臓器、生物組織または生細胞を保存するための媒質
本発明は、高分子量ヒアルロン酸および塩化ナトリウムを含み、動物由来の成分を含まないことを特徴とする、液体栄養ベースを含む、臓器、生物組織、または生細胞を保存するための媒質に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生細胞を保存する技術分野に関する。より正確には、本発明の目的は、生きている臓器、生物組織、および細胞、特に生きているヒト角膜を保存するための新しい媒質である。
【背景技術】
【０００２】
臓器移植の分野では、レシピエントへ移植する目的でドナーから臓器を取る場合、移植を成功させるために臓器の生存力を維持し得る臓器用の保存媒質が必要となる。実際に、種々の媒質がしばしば必要である。特にヒト角膜の場合、通常使用する媒質には：
角膜を提供施設から培養施設まで輸送し、同様にその角膜を培養施設から移植施設まで輸送するための輸送媒質、
保存媒質。一般に、保存は４℃または３１℃で行われる。この媒質は、媒質期間中、すなわち約４〜５週間の細胞生存力の最適な保存、品質（内皮試験）および無菌性（細菌学、血清学、およびウィルス学試験）に関して最大の安全を保証しなければならない、ならびに
角膜の厚みを減らし、透明にするために移植の約２４時間前に使用する水分排出媒質（ｄｅｔｕｒｇｅｓｃｅｎｃｅ ｍｅｄｉｕｍ）がある。
【０００３】
現在使用されている媒質の大半が、動物起源の成分：ウシ胎児血清アルブミン、トランスフェリン、インシュリンなどの動物起源のタンパク質を含んでいる。
【０００４】
これらの媒質中には動物起源の成分が存在するため、プリオン病、特にクロイツフェルト−ヤコブ病に関してこれらの医療の安全を保証するのは困難である。さらに、これらの媒質は、感染因子による汚染を受けやすく、完全に再生可能な組成ではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これに関して、本発明は、生細胞の生存力を保存する新しい保存媒質を提供することを目的とする。
【０００６】
本発明の別の目的は、含んでいる成分の点で製造するのに安価な保存媒質を提供することである。
【０００７】
本発明による保存媒質はまた、品質および無菌性に関して最大の安全を示さなければならない。
【０００８】
さらに、これは、完全に合成の、すなわち、組換えおよび化学合成から得られ、したがって非免疫原性であり感染因子に汚染されていない成分から調製することが可能な利点を示す。このため、本発明による保存媒質は、バッチごとに再現可能な厳密な組成を示すことができる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
より正確には、本発明は、高分子量のヒアルロン酸および塩化ナトリウムを含み、動物起源の成分を含まない、生きている臓器、生物組織、および細胞のための液体栄養ベースを含む保存媒質に関する。
【００１０】
本発明はまた、保存、臓器培養、細胞培養、輸送、ならびに生きている臓器、生物組織、および細胞、特に生きているヒト角膜の水分排出のためのかかる媒質の使用という目的がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
生きている生物学的臓器、細胞、および組織とは、生きている線維芽細胞、内皮細胞、および／または上皮細胞を含めたヒトまたは動物起源の成分を表す。
【００１２】
本発明の保存媒質は、補助的治療薬と表すことができる。
【００１３】
本発明による保存媒質は、内皮細胞および周囲の組織を保護するものである粘弾性物質（ＶＥＳ）を含む。これらの粘弾性物質は、特に高分子量のヒアルロン酸である。
【００１４】
高分子量、すなわち分子量が１００万ダルトン以上のヒアルロン酸は、動物起源、尖圭コンジローム抽出物または臍帯血、細菌起源（連鎖球菌の培養物由来）、あるいは野菜起源であってよい。もちろん、本発明による保存媒質は、動物起源の成分を含まないことを考えると、野菜起源の高分子量ヒアルロン酸を含む。特に、本発明の保存媒質は、分子量が１０６ダルトン以上で２０℃でのブルックフィールド粘度が１，５００センチポアズである、どちらもＬａｂｏｒａｔｏｉｒｅ Ｂｏｍａｎｎ（Ｇｒｏｕｐｅ Ｓｏｌｉａｎｃｅ）製の、商標名Ｃｒｉｓｔａｌｈｙａｌで販売されている粉末形態の、または商標名Ｖｉｔａｌｈｙａｌで販売されている１％水溶液の形の小麦由来の高分子量ヒアルロン酸を用いて調製することになる。
【００１５】
本発明による保存媒質はまた、結晶状の塩化ナトリウムを含む。塩化ナトリウムの機能は、特に、ヒアルロン酸の沈殿を防止することであるが、浸透圧モル濃度の維持にも関係する。
【００１６】
特に、本発明による保存媒質は：
８０〜４，０００ｍｇ／ｌ、好ましくは１００〜２００ｍｇ／ｌ、優先的には１００〜１６０ｍｇ／ｌの高分子量ヒアルロン酸、および
４，５００〜９，０００ｍｇ／ｌ、好ましくは５，５００〜９，０００ｍｇ／ｌ、優先的には７，０００ｍｇ／ｌの塩化ナトリウムを含む。
【００１７】
本発明による媒質は、特に媒質の粘度を増大させる機能を有するポロキサマー１８８を含むと有利である。
【００１８】
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８およびＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８とも呼ばれているポロキサマー１８８は、分子量が７，６８０〜９５０ｇ／ｍｏｌで一般式：
ＨＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｘ−［ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ］ｙ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｘ−Ｈ
（式中、ｘは約７９に等しく、ｙは約２８に等しい）
のポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンポリマー配列である。
【００１９】
ポロキサマー１８８の存在は、本発明による媒質では、前記媒質が臓器の水分排出ならびに生きている組織、細胞、特に、ヒト角膜移植片の輸送および保存に使用するものである場合、特に有利である。本発明による媒質は、好ましくは２００〜７５，０００ｍｇ／ｌ、優先的には４５０〜５０，０００ｍｇ／ｌのポロキサマー１８８を含むことになる。
【００２０】
現在販売されている角膜を水分排出するための保存媒質は、デキストランを含む。デキストランの機能は、角膜の厚みを減らすことであり、角膜を水分排出するための本発明による媒質に使用することができる。それでも、同様に角膜の厚みを減らすがはるかに細胞毒性が少ないポロキサマー１８８が、デキストランに比べて好ましい。
【００２１】
メチルセルロースは、本発明による保存媒質に含まれていてよいもう一つのＶＥＳである。メチルセルロースは植物起源であり、綿フロックまたは木材パルプ由来のセルロース繊維から得られる。これらのセルロース繊維は、塩化メチレンを用いてエーテル化させるために苛性ソーダ溶液で処理する。グルコシド単位当りのメトキシル化した置換基の数に相当する置換の程度は、１．６４〜１．９２である。特に、本発明の保存媒質を調製するために、ブルックフィールド粘度が４，０００センチポアズ（２０℃で２％水溶液）で分子量が８６，０００ダルトンの、ＳＥＰＰＩＣによりＭｅｔｏｌｏｓｅＳＭ ４００の商標名で販売されているメチルセルロースを使用することができる。本発明による媒質は、２１０〜５，０００ｍｇ／ｌ、好ましくは１，９００〜２，５００ｍｇ／ｌ、優先的には２，２０５ｍｇ／ｌのメチルセルロースを含むことが好ましい。
【００２２】
使用したＶＥＳは、水の保持による細胞の水和を可能にし、それらが囲んでいる細胞および組織へのある種の接着または付着を示し、したがって化学的攻撃および空気の毒性作用に対して前記囲んでいる細胞および組織を確実に保護する。
【００２３】
本発明による保存媒質は、生細胞保存の分野でより一般的に使用されている他の成分も含む。
【００２４】
特に、保存媒質は、臓器および細胞培養保存媒質に従来使用されている水性化学的栄養ベースを含む。有名な参考論文は、栄養ベースが以下のものを含むことが記載されている「Ｌｅ ｔｅｃｈｎｏｓｃｏｐｅ ｄｅ ｂｉｏｆｕｔｕｒ」、第１３３巻、１９９４年４月、３〜１６頁である：
細胞代謝における役割が窒素および炭素を供給することであるアミノ酸。いくつかの細胞には、１３種の必須アミノ酸とは別に特定の要求物がある（例えば、リンパ球にはセリン）；
乳酸の蓄積を制限する必要がある場合は代わりにガラクトースを使用することができるが、グルコースが最も広く使用されている糖類；
そのうち８種が必須であると考えられているビタミン、主にＢ群；
生理的食塩水の形で供給する、膜電位および浸透圧の維持に重要な役割を果たし、多くの酵素反応における補助因子でもあるイオン；
特に厳密な媒質中で培養を行う場合にますます重要な役割を果たすと思われる微量金属。最も重要なのは、セレン、カドミウム、およびリチウムである。
【００２５】
この種のベースは、これらの様々な構成元素から調製することができる。特定の化学的栄養ベースは、液体と固体のどちらの形態でも市販されている：後者は、その後水に溶解させなければならない。特に有用なものは、ＩＭＤＭ（イスコフ改変ダルベッコ媒質、参照：Ｉｓｃｏｖｅ、Ｎ．Ｎ．およびＭｅｌｃｈｅｒｓ（１９７８）Ｊ．ｏｆ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４７：９２３〜９３３）、Ｓｔａｉｎｅｒｓ、Ｃ．Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ．２３０、５２（１９７１）のＭＥＭアルファ、Ｃｌｉｃｋら、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３、２６４（１９７２）のクリックＲＰＭＩ、Ｐａｒｋｅｒ、Ｒ．Ｃ．ら、Ｓｐｅｃｉａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、５、３０３、（１９５７）のＣＭＲＬ１０６６媒質、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ、Ａ．、Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｇ．７８、１７３（１９６３）およびＭｏｒｔｏｎ、Ｈ．Ｊ．、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ、６、８９（１９７０）のライボビッツＬ１５媒質、Ｍｏｒｇａｎ、Ｊ．Ｆら、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．７３、１（１９５０）のＭ１９９媒質、ならびにＢａｒｎｅｓ、Ｄ．およびＳａｔｏ、Ｇ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２、２５５（１９８０）のＤＭＥＭ／ＨＡＭ Ｆ１２媒質、細胞および組織の維持に必要な様々な物質、特に様々な微量元素、アミノ酸、ビタミン、電解質、安定化ｐＨ緩衝液、ｐＨ指示薬（例えば、フェノールレッド）、およびグルコースまたはガラクトース（Ｌ１５）を含む水性栄養ベースである。微量元素とは、微量またはそれより多い量で存在する、ＮａＣｌを除いたすべての金属無機塩を表す。
【００２６】
有利な方法では、本発明による保存媒質は、使用する栄養ベースによって主に供給されるアミノ酸、微量元素、ビタミン、電解質、および安定化ｐＨ緩衝液をこのように含む。これらの元素が使用するベースに十分な量含まれていない場合、前記元素を補給することになる。
【００２７】
本発明による保存媒質は、有利にはそれぞれ独立に、１〜５０ｍｇ／ｌのコンドロイチン硫酸、０．１〜２５ｍｇ／ｌのヘパラン硫酸、５００〜２，０００ｍｇ／ｌのアルギン酸、および１，０００〜１０，０００ｍｇ／ｌのヘタスターチを含む。
【００２８】
保存媒質をヒト角膜移植に使用することを目的としている場合、乳酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸鉄（ＩＩ）、グルコン酸鉄（ＩＩ）、ピルビン酸ナトリウム、および塩化カルシウムなど房水中に存在する成分をなるべく含めることになる。
【００２９】
特に有利な方法では、本発明による保存媒質は、それぞれ独立に、または組み合わせて：
・好ましくは以下のものから選択した０．０１〜３５０ｍｇ／ｌのビタミン：
酢酸トコフェロール
酢酸レチノール
ヒドロキノン
アスコルビン酸
チアミンＢ１−ＨＣＬ
リボフラビンＢ２
カルシウムＤ−パントテン酸Ｂ５
塩酸ピリドキサールＢ６
ビオチンＢ８
葉酸Ｂ９
シアンコバラミンＢ１２
ニコチンアミドＢ３ ＰＰ
オロチン酸クロムＢ１３
・好ましくは以下のものから選択した０．０１〜６５０ｍｇ／ｌの微量元素：
ＣａＣｌ２・２Ｈ２０
ＫＣｌ
ＣａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ
ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ
ＮａＨＣＯ３
ＭｇＣＯ３・７Ｈ２Ｏ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ
ＭｎＣＯ３・４Ｈ２Ｏ
ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ
Ｎａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏ
Ｈ２ＳｅＯ３
ＮＨ４ＶＯ３
（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ
ＳｎＣ１２・２Ｈ２Ｏ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
酸化亜鉛
ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ
・好ましくは以下のものから選択した０．００５〜１５０ｍｇ／ｌのヌクレオシド：
アデノシン
シチジン
デオキシアデノシン
デオキシシチジン
デオキシグアノシン
グアノシン
ウリジン
チミジン
・８００〜４，０００ｍｇ／ｌのアミノ酸、
・５００〜９，０００ｍｇ／ｌの単糖類、好ましくはグルコースおよび／またはガラクトース、
・全濃度０．００１〜７５，０００ｍｇ／ｌでの他の元素、特に：
酢酸ナトリウム（３Ｈ２０）
クエン酸ナトリウム
乳酸ナトリウム
ピルビン酸ナトリウム
グルコン酸鉄（ＩＩ）
亜セレン酸ナトリウム
ポロキサマー１８８
オレイン酸
リノール酸
リノレン酸
パルミチン酸
ツイーン８０
を含む。
【００３０】
本発明による保存媒質は、液体または半固体形態であってよい。これは、細胞保護を助けるのに十分有効な粘度を示す。有利な方法では、本発明による保存媒質のブルックフィールド粘度は、２０℃で１〜１５センチポアズ（ｃｐｓ）、好ましくは２．５〜１０ｃｐｓの範囲である。したがって、本発明による保存媒質は、その粘度のため注入不可能である。
【００３１】
本発明による媒質の浸透圧モル濃度も重要であり、特に３００〜４６５ｍＯｓｍ±４０の範囲である。媒質の浸透圧モル濃度は、特にＮａＣｌ濃度によって決まる。本発明による媒質が保存または輸送を目的としている場合、その浸透圧モル濃度は、有利には３００〜３６０ｍＯｓｍ±４０の範囲のはずであり；水分排出を目的としている場合、その浸透圧モル濃度が３５０〜４６５ｍＯｓｍ±４０であると有利である。現在販売されている保存媒質の浸透圧モル濃度はより低い。本発明の利点の１つは、輸送、保存、および水分排出のための単一媒質を提供できることである。
【００３２】
本発明による保存媒質は、様々な成分を混合することによって調製する。好ましくは、ヒアルロン酸の液体生物学的栄養ベースへの溶解を改善するためには、後者を塩化ナトリウムと混合し、次いでメチルセルロースをすでに含んでいる栄養ベースに加えることになる。
【００３３】
本発明による保存媒質は、動物起源の成分を含まない。事実、一方では、生きている臓器、生物組織、および生細胞の保存のために現在まで使用されてきた大部分の媒質に反して、本発明による媒質は、ウシ胎児血清アルブミンも、ラクトフェリンも、トランスフェリンも、インシュリンも、他の動物起源のタンパク質も含まない。さらに、その合成に動物起源の原料を利用しない高分子量ヒアルロン酸およびメチルセルロースを使用している。したがって、このような保存媒質は、フランス公衆衛生規定の条項Ｌ．１２６３−１で定義されている補助的治療薬に関する法律に容易に準拠することができる。動物起源の成分を含まない保存媒質の使用により、保存細胞の医療保障を向上することができる。
【００３４】
本発明による保存媒質は、生きている臓器、生物組織、および細胞、特に生きているヒト角膜の保存、臓器培養、細胞培養、凍結、輸送、および水分排出に使用することができる。本発明による保存媒質は、特に−１９６℃〜３７℃の範囲の温度で使用可能である。
【００３５】
本発明による保存媒質は、想定した用途に応じて適合させることができる。
【００３６】
例えば、本発明による媒質が術前の水分排出に使用するものである場合、有利にはポロキサマー１８８を２００〜７５，０００ｍｇ／ｌ、優先的には４５０〜５０，０００ｍｇ／ｌの濃度で含むことになる。
【００３７】
媒質が生細胞の凍結に使用するものである場合、媒質中に存在する水の一部を凍結防止効果があるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と置き換えることができる。
【実施例】
【００３８】
以下の実施例は、本発明を例示しているが、決して限定するものではない。以下の実施例は、Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ Ｂｏｗｍａｎ（Ｇｒｏｕｐｅ Ｓｏｌｉａｎｃｅ）によって商標名Ｃｒｉｓｔａｌｈｙａｌで販売されている粉末形態のヒアルロン酸、ＳＥＰＰＩＣにより商標名メトローズＳＭ ４０００で販売されているメチルセルロース、およびＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈによって販売されているＮａＣｌを使用している。実施例１から３（保存媒質）は、ＩＭＤＭベースの体積が７４％であり、実施例４から７（水分排出媒質）は、ＩＭＤＭベースの体積が８８％である。
【００３９】
浸透圧モル濃度は、基準Ｍ８５５０１に従ってＦｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｂｌｏｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから販売されている浸透圧計で測定している（キー操作による自動零点［蒸留水］および標準［３００ｍＯｓｍ／ｋｇ］較正；応答時間１分）。
【００４０】
粘度は、基準Ｍ５７５７１に従ってＦｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｂｌｏｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから販売されている、１ｃｐｓ基準Ｍ５７５１０から始まる低粘度アダプターを備えた粘度計で測定している（速度、選択した移動相、ｃｐｓおよび範囲％における粘度、ならびに温度の同時表示；ブルックフィールド互換；移動相は試料に直接投入する）。
【００４１】
実施例１：実施例１の媒質は、輸送および保存に使用すると有利である。
高分子量ヒアルロン酸 １００ｍｇ／ｌ
メチルセルロース ２，２０５ｍｇ／ｌ
ＮａＣｌ ６，９８５ｍｇ／ｌ
アミノ酸 １，８３８ｍｇ／ｌ
微量元素 ５，３９０ｍｇ／ｌ
グルコース ４，５００ｍｇ／ｌ
炭水化物 １，１６７ｍｇ／ｌ
ヌクレオシド １０ｍｇ／ｌ
ビタミン １６３ｍｇ／ｌ
脂肪酸エステル ４６ｍｇ／ｌ
緩衝液 ８，９８２ｍｇ／ｌ
ｐＨ ７．３
浸透圧モル濃度 ３９４ｍＯｓｍ
粘度 ５ｃｐｓ（ブルックフィールド、２０℃）
【００４２】
実施例２：実施例２の媒質は、輸送および保存に使用すると有利である。
高分子量ヒアルロン酸 １００ｍｇ／ｌ
メチルセルロース ２，２０５ｍｇ／ｌ
ＮａＣｌ ５，５８５ｍｇ／ｌ
アミノ酸 １，８３８ｍｇ／ｌ
微量元素 ５，３９０ｍｇ／ｌ
グルコース ４，５００ｍｇ／ｌ
炭水化物 １，１６７ｍｇ／ｌ
ヌクレオシド １０ｍｇ／ｌ
ビタミン １６３ｍｇ／ｌ
脂肪酸エステル ４６ｍｇ／ｌ
緩衝液 ８，９８２ｍｇ／ｌ
ｐＨ ７．３
浸透圧モル濃度 ３７２ｍＯｓｍ
粘度 ５ｃｐｓ（ブルックフィールド、２０℃）
【００４３】
実施例３：実施例３の媒質は、輸送および保存に使用すると有利である。
高分子量ヒアルロン酸 １６０ｍｇ／ｌ
ポロキサマー１８８ ２，２０５ｍｇ／ｌ
ＮａＣｌ ５，５８５ｍｇ／ｌ
アミノ酸 １，８３８ｍｇ／ｌ
微量元素 ５，３９０ｍｇ／ｌ
グルコース ４，５００ｍｇ／ｌ
炭水化物 １，１６７ｍｇ／ｌ
ヌクレオシド １０ｍｇ／ｌ
ビタミン １６３ｍｇ／ｌ
脂肪酸エステル ４６ｍｇ／ｌ
緩衝液 ８，９８２ｍｇ／ｌ
ｐＨ ７．３
浸透圧モル濃度 ３０５ｍＯｓｍ
粘度 １．５ｃｐｓ（ブルックフィールド、２０℃）
【００４４】
実施例４：実施例４の媒質は、水分排出に使用すると有利である。
高分子量ヒアルロン酸 １００ｍｇ／ｌ
メチルセルロース ２，２０５ｍｇ／ｌ
デキストラン ５０，０００ｍｇ／ｌ
ＮａＣｌ ６，８９５ｍｇ／ｌ
アミノ酸 １，８３８ｍｇ／ｌ
微量元素 ５，３９０ｍｇ／ｌ
グルコース ４，５００ｍｇ／ｌ
炭水化物 １，１６７ｍｇ／ｌ
ヌクレオシド １０ｍｇ／ｌ
ビタミン １６３ｍｇ／ｌ
脂肪酸エステル ４６ｍｇ／ｌ
緩衝液 ８，９８２ｍｇ／ｌ
ｐＨ ７．３
浸透圧モル濃度 ６９４ｍＯｓｍ
粘度 １０ｃｐｓ（ブルックフィールド、２０℃）
【００４５】
実施例５：実施例５の媒質は、水分排出に使用すると有利である。
高分子量ヒアルロン酸 １００ｍｇ／ｌ
メチルセルロース ２，２０５ｍｇ／ｌ
デキストラン ５０，０００ｍｇ／ｌ
ＮａＣｌ ５，５８５ｍｇ／ｌ
アミノ酸 １，８３８ｍｇ／ｌ
微量元素 ５，３９０ｍｇ／ｌ
グルコース ４，５００ｍｇ／ｌ
炭水化物 １，１６７ｍｇ／ｌ
ヌクレオシド １０ｍｇ／ｌ
ビタミン １６３ｍｇ／ｌ
脂肪酸エステル ４６ｍｇ／ｌ
緩衝液 ８，９８２ｍｇ／ｌ
ｐＨ ７．３
浸透圧モル濃度 ５８５ｍＯｓｍ
粘度 １０ｃｐｓ（ブルックフィールド、２０℃）
【００４６】
実施例６：実施例６の媒質は、水分排出に使用すると有利である。
高分子量ヒアルロン酸 １６０ｍｇ／ｌ
デキストラン ５０，０００ｍｇ／ｌ
ＮａＣｌ ５，５８５ｍｇ／ｌ
アミノ酸 １，８３８ｍｇ／ｌ
微量元素 ５，３９０ｍｇ／ｌ
グルコース ４，５００ｍｇ／ｌ
炭水化物 １，１６７ｍｇ／ｌ
ヌクレオシド １０ｍｇ／ｌ
ビタミン １６３ｍｇ／ｌ
脂肪酸エステル ４６ｍｇ／ｌ
緩衝液 ８，９８２ｍｇ／ｌ
ｐＨ ７．３
浸透圧モル濃度 ５９５ｍＯｓｍ
粘度 ８．５ｃｐｓ（ブルックフィールド、２０℃）
【００４７】
実施例７：実施例７の媒質は、水分排出に使用すると有利である。
高分子量ヒアルロン酸 １６０ｍｇ／ｌ
ポロキサマー１８８ ５０，０００ｍｇ／ｌ
ＮａＣｌ ５，５８５ｍｇ／ｌ
アミノ酸 １，８３８ｍｇ／ｌ
微量元素 ５，３９０ｍｇ／ｌ
グルコース ４，５００ｍｇ／ｌ
炭水化物 １，１６７ｍｇ／ｌ
ヌクレオシド １０ｍｇ／ｌ
ビタミン １６３ｍｇ／ｌ
脂肪酸エステル ４６ｍｇ／ｌ
緩衝液 ８，９８２ｍｇ／ｌ
ｐＨ ７．３
浸透圧モル濃度 ３７６ｍＯｓｍ
粘度 ５ｃｐｓ（ブルックフィールド、２０℃）
【００４８】
（材料および方法）
保存順序
ドナーの死後２４時間以内に科学的なヒト角膜（科学的研究に提供された臓器）を採取する。ドナーは、同じドナー由来の２つの角膜の比較可能性を維持するために、眼内手術を受けるべきではない。取り出した後、対のそれぞれの角膜を輸送媒質５０ｍｌに浸漬する。参照媒質（Ｉｎｏｓｏｌ（登録商標）、Ｃｈａｕｖｉｎ−Ｏｐｓｉａ／Ｂａｕｓｈ ａｎｄ Ｌｏｍｂ、Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、フランス）または本発明による媒質（実施例１から３）のいずれかを使用する。角膜を含む密封したフラスコをすぐに３１℃の乾燥機に入れる。臓器培養物の保存２日目には、後述の手順に従って内皮細胞密度（ＥＣＤ）を測定する。次いで角膜を、新しい１００ｍｌフラスコ中の同じ種類の媒質中に再度浸し、フラスコ壁およびフラスコ底に沈殿した沈降物と接触するのを防止するために縫合糸と懸濁させる。１４日間保存した後、角膜を新しい１００ｍｌフラスコに移す。欧州における最高推奨期間である３０日間保存した後、新しいＥＣＤ測定を行い、所与の保存期間について細胞損失を計算する。次いで角膜を、その厚みを減らすことを目的とした「水分排出」媒質５０ｍｌに浸漬する。Ｅｘｏｓｏｌ（登録商標）（Ｃｈａｕｖｉｎ−Ｏｐｓｉａ／Ｂａｕｓｈ ａｎｄ Ｌｏｍｂ）あるいは５０，０００ｍｇ／ｌのデキストランまたは５０，０００ｍｇ／ｌのポロキサマー１８８に対応する本発明による媒質（実施例４から７）のいずれかを使用する。４８時間後、バックライトをあてた、徐々に太くなる８本の黒線のグリッドに位置を合わせて同じ対の２つの角膜を並んで撮影する。この写真は、角膜透明度の記録となる。超音波厚度計（Ｔｏｍｅｙ ＡＬ−２０００、東京、日本）によって角膜の厚さを尖部で測定する。３回目のＥＣＤ測定は、細胞膜を染色する目的でｐＨ４．５のリン酸緩衝液中４％アリザリンレッド（Ｓｉｇｍａ）と一緒に４５秒間のインキュベーションを行った後に実施する。この重要ではない染色は、その細胞毒性のために、保存の最後にしか利用できない。
【００４９】
全体の手順は、保存媒質の性質に関して盲検で行う。
【００５０】
盲検分析を保証する手順
２種類の保存および水分排出媒質を同一容器（１２５ｍｌ Ｎａｌｇｅｎｅフラスコ）内に詰め、保存にもＥＣＤ測定にも関与しない人が番号を付ける。無作為化表に基づいた番号付けシステムにより、予期しないフラスコの番号に従って媒質の識別が行われる。
【００５１】
ＥＣＤ測定手順
ＢＳＳ（平衡塩類溶液、Ａｌｃｏｎ、Ｋａｙｓｅｒｓｂｅｒｇ、フランス）を用いて角膜をすすいだ後、内皮を０．４％トリパンブルー（Ｓｉｇｍａ）で１分間覆い、次いで０．９％塩化ナトリウムで４分間すすぐ。次いで、角膜内皮を、Ｂｒ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２００２年、８６、３０６〜１１頁および５３１〜６頁のＧａｉｎ Ｐ．らによって記載されている内皮モザイク分析器のプロトタイプと一体になった光学顕微鏡下で、１０倍で観察する。内皮の異なる領域の像を１０個取込み、後で分析するためにコンピューターのハードディスクにアーカイブする。それぞれの分析には、３００個以上の細胞が関与する。
【００５２】
（結果）
ドナーの特徴
ドナーは、年齢が５７〜９０歳の範囲で平均年齢が７４．４歳の女性６人および男性１０人である。角膜の死と剥離の間の遅れは４．５〜４４時間で、遅れの平均は２０時間である。
【００５３】
結果
【００５４】
【表１】
【００５５】
％での全損失：Ｏｐｓｉａ媒質：３０．５ならびに本発明による実施例１および４由来の媒質：１７．３
【００５６】
【表２】
【００５７】
％での全損失：Ｏｐｓｉａ媒質：３０．２ならびに本発明による実施例２および５由来の媒質：１７．２
【００５８】
【表３】
【００５９】
％での全損失：Ｏｐｓｉａ媒質：３８ならびに本発明による実施例３および６由来の媒質：７．６
【００６０】
【表４】
【００６１】
％での全損失：Ｏｐｓｉａ媒質：３１．５ならびに本発明による実施例３および７由来の媒質：２０．８
【００６２】
（考察）
本研究の結論としては、発明者らは、角膜バンクで使用されている参照媒質で得られたものよりも有意に高い内皮の生存を３０日間以上保証することができる、動物起源の成分を少しも含まない厳密な媒質を開発した。平均してさらに約１６．９％の内皮細胞の元手が得られ、この結果は保存品質の劇的な改善であるため、この点は最も重要である。このような増加により、現在まで可能であったものよりもレシピエントの内皮予備量がより多くなり得る。レシピエントにとって、この予備量は、介入性の現象（外傷、拒絶反応、眼球内手術）へのより優れた耐性および移植片が透明なままである期間の増大も表す。
【００６３】
得られた結果に基づき、ポロキサマー１８８はデキストランよりも細胞毒性が低いと思われる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生細胞を保存する技術分野に関する。より正確には、本発明の目的は、生きている臓器、生物組織、および細胞、特に生きているヒト角膜を保存するための新しい媒質である。
【背景技術】
【０００２】
臓器移植の分野では、レシピエントへ移植する目的でドナーから臓器を取る場合、移植を成功させるために臓器の生存力を維持し得る臓器用の保存媒質が必要となる。実際に、種々の媒質がしばしば必要である。特にヒト角膜の場合、通常使用する媒質には：
角膜を提供施設から培養施設まで輸送し、同様にその角膜を培養施設から移植施設まで輸送するための輸送媒質、
保存媒質。一般に、保存は４℃または３１℃で行われる。この媒質は、媒質期間中、すなわち約４〜５週間の細胞生存力の最適な保存、品質（内皮試験）および無菌性（細菌学、血清学、およびウィルス学試験）に関して最大の安全を保証しなければならない、ならびに
角膜の厚みを減らし、透明にするために移植の約２４時間前に使用する水分排出媒質（ｄｅｔｕｒｇｅｓｃｅｎｃｅ ｍｅｄｉｕｍ）がある。
【０００３】
現在使用されている媒質の大半が、動物起源の成分：ウシ胎児血清アルブミン、トランスフェリン、インシュリンなどの動物起源のタンパク質を含んでいる。
【０００４】
これらの媒質中には動物起源の成分が存在するため、プリオン病、特にクロイツフェルト−ヤコブ病に関してこれらの医療の安全を保証するのは困難である。さらに、これらの媒質は、感染因子による汚染を受けやすく、完全に再生可能な組成ではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これに関して、本発明は、生細胞の生存力を保存する新しい保存媒質を提供することを目的とする。
【０００６】
本発明の別の目的は、含んでいる成分の点で製造するのに安価な保存媒質を提供することである。
【０００７】
本発明による保存媒質はまた、品質および無菌性に関して最大の安全を示さなければならない。
【０００８】
さらに、これは、完全に合成の、すなわち、組換えおよび化学合成から得られ、したがって非免疫原性であり感染因子に汚染されていない成分から調製することが可能な利点を示す。このため、本発明による保存媒質は、バッチごとに再現可能な厳密な組成を示すことができる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
より正確には、本発明は、高分子量のヒアルロン酸および塩化ナトリウムを含み、動物起源の成分を含まない、生きている臓器、生物組織、および細胞のための液体栄養ベースを含む保存媒質に関する。
【００１０】
本発明はまた、保存、臓器培養、細胞培養、輸送、ならびに生きている臓器、生物組織、および細胞、特に生きているヒト角膜の水分排出のためのかかる媒質の使用という目的がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
生きている生物学的臓器、細胞、および組織とは、生きている線維芽細胞、内皮細胞、および／または上皮細胞を含めたヒトまたは動物起源の成分を表す。
【００１２】
本発明の保存媒質は、補助的治療薬と表すことができる。
【００１３】
本発明による保存媒質は、内皮細胞および周囲の組織を保護するものである粘弾性物質（ＶＥＳ）を含む。これらの粘弾性物質は、特に高分子量のヒアルロン酸である。
【００１４】
高分子量、すなわち分子量が１００万ダルトン以上のヒアルロン酸は、動物起源、尖圭コンジローム抽出物または臍帯血、細菌起源（連鎖球菌の培養物由来）、あるいは野菜起源であってよい。もちろん、本発明による保存媒質は、動物起源の成分を含まないことを考えると、野菜起源の高分子量ヒアルロン酸を含む。特に、本発明の保存媒質は、分子量が１０６ダルトン以上で２０℃でのブルックフィールド粘度が１，５００センチポアズである、どちらもＬａｂｏｒａｔｏｉｒｅ Ｂｏｍａｎｎ（Ｇｒｏｕｐｅ Ｓｏｌｉａｎｃｅ）製の、商標名Ｃｒｉｓｔａｌｈｙａｌで販売されている粉末形態の、または商標名Ｖｉｔａｌｈｙａｌで販売されている１％水溶液の形の小麦由来の高分子量ヒアルロン酸を用いて調製することになる。
【００１５】
本発明による保存媒質はまた、結晶状の塩化ナトリウムを含む。塩化ナトリウムの機能は、特に、ヒアルロン酸の沈殿を防止することであるが、浸透圧モル濃度の維持にも関係する。
【００１６】
特に、本発明による保存媒質は：
８０〜４，０００ｍｇ／ｌ、好ましくは１００〜２００ｍｇ／ｌ、優先的には１００〜１６０ｍｇ／ｌの高分子量ヒアルロン酸、および
４，５００〜９，０００ｍｇ／ｌ、好ましくは５，５００〜９，０００ｍｇ／ｌ、優先的には７，０００ｍｇ／ｌの塩化ナトリウムを含む。
【００１７】
本発明による媒質は、特に媒質の粘度を増大させる機能を有するポロキサマー１８８を含むと有利である。
【００１８】
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８およびＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８とも呼ばれているポロキサマー１８８は、分子量が７，６８０〜９５０ｇ／ｍｏｌで一般式：
ＨＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｘ−［ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ］ｙ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｘ−Ｈ
（式中、ｘは約７９に等しく、ｙは約２８に等しい）
のポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンポリマー配列である。
【００１９】
ポロキサマー１８８の存在は、本発明による媒質では、前記媒質が臓器の水分排出ならびに生きている組織、細胞、特に、ヒト角膜移植片の輸送および保存に使用するものである場合、特に有利である。本発明による媒質は、好ましくは２００〜７５，０００ｍｇ／ｌ、優先的には４５０〜５０，０００ｍｇ／ｌのポロキサマー１８８を含むことになる。
【００２０】
現在販売されている角膜を水分排出するための保存媒質は、デキストランを含む。デキストランの機能は、角膜の厚みを減らすことであり、角膜を水分排出するための本発明による媒質に使用することができる。それでも、同様に角膜の厚みを減らすがはるかに細胞毒性が少ないポロキサマー１８８が、デキストランに比べて好ましい。
【００２１】
メチルセルロースは、本発明による保存媒質に含まれていてよいもう一つのＶＥＳである。メチルセルロースは植物起源であり、綿フロックまたは木材パルプ由来のセルロース繊維から得られる。これらのセルロース繊維は、塩化メチレンを用いてエーテル化させるために苛性ソーダ溶液で処理する。グルコシド単位当りのメトキシル化した置換基の数に相当する置換の程度は、１．６４〜１．９２である。特に、本発明の保存媒質を調製するために、ブルックフィールド粘度が４，０００センチポアズ（２０℃で２％水溶液）で分子量が８６，０００ダルトンの、ＳＥＰＰＩＣによりＭｅｔｏｌｏｓｅＳＭ ４００の商標名で販売されているメチルセルロースを使用することができる。本発明による媒質は、２１０〜５，０００ｍｇ／ｌ、好ましくは１，９００〜２，５００ｍｇ／ｌ、優先的には２，２０５ｍｇ／ｌのメチルセルロースを含むことが好ましい。
【００２２】
使用したＶＥＳは、水の保持による細胞の水和を可能にし、それらが囲んでいる細胞および組織へのある種の接着または付着を示し、したがって化学的攻撃および空気の毒性作用に対して前記囲んでいる細胞および組織を確実に保護する。
【００２３】
本発明による保存媒質は、生細胞保存の分野でより一般的に使用されている他の成分も含む。
【００２４】
特に、保存媒質は、臓器および細胞培養保存媒質に従来使用されている水性化学的栄養ベースを含む。有名な参考論文は、栄養ベースが以下のものを含むことが記載されている「Ｌｅ ｔｅｃｈｎｏｓｃｏｐｅ ｄｅ ｂｉｏｆｕｔｕｒ」、第１３３巻、１９９４年４月、３〜１６頁である：
細胞代謝における役割が窒素および炭素を供給することであるアミノ酸。いくつかの細胞には、１３種の必須アミノ酸とは別に特定の要求物がある（例えば、リンパ球にはセリン）；
乳酸の蓄積を制限する必要がある場合は代わりにガラクトースを使用することができるが、グルコースが最も広く使用されている糖類；
そのうち８種が必須であると考えられているビタミン、主にＢ群；
生理的食塩水の形で供給する、膜電位および浸透圧の維持に重要な役割を果たし、多くの酵素反応における補助因子でもあるイオン；
特に厳密な媒質中で培養を行う場合にますます重要な役割を果たすと思われる微量金属。最も重要なのは、セレン、カドミウム、およびリチウムである。
【００２５】
この種のベースは、これらの様々な構成元素から調製することができる。特定の化学的栄養ベースは、液体と固体のどちらの形態でも市販されている：後者は、その後水に溶解させなければならない。特に有用なものは、ＩＭＤＭ（イスコフ改変ダルベッコ媒質、参照：Ｉｓｃｏｖｅ、Ｎ．Ｎ．およびＭｅｌｃｈｅｒｓ（１９７８）Ｊ．ｏｆ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４７：９２３〜９３３）、Ｓｔａｉｎｅｒｓ、Ｃ．Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ．２３０、５２（１９７１）のＭＥＭアルファ、Ｃｌｉｃｋら、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３、２６４（１９７２）のクリックＲＰＭＩ、Ｐａｒｋｅｒ、Ｒ．Ｃ．ら、Ｓｐｅｃｉａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、５、３０３、（１９５７）のＣＭＲＬ１０６６媒質、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ、Ａ．、Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｇ．７８、１７３（１９６３）およびＭｏｒｔｏｎ、Ｈ．Ｊ．、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ、６、８９（１９７０）のライボビッツＬ１５媒質、Ｍｏｒｇａｎ、Ｊ．Ｆら、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．７３、１（１９５０）のＭ１９９媒質、ならびにＢａｒｎｅｓ、Ｄ．およびＳａｔｏ、Ｇ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２、２５５（１９８０）のＤＭＥＭ／ＨＡＭ Ｆ１２媒質、細胞および組織の維持に必要な様々な物質、特に様々な微量元素、アミノ酸、ビタミン、電解質、安定化ｐＨ緩衝液、ｐＨ指示薬（例えば、フェノールレッド）、およびグルコースまたはガラクトース（Ｌ１５）を含む水性栄養ベースである。微量元素とは、微量またはそれより多い量で存在する、ＮａＣｌを除いたすべての金属無機塩を表す。
【００２６】
有利な方法では、本発明による保存媒質は、使用する栄養ベースによって主に供給されるアミノ酸、微量元素、ビタミン、電解質、および安定化ｐＨ緩衝液をこのように含む。これらの元素が使用するベースに十分な量含まれていない場合、前記元素を補給することになる。
【００２７】
本発明による保存媒質は、有利にはそれぞれ独立に、１〜５０ｍｇ／ｌのコンドロイチン硫酸、０．１〜２５ｍｇ／ｌのヘパラン硫酸、５００〜２，０００ｍｇ／ｌのアルギン酸、および１，０００〜１０，０００ｍｇ／ｌのヘタスターチを含む。
【００２８】
保存媒質をヒト角膜移植に使用することを目的としている場合、乳酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸鉄（ＩＩ）、グルコン酸鉄（ＩＩ）、ピルビン酸ナトリウム、および塩化カルシウムなど房水中に存在する成分をなるべく含めることになる。
【００２９】
特に有利な方法では、本発明による保存媒質は、それぞれ独立に、または組み合わせて：
・好ましくは以下のものから選択した０．０１〜３５０ｍｇ／ｌのビタミン：
酢酸トコフェロール
酢酸レチノール
ヒドロキノン
アスコルビン酸
チアミンＢ１−ＨＣＬ
リボフラビンＢ２
カルシウムＤ−パントテン酸Ｂ５
塩酸ピリドキサールＢ６
ビオチンＢ８
葉酸Ｂ９
シアンコバラミンＢ１２
ニコチンアミドＢ３ ＰＰ
オロチン酸クロムＢ１３
・好ましくは以下のものから選択した０．０１〜６５０ｍｇ／ｌの微量元素：
ＣａＣｌ２・２Ｈ２０
ＫＣｌ
ＣａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ
ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ
ＮａＨＣＯ３
ＭｇＣＯ３・７Ｈ２Ｏ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ
ＭｎＣＯ３・４Ｈ２Ｏ
ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ
Ｎａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏ
Ｈ２ＳｅＯ３
ＮＨ４ＶＯ３
（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ
ＳｎＣ１２・２Ｈ２Ｏ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
酸化亜鉛
ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ
・好ましくは以下のものから選択した０．００５〜１５０ｍｇ／ｌのヌクレオシド：
アデノシン
シチジン
デオキシアデノシン
デオキシシチジン
デオキシグアノシン
グアノシン
ウリジン
チミジン
・８００〜４，０００ｍｇ／ｌのアミノ酸、
・５００〜９，０００ｍｇ／ｌの単糖類、好ましくはグルコースおよび／またはガラクトース、
・全濃度０．００１〜７５，０００ｍｇ／ｌでの他の元素、特に：
酢酸ナトリウム（３Ｈ２０）
クエン酸ナトリウム
乳酸ナトリウム
ピルビン酸ナトリウム
グルコン酸鉄（ＩＩ）
亜セレン酸ナトリウム
ポロキサマー１８８
オレイン酸
リノール酸
リノレン酸
パルミチン酸
ツイーン８０
を含む。
【００３０】
本発明による保存媒質は、液体または半固体形態であってよい。これは、細胞保護を助けるのに十分有効な粘度を示す。有利な方法では、本発明による保存媒質のブルックフィールド粘度は、２０℃で１〜１５センチポアズ（ｃｐｓ）、好ましくは２．５〜１０ｃｐｓの範囲である。したがって、本発明による保存媒質は、その粘度のため注入不可能である。
【００３１】
本発明による媒質の浸透圧モル濃度も重要であり、特に３００〜４６５ｍＯｓｍ±４０の範囲である。媒質の浸透圧モル濃度は、特にＮａＣｌ濃度によって決まる。本発明による媒質が保存または輸送を目的としている場合、その浸透圧モル濃度は、有利には３００〜３６０ｍＯｓｍ±４０の範囲のはずであり；水分排出を目的としている場合、その浸透圧モル濃度が３５０〜４６５ｍＯｓｍ±４０であると有利である。現在販売されている保存媒質の浸透圧モル濃度はより低い。本発明の利点の１つは、輸送、保存、および水分排出のための単一媒質を提供できることである。
【００３２】
本発明による保存媒質は、様々な成分を混合することによって調製する。好ましくは、ヒアルロン酸の液体生物学的栄養ベースへの溶解を改善するためには、後者を塩化ナトリウムと混合し、次いでメチルセルロースをすでに含んでいる栄養ベースに加えることになる。
【００３３】
本発明による保存媒質は、動物起源の成分を含まない。事実、一方では、生きている臓器、生物組織、および生細胞の保存のために現在まで使用されてきた大部分の媒質に反して、本発明による媒質は、ウシ胎児血清アルブミンも、ラクトフェリンも、トランスフェリンも、インシュリンも、他の動物起源のタンパク質も含まない。さらに、その合成に動物起源の原料を利用しない高分子量ヒアルロン酸およびメチルセルロースを使用している。したがって、このような保存媒質は、フランス公衆衛生規定の条項Ｌ．１２６３−１で定義されている補助的治療薬に関する法律に容易に準拠することができる。動物起源の成分を含まない保存媒質の使用により、保存細胞の医療保障を向上することができる。
【００３４】
本発明による保存媒質は、生きている臓器、生物組織、および細胞、特に生きているヒト角膜の保存、臓器培養、細胞培養、凍結、輸送、および水分排出に使用することができる。本発明による保存媒質は、特に−１９６℃〜３７℃の範囲の温度で使用可能である。
【００３５】
本発明による保存媒質は、想定した用途に応じて適合させることができる。
【００３６】
例えば、本発明による媒質が術前の水分排出に使用するものである場合、有利にはポロキサマー１８８を２００〜７５，０００ｍｇ／ｌ、優先的には４５０〜５０，０００ｍｇ／ｌの濃度で含むことになる。
【００３７】
媒質が生細胞の凍結に使用するものである場合、媒質中に存在する水の一部を凍結防止効果があるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と置き換えることができる。
【実施例】
【００３８】
以下の実施例は、本発明を例示しているが、決して限定するものではない。以下の実施例は、Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ Ｂｏｗｍａｎ（Ｇｒｏｕｐｅ Ｓｏｌｉａｎｃｅ）によって商標名Ｃｒｉｓｔａｌｈｙａｌで販売されている粉末形態のヒアルロン酸、ＳＥＰＰＩＣにより商標名メトローズＳＭ ４０００で販売されているメチルセルロース、およびＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈによって販売されているＮａＣｌを使用している。実施例１から３（保存媒質）は、ＩＭＤＭベースの体積が７４％であり、実施例４から７（水分排出媒質）は、ＩＭＤＭベースの体積が８８％である。
【００３９】
浸透圧モル濃度は、基準Ｍ８５５０１に従ってＦｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｂｌｏｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから販売されている浸透圧計で測定している（キー操作による自動零点［蒸留水］および標準［３００ｍＯｓｍ／ｋｇ］較正；応答時間１分）。
【００４０】
粘度は、基準Ｍ５７５７１に従ってＦｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｂｌｏｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから販売されている、１ｃｐｓ基準Ｍ５７５１０から始まる低粘度アダプターを備えた粘度計で測定している（速度、選択した移動相、ｃｐｓおよび範囲％における粘度、ならびに温度の同時表示；ブルックフィールド互換；移動相は試料に直接投入する）。
【００４１】
実施例１：実施例１の媒質は、輸送および保存に使用すると有利である。
高分子量ヒアルロン酸 １００ｍｇ／ｌ
メチルセルロース ２，２０５ｍｇ／ｌ
ＮａＣｌ ６，９８５ｍｇ／ｌ
アミノ酸 １，８３８ｍｇ／ｌ
微量元素 ５，３９０ｍｇ／ｌ
グルコース ４，５００ｍｇ／ｌ
炭水化物 １，１６７ｍｇ／ｌ
ヌクレオシド １０ｍｇ／ｌ
ビタミン １６３ｍｇ／ｌ
脂肪酸エステル ４６ｍｇ／ｌ
緩衝液 ８，９８２ｍｇ／ｌ
ｐＨ ７．３
浸透圧モル濃度 ３９４ｍＯｓｍ
粘度 ５ｃｐｓ（ブルックフィールド、２０℃）
【００４２】
実施例２：実施例２の媒質は、輸送および保存に使用すると有利である。
高分子量ヒアルロン酸 １００ｍｇ／ｌ
メチルセルロース ２，２０５ｍｇ／ｌ
ＮａＣｌ ５，５８５ｍｇ／ｌ
アミノ酸 １，８３８ｍｇ／ｌ
微量元素 ５，３９０ｍｇ／ｌ
グルコース ４，５００ｍｇ／ｌ
炭水化物 １，１６７ｍｇ／ｌ
ヌクレオシド １０ｍｇ／ｌ
ビタミン １６３ｍｇ／ｌ
脂肪酸エステル ４６ｍｇ／ｌ
緩衝液 ８，９８２ｍｇ／ｌ
ｐＨ ７．３
浸透圧モル濃度 ３７２ｍＯｓｍ
粘度 ５ｃｐｓ（ブルックフィールド、２０℃）
【００４３】
実施例３：実施例３の媒質は、輸送および保存に使用すると有利である。
高分子量ヒアルロン酸 １６０ｍｇ／ｌ
ポロキサマー１８８ ２，２０５ｍｇ／ｌ
ＮａＣｌ ５，５８５ｍｇ／ｌ
アミノ酸 １，８３８ｍｇ／ｌ
微量元素 ５，３９０ｍｇ／ｌ
グルコース ４，５００ｍｇ／ｌ
炭水化物 １，１６７ｍｇ／ｌ
ヌクレオシド １０ｍｇ／ｌ
ビタミン １６３ｍｇ／ｌ
脂肪酸エステル ４６ｍｇ／ｌ
緩衝液 ８，９８２ｍｇ／ｌ
ｐＨ ７．３
浸透圧モル濃度 ３０５ｍＯｓｍ
粘度 １．５ｃｐｓ（ブルックフィールド、２０℃）
【００４４】
実施例４：実施例４の媒質は、水分排出に使用すると有利である。
高分子量ヒアルロン酸 １００ｍｇ／ｌ
メチルセルロース ２，２０５ｍｇ／ｌ
デキストラン ５０，０００ｍｇ／ｌ
ＮａＣｌ ６，８９５ｍｇ／ｌ
アミノ酸 １，８３８ｍｇ／ｌ
微量元素 ５，３９０ｍｇ／ｌ
グルコース ４，５００ｍｇ／ｌ
炭水化物 １，１６７ｍｇ／ｌ
ヌクレオシド １０ｍｇ／ｌ
ビタミン １６３ｍｇ／ｌ
脂肪酸エステル ４６ｍｇ／ｌ
緩衝液 ８，９８２ｍｇ／ｌ
ｐＨ ７．３
浸透圧モル濃度 ６９４ｍＯｓｍ
粘度 １０ｃｐｓ（ブルックフィールド、２０℃）
【００４５】
実施例５：実施例５の媒質は、水分排出に使用すると有利である。
高分子量ヒアルロン酸 １００ｍｇ／ｌ
メチルセルロース ２，２０５ｍｇ／ｌ
デキストラン ５０，０００ｍｇ／ｌ
ＮａＣｌ ５，５８５ｍｇ／ｌ
アミノ酸 １，８３８ｍｇ／ｌ
微量元素 ５，３９０ｍｇ／ｌ
グルコース ４，５００ｍｇ／ｌ
炭水化物 １，１６７ｍｇ／ｌ
ヌクレオシド １０ｍｇ／ｌ
ビタミン １６３ｍｇ／ｌ
脂肪酸エステル ４６ｍｇ／ｌ
緩衝液 ８，９８２ｍｇ／ｌ
ｐＨ ７．３
浸透圧モル濃度 ５８５ｍＯｓｍ
粘度 １０ｃｐｓ（ブルックフィールド、２０℃）
【００４６】
実施例６：実施例６の媒質は、水分排出に使用すると有利である。
高分子量ヒアルロン酸 １６０ｍｇ／ｌ
デキストラン ５０，０００ｍｇ／ｌ
ＮａＣｌ ５，５８５ｍｇ／ｌ
アミノ酸 １，８３８ｍｇ／ｌ
微量元素 ５，３９０ｍｇ／ｌ
グルコース ４，５００ｍｇ／ｌ
炭水化物 １，１６７ｍｇ／ｌ
ヌクレオシド １０ｍｇ／ｌ
ビタミン １６３ｍｇ／ｌ
脂肪酸エステル ４６ｍｇ／ｌ
緩衝液 ８，９８２ｍｇ／ｌ
ｐＨ ７．３
浸透圧モル濃度 ５９５ｍＯｓｍ
粘度 ８．５ｃｐｓ（ブルックフィールド、２０℃）
【００４７】
実施例７：実施例７の媒質は、水分排出に使用すると有利である。
高分子量ヒアルロン酸 １６０ｍｇ／ｌ
ポロキサマー１８８ ５０，０００ｍｇ／ｌ
ＮａＣｌ ５，５８５ｍｇ／ｌ
アミノ酸 １，８３８ｍｇ／ｌ
微量元素 ５，３９０ｍｇ／ｌ
グルコース ４，５００ｍｇ／ｌ
炭水化物 １，１６７ｍｇ／ｌ
ヌクレオシド １０ｍｇ／ｌ
ビタミン １６３ｍｇ／ｌ
脂肪酸エステル ４６ｍｇ／ｌ
緩衝液 ８，９８２ｍｇ／ｌ
ｐＨ ７．３
浸透圧モル濃度 ３７６ｍＯｓｍ
粘度 ５ｃｐｓ（ブルックフィールド、２０℃）
【００４８】
（材料および方法）
保存順序
ドナーの死後２４時間以内に科学的なヒト角膜（科学的研究に提供された臓器）を採取する。ドナーは、同じドナー由来の２つの角膜の比較可能性を維持するために、眼内手術を受けるべきではない。取り出した後、対のそれぞれの角膜を輸送媒質５０ｍｌに浸漬する。参照媒質（Ｉｎｏｓｏｌ（登録商標）、Ｃｈａｕｖｉｎ−Ｏｐｓｉａ／Ｂａｕｓｈ ａｎｄ Ｌｏｍｂ、Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、フランス）または本発明による媒質（実施例１から３）のいずれかを使用する。角膜を含む密封したフラスコをすぐに３１℃の乾燥機に入れる。臓器培養物の保存２日目には、後述の手順に従って内皮細胞密度（ＥＣＤ）を測定する。次いで角膜を、新しい１００ｍｌフラスコ中の同じ種類の媒質中に再度浸し、フラスコ壁およびフラスコ底に沈殿した沈降物と接触するのを防止するために縫合糸と懸濁させる。１４日間保存した後、角膜を新しい１００ｍｌフラスコに移す。欧州における最高推奨期間である３０日間保存した後、新しいＥＣＤ測定を行い、所与の保存期間について細胞損失を計算する。次いで角膜を、その厚みを減らすことを目的とした「水分排出」媒質５０ｍｌに浸漬する。Ｅｘｏｓｏｌ（登録商標）（Ｃｈａｕｖｉｎ−Ｏｐｓｉａ／Ｂａｕｓｈ ａｎｄ Ｌｏｍｂ）あるいは５０，０００ｍｇ／ｌのデキストランまたは５０，０００ｍｇ／ｌのポロキサマー１８８に対応する本発明による媒質（実施例４から７）のいずれかを使用する。４８時間後、バックライトをあてた、徐々に太くなる８本の黒線のグリッドに位置を合わせて同じ対の２つの角膜を並んで撮影する。この写真は、角膜透明度の記録となる。超音波厚度計（Ｔｏｍｅｙ ＡＬ−２０００、東京、日本）によって角膜の厚さを尖部で測定する。３回目のＥＣＤ測定は、細胞膜を染色する目的でｐＨ４．５のリン酸緩衝液中４％アリザリンレッド（Ｓｉｇｍａ）と一緒に４５秒間のインキュベーションを行った後に実施する。この重要ではない染色は、その細胞毒性のために、保存の最後にしか利用できない。
【００４９】
全体の手順は、保存媒質の性質に関して盲検で行う。
【００５０】
盲検分析を保証する手順
２種類の保存および水分排出媒質を同一容器（１２５ｍｌ Ｎａｌｇｅｎｅフラスコ）内に詰め、保存にもＥＣＤ測定にも関与しない人が番号を付ける。無作為化表に基づいた番号付けシステムにより、予期しないフラスコの番号に従って媒質の識別が行われる。
【００５１】
ＥＣＤ測定手順
ＢＳＳ（平衡塩類溶液、Ａｌｃｏｎ、Ｋａｙｓｅｒｓｂｅｒｇ、フランス）を用いて角膜をすすいだ後、内皮を０．４％トリパンブルー（Ｓｉｇｍａ）で１分間覆い、次いで０．９％塩化ナトリウムで４分間すすぐ。次いで、角膜内皮を、Ｂｒ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２００２年、８６、３０６〜１１頁および５３１〜６頁のＧａｉｎ Ｐ．らによって記載されている内皮モザイク分析器のプロトタイプと一体になった光学顕微鏡下で、１０倍で観察する。内皮の異なる領域の像を１０個取込み、後で分析するためにコンピューターのハードディスクにアーカイブする。それぞれの分析には、３００個以上の細胞が関与する。
【００５２】
（結果）
ドナーの特徴
ドナーは、年齢が５７〜９０歳の範囲で平均年齢が７４．４歳の女性６人および男性１０人である。角膜の死と剥離の間の遅れは４．５〜４４時間で、遅れの平均は２０時間である。
【００５３】
結果
【００５４】
【表１】
【００５５】
％での全損失：Ｏｐｓｉａ媒質：３０．５ならびに本発明による実施例１および４由来の媒質：１７．３
【００５６】
【表２】
【００５７】
％での全損失：Ｏｐｓｉａ媒質：３０．２ならびに本発明による実施例２および５由来の媒質：１７．２
【００５８】
【表３】
【００５９】
％での全損失：Ｏｐｓｉａ媒質：３８ならびに本発明による実施例３および６由来の媒質：７．６
【００６０】
【表４】
【００６１】
％での全損失：Ｏｐｓｉａ媒質：３１．５ならびに本発明による実施例３および７由来の媒質：２０．８
【００６２】
（考察）
本研究の結論としては、発明者らは、角膜バンクで使用されている参照媒質で得られたものよりも有意に高い内皮の生存を３０日間以上保証することができる、動物起源の成分を少しも含まない厳密な媒質を開発した。平均してさらに約１６．９％の内皮細胞の元手が得られ、この結果は保存品質の劇的な改善であるため、この点は最も重要である。このような増加により、現在まで可能であったものよりもレシピエントの内皮予備量がより多くなり得る。レシピエントにとって、この予備量は、介入性の現象（外傷、拒絶反応、眼球内手術）へのより優れた耐性および移植片が透明なままである期間の増大も表す。
【００６３】
得られた結果に基づき、ポロキサマー１８８はデキストランよりも細胞毒性が低いと思われる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体栄養ベースを含む、生きている臓器、生物組織、および細胞のための保存媒質であって、高分子量ヒアルロン酸および塩化ナトリウムを含み、動物起源の成分を含まない保存媒質。
【請求項２】
８０〜４，０００ｍｇ／ｌ、好ましくは１００〜２００ｍｇ／ｌ、優先的には１００〜１６０ｍｇ／ｌの高分子量ヒアルロン酸、および
４，５００〜９，０００ｍｇ／ｌ、好ましくは５，５００〜９，０００ｍｇ／ｌ、優先的には７，０００ｍｇ／ｌの塩化ナトリウム
を含む、請求項１に記載の保存媒質。
【請求項３】
ポロキサマー１８８をさらに含む、請求項１または２に記載の保存媒質。
【請求項４】
２００〜７５，０００ｍｇ／ｌ、好ましくは４５０〜５０，０００ｍｇ／ｌのポロキサマー１８８を含む、請求項３に記載の保存媒質。
【請求項５】
メチルセルロースをさらに含む、請求項１から４の一項に記載の保存媒質。
【請求項６】
２１０〜５，０００ｍｇ／ｌ、好ましくは１，９００〜２，５００ｍｇ／ｌ、優先的には２，２０５ｍｇ／ｌのメチルセルロースを含む、請求項５に記載の保存媒質。
【請求項７】
３００〜４６５ｍＯｓｍ±４０ｍＯｓｍの浸透圧モル濃度を示す、請求項１から６の一項に記載の保存媒質。
【請求項８】
２０℃において１〜１５センチポアズ、好ましくは２．５〜１０センチポアズの範囲のブルックフィールド粘度を示す、請求項１から７の一項に記載の保存媒質。
【請求項９】
微量元素、アミノ酸、ビタミン、および安定化ｐＨ緩衝液を含む、請求項１から８の一項に記載の保存媒質。
【請求項１０】
デキストランを含まない、請求項１から９の一項に記載の保存媒質。
【請求項１１】
生きているヒト角膜を保存するための、請求項１から１０の一項に記載の保存媒質の使用。
【請求項１２】
生きている臓器、生物組織、および細胞、特に生きているヒト角膜を臓器培養するための、請求項１から１０の一項に記載の保存媒質の使用。
【請求項１３】
生きている臓器、生物組織、および細胞、特に生きているヒト角膜を輸送するための、請求項１から１０の一項に記載の保存媒質の使用。
【請求項１４】
生きている臓器、生物組織、および細胞、特に生きているヒト角膜を水分排出するための、請求項１から１０の一項に記載の保存媒質の使用。
【請求項１】
液体栄養ベースを含む、生きている臓器、生物組織、および細胞のための保存媒質であって、高分子量ヒアルロン酸および塩化ナトリウムを含み、動物起源の成分を含まない保存媒質。
【請求項２】
８０〜４，０００ｍｇ／ｌ、好ましくは１００〜２００ｍｇ／ｌ、優先的には１００〜１６０ｍｇ／ｌの高分子量ヒアルロン酸、および
４，５００〜９，０００ｍｇ／ｌ、好ましくは５，５００〜９，０００ｍｇ／ｌ、優先的には７，０００ｍｇ／ｌの塩化ナトリウム
を含む、請求項１に記載の保存媒質。
【請求項３】
ポロキサマー１８８をさらに含む、請求項１または２に記載の保存媒質。
【請求項４】
２００〜７５，０００ｍｇ／ｌ、好ましくは４５０〜５０，０００ｍｇ／ｌのポロキサマー１８８を含む、請求項３に記載の保存媒質。
【請求項５】
メチルセルロースをさらに含む、請求項１から４の一項に記載の保存媒質。
【請求項６】
２１０〜５，０００ｍｇ／ｌ、好ましくは１，９００〜２，５００ｍｇ／ｌ、優先的には２，２０５ｍｇ／ｌのメチルセルロースを含む、請求項５に記載の保存媒質。
【請求項７】
３００〜４６５ｍＯｓｍ±４０ｍＯｓｍの浸透圧モル濃度を示す、請求項１から６の一項に記載の保存媒質。
【請求項８】
２０℃において１〜１５センチポアズ、好ましくは２．５〜１０センチポアズの範囲のブルックフィールド粘度を示す、請求項１から７の一項に記載の保存媒質。
【請求項９】
微量元素、アミノ酸、ビタミン、および安定化ｐＨ緩衝液を含む、請求項１から８の一項に記載の保存媒質。
【請求項１０】
デキストランを含まない、請求項１から９の一項に記載の保存媒質。
【請求項１１】
生きているヒト角膜を保存するための、請求項１から１０の一項に記載の保存媒質の使用。
【請求項１２】
生きている臓器、生物組織、および細胞、特に生きているヒト角膜を臓器培養するための、請求項１から１０の一項に記載の保存媒質の使用。
【請求項１３】
生きている臓器、生物組織、および細胞、特に生きているヒト角膜を輸送するための、請求項１から１０の一項に記載の保存媒質の使用。
【請求項１４】
生きている臓器、生物組織、および細胞、特に生きているヒト角膜を水分排出するための、請求項１から１０の一項に記載の保存媒質の使用。
【公表番号】特表２００７−５１４６４０（Ｐ２００７−５１４６４０Ａ）
【公表日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１８２５２（Ｐ２００６−５１８２５２）
【出願日】平成１６年３月２３日（２００４．３．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００４／０００７１２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１３６９０
【国際公開日】平成１７年２月１７日（２００５．２．１７）
【出願人】（５０６００６２１２）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年３月２３日（２００４．３．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００４／０００７１２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１３６９０
【国際公開日】平成１７年２月１７日（２００５．２．１７）
【出願人】（５０６００６２１２）
【Ｆターム（参考）】
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