膨張床カラムおよび使い捨て可能なクロマトグラフィー
膨張床吸着クロマトグラフィーの分野において、制限されないが、特に使い捨て可能な膨張床クロマトグラフィーカラムに関する。分離されるべき少なくとも１つの成分を含む液体の上方流膨張床吸着クロマトグラフィーを実施する方法であり：カラムに含まれる静止相媒体に、入口を通って液体を供給し、変動し得る量のヘッドスペースの下の静止相媒体の膨張を生じさせること；静止相媒体により流体から少なくとも１つの成分を吸着させること；出口を通ってカラムから液体を回収すること；少なくとも入口を通る液体の流速の調節により静止相媒体の膨張を調節すること；ならびにカラムの外側の圧力に関してヘッドスペースにおける過剰圧力を、外側圧力＋０．１bar以下に制限すること、を含む方法、が提供される。さらに、この方法を使用するための装置、特に膨張床クロマトグラフィーにおいて使用されるカラムが提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膨張吸着（EBA）(expanded bed adsorption)システムに関する。それは、特に使い捨て可能なクロマトグラフィーカラムに関連するが、限定されない。
【背景技術】
【０００２】
発酵液（fermentation broths）の精製は、それから生物学的製剤を抽出するための、進展中の分野である。特に、モノクローナル抗体の精製は、治療および診断剤として、その開発に重要さが増加している。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ発酵液または微生物発酵液から、マウス、ヒトまたはヒト化された、形態で製造されるのが通常である。従来、その液は選択的な可逆沈殿プロセスにより精製され、そのプロセスは所望のイミュノグロビンを沈殿させることを目的とするが、溶液中の他のタンパクはそのままにするものである。しかしながら、このプロセスは時間がかかり、低純度の抗体を産生し、望ましくないタンパクと沈殿剤を含む上清の廃棄の問題を創り出す。その結果、発酵液を精製するためのクロマトグラフィーの使用が開発されてきている。
【０００３】
クロマトグラフィーは、互いに混和しない移動性相（mobile phase）および静止相(stationary phase)の使用を必要とし、それぞれは分離されるべき混合物の成分に対する異なる親和性を有する。２つの相に対して精製されるべき混合物の各成分の相対的親和性は、移動性相の流動の方向に、静止相を通る成分の移行速度を決定する。移動性および静止相の注意深い選定は、成分の移行速度が十分に異なり、各成分を静止相から分離して溶出させることを確かにすることにより、混合物中の成分の分離を可能にし得る。静止相は支持マトリックスであり得、成分に結合し得る官能基を有するリガンドが、それに取り付けられ得る。クロマトグラフィーを実施するために、２つの広い、通常の方法がある：静止相の充填床を用い、それを通って移動相は圧力の使用により強制される；または、膨張床吸着であり、そこでは移動相にかけられるは少なくとも大いに減少され、そして静止相の密度は、移動層の流速のある範囲で、安定な流動床を創り出すように選定される。
【０００４】
モノクローナル抗体の単離のために、クロマトグラフィーの最も広く用いられる方法は、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーである。この方法は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）に関連して使用され得、疎水性マトリックス（静止相）が効率的に抗体に結合するように、発酵液にリオトロピック塩を添加することが必要であり、つづいて固相から抗体を溶出するために減少した濃度のリオトロピック塩溶液を使用する。特に、リオトロピック塩の存在は抗体が消耗される原料の使用を妨げ得るので、リオトロピック塩の使用は廃棄の問題を生じさせる。あるいは、または付加的に、イオンクロマトグラフィーは、追加の精製段階として使用され得る。
【０００５】
プロテインＡクロマトグラフィーは、プロテインＡセファロースカラム上で実行され得る。これらのカラムの静止相は、２０回またはそれより多くまで使用可能であるが、再使用の前に水酸化ナトリウム溶液を用いて洗浄されなければならない。これは時間がかかり、精製装置の有意な休止時間（down-time）を必要とする。さらに、プロテインＡは、約１２を超えるｐH値で不安定であり、したがって水酸化ナトリウムを用いる各洗浄サイクルは、吸着剤の操作寿命を短くする。充填床溶出法は、カラムを含む装置が、カラムを通して移動性相の必要な流れを創り出すように、適用される背圧に耐えることができることを要求する。これは静止相を含むように永続的な設置を必要とするのが通常である。カラムは一般的にステンレス鋼または高荷重に耐える（heavy duty）ガラスであり、強度、ならびに静止相およびカラムの繰り返し洗浄に要求される条件に耐性、の点から選ばれる。これらのカラムは処分されるのではなく、何回も再使用される。精製されるべき混合物中の、細胞および細胞片のような粒子は、静止相の詰まり（clogging）を避けるために、カラムに導入する前に、混合物から除去されなければならない。ろ過および遠心分離のような清浄工程は高価で、時間がかかり、生成物の有意な損失をもたらす。さらに、プロテインＡリガンド自体も高価である。
【０００６】
したがって、抗体および発酵液のもっと安価で、もっと効率的な精製方法を提供しようとする努力がなされてきている。
【０００７】
プロテインＡ静止相に代わる静止相が提案されている。MBI Hypercel（登録商標）は商業的に入手し得る吸着剤であり、抗体との疎水性相互作用およびイオン相互作用の両方を含むと述べられる、メルカプト−ベンズイミダゾール−スルホン酸リガンドを含む。米国特許6,498,236号は、式M-SP1-X-A-SP2-Acidのリガンドを用いる抗体の精製法を記載し、ここでMはマトリックス骨格；SP1はスペーサー；XはO,SまたはNH;Aは単環もしくは二環の置換されていてもよい芳香族または複素環部分；SP2は任意のスペーサー；Acidは酸基である。WO97/10887は、タンパク様物質に対する、増加した選択性の疎水性リガンドを開示し、そこでリガンドの構造は少なくとも１つの環形成原子がNである複素環の実在（entity）を含む。WO03/024588は、疎水性およびイオン相互作用が可能な多型（multimodal）リガンドを開示する。
【０００８】
一般的に使用される充填床カラムに代えて膨張床吸着を用いることが開示されている。膨張床吸着は静止相を通る移動性相の上向き流を用いて実行され得、そこでは静止相は安定な流動床を形成するために、移動性相よりも密であることが要求され、あるいは移動性相の下向きの移動性相を用いて実施され得、そこでは静止相は安定な流動床の形成のために移動性相よりも密ではないようにするべきである。静止相は、混合物から目的化合物を吸着すべきであり、目的化合物に対して親和性が低い移動性相を用いて、望ましくない化合物を洗浄除去し、ついで目的化合物はその（それらの）化合物に対し高い親和性を有する溶出液を用いてカラムから溶出され得る。溶出は流動床を用いて生じ得、または圧力を溶出液にかけることにより充填床様式で生じ得る。膨張床移動相を通る移動性相の最大流は、静止相が安定な膨張床を形成するように、使用される粒子の密度および直径により決定される。膨張床吸着システムに使用される、調節された密度と直径を有する静止相媒体粒子は、多孔質複合材料を用いて製造され得、その孔径、粒径および密度が選択され得、所望ならば静止相を用いて精製されるべき化合物に対し親和性を有する被覆材で被覆され得る。この様な媒体の例は、Pharmacia Biotech（スウェーデン）の「Streamline matrix」およびUpFront Chromatography A/S （デンマーク）の「Front Matrix」であり、それらはともに アガロース球の内側の１つ以上の粒子からなる。WO00/57982は膨張床吸着における使用のための静止相を開示し、そこでは粒子の密度は2.5ｇ/mLであり、その平均粒径は５〜７５μｍ、そして粒子の芯は少なくとも3.0ｇ/mLを有する非多孔質材料である。適切な芯材料は鋼ビーズを含む。芯の被覆は荷電し得る基または親和性リガンドを有するポリマーベースマトリックスであり得る。
精製すべき混合物および移動性相の、静止相への導入は、流動床の安定な形成を可能にするが、従来技術において向けられていた課題である。その混合物および/または移動性相の導入による静止相でのチャンネル形成は、床の膨張の安定性を低下させ（たとえば逆混合および望ましくない乱流による）、そして分離効率を低下させることが知られている。この課題は、使用されるカラムの直径とともに増大し、したがって特に商業的規模の精製を意図されたカラムで激しい。WO99/65586およびWO01/85329は、混合物および/または移動性相がカラムに導入される分配器（distributor）を設けることにより、この課題を解決しようとする。WO01/85329において、その分配器は多数の出口を含み、それを通って液体はカラムに達するように進む。上昇流カラムの場合に、分配器はカラムの基部に設けられ、出口は、カラムに入る液体流から生じる静止相での乱流を最小とするために、カラムの底部方向に向けられるのが好ましい（すなわち、移動性相の移動方向に反対の方向）。分配器は、カラムの底部を越えて液体の分配を確実にするために十分速く回転され、しかし静止相で形成される「撹拌帯域」を最小にするために十分にゆっくりと撹拌され、そこでは安定な膨張が達成され得ない。非回転分配器の使用は、静止相にチャンネル形成、したがって比較的安定でない膨張を導く、ことは例に示される。WO99/65586において、流体の分配は、カラムの底部で静止相の磁気撹拌を用いて達成される。さらに、撹拌帯域の高さを最小にするのが好適である。
【０００９】
精製されるべき混合物中の粒子および不溶物によるカラムの部分的詰まりの課題は、従来技術において取り組まれてきた。WO2006/001867において、Pharmaciaにより開発され、商標Streamlineで販売されているシステムが検討されている。カラム底部で流動分配器プレートおよび静止相媒体の間に約２０μｍの孔径を有するスクリーンの設置することは、細胞および細胞破片の通過を許すが、静止相媒体がスクリーンから流動分配器プレートを通過するのを妨げると述べられている。その出願では、そのような配置は、ケーキブロックとして知られる、スクリーン入口の孔を塞ぐ粘着層を形成する粒子の固まり（clumps）の形成は防止しないと述べられている。WO2006/001867により提案されている、この課題の解決は、スクリーン入口の下のカラムの底部に入口および出口を用いることであり、その結果、流体の流れは「ケーキ」を洗い流すようにスクリーン入口底部を越えていく流れに循環され得る。あるいは、脈流またはカラムの振動の使用は、スクリーン入口から詰まりを除去するように提案される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許6,498,236号
【特許文献２】WO97/10887
【特許文献３】WO03/024588
【特許文献４】WO00/57982
【特許文献５】WO99/65586
【特許文献６】WO01/85329は
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述のように、広く使用されているプロテインＡカラムを清浄にし、その清浄さを確かめる必要性は時間がかかる不利を有しており、有意の時間を要し、その間に精製装置は使用され得ない。抗体の製造のための全体プロセスは、単一使用の振動（rocking）タンクにおいて実行されるが、発酵段階、単一使用フィルターとろ過による清澄、つづいて上述の生成物を獲得するクロマトグラフィー段階、および不純物を除去するための任意に１つまたは数個のクロマトグラフィーによる精製段階、つづいて使い捨て可能な膜を用いて実行される精製された生成物の膜ろ過である。したがって、単一使用の使い捨て可能な装置を用いて実行されない、操作の唯一の段階はクロマトグラフィー段階であることは明らかである。WO99/65586は、そこに記載されているカラムの使い捨て可能な態様を提供することが望ましいことを開示する。これらのカラムは機械的駆動撹拌ブレードまたは磁気撹拌棒を含む。
【００１２】
本発明者らは、使い捨て可能なカラムの使用は、システムの最小限の休止時間で使用した後に、交換され得る無菌カラムの供給を可能にすることがわかった。しかし、入口の上流に位置されt単一ポンプを用いて移動性相にカラムを通過させる通常の方法は、カラムのヘッドスペース（すなわち、移動相の上方で、その頂部の下方であるカラム空間）に圧力を創出し、その圧力は静止相媒体を通過した後に移動性相に出口を通過させるのに必要であり、したがって、WO99/65586に記載されているカラムは、このような圧力に安全に耐えることができなければならない。移動性相を出口に動かすように創り出される圧力に加えて、カラムは出口の意図しないブロック（たとえば閉じられたバルブ）に対して保護するために入口ポンプにより供給される最大圧力と評価される圧力であること必要とし、その間、入口ポンプはなお作動している。このようなポンプは設置に高価であり、輸送に重く、したがって使用者に高コストのために使い捨て用途に適用されることは少ない。カラムの圧力評価の必要性を無視しない空気ベントは、WO99/65586にカラムの任意の特徴として開示され、そして、空気ベントは、（ａ）静止相が膨張し、移動性相が出口を通って出ないように、安定な膨張床を確立する間、ヘッドスペースに負圧を与えるために；ならびに（ｂ）安定な膨張床の後に吸着相が形成される間、移動性相が出口を通って出るのを助けるようにヘッドスペースに正圧をあたえるために、使用される。したがって、WO99/65586におけるカラムは、たとえカラムが充填床溶出よりも膨張床溶出のために使用されるつもりであっても、ヘッドスペースに加えられる負圧と正圧に耐えることができなければならないことは明らかである。
【００１３】
もし最小限の背圧を必要とする膨張床吸着システムがクロマトグラフィー段階で用いられても、加圧された装置のための抑制（containment）を設けることは必要ではなく、カラムは上昇圧力に耐えることができる必要のない、軽く、使い捨て可能な材料から作られていてもよいこと、を本発明者は認識した。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
したがって、第１の態様において、本発明は分離されるべき少なくとも１つの成分を含む液体の上方流膨張床吸着クロマトグラフィーを実施する方法を提供し：カラムに含まれる静止相媒体に、入口を通って液体を供給し、変動し得る量のヘッドスペースの下の静止相媒体の膨張を生じさせること；静止相媒体により流体から少なくとも１つの成分を吸着させること；出口を通ってカラムから液体を回収すること；少なくとも入口を通る液体の流速の調節により静止相媒体の膨張を調節すること；ならびにカラムの外側の圧力に関してヘッドスペースにおける過剰圧力を、外側圧力＋０．１bar以下に制限すること、を含む。
好ましくは、過剰圧力は０．０８bar以下、もっと好ましくは、０．０５bar以下、たとえば０．０１bar以下、または０．００５bar以下である。
第２の態様において、本発明は、第１の態様に関連して用いられる装置を提供する。
第３の態様において、本発明は、第１の態様の方法および/または第２の態様の装置に関連して用いられるカラムを提供する。この態様によるカラムは：カラムへの液体の通路のための入口を含む下方部分；液体のための出口を含む上方部分；ならびにカラムに含まれる静止相媒体からなり、さらにカラムの上方部分はカラムの内部と外部の間に流体の接続を与えるベントを含む。
第４の態様において、本発明は、膨張床クロマトグラフィーで用いられるカラムを提供し：カラムへの液体の通路のための入口を含む下方部分；液体のための出口を含む上方部分；ならびにカラムに含まれる静止相媒体からなり、その入口は静止相媒体の動かされる撹拌には適合されない、を含む。
第５の態様において、本発明は、膨張床クロマトグラフィーを実施するための装置を提供し、本発明の第４の態様のカラムを含む。好ましくは、その装置は少なくともカラム入口上流の第１ポンプおよびカラム出口下流の第２ポンプをさらに含む。
第６の態様において、本発明は、分離すべき少なくとも１つの成分を含む液体の膨張床クロマトグラフィーを実施する方法を提供し：カラムに含まれる静止相媒体に、入口上流の第１ポンプにより入口を通って液体を供給し、変動し得る量のヘッドスペースの下の静止相媒体の膨張を生じさせること；静止相媒体により流体から少なくとも１つの成分を吸着させること；ならびに出口下流の第２ポンプにより出口を通ってカラムから液体を回収すること、からなる。好適には、その方法は、本発明の第４の態様によるカラムを用いて実施される。
【００１５】
以下に述べる好適な特徴は、本発明のすべての態様に適用し得、いかなる適切な方法でも組み合わせ得る。
適切には、ベントは保護フィルター、適切にはマイクロフィルター、を含み得、そしてフィルターは汚染物がカラムに入るのを防止し、および/または微生物がカラムを出、または入るのを防止する。
好適には、ベントはカラムにおける単純な開口である。あるいは、ベントは圧力開放バルブであってもよい。あるいは、ベントはカラムの外側圧力より低いヘッドスペースにおける圧力を保持するための手段を含み得る。
出口は管の形態であってもよい。管は移動可能であるので、管の上流端はカラム内の選定された位置に設けられ得る。たとえば、管の上流端はカラム内の移動性相の液面より下方であるか、静止相の高さより上方に位置される。適切には、このような位置取りは、管の上流端近くの、浮力のあるサポートの使用により達成され得、このサポートは移動性相の表面に浮き、移動性相の表面で、またはその下方で、管の上流端の位置を維持する。あるいは、このような位置は電気もしくは空気アクチュエーターのような機械的手段により達成され得る。好ましくは、電気もしくは空気リニアアクチュエーターは、カラム頂部の位置に環状シールされた開口により、上下に出口管を動かすためにカラムの外側に設けられる。好ましくは、１つの統合ユニットとして出口管を備える。あるいは、カラムは２つの部分、シールされたカラムおよび出口管、を備え、それらはカラム頂部のシールされた開口を通して管の挿入により使用される前に組み立てられる。いずれの場合も、出口管は、ついでポンプ管に接続され、カラムの最終的な使用に続き、カラムと出口管はカラムスタンド、アクチュエーターおよびポンプ（これらは生成物との接触はない）から分離され、そして処分される。
【００１６】
適切には、カラムは入口、出口および、ベントが含まれるときは、シールされ閉じられたベント、を備え得る。媒体の無菌性は製造者により検討され、使用者に保証され得るからである。これは、カラムが無菌静止相媒体で予備充填されるときに、特に好適である。入口、出口およびベント上のシールは、カラムの使用前に破壊される。適切には、入口、出口およびベントは、再びシールされ得る。この特徴は、カラムが使い捨てを意図されるときに特に好適である。したがって、シールされたカラムは無菌静止相含むように用意され、シールは使用前に破壊され、そして使用後にカラムは、好ましくは静止相媒体を含むユニット全体の処分前に再びシールされ得る。好適には、カラムは懸濁相ならびに静止相媒体を含み得る。好適には、その懸濁相は、使用前にカラムの輸送および/または貯蔵の間に静止相媒体の凝集を防止し得る物質を含む。これは、カラムが使用されるときに、膨張床の形成を容易にする利点がある。適切な物質は、グリセロール、ショ糖、デキストラン、PEG,PVPおよび洗浄剤（中性、負に帯電、正に帯電、または両性イオン）を含む。
懸濁相は、凝集防止物質の２つ以上の組み合わせを含み得る。適切には、懸濁相における物質の濃度は、低分子量に対して、少なくとも１％、好ましくは５％、好ましくは少なくとも１０％、たとえば少なくとも３０％、または５０％；ポリマーに対して、少なくとも０．１％、たとえば少なくとも０．５％、１％、２％、５％または１０％；そして洗浄剤に対して、少なくとも０．０１％、たとえば少なくとも０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、または５％である。
【００１７】
適切には、入口は静止相の駆動された撹拌を与えるために適用される、公知の種類の入口であってもよい。しかし、駆動された撹拌を与えない入口は、ある環境に、特にカラムが一回の使用および使い捨て可能に意図される場合に、好適であり得る。これは、カラム製造の複雑さとコストを最小にし、ハンドリング特性を向上するからである。単一回使用のために用意されるカラムは、できるかぎり簡単に必要なラインに位置され接続され得ることが必要である。さらに、カラムはハンドリング上の制限なしに輸送に耐えることができなければならない。
【００１８】
十分な密度を有する静止相媒体を用いるとき、静止相でチャンネルおよび乱流の形成を防止するために静止相媒体を撹拌することは不要であることがわかった。さらに、静止相媒体を支持するためのスクリーン入口の設置は不要であり、このようなスクリーンの詰まりの問題を除去するものである。膨張床吸着クロマトグラフィーに要求される装置への、このような簡素化は、使い捨て可能な装置を、上述の理由のために実施可能にし得る。
【００１９】
したがって、本発明者は、静止相の間に移動性相を均一に分配する駆動された撹拌を使用しないで、安定な膨張床を驚くべきことに提供する入口を発明した。このような入口は、本発明の第３の態様のベント付きカラムに関連して、ならびに本発明の第１および第２の態様の方法および装置において使用され得る。しかし、このような入口には、本発明の第４の態様の入口のような、孔を開けられていないカラム、ならびに膨張床クロマトグラフィーの方法、たとえば本発明の第６の態様のような、孔を開けられていないカラムを用いる方法においても使用され得ると当業者により認識され得る。
【００２０】
このような入口は、開放端管として形成され得る。管の開放端は、そこからの液体の流れはいかなる所望の方向、たとえば水平に、垂直に上方に、または垂直に下方に、設けられ得る。しかし、好適には、入口は少なくとも１つの開口を有する液体分配器で終わる入口導管を含む。好ましくは、少なくとも１つの開口は水平もしくは下方に傾斜した方向、すなわちその水平下方に０度より大きく、カラムの下方端の方向に向けられている。もっと好適には、その少なくとも１つの開口は、水平下方に少なくとも４５度、たとえば水平下方に９０度、向けられている。適切には、その少なくとも１つの開口は、実質的に円形の孔の形状であり得る。あるいはその開口は細長い小さな孔（slot）の形状であってもよい。適切には、少なくとも１つのドーム状または円錐状のカバー（cowl）が入口の上方に設けられていてもよく、カラムの上方端に向けられた頂点を有する。そのようなカバーは部分的に入口を囲んでいてもよい。適切には、水平方向のバッフル表面は入口の上方または入口と実質的に同じ高さに設けられていてもよく、そのような表面はカバーの底部を形成し得る。
【００２１】
あるいは、入口は、液体の分岐した流れを創り出す手段を含んでいてもよい、少なくとも１つの管からなっていてもよい。適切には、このような分岐流は、流体の実質的に円錐状の分配を形成し得、そのような円錐状の分配は６０度のような、少なくとも４５度の半角を有する。適切には、入口は少なくとも１つのノズルを含む。適切には、管は管壁を横断し、内面であるプレートを含み得、そのプレートは液体のらせん流を創り出すように配置されている。適切には、そのようなプレートは入口を通って静止相媒体の通路を妨げるように適合され得る。適切には、そのような管は、カラムの内部下方端がカラムの下方端の方向に半径を減少するカップを形成する、カラムに関連して使用され得る。要求される内部形状にカラムを成形することにより、またはカラムの下方部分への適切な形状のインサートを差し込むことにより、そのような形状が形成され得る。いくつかの管を含む入口の場合には、カラムの下方部分の内部表面は、各管に集中された、減少する半径のカップを与えるように形成されるのが好適である。
【００２２】
あるいは、入口は、カラムを越えて伸び、かつ少なくとも１つの開口をその中に備える、少なくとも１つの管を含み得る。適切には、少なくとも１つの開口は、水平にまたは下向きに面しており、たとえば水平に少なくとも０°、たとえば水平に４５°、好ましくは水平に９０°である。適切には、少なくとも１つの開口は、そこから液体の分岐流を供給するように適合され得る。適切には、入口は、少なくとも１つの管に液体を接続する、中心部の空チャンバーを含む。
【００２３】
好適には、少なくとも１つの開口の大きさは、汚染物（たとえば、処理されるべき液体に含まれる粒子および不溶物）の大きさに比べて大きい。しかし、少なくとも１つの開口は、所定の流速で意図された流動分布を与えるのになお十分に小さくなければならない。
【００２４】
好適には、少なくとも１つの開口は、最小大きさが０．０５ｍｍ、たとえば少なくとも０．１ｍｍ、および最大大きさ２ｍｍ、たとえば最大大きさ１ｍｍ、または最大大きさ０．７５ｍｍである。
【００２５】
カラムの底部を通る横方向の液体流れはないのが好ましい。入口の上方に開口プレートが備えられていないのが好ましい。
【００２６】
上述の流動分布デバイスについて、チャンネル形成なしに、意図された流動分布を得るために、EBAカラムに適用される線流速は少なくとも３ｃｍ/分、たとえば少なくとも４ｃｍ/分、少なくとも５ｃｍ/分、すなわち６，７，８，９もしくは１０ｃｍ/分である。
【００２７】
適切には、静止相媒体は少なくとも１．５ｇ/ｍLの密度を有し、たとえば少なくとも１．８ｇ/ｍL、たとえば２．０ｇ/ｍLである。特に好ましくは、静止相媒体は２．５〜４．０ｇ/ｍLの密度を有する。好ましくは、静止相媒体は２０〜２００μｍの平均粒径、もっと好ましくは４０〜１６０μｍの範囲、なおもっと好ましくは６０〜１２０μｍの範囲、さらには７０〜１１０μｍの範囲、さらにもっと好ましくは８０〜１００μｍの範囲である。
【００２８】
膨張床カラムに適用される原材料が、高い濃度の全細胞または細胞片を含む粗発酵液であるとき、操作時に許容し得る床膨張を生じさせるとともに高密度を有する静止相媒体を使用するのが特に有利である。したがって、原料が５％vol/volを超える細胞および/または細胞片、たとえば１０％vol/vol超、たとえば１５％vol/vol超、たとえば２０％vol/vol超、たとえば２５％vol/vol超、を含むとき、静止相媒体の密度は少なくとも２．８ｇ/ｍL、たとえば少なくとも３．０ｇ/ｍL、たとえば少なくとも３．５ｇ/ｍL、たとえば少なくとも４．０ｇ/ｍL、たとえば少なくとも４．５ｇ/ｍLであり、そして平均粒径サイズは５０〜１１０μｍの範囲、たとえば７０〜９０μｍである。
【００２９】
好ましくは、静止相媒体は鋼鉄ビーズもしくは粒子、または炭化ケイ素ビーズもしくは粒子である。
【００３０】
流速、粒子サイズおよび粒子の密度は、流動床の膨張にすべて影響し、カラム内に粒子を保持するように膨張の程度を調節することが重要である。膨張の程度はH/HOとして決定され得、ここでHOは充填床モードにおける床高さであり、Hは膨張モードにおける床高さである。
【００３１】
好ましくは、静止相媒体の使用での膨張H/HOの程度は３．０〜１．２の範囲、たとえば２．５〜１．３、２．２〜１．４または２．０〜１．５である。好ましくは、H/HOの最大値は３．０、もっと好ましくは２．５、たとえば最大２．２、２．０、１．８、または１．６である。好ましくは、膨張の程度は少なくとも１．２、たとえば少なくとも１．３、たとえば少なくとも１．４、たとえば少なくとも１．５である。
【００３２】
好ましくは、カラムが保持するように適合される最大圧力は０．３５atmであり、たとえば最大０．３０atm、０．２５atm、０．２０atm、０．１５atm、０．１０atm、０．０５atmである。
【００３３】
EBAカラムは好ましくは低コストのプラスチックス材料から製造され得、好ましくは透明または半透明のプラスチックス材料である。好ましくは、プラスチックス材料は、毒性化合物の最小の漏れで医薬生成物の製造に用いる、安全性の要求にさらに合致する。適切なプラスチックス材料の例は、ポリプロピレン、ポリエチレン、TPX（メチルペンテンコポリマー）、ポリカーボネート、プレキシガラス（plexi-glass）およびPVCである。好ましくは、カラムは射出成形または押出しで製造され得る。
【００３４】
いくつかの状況下で、EBAカラムはガラスから製造するのが好適であり得る。
【００３５】
適切には、本発明の第３または第４の態様によるEBAカラムは、２つのポンプに接続して供給され得、１つは入口の上流に位置され、１つは出口の下流に位置される。
【００３６】
クロマトグラフカラムの分離効率は、所定のカラムにおける理論段数Nの用語で表現され、充填床の１ｍあたりの理論段数N/ｎとして標準化される。その数字が大きければ大きいほど、カラムが持つクロマトグラフ分離効率は良くなる。
【００３７】
膨張床カラムに関して、理論段数の数は滞留時間分布試験（ハンドブック「Expanded Bed Adsorption」14〜１６頁、Edition AA, ISBN 91-630-5519-8, Amersham Pharmacia Biotech, スウェーデン ）により決定され得、それはトレーサー刺激法であり、膨張床における長軸方向混合（分散）の程度を評価するのに用いられ得る。高理論段数は長軸方向混合（または望ましくない乱流およびチャンネル形成）の低い度合い、それによる高い分離効率の度合い、を示す。さらに、上記ハンドブックに記載されるように、もし膨張床カラムがカラム中の理論段数N＝２５〜３０または沈降した吸着剤の１ｍあたりのN/m＝１７０〜２００段、を有するならば、単純な結合および放出（捕捉および放出）を含むいくつかの適用について、N/m＝１７０〜２００の数で示されるような高い分離効率を有する必要はなく、そこでは理論段数５０〜７５N/mを有するカラムを作用させるので十分であり得る場合である。
【００３８】
充填床カラムについて、流速が増加するとき、理論段数および分布効率が減少することは一般的に知られており、このことは、線流速が吸着剤ビーズの終端沈降速度（terminal settling velocity）に近づくとき、または物質移動運動学（mass transfer kinetics）が制限因子になるときには、膨張床カラムについても予測されよう。
【００３９】
驚くべきことに、本発明によるカラム入口が、非常に高密度の吸着剤ビーズを含む膨張床において使用されるとき、理論段数は高くとどまり、非常に幅広い範囲の流速内で（タンパクおよび他のバイオ分子を高生産性で製造するのに特に適している）、流速の増加とともに理論段数はなお増加することを見出した。
【００４０】
本発明によるカラム入口、吸着剤密度、粒径および高流速の特定の組み合わせは、従来法と異なり、いくつかの重要な課題を同時に達成する、非常に魅力的な膨張床システムをもたらすことを見出した。特に、カラムにおける過剰圧力の回避を含む、本発明の組み合わされた特徴は、低コスト材料から製造されるシール可能なカラムにおいて、高流速で（すなわち吸着剤の単位体積あたりの高生産性）、高い分離効率（高理論段数）を有する膨張床カラムの製造と使用を可能にする。
【００４１】
したがって、線流速少なくとも５cm/分、たとえば少なくとも６cm/分、７，８，９，１０または１５cm/分で試験されるとき、理論段数少なくとも２５、たとえば少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０または２００を有する、本発明による膨張床カラムを使用することは特に好適である。
【００４２】
同様に、線流速少なくとも５cm/分、たとえば少なくとも６cm/分、７，８，９，１０または１５cm/分で試験されるとき、理論段数少なくとも５０N/n、たとえば少なくとも７５、１００、１２５、１５０、１７５または２００N/nを有する、沈降吸着剤１ｍあたりの理論段数を有する、本発明による膨張床カラムを使用することは特に好適である。
【００４３】
好ましくは、カラム入口が静止相媒体の駆動撹拌に適用されないとき、本発明による方法においては、少なくとも２．５ｇ/ｍLの密度、たとえば少なくとも３．０ｇ/ｍL、そして少なくとも５ｃｍ/分の入口を通る液体の流速、たとえば少なくとも７．５もしくは少なくとも１０cm/分、が用いられる。
【００４４】
好ましくは、本発明の第２または第４の態様による装置は、少なくとも入口上流の第１ポンプおよび出口下流の第２ポンプを含む。好ましくは、ポンプはぺリスタルチック（ぜん動）ポンプである。
【００４５】
入口上流の第１ポンプおよび出口下流の第２ポンプの使用は、ベントのある、またはベントのないカラムに関して、そしてベントのある、またはベントのないカラムを使用して膨張床吸着を実施する方法において、用いられ得ると理解されよう。
【００４６】
好適には、装置は液レベル用のモニターおよび/またはカラム中の静止相媒体のレベル用のモニターをさらに含む。適切には、モニターは超音波モニターまたは光学的モニターであり得る。好適には、そのようなモニターは超音波モニターである。
【００４７】
適切には、装置は、出口管の上流端の位置を調節するためのコントローラー（適切にはリニアアクチュエーターの形態である）をさらに含み、出口の形状は前述のとおりに用いられる。カラム内側に出口管を位置させるアクチュエーターの調節は、液レベルおよび/またはカラム中の静止相媒体のレベルを測定するモニターに結合され得るのが好適である。
【００４８】
適切には、装置はさらに発酵液を含み得る。適切には、装置は消費された発酵液のための容器を含み得る。適切には、装置は溶出物源をさらに含み得る。適切には、装置は発酵液の少なくとも１成分のさらなる精製のための手段、たとえばメンブレンフィルター装置をさらに含み得る。
【００４９】
好適には、静止相媒体の膨張の調節は、液体をカラムに送るための、入口上流の第１ポンプの使用により達成される。
【００５０】
好適には、膨張された静止相媒体上方の液体レベルはカラムから液体を送るための出口下流の第２ポンプにより調節される。
【００５１】
好適には、静止相媒体の膨張は液体レベルおよび/またはカラム内の静止相媒体レベルを超音波モニタリングすることにより決定される。このようなモニタリング法はこの分野で知られている。
【００５２】
好適には、過剰圧力の制限はベントを用いて達成される。
【００５３】
好適には、出口は適用される管を含み、その管の上流端はカラム内で選定される位置に移動され得、さらに方法はカラム内の所望の位置に管の上流端を移動させる段階を含む。
【００５４】
好適には、本発明の第１の態様による方法は、さらに次の段階を含む：
シールされた入口を含む下方部分とシールされた出口を含む上方部分とを有するカラムに含まれる静止相媒体を用意すること、シールされていないとき、それらがカラムの内部と外部の間の流体接続を与えること；ならびに液体を静止相媒体に供給する前に入口、出口およびベントからシールを除去すること。
【００５５】
好適には、本発明の第６の態様による方法は、さらに次の段階を含む：
シールされた入口を含む下方部分とシールされた出口およびシールされたベントを含む上方部分とを有するカラムに含まれる静止相媒体を用意すること、シールされていないとき、それらがカラムの内部と外部の間の流体接続を与えること；ならびに液体を静止相媒体に供給する前に入口および出口からシールを除去すること。
このことは、カラムがベンダーから予備充填されて供給されることを可能にし、静止相媒体のみならず、上述のように懸濁相、たとえば凝集阻害剤を含む、も含むであろう。
【００５６】
好ましくは、本発明の第１または第６態様による方法は、少なくとも１つの成分の吸着を可能にした後に、さらに次の段階を含む：
静止相媒体が少なくとも１成分を溶出させること；そして吸着および溶出段階の少なくとも１つの反復の後に、カラムを処分すること、好ましくはカラムは、カラムが最初に使用されたのと同一の静止相媒体をなお含む。
【００５７】
しかし、適切には、本発明方法は、静止相媒体を清浄化すること、静止相媒体の清浄度を検査すること、および少なくとも１つの成分の溶出後に膨張床装置を再使用すること、の段階を含み得る。好ましくは、清浄化および再使用は撹拌段階なしで行われる。しかし、清浄度の検査は、カラムおよびその接続の内側の異なる部位で細菌テストのための検査用標本（swabs）を採取することにより、および/または吸着剤サンプルを採取し、細菌混入に関して試験し、および/またはビーズ表面の異物の存在を試験することにより、実施され得る。
【００５８】
好適には、静止相媒体が少なくとも１つの成分を溶出した後に、そしてカラムの廃棄の前に、方法は、カラムのベント（もし適用可能であれば）、出口および入口を再シールする、段階を含む。
【００５９】
好適には、液体の少なくとも１つの成分はタンパクである。
【００６０】
好適には、チャンバーの内容物は、液体、溶出物または入口を通る他の液体の導入、以外の手段により撹拌されない。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】本発明の用いるカラムの模式図。
【図２】本発明の代替的な液体供給手段を示す図。
【図３】本発明の代替的な液体供給手段を示す図。
【図４】本発明の代替的な液体供給手段を示す図。
【図５】本発明の代替的な液体供給手段を示す図。
【図６】本発明の代替的な液体供給手段を示す図。
【図７】本発明の代替的な液体供給手段を示す図。
【図８】本発明の代替的な液体供給手段を示す図。
【図９】本発明の代替的な液体供給手段を示す図。
【図１０】本発明の代替的な液体供給手段を示す図。
【図１１】本発明の代替的な液体供給手段を示す図。
【図１２】本発明の代替的な液体供給手段を示す図。
【図１３】本発明装置の模式図。
【図１４】例１の実験結果を示す図。
【図１５】例２の実験結果を示す図。
【図１６】例３の実験結果を示す図。
【図１７】例４の実験結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
図１に関して、カラム１０は、静止相媒体２を含む。それは、前述のように従来の態様で、プラスチックス材料またはガラスで形成され得る。たとえば、カラム１０はポリエチレンのようなプラスチックス材料から成形され得る。この材料は、強くて、軽くて、使い捨て可能であり、安価であるので、カラム１０が単一の使用を予定されているときに特に好適である。カラム１０は、実質的に
円筒形状であるのが通常であり、下方部分４に下端を、そして上方部分８に上端、を有する。下方部分４は入口２０を備える。入口２０は、バルブ６または他の適切なシール手段を備え、静止相２または輸送中にそれを囲み得る液体の流出を防止し、そしてカラムが使用のために必要な装置に接続されるときに開けられ得る。同様に、上方部分８を通って、出口１４とベント１２が設けられ、その両方または一方はバルブ６または他の適切なシール手段を備えていてもよい。好適な態様において、カラム１０は単一用途のために意図される単一シールユニットとして供給され得る。好ましくは、カラムの上方閉鎖はカラムに損傷を生じさせることなく取り外し可能ではなく、カラムの再使用または静止相媒体の取替えを防止する。しかし、上方部分８は、静止相が取替えられ得るように、および/または静止相が洗浄され得るように、取り外し可能であってもよく、カラム１０は再使用され得る。
【００６３】
ベント１２の好適な形状は、カラムの頂部の簡単な開口であり、下記のような保護フィルターを含んでいてもよい。しかし、ベントはバネまたは重力バイアスのボールバルブまたはニードルバルブのような、圧力開放バルブの形態でもよく、そこではヘッドスペースの圧力はバルブがヘッドスペースの圧力を開放するのに適用される圧力に依存する、カラム外側の圧力を超える、選ばれた量であり、あるいはベントはチャンバー外側の圧力より低い圧力にヘッドスペースを維持するポンプの形態をとり得る。
【００６４】
適切には、静止相媒体はベントまたは出口により少量を除去することにより試料採取され得る。しかし、カラムが限定された使用を意図され、続いて廃棄さるときは静止相媒体の試料採取が必要ということはない。
【００６５】
図２Aは、カラムを上方から示す図２Cにおける線X-Xに沿って切り取られた、カラム１０の断面図である。図２Bは斜視図における断面２Aを示す。図３〜１２A〜Cは同様に配置される。
【００６６】
図２は、図１に示されるカラム１０の下部を示す。入口２０は、垂直表面における小さな開口３０を有する、閉じられた管としてここに示される。入口２０の閉鎖端は円錐形状を有するように示される；他の閉鎖端形状も置換され得ることが当業者には理解され得るであろう。開口３０は、好ましくは粒子または処理される液体中に存在する他の不溶性物質の大きさよりも大きいのが好ましい。これはカラム１０に液体を導入する前に予備的なろ過または清澄化段階を要求しない利点があり、精製プロセスを簡素化し、短縮する。さらに、開口３０は下向きの角度を有するのが好ましく、その結果、入口２０を囲む静止相粒子（図示せず）によりブロックされず、さらに噴出を制限することにより、静止相中の液体の噴出により生成される乱流をカラム１０の底部に向ける。さらに、これは静止相媒体が開口を塞ぎ、または開口３０を通って入口２０を通過するという問題を生じさせないで、流体中の予期された大きさの粒子よりも有意に大きい開口３０を可能にする。このように、液体中の粒子または静止相媒体により生じる開口３０の詰まりの可能性は最小にされる。
【００６７】
図３は入口２０の代替的な態様を示し、そこでは開口３０は溝の形状である。さらに開口の大きさは液体中の不溶性物質に比べて大きいのが好ましく、そして開口は好ましくは下向きである。
【００６８】
図４および５は、図２の入口を示すが、さらに円錐カバー４０を有する。円錐カバー４０は、開口３０を出た後に、下向きの液をカラム１０の底部に向けるように作用し、液体が円錐の基部まわりを均一に流れ、カラムの頂部に静止相を上昇させることを可能にする。さらに、静止相２の乱流およびチャンネル形成は、開口３０の近くの静止相部分が円錐カバー４０の水平（下方）隔壁表面により静止相の大部分が分離されるので、最小化される。
【００６９】
カバー４０は入口２０を形成する管のエンドキャップとして作用し得、そしてカバーは開口３０を囲み得（図４に示されるように）、または開口の上方に位置され得る（図５に示されるように）ことが図面からわかる。
【００７０】
図６は、図３に示される入口とともに図５に示されるように円錐カバー４０を示す。
【００７１】
図７は、下方端でカラム１０の容積、したがって入口２０を囲む静止相の容積、を減少させる、円錐インサート５０とともに図２の入口を示す。円錐体積で創り出される静止相乱流は、液体と接触しない静止相の存在による、カラムの「デッドスペース」を形成し、膨張床の部分を形成しない可能性を低下させる。インサート５０の使用により達成されるカラム１０の下方部分の内部形状は、内部表面に要求テーパー形状を有する、カラム下方部分を形成することによっても達成され得ることが期待される。
【００７２】
図８は、円錐インサート５０とともに図３の入口を示す。
【００７３】
図９は、入口２０の代替的態様を示し、そこでは開口３０は拡散、分岐した噴出を供給するように適合されたノズルの形態である。適切には液体噴出により記載されるコーンの半角は少なくとも４５°、たとえば６０°であり得る。好適には、そのようなノズルは、図に示される円錐インサート５０とともに使用され、カラム中のデッドスペースが最小化される。円錐インサート５０の傾斜面により記載される半角は、液体の噴出により記載されるのと実質的に同じであるのが適切であり、静止相２の最大可能量が液体と接触される。
【００７４】
図１０は、入口２０の代替的態様を示し、その入口は管を通る液体に回転を生じさせるように適合された内部壁上にプレート６０を備える管である。開口３０は、カラム１０の下方部分４と同じレベルであり、管２０と同じ径を有するが、これに制限されない。このように回転液体は開口３０に達する際に、分岐した噴出を形成し、カラム１０内に広く分散される。好ましくは、この入口は開口３０と同じ径の、比較的小さな開口を有する円錐インサート５０とともに用いられる。それによって、分岐した噴出は開口３０の近くで実質的にすべての静止相と接触することができ、カラムにデッドスペースが形成されるのを避ける。円錐インサート５０なしに、開口３０により製造される分岐噴出は図１０Aの網状陰影領域を占める静止相と接触するように十分に分岐したものになりにくい。入口２０により製造される液体噴出は噴出により静止相にチャネル形成が生成されないように、十分に分散されるべきである。
【００７５】
図１１は、図１０に示される、４つの入口２０を持つカラム１０を示す。この配置は少なくとも径２０ｃｍのような、大きい径のカラムに適している。さらに、この４つの入口への液体竜の分割は、液体がカラム１０の下方部分にわたってもっと均一に分散されるのを可能にする。複数の入口の、このような配置は上述の入口の態様も使用し得る。
【００７６】
図１２は、代替的な入口２０を示し、カラム１０内に放射状に伸びる管７０を含む。開口３０は管７０に設けられている。処理されるべき液体は、中央の管８０を通って放射状管７０に供給され、開口３０を通過する。好ましくは、開口は上述の理由から、下方に向けられる。多数の開口は管７０のそれぞれに設けられ得、多数の管７０が設けられ得る。さらに、開口は処理されるべき液体中の粒状物または不溶物に比べて大きいのが好ましい。
【００７７】
静止相２は、少なくとも１．５ｇ/Lの密度を有するので、本発明の供給装置は静止相膨張床に静止相の比較的低い性能をもたらす、不安定および乱流を生じさせない。静止相媒体の平均粒径は２０〜２００μｍの範囲であり得る。適切な静止相はWO９２/００７９９およびWO００/５７９８２に記載のものを含む。
【００７８】
図１３は、本発明の第２の態様による膨張床クロマトグラフィを実施するための装置の模式図である。その装置は、入口２０、出口１４およびベント１２を有し、静止相媒体を含むカラム１０を含む。
【００７９】
この図において、ベント１２はその開口にわたって備えられたフィルター１６を有する。このようなフィルターは、埃および細菌のような汚染物のカラム１０への、および/または、からの、入口および/または出口を防止するのに用いられる。適切なフィルターはPall Corp.からの一般用ガスフィルターのようなマイクロフィルターであり得る[製品No.９００４５００Pallflex media,4.8-3.2mm(3/16-1/8インチ)HBまたはPall Corp.からのIntervene(商標)Intervene High-Flow filter] 。
【００８０】
入口２０は図２〜１２に関して述べられたように、カラム内容物の撹拌に適用されない入口であってもよく、あるいは機械的に駆動される回転入口または磁気駆動回転入口のような、公知の種類の入口であってもよい。この種の入口は、WO99/６５５８６に記載されている。
【００８１】
入口２０、出口１４およびベント１２がそれぞれ示され、カラムの使用前および使用後に入口、出口およびベントを閉じ、シールし得るバルブ６を有する。このように、カラム内容物はカラムの使用前に殺菌を保持され得る。そして、カラムが単一使用または限定された数の使用に続いて廃棄されるために静止相で予備充填されて供給されるように意図される場合には、カラムはサプライヤーにより、確かな殺菌状態で供給され得、そして内容物の安全な廃棄を促進するように使用後に閉じられ得る。
【００８２】
出口１４は、カラム内で所定のレベルに移動され得る管の形態でここに示される。この管は出口１４を一体的に備え、または図１に示されるように出口１４を通って導かれる別個のものであってもよい。管と出口１４との界面は、カラムに入り、もしくはカラムを離れる微小汚染物なしに管が上下にすべるのを可能にするリップシールでシールされ得る。管の外側部（しかし、カラムの外側に位置する管の部分は管の位置が下方に調節されるとき、内側に入り得る）は、固定されたフレキシブル管により被覆され得、細菌または化学的汚染を防止するために任意に殺菌ガスでフラッシュされ得る。出口の上流側は、カラムの使用時に、液体１８のレベルの下方に置かれ、そして静止相２の上方レベルの上方に置かれるのが望ましい。したがって、手段（図示されていない）は、カラム内の適切な位置への出口１４の上流端の移動を可能にするように備えられる。これは、モーター駆動の使用者が操作する手段により；液体１８レベルで、もしくは少し下に出口１４の上流端を保持する浮力ある支持体の使用により；または好ましくは液体１８のレベルおよび/または静止相２のレベルを監視するモニター２６からのフィードバックに応ずるモーター駆動手段により、達成される。このようなモーター駆動手段は気力アクチュエーターまたはエレクトリックアクチュエーターであり得る、リニアクチュエーターであり得る。
【００８３】
モニター２６は、カラム内で液体および/または静止相レベルを監視できる、いかなる形のモニターであってもよい。たとえば、モニターは光学モニターであり得る。しかし、液体１８、静止相２および/またはカラム１０が組み立てられる材料は個別にまたは一緒に不透明であるので、モニター２６として超音波モニターを用いるのが好ましい。モニターは、入口２０の上流のポンプ２２；出口１４の下流のポンプ２４；および出口１４の上流端に位置するコントローラー（図示せず）、のいずれか、または全部にフィードバックを提供する。
【００８４】
入口２０の上流および出口１４の下流は、入口を通ってカラムに液体を供給し、出口を通ってカラムから液体を押し流すためのポンプを備える。これらのポンプは、この分野で知られている、いかなる適切なポンプであってもよい、しかし、液体がポンプ自体の部分と接触しないぜん動ポンプを用いるのが好適である。適切なぜん動ポンプの例は、Cole-Parmer からのWatson-Marlow Bredel サニタリポンプまたはMasterflex ぜん動ポンプを含む。ポンプの清浄化の必要なしに、ポンプを通過する配管およびカラムの入口、出口への接続は一度用いられ、そして廃棄され得るので、ぜん動ポンプの使用は、液体の精製のための単一使用装置お提供する目的にかなう。
【００８５】
使用において、カラム１０は装置の間に置かれ、ポンプ２２に導く配管に入口で接続され、そしてポンプ２４に導く配管に出口で接続される。ついで、入口２０、出口１４およびベント１２のシールが解かれる。処理される液体は、ポンプ２２により入口２０を通って駆動されてカラム１０の下方端で静止相２の間に均一に分配される。ついで液体は静止相２を通って上方に流動し、静止相の膨張を生じさせ、そしてポンプ２４により出口から追われる。液体の流速は静止相の密度および粒径とバランスされるべきであり、その結果静止相２は十分に膨張し、安定な膨張床を形成するが、カラム１０の頂部からオーバーフローしない。要求される流速は、２つのポンプ、すなわちカラム１０の入口２０の上流の１つのポンプ２２およびカラム１０の出口２４の下流の１つのポンプ２４、の使用により維持される。静止相の膨張および静止相のレベル上方の液体レベルはモニター２６を用いて監視される。モニター２６は、２つのポンプ２２および２４にフィードバックを与えるので、これらのポンプの流速は個別に制御され、望ましい度合いの静止相の膨張および静止相のレベル上方の液体レベルが達成される。さらに、入口への、そして出口からの流速を測定するために、マスフローメーターのような正確なフローメーターの使用は、系の独立したマニュアル制御を促進する。膨張の程度はカラムへの流速により支配されるので、入口ポンプに本質的に制御される。膨張された媒体上方の液体の高さは、液体レベルを上昇させるために出口ポンプにより流速を一時的に低下させることにより、そして液体レベルを低下させるために出口ポンプにより流速を一時的に増加させることにより、制御され得る。さらに、モニター２６は、出口１４の上流端の位置を決定するコントローラー（図示せず）にフィードバックを提供し得るので、静止相の膨張および使用時に、出口の上流端は液体レベルの下方であるが静止相のレベルの上方、のような所望の位置に維持される。
【００８６】
しかし、あるいは、出口１４の上流端の位置はカラムの操作者により決定され得、または液体表面の下の小さな距離のような、液体表面に関し選定された位置に出口１４の上流端を維持する浮き支持体の使用により決定され得る。
【００８７】
静止相の膨張、およびカラム１０内の液体および/または静止相のレベルの続く調節の間、カラムにおける液体レベル上方の空気の圧力はベント１２によりカラム外側の圧力と平衡になることが可能である。このように、カラムは有意の圧力増強なしに操作され得る。カラム１０の上方部分が大気圧より有意に高い圧力に耐える必要がないので、このことはカラム１０の組み立てのために、この分野で通常しようされてきたものよりも比較的軽い材料の使用を可能にする。
【００８８】
好ましくは、カラム１０および静止相２は、関心のある化合物の吸着とその溶出のために、膨張床形態で使用される。
【実施例】
【００８９】
例１ 本発明による膨張床カラムにおいて理論段数の測定
膨張床吸着カラムが図１３に示すように（しかし図９による入口（コーン高さは１５ｃｍ）を有する）、組み立てられ、２つのぜん動ポンプ（Watson Marlow）に接続された。それは沈殿床高さ２５ｃｍに等しい吸着剤量を含んでいた。吸着剤はアガロース−タングステンカーバイド複合ビーズからなり、平均径（体積）（ｄ（０．５））１４９μｍで密度３．１ｇ/ｍLであった。吸着剤はクランピングと密充填を避けるために２５％グリセロール溶液に懸濁された。使用直前に、カラムは３０床容量の脱イオン水で洗浄された。
【００９０】
カラムは流速の関数として１ｍあたりの理論段数の測定（滞留時間分布測定、RTD）により試験された。
【００９１】
ハンドブック「Expanded Bed Adsorption」14〜１６頁、Edition AA, ISBN 91-630-5519-8, Amersham Pharmacia Biotech, スウェーデンに記載され、膨張床吸着の分野の当業者に一般的に使用されている、ネガティブ ステップ インプット法がシステムの性能を評価するのに使用された。
【００９２】
アセトン溶液（０．５％水溶液）が所定の流速でカラムにポンプで送られ、カラムの出口で送り出され、波長２８０ｎｍ（ＵＶ光）で流体の吸収が測定され、記録された。アセトンがＵＶ信号によって一定濃度でカラムから出るとき、流動溶液はアセトンから水に変更された。水での洗浄はアセトン溶液がある間、同一流速で実施された。水でのカラム洗浄は、記録されたＵＶ信号によりすべてのアセトンが洗い出されるまで、継続され、実験が停止され、そして１ｍあたりの理論段数が、記録されたＵＶ信号から流速の関数として計算/測定され、プロットされた。
【００９３】
実験は、表１により異なる流速の範囲を用いて繰り返され、そして流速と観察された理論段数の関係が表１および図１４に示されるように記録された。
【００９４】
【表１】
【００９５】
実験の結果は、静的分配器および流動床システムが測定された流速にわたって増加する固体相支持体の１ｍ沈殿床あたりの理論段数（Ｎ）を持つことを示す。さらに、5ｃｍ／分を超える流速が少なくとも１００Ｎ/ｍの理論段数を得るのに必要であることを示す。
例２ 本発明による膨張床カラムにおいて理論段数の測定
膨張床吸着カラムが例１のように（しかし図８による入口（コーン高さは１５ｃｍ）を有する）、組み立てられた。それは沈殿床高さ２５ｃｍに等しい吸着剤量を含んでいた。吸着剤はアガロース−タングステンカーバイド複合ビーズからなり、平均径（体積）（ｄ（０．５））１３０μｍで密度２．８ｇ/ｍLであった。吸着剤はクランピングと密充填を避けるために２５％グリセロール溶液に懸濁された。使用直前に、カラムは３０床容量の脱イオン水で洗浄された。
【００９６】
カラムは、例１に述べるように、流速の関数として１ｍあたりの理論段数の測定（滞留時間分布測定、RTD）により試験された。
【００９７】
実験は、表２により異なる流速の範囲を用いて繰り返され、そして流速と観察された理論段数の関係が表２および図１５に示されるように記録された。
【００９８】
【表２】
【００９９】
実験の結果は、静的分配器および流動床システムが測定された流速にわたって増加する固体相支持体の１ｍ沈殿床あたりの理論段数（Ｎ）を持つことを示す。さらに、5ｃｍ／分を超える流速が少なくとも１００Ｎ/ｍの理論段数を得るのに必要であることを示す。
例３ 本発明による膨張床カラムにおいて理論段数の測定
膨張床吸着カラムが例１のように（しかし図３（コーンなし）による入口を取り付けられた。それは沈殿床高さ２５ｃｍに等しい吸着剤量を含んでいた。吸着剤はアガロース−タングステンカーバイド複合ビーズからなり、平均径（体積）（ｄ（０．５））１４９μｍで密度３．１ｇ/ｍLであった。吸着剤はクランピングと密充填を避けるために２５％グリセロール溶液に懸濁された。使用直前に、カラムは３０床容量の脱イオン水で洗浄された。
【０１００】
カラムは、例１にのべるように、流速の関数として１ｍあたりの理論段数の測定（滞留時間分布測定、RTD）により試験された。
【０１０１】
実験は、表３により異なる流速の範囲を用いて繰り返され、そして流速と観察された理論段数の関係が表３および図に示されるように記録された。実験はさらに沈殿床高さ５０ｃｍに等しい吸着剤量を用いて繰り返された。
【０１０２】
【表３】
【０１０３】
実験の結果は、静的分配器および流動床システムが測定された流速にわたって増加する固体相支持体の１ｍ沈殿床あたりの理論段数（Ｎ）を持つことを示す。さらに、吸着剤の沈殿床高さが２５ｃｍのとき、７ｃｍ／分を超える流速が少なくとも１００Ｎ/ｍの理論段数を得るのに必要であり、一方吸着剤の沈殿床高さが５０ｃｍのとき、１３ｃｍ／分を超える流速が少なくとも１００Ｎ/ｍの理論段数を得るのに必要であることを示す。
例４ 本発明による膨張床カラムにおいて理論段数の測定
膨張床吸着カラム（１０ｃｍ径）が例３のように組み立てられた。それは沈殿床高さ２５ｃｍに等しい吸着剤量を含んでいた。吸着剤はアガロース−タングステンカーバイド複合ビーズからなり、平均径（体積）（ｄ（０．５））１３０μｍで密度２．８ｇ/ｍLであった。吸着剤はクランピングと密充填を避けるために２５％グリセロール溶液に懸濁された。使用直前に、カラムは３０床容量の脱イオン水で洗浄された。
【０１０４】
カラムは、例１に述べるように、流速の関数として１ｍあたりの理論段数の測定（滞留時間分布測定、RTD）により試験された。
【０１０５】
実験は、表４により異なる流速の範囲を用いて繰り返され、そして流速と観察された理論段数の関係が表４および図に示されるように記録された。実験はさらに沈殿床高さ５０ｃｍに等しい吸着剤量を用いて繰り返された。
【０１０６】
【表４】
【０１０７】
実験の結果は、静的分配器および流動床システムが測定された流速にわたって増加する固体相支持体の１ｍ沈殿床あたりの理論段数（Ｎ）を持つことを示す。さらに、吸着剤の沈殿床高さが２５ｃｍのとき、５ｃｍ／分を超える流速が少なくとも１００Ｎ/ｍの理論段数を得るのに必要であり、一方吸着剤の沈殿床高さが５０ｃｍのとき、１０ｃｍ／分を超える流速が少なくとも１００Ｎ/ｍの理論段数を得るのに必要であることを示す。
例５ ヒト血漿からヒトＩｇＧの吸着
膨張床吸着カラム（１０ｃｍ径）が例２のように組み立てられ、沈殿床高さ５０ｃｍに等しい吸着剤量を含んでいた。吸着剤は、リガンドとして４−アミノ−安息香酸と結合された、アガロース−タングステンカーバイド複合ビーズからなり、平均径（体積）（ｄ（０．５））９５μｍで密度２．９ｇ/ｍLであった（UpFront Chromatography A/S, コペンハーゲン、デンマーク、製品Ｎｏ．CS118,バッチ45818 WV）。吸着剤はク
２５％グリセロール溶液（リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２）に懸濁された。使用直前に、カラムは３０床容量の脱イオン水で洗浄された。
【０１０８】
カラムは、例１に述べるように、線流速１０ｃｍ/分で、１ｍあたりの理論段数の測定（滞留時間分布測定、RTD）により試験され、１ｍあたり１００Ｎ/ｍの段数を有することがわかった（１８５Ｎ/ｍ）。
【０１０９】
カラムは、ｐＨ６．２に塩酸滴定された０．１Ｍイミダゾール２０Ｌで、ついで線流速１０ｃｍ/分で、ｐＨ６．２に塩酸滴定された０．００２Ｍイミダゾール５０Ｌで洗浄された。カラムに、線流速１０ｃｍ/分で、０．００２Ｍイミダゾール/ＨＣｌｐＨ６．２で透析されたヒト血漿４０Ｌを充填された。血漿充填に続いて、カラムはイミダゾール/ＨＣｌ４０ＬでｐＨ６．２で洗浄され、ついでカラムに残る結合材料は、カラムを０．１Ｍリン酸カリウム４０Ｌ＋０．５Ｍ塩化ナトリウムｐＨ７．５で洗浄することにより溶出された。カラムからの溶出物はＵＶモニターで監視され、そしてカラムから溶出されたタンパクはＵＶ信号により捕集された。結合され、ついで溶出されたタンパクは、溶出体積１３Ｌで捕集された。結合されたタンパクの溶出に続いて、カラム（なお入口配管および出口配管に接続されている）は、スタンドから取り外され、閉鎖ループ状に入口配管および出口配管の接続によりシールされ、ついでカラム全体は生物学的廃棄物質を指定する領域に廃棄された。
【０１１０】
カラム内を動く未結合画分および続いて溶出された生成物が、タンパク含量を分析され、正常なヒト血漿プールに存在する、免疫グロブリンＧの９０％超が吸着剤に結合され、ついでリン酸カリウム緩衝液中に溶出されたことがわかった。アルブミンのような、他の主要タンパク画分は、これらの条件下では吸着剤に結合しなかった。
【０１１１】
操作時には、カラムは目視検査により観察されたが、吸着剤において、チャンネル形成または望ましくない乱流は、カラムの底部から約１０ｃｍ上方で観察されなかった。底部近くでは、いくらかの混合および乱流が観察され得たが、分配器の設計された作用によるものであった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膨張吸着（EBA）(expanded bed adsorption)システムに関する。それは、特に使い捨て可能なクロマトグラフィーカラムに関連するが、限定されない。
【背景技術】
【０００２】
発酵液（fermentation broths）の精製は、それから生物学的製剤を抽出するための、進展中の分野である。特に、モノクローナル抗体の精製は、治療および診断剤として、その開発に重要さが増加している。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ発酵液または微生物発酵液から、マウス、ヒトまたはヒト化された、形態で製造されるのが通常である。従来、その液は選択的な可逆沈殿プロセスにより精製され、そのプロセスは所望のイミュノグロビンを沈殿させることを目的とするが、溶液中の他のタンパクはそのままにするものである。しかしながら、このプロセスは時間がかかり、低純度の抗体を産生し、望ましくないタンパクと沈殿剤を含む上清の廃棄の問題を創り出す。その結果、発酵液を精製するためのクロマトグラフィーの使用が開発されてきている。
【０００３】
クロマトグラフィーは、互いに混和しない移動性相（mobile phase）および静止相(stationary phase)の使用を必要とし、それぞれは分離されるべき混合物の成分に対する異なる親和性を有する。２つの相に対して精製されるべき混合物の各成分の相対的親和性は、移動性相の流動の方向に、静止相を通る成分の移行速度を決定する。移動性および静止相の注意深い選定は、成分の移行速度が十分に異なり、各成分を静止相から分離して溶出させることを確かにすることにより、混合物中の成分の分離を可能にし得る。静止相は支持マトリックスであり得、成分に結合し得る官能基を有するリガンドが、それに取り付けられ得る。クロマトグラフィーを実施するために、２つの広い、通常の方法がある：静止相の充填床を用い、それを通って移動相は圧力の使用により強制される；または、膨張床吸着であり、そこでは移動相にかけられるは少なくとも大いに減少され、そして静止相の密度は、移動層の流速のある範囲で、安定な流動床を創り出すように選定される。
【０００４】
モノクローナル抗体の単離のために、クロマトグラフィーの最も広く用いられる方法は、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーである。この方法は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）に関連して使用され得、疎水性マトリックス（静止相）が効率的に抗体に結合するように、発酵液にリオトロピック塩を添加することが必要であり、つづいて固相から抗体を溶出するために減少した濃度のリオトロピック塩溶液を使用する。特に、リオトロピック塩の存在は抗体が消耗される原料の使用を妨げ得るので、リオトロピック塩の使用は廃棄の問題を生じさせる。あるいは、または付加的に、イオンクロマトグラフィーは、追加の精製段階として使用され得る。
【０００５】
プロテインＡクロマトグラフィーは、プロテインＡセファロースカラム上で実行され得る。これらのカラムの静止相は、２０回またはそれより多くまで使用可能であるが、再使用の前に水酸化ナトリウム溶液を用いて洗浄されなければならない。これは時間がかかり、精製装置の有意な休止時間（down-time）を必要とする。さらに、プロテインＡは、約１２を超えるｐH値で不安定であり、したがって水酸化ナトリウムを用いる各洗浄サイクルは、吸着剤の操作寿命を短くする。充填床溶出法は、カラムを含む装置が、カラムを通して移動性相の必要な流れを創り出すように、適用される背圧に耐えることができることを要求する。これは静止相を含むように永続的な設置を必要とするのが通常である。カラムは一般的にステンレス鋼または高荷重に耐える（heavy duty）ガラスであり、強度、ならびに静止相およびカラムの繰り返し洗浄に要求される条件に耐性、の点から選ばれる。これらのカラムは処分されるのではなく、何回も再使用される。精製されるべき混合物中の、細胞および細胞片のような粒子は、静止相の詰まり（clogging）を避けるために、カラムに導入する前に、混合物から除去されなければならない。ろ過および遠心分離のような清浄工程は高価で、時間がかかり、生成物の有意な損失をもたらす。さらに、プロテインＡリガンド自体も高価である。
【０００６】
したがって、抗体および発酵液のもっと安価で、もっと効率的な精製方法を提供しようとする努力がなされてきている。
【０００７】
プロテインＡ静止相に代わる静止相が提案されている。MBI Hypercel（登録商標）は商業的に入手し得る吸着剤であり、抗体との疎水性相互作用およびイオン相互作用の両方を含むと述べられる、メルカプト−ベンズイミダゾール−スルホン酸リガンドを含む。米国特許6,498,236号は、式M-SP1-X-A-SP2-Acidのリガンドを用いる抗体の精製法を記載し、ここでMはマトリックス骨格；SP1はスペーサー；XはO,SまたはNH;Aは単環もしくは二環の置換されていてもよい芳香族または複素環部分；SP2は任意のスペーサー；Acidは酸基である。WO97/10887は、タンパク様物質に対する、増加した選択性の疎水性リガンドを開示し、そこでリガンドの構造は少なくとも１つの環形成原子がNである複素環の実在（entity）を含む。WO03/024588は、疎水性およびイオン相互作用が可能な多型（multimodal）リガンドを開示する。
【０００８】
一般的に使用される充填床カラムに代えて膨張床吸着を用いることが開示されている。膨張床吸着は静止相を通る移動性相の上向き流を用いて実行され得、そこでは静止相は安定な流動床を形成するために、移動性相よりも密であることが要求され、あるいは移動性相の下向きの移動性相を用いて実施され得、そこでは静止相は安定な流動床の形成のために移動性相よりも密ではないようにするべきである。静止相は、混合物から目的化合物を吸着すべきであり、目的化合物に対して親和性が低い移動性相を用いて、望ましくない化合物を洗浄除去し、ついで目的化合物はその（それらの）化合物に対し高い親和性を有する溶出液を用いてカラムから溶出され得る。溶出は流動床を用いて生じ得、または圧力を溶出液にかけることにより充填床様式で生じ得る。膨張床移動相を通る移動性相の最大流は、静止相が安定な膨張床を形成するように、使用される粒子の密度および直径により決定される。膨張床吸着システムに使用される、調節された密度と直径を有する静止相媒体粒子は、多孔質複合材料を用いて製造され得、その孔径、粒径および密度が選択され得、所望ならば静止相を用いて精製されるべき化合物に対し親和性を有する被覆材で被覆され得る。この様な媒体の例は、Pharmacia Biotech（スウェーデン）の「Streamline matrix」およびUpFront Chromatography A/S （デンマーク）の「Front Matrix」であり、それらはともに アガロース球の内側の１つ以上の粒子からなる。WO00/57982は膨張床吸着における使用のための静止相を開示し、そこでは粒子の密度は2.5ｇ/mLであり、その平均粒径は５〜７５μｍ、そして粒子の芯は少なくとも3.0ｇ/mLを有する非多孔質材料である。適切な芯材料は鋼ビーズを含む。芯の被覆は荷電し得る基または親和性リガンドを有するポリマーベースマトリックスであり得る。
精製すべき混合物および移動性相の、静止相への導入は、流動床の安定な形成を可能にするが、従来技術において向けられていた課題である。その混合物および/または移動性相の導入による静止相でのチャンネル形成は、床の膨張の安定性を低下させ（たとえば逆混合および望ましくない乱流による）、そして分離効率を低下させることが知られている。この課題は、使用されるカラムの直径とともに増大し、したがって特に商業的規模の精製を意図されたカラムで激しい。WO99/65586およびWO01/85329は、混合物および/または移動性相がカラムに導入される分配器（distributor）を設けることにより、この課題を解決しようとする。WO01/85329において、その分配器は多数の出口を含み、それを通って液体はカラムに達するように進む。上昇流カラムの場合に、分配器はカラムの基部に設けられ、出口は、カラムに入る液体流から生じる静止相での乱流を最小とするために、カラムの底部方向に向けられるのが好ましい（すなわち、移動性相の移動方向に反対の方向）。分配器は、カラムの底部を越えて液体の分配を確実にするために十分速く回転され、しかし静止相で形成される「撹拌帯域」を最小にするために十分にゆっくりと撹拌され、そこでは安定な膨張が達成され得ない。非回転分配器の使用は、静止相にチャンネル形成、したがって比較的安定でない膨張を導く、ことは例に示される。WO99/65586において、流体の分配は、カラムの底部で静止相の磁気撹拌を用いて達成される。さらに、撹拌帯域の高さを最小にするのが好適である。
【０００９】
精製されるべき混合物中の粒子および不溶物によるカラムの部分的詰まりの課題は、従来技術において取り組まれてきた。WO2006/001867において、Pharmaciaにより開発され、商標Streamlineで販売されているシステムが検討されている。カラム底部で流動分配器プレートおよび静止相媒体の間に約２０μｍの孔径を有するスクリーンの設置することは、細胞および細胞破片の通過を許すが、静止相媒体がスクリーンから流動分配器プレートを通過するのを妨げると述べられている。その出願では、そのような配置は、ケーキブロックとして知られる、スクリーン入口の孔を塞ぐ粘着層を形成する粒子の固まり（clumps）の形成は防止しないと述べられている。WO2006/001867により提案されている、この課題の解決は、スクリーン入口の下のカラムの底部に入口および出口を用いることであり、その結果、流体の流れは「ケーキ」を洗い流すようにスクリーン入口底部を越えていく流れに循環され得る。あるいは、脈流またはカラムの振動の使用は、スクリーン入口から詰まりを除去するように提案される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許6,498,236号
【特許文献２】WO97/10887
【特許文献３】WO03/024588
【特許文献４】WO00/57982
【特許文献５】WO99/65586
【特許文献６】WO01/85329は
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述のように、広く使用されているプロテインＡカラムを清浄にし、その清浄さを確かめる必要性は時間がかかる不利を有しており、有意の時間を要し、その間に精製装置は使用され得ない。抗体の製造のための全体プロセスは、単一使用の振動（rocking）タンクにおいて実行されるが、発酵段階、単一使用フィルターとろ過による清澄、つづいて上述の生成物を獲得するクロマトグラフィー段階、および不純物を除去するための任意に１つまたは数個のクロマトグラフィーによる精製段階、つづいて使い捨て可能な膜を用いて実行される精製された生成物の膜ろ過である。したがって、単一使用の使い捨て可能な装置を用いて実行されない、操作の唯一の段階はクロマトグラフィー段階であることは明らかである。WO99/65586は、そこに記載されているカラムの使い捨て可能な態様を提供することが望ましいことを開示する。これらのカラムは機械的駆動撹拌ブレードまたは磁気撹拌棒を含む。
【００１２】
本発明者らは、使い捨て可能なカラムの使用は、システムの最小限の休止時間で使用した後に、交換され得る無菌カラムの供給を可能にすることがわかった。しかし、入口の上流に位置されt単一ポンプを用いて移動性相にカラムを通過させる通常の方法は、カラムのヘッドスペース（すなわち、移動相の上方で、その頂部の下方であるカラム空間）に圧力を創出し、その圧力は静止相媒体を通過した後に移動性相に出口を通過させるのに必要であり、したがって、WO99/65586に記載されているカラムは、このような圧力に安全に耐えることができなければならない。移動性相を出口に動かすように創り出される圧力に加えて、カラムは出口の意図しないブロック（たとえば閉じられたバルブ）に対して保護するために入口ポンプにより供給される最大圧力と評価される圧力であること必要とし、その間、入口ポンプはなお作動している。このようなポンプは設置に高価であり、輸送に重く、したがって使用者に高コストのために使い捨て用途に適用されることは少ない。カラムの圧力評価の必要性を無視しない空気ベントは、WO99/65586にカラムの任意の特徴として開示され、そして、空気ベントは、（ａ）静止相が膨張し、移動性相が出口を通って出ないように、安定な膨張床を確立する間、ヘッドスペースに負圧を与えるために；ならびに（ｂ）安定な膨張床の後に吸着相が形成される間、移動性相が出口を通って出るのを助けるようにヘッドスペースに正圧をあたえるために、使用される。したがって、WO99/65586におけるカラムは、たとえカラムが充填床溶出よりも膨張床溶出のために使用されるつもりであっても、ヘッドスペースに加えられる負圧と正圧に耐えることができなければならないことは明らかである。
【００１３】
もし最小限の背圧を必要とする膨張床吸着システムがクロマトグラフィー段階で用いられても、加圧された装置のための抑制（containment）を設けることは必要ではなく、カラムは上昇圧力に耐えることができる必要のない、軽く、使い捨て可能な材料から作られていてもよいこと、を本発明者は認識した。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
したがって、第１の態様において、本発明は分離されるべき少なくとも１つの成分を含む液体の上方流膨張床吸着クロマトグラフィーを実施する方法を提供し：カラムに含まれる静止相媒体に、入口を通って液体を供給し、変動し得る量のヘッドスペースの下の静止相媒体の膨張を生じさせること；静止相媒体により流体から少なくとも１つの成分を吸着させること；出口を通ってカラムから液体を回収すること；少なくとも入口を通る液体の流速の調節により静止相媒体の膨張を調節すること；ならびにカラムの外側の圧力に関してヘッドスペースにおける過剰圧力を、外側圧力＋０．１bar以下に制限すること、を含む。
好ましくは、過剰圧力は０．０８bar以下、もっと好ましくは、０．０５bar以下、たとえば０．０１bar以下、または０．００５bar以下である。
第２の態様において、本発明は、第１の態様に関連して用いられる装置を提供する。
第３の態様において、本発明は、第１の態様の方法および/または第２の態様の装置に関連して用いられるカラムを提供する。この態様によるカラムは：カラムへの液体の通路のための入口を含む下方部分；液体のための出口を含む上方部分；ならびにカラムに含まれる静止相媒体からなり、さらにカラムの上方部分はカラムの内部と外部の間に流体の接続を与えるベントを含む。
第４の態様において、本発明は、膨張床クロマトグラフィーで用いられるカラムを提供し：カラムへの液体の通路のための入口を含む下方部分；液体のための出口を含む上方部分；ならびにカラムに含まれる静止相媒体からなり、その入口は静止相媒体の動かされる撹拌には適合されない、を含む。
第５の態様において、本発明は、膨張床クロマトグラフィーを実施するための装置を提供し、本発明の第４の態様のカラムを含む。好ましくは、その装置は少なくともカラム入口上流の第１ポンプおよびカラム出口下流の第２ポンプをさらに含む。
第６の態様において、本発明は、分離すべき少なくとも１つの成分を含む液体の膨張床クロマトグラフィーを実施する方法を提供し：カラムに含まれる静止相媒体に、入口上流の第１ポンプにより入口を通って液体を供給し、変動し得る量のヘッドスペースの下の静止相媒体の膨張を生じさせること；静止相媒体により流体から少なくとも１つの成分を吸着させること；ならびに出口下流の第２ポンプにより出口を通ってカラムから液体を回収すること、からなる。好適には、その方法は、本発明の第４の態様によるカラムを用いて実施される。
【００１５】
以下に述べる好適な特徴は、本発明のすべての態様に適用し得、いかなる適切な方法でも組み合わせ得る。
適切には、ベントは保護フィルター、適切にはマイクロフィルター、を含み得、そしてフィルターは汚染物がカラムに入るのを防止し、および/または微生物がカラムを出、または入るのを防止する。
好適には、ベントはカラムにおける単純な開口である。あるいは、ベントは圧力開放バルブであってもよい。あるいは、ベントはカラムの外側圧力より低いヘッドスペースにおける圧力を保持するための手段を含み得る。
出口は管の形態であってもよい。管は移動可能であるので、管の上流端はカラム内の選定された位置に設けられ得る。たとえば、管の上流端はカラム内の移動性相の液面より下方であるか、静止相の高さより上方に位置される。適切には、このような位置取りは、管の上流端近くの、浮力のあるサポートの使用により達成され得、このサポートは移動性相の表面に浮き、移動性相の表面で、またはその下方で、管の上流端の位置を維持する。あるいは、このような位置は電気もしくは空気アクチュエーターのような機械的手段により達成され得る。好ましくは、電気もしくは空気リニアアクチュエーターは、カラム頂部の位置に環状シールされた開口により、上下に出口管を動かすためにカラムの外側に設けられる。好ましくは、１つの統合ユニットとして出口管を備える。あるいは、カラムは２つの部分、シールされたカラムおよび出口管、を備え、それらはカラム頂部のシールされた開口を通して管の挿入により使用される前に組み立てられる。いずれの場合も、出口管は、ついでポンプ管に接続され、カラムの最終的な使用に続き、カラムと出口管はカラムスタンド、アクチュエーターおよびポンプ（これらは生成物との接触はない）から分離され、そして処分される。
【００１６】
適切には、カラムは入口、出口および、ベントが含まれるときは、シールされ閉じられたベント、を備え得る。媒体の無菌性は製造者により検討され、使用者に保証され得るからである。これは、カラムが無菌静止相媒体で予備充填されるときに、特に好適である。入口、出口およびベント上のシールは、カラムの使用前に破壊される。適切には、入口、出口およびベントは、再びシールされ得る。この特徴は、カラムが使い捨てを意図されるときに特に好適である。したがって、シールされたカラムは無菌静止相含むように用意され、シールは使用前に破壊され、そして使用後にカラムは、好ましくは静止相媒体を含むユニット全体の処分前に再びシールされ得る。好適には、カラムは懸濁相ならびに静止相媒体を含み得る。好適には、その懸濁相は、使用前にカラムの輸送および/または貯蔵の間に静止相媒体の凝集を防止し得る物質を含む。これは、カラムが使用されるときに、膨張床の形成を容易にする利点がある。適切な物質は、グリセロール、ショ糖、デキストラン、PEG,PVPおよび洗浄剤（中性、負に帯電、正に帯電、または両性イオン）を含む。
懸濁相は、凝集防止物質の２つ以上の組み合わせを含み得る。適切には、懸濁相における物質の濃度は、低分子量に対して、少なくとも１％、好ましくは５％、好ましくは少なくとも１０％、たとえば少なくとも３０％、または５０％；ポリマーに対して、少なくとも０．１％、たとえば少なくとも０．５％、１％、２％、５％または１０％；そして洗浄剤に対して、少なくとも０．０１％、たとえば少なくとも０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、または５％である。
【００１７】
適切には、入口は静止相の駆動された撹拌を与えるために適用される、公知の種類の入口であってもよい。しかし、駆動された撹拌を与えない入口は、ある環境に、特にカラムが一回の使用および使い捨て可能に意図される場合に、好適であり得る。これは、カラム製造の複雑さとコストを最小にし、ハンドリング特性を向上するからである。単一回使用のために用意されるカラムは、できるかぎり簡単に必要なラインに位置され接続され得ることが必要である。さらに、カラムはハンドリング上の制限なしに輸送に耐えることができなければならない。
【００１８】
十分な密度を有する静止相媒体を用いるとき、静止相でチャンネルおよび乱流の形成を防止するために静止相媒体を撹拌することは不要であることがわかった。さらに、静止相媒体を支持するためのスクリーン入口の設置は不要であり、このようなスクリーンの詰まりの問題を除去するものである。膨張床吸着クロマトグラフィーに要求される装置への、このような簡素化は、使い捨て可能な装置を、上述の理由のために実施可能にし得る。
【００１９】
したがって、本発明者は、静止相の間に移動性相を均一に分配する駆動された撹拌を使用しないで、安定な膨張床を驚くべきことに提供する入口を発明した。このような入口は、本発明の第３の態様のベント付きカラムに関連して、ならびに本発明の第１および第２の態様の方法および装置において使用され得る。しかし、このような入口には、本発明の第４の態様の入口のような、孔を開けられていないカラム、ならびに膨張床クロマトグラフィーの方法、たとえば本発明の第６の態様のような、孔を開けられていないカラムを用いる方法においても使用され得ると当業者により認識され得る。
【００２０】
このような入口は、開放端管として形成され得る。管の開放端は、そこからの液体の流れはいかなる所望の方向、たとえば水平に、垂直に上方に、または垂直に下方に、設けられ得る。しかし、好適には、入口は少なくとも１つの開口を有する液体分配器で終わる入口導管を含む。好ましくは、少なくとも１つの開口は水平もしくは下方に傾斜した方向、すなわちその水平下方に０度より大きく、カラムの下方端の方向に向けられている。もっと好適には、その少なくとも１つの開口は、水平下方に少なくとも４５度、たとえば水平下方に９０度、向けられている。適切には、その少なくとも１つの開口は、実質的に円形の孔の形状であり得る。あるいはその開口は細長い小さな孔（slot）の形状であってもよい。適切には、少なくとも１つのドーム状または円錐状のカバー（cowl）が入口の上方に設けられていてもよく、カラムの上方端に向けられた頂点を有する。そのようなカバーは部分的に入口を囲んでいてもよい。適切には、水平方向のバッフル表面は入口の上方または入口と実質的に同じ高さに設けられていてもよく、そのような表面はカバーの底部を形成し得る。
【００２１】
あるいは、入口は、液体の分岐した流れを創り出す手段を含んでいてもよい、少なくとも１つの管からなっていてもよい。適切には、このような分岐流は、流体の実質的に円錐状の分配を形成し得、そのような円錐状の分配は６０度のような、少なくとも４５度の半角を有する。適切には、入口は少なくとも１つのノズルを含む。適切には、管は管壁を横断し、内面であるプレートを含み得、そのプレートは液体のらせん流を創り出すように配置されている。適切には、そのようなプレートは入口を通って静止相媒体の通路を妨げるように適合され得る。適切には、そのような管は、カラムの内部下方端がカラムの下方端の方向に半径を減少するカップを形成する、カラムに関連して使用され得る。要求される内部形状にカラムを成形することにより、またはカラムの下方部分への適切な形状のインサートを差し込むことにより、そのような形状が形成され得る。いくつかの管を含む入口の場合には、カラムの下方部分の内部表面は、各管に集中された、減少する半径のカップを与えるように形成されるのが好適である。
【００２２】
あるいは、入口は、カラムを越えて伸び、かつ少なくとも１つの開口をその中に備える、少なくとも１つの管を含み得る。適切には、少なくとも１つの開口は、水平にまたは下向きに面しており、たとえば水平に少なくとも０°、たとえば水平に４５°、好ましくは水平に９０°である。適切には、少なくとも１つの開口は、そこから液体の分岐流を供給するように適合され得る。適切には、入口は、少なくとも１つの管に液体を接続する、中心部の空チャンバーを含む。
【００２３】
好適には、少なくとも１つの開口の大きさは、汚染物（たとえば、処理されるべき液体に含まれる粒子および不溶物）の大きさに比べて大きい。しかし、少なくとも１つの開口は、所定の流速で意図された流動分布を与えるのになお十分に小さくなければならない。
【００２４】
好適には、少なくとも１つの開口は、最小大きさが０．０５ｍｍ、たとえば少なくとも０．１ｍｍ、および最大大きさ２ｍｍ、たとえば最大大きさ１ｍｍ、または最大大きさ０．７５ｍｍである。
【００２５】
カラムの底部を通る横方向の液体流れはないのが好ましい。入口の上方に開口プレートが備えられていないのが好ましい。
【００２６】
上述の流動分布デバイスについて、チャンネル形成なしに、意図された流動分布を得るために、EBAカラムに適用される線流速は少なくとも３ｃｍ/分、たとえば少なくとも４ｃｍ/分、少なくとも５ｃｍ/分、すなわち６，７，８，９もしくは１０ｃｍ/分である。
【００２７】
適切には、静止相媒体は少なくとも１．５ｇ/ｍLの密度を有し、たとえば少なくとも１．８ｇ/ｍL、たとえば２．０ｇ/ｍLである。特に好ましくは、静止相媒体は２．５〜４．０ｇ/ｍLの密度を有する。好ましくは、静止相媒体は２０〜２００μｍの平均粒径、もっと好ましくは４０〜１６０μｍの範囲、なおもっと好ましくは６０〜１２０μｍの範囲、さらには７０〜１１０μｍの範囲、さらにもっと好ましくは８０〜１００μｍの範囲である。
【００２８】
膨張床カラムに適用される原材料が、高い濃度の全細胞または細胞片を含む粗発酵液であるとき、操作時に許容し得る床膨張を生じさせるとともに高密度を有する静止相媒体を使用するのが特に有利である。したがって、原料が５％vol/volを超える細胞および/または細胞片、たとえば１０％vol/vol超、たとえば１５％vol/vol超、たとえば２０％vol/vol超、たとえば２５％vol/vol超、を含むとき、静止相媒体の密度は少なくとも２．８ｇ/ｍL、たとえば少なくとも３．０ｇ/ｍL、たとえば少なくとも３．５ｇ/ｍL、たとえば少なくとも４．０ｇ/ｍL、たとえば少なくとも４．５ｇ/ｍLであり、そして平均粒径サイズは５０〜１１０μｍの範囲、たとえば７０〜９０μｍである。
【００２９】
好ましくは、静止相媒体は鋼鉄ビーズもしくは粒子、または炭化ケイ素ビーズもしくは粒子である。
【００３０】
流速、粒子サイズおよび粒子の密度は、流動床の膨張にすべて影響し、カラム内に粒子を保持するように膨張の程度を調節することが重要である。膨張の程度はH/HOとして決定され得、ここでHOは充填床モードにおける床高さであり、Hは膨張モードにおける床高さである。
【００３１】
好ましくは、静止相媒体の使用での膨張H/HOの程度は３．０〜１．２の範囲、たとえば２．５〜１．３、２．２〜１．４または２．０〜１．５である。好ましくは、H/HOの最大値は３．０、もっと好ましくは２．５、たとえば最大２．２、２．０、１．８、または１．６である。好ましくは、膨張の程度は少なくとも１．２、たとえば少なくとも１．３、たとえば少なくとも１．４、たとえば少なくとも１．５である。
【００３２】
好ましくは、カラムが保持するように適合される最大圧力は０．３５atmであり、たとえば最大０．３０atm、０．２５atm、０．２０atm、０．１５atm、０．１０atm、０．０５atmである。
【００３３】
EBAカラムは好ましくは低コストのプラスチックス材料から製造され得、好ましくは透明または半透明のプラスチックス材料である。好ましくは、プラスチックス材料は、毒性化合物の最小の漏れで医薬生成物の製造に用いる、安全性の要求にさらに合致する。適切なプラスチックス材料の例は、ポリプロピレン、ポリエチレン、TPX（メチルペンテンコポリマー）、ポリカーボネート、プレキシガラス（plexi-glass）およびPVCである。好ましくは、カラムは射出成形または押出しで製造され得る。
【００３４】
いくつかの状況下で、EBAカラムはガラスから製造するのが好適であり得る。
【００３５】
適切には、本発明の第３または第４の態様によるEBAカラムは、２つのポンプに接続して供給され得、１つは入口の上流に位置され、１つは出口の下流に位置される。
【００３６】
クロマトグラフカラムの分離効率は、所定のカラムにおける理論段数Nの用語で表現され、充填床の１ｍあたりの理論段数N/ｎとして標準化される。その数字が大きければ大きいほど、カラムが持つクロマトグラフ分離効率は良くなる。
【００３７】
膨張床カラムに関して、理論段数の数は滞留時間分布試験（ハンドブック「Expanded Bed Adsorption」14〜１６頁、Edition AA, ISBN 91-630-5519-8, Amersham Pharmacia Biotech, スウェーデン ）により決定され得、それはトレーサー刺激法であり、膨張床における長軸方向混合（分散）の程度を評価するのに用いられ得る。高理論段数は長軸方向混合（または望ましくない乱流およびチャンネル形成）の低い度合い、それによる高い分離効率の度合い、を示す。さらに、上記ハンドブックに記載されるように、もし膨張床カラムがカラム中の理論段数N＝２５〜３０または沈降した吸着剤の１ｍあたりのN/m＝１７０〜２００段、を有するならば、単純な結合および放出（捕捉および放出）を含むいくつかの適用について、N/m＝１７０〜２００の数で示されるような高い分離効率を有する必要はなく、そこでは理論段数５０〜７５N/mを有するカラムを作用させるので十分であり得る場合である。
【００３８】
充填床カラムについて、流速が増加するとき、理論段数および分布効率が減少することは一般的に知られており、このことは、線流速が吸着剤ビーズの終端沈降速度（terminal settling velocity）に近づくとき、または物質移動運動学（mass transfer kinetics）が制限因子になるときには、膨張床カラムについても予測されよう。
【００３９】
驚くべきことに、本発明によるカラム入口が、非常に高密度の吸着剤ビーズを含む膨張床において使用されるとき、理論段数は高くとどまり、非常に幅広い範囲の流速内で（タンパクおよび他のバイオ分子を高生産性で製造するのに特に適している）、流速の増加とともに理論段数はなお増加することを見出した。
【００４０】
本発明によるカラム入口、吸着剤密度、粒径および高流速の特定の組み合わせは、従来法と異なり、いくつかの重要な課題を同時に達成する、非常に魅力的な膨張床システムをもたらすことを見出した。特に、カラムにおける過剰圧力の回避を含む、本発明の組み合わされた特徴は、低コスト材料から製造されるシール可能なカラムにおいて、高流速で（すなわち吸着剤の単位体積あたりの高生産性）、高い分離効率（高理論段数）を有する膨張床カラムの製造と使用を可能にする。
【００４１】
したがって、線流速少なくとも５cm/分、たとえば少なくとも６cm/分、７，８，９，１０または１５cm/分で試験されるとき、理論段数少なくとも２５、たとえば少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０または２００を有する、本発明による膨張床カラムを使用することは特に好適である。
【００４２】
同様に、線流速少なくとも５cm/分、たとえば少なくとも６cm/分、７，８，９，１０または１５cm/分で試験されるとき、理論段数少なくとも５０N/n、たとえば少なくとも７５、１００、１２５、１５０、１７５または２００N/nを有する、沈降吸着剤１ｍあたりの理論段数を有する、本発明による膨張床カラムを使用することは特に好適である。
【００４３】
好ましくは、カラム入口が静止相媒体の駆動撹拌に適用されないとき、本発明による方法においては、少なくとも２．５ｇ/ｍLの密度、たとえば少なくとも３．０ｇ/ｍL、そして少なくとも５ｃｍ/分の入口を通る液体の流速、たとえば少なくとも７．５もしくは少なくとも１０cm/分、が用いられる。
【００４４】
好ましくは、本発明の第２または第４の態様による装置は、少なくとも入口上流の第１ポンプおよび出口下流の第２ポンプを含む。好ましくは、ポンプはぺリスタルチック（ぜん動）ポンプである。
【００４５】
入口上流の第１ポンプおよび出口下流の第２ポンプの使用は、ベントのある、またはベントのないカラムに関して、そしてベントのある、またはベントのないカラムを使用して膨張床吸着を実施する方法において、用いられ得ると理解されよう。
【００４６】
好適には、装置は液レベル用のモニターおよび/またはカラム中の静止相媒体のレベル用のモニターをさらに含む。適切には、モニターは超音波モニターまたは光学的モニターであり得る。好適には、そのようなモニターは超音波モニターである。
【００４７】
適切には、装置は、出口管の上流端の位置を調節するためのコントローラー（適切にはリニアアクチュエーターの形態である）をさらに含み、出口の形状は前述のとおりに用いられる。カラム内側に出口管を位置させるアクチュエーターの調節は、液レベルおよび/またはカラム中の静止相媒体のレベルを測定するモニターに結合され得るのが好適である。
【００４８】
適切には、装置はさらに発酵液を含み得る。適切には、装置は消費された発酵液のための容器を含み得る。適切には、装置は溶出物源をさらに含み得る。適切には、装置は発酵液の少なくとも１成分のさらなる精製のための手段、たとえばメンブレンフィルター装置をさらに含み得る。
【００４９】
好適には、静止相媒体の膨張の調節は、液体をカラムに送るための、入口上流の第１ポンプの使用により達成される。
【００５０】
好適には、膨張された静止相媒体上方の液体レベルはカラムから液体を送るための出口下流の第２ポンプにより調節される。
【００５１】
好適には、静止相媒体の膨張は液体レベルおよび/またはカラム内の静止相媒体レベルを超音波モニタリングすることにより決定される。このようなモニタリング法はこの分野で知られている。
【００５２】
好適には、過剰圧力の制限はベントを用いて達成される。
【００５３】
好適には、出口は適用される管を含み、その管の上流端はカラム内で選定される位置に移動され得、さらに方法はカラム内の所望の位置に管の上流端を移動させる段階を含む。
【００５４】
好適には、本発明の第１の態様による方法は、さらに次の段階を含む：
シールされた入口を含む下方部分とシールされた出口を含む上方部分とを有するカラムに含まれる静止相媒体を用意すること、シールされていないとき、それらがカラムの内部と外部の間の流体接続を与えること；ならびに液体を静止相媒体に供給する前に入口、出口およびベントからシールを除去すること。
【００５５】
好適には、本発明の第６の態様による方法は、さらに次の段階を含む：
シールされた入口を含む下方部分とシールされた出口およびシールされたベントを含む上方部分とを有するカラムに含まれる静止相媒体を用意すること、シールされていないとき、それらがカラムの内部と外部の間の流体接続を与えること；ならびに液体を静止相媒体に供給する前に入口および出口からシールを除去すること。
このことは、カラムがベンダーから予備充填されて供給されることを可能にし、静止相媒体のみならず、上述のように懸濁相、たとえば凝集阻害剤を含む、も含むであろう。
【００５６】
好ましくは、本発明の第１または第６態様による方法は、少なくとも１つの成分の吸着を可能にした後に、さらに次の段階を含む：
静止相媒体が少なくとも１成分を溶出させること；そして吸着および溶出段階の少なくとも１つの反復の後に、カラムを処分すること、好ましくはカラムは、カラムが最初に使用されたのと同一の静止相媒体をなお含む。
【００５７】
しかし、適切には、本発明方法は、静止相媒体を清浄化すること、静止相媒体の清浄度を検査すること、および少なくとも１つの成分の溶出後に膨張床装置を再使用すること、の段階を含み得る。好ましくは、清浄化および再使用は撹拌段階なしで行われる。しかし、清浄度の検査は、カラムおよびその接続の内側の異なる部位で細菌テストのための検査用標本（swabs）を採取することにより、および/または吸着剤サンプルを採取し、細菌混入に関して試験し、および/またはビーズ表面の異物の存在を試験することにより、実施され得る。
【００５８】
好適には、静止相媒体が少なくとも１つの成分を溶出した後に、そしてカラムの廃棄の前に、方法は、カラムのベント（もし適用可能であれば）、出口および入口を再シールする、段階を含む。
【００５９】
好適には、液体の少なくとも１つの成分はタンパクである。
【００６０】
好適には、チャンバーの内容物は、液体、溶出物または入口を通る他の液体の導入、以外の手段により撹拌されない。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】本発明の用いるカラムの模式図。
【図２】本発明の代替的な液体供給手段を示す図。
【図３】本発明の代替的な液体供給手段を示す図。
【図４】本発明の代替的な液体供給手段を示す図。
【図５】本発明の代替的な液体供給手段を示す図。
【図６】本発明の代替的な液体供給手段を示す図。
【図７】本発明の代替的な液体供給手段を示す図。
【図８】本発明の代替的な液体供給手段を示す図。
【図９】本発明の代替的な液体供給手段を示す図。
【図１０】本発明の代替的な液体供給手段を示す図。
【図１１】本発明の代替的な液体供給手段を示す図。
【図１２】本発明の代替的な液体供給手段を示す図。
【図１３】本発明装置の模式図。
【図１４】例１の実験結果を示す図。
【図１５】例２の実験結果を示す図。
【図１６】例３の実験結果を示す図。
【図１７】例４の実験結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
図１に関して、カラム１０は、静止相媒体２を含む。それは、前述のように従来の態様で、プラスチックス材料またはガラスで形成され得る。たとえば、カラム１０はポリエチレンのようなプラスチックス材料から成形され得る。この材料は、強くて、軽くて、使い捨て可能であり、安価であるので、カラム１０が単一の使用を予定されているときに特に好適である。カラム１０は、実質的に
円筒形状であるのが通常であり、下方部分４に下端を、そして上方部分８に上端、を有する。下方部分４は入口２０を備える。入口２０は、バルブ６または他の適切なシール手段を備え、静止相２または輸送中にそれを囲み得る液体の流出を防止し、そしてカラムが使用のために必要な装置に接続されるときに開けられ得る。同様に、上方部分８を通って、出口１４とベント１２が設けられ、その両方または一方はバルブ６または他の適切なシール手段を備えていてもよい。好適な態様において、カラム１０は単一用途のために意図される単一シールユニットとして供給され得る。好ましくは、カラムの上方閉鎖はカラムに損傷を生じさせることなく取り外し可能ではなく、カラムの再使用または静止相媒体の取替えを防止する。しかし、上方部分８は、静止相が取替えられ得るように、および/または静止相が洗浄され得るように、取り外し可能であってもよく、カラム１０は再使用され得る。
【００６３】
ベント１２の好適な形状は、カラムの頂部の簡単な開口であり、下記のような保護フィルターを含んでいてもよい。しかし、ベントはバネまたは重力バイアスのボールバルブまたはニードルバルブのような、圧力開放バルブの形態でもよく、そこではヘッドスペースの圧力はバルブがヘッドスペースの圧力を開放するのに適用される圧力に依存する、カラム外側の圧力を超える、選ばれた量であり、あるいはベントはチャンバー外側の圧力より低い圧力にヘッドスペースを維持するポンプの形態をとり得る。
【００６４】
適切には、静止相媒体はベントまたは出口により少量を除去することにより試料採取され得る。しかし、カラムが限定された使用を意図され、続いて廃棄さるときは静止相媒体の試料採取が必要ということはない。
【００６５】
図２Aは、カラムを上方から示す図２Cにおける線X-Xに沿って切り取られた、カラム１０の断面図である。図２Bは斜視図における断面２Aを示す。図３〜１２A〜Cは同様に配置される。
【００６６】
図２は、図１に示されるカラム１０の下部を示す。入口２０は、垂直表面における小さな開口３０を有する、閉じられた管としてここに示される。入口２０の閉鎖端は円錐形状を有するように示される；他の閉鎖端形状も置換され得ることが当業者には理解され得るであろう。開口３０は、好ましくは粒子または処理される液体中に存在する他の不溶性物質の大きさよりも大きいのが好ましい。これはカラム１０に液体を導入する前に予備的なろ過または清澄化段階を要求しない利点があり、精製プロセスを簡素化し、短縮する。さらに、開口３０は下向きの角度を有するのが好ましく、その結果、入口２０を囲む静止相粒子（図示せず）によりブロックされず、さらに噴出を制限することにより、静止相中の液体の噴出により生成される乱流をカラム１０の底部に向ける。さらに、これは静止相媒体が開口を塞ぎ、または開口３０を通って入口２０を通過するという問題を生じさせないで、流体中の予期された大きさの粒子よりも有意に大きい開口３０を可能にする。このように、液体中の粒子または静止相媒体により生じる開口３０の詰まりの可能性は最小にされる。
【００６７】
図３は入口２０の代替的な態様を示し、そこでは開口３０は溝の形状である。さらに開口の大きさは液体中の不溶性物質に比べて大きいのが好ましく、そして開口は好ましくは下向きである。
【００６８】
図４および５は、図２の入口を示すが、さらに円錐カバー４０を有する。円錐カバー４０は、開口３０を出た後に、下向きの液をカラム１０の底部に向けるように作用し、液体が円錐の基部まわりを均一に流れ、カラムの頂部に静止相を上昇させることを可能にする。さらに、静止相２の乱流およびチャンネル形成は、開口３０の近くの静止相部分が円錐カバー４０の水平（下方）隔壁表面により静止相の大部分が分離されるので、最小化される。
【００６９】
カバー４０は入口２０を形成する管のエンドキャップとして作用し得、そしてカバーは開口３０を囲み得（図４に示されるように）、または開口の上方に位置され得る（図５に示されるように）ことが図面からわかる。
【００７０】
図６は、図３に示される入口とともに図５に示されるように円錐カバー４０を示す。
【００７１】
図７は、下方端でカラム１０の容積、したがって入口２０を囲む静止相の容積、を減少させる、円錐インサート５０とともに図２の入口を示す。円錐体積で創り出される静止相乱流は、液体と接触しない静止相の存在による、カラムの「デッドスペース」を形成し、膨張床の部分を形成しない可能性を低下させる。インサート５０の使用により達成されるカラム１０の下方部分の内部形状は、内部表面に要求テーパー形状を有する、カラム下方部分を形成することによっても達成され得ることが期待される。
【００７２】
図８は、円錐インサート５０とともに図３の入口を示す。
【００７３】
図９は、入口２０の代替的態様を示し、そこでは開口３０は拡散、分岐した噴出を供給するように適合されたノズルの形態である。適切には液体噴出により記載されるコーンの半角は少なくとも４５°、たとえば６０°であり得る。好適には、そのようなノズルは、図に示される円錐インサート５０とともに使用され、カラム中のデッドスペースが最小化される。円錐インサート５０の傾斜面により記載される半角は、液体の噴出により記載されるのと実質的に同じであるのが適切であり、静止相２の最大可能量が液体と接触される。
【００７４】
図１０は、入口２０の代替的態様を示し、その入口は管を通る液体に回転を生じさせるように適合された内部壁上にプレート６０を備える管である。開口３０は、カラム１０の下方部分４と同じレベルであり、管２０と同じ径を有するが、これに制限されない。このように回転液体は開口３０に達する際に、分岐した噴出を形成し、カラム１０内に広く分散される。好ましくは、この入口は開口３０と同じ径の、比較的小さな開口を有する円錐インサート５０とともに用いられる。それによって、分岐した噴出は開口３０の近くで実質的にすべての静止相と接触することができ、カラムにデッドスペースが形成されるのを避ける。円錐インサート５０なしに、開口３０により製造される分岐噴出は図１０Aの網状陰影領域を占める静止相と接触するように十分に分岐したものになりにくい。入口２０により製造される液体噴出は噴出により静止相にチャネル形成が生成されないように、十分に分散されるべきである。
【００７５】
図１１は、図１０に示される、４つの入口２０を持つカラム１０を示す。この配置は少なくとも径２０ｃｍのような、大きい径のカラムに適している。さらに、この４つの入口への液体竜の分割は、液体がカラム１０の下方部分にわたってもっと均一に分散されるのを可能にする。複数の入口の、このような配置は上述の入口の態様も使用し得る。
【００７６】
図１２は、代替的な入口２０を示し、カラム１０内に放射状に伸びる管７０を含む。開口３０は管７０に設けられている。処理されるべき液体は、中央の管８０を通って放射状管７０に供給され、開口３０を通過する。好ましくは、開口は上述の理由から、下方に向けられる。多数の開口は管７０のそれぞれに設けられ得、多数の管７０が設けられ得る。さらに、開口は処理されるべき液体中の粒状物または不溶物に比べて大きいのが好ましい。
【００７７】
静止相２は、少なくとも１．５ｇ/Lの密度を有するので、本発明の供給装置は静止相膨張床に静止相の比較的低い性能をもたらす、不安定および乱流を生じさせない。静止相媒体の平均粒径は２０〜２００μｍの範囲であり得る。適切な静止相はWO９２/００７９９およびWO００/５７９８２に記載のものを含む。
【００７８】
図１３は、本発明の第２の態様による膨張床クロマトグラフィを実施するための装置の模式図である。その装置は、入口２０、出口１４およびベント１２を有し、静止相媒体を含むカラム１０を含む。
【００７９】
この図において、ベント１２はその開口にわたって備えられたフィルター１６を有する。このようなフィルターは、埃および細菌のような汚染物のカラム１０への、および/または、からの、入口および/または出口を防止するのに用いられる。適切なフィルターはPall Corp.からの一般用ガスフィルターのようなマイクロフィルターであり得る[製品No.９００４５００Pallflex media,4.8-3.2mm(3/16-1/8インチ)HBまたはPall Corp.からのIntervene(商標)Intervene High-Flow filter] 。
【００８０】
入口２０は図２〜１２に関して述べられたように、カラム内容物の撹拌に適用されない入口であってもよく、あるいは機械的に駆動される回転入口または磁気駆動回転入口のような、公知の種類の入口であってもよい。この種の入口は、WO99/６５５８６に記載されている。
【００８１】
入口２０、出口１４およびベント１２がそれぞれ示され、カラムの使用前および使用後に入口、出口およびベントを閉じ、シールし得るバルブ６を有する。このように、カラム内容物はカラムの使用前に殺菌を保持され得る。そして、カラムが単一使用または限定された数の使用に続いて廃棄されるために静止相で予備充填されて供給されるように意図される場合には、カラムはサプライヤーにより、確かな殺菌状態で供給され得、そして内容物の安全な廃棄を促進するように使用後に閉じられ得る。
【００８２】
出口１４は、カラム内で所定のレベルに移動され得る管の形態でここに示される。この管は出口１４を一体的に備え、または図１に示されるように出口１４を通って導かれる別個のものであってもよい。管と出口１４との界面は、カラムに入り、もしくはカラムを離れる微小汚染物なしに管が上下にすべるのを可能にするリップシールでシールされ得る。管の外側部（しかし、カラムの外側に位置する管の部分は管の位置が下方に調節されるとき、内側に入り得る）は、固定されたフレキシブル管により被覆され得、細菌または化学的汚染を防止するために任意に殺菌ガスでフラッシュされ得る。出口の上流側は、カラムの使用時に、液体１８のレベルの下方に置かれ、そして静止相２の上方レベルの上方に置かれるのが望ましい。したがって、手段（図示されていない）は、カラム内の適切な位置への出口１４の上流端の移動を可能にするように備えられる。これは、モーター駆動の使用者が操作する手段により；液体１８レベルで、もしくは少し下に出口１４の上流端を保持する浮力ある支持体の使用により；または好ましくは液体１８のレベルおよび/または静止相２のレベルを監視するモニター２６からのフィードバックに応ずるモーター駆動手段により、達成される。このようなモーター駆動手段は気力アクチュエーターまたはエレクトリックアクチュエーターであり得る、リニアクチュエーターであり得る。
【００８３】
モニター２６は、カラム内で液体および/または静止相レベルを監視できる、いかなる形のモニターであってもよい。たとえば、モニターは光学モニターであり得る。しかし、液体１８、静止相２および/またはカラム１０が組み立てられる材料は個別にまたは一緒に不透明であるので、モニター２６として超音波モニターを用いるのが好ましい。モニターは、入口２０の上流のポンプ２２；出口１４の下流のポンプ２４；および出口１４の上流端に位置するコントローラー（図示せず）、のいずれか、または全部にフィードバックを提供する。
【００８４】
入口２０の上流および出口１４の下流は、入口を通ってカラムに液体を供給し、出口を通ってカラムから液体を押し流すためのポンプを備える。これらのポンプは、この分野で知られている、いかなる適切なポンプであってもよい、しかし、液体がポンプ自体の部分と接触しないぜん動ポンプを用いるのが好適である。適切なぜん動ポンプの例は、Cole-Parmer からのWatson-Marlow Bredel サニタリポンプまたはMasterflex ぜん動ポンプを含む。ポンプの清浄化の必要なしに、ポンプを通過する配管およびカラムの入口、出口への接続は一度用いられ、そして廃棄され得るので、ぜん動ポンプの使用は、液体の精製のための単一使用装置お提供する目的にかなう。
【００８５】
使用において、カラム１０は装置の間に置かれ、ポンプ２２に導く配管に入口で接続され、そしてポンプ２４に導く配管に出口で接続される。ついで、入口２０、出口１４およびベント１２のシールが解かれる。処理される液体は、ポンプ２２により入口２０を通って駆動されてカラム１０の下方端で静止相２の間に均一に分配される。ついで液体は静止相２を通って上方に流動し、静止相の膨張を生じさせ、そしてポンプ２４により出口から追われる。液体の流速は静止相の密度および粒径とバランスされるべきであり、その結果静止相２は十分に膨張し、安定な膨張床を形成するが、カラム１０の頂部からオーバーフローしない。要求される流速は、２つのポンプ、すなわちカラム１０の入口２０の上流の１つのポンプ２２およびカラム１０の出口２４の下流の１つのポンプ２４、の使用により維持される。静止相の膨張および静止相のレベル上方の液体レベルはモニター２６を用いて監視される。モニター２６は、２つのポンプ２２および２４にフィードバックを与えるので、これらのポンプの流速は個別に制御され、望ましい度合いの静止相の膨張および静止相のレベル上方の液体レベルが達成される。さらに、入口への、そして出口からの流速を測定するために、マスフローメーターのような正確なフローメーターの使用は、系の独立したマニュアル制御を促進する。膨張の程度はカラムへの流速により支配されるので、入口ポンプに本質的に制御される。膨張された媒体上方の液体の高さは、液体レベルを上昇させるために出口ポンプにより流速を一時的に低下させることにより、そして液体レベルを低下させるために出口ポンプにより流速を一時的に増加させることにより、制御され得る。さらに、モニター２６は、出口１４の上流端の位置を決定するコントローラー（図示せず）にフィードバックを提供し得るので、静止相の膨張および使用時に、出口の上流端は液体レベルの下方であるが静止相のレベルの上方、のような所望の位置に維持される。
【００８６】
しかし、あるいは、出口１４の上流端の位置はカラムの操作者により決定され得、または液体表面の下の小さな距離のような、液体表面に関し選定された位置に出口１４の上流端を維持する浮き支持体の使用により決定され得る。
【００８７】
静止相の膨張、およびカラム１０内の液体および/または静止相のレベルの続く調節の間、カラムにおける液体レベル上方の空気の圧力はベント１２によりカラム外側の圧力と平衡になることが可能である。このように、カラムは有意の圧力増強なしに操作され得る。カラム１０の上方部分が大気圧より有意に高い圧力に耐える必要がないので、このことはカラム１０の組み立てのために、この分野で通常しようされてきたものよりも比較的軽い材料の使用を可能にする。
【００８８】
好ましくは、カラム１０および静止相２は、関心のある化合物の吸着とその溶出のために、膨張床形態で使用される。
【実施例】
【００８９】
例１ 本発明による膨張床カラムにおいて理論段数の測定
膨張床吸着カラムが図１３に示すように（しかし図９による入口（コーン高さは１５ｃｍ）を有する）、組み立てられ、２つのぜん動ポンプ（Watson Marlow）に接続された。それは沈殿床高さ２５ｃｍに等しい吸着剤量を含んでいた。吸着剤はアガロース−タングステンカーバイド複合ビーズからなり、平均径（体積）（ｄ（０．５））１４９μｍで密度３．１ｇ/ｍLであった。吸着剤はクランピングと密充填を避けるために２５％グリセロール溶液に懸濁された。使用直前に、カラムは３０床容量の脱イオン水で洗浄された。
【００９０】
カラムは流速の関数として１ｍあたりの理論段数の測定（滞留時間分布測定、RTD）により試験された。
【００９１】
ハンドブック「Expanded Bed Adsorption」14〜１６頁、Edition AA, ISBN 91-630-5519-8, Amersham Pharmacia Biotech, スウェーデンに記載され、膨張床吸着の分野の当業者に一般的に使用されている、ネガティブ ステップ インプット法がシステムの性能を評価するのに使用された。
【００９２】
アセトン溶液（０．５％水溶液）が所定の流速でカラムにポンプで送られ、カラムの出口で送り出され、波長２８０ｎｍ（ＵＶ光）で流体の吸収が測定され、記録された。アセトンがＵＶ信号によって一定濃度でカラムから出るとき、流動溶液はアセトンから水に変更された。水での洗浄はアセトン溶液がある間、同一流速で実施された。水でのカラム洗浄は、記録されたＵＶ信号によりすべてのアセトンが洗い出されるまで、継続され、実験が停止され、そして１ｍあたりの理論段数が、記録されたＵＶ信号から流速の関数として計算/測定され、プロットされた。
【００９３】
実験は、表１により異なる流速の範囲を用いて繰り返され、そして流速と観察された理論段数の関係が表１および図１４に示されるように記録された。
【００９４】
【表１】
【００９５】
実験の結果は、静的分配器および流動床システムが測定された流速にわたって増加する固体相支持体の１ｍ沈殿床あたりの理論段数（Ｎ）を持つことを示す。さらに、5ｃｍ／分を超える流速が少なくとも１００Ｎ/ｍの理論段数を得るのに必要であることを示す。
例２ 本発明による膨張床カラムにおいて理論段数の測定
膨張床吸着カラムが例１のように（しかし図８による入口（コーン高さは１５ｃｍ）を有する）、組み立てられた。それは沈殿床高さ２５ｃｍに等しい吸着剤量を含んでいた。吸着剤はアガロース−タングステンカーバイド複合ビーズからなり、平均径（体積）（ｄ（０．５））１３０μｍで密度２．８ｇ/ｍLであった。吸着剤はクランピングと密充填を避けるために２５％グリセロール溶液に懸濁された。使用直前に、カラムは３０床容量の脱イオン水で洗浄された。
【００９６】
カラムは、例１に述べるように、流速の関数として１ｍあたりの理論段数の測定（滞留時間分布測定、RTD）により試験された。
【００９７】
実験は、表２により異なる流速の範囲を用いて繰り返され、そして流速と観察された理論段数の関係が表２および図１５に示されるように記録された。
【００９８】
【表２】
【００９９】
実験の結果は、静的分配器および流動床システムが測定された流速にわたって増加する固体相支持体の１ｍ沈殿床あたりの理論段数（Ｎ）を持つことを示す。さらに、5ｃｍ／分を超える流速が少なくとも１００Ｎ/ｍの理論段数を得るのに必要であることを示す。
例３ 本発明による膨張床カラムにおいて理論段数の測定
膨張床吸着カラムが例１のように（しかし図３（コーンなし）による入口を取り付けられた。それは沈殿床高さ２５ｃｍに等しい吸着剤量を含んでいた。吸着剤はアガロース−タングステンカーバイド複合ビーズからなり、平均径（体積）（ｄ（０．５））１４９μｍで密度３．１ｇ/ｍLであった。吸着剤はクランピングと密充填を避けるために２５％グリセロール溶液に懸濁された。使用直前に、カラムは３０床容量の脱イオン水で洗浄された。
【０１００】
カラムは、例１にのべるように、流速の関数として１ｍあたりの理論段数の測定（滞留時間分布測定、RTD）により試験された。
【０１０１】
実験は、表３により異なる流速の範囲を用いて繰り返され、そして流速と観察された理論段数の関係が表３および図に示されるように記録された。実験はさらに沈殿床高さ５０ｃｍに等しい吸着剤量を用いて繰り返された。
【０１０２】
【表３】
【０１０３】
実験の結果は、静的分配器および流動床システムが測定された流速にわたって増加する固体相支持体の１ｍ沈殿床あたりの理論段数（Ｎ）を持つことを示す。さらに、吸着剤の沈殿床高さが２５ｃｍのとき、７ｃｍ／分を超える流速が少なくとも１００Ｎ/ｍの理論段数を得るのに必要であり、一方吸着剤の沈殿床高さが５０ｃｍのとき、１３ｃｍ／分を超える流速が少なくとも１００Ｎ/ｍの理論段数を得るのに必要であることを示す。
例４ 本発明による膨張床カラムにおいて理論段数の測定
膨張床吸着カラム（１０ｃｍ径）が例３のように組み立てられた。それは沈殿床高さ２５ｃｍに等しい吸着剤量を含んでいた。吸着剤はアガロース−タングステンカーバイド複合ビーズからなり、平均径（体積）（ｄ（０．５））１３０μｍで密度２．８ｇ/ｍLであった。吸着剤はクランピングと密充填を避けるために２５％グリセロール溶液に懸濁された。使用直前に、カラムは３０床容量の脱イオン水で洗浄された。
【０１０４】
カラムは、例１に述べるように、流速の関数として１ｍあたりの理論段数の測定（滞留時間分布測定、RTD）により試験された。
【０１０５】
実験は、表４により異なる流速の範囲を用いて繰り返され、そして流速と観察された理論段数の関係が表４および図に示されるように記録された。実験はさらに沈殿床高さ５０ｃｍに等しい吸着剤量を用いて繰り返された。
【０１０６】
【表４】
【０１０７】
実験の結果は、静的分配器および流動床システムが測定された流速にわたって増加する固体相支持体の１ｍ沈殿床あたりの理論段数（Ｎ）を持つことを示す。さらに、吸着剤の沈殿床高さが２５ｃｍのとき、５ｃｍ／分を超える流速が少なくとも１００Ｎ/ｍの理論段数を得るのに必要であり、一方吸着剤の沈殿床高さが５０ｃｍのとき、１０ｃｍ／分を超える流速が少なくとも１００Ｎ/ｍの理論段数を得るのに必要であることを示す。
例５ ヒト血漿からヒトＩｇＧの吸着
膨張床吸着カラム（１０ｃｍ径）が例２のように組み立てられ、沈殿床高さ５０ｃｍに等しい吸着剤量を含んでいた。吸着剤は、リガンドとして４−アミノ−安息香酸と結合された、アガロース−タングステンカーバイド複合ビーズからなり、平均径（体積）（ｄ（０．５））９５μｍで密度２．９ｇ/ｍLであった（UpFront Chromatography A/S, コペンハーゲン、デンマーク、製品Ｎｏ．CS118,バッチ45818 WV）。吸着剤はク
２５％グリセロール溶液（リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２）に懸濁された。使用直前に、カラムは３０床容量の脱イオン水で洗浄された。
【０１０８】
カラムは、例１に述べるように、線流速１０ｃｍ/分で、１ｍあたりの理論段数の測定（滞留時間分布測定、RTD）により試験され、１ｍあたり１００Ｎ/ｍの段数を有することがわかった（１８５Ｎ/ｍ）。
【０１０９】
カラムは、ｐＨ６．２に塩酸滴定された０．１Ｍイミダゾール２０Ｌで、ついで線流速１０ｃｍ/分で、ｐＨ６．２に塩酸滴定された０．００２Ｍイミダゾール５０Ｌで洗浄された。カラムに、線流速１０ｃｍ/分で、０．００２Ｍイミダゾール/ＨＣｌｐＨ６．２で透析されたヒト血漿４０Ｌを充填された。血漿充填に続いて、カラムはイミダゾール/ＨＣｌ４０ＬでｐＨ６．２で洗浄され、ついでカラムに残る結合材料は、カラムを０．１Ｍリン酸カリウム４０Ｌ＋０．５Ｍ塩化ナトリウムｐＨ７．５で洗浄することにより溶出された。カラムからの溶出物はＵＶモニターで監視され、そしてカラムから溶出されたタンパクはＵＶ信号により捕集された。結合され、ついで溶出されたタンパクは、溶出体積１３Ｌで捕集された。結合されたタンパクの溶出に続いて、カラム（なお入口配管および出口配管に接続されている）は、スタンドから取り外され、閉鎖ループ状に入口配管および出口配管の接続によりシールされ、ついでカラム全体は生物学的廃棄物質を指定する領域に廃棄された。
【０１１０】
カラム内を動く未結合画分および続いて溶出された生成物が、タンパク含量を分析され、正常なヒト血漿プールに存在する、免疫グロブリンＧの９０％超が吸着剤に結合され、ついでリン酸カリウム緩衝液中に溶出されたことがわかった。アルブミンのような、他の主要タンパク画分は、これらの条件下では吸着剤に結合しなかった。
【０１１１】
操作時には、カラムは目視検査により観察されたが、吸着剤において、チャンネル形成または望ましくない乱流は、カラムの底部から約１０ｃｍ上方で観察されなかった。底部近くでは、いくらかの混合および乱流が観察され得たが、分配器の設計された作用によるものであった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分離されるべき少なくとも１つの成分を含む液体の上方流膨張床吸着クロマトグラフィーを実施する方法であり：カラムに含まれる静止相媒体に、入口を通って液体を供給し、変動し得る量のヘッドスペースの下の静止相媒体の膨張を生じさせること；静止相媒体により流体から少なくとも１つの成分を吸着させること；出口を通ってカラムから液体を回収すること；少なくとも入口を通る液体の流速の調節により静止相媒体の膨張を調節すること；ならびにカラムの外側の圧力に関してヘッドスペースにおける過剰圧力を、外側圧力＋０．１bar以下に制限すること、を含む方法。
【請求項２】
過剰圧力が０．０５bar以下である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
過剰圧力が０．０１bar以下である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
静止相媒体の膨張の調節が、液体をカラムにポンプで送るための入口上流の第１ポンプの使用により達成される請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
第１ポンプが、少なくとも３cm/分の、カラムへの液体流速を与える請求項４に記載の方法。
【請求項６】
第１ポンプが、少なくとも５cm/分の、カラムへの液体流速を与える請求項４に記載の方法。
【請求項７】
第１ポンプが、少なくとも７cm/分の、カラムへの液体流速を与える請求項４に記載の方法。
【請求項８】
膨張静止相媒体上方の液体の高さが、カラムから液体をポンプで送るための出口下流の第２ポンプにより調節される請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
過剰圧力の制限がベントにより達成される請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の方法であり、出口は、管の上流端がカラム内の選定された位置に移動され得るように適合された管を含み、さらに該方法は管の
上流端をカラム内の所望の位置に移動する段階を含む方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の方法であり：
シールされた入口を含む下方部分とシールされた出口およびシールされたベントを含む上方部分とを有するカラムに含まれる静止相媒体を用意すること、シールされていないとき、それらがカラムの内部と外部の間の流体接続を与えること；ならびに液体を静止相媒体に供給する前に入口、出口およびベントからシールを破壊すること、を含む方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの成分の吸着を可能とした後に、静止相媒体から少なくとも１つの成分を溶出させること；ならびに吸着および溶出の少なくとも１つの反復の後に、該カラムを廃棄すること、の段階をさらに含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
吸着および溶出の反復の最大反復数が２０である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
吸着および溶出の反復の最大反復数が１５である請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
吸着および溶出の反復の最大反復数が１０である請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
吸着および溶出の反復の最大反復数が５である請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
カラムの廃棄が、カラムから静止相媒体を除去しないで実施される請求項１２〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
溶出段階後に、静止相媒体が清浄化され、カラムが再使用される請求項１２〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
静止相媒体から少なくとも１つの成分溶出後に、そしてカラムの廃棄前に、カラムのベント、出口および入口が再シールされる請求項１２〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれかに記載の方法により、膨張床吸着クロマトグラフィーを実施するための装置。
【請求項２１】
少なくとも入口上流の第１ポンプおよび出口下流の第２ポンプをさらに含む請求項２０に記載の装置。
【請求項２２】
ポンプがぜん動ポンプである請求項２１に記載の装置。
【請求項２３】
出口が、管の上流端がカラム内の選定された位置に移動され得るように適合された管を含み、装置は、管の上流端の位置を調節するためのコントローラーをさらに含む請求項２０〜２２のいずれかに記載の装置。
【請求項２４】
コントローラーがリニアアクチュエーターである請求項２３に記載の装置。
【請求項２５】
リニアアクチュエーターが気力アクチュエーターである請求項２４に記載の装置。
【請求項２６】
リニアアクチュエーターがエレクトリックアクチュエーターである請求項２４に記載の装置。
【請求項２７】
カラムにおける液体および/または静止相媒体レベルのモニターをさらに含む請求項２０〜２６のいずれかに記載の装置。
【請求項２８】
モニターが超音波モニターである請求項２７に記載の装置。
【請求項２９】
請求項２０〜２８のいずれかに記載の装置であり、さらに次の少なくとも1つを含む装置：
発酵液；消費された液のための容器；溶出源；メンブレンフィルターのような発酵液の少なくとも１成分を精製するための手段。
【請求項３０】
膨張床クロマトグラフィーに使用するためのカラムであり：
カラムへの液体の通路のための入口を含む下方部分；
液体のための出口を含む上方部分；ならびに
カラム内に含まれる静止相媒体；
ここで、カラムの上方部分は、カラムの内部と外部の間の流体接続を与えるベントをさらに含む。
【請求項３１】
膨張床クロマトグラフィーに使用するためのカラムであり：
カラムへの液体の通路のための入口を含む下方部分；液体のための出口を含む上方部分；ならびにカラムに含まれる静止相媒体からなり、その入口は静止相媒体の動かされる撹拌には適合されない。
【請求項３２】
請求項３１に記載されるカラムを含む、膨張床クロマトグラフィーを実施するための装置。
【請求項３３】
少なくともカラムの入口上流の第１ポンプおよびカラムの出口下流の第２ポンプをさらに含む請求項３２に記載の装置。
【請求項３４】
静止相媒体が少なくとも１．５ｇ/mLの密度を有する請求項３１〜３３のいずれかに記載の装置。
【請求項３５】
静止相媒体が少なくとも２．５〜４．０ｇ/mLの密度を有する請求項３１〜３３のいずれかに記載の装置。
【請求項３６】
静止相媒体が２０〜２００μｍの平均粒径を有する請求項３１〜３５のいずれかに記載の装置。
【請求項３７】
静止相媒体が６０〜１２０μｍの平均粒径を有する請求項３１〜３５のいずれかに記載の装置。
【請求項３８】
カラムが少なくとも２５の理論段数を有する請求項３１〜３７のいずれかに記載の装置。
【請求項３９】
分離すべき少なくとも１つの成分を含む液体の膨張床クロマトグラフィーを実施する方法であり：カラムに含まれる静止相媒体に、入口上流の第１ポンプにより入口を通って液体を供給し、変動し得る量のヘッドスペースの下の静止相媒体の膨張を生じさせること；静止相媒体により流体から少なくとも１つの成分を吸着させること；ならびに出口下流の第２ポンプにより出口を通ってカラムから液体を回収すること、からなる方法。
【請求項４０】
請求項３１に記載のカラム用いて実施される、請求項３９に記載の方法。
【請求項１】
分離されるべき少なくとも１つの成分を含む液体の上方流膨張床吸着クロマトグラフィーを実施する方法であり：カラムに含まれる静止相媒体に、入口を通って液体を供給し、変動し得る量のヘッドスペースの下の静止相媒体の膨張を生じさせること；静止相媒体により流体から少なくとも１つの成分を吸着させること；出口を通ってカラムから液体を回収すること；少なくとも入口を通る液体の流速の調節により静止相媒体の膨張を調節すること；ならびにカラムの外側の圧力に関してヘッドスペースにおける過剰圧力を、外側圧力＋０．１bar以下に制限すること、を含む方法。
【請求項２】
過剰圧力が０．０５bar以下である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
過剰圧力が０．０１bar以下である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
静止相媒体の膨張の調節が、液体をカラムにポンプで送るための入口上流の第１ポンプの使用により達成される請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
第１ポンプが、少なくとも３cm/分の、カラムへの液体流速を与える請求項４に記載の方法。
【請求項６】
第１ポンプが、少なくとも５cm/分の、カラムへの液体流速を与える請求項４に記載の方法。
【請求項７】
第１ポンプが、少なくとも７cm/分の、カラムへの液体流速を与える請求項４に記載の方法。
【請求項８】
膨張静止相媒体上方の液体の高さが、カラムから液体をポンプで送るための出口下流の第２ポンプにより調節される請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
過剰圧力の制限がベントにより達成される請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の方法であり、出口は、管の上流端がカラム内の選定された位置に移動され得るように適合された管を含み、さらに該方法は管の
上流端をカラム内の所望の位置に移動する段階を含む方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の方法であり：
シールされた入口を含む下方部分とシールされた出口およびシールされたベントを含む上方部分とを有するカラムに含まれる静止相媒体を用意すること、シールされていないとき、それらがカラムの内部と外部の間の流体接続を与えること；ならびに液体を静止相媒体に供給する前に入口、出口およびベントからシールを破壊すること、を含む方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの成分の吸着を可能とした後に、静止相媒体から少なくとも１つの成分を溶出させること；ならびに吸着および溶出の少なくとも１つの反復の後に、該カラムを廃棄すること、の段階をさらに含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
吸着および溶出の反復の最大反復数が２０である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
吸着および溶出の反復の最大反復数が１５である請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
吸着および溶出の反復の最大反復数が１０である請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
吸着および溶出の反復の最大反復数が５である請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
カラムの廃棄が、カラムから静止相媒体を除去しないで実施される請求項１２〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
溶出段階後に、静止相媒体が清浄化され、カラムが再使用される請求項１２〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
静止相媒体から少なくとも１つの成分溶出後に、そしてカラムの廃棄前に、カラムのベント、出口および入口が再シールされる請求項１２〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれかに記載の方法により、膨張床吸着クロマトグラフィーを実施するための装置。
【請求項２１】
少なくとも入口上流の第１ポンプおよび出口下流の第２ポンプをさらに含む請求項２０に記載の装置。
【請求項２２】
ポンプがぜん動ポンプである請求項２１に記載の装置。
【請求項２３】
出口が、管の上流端がカラム内の選定された位置に移動され得るように適合された管を含み、装置は、管の上流端の位置を調節するためのコントローラーをさらに含む請求項２０〜２２のいずれかに記載の装置。
【請求項２４】
コントローラーがリニアアクチュエーターである請求項２３に記載の装置。
【請求項２５】
リニアアクチュエーターが気力アクチュエーターである請求項２４に記載の装置。
【請求項２６】
リニアアクチュエーターがエレクトリックアクチュエーターである請求項２４に記載の装置。
【請求項２７】
カラムにおける液体および/または静止相媒体レベルのモニターをさらに含む請求項２０〜２６のいずれかに記載の装置。
【請求項２８】
モニターが超音波モニターである請求項２７に記載の装置。
【請求項２９】
請求項２０〜２８のいずれかに記載の装置であり、さらに次の少なくとも1つを含む装置：
発酵液；消費された液のための容器；溶出源；メンブレンフィルターのような発酵液の少なくとも１成分を精製するための手段。
【請求項３０】
膨張床クロマトグラフィーに使用するためのカラムであり：
カラムへの液体の通路のための入口を含む下方部分；
液体のための出口を含む上方部分；ならびに
カラム内に含まれる静止相媒体；
ここで、カラムの上方部分は、カラムの内部と外部の間の流体接続を与えるベントをさらに含む。
【請求項３１】
膨張床クロマトグラフィーに使用するためのカラムであり：
カラムへの液体の通路のための入口を含む下方部分；液体のための出口を含む上方部分；ならびにカラムに含まれる静止相媒体からなり、その入口は静止相媒体の動かされる撹拌には適合されない。
【請求項３２】
請求項３１に記載されるカラムを含む、膨張床クロマトグラフィーを実施するための装置。
【請求項３３】
少なくともカラムの入口上流の第１ポンプおよびカラムの出口下流の第２ポンプをさらに含む請求項３２に記載の装置。
【請求項３４】
静止相媒体が少なくとも１．５ｇ/mLの密度を有する請求項３１〜３３のいずれかに記載の装置。
【請求項３５】
静止相媒体が少なくとも２．５〜４．０ｇ/mLの密度を有する請求項３１〜３３のいずれかに記載の装置。
【請求項３６】
静止相媒体が２０〜２００μｍの平均粒径を有する請求項３１〜３５のいずれかに記載の装置。
【請求項３７】
静止相媒体が６０〜１２０μｍの平均粒径を有する請求項３１〜３５のいずれかに記載の装置。
【請求項３８】
カラムが少なくとも２５の理論段数を有する請求項３１〜３７のいずれかに記載の装置。
【請求項３９】
分離すべき少なくとも１つの成分を含む液体の膨張床クロマトグラフィーを実施する方法であり：カラムに含まれる静止相媒体に、入口上流の第１ポンプにより入口を通って液体を供給し、変動し得る量のヘッドスペースの下の静止相媒体の膨張を生じさせること；静止相媒体により流体から少なくとも１つの成分を吸着させること；ならびに出口下流の第２ポンプにより出口を通ってカラムから液体を回収すること、からなる方法。
【請求項４０】
請求項３１に記載のカラム用いて実施される、請求項３９に記載の方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公表番号】特表２０１０−５２２８７３（Ｐ２０１０−５２２８７３Ａ）
【公表日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５００２９２（Ｐ２０１０−５００２９２）
【出願日】平成２０年３月２８日（２００８．３．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５３７３２
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１１６９３５
【国際公開日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【出願人】（５０９２６８６９１）ウプフロント クロマトグラフィー アクティーゼルスカブ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２８日（２００８．３．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５３７３２
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１１６９３５
【国際公開日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【出願人】（５０９２６８６９１）ウプフロント クロマトグラフィー アクティーゼルスカブ (1)
【Ｆターム（参考）】
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