑えられ、死ぬ細胞が確認された。一連の過程における細胞の増殖能の変化を、ＢｒｄＵ免疫染色法により確認した。核染色剤であるＤＡＰＩを用いて二重染色した（図５ａ〜ｆ）。
ＥＧＦ存在下で２日間培養した後、一方は、ＥＧＦを含まない培養液に培地交換してさらに１日間培養し、もう一方は同じＥＧＦ（＋）培地で培地交換してさらに１日間培養した。その後、ＢｒｄＵ（１０μＭ）（Ｓｉｇｍａ，Ｂ９２８５）を培地に添加し、１．５時間経過後にＢｒｄＵを取り込んだ増殖細胞の割合をフローサイトメトリーおよび免疫染色にて解析した。フローサイトメトリー解析は、ＢｒｄＵ Ｆｌｏｗ Ｋｉｔ （ＢＤ，５５２５９８）のマニュアルに沿って細胞を標識後、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＢＤ）を用いて行った。この際、ゲートの設定はネガティブコントロールを指標にして行った。ＢｒｄＵの免疫染色は、ＢｒｄＵ Ｆｌｏｗ Ｋｉｔの試薬と抗ＢｒｄＵ抗体（×５０）（ＢＤ，３４７５８０）、Ｃｙ３をコンジュゲートしたロバ抗マウスＩｇＧ抗体（×２００）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ｃａｔ ｎｏ．７１５−１６５−１５０）、およびＤＡＰＩ（１μｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ，Ｄ９５４２）を用いて行い、蛍光顕微鏡で観察した。ＥＧＦ非存在下で培養した細胞についてはＢｒｄＵの取り込みが顕著に減少しており、増殖能が低下したことが明らかとなった（図５ａ〜ｆ）。
また、ＥＧＦを培養液から除くと、死ぬ細胞が確認されたことから、ＥＧＦ非存在下でのアポトーシス誘導について調べた（図５ｇ〜ｈ）。
ＢｒｄＵの解析時と同様に細胞を培養した。細胞をディッシュから回収した後、冷ＰＢＳにて細胞を１回洗い、アネキシンＶ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（１×）（ＢＤ，５５６４５４）にて細胞懸濁液を調製した。そこへ７−ＡＡＤ（５μＬ；ＢＤ，５５９９２５）とＡＰＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ アネキシンＶ（５μＬ；ＢＤ，５５０４７４）を添加し、室温にて１５分間反応させた（遮光）。染色した細胞はＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＢＤ）を用いて解析した。ゲートの設定はネガティブコントロールを指標にして行った。アネキシンＶはリン脂質結合性タンパク質である。アポトーシスを起こした細胞は細胞膜表面にホスファチジルセリンを露出するようになり、そこにアネキシンＶが結合する。従ってアネキシンＶはアポトーシス細胞に強い親和性を有する。ＥＧＦ非存在下ではアネキシンＶが結合する細胞が顕著に増加しており、アポトーシス誘導が起こっていることが示された（図５ｇ〜ｈ）。
ＦＩＰ細胞は、ＥＧＦの存在下、活発に分裂増殖したが、ＥＧＦを含まない培養条件では増殖活性が著しく減少し、アポトーシスを起こす細胞が増加した。
【００３８】
実施例５：マーカー蛋白質の発現
ＦＩＰ細胞における種々のマーカー蛋白質の発現について調べた。各マーカー蛋白質の発現は、各蛋白質の抗体をそれぞれ用いて免疫染色法により調べた。尚、細胞の存在を示す為に、核染色剤であるＤＡＰＩで二重染色した。
細胞をＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（ＰＢＳ中）で５分間、室温で固定した。続いて、２５％アセトン（メタノール中）で１分間、室温で処理した。固定後、細胞を０．０５％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ ２０）（Ｗａｋｏ）を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で洗浄し、続いて、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）で１時間、室温で処理した。非特異的な結合は、１０％のロバ血清（Ｓｉｇｍａ，Ｄ９６６３）で１時間、室温で処理することによりブロッキングした。固定した細胞を１次抗体と湿室内で１６時間、４℃でインキュベートした。細胞を、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、ブロッキングした後、さらに２次抗体と４時間、４℃でインキュベートした。室温でＤＡＰＩと５分間インキュベートし、洗浄後、細胞を蛍光顕微鏡で観察した。
用いた抗体は以下の通り。
（１次抗体）
抗Ｅ−カドヘリン抗体：ＢＤ，６１０１８１（２次抗体、マウス用）；×１００
抗Ｚｏ−１抗体：Ｚｙｍｅｄ，６１−７３００（２次抗体、ウサギ用）；×１００
抗ビリン抗体：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ｓｃ−７６７２（２次抗体，ヤギ用）；×１０
抗Ｍｕｓａｓｈｉ−１抗体： Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＡＢ５９７７（２次抗体、ウサギ用）；×１００
（２次抗体）
マウス用：Ａｌｅｘａ ４８８が結合したロバ抗マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ａ２１２０２）；×２００
ウサギ用：Ａｌｅｘａ ４８８が結合したロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ａ２１２０６）；×２００
ヤギ用：Ａｌｅｘａ ４８８が結合したロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ａ１１０５５）；×２００
ＦＩＰ細胞は、全細胞において上皮細胞のマーカーであるＥ−カドヘリンやＺｏ−１、及び、腸上皮細胞のマーカーであるビリンを発現していた。また、一部の細胞は腸管幹／前駆細胞マーカーと考えられているＭｕｓａｓｈｉ−１を発現していた（図６）。
【００３９】
実施例６：βカテニン転写活性化
ＴＣＦ／ｂ−ｃａｔｅｎｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅによってβガラクトシダーゼ遺伝子がドライブされるコンストラクト（ＴＯＰＧＡＬ）をリポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１１６６８）を用いて細胞に導入し、Ｘ−ｇａｌ染色により陽性細胞を検出した。具体的には以下の手順で行った。
（１） 細胞をＰＢＳで洗浄（×２）
（２） 固定液（２％ＰＦＡ／０．２％グルタルアルデヒド（ＧＡ）／０．０５％ＮＰ−４０／ＰＢＳ）を添加（６ウェルプレートの１ウェルあたり１．５〜２ｍＬ）
（３） １分間室温で放置
（４） ＰＢＳで洗浄（×２）
（５） Ｘ−ｇａｌ溶液を添加（６ウェルプレートの１ウェルあたり１．５〜２ｍＬ）
（６） ３７℃のインキュベーター中で放置（少なくとも３時間〜一晩）
（７） ＰＢＳで洗浄（×２）することで反応を停止させる
（８） 観察（写真撮影）、ＰＢＳ中４℃で保存
（固定液の調製）
以下の割合で各成分を混合して固定液を調製した。
２０％ ＰＦＡ／ＰＢＳ １ｍＬ（−２０℃保存）
２５％ ＧＡ ８０μＬ（−２０℃保存）
５％ ＮＰ−４０ ８０μＬ（室温保存）
ＰＢＳ ９ｍＬ（室温保存）
（Ｘ−ｇａｌ溶液の調製）
以下の割合で各成分を混合してＸ−ｇａｌ溶液を調製した。
５００ｍＭ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６ ５０μｌ（室温保存、遮光保存）
５００ｍＭ Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６ ５０μｌ（室温保存、遮光保存）
１Ｍ ＭｇＣｌ２ １０μｌ（室温保存）
２０ｍｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌ ２５０μｌ（−２０℃保存、遮光保存）
ＰＢＳ ４．７ｍｌ（室温保存）
Ｘ−ｇａｌ陽性細胞が検出され、βカテニンの転写活性化が確認された（図７）。
【００４０】
実施例７：腸上皮組織を構築する細胞への分化誘導
ＦＩＰ細胞をコンフルエントな状態になるまで培養した。コンフルエントになった状態からＥＧＦを除くと、アポトーシスを起こす細胞の中で生き残る細胞が存在した。これら生き残った細胞をＥＧＦ非存在下で培養し続けると分化した腸上皮様細胞の特徴を示す細胞が出現してきた（図８）。
この状態の細胞をＰＡＳ染色すると、ＥＧＦ非存在下で培養し続けた細胞において赤紫色に染色される細胞が多数出現した（図９）。ＰＡＳ染色は、糖質に含まれる１，２グリコール基群を過ヨウ素酸で酸化し、生じた２分子のアルデヒド基がシッフ試薬１分子と結合して、赤紫色の化合物を形成する２つの反応を利用したものであり、グリコーゲン、中性粘液多糖類、糖蛋白質、粘液蛋白質、糖脂質等の検出に用いられる。腸上皮組織においては、粘液分泌細胞の１種であるゴブレット細胞を染め分けることが知られている。具体的には以下の手順で行った。尚、各試薬については当分野で通常ＰＡＳ染色を行う際に用いられている試薬を使用することができる。
（１） 細胞をＰＢＳで洗浄（×１）
（２） ０．５％過ヨウ素酸で室温７分間処理
（３） ミリＱ水で洗浄（×５）
（４） シッフ試薬で室温７〜１０分間処理
（５） 亜硫酸水で処理（室温１分間処理を３回繰り返す）
（６） ミリＱ水で洗浄（×５）
（７） ヘマトキシレンで処理（室温で１分間）
（８） ミリＱ水で洗浄（×５）
又、各腸上皮組織において分泌、発現している蛋白質に対する抗体を用いて免疫染色を行い、該蛋白質の発現状況を解析した。用いた各蛋白質の抗体は以下の通り。尚、細胞の存在を示す為に、核染色剤であるＤＡＰＩで二重染色した。
（１次抗体）
抗セロトニン抗体：Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｒ，２００８０（２次抗体、ウサギ用）；×１０
抗クロモグラニンＡ抗体：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ｓｃ−１４８８（２次抗体、ヤギ用）；×１０
抗ガストリン抗体：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ｓｃ−７７８３（２次抗体、ヤギ用）；×１０
抗セクレチン抗体：Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＡＢ９８１（２次抗体、ウサギ用）；×１００
抗ソマトスタチン抗体：ＡＦＦＩＮＩＴＩ，ＳＡ１２６８（２次抗体、ウサギ用）；×１０
抗ＧＩＰ抗体：Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＡＢ９５３（２次抗体、ウサギ用）；×１０
抗リゾチーム抗体：Ｄａｋｏ，Ａ００９９（２次抗体、ウサギ用）；×１００
抗シナプトフィジン抗体：Ｄａｋｏ，Ａ００１０（２次抗体，ウサギ用）；×１０
（２次抗体）
ウサギ用：Ａｌｅｘａ ４８８が結合したロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ａ２１２０６）；×２００
ヤギ用：Ａｌｅｘａ ４８８が結合したロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ａ１１０５５）；×２００
結果、ＥＧＦ非存在下で培養すると、腸内分泌細胞に特徴的なセロトニン、クロモグラニンＡ、ガストリン、セクレチン、ソマトスタチン、ＧＩＰを発現している細胞が検出され、粘液分泌細胞の１種であるパネート細胞に特徴的なリゾチーム及びシナプトフィジンを発現している細胞が検出された。これらの結果より、ＦＩＰ細胞の培養液からＥＧＦを除去することにより腸内分泌細胞への分化が誘導されたことがわかる。
【００４１】
実施例８：ＲＴ−ＰＣＲによる解析
上記した実施例より、ＦＩＰ細胞には、腸管幹／前駆細胞が含まれていることが示され、さらにＥＧＦ存在下で、該幹／前駆細胞は増殖を続け、ＥＧＦを培養液中から除去することにより、細胞はアポトーシスを引き起こし、又、種々の腸上皮組織を構築する細胞へと分化することがわかった（模式図を図１０に示す）。
ＦＩＰ細胞、及び各発生段階（胎生１４．５日目、新生児、成体）にあるマウスの腸組織を用いて、腸管の細胞分化に関与すると考えられる遺伝子の発現プロファイルをＲＴ−ＰＣＲによって解析した。
ＦＩＰ細胞をＥＧＦ（＋）培地で培養後、コンフルエントになった時点でＥＧＦを含まない培地に培地交換し、その後１週間培養した。その細胞からＲＮＡを抽出（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ；ＱＩＡＧＥＮ）し、逆転写酵素反応（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ）によりｃＤＮＡを得た。腸組織からのＲＮＡ抽出では、ホモジナイザー（ポリトロン）を用いて組織を破砕後に同様の方法で抽出と逆転写酵素反応を行った。続いて、それらのｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、各種分化マーカーの発現を解析した。
目的とするマーカーならびにそのプライマーを表１に示す。
【００４２】
【表１】
【００４３】
ＰＣＲサイクルは、９５℃（４分間）→［９４℃（１分間）→５６℃（１分間）→７２℃（１分間）］×４５サイクル→７２℃（１０分間）である。ＰＣＲにより産生された核酸は、２％アガロースゲルにて展開し、解析した。結果を図１１に示す。
【００４４】
実施例９：単一細胞レベルでの解析
上記した実施例３〜７での実験はｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓな細胞集団での解析であったので、腸管幹／前駆細胞の解析を厳密に行うためには、単一細胞レベルでの解析が必要であると考えた。そこで、フローサイトメトリーを用いてＦＩＰ細胞をクローンソーティングし、９６ウェルディッシュの各ウェルにて単一細胞培養を試みた。増殖してきたクローンのひとつを用いて同様にして、増殖能、マーカー蛋白質の発現及び分化誘導について調べた。
その結果、単一コロニーから増殖させた細胞についても、Ｅ−カドヘリンやＺｏ−１、ビリンを全細胞で発現し、また一部のコロニーについてはＭｕｓａｓｈｉ−１を発現していた。さらにＥＧＦ依存的な増殖活性や細胞死抑制を示し、さらに、ＥＧＦ非存在下で複数の腸上皮細胞マーカーを発現するようになった。このように、単一細胞レベルの解析においても増殖能や多分化能が示されたことで、ＦＩＰ細胞には腸管幹／前駆細胞が含まれることが確認された。
以上の結果より、ＦＩＰ細胞集団には、自己複製能及び多分化能を有する幹／前駆細胞が含まれ、長期間安定に維持され得ることが示された。本願発明の方法を用いることによって腸管上皮細胞の幹／前駆細胞を選択的に増殖させることが可能となった。かかる選択的増殖によって、効率的に腸管幹／前駆細胞を取得・培養することができる。
【００４５】
実施例１０：ヒト小腸上皮細胞からの腸管幹／前駆細胞の取得
本実施例では、ＡＣＢＲＩにより分離され、日本では大日本住友製薬株式会社から供給されているヒト小腸上皮細胞（Cat No. CS-ABI-519）を用いた。この細胞を添付のデータシートに記載された方法に従って培養ディッシュに播種し培養した（図１２ａ）。培養ディッシュは、タイプＩＶコラーゲンコートされたディッシュを用いた。培養液として、データシートに記載され、添付されている培地、すなわちＣＳ−２．０基礎培地に添加剤を加えたもの（以下、CS-2.0 + supplement）を用いた。当該処理は、２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ存在下で行なった。
CS-2.0 + supplementを用いて培養したところ継代を２回行なった時点で細胞は培養ディッシュに接着せず、全て死滅してしまった（図１２ｃ，ｅ）。
そこで、実施例１で調製した、マウス胎児由来の腸管細胞を培養するのに用いたＥＧＦを含有する培地（腸管幹／前駆細胞培養用培地）を用いて同様にして継代培養したところ、継代を重ねても培養ディッシュに接着し、増殖維持することができる細胞が得られた（図１２ｂ，ｄ）。
これらの細胞は、購入したヒト上皮細胞集団中に含まれる腸管幹／前駆細胞であると考えられたので、便宜上、ｈＡＩＰ（human adult intestine progenitor）細胞とも、以後、称する。
【００４６】
実施例１１：マーカータンパク質の発現とβカテニン転写活性化
ｈＡＩＰ細胞について、実施例５と同様にしてマーカータンパク質の発現について調べた。
【００４７】
ｈＡＩＰ細胞は、全細胞において上皮細胞のマーカーであるＥ−カドヘリンやＺｏ−１、及び、腸上皮細胞のマーカーであるビリンを発現していた。また、一部の細胞は腸管幹／前駆細胞マーカーと考えられているＭｕｓａｓｈｉ−１を発現していた（図１３、上段）。
また、ｈＡＩＰ細胞について、実施例６と同様にして、βカテニンの転写活性化の有無を確認した。Ｘ−ｇａｌ陽性細胞が検出され、βカテニンの転写活性化が確認された（図１３、下段）。
【００４８】
実施例１２：増殖能
実施例３と同様にしてｈＡＩＰ細胞の増殖能について調べた。実施例１で用いたＥＧＦ（＋）培地、及びＥＧＦを含まない以外は同じ組成のＥＧＦ（−）培地でそれぞれ４日間培養した。ＥＧＦの存在下ではｈＡＩＰ細胞は活発に分裂増殖するが、ＥＧＦを含まない培養条件では増殖活性が低下し、アポトーシスを起こす細胞が増加した（図１４）。
この結果から、ＥＧＦはｈＡＩＰ細胞の自己複製を促進し、細胞死を抑制することで、培養下における維持を可能にしていることがわかる。
【００４９】
実施例１３：増殖とアポトーシス
ｈＡＩＰ細胞をＥＧＦ（＋）培地（ＥＧＦ濃度２０ｎｇ／ｍＬ）中、４日間培養した。同じ状態のものを２セット用意した。ＥＧＦ存在下で４日間培養した後、一方は、同じＥＧＦ（＋）培地で培地交換してさらに１日間培養し（図１５Ａ，左）、もう一方はＥＧＦを含まない培養液に培地交換してさらに１日間培養した（図１５Ａ，右）。ＥＧＦ存在下では細胞は増殖を続けたが、ＥＧＦ非存在下では細胞の増殖は抑えられ、死ぬ細胞が確認された。一連の過程における細胞の増殖能の変化を、ＢｒｄＵ免疫染色法により確認した。核染色剤であるＤＡＰＩを用いて二重染色した（図１５Ａ）。
ＥＧＦ存在下で４日間培養した後、一方は、ＥＧＦを含まない培養液に培地交換してさらに１日間培養し、もう一方は同じＥＧＦ（＋）培地で培地交換してさらに１日間培養した。その後、ＢｒｄＵ（１０μＭ）（Ｓｉｇｍａ，Ｂ９２８５）を培地に添加し、１．５時間経過後にＢｒｄＵを取り込んだ増殖細胞の割合をフローサイトメトリーおよび免疫染色にて解析した。フローサイトメトリー解析は、実施例４で記載した方法に従って行なった（図１５Ｂ，左）。ＢｒｄＵの解析時と同様に細胞を培養し、アネキシンＶとの結合を実施例４で記載した方法に従って解析した。アネキシンＶが結合する細胞をアポトーシスを起こしている細胞とみなし、その割合を調べた（図１５Ｂ，右）。ＥＧＦを培養液中から除くことによって、ＢｒｄＵの取り込みが減少し、すなわち増殖能が低下することがわかる。さらに、ＥＧＦを培養液中から除くことによって、アポトーシスを起こす細胞が増加した。
ｈＡＩＰ細胞の増殖あるいはアポトーシスに及ぼすＥＧＦの影響を確認するために、ＥＧＦを含有する培養液中に、ＥＧＦシグナル伝達系を阻害するＡＧ１４７８、ＰＤ９８０５９、あるいはＬＹ２９４００２を添加した培養液を用いて同様にＢｒｄＵの取り込みとアポトーシス誘導について調べた。
ＰＤ９８０５９（２’−アミノ−３’−メトキシフラボン）は、ＭＥＫ１（ＭＡＰキナーゼ・キナーゼ）に対する選択的で細胞透過性の阻害剤であり、ＭＥＫ１の活性化を阻害する結果、続いて起こるＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２）のリン酸化−活性化を阻害する。使用濃度：１００μＭ。
ＬＹ２９４００２（［２−（４−モルホリニル）−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン］はホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）に対する強力で特異的な細胞透過性阻害剤である。使用濃度：１００μＭ
【００５０】
実施例１４：腸上皮組織を構築する細胞への分化誘導
ｈＡＩＰ細胞は上記した培養条件下で自然に分化誘導され、腸上皮様細胞の特徴を示す細胞が出現してくる。この状態の細胞を実施例７に記載する方法に従ってＰＡＳ染色すると、赤紫色に染色される細胞が多数出現したことから、腸上皮組織であるゴブレット細胞の存在を確認することができた（図１６Ｂ）。
さらに、実施例８と同様な手法で、腸上皮組織を構築する細胞への分化誘導をＲＴ−ＰＣＲ解析により調べた。誘導される腸上皮組織の種類は、図１０に示されている。
ｈＡＩＰ細胞、及びヒト成体小腸からの組織を用いて、腸管の細胞分化に関与すると考えられる遺伝子の発現プロファイルをＲＴ−ＰＣＲによって解析した。目的とするマーカー及びそのためのプライマーは、下記表２に示すヒト用のものを用いた。
【００５１】
【表２】
【００５２】
結果を図１６Ａに示す。
ｈＡＩＰ細胞培養中には、腸上皮組織を構築する複数の腸内分泌細胞や粘液分泌細胞の特徴を示す細胞が観察された。従ってｈＡＩＰ細胞は、培養下で増殖し続けるのと同時に、腸を構成する様々な細胞に分化する多分化能を有することが判明した。
【配列表フリーテキスト】
【００５３】
配列番号１：ビリン（マウス）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号２：ビリン（マウス）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号３：Ｌｆａｂｐ（マウス）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号４：Ｌｆａｂｐ（マウス）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号５：クロモグラニンＡ（マウス）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号６：クロモグラニンＡ（マウス）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号７：Ｔｒｅｆｏｉｌ ｆａｃｔｏｒ−３（マウス）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号８：Ｔｒｅｆｏｉｌ ｆａｃｔｏｒ−３（マウス）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号９：リゾチーム（マウス）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号１０：リゾチーム（マウス）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号１１：シナプトフィジン（マウス）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号１２：シナプトフィジン（マウス）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号１３：Ｍｕｓａｓｈｉ−１（マウス）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号１４：Ｍｕｓａｓｈｉ−１（マウス）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号１５：Ｍａｔｈ−１（マウス）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号１６：Ｍａｔｈ−１（マウス）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号１７：ビリン（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号１８：ビリン（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号１９：Ｌｆａｂｐ（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号２０：Ｌｆａｂｐ（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号２１：シュクラーゼ−イソマルターゼ（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号２２：シュクラーゼ−イソマルターゼ（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号２３：セクレチン（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号２４：セクレチン（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号２５：ＧＩＰ（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号２６：ＧＩＰ（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号２７：ガストリン（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号２８：ガストリン（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号２９：クロモグラニンＡ（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号３０：クロモグラニンＡ（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号３１：ＣＣＫ（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号３２：ＣＣＫ（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号３３：ソマトスタチン（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号３４：ソマトスタチン（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号３５：Ｔｒｅｆｏｉｌ ｆａｃｔｏｒ−３（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号３６：Ｔｒｅｆｏｉｌ ｆａｃｔｏｒ−３（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号３７：リゾチーム（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号３８：リゾチーム（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号３９：シナプトフィジン（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号４０：シナプトフィジン（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号４１：Ｍｕｓａｓｈｉ−１（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号４２：Ｍｕｓａｓｈｉ−１（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号４３：Ｍａｔｈ−１（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号４４：Ｍａｔｈ−１（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号４５：Ｎｇｎ３（Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ−３）（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号４６：Ｎｇｎ３（Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ−３）（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
配列番号４７：ＨＰＲＴ（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（フォワード）である。
配列番号４８：ＨＰＲＴ（ヒト）を検出する為のＰＣＲ用プライマー（リバース）である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】腸管細胞培養の簡単な手順を示す図である。ａは、非接着性培養容器上で形成させた凝集体を示す図（位相差像）である。ｂは、形成させた凝集体を接着細胞用の処理を行っていない（しかし低接着性処理も行っていない）普通のペトリディッシュ上で培養した状態を示す図（位相差像）である。ｃは、凝集体を形成させず、腸管細胞を接着性培養容器上で培養した状態を示す図（位相差像）である。
【図２】一連の操作によって得られた腸管細胞由来の、上皮細胞様の細胞を継代培養して増殖させた状態を示す図（位相差像）である。
【図３】ＦＩＰ細胞のＥＧＦ依存性の増殖能を示した図（位相差像）である。ａはＥＧＦ非存在下で、ｂはＥＧＦ存在下でそれぞれ２日間培養した状態を示す。ｃは細胞をトリプシン−ＥＤＴＡではがして血球計算板により計測した結果を示す。横軸は添加したＥＧＦの濃度を、縦軸は細胞数を示す。
【図４】ＥＧＦ存在下で培養していたＦＩＰ細胞をＥＧＦ非存在下又は引き続きＥＧＦ存在下で培養した場合の細胞の状態を示す図（位相差像）である。ａはＥＧＦ存在下で２日間ＦＩＰ細胞を培養した状態を示す。ＥＧＦ存在下での２日間の培養後、さらにＥＧＦを含む培養液中で１日間（ｂ）、あるいはＥＧＦを含まない培養液中で１日間（ｃ）、それぞれ培養した。
【図５】ＥＧＦ存在下で培養していたＦＩＰ細胞を引き続きＥＧＦ存在下で培養した場合又はＥＧＦ非存在下で培養した場合の細胞の状態を示す図である。ａ及びｂは、それぞれの細胞のＢｒｄＵ取り込みの様子をＢｒｄＵ免疫染色法により調べた結果を表す図（蛍光顕微鏡像）である。ｃ及びｄは、それぞれの細胞をＢｒｄＵ／ＤＡＰＩの二重染色により染色した結果を表す図である（蛍光顕微鏡像）。ｅ及びｆは、ＥＧＦ存在下、あるいは非存在下でのＢｒｄＵの取り込みをＦＡＣＳ解析した結果を表すグラフである。ｇ及びｈは、ＥＧＦ存在下、あるいは非存在下でのアネキシンＶの結合をＦＡＣＳ解析した結果を表すグラフである。
【図６】ＥＧＦ存在下で培養を続けたＦＩＰ細胞における各種マーカー蛋白質（Ｅ−カドヘリン、Ｚｏ−１、ビリン及びＭｕｓａｓｈｉ−１）の発現を調べた結果を示す図である（蛍光顕微鏡像）。
【図７】ＴＣＦ／ｂ−ｃａｔｅｎｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅによってβガラクトシダーゼ遺伝子がドライブされるコンストラクト（ＴＯＰＧＡＬ）を細胞に導入し、Ｘ−ｇａｌ染色により陽性細胞を検出した結果を示す図である。
【図８】ＥＧＦ存在下で培養していたＦＩＰ細胞（ａ，ｃ）からＥＧＦを除去し、さらにＥＧＦ非存在下で７日間培養した細胞（ｂ，ｄ）の状態を示す図（位相差像）である。
【図９】ＦＩＰ細胞をＥＧＦ非存在下で培養し続けた細胞（腸上皮細胞様の細胞）をＰＡＳ染色した像である。ａはコンフルエントな状態になったＦＩＰ細胞を示し、ｂはＥＧＦ非存在下で７日間培養した細胞を示す。
【図１０】ＦＩＰ細胞とＥＧＦとの関係を模式的に示した図である。
【図１１】ＦＩＰ細胞、胎生１４．５日のマウス腸組織、新生児腸組織、成体腸組織における種々の遺伝子発現プロファイルをＲＴ−ＰＣＲ法により調べた結果を示す図である。
【図１２】ヒト小腸上皮細胞（Cat No. CS-ABI-519）をCS-2.0+supplement培地あるいは腸管幹／前駆細胞培養用の培地で継代培養した場合の細胞の様子を示す図である。ａは、CS-2.0+supplement培地中に播種した継代１回目の細胞の様子を、ｂ及びｄは、腸管幹／前駆細胞培養用の培地で２回継代培養を行なった細胞の様子を示している。播種後１日目（ｂ）と５日目（ｄ）の様子である。ｃ及びｅは、CS-2.0+supplement培地で２回継代培養を行なった細胞の様子を示している。播種後１日目（ｃ）と５日目（ｅ）の様子である。位相差像である。
【図１３】上段は、ＥＧＦ存在下で培養を続けたｈＡＩＰ細胞における各種マーカー蛋白質（Ｅ−カドヘリン、Ｚｏ−１、ビリン及びＭｕｓａｓｈｉ−１）の発現を調べた結果を示す図（蛍光顕微鏡像）である。下段は、ＴＣＦ／ｂ−ｃａｔｅｎｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅによってβガラクトシダーゼ遺伝子がドライブされるコンストラクト（ＴＯＰＧＡＬ）を細胞に導入し、Ｘ−ｇａｌ染色により陽性細胞を検出した結果を示す図である。
【図１４】ｈＡＩＰ細胞のＥＧＦ依存性の増殖能を示した図（位相差像）である。ａ及びｃはＥＧＦ存在下で、ｂ及びｄはＥＧＦ非存在下でそれぞれ４日間培養した状態を示す。ｃ及びｄは、それぞれａ及びｂの高倍率像である。
【図１５】ｈＡＩＰ細胞の増殖とアポトーシスに及ぼすＥＧＦの影響を解析した結果を示す図である。図１５ＡはＥＧＦ存在下で培養していたｈＡＩＰ細胞を引き続きＥＧＦ存在下で培養した場合又はＥＧＦ非存在下で培養した場合の細胞の状態を示す図である。それぞれの細胞をＢｒｄＵ／ＤＡＰＩの二重染色により染色した結果を表す（蛍光顕微鏡像）。図１５Ｂは、ＥＧＦ存在下、あるいは非存在下、あるいは種々の阻害剤を用いた場合の、ＢｒｄＵの取り込みをＦＡＣＳ解析した結果、あるいはアポトーシスを起こした細胞をＦＡＣＳ解析した結果を表すグラフである。
【図１６】図１６Ａは、ｈＡＩＰ細胞、ヒト成体腸組織における種々の遺伝子発現プロファイルをＲＴ−ＰＣＲ法により調べた結果を示す図である。図１６ＢはｈＡＩＰ細胞をＰＡＳ染色した像である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸管細胞の凝集体を培養することを含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の取得方法。
【請求項２】
腸管細胞の凝集体を、ＥＧＦを含有する培養液中で培養することを含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の取得方法。
【請求項３】
凝集体が腸管細胞を浮遊培養することによって得られるものである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
以下の工程を含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の取得方法。
（１）腸管から腸管細胞を採取する工程
（２）腸管細胞を浮遊培養することによって細胞塊（凝集体）を調製する工程
（３）腸管細胞の凝集体を、ＥＧＦを含有する培養液中で培養する工程
（４）腸管上皮細胞の幹／前駆細胞マーカーを発現している細胞を腸管上皮細胞の幹／前駆細胞として回収する工程
【請求項５】
腸管上皮細胞の幹／前駆細胞マーカーがＭｕｓａｓｈｉ−１である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
腸管細胞を、血清、インスリン、デキサメサゾン、ニコチンアミド、Ｌ−グルタミン、β−メルカプトエタノール及びＥＧＦを含有する培養液中で培養することを含む腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の取得方法。
【請求項７】
腸管細胞を、ＥＧＦを含有する培養液中、高密度で培養することを含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の取得方法。
【請求項８】
以下の工程を含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の取得方法。
（１）腸管から腸管細胞を採取する工程
（２）腸管細胞を、ＥＧＦを含有する培養液中、高密度で培養する工程
（３）腸管上皮細胞の幹／前駆細胞マーカーを発現している細胞を腸管上皮細胞の幹／前駆細胞として回収する工程
【請求項９】
腸管上皮細胞の幹／前駆細胞マーカーがＭｕｓａｓｈｉ−１である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法によって得られた腸管上皮細胞の幹／前駆細胞。
【請求項１１】
腸管細胞の凝集体を培養することを含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の培養方法。
【請求項１２】
腸管細胞の凝集体を、ＥＧＦを含有する培養液中で培養することを含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の培養方法。
【請求項１３】
凝集体が腸管細胞を浮遊培養することによって得られるものである、請求項１１又は１２記載の方法。
【請求項１４】
腸管細胞を、血清、インスリン、デキサメサゾン、ニコチンアミド、Ｌ−グルタミン、β−メルカプトエタノール及びＥＧＦを含有する培養液中で培養することを含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の培養方法。
【請求項１５】
腸管細胞を、ＥＧＦを含有する培養液中、高密度で培養することを含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の培養方法。
【請求項１６】
腸管上皮細胞の幹／前駆細胞から腸上皮組織を構築する細胞への分化を誘導する方法であって、該幹／前駆細胞の培養液からＥＧＦを除去することを特徴とする方法。
【請求項１７】
腸上皮組織を構築する細胞が、腸内分泌細胞又は粘液分泌細胞である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
血清、インスリン、デキサメサゾン、ニコチンアミド、Ｌ−グルタミン、β−メルカプトエタノール及びＥＧＦを含有する、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞培養用培地。
【請求項１】
腸管細胞の凝集体を培養することを含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の取得方法。
【請求項２】
腸管細胞の凝集体を、ＥＧＦを含有する培養液中で培養することを含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の取得方法。
【請求項３】
凝集体が腸管細胞を浮遊培養することによって得られるものである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
以下の工程を含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の取得方法。
（１）腸管から腸管細胞を採取する工程
（２）腸管細胞を浮遊培養することによって細胞塊（凝集体）を調製する工程
（３）腸管細胞の凝集体を、ＥＧＦを含有する培養液中で培養する工程
（４）腸管上皮細胞の幹／前駆細胞マーカーを発現している細胞を腸管上皮細胞の幹／前駆細胞として回収する工程
【請求項５】
腸管上皮細胞の幹／前駆細胞マーカーがＭｕｓａｓｈｉ−１である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
腸管細胞を、血清、インスリン、デキサメサゾン、ニコチンアミド、Ｌ−グルタミン、β−メルカプトエタノール及びＥＧＦを含有する培養液中で培養することを含む腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の取得方法。
【請求項７】
腸管細胞を、ＥＧＦを含有する培養液中、高密度で培養することを含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の取得方法。
【請求項８】
以下の工程を含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の取得方法。
（１）腸管から腸管細胞を採取する工程
（２）腸管細胞を、ＥＧＦを含有する培養液中、高密度で培養する工程
（３）腸管上皮細胞の幹／前駆細胞マーカーを発現している細胞を腸管上皮細胞の幹／前駆細胞として回収する工程
【請求項９】
腸管上皮細胞の幹／前駆細胞マーカーがＭｕｓａｓｈｉ−１である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法によって得られた腸管上皮細胞の幹／前駆細胞。
【請求項１１】
腸管細胞の凝集体を培養することを含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の培養方法。
【請求項１２】
腸管細胞の凝集体を、ＥＧＦを含有する培養液中で培養することを含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の培養方法。
【請求項１３】
凝集体が腸管細胞を浮遊培養することによって得られるものである、請求項１１又は１２記載の方法。
【請求項１４】
腸管細胞を、血清、インスリン、デキサメサゾン、ニコチンアミド、Ｌ−グルタミン、β−メルカプトエタノール及びＥＧＦを含有する培養液中で培養することを含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の培養方法。
【請求項１５】
腸管細胞を、ＥＧＦを含有する培養液中、高密度で培養することを含む、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞の培養方法。
【請求項１６】
腸管上皮細胞の幹／前駆細胞から腸上皮組織を構築する細胞への分化を誘導する方法であって、該幹／前駆細胞の培養液からＥＧＦを除去することを特徴とする方法。
【請求項１７】
腸上皮組織を構築する細胞が、腸内分泌細胞又は粘液分泌細胞である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
血清、インスリン、デキサメサゾン、ニコチンアミド、Ｌ−グルタミン、β−メルカプトエタノール及びＥＧＦを含有する、腸管上皮細胞の幹／前駆細胞培養用培地。
【図１０】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公開番号】特開２００８−２０６５１０（Ｐ２００８−２０６５１０Ａ）
【公開日】平成２０年９月１１日（２００８．９．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２４１５３６（Ｐ２００７−２４１５３６）
【出願日】平成１９年９月１８日（２００７．９．１８）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１８年度、文部科学省、科学技術試験研究「再生医療実現化プロジェクト」産業活性化再生特別措置法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月１１日（２００８．９．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月１８日（２００７．９．１８）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１８年度、文部科学省、科学技術試験研究「再生医療実現化プロジェクト」産業活性化再生特別措置法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【Ｆターム（参考）】
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