自己免疫疾患治療剤
本願では、（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物を有効成分として含んでなる、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制が治療に有効である疾患および／または自己抗体の産生抑制が治療に有効である疾患の治療剤、それらの疾患の根治治療剤、およびそれらの疾患の進行阻害剤が開示される。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、自己免疫疾患治療剤に関し、詳細には、プロアントシアニジンを有効成分として含んでなる自己免疫疾患治療剤に関する。
【０００２】
背景技術
近年、高齢化社会をむかえて慢性関節リウマチに代表される自己免疫疾患が増加している。自己免疫疾患には免疫応答のタイプの違う２種類に大別することができる。ひとつは細胞性免疫の過剰な亢進による疾患であり、もうひとつは自己抗体に媒介される疾患である。前者の非限定的な例は、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、自己免疫性甲状腺炎（ＡＴ）、若年性糖尿病やＩ型糖尿病等のインスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫ブドウ膜網膜炎（ＡＵＲ）、乾癬症などである。後者の非限定的な例は、重症筋無力症（ＭＧ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、グッドパスチャー症候群、自己免疫性溶血性貧血などである。これら自己免疫疾患の既存の治療法としては、非特異的に免疫反応を抑制する免疫抑制剤が代表的である。例としてはメトトレキサート、シクロホスファミド、サイクロスポリンＡ、タクロリムス、各種ステロイド化合物などがある。これらの薬剤は毒性・副作用が深刻であるばかりでなく、治療期間中は免疫反応が抑制されているため感染症に罹患する危機にさらされる。このような背景の中、最近特にリウマチ治療において生物製剤が脚光を浴びている。細胞性免疫依存型の自己免疫疾患の増悪因子はＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６などの炎症性サイトカインであるが、抗ＴＮＦ−α抗体、可溶性ＴＮＦ−α受容体、抗ＩＬ−６受容体抗体、ＩＬ−１受容体アンタゴニストなどについて臨床試験が行われている。これらの生物製剤は、対症療法であるため継続的な投与を要する。
【０００３】
ところで、自己免疫疾患の中で患者数が多いのは細胞性免疫亢進型自己免疫疾患である。このタイプでは、Ｔｈ１細胞やＴｃ１細胞が発症機序の中心的な役割を持っている。Ｔｈ１細胞はヘルパーＴ細胞の亜群であり、抗原刺激に対して選択的にＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２などのＴｈ１サイトカインを産生する。Ｔｈ１細胞の分化には抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ）が産生するＩＬ−１２と呼ばれるサイトカインが必須であるが、細胞性免疫亢進型自己免疫疾患では抗原提示細胞によるＩＬ−１２産生量が増加しており、いっそうＴｈ１細胞が誘導されやすい環境となっている。Ｔｈ１細胞はＴｈ１サイトカイン環境を作り出し、細胞障害活性をもつＴ細胞であるＴｃ１細胞の分化を誘導する。従ってＴｈ１サイトカインの産生を抑制することが自己免疫疾患の治療および予防に有効であると言える。
【０００４】
漢方薬を始めとする民間療法もこの分野では試みられることが多く、ある種の植物素材も自己免疫疾患に効果があることが経験的に知られている。
【０００５】
例えば、雷公藤はリウマチに効果があることが報告され（BMC Pharmacol., 2004,4(1):2）、人参湯はＩ型糖尿病に効果があることが報告され（Microbiol. Immunol., 2000, 44(4):299-305）、カンランは多発性硬化症に効果があることが報告されている（Arzneimittelforschung, 1998, 48(6):668-74）。また、シダの１種であるPolypodium Leucotomosは古くから乾癬症の治療に使われている（Padilla HC., 1974. Int J Dermatol 13, 276-282; Gonzales S., et al., 2000, Anticancer Res.20, 1567-1576）。また、同じシダ類であるサマンバイア（Polypodium lepidopteris）のエキスにはＣＤ４＋Ｔ細胞やＢ細胞の数に影響を与えることなく、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数を増加させる作用があることが知られている（Hostettmann K., et.al., 1995 Phytochemistry of Plants Used in Traditional Medicine, Proceedings of the Phytochemical Society of Europe. Oxford University Press: Oxford, NY）。このような素材で得られる効果については、科学的な解明はされていないが、安価で手軽に試みられる利点がある。また、ジャトバ（Hymenaea courbaril、別名：アスカル・ワーヨ）の樹皮、樹液、樹脂、葉などは下痢止めや膀胱炎、肝炎、前立腺炎、咳の自然薬として用いられてきた（Rutter, R.A. 1990 Catalogo de Plantas Utiles de la Amazonia Peruana. Instituto Linguistico de Verano. Yarinacocha, Peru. 349）。現在でも、ジャトバ樹皮から作るお茶や液体エキスは食欲促進、疲労回復、滋養強壮、栄養補給剤として広く受け入れられている（Silva., 1930. Catalogo de Extractos Fluidos, Araija e Cia.Ltd., Rio de Janeiro, Brazil: Cruz GL., 1995. Dicionario das Plantas Uteis Do Brasil, 5th Ed. Rio de Janeiro: Bertrand Brazil)。また、ジャトバの樹皮に含まれているアチルビンと呼ばれるフラボノイドが、抗酸化効果や肝臓保護特性を生み出すことや抗菌作用とテルペンやフェノールとの因果関係が報告されている (Closa D et al., 1997. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 56, 331-334；Pinheiro de SM., et.al., 1974. Molluscicidal activity of plants from Northeast Brazil. Rev Bras Fpesq Med Biol, 74: 389-394;Rouquayrol MZ., et al., 1980. Rev Brasil Pesq Med Biol 13, 135-143）。しかしながら、これらの成分のＴｈ１サイトカイン産生に対する効果や自己免疫疾患に対する効果はこれまで報告がなされていない。
【０００６】
ところで、プロアントシアニジンは様々な植物に広く含有される縮合型タンニンであり、酸処理によってアントシアニジンを与える。図１に示すように、主としてカテキン類すなわちフラバン−３−オールを基本単位として重合したポリフェノール成分である。すなわち、プロアントシアニジンとはフラバン骨格を基本として種々な部位に水酸基を有する単量体が重合した、非常に多様な化合物群の総称である。重合体の構成単位のうち、基端部をターミナルユニット、その他をエクステンションユニットと呼び、重合度は二量体、三量体のものから１００量体以上の高分子にまで及ぶ。
【０００７】
これまでに、プロアントシアニジンの好塩基球からのヒスタミン、ロイコトリエンなどの遊離抑制作用に基づく抗アレルギー剤としての利用が報告されている。（特開２００１−２７８７９２号公報）また、抗肥満作用（特開平９−２９１０３９号公報）、マトリックスプロテアーゼ阻害作用（特表２００３−５０４４０２号公報）、筋肉萎縮抑制作用（特開２００２−３３８４６４号公報）、血糖降下作用（特開平４−２５３９１８号公報）など多様な報告がなされている。しかしながら、自己免疫疾患の治療および予防はもちろん、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制に関するプロアントシアニジンの作用は知られていない。
【発明の概要】
【０００８】
本発明者らは、特定の植物由来エキスがＴｈ１偏向マウス脾臓細胞においてＴｈ１サイトカインの産生を抑制すること、その効果をもたらす有効成分がポリフェノールの一種であるプロアントシアニジンであること、特定の重合度を有するプロアントシアニジンが特にＴｈ１サイトカインの産生抑制に有効であること等を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明者等はまた、４量体以上、特に５量体以上のプロアントシアニジンが実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルにおいて高い治療活性を示すこと等を確認した。
【００１０】
本発明者らはまた、高重合度プロアントシアニジンがＢ細胞の活性化を抑制すること、自己抗体が誘導されたマウスにおいて高重合度プロアントシアニジンが自己抗体の産生を抑制すること等を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、インスリン依存型糖尿病をはじめとするＴｈ１サイトカインの産生抑制が治療に有効である疾患や自己抗体の産生抑制が治療に有効である疾患の治療剤の提供を目的とする。
【００１２】
本発明によれば、（ｉ）重合度が４以上のプロアントシアニジン、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物を有効成分として含有してなる、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制が治療に有効である疾患および／または自己抗体の産生抑制が治療に有効である疾患の治療剤、それら疾患の根治治療剤、およびそれら疾患の進行阻害剤（以下、「本発明による治療剤」という）が提供される。
【００１３】
本発明によればまた、本発明による治療剤の製造のための、（ｉ）重合度が４以上のプロアントシアニジン、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物の使用が提供される。
【００１４】
本発明によれば更に、治療上の有効量の（ｉ）重合度が４以上のプロアントシアニジン、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物を、必要であれば薬学上許容される担体とともに哺乳類に投与することを含んでなる、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制が治療に有効である疾患および／または自己抗体の産生抑制が治療に有効である疾患の治療方法、それら疾患の根治治療方法、およびそれら疾患の進行阻害方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】プロアントシアニジンを構成するフラバン化合物の代表成分であるエピカテキンおよびカテキン並びにフラバン環３位水酸基にしばしばエステル付加する没食子酸の構造式をそれぞれ示した図である。
【図２】ヒト多発性硬化症モデルマウスの作成とジャトバ腹腔内投与のスケジュールを示した図である。
【図３】ヒト多発性硬化症モデルマウスにおける、ジャトバの抗自己免疫疾患活性を臨床スコアの変動により評価した図である。
【図４】Ａ：脾臓細胞の産生するＴｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γの産生活性に対するジャトバの抑制活性を示した図である。Ｂ：炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αの産生活性に対するジャトバの抑制活性を示した図である。「＋ＭＯＧ」はＭＯＧペプチドを培養上清中に添加したもの、「−ＭＯＧ」はＭＯＧペプチドを培養上清中に添加しないものを意味する。両者の比較により抗原依存的な反応を確認できる。
【図５】ジャトバの脱髄抑制効果を示した図である。コントロールマウス（Control, Score 3）（発症）とジャトバ投与マウス（50m/kg jatoba, Score 0）（無症状）を第１５日目に剖検し、脊髄の脱髄の有無を観察した。
【図６】ＳＪＬ／ＪマウスにＰＬＰペプチドを用いて誘導したＥＡＥモデルを第１２日目で剖検し、脾臓細胞の産生するＴｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γに対するジャトバの産生抑制活性を示した図である。「＋ＰＬＰ」はＰＬＰペプチドを培養上清中に添加したもの、「−ＰＬＰ」はＰＬＰペプチドを培養上清中に添加しないものを意味する。両者の比較により抗原依存的な反応を確認できる。
【図７】Ａ：ジャトバの予防投与１回の効果について臨床スコアの変動を示した図である。control：コントロール。Once：一回投与。Ｂ：第１１日目で剖検し、脾臓細胞の産生するＴｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γへジャトバの予防投与１回での抑制活性を示した図である。「＋ＭＯＧ」はＭＯＧペプチドを培養上清中に添加したもの、「−ＭＯＧ」はＭＯＧペプチドを培養上清中に添加しないものを意味する。両者の比較により抗原依存的な反応を確認できる。
【図８】ＰＶＰＰ処理したジャトバ抽出物を投与した場合の臨床スコアの変動を示した図である。
【図９】脾臓細胞の産生するＴｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γおよび炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αに対する、ジャトバ抽出物およびＰＶＰＰ処理したジャトバ抽出物の抑制活性を示した図である。「＋ＭＯＧ」はＭＯＧペプチドを培養上清中に添加したもの、「−ＭＯＧ」はＭＯＧペプチドを培養上清中に添加しないものを意味する。両者の比較により抗原依存的な反応を確認できる。
【図１０】Ａ：実施例７において、ジャトバエタノール抽出物を電子スプレーイオン化質量分析に供し、プロシアニジン二量体、三量体、四量体、五量体、そして六量体の分子イオンピークを観測したことを示した図である。Ｂ：実施例７において、ジャトバエタノール抽出物をマトリックス支援レーザー脱離イオン化―飛行時間型質量分析に供し、２０以上の重合度を有するプロシアニジンの分子イオンピークが観測されたことを示した図である。
【図１１】プロアントシアニジンを酸性条件下、トルエン−α−チオールと共に加熱する反応であるチオール開裂を模式的に示した図である。
【図１２】ジャトバエタノール抽出物のチオール開裂反応生成物を逆相カラムクロマトグラフィで分析したクロマトグラムを示した図である。
【図１３】ジャトバエタノール抽出物中のプロシアニジンを、メタノールとクロロホルムに対する溶解性の違いを利用して分別沈殿し、重合度別に分画したことを示した図である。※：プロシアニジンの平均重合度／含量％。
【図１４】脾臓細胞の産生するＴｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γに対する、ジャトバエタノール抽出物および実施例９で分画された各画分（Ｆｒ）の抑制活性を示した図である。「＋ＭＯＧ」はＭＯＧペプチドを培養上清中に添加したもの、「−ＭＯＧ」はＭＯＧペプチドを培養上清中に添加しないものを意味する。両者の比較により抗原依存的な反応を確認できる。
【図１５】エピカテキン−ベンジルチオールエーテル（ＥＣ−ＢＴＥ）のプロトン（１Ｈ）ＮＭＲスペクトル（重アセトン、２０℃、５００ＭＨｚ）であり、構造を同定する図である。
【図１６】ベンジルチオールがフラバン環の４位に付加していることを証明する、エピカテキン−ベンジルチオールエーテル（ＥＣ−ＢＴＥ）のＨＭＢＣスペクトル（重アセトン、２０℃、５００ＭＨｚ）の図である。
【図１７】ＥＣ−ＢＴＥを標品としてＨＰＬＣ分析を行ない、さらに各成分をモル換算して計算したプロシアニジンの平均重合度と含量％を示す図である。※：プロシアニジンの平均重合度／含量％。
【図１８】アップルフェノン（登録商標）に含有されるプロシアニジンを逆相カラムクロマトグラフィで定量分析し、さらに液体クロマトグラフ質量分析によってそのメインピークが三量体であることを示した図である。
【図１９】市販標品エピカテキンガレート（ＥＣＧ）と精製したエピカテキンガレート−ベンジルチオールエーテル（ＥＣ−ＢＴＥ）を比較するプロトン（１Ｈ）ＮＭＲ (ｃｄ３ｏｄ、２０℃、６００ ＭＨｚ)の図である。
【図２０】ベンジルチオールがフラバン環の４位に付加していることを証明する、エピカテキンガレート−ベンジルチオールエーテル（ＥＣＧ−ＢＴＥ）のＨＭＢＣ スペクトル(ｃｄ３ｏｄ、２０℃、６００ ＭＨｚ)の図である。
【図２１】エピカテキンガレート−ベンジルチオールエーテル（ＥＣＧ−ＢＴＥ）のＨＳＱＣ (ｃｄ３ｏｄ、２０℃、６００ ＭＨｚ)であり、フラバン環４位、ベンジルチオールのＳＣＨ２部位のカーボンを帰属した図である。
【図２２】市販標品カテキン（ＣＡ）と精製したカテキン−ベンジルチオールエーテル（ＣＡ−ＢＴＥ）を比較するプロトン（１Ｈ）ＮＭＲ (ｃｄ３ｏｄ、２０℃、６００ ＭＨｚ)の図である。
【図２３】ベンジルチオールがフラバン環の４位に付加していることを証明する、カテキン−ベンジルチオールエーテル（ＣＡ−ＢＴＥ）のＨＭＢＣ (ｃｄ３ｏｄ、２０℃、６００ ＭＨｚ)の図である。
【図２４】カテキン−ベンジルチオールエーテル（ＣＡ−ＢＴＥ）のＨＳＱＣ (ｃｄ３ｏｄ、２０℃、６００ ＭＨｚ)であり、フラバン環４位、ベンジルチオールのＳＣＨ２部位のカーボンを帰属した図である。
【図２５】Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）ＨＳ ＰＥＧカラムを用いてプロシアニジン（実施例９で得られたＦｒ．５）を重合度別に厳密に分離したことを示すＬＣ−ＭＳクロマトグラムの図である。実線枠は１価イオンによるピーク同定を、破線枠は２価イオンによるピーク同定を、それぞれ示す。丸数字３、４、５、６、７、および８は重合度３、４、５、６、７、および８を意味する。
【図２６】Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）ＨＳ ＰＥＧカラムを用いてプロシアニジン（実施例９と同様にして調製したＦｒ．４）を重合度別に厳密に分離したことを示すＬＣ−ＭＳクロマトグラムの図である。実線枠は１価イオンによるピーク同定を、破線枠は２価イオンによるピーク同定を、それぞれ示す。丸数字３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２は重合度３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２を意味する。
【図２７】Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）ＨＳ ＰＥＧカラムを用いてプロシアニジン（実施例９と同様にして調製したＦｒ．５）の重合度分布を分析した図である。丸数字２、３、４、５、６、７、８、９、および１０は重合度２、３、４、５、６、７、８、９、および１０を意味する。
【図２８】Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）ＨＳ ＰＥＧカラムを用いてプロシアニジン（実施例９と同様にして調製したＦｒ．４）の重合度分布を分析した図である。丸数字２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３は重合度２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３を意味する。
【図２９】Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）ＨＳ ＰＥＧカラムを用いてプロシアニジン（実施例９と同様にして調製したＦｒ．３）の重合度分布を分析した図である。丸数字２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３は重合度２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３を意味する。
【図３０】ＥＡＥ臨床スコアへの各種プロシアニジン含有サンプルの影響を示した図である。括弧内の数字は平均重合度を示す。
【図３１】脾臓細胞の産生するＴｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γへの各種プロシアニジン含有サンプルの抑制活性を示した図である。「＋ＭＯＧ」はＭＯＧペプチドを培養上清中に添加したもの、「−ＭＯＧ」はＭＯＧペプチドを培養上清中に添加しないものを意味する。両者の比較により抗原依存的な反応を確認できる。
【図３２】脾臓細胞が産生するＴｈ１サイトカインであるＩＦＮ−α産生活性に対する他素材の高重合度プロシアニジン活性を比較した図である。「＋ＭＯＧ」はＭＯＧペプチドを培養上清中に添加したもの、「−ＭＯＧ」はＭＯＧペプチドを培養上清中に添加しないものを意味する。両者の比較により抗原依存的な反応を確認できる。
【図３３】慢性関節炎誘導モデルマウスの作成とジャトバ腹腔内投与のスケジュールを示した図である。
【図３４】ＴｙｐｅＩＩコラーゲン誘導関節炎モデルにおける、ジャトバ腹腔内投与群とコントロール群の臨床スコアの変動を示した図である。
【図３５】Ｉ型糖尿病誘導モデルマウスの作成とジャトバ腹腔内投与のスケジュールを示した図である。
【図３６】Ｉ型糖尿病誘導モデルマウスにおける、インビボにおけるジャトバ腹腔内投与群とコントロール群の糖尿発症率の変動を示した図である。
【図３７】９週齢で剖検し、脾臓細胞の産生するＴｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γに対するジャトバの抑制活性を示した図である。
【図３８】Ｉ型糖尿病自然発症モデルマウス実験スケジュールを示した図である。
【図３９】Ｉ型糖尿病自然発症モデルにおける抗原特異的な脾臓細胞の反応性を、インスリン依存的なＩＦＮ−γ産生活性で示した図である。
【図４０】Ｉ型糖尿病自然発症モデルにおける脾臓細胞のポピュレーションを示した図である。
【図４１】Ｉ型糖尿病自然発症モデルにおけるマクロファージの表面抗原発現レベルを示した図である。
【図４２】Ｉ型糖尿病自然発症モデルにおけるジャトバ投与による発症率抑制を示した図である。
【図４３】ＥＡＥモデルを用い、脾臓細胞における各免疫担当細胞割合の経時変化を示した図である。
【図４４】ＥＡＥモデルにおける脾臓細胞中のマクロファージの細胞表面抗原発現量を示した図である。
【図４５】リウマチモデルにおけるジャトバ抽出物、ポリフェノン、ジャトバ抽出物Ｆｒ３の経口投与の効果を臨床スコアで示した図である。
【図４６】リウマチモデルにおけるジャトバの経口投与の効果を脾細胞の抗原特異的ＩＦＮ−γ産生量で示した図である。「＋コラーゲン」はタイプＩＩコラーゲンを培養上清中に添加したもの、「−コラーゲン」は添加しないものを意味する。両者を比較することにより抗原依存的な反応を確認できる。
【図４７】リウマチモデルを用い、ジャトバＦｒ３の効果について用量依存性を臨床スコアで示した図である。
【図４８】ジャトバ投与の開始時期別に慢性関節炎リウマチスコアを示した図である。
【図４９】慢性関節リウマチにおけるジャトバ抽出物Ｆｒ３による血中抗体価の抑制を示した図である。
【図５０】脾臓細胞の産生するＴｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γの産生活性に対する各オリゴマーでの活性を比較した図である。
【図５１】脾臓細胞の産生するＴｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γの産生活性に対する各オリゴマーでの活性を比較した図である。
【図５２】ジャトバＥｔＯＨ抽出物およびポリフェノンの単回投与による体重、摂餌量への影響を示した図である。
【発明の具体的説明】
【００１６】
有効成分
本発明において有効成分である「プロアントシアニジン」とは、カテキン類、すなわち、フラバン骨格を基本単位とするポリフェノール類をいう。その構成単位としては、例えば、フラバン−３−オールとしてカテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン、カテキンガレート、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、エピディステニン（Ｂ環に水酸基を有さない）、アフゼレチン（Afzelechin）、エピアフゼレチン（epiafzelechin）が挙げられ、さらにフラバン−４−オール、ロイコアントシアニン（すなわち、フラバン−３，４−ジオール）、およびアントシアニジン等が挙げられる。
【００１７】
３位の水酸基は没食子酸とエステル（ガレート）を形成していてもよく、３位以外のいずれかの部位の水酸基が配糖体あるいはメチルエーテル（メトキシ）を形成していてもよい（図１参照）。
【００１８】
プロアントシアニジンの構成単位同士の主たる結合部位としては、４位と６位または４位と８位のいずれか１箇所（Ｂタイプ結合）、あるいは４位と８位および２位と７位酸素の２箇所（Ａタイプ結合）が挙げられるがこれらに限定されるものではなく、またこれら結合の立体配置も特に限定されるものではない。
【００１９】
ある特定の単量体が重合したプロアントシアニジンには慣用名が与えられ、代表的なプロアントシアニジンとしては、Ｂ環（図１参照）の水酸基の数に応じて定義・分類された、プロペラルゴニジン（４’−ＯＨ）、プロシアニジン（３’−ＯＨ，４’−ＯＨ）、プロデルフィニジン（３’−ＯＨ，４’−ＯＨ，５’−ＯＨ）が挙げられるが、プロアントシアニジンはこれらに限定されるものではない。例えば、Ａ環５位の水酸基を欠く成分を構成単位とした重合体であるプロガイボールチニジン（proguibourtinidin）、プロフィセチニジン、およびプロロビネチニジンがあり、さらにその他特定部位の水酸基の有無に応じて、プロテラカシジン、プロメラカシジン、プロアピゲニニジン、プロルテオリニジン等の慣用名を持つ成分が挙げられる。
【００２０】
本発明において「プロアントシアニジン」は、好ましくは、プロシアニジンおよびプロデルフィニジンである。「プロシアニジン」の構成単位は、同一または異なっていてもよく、カテキン、エピカテキン、カテキンガレート、およびエピカテキンガレートから選択できる。「プロデルフィニジン」の構成単位は、同一または異なっていてもよく、ガロカテキン、エピガロカテキン、ガロカテキンガレート、およびエピガロカテキンガレートから選択できる。
【００２１】
本発明において有効成分として用いる「重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン」は、好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジンであることができる。
【００２２】
本発明において用いられるプロアントシアニジンは、その重合度が５以上の場合に実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルにおいて高い治療活性を示した（実施例３１、図５０）。従って、本発明において用いられるプロアントシアニジンの重合度は、少なくとも５であることが好ましい。
【００２３】
本発明において用いられるプロアントシアニジンの重合度の上限は特に限定されるものではないが、プロアントシアニジンが植物由来である場合には、２０量体〜３０量体程度のプロアントシアニジンが確認されている。またプロアントシアニジンを有機合成する場合には、経済性および合成操作の便宜の観点から２０量体〜３０量体程度を重合度の上限とすることができる。更に、重合度が５以上のプロアントシアニジンに高い治療活性が認められたことから、プロアントシアニジンの重合度の上限を１０量体程度としても、本発明による効果を期待できる。従って本発明においては、プロアントシアニジンの重合度は、４〜３０量体、４〜２０量体、あるいは４〜１０量体とすることができ、好ましくは、５〜３０量体、５〜２０量体、あるいは５〜１０量体である。また本発明においては、プロアントシアニジンの重合度を、５〜６量体、５〜７量体、５〜８量体、および５〜９量体とすることができる。本発明においてプロアントシアニジンの重合度は、例えば、質量分析法（Jan F. Stevens et al., J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 3435-3443）により測定することができ、具体的には、実施例７、実施例１６、実施例１７、および実施例１９に従って測定することができる。
【００２４】
本発明において、プロアントシアニジンは式（Ｉ）で表すことができる。
【化１】
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、同一または異なっていてもよく、水素原子、水酸基、または−Ｏ−Ｒ１１（Ｒ１１は炭素数１〜４のアルキル基または糖残基を表す。）を表し、Ｒ３およびＲ４は、同一または異なっていてもよく、水素原子、水酸基、または基（ＩＩ）：
【化２】
を表し、但し、Ｒ３およびＲ４の両方が水酸基を表すことはなく、Ｒ３およびＲ４の両方が基（ＩＩ）を表すことはなく、ｎは４〜３０の整数を表し、各構成単位は、４位と６位または４位と８位の一カ所において互いに結合しているか、あるいは４位と８位および２位と７位の二カ所において互いに結合している。）
式（Ｉ）中、Ｒ１１が表すことがある「炭素数１〜４のアルキル基」は、好ましくは、メチル基である。
【００２５】
式（Ｉ）中、Ｒ１１が表すことがある「糖残基」は、ヘミアセタール性またはヘミケタール性水酸基とＲ３またはＲ４の水酸基とのエーテル結合を通じて式（Ｉ）の化合物に結合した糖を意味する。糖としては、例えば、グルコース、アロース、アルトロース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、フルクトース、キシロース、リボース、アラビノース、リキソース、ラムノースが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
式（Ｉ）中、構成単位の２位、４位、６位、または８位を通じて各構成単位同士が結合する場合には、２位、４位、６位、または８位には水素原子の代わりに単結合が存在する。
【００２７】
式（Ｉ）中、構成単位の７位を通じて各構成単位同士が結合する場合には、７位にはＲ２の代わりに、−Ｏ−が存在する。
【００２８】
式（Ｉ）における各構成単位に存在する置換基は、すべて同一であっても、構成単位ごとに異なっていてもよい。
【００２９】
式（ＩＩ）中の水酸基は、同一または異なっていてもよく、Ｒ１１−Ｏ−（Ｒ１１は前記と同義である）を表すことができる。
【００３０】
式（Ｉ）中、各構成単位において、Ｒ１およびＲ２が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ６が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ５およびＲ７が水素原子を表す化合物、およびＲ１およびＲ２が水酸基を表し、Ｒ６が水酸基を表し、Ｒ５およびＲ７が水素原子を表す化合物は、プロペラルゴニジンに対応する。これらの場合において、Ｒ３およびＲ４いずれか一方が水酸基または基（ＩＩ）を表し、他方が水素原子を表す場合が好ましい。
【００３１】
式（Ｉ）中、各構成単位において、Ｒ１およびＲ２が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ５およびＲ６が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ７が水素原子を表す化合物、およびＲ１およびＲ２が水酸基を表し、Ｒ５およびＲ６が水酸基を表し、Ｒ７が水素原子を表す化合物は、プロシアニジンに対応する。これら場合において、Ｒ３およびＲ４いずれか一方が水酸基または基（ＩＩ）を表し、他方が水素原子を表す場合が好ましい。
【００３２】
式（Ｉ）が表す構成単位のうち
− Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、およびＲ６が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ３が水酸基を表し、Ｒ４およびＲ７が水素原子を表す式（Ｉ）の構成単位はカテキンに対応し、
− Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、およびＲ６が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ４が水酸基を表し、Ｒ３およびＲ７が水素原子を表す式（Ｉ）の構成単位はエピカテキンに対応し、
− Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、およびＲ６が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ３が式（ＩＩ）を表し、Ｒ４およびＲ７が水素原子を表す式（Ｉ）の構成単位はカテキンガレートに対応し、
− Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、およびＲ６が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ４が式（ＩＩ）を表し、Ｒ３およびＲ７が水素原子を表す式（Ｉ）の構成単位はエピカテキンガレートに対応する。
式（Ｉ）中、各構成単位において、Ｒ１およびＲ２が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表す化合物、およびＲ１およびＲ２が水酸基を表し、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が水酸基を表す化合物は、プロデルフィニジンに対応する。これら場合において、Ｒ３およびＲ４いずれか一方が水酸基または基（ＩＩ）を表し、他方が水素原子を表す場合が好ましい。
【００３３】
式（Ｉ）が表す構成単位のうち
− Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ３が水酸基を表し、Ｒ４が水素原子を表す式（Ｉ）の構成単位はガロカテキンに対応し、
− Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ４が水酸基を表し、Ｒ３が水素原子を表す式（Ｉ）の構成単位はエピガロカテキンに対応し、
− Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６がＲ７が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ３が式（ＩＩ）を表し、Ｒ４が水素原子を表す式（Ｉ）の構成単位はガロカテキンガレートに対応し、
− Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ４が式（ＩＩ）を表し、Ｒ３が水素原子を表す式（Ｉ）の構成単位はエピガロカテキンガレートに対応する。
【００３４】
式（Ｉ）中、ｎはプロアントシアニジンの重合度（量体）を表す。ｎは好ましくは５〜３０の整数を表す。ｎはまた、４〜２０、４〜１０、５〜２０、５〜１０、５〜６、５〜７、５〜８、５〜９の整数であることができる。
【００３５】
式（Ｉ）における各構成単位の結合様式としては、Ａタイプ結合とＢタイプ結合が挙げられる。Ａタイプ結合は、各構成単位が４位と８位および２位と７位の二カ所において互いに結合している結合様式をいう。Ｂタイプ結合は、各構成単位が４位と６位または４位と８位の一カ所において互いに結合している結合様式をいう。本発明においては、式（Ｉ）における構成単位同士の結合すべてがＡタイプ結合である場合やＢタイプ結合である場合のみならず、Ａタイプ結合とＢタイプ結合が混在している場合も含まれる。各構成単位の結合は、すべて同一であっても、構成単位ごとに異なっていてもよい。
【００３６】
式（Ｉ）における各構成単位の結合様式の好ましい例は下記の通りである（カテキン、ガロカテキン、エピカテキン、エピガロカテキンにはガレート体も含まれる）。
【００３７】
エピカテキン／エピガロカテキン−（４β→８結合）−カテキン／ガロカテキン；
エピカテキン／エピガロカテキン−（４β→８結合）−エピカテキン／エピガロカテキン；
カテキン／ガロカテキン−（４α→８結合）−カテキン／ガロカテキン；
エピカテキン／エピガロカテキン−（４β→６結合）−エピカテキン／エピガロカテキン；
カテキン／ガロカテキン−（４α→６結合）−カテキン／ガロカテキン；
［エピカテキン／エピガロカテキン−（４β→８）］２−エピカテキン／エピガロカテキン；および
エピカテキン／エピガロカテキン−（２β→７，４β→８結合）−カテキン／ガロカテキン。
【００３８】
式（Ｉ）が表すプロアントシアニジンのうち好ましい例としては、
各構成単位が、同一または異なっていてもよく、
− Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、およびＲ６が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ３が水酸基を表し、Ｒ４およびＲ７が水素原子を表す（カテキン）か、
− Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、およびＲ６が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ４が水酸基を表し、Ｒ３およびＲ７が水素原子を表す（エピカテキン）か、
− Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、およびＲ６が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ３が式（ＩＩ）を表し、Ｒ４およびＲ７が水素原子を表す（カテキンガレート）か、
− Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、およびＲ６が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ４が式（ＩＩ）を表し、Ｒ３およびＲ７が水素原子を表す（エピカテキンガレート）か、
− Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ３が水酸基を表し、Ｒ４が水素原子を表す式（Ｉ）の化合物はガロカテキンに対応し、
− Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ４が水酸基を表し、Ｒ３が水素原子を表す（エピガロカテキン）か、
− Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６がＲ７が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ３が式（ＩＩ）を表し、Ｒ４が水素原子を表す（ガロカテキンガレート）か、
− Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ４が式（ＩＩ）を表し、Ｒ３が水素原子を表し（エピガロカテキンガレート）
ｎが５〜３０の整数を表し、
各構成単位の結合が、同一または異なっていてもよく、
エピカテキン／エピガロカテキン−（４β→８結合）−カテキン／ガロカテキン；
エピカテキン／エピガロカテキン−（４β→８結合）−エピカテキン／エピガロカテキン；
カテキン／ガロカテキン−（４α→８結合）−カテキン／ガロカテキン；
エピカテキン／エピガロカテキン−（４β→６結合）−エピカテキン／エピガロカテキン；
カテキン／ガロカテキン−（４α→６結合）−カテキン／ガロカテキン；
［エピカテキン／エピガロカテキン−（４β→８）］２−エピカテキン／エピガロカテキン；および
エピカテキン／エピガロカテキン−（２β→７，４β→８結合）−カテキン／ガロカテキン
から選択される（但し、カテキン、ガロカテキン、エピカテキン、エピガロカテキンにはガレート体も含まれる）、式（Ｉ）の化合物が挙げられる。
【００３９】
式（Ｉ）における各構成単位の結合様式の特に好ましい例は下記の通りである。
【００４０】
エピカテキン−（４β→８結合）−カテキン；
エピカテキン−（４β→８結合）−エピカテキン；
カテキン−（４α→８結合）−カテキン；
エピカテキン−（４β→６結合）−エピカテキン；
カテキン−（４α→６結合）−カテキン；
［エピカテキン−（４β→８）］２−エピカテキン；および
エピカテキン−（２β→７，４β→８結合）−カテキン。
【００４１】
式（Ｉ）が表すプロアントシアニジンのうち特に好ましい例としては、
各構成単位が、同一または異なっていてもよく、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６が水酸基を表し、かつＲ４およびＲ７が水素原子を表す（カテキン）か、あるいはＲ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６が水酸基を表し、かつＲ３およびＲ７が水素原子を表し（エピカテキン）、
ｎが５〜３０の整数を表し、
各構成単位の結合が、同一または異なっていてもよく、
エピカテキン−（４β→８結合）−カテキン；
エピカテキン−（４β→８結合）−エピカテキン；
カテキン−（４α→８結合）−カテキン；
エピカテキン−（４β→６結合）−エピカテキン；
カテキン−（４α→６結合）−カテキン；
［エピカテキン−（４β→８）］２−エピカテキン；および
エピカテキン−（２β→７，４β→８結合）−カテキン
から選択される、式（Ｉ）の化合物が挙げられる。
【００４２】
プロアントシアニジンは多くの植物に存在する成分であり、植物から抽出することにより調製することができる。プロアントシアニジンを植物から調製するための好ましい原料としては、ジャトバ、葡萄種子、クランベリー、シナモン、および松樹皮等が挙げられ、プロアントシアニジンの含有量の豊富な点からジャトバがより好ましい。プロアントシアニジンを含有する植物素材としては、例えば、ジャトバ樹皮乾燥粉末（有限会社エジソン・エス・アール・エル日本事務所）、クランベリー由来抽出物（「クランベリーパウダー」（キッコーマン（株））、葡萄種子由来抽出物（「グラビノールＳＬ」（キッコーマン（株））、松樹皮由来抽出物（有限会社素材機能研究所）、カカオ由来抽出物（「カカオポリフェノール」（明治製菓（株））が挙げられ、これらをそのまま、あるいは後述するように所望の程度に高重合度のものを適宜分画精製し、本発明による有効成分として用いることができる。
【００４３】
従って本発明では、「プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物」を有効成分として使用することができる。「プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物」としては、例えば、ジャトバ抽出物、葡萄種子抽出物、クランベリー抽出物、シナモン抽出物、松樹皮抽出物、カカオ抽出物が挙げられるが、プロアントシアニジン（特に重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン）を含有する限り、その素材は限定されない。
【００４４】
本発明において有効成分として用いる「プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物」は、好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジンを含有する植物素材の抽出物であることができる。
【００４５】
植物素材に含まれているプロアントシアニジンの構成成分を例示すると、表１の通りである。
【表１】
（表中、Ｒ１乃至Ｒ７は式（Ｉ）に対応し、ＥＣはエピカテキンを、ＣＡはカテキンを、ＥＣＧはエピカテキンガレートを、ＥＧＣＧはエピガロカテキンガレートを、Ｇはガレートをそれぞれ表す。）
本発明による有効成分であるプロアントシアニジンおよび抽出物を、前述したような植物原料から分画精製する方法として、具体的には、該植物原料をそのままもしくは粉砕後、抽出操作に供することによって調製することができる。抽出方法としては、例えば、溶媒中に植物原料あるいは、その粉砕物などを冷浸、温浸等によって浸漬する方法；加温し攪拌しながら抽出を行い、濾過して抽出液を得る方法；またはパーコレーション法等を挙げられる。得られた抽出液は、必要に応じてろ過または遠心分離によって固形物を除去した後、使用の態様により、そのまま用いるか、または溶媒を留去して一部濃縮若しくは乾燥して用いてもよい。また濃縮乃至は乾燥後、さらに非溶解性溶媒で洗浄して精製して用いても、またこれを更に適当な溶剤に溶解もしくは懸濁して用いることもできる。更に、本発明においては、例えば、上記のようにして得られた溶媒抽出液を、減圧乾燥、凍結乾燥等の通常の手段により抽出エキス乾燥物として使用することもできる。従って、本発明における「抽出物」には、抽出物そのもののみならず、抽出物の濃縮物や乾燥物も含まれる。
【００４６】
上記抽出に用いられる溶媒としては、例えば、水；メタノール，エタノール，プロパノールおよびブタノール等の炭素数１〜４の低級アルコール；酢酸エチルエステル等の低級アルキルエステル；エチレングリコール、ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなどのグリコール類；その他エチルエーテル、アセトン、酢酸等の極性溶媒；ベンゼンやヘキサン等の炭化水素；エチルエーテルや石油エーテルなどのエーテル類等の非極性溶媒の公知の有機溶媒が挙げられる。これら溶媒は、単独で用いてもよく、二種以上を組み合わせて使用することもできる。より好ましくは、熱水、エタノール、またはアセトン等を用いた抽出方法を挙げることができる。特に、平均重合度の高いプロアントシアニジン画分を分画する場合には、７０％アセトンあるいはエタノールによる抽出が有効である。更に特定平均重合度の画分を取得したい場合には、以下に述べるように７０％アセトンあるいはエタノール抽出物を酢酸エチル／水により抽出した後、水層画分をメタノールに再溶解し、Saucierらの方法（J Agric Food Chem 49, 5732-5735(2001)）に従いクロロホルムを用いた分画をおこなってもよい。即ち、プロアントシアニジンは重合度が高いほど低い濃度のクロロホルムで不溶となる性質を利用し、クロロホルム濃度を適宜変えていくことにより、所望の平均重合度の画分を得ることができる。従って本発明において「抽出物」は、好ましくは、水抽出物、エタノール抽出物、またはアセトン抽出物であることができる。
【００４７】
上記のような溶媒抽出／沈殿操作に加えて、さらに慣用の分画精製手段を採用しても良い。具体的には、プロアントシアニジンを吸着かつ溶離できる吸着剤、例えばスチレンージビニルベンゼン系の合成吸着樹脂、陰イオン交換樹脂、オクタデシル基化学結合型シリカゲル（ＯＤＳ）、ゲルろ過樹脂（Sephadex ＬＨ２０など）などが使用される。これらの吸着剤を充填したカラムに上記の清澄抽出液や清澄果汁液などを通すことによりプロアントシアニジンを吸着させ、洗浄後、それぞれに適した溶出液を通すことにより、プロアントシアニジンの分画精製を行なうことができる。また、分子量分画膜を用いた膜分離法等を用いることもできる。
【００４８】
各種抽出分画方法は特定重合度のプロアントシアニジンのみを得る目的で、あるいは、医薬や食品として用いる場合に安全性、物性、風味等の点で好ましくない成分あるいは溶媒を除去する目的でも使用することができる。
【００４９】
本発明によれば、Ｔｈ１サイトカイン産生抑制活性を有する画分の製造法であって、
（ａ）プロアントシアニジンを含有する植物原料を抽出操作に付す工程；および
（ｂ）工程（ａ）で得られた抽出画分を限外濾過操作に付して、ケーキ（濾滓）を得る工程
を含んでなる、製造法が提供される。
【００５０】
工程（ａ）の抽出操作および植物原料は前記の通りである。工程（ａ）の抽出操作においては好ましくは極性溶媒を用いることができ、特に、エタノール、水、含水アセトンが好ましい。植物原料としては好ましくはプロアントシアニジンを含有する植物を用いることができる。
【００５１】
工程（ａ）においては、抽出液を溶媒留去して抽出画分を得、次いで、この抽出画分を非極性有機溶媒（例えば、酢酸エチル）／水を用いた抽出操作に付すことにより、水溶性画分とすることができる。あるいは、工程（ａ）で得られた抽出画分をそのまま工程（ｂ）の限外濾過操作に付してもよい。
【００５２】
工程（ｂ）の限外濾過操作においては、Ｔｈ１サイトカイン産生抑制活性を有する画分が限外濾過膜に残存するように（すなわち、限外濾過膜を透過しないように）、カットオフ値を設定することができる。Ｔｈ１サイトカイン産生抑制活性とプロアントシアニジンの重合度の関係は上記した通りであり、限外濾過膜を透過する物質の分子量とカットオフ値との関係は当業者に周知であることから、当業者であれば製造すべきプロアントシアニジンの種類に応じて限外濾過膜のカットオフ値を適宜設定することができる。例えば、少なくとも５以上の重合度のプロシアニジンが高いＴｈ１サイトカイン産生抑制活性を有し、重合度５のプロシアニジンの分子量は約１４４２であることから、例えば、カットオフ値を１４００と設定することができる。
【００５３】
工程（ｂ）の後、必要に応じてケーキに含まれるプロアントシアニジンの重合度を測定してもよい。重合度は質量分析法（Jan F. Stevens et al., J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 3435-3443）により測定することができる。またチオール開裂分析法（Sylvain Guyot, Nathalie Marnet, and Jean-Francois Drilleau, J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 14-20）により平均重合度を測定してもよい。プロアントシアニジンの重合度を測定することにより、Ｔｈ１サイトカイン産生抑制活性を有する画分の製造を確認することができる。
【００５４】
本発明による有効成分であるプロアントシアニジンは、重合度が４以上、好ましくは５以上である。従って、植物からプロアントシアニジンを調製する場合、元来重合度が４以上あるいは５以上のプロアントシアニジンを含有する抽出物の場合はそのまま有効成分として、あるいは後述実施例に示した活性測定法により活性を指標にするか、あるいは重合度を指標にして更に有効成分を分画・精製して使用することができる。また、平均重合度が３以下の抽出物についても、後述実施例に示した活性測定法により活性を指標にするかあるいは重合度を指標にして重合度が４以上の有効成分を多く含むものを分画・精製し使用することができる。医薬組成物あるいは食品中において、複数の重合度のプロアントシアニジンを含む場合は、平均重合度として４以下のものであっても、４以上の重合度のものを有効量含有している限り本発明の範囲内であるが、平均重合度が約４以上のプロアントシアニジンをより好ましくは用いることができる。
【００５５】
プロアントシアニジンは植物からの抽出以外に、有機化学合成により調製してもよい（例えば、Swain et al., 1954. Chem Ind, 1144、Eastmond., 1974. J Inst Brew 80, 188. Kozikowski AP et al., 2003、 J Org Chem 68, 1641-1658、および特表２００２−５４２２４０号公報参照）。
【００５６】
用途
本発明において用いられるプロアントシアニジンおよびジャトバ等の特定植物の抽出物は、Ｔｈ１偏向させた脾臓細胞においてＴｈ１サイトカイン（具体的には、ＩＦＮ−γ）産生を抑制し、細胞性免疫過多の状況を改善・抑制する。従って、本発明による医薬組成物は、Ｔｈ１サイトカイン産生の抑制が治療に有効である疾患の治療に有効である。
【００５７】
Ｔｈ１サイトカインの産生抑制が治療に有効である疾患としては、例えば、Ｔｈ１サイトカイン依存型自己免疫疾患が挙げられる。本発明において「Ｔｈ１サイトカイン依存型自己免疫疾患」とは、細胞性免疫依存型自己免疫疾患を含む意味で用いられるものとする。
【００５８】
Ｔｈ１依存型自己免疫疾患としては、多発性硬化症（ＭＳ）、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、若年性糖尿病やＩ型糖尿病等のインスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎（ＡＴ）、自己免疫性ブドウ膜網膜炎（ＡＵＲ）、橋本病、乾癬症、クローン病、および円形脱毛症が挙げられる。
【００５９】
Ｔｈ１依存型自己免疫疾患では、炎症局所へのリンパ球（Ｔｈ１細胞）の浸潤や血中でのＴｈ１サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γやＴＮＦ−α）の濃度亢進が認められている（Skurkovich B & Skurkovich S, Curr Opin Mol Ther. 2003 Feb;5(1):52-7; Fuss, I.J., et al, J. Immunol. 157:1261(1996); Gherardo M., et al, European Journal of Endocrinology(2003) 148 383-388）。更に、抗ＩＦＮ−γ抗体や抗ＴＮＦ−α抗体を使用することにより自己免疫疾患の症状が実際に改善することが報告されている（Skurkovich B & Skurkovich S, Curr Opin Mol Ther. 2003 Feb;5(1):52-7）。従って、これらの疾患の原因因子であるＴｈ１サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γやＴＮＦ−α）を抑制することは、これらの疾患の治療に有効である。
【００６０】
本発明において用いられる高重合度プロアントシアニジンは、自己抗体が誘導されたマウスにおいて自己抗体の産生を抑制する（実施例３０）。本発明において用いられる高重合度プロアントシアニジンを含有する抽出物は、自己抗体産生と密接な関連性を有するＢ細胞の活性化を抑制する（実施例２５）。従って、本発明による医薬組成物は、自己抗体の産生抑制やＢ細胞の活性化の抑制が治療に有効である疾患の治療に有効である。
【００６１】
自己抗体の産生抑制やＢ細胞の活性化の抑制が治療に有効である疾患としては、自己抗体媒介型自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、自己免疫性溶血性貧血、シェーグレン症候群、急性リウマチ熱、尋常性天疱瘡、自己免疫性血小板減少性紫斑病、および混合型本態性クリオグロブリン血症）が挙げられる。
【００６２】
自己抗体媒介型自己免疫疾患では、自己抗体の産生あるいは産生亢進や、Ｂ細胞の活性化が認められている（Clin.Exp.Immunol.,1985:62:639-46; N.Engl.J.Med.,338:1359）。更に、Ｂ細胞の活性化の抑制が自己抗体産生に起因する自己免疫疾患の治療に有効であること（Int. Immunol.,2001:13(7):921-31）、自己反応性Ｂ細胞の増殖阻害と全身性エリテマトーデスの改善が一致すること（J.Clin.Invest.,2000:106(1):91-101）が報告されている。従って、これらの疾患の原因因子である自己抗体の産生を抑制することや自己抗体の産生に密接に関連するＢ細胞の活性化を抑制することは、これらの疾患の治療に有効である。本発明において「自己抗体の産生抑制」とは、自己抗体の産生と密接に関連するＢ細胞の活性化の抑制を含む意味で用いられるものとする。
【００６３】
本発明において用いられるプロアントシアニジンはＴｈ１サイトカインの産生を抑制することができる。従って本発明は、Ｔｈ１サイトカインの産生が本質的な原因である疾患を根治でき、あるいはその疾患の進行を阻害できる点で、対症療法的に用いられる治療剤よりも有利である。特に慢性関節リウマチについては、炎症の抑制や痛みの軽減といった対症療法的に用いられる従来の治療剤とは異なり、根治治療することあるいは疾患の進行を阻害することが可能となる点で、本発明は有利であると言える。プロアントシアニジンによる慢性関節リウマチの根治治療は、実施例２８および２９において慢性関節リウマチモデルマウスにおいて臨床スコアが改善されたとともに、実施例３０においてリウマチ抗体（自己抗体）の産生が抑制されたことからも裏付けられている。また、プロアントシアニジンによる慢性関節リウマチの病状の進行阻害は、実施例２８および２９において慢性関節リウマチモデルマウスにおいて一次免疫成立後においても臨床スコアが改善されたとともに、実施例３０においてリウマチ抗体（自己抗体）の産生が抑制されたことからも裏付けられている。
【００６４】
慢性関節リウマチにおいては、疾患の初期においてＴ細胞（具体的にはＴｈ１細胞）が活性化され、それに伴って症状が発現しはじめること、疾患の中期あるいは慢性期において、活性化したＴ細胞によりＢ細胞の自己抗体産生が促され、異常に産生された自己抗体により症状の慢性化、重篤化に至ることが報告されている（Cin Exp Immunol 1998; 111:521-526; Springer Semin Immunopathol. 2003 Aug;25(1):3-18; Immunol Rev. 1990 Dec;118:193-232）。またマウスにおいてＩｇＧレベルを低下させることによりリウマチが抑制されたことが報告されている（Ann Rheum Dis.,2003,62:707-14）。上記のようにプロアントシアニジンはＴｈ１サイトカインを抑制し、Ｔｈ１細胞の活性化を抑制するとともに、Ｔｈ１細胞活性化により刺激された自己抗体であるリウマチ抗体の産生を実際に抑制した。また本発明による有効成分は、自己抗体産生と密接な関連性を有するＢ細胞の活性化を抑制した。従って、本発明において用いられるプロアントシアニジンは、慢性関節リウマチの初期の病状のみならず、慢性化、重篤化した病状の治療に用いることができる点でも有利である。
【００６５】
従って本発明によれば、（ｉ）重合度が４以上のプロアントシアニジン（好ましくは、重合度が５以上のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン）、または（ii）プロアントシアニジン（好ましくは、重合度が５以上のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン）を含有する植物素材の抽出物を有効成分として含んでなる、慢性関節リウマチの根治治療剤およびその進行阻害剤が提供される。
【００６６】
本発明によればまた、治療上の有効量の（ｉ）重合度が４以上のプロアントシアニジン（好ましくは、重合度が５以上のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン）、または（ii）プロアントシアニジン（好ましくは、重合度が５以上のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン）を含有する植物素材の抽出物を、必要であれば薬学上許容される担体とともに哺乳類に投与することを含んでなる、慢性関節リウマチを根治治療する方法およびその進行を阻害する方法が提供される。
【００６７】
本発明によればまた、慢性関節リウマチの根治治療剤およびその進行阻害剤の製造のための、（ｉ）重合度が４以上のプロアントシアニジン（好ましくは、重合度が５以上のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン）、または（ii）プロアントシアニジン（好ましくは、重合度が５以上のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン）を含有する植物素材の抽出物の使用が提供される。
【００６８】
本発明において「治療」とは、疾患の改善、調節、遅延、予防（特に、発症の予防および再発予防）を含む意味で用いられる。
【００６９】
医薬組成物および食品組成物
本発明による治療剤は、前述した本発明による有効成分であるプロアントシアニジン、あるいは、それを含有した植物エキスや該エキスからの部分精製物を、有効成分として用い、生理学的に許容されうる担体、賦形剤、結合剤、希釈剤などと混合することにより製造できる。本発明による治療剤は、経口または非経口的に投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤が挙げられる。非経口剤としては、注射剤（例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤）、点滴剤、外用剤（例えば、経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤）、坐剤（例えば、直腸坐剤、膣坐剤）が挙げられる。これらの製剤は、当分野で通常行われている手法により、薬学的に許容される担体（例えば、賦形剤、添加剤）とともに製剤化することができる。薬学的に許容される賦形剤や添加剤としては、担体、結合剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤等が挙げられる。薬学的に許容される担体としては、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、澱粉、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ワックス、カカオバター等が挙げられる。
【００７０】
製剤は、例えば下記のようにして製造できる。
【００７１】
経口剤は、有効成分として、例えば賦形剤（例えば、乳糖、白糖、デンプン、マンニトール）、崩壊剤（例えば、炭酸カルシウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム）、結合剤（例えば、α化デンプン、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリビニールピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース）または滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール６０００）を添加して圧縮成形し、次いで必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性の目的のため自体公知の方法でコーティングすることにより製造することができる。コーティング剤としては、例えばエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートおよびオイドラギット（ローム社製、ドイツ、メタアクリル酸・アクリル酸共重合物）などを用いることができる。
【００７２】
注射剤は、有効成分を分散剤（例えば、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０（アトラスパウダー社製、米国）、ＨＣＯ ６０（日光ケミカルズ製）、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウムなど）、保存剤（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコール、クロロブタノール、フェノール）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、ソルビトール、ブドウ糖、転化糖）などと共に水性溶剤（例えば、蒸留水、生理的食塩水、リンゲル液等）あるいは油性溶剤（例えば、オリーブ油、ゴマ油、綿実油、コーン油などの植物油、プロピレングリコール）などに溶解、懸濁あるいは乳化することにより製造することができる。この際、所望により溶解補助剤（例えば、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウム）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン）等の添加物を添加してもよい。
【００７３】
外用剤は、有効成分を固状、半固状または液状の組成物とすることにより製造することができる。例えば、上記固状の組成物は、有効成分をそのまま、あるいは賦形剤（例えば、ラクトース、マンニトール、デンプン、微結晶セルロース、白糖）、増粘剤（例えば、天然ガム類、セルロース誘導体、アクリル酸重合体）などを添加、混合して粉状とすることにより製造できる。上記液状の組成物は、注射剤の場合とほとんど同様にして製造できる。半固状の組成物は、水性または油性のゲル剤、あるいは軟骨状のものがよい。また、これらの組成物は、いずれもｐＨ調節剤（例えば、炭酸、リン酸、クエン酸、塩酸、水酸化ナトリウム）、防腐剤（例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウム）などを含んでいてもよい。坐剤は、有効成分を油性または水性の固状、半固状あるいは液状の組成物とすることにより製造できる。該組成物に用いる油性基剤としては、高級脂肪酸のグリセリド〔例えば、カカオ脂、ウイテプゾル類（ダイナマイトノーベル社製）〕、中級脂肪酸〔例えば、ミグリオール類（ダイナマイトノーベル社製）〕、あるいは植物油（例えば、ゴマ油、大豆油、綿実油）が挙げられる。水性基剤としては、ポリエチレングリコール類、プロピレングリコールが挙げられる。また、水性ゲル基剤としては、天然ガム類、セルロース誘導体、ビニール重合体、アクリル酸重合体が挙げられる。
【００７４】
製剤化に当たっては、本発明による有効成分以外の１種またはそれ以上の医療上有効な有効成分を更に添加・配合してもよい。また本発明による有効成分の投与に当たっては、本発明による有効成分以外の１種またはそれ以上の医療上有効な有効成分を組み合わせて投与してもよい。このような他の有効成分としては、抗炎症剤、消炎鎮痛剤、免疫抑制剤、その他の自己免疫疾患治療剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。抗炎症剤としては、ステロイド抗炎症剤、非ステロイド抗炎症剤が挙げられる。ステロイド抗炎症剤としては、酢酸コルチゾン、ヒドロコルチゾン、酢酸パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾロン、メチルプレドニン、デキサメタゾン、トリアムシノロン、ベタメタゾンが挙げられる。非ステロイド抗炎症剤としては、アスピリン、ジフルニサル、アスピリン・アスコルビン酸、アスピリンダイアルミネートなどのサリチル酸系非ステロイド抗炎症剤；ジクロフェナクナトリウム、スリンダク、フェンブフェン、インドメタシン、インドメタシンファルネシル、アセメタシン、マレイン酸プログルメタシン、アンフェナクナトリウム、ナブメトン、モエゾラク、エトドラグなどのアリール酸系非ステロイド抗炎症剤；メフェナム酸、フルフェナム酸アルミニウム、トルフェナム酸、フロクタフェニンなどのフェナム酸系非ステロイド抗炎症剤；イブプロフェン、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセン、プラノプロフェン、フェノプロフェンカルシウム、チアプロフェン、オキサプロジン、ロキソプロフェン、ナトリウム、アルミノプロフェン、ザルトプロフェンなどのプロピオン酸系非ステロイド抗炎症剤；ピロキシカム、アンピロキシカム、テノキシカム、ロルノキシカム、メロキシカムなどのオキシカム系非ステロイド抗炎症剤；塩酸チアラミド、エピリゾール、エモルファゾンなどの塩基性非ステロイド抗炎症剤が挙げられる。免疫抑制剤としては、サイクロスポリン、ＦＫ５０６が挙げられる。その他の自己免疫疾患治療剤としては、インターフェロンβなどの多発性硬化症治療剤が挙げられる。
【００７５】
本発明による有効成分を、抗炎症剤、消炎鎮痛剤、免疫抑制剤などの他の有効成分と組み合わせることにより、治療活性がより強化された多機能性治療剤を提供することができる。特に、本発明による有効成分を、抗炎症剤や消炎鎮痛剤などの自己免疫疾患の対症療法に用いられる薬剤と併用することにより、自己免疫疾患の根本治療と対症治療が期待できる治療剤を提供することができる。また、本発明による有効成分を、免疫抑制剤などの根本治療が期待される薬剤と組み合わせることにより、自己免疫疾患の根本治療効果が強化された治療剤を提供することができる。慢性関節リウマチの治療に当たっては、本発明による有効性成分をコンドロイチンやムコ多糖を主成分とするグルコサミンと組み合わせてて投与してもよい。
【００７６】
本発明による治療剤は、医薬品への適用のみならず、食品への適用も意図されている。従って、本発明による治療剤の食品への適用に当たっては、後述するような食品に関する記述を参照することができる。
【００７７】
本発明による食品は、本発明による有効成分であるプロアントシアニジンを有効量含有した食品である。ここで「有効成分を有効量含有した」とは、個々の飲食品において通常喫食される量を摂取した場合に、後述するような範囲で有効成分が摂取されるような含有量をいう。本発明による食品には本発明による有効成分をそのままあるいは上記のような組成物の形態で、食品に配合することができる。より具体的には、本発明による食品は、前述した本発明による有効成分であるプロアントシアニジン、あるいはそれを含有した植物抽出物や該抽出物からの部分精製物をそのまま、飲食品として調製したもの、各種タンパク質、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類等を更に配合したもの、液状、半液体状若しくは固体状にしたもの、ペースト状のもの、一般の飲食品へ添加したものであってもよい。本発明において「食品」は、医薬以外のものであって、哺乳動物が摂取可能なものであればその形態に特に制限はない。
【００７８】
本発明において「食品」とは、健康食品（例えば、特定保健用食品、栄養機能食品、栄養補助食品）、機能性食品、病者用食品を含む意味で用いられる。
【００７９】
また「食品」の形態は特に限定されるものではなく、例えば、飲料の形態であってもよい。
【００８０】
本発明によれば、重合度が少なくとも４のプロアントシアニジンを、成人１人１日当たり５０〜２０００ｍｇ（好ましくは、４００〜２０００ｍｇ）の摂取量となるように含んでなる、健康食品が提供される。
【００８１】
本発明によればまた、重合度が少なくとも５のプロアントシアニジンを、成人１人１日当たり５０〜２０００ｍｇ（好ましくは、４００〜２０００ｍｇ）の摂取量となるように含んでなる、健康食品が提供される。
【００８２】
上記健康食品に含有されるプロアントシアニジンは、ジャトバ抽出物、葡萄種子抽出物、クランベリー抽出物、シナモン抽出物、松樹皮抽出物、およびカカオ抽出物からなる群から選択される抽出物であって、重合度が少なくとも４あるいは少なくとも５のプロアントシアニジンを含む抽出物の形態で提供されてもよい。
【００８３】
上記健康食品はまた、通常の食品の形状であっても、栄養補助食品の形状（例えば、サプリメント）であってもよい。
【００８４】
本発明による有効成分は、Ｔｈ１偏向させた脾臓細胞においてＴｈ１サイトカイン（具体的には、ＩＦＮ−γ）の産生を抑制し、細胞性免疫過多の状況を改善・抑制作用を有する。本発明による有効成分はまた、自己抗体が誘導されたマウスにおいて自己抗体の産生を抑制する。このため、日常摂取する食品やサプリメントとして摂取する健康食品や機能性食品に本発明の有効成分あるいはジャトバ等の抽出物を添加・配合することにより、Ｔｈ１サイトカイン産生抑制機能、自己抗体産生抑制機能、またはＴｈ１サイトカイン産生増大に関連する状態や自己抗体産生に関連する状態の改善または緩和機能、特に自己免疫疾患の治療機能を併せ持つ食品を提供することができる。
【００８５】
従って、本発明によれば、（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン（好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン）、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物（好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジンを含有する植物素材の抽出物）を有効成分として含む、Ｔｈ１サイトカイン産生抑制機能、自己抗体産生抑制機能、またはＴｈ１サイトカイン産生増大に関連する状態や自己抗体産生に関連する状態（例えば、Ｔｈ１サイトカイン依存型自己免疫疾患や自己抗体媒介型自己免疫疾患に特徴的な全身の強張りや関節の違和感）の改善または緩和機能が表示された食品が提供される。このような表示は、食品の本体、容器、包装、説明書、添付文書、または宣伝物のいずれかに付すことができる。
【００８６】
本発明によれば、（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン（好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン）、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物（好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジンを含有する植物素材の抽出物）を有効量含んでなる食品であって、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制が治療に有効である疾患および／または自己抗体の産生抑制が治療に有効である疾患の治療、それらの疾患の根治治療、および／またはそれらの疾患の進行阻害に用いられる食品が提供される。
【００８７】
本発明によればまた、（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン（好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン）、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物（好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジンを含有する植物素材の抽出物）を有効量含んでなる食品であって、Ｔｈ１サイトカイン産生抑制機能、Ｔｈ１サイトカイン産生増大に関連する状態の改善または緩和機能、自己抗体産生抑制機能、または自己抗体産生に関連する状態の改善または緩和機能を有する食品が提供される。
【００８８】
本発明によれば更に、（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物であって、Ｔｈ１サイトカイン産生抑制機能、Ｔｈ１サイトカイン産生増大に関連する状態の改善または緩和機能、自己抗体産生抑制機能、または自己抗体産生に関連する状態の改善または緩和機能を有する抽出物を含んでなる食品が提供される。
【００８９】
本発明による食品は、Ｔｈ１サイトカイン産生抑制機能、自己抗体産生抑制機能、またはＴｈ１サイトカイン産生増大に関連する状態や自己抗体産生に関連する状態の改善または緩和機能等の機能を期待する消費者に適した食品、すなわち、特定保健用食品、として提供することができる。ここでいう特定保健用食品とは、Ｔｈ１サイトカイン産生抑制、自己抗体産生抑制、またはＴｈ１サイトカイン産生増大に関連する状態や自己抗体産生に関連する状態の改善または緩和等を目的として食品の製造または販売等を行う場合に、保健上の観点から、各国において法上の何らかの制限を受けることがある食品をいう。
【００９０】
本発明の有効成分あるいはジャトバ等の抽出物の添加・配合の対象である日常摂取する食品としては、飯類、麺類、パン類およびパスタ類等炭水化物含有飲食品；クッキーやケーキなどの洋菓子類、饅頭や羊羹等の和菓子類、キャンディー類、ガム類、ヨーグルト、プリン、ゼリーなどの冷菓や氷菓などの各種菓子類；ジュースや清涼飲料水、乳飲料等の各種飲料；卵を用いた加工品、魚介類（イカ、タコ、貝、ウナギなど）や畜肉（レバー等の臓物を含む）の加工品（珍味を含む）などを例示することができるが、これらに特に制限されない。
【００９１】
本発明のより好ましい態様によれば、添加・配合の対象である食品としては、飲料（例えば、茶飲料、乳飲料）、ヨーグルトが挙げられる。
【００９２】
ここで茶飲料とは、ツバキ科の常緑樹である茶樹の葉（茶葉）、または茶樹以外の植物の葉もしくは穀類等を煎じて飲むための飲料をいい、発酵茶、半発酵茶および不発酵茶のいずれも包含される。茶飲料の具体例としては、日本茶（例えば、緑茶、麦茶）、紅茶、ハーブ茶（例えば、ジャスミン茶）、中国茶（例えば、中国緑茶、烏龍茶）、ほうじ茶等が挙げられる。
【００９３】
ここで乳飲料とは、生乳、牛乳等またはこれらを原料として製造した食品を主原料とした飲料をいい、牛乳等そのもの材料とするものの他に、例えば、栄養素強化乳、フレーバー添加乳、加糖分解乳等の加工乳を原料とするものも包含される。
【００９４】
またヨーグルトには、ハードタイプ、ソフトタイプ、ドリンクタイプのいずれのものも包含され、さらにヨーグルトを原料とする加工ヨーグルト製品も包含される。
【００９５】
本発明の有効成分あるいはジャトバ等の抽出物の添加・配合の対象である日常摂取する食品としてはまた、プロアントシアニジンを元来含有する食品が挙げられる。本発明の有効成分あるいはジャトバ等の抽出物を、プロアントシアニジンを元来含有する食品に添加・配合することにより、Ｔｈ１サイトカイン産生抑制機能、自己抗体産生抑制機能、またはＴｈ１サイトカイン産生増大に関連する状態や自己抗体産生に関連する状態の改善または緩和機能を強化することができる。ここで「強化」とは、食品に当初から含まれている有効成分の量が、期待される機能の発現に必要とされる量以上となるように本発明による有効成分あるいは抽出物を添加・配合することをいう。また、「プロアントシアニジンを元来含有する食品」としては、例えば、クランベリージュースやクランベリージャムなどのクランベリー製品；チョコレート菓子、ココアなどのカカオ製品；シナモンスティック、シナモンシュガー、シナモンガム、シナモンティーなどのシナモン製品が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９６】
本発明の有効成分あるいはジャトバ等の抽出物の添加・配合の対象であるサプリメントとして摂取する健康食品や機能性食品の形態としては、例えば、ジュースや茶のような飲料、ゼリー、カプセル、顆粒剤、粒剤、ペーストが挙げられる。本発明の有効成分あるいはジャトバ等の抽出物を、単独で、あるいは他の成分（例えば、植物素材）と組み合わせて、飲料、ゼリー、カプセル、顆粒剤、粒剤、ペーストなどの形態に加工することによりで、Ｔｈ１サイトカイン産生抑制機能、自己抗体産生抑制機能、またはＴｈ１サイトカイン産生増大に関連する状態や自己抗体産生に関連する状態の改善または緩和機能を有するサプリメントなどの健康食品や機能性食品として提供することができる。特に、本発明による有効成分以外の成分であって、抗炎症作用、消炎鎮痛作用、または免疫抑制作用があるとされる他の成分と組み合わせることによって、Ｔｈ１サイトカイン産生増大に関連する状態や自己抗体産生に関連する状態の改善または緩和機能をより強化することができる。抗炎症作用、消炎鎮痛作用、または免疫抑制作用があるとされる他の成分は公知の成分から選択することができる。抗炎症作用を有する成分としては、アリシン、カプサイシン、ブロメリン、硫化アリルが挙げられる。これらの成分は植物素材に含まれており、例えば、アリシンを含む植物素材としては、玉ねぎ、にら、にんにく、ニラ、葉ねぎが、カプサイシンを含む植物素材としては、唐辛子が、ブロメリンを含む植物素材としては、パイナップルが、硫化アリルを含む植物素材としては、あさつき、にんにく、エシャロット、ねぎ、葉ねぎ、ニラ、らっきょうが、それぞれ挙げられる。また、免疫抑制作用を有する成分としてはグリチルレチン酸が挙げられ、グリチルレチン酸を含む植物素材としては、カンゾウが挙げられる。また、リウマチに効果があるとされる雷公藤；I型糖尿病に効果があるとされる人参湯；多発性硬化症に効果があるとされるカンラン；乾癬症に効果があるとされるPolypodium Leucotomos等の植物素材を組み合わせることができる。また、本発明による機能以外の機能を発揮する他の成分あるいは他の機能性食品と組み合わせることによって、多機能性の食品を提供することができる。
【００９７】
本発明において提供される飲料（飲料形態の健康食品や機能性食品を含む）の製造に当たっては、通常の飲料の処方設計に用いられている糖類、香料、果汁、食品添加剤などを適宜添加することができる。飲料の製造に当たってはまた、当業界に公知の製造技術を参照することができ、例えば、「改訂新版ソフトドリンクス」（株式会社光琳）を参考とすることができる。
【００９８】
本発明の好ましい態様によれば、重合度が少なくとも５のプロアントシアニジン（好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン）を、Ｔｈ１サイトカイン産生抑制機能、自己抗体産生抑制機能、またはＴｈ１サイトカイン産生増大に関連する状態や自己抗体産生に関連する状態の改善または緩和機能の強化等を目的として、プロアントシアニジンを元来含有する食品へ添加・配合することができる。
【００９９】
本発明による有効成分または抽出物を、そのまま食用に供する場合や、あるいは一般食品の原料に添加・配合して食品とする場合は、有効成分の苦みが食品の味に影響しない範囲で用いるか、または苦味がマスクされるような工夫をすることが好ましい。例えば、有効成分または抽出物を、カプセルに注入するか、あるいは適当なコーティング剤でコーティングすることにより、苦味をマスクすることができる。カプセル化された形態としてはゼラチンカプセル、プルランカプセルが挙げられる。コーティングされた形態としては糖衣錠が挙げられる。
【０１００】
本発明による食品は様々な形態を取ることができ、公知の医薬品の製造技術に準じて本発明による食品を製造してもよい。その場合には、本発明による治療剤の製造の項目において述べたような担体や製剤用添加剤を用いて製造することができ、具体的には、経口剤の欄に記載された担体や製造用添加剤を用いて製造することができる。
【０１０１】
本発明による有効成分であるプロアントシアニジンは、人類が食品として長年摂取してきたカカオやブドウ類に多く含まれていることから、毒性も低く、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル等）に対し安全に用いることができる。
【０１０２】
本発明による治療剤および食品を投与あるいは摂取する場合、本発明による有効成分の投与量または摂取量は、受容者、受容者の年齢および体重、症状、投与時間、剤形、投与方法、薬剤の組み合わせ等に依存して決定できる。例えば、本発明による有効成分を医薬として経口投与する場合、プロアントシアニジン量として成人１人１日当たり５０〜５０００ｍｇ、好ましくは５０〜２０００ｍｇ、非経口的に投与する場合は５〜５００ｍｇ、好ましくは５〜２００ｍｇの範囲で投与することができる。本発明による有効成分と組み合わせて用いる他の作用機序を有する薬剤も、それぞれ臨床上用いられる用量を基準として適宜決定できる。また、食品として摂取する場合には、成人１人１日当たり５０〜５０００ｍｇの範囲、好ましくは５０〜２０００ｍｇの範囲の摂取量となるよう本発明による有効成分を食品に配合することができる。
【０１０３】
本発明による治療剤の好ましい態様によれば、（ｉ）重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン、または（ii）重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジンを含有する植物素材の抽出物を有効成分として含んでなる、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制が治療に有効である疾患（特に、Ｔｈ１サイトカイン依存型自己免疫疾患）の治療剤、それらの疾患の根治治療剤、およびそれらの疾患の進行阻害剤が提供される。
【０１０４】
本発明の好ましい態様によればまた、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制が治療に有効である疾患（特に、Ｔｈ１サイトカイン依存型自己免疫疾患）の治療剤、それらの疾患の根治治療剤、およびそれらの疾患の進行阻害剤の製造のための、（ｉ）重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン、または（ii）重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジンを含有する植物素材の抽出物の使用が提供される。
【０１０５】
本発明の好ましい態様によればまた、治療上の有効量の（ｉ）重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン、または（ii）重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジンを含有する植物素材の抽出物を、必要であれば薬学上許容される担体とともに哺乳類に投与することを含んでなる、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制が治療に有効である疾患（特に、Ｔｈ１サイトカイン依存型自己免疫疾患）の治療方法、その疾患の根治治療方法、およびその疾患の進行阻害方法が提供される。
【０１０６】
Ｔｈ１サイトカインの産生抑制剤および自己抗体産生抑制剤
本発明によれば、（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン（好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン）、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物（好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジンを含有する植物素材の抽出物）を有効成分として含んでなる、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制剤が提供される。
【０１０７】
本発明によればまた、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制剤の製造のための（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン（好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン）、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物（好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジンを含有する植物素材の抽出物）の使用が提供される。
【０１０８】
本発明によればまた、有効量の（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン（好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン）、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物（好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジンを含有する植物素材の抽出物）を哺乳類に投与することを含んでなる、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制方法が提供される。
【０１０９】
Ｔｈ１サイトカインは、好ましくは、ＩＦＮ−γである。
【０１１０】
Ｔｈ１サイトカインの産生抑制剤は、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制を目的とした医薬品への適用のみならず、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制を目的とした食品への適用も意図されている。従って、本発明によるＴｈ１サイトカインの産生抑制剤の実施に当たっては、前記のような治療剤に関する記述および食品に関する記述を参照することができる。
【０１１１】
本発明によれば、（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン（好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン）、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物（好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジンを含有する植物素材の抽出物）を有効成分として含んでなる、自己抗体の産生抑制剤が提供される。
【０１１２】
本発明によればまた、自己抗体の産生抑制剤の製造のための、（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン（好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン）、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物（好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジンを含有する植物素材の抽出物）の使用が提供される。
【０１１３】
本発明によればまた、有効量の（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン（好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン）、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物（好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジンを含有する植物素材の抽出物）を哺乳類に投与することを含んでなる、自己抗体の産生抑制方法が提供される。
【０１１４】
自己抗体の産生抑制剤は、自己抗体の産生抑制を目的とした医薬品への適用のみならず、自己抗体の産生抑制を目的とした食品への適用も意図されている。従って、本発明による自己抗体の産生抑制剤の実施に当たっては、前記のような治療剤に関する記述および食品に関する記述を参照することができる。
【０１１５】
検定方法
本発明によれば、試料中のプロアントシアニジンの重合度を測定する工程を含んでなる、Ｔｈ１サイトカイン産生抑制活性の検定方法であって、４以上の重合度のプロアントシアニジンの検出がＴｈ１サイトカイン産生抑制活性を示すことを特徴とする方法が提供される。
【０１１６】
検定の対象である試料としては、例えば、植物原料由来の抽出物や乾燥粉末が挙げられる。植物原料としては、プロアントシアニジンを含む植物原料のみならず、プロアントシアニジンの含有が不明な植物原料も含まれる。抽出物としては、例えば、水や有機溶媒による抽出物が挙げられる。
【０１１７】
検定の対象である試料としてはまた、合成されたプロアントシアニジンやプロアントシアニジンが含有されているか不明な試料が挙げられる。
【０１１８】
プロアントシアニジンの重合度は、例えば、電子スプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）やマトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）により測定することができる。
【０１１９】
本発明による検定方法では、試料中に５以上の重合度のプロアントシアニジンが含まれているか否かを指標にすることができる。実施例３１および図５０に示されたように、重合度が５以上のプロアントシアニジンはＥＡＥモデルマウスにおいて高い治療活性を示す。従って、このような指標を採用することにより、試料が強いＴｈ１サイトカイン産生抑制活性を有するか否かを検定することができる。
【０１２０】
本発明による検定方法ではまた、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制が治療に有効である疾患の治療活性の検定に用いることができる。
【実施例】
【０１２１】
以下実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によりその技術的範囲が限定されるものではない。
【０１２２】
実施例１：Ｔｈ１偏向マウス脾臓細胞を用いた各種アマゾンハーブ抽出物のＩＦＮ−γ産生抑制能の検討
一連のアマゾンハーブについてＴｈ１偏向させたマウスの脾臓細胞を用いて、インビトロにおけるＩＦＮ−γ産生抑制能を検討した。
【０１２３】
１．実験方法
（１）試料
サマンバイア（Polypodium lepidopteris）、ジャトバ（Hymenaea courbaril）、キャッツクロー（Uncaria tomentosa）、シジウム（Psidium guajava）、ヘルゴンサッチャ（Dracontium loretense Krause）の市販乾燥粉末（有限会社エジソン・エス・アール・エル日本事務所）１０ｇにエタノールを２００ｍＬ加え、一晩攪拌した。ろ過後、溶媒を留去し、エタノール抽出物を得た（表２）。抽出物をそれぞれ１％エタノールに溶解し、投与試料とした。
【０１２４】
表２：本発明の実施例において、サマンバイア、ジャトバ、キャッツクロー、シジウム、そしてヘルゴンサッチャのエタノール抽出物重量を示す。
【表２】
【０１２５】
（２）実験動物
６−８週齢、雄性、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（チャールズリバー社）に第０日目と第７日目に卵白アルブミン（ＯＶＡ、生化学工業(株)）１ｍｇをcomplete freund’s adjuvant（シグマ社）にMycobacterium tuberculosis H37 Ra（Difco社）を０．８ｍｇ添加したもの（以下、ＣＦＡと表記する。）に混合し、エマルジョン化したものを腹腔内投与した。第１４日目に解剖し、常法に従い、脾細胞を調製した。
【０１２６】
（３）脾細胞ＩＦＮ−γの測定
ＩＦＮ−γの測定はＯｐｔＥＩＡ ＥＬＩＳＡ Ｓｅｔ（ベクトン・ディッキンソン社）を用いて測定した。
【０１２７】
（４）実験条件
実験動物の方法で調製した脾細胞をＲＰＭＩ１６４０（シグマ社）＋１０％ ＦＣＳ（ロシュ社）＋１ｍｇ ＯＶＡ培地で５×１０６細胞／ｍｌになるように懸濁し、２００μｌ／ウェルで９６穴プレートに分注した。さらに試験する各ハーブ抽出物を１００あるいは５００μｇ／ｍｌで添加した。１週間後に培養上清を回収し、Ｔｈ１サイトカインとしてＩＦＮ−γを測定した。
【０１２８】
２．実験結果
結果を表３に示す。サマンバイアにはＩＦＮ−γ産生抑制能は見られず、むしろ上昇した。他のハーブ抽出物でも同様なＩＦＮ−γ産生の上昇が見られた。ジャトバでのみ、顕著なＩＦＮ−γ産生抑制が見出された。
【０１２９】
表３：Ｔｈ１偏向させたマウスの脾臓細胞を用いて、抗原特異的に産生されたＴｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γに対する各種アマゾンハーブの抑制、または亢進活性を示す。
【表３】
【０１３０】
実施例２：インビトロにおけるジャトバ抽出物IFN-γ抑制活性の濃度依存性検討
実験１によってＩＦＮ−γ抑制活性をインビトロで示したジャトバ抽出物について濃度依存性を検討した。
【０１３１】
１．実験方法
（１）投与試料
ジャトバ乾燥粉末１００ｇに５００ｍＬのエタノールを加え、一晩、室温で攪拌した。ろ過後、残渣を再度同量エタノールで抽出した。ろ液を濃縮乾固し、２７．２ｇのエタノール抽出物を得た。抽出物を１％エタノールに溶解し、投与試料とした。
【０１３２】
（２）実験動物
実施例１と同様にＯＶＡをＣＦＡでエマルジョン化したものをＣ５７ＢＬ／６に２回免疫し、Ｔｈ１偏向マウスを作製した。
【０１３３】
（３）脾細胞ＩＦＮ−γの測定
ＩＦＮ−γの測定はＯｐｔＥＩＡ ＥＬＩＳＡ Ｓｅｔ（ベクトン・ディッキンソン社）を用いて測定した。
【０１３４】
（４）実験条件
脾細胞はＲＰＭＩ１６４０（シグマ社）＋１０％ ＦＣＳ（ロシュ社）＋１００μｇ／ｍｌ ＯＶＡ培地で３７℃、５％ＣＯ２の条件で１週間培養し、培養上清を回収し、ＩＦＮ−γ濃度測定を行った。ジャトバ抽出物の添加濃度は０（コントロール）、１５．５，３１，６２．５，１２５，２５０，５００μｇ／ｍｌとした。
【０１３５】
２．実験結果
７日後の培養上清中ＩＦＮ−γ濃度を表４に示す。コントロール（ジャトバ無添加）でＯＶＡ添加によって強いＩＦＮ−γ産生が見られた。ジャトバ濃度依存的にＩＦＮ−γ産生は抑制され、１２５μｇ／ｍｌ以上で殆ど産生は見られなくなった。以上の結果、ジャトバはインビトロにおいてＴｈ１サイトカインを抑制する活性があることが示された。これは細胞性免疫過多によって起こる自己免疫疾患の予防・治療に有効である可能性を示す。
【０１３６】
表４：Ｔｈ１偏向させたマウスの脾臓細胞を用いて、抗原特異的に産生されたＴｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γに対するジャトバの抑制活性の容量依存性を示す。
【表４】
【０１３７】
実施例３：実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルを用いたジャトバ抽出物のインビボでの効果Ｉ
ジャトバ抽出物のインビボでの効果を明らかにするために、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルマウスで検討した。ＥＡＥモデルマウスは、ヒト多発性硬化症のモデルとして用いられている（Antel JP., 1999. J Neuroimmunol 100, 181-189）。
【０１３８】
１．実験方法
（１）投与試料
実施例２で調製したものを用いた。
【０１３９】
（２）実験動物
Ｃ５７ＢＬ／６、雄性、６−８週齢のマウスに対して、第０日目にMyelin oligodendrocyte glycoprotein peptide（以下「ＭＯＧペプチド」と表記する：キアゲン社）２００μｇをＣＦＡ ８００μｇと混合して、エマルジョン化したものを皮下投与し、第１日目と第３日目に百日咳毒素（ＰＴＸ：Calbiochem社）２００ｎｇを腹腔内投与することにより実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘導した。試験期間を通じてマウスは標準固形飼料ＣＥ−２（アメリカ国立栄養研究所による標準組成）を供与された。飲用水は水道水を用いた。
【０１４０】
（３）実験条件
Ｃ５７ＢＬ／６、雄性、６−８週齢を１群１０匹でコントロール群、２０ｍｇ／ｋｇ群、５０ｍｇ／ｋｇ群、および５０ｍｇ／ｋｇ前投与群に分けた。コントロール群は第０日目にＭＯＧ抗原投与後、第３０日目まで週３回１％エタノールを腹腔内投与した。２０ｍｇ／ｋｇ群、５０ｍｇ／ｋｇ群は第０日目にＭＯＧ抗原投与後、第３０日目まで週３回ジャトバを所定量投与した。５０ｍｇ／ｋｇ前投与群はＭＯＧ抗原投与２週間前から合計７回ジャトバを５０ｍｇ／ｋｇで投与し、抗原感作後は１％エタノールに切り替えた。実験スケジュールを図２に示す。
【０１４１】
（４）臨床スコアのつけ方
スコア０：正常、スコア１：尾の麻痺、スコア２：正向不全、スコア３：後肢片方麻痺、スコア４：両後肢麻痺、スコア５：前後肢麻痺、スコア６：死亡で、第５５日目まで毎日各個体の臨床スコア（clinical score）を記録した。
【０１４２】
（５）Ｅｘ ｖｉｖｏ ＩＦＮ−γ，ＴＮＦ−α産生能測定
第１２日目で各群５匹を解剖し、脾細胞を調製した。脾細胞はＲＰＭＩ１６４０（シグマ社）＋１０％ ＦＣＳ（ロシュ社）±ＭＯＧ２μＭで培養し、１週間培養後の上清についてＩＦＮ−γ濃度を、１０日後培養上清についてＴＮＦ−α濃度を測定した。ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αの測定はＯｐｔＥＩＡ ＥＬＩＳＡ Ｓｅｔ（ベクトン・ディッキンソン社）を用いた。
【０１４３】
（６）脊髄病理切片の作製と脱髄の観察
脊髄の脱髄がジャトバによって抑制されるかを検討するために、組織切片の作製と観察を行った。第１５日目のコントロール群およびジャトバ群のマウスから脊髄を摘出し、２０％のホルマリン溶液中で固定後、パラフィン包埋して５μｍ切片をミクロトームＲＭ２１４５（ライカ社）にて作製した。切片を脱パラフィン後、ルクソールファストブルー溶液（武藤化学薬品社）で髄鞘染色し、水洗い後、コールドシッフ試薬で細胞質を染色した。最後にヘマトキシリンで核を染色し、顕微鏡下で観察した。
【０１４４】
２．実験結果
臨床スコアの平均値の経時変化グラフを図３に示す。コントロール群では第９日目で発症が始まり、第１６日目で平均スコアが３．５を上回った。２０ｍｇ／ｋｇ群では第１５日目近辺で発症が始まり、第２１日目前後でピークの平均スコア１．５になったが、その後症状は回復した。５０ｍｇ／ｋｇでは発症しなかった。また、５０ｍｇ／ｋｇ前投与群では第３０日目前後で発症し、第４１日目にピークの平均スコアが２程度になったが、その後回復した。以上の結果、ジャトバは明確なＥＡＥ発症抑制効果を持つ事が明らかになった。またＥＡＥ誘導前に投与しておくと、発症が３週間遅延するという予防効果もあることが明らかになった。
【０１４５】
Ｅｘ ｖｉｖｏサイトカイン産生量を図４に示す。ＩＦＮ−γについてはコントロール群で６０，０００ｐｇ／ｍｌと高濃度の産生が見られているが、２０ｍｇ／ｋｇ群では３０，０００ｐｇ／ｍｌ前後と半減し、５０ｍｇ／ｋｇ群では５０００ｐｇ／ｍｌ前後と激減した。ＴＮＦ−αについても、コントロール群で１８０ｐｇ／ｍｌ前後であったのが、２０ｍｇ／ｋｇ群で１１０ｐｇ／ｍｌ前後と減り、５０ｍｇ／ｋｇ群で２０ｐｇ／ｍｌ前後と激減した。さらに、脊髄切片のルクソールファストブルー染色による観察結果を図５に示した。コントロール群脊髄切片写真を見ると、脱髄による青く染色されない個所（切片写真中の組織右側個所）が観察されるのに対し、ジャトバ群ではそのような脱髄が抑制されていることが明らかである。以上の結果はジャトバがＴｈ１サイトカイン産生を強く抑制し、ＥＡＥの症状を抑制したことを示している。
【０１４６】
実施例４：ＥＡＥモデルを用いたジャトバ抽出物のインビボでの効果ＩＩ
実施例３の効果がマウス種によらないことを示す為、実施例３とは異なったマウス種を用いて、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルによる検討を行った。
【０１４７】
１．実験方法
（１）投与試料
実施例２で調製したものを用いた。
【０１４８】
（２）実験動物
ＳＪＬ／Ｊ、雄性、８−１０週齢のマウス（購入先：チャールスリバー社）に対して、Proteolipid protein peptide（以下「PLPペプチド」と表記する：キアゲン社）１００μｇをＣＦＡ ８００μｇにエマルジョン化したものを皮下投与し、第１日目と第３日目にＰＴＸ２００ｎｇを腹腔内投与することにより実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘導した。飼料および飲用水は実施例３と同様のものを用いた。
【０１４９】
（３）実験条件
ＳＪＬ／Ｊ、雄性、８−１０週齢を１群１０匹でコントロール群、５０ｍｇ／ｋｇ群を設定した。抗原およびジャトバ抽出物の投与法・時期は実施例３の実験に準じた。
【０１５０】
（４）Ｅｘ ｖｉｖｏ ＩＦＮ−γ，ＴＮＦ−α産生能測定
実施例３と同様に実施した。但し、培養時に添加する抗原は２μＭＰＬＰペプチドとした。
【０１５１】
２．実験結果
前記実施例３とは異なったマウス種であるＳＪＬ／Ｊにおいても、図６に示すようにｅｘ ｖｉｖｏでのＩＦＮ−γ産生はジャトバ投与によって殆ど見られなくなっており、ジャトバのＥＡＥ抑制効果はマウス種によらないことが明らかになった。
【０１５２】
実施例５：ＥＡＥモデルを用いたジャトバ抽出物単回前投与によるインビボでの効果
ジャトバ投与によるＥＡＥ発症予防について単回前投与による検討を行なった。
【０１５３】
１．実験方法
（１）投与試料
実施例２のジャトバエタノール抽出物を用いた。
【０１５４】
（２）実験動物
実施例３で示したＣ５７ＢＬ／６マウスをＭＯＧ抗原で免疫する方法でＥＡＥを誘導した。一群は１０匹で、第１２日目に半数を解剖した。
【０１５５】
（３）実験条件
ジャトバ５０ｍｇ／ｋｇを、第０日目にＭＯＧ抗原を投与する前である第−１日目に、一回腹腔内投与する。
【０１５６】
（４）Ｅｘ ｖｉｖｏ ＩＦＮ−γ産生能測定
第１２日目で５匹を解剖し、脾細胞を調製した。脾細胞はＲＰＭＩ１６４０（シグマ社）＋１０％ ＦＣＳ（ロシュ社）±ＭＯＧ２μＭで培養し、１週間培養後の上清についてＩＦＮ−γ濃度を測定した。ＩＦＮ−γの測定はＯｐｔＥＩＡ ＥＬＩＳＡ Ｓｅｔ（ベクトン・ディッキンソン社）を用いた。
【０１５７】
２．実験結果
ＥＡＥの臨床スコア平均値の経時変化では、コントロール群が第９日目に発症したのに対して、１回前投与した場合２日の遅れが観察された（図７Ａ）。以上の結果、前記実施例３の複数回前投与よりは効果が劣るものの１回投与のみでも効果が認められた。本実施例および前記実施例３の前投与の結果を踏まえると、回数の増加と共に予防効果は増大することが示唆された。脾細胞のＩＦＮ−γ産生能は１回予防投与でも、著しく減少することが示された（図７Ｂ）。
【０１５８】
実施例６：ジャトバ抽出物の成分検討（Ｉ）
ジャトバ抽出物の活性成分の特性を明らかにするために、ジャトバ抽出物をポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）で吸着処理し、非吸着画分の活性を実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルで検証した。
【０１５９】
１．実験方法
（１）投与試料
実施例２のジャトバエタノール抽出物３．４９ｇを水５００ｍＬに溶解し、ポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ シグマ社）５０ｇを加えて一晩攪拌した。その後吸引濾過し、凍結乾燥を行ない、４２０．３ｍｇのＰＶＰＰ処理物、すなわちＰＶＰＰ非吸着画分を得た。
【０１６０】
（２）実験動物
実施例３で示したＣ５７ＢＬ／６マウスをＭＯＧ抗原で免疫する方法でＥＡＥを誘導した。一群は１０匹で、第１２日目に半数を解剖した。
【０１６１】
（３）実験条件
コントロール群は第３０日目まで週３回１％エタノールを腹腔内に注射した。ジャトバ群はジャトバエタノール抽出物を、ジャトバＰＶＰＰ処理群はＰＶＰＰ処理したジャトバエタノール抽出物をそれぞれ週３回、５０ｍｇ／ｋｇで投与した。
【０１６２】
（４）Ｅｘ ｖｉｖｏ ＩＦＮ−γ，ＴＮＦ−α産生能測定
第１２日目で各群５匹を解剖し、脾細胞を調製した。脾細胞はＲＰＭＩ１６４０（ＳＩＧＭＡ）＋１０％ ＦＣＳ（ロシュ）±ＭＯＧ２μＭで培養し、１週間培養後の上清についてＩＦＮ−γ濃度を、１０日後培養上清についてＴＮＦ−α濃度を測定した。ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αの測定はＯｐｔＥＩＡ ＥＬＩＳＡ Ｓｅｔ（ベクトン・ディッキンソン）を用いた。
【０１６３】
２．実験結果
結果を図８に示す。コントロール群は第１３日目に発症し、ジャトバ群は第２１日目まで発症しなかった。ジャトバＰＶＰＰ処理群は第１５日目に発症した。脾細胞のＩＦＮ−γ，ＴＮＦ−α産生能はジャトバ群では顕著に抑制されたが、ジャトバＰＶＰＰ処理群では殆どコントロール群と変わらなかった（図９）。以上の結果、ＰＶＰＰ処理によってジャトバの活性は著しく減弱しており、従って、ジャトバの活性成分はＰＶＰＰに吸着することが明らかになった。ＰＶＰＰはポリフェノールを強力に吸着する性質を有し、ポリフェノールの除去剤として知られている（Loomis, W.D., Battaile, J., 1966. Phytochem. 5, 423-438., Loomis, W.D., 1969. In: Lowenstein, J.M., (Ed.), Methods in enzymology Vol. 13. Academic Press, New York, pp. 555-563. Loomis, W.D., 1974. In: Fleischer, S., Packer, L., (Eds.), Methods in enzymology Vol. 31. Academic Press, New York, pp. 528-544.）。ジャトバエタノール抽出物の８８％がＰＶＰＰに吸着したことから、ジャトバ抽出物の８８％はポリフェノールであり、そして活性成分もポリフェノールである可能性が示唆された。
【０１６４】
実施例７：ジャトバ抽出物の成分検討（ＩＩ）
実施例６より、ジャトバの活性成分はポリフェノールである可能性が示唆された。活性本体をさらに追求する目的で、ジャトバエタノール抽出物について以下の実験を実施した。
【０１６５】
１．実験方法
（１）塩酸−ブタノール法
ジャトバエタノール抽出物を文献（J. Agric. Food Chem. 1998, 46, 1698-1705）の方法に従い、塩酸−ブタノール法に供した。すなわちジャトバエタノール抽出物の４ｍｇ／ｍＬメタノール溶液を調製し、その２５０μＬに、５％塩酸を含む１−ブタノール１．５ｍＬと、２％硫酸アンモニウムを含む２Ｎ塩酸５０μＬを添加し、９５℃で５０分反応させた。反応液を室温に戻し、５５０ｎｍにおける吸光度を測定した。測定の対照には、ジャトバエタノール抽出物４ｍｇ／ｍＬ（メタノール溶液）を用いた。
【０１６６】
（２）順相カラムクロマトグラフィ（ＮＰ−ＨＰＬＣ）
ジャトバエタノール抽出物を文献（Journal of Chromatography A. 1993. 255-260）の方法に従い、ＮＰ−ＨＰＬＣに供した。ポンプおよび制御装置はShimazu LC-10Advp、UV検出器はShimazu SPD-10Aを用いた。カラム条件を以下に示す。
【０１６７】
カラム：Ｆｉｎｅｐａｋ ＳＩＬ−５ φ４．６×２５０ｍｍ（日本分光）
移動相：
（Ａ）ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２：ＨＣＯＯＨ：Ｈ２Ｏ＝７：４１：１：１３
（Ｂ）ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２：ＨＣＯＯＨ：Ｈ２Ｏ＝４３：７：１：１
移動相グラジェント条件：
時間（分） Ａ溶媒（％） Ｂ溶媒（％）
０ ９５ ５
１０ ８５ １５
３５ ８０ ２０
３７ ７７ ２３
４０ ７７ ２３
４２ ７０ ３０
４５ ５０ ５０
４６ ０ １００
５０ ０ １００
移動相流速：１ｍＬ／分
検出波長：２８０ｎｍ
（３）電子スプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）
ジャトバエタノール抽出物をＥＳＩ−ＭＳに供した。装置はサーモクエスト社ＬＣＱを用いた。測定条件は、インフュージョン法、陰イオンモード、流速６μｌ／分， Sheath gas flow rate 60 arb, Spray voltage 4.5 kV, Capillary temp 200 ℃とした。
【０１６８】
（４）マトリックス支援レーザー脱離イオン化―飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）
ジャトバエタノール抽出物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供した。装置はPerSeptive Biosystems, voyagerを用い、マトリックスとして２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）を用いた。
【０１６９】
２．実験結果
（１）プロアントシアニジンは酸性条件下における加熱処理により、フラバン間の結合が切断され、エクステンションユニットに由来するカルベニウムイオンと、ターミナルユニットに由来するカテキン類を与える。前者はさらに酸化されて赤色のアントシアニジンになる。この原理を利用した呈色法が塩酸−ブタノール法であり、５５０ｎｍにおける吸光度の上昇をして試料中のプロアントシアニジンを鋭敏に検出できる。本法によってジャトバエタノール抽出物は赤色化し、５５０ｎｍにおける吸光度は２．７２となった。このことから、ジャトバに含有されるポリフェノールはプロアントシアニジンであることが明らかとなった。
【０１７０】
（２）ＮＰ−ＨＰＬＣは、プロアントシアニジンのオリゴマー成分を溶出ピークとして検出することができる。しかし、より高重合度の成分はカラムに強く吸着されるために、溶出後半に特徴的なブロード型のクロマトグラムを与える。ジャトバエタノール抽出物のクロマトグラムは８本の溶出ピークと、それに続く特徴的なブロード形状を示したので、プロアントシアニジンのオリゴマーのみならず、より高重合度成分の存在を示唆した。
【０１７１】
（３）ＥＳＩ−ＭＳでは装置の測定限界として分子量２０００までの成分しか観測できなかったが、図１０Ａに示すように、２８８ずつ増加していく分子イオンピークが５本観測された。すなわちジャトバのプロアントシアニジンは、分子量２８８の繰り返し構造を有していた。この分子量はカテキンまたはエピカテキンに相当し、かつガレートの付加がないことを示す。以上のことから、ジャトバエタノール抽出物の主成分はプロアントシアニジンのうち、プロシアニジンであることが明らかとなった。
【０１７２】
（４）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳでは、ＥＳＩ−ＭＳでは観測することができなかった、さらなる高分子領域に属する高重合度プロシアニジンの存在が確認された。すなわち図１０Ｂに示したように、プロシアニジン２０量体以上にまで及ぶ分子イオンピークが観測された。
【０１７３】
実施例８：ジャトバ抽出物の成分検討（III）
実施例７により、ジャトバのエタノール抽出物の主成分がプロシアニジンであることが示された。構成単位の同定、結合様式、重合度の算出、および定量分析を精密に行なう目的で、Guyotらの方法（Sylvain Guyot, Nathalie Marnet, and Jean-Francois Drilleau, J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 14-20）に基づき、チオール開裂分析を行なった。
【０１７４】
１．実験方法
（１）チオール開裂、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）分析
ジャトバエタノール抽出物を４ｍｇ／ｍＬのメタノール溶液に調製し、その２５μＬに３．３％塩酸含有メタノールを２５μＬ、５％トルエン−α−チオール（シグマ社）５０μＬを添加し、４０℃で３０分反応させた後、反応液をそのままＲＰ−ＨＰＬＣに供し、分析した。ポンプはHITACHI L-7100、UV検出器はShimazu SPD-10Aを用いた。カラム条件を以下に示す。
【０１７５】
カラム：ディスカバリー Ｃ１８φ４．６×２５０ ｍｍ（スペルコ社）
移動相：（Ａ）２．５％酢酸／水（ｖ／ｖ）、（Ｂ）アセトニトリル
移動相グラジェント条件：
時間（分） Ａ溶媒（％） Ｂ溶媒（％）
０ ９７ ３
５ ９１ ９
１５ ８４ １６
４５ ５０ ５０
５５ ０ １００
移動相流速：０．６ｍＬ／分
検出波長：２８０ｎｍ
（２）液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ−ＭＳ）による反応物の同定
チオール開裂反応液中にはトルエン−α−チオールが残存するために、反応液をそのままＬＣ−ＭＳに供することができない。そこでまず（１）のＲＰ−ＨＰＬＣにおいてそれぞれのピークを分取し、ＬＣ−ＭＳに供した。ＬＣ部分のポンプはWaters 2690 allianceを使用し、検出は多波長検出器（Waters 996）で行なった。カラム条件を以下に示す。
【０１７６】
カラム：ＹＭＣ Ｐａｃｋ Ｃ１８φ４．６×２５０ ｍｍ
移動相：（Ａ）１％ＨＣＯＯＨ／水（ｖ／ｖ）、（Ｂ）ＭｅＯＨ
移動相グラジェント条件：
時間（分） Ａ溶媒（％） Ｂ溶媒（％）
０ ９０ １０
５ ８４ １６
４５ ５０ ５０
５０ ０ １００
移動相流速：１ｍＬ／分
検出波長：２００−４００ｎｍ
ＭＳのイオン化モードはＥＳＩとし、装置はWaters micromass ZQ2000を用いた。
【０１７７】
（３）トルエン−α−チオール付加に伴うモル吸光係数（ε）値の補正
エピカテキンにトルエン−α−チオールが付加することに伴う２８０ ｎｍにおけるε値の変化を、エピカテキン二量体であるプロシアニジンＢ２を用いて算出した。すなわちプロシアニジンＢ２を（１）の条件でチオール開裂し、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析に供した。
【０１７８】
（４）平均重合度の算出と定量分析
（１）、（２）、および（３）の結果に基づき、ジャトバエタノール抽出物に含まれるプロアントシアニジンの平均重合度と含量を算出した。
【０１７９】
２．実験結果
（１）図１１に示すように、プロアントシアニジンはチオール開裂によって、ターミナルユニットに由来する単量体成分と、エクステンションユニットに由来するベンジルチオエーテル付加体を与えるので、これらをＲＰ−ＨＰＬＣで分離、同定、定量することができる。ジャトバエタノール抽出物のチオール開裂を行なった結果、図１２に示すように、２１．６分と４２．８分に２本のピークが認められた。前者はエピカテキン（ＥＣ）と溶出位置が一致した。これら２本以外には、いかなるピークをも与えなかった。
【０１８０】
Ａタイプ結合はチオール開裂反応で開裂せず、残存する。そのため、もしＡタイプ結合があれば、チオール開裂により、Ａタイプで結合した二量体のベンジルチオエーテル付加体が生成され、ＲＰ−ＨＰＬＣで検出される。チオール開裂分析の結果より、ジャトバのプロシアニジンにはＡタイプ結合は存在せず、従ってＢタイプ結合のみで構成されていることが明らかとなった。
【０１８１】
（２）（１）で検出されたピークをＬＣ−ＭＳによって同定した。すなわちこれら２本のピークは、プロシアニジンＢ２のチオール開裂産物であるＥＣ、およびＥＣのベンジルチオエーテル付加体（ＥＣ−ＢＴＥ）とＬＣ溶出位置および分子量がそれぞれ一致した。（１）と（２）の結果から、ジャトバのプロシアニジンはＥＣのみを構成単位とすることが明らかとなった。
【０１８２】
（３）プロシアニジンＢ２をチオール開裂に供すると、ターミナルユニットに由来するＥＣと、エクステンションユニットに由来するＥＣ−ＢＴＥを等モル比で生成する。ＲＰ−ＨＰＬＣで検出される両成分の２８０ｎｍにおける吸光度すなわちピーク面積値を比較することにより、ＥＣにトルエン−α−チオールが付加することに伴う２８０ｎｍにおけるε値の変化を算出した。その結果、ＥＣのε：ＥＣ−ＢＴＥのε＝１：１．２であった。
【０１８３】
（４）（３）の結果に基づき、ジャトバエタノール抽出物に含まれるプロシアニジンの平均重合度を、以下のように計算した。
【０１８４】
平均重合度＝（Ｔ＋Ｅ／１．２）／Ｔ
Ｔ＝ターミナルユニットのピーク面積
Ｅ＝エクステンションユニットトルエン−α−チオール付加体のピーク面積
その結果、ジャトバエタノール抽出物中に含まれるプロシアニジンの平均重合度は、６．８と算出された。
【０１８５】
チオール開裂反応生成物であるＥＣとＥＣ−ＢＴＥを定量分析することによって、ジャトバエタノール抽出物中のプロシアニジン含量を求めることができる。定量分析に必要なチオール開裂の反応率は、プロシアニジンＢ２を外部標準として用い、生成したＥＣを定量することで求めた。反応率は概して８３％であった。その結果、ジャトバエタノール抽出物中のプロシアニジン含量を７６．０％（ｗ／ｗ）と算出した。
【０１８６】
実施例９：ジャトバのプロシアニジンの分画・分析
実験方法および結果
（１）抽出および分画
ジャトバ市販乾燥粉末２０ｇにエタノール（ＥｔＯＨ）５００ｍＬを加え、一晩、室温で攪拌した。ろ過後、残渣を再度同量ＥｔＯＨで抽出した。ろ液を濃縮乾固し、抽出物６．９７ｇを得た。この抽出物を１００ｍＬの水に再溶し、等量の酢酸エチルで３回抽出した。それぞれを溶媒留去し、水画分５．９３ｇ、酢酸エチル画分８９４ｍｇを得た。水画分をメタノール（ＭｅＯＨ）に再溶し、Saucierらの方法（J. Agric. Food Chem., 2001. 49: 5732- 5735）に基づき、クロロホルム（ＣＨＣｌ３）を順次加え、生じた沈殿を分別した。本法により、プロシアニジンを重合度別に分画することができる。酢酸エチル画分はＣ１８カラムによる固相抽出を行ない、さらに２つの画分に分別した。すなわち最初にジエチルエーテル（ＤＥＥ）で溶出してＦｒ．７を、次いでＭｅＯＨで溶出してＦｒ．６を得た。それぞれの画分の重量を図１３に示した。
【０１８７】
（２）ジャトバ抽出物ならびに各画分の分析
得られた分画物について、プロシアニジンの平均重合度と含量をチオール開裂分析により算出した（方法は実施例８を参照）。図１３に示した通り、本法によって平均重合度を異にするプロシアニジン画分を容易に調製することができた。
【０１８８】
実施例１０：ＥＡＥモデルを用いたジャトバ由来分画サンプルのＩＦＮ−γ抑制活性
実施例９で分画されたサンプルをＥＡＥモデルマウスに腹腔内投与し、脾細胞のＩＦＮ−γ抑制活性を検討した。
【０１８９】
１．実験方法
（１）投与試料
実施例２のジャトバエタノール抽出物および実施例９で分画された分画物Ｆｒ．１−７を使用した。
【０１９０】
（２）実験条件
Ｃ５７ＢＬ／６、雄性、６週齢を１群３匹でコントロール群、ジャトバ群（未分画）、Ｆｒ１−Ｆｒ７群に分けた。コントロール群は第０日目にＭＯＧ抗原投与後、第０，２，４，７，９日目の合計５回、１％エタノールを腹腔内投与した。ジャトバ群は同じスケジュールで５０ｍｇ／ｋｇ投与した。各フラクションは同じスケジュールで５０ｍｇ／ｋｇで投与した。第１１日目に剖検し、脾細胞をＭＯＧと共培養し、培養上清中のＩＦＮ−γ産生量をＥＬＩＳＡにて測定した。
【０１９１】
２．実験結果
結果を図１４に示す。コントロール群では約２００００ｐｇ／ｍｌのＩＦＮ−γ産生が見られたが、ジャトバ群では殆ど産生が見られなかった。Ｆｒ５−７ではコントロールに比べ、若干のＩＦＮ−γ産生が見られた。Ｆｒ１−４においては殆どＩＦＮ−γの産生がなかった。以上の結果、自己免疫疾患の増悪因子であるＩＦＮ−γ産生を抑制する活性は、平均重合度６．５以上で顕著に強い活性を有し、重合度が高い程同活性は高くなることが示唆された。
【０１９２】
実施例１１：ジャトバ抽出物の成分検討（IV）
実施例８ではジャトバに含まれるプロシアニジンの構成単位の同定、結合様式の決定、重合度の算出、および定量分析を精密に行なう目的でチオール開裂分析を行なった。プロシアニジンの平均重合度および定量分析をさらに厳密に行なう目的で、エピカテキン（ＥＣ）のトルエン−α−チオール付加誘導体（ＥＣ−ＢＴＥ）を精製・単離し、高分解能質量分析（ＨＲ−ＭＳ）と核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）に供し、構造の同定を行なった後、これを標品としてＨＰＬＣ分析を行なった。精製・単離された標品を用いて分析を行うことにより、より精密に、プロシアニジンの構成単位の同定、結合様式の決定、重合度の算出を行うことができた。
【０１９３】
１．実験方法
（１）ＥＣ−ＢＴＥの単離・精製
実施例９で調製したＦｒ．１を実施例８の手法でチオール開裂を行ない、反応物をＨＰＬＣに供し、ＥＣ−ＢＴＥのピークを分取した。カラム条件を以下に示す。
【０１９４】
カラム Ｃａｄｅｎｚａ ＣＤ−Ｃ１８ C18 φ１０×２５０ ｍｍ（インタクト社）
移動相 メタノール：水：ギ酸（５０：４９．８：０．２、ｖ／ｖ／ｖ）
移動相流速 ２ｍＬ／分
検出波長 ２８０ｎｍ
（２）ＥＣ−ＢＴＥの構造同定
前項で得たＥＣ−ＢＴＥを、まず精密分子量を得る目的でＨＲ−ＭＳに供した。装置はＪｅｏｌＪＭＳ−７００（日本電子株式会社）を用い、イオン化モードは高速原子衝撃（ＦＡＢ）とし、イオン化電圧は７０ｅＶとした。また、文献値とシグナルを比較するためにプロトンＮＭＲスペクトルを測定した。装置はＶａｒｉａｎ社製ＵＮＩＴＹ ＩＮＯＶＡ−５００（５００ＭＨｚ）を用いた。
【０１９５】
（３）プロシアニジンのＨＰＬＣ分析
得られたＥＣ−ＢＴＥを標品とし、実施例８に示した条件でＨＰＬＣ分析を行ない、プロシアニジンの平均重合度と含量を算出した。平均重合度は以下のように計算した。
【０１９６】
平均重合度＝（Ｔ＋Ｅ）／Ｔ
Ｔ＝ターミナルユニット（ＥＣ）のモル量
Ｅ＝エクステンションユニット（ＥＣ−ＢＴＥ）のモル量
含量は試料中のプロシアニジン量をＥＣ換算した重量％で求めた。
【０１９７】
２．実験結果
（１）６６ｍｇのＦｒ．１より１０．８ｍｇのＥＣ−ＢＴＥを得た。
【０１９８】
（２）ＨＲ−ＭＳの結果、ＭＨ＋として４１３．１０６１のイオンピークが観測され、分子式がＣ２２Ｈ２１Ｏ６Ｓと定まり、ＥＣ−ＢＴＥと一致した。またプロトンＮＭＲスペクトル（図１５）も文献値（Chem. Pharm. Bull., 40, 889-898, 1992）と一致し、さらに１Ｈ−Ｄｅｔｅｃｔｅｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｂｏｎｄ Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｃｏｈｅｒｒｅｎｃｅ（ＨＭＢＣ）スペクトルにおいて、ベンジルチオールのＳＣＨ２部位のプロトンからフラバン環４位カーボンへの遠隔相関シグナルが観測されたので（図１６）、ベンジルチオールはフラバン環４位に付加していることが証明され、以上の事実からＥＣ−ＢＴＥ構造が完全に同定された。
【０１９９】
（３）ＥＣ−ＢＴＥを標品として用いてＨＰＬＣ分析を行なった結果得られたプロシアニジンの平均重合度と含量を図１７に示した。
【０２００】
実施例１２：プロシアニジン含有試料の調製と分析（Ｉ）
実施例１０より、ジャトバの活性本体が特定重合度以上のプロシアニジンであることが明らかになったので、更にプロシアニジンを含有する他素材の探索を行った。
【０２０１】
１．試料
市販の素材である、グラビノールＳＬ（キッコーマン株式会社）、ポリフェノン（東京テクノフード株式会社）、アップルフェノン（ニッカウヰスキー株式会社）、クランベリーパウダー（キッコーマン株式会社）、カカオポリフェノール（明治製菓株式会社）、松樹皮エキス（有限会社素材機能研究所）、シナモン粉末（ヱスビー食品株式会社）を試料として用いた。
【０２０２】
２．実験方法
（１）シナモン試料の調製
シナモン粉末３０．５ｇをエタノール３００ ｍＬで抽出し、得られたエタノール抽出物を濃縮乾固した後、５０％メタノール／水に再溶し、等量のクロロホルムで４回抽出した。含水メタノール画分を溶媒留去後、１％エタノール／水による抽出を行なった。
【０２０３】
（２）クランベリー試料の調製
クランベリーパウダーより、高重合度プロシアニジンを含有する試料を調製した。すなわちクランベリーパウダー９ｇを水６００ｍＬに溶解し、セファデックスＬＨ−２０樹脂を充填したカラム（φ２．６ｃｍ×７２ｃｍ）に供した。５ｍＬ／分の流速で１Ｌずつの水、メタノールで溶出した後、最後に１Ｌの７０％アセトン／水で溶出した。このカラムクロマトグラフィを３回実施した。
【０２０４】
（３）プロシアニジン分析
実施例８のチオール開裂分析法により、各試料および（１）で調製したシナモン試料、（２）で調製したクランベリー試料に含有されるプロシアニジンを定量し、平均重合度、構成成分、結合様式を決定した。また試料によってはフラバン環３位水酸基へのガレート付加があったので、それに伴う２８０ｎｍにおけるモル吸光係数（ε）値の変化を、エピカテキン（ＥＣ）とエピカテキンガレート（ＥＣＧ）を用いて算出した。
【０２０５】
３．実験結果
（１）シナモンエタノール抽出物を３．９１ｇ得た。分配後の含水メタノール画分１．４５ｇより、１％エタノール／水可溶画分６３５ｍｇが得られ、これをシナモン試料とした。
【０２０６】
（２）合計２７ｇのクランベリーパウダーより、水画分２０．８ｇ、メタノール画分３０３ｍｇ、含水アセトン画分２１７ｍｇを得た。チオール開裂分析法により、含水アセトン溶出画分を高重合度プロシアニジン画分とした。
【０２０７】
（３）各試料に含まれるプロシアニジンの分析結果は表５のようになった。ジャトバについては実施例８を参照。ガレート付加体とその修飾体のピーク同定は、実施例８の１．（２）と同様に液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によって行なった。ＥＣとＥＣＧの２８０ｎｍにおけるε値の比は１：３．１であったので、ガレート付加体を定量する際にはピーク面積を３．１で除算し、補正した。
【０２０８】
表５：本発明の実施例において、ジャトバ、グラビノールＳＬ、ポリフェノン、アップルフェノン、クランベリー高重合度画分精製物、カカオポリフェノール、松樹皮エキス、そしてシナモン粗分画物に含有されるプロシアニジンについて、平均重合度、含量、そして構成成分の分析結果を示す。
【表５】
【０２０９】
ポリフェノンは緑茶由来のポリフェノール粗精製物であるが、プロシアニジンのオリゴマーは検出されず、主成分はエピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）、ＥＣ、ＥＣＧ、カテキン（ＣＡ）の単量体のみであった。グラビノールＳＬはブドウ種子由来、アップルフェノン（登録商標）はリンゴ由来のプロシアニジン粗精製物であり、構成成分はＣＡ、ＥＣ、ＥＣＧであった。また、松樹皮エキス、カカオポリフェノール、シナモンのプロシアニジンはＣＡ、ＥＣから構成されていた。試料の平均重合度は１から６．８の範囲にあり、ジャトバの平均重合度が最も高かった。
【０２１０】
アップルフェノンの平均重合度は２．７であったが、チオール開裂を経ない試料を実施例８の１．（２）の条件でＬＣ−ＭＳに供した結果、観測されたのはプロシアニジン二量体、三量体、四量体の分子イオンピークのみであった。さらに実施例８の１．（１）の条件で逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）による定量分析を行なった結果、主成分は三量体（３８．１％，ｗ／ｗ）であった（図１８）。
【０２１１】
クランベリーのプロシアニジン高重合度画分をチオール開裂し、実施例８の１．（２）の条件でＬＣ−ＭＳに供した結果、Ａタイプ結合の存在が確認された。Ａタイプ結合はクランベリー以外の試料では認められなかった。
【０２１２】
実施例１３：プロシアニジン含有試料の調製と分析（ＩＩ）
１．実験方法
実施例１２で得られた知見をさらに精査する目的で、市販の素材であるシナモン（株式会社岡田薬局）、ピクノジェノール（株式会社バレンタイン）、グラビノール（キッコーマン株式会社）について、実施例９と同様のクロロホルム添加による沈殿分別分画法を行なった。
【０２１３】
（１）シナモン
２００ｇのシナモン粉末に２Ｌのエタノールを加え、１晩室温で抽出した。ろ過してシナモン抽出液を得て、溶媒留去し、粗抽出物２２．５８ｇを得た。これをメタノール：水（５０：５０、ｖ／ｖ）４００ｍＬに溶解し、濃度を４０ｇ／Ｌに調整した。これを等容のクロロホルムで３回洗浄し、夾雑物を除去した。含水メタノール画分を減圧溶媒留去し、１１．９７ｇの試料を得た。これを３００ｍＬのメタノールに再溶し、等容のクロロホルムを加え、クロロホルム：メタノール（５０：５０、ｖ／ｖ）溶液とした。得られた沈殿（Ｆｒ．１）をガラス漏斗（ポアサイズＰ１６）でろ過して分別後、ろ液に１５０ｍＬのクロロホルムを添加してクロロホルム：メタノール（６０：４０、ｖ／ｖ）溶液とした。生じた沈殿（Ｆｒ．２）を同様に分別し、ろ液に２５０ｍＬのクロロホルムを加えてクロロホルム：メタノール（７０：３０、ｖ／ｖ）溶液とした。生じた沈殿（Ｆｒ．３）を分別後、ろ液に２００ｍＬのクロロホルムを加えてクロロホルム：メタノール（７５：２５、ｖ／ｖ）溶液とした。生じた沈殿（Ｆｒ．４）を分別し、ろ液を溶媒留去してＦｒ．５とした。
【０２１４】
（２）ピクノジェノール
１０ｇのピクノジェノールを水２００ｍＬに溶解し、等容の酢酸エチルで４回分配を行ない、水層を乾固して６．５４ｇの試料を得た。これを１６４ｍＬのメタノールに溶解し、濃度を４０ｇ／Ｌに調整した。これに（１）と同様にクロロホルムを順次添加し、沈殿分別を行ない、Ｆｒ．１からＦｒ．５を調製した。
【０２１５】
（３）グラビノール
１０ｇのグラビノールを水２００ｍＬに溶解し、（２）と同様の手法でＦｒ.１からＦｒ.５を調製した。
【０２１６】
２．実験結果
（１）各画分の調製結果
シナモン、ピクノジェノール、グラビノールのプロシアニジンをクロロホルム沈殿分別法で分画した結果、得られた各画分の重量と重量比を表６に示す。
【０２１７】
表６：（１）から（３）で得られた分画物の重量を示す。
【表６】
【０２１８】
実施例１４：プロシアニジン含有試料の調製と分析（ＩＩＩ）
プロシアニジンの平均重合度および定量分析を精密に行なう目的で、実施例１２で得られた各調製物をチオール開裂反応に供し、実施例１１と同様の方針で計算した。すなわちエピカテキンガレート（ＥＣＧ）のトルエン−α−チオール付加誘導体（ＥＣＧ−ＢＴＥ）およびカテキン（ＣＡ）のトルエン−α−チオール付加誘導体（ＣＡ−ＢＴＥ）を精製・単離し、高分解能質量分析（ＨＲ−ＭＳ）と核磁気共鳴（ＮＭＲ）に供し、構造の同定を行なった後、それぞれを標品として当該成分のＨＰＬＣ分析を行なった。
【０２１９】
１．実験方法
（１）ＥＣＧ−ＢＴＥの単離・精製
グラビノールを実施例８の方法でチオール開裂を行ない、反応物をＨＰＬＣに供し、ＥＣＧ−ＢＴＥのピークを分取した。カラム条件を以下に示す。
【０２２０】
カラム ＸＴｅｒｒａ ＭＳ Ｃ１８ φ１９×１００ ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ社）
移動相 ０．２％（ｖ／ｖ）ギ酸水：メタノール（４７：５３）
移動相速度 ３ｍL／分
検出波長 ２８０ｎｍ
（２）ＥＣＧ−ＢＴＥの構造同定
前項で得たＥＣＧ−ＢＴＥについて、ＥＣＧのフラバン環４位へのベンジルチオール付加を立証するために、ＮＭＲスペクトルを測定した。装置はＶａｒｉａｎ社製ＵＮＩＴＹ ＩＮＯＶＡ−６００（６００ＭＨｚ）を用いた。シグナルの比較のため、市販標品ＥＣＧ（フナコシ株式会社）のプロトン（１Ｈ）ＮＭＲを測定した。
【０２２１】
（３）ＣＡ−ＢＴＥの単離・精製
ニュージーランド産の松樹皮エキスであるエンゾジノール（株式会社バレンタイン）を実施例８の方法でチオール開裂を行ない、反応物をHPLCに供し、ＣＡ−ＢＴＥのピークを分取した。カラム条件を以下に示す。またＣＡ−ＢＴＥのピークを同定する目的で、Ｐｒｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｂ３（ＣＡの２量体）をチオール開裂に供した。
【０２２２】
カラム Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標） Ｃ１８ φ１０×２５０ ｍｍ（シグマ−アルドリッチ社スペルコ事業部）
移動相 ０．２％（ｖ／ｖ）ギ酸水：メタノール（５０：５０）
移動相速度 ２ｍL／分
検出波長 ２８０ｎｍ
（４）ＣＡ−ＢＴＥの構造同定
前項で得たＣＡ−ＢＴＥについて、ＣＡのフラバン環４位へのベンジルチオール付加を立証するために、ＮＭＲスペクトルを測定した。装置はＶａｒｉａｎ社製ＵＮＩＴＹ ＩＮＯＶＡ−６００（６００ＭＨｚ）を用いた。シグナルの比較のため、市販標品ＣＡ（フナコシ株式会社）のプロトン（１Ｈ）ＮＭＲを測定した。
【０２２３】
（５）プロシアニジンのＨＰＬＣ分析
実施例１１で得られたエピカテキン−ベンジルチオールエーテル（ＥＣ−ＢＴＥ）と、今回得られたＥＣＧ−ＢＴＥ、ＣＡ−ＢＴＥをそれぞれを標品とし、実施例８に示した条件でＨＰＬＣ分析を行ない、プロシアニジンの平均重合度と含有量を算出した。平均重合度は以下のように計算した。
【０２２４】
平均重合度＝（Ｔ＋Ｅ）／Ｔ
Ｔ＝ターミナルユニット（ＥＣ、ＥＣＧ、ＣＡ）のモル量
Ｅ＝エクステンションユニット（ＥＣ−ＢＴＥ、ＥＣＧ−ＢＴＥ、ＣＡ−ＢＴＥ）のモル量
２．実験結果
（１）３２６ｍｇのグラビノールより３２．０ｍｇのＥＣＧ−ＢＴＥを得た。
【０２２５】
（２）ＥＣＧ−ＢＴＥのプロトンＮＭＲをＥＣＧのそれと比較した結果（図１９）、ＥＣＧでは２．８５ｐｐｍ、３．００ｐｐｍに観測されたフラバン環４位メチレンのシグナルがＥＣＧ−ＢＴＥでは消失し、代わりにベンジルチオール付加に伴い、４．１７ｐｐｍに低磁場シフトした４位メチンのシグナルと、７．２ｐｐｍ〜７．５ｐｐｍの領域にベンジルチオールのアロマティックプロトンのシグナルが観測された。また、１Ｈ−Detected Multiple-bond Heteronuclear Multiple Quantum Coherrence（ＨＭＢＣ）スペクトルにおいて、ベンジルチオールのＳＣＨ２部位のプロトンから４位カーボンへの遠隔相関シグナル、および４位プロトンからＳＣＨ２部位のカーボンへの遠隔相関シグナルが観測されたので（図２０）、ベンジルチオールはフラバン環４位に付加していることが証明された。なお、４位カーボン、ＳＣＨ２部位のカーボンのシグナルは、Heteronuclear Single Quantum Coherence（ＨＳＱＣ）スペクトル（図２１）により帰属した。以上の事実から、ＥＣＧ−ＢＴＥ構造が同定された。
【０２２６】
（３）Ｐｒｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｂ３のチオール開裂反応物よりＣＡ−ＢＴＥのカラム溶出位置を１８．６分と定めた。９０ｍｇのエンゾジノールより１１．３ｍｇのＣＡ−ＢＴＥを得た。
【０２２７】
（４）ＣＡ−ＢＴＥのプロトンＮＭＲをＣＡのそれと比較した結果（図２２）、ＣＡでは２．５０ｐｐｍ、２．８５ｐｐｍに観測されたフラバン環４位メチレンのシグナルがＣＡ−ＢＴＥでは消失し、代わりにベンジルチオール付加に伴い、４．３６ｐｐｍに低磁場シフトした４位メチンのシグナルと、７．２ｐｐｍ〜７．４ｐｐｍの領域にベンジルチオールのアロマティックプロトンのシグナルが観測された。また、１Ｈ−Detected Multiple-bond Heteronuclear Multiple Quantum Coherrence（ＨＭＢＣ）スペクトルにおいて、ベンジルチオールのＳＣＨ２部位のプロトンから４位カーボンへの遠隔相関シグナル、および４位プロトンからＳＣＨ２部位のカーボンへの遠隔相関シグナルが観測されたので（図２３）、ベンジルチオールはフラバン環４位に付加していることが証明された。なお、４位カーボン、ＳＣＨ２部位のカーボンのシグナルは、Heteronuclear Single Quantum Coherence（ＨＳＱＣ）スペクトル（図２４）によりアサインした。以上の事実から、ＣＡ−ＢＴＥ構造が同定された。
【０２２８】
（５）チオール開裂で生成するＥＣ、ＣＡ、ＥＣＧ、ＥＣ−ＢＴＥ、ＣＡ−ＢＴＥ、そしてＥＣＧ−ＢＴＥをそれぞれ標品として用いてＨＰＬＣ分析を行なった結果得られた各調製物のプロシアニジンの平均重合度と含有量％（ｗ／ｗ）を表７に示した。
【０２２９】
表７：ジャトバ、グラビノールＳＬ、ポリフェノン、アップルフェノン、クランベリー高重合度画分精製物、カカオポリフェノール、松樹皮エキス、そしてシナモン粗分画物に含有されるプロシアニジンについて、平均重合度、含量、そして構成成分の分析結果を示す。
【表７】
【０２３０】
実施例１５：プロシアニジン含有試料の調製と分析（ＩＶ）
実施例１３で得られたシナモン、ピクノジェノール、グラビノール由来のそれぞれの画分について、実施例８と同様にチオール開裂反応後、実施例１４と同様の方針でプロシアニジンの構成単位の同定、重合度の算出、および含有量の定量分析を行なった。
【０２３１】
１．実験方法
実施例１１で得られたエピカテキン−ベンジルチオールエーテル（ＥＣ−ＢＴＥ）と、実施例１４で得られたＥＣＧ−ＢＴＥ、ＣＡ−ＢＴＥをそれぞれ標品とし、実施例８に示した条件でＨＰＬＣ分析を行ない、プロシアニジンの平均重合度と含有量を算出した。平均重合度は以下のように計算した。
【０２３２】
平均重合度＝（Ｔ＋Ｅ）／Ｔ
Ｔ＝ターミナルユニット（ＥＣ、ＥＣＧ、ＣＡ）のモル量
Ｅ＝エクステンションユニット（ＥＣ−ＢＴＥ、ＥＣＧ−ＢＴＥ、ＣＡ−ＢＴＥ）のモル量
２．実験結果
チオール開裂で生成するＥＣ、ＣＡ、ＥＣＧ、ＥＣ−ＢＴＥ、ＣＡ−ＢＴＥ、そしてＥＣＧ−ＢＴＥをそれぞれ標品として用いてＨＰＬＣ分析を行ない、得られた各画分のプロシアニジンの平均重合度と含有量％（ｗ／ｗ）を表８に示した。
【０２３３】
表８：シナモン、ピクノジェノール、グラビノールをクロロホルム沈殿分別法で分画した結果得られた各画分のプロシアニジン（ＰＣ）の平均重合度と含有量％（ｗ／ｗ）を示す表である。参考としてジャトバの数値を附記してある。
【表８】
【０２３４】
実施例１６：ジャトバプロシアニジン３量体〜６量体の精製
１．実験方法
実施例９で調製したＦｒ．５より、プロシアニジンの３量体から６量体までをカラム精製した。まずＬＣ−ＭＳで各オリゴマーの溶出位置を決め、次いで日立製のＨＰＬＣで大量精製を行なった。各々の条件を以下に示す。
【０２３５】
（１）ＬＣ−ＭＳ
カラム：Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標） ＨＳ ＰＥＧ φ１０×２５０ ｍｍ，５μｍ（シグマ−アルドリッチ社スペルコ事業部）
ポンプ：Ｗａｔｅｒｓ社ａｌｌｉａｎｃｅ（商標名）２６９０
移動相：０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸入りメタノール：０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸水（６０：４０、ｖ／ｖ）
移動相流速：２ｍＬ／分
検出波長：２８０ｎｍ（Ｗａｔｅｒｓ社２９９６多波長検出器）
ＭＳ装置：Ｗａｔｅｒｓ社ｍｉｃｒｏｍａｓｓＺＱ２０００
Ｆｒ．５は１００μｇ／μＬの濃度のメタノール溶液１０μＬにメタノール６０μＬを加え、水で１２０μＬに希釈した溶液を１００μＬインジェクトした。ＵＶ検出器の出口流路を１／６にスプリットし、ＭＳに導入した。イオン化モードはＥＳＩのネガティブイオンモードとし、分子量２０００以上のプロシアニジンについては２価イオンで検出を行なった。コーン電圧は４０Ｖとした。
【０２３６】
（２）大量精製
カラム、移動相、移動相流速、検出波長は（１）と同様とし、ポンプを日立Ｌ−７１００、検出器を日立Ｌ−７４５５（多波長検出器）とした。サンプルループ容量は１ｍＬとし、Ｆｒ.５の１５０ｍｇをメタノール：水（５０：５０、ｖ／ｖ）溶媒１ｍLに溶解した試料を１回のインジェクト量とした。
【０２３７】
２．実験結果
（１）ＬＣ−ＭＳ
２８０ｎｍでモニターしたクロマトグラムと、ＭＳクロマトグラムを図２５に示した。各オリゴマーにおいて複数のピークが検出されているのは４→８結合と４→６結合から構成される異性体があるためであると考えられる。Ｆｒ．５より、７量体までの重合体が検出され、８量体、９量体のピークは検出されなかった。なお、ＭＳ装置の性能として検出上限が２０００なので、分子量１７３０の６量体までを１価イオンで検出し、７量体は２価イオン（１００９）で検出した。
【０２３８】
ＰＥＧカラムにより、各オリゴマーは重合度順に溶出されていることが明らかとなった。
【０２３９】
（２）大量精製
（１）でアサインした溶出ピークパターンに基づき、３量体から６量体までの精製を行なった。７量体はＦｒ．５中の含量が少なかったため、分取しなかった。２．３１ｇのＦｒ．５より、１３２．１ｍｇの３量体、１７３．１ｍｇの４量体、１８７．０ｍｇの５量体、１１１．０ｍｇの６量体を得た。精製物の一部を同ＨＰＬＣ条件に供し、純度検定を行なった結果、隣接する各オリゴマーの相互混入は微量であり、それぞれの純度は、３量体が９５．７％、４量体が９２．１％、５量体が９７．４％、６量体が９５．９％であった。
【０２４０】
実施例１７：ジャトバプロシアニジン６量体〜９量体の精製
１．実験方法
実施例９と同様にして調製したＦｒ．４より、プロシアニジンの６量体から９量体までをカラム精製した。まずＬＣ−ＭＳで各オリゴマーの溶出位置を決め、次いで日立製のＨＰＬＣで大量精製を行なった。各々の条件を以下に示す。
【０２４１】
（１）ＬＣ−ＭＳ
カラム：Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）ＨＳ ＰＥＧ φ１０×２５０ ｍｍ，５μｍ（シグマ−アルドリッチ社スペルコ事業部）
ポンプ：Ｗａｔｅｒｓ社ａｌｌｉａｎｃｅ（商標名）２６９０
移動相：０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸入りメタノール：０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸水（８０：２０、ｖ／ｖ）
移動相流速：２ｍＬ／分
検出波長：２８０ｎｍ（Ｗａｔｅｒｓ社２９９６多波長検出器）
ＭＳ装置：Ｗａｔｅｒｓ社ｍｉｃｒｏｍａｓｓＺＱ２０００
Ｆｒ．４については、１００μｇ／μＬの濃度のメタノール溶液８０μＬを水で１２０μＬに希釈した溶液を１００μＬインジェクトした。ＵＶ検出器の出口流路を１／６にスプリットし、ＭＳに導入した。イオン化モードはＥＳＩのネガティブイオンモードとし、分子量２０００以上のプロシアニジンについては２価イオンで検出を行なった。コーン電圧は４０Ｖとした。
【０２４２】
（２）大量精製
カラム、移動相流速、検出波長は（１）と同様とし、移動相を０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸入りメタノール：０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸水（８０：２０、ｖ／ｖ）ポンプを日立Ｌ−７１００、検出器を日立Ｌ−７４５５（多波長検出器）とした。サンプルループ容量は１ｍＬとし、Ｆｒ.４の１５０ｍｇをメタノール：水（７０：３０、ｖ／ｖ）溶媒９００μLに溶解した試料を１回のインジェクト量とした。
【０２４３】
２．実験結果
（１）ＬＣ−ＭＳ
２８０ｎｍでモニターしたクロマトグラムと、ＭＳクロマトグラムを図２６に示した。各オリゴマーにおいて複数のピークが検出されているのは４→８結合と４→６結合から構成される異性体があるためであると考えられる。Ｆｒ．４より、１２量体までの重合体が検出された。なお、ＭＳ装置の性能として検出上限が２０００なので、分子量１７３０の６量体までを１価イオンで検出し、７量体以上は２価イオンで検出した。
【０２４４】
ＰＥＧカラムにより、各オリゴマーは重合度順に溶出されていることが明らかとなった。
【０２４５】
（２）大量精製
（１）の結果、１０量体以上のオリゴマーは量が少なかったので、帰属した溶出ピークパターンに基づき、６量体から９量体までの精製を行なった。２．６６ｇのＦｒ．４より、１５６．２ｍｇの６量体、２２２．９ｍｇの７量体、２３６．１ｍｇの８量体、１７６．４ｍｇの９量体を得た。精製物の一部を同ＨＰＬＣ条件に供し、純度検定を行なった結果、隣接する各オリゴマーの相互混入は微量であり、それぞれの純度は、６量体が９５．９％、７量体が９５．８％、８量体が９０．３％、９量体が９７・０％であった。
【０２４６】
実施例１８：プロシアニジン３量体〜９量体のチオール開裂分析
１．実験方法
実施例１６と実施例１７で得た画分中のプロシアニジン含有量％（ｗ／ｗ）を算出するために、実施例８の方法でチオール開裂分析を行ない、実施例１１の方法で結果を解析した。チオール開裂分析ではプロシアニジン含有量％（ｗ／ｗ）以外に、その平均重合度をも算出できる。なお、６量体については実施例１７で得られたものを用いた。
【０２４７】
２．実験結果
３量体〜９量体の各画分中のプロシアニジン含有量％（ｗ／ｗ）を表９に示した。プロシアニジン（ＰＣ）含有量は低いものでも７１．３％（６量体）、高いものでは８３．０％（３量体）であった。また各々について算出した平均重合度についても表８に示した通り、いずれも目的重合度と符合し、チオール開裂分析法自体の精度が極めて良好であることも示された。
【０２４８】
表９：３量体〜９量体のプロシアニジンを実施例８の方法でチオール開裂分析し、平均重合度とプロシアニジン（ＰＣ）含有量％（ｗ／ｗ）を実施例１１の方法で解析した結果である。オリゴマー純度％（ｗ／ｗ）は実施例１６と実施例１７のＨＰＬＣでの定量結果であり、総純度とはＰＣ含有量にオリゴマー純度を乗算した値である。
【表９】
【０２４９】
実施例１９：プロシアニジンオリゴマーのＨＰＬＣ分析
プロシアニジンは実施例８および実施例１１のチオール開裂分析により平均重合度と含有量％（ｗ／ｗ）を、実施例７、実施例１６、実施例１７の質量分析法により重合体の分布を分析することができるが、実施例１６、実施例１７のＨＰＬＣ条件を以下のように設定することにより、プロシアニジンオリゴマーの分布をより高い重合度まで検出することが可能となる。
【０２５０】
１．実験方法
ＬＣ−ＭＳの条件を以下のように設定した。
【０２５１】
カラム：Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）ＨＳ ＰＥＧ φ１０×２５０ ｍｍ，５μｍ（シグマ−アルドリッチ社スペルコ事業部）
ポンプ：Ｗａｔｅｒｓ社ａｌｌｉａｎｃｅ（商標名）２６９０
移動相：０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸入りメタノール：０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸水（９５：５、ｖ／ｖ）
移動相流速：２ｍＬ／分
検出波長：２８０ｎｍ（Ｗａｔｅｒｓ社２９９６多波長検出器）
ＭＳ装置：Ｗａｔｅｒｓ社ｍｉｃｒｏｍａｓｓＺＱ２０００
実施例９と同様にして調製したＦｒ．５、Ｆｒ．４、Ｆｒ．３については、１００μｇ／μＬの濃度のメタノール溶液８０μＬを水で１２０μＬに希釈した溶液を１００μＬインジェクトした。ＵＶ検出器の出口流路を１／６にスプリットし、ＭＳに導入した。イオン化モードはＥＳＩのネガティブイオンモードとし、分子量２０００以上のプロシアニジンについては２価イオンで検出を行なった。コーン電圧は４０Ｖとした。
【０２５２】
２．実験結果
２８０ｎｍでモニターしたＦｒ．５、Ｆｒ．４、Ｆｒ．３のクロマトグラムをそれぞれ図２７、図２８、図２９に示した。ＭＳによってＦｒ．４、Ｆｒ．３から１３量体までのピークを確認した。ＭＳ装置の性能として検出上限が２０００なので、分子量１７３０の６量体までを１価イオンで検出し、７量体以上は２価イオンで検出した。１３量体は２価イオンで検出できる限界であり（イオンピーク１８７３）、Ｆｒ．４、Ｆｒ．３には、より高重合度のプロシアニジンを含んでいる可能性がある。
【０２５３】
実施例２０：ＥＡＥモデルを用いた各種植物由来試料のインビボでの効果
プロアントシアニジン類の自己免疫疾患改善作用について検討するために、実施例８の各種植物素材由来の試料をＥＡＥモデルマウスで検討した。
【０２５４】
１．実験方法
（１）投与試料
実施例２のジャトバエタノール抽出物および、実施例１２の各試料を使用した。各試料はそのプロシアニジン含量がジャトバエタノール抽出物と同一になるように１％エタノール溶液を調製した。
【０２５５】
（２）実験条件
Ｃ５７ＢＬ／６、雄性、６週齢を１群１０匹でコントロール群、および各試料群に分けた。コントロール群は第０日目にＭＯＧ抗原投与後、第０，２，４，７，９，１１，１４，１６，１８，２１日目の合計１０回、１％エタノールを投与した。各試料群は同じスケジュールでプロシアニジン換算で５０ｍｇ／ｋｇジャトバ相当量を投与した。第１１日目に５匹を剖検し、脾細胞をＭＯＧと共培養し、培養上清中のＩＦＮ−γ産生量をＥＬＩＳＡにて測定した。また、残り５匹は第２５日目まで臨床スコアを観察した。
【０２５６】
２．実験結果
臨床スコアの結果を図３０に示す。コントロールは第１１日目で発症し、最大臨床スコアは２．５前後となった。ジャトバと同様なＥＡＥ発症抑制が見られたのは松樹皮エキス、クランベリー高重合度画分およびシナモン抽出物であり、これらの素材では第２５日目まで明確な発症が認められなかった。グラビノールＳＬでは発症が４日遅れ、臨床スコアではコントロールの半分程度の抑制が見られた。その他の試料ではＥＡＥ抑制はコントロールと同程度であり、効果が認められなかった。脾細胞によるＩＦＮ−γ産生能についてもグラビノール、クランベリー、松樹皮エキス、シナモン、ジャトバでは完全に抑制されたが、その他の試料では明確な抑制は見られなかった（図３１）。
【０２５７】
以上の結果、実施例１２で示したように主成分が三量体であるアップルフェノンに効果が無いことから少なくとも重合度３以下のプロアントシアニジンには自己免疫疾患抑制効果は無いことが示唆された。
【０２５８】
なお、平均重合度でアップルフェノン（２．７２）と大差ないグラビノール（３．１８）に、部分的な抑制活性が認められた点については、アップルフェノンが前述したように三量体が主成分であってそれより高い重合度の物の含有量が乏しいのに対し、予備的試験であるがグラビノールは重合度分布が広く４以上の高重合度のものを十分量含有していることを確認しており、これが両者の差となったと考えられる。
【０２５９】
効果が認められた試料に含まれるプロシアニジンの種類は一義に限定されず、例えばＡタイプ，Ｂタイプの結合様式、構成成分、ガレート付加の有無は活性と相関しないことが明らかとなった。これらのことから、フラバン基本骨格の水酸基の数も活性には関係しないことが容易に演繹される。すなわち活性に関わるのは重合度のみであり、重合度４以上のプロアントシアニジンが自己免疫疾患改善作用を有することが明らかになった。
【０２６０】
実施例２１：高重合度プロシアニジン含有素材における活性の普遍性
高重合度プロシアニジンを含む他素材活性比較のために、松の樹皮（ピクノジェノール）、シナモン、ぶどう種子（グラビノール）からジャトバのＦｒ３相当（平均重合度１０）のものを抽出し、自己免疫疾患改善活性を検討した。
【０２６１】
１．実験方法
（１）投与試料
コントロール群には、１％ ＥｔＯＨ、ジャトバ由来高重合度プロシアニジンとしてジャトバＦｒ３（１５．７）（実施例９）を、グラビノール由来高重合度プロシアニジンとしてグラビノールＦｒ２（８．８）（実施例１３）を、松の樹皮由来高重合度プロシアニジンとしてピクノジェノールＦｒ２（８．６）（実施例１３）を、シナモン由来高重合度プロシアニジンとしてシナモンＦｒ１（１０．２）（実施例１３）を、それぞれ５ｍｇ／ｍｌになるように１％ ＥｔＯＨに溶解した。（）内は、平均重合度を示す。
【０２６２】
（２）実験動物
Ｃ５７ＢＬ／６，雄，７週齢を用い、一群１６匹で開始。ＭＯＧ（２００μｇ）と８００μｇのＨ３７Ｒａを含むＣＦＡをエマルジョン化したものを第０日目に皮内投与、第１日目と第３日目に腹腔内に１μｇ／ｍｌのＰＴＸを２００μｌ（実質２００ｎｇ）投与して疾患を惹起した。
【０２６３】
（３）脾細胞のＩＦＮ−γの測定
ＩＦＮ−γの測定はＯｐｔＥＩＡ ＥＬＩＳＡ Ｓｅｔ（ベクトン・デッキンソン社）を用いて実施した。
【０２６４】
（４）実験条件
各サンプルは１ｍｇ／ｍｏｕｓｅとなるように週３回腹腔内投与した。第１１日目にて剖検し、脾細胞を調製した。脾臓細胞はＲＰＭＩ１６４０（シグマ社）＋１０％ ＦＣＳ（ロシュ社）±２μＭ ＭＯＧ培地で３７℃、５％ＣＯ２の条件で７日間培養し、培養上清を回収し、ＩＦＮ−γ濃度測定を実施した。
【０２６５】
２．実験結果
いずれのプロシアニジン含有素材も高重合度プロシアニジンを濃縮する事により、同様に強い抗自己免疫疾患活性を示す事が分かった（図３２）。また後述する実施例３１において示されているように、抗自己免疫疾患活性は重合度５以上のプロアントシアニジンにより担われている。このことから、当該活性はジャトバに限定されるものではなく、高重合度プロシアニジンを含む他の素材にも適用可能であることが明らかとなった。
【０２６６】
実施例２２：ＴｙｐｅＩＩ コラーゲン誘導関節炎モデルを用いたジャトバのインビボでの効果
ジャトバの慢性関節リウマチにおける効能を調べるために、ＴｙｐｅＩＩ コラーゲン誘導関節炎モデルで検討した。
【０２６７】
１．実験方法
（１）投与試料
実施例２のジャトバエタノール抽出物を用いた。
【０２６８】
（２）実験動物およびその飼育
ＤＢＡ／１Ｊマウス（雄）、８週齢（購入先：チャールスリバー社）に対して、第０日目および第２１日目にＩＩ型コラーゲン（コスモバイオ）１５０μｇをＣＦＡ４００μｇと混合してエマルジョン化したものを皮内投与して誘導した。
【０２６９】
（３）実験条件
１群１０匹でコントロール群、ジャトバ群に分けた。コントロール群は第０日目から第３０日目まで週３回、１％エタノールを腹腔内投与した。ジャトバ群は同じスケジュールで５０ｍｇ／ｋｇでジャトバエタノール抽出物を腹腔内投与した。
【０２７０】
実験スケジュールを図３３に示す。
【０２７１】
（４）臨床スコアのつけ方
スコア０：正常、スコア１：四肢の指など小関節が一本のみ膨張発赤、スコア２：小関節２本以上、あるいは手首・足首など大きな関節が膨張発赤、スコア３：一本の手や足全体が発赤膨張、スコア４：さらに１本の手や足の膨張が最大限に達している
臨床スコアは４本の足全てに対して、上記基準で観察し、４本の合計をスコアとして記録した。
【０２７２】
２．実験結果
臨床スコアの経時変化グラフを図３４に示す。コントロール群では第２１日目に２次免疫を行い（０日目とする）、二次免疫後２日経過した２日目で発症が始まり、それから２週間でほぼ完全発症（スコア１６）した。ジャトバ群では２次免疫後、１週間経過した６日目近辺で発症が始まったが、スコア８までしか病状が進行しなかった。以上の結果、ジャトバ抽出物は慢性関節リウマチにも効果があることが示された。
【０２７３】
実施例２３：Ｉ型糖尿病モデルを用いたジャトバのインビボでの効果
ジャトバのＩ型糖尿病における効能を調べるために、Ｉ型糖尿病が誘導されたＮＯＤ／Ｌｔｊマウスで検討した。
【０２７４】
１．実験方法
（１）投与試料
実施例２のジャトバエタノール抽出物を用いた。
【０２７５】
（２）実験動物、飼育
ＮＯＤ／Ｌｔｊマウス（雌）、４週齢（購入先：チャールスリバー社）に対して１０週齢時にシクロホスファミド（Ｃｙ）を３００ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与した。
【０２７６】
（３）実験条件
１群２０匹でコントロール群、ジャトバ群に分けた。コントロール群は４週齢時から週２回、１％エタノールを腹腔内投与した。ジャトバ群は同じスケジュールで５０ｍｇ／ｋｇでジャトバエタノール抽出物を腹腔内投与した。９週齢時に５匹を剖検し、脾細胞を抗原のひとつであるインスリンと共培養し、培養上清中のＩＦＮ−γ産生量をＥＬＩＳＡにて測定した。また、残り１５匹は１０週齢時にＣｙを投与し、Ｃｙ投与後第３５日目まで臨床スコアを観察した。実験スケジュールを図３５に示す。
【０２７７】
（４）発症の判定
糖尿病の発症率はグルテストエース（三和化学研究所（株））で尾から微量採血したものを測定し、２５０ｍｇ／ｄｌ以上の値を示した場合、陽性とした。
【０２７８】
２．実験結果
糖尿病発症率を図３６に示す。コントロール群ではＣｙ投与後第２８日目で３９％が発症したが、ジャトバ群では１３％しか発症しなかった。
【０２７９】
さらに、９週齢時点の脾細胞のインスリンに対するＩＦＮ−γ産生量を測定したところ、コントロール群では６０００ｐｇ／ｍｌの産生が見られたにも関わらず、ジャトバ群では１０００ｐｇ／ｍｌ程度に抑制されていた。以上の結果、ジャトバ抽出物はＩ型糖尿病にも効果があることが示された（図３７）。
【０２８０】
実施例２４：Ｉ型糖尿病における効能検討
実施例２３ではシクロホスファミドをマウスに投与してＩ型糖尿病を誘導し、そのマウスを実験に用いた。本実施例では、長期的なＩ型糖尿病自然発症モデルマウスを実験に用いることによって、本発明による有効成分の効果をより正確に検証する。
【０２８１】
１．実験方法
（１）投与試料
コントロール群として１％ ＥｔＯＨを、またジャトバ投与群としてジャトバＥｔＯＨ抽出物（実施例２）を５ｍｇ／ｍｌになるように１％ ＥｔＯＨに溶解したもの
（２）実験動物
ＮＯＤ／Ｌｔｊマウス（雌）、４週齢（購入先：チャールスリバー社）。
【０２８２】
（３）実験条件
１群２０匹でＩ型糖尿病自然発症モデルマウスＮＯＤ／Ｌｔｊを４週齢で購入と同時にジャトバＥｔＯＨ抽出物を１ｍｇ／ｍｏｕｓｅ、コントロール群には１％ ＥｔＯＨを２００μｌ腹腔内へ週２回投与を開始。９週目以降、週１回に切り替え、発症率の検討終了の３３週目まで投与を継続した。また一部（ｎ＝３）９週目で剖検し、脾細胞の抗原特異的な反応を検討した。脾細胞はＲＰＭＩ１６４０（シグマ社）＋１０％ ＦＣＳ（ロシュ社）±３００ μｇ／ｍｌ インスリン（シグマ社）で培養し、３日間培養後の上清についてＩＦＮ−γの濃度を測定した。更に１１週目で一部（ｎ＝５）剖検し、脾臓細胞の各種免疫細胞存在比率を調べた。残りの個体は３３週目まで週一回血糖値を測定し、発症率を検討した（図３８）。
【０２８３】
（４）脾細胞のＩＦＮ−γの測定
ＩＦＮ−γの測定はＯｐｔＥＩＡ ＥＬＩＳＡ Ｓｅｔ（ベクトン・デッキンソン社）を用いて実施した。
【０２８４】
（５）ｅｘ ｖｉｖｏ 脾細胞における各種免疫担当細胞比率への影響
１１週目で剖検した各群５匹から脾細胞を調製した。免疫担当細胞の表面マーカーの発現はフローサイトメトリーを用いて実施例２５と同様の条件で調べた。
【０２８５】
（６）発症の判定
糖尿病の発症率はグルテストエース（三和化学研究所（株））で尾から微量採血したものを測定し、２５０ｍｇ／ｄｌ以上の値を示した場合、陽性とした。
【０２８６】
２．実験結果
９週目における抗原依存的な反応を調べた結果、抗原の一つであるインスリン依存的なＩＦＮ−γ産生が検出された。更にジャトバ投与によりこのＩＦＮ−γ産生が抑制された（図３９）。また１１週目で調べた脾臓細胞の各種免疫細胞存在比率に関してはジャトバ投与群でマクロファージの顕著な増加（約６％→２０％）を観察した一方、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞の減少傾向がみられた（図４０）。また増加したマクロファージの表面抗原を調べたところ、ＭＨＣ ｃｌａｓｓＩＩや共刺激分子であるＣＤ４０，ＣＤ８６に関してはそれぞれ発現低下傾向を示し（図４１）、ジャトバ投与群ではＴ細胞活性化能の低い未熟なマクロファージが増加していると考えられる。これは実施例２５におけるＥＡＥモデルにおけるジャトバ投与の効果と同様の傾向である。
【０２８７】
また３３週目における最終的な発症率は対照群の５４％に比較してジャトバ投与群では２２％に抑制されていた（図４２）。以上の結果から、高重合度プロシアニジンを豊富に含むジャトバ抽出物はＩ型糖尿病に対して抑制効果を持つ事が明らかとなった。
【０２８８】
実施例２５：ジャトバEtOH抽出物の脾細胞における各免疫担当細胞比率への影響検討
ジャトバ抽出物の特性を明らかにするために、ｅｘ ｖｉｖｏにおける脾細胞の免疫担当細胞の割合を実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルで検証した。
【０２８９】
１．実験方法
（１）投与試料
ジャトバＥｔＯＨ抽出物（実施例２）を５ｍｇ／ｍｌになるように１％ ＥｔＯＨ溶液に溶解させた。対照群には１％ＥｔＯＨ溶液を用いた。
【０２９０】
（２）実験動物
Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＭＯＧ抗原で免疫する方法でＥＡＥを誘導した一群３匹で第０，２，４，８，１５日目と経時的に剖検を行った。
【０２９１】
（３）実験条件
対照群では週３回１％ＥｔＯＨを２００μｌ、ジャトバ投与群は５ｍｇ／ｍｌ（１％ ＥｔＯＨ溶媒）を２００μｌ腹腔内投与した。
【０２９２】
（４）ｅｘ ｖｉｖｏ 脾細胞ポピュレーション解析
第０，２，４，８，１５日目で各群、３匹解剖し、脾細胞とリンパ節細胞を調製した。免疫担当細胞の細胞表面マーカーの発現はフローサイトメトリーにて解析を行った（ベクトンデッキンソン）。解析する免疫担当細胞は、Ｔ細胞（ＣＤ３）｛ＣＤ４陽性（ＣＤ４）Ｔ細胞、ＣＤ８陽性（ＣＤ８）Ｔ細胞、制御性（ＣＤ４／ＣＤ２５）Ｔ細胞｝、Ｂ細胞（Ｂ２２０）、ＮＫ細胞（ＤＸ５）、マクロファージ（ＣＤ１１ｂ）、樹状細胞（ＣＤ１１ｃ）であり括弧内の細胞表面マーカーを指標とした。マクロファージの成熟度を示す細胞表面マーカーとしてはＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩの抗体を用いた。
【０２９３】
細胞はＦｃ受容体をブロックするためにＣＤ１６／ＣＤ３２（Ｒａｔ ＩｇＧ２ｂ，ｃｌｏｎｅ，９３）でプレインキュベーションし洗浄後、５ｘ１０５ｃｅｌｌｓを５％ＦＢＳ、０．１％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中で目的とする抗原に特異的なマウスの抗体３０分間、４℃でインキュベートした。染色にはfluorescein isothiocyanate （ＦＩＴＣ）−またはphycoerythrin （ＰＥ）−で標識されたモノクローナル抗体を用いた。各々用いた抗体は、ＣＤ３e（Ａｒｍｅｎｉａｎ ｈａｍｓｔｅｒ ＩｇＧ，１４５−２Ｃ１１）， ＣＤ４（Ｒａｔ ＩｇＧ２ｂ， ＧＫ１．５），ＣＤ８a（Ｒａｔ ＩｇＧ２ａ，５３−６．７），ＣＤ１１ｂ （Ｒａｔ ＴｇＧ２ｂ，Ｍ１／７０），ＣＤ１１ｃ （Ａｒｍｅｎｉａｎ Ｈａｍｓｔｅｒ ＩｇＧ，Ｎ４１８）， ＣＤ４０（Ｒａｔ ＩｇＧ２ａ，１Ｃ１０），ＣＤ８０（Ｂ７−１）（Ａｒｍｅｎｉａｎ ｈａｍｓｔｅｒ ＩｇＧ，１６−１０Ａ１），ＣＤ８６（Ｂ７−２）（Ｒａｔ ＩｇＧ２ｂ，ＧＬ１），ＭＨＣ ｃｌａｓｓＩＩ （Ｒａｔ ＩｇＧ２ｂ，Ｍ５／１１４．１５．２）．ネガティブコントロールとして ＦＩＴＣ−またはＰＥ−標識したマウスＩｇＧ、ラットＩｇＧ、あるいはアルメニアハムスターＩｇＧを用いた。これらの抗体は全てｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ． （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。
【０２９４】
２．実験結果
脾臓細胞では第８日目から第１５日目にかけてヘルパーＴ細胞であるＣＤ４＋Ｔ細胞の増加が対照群でみられるのに対し、ジャトバ投与群では抑制されていた。また、抗原提示細胞であるＤＣおよびＢ細胞は実験開始から一貫して低下傾向にある一方でマクロファージは増加傾向にある（図４３）。ＣＤ８＋Ｔ細胞については特に両群間で差異はなかった。Ｔｈ１免疫亢進性の疾患ではＣＤ４＋Ｔ細胞の減少や、抗原提示細胞（ＤＣ）の減少はその症状抑制に寄与すると考えられ、ジャトバ投与により、これらの細胞の割合が減少することは抑制活性をよく説明する結果となった。一方、これとは逆にジャトバ投与群で増加していたマクロファージについてその成熟度を検討するために、第１０日目の脾臓細胞について更に解析した。細胞表面マーカーとして抗原提示能を反映すると言われている共刺激分子であるＣＤ４０，ＣＤ８０，ＣＤ８６，ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩを用いた。その結果ジャトバ投与により増加しているマクロファージは調べたいずれの共刺激分子の発現も抑制傾向である事が分かり、特にＴｈ１反応による炎症増幅に関わるＣＤ８０や抗原提示に主要に関わるＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩについては有意に抑制していた。これらのことから、ジャトバ投与により脾細胞で増加しているマクロファージは対照群に比較して、抗原提示能が低い事が示唆された（図４４）。
【０２９５】
実施例２６：Ｔｙｐｅ ＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎ誘導関節炎モデルにおけるジャトバ経口投与による臨床スコアの改善
ジャトバの経口投与の効果を調べるためにＴｙｐｅ ＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎ誘導関節炎モデルで検討した。
【０２９６】
１．実験方法
（１）投与試料
ジャトバＥｔＯＨ抽出物（実施例２）、ジャトバＦｒ３分画物（実施例９）、カテキン類単量体である緑茶ポリフェノール（ポリフェノン：三井農林）を各々５０ｍｇ／ｍｌになるように１０％ＥｔＯＨ溶液に溶解させた。対照群には１０％ＥｔＯＨ溶液を用いた。
【０２９７】
（２）実験動物
ＤＢＡ／１Ｊマウス（雄）、８週齢に対してウシタイプＩＩコラーゲン（コスモバイオ）１５０μｇを４００μｇの結核死菌（Ｈ３７Ｒａ：ディフコ）含むＣＦＡと混合し、エマルジョン化したものを第０日目に皮内投与（１次免疫）、３週間後の第２１日目に腹腔内投与（２次免疫）することで疾患を誘導した。
実験は一群１３匹で実施した。
【０２９８】
（３）実験条件
一次免疫開始日から第４０日目まで週５回、対照群では１０％ＥｔＯＨを２５０μｌ、ジャトバＥｔＯＨ抽出物投与群、ジャトバＦｒ３分画物投与群、緑茶ポリフェノール（ポリフェノン）投与群はそれぞれ５０ｍｇ／ｍｌ（１０％ＥｔＯＨ溶媒）に調製した試料を２５０μｌ強制経口投与した。
【０２９９】
（４）臨床スコアの付け方
２次免疫日を０日目として、以降３１日目まで臨床症状を観察した。スコアの付け方は実施例２２に従った。
【０３００】
２．実験結果
臨床スコアの経時変化を図４５に示した。ジャトバＥｔＯＨ抽出物投与によって臨床スコアの抑制がみられた。またジャトバのＲａｐｉｄ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎによる分画物であるＦｒ３投与では抑制効果が顕著であり、２次免疫後１０日目から有意差をもって抑制することが分かった。一方単量体ポリフェノールであるポリフェノン投与では臨床スコアの増悪傾向が認められた。
【０３０１】
実施例２７：Ｔｙｐｅ ＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎ誘導関節炎モデルにおけるジャトバ経口投与によるＴｈ１サイトカイン産生能の抑制
ジャトバの経口投与の効果をｅｘ ｖｉｖｏで評価するためにＴｙｐｅ ＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎ誘導関節炎モデルで検討した。
【０３０２】
１．実験方法
（１）投与試料
ジャトバ投与群にはジャトバＥｔＯＨ抽出物（実施例２）を５０ｍｇ／ｍｌになるように１０％ＥｔＯＨ溶液に溶解したものを投与した。対照群には１０％ＥｔＯＨ溶液を用いた。
【０３０３】
（２）実験動物
ＤＢＡ／１Ｊマウス（雄）、８週齢に対してウシタイプＩＩコラーゲン（コスモバイオ）１５０μｇを４００μｇ Ｈ３７Ｒａ含むＣＦＡと混合し、エマルジョン化したものを皮内投与した。実験は一群２０匹で実施した。
【０３０４】
（３）脾細胞のＩＦＮ−γの測定
ＩＦＮ−γの測定はＯｐｔＥＩＡ ＥＬＩＳＡ Ｓｅｔ（ベクトン・デッキンソン社）を用いて実施した。
【０３０５】
（４）実験条件
免疫開始から２週間、週５回、対照群では１０％ＥｔＯＨを２５０μｌ、ジャトバ投与群は５０ｍｇ／ｍｌ（１％ＥｔＯＨ溶媒）を２５０μｌ強制経口投与した。第１４日目に剖検し、脾臓細胞を調製した。脾細胞はＲＰＭＩ１６４０（シグマ社）＋１０％ＦＣＳ（ロシュ社）±２５μｇ／ｍｌコラーゲン培地で３７℃、５％ＣＯ２の条件で３日間培養し、培養上清を回収した。この上清中のＩＦＮ−γ濃度測定を実施した。
【０３０６】
２．実験結果
対照群における抗原依存的なＩＦＮ−γの上昇とジャトバ投与群における有意な抑制が確認できた（図４６）。このことは経口投与によっても、腹腔内投与と同様にＴｈ１型サイトカインであるＩＦＮ−γ産生の抑制を介して臨床スコアを改善している事を示している。
【０３０７】
実施例２８：Ｔｙｐｅ ＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎ誘導関節炎モデルにおけるジャトバ経口投与による臨床スコアの改善効果の容量依存性
ジャトバの経口投与の効果について容量依存性を調べるためにＴｙｐｅ ＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎ誘導関節炎モデルで検討した。
【０３０８】
１．実験方法
（１）投与試料
ジャトバ抽出物のＲａｐｉｄ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ分画物であるＦｒ３（実施例９）を各々５０ｍｇ／ｍｌ，３７．５ｍｇ／ｍｌ，２５ｍｇ／ｍｌになるように１０％ＥｔＯＨ溶液に溶解させた。対照群には１０％ＥｔＯＨ溶液を用いた。
【０３０９】
（２）実験動物
ＤＢＡ／１Ｊマウス（雄）、８週齢に対してウシタイプＩＩコラーゲン（コスモバイオ）１５０μｇを４００μｇの結核死菌（Ｈ３７Ｒａ：ディフコ）含むＣＦＡと混合し、エマルジョン化したものを第０日目に皮内投与（１次免疫）、３週間後の第２１日目に腹腔内投与（２次免疫）することで疾患を誘導した。実験は一群７匹で実施した。
【０３１０】
（３）実験条件
一次免疫開始日から第４０日目まで週５回、コントロール群では１０％ＥｔＯＨを２５０μｌ、５０ｍｇ／ｍｌ， ３７．５ｍｇ／ｍｌ，２５ｍｇ／ｍｌのＦｒ３を各々２５０μｌ投与した。一匹あたりの投与量はＦｒ３換算でそれぞれ１２．５、９．３７５、６．２５ｍｇ／マウスとなる。
【０３１１】
（４）臨床スコアの付け方
２次免疫日を０日目として、以降１７日目まで臨床症状を観察した。スコアの付け方は実施例２２に従った。
【０３１２】
２．実験結果
スコアの変化のグラフを図４７に示す。約９．３７５ｍｇ／マウスのＦｒ３投与より高い濃度においては有意に病状が抑制されたが、それより低い濃度においては有意なスコアの抑制はみられなかった。よってジャトバ抽出物の効果が期待できる濃度は約９．３７５ｍｇ／マウス以上と考えられた。
【０３１３】
実施例２９：高重合度プロシアニジンの効果が得られる投与時期の検討
発症期、急性期、慢性期以降からの高重合度プロシアニジン経口投与を行い、有効な投与時期について検討を行った。
【０３１４】
１．実験方法
（１）投与試料
コントロールとして１０％ ＥｔＯＨを、また高重合度プロシアニジンサンプルとしてジャトバＦｒ３（実施例９）を５０ｍｇ／ｍｌになるように１０％ ＥｔＯＨに溶解したものを用いた。
【０３１５】
（２）実験動物
ＤＢＡ／１Ｊマウス（雄）、８週齢に対してウシタイプＩＩコラーゲン（コスモバイオ）１５０μｇを４００μｇの結核死菌（Ｈ３７Ｒａ：ディフコ）含むＣＦＡと混合し、エマルジョン化したものを第０日目に皮内投与（１次免疫）、３週間後の第２１日目に腹腔内投与（２次免疫）することで疾患を誘導した。実験は一群１２匹で実施した。
【０３１６】
（３）実験条件
一次免疫開始日第０日目から第４６日目まで週５回、以下のような条件で経口投与を実施した。（第２１日目開始を発症期、第２８日目開始を急性期、第３５日目開始を慢性期投与とした。）なお、一回あたりのジャトバＦｒ３の投与量は１２．５ｍｇ／ｍｏｕｓｅである。
Ｉ．コントロール群：一次免疫開始から実験終了まで２５０μｌの１０％ ＥｔＯＨ溶液を経口投与。
II． ジャトバ投与群：一次免疫開始から実験終了までジャトバＦｒ３を経口投与。
III． 第２１日目開始群：一次免疫開始から第２０日目まで２５０μｌの１０％ ＥｔＯＨを、２次免疫日の第２１日目から実験終了までジャトバＦｒ３を経口投与。
IV． 第２８日目開始群：一次免疫開始から第２７日目まで２５０μｌの１０％ ＥｔＯＨを、２次免疫日から１週間後の第２８日目から実験終了までジャトバＦｒ３を経口投与。
Ｖ． 第３５日目開始群：一次免疫開始から第３４日目まで２５０μｌの１０％ ＥｔＯＨを、２次免疫日から２週間後の第３５日目から実験終了までジャトバＦｒ３を経口投与。
【０３１７】
（４）臨床スコアの付け方
２次免疫日を０日目として、以降２５日目まで臨床症状を観察した。スコアの付け方は実施例２２と同じ。
【０３１８】
２．実験結果
発症期投与としての第２１日目投与開始群と、急性期投与としての第２８日目投与開始群は、コントロール群と比較して発症率に影響はなかった（表１０）。しかし、第２１日目投与開始群では最大スコアが対照群のほぼ半分に、第２８日目投与開始群ではコントロール群の約６８％程度にまで抑制されていた（表１０）。
【表１０】
【０３１９】
平均スコアの推移を図４８に示した。第２１日目及び第２８日目開始群は投与を開始することで病状の悪化を抑制していることが示された。高重合度プロシアニジンの抗自己免疫疾患効果は一次免疫成立後でも、有効であることが示された。
【０３２０】
実施例３０：高重合度プロシアニジンによる血中抗体価の抑制活性
慢性関節炎リウマチモデルの臨床症状に加え、血中抗体価の抑制を確認する事を目的として実施した。
【０３２１】
１．実験方法
（１）投与試料
コントロール群として１０％ ＥｔＯＨを、またジャトバ投与群としてジャトバＦｒ３（実施例９）を５０ｍｇ／ｍｌになるように１０％ ＥｔＯＨに溶解したものを用いた。
【０３２２】
（２）実験動物
ＤＢＡ／１Ｊマウス（雄）、８週齢に対してウシタイプＩＩコラーゲン（コスモバイオ）１５０μｇを４００μｇの結核死菌（Ｈ３７Ｒａ：ディフコ）含むＣＦＡと混合し、エマルジョン化したものを第０日目に皮内投与（１次免疫）、３週間後の第２１日目に腹腔内投与（２次免疫）することで疾患を誘導した。実験は一群１２匹で実施した。
【０３２３】
（３）血中抗体価の測定
ウシタイプＩＩコラーゲン（コスモバイオ）をリン酸バッファーで３μｇ／ｍｌに調製したものを４℃で一晩コーティングしたプレートに５００〜５０００倍希釈した血清サンプルを添加して測定した。一次抗体には５００倍希釈したＡＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅの抗ｔｏｔａｌ ＩｇＧ抗体， 抗ＩｇＧ１抗体， 抗ＩｇＧ２ａ抗体（コスモバイオ）を用い、その後ｐＮＰＰ（フナコシ）にて発色させて４１０ｎｍにて検出した。
【０３２４】
（４）実験条件
一次免疫開始日から第４０日目まで週５回対照群には１０％ ＥｔＯＨを２５０μｌ、ジャトバ群にはジャトバＦｒ３を２５０μｌ経口投与した。第４２日目に採血し、血清を調製した。
【０３２５】
２．実験結果
抗原であるコラーゲンに特異的な血中抗体価について調べた。ＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ，総ＩｇＧ量のいずれもジャトバＦｒ３投与により抑制された。更にＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比については上昇傾向を認めており、Ｔｈ１免疫の抑制傾向を示した（図４９）。この結果から高重合度プロシアニジン投与により自己抗体の産生が抑制されること、高重合度プロシアニジンによる慢性関節炎リウマチ抑制効果は抗原特異的な抗体産生の抑制効果を介していることが明らかとなった。
【０３２６】
実施例３１：プロシアニジンの重合度別活性検討（Ｉ）
ジャトバ抽出物から３量体から６量体までのプロシアニジンを重合度ごとに調製したものを、ＥＡＥのｅｘ ｖｉｖｏの系を用いて検討した。
【０３２７】
１．実験方法
（１）投与試料
３量体から６量体までのプロシアニジン分画（実施例１６）はプロシアニジン換算で各々５ｍｇ／ｍｌになるように１％ ＥｔＯＨ溶液に溶解した。また単量体として、（−）エピカテキン（シグマ）を、二量体として、Ｐｒｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｂ２（フナコシ）を各々購入し、同様の条件で溶解した。対照群には１％ ＥｔＯＨ溶液を用いた。
【０３２８】
（２）実験動物
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを実施例３に記載のＭＯＧ抗原で免疫する方法でＥＡＥを誘導した。一群１２匹で第１１日目に剖検を行った。
【０３２９】
（３）脾細胞のＩＦＮ−γの測定
ＩＦＮ−γの測定はＯｐｔＥＩＡ ＥＬＩＳＡ Ｓｅｔ（ベクトン・デッキンソン社）を用いて実施した。
【０３３０】
（４）実験条件
第０日目から第１０日目までコントロール群では週３回１％ＥｔＯＨを２００μｌ、（−）エピカテキン、Ｐｒｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｂ２と調製した各オリゴマーは５ｍｇ／ｍｌ（１％ ＥｔＯＨ溶媒）を２００μｌ腹腔内投与した。第１１日目にて剖検し、脾臓細胞を調製した。脾細胞はＲＰＭＩ１６４０（シグマ社）＋１０％ ＦＣＳ（ロシュ社）２μＭ ＭＯＧ培地で３７℃、５％ＣＯ２の条件で７日間培養し、培養上清を条件回収し、ＩＦＮ−γ濃度測定を実施した。
【０３３１】
２．実験結果
ＩＦＮ−γの測定結果を図５０に示す。単量体（−）エピカテキンから６量体までの活性比較により、５量体以上のプロシアニジンにＩＦＮ−γ抑制がみられた。このことからこれまでみられていたジャトバ抽出物投与によるＴｈ１サイトカインの抑制効果は重合度５以上のプロシアニジンによることが示唆された。
【０３３２】
実施例３２：プロシアニジンの重合度別活性検討（II）
ジャトバ抽出物から３量体から９量体までのプロシアニジンを各重合度別に調製したもの（実施例１６および実施例１７）をＥＡＥのｅｘ ｖｉｖｏの系を用いて検討した。今回、７量体乃至９量体の効果を検討するため、投与量は実施例３１の半分の用量で実験を実施した。
【０３３３】
１．実験方法
（１）投与試料
３量体から９量体までのプロシアニジン精製物（実施例１６および１７）はプロシアニジン換算で各々２．５ｍｇ／ｍｌになるように１％ ＥｔＯＨ溶液に溶解した。また単量体として（−）エピカテキン（シグマ）を、二量体としてＰｒｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｂ２（フナコシ）を各々購入し、同様の条件で溶解した。コントロール群には１％ ＥｔＯＨ溶液を用いた。
【０３３４】
（２）実験動物
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを実施例３１に記載のＭＯＧ抗原で免疫する方法でＥＡＥを誘導した。一群１２匹で第１１日目に剖検を行った。
【０３３５】
（３）脾細胞のＩＦＮ−γの測定
ＩＦＮ−γの測定はＯｐｔＥＩＡ ＥＬＩＳＡ Ｓｅｔ（ベクトン・デッキンソン社）を用いて実施した。
【０３３６】
（４）実験条件
第０日目から第１０日目までコントロール群では週３回１％ＥｔＯＨを２００μｌ、（−）エピカテキン、Ｐｒｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｂ２と調製した各オリゴマーはそれぞれ５００μｇ／ｍｏｕｓｅとなるように腹腔内投与した。第１１日目にて剖検し、脾細胞を調製した。脾細胞はＲＰＭＩ１６４０（シグマ社）＋１０％ ＦＣＳ（ロシュ社）２μＭ ＭＯＧ培地で３７℃、５％ＣＯ２の条件で７日間培養し、培養上清を回収し、ＩＦＮ−γ濃度測定を実施した。
【０３３７】
２．実験結果
ＩＦＮ−γの測定結果を図５１に示す。実施例３１で５量体以上のプロシアニジンに活性があることを示したが、本実施例においては投与量を減少させて、更に９量体まで活性比較を実施した。投与量を減少させたため５量体での活性は弱まったが、５量体以上のプロシアニジンでは重合度が高くなると共に、活性が上昇し、９量体まで重合度と活性の相関関係を確認することができた。
【０３３８】
実施例３３：ジャトバ抽出物の安全性試験（ジャトバ抽出物の単回投与によるラットを用いた急性毒性試験）
１．実験方法
（１）投与試料
ジャトバＥｔＯＨ抽出物（実施例２）、緑茶ポリフェノール（単量体）としてのポリフェノン（三井農林）を２００ｍｇ／ｍｌの容量になるように１０％ＥｔＯＨに溶解した。対照群には１０％ＥｔＯＨ溶液を用いた。
【０３３９】
（２）実験動物
ＳＤ系ラット、雄、６週齢
（３）実験条件
第０日目に２００ｍｇ／ｍｌのジャトバＥｔＯＨ抽出物または緑茶ポリフェノールを２ｇ／ｋｇとなるように強制的に経口投与した。第６日目まで毎日同時間に体重と、摂餌量を計測した。
【０３４０】
２．実験結果
ジャトバ投与群では毒性は認められず、体重変化（図５２上）、摂餌量（図５２下）ともに、対照群と変わらなかった。一方、緑茶ポリフェノール投与群では第１日目で１０ｇ以上の体重減少を３個体で認めたが、翌日から回復し、死亡例はなかった。以上の結果からジャトバ抽出物では急性毒性は認められないことが分かった。
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、自己免疫疾患治療剤に関し、詳細には、プロアントシアニジンを有効成分として含んでなる自己免疫疾患治療剤に関する。
【０００２】
背景技術
近年、高齢化社会をむかえて慢性関節リウマチに代表される自己免疫疾患が増加している。自己免疫疾患には免疫応答のタイプの違う２種類に大別することができる。ひとつは細胞性免疫の過剰な亢進による疾患であり、もうひとつは自己抗体に媒介される疾患である。前者の非限定的な例は、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、自己免疫性甲状腺炎（ＡＴ）、若年性糖尿病やＩ型糖尿病等のインスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫ブドウ膜網膜炎（ＡＵＲ）、乾癬症などである。後者の非限定的な例は、重症筋無力症（ＭＧ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、グッドパスチャー症候群、自己免疫性溶血性貧血などである。これら自己免疫疾患の既存の治療法としては、非特異的に免疫反応を抑制する免疫抑制剤が代表的である。例としてはメトトレキサート、シクロホスファミド、サイクロスポリンＡ、タクロリムス、各種ステロイド化合物などがある。これらの薬剤は毒性・副作用が深刻であるばかりでなく、治療期間中は免疫反応が抑制されているため感染症に罹患する危機にさらされる。このような背景の中、最近特にリウマチ治療において生物製剤が脚光を浴びている。細胞性免疫依存型の自己免疫疾患の増悪因子はＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６などの炎症性サイトカインであるが、抗ＴＮＦ−α抗体、可溶性ＴＮＦ−α受容体、抗ＩＬ−６受容体抗体、ＩＬ−１受容体アンタゴニストなどについて臨床試験が行われている。これらの生物製剤は、対症療法であるため継続的な投与を要する。
【０００３】
ところで、自己免疫疾患の中で患者数が多いのは細胞性免疫亢進型自己免疫疾患である。このタイプでは、Ｔｈ１細胞やＴｃ１細胞が発症機序の中心的な役割を持っている。Ｔｈ１細胞はヘルパーＴ細胞の亜群であり、抗原刺激に対して選択的にＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２などのＴｈ１サイトカインを産生する。Ｔｈ１細胞の分化には抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ）が産生するＩＬ−１２と呼ばれるサイトカインが必須であるが、細胞性免疫亢進型自己免疫疾患では抗原提示細胞によるＩＬ−１２産生量が増加しており、いっそうＴｈ１細胞が誘導されやすい環境となっている。Ｔｈ１細胞はＴｈ１サイトカイン環境を作り出し、細胞障害活性をもつＴ細胞であるＴｃ１細胞の分化を誘導する。従ってＴｈ１サイトカインの産生を抑制することが自己免疫疾患の治療および予防に有効であると言える。
【０００４】
漢方薬を始めとする民間療法もこの分野では試みられることが多く、ある種の植物素材も自己免疫疾患に効果があることが経験的に知られている。
【０００５】
例えば、雷公藤はリウマチに効果があることが報告され（BMC Pharmacol., 2004,4(1):2）、人参湯はＩ型糖尿病に効果があることが報告され（Microbiol. Immunol., 2000, 44(4):299-305）、カンランは多発性硬化症に効果があることが報告されている（Arzneimittelforschung, 1998, 48(6):668-74）。また、シダの１種であるPolypodium Leucotomosは古くから乾癬症の治療に使われている（Padilla HC., 1974. Int J Dermatol 13, 276-282; Gonzales S., et al., 2000, Anticancer Res.20, 1567-1576）。また、同じシダ類であるサマンバイア（Polypodium lepidopteris）のエキスにはＣＤ４＋Ｔ細胞やＢ細胞の数に影響を与えることなく、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数を増加させる作用があることが知られている（Hostettmann K., et.al., 1995 Phytochemistry of Plants Used in Traditional Medicine, Proceedings of the Phytochemical Society of Europe. Oxford University Press: Oxford, NY）。このような素材で得られる効果については、科学的な解明はされていないが、安価で手軽に試みられる利点がある。また、ジャトバ（Hymenaea courbaril、別名：アスカル・ワーヨ）の樹皮、樹液、樹脂、葉などは下痢止めや膀胱炎、肝炎、前立腺炎、咳の自然薬として用いられてきた（Rutter, R.A. 1990 Catalogo de Plantas Utiles de la Amazonia Peruana. Instituto Linguistico de Verano. Yarinacocha, Peru. 349）。現在でも、ジャトバ樹皮から作るお茶や液体エキスは食欲促進、疲労回復、滋養強壮、栄養補給剤として広く受け入れられている（Silva., 1930. Catalogo de Extractos Fluidos, Araija e Cia.Ltd., Rio de Janeiro, Brazil: Cruz GL., 1995. Dicionario das Plantas Uteis Do Brasil, 5th Ed. Rio de Janeiro: Bertrand Brazil)。また、ジャトバの樹皮に含まれているアチルビンと呼ばれるフラボノイドが、抗酸化効果や肝臓保護特性を生み出すことや抗菌作用とテルペンやフェノールとの因果関係が報告されている (Closa D et al., 1997. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 56, 331-334；Pinheiro de SM., et.al., 1974. Molluscicidal activity of plants from Northeast Brazil. Rev Bras Fpesq Med Biol, 74: 389-394;Rouquayrol MZ., et al., 1980. Rev Brasil Pesq Med Biol 13, 135-143）。しかしながら、これらの成分のＴｈ１サイトカイン産生に対する効果や自己免疫疾患に対する効果はこれまで報告がなされていない。
【０００６】
ところで、プロアントシアニジンは様々な植物に広く含有される縮合型タンニンであり、酸処理によってアントシアニジンを与える。図１に示すように、主としてカテキン類すなわちフラバン−３−オールを基本単位として重合したポリフェノール成分である。すなわち、プロアントシアニジンとはフラバン骨格を基本として種々な部位に水酸基を有する単量体が重合した、非常に多様な化合物群の総称である。重合体の構成単位のうち、基端部をターミナルユニット、その他をエクステンションユニットと呼び、重合度は二量体、三量体のものから１００量体以上の高分子にまで及ぶ。
【０００７】
これまでに、プロアントシアニジンの好塩基球からのヒスタミン、ロイコトリエンなどの遊離抑制作用に基づく抗アレルギー剤としての利用が報告されている。（特開２００１−２７８７９２号公報）また、抗肥満作用（特開平９−２９１０３９号公報）、マトリックスプロテアーゼ阻害作用（特表２００３−５０４４０２号公報）、筋肉萎縮抑制作用（特開２００２−３３８４６４号公報）、血糖降下作用（特開平４−２５３９１８号公報）など多様な報告がなされている。しかしながら、自己免疫疾患の治療および予防はもちろん、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制に関するプロアントシアニジンの作用は知られていない。
【発明の概要】
【０００８】
本発明者らは、特定の植物由来エキスがＴｈ１偏向マウス脾臓細胞においてＴｈ１サイトカインの産生を抑制すること、その効果をもたらす有効成分がポリフェノールの一種であるプロアントシアニジンであること、特定の重合度を有するプロアントシアニジンが特にＴｈ１サイトカインの産生抑制に有効であること等を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明者等はまた、４量体以上、特に５量体以上のプロアントシアニジンが実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルにおいて高い治療活性を示すこと等を確認した。
【００１０】
本発明者らはまた、高重合度プロアントシアニジンがＢ細胞の活性化を抑制すること、自己抗体が誘導されたマウスにおいて高重合度プロアントシアニジンが自己抗体の産生を抑制すること等を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、インスリン依存型糖尿病をはじめとするＴｈ１サイトカインの産生抑制が治療に有効である疾患や自己抗体の産生抑制が治療に有効である疾患の治療剤の提供を目的とする。
【００１２】
本発明によれば、（ｉ）重合度が４以上のプロアントシアニジン、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物を有効成分として含有してなる、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制が治療に有効である疾患および／または自己抗体の産生抑制が治療に有効である疾患の治療剤、それら疾患の根治治療剤、およびそれら疾患の進行阻害剤（以下、「本発明による治療剤」という）が提供される。
【００１３】
本発明によればまた、本発明による治療剤の製造のための、（ｉ）重合度が４以上のプロアントシアニジン、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物の使用が提供される。
【００１４】
本発明によれば更に、治療上の有効量の（ｉ）重合度が４以上のプロアントシアニジン、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物を、必要であれば薬学上許容される担体とともに哺乳類に投与することを含んでなる、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制が治療に有効である疾患および／または自己抗体の産生抑制が治療に有効である疾患の治療方法、それら疾患の根治治療方法、およびそれら疾患の進行阻害方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】プロアントシアニジンを構成するフラバン化合物の代表成分であるエピカテキンおよびカテキン並びにフラバン環３位水酸基にしばしばエステル付加する没食子酸の構造式をそれぞれ示した図である。
【図２】ヒト多発性硬化症モデルマウスの作成とジャトバ腹腔内投与のスケジュールを示した図である。
【図３】ヒト多発性硬化症モデルマウスにおける、ジャトバの抗自己免疫疾患活性を臨床スコアの変動により評価した図である。
【図４】Ａ：脾臓細胞の産生するＴｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γの産生活性に対するジャトバの抑制活性を示した図である。Ｂ：炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αの産生活性に対するジャトバの抑制活性を示した図である。「＋ＭＯＧ」はＭＯＧペプチドを培養上清中に添加したもの、「−ＭＯＧ」はＭＯＧペプチドを培養上清中に添加しないものを意味する。両者の比較により抗原依存的な反応を確認できる。
【図５】ジャトバの脱髄抑制効果を示した図である。コントロールマウス（Control, Score 3）（発症）とジャトバ投与マウス（50m/kg jatoba, Score 0）（無症状）を第１５日目に剖検し、脊髄の脱髄の有無を観察した。
【図６】ＳＪＬ／ＪマウスにＰＬＰペプチドを用いて誘導したＥＡＥモデルを第１２日目で剖検し、脾臓細胞の産生するＴｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γに対するジャトバの産生抑制活性を示した図である。「＋ＰＬＰ」はＰＬＰペプチドを培養上清中に添加したもの、「−ＰＬＰ」はＰＬＰペプチドを培養上清中に添加しないものを意味する。両者の比較により抗原依存的な反応を確認できる。
【図７】Ａ：ジャトバの予防投与１回の効果について臨床スコアの変動を示した図である。control：コントロール。Once：一回投与。Ｂ：第１１日目で剖検し、脾臓細胞の産生するＴｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γへジャトバの予防投与１回での抑制活性を示した図である。「＋ＭＯＧ」はＭＯＧペプチドを培養上清中に添加したもの、「−ＭＯＧ」はＭＯＧペプチドを培養上清中に添加しないものを意味する。両者の比較により抗原依存的な反応を確認できる。
【図８】ＰＶＰＰ処理したジャトバ抽出物を投与した場合の臨床スコアの変動を示した図である。
【図９】脾臓細胞の産生するＴｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γおよび炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αに対する、ジャトバ抽出物およびＰＶＰＰ処理したジャトバ抽出物の抑制活性を示した図である。「＋ＭＯＧ」はＭＯＧペプチドを培養上清中に添加したもの、「−ＭＯＧ」はＭＯＧペプチドを培養上清中に添加しないものを意味する。両者の比較により抗原依存的な反応を確認できる。
【図１０】Ａ：実施例７において、ジャトバエタノール抽出物を電子スプレーイオン化質量分析に供し、プロシアニジン二量体、三量体、四量体、五量体、そして六量体の分子イオンピークを観測したことを示した図である。Ｂ：実施例７において、ジャトバエタノール抽出物をマトリックス支援レーザー脱離イオン化―飛行時間型質量分析に供し、２０以上の重合度を有するプロシアニジンの分子イオンピークが観測されたことを示した図である。
【図１１】プロアントシアニジンを酸性条件下、トルエン−α−チオールと共に加熱する反応であるチオール開裂を模式的に示した図である。
【図１２】ジャトバエタノール抽出物のチオール開裂反応生成物を逆相カラムクロマトグラフィで分析したクロマトグラムを示した図である。
【図１３】ジャトバエタノール抽出物中のプロシアニジンを、メタノールとクロロホルムに対する溶解性の違いを利用して分別沈殿し、重合度別に分画したことを示した図である。※：プロシアニジンの平均重合度／含量％。
【図１４】脾臓細胞の産生するＴｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γに対する、ジャトバエタノール抽出物および実施例９で分画された各画分（Ｆｒ）の抑制活性を示した図である。「＋ＭＯＧ」はＭＯＧペプチドを培養上清中に添加したもの、「−ＭＯＧ」はＭＯＧペプチドを培養上清中に添加しないものを意味する。両者の比較により抗原依存的な反応を確認できる。
【図１５】エピカテキン−ベンジルチオールエーテル（ＥＣ−ＢＴＥ）のプロトン（１Ｈ）ＮＭＲスペクトル（重アセトン、２０℃、５００ＭＨｚ）であり、構造を同定する図である。
【図１６】ベンジルチオールがフラバン環の４位に付加していることを証明する、エピカテキン−ベンジルチオールエーテル（ＥＣ−ＢＴＥ）のＨＭＢＣスペクトル（重アセトン、２０℃、５００ＭＨｚ）の図である。
【図１７】ＥＣ−ＢＴＥを標品としてＨＰＬＣ分析を行ない、さらに各成分をモル換算して計算したプロシアニジンの平均重合度と含量％を示す図である。※：プロシアニジンの平均重合度／含量％。
【図１８】アップルフェノン（登録商標）に含有されるプロシアニジンを逆相カラムクロマトグラフィで定量分析し、さらに液体クロマトグラフ質量分析によってそのメインピークが三量体であることを示した図である。
【図１９】市販標品エピカテキンガレート（ＥＣＧ）と精製したエピカテキンガレート−ベンジルチオールエーテル（ＥＣ−ＢＴＥ）を比較するプロトン（１Ｈ）ＮＭＲ (ｃｄ３ｏｄ、２０℃、６００ ＭＨｚ)の図である。
【図２０】ベンジルチオールがフラバン環の４位に付加していることを証明する、エピカテキンガレート−ベンジルチオールエーテル（ＥＣＧ−ＢＴＥ）のＨＭＢＣ スペクトル(ｃｄ３ｏｄ、２０℃、６００ ＭＨｚ)の図である。
【図２１】エピカテキンガレート−ベンジルチオールエーテル（ＥＣＧ−ＢＴＥ）のＨＳＱＣ (ｃｄ３ｏｄ、２０℃、６００ ＭＨｚ)であり、フラバン環４位、ベンジルチオールのＳＣＨ２部位のカーボンを帰属した図である。
【図２２】市販標品カテキン（ＣＡ）と精製したカテキン−ベンジルチオールエーテル（ＣＡ−ＢＴＥ）を比較するプロトン（１Ｈ）ＮＭＲ (ｃｄ３ｏｄ、２０℃、６００ ＭＨｚ)の図である。
【図２３】ベンジルチオールがフラバン環の４位に付加していることを証明する、カテキン−ベンジルチオールエーテル（ＣＡ−ＢＴＥ）のＨＭＢＣ (ｃｄ３ｏｄ、２０℃、６００ ＭＨｚ)の図である。
【図２４】カテキン−ベンジルチオールエーテル（ＣＡ−ＢＴＥ）のＨＳＱＣ (ｃｄ３ｏｄ、２０℃、６００ ＭＨｚ)であり、フラバン環４位、ベンジルチオールのＳＣＨ２部位のカーボンを帰属した図である。
【図２５】Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）ＨＳ ＰＥＧカラムを用いてプロシアニジン（実施例９で得られたＦｒ．５）を重合度別に厳密に分離したことを示すＬＣ−ＭＳクロマトグラムの図である。実線枠は１価イオンによるピーク同定を、破線枠は２価イオンによるピーク同定を、それぞれ示す。丸数字３、４、５、６、７、および８は重合度３、４、５、６、７、および８を意味する。
【図２６】Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）ＨＳ ＰＥＧカラムを用いてプロシアニジン（実施例９と同様にして調製したＦｒ．４）を重合度別に厳密に分離したことを示すＬＣ−ＭＳクロマトグラムの図である。実線枠は１価イオンによるピーク同定を、破線枠は２価イオンによるピーク同定を、それぞれ示す。丸数字３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２は重合度３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２を意味する。
【図２７】Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）ＨＳ ＰＥＧカラムを用いてプロシアニジン（実施例９と同様にして調製したＦｒ．５）の重合度分布を分析した図である。丸数字２、３、４、５、６、７、８、９、および１０は重合度２、３、４、５、６、７、８、９、および１０を意味する。
【図２８】Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）ＨＳ ＰＥＧカラムを用いてプロシアニジン（実施例９と同様にして調製したＦｒ．４）の重合度分布を分析した図である。丸数字２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３は重合度２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３を意味する。
【図２９】Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）ＨＳ ＰＥＧカラムを用いてプロシアニジン（実施例９と同様にして調製したＦｒ．３）の重合度分布を分析した図である。丸数字２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３は重合度２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３を意味する。
【図３０】ＥＡＥ臨床スコアへの各種プロシアニジン含有サンプルの影響を示した図である。括弧内の数字は平均重合度を示す。
【図３１】脾臓細胞の産生するＴｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γへの各種プロシアニジン含有サンプルの抑制活性を示した図である。「＋ＭＯＧ」はＭＯＧペプチドを培養上清中に添加したもの、「−ＭＯＧ」はＭＯＧペプチドを培養上清中に添加しないものを意味する。両者の比較により抗原依存的な反応を確認できる。
【図３２】脾臓細胞が産生するＴｈ１サイトカインであるＩＦＮ−α産生活性に対する他素材の高重合度プロシアニジン活性を比較した図である。「＋ＭＯＧ」はＭＯＧペプチドを培養上清中に添加したもの、「−ＭＯＧ」はＭＯＧペプチドを培養上清中に添加しないものを意味する。両者の比較により抗原依存的な反応を確認できる。
【図３３】慢性関節炎誘導モデルマウスの作成とジャトバ腹腔内投与のスケジュールを示した図である。
【図３４】ＴｙｐｅＩＩコラーゲン誘導関節炎モデルにおける、ジャトバ腹腔内投与群とコントロール群の臨床スコアの変動を示した図である。
【図３５】Ｉ型糖尿病誘導モデルマウスの作成とジャトバ腹腔内投与のスケジュールを示した図である。
【図３６】Ｉ型糖尿病誘導モデルマウスにおける、インビボにおけるジャトバ腹腔内投与群とコントロール群の糖尿発症率の変動を示した図である。
【図３７】９週齢で剖検し、脾臓細胞の産生するＴｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γに対するジャトバの抑制活性を示した図である。
【図３８】Ｉ型糖尿病自然発症モデルマウス実験スケジュールを示した図である。
【図３９】Ｉ型糖尿病自然発症モデルにおける抗原特異的な脾臓細胞の反応性を、インスリン依存的なＩＦＮ−γ産生活性で示した図である。
【図４０】Ｉ型糖尿病自然発症モデルにおける脾臓細胞のポピュレーションを示した図である。
【図４１】Ｉ型糖尿病自然発症モデルにおけるマクロファージの表面抗原発現レベルを示した図である。
【図４２】Ｉ型糖尿病自然発症モデルにおけるジャトバ投与による発症率抑制を示した図である。
【図４３】ＥＡＥモデルを用い、脾臓細胞における各免疫担当細胞割合の経時変化を示した図である。
【図４４】ＥＡＥモデルにおける脾臓細胞中のマクロファージの細胞表面抗原発現量を示した図である。
【図４５】リウマチモデルにおけるジャトバ抽出物、ポリフェノン、ジャトバ抽出物Ｆｒ３の経口投与の効果を臨床スコアで示した図である。
【図４６】リウマチモデルにおけるジャトバの経口投与の効果を脾細胞の抗原特異的ＩＦＮ−γ産生量で示した図である。「＋コラーゲン」はタイプＩＩコラーゲンを培養上清中に添加したもの、「−コラーゲン」は添加しないものを意味する。両者を比較することにより抗原依存的な反応を確認できる。
【図４７】リウマチモデルを用い、ジャトバＦｒ３の効果について用量依存性を臨床スコアで示した図である。
【図４８】ジャトバ投与の開始時期別に慢性関節炎リウマチスコアを示した図である。
【図４９】慢性関節リウマチにおけるジャトバ抽出物Ｆｒ３による血中抗体価の抑制を示した図である。
【図５０】脾臓細胞の産生するＴｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γの産生活性に対する各オリゴマーでの活性を比較した図である。
【図５１】脾臓細胞の産生するＴｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γの産生活性に対する各オリゴマーでの活性を比較した図である。
【図５２】ジャトバＥｔＯＨ抽出物およびポリフェノンの単回投与による体重、摂餌量への影響を示した図である。
【発明の具体的説明】
【００１６】
有効成分
本発明において有効成分である「プロアントシアニジン」とは、カテキン類、すなわち、フラバン骨格を基本単位とするポリフェノール類をいう。その構成単位としては、例えば、フラバン−３−オールとしてカテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン、カテキンガレート、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、エピディステニン（Ｂ環に水酸基を有さない）、アフゼレチン（Afzelechin）、エピアフゼレチン（epiafzelechin）が挙げられ、さらにフラバン−４−オール、ロイコアントシアニン（すなわち、フラバン−３，４−ジオール）、およびアントシアニジン等が挙げられる。
【００１７】
３位の水酸基は没食子酸とエステル（ガレート）を形成していてもよく、３位以外のいずれかの部位の水酸基が配糖体あるいはメチルエーテル（メトキシ）を形成していてもよい（図１参照）。
【００１８】
プロアントシアニジンの構成単位同士の主たる結合部位としては、４位と６位または４位と８位のいずれか１箇所（Ｂタイプ結合）、あるいは４位と８位および２位と７位酸素の２箇所（Ａタイプ結合）が挙げられるがこれらに限定されるものではなく、またこれら結合の立体配置も特に限定されるものではない。
【００１９】
ある特定の単量体が重合したプロアントシアニジンには慣用名が与えられ、代表的なプロアントシアニジンとしては、Ｂ環（図１参照）の水酸基の数に応じて定義・分類された、プロペラルゴニジン（４’−ＯＨ）、プロシアニジン（３’−ＯＨ，４’−ＯＨ）、プロデルフィニジン（３’−ＯＨ，４’−ＯＨ，５’−ＯＨ）が挙げられるが、プロアントシアニジンはこれらに限定されるものではない。例えば、Ａ環５位の水酸基を欠く成分を構成単位とした重合体であるプロガイボールチニジン（proguibourtinidin）、プロフィセチニジン、およびプロロビネチニジンがあり、さらにその他特定部位の水酸基の有無に応じて、プロテラカシジン、プロメラカシジン、プロアピゲニニジン、プロルテオリニジン等の慣用名を持つ成分が挙げられる。
【００２０】
本発明において「プロアントシアニジン」は、好ましくは、プロシアニジンおよびプロデルフィニジンである。「プロシアニジン」の構成単位は、同一または異なっていてもよく、カテキン、エピカテキン、カテキンガレート、およびエピカテキンガレートから選択できる。「プロデルフィニジン」の構成単位は、同一または異なっていてもよく、ガロカテキン、エピガロカテキン、ガロカテキンガレート、およびエピガロカテキンガレートから選択できる。
【００２１】
本発明において有効成分として用いる「重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン」は、好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジンであることができる。
【００２２】
本発明において用いられるプロアントシアニジンは、その重合度が５以上の場合に実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルにおいて高い治療活性を示した（実施例３１、図５０）。従って、本発明において用いられるプロアントシアニジンの重合度は、少なくとも５であることが好ましい。
【００２３】
本発明において用いられるプロアントシアニジンの重合度の上限は特に限定されるものではないが、プロアントシアニジンが植物由来である場合には、２０量体〜３０量体程度のプロアントシアニジンが確認されている。またプロアントシアニジンを有機合成する場合には、経済性および合成操作の便宜の観点から２０量体〜３０量体程度を重合度の上限とすることができる。更に、重合度が５以上のプロアントシアニジンに高い治療活性が認められたことから、プロアントシアニジンの重合度の上限を１０量体程度としても、本発明による効果を期待できる。従って本発明においては、プロアントシアニジンの重合度は、４〜３０量体、４〜２０量体、あるいは４〜１０量体とすることができ、好ましくは、５〜３０量体、５〜２０量体、あるいは５〜１０量体である。また本発明においては、プロアントシアニジンの重合度を、５〜６量体、５〜７量体、５〜８量体、および５〜９量体とすることができる。本発明においてプロアントシアニジンの重合度は、例えば、質量分析法（Jan F. Stevens et al., J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 3435-3443）により測定することができ、具体的には、実施例７、実施例１６、実施例１７、および実施例１９に従って測定することができる。
【００２４】
本発明において、プロアントシアニジンは式（Ｉ）で表すことができる。
【化１】
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、同一または異なっていてもよく、水素原子、水酸基、または−Ｏ−Ｒ１１（Ｒ１１は炭素数１〜４のアルキル基または糖残基を表す。）を表し、Ｒ３およびＲ４は、同一または異なっていてもよく、水素原子、水酸基、または基（ＩＩ）：
【化２】
を表し、但し、Ｒ３およびＲ４の両方が水酸基を表すことはなく、Ｒ３およびＲ４の両方が基（ＩＩ）を表すことはなく、ｎは４〜３０の整数を表し、各構成単位は、４位と６位または４位と８位の一カ所において互いに結合しているか、あるいは４位と８位および２位と７位の二カ所において互いに結合している。）
式（Ｉ）中、Ｒ１１が表すことがある「炭素数１〜４のアルキル基」は、好ましくは、メチル基である。
【００２５】
式（Ｉ）中、Ｒ１１が表すことがある「糖残基」は、ヘミアセタール性またはヘミケタール性水酸基とＲ３またはＲ４の水酸基とのエーテル結合を通じて式（Ｉ）の化合物に結合した糖を意味する。糖としては、例えば、グルコース、アロース、アルトロース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、フルクトース、キシロース、リボース、アラビノース、リキソース、ラムノースが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
式（Ｉ）中、構成単位の２位、４位、６位、または８位を通じて各構成単位同士が結合する場合には、２位、４位、６位、または８位には水素原子の代わりに単結合が存在する。
【００２７】
式（Ｉ）中、構成単位の７位を通じて各構成単位同士が結合する場合には、７位にはＲ２の代わりに、−Ｏ−が存在する。
【００２８】
式（Ｉ）における各構成単位に存在する置換基は、すべて同一であっても、構成単位ごとに異なっていてもよい。
【００２９】
式（ＩＩ）中の水酸基は、同一または異なっていてもよく、Ｒ１１−Ｏ−（Ｒ１１は前記と同義である）を表すことができる。
【００３０】
式（Ｉ）中、各構成単位において、Ｒ１およびＲ２が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ６が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ５およびＲ７が水素原子を表す化合物、およびＲ１およびＲ２が水酸基を表し、Ｒ６が水酸基を表し、Ｒ５およびＲ７が水素原子を表す化合物は、プロペラルゴニジンに対応する。これらの場合において、Ｒ３およびＲ４いずれか一方が水酸基または基（ＩＩ）を表し、他方が水素原子を表す場合が好ましい。
【００３１】
式（Ｉ）中、各構成単位において、Ｒ１およびＲ２が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ５およびＲ６が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ７が水素原子を表す化合物、およびＲ１およびＲ２が水酸基を表し、Ｒ５およびＲ６が水酸基を表し、Ｒ７が水素原子を表す化合物は、プロシアニジンに対応する。これら場合において、Ｒ３およびＲ４いずれか一方が水酸基または基（ＩＩ）を表し、他方が水素原子を表す場合が好ましい。
【００３２】
式（Ｉ）が表す構成単位のうち
− Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、およびＲ６が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ３が水酸基を表し、Ｒ４およびＲ７が水素原子を表す式（Ｉ）の構成単位はカテキンに対応し、
− Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、およびＲ６が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ４が水酸基を表し、Ｒ３およびＲ７が水素原子を表す式（Ｉ）の構成単位はエピカテキンに対応し、
− Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、およびＲ６が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ３が式（ＩＩ）を表し、Ｒ４およびＲ７が水素原子を表す式（Ｉ）の構成単位はカテキンガレートに対応し、
− Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、およびＲ６が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ４が式（ＩＩ）を表し、Ｒ３およびＲ７が水素原子を表す式（Ｉ）の構成単位はエピカテキンガレートに対応する。
式（Ｉ）中、各構成単位において、Ｒ１およびＲ２が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表す化合物、およびＲ１およびＲ２が水酸基を表し、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が水酸基を表す化合物は、プロデルフィニジンに対応する。これら場合において、Ｒ３およびＲ４いずれか一方が水酸基または基（ＩＩ）を表し、他方が水素原子を表す場合が好ましい。
【００３３】
式（Ｉ）が表す構成単位のうち
− Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ３が水酸基を表し、Ｒ４が水素原子を表す式（Ｉ）の構成単位はガロカテキンに対応し、
− Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ４が水酸基を表し、Ｒ３が水素原子を表す式（Ｉ）の構成単位はエピガロカテキンに対応し、
− Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６がＲ７が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ３が式（ＩＩ）を表し、Ｒ４が水素原子を表す式（Ｉ）の構成単位はガロカテキンガレートに対応し、
− Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ４が式（ＩＩ）を表し、Ｒ３が水素原子を表す式（Ｉ）の構成単位はエピガロカテキンガレートに対応する。
【００３４】
式（Ｉ）中、ｎはプロアントシアニジンの重合度（量体）を表す。ｎは好ましくは５〜３０の整数を表す。ｎはまた、４〜２０、４〜１０、５〜２０、５〜１０、５〜６、５〜７、５〜８、５〜９の整数であることができる。
【００３５】
式（Ｉ）における各構成単位の結合様式としては、Ａタイプ結合とＢタイプ結合が挙げられる。Ａタイプ結合は、各構成単位が４位と８位および２位と７位の二カ所において互いに結合している結合様式をいう。Ｂタイプ結合は、各構成単位が４位と６位または４位と８位の一カ所において互いに結合している結合様式をいう。本発明においては、式（Ｉ）における構成単位同士の結合すべてがＡタイプ結合である場合やＢタイプ結合である場合のみならず、Ａタイプ結合とＢタイプ結合が混在している場合も含まれる。各構成単位の結合は、すべて同一であっても、構成単位ごとに異なっていてもよい。
【００３６】
式（Ｉ）における各構成単位の結合様式の好ましい例は下記の通りである（カテキン、ガロカテキン、エピカテキン、エピガロカテキンにはガレート体も含まれる）。
【００３７】
エピカテキン／エピガロカテキン−（４β→８結合）−カテキン／ガロカテキン；
エピカテキン／エピガロカテキン−（４β→８結合）−エピカテキン／エピガロカテキン；
カテキン／ガロカテキン−（４α→８結合）−カテキン／ガロカテキン；
エピカテキン／エピガロカテキン−（４β→６結合）−エピカテキン／エピガロカテキン；
カテキン／ガロカテキン−（４α→６結合）−カテキン／ガロカテキン；
［エピカテキン／エピガロカテキン−（４β→８）］２−エピカテキン／エピガロカテキン；および
エピカテキン／エピガロカテキン−（２β→７，４β→８結合）−カテキン／ガロカテキン。
【００３８】
式（Ｉ）が表すプロアントシアニジンのうち好ましい例としては、
各構成単位が、同一または異なっていてもよく、
− Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、およびＲ６が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ３が水酸基を表し、Ｒ４およびＲ７が水素原子を表す（カテキン）か、
− Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、およびＲ６が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ４が水酸基を表し、Ｒ３およびＲ７が水素原子を表す（エピカテキン）か、
− Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、およびＲ６が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ３が式（ＩＩ）を表し、Ｒ４およびＲ７が水素原子を表す（カテキンガレート）か、
− Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、およびＲ６が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ４が式（ＩＩ）を表し、Ｒ３およびＲ７が水素原子を表す（エピカテキンガレート）か、
− Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ３が水酸基を表し、Ｒ４が水素原子を表す式（Ｉ）の化合物はガロカテキンに対応し、
− Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ４が水酸基を表し、Ｒ３が水素原子を表す（エピガロカテキン）か、
− Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６がＲ７が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ３が式（ＩＩ）を表し、Ｒ４が水素原子を表す（ガロカテキンガレート）か、
− Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ４が式（ＩＩ）を表し、Ｒ３が水素原子を表し（エピガロカテキンガレート）
ｎが５〜３０の整数を表し、
各構成単位の結合が、同一または異なっていてもよく、
エピカテキン／エピガロカテキン−（４β→８結合）−カテキン／ガロカテキン；
エピカテキン／エピガロカテキン−（４β→８結合）−エピカテキン／エピガロカテキン；
カテキン／ガロカテキン−（４α→８結合）−カテキン／ガロカテキン；
エピカテキン／エピガロカテキン−（４β→６結合）−エピカテキン／エピガロカテキン；
カテキン／ガロカテキン−（４α→６結合）−カテキン／ガロカテキン；
［エピカテキン／エピガロカテキン−（４β→８）］２−エピカテキン／エピガロカテキン；および
エピカテキン／エピガロカテキン−（２β→７，４β→８結合）−カテキン／ガロカテキン
から選択される（但し、カテキン、ガロカテキン、エピカテキン、エピガロカテキンにはガレート体も含まれる）、式（Ｉ）の化合物が挙げられる。
【００３９】
式（Ｉ）における各構成単位の結合様式の特に好ましい例は下記の通りである。
【００４０】
エピカテキン−（４β→８結合）−カテキン；
エピカテキン−（４β→８結合）−エピカテキン；
カテキン−（４α→８結合）−カテキン；
エピカテキン−（４β→６結合）−エピカテキン；
カテキン−（４α→６結合）−カテキン；
［エピカテキン−（４β→８）］２−エピカテキン；および
エピカテキン−（２β→７，４β→８結合）−カテキン。
【００４１】
式（Ｉ）が表すプロアントシアニジンのうち特に好ましい例としては、
各構成単位が、同一または異なっていてもよく、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６が水酸基を表し、かつＲ４およびＲ７が水素原子を表す（カテキン）か、あるいはＲ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６が水酸基を表し、かつＲ３およびＲ７が水素原子を表し（エピカテキン）、
ｎが５〜３０の整数を表し、
各構成単位の結合が、同一または異なっていてもよく、
エピカテキン−（４β→８結合）−カテキン；
エピカテキン−（４β→８結合）−エピカテキン；
カテキン−（４α→８結合）−カテキン；
エピカテキン−（４β→６結合）−エピカテキン；
カテキン−（４α→６結合）−カテキン；
［エピカテキン−（４β→８）］２−エピカテキン；および
エピカテキン−（２β→７，４β→８結合）−カテキン
から選択される、式（Ｉ）の化合物が挙げられる。
【００４２】
プロアントシアニジンは多くの植物に存在する成分であり、植物から抽出することにより調製することができる。プロアントシアニジンを植物から調製するための好ましい原料としては、ジャトバ、葡萄種子、クランベリー、シナモン、および松樹皮等が挙げられ、プロアントシアニジンの含有量の豊富な点からジャトバがより好ましい。プロアントシアニジンを含有する植物素材としては、例えば、ジャトバ樹皮乾燥粉末（有限会社エジソン・エス・アール・エル日本事務所）、クランベリー由来抽出物（「クランベリーパウダー」（キッコーマン（株））、葡萄種子由来抽出物（「グラビノールＳＬ」（キッコーマン（株））、松樹皮由来抽出物（有限会社素材機能研究所）、カカオ由来抽出物（「カカオポリフェノール」（明治製菓（株））が挙げられ、これらをそのまま、あるいは後述するように所望の程度に高重合度のものを適宜分画精製し、本発明による有効成分として用いることができる。
【００４３】
従って本発明では、「プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物」を有効成分として使用することができる。「プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物」としては、例えば、ジャトバ抽出物、葡萄種子抽出物、クランベリー抽出物、シナモン抽出物、松樹皮抽出物、カカオ抽出物が挙げられるが、プロアントシアニジン（特に重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン）を含有する限り、その素材は限定されない。
【００４４】
本発明において有効成分として用いる「プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物」は、好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジンを含有する植物素材の抽出物であることができる。
【００４５】
植物素材に含まれているプロアントシアニジンの構成成分を例示すると、表１の通りである。
【表１】
（表中、Ｒ１乃至Ｒ７は式（Ｉ）に対応し、ＥＣはエピカテキンを、ＣＡはカテキンを、ＥＣＧはエピカテキンガレートを、ＥＧＣＧはエピガロカテキンガレートを、Ｇはガレートをそれぞれ表す。）
本発明による有効成分であるプロアントシアニジンおよび抽出物を、前述したような植物原料から分画精製する方法として、具体的には、該植物原料をそのままもしくは粉砕後、抽出操作に供することによって調製することができる。抽出方法としては、例えば、溶媒中に植物原料あるいは、その粉砕物などを冷浸、温浸等によって浸漬する方法；加温し攪拌しながら抽出を行い、濾過して抽出液を得る方法；またはパーコレーション法等を挙げられる。得られた抽出液は、必要に応じてろ過または遠心分離によって固形物を除去した後、使用の態様により、そのまま用いるか、または溶媒を留去して一部濃縮若しくは乾燥して用いてもよい。また濃縮乃至は乾燥後、さらに非溶解性溶媒で洗浄して精製して用いても、またこれを更に適当な溶剤に溶解もしくは懸濁して用いることもできる。更に、本発明においては、例えば、上記のようにして得られた溶媒抽出液を、減圧乾燥、凍結乾燥等の通常の手段により抽出エキス乾燥物として使用することもできる。従って、本発明における「抽出物」には、抽出物そのもののみならず、抽出物の濃縮物や乾燥物も含まれる。
【００４６】
上記抽出に用いられる溶媒としては、例えば、水；メタノール，エタノール，プロパノールおよびブタノール等の炭素数１〜４の低級アルコール；酢酸エチルエステル等の低級アルキルエステル；エチレングリコール、ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなどのグリコール類；その他エチルエーテル、アセトン、酢酸等の極性溶媒；ベンゼンやヘキサン等の炭化水素；エチルエーテルや石油エーテルなどのエーテル類等の非極性溶媒の公知の有機溶媒が挙げられる。これら溶媒は、単独で用いてもよく、二種以上を組み合わせて使用することもできる。より好ましくは、熱水、エタノール、またはアセトン等を用いた抽出方法を挙げることができる。特に、平均重合度の高いプロアントシアニジン画分を分画する場合には、７０％アセトンあるいはエタノールによる抽出が有効である。更に特定平均重合度の画分を取得したい場合には、以下に述べるように７０％アセトンあるいはエタノール抽出物を酢酸エチル／水により抽出した後、水層画分をメタノールに再溶解し、Saucierらの方法（J Agric Food Chem 49, 5732-5735(2001)）に従いクロロホルムを用いた分画をおこなってもよい。即ち、プロアントシアニジンは重合度が高いほど低い濃度のクロロホルムで不溶となる性質を利用し、クロロホルム濃度を適宜変えていくことにより、所望の平均重合度の画分を得ることができる。従って本発明において「抽出物」は、好ましくは、水抽出物、エタノール抽出物、またはアセトン抽出物であることができる。
【００４７】
上記のような溶媒抽出／沈殿操作に加えて、さらに慣用の分画精製手段を採用しても良い。具体的には、プロアントシアニジンを吸着かつ溶離できる吸着剤、例えばスチレンージビニルベンゼン系の合成吸着樹脂、陰イオン交換樹脂、オクタデシル基化学結合型シリカゲル（ＯＤＳ）、ゲルろ過樹脂（Sephadex ＬＨ２０など）などが使用される。これらの吸着剤を充填したカラムに上記の清澄抽出液や清澄果汁液などを通すことによりプロアントシアニジンを吸着させ、洗浄後、それぞれに適した溶出液を通すことにより、プロアントシアニジンの分画精製を行なうことができる。また、分子量分画膜を用いた膜分離法等を用いることもできる。
【００４８】
各種抽出分画方法は特定重合度のプロアントシアニジンのみを得る目的で、あるいは、医薬や食品として用いる場合に安全性、物性、風味等の点で好ましくない成分あるいは溶媒を除去する目的でも使用することができる。
【００４９】
本発明によれば、Ｔｈ１サイトカイン産生抑制活性を有する画分の製造法であって、
（ａ）プロアントシアニジンを含有する植物原料を抽出操作に付す工程；および
（ｂ）工程（ａ）で得られた抽出画分を限外濾過操作に付して、ケーキ（濾滓）を得る工程
を含んでなる、製造法が提供される。
【００５０】
工程（ａ）の抽出操作および植物原料は前記の通りである。工程（ａ）の抽出操作においては好ましくは極性溶媒を用いることができ、特に、エタノール、水、含水アセトンが好ましい。植物原料としては好ましくはプロアントシアニジンを含有する植物を用いることができる。
【００５１】
工程（ａ）においては、抽出液を溶媒留去して抽出画分を得、次いで、この抽出画分を非極性有機溶媒（例えば、酢酸エチル）／水を用いた抽出操作に付すことにより、水溶性画分とすることができる。あるいは、工程（ａ）で得られた抽出画分をそのまま工程（ｂ）の限外濾過操作に付してもよい。
【００５２】
工程（ｂ）の限外濾過操作においては、Ｔｈ１サイトカイン産生抑制活性を有する画分が限外濾過膜に残存するように（すなわち、限外濾過膜を透過しないように）、カットオフ値を設定することができる。Ｔｈ１サイトカイン産生抑制活性とプロアントシアニジンの重合度の関係は上記した通りであり、限外濾過膜を透過する物質の分子量とカットオフ値との関係は当業者に周知であることから、当業者であれば製造すべきプロアントシアニジンの種類に応じて限外濾過膜のカットオフ値を適宜設定することができる。例えば、少なくとも５以上の重合度のプロシアニジンが高いＴｈ１サイトカイン産生抑制活性を有し、重合度５のプロシアニジンの分子量は約１４４２であることから、例えば、カットオフ値を１４００と設定することができる。
【００５３】
工程（ｂ）の後、必要に応じてケーキに含まれるプロアントシアニジンの重合度を測定してもよい。重合度は質量分析法（Jan F. Stevens et al., J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 3435-3443）により測定することができる。またチオール開裂分析法（Sylvain Guyot, Nathalie Marnet, and Jean-Francois Drilleau, J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 14-20）により平均重合度を測定してもよい。プロアントシアニジンの重合度を測定することにより、Ｔｈ１サイトカイン産生抑制活性を有する画分の製造を確認することができる。
【００５４】
本発明による有効成分であるプロアントシアニジンは、重合度が４以上、好ましくは５以上である。従って、植物からプロアントシアニジンを調製する場合、元来重合度が４以上あるいは５以上のプロアントシアニジンを含有する抽出物の場合はそのまま有効成分として、あるいは後述実施例に示した活性測定法により活性を指標にするか、あるいは重合度を指標にして更に有効成分を分画・精製して使用することができる。また、平均重合度が３以下の抽出物についても、後述実施例に示した活性測定法により活性を指標にするかあるいは重合度を指標にして重合度が４以上の有効成分を多く含むものを分画・精製し使用することができる。医薬組成物あるいは食品中において、複数の重合度のプロアントシアニジンを含む場合は、平均重合度として４以下のものであっても、４以上の重合度のものを有効量含有している限り本発明の範囲内であるが、平均重合度が約４以上のプロアントシアニジンをより好ましくは用いることができる。
【００５５】
プロアントシアニジンは植物からの抽出以外に、有機化学合成により調製してもよい（例えば、Swain et al., 1954. Chem Ind, 1144、Eastmond., 1974. J Inst Brew 80, 188. Kozikowski AP et al., 2003、 J Org Chem 68, 1641-1658、および特表２００２−５４２２４０号公報参照）。
【００５６】
用途
本発明において用いられるプロアントシアニジンおよびジャトバ等の特定植物の抽出物は、Ｔｈ１偏向させた脾臓細胞においてＴｈ１サイトカイン（具体的には、ＩＦＮ−γ）産生を抑制し、細胞性免疫過多の状況を改善・抑制する。従って、本発明による医薬組成物は、Ｔｈ１サイトカイン産生の抑制が治療に有効である疾患の治療に有効である。
【００５７】
Ｔｈ１サイトカインの産生抑制が治療に有効である疾患としては、例えば、Ｔｈ１サイトカイン依存型自己免疫疾患が挙げられる。本発明において「Ｔｈ１サイトカイン依存型自己免疫疾患」とは、細胞性免疫依存型自己免疫疾患を含む意味で用いられるものとする。
【００５８】
Ｔｈ１依存型自己免疫疾患としては、多発性硬化症（ＭＳ）、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、若年性糖尿病やＩ型糖尿病等のインスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎（ＡＴ）、自己免疫性ブドウ膜網膜炎（ＡＵＲ）、橋本病、乾癬症、クローン病、および円形脱毛症が挙げられる。
【００５９】
Ｔｈ１依存型自己免疫疾患では、炎症局所へのリンパ球（Ｔｈ１細胞）の浸潤や血中でのＴｈ１サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γやＴＮＦ−α）の濃度亢進が認められている（Skurkovich B & Skurkovich S, Curr Opin Mol Ther. 2003 Feb;5(1):52-7; Fuss, I.J., et al, J. Immunol. 157:1261(1996); Gherardo M., et al, European Journal of Endocrinology(2003) 148 383-388）。更に、抗ＩＦＮ−γ抗体や抗ＴＮＦ−α抗体を使用することにより自己免疫疾患の症状が実際に改善することが報告されている（Skurkovich B & Skurkovich S, Curr Opin Mol Ther. 2003 Feb;5(1):52-7）。従って、これらの疾患の原因因子であるＴｈ１サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γやＴＮＦ−α）を抑制することは、これらの疾患の治療に有効である。
【００６０】
本発明において用いられる高重合度プロアントシアニジンは、自己抗体が誘導されたマウスにおいて自己抗体の産生を抑制する（実施例３０）。本発明において用いられる高重合度プロアントシアニジンを含有する抽出物は、自己抗体産生と密接な関連性を有するＢ細胞の活性化を抑制する（実施例２５）。従って、本発明による医薬組成物は、自己抗体の産生抑制やＢ細胞の活性化の抑制が治療に有効である疾患の治療に有効である。
【００６１】
自己抗体の産生抑制やＢ細胞の活性化の抑制が治療に有効である疾患としては、自己抗体媒介型自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、自己免疫性溶血性貧血、シェーグレン症候群、急性リウマチ熱、尋常性天疱瘡、自己免疫性血小板減少性紫斑病、および混合型本態性クリオグロブリン血症）が挙げられる。
【００６２】
自己抗体媒介型自己免疫疾患では、自己抗体の産生あるいは産生亢進や、Ｂ細胞の活性化が認められている（Clin.Exp.Immunol.,1985:62:639-46; N.Engl.J.Med.,338:1359）。更に、Ｂ細胞の活性化の抑制が自己抗体産生に起因する自己免疫疾患の治療に有効であること（Int. Immunol.,2001:13(7):921-31）、自己反応性Ｂ細胞の増殖阻害と全身性エリテマトーデスの改善が一致すること（J.Clin.Invest.,2000:106(1):91-101）が報告されている。従って、これらの疾患の原因因子である自己抗体の産生を抑制することや自己抗体の産生に密接に関連するＢ細胞の活性化を抑制することは、これらの疾患の治療に有効である。本発明において「自己抗体の産生抑制」とは、自己抗体の産生と密接に関連するＢ細胞の活性化の抑制を含む意味で用いられるものとする。
【００６３】
本発明において用いられるプロアントシアニジンはＴｈ１サイトカインの産生を抑制することができる。従って本発明は、Ｔｈ１サイトカインの産生が本質的な原因である疾患を根治でき、あるいはその疾患の進行を阻害できる点で、対症療法的に用いられる治療剤よりも有利である。特に慢性関節リウマチについては、炎症の抑制や痛みの軽減といった対症療法的に用いられる従来の治療剤とは異なり、根治治療することあるいは疾患の進行を阻害することが可能となる点で、本発明は有利であると言える。プロアントシアニジンによる慢性関節リウマチの根治治療は、実施例２８および２９において慢性関節リウマチモデルマウスにおいて臨床スコアが改善されたとともに、実施例３０においてリウマチ抗体（自己抗体）の産生が抑制されたことからも裏付けられている。また、プロアントシアニジンによる慢性関節リウマチの病状の進行阻害は、実施例２８および２９において慢性関節リウマチモデルマウスにおいて一次免疫成立後においても臨床スコアが改善されたとともに、実施例３０においてリウマチ抗体（自己抗体）の産生が抑制されたことからも裏付けられている。
【００６４】
慢性関節リウマチにおいては、疾患の初期においてＴ細胞（具体的にはＴｈ１細胞）が活性化され、それに伴って症状が発現しはじめること、疾患の中期あるいは慢性期において、活性化したＴ細胞によりＢ細胞の自己抗体産生が促され、異常に産生された自己抗体により症状の慢性化、重篤化に至ることが報告されている（Cin Exp Immunol 1998; 111:521-526; Springer Semin Immunopathol. 2003 Aug;25(1):3-18; Immunol Rev. 1990 Dec;118:193-232）。またマウスにおいてＩｇＧレベルを低下させることによりリウマチが抑制されたことが報告されている（Ann Rheum Dis.,2003,62:707-14）。上記のようにプロアントシアニジンはＴｈ１サイトカインを抑制し、Ｔｈ１細胞の活性化を抑制するとともに、Ｔｈ１細胞活性化により刺激された自己抗体であるリウマチ抗体の産生を実際に抑制した。また本発明による有効成分は、自己抗体産生と密接な関連性を有するＢ細胞の活性化を抑制した。従って、本発明において用いられるプロアントシアニジンは、慢性関節リウマチの初期の病状のみならず、慢性化、重篤化した病状の治療に用いることができる点でも有利である。
【００６５】
従って本発明によれば、（ｉ）重合度が４以上のプロアントシアニジン（好ましくは、重合度が５以上のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン）、または（ii）プロアントシアニジン（好ましくは、重合度が５以上のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン）を含有する植物素材の抽出物を有効成分として含んでなる、慢性関節リウマチの根治治療剤およびその進行阻害剤が提供される。
【００６６】
本発明によればまた、治療上の有効量の（ｉ）重合度が４以上のプロアントシアニジン（好ましくは、重合度が５以上のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン）、または（ii）プロアントシアニジン（好ましくは、重合度が５以上のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン）を含有する植物素材の抽出物を、必要であれば薬学上許容される担体とともに哺乳類に投与することを含んでなる、慢性関節リウマチを根治治療する方法およびその進行を阻害する方法が提供される。
【００６７】
本発明によればまた、慢性関節リウマチの根治治療剤およびその進行阻害剤の製造のための、（ｉ）重合度が４以上のプロアントシアニジン（好ましくは、重合度が５以上のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン）、または（ii）プロアントシアニジン（好ましくは、重合度が５以上のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン）を含有する植物素材の抽出物の使用が提供される。
【００６８】
本発明において「治療」とは、疾患の改善、調節、遅延、予防（特に、発症の予防および再発予防）を含む意味で用いられる。
【００６９】
医薬組成物および食品組成物
本発明による治療剤は、前述した本発明による有効成分であるプロアントシアニジン、あるいは、それを含有した植物エキスや該エキスからの部分精製物を、有効成分として用い、生理学的に許容されうる担体、賦形剤、結合剤、希釈剤などと混合することにより製造できる。本発明による治療剤は、経口または非経口的に投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤が挙げられる。非経口剤としては、注射剤（例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤）、点滴剤、外用剤（例えば、経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤）、坐剤（例えば、直腸坐剤、膣坐剤）が挙げられる。これらの製剤は、当分野で通常行われている手法により、薬学的に許容される担体（例えば、賦形剤、添加剤）とともに製剤化することができる。薬学的に許容される賦形剤や添加剤としては、担体、結合剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤等が挙げられる。薬学的に許容される担体としては、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、澱粉、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ワックス、カカオバター等が挙げられる。
【００７０】
製剤は、例えば下記のようにして製造できる。
【００７１】
経口剤は、有効成分として、例えば賦形剤（例えば、乳糖、白糖、デンプン、マンニトール）、崩壊剤（例えば、炭酸カルシウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム）、結合剤（例えば、α化デンプン、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリビニールピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース）または滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール６０００）を添加して圧縮成形し、次いで必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性の目的のため自体公知の方法でコーティングすることにより製造することができる。コーティング剤としては、例えばエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートおよびオイドラギット（ローム社製、ドイツ、メタアクリル酸・アクリル酸共重合物）などを用いることができる。
【００７２】
注射剤は、有効成分を分散剤（例えば、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０（アトラスパウダー社製、米国）、ＨＣＯ ６０（日光ケミカルズ製）、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウムなど）、保存剤（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコール、クロロブタノール、フェノール）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、ソルビトール、ブドウ糖、転化糖）などと共に水性溶剤（例えば、蒸留水、生理的食塩水、リンゲル液等）あるいは油性溶剤（例えば、オリーブ油、ゴマ油、綿実油、コーン油などの植物油、プロピレングリコール）などに溶解、懸濁あるいは乳化することにより製造することができる。この際、所望により溶解補助剤（例えば、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウム）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン）等の添加物を添加してもよい。
【００７３】
外用剤は、有効成分を固状、半固状または液状の組成物とすることにより製造することができる。例えば、上記固状の組成物は、有効成分をそのまま、あるいは賦形剤（例えば、ラクトース、マンニトール、デンプン、微結晶セルロース、白糖）、増粘剤（例えば、天然ガム類、セルロース誘導体、アクリル酸重合体）などを添加、混合して粉状とすることにより製造できる。上記液状の組成物は、注射剤の場合とほとんど同様にして製造できる。半固状の組成物は、水性または油性のゲル剤、あるいは軟骨状のものがよい。また、これらの組成物は、いずれもｐＨ調節剤（例えば、炭酸、リン酸、クエン酸、塩酸、水酸化ナトリウム）、防腐剤（例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウム）などを含んでいてもよい。坐剤は、有効成分を油性または水性の固状、半固状あるいは液状の組成物とすることにより製造できる。該組成物に用いる油性基剤としては、高級脂肪酸のグリセリド〔例えば、カカオ脂、ウイテプゾル類（ダイナマイトノーベル社製）〕、中級脂肪酸〔例えば、ミグリオール類（ダイナマイトノーベル社製）〕、あるいは植物油（例えば、ゴマ油、大豆油、綿実油）が挙げられる。水性基剤としては、ポリエチレングリコール類、プロピレングリコールが挙げられる。また、水性ゲル基剤としては、天然ガム類、セルロース誘導体、ビニール重合体、アクリル酸重合体が挙げられる。
【００７４】
製剤化に当たっては、本発明による有効成分以外の１種またはそれ以上の医療上有効な有効成分を更に添加・配合してもよい。また本発明による有効成分の投与に当たっては、本発明による有効成分以外の１種またはそれ以上の医療上有効な有効成分を組み合わせて投与してもよい。このような他の有効成分としては、抗炎症剤、消炎鎮痛剤、免疫抑制剤、その他の自己免疫疾患治療剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。抗炎症剤としては、ステロイド抗炎症剤、非ステロイド抗炎症剤が挙げられる。ステロイド抗炎症剤としては、酢酸コルチゾン、ヒドロコルチゾン、酢酸パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾロン、メチルプレドニン、デキサメタゾン、トリアムシノロン、ベタメタゾンが挙げられる。非ステロイド抗炎症剤としては、アスピリン、ジフルニサル、アスピリン・アスコルビン酸、アスピリンダイアルミネートなどのサリチル酸系非ステロイド抗炎症剤；ジクロフェナクナトリウム、スリンダク、フェンブフェン、インドメタシン、インドメタシンファルネシル、アセメタシン、マレイン酸プログルメタシン、アンフェナクナトリウム、ナブメトン、モエゾラク、エトドラグなどのアリール酸系非ステロイド抗炎症剤；メフェナム酸、フルフェナム酸アルミニウム、トルフェナム酸、フロクタフェニンなどのフェナム酸系非ステロイド抗炎症剤；イブプロフェン、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセン、プラノプロフェン、フェノプロフェンカルシウム、チアプロフェン、オキサプロジン、ロキソプロフェン、ナトリウム、アルミノプロフェン、ザルトプロフェンなどのプロピオン酸系非ステロイド抗炎症剤；ピロキシカム、アンピロキシカム、テノキシカム、ロルノキシカム、メロキシカムなどのオキシカム系非ステロイド抗炎症剤；塩酸チアラミド、エピリゾール、エモルファゾンなどの塩基性非ステロイド抗炎症剤が挙げられる。免疫抑制剤としては、サイクロスポリン、ＦＫ５０６が挙げられる。その他の自己免疫疾患治療剤としては、インターフェロンβなどの多発性硬化症治療剤が挙げられる。
【００７５】
本発明による有効成分を、抗炎症剤、消炎鎮痛剤、免疫抑制剤などの他の有効成分と組み合わせることにより、治療活性がより強化された多機能性治療剤を提供することができる。特に、本発明による有効成分を、抗炎症剤や消炎鎮痛剤などの自己免疫疾患の対症療法に用いられる薬剤と併用することにより、自己免疫疾患の根本治療と対症治療が期待できる治療剤を提供することができる。また、本発明による有効成分を、免疫抑制剤などの根本治療が期待される薬剤と組み合わせることにより、自己免疫疾患の根本治療効果が強化された治療剤を提供することができる。慢性関節リウマチの治療に当たっては、本発明による有効性成分をコンドロイチンやムコ多糖を主成分とするグルコサミンと組み合わせてて投与してもよい。
【００７６】
本発明による治療剤は、医薬品への適用のみならず、食品への適用も意図されている。従って、本発明による治療剤の食品への適用に当たっては、後述するような食品に関する記述を参照することができる。
【００７７】
本発明による食品は、本発明による有効成分であるプロアントシアニジンを有効量含有した食品である。ここで「有効成分を有効量含有した」とは、個々の飲食品において通常喫食される量を摂取した場合に、後述するような範囲で有効成分が摂取されるような含有量をいう。本発明による食品には本発明による有効成分をそのままあるいは上記のような組成物の形態で、食品に配合することができる。より具体的には、本発明による食品は、前述した本発明による有効成分であるプロアントシアニジン、あるいはそれを含有した植物抽出物や該抽出物からの部分精製物をそのまま、飲食品として調製したもの、各種タンパク質、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類等を更に配合したもの、液状、半液体状若しくは固体状にしたもの、ペースト状のもの、一般の飲食品へ添加したものであってもよい。本発明において「食品」は、医薬以外のものであって、哺乳動物が摂取可能なものであればその形態に特に制限はない。
【００７８】
本発明において「食品」とは、健康食品（例えば、特定保健用食品、栄養機能食品、栄養補助食品）、機能性食品、病者用食品を含む意味で用いられる。
【００７９】
また「食品」の形態は特に限定されるものではなく、例えば、飲料の形態であってもよい。
【００８０】
本発明によれば、重合度が少なくとも４のプロアントシアニジンを、成人１人１日当たり５０〜２０００ｍｇ（好ましくは、４００〜２０００ｍｇ）の摂取量となるように含んでなる、健康食品が提供される。
【００８１】
本発明によればまた、重合度が少なくとも５のプロアントシアニジンを、成人１人１日当たり５０〜２０００ｍｇ（好ましくは、４００〜２０００ｍｇ）の摂取量となるように含んでなる、健康食品が提供される。
【００８２】
上記健康食品に含有されるプロアントシアニジンは、ジャトバ抽出物、葡萄種子抽出物、クランベリー抽出物、シナモン抽出物、松樹皮抽出物、およびカカオ抽出物からなる群から選択される抽出物であって、重合度が少なくとも４あるいは少なくとも５のプロアントシアニジンを含む抽出物の形態で提供されてもよい。
【００８３】
上記健康食品はまた、通常の食品の形状であっても、栄養補助食品の形状（例えば、サプリメント）であってもよい。
【００８４】
本発明による有効成分は、Ｔｈ１偏向させた脾臓細胞においてＴｈ１サイトカイン（具体的には、ＩＦＮ−γ）の産生を抑制し、細胞性免疫過多の状況を改善・抑制作用を有する。本発明による有効成分はまた、自己抗体が誘導されたマウスにおいて自己抗体の産生を抑制する。このため、日常摂取する食品やサプリメントとして摂取する健康食品や機能性食品に本発明の有効成分あるいはジャトバ等の抽出物を添加・配合することにより、Ｔｈ１サイトカイン産生抑制機能、自己抗体産生抑制機能、またはＴｈ１サイトカイン産生増大に関連する状態や自己抗体産生に関連する状態の改善または緩和機能、特に自己免疫疾患の治療機能を併せ持つ食品を提供することができる。
【００８５】
従って、本発明によれば、（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン（好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン）、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物（好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジンを含有する植物素材の抽出物）を有効成分として含む、Ｔｈ１サイトカイン産生抑制機能、自己抗体産生抑制機能、またはＴｈ１サイトカイン産生増大に関連する状態や自己抗体産生に関連する状態（例えば、Ｔｈ１サイトカイン依存型自己免疫疾患や自己抗体媒介型自己免疫疾患に特徴的な全身の強張りや関節の違和感）の改善または緩和機能が表示された食品が提供される。このような表示は、食品の本体、容器、包装、説明書、添付文書、または宣伝物のいずれかに付すことができる。
【００８６】
本発明によれば、（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン（好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン）、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物（好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジンを含有する植物素材の抽出物）を有効量含んでなる食品であって、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制が治療に有効である疾患および／または自己抗体の産生抑制が治療に有効である疾患の治療、それらの疾患の根治治療、および／またはそれらの疾患の進行阻害に用いられる食品が提供される。
【００８７】
本発明によればまた、（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン（好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン）、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物（好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジンを含有する植物素材の抽出物）を有効量含んでなる食品であって、Ｔｈ１サイトカイン産生抑制機能、Ｔｈ１サイトカイン産生増大に関連する状態の改善または緩和機能、自己抗体産生抑制機能、または自己抗体産生に関連する状態の改善または緩和機能を有する食品が提供される。
【００８８】
本発明によれば更に、（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物であって、Ｔｈ１サイトカイン産生抑制機能、Ｔｈ１サイトカイン産生増大に関連する状態の改善または緩和機能、自己抗体産生抑制機能、または自己抗体産生に関連する状態の改善または緩和機能を有する抽出物を含んでなる食品が提供される。
【００８９】
本発明による食品は、Ｔｈ１サイトカイン産生抑制機能、自己抗体産生抑制機能、またはＴｈ１サイトカイン産生増大に関連する状態や自己抗体産生に関連する状態の改善または緩和機能等の機能を期待する消費者に適した食品、すなわち、特定保健用食品、として提供することができる。ここでいう特定保健用食品とは、Ｔｈ１サイトカイン産生抑制、自己抗体産生抑制、またはＴｈ１サイトカイン産生増大に関連する状態や自己抗体産生に関連する状態の改善または緩和等を目的として食品の製造または販売等を行う場合に、保健上の観点から、各国において法上の何らかの制限を受けることがある食品をいう。
【００９０】
本発明の有効成分あるいはジャトバ等の抽出物の添加・配合の対象である日常摂取する食品としては、飯類、麺類、パン類およびパスタ類等炭水化物含有飲食品；クッキーやケーキなどの洋菓子類、饅頭や羊羹等の和菓子類、キャンディー類、ガム類、ヨーグルト、プリン、ゼリーなどの冷菓や氷菓などの各種菓子類；ジュースや清涼飲料水、乳飲料等の各種飲料；卵を用いた加工品、魚介類（イカ、タコ、貝、ウナギなど）や畜肉（レバー等の臓物を含む）の加工品（珍味を含む）などを例示することができるが、これらに特に制限されない。
【００９１】
本発明のより好ましい態様によれば、添加・配合の対象である食品としては、飲料（例えば、茶飲料、乳飲料）、ヨーグルトが挙げられる。
【００９２】
ここで茶飲料とは、ツバキ科の常緑樹である茶樹の葉（茶葉）、または茶樹以外の植物の葉もしくは穀類等を煎じて飲むための飲料をいい、発酵茶、半発酵茶および不発酵茶のいずれも包含される。茶飲料の具体例としては、日本茶（例えば、緑茶、麦茶）、紅茶、ハーブ茶（例えば、ジャスミン茶）、中国茶（例えば、中国緑茶、烏龍茶）、ほうじ茶等が挙げられる。
【００９３】
ここで乳飲料とは、生乳、牛乳等またはこれらを原料として製造した食品を主原料とした飲料をいい、牛乳等そのもの材料とするものの他に、例えば、栄養素強化乳、フレーバー添加乳、加糖分解乳等の加工乳を原料とするものも包含される。
【００９４】
またヨーグルトには、ハードタイプ、ソフトタイプ、ドリンクタイプのいずれのものも包含され、さらにヨーグルトを原料とする加工ヨーグルト製品も包含される。
【００９５】
本発明の有効成分あるいはジャトバ等の抽出物の添加・配合の対象である日常摂取する食品としてはまた、プロアントシアニジンを元来含有する食品が挙げられる。本発明の有効成分あるいはジャトバ等の抽出物を、プロアントシアニジンを元来含有する食品に添加・配合することにより、Ｔｈ１サイトカイン産生抑制機能、自己抗体産生抑制機能、またはＴｈ１サイトカイン産生増大に関連する状態や自己抗体産生に関連する状態の改善または緩和機能を強化することができる。ここで「強化」とは、食品に当初から含まれている有効成分の量が、期待される機能の発現に必要とされる量以上となるように本発明による有効成分あるいは抽出物を添加・配合することをいう。また、「プロアントシアニジンを元来含有する食品」としては、例えば、クランベリージュースやクランベリージャムなどのクランベリー製品；チョコレート菓子、ココアなどのカカオ製品；シナモンスティック、シナモンシュガー、シナモンガム、シナモンティーなどのシナモン製品が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９６】
本発明の有効成分あるいはジャトバ等の抽出物の添加・配合の対象であるサプリメントとして摂取する健康食品や機能性食品の形態としては、例えば、ジュースや茶のような飲料、ゼリー、カプセル、顆粒剤、粒剤、ペーストが挙げられる。本発明の有効成分あるいはジャトバ等の抽出物を、単独で、あるいは他の成分（例えば、植物素材）と組み合わせて、飲料、ゼリー、カプセル、顆粒剤、粒剤、ペーストなどの形態に加工することによりで、Ｔｈ１サイトカイン産生抑制機能、自己抗体産生抑制機能、またはＴｈ１サイトカイン産生増大に関連する状態や自己抗体産生に関連する状態の改善または緩和機能を有するサプリメントなどの健康食品や機能性食品として提供することができる。特に、本発明による有効成分以外の成分であって、抗炎症作用、消炎鎮痛作用、または免疫抑制作用があるとされる他の成分と組み合わせることによって、Ｔｈ１サイトカイン産生増大に関連する状態や自己抗体産生に関連する状態の改善または緩和機能をより強化することができる。抗炎症作用、消炎鎮痛作用、または免疫抑制作用があるとされる他の成分は公知の成分から選択することができる。抗炎症作用を有する成分としては、アリシン、カプサイシン、ブロメリン、硫化アリルが挙げられる。これらの成分は植物素材に含まれており、例えば、アリシンを含む植物素材としては、玉ねぎ、にら、にんにく、ニラ、葉ねぎが、カプサイシンを含む植物素材としては、唐辛子が、ブロメリンを含む植物素材としては、パイナップルが、硫化アリルを含む植物素材としては、あさつき、にんにく、エシャロット、ねぎ、葉ねぎ、ニラ、らっきょうが、それぞれ挙げられる。また、免疫抑制作用を有する成分としてはグリチルレチン酸が挙げられ、グリチルレチン酸を含む植物素材としては、カンゾウが挙げられる。また、リウマチに効果があるとされる雷公藤；I型糖尿病に効果があるとされる人参湯；多発性硬化症に効果があるとされるカンラン；乾癬症に効果があるとされるPolypodium Leucotomos等の植物素材を組み合わせることができる。また、本発明による機能以外の機能を発揮する他の成分あるいは他の機能性食品と組み合わせることによって、多機能性の食品を提供することができる。
【００９７】
本発明において提供される飲料（飲料形態の健康食品や機能性食品を含む）の製造に当たっては、通常の飲料の処方設計に用いられている糖類、香料、果汁、食品添加剤などを適宜添加することができる。飲料の製造に当たってはまた、当業界に公知の製造技術を参照することができ、例えば、「改訂新版ソフトドリンクス」（株式会社光琳）を参考とすることができる。
【００９８】
本発明の好ましい態様によれば、重合度が少なくとも５のプロアントシアニジン（好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン）を、Ｔｈ１サイトカイン産生抑制機能、自己抗体産生抑制機能、またはＴｈ１サイトカイン産生増大に関連する状態や自己抗体産生に関連する状態の改善または緩和機能の強化等を目的として、プロアントシアニジンを元来含有する食品へ添加・配合することができる。
【００９９】
本発明による有効成分または抽出物を、そのまま食用に供する場合や、あるいは一般食品の原料に添加・配合して食品とする場合は、有効成分の苦みが食品の味に影響しない範囲で用いるか、または苦味がマスクされるような工夫をすることが好ましい。例えば、有効成分または抽出物を、カプセルに注入するか、あるいは適当なコーティング剤でコーティングすることにより、苦味をマスクすることができる。カプセル化された形態としてはゼラチンカプセル、プルランカプセルが挙げられる。コーティングされた形態としては糖衣錠が挙げられる。
【０１００】
本発明による食品は様々な形態を取ることができ、公知の医薬品の製造技術に準じて本発明による食品を製造してもよい。その場合には、本発明による治療剤の製造の項目において述べたような担体や製剤用添加剤を用いて製造することができ、具体的には、経口剤の欄に記載された担体や製造用添加剤を用いて製造することができる。
【０１０１】
本発明による有効成分であるプロアントシアニジンは、人類が食品として長年摂取してきたカカオやブドウ類に多く含まれていることから、毒性も低く、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル等）に対し安全に用いることができる。
【０１０２】
本発明による治療剤および食品を投与あるいは摂取する場合、本発明による有効成分の投与量または摂取量は、受容者、受容者の年齢および体重、症状、投与時間、剤形、投与方法、薬剤の組み合わせ等に依存して決定できる。例えば、本発明による有効成分を医薬として経口投与する場合、プロアントシアニジン量として成人１人１日当たり５０〜５０００ｍｇ、好ましくは５０〜２０００ｍｇ、非経口的に投与する場合は５〜５００ｍｇ、好ましくは５〜２００ｍｇの範囲で投与することができる。本発明による有効成分と組み合わせて用いる他の作用機序を有する薬剤も、それぞれ臨床上用いられる用量を基準として適宜決定できる。また、食品として摂取する場合には、成人１人１日当たり５０〜５０００ｍｇの範囲、好ましくは５０〜２０００ｍｇの範囲の摂取量となるよう本発明による有効成分を食品に配合することができる。
【０１０３】
本発明による治療剤の好ましい態様によれば、（ｉ）重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン、または（ii）重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジンを含有する植物素材の抽出物を有効成分として含んでなる、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制が治療に有効である疾患（特に、Ｔｈ１サイトカイン依存型自己免疫疾患）の治療剤、それらの疾患の根治治療剤、およびそれらの疾患の進行阻害剤が提供される。
【０１０４】
本発明の好ましい態様によればまた、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制が治療に有効である疾患（特に、Ｔｈ１サイトカイン依存型自己免疫疾患）の治療剤、それらの疾患の根治治療剤、およびそれらの疾患の進行阻害剤の製造のための、（ｉ）重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン、または（ii）重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジンを含有する植物素材の抽出物の使用が提供される。
【０１０５】
本発明の好ましい態様によればまた、治療上の有効量の（ｉ）重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン、または（ii）重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジンを含有する植物素材の抽出物を、必要であれば薬学上許容される担体とともに哺乳類に投与することを含んでなる、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制が治療に有効である疾患（特に、Ｔｈ１サイトカイン依存型自己免疫疾患）の治療方法、その疾患の根治治療方法、およびその疾患の進行阻害方法が提供される。
【０１０６】
Ｔｈ１サイトカインの産生抑制剤および自己抗体産生抑制剤
本発明によれば、（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン（好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン）、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物（好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジンを含有する植物素材の抽出物）を有効成分として含んでなる、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制剤が提供される。
【０１０７】
本発明によればまた、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制剤の製造のための（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン（好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン）、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物（好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジンを含有する植物素材の抽出物）の使用が提供される。
【０１０８】
本発明によればまた、有効量の（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン（好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン）、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物（好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジンを含有する植物素材の抽出物）を哺乳類に投与することを含んでなる、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制方法が提供される。
【０１０９】
Ｔｈ１サイトカインは、好ましくは、ＩＦＮ−γである。
【０１１０】
Ｔｈ１サイトカインの産生抑制剤は、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制を目的とした医薬品への適用のみならず、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制を目的とした食品への適用も意図されている。従って、本発明によるＴｈ１サイトカインの産生抑制剤の実施に当たっては、前記のような治療剤に関する記述および食品に関する記述を参照することができる。
【０１１１】
本発明によれば、（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン（好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン）、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物（好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジンを含有する植物素材の抽出物）を有効成分として含んでなる、自己抗体の産生抑制剤が提供される。
【０１１２】
本発明によればまた、自己抗体の産生抑制剤の製造のための、（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン（好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン）、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物（好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジンを含有する植物素材の抽出物）の使用が提供される。
【０１１３】
本発明によればまた、有効量の（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン（好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジン）、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物（好ましくは、重合度が少なくとも５のプロシアニジンおよび／またはプロデルフィニジンを含有する植物素材の抽出物）を哺乳類に投与することを含んでなる、自己抗体の産生抑制方法が提供される。
【０１１４】
自己抗体の産生抑制剤は、自己抗体の産生抑制を目的とした医薬品への適用のみならず、自己抗体の産生抑制を目的とした食品への適用も意図されている。従って、本発明による自己抗体の産生抑制剤の実施に当たっては、前記のような治療剤に関する記述および食品に関する記述を参照することができる。
【０１１５】
検定方法
本発明によれば、試料中のプロアントシアニジンの重合度を測定する工程を含んでなる、Ｔｈ１サイトカイン産生抑制活性の検定方法であって、４以上の重合度のプロアントシアニジンの検出がＴｈ１サイトカイン産生抑制活性を示すことを特徴とする方法が提供される。
【０１１６】
検定の対象である試料としては、例えば、植物原料由来の抽出物や乾燥粉末が挙げられる。植物原料としては、プロアントシアニジンを含む植物原料のみならず、プロアントシアニジンの含有が不明な植物原料も含まれる。抽出物としては、例えば、水や有機溶媒による抽出物が挙げられる。
【０１１７】
検定の対象である試料としてはまた、合成されたプロアントシアニジンやプロアントシアニジンが含有されているか不明な試料が挙げられる。
【０１１８】
プロアントシアニジンの重合度は、例えば、電子スプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）やマトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）により測定することができる。
【０１１９】
本発明による検定方法では、試料中に５以上の重合度のプロアントシアニジンが含まれているか否かを指標にすることができる。実施例３１および図５０に示されたように、重合度が５以上のプロアントシアニジンはＥＡＥモデルマウスにおいて高い治療活性を示す。従って、このような指標を採用することにより、試料が強いＴｈ１サイトカイン産生抑制活性を有するか否かを検定することができる。
【０１２０】
本発明による検定方法ではまた、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制が治療に有効である疾患の治療活性の検定に用いることができる。
【実施例】
【０１２１】
以下実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によりその技術的範囲が限定されるものではない。
【０１２２】
実施例１：Ｔｈ１偏向マウス脾臓細胞を用いた各種アマゾンハーブ抽出物のＩＦＮ−γ産生抑制能の検討
一連のアマゾンハーブについてＴｈ１偏向させたマウスの脾臓細胞を用いて、インビトロにおけるＩＦＮ−γ産生抑制能を検討した。
【０１２３】
１．実験方法
（１）試料
サマンバイア（Polypodium lepidopteris）、ジャトバ（Hymenaea courbaril）、キャッツクロー（Uncaria tomentosa）、シジウム（Psidium guajava）、ヘルゴンサッチャ（Dracontium loretense Krause）の市販乾燥粉末（有限会社エジソン・エス・アール・エル日本事務所）１０ｇにエタノールを２００ｍＬ加え、一晩攪拌した。ろ過後、溶媒を留去し、エタノール抽出物を得た（表２）。抽出物をそれぞれ１％エタノールに溶解し、投与試料とした。
【０１２４】
表２：本発明の実施例において、サマンバイア、ジャトバ、キャッツクロー、シジウム、そしてヘルゴンサッチャのエタノール抽出物重量を示す。
【表２】
【０１２５】
（２）実験動物
６−８週齢、雄性、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（チャールズリバー社）に第０日目と第７日目に卵白アルブミン（ＯＶＡ、生化学工業(株)）１ｍｇをcomplete freund’s adjuvant（シグマ社）にMycobacterium tuberculosis H37 Ra（Difco社）を０．８ｍｇ添加したもの（以下、ＣＦＡと表記する。）に混合し、エマルジョン化したものを腹腔内投与した。第１４日目に解剖し、常法に従い、脾細胞を調製した。
【０１２６】
（３）脾細胞ＩＦＮ−γの測定
ＩＦＮ−γの測定はＯｐｔＥＩＡ ＥＬＩＳＡ Ｓｅｔ（ベクトン・ディッキンソン社）を用いて測定した。
【０１２７】
（４）実験条件
実験動物の方法で調製した脾細胞をＲＰＭＩ１６４０（シグマ社）＋１０％ ＦＣＳ（ロシュ社）＋１ｍｇ ＯＶＡ培地で５×１０６細胞／ｍｌになるように懸濁し、２００μｌ／ウェルで９６穴プレートに分注した。さらに試験する各ハーブ抽出物を１００あるいは５００μｇ／ｍｌで添加した。１週間後に培養上清を回収し、Ｔｈ１サイトカインとしてＩＦＮ−γを測定した。
【０１２８】
２．実験結果
結果を表３に示す。サマンバイアにはＩＦＮ−γ産生抑制能は見られず、むしろ上昇した。他のハーブ抽出物でも同様なＩＦＮ−γ産生の上昇が見られた。ジャトバでのみ、顕著なＩＦＮ−γ産生抑制が見出された。
【０１２９】
表３：Ｔｈ１偏向させたマウスの脾臓細胞を用いて、抗原特異的に産生されたＴｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γに対する各種アマゾンハーブの抑制、または亢進活性を示す。
【表３】
【０１３０】
実施例２：インビトロにおけるジャトバ抽出物IFN-γ抑制活性の濃度依存性検討
実験１によってＩＦＮ−γ抑制活性をインビトロで示したジャトバ抽出物について濃度依存性を検討した。
【０１３１】
１．実験方法
（１）投与試料
ジャトバ乾燥粉末１００ｇに５００ｍＬのエタノールを加え、一晩、室温で攪拌した。ろ過後、残渣を再度同量エタノールで抽出した。ろ液を濃縮乾固し、２７．２ｇのエタノール抽出物を得た。抽出物を１％エタノールに溶解し、投与試料とした。
【０１３２】
（２）実験動物
実施例１と同様にＯＶＡをＣＦＡでエマルジョン化したものをＣ５７ＢＬ／６に２回免疫し、Ｔｈ１偏向マウスを作製した。
【０１３３】
（３）脾細胞ＩＦＮ−γの測定
ＩＦＮ−γの測定はＯｐｔＥＩＡ ＥＬＩＳＡ Ｓｅｔ（ベクトン・ディッキンソン社）を用いて測定した。
【０１３４】
（４）実験条件
脾細胞はＲＰＭＩ１６４０（シグマ社）＋１０％ ＦＣＳ（ロシュ社）＋１００μｇ／ｍｌ ＯＶＡ培地で３７℃、５％ＣＯ２の条件で１週間培養し、培養上清を回収し、ＩＦＮ−γ濃度測定を行った。ジャトバ抽出物の添加濃度は０（コントロール）、１５．５，３１，６２．５，１２５，２５０，５００μｇ／ｍｌとした。
【０１３５】
２．実験結果
７日後の培養上清中ＩＦＮ−γ濃度を表４に示す。コントロール（ジャトバ無添加）でＯＶＡ添加によって強いＩＦＮ−γ産生が見られた。ジャトバ濃度依存的にＩＦＮ−γ産生は抑制され、１２５μｇ／ｍｌ以上で殆ど産生は見られなくなった。以上の結果、ジャトバはインビトロにおいてＴｈ１サイトカインを抑制する活性があることが示された。これは細胞性免疫過多によって起こる自己免疫疾患の予防・治療に有効である可能性を示す。
【０１３６】
表４：Ｔｈ１偏向させたマウスの脾臓細胞を用いて、抗原特異的に産生されたＴｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γに対するジャトバの抑制活性の容量依存性を示す。
【表４】
【０１３７】
実施例３：実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルを用いたジャトバ抽出物のインビボでの効果Ｉ
ジャトバ抽出物のインビボでの効果を明らかにするために、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルマウスで検討した。ＥＡＥモデルマウスは、ヒト多発性硬化症のモデルとして用いられている（Antel JP., 1999. J Neuroimmunol 100, 181-189）。
【０１３８】
１．実験方法
（１）投与試料
実施例２で調製したものを用いた。
【０１３９】
（２）実験動物
Ｃ５７ＢＬ／６、雄性、６−８週齢のマウスに対して、第０日目にMyelin oligodendrocyte glycoprotein peptide（以下「ＭＯＧペプチド」と表記する：キアゲン社）２００μｇをＣＦＡ ８００μｇと混合して、エマルジョン化したものを皮下投与し、第１日目と第３日目に百日咳毒素（ＰＴＸ：Calbiochem社）２００ｎｇを腹腔内投与することにより実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘導した。試験期間を通じてマウスは標準固形飼料ＣＥ−２（アメリカ国立栄養研究所による標準組成）を供与された。飲用水は水道水を用いた。
【０１４０】
（３）実験条件
Ｃ５７ＢＬ／６、雄性、６−８週齢を１群１０匹でコントロール群、２０ｍｇ／ｋｇ群、５０ｍｇ／ｋｇ群、および５０ｍｇ／ｋｇ前投与群に分けた。コントロール群は第０日目にＭＯＧ抗原投与後、第３０日目まで週３回１％エタノールを腹腔内投与した。２０ｍｇ／ｋｇ群、５０ｍｇ／ｋｇ群は第０日目にＭＯＧ抗原投与後、第３０日目まで週３回ジャトバを所定量投与した。５０ｍｇ／ｋｇ前投与群はＭＯＧ抗原投与２週間前から合計７回ジャトバを５０ｍｇ／ｋｇで投与し、抗原感作後は１％エタノールに切り替えた。実験スケジュールを図２に示す。
【０１４１】
（４）臨床スコアのつけ方
スコア０：正常、スコア１：尾の麻痺、スコア２：正向不全、スコア３：後肢片方麻痺、スコア４：両後肢麻痺、スコア５：前後肢麻痺、スコア６：死亡で、第５５日目まで毎日各個体の臨床スコア（clinical score）を記録した。
【０１４２】
（５）Ｅｘ ｖｉｖｏ ＩＦＮ−γ，ＴＮＦ−α産生能測定
第１２日目で各群５匹を解剖し、脾細胞を調製した。脾細胞はＲＰＭＩ１６４０（シグマ社）＋１０％ ＦＣＳ（ロシュ社）±ＭＯＧ２μＭで培養し、１週間培養後の上清についてＩＦＮ−γ濃度を、１０日後培養上清についてＴＮＦ−α濃度を測定した。ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αの測定はＯｐｔＥＩＡ ＥＬＩＳＡ Ｓｅｔ（ベクトン・ディッキンソン社）を用いた。
【０１４３】
（６）脊髄病理切片の作製と脱髄の観察
脊髄の脱髄がジャトバによって抑制されるかを検討するために、組織切片の作製と観察を行った。第１５日目のコントロール群およびジャトバ群のマウスから脊髄を摘出し、２０％のホルマリン溶液中で固定後、パラフィン包埋して５μｍ切片をミクロトームＲＭ２１４５（ライカ社）にて作製した。切片を脱パラフィン後、ルクソールファストブルー溶液（武藤化学薬品社）で髄鞘染色し、水洗い後、コールドシッフ試薬で細胞質を染色した。最後にヘマトキシリンで核を染色し、顕微鏡下で観察した。
【０１４４】
２．実験結果
臨床スコアの平均値の経時変化グラフを図３に示す。コントロール群では第９日目で発症が始まり、第１６日目で平均スコアが３．５を上回った。２０ｍｇ／ｋｇ群では第１５日目近辺で発症が始まり、第２１日目前後でピークの平均スコア１．５になったが、その後症状は回復した。５０ｍｇ／ｋｇでは発症しなかった。また、５０ｍｇ／ｋｇ前投与群では第３０日目前後で発症し、第４１日目にピークの平均スコアが２程度になったが、その後回復した。以上の結果、ジャトバは明確なＥＡＥ発症抑制効果を持つ事が明らかになった。またＥＡＥ誘導前に投与しておくと、発症が３週間遅延するという予防効果もあることが明らかになった。
【０１４５】
Ｅｘ ｖｉｖｏサイトカイン産生量を図４に示す。ＩＦＮ−γについてはコントロール群で６０，０００ｐｇ／ｍｌと高濃度の産生が見られているが、２０ｍｇ／ｋｇ群では３０，０００ｐｇ／ｍｌ前後と半減し、５０ｍｇ／ｋｇ群では５０００ｐｇ／ｍｌ前後と激減した。ＴＮＦ−αについても、コントロール群で１８０ｐｇ／ｍｌ前後であったのが、２０ｍｇ／ｋｇ群で１１０ｐｇ／ｍｌ前後と減り、５０ｍｇ／ｋｇ群で２０ｐｇ／ｍｌ前後と激減した。さらに、脊髄切片のルクソールファストブルー染色による観察結果を図５に示した。コントロール群脊髄切片写真を見ると、脱髄による青く染色されない個所（切片写真中の組織右側個所）が観察されるのに対し、ジャトバ群ではそのような脱髄が抑制されていることが明らかである。以上の結果はジャトバがＴｈ１サイトカイン産生を強く抑制し、ＥＡＥの症状を抑制したことを示している。
【０１４６】
実施例４：ＥＡＥモデルを用いたジャトバ抽出物のインビボでの効果ＩＩ
実施例３の効果がマウス種によらないことを示す為、実施例３とは異なったマウス種を用いて、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルによる検討を行った。
【０１４７】
１．実験方法
（１）投与試料
実施例２で調製したものを用いた。
【０１４８】
（２）実験動物
ＳＪＬ／Ｊ、雄性、８−１０週齢のマウス（購入先：チャールスリバー社）に対して、Proteolipid protein peptide（以下「PLPペプチド」と表記する：キアゲン社）１００μｇをＣＦＡ ８００μｇにエマルジョン化したものを皮下投与し、第１日目と第３日目にＰＴＸ２００ｎｇを腹腔内投与することにより実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘導した。飼料および飲用水は実施例３と同様のものを用いた。
【０１４９】
（３）実験条件
ＳＪＬ／Ｊ、雄性、８−１０週齢を１群１０匹でコントロール群、５０ｍｇ／ｋｇ群を設定した。抗原およびジャトバ抽出物の投与法・時期は実施例３の実験に準じた。
【０１５０】
（４）Ｅｘ ｖｉｖｏ ＩＦＮ−γ，ＴＮＦ−α産生能測定
実施例３と同様に実施した。但し、培養時に添加する抗原は２μＭＰＬＰペプチドとした。
【０１５１】
２．実験結果
前記実施例３とは異なったマウス種であるＳＪＬ／Ｊにおいても、図６に示すようにｅｘ ｖｉｖｏでのＩＦＮ−γ産生はジャトバ投与によって殆ど見られなくなっており、ジャトバのＥＡＥ抑制効果はマウス種によらないことが明らかになった。
【０１５２】
実施例５：ＥＡＥモデルを用いたジャトバ抽出物単回前投与によるインビボでの効果
ジャトバ投与によるＥＡＥ発症予防について単回前投与による検討を行なった。
【０１５３】
１．実験方法
（１）投与試料
実施例２のジャトバエタノール抽出物を用いた。
【０１５４】
（２）実験動物
実施例３で示したＣ５７ＢＬ／６マウスをＭＯＧ抗原で免疫する方法でＥＡＥを誘導した。一群は１０匹で、第１２日目に半数を解剖した。
【０１５５】
（３）実験条件
ジャトバ５０ｍｇ／ｋｇを、第０日目にＭＯＧ抗原を投与する前である第−１日目に、一回腹腔内投与する。
【０１５６】
（４）Ｅｘ ｖｉｖｏ ＩＦＮ−γ産生能測定
第１２日目で５匹を解剖し、脾細胞を調製した。脾細胞はＲＰＭＩ１６４０（シグマ社）＋１０％ ＦＣＳ（ロシュ社）±ＭＯＧ２μＭで培養し、１週間培養後の上清についてＩＦＮ−γ濃度を測定した。ＩＦＮ−γの測定はＯｐｔＥＩＡ ＥＬＩＳＡ Ｓｅｔ（ベクトン・ディッキンソン社）を用いた。
【０１５７】
２．実験結果
ＥＡＥの臨床スコア平均値の経時変化では、コントロール群が第９日目に発症したのに対して、１回前投与した場合２日の遅れが観察された（図７Ａ）。以上の結果、前記実施例３の複数回前投与よりは効果が劣るものの１回投与のみでも効果が認められた。本実施例および前記実施例３の前投与の結果を踏まえると、回数の増加と共に予防効果は増大することが示唆された。脾細胞のＩＦＮ−γ産生能は１回予防投与でも、著しく減少することが示された（図７Ｂ）。
【０１５８】
実施例６：ジャトバ抽出物の成分検討（Ｉ）
ジャトバ抽出物の活性成分の特性を明らかにするために、ジャトバ抽出物をポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）で吸着処理し、非吸着画分の活性を実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルで検証した。
【０１５９】
１．実験方法
（１）投与試料
実施例２のジャトバエタノール抽出物３．４９ｇを水５００ｍＬに溶解し、ポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ シグマ社）５０ｇを加えて一晩攪拌した。その後吸引濾過し、凍結乾燥を行ない、４２０．３ｍｇのＰＶＰＰ処理物、すなわちＰＶＰＰ非吸着画分を得た。
【０１６０】
（２）実験動物
実施例３で示したＣ５７ＢＬ／６マウスをＭＯＧ抗原で免疫する方法でＥＡＥを誘導した。一群は１０匹で、第１２日目に半数を解剖した。
【０１６１】
（３）実験条件
コントロール群は第３０日目まで週３回１％エタノールを腹腔内に注射した。ジャトバ群はジャトバエタノール抽出物を、ジャトバＰＶＰＰ処理群はＰＶＰＰ処理したジャトバエタノール抽出物をそれぞれ週３回、５０ｍｇ／ｋｇで投与した。
【０１６２】
（４）Ｅｘ ｖｉｖｏ ＩＦＮ−γ，ＴＮＦ−α産生能測定
第１２日目で各群５匹を解剖し、脾細胞を調製した。脾細胞はＲＰＭＩ１６４０（ＳＩＧＭＡ）＋１０％ ＦＣＳ（ロシュ）±ＭＯＧ２μＭで培養し、１週間培養後の上清についてＩＦＮ−γ濃度を、１０日後培養上清についてＴＮＦ−α濃度を測定した。ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αの測定はＯｐｔＥＩＡ ＥＬＩＳＡ Ｓｅｔ（ベクトン・ディッキンソン）を用いた。
【０１６３】
２．実験結果
結果を図８に示す。コントロール群は第１３日目に発症し、ジャトバ群は第２１日目まで発症しなかった。ジャトバＰＶＰＰ処理群は第１５日目に発症した。脾細胞のＩＦＮ−γ，ＴＮＦ−α産生能はジャトバ群では顕著に抑制されたが、ジャトバＰＶＰＰ処理群では殆どコントロール群と変わらなかった（図９）。以上の結果、ＰＶＰＰ処理によってジャトバの活性は著しく減弱しており、従って、ジャトバの活性成分はＰＶＰＰに吸着することが明らかになった。ＰＶＰＰはポリフェノールを強力に吸着する性質を有し、ポリフェノールの除去剤として知られている（Loomis, W.D., Battaile, J., 1966. Phytochem. 5, 423-438., Loomis, W.D., 1969. In: Lowenstein, J.M., (Ed.), Methods in enzymology Vol. 13. Academic Press, New York, pp. 555-563. Loomis, W.D., 1974. In: Fleischer, S., Packer, L., (Eds.), Methods in enzymology Vol. 31. Academic Press, New York, pp. 528-544.）。ジャトバエタノール抽出物の８８％がＰＶＰＰに吸着したことから、ジャトバ抽出物の８８％はポリフェノールであり、そして活性成分もポリフェノールである可能性が示唆された。
【０１６４】
実施例７：ジャトバ抽出物の成分検討（ＩＩ）
実施例６より、ジャトバの活性成分はポリフェノールである可能性が示唆された。活性本体をさらに追求する目的で、ジャトバエタノール抽出物について以下の実験を実施した。
【０１６５】
１．実験方法
（１）塩酸−ブタノール法
ジャトバエタノール抽出物を文献（J. Agric. Food Chem. 1998, 46, 1698-1705）の方法に従い、塩酸−ブタノール法に供した。すなわちジャトバエタノール抽出物の４ｍｇ／ｍＬメタノール溶液を調製し、その２５０μＬに、５％塩酸を含む１−ブタノール１．５ｍＬと、２％硫酸アンモニウムを含む２Ｎ塩酸５０μＬを添加し、９５℃で５０分反応させた。反応液を室温に戻し、５５０ｎｍにおける吸光度を測定した。測定の対照には、ジャトバエタノール抽出物４ｍｇ／ｍＬ（メタノール溶液）を用いた。
【０１６６】
（２）順相カラムクロマトグラフィ（ＮＰ−ＨＰＬＣ）
ジャトバエタノール抽出物を文献（Journal of Chromatography A. 1993. 255-260）の方法に従い、ＮＰ−ＨＰＬＣに供した。ポンプおよび制御装置はShimazu LC-10Advp、UV検出器はShimazu SPD-10Aを用いた。カラム条件を以下に示す。
【０１６７】
カラム：Ｆｉｎｅｐａｋ ＳＩＬ−５ φ４．６×２５０ｍｍ（日本分光）
移動相：
（Ａ）ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２：ＨＣＯＯＨ：Ｈ２Ｏ＝７：４１：１：１３
（Ｂ）ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２：ＨＣＯＯＨ：Ｈ２Ｏ＝４３：７：１：１
移動相グラジェント条件：
時間（分） Ａ溶媒（％） Ｂ溶媒（％）
０ ９５ ５
１０ ８５ １５
３５ ８０ ２０
３７ ７７ ２３
４０ ７７ ２３
４２ ７０ ３０
４５ ５０ ５０
４６ ０ １００
５０ ０ １００
移動相流速：１ｍＬ／分
検出波長：２８０ｎｍ
（３）電子スプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）
ジャトバエタノール抽出物をＥＳＩ−ＭＳに供した。装置はサーモクエスト社ＬＣＱを用いた。測定条件は、インフュージョン法、陰イオンモード、流速６μｌ／分， Sheath gas flow rate 60 arb, Spray voltage 4.5 kV, Capillary temp 200 ℃とした。
【０１６８】
（４）マトリックス支援レーザー脱離イオン化―飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）
ジャトバエタノール抽出物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供した。装置はPerSeptive Biosystems, voyagerを用い、マトリックスとして２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）を用いた。
【０１６９】
２．実験結果
（１）プロアントシアニジンは酸性条件下における加熱処理により、フラバン間の結合が切断され、エクステンションユニットに由来するカルベニウムイオンと、ターミナルユニットに由来するカテキン類を与える。前者はさらに酸化されて赤色のアントシアニジンになる。この原理を利用した呈色法が塩酸−ブタノール法であり、５５０ｎｍにおける吸光度の上昇をして試料中のプロアントシアニジンを鋭敏に検出できる。本法によってジャトバエタノール抽出物は赤色化し、５５０ｎｍにおける吸光度は２．７２となった。このことから、ジャトバに含有されるポリフェノールはプロアントシアニジンであることが明らかとなった。
【０１７０】
（２）ＮＰ−ＨＰＬＣは、プロアントシアニジンのオリゴマー成分を溶出ピークとして検出することができる。しかし、より高重合度の成分はカラムに強く吸着されるために、溶出後半に特徴的なブロード型のクロマトグラムを与える。ジャトバエタノール抽出物のクロマトグラムは８本の溶出ピークと、それに続く特徴的なブロード形状を示したので、プロアントシアニジンのオリゴマーのみならず、より高重合度成分の存在を示唆した。
【０１７１】
（３）ＥＳＩ−ＭＳでは装置の測定限界として分子量２０００までの成分しか観測できなかったが、図１０Ａに示すように、２８８ずつ増加していく分子イオンピークが５本観測された。すなわちジャトバのプロアントシアニジンは、分子量２８８の繰り返し構造を有していた。この分子量はカテキンまたはエピカテキンに相当し、かつガレートの付加がないことを示す。以上のことから、ジャトバエタノール抽出物の主成分はプロアントシアニジンのうち、プロシアニジンであることが明らかとなった。
【０１７２】
（４）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳでは、ＥＳＩ−ＭＳでは観測することができなかった、さらなる高分子領域に属する高重合度プロシアニジンの存在が確認された。すなわち図１０Ｂに示したように、プロシアニジン２０量体以上にまで及ぶ分子イオンピークが観測された。
【０１７３】
実施例８：ジャトバ抽出物の成分検討（III）
実施例７により、ジャトバのエタノール抽出物の主成分がプロシアニジンであることが示された。構成単位の同定、結合様式、重合度の算出、および定量分析を精密に行なう目的で、Guyotらの方法（Sylvain Guyot, Nathalie Marnet, and Jean-Francois Drilleau, J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 14-20）に基づき、チオール開裂分析を行なった。
【０１７４】
１．実験方法
（１）チオール開裂、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）分析
ジャトバエタノール抽出物を４ｍｇ／ｍＬのメタノール溶液に調製し、その２５μＬに３．３％塩酸含有メタノールを２５μＬ、５％トルエン−α−チオール（シグマ社）５０μＬを添加し、４０℃で３０分反応させた後、反応液をそのままＲＰ−ＨＰＬＣに供し、分析した。ポンプはHITACHI L-7100、UV検出器はShimazu SPD-10Aを用いた。カラム条件を以下に示す。
【０１７５】
カラム：ディスカバリー Ｃ１８φ４．６×２５０ ｍｍ（スペルコ社）
移動相：（Ａ）２．５％酢酸／水（ｖ／ｖ）、（Ｂ）アセトニトリル
移動相グラジェント条件：
時間（分） Ａ溶媒（％） Ｂ溶媒（％）
０ ９７ ３
５ ９１ ９
１５ ８４ １６
４５ ５０ ５０
５５ ０ １００
移動相流速：０．６ｍＬ／分
検出波長：２８０ｎｍ
（２）液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ−ＭＳ）による反応物の同定
チオール開裂反応液中にはトルエン−α−チオールが残存するために、反応液をそのままＬＣ−ＭＳに供することができない。そこでまず（１）のＲＰ−ＨＰＬＣにおいてそれぞれのピークを分取し、ＬＣ−ＭＳに供した。ＬＣ部分のポンプはWaters 2690 allianceを使用し、検出は多波長検出器（Waters 996）で行なった。カラム条件を以下に示す。
【０１７６】
カラム：ＹＭＣ Ｐａｃｋ Ｃ１８φ４．６×２５０ ｍｍ
移動相：（Ａ）１％ＨＣＯＯＨ／水（ｖ／ｖ）、（Ｂ）ＭｅＯＨ
移動相グラジェント条件：
時間（分） Ａ溶媒（％） Ｂ溶媒（％）
０ ９０ １０
５ ８４ １６
４５ ５０ ５０
５０ ０ １００
移動相流速：１ｍＬ／分
検出波長：２００−４００ｎｍ
ＭＳのイオン化モードはＥＳＩとし、装置はWaters micromass ZQ2000を用いた。
【０１７７】
（３）トルエン−α−チオール付加に伴うモル吸光係数（ε）値の補正
エピカテキンにトルエン−α−チオールが付加することに伴う２８０ ｎｍにおけるε値の変化を、エピカテキン二量体であるプロシアニジンＢ２を用いて算出した。すなわちプロシアニジンＢ２を（１）の条件でチオール開裂し、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析に供した。
【０１７８】
（４）平均重合度の算出と定量分析
（１）、（２）、および（３）の結果に基づき、ジャトバエタノール抽出物に含まれるプロアントシアニジンの平均重合度と含量を算出した。
【０１７９】
２．実験結果
（１）図１１に示すように、プロアントシアニジンはチオール開裂によって、ターミナルユニットに由来する単量体成分と、エクステンションユニットに由来するベンジルチオエーテル付加体を与えるので、これらをＲＰ−ＨＰＬＣで分離、同定、定量することができる。ジャトバエタノール抽出物のチオール開裂を行なった結果、図１２に示すように、２１．６分と４２．８分に２本のピークが認められた。前者はエピカテキン（ＥＣ）と溶出位置が一致した。これら２本以外には、いかなるピークをも与えなかった。
【０１８０】
Ａタイプ結合はチオール開裂反応で開裂せず、残存する。そのため、もしＡタイプ結合があれば、チオール開裂により、Ａタイプで結合した二量体のベンジルチオエーテル付加体が生成され、ＲＰ−ＨＰＬＣで検出される。チオール開裂分析の結果より、ジャトバのプロシアニジンにはＡタイプ結合は存在せず、従ってＢタイプ結合のみで構成されていることが明らかとなった。
【０１８１】
（２）（１）で検出されたピークをＬＣ−ＭＳによって同定した。すなわちこれら２本のピークは、プロシアニジンＢ２のチオール開裂産物であるＥＣ、およびＥＣのベンジルチオエーテル付加体（ＥＣ−ＢＴＥ）とＬＣ溶出位置および分子量がそれぞれ一致した。（１）と（２）の結果から、ジャトバのプロシアニジンはＥＣのみを構成単位とすることが明らかとなった。
【０１８２】
（３）プロシアニジンＢ２をチオール開裂に供すると、ターミナルユニットに由来するＥＣと、エクステンションユニットに由来するＥＣ−ＢＴＥを等モル比で生成する。ＲＰ−ＨＰＬＣで検出される両成分の２８０ｎｍにおける吸光度すなわちピーク面積値を比較することにより、ＥＣにトルエン−α−チオールが付加することに伴う２８０ｎｍにおけるε値の変化を算出した。その結果、ＥＣのε：ＥＣ−ＢＴＥのε＝１：１．２であった。
【０１８３】
（４）（３）の結果に基づき、ジャトバエタノール抽出物に含まれるプロシアニジンの平均重合度を、以下のように計算した。
【０１８４】
平均重合度＝（Ｔ＋Ｅ／１．２）／Ｔ
Ｔ＝ターミナルユニットのピーク面積
Ｅ＝エクステンションユニットトルエン−α−チオール付加体のピーク面積
その結果、ジャトバエタノール抽出物中に含まれるプロシアニジンの平均重合度は、６．８と算出された。
【０１８５】
チオール開裂反応生成物であるＥＣとＥＣ−ＢＴＥを定量分析することによって、ジャトバエタノール抽出物中のプロシアニジン含量を求めることができる。定量分析に必要なチオール開裂の反応率は、プロシアニジンＢ２を外部標準として用い、生成したＥＣを定量することで求めた。反応率は概して８３％であった。その結果、ジャトバエタノール抽出物中のプロシアニジン含量を７６．０％（ｗ／ｗ）と算出した。
【０１８６】
実施例９：ジャトバのプロシアニジンの分画・分析
実験方法および結果
（１）抽出および分画
ジャトバ市販乾燥粉末２０ｇにエタノール（ＥｔＯＨ）５００ｍＬを加え、一晩、室温で攪拌した。ろ過後、残渣を再度同量ＥｔＯＨで抽出した。ろ液を濃縮乾固し、抽出物６．９７ｇを得た。この抽出物を１００ｍＬの水に再溶し、等量の酢酸エチルで３回抽出した。それぞれを溶媒留去し、水画分５．９３ｇ、酢酸エチル画分８９４ｍｇを得た。水画分をメタノール（ＭｅＯＨ）に再溶し、Saucierらの方法（J. Agric. Food Chem., 2001. 49: 5732- 5735）に基づき、クロロホルム（ＣＨＣｌ３）を順次加え、生じた沈殿を分別した。本法により、プロシアニジンを重合度別に分画することができる。酢酸エチル画分はＣ１８カラムによる固相抽出を行ない、さらに２つの画分に分別した。すなわち最初にジエチルエーテル（ＤＥＥ）で溶出してＦｒ．７を、次いでＭｅＯＨで溶出してＦｒ．６を得た。それぞれの画分の重量を図１３に示した。
【０１８７】
（２）ジャトバ抽出物ならびに各画分の分析
得られた分画物について、プロシアニジンの平均重合度と含量をチオール開裂分析により算出した（方法は実施例８を参照）。図１３に示した通り、本法によって平均重合度を異にするプロシアニジン画分を容易に調製することができた。
【０１８８】
実施例１０：ＥＡＥモデルを用いたジャトバ由来分画サンプルのＩＦＮ−γ抑制活性
実施例９で分画されたサンプルをＥＡＥモデルマウスに腹腔内投与し、脾細胞のＩＦＮ−γ抑制活性を検討した。
【０１８９】
１．実験方法
（１）投与試料
実施例２のジャトバエタノール抽出物および実施例９で分画された分画物Ｆｒ．１−７を使用した。
【０１９０】
（２）実験条件
Ｃ５７ＢＬ／６、雄性、６週齢を１群３匹でコントロール群、ジャトバ群（未分画）、Ｆｒ１−Ｆｒ７群に分けた。コントロール群は第０日目にＭＯＧ抗原投与後、第０，２，４，７，９日目の合計５回、１％エタノールを腹腔内投与した。ジャトバ群は同じスケジュールで５０ｍｇ／ｋｇ投与した。各フラクションは同じスケジュールで５０ｍｇ／ｋｇで投与した。第１１日目に剖検し、脾細胞をＭＯＧと共培養し、培養上清中のＩＦＮ−γ産生量をＥＬＩＳＡにて測定した。
【０１９１】
２．実験結果
結果を図１４に示す。コントロール群では約２００００ｐｇ／ｍｌのＩＦＮ−γ産生が見られたが、ジャトバ群では殆ど産生が見られなかった。Ｆｒ５−７ではコントロールに比べ、若干のＩＦＮ−γ産生が見られた。Ｆｒ１−４においては殆どＩＦＮ−γの産生がなかった。以上の結果、自己免疫疾患の増悪因子であるＩＦＮ−γ産生を抑制する活性は、平均重合度６．５以上で顕著に強い活性を有し、重合度が高い程同活性は高くなることが示唆された。
【０１９２】
実施例１１：ジャトバ抽出物の成分検討（IV）
実施例８ではジャトバに含まれるプロシアニジンの構成単位の同定、結合様式の決定、重合度の算出、および定量分析を精密に行なう目的でチオール開裂分析を行なった。プロシアニジンの平均重合度および定量分析をさらに厳密に行なう目的で、エピカテキン（ＥＣ）のトルエン−α−チオール付加誘導体（ＥＣ−ＢＴＥ）を精製・単離し、高分解能質量分析（ＨＲ−ＭＳ）と核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）に供し、構造の同定を行なった後、これを標品としてＨＰＬＣ分析を行なった。精製・単離された標品を用いて分析を行うことにより、より精密に、プロシアニジンの構成単位の同定、結合様式の決定、重合度の算出を行うことができた。
【０１９３】
１．実験方法
（１）ＥＣ−ＢＴＥの単離・精製
実施例９で調製したＦｒ．１を実施例８の手法でチオール開裂を行ない、反応物をＨＰＬＣに供し、ＥＣ−ＢＴＥのピークを分取した。カラム条件を以下に示す。
【０１９４】
カラム Ｃａｄｅｎｚａ ＣＤ−Ｃ１８ C18 φ１０×２５０ ｍｍ（インタクト社）
移動相 メタノール：水：ギ酸（５０：４９．８：０．２、ｖ／ｖ／ｖ）
移動相流速 ２ｍＬ／分
検出波長 ２８０ｎｍ
（２）ＥＣ−ＢＴＥの構造同定
前項で得たＥＣ−ＢＴＥを、まず精密分子量を得る目的でＨＲ−ＭＳに供した。装置はＪｅｏｌＪＭＳ−７００（日本電子株式会社）を用い、イオン化モードは高速原子衝撃（ＦＡＢ）とし、イオン化電圧は７０ｅＶとした。また、文献値とシグナルを比較するためにプロトンＮＭＲスペクトルを測定した。装置はＶａｒｉａｎ社製ＵＮＩＴＹ ＩＮＯＶＡ−５００（５００ＭＨｚ）を用いた。
【０１９５】
（３）プロシアニジンのＨＰＬＣ分析
得られたＥＣ−ＢＴＥを標品とし、実施例８に示した条件でＨＰＬＣ分析を行ない、プロシアニジンの平均重合度と含量を算出した。平均重合度は以下のように計算した。
【０１９６】
平均重合度＝（Ｔ＋Ｅ）／Ｔ
Ｔ＝ターミナルユニット（ＥＣ）のモル量
Ｅ＝エクステンションユニット（ＥＣ−ＢＴＥ）のモル量
含量は試料中のプロシアニジン量をＥＣ換算した重量％で求めた。
【０１９７】
２．実験結果
（１）６６ｍｇのＦｒ．１より１０．８ｍｇのＥＣ−ＢＴＥを得た。
【０１９８】
（２）ＨＲ−ＭＳの結果、ＭＨ＋として４１３．１０６１のイオンピークが観測され、分子式がＣ２２Ｈ２１Ｏ６Ｓと定まり、ＥＣ−ＢＴＥと一致した。またプロトンＮＭＲスペクトル（図１５）も文献値（Chem. Pharm. Bull., 40, 889-898, 1992）と一致し、さらに１Ｈ−Ｄｅｔｅｃｔｅｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｂｏｎｄ Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｃｏｈｅｒｒｅｎｃｅ（ＨＭＢＣ）スペクトルにおいて、ベンジルチオールのＳＣＨ２部位のプロトンからフラバン環４位カーボンへの遠隔相関シグナルが観測されたので（図１６）、ベンジルチオールはフラバン環４位に付加していることが証明され、以上の事実からＥＣ−ＢＴＥ構造が完全に同定された。
【０１９９】
（３）ＥＣ−ＢＴＥを標品として用いてＨＰＬＣ分析を行なった結果得られたプロシアニジンの平均重合度と含量を図１７に示した。
【０２００】
実施例１２：プロシアニジン含有試料の調製と分析（Ｉ）
実施例１０より、ジャトバの活性本体が特定重合度以上のプロシアニジンであることが明らかになったので、更にプロシアニジンを含有する他素材の探索を行った。
【０２０１】
１．試料
市販の素材である、グラビノールＳＬ（キッコーマン株式会社）、ポリフェノン（東京テクノフード株式会社）、アップルフェノン（ニッカウヰスキー株式会社）、クランベリーパウダー（キッコーマン株式会社）、カカオポリフェノール（明治製菓株式会社）、松樹皮エキス（有限会社素材機能研究所）、シナモン粉末（ヱスビー食品株式会社）を試料として用いた。
【０２０２】
２．実験方法
（１）シナモン試料の調製
シナモン粉末３０．５ｇをエタノール３００ ｍＬで抽出し、得られたエタノール抽出物を濃縮乾固した後、５０％メタノール／水に再溶し、等量のクロロホルムで４回抽出した。含水メタノール画分を溶媒留去後、１％エタノール／水による抽出を行なった。
【０２０３】
（２）クランベリー試料の調製
クランベリーパウダーより、高重合度プロシアニジンを含有する試料を調製した。すなわちクランベリーパウダー９ｇを水６００ｍＬに溶解し、セファデックスＬＨ−２０樹脂を充填したカラム（φ２．６ｃｍ×７２ｃｍ）に供した。５ｍＬ／分の流速で１Ｌずつの水、メタノールで溶出した後、最後に１Ｌの７０％アセトン／水で溶出した。このカラムクロマトグラフィを３回実施した。
【０２０４】
（３）プロシアニジン分析
実施例８のチオール開裂分析法により、各試料および（１）で調製したシナモン試料、（２）で調製したクランベリー試料に含有されるプロシアニジンを定量し、平均重合度、構成成分、結合様式を決定した。また試料によってはフラバン環３位水酸基へのガレート付加があったので、それに伴う２８０ｎｍにおけるモル吸光係数（ε）値の変化を、エピカテキン（ＥＣ）とエピカテキンガレート（ＥＣＧ）を用いて算出した。
【０２０５】
３．実験結果
（１）シナモンエタノール抽出物を３．９１ｇ得た。分配後の含水メタノール画分１．４５ｇより、１％エタノール／水可溶画分６３５ｍｇが得られ、これをシナモン試料とした。
【０２０６】
（２）合計２７ｇのクランベリーパウダーより、水画分２０．８ｇ、メタノール画分３０３ｍｇ、含水アセトン画分２１７ｍｇを得た。チオール開裂分析法により、含水アセトン溶出画分を高重合度プロシアニジン画分とした。
【０２０７】
（３）各試料に含まれるプロシアニジンの分析結果は表５のようになった。ジャトバについては実施例８を参照。ガレート付加体とその修飾体のピーク同定は、実施例８の１．（２）と同様に液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によって行なった。ＥＣとＥＣＧの２８０ｎｍにおけるε値の比は１：３．１であったので、ガレート付加体を定量する際にはピーク面積を３．１で除算し、補正した。
【０２０８】
表５：本発明の実施例において、ジャトバ、グラビノールＳＬ、ポリフェノン、アップルフェノン、クランベリー高重合度画分精製物、カカオポリフェノール、松樹皮エキス、そしてシナモン粗分画物に含有されるプロシアニジンについて、平均重合度、含量、そして構成成分の分析結果を示す。
【表５】
【０２０９】
ポリフェノンは緑茶由来のポリフェノール粗精製物であるが、プロシアニジンのオリゴマーは検出されず、主成分はエピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）、ＥＣ、ＥＣＧ、カテキン（ＣＡ）の単量体のみであった。グラビノールＳＬはブドウ種子由来、アップルフェノン（登録商標）はリンゴ由来のプロシアニジン粗精製物であり、構成成分はＣＡ、ＥＣ、ＥＣＧであった。また、松樹皮エキス、カカオポリフェノール、シナモンのプロシアニジンはＣＡ、ＥＣから構成されていた。試料の平均重合度は１から６．８の範囲にあり、ジャトバの平均重合度が最も高かった。
【０２１０】
アップルフェノンの平均重合度は２．７であったが、チオール開裂を経ない試料を実施例８の１．（２）の条件でＬＣ−ＭＳに供した結果、観測されたのはプロシアニジン二量体、三量体、四量体の分子イオンピークのみであった。さらに実施例８の１．（１）の条件で逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）による定量分析を行なった結果、主成分は三量体（３８．１％，ｗ／ｗ）であった（図１８）。
【０２１１】
クランベリーのプロシアニジン高重合度画分をチオール開裂し、実施例８の１．（２）の条件でＬＣ−ＭＳに供した結果、Ａタイプ結合の存在が確認された。Ａタイプ結合はクランベリー以外の試料では認められなかった。
【０２１２】
実施例１３：プロシアニジン含有試料の調製と分析（ＩＩ）
１．実験方法
実施例１２で得られた知見をさらに精査する目的で、市販の素材であるシナモン（株式会社岡田薬局）、ピクノジェノール（株式会社バレンタイン）、グラビノール（キッコーマン株式会社）について、実施例９と同様のクロロホルム添加による沈殿分別分画法を行なった。
【０２１３】
（１）シナモン
２００ｇのシナモン粉末に２Ｌのエタノールを加え、１晩室温で抽出した。ろ過してシナモン抽出液を得て、溶媒留去し、粗抽出物２２．５８ｇを得た。これをメタノール：水（５０：５０、ｖ／ｖ）４００ｍＬに溶解し、濃度を４０ｇ／Ｌに調整した。これを等容のクロロホルムで３回洗浄し、夾雑物を除去した。含水メタノール画分を減圧溶媒留去し、１１．９７ｇの試料を得た。これを３００ｍＬのメタノールに再溶し、等容のクロロホルムを加え、クロロホルム：メタノール（５０：５０、ｖ／ｖ）溶液とした。得られた沈殿（Ｆｒ．１）をガラス漏斗（ポアサイズＰ１６）でろ過して分別後、ろ液に１５０ｍＬのクロロホルムを添加してクロロホルム：メタノール（６０：４０、ｖ／ｖ）溶液とした。生じた沈殿（Ｆｒ．２）を同様に分別し、ろ液に２５０ｍＬのクロロホルムを加えてクロロホルム：メタノール（７０：３０、ｖ／ｖ）溶液とした。生じた沈殿（Ｆｒ．３）を分別後、ろ液に２００ｍＬのクロロホルムを加えてクロロホルム：メタノール（７５：２５、ｖ／ｖ）溶液とした。生じた沈殿（Ｆｒ．４）を分別し、ろ液を溶媒留去してＦｒ．５とした。
【０２１４】
（２）ピクノジェノール
１０ｇのピクノジェノールを水２００ｍＬに溶解し、等容の酢酸エチルで４回分配を行ない、水層を乾固して６．５４ｇの試料を得た。これを１６４ｍＬのメタノールに溶解し、濃度を４０ｇ／Ｌに調整した。これに（１）と同様にクロロホルムを順次添加し、沈殿分別を行ない、Ｆｒ．１からＦｒ．５を調製した。
【０２１５】
（３）グラビノール
１０ｇのグラビノールを水２００ｍＬに溶解し、（２）と同様の手法でＦｒ.１からＦｒ.５を調製した。
【０２１６】
２．実験結果
（１）各画分の調製結果
シナモン、ピクノジェノール、グラビノールのプロシアニジンをクロロホルム沈殿分別法で分画した結果、得られた各画分の重量と重量比を表６に示す。
【０２１７】
表６：（１）から（３）で得られた分画物の重量を示す。
【表６】
【０２１８】
実施例１４：プロシアニジン含有試料の調製と分析（ＩＩＩ）
プロシアニジンの平均重合度および定量分析を精密に行なう目的で、実施例１２で得られた各調製物をチオール開裂反応に供し、実施例１１と同様の方針で計算した。すなわちエピカテキンガレート（ＥＣＧ）のトルエン−α−チオール付加誘導体（ＥＣＧ−ＢＴＥ）およびカテキン（ＣＡ）のトルエン−α−チオール付加誘導体（ＣＡ−ＢＴＥ）を精製・単離し、高分解能質量分析（ＨＲ−ＭＳ）と核磁気共鳴（ＮＭＲ）に供し、構造の同定を行なった後、それぞれを標品として当該成分のＨＰＬＣ分析を行なった。
【０２１９】
１．実験方法
（１）ＥＣＧ−ＢＴＥの単離・精製
グラビノールを実施例８の方法でチオール開裂を行ない、反応物をＨＰＬＣに供し、ＥＣＧ−ＢＴＥのピークを分取した。カラム条件を以下に示す。
【０２２０】
カラム ＸＴｅｒｒａ ＭＳ Ｃ１８ φ１９×１００ ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ社）
移動相 ０．２％（ｖ／ｖ）ギ酸水：メタノール（４７：５３）
移動相速度 ３ｍL／分
検出波長 ２８０ｎｍ
（２）ＥＣＧ−ＢＴＥの構造同定
前項で得たＥＣＧ−ＢＴＥについて、ＥＣＧのフラバン環４位へのベンジルチオール付加を立証するために、ＮＭＲスペクトルを測定した。装置はＶａｒｉａｎ社製ＵＮＩＴＹ ＩＮＯＶＡ−６００（６００ＭＨｚ）を用いた。シグナルの比較のため、市販標品ＥＣＧ（フナコシ株式会社）のプロトン（１Ｈ）ＮＭＲを測定した。
【０２２１】
（３）ＣＡ−ＢＴＥの単離・精製
ニュージーランド産の松樹皮エキスであるエンゾジノール（株式会社バレンタイン）を実施例８の方法でチオール開裂を行ない、反応物をHPLCに供し、ＣＡ−ＢＴＥのピークを分取した。カラム条件を以下に示す。またＣＡ−ＢＴＥのピークを同定する目的で、Ｐｒｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｂ３（ＣＡの２量体）をチオール開裂に供した。
【０２２２】
カラム Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標） Ｃ１８ φ１０×２５０ ｍｍ（シグマ−アルドリッチ社スペルコ事業部）
移動相 ０．２％（ｖ／ｖ）ギ酸水：メタノール（５０：５０）
移動相速度 ２ｍL／分
検出波長 ２８０ｎｍ
（４）ＣＡ−ＢＴＥの構造同定
前項で得たＣＡ−ＢＴＥについて、ＣＡのフラバン環４位へのベンジルチオール付加を立証するために、ＮＭＲスペクトルを測定した。装置はＶａｒｉａｎ社製ＵＮＩＴＹ ＩＮＯＶＡ−６００（６００ＭＨｚ）を用いた。シグナルの比較のため、市販標品ＣＡ（フナコシ株式会社）のプロトン（１Ｈ）ＮＭＲを測定した。
【０２２３】
（５）プロシアニジンのＨＰＬＣ分析
実施例１１で得られたエピカテキン−ベンジルチオールエーテル（ＥＣ−ＢＴＥ）と、今回得られたＥＣＧ−ＢＴＥ、ＣＡ−ＢＴＥをそれぞれを標品とし、実施例８に示した条件でＨＰＬＣ分析を行ない、プロシアニジンの平均重合度と含有量を算出した。平均重合度は以下のように計算した。
【０２２４】
平均重合度＝（Ｔ＋Ｅ）／Ｔ
Ｔ＝ターミナルユニット（ＥＣ、ＥＣＧ、ＣＡ）のモル量
Ｅ＝エクステンションユニット（ＥＣ−ＢＴＥ、ＥＣＧ−ＢＴＥ、ＣＡ−ＢＴＥ）のモル量
２．実験結果
（１）３２６ｍｇのグラビノールより３２．０ｍｇのＥＣＧ−ＢＴＥを得た。
【０２２５】
（２）ＥＣＧ−ＢＴＥのプロトンＮＭＲをＥＣＧのそれと比較した結果（図１９）、ＥＣＧでは２．８５ｐｐｍ、３．００ｐｐｍに観測されたフラバン環４位メチレンのシグナルがＥＣＧ−ＢＴＥでは消失し、代わりにベンジルチオール付加に伴い、４．１７ｐｐｍに低磁場シフトした４位メチンのシグナルと、７．２ｐｐｍ〜７．５ｐｐｍの領域にベンジルチオールのアロマティックプロトンのシグナルが観測された。また、１Ｈ−Detected Multiple-bond Heteronuclear Multiple Quantum Coherrence（ＨＭＢＣ）スペクトルにおいて、ベンジルチオールのＳＣＨ２部位のプロトンから４位カーボンへの遠隔相関シグナル、および４位プロトンからＳＣＨ２部位のカーボンへの遠隔相関シグナルが観測されたので（図２０）、ベンジルチオールはフラバン環４位に付加していることが証明された。なお、４位カーボン、ＳＣＨ２部位のカーボンのシグナルは、Heteronuclear Single Quantum Coherence（ＨＳＱＣ）スペクトル（図２１）により帰属した。以上の事実から、ＥＣＧ−ＢＴＥ構造が同定された。
【０２２６】
（３）Ｐｒｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｂ３のチオール開裂反応物よりＣＡ−ＢＴＥのカラム溶出位置を１８．６分と定めた。９０ｍｇのエンゾジノールより１１．３ｍｇのＣＡ−ＢＴＥを得た。
【０２２７】
（４）ＣＡ−ＢＴＥのプロトンＮＭＲをＣＡのそれと比較した結果（図２２）、ＣＡでは２．５０ｐｐｍ、２．８５ｐｐｍに観測されたフラバン環４位メチレンのシグナルがＣＡ−ＢＴＥでは消失し、代わりにベンジルチオール付加に伴い、４．３６ｐｐｍに低磁場シフトした４位メチンのシグナルと、７．２ｐｐｍ〜７．４ｐｐｍの領域にベンジルチオールのアロマティックプロトンのシグナルが観測された。また、１Ｈ−Detected Multiple-bond Heteronuclear Multiple Quantum Coherrence（ＨＭＢＣ）スペクトルにおいて、ベンジルチオールのＳＣＨ２部位のプロトンから４位カーボンへの遠隔相関シグナル、および４位プロトンからＳＣＨ２部位のカーボンへの遠隔相関シグナルが観測されたので（図２３）、ベンジルチオールはフラバン環４位に付加していることが証明された。なお、４位カーボン、ＳＣＨ２部位のカーボンのシグナルは、Heteronuclear Single Quantum Coherence（ＨＳＱＣ）スペクトル（図２４）によりアサインした。以上の事実から、ＣＡ−ＢＴＥ構造が同定された。
【０２２８】
（５）チオール開裂で生成するＥＣ、ＣＡ、ＥＣＧ、ＥＣ−ＢＴＥ、ＣＡ−ＢＴＥ、そしてＥＣＧ−ＢＴＥをそれぞれ標品として用いてＨＰＬＣ分析を行なった結果得られた各調製物のプロシアニジンの平均重合度と含有量％（ｗ／ｗ）を表７に示した。
【０２２９】
表７：ジャトバ、グラビノールＳＬ、ポリフェノン、アップルフェノン、クランベリー高重合度画分精製物、カカオポリフェノール、松樹皮エキス、そしてシナモン粗分画物に含有されるプロシアニジンについて、平均重合度、含量、そして構成成分の分析結果を示す。
【表７】
【０２３０】
実施例１５：プロシアニジン含有試料の調製と分析（ＩＶ）
実施例１３で得られたシナモン、ピクノジェノール、グラビノール由来のそれぞれの画分について、実施例８と同様にチオール開裂反応後、実施例１４と同様の方針でプロシアニジンの構成単位の同定、重合度の算出、および含有量の定量分析を行なった。
【０２３１】
１．実験方法
実施例１１で得られたエピカテキン−ベンジルチオールエーテル（ＥＣ−ＢＴＥ）と、実施例１４で得られたＥＣＧ−ＢＴＥ、ＣＡ−ＢＴＥをそれぞれ標品とし、実施例８に示した条件でＨＰＬＣ分析を行ない、プロシアニジンの平均重合度と含有量を算出した。平均重合度は以下のように計算した。
【０２３２】
平均重合度＝（Ｔ＋Ｅ）／Ｔ
Ｔ＝ターミナルユニット（ＥＣ、ＥＣＧ、ＣＡ）のモル量
Ｅ＝エクステンションユニット（ＥＣ−ＢＴＥ、ＥＣＧ−ＢＴＥ、ＣＡ−ＢＴＥ）のモル量
２．実験結果
チオール開裂で生成するＥＣ、ＣＡ、ＥＣＧ、ＥＣ−ＢＴＥ、ＣＡ−ＢＴＥ、そしてＥＣＧ−ＢＴＥをそれぞれ標品として用いてＨＰＬＣ分析を行ない、得られた各画分のプロシアニジンの平均重合度と含有量％（ｗ／ｗ）を表８に示した。
【０２３３】
表８：シナモン、ピクノジェノール、グラビノールをクロロホルム沈殿分別法で分画した結果得られた各画分のプロシアニジン（ＰＣ）の平均重合度と含有量％（ｗ／ｗ）を示す表である。参考としてジャトバの数値を附記してある。
【表８】
【０２３４】
実施例１６：ジャトバプロシアニジン３量体〜６量体の精製
１．実験方法
実施例９で調製したＦｒ．５より、プロシアニジンの３量体から６量体までをカラム精製した。まずＬＣ−ＭＳで各オリゴマーの溶出位置を決め、次いで日立製のＨＰＬＣで大量精製を行なった。各々の条件を以下に示す。
【０２３５】
（１）ＬＣ−ＭＳ
カラム：Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標） ＨＳ ＰＥＧ φ１０×２５０ ｍｍ，５μｍ（シグマ−アルドリッチ社スペルコ事業部）
ポンプ：Ｗａｔｅｒｓ社ａｌｌｉａｎｃｅ（商標名）２６９０
移動相：０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸入りメタノール：０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸水（６０：４０、ｖ／ｖ）
移動相流速：２ｍＬ／分
検出波長：２８０ｎｍ（Ｗａｔｅｒｓ社２９９６多波長検出器）
ＭＳ装置：Ｗａｔｅｒｓ社ｍｉｃｒｏｍａｓｓＺＱ２０００
Ｆｒ．５は１００μｇ／μＬの濃度のメタノール溶液１０μＬにメタノール６０μＬを加え、水で１２０μＬに希釈した溶液を１００μＬインジェクトした。ＵＶ検出器の出口流路を１／６にスプリットし、ＭＳに導入した。イオン化モードはＥＳＩのネガティブイオンモードとし、分子量２０００以上のプロシアニジンについては２価イオンで検出を行なった。コーン電圧は４０Ｖとした。
【０２３６】
（２）大量精製
カラム、移動相、移動相流速、検出波長は（１）と同様とし、ポンプを日立Ｌ−７１００、検出器を日立Ｌ−７４５５（多波長検出器）とした。サンプルループ容量は１ｍＬとし、Ｆｒ.５の１５０ｍｇをメタノール：水（５０：５０、ｖ／ｖ）溶媒１ｍLに溶解した試料を１回のインジェクト量とした。
【０２３７】
２．実験結果
（１）ＬＣ−ＭＳ
２８０ｎｍでモニターしたクロマトグラムと、ＭＳクロマトグラムを図２５に示した。各オリゴマーにおいて複数のピークが検出されているのは４→８結合と４→６結合から構成される異性体があるためであると考えられる。Ｆｒ．５より、７量体までの重合体が検出され、８量体、９量体のピークは検出されなかった。なお、ＭＳ装置の性能として検出上限が２０００なので、分子量１７３０の６量体までを１価イオンで検出し、７量体は２価イオン（１００９）で検出した。
【０２３８】
ＰＥＧカラムにより、各オリゴマーは重合度順に溶出されていることが明らかとなった。
【０２３９】
（２）大量精製
（１）でアサインした溶出ピークパターンに基づき、３量体から６量体までの精製を行なった。７量体はＦｒ．５中の含量が少なかったため、分取しなかった。２．３１ｇのＦｒ．５より、１３２．１ｍｇの３量体、１７３．１ｍｇの４量体、１８７．０ｍｇの５量体、１１１．０ｍｇの６量体を得た。精製物の一部を同ＨＰＬＣ条件に供し、純度検定を行なった結果、隣接する各オリゴマーの相互混入は微量であり、それぞれの純度は、３量体が９５．７％、４量体が９２．１％、５量体が９７．４％、６量体が９５．９％であった。
【０２４０】
実施例１７：ジャトバプロシアニジン６量体〜９量体の精製
１．実験方法
実施例９と同様にして調製したＦｒ．４より、プロシアニジンの６量体から９量体までをカラム精製した。まずＬＣ−ＭＳで各オリゴマーの溶出位置を決め、次いで日立製のＨＰＬＣで大量精製を行なった。各々の条件を以下に示す。
【０２４１】
（１）ＬＣ−ＭＳ
カラム：Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）ＨＳ ＰＥＧ φ１０×２５０ ｍｍ，５μｍ（シグマ−アルドリッチ社スペルコ事業部）
ポンプ：Ｗａｔｅｒｓ社ａｌｌｉａｎｃｅ（商標名）２６９０
移動相：０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸入りメタノール：０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸水（８０：２０、ｖ／ｖ）
移動相流速：２ｍＬ／分
検出波長：２８０ｎｍ（Ｗａｔｅｒｓ社２９９６多波長検出器）
ＭＳ装置：Ｗａｔｅｒｓ社ｍｉｃｒｏｍａｓｓＺＱ２０００
Ｆｒ．４については、１００μｇ／μＬの濃度のメタノール溶液８０μＬを水で１２０μＬに希釈した溶液を１００μＬインジェクトした。ＵＶ検出器の出口流路を１／６にスプリットし、ＭＳに導入した。イオン化モードはＥＳＩのネガティブイオンモードとし、分子量２０００以上のプロシアニジンについては２価イオンで検出を行なった。コーン電圧は４０Ｖとした。
【０２４２】
（２）大量精製
カラム、移動相流速、検出波長は（１）と同様とし、移動相を０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸入りメタノール：０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸水（８０：２０、ｖ／ｖ）ポンプを日立Ｌ−７１００、検出器を日立Ｌ−７４５５（多波長検出器）とした。サンプルループ容量は１ｍＬとし、Ｆｒ.４の１５０ｍｇをメタノール：水（７０：３０、ｖ／ｖ）溶媒９００μLに溶解した試料を１回のインジェクト量とした。
【０２４３】
２．実験結果
（１）ＬＣ−ＭＳ
２８０ｎｍでモニターしたクロマトグラムと、ＭＳクロマトグラムを図２６に示した。各オリゴマーにおいて複数のピークが検出されているのは４→８結合と４→６結合から構成される異性体があるためであると考えられる。Ｆｒ．４より、１２量体までの重合体が検出された。なお、ＭＳ装置の性能として検出上限が２０００なので、分子量１７３０の６量体までを１価イオンで検出し、７量体以上は２価イオンで検出した。
【０２４４】
ＰＥＧカラムにより、各オリゴマーは重合度順に溶出されていることが明らかとなった。
【０２４５】
（２）大量精製
（１）の結果、１０量体以上のオリゴマーは量が少なかったので、帰属した溶出ピークパターンに基づき、６量体から９量体までの精製を行なった。２．６６ｇのＦｒ．４より、１５６．２ｍｇの６量体、２２２．９ｍｇの７量体、２３６．１ｍｇの８量体、１７６．４ｍｇの９量体を得た。精製物の一部を同ＨＰＬＣ条件に供し、純度検定を行なった結果、隣接する各オリゴマーの相互混入は微量であり、それぞれの純度は、６量体が９５．９％、７量体が９５．８％、８量体が９０．３％、９量体が９７・０％であった。
【０２４６】
実施例１８：プロシアニジン３量体〜９量体のチオール開裂分析
１．実験方法
実施例１６と実施例１７で得た画分中のプロシアニジン含有量％（ｗ／ｗ）を算出するために、実施例８の方法でチオール開裂分析を行ない、実施例１１の方法で結果を解析した。チオール開裂分析ではプロシアニジン含有量％（ｗ／ｗ）以外に、その平均重合度をも算出できる。なお、６量体については実施例１７で得られたものを用いた。
【０２４７】
２．実験結果
３量体〜９量体の各画分中のプロシアニジン含有量％（ｗ／ｗ）を表９に示した。プロシアニジン（ＰＣ）含有量は低いものでも７１．３％（６量体）、高いものでは８３．０％（３量体）であった。また各々について算出した平均重合度についても表８に示した通り、いずれも目的重合度と符合し、チオール開裂分析法自体の精度が極めて良好であることも示された。
【０２４８】
表９：３量体〜９量体のプロシアニジンを実施例８の方法でチオール開裂分析し、平均重合度とプロシアニジン（ＰＣ）含有量％（ｗ／ｗ）を実施例１１の方法で解析した結果である。オリゴマー純度％（ｗ／ｗ）は実施例１６と実施例１７のＨＰＬＣでの定量結果であり、総純度とはＰＣ含有量にオリゴマー純度を乗算した値である。
【表９】
【０２４９】
実施例１９：プロシアニジンオリゴマーのＨＰＬＣ分析
プロシアニジンは実施例８および実施例１１のチオール開裂分析により平均重合度と含有量％（ｗ／ｗ）を、実施例７、実施例１６、実施例１７の質量分析法により重合体の分布を分析することができるが、実施例１６、実施例１７のＨＰＬＣ条件を以下のように設定することにより、プロシアニジンオリゴマーの分布をより高い重合度まで検出することが可能となる。
【０２５０】
１．実験方法
ＬＣ−ＭＳの条件を以下のように設定した。
【０２５１】
カラム：Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）ＨＳ ＰＥＧ φ１０×２５０ ｍｍ，５μｍ（シグマ−アルドリッチ社スペルコ事業部）
ポンプ：Ｗａｔｅｒｓ社ａｌｌｉａｎｃｅ（商標名）２６９０
移動相：０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸入りメタノール：０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸水（９５：５、ｖ／ｖ）
移動相流速：２ｍＬ／分
検出波長：２８０ｎｍ（Ｗａｔｅｒｓ社２９９６多波長検出器）
ＭＳ装置：Ｗａｔｅｒｓ社ｍｉｃｒｏｍａｓｓＺＱ２０００
実施例９と同様にして調製したＦｒ．５、Ｆｒ．４、Ｆｒ．３については、１００μｇ／μＬの濃度のメタノール溶液８０μＬを水で１２０μＬに希釈した溶液を１００μＬインジェクトした。ＵＶ検出器の出口流路を１／６にスプリットし、ＭＳに導入した。イオン化モードはＥＳＩのネガティブイオンモードとし、分子量２０００以上のプロシアニジンについては２価イオンで検出を行なった。コーン電圧は４０Ｖとした。
【０２５２】
２．実験結果
２８０ｎｍでモニターしたＦｒ．５、Ｆｒ．４、Ｆｒ．３のクロマトグラムをそれぞれ図２７、図２８、図２９に示した。ＭＳによってＦｒ．４、Ｆｒ．３から１３量体までのピークを確認した。ＭＳ装置の性能として検出上限が２０００なので、分子量１７３０の６量体までを１価イオンで検出し、７量体以上は２価イオンで検出した。１３量体は２価イオンで検出できる限界であり（イオンピーク１８７３）、Ｆｒ．４、Ｆｒ．３には、より高重合度のプロシアニジンを含んでいる可能性がある。
【０２５３】
実施例２０：ＥＡＥモデルを用いた各種植物由来試料のインビボでの効果
プロアントシアニジン類の自己免疫疾患改善作用について検討するために、実施例８の各種植物素材由来の試料をＥＡＥモデルマウスで検討した。
【０２５４】
１．実験方法
（１）投与試料
実施例２のジャトバエタノール抽出物および、実施例１２の各試料を使用した。各試料はそのプロシアニジン含量がジャトバエタノール抽出物と同一になるように１％エタノール溶液を調製した。
【０２５５】
（２）実験条件
Ｃ５７ＢＬ／６、雄性、６週齢を１群１０匹でコントロール群、および各試料群に分けた。コントロール群は第０日目にＭＯＧ抗原投与後、第０，２，４，７，９，１１，１４，１６，１８，２１日目の合計１０回、１％エタノールを投与した。各試料群は同じスケジュールでプロシアニジン換算で５０ｍｇ／ｋｇジャトバ相当量を投与した。第１１日目に５匹を剖検し、脾細胞をＭＯＧと共培養し、培養上清中のＩＦＮ−γ産生量をＥＬＩＳＡにて測定した。また、残り５匹は第２５日目まで臨床スコアを観察した。
【０２５６】
２．実験結果
臨床スコアの結果を図３０に示す。コントロールは第１１日目で発症し、最大臨床スコアは２．５前後となった。ジャトバと同様なＥＡＥ発症抑制が見られたのは松樹皮エキス、クランベリー高重合度画分およびシナモン抽出物であり、これらの素材では第２５日目まで明確な発症が認められなかった。グラビノールＳＬでは発症が４日遅れ、臨床スコアではコントロールの半分程度の抑制が見られた。その他の試料ではＥＡＥ抑制はコントロールと同程度であり、効果が認められなかった。脾細胞によるＩＦＮ−γ産生能についてもグラビノール、クランベリー、松樹皮エキス、シナモン、ジャトバでは完全に抑制されたが、その他の試料では明確な抑制は見られなかった（図３１）。
【０２５７】
以上の結果、実施例１２で示したように主成分が三量体であるアップルフェノンに効果が無いことから少なくとも重合度３以下のプロアントシアニジンには自己免疫疾患抑制効果は無いことが示唆された。
【０２５８】
なお、平均重合度でアップルフェノン（２．７２）と大差ないグラビノール（３．１８）に、部分的な抑制活性が認められた点については、アップルフェノンが前述したように三量体が主成分であってそれより高い重合度の物の含有量が乏しいのに対し、予備的試験であるがグラビノールは重合度分布が広く４以上の高重合度のものを十分量含有していることを確認しており、これが両者の差となったと考えられる。
【０２５９】
効果が認められた試料に含まれるプロシアニジンの種類は一義に限定されず、例えばＡタイプ，Ｂタイプの結合様式、構成成分、ガレート付加の有無は活性と相関しないことが明らかとなった。これらのことから、フラバン基本骨格の水酸基の数も活性には関係しないことが容易に演繹される。すなわち活性に関わるのは重合度のみであり、重合度４以上のプロアントシアニジンが自己免疫疾患改善作用を有することが明らかになった。
【０２６０】
実施例２１：高重合度プロシアニジン含有素材における活性の普遍性
高重合度プロシアニジンを含む他素材活性比較のために、松の樹皮（ピクノジェノール）、シナモン、ぶどう種子（グラビノール）からジャトバのＦｒ３相当（平均重合度１０）のものを抽出し、自己免疫疾患改善活性を検討した。
【０２６１】
１．実験方法
（１）投与試料
コントロール群には、１％ ＥｔＯＨ、ジャトバ由来高重合度プロシアニジンとしてジャトバＦｒ３（１５．７）（実施例９）を、グラビノール由来高重合度プロシアニジンとしてグラビノールＦｒ２（８．８）（実施例１３）を、松の樹皮由来高重合度プロシアニジンとしてピクノジェノールＦｒ２（８．６）（実施例１３）を、シナモン由来高重合度プロシアニジンとしてシナモンＦｒ１（１０．２）（実施例１３）を、それぞれ５ｍｇ／ｍｌになるように１％ ＥｔＯＨに溶解した。（）内は、平均重合度を示す。
【０２６２】
（２）実験動物
Ｃ５７ＢＬ／６，雄，７週齢を用い、一群１６匹で開始。ＭＯＧ（２００μｇ）と８００μｇのＨ３７Ｒａを含むＣＦＡをエマルジョン化したものを第０日目に皮内投与、第１日目と第３日目に腹腔内に１μｇ／ｍｌのＰＴＸを２００μｌ（実質２００ｎｇ）投与して疾患を惹起した。
【０２６３】
（３）脾細胞のＩＦＮ−γの測定
ＩＦＮ−γの測定はＯｐｔＥＩＡ ＥＬＩＳＡ Ｓｅｔ（ベクトン・デッキンソン社）を用いて実施した。
【０２６４】
（４）実験条件
各サンプルは１ｍｇ／ｍｏｕｓｅとなるように週３回腹腔内投与した。第１１日目にて剖検し、脾細胞を調製した。脾臓細胞はＲＰＭＩ１６４０（シグマ社）＋１０％ ＦＣＳ（ロシュ社）±２μＭ ＭＯＧ培地で３７℃、５％ＣＯ２の条件で７日間培養し、培養上清を回収し、ＩＦＮ−γ濃度測定を実施した。
【０２６５】
２．実験結果
いずれのプロシアニジン含有素材も高重合度プロシアニジンを濃縮する事により、同様に強い抗自己免疫疾患活性を示す事が分かった（図３２）。また後述する実施例３１において示されているように、抗自己免疫疾患活性は重合度５以上のプロアントシアニジンにより担われている。このことから、当該活性はジャトバに限定されるものではなく、高重合度プロシアニジンを含む他の素材にも適用可能であることが明らかとなった。
【０２６６】
実施例２２：ＴｙｐｅＩＩ コラーゲン誘導関節炎モデルを用いたジャトバのインビボでの効果
ジャトバの慢性関節リウマチにおける効能を調べるために、ＴｙｐｅＩＩ コラーゲン誘導関節炎モデルで検討した。
【０２６７】
１．実験方法
（１）投与試料
実施例２のジャトバエタノール抽出物を用いた。
【０２６８】
（２）実験動物およびその飼育
ＤＢＡ／１Ｊマウス（雄）、８週齢（購入先：チャールスリバー社）に対して、第０日目および第２１日目にＩＩ型コラーゲン（コスモバイオ）１５０μｇをＣＦＡ４００μｇと混合してエマルジョン化したものを皮内投与して誘導した。
【０２６９】
（３）実験条件
１群１０匹でコントロール群、ジャトバ群に分けた。コントロール群は第０日目から第３０日目まで週３回、１％エタノールを腹腔内投与した。ジャトバ群は同じスケジュールで５０ｍｇ／ｋｇでジャトバエタノール抽出物を腹腔内投与した。
【０２７０】
実験スケジュールを図３３に示す。
【０２７１】
（４）臨床スコアのつけ方
スコア０：正常、スコア１：四肢の指など小関節が一本のみ膨張発赤、スコア２：小関節２本以上、あるいは手首・足首など大きな関節が膨張発赤、スコア３：一本の手や足全体が発赤膨張、スコア４：さらに１本の手や足の膨張が最大限に達している
臨床スコアは４本の足全てに対して、上記基準で観察し、４本の合計をスコアとして記録した。
【０２７２】
２．実験結果
臨床スコアの経時変化グラフを図３４に示す。コントロール群では第２１日目に２次免疫を行い（０日目とする）、二次免疫後２日経過した２日目で発症が始まり、それから２週間でほぼ完全発症（スコア１６）した。ジャトバ群では２次免疫後、１週間経過した６日目近辺で発症が始まったが、スコア８までしか病状が進行しなかった。以上の結果、ジャトバ抽出物は慢性関節リウマチにも効果があることが示された。
【０２７３】
実施例２３：Ｉ型糖尿病モデルを用いたジャトバのインビボでの効果
ジャトバのＩ型糖尿病における効能を調べるために、Ｉ型糖尿病が誘導されたＮＯＤ／Ｌｔｊマウスで検討した。
【０２７４】
１．実験方法
（１）投与試料
実施例２のジャトバエタノール抽出物を用いた。
【０２７５】
（２）実験動物、飼育
ＮＯＤ／Ｌｔｊマウス（雌）、４週齢（購入先：チャールスリバー社）に対して１０週齢時にシクロホスファミド（Ｃｙ）を３００ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与した。
【０２７６】
（３）実験条件
１群２０匹でコントロール群、ジャトバ群に分けた。コントロール群は４週齢時から週２回、１％エタノールを腹腔内投与した。ジャトバ群は同じスケジュールで５０ｍｇ／ｋｇでジャトバエタノール抽出物を腹腔内投与した。９週齢時に５匹を剖検し、脾細胞を抗原のひとつであるインスリンと共培養し、培養上清中のＩＦＮ−γ産生量をＥＬＩＳＡにて測定した。また、残り１５匹は１０週齢時にＣｙを投与し、Ｃｙ投与後第３５日目まで臨床スコアを観察した。実験スケジュールを図３５に示す。
【０２７７】
（４）発症の判定
糖尿病の発症率はグルテストエース（三和化学研究所（株））で尾から微量採血したものを測定し、２５０ｍｇ／ｄｌ以上の値を示した場合、陽性とした。
【０２７８】
２．実験結果
糖尿病発症率を図３６に示す。コントロール群ではＣｙ投与後第２８日目で３９％が発症したが、ジャトバ群では１３％しか発症しなかった。
【０２７９】
さらに、９週齢時点の脾細胞のインスリンに対するＩＦＮ−γ産生量を測定したところ、コントロール群では６０００ｐｇ／ｍｌの産生が見られたにも関わらず、ジャトバ群では１０００ｐｇ／ｍｌ程度に抑制されていた。以上の結果、ジャトバ抽出物はＩ型糖尿病にも効果があることが示された（図３７）。
【０２８０】
実施例２４：Ｉ型糖尿病における効能検討
実施例２３ではシクロホスファミドをマウスに投与してＩ型糖尿病を誘導し、そのマウスを実験に用いた。本実施例では、長期的なＩ型糖尿病自然発症モデルマウスを実験に用いることによって、本発明による有効成分の効果をより正確に検証する。
【０２８１】
１．実験方法
（１）投与試料
コントロール群として１％ ＥｔＯＨを、またジャトバ投与群としてジャトバＥｔＯＨ抽出物（実施例２）を５ｍｇ／ｍｌになるように１％ ＥｔＯＨに溶解したもの
（２）実験動物
ＮＯＤ／Ｌｔｊマウス（雌）、４週齢（購入先：チャールスリバー社）。
【０２８２】
（３）実験条件
１群２０匹でＩ型糖尿病自然発症モデルマウスＮＯＤ／Ｌｔｊを４週齢で購入と同時にジャトバＥｔＯＨ抽出物を１ｍｇ／ｍｏｕｓｅ、コントロール群には１％ ＥｔＯＨを２００μｌ腹腔内へ週２回投与を開始。９週目以降、週１回に切り替え、発症率の検討終了の３３週目まで投与を継続した。また一部（ｎ＝３）９週目で剖検し、脾細胞の抗原特異的な反応を検討した。脾細胞はＲＰＭＩ１６４０（シグマ社）＋１０％ ＦＣＳ（ロシュ社）±３００ μｇ／ｍｌ インスリン（シグマ社）で培養し、３日間培養後の上清についてＩＦＮ−γの濃度を測定した。更に１１週目で一部（ｎ＝５）剖検し、脾臓細胞の各種免疫細胞存在比率を調べた。残りの個体は３３週目まで週一回血糖値を測定し、発症率を検討した（図３８）。
【０２８３】
（４）脾細胞のＩＦＮ−γの測定
ＩＦＮ−γの測定はＯｐｔＥＩＡ ＥＬＩＳＡ Ｓｅｔ（ベクトン・デッキンソン社）を用いて実施した。
【０２８４】
（５）ｅｘ ｖｉｖｏ 脾細胞における各種免疫担当細胞比率への影響
１１週目で剖検した各群５匹から脾細胞を調製した。免疫担当細胞の表面マーカーの発現はフローサイトメトリーを用いて実施例２５と同様の条件で調べた。
【０２８５】
（６）発症の判定
糖尿病の発症率はグルテストエース（三和化学研究所（株））で尾から微量採血したものを測定し、２５０ｍｇ／ｄｌ以上の値を示した場合、陽性とした。
【０２８６】
２．実験結果
９週目における抗原依存的な反応を調べた結果、抗原の一つであるインスリン依存的なＩＦＮ−γ産生が検出された。更にジャトバ投与によりこのＩＦＮ−γ産生が抑制された（図３９）。また１１週目で調べた脾臓細胞の各種免疫細胞存在比率に関してはジャトバ投与群でマクロファージの顕著な増加（約６％→２０％）を観察した一方、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞の減少傾向がみられた（図４０）。また増加したマクロファージの表面抗原を調べたところ、ＭＨＣ ｃｌａｓｓＩＩや共刺激分子であるＣＤ４０，ＣＤ８６に関してはそれぞれ発現低下傾向を示し（図４１）、ジャトバ投与群ではＴ細胞活性化能の低い未熟なマクロファージが増加していると考えられる。これは実施例２５におけるＥＡＥモデルにおけるジャトバ投与の効果と同様の傾向である。
【０２８７】
また３３週目における最終的な発症率は対照群の５４％に比較してジャトバ投与群では２２％に抑制されていた（図４２）。以上の結果から、高重合度プロシアニジンを豊富に含むジャトバ抽出物はＩ型糖尿病に対して抑制効果を持つ事が明らかとなった。
【０２８８】
実施例２５：ジャトバEtOH抽出物の脾細胞における各免疫担当細胞比率への影響検討
ジャトバ抽出物の特性を明らかにするために、ｅｘ ｖｉｖｏにおける脾細胞の免疫担当細胞の割合を実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルで検証した。
【０２８９】
１．実験方法
（１）投与試料
ジャトバＥｔＯＨ抽出物（実施例２）を５ｍｇ／ｍｌになるように１％ ＥｔＯＨ溶液に溶解させた。対照群には１％ＥｔＯＨ溶液を用いた。
【０２９０】
（２）実験動物
Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＭＯＧ抗原で免疫する方法でＥＡＥを誘導した一群３匹で第０，２，４，８，１５日目と経時的に剖検を行った。
【０２９１】
（３）実験条件
対照群では週３回１％ＥｔＯＨを２００μｌ、ジャトバ投与群は５ｍｇ／ｍｌ（１％ ＥｔＯＨ溶媒）を２００μｌ腹腔内投与した。
【０２９２】
（４）ｅｘ ｖｉｖｏ 脾細胞ポピュレーション解析
第０，２，４，８，１５日目で各群、３匹解剖し、脾細胞とリンパ節細胞を調製した。免疫担当細胞の細胞表面マーカーの発現はフローサイトメトリーにて解析を行った（ベクトンデッキンソン）。解析する免疫担当細胞は、Ｔ細胞（ＣＤ３）｛ＣＤ４陽性（ＣＤ４）Ｔ細胞、ＣＤ８陽性（ＣＤ８）Ｔ細胞、制御性（ＣＤ４／ＣＤ２５）Ｔ細胞｝、Ｂ細胞（Ｂ２２０）、ＮＫ細胞（ＤＸ５）、マクロファージ（ＣＤ１１ｂ）、樹状細胞（ＣＤ１１ｃ）であり括弧内の細胞表面マーカーを指標とした。マクロファージの成熟度を示す細胞表面マーカーとしてはＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩの抗体を用いた。
【０２９３】
細胞はＦｃ受容体をブロックするためにＣＤ１６／ＣＤ３２（Ｒａｔ ＩｇＧ２ｂ，ｃｌｏｎｅ，９３）でプレインキュベーションし洗浄後、５ｘ１０５ｃｅｌｌｓを５％ＦＢＳ、０．１％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中で目的とする抗原に特異的なマウスの抗体３０分間、４℃でインキュベートした。染色にはfluorescein isothiocyanate （ＦＩＴＣ）−またはphycoerythrin （ＰＥ）−で標識されたモノクローナル抗体を用いた。各々用いた抗体は、ＣＤ３e（Ａｒｍｅｎｉａｎ ｈａｍｓｔｅｒ ＩｇＧ，１４５−２Ｃ１１）， ＣＤ４（Ｒａｔ ＩｇＧ２ｂ， ＧＫ１．５），ＣＤ８a（Ｒａｔ ＩｇＧ２ａ，５３−６．７），ＣＤ１１ｂ （Ｒａｔ ＴｇＧ２ｂ，Ｍ１／７０），ＣＤ１１ｃ （Ａｒｍｅｎｉａｎ Ｈａｍｓｔｅｒ ＩｇＧ，Ｎ４１８）， ＣＤ４０（Ｒａｔ ＩｇＧ２ａ，１Ｃ１０），ＣＤ８０（Ｂ７−１）（Ａｒｍｅｎｉａｎ ｈａｍｓｔｅｒ ＩｇＧ，１６−１０Ａ１），ＣＤ８６（Ｂ７−２）（Ｒａｔ ＩｇＧ２ｂ，ＧＬ１），ＭＨＣ ｃｌａｓｓＩＩ （Ｒａｔ ＩｇＧ２ｂ，Ｍ５／１１４．１５．２）．ネガティブコントロールとして ＦＩＴＣ−またはＰＥ−標識したマウスＩｇＧ、ラットＩｇＧ、あるいはアルメニアハムスターＩｇＧを用いた。これらの抗体は全てｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ． （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。
【０２９４】
２．実験結果
脾臓細胞では第８日目から第１５日目にかけてヘルパーＴ細胞であるＣＤ４＋Ｔ細胞の増加が対照群でみられるのに対し、ジャトバ投与群では抑制されていた。また、抗原提示細胞であるＤＣおよびＢ細胞は実験開始から一貫して低下傾向にある一方でマクロファージは増加傾向にある（図４３）。ＣＤ８＋Ｔ細胞については特に両群間で差異はなかった。Ｔｈ１免疫亢進性の疾患ではＣＤ４＋Ｔ細胞の減少や、抗原提示細胞（ＤＣ）の減少はその症状抑制に寄与すると考えられ、ジャトバ投与により、これらの細胞の割合が減少することは抑制活性をよく説明する結果となった。一方、これとは逆にジャトバ投与群で増加していたマクロファージについてその成熟度を検討するために、第１０日目の脾臓細胞について更に解析した。細胞表面マーカーとして抗原提示能を反映すると言われている共刺激分子であるＣＤ４０，ＣＤ８０，ＣＤ８６，ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩを用いた。その結果ジャトバ投与により増加しているマクロファージは調べたいずれの共刺激分子の発現も抑制傾向である事が分かり、特にＴｈ１反応による炎症増幅に関わるＣＤ８０や抗原提示に主要に関わるＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩについては有意に抑制していた。これらのことから、ジャトバ投与により脾細胞で増加しているマクロファージは対照群に比較して、抗原提示能が低い事が示唆された（図４４）。
【０２９５】
実施例２６：Ｔｙｐｅ ＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎ誘導関節炎モデルにおけるジャトバ経口投与による臨床スコアの改善
ジャトバの経口投与の効果を調べるためにＴｙｐｅ ＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎ誘導関節炎モデルで検討した。
【０２９６】
１．実験方法
（１）投与試料
ジャトバＥｔＯＨ抽出物（実施例２）、ジャトバＦｒ３分画物（実施例９）、カテキン類単量体である緑茶ポリフェノール（ポリフェノン：三井農林）を各々５０ｍｇ／ｍｌになるように１０％ＥｔＯＨ溶液に溶解させた。対照群には１０％ＥｔＯＨ溶液を用いた。
【０２９７】
（２）実験動物
ＤＢＡ／１Ｊマウス（雄）、８週齢に対してウシタイプＩＩコラーゲン（コスモバイオ）１５０μｇを４００μｇの結核死菌（Ｈ３７Ｒａ：ディフコ）含むＣＦＡと混合し、エマルジョン化したものを第０日目に皮内投与（１次免疫）、３週間後の第２１日目に腹腔内投与（２次免疫）することで疾患を誘導した。
実験は一群１３匹で実施した。
【０２９８】
（３）実験条件
一次免疫開始日から第４０日目まで週５回、対照群では１０％ＥｔＯＨを２５０μｌ、ジャトバＥｔＯＨ抽出物投与群、ジャトバＦｒ３分画物投与群、緑茶ポリフェノール（ポリフェノン）投与群はそれぞれ５０ｍｇ／ｍｌ（１０％ＥｔＯＨ溶媒）に調製した試料を２５０μｌ強制経口投与した。
【０２９９】
（４）臨床スコアの付け方
２次免疫日を０日目として、以降３１日目まで臨床症状を観察した。スコアの付け方は実施例２２に従った。
【０３００】
２．実験結果
臨床スコアの経時変化を図４５に示した。ジャトバＥｔＯＨ抽出物投与によって臨床スコアの抑制がみられた。またジャトバのＲａｐｉｄ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎによる分画物であるＦｒ３投与では抑制効果が顕著であり、２次免疫後１０日目から有意差をもって抑制することが分かった。一方単量体ポリフェノールであるポリフェノン投与では臨床スコアの増悪傾向が認められた。
【０３０１】
実施例２７：Ｔｙｐｅ ＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎ誘導関節炎モデルにおけるジャトバ経口投与によるＴｈ１サイトカイン産生能の抑制
ジャトバの経口投与の効果をｅｘ ｖｉｖｏで評価するためにＴｙｐｅ ＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎ誘導関節炎モデルで検討した。
【０３０２】
１．実験方法
（１）投与試料
ジャトバ投与群にはジャトバＥｔＯＨ抽出物（実施例２）を５０ｍｇ／ｍｌになるように１０％ＥｔＯＨ溶液に溶解したものを投与した。対照群には１０％ＥｔＯＨ溶液を用いた。
【０３０３】
（２）実験動物
ＤＢＡ／１Ｊマウス（雄）、８週齢に対してウシタイプＩＩコラーゲン（コスモバイオ）１５０μｇを４００μｇ Ｈ３７Ｒａ含むＣＦＡと混合し、エマルジョン化したものを皮内投与した。実験は一群２０匹で実施した。
【０３０４】
（３）脾細胞のＩＦＮ−γの測定
ＩＦＮ−γの測定はＯｐｔＥＩＡ ＥＬＩＳＡ Ｓｅｔ（ベクトン・デッキンソン社）を用いて実施した。
【０３０５】
（４）実験条件
免疫開始から２週間、週５回、対照群では１０％ＥｔＯＨを２５０μｌ、ジャトバ投与群は５０ｍｇ／ｍｌ（１％ＥｔＯＨ溶媒）を２５０μｌ強制経口投与した。第１４日目に剖検し、脾臓細胞を調製した。脾細胞はＲＰＭＩ１６４０（シグマ社）＋１０％ＦＣＳ（ロシュ社）±２５μｇ／ｍｌコラーゲン培地で３７℃、５％ＣＯ２の条件で３日間培養し、培養上清を回収した。この上清中のＩＦＮ−γ濃度測定を実施した。
【０３０６】
２．実験結果
対照群における抗原依存的なＩＦＮ−γの上昇とジャトバ投与群における有意な抑制が確認できた（図４６）。このことは経口投与によっても、腹腔内投与と同様にＴｈ１型サイトカインであるＩＦＮ−γ産生の抑制を介して臨床スコアを改善している事を示している。
【０３０７】
実施例２８：Ｔｙｐｅ ＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎ誘導関節炎モデルにおけるジャトバ経口投与による臨床スコアの改善効果の容量依存性
ジャトバの経口投与の効果について容量依存性を調べるためにＴｙｐｅ ＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎ誘導関節炎モデルで検討した。
【０３０８】
１．実験方法
（１）投与試料
ジャトバ抽出物のＲａｐｉｄ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ分画物であるＦｒ３（実施例９）を各々５０ｍｇ／ｍｌ，３７．５ｍｇ／ｍｌ，２５ｍｇ／ｍｌになるように１０％ＥｔＯＨ溶液に溶解させた。対照群には１０％ＥｔＯＨ溶液を用いた。
【０３０９】
（２）実験動物
ＤＢＡ／１Ｊマウス（雄）、８週齢に対してウシタイプＩＩコラーゲン（コスモバイオ）１５０μｇを４００μｇの結核死菌（Ｈ３７Ｒａ：ディフコ）含むＣＦＡと混合し、エマルジョン化したものを第０日目に皮内投与（１次免疫）、３週間後の第２１日目に腹腔内投与（２次免疫）することで疾患を誘導した。実験は一群７匹で実施した。
【０３１０】
（３）実験条件
一次免疫開始日から第４０日目まで週５回、コントロール群では１０％ＥｔＯＨを２５０μｌ、５０ｍｇ／ｍｌ， ３７．５ｍｇ／ｍｌ，２５ｍｇ／ｍｌのＦｒ３を各々２５０μｌ投与した。一匹あたりの投与量はＦｒ３換算でそれぞれ１２．５、９．３７５、６．２５ｍｇ／マウスとなる。
【０３１１】
（４）臨床スコアの付け方
２次免疫日を０日目として、以降１７日目まで臨床症状を観察した。スコアの付け方は実施例２２に従った。
【０３１２】
２．実験結果
スコアの変化のグラフを図４７に示す。約９．３７５ｍｇ／マウスのＦｒ３投与より高い濃度においては有意に病状が抑制されたが、それより低い濃度においては有意なスコアの抑制はみられなかった。よってジャトバ抽出物の効果が期待できる濃度は約９．３７５ｍｇ／マウス以上と考えられた。
【０３１３】
実施例２９：高重合度プロシアニジンの効果が得られる投与時期の検討
発症期、急性期、慢性期以降からの高重合度プロシアニジン経口投与を行い、有効な投与時期について検討を行った。
【０３１４】
１．実験方法
（１）投与試料
コントロールとして１０％ ＥｔＯＨを、また高重合度プロシアニジンサンプルとしてジャトバＦｒ３（実施例９）を５０ｍｇ／ｍｌになるように１０％ ＥｔＯＨに溶解したものを用いた。
【０３１５】
（２）実験動物
ＤＢＡ／１Ｊマウス（雄）、８週齢に対してウシタイプＩＩコラーゲン（コスモバイオ）１５０μｇを４００μｇの結核死菌（Ｈ３７Ｒａ：ディフコ）含むＣＦＡと混合し、エマルジョン化したものを第０日目に皮内投与（１次免疫）、３週間後の第２１日目に腹腔内投与（２次免疫）することで疾患を誘導した。実験は一群１２匹で実施した。
【０３１６】
（３）実験条件
一次免疫開始日第０日目から第４６日目まで週５回、以下のような条件で経口投与を実施した。（第２１日目開始を発症期、第２８日目開始を急性期、第３５日目開始を慢性期投与とした。）なお、一回あたりのジャトバＦｒ３の投与量は１２．５ｍｇ／ｍｏｕｓｅである。
Ｉ．コントロール群：一次免疫開始から実験終了まで２５０μｌの１０％ ＥｔＯＨ溶液を経口投与。
II． ジャトバ投与群：一次免疫開始から実験終了までジャトバＦｒ３を経口投与。
III． 第２１日目開始群：一次免疫開始から第２０日目まで２５０μｌの１０％ ＥｔＯＨを、２次免疫日の第２１日目から実験終了までジャトバＦｒ３を経口投与。
IV． 第２８日目開始群：一次免疫開始から第２７日目まで２５０μｌの１０％ ＥｔＯＨを、２次免疫日から１週間後の第２８日目から実験終了までジャトバＦｒ３を経口投与。
Ｖ． 第３５日目開始群：一次免疫開始から第３４日目まで２５０μｌの１０％ ＥｔＯＨを、２次免疫日から２週間後の第３５日目から実験終了までジャトバＦｒ３を経口投与。
【０３１７】
（４）臨床スコアの付け方
２次免疫日を０日目として、以降２５日目まで臨床症状を観察した。スコアの付け方は実施例２２と同じ。
【０３１８】
２．実験結果
発症期投与としての第２１日目投与開始群と、急性期投与としての第２８日目投与開始群は、コントロール群と比較して発症率に影響はなかった（表１０）。しかし、第２１日目投与開始群では最大スコアが対照群のほぼ半分に、第２８日目投与開始群ではコントロール群の約６８％程度にまで抑制されていた（表１０）。
【表１０】
【０３１９】
平均スコアの推移を図４８に示した。第２１日目及び第２８日目開始群は投与を開始することで病状の悪化を抑制していることが示された。高重合度プロシアニジンの抗自己免疫疾患効果は一次免疫成立後でも、有効であることが示された。
【０３２０】
実施例３０：高重合度プロシアニジンによる血中抗体価の抑制活性
慢性関節炎リウマチモデルの臨床症状に加え、血中抗体価の抑制を確認する事を目的として実施した。
【０３２１】
１．実験方法
（１）投与試料
コントロール群として１０％ ＥｔＯＨを、またジャトバ投与群としてジャトバＦｒ３（実施例９）を５０ｍｇ／ｍｌになるように１０％ ＥｔＯＨに溶解したものを用いた。
【０３２２】
（２）実験動物
ＤＢＡ／１Ｊマウス（雄）、８週齢に対してウシタイプＩＩコラーゲン（コスモバイオ）１５０μｇを４００μｇの結核死菌（Ｈ３７Ｒａ：ディフコ）含むＣＦＡと混合し、エマルジョン化したものを第０日目に皮内投与（１次免疫）、３週間後の第２１日目に腹腔内投与（２次免疫）することで疾患を誘導した。実験は一群１２匹で実施した。
【０３２３】
（３）血中抗体価の測定
ウシタイプＩＩコラーゲン（コスモバイオ）をリン酸バッファーで３μｇ／ｍｌに調製したものを４℃で一晩コーティングしたプレートに５００〜５０００倍希釈した血清サンプルを添加して測定した。一次抗体には５００倍希釈したＡＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅの抗ｔｏｔａｌ ＩｇＧ抗体， 抗ＩｇＧ１抗体， 抗ＩｇＧ２ａ抗体（コスモバイオ）を用い、その後ｐＮＰＰ（フナコシ）にて発色させて４１０ｎｍにて検出した。
【０３２４】
（４）実験条件
一次免疫開始日から第４０日目まで週５回対照群には１０％ ＥｔＯＨを２５０μｌ、ジャトバ群にはジャトバＦｒ３を２５０μｌ経口投与した。第４２日目に採血し、血清を調製した。
【０３２５】
２．実験結果
抗原であるコラーゲンに特異的な血中抗体価について調べた。ＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ，総ＩｇＧ量のいずれもジャトバＦｒ３投与により抑制された。更にＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比については上昇傾向を認めており、Ｔｈ１免疫の抑制傾向を示した（図４９）。この結果から高重合度プロシアニジン投与により自己抗体の産生が抑制されること、高重合度プロシアニジンによる慢性関節炎リウマチ抑制効果は抗原特異的な抗体産生の抑制効果を介していることが明らかとなった。
【０３２６】
実施例３１：プロシアニジンの重合度別活性検討（Ｉ）
ジャトバ抽出物から３量体から６量体までのプロシアニジンを重合度ごとに調製したものを、ＥＡＥのｅｘ ｖｉｖｏの系を用いて検討した。
【０３２７】
１．実験方法
（１）投与試料
３量体から６量体までのプロシアニジン分画（実施例１６）はプロシアニジン換算で各々５ｍｇ／ｍｌになるように１％ ＥｔＯＨ溶液に溶解した。また単量体として、（−）エピカテキン（シグマ）を、二量体として、Ｐｒｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｂ２（フナコシ）を各々購入し、同様の条件で溶解した。対照群には１％ ＥｔＯＨ溶液を用いた。
【０３２８】
（２）実験動物
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを実施例３に記載のＭＯＧ抗原で免疫する方法でＥＡＥを誘導した。一群１２匹で第１１日目に剖検を行った。
【０３２９】
（３）脾細胞のＩＦＮ−γの測定
ＩＦＮ−γの測定はＯｐｔＥＩＡ ＥＬＩＳＡ Ｓｅｔ（ベクトン・デッキンソン社）を用いて実施した。
【０３３０】
（４）実験条件
第０日目から第１０日目までコントロール群では週３回１％ＥｔＯＨを２００μｌ、（−）エピカテキン、Ｐｒｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｂ２と調製した各オリゴマーは５ｍｇ／ｍｌ（１％ ＥｔＯＨ溶媒）を２００μｌ腹腔内投与した。第１１日目にて剖検し、脾臓細胞を調製した。脾細胞はＲＰＭＩ１６４０（シグマ社）＋１０％ ＦＣＳ（ロシュ社）２μＭ ＭＯＧ培地で３７℃、５％ＣＯ２の条件で７日間培養し、培養上清を条件回収し、ＩＦＮ−γ濃度測定を実施した。
【０３３１】
２．実験結果
ＩＦＮ−γの測定結果を図５０に示す。単量体（−）エピカテキンから６量体までの活性比較により、５量体以上のプロシアニジンにＩＦＮ−γ抑制がみられた。このことからこれまでみられていたジャトバ抽出物投与によるＴｈ１サイトカインの抑制効果は重合度５以上のプロシアニジンによることが示唆された。
【０３３２】
実施例３２：プロシアニジンの重合度別活性検討（II）
ジャトバ抽出物から３量体から９量体までのプロシアニジンを各重合度別に調製したもの（実施例１６および実施例１７）をＥＡＥのｅｘ ｖｉｖｏの系を用いて検討した。今回、７量体乃至９量体の効果を検討するため、投与量は実施例３１の半分の用量で実験を実施した。
【０３３３】
１．実験方法
（１）投与試料
３量体から９量体までのプロシアニジン精製物（実施例１６および１７）はプロシアニジン換算で各々２．５ｍｇ／ｍｌになるように１％ ＥｔＯＨ溶液に溶解した。また単量体として（−）エピカテキン（シグマ）を、二量体としてＰｒｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｂ２（フナコシ）を各々購入し、同様の条件で溶解した。コントロール群には１％ ＥｔＯＨ溶液を用いた。
【０３３４】
（２）実験動物
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを実施例３１に記載のＭＯＧ抗原で免疫する方法でＥＡＥを誘導した。一群１２匹で第１１日目に剖検を行った。
【０３３５】
（３）脾細胞のＩＦＮ−γの測定
ＩＦＮ−γの測定はＯｐｔＥＩＡ ＥＬＩＳＡ Ｓｅｔ（ベクトン・デッキンソン社）を用いて実施した。
【０３３６】
（４）実験条件
第０日目から第１０日目までコントロール群では週３回１％ＥｔＯＨを２００μｌ、（−）エピカテキン、Ｐｒｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｂ２と調製した各オリゴマーはそれぞれ５００μｇ／ｍｏｕｓｅとなるように腹腔内投与した。第１１日目にて剖検し、脾細胞を調製した。脾細胞はＲＰＭＩ１６４０（シグマ社）＋１０％ ＦＣＳ（ロシュ社）２μＭ ＭＯＧ培地で３７℃、５％ＣＯ２の条件で７日間培養し、培養上清を回収し、ＩＦＮ−γ濃度測定を実施した。
【０３３７】
２．実験結果
ＩＦＮ−γの測定結果を図５１に示す。実施例３１で５量体以上のプロシアニジンに活性があることを示したが、本実施例においては投与量を減少させて、更に９量体まで活性比較を実施した。投与量を減少させたため５量体での活性は弱まったが、５量体以上のプロシアニジンでは重合度が高くなると共に、活性が上昇し、９量体まで重合度と活性の相関関係を確認することができた。
【０３３８】
実施例３３：ジャトバ抽出物の安全性試験（ジャトバ抽出物の単回投与によるラットを用いた急性毒性試験）
１．実験方法
（１）投与試料
ジャトバＥｔＯＨ抽出物（実施例２）、緑茶ポリフェノール（単量体）としてのポリフェノン（三井農林）を２００ｍｇ／ｍｌの容量になるように１０％ＥｔＯＨに溶解した。対照群には１０％ＥｔＯＨ溶液を用いた。
【０３３９】
（２）実験動物
ＳＤ系ラット、雄、６週齢
（３）実験条件
第０日目に２００ｍｇ／ｍｌのジャトバＥｔＯＨ抽出物または緑茶ポリフェノールを２ｇ／ｋｇとなるように強制的に経口投与した。第６日目まで毎日同時間に体重と、摂餌量を計測した。
【０３４０】
２．実験結果
ジャトバ投与群では毒性は認められず、体重変化（図５２上）、摂餌量（図５２下）ともに、対照群と変わらなかった。一方、緑茶ポリフェノール投与群では第１日目で１０ｇ以上の体重減少を３個体で認めたが、翌日から回復し、死亡例はなかった。以上の結果からジャトバ抽出物では急性毒性は認められないことが分かった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物を有効成分として含んでなる、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制が治療に有効である疾患および／または自己抗体の産生抑制が治療に有効である疾患の治療剤、それらの疾患の根治治療剤、およびそれらの疾患の進行阻害剤。
【請求項２】
（ｉ）および／または（ii）のプロアントシアニジンの重合度が少なくとも５である、請求項１に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項３】
（ｉ）および／または（ii）のプロアントシアニジンの重合度が４〜３０である、請求項１に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項４】
（ｉ）および／または（ii）のプロアントシアニジンの重合度が５〜３０である、請求項１に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項５】
（ｉ）および／または（ii）のプロアントシアニジンが、カテキン、エピカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、およびこれらの組み合わせから選択される構成単位を少なくとも含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項６】
（ｉ）および／または（ii）のプロアントシアニジンが、プロペラルゴニジン、プロシアニジン、プロデルフィニジン、プロガイボールチニジン（proguibourtinidin）、プロフィセチニジン、プロロビネチニジン、プロテラカシジン、プロメラカシジン、プロアピゲニニジン、およびプロルテオリニジンからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項７】
（ｉ）のプロアントシアニジンが、ジャトバ、葡萄種子、クランベリー、シナモン、松樹皮、またはカカオ由来である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項８】
（ii）の植物素材の抽出物が、ジャトバ抽出物、葡萄種子抽出物、クランベリー抽出物、シナモン抽出物、松樹皮抽出物、およびカカオ抽出物からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項９】
（ｉ）および／または（ii）のプロアントシアニジンが式（Ｉ）で表される、請求項１に記載の治療剤および阻害剤。
【化１】
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、同一または異なっていてもよく、水素原子、水酸基、または−Ｏ−Ｒ１１（Ｒ１１は炭素数１〜４のアルキル基または糖残基を表す。）を表し、Ｒ３およびＲ４は、同一または異なっていてもよく、水素原子、水酸基、または基（ＩＩ）：
【化２】
を表し、但し、Ｒ３およびＲ４の両方が水酸基を表すことはなく、Ｒ３およびＲ４の両方が基（ＩＩ）を表すことはなく、ｎは４〜３０の整数を表し、各構成単位は、４位と６位または４位と８位の一カ所において互いに結合しているか、あるいは４位と８位および２位と７位の二カ所において互いに結合している。）
【請求項１０】
各構成単位において、Ｒ１およびＲ２が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ６が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ５およびＲ７が水素原子を表す、請求項９に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項１１】
各構成単位において、Ｒ１およびＲ２が水酸基を表し、Ｒ６が水酸基を表し、Ｒ５およびＲ７が水素原子を表す、請求項１０に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項１２】
各構成単位において、Ｒ３およびＲ４いずれか一方が水酸基を表し、他方が水素原子を表す、請求項１０または１１に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項１３】
各構成単位において、Ｒ３およびＲ４いずれか一方が基（ＩＩ）を表し、他方が水素原子を表す、請求項１０または１１に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項１４】
各構成単位において、Ｒ１およびＲ２が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ５およびＲ６が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ７が水素原子を表す、請求項９に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項１５】
各構成単位において、Ｒ１およびＲ２が水酸基を表し、Ｒ５およびＲ６が水酸基を表し、Ｒ７が水素原子を表す、請求項１４に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項１６】
各構成単位において、Ｒ３およびＲ４いずれか一方が水酸基を表し、他方が水素原子を表す、請求項１４または１５に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項１７】
各構成単位において、Ｒ３およびＲ４いずれか一方が基（ＩＩ）を表し、他方が水素原子を表す、請求項１４または１５に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項１８】
各構成単位において、Ｒ１およびＲ２が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表す、請求項９に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項１９】
各構成単位において、Ｒ１およびＲ２が水酸基を表し、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が水酸基を表す、請求項１８に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項２０】
各構成単位において、Ｒ３およびＲ４いずれか一方が水酸基を表し、他方が水素原子を表す、請求項１８または１９に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項２１】
各構成単位において、Ｒ３およびＲ４いずれか一方が基（ＩＩ）を表し、他方が水素原子を表す、請求項１８または１９に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項２２】
ｎが５〜３０の整数を表す、請求項９〜２１のいずれか一項に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項２３】
各構成単位が、４位と６位または４位と８位において互いに結合している、請求項９〜２２のいずれか一項に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項２４】
各構成単位が、４位と８位および２位と７位において互いに結合している、請求項９〜２２のいずれか一項に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項２５】
Ｔｈ１サイトカインの産生抑制が治療上有効である疾患が、Ｔｈ１サイトカイン依存型自己免疫疾患である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項２６】
Ｔｈ１サイトカイン依存型自己免疫疾患が、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、インスリン依存型糖尿病、自己免疫性甲状腺炎（ＡＴ）、自己免疫性ブドウ膜網膜炎（ＡＵＲ）、橋本病、乾癬症、クローン病、および円形脱毛症から選択される、請求項２５に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項２７】
自己抗体の産生抑制が治療上有効である疾患が、自己抗体媒介型自己免疫疾患である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項２８】
自己抗体媒介型自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、自己免疫性溶血性貧血、シェーグレン症候群、急性リウマチ熱、尋常性天疱瘡、自己免疫性血小板減少性紫斑病、および混合型本態性クリオグロブリン血症から選択される、請求項２７に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項２９】
Ｔｈ１サイトカインがＩＦＮ−γである、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項３０】
経口剤または外用剤の態様で提供される、請求項１〜２９に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項３１】
Ｔｈ１サイトカインの産生抑制が治療に有効である疾患および／または自己抗体の産生抑制が治療に有効である疾患の治療剤、それら疾患の根治治療剤、およびそれら疾患の進行阻害剤の製造のための、（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物の使用。
【請求項３２】
Ｔｈ１サイトカインの産生抑制が治療に有効である疾患および／または自己抗体の産生抑制が治療に有効である疾患の治療剤、それら疾患の根治治療剤、およびそれら疾患の進行阻害剤が、食品の形態で提供される、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
治療上の有効量の（ｉ）重合度が４以上のプロアントシアニジン、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物を、必要であれば薬学上許容される担体とともに哺乳類に投与することを含んでなる、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制が治療に有効である疾患および／または自己抗体の産生抑制が治療に有効である疾患の治療方法、それら疾患の根治治療方法、およびそれら疾患の進行阻害方法。
【請求項３４】
（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物を有効成分として含んでなる、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制剤。
【請求項３５】
Ｔｈ１サイトカインの産生抑制剤の製造のための、（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物の使用。
【請求項３６】
Ｔｈ１サイトカインの産生抑制剤が、食品の形態で提供される、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
有効量の（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物を哺乳類に投与することを含んでなる、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制方法。
【請求項３８】
（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物を有効成分として含んでなる、自己抗体の産生抑制剤。
【請求項３９】
自己抗体の産生抑制剤の製造のための、（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物の使用。
【請求項４０】
自己抗体の産生抑制剤が、食品の形態で提供される、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
有効量の（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物を哺乳類に投与することを含んでなる、自己抗体の産生抑制方法。
【請求項４２】
（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物を有効量含んでなる食品であって、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制が治療に有効である疾患および／または自己抗体の産生抑制が治療に有効である疾患の治療、それらの疾患の根治治療、および／またはそれらの疾患の進行阻害に用いられる食品。
【請求項４３】
（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物を有効量含んでなる食品であって、Ｔｈ１サイトカイン産生抑制機能、Ｔｈ１サイトカイン産生増大に関連する状態の改善または緩和機能、自己抗体産生抑制機能、または自己抗体産生に関連する状態の改善または緩和機能を有する食品。
【請求項４４】
（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物であって、Ｔｈ１サイトカイン産生抑制機能、Ｔｈ１サイトカイン産生増大に関連する状態の改善または緩和機能、自己抗体産生抑制機能、または自己抗体産生に関連する状態の改善または緩和機能を有する抽出物を含んでなる食品。
【請求項４５】
（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物を有効量含んでなる食品であって、Ｔｈ１サイトカイン産生抑制機能、Ｔｈ１サイトカイン産生増大に関連する状態の改善または緩和機能、自己抗体産生抑制機能、または自己抗体産生に関連する状態の改善または緩和機能が表示された食品。
【請求項４６】
本体、容器、包装、説明書、添付文書、または宣伝物のいずれかにＴｈ１サイトカイン産生抑制機能、Ｔｈ１サイトカイン産生増大に関連する状態の改善または緩和機能、自己抗体産生抑制機能、または自己抗体に関連する状態の改善または緩和機能が表示された、請求項４５に記載の食品。
【請求項４７】
（ｉ）および／または（ii）のプロアントシアニジンの重合度が少なくとも５である、請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の食品。
【請求項４８】
（ｉ）および／または（ii）のプロアントシアニジンの重合度が４〜３０である、請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の食品
【請求項４９】
（ｉ）および／または（ii）のプロアントシアニジンの重合度が５〜３０である、請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の食品
【請求項５０】
（ｉ）および／または（ii）のプロアントシアニジンが、カテキン、エピカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、およびこれらの組み合わせから選択される構成単位を少なくとも含む、請求項４２〜４９のいずれか一項に記載の食品。
【請求項５１】
（ｉ）および／または（ii）のプロアントシアニジンが、プロペラルゴニジン、プロシアニジン、プロデルフィニジン、プロガイボールチニジン（proguibourtinidin）、プロフィセチニジン、プロロビネチニジン、プロテラカシジン、プロメラカシジン、プロアピゲニニジン、およびプロルテオリニジンからなる群から選択される、請求項４２〜４９のいずれか一項に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項５２】
（ｉ）のプロアントシアニジンが、ジャトバ、葡萄種子、クランベリー、シナモン、または松樹皮由来である、請求項４２〜５１のいずれか一項に記載の食品。
【請求項５３】
（ii）の植物素材の抽出物が、ジャトバ抽出物、葡萄種子抽出物、クランベリー抽出物、シナモン抽出物、松樹皮抽出物、およびカカオ抽出物からなる群から選択される、請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の食品。
【請求項５４】
（ｉ）および／または（ii）のプロアントシアニジンが式（Ｉ）で表される、請求項４２〜５３のいずれか一項に記載の食品。
【化３】
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、同一または異なっていてもよく、水素原子、水酸基、または−Ｏ−Ｒ１１（Ｒ１１は炭素数１〜４のアルキル基または糖残基を表す。）を表し、Ｒ３およびＲ４は、同一または異なっていてもよく、水素原子、水酸基、または基（ＩＩ）：
【化４】
を表し、但し、Ｒ３およびＲ４の両方が水酸基を表すことはなく、Ｒ３およびＲ４の両方が基（ＩＩ）を表すことはなく、ｎは４〜３０の整数を表し、各構成単位は、４位と６位または４位と８位の一カ所において互いに結合しているか、あるいは４位と８位および２位と７位の二カ所において互いに結合している。）
【請求項５５】
各構成単位において、Ｒ１およびＲ２が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ６が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ５およびＲ７が水素原子を表す、請求項５４に記載の食品。
【請求項５６】
各構成単位において、Ｒ１およびＲ２が水酸基を表し、Ｒ６が水酸基を表し、Ｒ５およびＲ７が水素原子を表す、請求項５５に記載の食品。
【請求項５７】
各構成単位において、Ｒ３およびＲ４いずれか一方が水酸基を表し、他方が水素原子を表す、請求項５５または５６に記載の食品。
【請求項５８】
各構成単位において、Ｒ３およびＲ４いずれか一方が基（ＩＩ）を表し、他方が水素原子を表す、請求項５５または５６に記載の食品。
【請求項５９】
各構成単位において、Ｒ１およびＲ２が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ５およびＲ６が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ７が水素原子を表す、請求項５４に記載の食品。
【請求項６０】
各構成単位において、Ｒ１およびＲ２が水酸基を表し、Ｒ５およびＲ６が水酸基を表し、Ｒ７が水素原子を表す、請求項５９に記載の食品。
【請求項６１】
各構成単位において、Ｒ３およびＲ４いずれか一方が水酸基を表し、他方が水素原子を表す、請求項５９または６０に記載の食品。
【請求項６２】
各構成単位において、Ｒ３およびＲ４いずれか一方が基（ＩＩ）を表し、他方が水素原子を表す、請求項５９または６０に記載の食品。
【請求項６３】
各構成単位において、Ｒ１およびＲ２が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表す、請求項５４に記載の食品。
【請求項６４】
各構成単位において、Ｒ１およびＲ２が水酸基を表し、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が水酸基を表す、請求項６３に記載の食品。
【請求項６５】
各構成単位において、Ｒ３およびＲ４いずれか一方が水酸基を表し、他方が水素原子を表す、請求項６３または６４に記載の食品。
【請求項６６】
各構成単位において、Ｒ３およびＲ４いずれか一方が基（ＩＩ）を表し、他方が水素原子を表す、請求項６３または６４に記載の食品。
【請求項６７】
ｎが５〜３０の整数を表す、請求項５４〜６６のいずれか一項に記載の食品。
【請求項６８】
各構成単位が、４位と６位または４位と８位において互いに結合している、請求項５４〜６７のいずれか一項に記載の食品。
【請求項６９】
各構成単位が、４位と８位および２位と７位において互いに結合している、請求項５４〜６７のいずれか一項に記載の食品。
【請求項７０】
Ｔｈ１サイトカイン産生増大に関連する状態が、Ｔｈ１サイトカイン依存型自己免疫疾患に特徴的な状態である、請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の食品。
【請求項７１】
Ｔｈ１サイトカイン依存型自己免疫疾患が、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、インスリン依存型糖尿病、自己免疫性甲状腺炎（ＡＴ）、自己免疫性ブドウ膜網膜炎（ＡＵＲ）、橋本病、乾癬症、クローン病、および円形脱毛症から選択される、請求項７０に記載の食品。
【請求項７２】
自己抗体産生に関連する状態が、自己抗体媒介型自己免疫疾患に特徴的な状態である、請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の食品。
【請求項７３】
自己抗体媒介型自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、自己免疫性溶血性貧血、シェーグレン症候群、急性リウマチ熱、尋常性天疱瘡、自己免疫性血小板減少性紫斑病、および混合型本態性クリオグロブリン血症から選択される、請求項７２に記載の食品。
【請求項７４】
Ｔｈ１サイトカインがＩＦＮ−γである、請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の食品。
【請求項７５】
Ｔｈ１サイトカイン産生増大に関連する状態および／または自己抗体産生に関連する状態が、全身の強張りや関節の違和感である、請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の食品。
【請求項７６】
重合度が少なくとも４のプロアントシアニジンを、成人１人１日当たり５０〜２０００ｍｇの摂取量となるように含んでなる、健康食品。
【請求項７７】
プロアントシアニジンが、ジャトバ抽出物、葡萄種子抽出物、クランベリー抽出物、シナモン抽出物、松樹皮抽出物、およびカカオ抽出物からなる群から選択される抽出物であって、重合度が少なくとも４のプロアントシアニジンを含む抽出物の形態で提供される、請求項７６に記載の健康食品。
【請求項７８】
プロアントシアニジンの重合度が４〜３０である、請求項７６または７７に記載の健康食品。
【請求項７９】
プロアントシアニジンの重合度が少なくとも５である、請求項７６または７７に記載の健康食品。
【請求項８０】
プロアントシアニジンの重合度が５〜３０である、請求項７６または７７に記載の健康食品。
【請求項８１】
特定保健用食品、栄養機能食品、または栄養補助食品である、請求項７６〜８０のいずれか一項に記載の健康食品。
【請求項８２】
通常の食品の形状あるいは栄養補助食品の形状である、請求項７６〜８１のいずれか一項に記載の健康食品。
【請求項８３】
Ｔｈ１サイトカイン産生抑制活性を有する画分の製造法であって、
（ａ）プロアントシアニジンを含有する植物原料を抽出操作に付す工程；および
（ｂ）工程（ａ）で得られた抽出画分を限外濾過操作に付して、ケーキを得る工程
を含んでなる、製造法。
【請求項８４】
工程（ｂ）の後に、（ｃ）工程（ｂ）で得られたケーキに含まれるプロアントシアニジンの重合度を測定する工程を更に含んでなる、請求項８３に記載の製造法。
【請求項８５】
試料中のプロアントシアニジンの重合度を測定する工程を含んでなる、Ｔｈ１サイトカイン産生抑制活性の検定方法であって、４以上の重合度のプロアントシアニジンの検出がＴｈ１サイトカイン産生抑制活性を示すことを特徴とする方法。
【請求項８６】
５以上の重合度のプロアントシアニジンの検出がＴｈ１サイトカイン産生抑制活性の指標である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
試料中のプロアントシアニジンの重合度を測定する工程を含んでなる、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制が治療に有効である疾患の治療活性の検定方法であって、４以上の重合度のプロアントシアニジンの検出がＴｈ１サイトカインの産生抑制が治療に有効である疾患の治療活性を示すことを特徴とする方法。
【請求項８８】
５以上の重合度のプロアントシアニジンの検出がＴｈ１サイトカインの産生抑制が治療に有効である疾患の治療活性の指標である、請求項８７に記載の方法。
【請求項１】
（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物を有効成分として含んでなる、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制が治療に有効である疾患および／または自己抗体の産生抑制が治療に有効である疾患の治療剤、それらの疾患の根治治療剤、およびそれらの疾患の進行阻害剤。
【請求項２】
（ｉ）および／または（ii）のプロアントシアニジンの重合度が少なくとも５である、請求項１に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項３】
（ｉ）および／または（ii）のプロアントシアニジンの重合度が４〜３０である、請求項１に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項４】
（ｉ）および／または（ii）のプロアントシアニジンの重合度が５〜３０である、請求項１に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項５】
（ｉ）および／または（ii）のプロアントシアニジンが、カテキン、エピカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、およびこれらの組み合わせから選択される構成単位を少なくとも含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項６】
（ｉ）および／または（ii）のプロアントシアニジンが、プロペラルゴニジン、プロシアニジン、プロデルフィニジン、プロガイボールチニジン（proguibourtinidin）、プロフィセチニジン、プロロビネチニジン、プロテラカシジン、プロメラカシジン、プロアピゲニニジン、およびプロルテオリニジンからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項７】
（ｉ）のプロアントシアニジンが、ジャトバ、葡萄種子、クランベリー、シナモン、松樹皮、またはカカオ由来である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項８】
（ii）の植物素材の抽出物が、ジャトバ抽出物、葡萄種子抽出物、クランベリー抽出物、シナモン抽出物、松樹皮抽出物、およびカカオ抽出物からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項９】
（ｉ）および／または（ii）のプロアントシアニジンが式（Ｉ）で表される、請求項１に記載の治療剤および阻害剤。
【化１】
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、同一または異なっていてもよく、水素原子、水酸基、または−Ｏ−Ｒ１１（Ｒ１１は炭素数１〜４のアルキル基または糖残基を表す。）を表し、Ｒ３およびＲ４は、同一または異なっていてもよく、水素原子、水酸基、または基（ＩＩ）：
【化２】
を表し、但し、Ｒ３およびＲ４の両方が水酸基を表すことはなく、Ｒ３およびＲ４の両方が基（ＩＩ）を表すことはなく、ｎは４〜３０の整数を表し、各構成単位は、４位と６位または４位と８位の一カ所において互いに結合しているか、あるいは４位と８位および２位と７位の二カ所において互いに結合している。）
【請求項１０】
各構成単位において、Ｒ１およびＲ２が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ６が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ５およびＲ７が水素原子を表す、請求項９に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項１１】
各構成単位において、Ｒ１およびＲ２が水酸基を表し、Ｒ６が水酸基を表し、Ｒ５およびＲ７が水素原子を表す、請求項１０に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項１２】
各構成単位において、Ｒ３およびＲ４いずれか一方が水酸基を表し、他方が水素原子を表す、請求項１０または１１に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項１３】
各構成単位において、Ｒ３およびＲ４いずれか一方が基（ＩＩ）を表し、他方が水素原子を表す、請求項１０または１１に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項１４】
各構成単位において、Ｒ１およびＲ２が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ５およびＲ６が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ７が水素原子を表す、請求項９に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項１５】
各構成単位において、Ｒ１およびＲ２が水酸基を表し、Ｒ５およびＲ６が水酸基を表し、Ｒ７が水素原子を表す、請求項１４に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項１６】
各構成単位において、Ｒ３およびＲ４いずれか一方が水酸基を表し、他方が水素原子を表す、請求項１４または１５に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項１７】
各構成単位において、Ｒ３およびＲ４いずれか一方が基（ＩＩ）を表し、他方が水素原子を表す、請求項１４または１５に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項１８】
各構成単位において、Ｒ１およびＲ２が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表す、請求項９に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項１９】
各構成単位において、Ｒ１およびＲ２が水酸基を表し、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が水酸基を表す、請求項１８に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項２０】
各構成単位において、Ｒ３およびＲ４いずれか一方が水酸基を表し、他方が水素原子を表す、請求項１８または１９に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項２１】
各構成単位において、Ｒ３およびＲ４いずれか一方が基（ＩＩ）を表し、他方が水素原子を表す、請求項１８または１９に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項２２】
ｎが５〜３０の整数を表す、請求項９〜２１のいずれか一項に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項２３】
各構成単位が、４位と６位または４位と８位において互いに結合している、請求項９〜２２のいずれか一項に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項２４】
各構成単位が、４位と８位および２位と７位において互いに結合している、請求項９〜２２のいずれか一項に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項２５】
Ｔｈ１サイトカインの産生抑制が治療上有効である疾患が、Ｔｈ１サイトカイン依存型自己免疫疾患である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項２６】
Ｔｈ１サイトカイン依存型自己免疫疾患が、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、インスリン依存型糖尿病、自己免疫性甲状腺炎（ＡＴ）、自己免疫性ブドウ膜網膜炎（ＡＵＲ）、橋本病、乾癬症、クローン病、および円形脱毛症から選択される、請求項２５に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項２７】
自己抗体の産生抑制が治療上有効である疾患が、自己抗体媒介型自己免疫疾患である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項２８】
自己抗体媒介型自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、自己免疫性溶血性貧血、シェーグレン症候群、急性リウマチ熱、尋常性天疱瘡、自己免疫性血小板減少性紫斑病、および混合型本態性クリオグロブリン血症から選択される、請求項２７に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項２９】
Ｔｈ１サイトカインがＩＦＮ−γである、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項３０】
経口剤または外用剤の態様で提供される、請求項１〜２９に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項３１】
Ｔｈ１サイトカインの産生抑制が治療に有効である疾患および／または自己抗体の産生抑制が治療に有効である疾患の治療剤、それら疾患の根治治療剤、およびそれら疾患の進行阻害剤の製造のための、（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物の使用。
【請求項３２】
Ｔｈ１サイトカインの産生抑制が治療に有効である疾患および／または自己抗体の産生抑制が治療に有効である疾患の治療剤、それら疾患の根治治療剤、およびそれら疾患の進行阻害剤が、食品の形態で提供される、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
治療上の有効量の（ｉ）重合度が４以上のプロアントシアニジン、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物を、必要であれば薬学上許容される担体とともに哺乳類に投与することを含んでなる、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制が治療に有効である疾患および／または自己抗体の産生抑制が治療に有効である疾患の治療方法、それら疾患の根治治療方法、およびそれら疾患の進行阻害方法。
【請求項３４】
（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物を有効成分として含んでなる、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制剤。
【請求項３５】
Ｔｈ１サイトカインの産生抑制剤の製造のための、（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物の使用。
【請求項３６】
Ｔｈ１サイトカインの産生抑制剤が、食品の形態で提供される、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
有効量の（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物を哺乳類に投与することを含んでなる、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制方法。
【請求項３８】
（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物を有効成分として含んでなる、自己抗体の産生抑制剤。
【請求項３９】
自己抗体の産生抑制剤の製造のための、（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物の使用。
【請求項４０】
自己抗体の産生抑制剤が、食品の形態で提供される、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
有効量の（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物を哺乳類に投与することを含んでなる、自己抗体の産生抑制方法。
【請求項４２】
（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物を有効量含んでなる食品であって、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制が治療に有効である疾患および／または自己抗体の産生抑制が治療に有効である疾患の治療、それらの疾患の根治治療、および／またはそれらの疾患の進行阻害に用いられる食品。
【請求項４３】
（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物を有効量含んでなる食品であって、Ｔｈ１サイトカイン産生抑制機能、Ｔｈ１サイトカイン産生増大に関連する状態の改善または緩和機能、自己抗体産生抑制機能、または自己抗体産生に関連する状態の改善または緩和機能を有する食品。
【請求項４４】
（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物であって、Ｔｈ１サイトカイン産生抑制機能、Ｔｈ１サイトカイン産生増大に関連する状態の改善または緩和機能、自己抗体産生抑制機能、または自己抗体産生に関連する状態の改善または緩和機能を有する抽出物を含んでなる食品。
【請求項４５】
（ｉ）重合度が少なくとも４のプロアントシアニジン、または（ii）プロアントシアニジンを含有する植物素材の抽出物を有効量含んでなる食品であって、Ｔｈ１サイトカイン産生抑制機能、Ｔｈ１サイトカイン産生増大に関連する状態の改善または緩和機能、自己抗体産生抑制機能、または自己抗体産生に関連する状態の改善または緩和機能が表示された食品。
【請求項４６】
本体、容器、包装、説明書、添付文書、または宣伝物のいずれかにＴｈ１サイトカイン産生抑制機能、Ｔｈ１サイトカイン産生増大に関連する状態の改善または緩和機能、自己抗体産生抑制機能、または自己抗体に関連する状態の改善または緩和機能が表示された、請求項４５に記載の食品。
【請求項４７】
（ｉ）および／または（ii）のプロアントシアニジンの重合度が少なくとも５である、請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の食品。
【請求項４８】
（ｉ）および／または（ii）のプロアントシアニジンの重合度が４〜３０である、請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の食品
【請求項４９】
（ｉ）および／または（ii）のプロアントシアニジンの重合度が５〜３０である、請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の食品
【請求項５０】
（ｉ）および／または（ii）のプロアントシアニジンが、カテキン、エピカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、およびこれらの組み合わせから選択される構成単位を少なくとも含む、請求項４２〜４９のいずれか一項に記載の食品。
【請求項５１】
（ｉ）および／または（ii）のプロアントシアニジンが、プロペラルゴニジン、プロシアニジン、プロデルフィニジン、プロガイボールチニジン（proguibourtinidin）、プロフィセチニジン、プロロビネチニジン、プロテラカシジン、プロメラカシジン、プロアピゲニニジン、およびプロルテオリニジンからなる群から選択される、請求項４２〜４９のいずれか一項に記載の治療剤および阻害剤。
【請求項５２】
（ｉ）のプロアントシアニジンが、ジャトバ、葡萄種子、クランベリー、シナモン、または松樹皮由来である、請求項４２〜５１のいずれか一項に記載の食品。
【請求項５３】
（ii）の植物素材の抽出物が、ジャトバ抽出物、葡萄種子抽出物、クランベリー抽出物、シナモン抽出物、松樹皮抽出物、およびカカオ抽出物からなる群から選択される、請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の食品。
【請求項５４】
（ｉ）および／または（ii）のプロアントシアニジンが式（Ｉ）で表される、請求項４２〜５３のいずれか一項に記載の食品。
【化３】
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、同一または異なっていてもよく、水素原子、水酸基、または−Ｏ−Ｒ１１（Ｒ１１は炭素数１〜４のアルキル基または糖残基を表す。）を表し、Ｒ３およびＲ４は、同一または異なっていてもよく、水素原子、水酸基、または基（ＩＩ）：
【化４】
を表し、但し、Ｒ３およびＲ４の両方が水酸基を表すことはなく、Ｒ３およびＲ４の両方が基（ＩＩ）を表すことはなく、ｎは４〜３０の整数を表し、各構成単位は、４位と６位または４位と８位の一カ所において互いに結合しているか、あるいは４位と８位および２位と７位の二カ所において互いに結合している。）
【請求項５５】
各構成単位において、Ｒ１およびＲ２が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ６が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ５およびＲ７が水素原子を表す、請求項５４に記載の食品。
【請求項５６】
各構成単位において、Ｒ１およびＲ２が水酸基を表し、Ｒ６が水酸基を表し、Ｒ５およびＲ７が水素原子を表す、請求項５５に記載の食品。
【請求項５７】
各構成単位において、Ｒ３およびＲ４いずれか一方が水酸基を表し、他方が水素原子を表す、請求項５５または５６に記載の食品。
【請求項５８】
各構成単位において、Ｒ３およびＲ４いずれか一方が基（ＩＩ）を表し、他方が水素原子を表す、請求項５５または５６に記載の食品。
【請求項５９】
各構成単位において、Ｒ１およびＲ２が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ５およびＲ６が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ７が水素原子を表す、請求項５４に記載の食品。
【請求項６０】
各構成単位において、Ｒ１およびＲ２が水酸基を表し、Ｒ５およびＲ６が水酸基を表し、Ｒ７が水素原子を表す、請求項５９に記載の食品。
【請求項６１】
各構成単位において、Ｒ３およびＲ４いずれか一方が水酸基を表し、他方が水素原子を表す、請求項５９または６０に記載の食品。
【請求項６２】
各構成単位において、Ｒ３およびＲ４いずれか一方が基（ＩＩ）を表し、他方が水素原子を表す、請求項５９または６０に記載の食品。
【請求項６３】
各構成単位において、Ｒ１およびＲ２が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表し、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が水酸基または−Ｏ−Ｒ１１を表す、請求項５４に記載の食品。
【請求項６４】
各構成単位において、Ｒ１およびＲ２が水酸基を表し、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が水酸基を表す、請求項６３に記載の食品。
【請求項６５】
各構成単位において、Ｒ３およびＲ４いずれか一方が水酸基を表し、他方が水素原子を表す、請求項６３または６４に記載の食品。
【請求項６６】
各構成単位において、Ｒ３およびＲ４いずれか一方が基（ＩＩ）を表し、他方が水素原子を表す、請求項６３または６４に記載の食品。
【請求項６７】
ｎが５〜３０の整数を表す、請求項５４〜６６のいずれか一項に記載の食品。
【請求項６８】
各構成単位が、４位と６位または４位と８位において互いに結合している、請求項５４〜６７のいずれか一項に記載の食品。
【請求項６９】
各構成単位が、４位と８位および２位と７位において互いに結合している、請求項５４〜６７のいずれか一項に記載の食品。
【請求項７０】
Ｔｈ１サイトカイン産生増大に関連する状態が、Ｔｈ１サイトカイン依存型自己免疫疾患に特徴的な状態である、請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の食品。
【請求項７１】
Ｔｈ１サイトカイン依存型自己免疫疾患が、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、インスリン依存型糖尿病、自己免疫性甲状腺炎（ＡＴ）、自己免疫性ブドウ膜網膜炎（ＡＵＲ）、橋本病、乾癬症、クローン病、および円形脱毛症から選択される、請求項７０に記載の食品。
【請求項７２】
自己抗体産生に関連する状態が、自己抗体媒介型自己免疫疾患に特徴的な状態である、請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の食品。
【請求項７３】
自己抗体媒介型自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、自己免疫性溶血性貧血、シェーグレン症候群、急性リウマチ熱、尋常性天疱瘡、自己免疫性血小板減少性紫斑病、および混合型本態性クリオグロブリン血症から選択される、請求項７２に記載の食品。
【請求項７４】
Ｔｈ１サイトカインがＩＦＮ−γである、請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の食品。
【請求項７５】
Ｔｈ１サイトカイン産生増大に関連する状態および／または自己抗体産生に関連する状態が、全身の強張りや関節の違和感である、請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の食品。
【請求項７６】
重合度が少なくとも４のプロアントシアニジンを、成人１人１日当たり５０〜２０００ｍｇの摂取量となるように含んでなる、健康食品。
【請求項７７】
プロアントシアニジンが、ジャトバ抽出物、葡萄種子抽出物、クランベリー抽出物、シナモン抽出物、松樹皮抽出物、およびカカオ抽出物からなる群から選択される抽出物であって、重合度が少なくとも４のプロアントシアニジンを含む抽出物の形態で提供される、請求項７６に記載の健康食品。
【請求項７８】
プロアントシアニジンの重合度が４〜３０である、請求項７６または７７に記載の健康食品。
【請求項７９】
プロアントシアニジンの重合度が少なくとも５である、請求項７６または７７に記載の健康食品。
【請求項８０】
プロアントシアニジンの重合度が５〜３０である、請求項７６または７７に記載の健康食品。
【請求項８１】
特定保健用食品、栄養機能食品、または栄養補助食品である、請求項７６〜８０のいずれか一項に記載の健康食品。
【請求項８２】
通常の食品の形状あるいは栄養補助食品の形状である、請求項７６〜８１のいずれか一項に記載の健康食品。
【請求項８３】
Ｔｈ１サイトカイン産生抑制活性を有する画分の製造法であって、
（ａ）プロアントシアニジンを含有する植物原料を抽出操作に付す工程；および
（ｂ）工程（ａ）で得られた抽出画分を限外濾過操作に付して、ケーキを得る工程
を含んでなる、製造法。
【請求項８４】
工程（ｂ）の後に、（ｃ）工程（ｂ）で得られたケーキに含まれるプロアントシアニジンの重合度を測定する工程を更に含んでなる、請求項８３に記載の製造法。
【請求項８５】
試料中のプロアントシアニジンの重合度を測定する工程を含んでなる、Ｔｈ１サイトカイン産生抑制活性の検定方法であって、４以上の重合度のプロアントシアニジンの検出がＴｈ１サイトカイン産生抑制活性を示すことを特徴とする方法。
【請求項８６】
５以上の重合度のプロアントシアニジンの検出がＴｈ１サイトカイン産生抑制活性の指標である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
試料中のプロアントシアニジンの重合度を測定する工程を含んでなる、Ｔｈ１サイトカインの産生抑制が治療に有効である疾患の治療活性の検定方法であって、４以上の重合度のプロアントシアニジンの検出がＴｈ１サイトカインの産生抑制が治療に有効である疾患の治療活性を示すことを特徴とする方法。
【請求項８８】
５以上の重合度のプロアントシアニジンの検出がＴｈ１サイトカインの産生抑制が治療に有効である疾患の治療活性の指標である、請求項８７に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５０】
【図５１】
【図５２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５０】
【図５１】
【図５２】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３０２００
【国際公開日】平成１７年４月７日（２００５．４．７）
【発行日】平成１８年１２月７日（２００６．１２．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１４２２８（Ｐ２００５−５１４２２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１４１１６
【国際出願日】平成１６年９月２７日（２００４．９．２７）
【出願人】（０００２５３５０３）麒麟麦酒株式会社 (247)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年４月７日（２００５．４．７）
【発行日】平成１８年１２月７日（２００６．１２．７）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１４１１６
【国際出願日】平成１６年９月２７日（２００４．９．２７）
【出願人】（０００２５３５０３）麒麟麦酒株式会社 (247)
【Ｆターム（参考）】
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