自己免疫疾患の発症に関わる自己応答性Ｔ細胞またはＴ細胞受容体の同定方法、およびその利用
【課題】自己免疫疾患の発症または発症可能性について、客観的かつ正確な診断を可能とするための、自己免疫疾患の発症に関わる自己応答性Ｔ細胞またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の同定方法、およびその利用方法を提供する。
【解決手段】自己免疫疾患の発症に関わる自己応答性Ｔ細胞の同定方法であって、Ｔ細胞群におけるレパトアの偏りを、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域の多様性の偏りについて、ＴＣＲ遺伝子中の該領域のポリヌクレオチドの長さ、あるいはＴＣＲタンパク質中の該領域のポリペプチドの長さの多様性から検出する工程を含む。
【解決手段】自己免疫疾患の発症に関わる自己応答性Ｔ細胞の同定方法であって、Ｔ細胞群におけるレパトアの偏りを、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域の多様性の偏りについて、ＴＣＲ遺伝子中の該領域のポリヌクレオチドの長さ、あるいはＴＣＲタンパク質中の該領域のポリペプチドの長さの多様性から検出する工程を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫疾患の発症に関わる自己応答性Ｔ細胞またはＴ細胞受容体の同定方法、およびその利用に関するものであり、より具体的には、Ｔ細胞受容体のＣＤＲ３領域を指標とした、自己免疫疾患の発症に関わる自己応答性Ｔ細胞またはＴ細胞受容体の同定方法、およびその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生物は、外界から体内に侵入してくる抗原を予測することはできない。したがって、生物は、Ｔ細胞受容体（T cell receptor;TCR）レパトアの多様性を維持することによって、多種多様な抗原に対応している。この場合、免疫システムを正常に機能させるためには、抗原に晒されていない状態において、Ｔ細胞受容体レパトアの多様性を維持することが、非常に重要であるといえる。
【０００３】
Ｔ細胞受容体の多様性は、抗原提示されたポリペプチドを認識する部分であるＣＤＲ（complementarity determining region）の多様性に依存している。ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼ばれる３つの領域を含み、当該３つの領域において抗原に結合する。ＣＤＲ３は、さらにＣＤＲ３−αおよびＣＤＲ３−βの２つの領域を含み、当該２つの領域が、ポリペプチドを認識する上で、中心的な機能を有する（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
現在までに、上記ＣＤＲ３は、イムノグロブリンと同様に複数の遺伝子領域の組み合わせによって形成されることが知られている。そして、その組み合わせによって、塩基配列およびアミノ酸配列において、多種多様な長さと配列とを有するＣＤＲ３が形成され得ることが知られている。（例えば、非特許文献２参照）。そして、当該ＣＤＲ３の多様性こそが、Ｔ細胞受容体の多様性を生み出す要因であるともいえる。
【０００５】
ところで、上述した免疫システムは、本来外界からの有害な異物の侵入に対する生体の防御機構として存在するものである。しかし、時にはこの免疫系の働きが、結果的に生体に有害であることがある。これを一般的にアレルギーと呼んでいる。生体は、外界からの異物に対するのみならず、自己の成分に対しても一種のアレルギー反応・自己免疫応答を起こすことが知られている。これを自己免疫現象（autoimmunity）と称し、これをもとにある病態が生じた場合には、自己免疫疾患（autoimmune disease）と称する。
【０００６】
自己免疫疾患は、全身性の疾患であるが、臓器特異性のある疾患と、特異性のない疾患の２つに大別される。臓器特異的自己免疫疾患には、橋本甲状腺炎（慢性甲状腺炎）、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症（甲状腺剤中毒症）、悪性貧血、グッドパスチャー症候群、急性進行性糸球体腎炎、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、インスリン抵抗性糖尿病、若年性糖尿病、アジソン病、萎縮性胃炎（自己免疫性萎縮性胃炎）、男性不妊症、早発性更年期、水晶体原性ぶどう膜炎、交感性脈炎、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、発作性血色素尿症（発作性ヘモグロビン尿症）、特発性血小板減少性紫斑病、シェーグレン症候群がある。臓器非特異的自己免疫疾患には、関節リウマチ（慢性関節リウマチ）、全身性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、多発性筋炎、強（鞏）皮症、混合結合組織病がある。
【０００７】
近年、上記自己免疫疾患の一部および他の疾患における病態の進行過程で、上記ＣＤＲ３が重要な役割を果たしているものがあることが示唆されている。
【０００８】
例えば、上記多発性硬化症に似た病体の発症モデルマウスを作製するにあたって、ラット（例えば、Lewis rat）にミエリン塩基性タンパク質（myelin basic protein;MBP）を投与する方法が用いられている。そして、当該方法によって引き起こされたモデル疾患を、実験的自己免疫脳脊髄炎（experimental autoimmune encephalomyelitis;EAE）と呼ぶ。そして、実験的自己免疫脳脊髄炎においては、病態の進行において、ＣＤＲ３が多様性を有することが重要な意味を有することが示唆されている（例えば、非特許文献３参照）。さらに具体的には、上記非特許文献３では、Ｔ細胞受容体のβ鎖のうち、ＣＤＲ３を含むＶβ１７およびＶβ８．２が、疾患の初期段階において、塩基配列の長さ、およびアミノ酸配列において多様性を有することが示されている。さらに、上記非特許文献３においては、Ｖβ１７の塩基配列の長さおよびアミノ酸配列は、疾患が悪化するに伴って更に多様性を増すが、Ｖβ８．２の塩基配列の長さおよびアミノ酸配列は、疾患の初期段階から変化しないことが示されている。また、実験的自己免疫脳脊髄炎において、ＣＤＲ３中のAsp-Ala-Gly-Gly-Gly-Tyr（DAGGGY）配列が、病態の進行において重要な役割を担っていることも示唆されている（例えば、非特許文献４参照）。
【０００９】
また、例えば、上記シェーグレン症候群の発症モデルマウスを作製するにあたって、α-fodrin peptideをマウスに投与する方法が用いられている。そして、シューグレン症候群を発症するマウスのＣＤＲ３の塩基配列およびアミノ酸配列は、類似の塩基配列およびアミノ酸配列を有することが示唆されている（例えば、非特許文献５参照）。
【００１０】
また、例えば、大顆粒リンパ球性白血病（large granular lymphocyte leukemia）における細胞増殖が、自己免疫反応と関連していることが示されている（例えば、非特許文献６参照）。そして、上記非特許文献６では、増殖性の大顆粒リンパ球のＣＤＲ３には、塩基配列およびアミノ酸配列において類似した領域が存在することが示されている。
【非特許文献１】Janko Nikolich-Zugich et al.,The Many Important Factors of T-cell Repertoire Diversity,Nature reviews/immunology,Vol.4,123-132,Feb 2004
【非特許文献２】Christophe Pannetier et al.,The sizes of the CDR3 hypervariable regions of the murine T-cell receptor β chains vary as a function of the recombined germ-line segment,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,Vol.90,4319-4323,May 1993
【非特許文献３】Giok Kim et al.,CDR3 Size Spectratyping and Sequencing of Spectratype-Derived TCR of Spinal Cord T Cells in Autoimmune Encephalomyelitis,J. Immunol.,1998,160:509-513
【非特許文献４】Jason G. Huang et al.,The central residues of a T cell receptor sequence motif are key determinants of autoantigen recognition in murine experimental autoimmune encephalomyelitis,Eur. J. Immunol.,2005,35;299-304
【非特許文献５】Rieko Arakaki et al.,Development of Autoimmune Exocrinopathy Resembling Sjogren’s Syndrome in Adoptively Transferred Mice With Autoreactive CD4+ T Cells,ARTHRITIS & RHEUMATISM,Vol.48,No.12,Dec 2003,3603-3609
【非特許文献６】Marcin W. Wlodarski et al.,Pathologic clonal cytotoxic T-cell responses:nonrandom nature of the T-cell-receptor restriction in large granular lymphocyte leukemia,Blood,15,Oct 2005,Vol.106,No.8,2769-2780
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述したように、自己免疫疾患には多種多様な疾患が含まれており、各疾患の発症機構も異なると考えられている。したがって、各自己免疫疾患ごとに、発症を客観的に診断する技術を確立する必要がある。
【００１２】
上記自己免疫疾患のなかでも、特に本発明者らは関節リウマチに着目して研究を進めている。関節リウマチ（rheumatoid arthritis、以下「ＲＡ」ともいう）は、多発するびらん性関節炎を主徴とするが、同時に多臓器を障害する原因不明の全身性炎症疾患である。ＲＡは寛解と増悪とを繰り返しながら慢性に進行し、無治療で放置すると関節の破壊や変形を来し、やがて運動器の機能障害を呈してくる。時には生命をも脅かす。したがって、ＲＡ患者は身体的にも精神的にも大きな苦痛を生涯に亘って背負うことになる。
【００１３】
上述のように、いくつかの自己免疫疾患については積極的な研究成果が数多く報告されているが、自己免疫疾患の発症または発症可能性を客観的に診断する技術は未だ十分に確立されているとはいえない。
【００１４】
このため、自己免疫疾患の発症または発症可能性についての客観的かつ正確な診断に寄与できる、新たな技術の確立が強く望まれていた。
【００１５】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、自己免疫疾患の発症または発症可能性について、客観的かつ正確な診断を可能とするための、自己免疫疾患の発症に関わる自己応答性Ｔ細胞またはＴ細胞受容体の同定方法、およびその利用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本願発明者らは、独自に検討した結果、スーパー抗原の一種であるstaphylococcal entrotoxin B（ＳＥＢ）を繰り返しマウスに投与すると、ＳＥＢ応答性Ｔ細胞のアネルギー破綻と同時に、リウマチ因子（ＲＦ）が上昇することを見出している。そして、本願発明者らは、さらに上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＳＥＢを繰り返し投与したマウスでは、ＴＣＲ遺伝子の再構成によって、抹消のＶβ８＋Ｔ細胞のレパトアに偏りが生じること、つまり、ＣＤＲ３の塩基配列およびアミノ酸配列において、長さや配列に偏りが生じることを見出して、本願発明を完成させるに至った。
【００１７】
すなわち、本願発明は産業上有用な方法またはその利用として、以下の（１）〜（１２）を含むものである。
【００１８】
（１）自己免疫疾患の発症に関わる自己応答性Ｔ細胞またはＴ細胞受容体の同定方法であって、Ｔ細胞群におけるレパトアの多様性の偏りを検出する多様性検出工程を含む同定方法。
【００１９】
（２）上記多様性検出工程では、ＴＣＲ遺伝子またはＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域の多様性の偏りが検出される同定方法。
【００２０】
（３）上記ＣＤＲ３領域の多様性の偏りは、以下の１）および２）、つまり、
１）ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドの長さの多様性を検出するポリヌクレオチド長検出工程
２）ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドの長さの多様性を検出するポリペプチド長検出工程
の少なくとも一つの工程によって検出される同定方法。
【００２１】
（４）上記ポリヌクレオチド長検出工程では、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域が、３９個のヌクレオチドから構成されているＴ細胞の割合と、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域が、３９個以外のヌクレオチドから構成されているＴ細胞の割合とが比較され、上記ポリペプチド長検出工程では、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域が、１３個のアミノ酸から構成されているＴ細胞の割合と、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域が、１３個以外のアミノ酸から構成されているＴ細胞の割合とが比較される同定方法。
【００２２】
（５）上記ポリヌクレオチド長検出工程は、Ｔ細胞におけるＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域の長さが、３９個のヌクレオチドを中心として、正規分布しているか否かを検出する工程を含み、上記ポリペプチド長検出工程は、Ｔ細胞におけるＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域の長さが、１３個のアミノ酸を中心として、正規分布しているか否かを検出する工程を含む同定方法。
【００２３】
（６）上記ポリヌクレオチド長検出工程は、Ｔ細胞におけるＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域が、３０〜４８個のヌクレオチドから構成されるように分布しているか否かを検出する工程を含み、上記ポリペプチド長検出工程は、Ｔ細胞におけるＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域が、１０〜１６個のアミノ酸から構成されるように分布しているか否かを検出する工程を含む同定方法。
【００２４】
（７）上記ＣＤＲ３領域の多様性の偏りは、以下の１）および２）、つまり、
１）ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドの塩基配列の多様性を検出する塩基配列検出工程
２）ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドのアミノ酸配列の多様性を検出するアミノ酸配列検出工程
の少なくとも一つの工程によって検出される同定方法。
【００２５】
（８）上記塩基配列検出工程では、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域が、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）からなる群より選択されるアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸が連続して配置されることによって形成される、２つのアミノ酸からなる親水性領域をコードするＴ細胞の割合と、当該親水性領域をコードしないＴ細胞の割合とが比較され、上記アミノ酸配列検出工程では、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域が、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）からなる群より選択されるアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸が連続して配置されることによって形成される、２つのアミノ酸からなる親水性領域を有するＴ細胞の割合と、当該親水性領域を有さないＴ細胞の割合とが比較される同定方法。
【００２６】
（９）上記親水性領域を形成する２つのアミノ酸は、少なくとも一方がグリシン（Ｇ）である同定方法。
【００２７】
（１０）上記自己免疫疾患が、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、発作性血色素尿症、特発性血小板減少性紫斑病、シェーグレン症候群、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、多発性筋炎、強皮症または混合結合組織病である同定方法。
【００２８】
（１１）生体から分離された生体サンプルを用いて自己免疫疾患の発症または発症可能性を判定する方法であって、上記同定方法のいずれかによって自己応答性Ｔ細胞またはＴ細胞受容体を検出する工程を含む判定方法。
【００２９】
（１２）上記同定方法のいずれかを実施するための同定キットであって、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域を増幅可能なプライマー対を含む同定キット。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、自己免疫疾患の発症に寄与する自己応答性Ｔ細胞およびＴ細胞受容体を同定することができるとともに、自己免疫疾患の発症または発症可能性について、客観的かつ正確な診断を可能にするという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下に本発明の、自己免疫疾患の発症に関わる自己応答性Ｔ細胞またはＴ細胞受容体の同定方法、自己免疫疾患の発症または発症可能性を判定する方法、および同定キットについて説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３２】
〔自己免疫疾患の発症に関わる自己応答性Ｔ細胞またはＴ細胞受容体の同定方法〕
本実施の形態の同定方法は、自己免疫疾患に関わる自己応答性Ｔ細胞のレパトアの多様性に偏りを生じるという、本願発明者によって独自に見出された事実に基づいている。以下に、本実施の形態の同定方法について説明する。
【００３３】
本実施の形態の同定方法は、自己免疫疾患の発症に関わる自己応答性Ｔ細胞またはＴ細胞受容体の同定方法である。
【００３４】
上記自己免疫疾患としては特に限定されないが、橋本甲状腺炎（慢性甲状腺炎）、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、発作性血色素尿症（発作性ヘモグロビン尿症）、特発性血小板減少性紫斑病、シェーグレン症候群、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、多発性筋炎、強（鞏）皮症、または混合結合組織病であることが好ましい。
【００３５】
本願発明者らは、発明者らが独自に開発した自己免疫疾患モデルマウスから得た知見に基づいて、本願発明を完成させるに至った。上記自己免疫疾患モデルマウスは、広く自己免疫疾患に共通した症状を示すが、自己免疫疾患のなかでも、上記自己免疫疾患に近い症状を示す。したがって、本実施の形態の同定方法において、自己免疫疾患が上述したものであれば、より正確に、Ｔ細胞群におけるレパトアの多様性の偏りを検出することができる。
【００３６】
また、上記Ｔ細胞としては特に限定されないが、免疫応答の活性化（ヘルパーＴ細胞）、抑制（サプレッサーＴ細胞）など免疫応答の制御、および、ウイルスが感染した細胞および癌細胞の傷害（キラーＴ細胞）や遅延型アレルギーなどに関与するリンパ球亜群が含まれる。
【００３７】
また、本実施の形態の同定方法は、Ｔ細胞群におけるレパトアの多様性の偏りを検出する多様性検出工程を含む。なお、本明細書において「レパトアの多様性」とは、抗原認識の多様性が意図される。上記多様性検出工程にて、Ｔ細胞群におけるレパトアの多様性の偏りを検出することによって、自己免疫疾患の発症に関わる自己応答性Ｔ細胞またはＴ細胞受容体を同定することができる。
【００３８】
上記多様性検出工程は、Ｔ細胞群におけるレパトアの多様性の偏りを検出し得るものであればよく、特に限定されないが、ＴＣＲ遺伝子またはＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域の多様性の偏りを検出することができる工程であることが好ましい。上述したように、ＴＣＲ遺伝子およびＴＣＲタンパク質は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼ばれる３つの領域を含み、当該３つの領域において抗原に結合する。そして、ポリペプチドを認識する上で、上記３つの領域の中でもＣＤＲ３領域が中心的な機能を果たす。したがって、上記多様性検出工程において、ＴＣＲ遺伝子またはＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域の多様性の偏りを検出すれば、より正確に、Ｔ細胞群におけるレパトアの多様性の偏りを検出することができる。
【００３９】
本実施の形態の同定方法では、ＣＤＲ３領域の多様性を検出するための指標は特に限定されないが、当該指標としては、例えば、１）ＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドの長さ、２）ＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドの長さ、３）ＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドの塩基配列、４）ＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドのアミノ酸配列、であることが好ましい。つまり、本実施の形態の同定方法では、Ｔ細胞群において、上記１）〜４）にて示される指標に偏りがあるか否かを検出することが好ましい。上記構成によれば、より容易にＴ細胞群におけるレパトアの多様性の偏りを検出することができる。
【００４０】
なお、本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。さらに具体的には、ゲノムＤＮＡやｍＲＮＡなどが意図されるが、これらに限定されない。また、本明細書にて「ポリペプチド」とは、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用され、アミノ酸の重合体が意図される。
【００４１】
本実施の形態の同定方法では、上記１）〜４）にて示される指標の偏りは、それぞれ、ポリヌクレオチド長検出工程、ポリペプチド長検出工程、塩基配列検出工程、アミノ酸配列検出工程によって検出される。以下に、各工程について説明する。
【００４２】
＜ポリヌクレオチド長検出工程＞
ポリヌクレオチド長検出工程は、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドの長さの多様性を検出することができる工程であればよく、特に限定されない。当該ポリヌクレオチド長検出工程において、Ｔ細胞群におけるレパトアの多様性の偏りを、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドの長さの多様性の偏りを指標として検出することによって、自己免疫疾患の発症に関わる自己免疫応答性Ｔ細胞およびＴ細胞受容体を容易に同定することができる。つまり、正常なＴ細胞群では、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドの長さの多様性に偏りがないが、自己免疫応答性Ｔ細胞群では、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドの長さの多様性に偏りを生じる場合がある。したがって、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドの長さの多様性の偏りを検出することによって、自己免疫疾患の発症に関わる自己免疫応答性Ｔ細胞およびＴ細胞受容体を同定することが可能となる。
【００４３】
上述したように、自己免疫応答性Ｔ細胞群では、ＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドが、ある特定の配列および長さを有するポリヌクレオチドに偏っている。このとき、偏って存在しているポリヌクレオチドの長さは特に限定されないが、例えば、３９個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドである場合を一例として挙げることができる。なお、これは単なる一例であって、本願発明の本質は、「Ｔ細胞群におけるレパトアの多様性の偏りを検出する」ことにある。したがって、当該実施の形態は、単なる一例にすぎず、これによって、本願発明を狭義に解釈すべきではないことは明らかである。
【００４４】
この場合、上記ポリヌクレオチド長検出工程は、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域が、３９個のヌクレオチドから構成されているＴ細胞の割合と、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域が、３９個以外のヌクレオチドから構成されているＴ細胞の割合とを比較可能な工程であることが好ましい。
【００４５】
また、偏って存在しているポリヌクレオチドの、他のポリヌクレオチドに対する存在比率も特に限定されないが、Ｔ細胞群が、ＣＤＲ３領域が特定の数のヌクレオチド（例えば、３９個のヌクレオチド）から構成されているＴ細胞を中心として、偏って存在（例えば略正規分布）していれば、抗原認識において何らかの異常が生じていることが推定される。
【００４６】
また、３９個以外のヌクレオチドから構成されているＣＤＲ３領域としては特に限定されないが、３０〜３８、４０〜４８個のヌクレオチドから構成されていることが好ましい。上記構成によれば、自己免疫疾患の発症に関わる自己応答性Ｔ細胞またはＴ細胞受容体を容易に同定することができる。
【００４７】
例えば、上記ポリヌクレオチド長検出工程は、ＰＣＲ法によってＣＤＲ３領域を増幅するＰＣＲ増幅工程を有するものであることが好ましい。当該ＰＣＲ増幅工程を用いれば、生体サンプルから、ＣＤＲ３領域に相当するポリヌクレオチドを一度に増幅することができる。そして、上記ポリヌクレオチド長検出工程では、増幅されたポリヌクレオチドと、マーカー（例えば、化学合成によって作製された３９個のポリヌクレオチドからなるＤＮＡ断片）とが同時に電気泳動され、電気泳動後のゲルが染色されることによって増幅された各ポリヌクレオチドの長さと、各ポリヌクレオチドの量比が検出される。
【００４８】
上記ＰＣＲ増幅工程に用いるサンプルには、例えばＴ細胞のゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡなどが含まれていればよい。上記サンプルにＴ細胞のゲノムＤＮＡが含まれている場合には、ＣＤＲ３領域を増幅可能なように適宜プライマーを設定した後、ＰＣＲ反応を行い、当該ＰＣＲ反応後の増幅されたポリヌクレオチドを電気泳動すればよい。なお、上記プライマーとしては、ＣＤＲ３領域を増幅可能なものであればよく、特に限定されない。また、上記サンプルにＴ細胞のｍＲＮＡが含まれている場合には、公知の方法によってｍＲＮＡを分離し、当該ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成してもよい。そして、上記プライマーと、鋳型として当該ｃＤＮＡとを用いたＰＣＲ反応によって、ＣＤＲ３領域を増幅する。そして、ＰＣＲ反応後の増幅されたポリヌクレオチドを電気泳動すればよい。
【００４９】
以上のようにして、Ｔ細胞群におけるレパトアの多様性の偏りを検出することができ、それによって、自己免疫疾患の発症に関わる自己免疫応答性Ｔ細胞およびＴ細胞受容体を同定することが可能となる。
【００５０】
＜ポリペプチド長検出工程＞
ポリペプチド長検出工程は、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドの長さの多様性を検出することができる工程であればよく、特に限定されない。当該ポリペプチド長検出工程において、Ｔ細胞群におけるレパトアの多様性の偏りを、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドの長さの多様性の偏りを指標として検出することによって、自己免疫疾患の発症に関わる自己免疫応答性Ｔ細胞およびＴ細胞受容体を容易に同定することができる。つまり、正常なＴ細胞群では、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドの長さの多様性に偏りがないが、自己免疫応答性Ｔ細胞群では、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドの長さの多様性に偏りを生じる場合がある。したがって、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドの長さの多様性の偏りを検出することによって、自己免疫疾患の発症に関わる自己免疫応答性Ｔ細胞およびＴ細胞受容体を同定することが可能となる。
【００５１】
上述したように、自己免疫応答性Ｔ細胞群では、ＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドが、ある特定の配列および長さを有するポリペプチドに偏っている。このとき、偏って存在しているポリペプチドの長さは特に限定されないが、例えば、１３個のアミノ酸からなるポリペプチドである場合を一例として挙げることができる。なお、これは単なる一例であって、本願発明の本質は、「Ｔ細胞群におけるレパトアの多様性の偏りを検出する」ことにある。したがって、当該実施の形態は、単なる一例にすぎず、これによって、本願発明を狭義に解釈すべきではないことは明らかである。
【００５２】
この場合、上記ポリペプチド長検出工程は、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域が、１３個のアミノ酸から構成されているＴ細胞の割合と、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域が、１３個以外のアミノ酸から構成されているＴ細胞の割合とを比較可能な工程であることが好ましい。
【００５３】
このとき、偏って存在しているポリペプチドの、他のポリペプチドに対する存在比率も特に限定されないが、Ｔ細胞群が、ＣＤＲ３領域が特定の数のアミノ酸（例えば、１３個のアミノ酸）から構成されているＴ細胞を中心として、偏って存在（例えば略正規分布）していれば、抗原認識において何らかの異常が生じていることが推定される。
【００５４】
また、１３個以外のアミノ酸から構成されているＣＤＲ３領域としては特に限定されないが、１０〜１２、１４〜１６個のアミノ酸から構成されていることが好ましい。上記構成によれば、自己免疫疾患の発症に関わる自己応答性Ｔ細胞またはＴ細胞受容体を容易に同定することができる。
【００５５】
例えば、本実施の形態のポリペプチド長検出工程は、上記ポリヌクレオチド長検出工程を含むものであってもよい。この場合、ポリヌクレオチド長検出工程において検出されたＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドをアミノ酸に置き換えることによって、Ｔ細胞群におけるレパトアの多様性の偏りを検出することができる。そして、それによって、自己免疫疾患の発症に関わる自己免疫応答性Ｔ細胞およびＴ細胞受容体を同定することが可能となる。
【００５６】
＜塩基配列検出工程＞
塩基配列検出工程は、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドの塩基配列の多様性を検出することができる工程であればよく、特に限定されない。当該塩基配列検出工程において、Ｔ細胞群におけるレパトアの多様性の偏りを、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドの塩基配列の多様性の偏りを指標として検出することによって、自己免疫疾患の発症に関わる自己免疫応答性Ｔ細胞およびＴ細胞受容体を容易に同定することができる。つまり、正常なＴ細胞群では、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドの塩基配列の多様性に偏りがないが、自己免疫応答性Ｔ細胞群では、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドの塩基配列の多様性に偏りを生じる。したがって、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドの塩基配列の多様性の偏りを検出することによって、自己免疫疾患の発症に関わる自己免疫応答性Ｔ細胞およびＴ細胞受容体を同定することが可能となる。
【００５７】
上述したように、自己免疫応答性Ｔ細胞群では、ＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドが、ある特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドに偏っている。このとき、偏って存在しているポリヌクレオチドの塩基配列は特に限定されないが、これらの塩基配列をアミノ酸に翻訳すると、例えば、当該塩基配列には、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）からなる群より選択されるアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸が連続して配置されることによって形成される、２つのアミノ酸からなる親水性領域をコードする塩基配列が含まれている。
【００５８】
したがって、上記塩基配列検出工程は、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域が、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）からなる群より選択されるアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸が連続して配置されることによって形成される、２つのアミノ酸からなる親水性領域を有するＴ細胞の割合と、当該親水性領域を有さないＴ細胞の割合とを比較することができる工程であることが好ましい。また、このとき、上記親水性領域が有する２つのアミノ酸は、少なくとも一方がグリシン（Ｇ）であることが更に好ましい。
【００５９】
上記親水性領域はＣＤＲ３領域中にあればよく、ＣＤＲ３領域中の位置は特に限定されない。また、ＣＤＲ３領域中の親水性領域の数も特に限定されない。
【００６０】
例えば、上記塩基配列検出工程は、上述したポリヌクレオチド長検出工程と同様に、ＰＣＲ法によってＣＤＲ３領域を増幅するＰＣＲ増幅工程を有するものであることが好ましい。当該増幅工程を用いれば、Ｔ細胞群を含む生体サンプルから、ＣＤＲ３領域に相当するポリヌクレオチドを一度に増幅することができる。なお、ＰＣＲ増幅工程に用いるプライマーは特に限定されず、ＣＤＲ３領域を増幅可能なように適宜設定すればよい。そして、増幅されたポリヌクレオチドをベクターに挿入して、当該ベクターに挿入されたポリヌクレオチドの配列を読むことによって、ＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドの塩基配列を確認するとともに、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドの塩基配列の多様性に偏りがあるか否かを確認することができる。そして、その結果、自己免疫疾患の発症に関わる自己免疫応答性Ｔ細胞およびＴ細胞受容体を容易に同定することができる。なお、上記ベクターとしては特に限定されず、適宜公知のベクターを用いることができる。また、ポリヌクレオチドの塩基配列は、適宜公知の方法によって確認することができる。
【００６１】
＜アミノ酸配列検出工程＞
アミノ酸配列検出工程は、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドのアミノ酸配列の多様性を検出することができる工程であればよく、特に限定されない。当該アミノ酸配列検出工程において、Ｔ細胞群におけるレパトアの多様性の偏りを、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドのアミノ酸配列の多様性の偏りを指標として検出することによって、自己免疫疾患の発症に関わる自己免疫応答性Ｔ細胞およびＴ細胞受容体を容易に同定することができる。つまり、正常なＴ細胞群では、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドのアミノ酸配列の多様性に偏りがないが、自己免疫応答性Ｔ細胞群では、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドのアミノ酸配列の多様性に偏りを生じる。したがって、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドのアミノ酸配列の多様性の偏りを検出することによって、自己免疫疾患の発症に関わる自己免疫応答性Ｔ細胞およびＴ細胞受容体を同定することが可能となる。
【００６２】
上述したように、自己免疫応答性Ｔ細胞群では、ＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドが、ある特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドに偏っている。このとき、偏って存在しているポリペプチドのアミノ酸配列は特に限定されないが、例えば、当該アミノ酸配列には、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）からなる群より選択されるアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸が連続して配置されることによって形成される、２つのアミノ酸からなる親水性領域が含まれている場合が多い。
【００６３】
したがって、上記アミノ酸配列検出工程は、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域が、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）からなる群より選択されるアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸が連続して配置されることによって形成される、２つのアミノ酸からなる親水性領域を有するＴ細胞の割合と、当該親水性領域を有さないＴ細胞の割合とを比較することができる工程であることが好ましい。また、このとき、上記親水性領域が有する２つのアミノ酸は、少なくとも一方がグリシン（Ｇ）であることが更に好ましい。
【００６４】
上記親水性領域はＣＤＲ３領域中にあればよく、ＣＤＲ３領域中の位置は特に限定されない。また、ＣＤＲ３領域中の親水性領域の数も特に限定されない。
【００６５】
例えば、上記アミノ酸配列検出工程は、上述したポリヌクレオチド長検出工程と同様に、ＰＣＲ法によってＣＤＲ３領域を増幅するＰＣＲ増幅工程を有するものであることが好ましい。当該増幅工程を用いれば、Ｔ細胞群を含む生体サンプルから、ＣＤＲ３領域に相当するポリヌクレオチドを一度に増幅することができる。なお、ＰＣＲ増幅工程に用いるプライマーは特に限定されず、ＣＤＲ３領域を増幅可能なように適宜設定すればよい。そして、増幅されたポリヌクレオチドをベクターに挿入して、当該ベクターに挿入されたポリヌクレオチドの配列を読むことによって、ＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドのアミノ酸配列を確認するとともに、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドのアミノ酸配列の多様性に偏りがあるか否かを確認することができる。そして、その結果、自己免疫疾患の発症に関わる自己免疫応答性Ｔ細胞およびＴ細胞受容体を容易に同定することができる。なお、上記ベクターとしては特に限定されず、適宜公知のベクターを用いることができる。また、ポリヌクレオチドの塩基配列は、適宜公知の方法によって確認することができる。
【００６６】
〔自己免疫疾患の発症または発症可能性を判定する方法〕
本実施の形態の判定方法は、自己免疫疾患の発症または発症可能性を判定する方法であって、本願発明の自己免疫疾患の発症に関わる自己応答性Ｔ細胞およびＴ細胞受容体の同定方法の何れかを用いるものである。本願発明の同定方法については先に詳細に説明したので、ここでは説明を省略することにする。
【００６７】
本実施の形態の判定方法は、生体から分離された生体サンプルを用いるものである。上記生体サンプルはＴ細胞を含むものであればよく、特に限定されない。例えば、上記生体サンプルには、Ｔ細胞のポリヌクレオチドが含まれることが好ましい。生体サンプル中にＴ細胞群由来のポリヌクレオチドが含まれる場合には、本願発明の同定方法を用いることによって、自己免疫疾患の発症または発症可能性を簡便に判定することができる。
【００６８】
上記生体サンプルが由来する生体としても特に限定されない。例えば、上記生体としては、自己免疫疾患に罹患し得る生体であることが好ましい。具体的には、上記生体は、ヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ウサギ、サル、チンパンジー等であることが好ましい。上記生体由来の生体サンプルを用いることによって、自己免疫疾患の発症または発症可能性を判定することができる。
【００６９】
上記生体サンプルを分離する組織としても特に限定されず、Ｔ細胞を含む組織から適宜分離することができる。具体的には、上記生体サンプルは、抹消リンパ組織から分離することが好ましい。さらに、抹消リンパ組織としては、例えば、リンパ節、脾（臓）、抹消血、腸付属リンパ組織（gut‐associated lymphoid tissue（扁桃、Peyer板など））などを挙げることができる。抹消リンパ組織には多くのＴ細胞が含まれているので、抹消リンパ組織から生体サンプルを分離すれば、本実施の形態の自己免疫疾患の判定方法においてより多くのデータ（ＣＤＲ３領域の長さやアミノ酸配列の多様性など）を収集することができる。その結果、より正確に自己免疫疾患の発症または発症可能性を判定することができる。
【００７０】
〔同定キット〕
本発明の同定キットは、本発明の自己免疫疾患の発症に関わる自己応答性Ｔ細胞またはＴ細胞受容体の同定方法を実施するためのものであればよく、これに含まれる具体的な構成、材料、機器等は、特に限定されるものではない。具体的には、上記同定方法の各工程を実施するための物が含まれていればよい。例えば、ＴＣＲ遺伝子のＣＤＲ３領域を増幅するためのプライマーが含まれることが好ましい。
【００７１】
上記プライマーは、Ｔ細胞群が有する多様性に富んだＣＤＲ３領域を同時に増幅可能なものであればよく、その具体的な配列は特に限定されるものではない。
【００７２】
以下実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００７３】
〔方法〕
２匹のＢＡＬＢ／Ｃマウス（雌、７週齢）に対し、ＳＥＢ（２５μｇ）を５日毎に８回免疫した。最終免疫から９日後にサクリファイスを行い、Ｂ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を除去した脾細胞から、Dyna beads（DYNAL社製）を用いてＶβ＋８細胞を単離した。なお、Ｖβ＋８細胞の具体的な単離方法は、添付のプロトコールに従った。
【００７４】
得られたＣＤ４＋・Ｖβ８＋細胞からtotal RNAを抽出した。そして、抽出したtotal RNAを用いて逆転写反応を行ってｃＤＮＡを作製した。
【００７５】
次いで、上記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行い、ＣＤＲ３領域に対応するＤＮＡ断片を増幅した。なお、当該ＰＣＲ反応には、Ｖβ８．３プライマーおよびＣβプライマーを用い、反応条件は以下の条件であった。９５℃にて１２分間の前変性処理を行った後、９４℃にて３０秒間の変性反応、６３℃にて４０秒間のアニーリング反応（−１℃／cycle）、および７２℃にて５０秒間の伸長反応からなる反応サイクルを１０回行った。その後、引き続いて、９４℃にて３０秒間の変性反応、５４℃にて４０秒間のアニーリング反応、および７２℃にて５０秒間の伸長反応からなる反応サイクルを２５回行った。そして、最後に、７２℃にて５分間の伸長反応を１回行った。
【００７６】
Ｖβ８．３プライマー：5’-TGCTGGCAACCTTCGAATAGGA-3’（配列番号１）
Ｃβプライマー ：5’-CTTGGGTGGAGTCACATTTCTC-3’（配列番号２）
次いで、増幅されたＤＮＡ断片をTOPOベクター（Invitrogen社製）にクローニングし、当該ベクターを用いて大腸菌を形質転換した。なお、形質転換された大腸菌を、カナマイシンを含有するＬＢ培地上で選択した。
【００７７】
大腸菌のコロニーを単離し、各コロニーを液体培養した。培養した大腸菌からプラスミドを抽出したあと、各プラスミドに挿入されているＣＤＲ３領域の塩基配列を確認した。
【００７８】
〔結果１〕
上述したように、上記実験は、２匹のＢＡＬＢ／Ｃマウス（以下、各々をNo.1個体、No.2個体と呼ぶ）に対して行った。上記実験の結果、No.1個体からは、２１種類のＣＤＲ３領域の塩基配列が得られた。また、No.2個体からは、１５種類のＣＤＲ３領域の塩基配列が得られた。
【００７９】
図１に、得られた塩基配列から換算した、ＣＤＲ３領域のアミノ酸配列の長さと、その存在比率との関係を示した。図１から明らかなように、ＳＥＢを投与したＢＡＬＢ／Ｃマウスでは、ＣＤＲ３領域は１３アミノ酸であるものが最も多く存在し、１３アミノ酸を境にして拡散するように偏って分布していた。つまり、ＳＥＢを投与したＢＡＬＢ／Ｃマウスでは、ＣＤＲ３領域は、１３アミノ酸に偏って存在していた。さらに具体的には、１３アミノ酸配列からなるＣＤＲ３領域の割合は、No.1個体においては５２．４％（１１／２１）であり、No.2個体においては３３．３％（５／１５）であった。
【００８０】
〔結果２〕
次いで、No.1個体由来の２１種類のＣＤＲ３領域のアミノ酸配列、およびNo.2個体由来の１５種類のＣＤＲ３領域のアミノ酸配列に共通した特徴的な配列が存在するか否かについて検討した。
【００８１】
表１には、No.1個体由来の２１種類のＣＤＲ３領域のアミノ酸配列が、２０アミノ酸表記と８アミノ酸表記との２種類の表記法にて示されている。また、表２には、N0.2個体由来の１５種類のＣＤＲ３領域のアミノ酸配列が、２０アミノ酸表記と８アミノ酸表記との２種類の表記法にて示されている。なお、２０アミノ酸表記と８アミノ酸表記との対応関係を、表３に示す。
【００８２】
【表１】
【００８３】
【表２】
【００８４】
【表３】
【００８５】
表１および表２から明らかなように、ＳＥＢを投与したＢＡＬＢ／Ｃマウスでは、２０アミノ酸表記においてＧＧ（以下、Gly-Gly motifと呼ぶ）にて示される親水性アミノ酸配列を高頻度で含むことが明らかになった。さらに具体的には、Gly-Gly motifを含むＣＤＲ３領域の割合は、No.1個体においては３８．１％（８／２１）であって、No.2個体では３３．３％（５／１５）であった。
【００８６】
また、さらに詳細にＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を検討した結果、表１および表２から明らかなように、ＳＥＢを投与したＢＡＬＢ／Ｃマウスでは、８アミノ酸表記においてＤＤ、ＤＥ、ＥＤまたはＥＥにて示される親水性アミノ酸配列を高頻度に含むことが明らかになった。さらに具体的には、上記４種類の親水性アミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域の割合は、No.1個体においては７１．４％（１５／２１）であって、No.2個体では８０．０％（１２／１５）であった。
【００８７】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明の定方法およびその利用は、関節リウマチをはじめとした自己免疫疾患の発症のメカニズムの解明に有効に利用することができると考えられる。また、本発明によれば、関節リウマチ等の自己免疫疾患の発症またはその発症可能性を高精度に簡便かつ確実に行うことができる。それゆえ、本発明は自己免疫疾患の予防および治療の分野において、高い利用可能性を有しているといえる。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】本実施例において行ったＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドの長さの多様性を解析した結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫疾患の発症に関わる自己応答性Ｔ細胞またはＴ細胞受容体の同定方法、およびその利用に関するものであり、より具体的には、Ｔ細胞受容体のＣＤＲ３領域を指標とした、自己免疫疾患の発症に関わる自己応答性Ｔ細胞またはＴ細胞受容体の同定方法、およびその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生物は、外界から体内に侵入してくる抗原を予測することはできない。したがって、生物は、Ｔ細胞受容体（T cell receptor;TCR）レパトアの多様性を維持することによって、多種多様な抗原に対応している。この場合、免疫システムを正常に機能させるためには、抗原に晒されていない状態において、Ｔ細胞受容体レパトアの多様性を維持することが、非常に重要であるといえる。
【０００３】
Ｔ細胞受容体の多様性は、抗原提示されたポリペプチドを認識する部分であるＣＤＲ（complementarity determining region）の多様性に依存している。ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼ばれる３つの領域を含み、当該３つの領域において抗原に結合する。ＣＤＲ３は、さらにＣＤＲ３−αおよびＣＤＲ３−βの２つの領域を含み、当該２つの領域が、ポリペプチドを認識する上で、中心的な機能を有する（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
現在までに、上記ＣＤＲ３は、イムノグロブリンと同様に複数の遺伝子領域の組み合わせによって形成されることが知られている。そして、その組み合わせによって、塩基配列およびアミノ酸配列において、多種多様な長さと配列とを有するＣＤＲ３が形成され得ることが知られている。（例えば、非特許文献２参照）。そして、当該ＣＤＲ３の多様性こそが、Ｔ細胞受容体の多様性を生み出す要因であるともいえる。
【０００５】
ところで、上述した免疫システムは、本来外界からの有害な異物の侵入に対する生体の防御機構として存在するものである。しかし、時にはこの免疫系の働きが、結果的に生体に有害であることがある。これを一般的にアレルギーと呼んでいる。生体は、外界からの異物に対するのみならず、自己の成分に対しても一種のアレルギー反応・自己免疫応答を起こすことが知られている。これを自己免疫現象（autoimmunity）と称し、これをもとにある病態が生じた場合には、自己免疫疾患（autoimmune disease）と称する。
【０００６】
自己免疫疾患は、全身性の疾患であるが、臓器特異性のある疾患と、特異性のない疾患の２つに大別される。臓器特異的自己免疫疾患には、橋本甲状腺炎（慢性甲状腺炎）、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症（甲状腺剤中毒症）、悪性貧血、グッドパスチャー症候群、急性進行性糸球体腎炎、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、インスリン抵抗性糖尿病、若年性糖尿病、アジソン病、萎縮性胃炎（自己免疫性萎縮性胃炎）、男性不妊症、早発性更年期、水晶体原性ぶどう膜炎、交感性脈炎、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、発作性血色素尿症（発作性ヘモグロビン尿症）、特発性血小板減少性紫斑病、シェーグレン症候群がある。臓器非特異的自己免疫疾患には、関節リウマチ（慢性関節リウマチ）、全身性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、多発性筋炎、強（鞏）皮症、混合結合組織病がある。
【０００７】
近年、上記自己免疫疾患の一部および他の疾患における病態の進行過程で、上記ＣＤＲ３が重要な役割を果たしているものがあることが示唆されている。
【０００８】
例えば、上記多発性硬化症に似た病体の発症モデルマウスを作製するにあたって、ラット（例えば、Lewis rat）にミエリン塩基性タンパク質（myelin basic protein;MBP）を投与する方法が用いられている。そして、当該方法によって引き起こされたモデル疾患を、実験的自己免疫脳脊髄炎（experimental autoimmune encephalomyelitis;EAE）と呼ぶ。そして、実験的自己免疫脳脊髄炎においては、病態の進行において、ＣＤＲ３が多様性を有することが重要な意味を有することが示唆されている（例えば、非特許文献３参照）。さらに具体的には、上記非特許文献３では、Ｔ細胞受容体のβ鎖のうち、ＣＤＲ３を含むＶβ１７およびＶβ８．２が、疾患の初期段階において、塩基配列の長さ、およびアミノ酸配列において多様性を有することが示されている。さらに、上記非特許文献３においては、Ｖβ１７の塩基配列の長さおよびアミノ酸配列は、疾患が悪化するに伴って更に多様性を増すが、Ｖβ８．２の塩基配列の長さおよびアミノ酸配列は、疾患の初期段階から変化しないことが示されている。また、実験的自己免疫脳脊髄炎において、ＣＤＲ３中のAsp-Ala-Gly-Gly-Gly-Tyr（DAGGGY）配列が、病態の進行において重要な役割を担っていることも示唆されている（例えば、非特許文献４参照）。
【０００９】
また、例えば、上記シェーグレン症候群の発症モデルマウスを作製するにあたって、α-fodrin peptideをマウスに投与する方法が用いられている。そして、シューグレン症候群を発症するマウスのＣＤＲ３の塩基配列およびアミノ酸配列は、類似の塩基配列およびアミノ酸配列を有することが示唆されている（例えば、非特許文献５参照）。
【００１０】
また、例えば、大顆粒リンパ球性白血病（large granular lymphocyte leukemia）における細胞増殖が、自己免疫反応と関連していることが示されている（例えば、非特許文献６参照）。そして、上記非特許文献６では、増殖性の大顆粒リンパ球のＣＤＲ３には、塩基配列およびアミノ酸配列において類似した領域が存在することが示されている。
【非特許文献１】Janko Nikolich-Zugich et al.,The Many Important Factors of T-cell Repertoire Diversity,Nature reviews/immunology,Vol.4,123-132,Feb 2004
【非特許文献２】Christophe Pannetier et al.,The sizes of the CDR3 hypervariable regions of the murine T-cell receptor β chains vary as a function of the recombined germ-line segment,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,Vol.90,4319-4323,May 1993
【非特許文献３】Giok Kim et al.,CDR3 Size Spectratyping and Sequencing of Spectratype-Derived TCR of Spinal Cord T Cells in Autoimmune Encephalomyelitis,J. Immunol.,1998,160:509-513
【非特許文献４】Jason G. Huang et al.,The central residues of a T cell receptor sequence motif are key determinants of autoantigen recognition in murine experimental autoimmune encephalomyelitis,Eur. J. Immunol.,2005,35;299-304
【非特許文献５】Rieko Arakaki et al.,Development of Autoimmune Exocrinopathy Resembling Sjogren’s Syndrome in Adoptively Transferred Mice With Autoreactive CD4+ T Cells,ARTHRITIS & RHEUMATISM,Vol.48,No.12,Dec 2003,3603-3609
【非特許文献６】Marcin W. Wlodarski et al.,Pathologic clonal cytotoxic T-cell responses:nonrandom nature of the T-cell-receptor restriction in large granular lymphocyte leukemia,Blood,15,Oct 2005,Vol.106,No.8,2769-2780
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述したように、自己免疫疾患には多種多様な疾患が含まれており、各疾患の発症機構も異なると考えられている。したがって、各自己免疫疾患ごとに、発症を客観的に診断する技術を確立する必要がある。
【００１２】
上記自己免疫疾患のなかでも、特に本発明者らは関節リウマチに着目して研究を進めている。関節リウマチ（rheumatoid arthritis、以下「ＲＡ」ともいう）は、多発するびらん性関節炎を主徴とするが、同時に多臓器を障害する原因不明の全身性炎症疾患である。ＲＡは寛解と増悪とを繰り返しながら慢性に進行し、無治療で放置すると関節の破壊や変形を来し、やがて運動器の機能障害を呈してくる。時には生命をも脅かす。したがって、ＲＡ患者は身体的にも精神的にも大きな苦痛を生涯に亘って背負うことになる。
【００１３】
上述のように、いくつかの自己免疫疾患については積極的な研究成果が数多く報告されているが、自己免疫疾患の発症または発症可能性を客観的に診断する技術は未だ十分に確立されているとはいえない。
【００１４】
このため、自己免疫疾患の発症または発症可能性についての客観的かつ正確な診断に寄与できる、新たな技術の確立が強く望まれていた。
【００１５】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、自己免疫疾患の発症または発症可能性について、客観的かつ正確な診断を可能とするための、自己免疫疾患の発症に関わる自己応答性Ｔ細胞またはＴ細胞受容体の同定方法、およびその利用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本願発明者らは、独自に検討した結果、スーパー抗原の一種であるstaphylococcal entrotoxin B（ＳＥＢ）を繰り返しマウスに投与すると、ＳＥＢ応答性Ｔ細胞のアネルギー破綻と同時に、リウマチ因子（ＲＦ）が上昇することを見出している。そして、本願発明者らは、さらに上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＳＥＢを繰り返し投与したマウスでは、ＴＣＲ遺伝子の再構成によって、抹消のＶβ８＋Ｔ細胞のレパトアに偏りが生じること、つまり、ＣＤＲ３の塩基配列およびアミノ酸配列において、長さや配列に偏りが生じることを見出して、本願発明を完成させるに至った。
【００１７】
すなわち、本願発明は産業上有用な方法またはその利用として、以下の（１）〜（１２）を含むものである。
【００１８】
（１）自己免疫疾患の発症に関わる自己応答性Ｔ細胞またはＴ細胞受容体の同定方法であって、Ｔ細胞群におけるレパトアの多様性の偏りを検出する多様性検出工程を含む同定方法。
【００１９】
（２）上記多様性検出工程では、ＴＣＲ遺伝子またはＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域の多様性の偏りが検出される同定方法。
【００２０】
（３）上記ＣＤＲ３領域の多様性の偏りは、以下の１）および２）、つまり、
１）ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドの長さの多様性を検出するポリヌクレオチド長検出工程
２）ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドの長さの多様性を検出するポリペプチド長検出工程
の少なくとも一つの工程によって検出される同定方法。
【００２１】
（４）上記ポリヌクレオチド長検出工程では、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域が、３９個のヌクレオチドから構成されているＴ細胞の割合と、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域が、３９個以外のヌクレオチドから構成されているＴ細胞の割合とが比較され、上記ポリペプチド長検出工程では、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域が、１３個のアミノ酸から構成されているＴ細胞の割合と、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域が、１３個以外のアミノ酸から構成されているＴ細胞の割合とが比較される同定方法。
【００２２】
（５）上記ポリヌクレオチド長検出工程は、Ｔ細胞におけるＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域の長さが、３９個のヌクレオチドを中心として、正規分布しているか否かを検出する工程を含み、上記ポリペプチド長検出工程は、Ｔ細胞におけるＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域の長さが、１３個のアミノ酸を中心として、正規分布しているか否かを検出する工程を含む同定方法。
【００２３】
（６）上記ポリヌクレオチド長検出工程は、Ｔ細胞におけるＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域が、３０〜４８個のヌクレオチドから構成されるように分布しているか否かを検出する工程を含み、上記ポリペプチド長検出工程は、Ｔ細胞におけるＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域が、１０〜１６個のアミノ酸から構成されるように分布しているか否かを検出する工程を含む同定方法。
【００２４】
（７）上記ＣＤＲ３領域の多様性の偏りは、以下の１）および２）、つまり、
１）ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドの塩基配列の多様性を検出する塩基配列検出工程
２）ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドのアミノ酸配列の多様性を検出するアミノ酸配列検出工程
の少なくとも一つの工程によって検出される同定方法。
【００２５】
（８）上記塩基配列検出工程では、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域が、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）からなる群より選択されるアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸が連続して配置されることによって形成される、２つのアミノ酸からなる親水性領域をコードするＴ細胞の割合と、当該親水性領域をコードしないＴ細胞の割合とが比較され、上記アミノ酸配列検出工程では、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域が、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）からなる群より選択されるアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸が連続して配置されることによって形成される、２つのアミノ酸からなる親水性領域を有するＴ細胞の割合と、当該親水性領域を有さないＴ細胞の割合とが比較される同定方法。
【００２６】
（９）上記親水性領域を形成する２つのアミノ酸は、少なくとも一方がグリシン（Ｇ）である同定方法。
【００２７】
（１０）上記自己免疫疾患が、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、発作性血色素尿症、特発性血小板減少性紫斑病、シェーグレン症候群、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、多発性筋炎、強皮症または混合結合組織病である同定方法。
【００２８】
（１１）生体から分離された生体サンプルを用いて自己免疫疾患の発症または発症可能性を判定する方法であって、上記同定方法のいずれかによって自己応答性Ｔ細胞またはＴ細胞受容体を検出する工程を含む判定方法。
【００２９】
（１２）上記同定方法のいずれかを実施するための同定キットであって、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域を増幅可能なプライマー対を含む同定キット。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、自己免疫疾患の発症に寄与する自己応答性Ｔ細胞およびＴ細胞受容体を同定することができるとともに、自己免疫疾患の発症または発症可能性について、客観的かつ正確な診断を可能にするという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下に本発明の、自己免疫疾患の発症に関わる自己応答性Ｔ細胞またはＴ細胞受容体の同定方法、自己免疫疾患の発症または発症可能性を判定する方法、および同定キットについて説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３２】
〔自己免疫疾患の発症に関わる自己応答性Ｔ細胞またはＴ細胞受容体の同定方法〕
本実施の形態の同定方法は、自己免疫疾患に関わる自己応答性Ｔ細胞のレパトアの多様性に偏りを生じるという、本願発明者によって独自に見出された事実に基づいている。以下に、本実施の形態の同定方法について説明する。
【００３３】
本実施の形態の同定方法は、自己免疫疾患の発症に関わる自己応答性Ｔ細胞またはＴ細胞受容体の同定方法である。
【００３４】
上記自己免疫疾患としては特に限定されないが、橋本甲状腺炎（慢性甲状腺炎）、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、発作性血色素尿症（発作性ヘモグロビン尿症）、特発性血小板減少性紫斑病、シェーグレン症候群、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、多発性筋炎、強（鞏）皮症、または混合結合組織病であることが好ましい。
【００３５】
本願発明者らは、発明者らが独自に開発した自己免疫疾患モデルマウスから得た知見に基づいて、本願発明を完成させるに至った。上記自己免疫疾患モデルマウスは、広く自己免疫疾患に共通した症状を示すが、自己免疫疾患のなかでも、上記自己免疫疾患に近い症状を示す。したがって、本実施の形態の同定方法において、自己免疫疾患が上述したものであれば、より正確に、Ｔ細胞群におけるレパトアの多様性の偏りを検出することができる。
【００３６】
また、上記Ｔ細胞としては特に限定されないが、免疫応答の活性化（ヘルパーＴ細胞）、抑制（サプレッサーＴ細胞）など免疫応答の制御、および、ウイルスが感染した細胞および癌細胞の傷害（キラーＴ細胞）や遅延型アレルギーなどに関与するリンパ球亜群が含まれる。
【００３７】
また、本実施の形態の同定方法は、Ｔ細胞群におけるレパトアの多様性の偏りを検出する多様性検出工程を含む。なお、本明細書において「レパトアの多様性」とは、抗原認識の多様性が意図される。上記多様性検出工程にて、Ｔ細胞群におけるレパトアの多様性の偏りを検出することによって、自己免疫疾患の発症に関わる自己応答性Ｔ細胞またはＴ細胞受容体を同定することができる。
【００３８】
上記多様性検出工程は、Ｔ細胞群におけるレパトアの多様性の偏りを検出し得るものであればよく、特に限定されないが、ＴＣＲ遺伝子またはＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域の多様性の偏りを検出することができる工程であることが好ましい。上述したように、ＴＣＲ遺伝子およびＴＣＲタンパク質は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼ばれる３つの領域を含み、当該３つの領域において抗原に結合する。そして、ポリペプチドを認識する上で、上記３つの領域の中でもＣＤＲ３領域が中心的な機能を果たす。したがって、上記多様性検出工程において、ＴＣＲ遺伝子またはＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域の多様性の偏りを検出すれば、より正確に、Ｔ細胞群におけるレパトアの多様性の偏りを検出することができる。
【００３９】
本実施の形態の同定方法では、ＣＤＲ３領域の多様性を検出するための指標は特に限定されないが、当該指標としては、例えば、１）ＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドの長さ、２）ＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドの長さ、３）ＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドの塩基配列、４）ＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドのアミノ酸配列、であることが好ましい。つまり、本実施の形態の同定方法では、Ｔ細胞群において、上記１）〜４）にて示される指標に偏りがあるか否かを検出することが好ましい。上記構成によれば、より容易にＴ細胞群におけるレパトアの多様性の偏りを検出することができる。
【００４０】
なお、本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。さらに具体的には、ゲノムＤＮＡやｍＲＮＡなどが意図されるが、これらに限定されない。また、本明細書にて「ポリペプチド」とは、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用され、アミノ酸の重合体が意図される。
【００４１】
本実施の形態の同定方法では、上記１）〜４）にて示される指標の偏りは、それぞれ、ポリヌクレオチド長検出工程、ポリペプチド長検出工程、塩基配列検出工程、アミノ酸配列検出工程によって検出される。以下に、各工程について説明する。
【００４２】
＜ポリヌクレオチド長検出工程＞
ポリヌクレオチド長検出工程は、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドの長さの多様性を検出することができる工程であればよく、特に限定されない。当該ポリヌクレオチド長検出工程において、Ｔ細胞群におけるレパトアの多様性の偏りを、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドの長さの多様性の偏りを指標として検出することによって、自己免疫疾患の発症に関わる自己免疫応答性Ｔ細胞およびＴ細胞受容体を容易に同定することができる。つまり、正常なＴ細胞群では、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドの長さの多様性に偏りがないが、自己免疫応答性Ｔ細胞群では、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドの長さの多様性に偏りを生じる場合がある。したがって、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドの長さの多様性の偏りを検出することによって、自己免疫疾患の発症に関わる自己免疫応答性Ｔ細胞およびＴ細胞受容体を同定することが可能となる。
【００４３】
上述したように、自己免疫応答性Ｔ細胞群では、ＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドが、ある特定の配列および長さを有するポリヌクレオチドに偏っている。このとき、偏って存在しているポリヌクレオチドの長さは特に限定されないが、例えば、３９個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドである場合を一例として挙げることができる。なお、これは単なる一例であって、本願発明の本質は、「Ｔ細胞群におけるレパトアの多様性の偏りを検出する」ことにある。したがって、当該実施の形態は、単なる一例にすぎず、これによって、本願発明を狭義に解釈すべきではないことは明らかである。
【００４４】
この場合、上記ポリヌクレオチド長検出工程は、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域が、３９個のヌクレオチドから構成されているＴ細胞の割合と、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域が、３９個以外のヌクレオチドから構成されているＴ細胞の割合とを比較可能な工程であることが好ましい。
【００４５】
また、偏って存在しているポリヌクレオチドの、他のポリヌクレオチドに対する存在比率も特に限定されないが、Ｔ細胞群が、ＣＤＲ３領域が特定の数のヌクレオチド（例えば、３９個のヌクレオチド）から構成されているＴ細胞を中心として、偏って存在（例えば略正規分布）していれば、抗原認識において何らかの異常が生じていることが推定される。
【００４６】
また、３９個以外のヌクレオチドから構成されているＣＤＲ３領域としては特に限定されないが、３０〜３８、４０〜４８個のヌクレオチドから構成されていることが好ましい。上記構成によれば、自己免疫疾患の発症に関わる自己応答性Ｔ細胞またはＴ細胞受容体を容易に同定することができる。
【００４７】
例えば、上記ポリヌクレオチド長検出工程は、ＰＣＲ法によってＣＤＲ３領域を増幅するＰＣＲ増幅工程を有するものであることが好ましい。当該ＰＣＲ増幅工程を用いれば、生体サンプルから、ＣＤＲ３領域に相当するポリヌクレオチドを一度に増幅することができる。そして、上記ポリヌクレオチド長検出工程では、増幅されたポリヌクレオチドと、マーカー（例えば、化学合成によって作製された３９個のポリヌクレオチドからなるＤＮＡ断片）とが同時に電気泳動され、電気泳動後のゲルが染色されることによって増幅された各ポリヌクレオチドの長さと、各ポリヌクレオチドの量比が検出される。
【００４８】
上記ＰＣＲ増幅工程に用いるサンプルには、例えばＴ細胞のゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡなどが含まれていればよい。上記サンプルにＴ細胞のゲノムＤＮＡが含まれている場合には、ＣＤＲ３領域を増幅可能なように適宜プライマーを設定した後、ＰＣＲ反応を行い、当該ＰＣＲ反応後の増幅されたポリヌクレオチドを電気泳動すればよい。なお、上記プライマーとしては、ＣＤＲ３領域を増幅可能なものであればよく、特に限定されない。また、上記サンプルにＴ細胞のｍＲＮＡが含まれている場合には、公知の方法によってｍＲＮＡを分離し、当該ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成してもよい。そして、上記プライマーと、鋳型として当該ｃＤＮＡとを用いたＰＣＲ反応によって、ＣＤＲ３領域を増幅する。そして、ＰＣＲ反応後の増幅されたポリヌクレオチドを電気泳動すればよい。
【００４９】
以上のようにして、Ｔ細胞群におけるレパトアの多様性の偏りを検出することができ、それによって、自己免疫疾患の発症に関わる自己免疫応答性Ｔ細胞およびＴ細胞受容体を同定することが可能となる。
【００５０】
＜ポリペプチド長検出工程＞
ポリペプチド長検出工程は、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドの長さの多様性を検出することができる工程であればよく、特に限定されない。当該ポリペプチド長検出工程において、Ｔ細胞群におけるレパトアの多様性の偏りを、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドの長さの多様性の偏りを指標として検出することによって、自己免疫疾患の発症に関わる自己免疫応答性Ｔ細胞およびＴ細胞受容体を容易に同定することができる。つまり、正常なＴ細胞群では、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドの長さの多様性に偏りがないが、自己免疫応答性Ｔ細胞群では、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドの長さの多様性に偏りを生じる場合がある。したがって、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドの長さの多様性の偏りを検出することによって、自己免疫疾患の発症に関わる自己免疫応答性Ｔ細胞およびＴ細胞受容体を同定することが可能となる。
【００５１】
上述したように、自己免疫応答性Ｔ細胞群では、ＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドが、ある特定の配列および長さを有するポリペプチドに偏っている。このとき、偏って存在しているポリペプチドの長さは特に限定されないが、例えば、１３個のアミノ酸からなるポリペプチドである場合を一例として挙げることができる。なお、これは単なる一例であって、本願発明の本質は、「Ｔ細胞群におけるレパトアの多様性の偏りを検出する」ことにある。したがって、当該実施の形態は、単なる一例にすぎず、これによって、本願発明を狭義に解釈すべきではないことは明らかである。
【００５２】
この場合、上記ポリペプチド長検出工程は、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域が、１３個のアミノ酸から構成されているＴ細胞の割合と、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域が、１３個以外のアミノ酸から構成されているＴ細胞の割合とを比較可能な工程であることが好ましい。
【００５３】
このとき、偏って存在しているポリペプチドの、他のポリペプチドに対する存在比率も特に限定されないが、Ｔ細胞群が、ＣＤＲ３領域が特定の数のアミノ酸（例えば、１３個のアミノ酸）から構成されているＴ細胞を中心として、偏って存在（例えば略正規分布）していれば、抗原認識において何らかの異常が生じていることが推定される。
【００５４】
また、１３個以外のアミノ酸から構成されているＣＤＲ３領域としては特に限定されないが、１０〜１２、１４〜１６個のアミノ酸から構成されていることが好ましい。上記構成によれば、自己免疫疾患の発症に関わる自己応答性Ｔ細胞またはＴ細胞受容体を容易に同定することができる。
【００５５】
例えば、本実施の形態のポリペプチド長検出工程は、上記ポリヌクレオチド長検出工程を含むものであってもよい。この場合、ポリヌクレオチド長検出工程において検出されたＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドをアミノ酸に置き換えることによって、Ｔ細胞群におけるレパトアの多様性の偏りを検出することができる。そして、それによって、自己免疫疾患の発症に関わる自己免疫応答性Ｔ細胞およびＴ細胞受容体を同定することが可能となる。
【００５６】
＜塩基配列検出工程＞
塩基配列検出工程は、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドの塩基配列の多様性を検出することができる工程であればよく、特に限定されない。当該塩基配列検出工程において、Ｔ細胞群におけるレパトアの多様性の偏りを、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドの塩基配列の多様性の偏りを指標として検出することによって、自己免疫疾患の発症に関わる自己免疫応答性Ｔ細胞およびＴ細胞受容体を容易に同定することができる。つまり、正常なＴ細胞群では、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドの塩基配列の多様性に偏りがないが、自己免疫応答性Ｔ細胞群では、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドの塩基配列の多様性に偏りを生じる。したがって、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドの塩基配列の多様性の偏りを検出することによって、自己免疫疾患の発症に関わる自己免疫応答性Ｔ細胞およびＴ細胞受容体を同定することが可能となる。
【００５７】
上述したように、自己免疫応答性Ｔ細胞群では、ＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドが、ある特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドに偏っている。このとき、偏って存在しているポリヌクレオチドの塩基配列は特に限定されないが、これらの塩基配列をアミノ酸に翻訳すると、例えば、当該塩基配列には、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）からなる群より選択されるアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸が連続して配置されることによって形成される、２つのアミノ酸からなる親水性領域をコードする塩基配列が含まれている。
【００５８】
したがって、上記塩基配列検出工程は、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域が、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）からなる群より選択されるアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸が連続して配置されることによって形成される、２つのアミノ酸からなる親水性領域を有するＴ細胞の割合と、当該親水性領域を有さないＴ細胞の割合とを比較することができる工程であることが好ましい。また、このとき、上記親水性領域が有する２つのアミノ酸は、少なくとも一方がグリシン（Ｇ）であることが更に好ましい。
【００５９】
上記親水性領域はＣＤＲ３領域中にあればよく、ＣＤＲ３領域中の位置は特に限定されない。また、ＣＤＲ３領域中の親水性領域の数も特に限定されない。
【００６０】
例えば、上記塩基配列検出工程は、上述したポリヌクレオチド長検出工程と同様に、ＰＣＲ法によってＣＤＲ３領域を増幅するＰＣＲ増幅工程を有するものであることが好ましい。当該増幅工程を用いれば、Ｔ細胞群を含む生体サンプルから、ＣＤＲ３領域に相当するポリヌクレオチドを一度に増幅することができる。なお、ＰＣＲ増幅工程に用いるプライマーは特に限定されず、ＣＤＲ３領域を増幅可能なように適宜設定すればよい。そして、増幅されたポリヌクレオチドをベクターに挿入して、当該ベクターに挿入されたポリヌクレオチドの配列を読むことによって、ＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドの塩基配列を確認するとともに、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドの塩基配列の多様性に偏りがあるか否かを確認することができる。そして、その結果、自己免疫疾患の発症に関わる自己免疫応答性Ｔ細胞およびＴ細胞受容体を容易に同定することができる。なお、上記ベクターとしては特に限定されず、適宜公知のベクターを用いることができる。また、ポリヌクレオチドの塩基配列は、適宜公知の方法によって確認することができる。
【００６１】
＜アミノ酸配列検出工程＞
アミノ酸配列検出工程は、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドのアミノ酸配列の多様性を検出することができる工程であればよく、特に限定されない。当該アミノ酸配列検出工程において、Ｔ細胞群におけるレパトアの多様性の偏りを、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドのアミノ酸配列の多様性の偏りを指標として検出することによって、自己免疫疾患の発症に関わる自己免疫応答性Ｔ細胞およびＴ細胞受容体を容易に同定することができる。つまり、正常なＴ細胞群では、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドのアミノ酸配列の多様性に偏りがないが、自己免疫応答性Ｔ細胞群では、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドのアミノ酸配列の多様性に偏りを生じる。したがって、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドのアミノ酸配列の多様性の偏りを検出することによって、自己免疫疾患の発症に関わる自己免疫応答性Ｔ細胞およびＴ細胞受容体を同定することが可能となる。
【００６２】
上述したように、自己免疫応答性Ｔ細胞群では、ＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドが、ある特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドに偏っている。このとき、偏って存在しているポリペプチドのアミノ酸配列は特に限定されないが、例えば、当該アミノ酸配列には、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）からなる群より選択されるアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸が連続して配置されることによって形成される、２つのアミノ酸からなる親水性領域が含まれている場合が多い。
【００６３】
したがって、上記アミノ酸配列検出工程は、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域が、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）からなる群より選択されるアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸が連続して配置されることによって形成される、２つのアミノ酸からなる親水性領域を有するＴ細胞の割合と、当該親水性領域を有さないＴ細胞の割合とを比較することができる工程であることが好ましい。また、このとき、上記親水性領域が有する２つのアミノ酸は、少なくとも一方がグリシン（Ｇ）であることが更に好ましい。
【００６４】
上記親水性領域はＣＤＲ３領域中にあればよく、ＣＤＲ３領域中の位置は特に限定されない。また、ＣＤＲ３領域中の親水性領域の数も特に限定されない。
【００６５】
例えば、上記アミノ酸配列検出工程は、上述したポリヌクレオチド長検出工程と同様に、ＰＣＲ法によってＣＤＲ３領域を増幅するＰＣＲ増幅工程を有するものであることが好ましい。当該増幅工程を用いれば、Ｔ細胞群を含む生体サンプルから、ＣＤＲ３領域に相当するポリヌクレオチドを一度に増幅することができる。なお、ＰＣＲ増幅工程に用いるプライマーは特に限定されず、ＣＤＲ３領域を増幅可能なように適宜設定すればよい。そして、増幅されたポリヌクレオチドをベクターに挿入して、当該ベクターに挿入されたポリヌクレオチドの配列を読むことによって、ＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドのアミノ酸配列を確認するとともに、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドのアミノ酸配列の多様性に偏りがあるか否かを確認することができる。そして、その結果、自己免疫疾患の発症に関わる自己免疫応答性Ｔ細胞およびＴ細胞受容体を容易に同定することができる。なお、上記ベクターとしては特に限定されず、適宜公知のベクターを用いることができる。また、ポリヌクレオチドの塩基配列は、適宜公知の方法によって確認することができる。
【００６６】
〔自己免疫疾患の発症または発症可能性を判定する方法〕
本実施の形態の判定方法は、自己免疫疾患の発症または発症可能性を判定する方法であって、本願発明の自己免疫疾患の発症に関わる自己応答性Ｔ細胞およびＴ細胞受容体の同定方法の何れかを用いるものである。本願発明の同定方法については先に詳細に説明したので、ここでは説明を省略することにする。
【００６７】
本実施の形態の判定方法は、生体から分離された生体サンプルを用いるものである。上記生体サンプルはＴ細胞を含むものであればよく、特に限定されない。例えば、上記生体サンプルには、Ｔ細胞のポリヌクレオチドが含まれることが好ましい。生体サンプル中にＴ細胞群由来のポリヌクレオチドが含まれる場合には、本願発明の同定方法を用いることによって、自己免疫疾患の発症または発症可能性を簡便に判定することができる。
【００６８】
上記生体サンプルが由来する生体としても特に限定されない。例えば、上記生体としては、自己免疫疾患に罹患し得る生体であることが好ましい。具体的には、上記生体は、ヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ウサギ、サル、チンパンジー等であることが好ましい。上記生体由来の生体サンプルを用いることによって、自己免疫疾患の発症または発症可能性を判定することができる。
【００６９】
上記生体サンプルを分離する組織としても特に限定されず、Ｔ細胞を含む組織から適宜分離することができる。具体的には、上記生体サンプルは、抹消リンパ組織から分離することが好ましい。さらに、抹消リンパ組織としては、例えば、リンパ節、脾（臓）、抹消血、腸付属リンパ組織（gut‐associated lymphoid tissue（扁桃、Peyer板など））などを挙げることができる。抹消リンパ組織には多くのＴ細胞が含まれているので、抹消リンパ組織から生体サンプルを分離すれば、本実施の形態の自己免疫疾患の判定方法においてより多くのデータ（ＣＤＲ３領域の長さやアミノ酸配列の多様性など）を収集することができる。その結果、より正確に自己免疫疾患の発症または発症可能性を判定することができる。
【００７０】
〔同定キット〕
本発明の同定キットは、本発明の自己免疫疾患の発症に関わる自己応答性Ｔ細胞またはＴ細胞受容体の同定方法を実施するためのものであればよく、これに含まれる具体的な構成、材料、機器等は、特に限定されるものではない。具体的には、上記同定方法の各工程を実施するための物が含まれていればよい。例えば、ＴＣＲ遺伝子のＣＤＲ３領域を増幅するためのプライマーが含まれることが好ましい。
【００７１】
上記プライマーは、Ｔ細胞群が有する多様性に富んだＣＤＲ３領域を同時に増幅可能なものであればよく、その具体的な配列は特に限定されるものではない。
【００７２】
以下実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００７３】
〔方法〕
２匹のＢＡＬＢ／Ｃマウス（雌、７週齢）に対し、ＳＥＢ（２５μｇ）を５日毎に８回免疫した。最終免疫から９日後にサクリファイスを行い、Ｂ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を除去した脾細胞から、Dyna beads（DYNAL社製）を用いてＶβ＋８細胞を単離した。なお、Ｖβ＋８細胞の具体的な単離方法は、添付のプロトコールに従った。
【００７４】
得られたＣＤ４＋・Ｖβ８＋細胞からtotal RNAを抽出した。そして、抽出したtotal RNAを用いて逆転写反応を行ってｃＤＮＡを作製した。
【００７５】
次いで、上記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行い、ＣＤＲ３領域に対応するＤＮＡ断片を増幅した。なお、当該ＰＣＲ反応には、Ｖβ８．３プライマーおよびＣβプライマーを用い、反応条件は以下の条件であった。９５℃にて１２分間の前変性処理を行った後、９４℃にて３０秒間の変性反応、６３℃にて４０秒間のアニーリング反応（−１℃／cycle）、および７２℃にて５０秒間の伸長反応からなる反応サイクルを１０回行った。その後、引き続いて、９４℃にて３０秒間の変性反応、５４℃にて４０秒間のアニーリング反応、および７２℃にて５０秒間の伸長反応からなる反応サイクルを２５回行った。そして、最後に、７２℃にて５分間の伸長反応を１回行った。
【００７６】
Ｖβ８．３プライマー：5’-TGCTGGCAACCTTCGAATAGGA-3’（配列番号１）
Ｃβプライマー ：5’-CTTGGGTGGAGTCACATTTCTC-3’（配列番号２）
次いで、増幅されたＤＮＡ断片をTOPOベクター（Invitrogen社製）にクローニングし、当該ベクターを用いて大腸菌を形質転換した。なお、形質転換された大腸菌を、カナマイシンを含有するＬＢ培地上で選択した。
【００７７】
大腸菌のコロニーを単離し、各コロニーを液体培養した。培養した大腸菌からプラスミドを抽出したあと、各プラスミドに挿入されているＣＤＲ３領域の塩基配列を確認した。
【００７８】
〔結果１〕
上述したように、上記実験は、２匹のＢＡＬＢ／Ｃマウス（以下、各々をNo.1個体、No.2個体と呼ぶ）に対して行った。上記実験の結果、No.1個体からは、２１種類のＣＤＲ３領域の塩基配列が得られた。また、No.2個体からは、１５種類のＣＤＲ３領域の塩基配列が得られた。
【００７９】
図１に、得られた塩基配列から換算した、ＣＤＲ３領域のアミノ酸配列の長さと、その存在比率との関係を示した。図１から明らかなように、ＳＥＢを投与したＢＡＬＢ／Ｃマウスでは、ＣＤＲ３領域は１３アミノ酸であるものが最も多く存在し、１３アミノ酸を境にして拡散するように偏って分布していた。つまり、ＳＥＢを投与したＢＡＬＢ／Ｃマウスでは、ＣＤＲ３領域は、１３アミノ酸に偏って存在していた。さらに具体的には、１３アミノ酸配列からなるＣＤＲ３領域の割合は、No.1個体においては５２．４％（１１／２１）であり、No.2個体においては３３．３％（５／１５）であった。
【００８０】
〔結果２〕
次いで、No.1個体由来の２１種類のＣＤＲ３領域のアミノ酸配列、およびNo.2個体由来の１５種類のＣＤＲ３領域のアミノ酸配列に共通した特徴的な配列が存在するか否かについて検討した。
【００８１】
表１には、No.1個体由来の２１種類のＣＤＲ３領域のアミノ酸配列が、２０アミノ酸表記と８アミノ酸表記との２種類の表記法にて示されている。また、表２には、N0.2個体由来の１５種類のＣＤＲ３領域のアミノ酸配列が、２０アミノ酸表記と８アミノ酸表記との２種類の表記法にて示されている。なお、２０アミノ酸表記と８アミノ酸表記との対応関係を、表３に示す。
【００８２】
【表１】
【００８３】
【表２】
【００８４】
【表３】
【００８５】
表１および表２から明らかなように、ＳＥＢを投与したＢＡＬＢ／Ｃマウスでは、２０アミノ酸表記においてＧＧ（以下、Gly-Gly motifと呼ぶ）にて示される親水性アミノ酸配列を高頻度で含むことが明らかになった。さらに具体的には、Gly-Gly motifを含むＣＤＲ３領域の割合は、No.1個体においては３８．１％（８／２１）であって、No.2個体では３３．３％（５／１５）であった。
【００８６】
また、さらに詳細にＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を検討した結果、表１および表２から明らかなように、ＳＥＢを投与したＢＡＬＢ／Ｃマウスでは、８アミノ酸表記においてＤＤ、ＤＥ、ＥＤまたはＥＥにて示される親水性アミノ酸配列を高頻度に含むことが明らかになった。さらに具体的には、上記４種類の親水性アミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域の割合は、No.1個体においては７１．４％（１５／２１）であって、No.2個体では８０．０％（１２／１５）であった。
【００８７】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明の定方法およびその利用は、関節リウマチをはじめとした自己免疫疾患の発症のメカニズムの解明に有効に利用することができると考えられる。また、本発明によれば、関節リウマチ等の自己免疫疾患の発症またはその発症可能性を高精度に簡便かつ確実に行うことができる。それゆえ、本発明は自己免疫疾患の予防および治療の分野において、高い利用可能性を有しているといえる。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】本実施例において行ったＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドの長さの多様性を解析した結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己免疫疾患の発症に関わる自己応答性Ｔ細胞またはＴ細胞受容体の同定方法であって、
Ｔ細胞群におけるレパトアの多様性の偏りを検出する多様性検出工程を含むことを特徴とする同定方法。
【請求項２】
上記多様性検出工程では、ＴＣＲ遺伝子またはＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域の多様性の偏りが検出されることを特徴とする請求項１に記載の同定方法。
【請求項３】
上記ＣＤＲ３領域の多様性の偏りは、以下の１）および２）の少なくとも一つの工程によって検出されることを特徴とする請求項２に記載の同定方法。
１）ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドの長さの多様性を検出するポリヌクレオチド長検出工程
２）ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドの長さの多様性を検出するポリペプチド長検出工程
【請求項４】
上記ポリヌクレオチド長検出工程では、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域が、３９個のヌクレオチドから構成されているＴ細胞の割合と、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域が、３９個以外のヌクレオチドから構成されているＴ細胞の割合とが比較され、
上記ポリペプチド長検出工程では、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域が、１３個のアミノ酸から構成されているＴ細胞の割合と、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域が、１３個以外のアミノ酸から構成されているＴ細胞の割合とが比較されることを特徴とする請求項３に記載の同定方法。
【請求項５】
上記ポリヌクレオチド長検出工程は、Ｔ細胞におけるＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域の長さが、３９個のヌクレオチドを中心として、正規分布しているか否かを検出する工程を含み、
上記ポリペプチド長検出工程は、Ｔ細胞におけるＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域の長さが、１３個のアミノ酸を中心として、正規分布しているか否かを検出する工程を含むことを特徴とする請求項４に記載の同定方法。
【請求項６】
上記ポリヌクレオチド長検出工程は、Ｔ細胞におけるＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域が、３０〜４８個のヌクレオチドから構成されるように分布しているか否かを検出する工程を含み、
上記ポリペプチド長検出工程は、Ｔ細胞におけるＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域が、１０〜１６個のアミノ酸から構成されるように分布しているか否かを検出する工程を含むことを特徴とする請求項４または５に記載の同定方法。
【請求項７】
上記ＣＤＲ３領域の多様性の偏りは、以下の１）および２）の少なくとも一つの工程によって検出されることを特徴とする請求項２に記載の同定方法。
１）ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドの塩基配列の多様性を検出する塩基配列検出工程
２）ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドのアミノ酸配列の多様性を検出するアミノ酸配列検出工程
【請求項８】
上記塩基配列検出工程では、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域が、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）からなる群より選択されるアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸が連続して配置されることによって形成される、２つのアミノ酸からなる親水性領域をコードするＴ細胞の割合と、当該親水性領域をコードしないＴ細胞の割合とが比較され、
上記アミノ酸配列検出工程では、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域が、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）からなる群より選択されるアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸が連続して配置されることによって形成される、２つのアミノ酸からなる親水性領域を有するＴ細胞の割合と、当該親水性領域を有さないＴ細胞の割合とが比較されることを特徴とする請求項７に記載の同定方法。
【請求項９】
上記親水性領域を形成する２つのアミノ酸は、少なくとも一方がグリシン（Ｇ）であることを特徴とする請求項８に記載の同定方法。
【請求項１０】
上記自己免疫疾患が、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、発作性血色素尿症、特発性血小板減少性紫斑病、シェーグレン症候群、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、多発性筋炎、強皮症または混合結合組織病であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の同定方法。
【請求項１１】
生体から分離された生体サンプルを用いて自己免疫疾患の発症または発症可能性を判定する方法であって、
請求項１〜１０の何れか１項に記載の同定方法によって自己応答性Ｔ細胞またはＴ細胞受容体を検出する工程を含むことを特徴とする判定方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０の何れか１項に記載の同定方法を実施するための同定キットであって、
ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域を増幅可能なプライマー対を含むことを特徴とする同定キット。
【請求項１】
自己免疫疾患の発症に関わる自己応答性Ｔ細胞またはＴ細胞受容体の同定方法であって、
Ｔ細胞群におけるレパトアの多様性の偏りを検出する多様性検出工程を含むことを特徴とする同定方法。
【請求項２】
上記多様性検出工程では、ＴＣＲ遺伝子またはＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域の多様性の偏りが検出されることを特徴とする請求項１に記載の同定方法。
【請求項３】
上記ＣＤＲ３領域の多様性の偏りは、以下の１）および２）の少なくとも一つの工程によって検出されることを特徴とする請求項２に記載の同定方法。
１）ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドの長さの多様性を検出するポリヌクレオチド長検出工程
２）ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドの長さの多様性を検出するポリペプチド長検出工程
【請求項４】
上記ポリヌクレオチド長検出工程では、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域が、３９個のヌクレオチドから構成されているＴ細胞の割合と、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域が、３９個以外のヌクレオチドから構成されているＴ細胞の割合とが比較され、
上記ポリペプチド長検出工程では、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域が、１３個のアミノ酸から構成されているＴ細胞の割合と、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域が、１３個以外のアミノ酸から構成されているＴ細胞の割合とが比較されることを特徴とする請求項３に記載の同定方法。
【請求項５】
上記ポリヌクレオチド長検出工程は、Ｔ細胞におけるＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域の長さが、３９個のヌクレオチドを中心として、正規分布しているか否かを検出する工程を含み、
上記ポリペプチド長検出工程は、Ｔ細胞におけるＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域の長さが、１３個のアミノ酸を中心として、正規分布しているか否かを検出する工程を含むことを特徴とする請求項４に記載の同定方法。
【請求項６】
上記ポリヌクレオチド長検出工程は、Ｔ細胞におけるＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域が、３０〜４８個のヌクレオチドから構成されるように分布しているか否かを検出する工程を含み、
上記ポリペプチド長検出工程は、Ｔ細胞におけるＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域が、１０〜１６個のアミノ酸から構成されるように分布しているか否かを検出する工程を含むことを特徴とする請求項４または５に記載の同定方法。
【請求項７】
上記ＣＤＲ３領域の多様性の偏りは、以下の１）および２）の少なくとも一つの工程によって検出されることを特徴とする請求項２に記載の同定方法。
１）ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域を構成するポリヌクレオチドの塩基配列の多様性を検出する塩基配列検出工程
２）ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域を構成するポリペプチドのアミノ酸配列の多様性を検出するアミノ酸配列検出工程
【請求項８】
上記塩基配列検出工程では、ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域が、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）からなる群より選択されるアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸が連続して配置されることによって形成される、２つのアミノ酸からなる親水性領域をコードするＴ細胞の割合と、当該親水性領域をコードしないＴ細胞の割合とが比較され、
上記アミノ酸配列検出工程では、ＴＣＲタンパク質中のＣＤＲ３領域が、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）からなる群より選択されるアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸が連続して配置されることによって形成される、２つのアミノ酸からなる親水性領域を有するＴ細胞の割合と、当該親水性領域を有さないＴ細胞の割合とが比較されることを特徴とする請求項７に記載の同定方法。
【請求項９】
上記親水性領域を形成する２つのアミノ酸は、少なくとも一方がグリシン（Ｇ）であることを特徴とする請求項８に記載の同定方法。
【請求項１０】
上記自己免疫疾患が、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、発作性血色素尿症、特発性血小板減少性紫斑病、シェーグレン症候群、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、多発性筋炎、強皮症または混合結合組織病であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の同定方法。
【請求項１１】
生体から分離された生体サンプルを用いて自己免疫疾患の発症または発症可能性を判定する方法であって、
請求項１〜１０の何れか１項に記載の同定方法によって自己応答性Ｔ細胞またはＴ細胞受容体を検出する工程を含むことを特徴とする判定方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０の何れか１項に記載の同定方法を実施するための同定キットであって、
ＴＣＲ遺伝子中のＣＤＲ３領域を増幅可能なプライマー対を含むことを特徴とする同定キット。
【図１】
【公開番号】特開２００８−９９５８８（Ｐ２００８−９９５８８Ａ）
【公開日】平成２０年５月１日（２００８．５．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２８４２３０（Ｐ２００６−２８４２３０）
【出願日】平成１８年１０月１８日（２００６．１０．１８）
【出願人】（５０４１５６７０６）株式会社膠原病研究所 (13)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年５月１日（２００８．５．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月１８日（２００６．１０．１８）
【出願人】（５０４１５６７０６）株式会社膠原病研究所 (13)
【Ｆターム（参考）】
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