花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質の評価方法及びスクリーニング方法、花粉症の予防又は治療のための薬剤及びその製造方法、並びに、花粉症の検査方法及び検査用薬剤
【課題】花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質の評価方法及びスクリーニング方法、花粉症の予防又は治療のための薬剤及びその製造方法、並びに、花粉症の検査方法及び検査用薬剤の提供。
【解決手段】被検物質がペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有するか否かを評価する工程、を少なくとも含む花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質の評価方法及びスクリーニング方法、並びに、花粉症の予防又は治療のための薬剤の製造方法である。また、ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有する物質を有効成分とする花粉症の予防又は治療のための薬剤である。また、ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌を検出する花粉症の検査方法、及び、ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対する抗体を含む花粉症の検査用薬剤である。
【解決手段】被検物質がペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有するか否かを評価する工程、を少なくとも含む花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質の評価方法及びスクリーニング方法、並びに、花粉症の予防又は治療のための薬剤の製造方法である。また、ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有する物質を有効成分とする花粉症の予防又は治療のための薬剤である。また、ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌を検出する花粉症の検査方法、及び、ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対する抗体を含む花粉症の検査用薬剤である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、花粉症の発症メカニズムに関する本発明者らの新たな知見を利用した、花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質の評価方法及びスクリーニング方法、花粉症の予防又は治療のための薬剤及びその製造方法、並びに、花粉症の検査方法及び検査用薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
スギ花粉等の花粉により引き起こされる花粉症のアレルギー症状は、ＩｇＥを介した即時型アレルギー反応であると考えられている。即ち、目や鼻に侵入し、外膜（細胞壁）が割れて内膜（細胞膜）が放出されるように形態変化した花粉は、表面に現れた内膜が更に分解されることにより、内容物、即ち花粉のアレルゲンであるとされる抗原、Ｃｒｙｊ１、Ｃｒｙｊ２タンパク質を放出する。これらの抗原情報がマクロファージ等の抗原提示細胞からＴ細胞へ送られると、更に、Ｔ細胞からの指令により、これらの抗原と反応するＩｇＥがＢ細胞より産生される。産生されたＩｇＥは、肥満細胞に受容体を介して結合する。このような状態で、再度花粉中の抗原、Ｃｒｙｊ１、Ｃｒｙｊ２タンパク質が体内に侵入すると、肥満細胞上のＩｇＥと結合し、その結果、肥満細胞が活性化され、ヒスタミンが遊離し、くしゃみや鼻水などの様々なアレルギー反応を引き起こすと考えられている。
【０００３】
また、花粉症用の薬剤としては、従来から、抗アレルギー薬、抗ヒスタミン薬などが広く使用されている。しかしながら、抗アレルギー薬は効果が現れるまでに時間がかかるという問題があり、また、抗ヒスタミン薬はくしゃみ、鼻水、鼻づまり、目のかゆみといった既に出てしまったアレルギー症状を緩和するのには即効性があるものの、重度の症状にはあまり効果が無く、更に副作用があるという問題があった。
これに対し、近年は、副作用の心配のない花粉症用の薬剤の開発についても広く研究が行われており、例えば、スフィンゴ脂質を有効成分としたＩｇＥ抗体産生抑制剤を含む花粉症の治療剤などが提案されている（特許文献１参照）。
【０００４】
しかしながら、花粉症の発症メカニズムについては未だ完全な解明はなされておらず、また、症状に悩む患者数も多いことから、花粉症の発症メカニズムに関する新たな知見、及び、前記知見を利用した新たな花粉症用の薬剤の開発が望まれているのが現状である。
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−４３３５９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、花粉症の発症メカニズムに関する新たな知見を得ること、また、前記知見を利用し、花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質の、容易、かつ効率的な評価方法及びスクリーニング方法、効果的な花粉症の予防又は治療のための薬剤及びその効率的な製造方法、並びに、花粉症の検査方法及び検査用薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、花粉症の発症に、鼻腔粘膜などに存在する真菌が放出するペクチン分解酵素による花粉内膜の分解が関与しており、したがって、前記ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対する阻害活性を指標として、花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質を、容易、かつ効率的に評価乃至スクリーニングできるという知見である。また、前記ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有する物質を作用させることにより、花粉症の発症を効果的に予防乃至治療できるという知見である。また、前記ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかを検出することにより、花粉症の検査を行うことができるという知見である。
【０００８】
従来から、目や鼻に侵入した花粉が形態変化を起こすという現象は、当該技術分野において知られており、この形態変化は、花粉の外膜（細胞壁）が割れ、内膜（細胞膜）に覆われた原形質が現れることから、花粉の「破壊」、「破裂」等とも呼ばれている。目や鼻に侵入し、形態変化を起こした花粉は、現れた内膜が更に分解されることにより、内容物、即ち花粉のアレルゲンであるとされる抗原、Ｃｒｙｊ１、Ｃｒｙｊ２タンパク質を放出し、くしゃみや鼻水などの花粉症のアレルギー症状を引き起こすと考えられている。
【０００９】
しかしながら、前記したような花粉内膜の分解が、鼻腔粘膜などに存在する真菌が放出するペクチン分解酵素の作用によるものであり、したがって、前記ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対する阻害活性を指標として、花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質を、容易、かつ効率的に評価乃至スクリーニングできること、また、前記ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有する物質を作用させることにより、花粉症の発症を効果的に予防乃至治療できること、更には、前記ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかを検出することにより、花粉症の検査を行うことができることは、従来全く知られておらず、本発明者らの新たな知見である。
【００１０】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 被検物質が、花粉症に対する予防又は治療作用を有するか否かを評価する方法であって、
（ａ）前記被検物質が、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有するか否かを評価する工程
を含むことを特徴とする方法である。
＜２＞ 花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被検物質が、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有するか否かを評価する工程、並びに、
（ｂ）前記工程（ａ）で前記ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有すると評価された物質を選択する工程
を含むことを特徴とする方法である。
＜３＞ 花粉症の予防又は治療のための薬剤の製造方法であって、
（ａ）被検物質が、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有するか否かを評価する工程、
（ｂ）前記工程（ａ）で前記ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有すると評価された物質を選択する工程、
（ｃ）前記工程（ｂ）で選択された物質を生成する工程、並びに、
（ｄ）前記工程（ｃ）で生成された物質と、薬理学的に許容され得る担体とを混合する工程
を含むことを特徴とする製造方法である。
＜４＞ 花粉症の予防又は治療のための薬剤であって、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有する物質を有効成分とすることを特徴とする薬剤である。
＜５＞ （ａ’）被検体から被検試料を採取する工程、並びに、
（ｂ’）前記工程（ａ’）で採取した被検試料について、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかを検出する工程
を含むことを特徴とする花粉症の検査方法である。
＜６＞ ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対する抗体を含むことを特徴とする花粉症の検査用薬剤である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、従来における諸問題を解決することができ、花粉症の発症メカニズムに関する本発明者らの新たな知見を利用し、花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質の、容易、かつ効率的な評価方法及びスクリーニング方法、効果的な花粉症の予防又は治療のための薬剤及びその効率的な製造方法、並びに、花粉症の検査方法及び検査用薬剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（評価方法、スクリーニング方法）
本発明の評価方法は、被検物質が、花粉症に対する予防又は治療作用を有するか否かを評価する方法であり、以下の工程（ａ）を含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
また、本発明のスクリーニング方法は、花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質をスクリーニングする方法であり、以下の工程（ａ）〜工程（ｂ）を含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
前記評価方法及び前記スクリーニング方法（以下、単に前記「方法」と称することがある）は、花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質の評価乃至スクリーニングを、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対する阻害活性を指標として行うことを特徴とする。
【００１３】
＜工程（ａ）＞
前記評価方法及び前記スクリーニング方法においては、まず、被検物質が、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれか（ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌）に対して阻害活性を有するか否かを評価する（工程（ａ））。
【００１４】
−被検物質−
前記「被検物質」としては、特に制限はなく、花粉症に対する予防又は治療作用を有するか否かを評価したい任意の物質を用いることができ、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製蛋白質、粗精製蛋白質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物、既存のペクチン分解酵素阻害薬、既存の抗真菌薬、既存の花粉症用の薬剤などが挙げられる。
【００１５】
−ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対する阻害活性の評価−
前記「ペクチン分解酵素」としては、ペクチンを分解可能な酵素であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンエステラーゼなどが挙げられる。
前記被検物質が前記ペクチン分解酵素に対して阻害活性を有するか否かを評価する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の酵素活性測定方法などを利用することができる。前記被検物質の存在下では、前記被検物質の非存在下と比較して、前記ペクチン分解酵素の酵素活性が低下するときに、前記被検物質は、前記ペクチン分解酵素に対して阻害活性を有すると評価することができる。
また、ここで、後述する実施例１で示されるように、花粉内膜はペクチンで構成される膜であることから、前記被検物質が前記ペクチン分解酵素に対して阻害活性を有するか否かを評価する方法としては、前記被検物質の存在下及び非存在下での、前記ペクチン分解酵素による花粉内膜の分解の程度の違いを調べてもよい。前記被検物質の存在下では、前記被検物質の非存在下と比較して、前記ペクチン分解酵素による花粉内膜の分解が抑制乃至阻止されたときに、前記被検物質は、前記ペクチン分解酵素に対して阻害活性を有すると評価することができる。
【００１６】
また、前記「ペクチン分解酵素を放出する真菌」としては、前記したようなペクチン分解酵素を放出する真菌であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓなどが挙げられる。これらの中でも、前記ペクチン分解酵素を放出する真菌としては、体内、特に鼻腔粘膜内などに存在し得る真菌であることが好ましい。
前記被検物質が前記ペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有するか否かを評価する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の真菌数測定方法、公知の真菌活性測定方法などを利用することができる。前記被検物質の存在下では、前記被検物質の非存在下と比較して、前記真菌数が減少するときに、乃至、前記真菌活性が低下するときに、前記被検物質は、前記ペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有すると評価することができる。
また、前記被検物質が前記ペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有するか否かを評価する方法としては、間接的に、前記被検物質の存在下及び非存在下での、前記ペクチン分解酵素の酵素活性の違いを調べてもよく、また、前記被検物質の存在下及び非存在下での、前記ペクチン分解酵素による花粉内膜の分解の程度の違いを調べてもよい。
【００１７】
なお、前記工程（ａ）では、前記被検物質の、前記ペクチン分解酵素に対する阻害活性のみを評価してもよいし、前記ペクチン分解酵素を放出する真菌に対する阻害活性のみを評価してもよいし、双方を評価してもよい。前記被検物質が、前記ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対する阻害活性を有していると評価された場合に、前記被検物質は、花粉症に対する予防又は治療作用を有すると評価することができる。
以上、前記工程（ａ）により、本発明の評価方法を行うことができる。前記評価方法によれば、容易に、かつ効率的に、被検物質が花粉症の予防又は治療作用を有するか否かを評価することができる。
【００１８】
＜工程（ｂ）＞
また、前記スクリーニング方法においては、更に、前記工程（ａ）でペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれか（ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌）に対して阻害活性を有すると評価された物質を選択する（工程（ｂ））。
種々の被検物質を用いて前記工程（ａ）による評価を行い、次いで、本工程（ｂ）において、種々の被検物質の中からペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有すると評価された物質を選択することにより、容易に、かつ効率的に、花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質をスクリーニングすることができる。
【００１９】
前記方法により評価乃至スクリーニングされた、花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質は、例えば、化学合成や、分離精製などの手法により適宜生成することができる。前記物質の使用用途としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、そのまま、花粉症の予防又は治療に使用してもよいし、花粉症用の薬剤開発のための実験などに使用してもよい。また、後述する本発明の製造方法により製造される薬剤や、後述する本発明の薬剤などの有効成分として使用してもよい。
【００２０】
（製造方法）
本発明の製造方法は、花粉症の予防又は治療のための薬剤の製造方法であり、以下の工程（ａ）〜工程（ｄ）を含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００２１】
＜工程（ａ）、工程（ｂ）＞
前記製造方法における工程（ａ）及び工程（ｂ）は、前記した本発明の評価方法及び本発明のスクリーニング方法における工程（ａ）及び工程（ｂ）とそれぞれ同様である。前記工程（ａ）〜（ｂ）により、花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質を、容易に、かつ効率的に選択することができる。
【００２２】
＜工程（ｃ）＞
前記製造方法においては、次いで、前記工程（ａ）〜（ｂ）で選択された、花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質を生成する（工程（ｃ））。
前記生成の手段としては、特に制限はなく、例えば、前記物質の構造や由来などに応じて、化学合成や、分離精製などの公知の生成手段から適宜選択することができる。
【００２３】
＜工程（ｄ）＞
前記製造方法においては、次いで、前記工程（ｃ）で生成された物質を、薬学的に許容され得る担体と混合する（工程（ｄ））。
−薬学的に許容され得る担体−
前記薬学的に許容され得る担体としては、特に制限はなく、例えば、製造する薬剤の所望の剤型等に応じて適宜選択することができる。また、前記剤型としても、特に制限はなく、例えば、後述する本発明の薬剤の項目で列挙される剤型などが挙げられる。
【００２４】
−混合−
前記工程（ｃ）で生成された物質と前記薬学的に許容され得る担体との混合方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記物質に前記薬学的に許容され得る担体を添加してもよいし、前記薬学的に許容され得る担体に前記物質を添加してもよいし、双方を同時に容器内に添加し混合してもよい。また、前記混合方法としては、例えば、公知の薬剤の製造方法における各成分の混合方法から適宜選択することができる。
また、前記混合時の、前記物質と前記薬学的に許容され得る担体との使用量比としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２５】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記工程（ｄ）で得られた混合物を成形する成形工程、などが挙げられる。
【００２６】
以上、前記工程（ａ）〜工程（ｄ）により、本発明の製造方法を行うことができ、これにより、花粉症の予防又は治療のための薬剤を効率的に製造することができる。
前記製造方法により得られた花粉症の予防又は治療のための薬剤の使用形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、後述する本発明の薬剤と同様に使用することができる。
【００２７】
（薬剤）
本発明の薬剤は、花粉症の予防又は治療のための薬剤であって、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれか（ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌）に対して阻害活性を有する物質を有効成分として含有し、更に必要に応じてその他の成分を含有してなる。なお、前記薬剤は、前記した本発明の製造方法により製造された薬剤であってもよい。
【００２８】
−ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有する物質−
前記「ペクチン分解酵素」とは、ペクチンを分解する酵素の総称であり、例えば、一般的に、ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンエステラーゼなどが知られている。後述する実施例１において示されるように、花粉内膜はペクチンから構成されるため、目や鼻に侵入し、形態変化を起こした花粉内膜に前記ペクチン分解酵素が作用すると、花粉内膜は分解され、内容物であるＣｒｙｊ１、Ｃｒｙｊ２タンパク質が放出されて、くしゃみや鼻水などの花粉症のアレルギー症状が引き起こされると考えられる。したがって、前記ペクチン分解酵素に対して阻害活性を有する物質は、花粉症を予防又は治療するための有効成分となり得る。
前記ペクチン分解酵素に対して阻害活性を有する物質としては、前記ペクチン分解酵素の反応速度を低下させ、その働きを阻害することのできる物質であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、システインなどが挙げられる。
【００２９】
また、前記ペクチン分解酵素を放出する真菌としては、例えば、一般的に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓなどが知られている。前記したように、花粉内膜はペクチンから構成されるため、例えば鼻腔粘膜などに前記ペクチン分解酵素を放出する真菌が存在すると、目や鼻に侵入し形態変化を起こした花粉内膜に、前記真菌から放出されたペクチン分解酵素が作用し、花粉内膜が分解され、内容物であるＣｒｙｊ１、Ｃｒｙｊ２タンパク質が放出されて、くしゃみや鼻水などの花粉症のアレルギー症状が引き起こされると考えられる。したがって、前記ペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有する物質は、花粉症を予防又は治療するための有効成分となり得る。
前記ペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有する物質としては、特に制限はなく、例えば、アンホテリシンＢ、フルコナゾール、ミコナゾール、ミカファンギンなどが挙げられる。また、前記ペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有する物質としては、中でも、体内、特に鼻腔粘膜内などに存在し得る前記真菌に対して阻害活性を有する物質であることが好ましい。
【００３０】
なお、前記ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有する物質としては、前記ペクチン分解酵素に対してのみ阻害活性を有する物質であってもよいし、前記ペクチン分解酵素を放出する真菌に対してのみ阻害活性を有する物質であってもよいし、双方に対して阻害活性を有する物質であってもよい。
また、前記ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有する物質としては、例えば、前記した本発明の評価方法、本発明のスクリーニング方法により、花粉症に対する予防又は治療作用を有すると評価乃至スクリーニングされた物質を使用することもできる。
【００３１】
前記薬剤中の、前記ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有する物質（有効成分）の含有量は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、また、前記薬剤は、前記有効成分そのものであってもよい。
また、前記有効成分は、いずれか１種を単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。２種以上を併用する場合の、前記薬剤中の各々の有効成分の含有量比にも、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３２】
−その他の成分−
前記その他の成分としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薬学的に許容され得る担体などが挙げられる。前記担体としても、特に制限はなく、例えば、後述する前記薬剤の剤型等に応じて適宜選択することができる。また、前記薬剤中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて、適宜選択することができる。
【００３３】
−剤型−
前記薬剤の剤型としては、特に制限はなく、例えば、後述するような所望の投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等）、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤などが挙げられる。
【００３４】
前記経口固形剤としては、例えば、前記有効成分に、賦形剤、更には必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。前記結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。前記崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられる。前記滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。前記着色剤としては、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
【００３５】
前記経口液剤としては、例えば、前記有効成分に、矯味・矯臭剤、緩衝剤、安定化剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどが挙げられる。
【００３６】
前記注射剤としては、例えば、前記有効成分に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用等の注射剤を製造することができる。
前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
【００３７】
前記軟膏剤としては、例えば、前記有効成分に、公知の基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等を配合し、常法により混合し、製造することができる。
前記基剤としては、例えば、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィンなどが挙げられる。前記保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピルなどが挙げられる。
【００３８】
前記貼付剤としては、例えば、公知の支持体に前記軟膏剤としてのクリーム剤、ゲル剤、ペースト剤等を、常法により塗布し、製造することができる。前記支持体としては、例えば、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布、軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルム、発泡体シートなどが挙げられる。
【００３９】
−使用−
前記薬剤は、例えば、花粉症の患者に投与することにより使用することができる。
前記薬剤の投与対象動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サルなどが挙げられる。
また、前記薬剤の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記薬剤の剤型等に応じ、適宜選択することができ、経口投与、腹腔内投与、血液中への注射、腸内への注入、軟膏塗布による鼻腔内への投与、スプレーによる鼻腔内への投与などが挙げられる。
また、前記薬剤の投与量としては、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、成人への１日の投与あたり、有効成分の量として、１μｇ〜１ｇが好ましく、１μｇ〜１ｍｇがより好ましい。
また、前記薬剤の投与時期としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、花粉症のアレルギー症状の発症前に予防的に投与されてもよいし、花粉症のアレルギー症状の発症後に治療的に投与されてもよい。
なお、前記薬剤の予防又は治療対象となる花粉症の、原因となる花粉の種類としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、スギ、ヒノキ、スズメノテッポウ、カモガヤ、ブタクサ、ヨモギ等の花粉などが挙げられる。
【００４０】
（花粉症の検査方法）
本発明の花粉症の検査方法（以下、単に「検査方法」と称することがある）は、以下の工程（ａ’）〜工程（ｂ’）を含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
前記花粉症の検査方法により検査することができる事項としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、検査を受ける被検体が花粉症であるか否か、検査を受ける被検体の花粉症の重症度、などが挙げられる。
なお、前記花粉症の検査方法は、被検体から採取した被検試料中の、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかを検出することを特徴とする。
【００４１】
＜工程（ａ’）＞
前記検査方法では、まず、被検体から被検試料を採取する（工程（ａ’））。
−被検体−
前記被検体としては、前記検査の検査対象となり得る生物であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、花粉症の疑いのある患者などが挙げられる。なお、前記被検体の生物種としても特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
−被検試料−
前記被検試料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、前記被検体の、鼻水、涙、鼻腔粘膜組織などが好適に挙げられる。
前記被検体から前記被検試料を採取する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記被検体から採取された前記被検試料は、例えば、そのまま後述する工程（ｂ’）に供されてもよいし、洗浄、保存などの操作が行われた後に、工程（ｂ’）に供されてもよい。
【００４２】
＜工程（ｂ’）＞
前記検査方法では、次いで、前記工程（ａ’）で採取した被検試料について、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれか（ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌）を検出する（工程（ｂ’））。
【００４３】
−ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌の検出−
ここで、前記「ペクチン分解酵素」、及び、前記「ペクチン分解酵素を放出する真菌」としては、前記した本発明の評価方法、本発明のスクリーニング方法の項目と同様である。
前記「ペクチン分解酵素」を検出する方法としては、前記被検試料中のペクチン分解酵素の、酵素量、乃至、酵素活性を測定できる方法であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ペクチン分解酵素と前記ペクチン分解酵素に対する抗体との抗原抗体反応を利用した測定方法、前記ペクチン分解酵素と前記ペクチン分解酵素の基質（ペクチン）との反応を利用した測定方法などが挙げられる。
また、前記「ペクチン分解酵素を放出する真菌」を検出する方法としては、前記被検試料中のペクチン分解酵素を放出する真菌の、真菌量、乃至、真菌活性を測定できる方法であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記真菌と前記真菌に対する抗体との抗原抗体反応を利用した測定方法、前記真菌を分離・培養しコロニー数を調べる測定方法などが挙げられる。
【００４４】
なお、前記工程（ｂ’）では、前記被検試料について、前記ペクチン分解酵素のみを検出してもよいし、前記ペクチン分解酵素を放出する真菌のみを検出してもよいし、双方を検出してもよい。
【００４５】
前記花粉症の検査方法では、前記工程（ｂ’）の検出結果に基づき、例えば、前記被検体が花粉症であるか否か、前記被検体の花粉症の重症度、などを判断することができる。
前記判断方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記工程（ａ’）と並行して、花粉症の疑いの無い健常者からの対照試料を準備し、この対照試料と比較して、前記工程（ａ’）の被検体から得られた被検試料では、前記ペクチン分解酵素及び／又は前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の、量が多い、乃至は、活性が高いときに、前記被検試料を採取した被検体は、花粉症であると判断することができる。また、前記ペクチン分解酵素及び／又は前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の、量の多さの程度、乃至は、活性の高さの程度に応じて、前記被検体の花粉症の重症度を判断することができる。
【００４６】
前記花粉症の検査方法は、例えば、花粉症の疑いのある患者が花粉症であるか否か、また、花粉症患者の花粉症の重症度、などを診断するために使用することができる。また、前記花粉症の検査方法は、花粉症の患者に対する好適な薬剤を選択するためにも有用である。前記花粉症の検査により、花粉症であると判断された患者の予防又は治療には、ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌の活性を抑制することが有効であると考えられ、即ち、前記したような、ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有する物質を有効成分とする本発明の薬剤が好適であると判断することができる。
【００４７】
（花粉症の検査用薬剤）
本発明の花粉症の検査用薬剤（以下、単に「検査用薬剤」と称することがある）は、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれか（ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌）に対する抗体を含み、必要に応じてその他の成分を含んでなる。
【００４８】
−ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対する抗体−
ここで、前記「ペクチン分解酵素」、及び、前記「ペクチン分解酵素を放出する真菌」としては、前記した本発明の評価方法、本発明のスクリーニング方法の項目と同様である。
前記「ペクチン分解酵素」に対する抗体としては、前記ペクチン分解酵素を認識可能な抗体であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ペクチン分解酵素の全体又は一部を抗原として用い、公知の手法により、目的に応じて適宜作製することができる。
前記「ペクチン分解酵素を放出する真菌」に対する抗体としても、前記ペクチン分解酵素を放出する真菌を認識可能な抗体であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の全体又は一部、例えば膜タンパク質などを抗原として用い、公知の手法により、目的に応じて適宜作製することができる。
また、前記抗体はポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。また、前記抗体は、標識されていてもよい。また、前記抗体としては、市販品を使用することもできる。
【００４９】
なお、前記抗体が、ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有する場合、このような抗体は、前記した本発明の薬剤の有効成分としても使用することができる。
【００５０】
前記検査用薬剤中の前記抗体の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、また、前記検査用薬剤は、前記抗体そのものであってもよい。
また、前記抗体は１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。２種以上を併用する場合の、前記検査用薬剤中の各々の抗体の含有量比としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５１】
−その他の成分−
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記抗体を保存するための保存液などが挙げられる。
前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５２】
前記検査用薬剤の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記抗体と前記その他の成分とを混合することにより製造することができる。
【００５３】
前記花粉症の検査用薬剤は、例えば、前記した本発明の花粉症の検査方法に好適に利用可能である。例えば、花粉症の疑いのある患者から採取した被検試料に、前記検査用薬剤を加え、適宜公知の手法により、前記被検試料における抗原抗体反応を検出することにより、前記患者が花粉症であるか否か、また、その花粉症の重症度を判断することができる。
また、前記花粉症の検査用薬剤は、例えば、前記抗原抗体反応を検出するための検出用薬剤などと組合せ、花粉症の検査用キットとして使用されてもよい。
【００５４】
［効果］
本発明の評価方法及びスクリーニング方法によれば、ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対する阻害活性を指標として、容易に、かつ効率的に、花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質を評価乃至スクリーニングすることができる。また、本発明の製造方法によれば、前記評価乃至スクリーニングされた花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質を有効成分とする、花粉症の予防又は治療のための薬剤を効率的に製造することができる。したがって、前記評価方法、スクリーニング方法、及び製造方法は、新たな花粉症用の薬剤の開発に非常に有用である。
また、本発明の薬剤は、ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有する物質を有効成分として含むので、例えば鼻腔粘膜などに存在する真菌が放出するペクチン分解酵素による花粉内膜の分解を抑制することができ、そのため、スギ花粉の内容物である抗原の放出を抑制し、くしゃみや鼻水などの花粉症のアレルギー症状を抑制することができる。したがって、前記薬剤は、花粉症の予防又は治療に非常に有用である。
また、本発明の花粉症の検査方法及び検査用薬剤によれば、被検体から採取した被検試料中のペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌を検出することにより、前記被検体が花粉症であるか否か、前記被検体の花粉症の重症度、などを検査することができる。したがって、前記花粉症の検査方法及び検査用薬剤は、花粉症の診断に非常に有用である。
【実施例】
【００５５】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００５６】
（実施例１：ペクチン分解酵素に対するスギ花粉内膜の感受性）
従来から、鼻水等のアルカリ性条件下で花粉が形態変化を起こすという現象は、当該技術分野において知られており、この形態変化は、花粉の外膜（細胞壁）が割れ、内膜（細胞膜）に覆われた原形質が現れることから、花粉の「破壊」、「破裂」等とも呼ばれている。目や鼻に侵入し、形態変化を起こした花粉は、現れた内膜（細胞膜）が更に分解されることにより、内容物、即ち花粉のアレルゲンであるとされる抗原、Ｃｒｙｊ１、Ｃｒｙｊ２タンパク質を放出し、くしゃみや鼻水などの花粉症のアレルギー症状を引き起こすと考えられている。
本実施例１では、スギ花粉が前記したような形態変化を起こすことにより現れるスギ花粉内膜の、ペクチン分解酵素に対する感受性を検討した。
【００５７】
５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８、弱アルカリ性）中で形態変化を起こさせたスギ花粉（０．１ｇ／２ｍｌ）懸濁液に、希塩酸を加えてｐＨ５とし、アスペルギウス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のペクチン分解酵素（シグマ社から購入）２８ユニットを加えた。３７℃で１時間インキュベーションした後、スギ花粉の形態を位相差顕微鏡により観察した。結果を図１に示す。
【００５８】
図１の結果から、ペクチン分解酵素を加えなかった場合（コントロール）には、スギ花粉内膜は形態を保持していた（図１、上段）のに対し、ペクチン分解酵素を加えた場合には、多くのスギ花粉内膜が消失した（図１、下段）ことがわかる。
この結果から、スギ花粉内膜は、ペクチンから構成される膜であり、ペクチン分解酵素により分解されることが示された。目や鼻に侵入し、形態変化を起こしたスギ花粉は、このようなペクチン分解酵素の作用により内膜が分解され、内容物、即ちスギ花粉の抗原、Ｃｒｙｊ１、Ｃｒｙｊ２タンパク質を放出し、花粉症の症状を引き起こしているものと考えられる。
【００５９】
（実施例２：スギ花粉保存液からの真菌の分離）
−スギ花粉含有寒天培地の作製−
スギ花粉５ｇを、５０ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４を含む水溶液（ｐＨ９、弱アルカリ性）５０ｍｌに懸濁して形態変化を引き起こさせた。一方、寒天３ｇ、及び馬鈴薯澱粉１０ｇを含む水１５０ｍｌをオートクレーブ処理（１２１℃、２０分）後、５５℃に冷却した。前記スギ花粉液及び前記寒天液を、均一になるまで混合した後、２５ｍｌを直径１０ｃｍの滅菌したシャーレに流し込み、室温にて冷却させ、固化させてスギ花粉含有寒天培地を作製した。
【００６０】
−スギ花粉保存液からの真菌の分離−
スギ花粉１２．４ｇを、４８０ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．２）水溶液中に懸濁し、超音波処理後、５０ｍｌの遠心管に分注して、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を除いた後、室温にて１ヶ月間保存したところ、表面に赤色及び緑色のカビが現れた。このスギ花粉保存液に生じた緑色及び赤色のカビは、前記スギ花粉含有寒天培地上で増殖し、コロニーを形成した。
【００６１】
−青カビ上清によるスギ花粉内膜の分解−
前記スギ花粉含有寒天培地上でコロニーを形成した緑色のカビ（青カビ）をサブロー液体培地で培養し、遠心（８，０００ｒｐｍ、５分）して上清を得た。この青カビの培養上清に、リン酸２カリウム水溶液（ｐＨ９、弱アルカリ性）中で形態変化を起こしたスギ花粉を懸濁し、３７℃にて２６時間インキュベーションし、位相差顕微鏡下で観察した。結果を図２に示す。
【００６２】
図２の結果から、サブロー液体培地に懸濁した場合（コントロール）には、スギ花粉内膜は形態を保持していた（図２、上段）のに対し、青カビの培養上清とインキュベーションした場合には、スギ花粉内膜は消失した（図２、下段）ことがわかる。
この結果から、前記スギ花粉含有寒天培地上で分離された青カビは、スギ花粉内膜を分解する作用を有することが示された。この青カビが、ペクチン分解酵素を培地中に放出し、そのペクチン分解酵素が、スギ花粉内膜を分解したものと考えられる。
【００６３】
（実施例３：ヒト鼻腔からの真菌の分離）
−スギ花粉含有寒天培地の作製−
前記実施例２と同様にして、スギ花粉含有寒天培地を作製した。
【００６４】
−ヒト鼻腔からの真菌の分離−
ちり紙の代わりに包装用ラップを用いて鼻をかみ、ヒト鼻腔サンプルを採取した（被検体：花粉症患者）。前記スギ花粉含有寒天培地に前記ヒト鼻腔サンプルを塗布し、３０℃にて３日間培養した。
【００６５】
結果、前記スギ花粉含有寒天培地上に、多数の真菌と思われる色調の薄いコロニーが現れた。また、このコロニーは、別のスギ花粉を含む寒天培地上に塗布して、更に培養できることが確認できた。
用いたスギ花粉含有寒天培地には、ペクチン膜からなる内膜で覆われたスギ花粉以外には窒素源を供給する物質は含まれていないことから、出現したコロニーは、スギ花粉の内膜を破壊し、内部の窒素源を利用して生育したものと考えられる。したがって、この結果から、ヒト（例えば、花粉症患者）の鼻腔内には、ペクチン分解酵素を放出し、ペクチン膜からなるスギ花粉の内膜を破壊する真菌が存在している可能性が示唆された。
【００６６】
前記実施例１〜３の結果から、ペクチン分解酵素によるスギ花粉内膜の分解が花粉症のアレルギー症状を引き起こす一因であること、更には、ペクチン分解酵素を放出する真菌の存在が花粉症のアレルギー症状を引き起こす一因であることが示唆された。
前記したようなペクチン分解酵素を放出する真菌は、例えば花粉症患者の鼻腔粘膜などに存在していることが考えられる。即ち、目や鼻に侵入し、鼻水等のアルカリ性条件下で形態変化を起こした花粉の内膜は、鼻腔粘膜などに存在する真菌が放出するペクチン分解酵素により分解され、内容物、即ちスギ花粉のアレルゲンであるとされる抗原、Ｃｒｙｊ１、Ｃｒｙｊ２タンパク質を放出して、花粉症のアレルギー症状を引き起こすというメカニズムが考えられる。
したがって、ペクチン分解酵素の働きを阻害し得る物質を作用させることにより、また、前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の働きを阻害し得る物質を作用させることにより、花粉症のアレルギー症状は効果的に抑制できるものと考えられる。
以上のことから、ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対する阻害活性を指標として、花粉症の予防又は治療作用を有する物質を、容易、かつ効率的に評価乃至スクリーニングできること、並びに、前記評価乃至スクリーニングされた物質を有効成分として、花粉症の予防又は治療のための薬剤を効率的に製造できることが示された。また、ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有する物質を有効成分として含む薬剤が、花粉症の予防又は治療に効果的であることが示された。また、被検体から採取した被検試料中のペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌を検出することにより、花粉症の検査を行うことができることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明の評価方法、本発明のスクリーニング方法、及び本発明の製造方法は、新たな花粉症用の薬剤の開発に非常に有用であり、また、本発明の薬剤は、花粉症の予防又は治療に非常に有用である。また、本発明の花粉症の検査方法及び検査用薬剤は、花粉症の診断に非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、ペクチン分解酵素によりスギ花粉内膜が分解されたことを示す図である。
【図２】図２は、スギ花粉含有寒天培地で分離された青カビ培養上清によりスギ花粉内膜が分解されたことを示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、花粉症の発症メカニズムに関する本発明者らの新たな知見を利用した、花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質の評価方法及びスクリーニング方法、花粉症の予防又は治療のための薬剤及びその製造方法、並びに、花粉症の検査方法及び検査用薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
スギ花粉等の花粉により引き起こされる花粉症のアレルギー症状は、ＩｇＥを介した即時型アレルギー反応であると考えられている。即ち、目や鼻に侵入し、外膜（細胞壁）が割れて内膜（細胞膜）が放出されるように形態変化した花粉は、表面に現れた内膜が更に分解されることにより、内容物、即ち花粉のアレルゲンであるとされる抗原、Ｃｒｙｊ１、Ｃｒｙｊ２タンパク質を放出する。これらの抗原情報がマクロファージ等の抗原提示細胞からＴ細胞へ送られると、更に、Ｔ細胞からの指令により、これらの抗原と反応するＩｇＥがＢ細胞より産生される。産生されたＩｇＥは、肥満細胞に受容体を介して結合する。このような状態で、再度花粉中の抗原、Ｃｒｙｊ１、Ｃｒｙｊ２タンパク質が体内に侵入すると、肥満細胞上のＩｇＥと結合し、その結果、肥満細胞が活性化され、ヒスタミンが遊離し、くしゃみや鼻水などの様々なアレルギー反応を引き起こすと考えられている。
【０００３】
また、花粉症用の薬剤としては、従来から、抗アレルギー薬、抗ヒスタミン薬などが広く使用されている。しかしながら、抗アレルギー薬は効果が現れるまでに時間がかかるという問題があり、また、抗ヒスタミン薬はくしゃみ、鼻水、鼻づまり、目のかゆみといった既に出てしまったアレルギー症状を緩和するのには即効性があるものの、重度の症状にはあまり効果が無く、更に副作用があるという問題があった。
これに対し、近年は、副作用の心配のない花粉症用の薬剤の開発についても広く研究が行われており、例えば、スフィンゴ脂質を有効成分としたＩｇＥ抗体産生抑制剤を含む花粉症の治療剤などが提案されている（特許文献１参照）。
【０００４】
しかしながら、花粉症の発症メカニズムについては未だ完全な解明はなされておらず、また、症状に悩む患者数も多いことから、花粉症の発症メカニズムに関する新たな知見、及び、前記知見を利用した新たな花粉症用の薬剤の開発が望まれているのが現状である。
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−４３３５９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、花粉症の発症メカニズムに関する新たな知見を得ること、また、前記知見を利用し、花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質の、容易、かつ効率的な評価方法及びスクリーニング方法、効果的な花粉症の予防又は治療のための薬剤及びその効率的な製造方法、並びに、花粉症の検査方法及び検査用薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、花粉症の発症に、鼻腔粘膜などに存在する真菌が放出するペクチン分解酵素による花粉内膜の分解が関与しており、したがって、前記ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対する阻害活性を指標として、花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質を、容易、かつ効率的に評価乃至スクリーニングできるという知見である。また、前記ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有する物質を作用させることにより、花粉症の発症を効果的に予防乃至治療できるという知見である。また、前記ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかを検出することにより、花粉症の検査を行うことができるという知見である。
【０００８】
従来から、目や鼻に侵入した花粉が形態変化を起こすという現象は、当該技術分野において知られており、この形態変化は、花粉の外膜（細胞壁）が割れ、内膜（細胞膜）に覆われた原形質が現れることから、花粉の「破壊」、「破裂」等とも呼ばれている。目や鼻に侵入し、形態変化を起こした花粉は、現れた内膜が更に分解されることにより、内容物、即ち花粉のアレルゲンであるとされる抗原、Ｃｒｙｊ１、Ｃｒｙｊ２タンパク質を放出し、くしゃみや鼻水などの花粉症のアレルギー症状を引き起こすと考えられている。
【０００９】
しかしながら、前記したような花粉内膜の分解が、鼻腔粘膜などに存在する真菌が放出するペクチン分解酵素の作用によるものであり、したがって、前記ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対する阻害活性を指標として、花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質を、容易、かつ効率的に評価乃至スクリーニングできること、また、前記ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有する物質を作用させることにより、花粉症の発症を効果的に予防乃至治療できること、更には、前記ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかを検出することにより、花粉症の検査を行うことができることは、従来全く知られておらず、本発明者らの新たな知見である。
【００１０】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 被検物質が、花粉症に対する予防又は治療作用を有するか否かを評価する方法であって、
（ａ）前記被検物質が、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有するか否かを評価する工程
を含むことを特徴とする方法である。
＜２＞ 花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被検物質が、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有するか否かを評価する工程、並びに、
（ｂ）前記工程（ａ）で前記ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有すると評価された物質を選択する工程
を含むことを特徴とする方法である。
＜３＞ 花粉症の予防又は治療のための薬剤の製造方法であって、
（ａ）被検物質が、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有するか否かを評価する工程、
（ｂ）前記工程（ａ）で前記ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有すると評価された物質を選択する工程、
（ｃ）前記工程（ｂ）で選択された物質を生成する工程、並びに、
（ｄ）前記工程（ｃ）で生成された物質と、薬理学的に許容され得る担体とを混合する工程
を含むことを特徴とする製造方法である。
＜４＞ 花粉症の予防又は治療のための薬剤であって、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有する物質を有効成分とすることを特徴とする薬剤である。
＜５＞ （ａ’）被検体から被検試料を採取する工程、並びに、
（ｂ’）前記工程（ａ’）で採取した被検試料について、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかを検出する工程
を含むことを特徴とする花粉症の検査方法である。
＜６＞ ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対する抗体を含むことを特徴とする花粉症の検査用薬剤である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、従来における諸問題を解決することができ、花粉症の発症メカニズムに関する本発明者らの新たな知見を利用し、花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質の、容易、かつ効率的な評価方法及びスクリーニング方法、効果的な花粉症の予防又は治療のための薬剤及びその効率的な製造方法、並びに、花粉症の検査方法及び検査用薬剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（評価方法、スクリーニング方法）
本発明の評価方法は、被検物質が、花粉症に対する予防又は治療作用を有するか否かを評価する方法であり、以下の工程（ａ）を含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
また、本発明のスクリーニング方法は、花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質をスクリーニングする方法であり、以下の工程（ａ）〜工程（ｂ）を含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
前記評価方法及び前記スクリーニング方法（以下、単に前記「方法」と称することがある）は、花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質の評価乃至スクリーニングを、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対する阻害活性を指標として行うことを特徴とする。
【００１３】
＜工程（ａ）＞
前記評価方法及び前記スクリーニング方法においては、まず、被検物質が、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれか（ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌）に対して阻害活性を有するか否かを評価する（工程（ａ））。
【００１４】
−被検物質−
前記「被検物質」としては、特に制限はなく、花粉症に対する予防又は治療作用を有するか否かを評価したい任意の物質を用いることができ、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製蛋白質、粗精製蛋白質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物、既存のペクチン分解酵素阻害薬、既存の抗真菌薬、既存の花粉症用の薬剤などが挙げられる。
【００１５】
−ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対する阻害活性の評価−
前記「ペクチン分解酵素」としては、ペクチンを分解可能な酵素であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンエステラーゼなどが挙げられる。
前記被検物質が前記ペクチン分解酵素に対して阻害活性を有するか否かを評価する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の酵素活性測定方法などを利用することができる。前記被検物質の存在下では、前記被検物質の非存在下と比較して、前記ペクチン分解酵素の酵素活性が低下するときに、前記被検物質は、前記ペクチン分解酵素に対して阻害活性を有すると評価することができる。
また、ここで、後述する実施例１で示されるように、花粉内膜はペクチンで構成される膜であることから、前記被検物質が前記ペクチン分解酵素に対して阻害活性を有するか否かを評価する方法としては、前記被検物質の存在下及び非存在下での、前記ペクチン分解酵素による花粉内膜の分解の程度の違いを調べてもよい。前記被検物質の存在下では、前記被検物質の非存在下と比較して、前記ペクチン分解酵素による花粉内膜の分解が抑制乃至阻止されたときに、前記被検物質は、前記ペクチン分解酵素に対して阻害活性を有すると評価することができる。
【００１６】
また、前記「ペクチン分解酵素を放出する真菌」としては、前記したようなペクチン分解酵素を放出する真菌であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓなどが挙げられる。これらの中でも、前記ペクチン分解酵素を放出する真菌としては、体内、特に鼻腔粘膜内などに存在し得る真菌であることが好ましい。
前記被検物質が前記ペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有するか否かを評価する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の真菌数測定方法、公知の真菌活性測定方法などを利用することができる。前記被検物質の存在下では、前記被検物質の非存在下と比較して、前記真菌数が減少するときに、乃至、前記真菌活性が低下するときに、前記被検物質は、前記ペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有すると評価することができる。
また、前記被検物質が前記ペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有するか否かを評価する方法としては、間接的に、前記被検物質の存在下及び非存在下での、前記ペクチン分解酵素の酵素活性の違いを調べてもよく、また、前記被検物質の存在下及び非存在下での、前記ペクチン分解酵素による花粉内膜の分解の程度の違いを調べてもよい。
【００１７】
なお、前記工程（ａ）では、前記被検物質の、前記ペクチン分解酵素に対する阻害活性のみを評価してもよいし、前記ペクチン分解酵素を放出する真菌に対する阻害活性のみを評価してもよいし、双方を評価してもよい。前記被検物質が、前記ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対する阻害活性を有していると評価された場合に、前記被検物質は、花粉症に対する予防又は治療作用を有すると評価することができる。
以上、前記工程（ａ）により、本発明の評価方法を行うことができる。前記評価方法によれば、容易に、かつ効率的に、被検物質が花粉症の予防又は治療作用を有するか否かを評価することができる。
【００１８】
＜工程（ｂ）＞
また、前記スクリーニング方法においては、更に、前記工程（ａ）でペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれか（ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌）に対して阻害活性を有すると評価された物質を選択する（工程（ｂ））。
種々の被検物質を用いて前記工程（ａ）による評価を行い、次いで、本工程（ｂ）において、種々の被検物質の中からペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有すると評価された物質を選択することにより、容易に、かつ効率的に、花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質をスクリーニングすることができる。
【００１９】
前記方法により評価乃至スクリーニングされた、花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質は、例えば、化学合成や、分離精製などの手法により適宜生成することができる。前記物質の使用用途としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、そのまま、花粉症の予防又は治療に使用してもよいし、花粉症用の薬剤開発のための実験などに使用してもよい。また、後述する本発明の製造方法により製造される薬剤や、後述する本発明の薬剤などの有効成分として使用してもよい。
【００２０】
（製造方法）
本発明の製造方法は、花粉症の予防又は治療のための薬剤の製造方法であり、以下の工程（ａ）〜工程（ｄ）を含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００２１】
＜工程（ａ）、工程（ｂ）＞
前記製造方法における工程（ａ）及び工程（ｂ）は、前記した本発明の評価方法及び本発明のスクリーニング方法における工程（ａ）及び工程（ｂ）とそれぞれ同様である。前記工程（ａ）〜（ｂ）により、花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質を、容易に、かつ効率的に選択することができる。
【００２２】
＜工程（ｃ）＞
前記製造方法においては、次いで、前記工程（ａ）〜（ｂ）で選択された、花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質を生成する（工程（ｃ））。
前記生成の手段としては、特に制限はなく、例えば、前記物質の構造や由来などに応じて、化学合成や、分離精製などの公知の生成手段から適宜選択することができる。
【００２３】
＜工程（ｄ）＞
前記製造方法においては、次いで、前記工程（ｃ）で生成された物質を、薬学的に許容され得る担体と混合する（工程（ｄ））。
−薬学的に許容され得る担体−
前記薬学的に許容され得る担体としては、特に制限はなく、例えば、製造する薬剤の所望の剤型等に応じて適宜選択することができる。また、前記剤型としても、特に制限はなく、例えば、後述する本発明の薬剤の項目で列挙される剤型などが挙げられる。
【００２４】
−混合−
前記工程（ｃ）で生成された物質と前記薬学的に許容され得る担体との混合方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記物質に前記薬学的に許容され得る担体を添加してもよいし、前記薬学的に許容され得る担体に前記物質を添加してもよいし、双方を同時に容器内に添加し混合してもよい。また、前記混合方法としては、例えば、公知の薬剤の製造方法における各成分の混合方法から適宜選択することができる。
また、前記混合時の、前記物質と前記薬学的に許容され得る担体との使用量比としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２５】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記工程（ｄ）で得られた混合物を成形する成形工程、などが挙げられる。
【００２６】
以上、前記工程（ａ）〜工程（ｄ）により、本発明の製造方法を行うことができ、これにより、花粉症の予防又は治療のための薬剤を効率的に製造することができる。
前記製造方法により得られた花粉症の予防又は治療のための薬剤の使用形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、後述する本発明の薬剤と同様に使用することができる。
【００２７】
（薬剤）
本発明の薬剤は、花粉症の予防又は治療のための薬剤であって、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれか（ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌）に対して阻害活性を有する物質を有効成分として含有し、更に必要に応じてその他の成分を含有してなる。なお、前記薬剤は、前記した本発明の製造方法により製造された薬剤であってもよい。
【００２８】
−ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有する物質−
前記「ペクチン分解酵素」とは、ペクチンを分解する酵素の総称であり、例えば、一般的に、ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンエステラーゼなどが知られている。後述する実施例１において示されるように、花粉内膜はペクチンから構成されるため、目や鼻に侵入し、形態変化を起こした花粉内膜に前記ペクチン分解酵素が作用すると、花粉内膜は分解され、内容物であるＣｒｙｊ１、Ｃｒｙｊ２タンパク質が放出されて、くしゃみや鼻水などの花粉症のアレルギー症状が引き起こされると考えられる。したがって、前記ペクチン分解酵素に対して阻害活性を有する物質は、花粉症を予防又は治療するための有効成分となり得る。
前記ペクチン分解酵素に対して阻害活性を有する物質としては、前記ペクチン分解酵素の反応速度を低下させ、その働きを阻害することのできる物質であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、システインなどが挙げられる。
【００２９】
また、前記ペクチン分解酵素を放出する真菌としては、例えば、一般的に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓなどが知られている。前記したように、花粉内膜はペクチンから構成されるため、例えば鼻腔粘膜などに前記ペクチン分解酵素を放出する真菌が存在すると、目や鼻に侵入し形態変化を起こした花粉内膜に、前記真菌から放出されたペクチン分解酵素が作用し、花粉内膜が分解され、内容物であるＣｒｙｊ１、Ｃｒｙｊ２タンパク質が放出されて、くしゃみや鼻水などの花粉症のアレルギー症状が引き起こされると考えられる。したがって、前記ペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有する物質は、花粉症を予防又は治療するための有効成分となり得る。
前記ペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有する物質としては、特に制限はなく、例えば、アンホテリシンＢ、フルコナゾール、ミコナゾール、ミカファンギンなどが挙げられる。また、前記ペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有する物質としては、中でも、体内、特に鼻腔粘膜内などに存在し得る前記真菌に対して阻害活性を有する物質であることが好ましい。
【００３０】
なお、前記ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有する物質としては、前記ペクチン分解酵素に対してのみ阻害活性を有する物質であってもよいし、前記ペクチン分解酵素を放出する真菌に対してのみ阻害活性を有する物質であってもよいし、双方に対して阻害活性を有する物質であってもよい。
また、前記ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有する物質としては、例えば、前記した本発明の評価方法、本発明のスクリーニング方法により、花粉症に対する予防又は治療作用を有すると評価乃至スクリーニングされた物質を使用することもできる。
【００３１】
前記薬剤中の、前記ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有する物質（有効成分）の含有量は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、また、前記薬剤は、前記有効成分そのものであってもよい。
また、前記有効成分は、いずれか１種を単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。２種以上を併用する場合の、前記薬剤中の各々の有効成分の含有量比にも、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３２】
−その他の成分−
前記その他の成分としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薬学的に許容され得る担体などが挙げられる。前記担体としても、特に制限はなく、例えば、後述する前記薬剤の剤型等に応じて適宜選択することができる。また、前記薬剤中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて、適宜選択することができる。
【００３３】
−剤型−
前記薬剤の剤型としては、特に制限はなく、例えば、後述するような所望の投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等）、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤などが挙げられる。
【００３４】
前記経口固形剤としては、例えば、前記有効成分に、賦形剤、更には必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。前記結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。前記崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられる。前記滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。前記着色剤としては、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
【００３５】
前記経口液剤としては、例えば、前記有効成分に、矯味・矯臭剤、緩衝剤、安定化剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどが挙げられる。
【００３６】
前記注射剤としては、例えば、前記有効成分に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用等の注射剤を製造することができる。
前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
【００３７】
前記軟膏剤としては、例えば、前記有効成分に、公知の基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等を配合し、常法により混合し、製造することができる。
前記基剤としては、例えば、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィンなどが挙げられる。前記保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピルなどが挙げられる。
【００３８】
前記貼付剤としては、例えば、公知の支持体に前記軟膏剤としてのクリーム剤、ゲル剤、ペースト剤等を、常法により塗布し、製造することができる。前記支持体としては、例えば、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布、軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルム、発泡体シートなどが挙げられる。
【００３９】
−使用−
前記薬剤は、例えば、花粉症の患者に投与することにより使用することができる。
前記薬剤の投与対象動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サルなどが挙げられる。
また、前記薬剤の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記薬剤の剤型等に応じ、適宜選択することができ、経口投与、腹腔内投与、血液中への注射、腸内への注入、軟膏塗布による鼻腔内への投与、スプレーによる鼻腔内への投与などが挙げられる。
また、前記薬剤の投与量としては、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、成人への１日の投与あたり、有効成分の量として、１μｇ〜１ｇが好ましく、１μｇ〜１ｍｇがより好ましい。
また、前記薬剤の投与時期としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、花粉症のアレルギー症状の発症前に予防的に投与されてもよいし、花粉症のアレルギー症状の発症後に治療的に投与されてもよい。
なお、前記薬剤の予防又は治療対象となる花粉症の、原因となる花粉の種類としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、スギ、ヒノキ、スズメノテッポウ、カモガヤ、ブタクサ、ヨモギ等の花粉などが挙げられる。
【００４０】
（花粉症の検査方法）
本発明の花粉症の検査方法（以下、単に「検査方法」と称することがある）は、以下の工程（ａ’）〜工程（ｂ’）を含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
前記花粉症の検査方法により検査することができる事項としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、検査を受ける被検体が花粉症であるか否か、検査を受ける被検体の花粉症の重症度、などが挙げられる。
なお、前記花粉症の検査方法は、被検体から採取した被検試料中の、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかを検出することを特徴とする。
【００４１】
＜工程（ａ’）＞
前記検査方法では、まず、被検体から被検試料を採取する（工程（ａ’））。
−被検体−
前記被検体としては、前記検査の検査対象となり得る生物であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、花粉症の疑いのある患者などが挙げられる。なお、前記被検体の生物種としても特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
−被検試料−
前記被検試料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、前記被検体の、鼻水、涙、鼻腔粘膜組織などが好適に挙げられる。
前記被検体から前記被検試料を採取する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記被検体から採取された前記被検試料は、例えば、そのまま後述する工程（ｂ’）に供されてもよいし、洗浄、保存などの操作が行われた後に、工程（ｂ’）に供されてもよい。
【００４２】
＜工程（ｂ’）＞
前記検査方法では、次いで、前記工程（ａ’）で採取した被検試料について、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれか（ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌）を検出する（工程（ｂ’））。
【００４３】
−ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌の検出−
ここで、前記「ペクチン分解酵素」、及び、前記「ペクチン分解酵素を放出する真菌」としては、前記した本発明の評価方法、本発明のスクリーニング方法の項目と同様である。
前記「ペクチン分解酵素」を検出する方法としては、前記被検試料中のペクチン分解酵素の、酵素量、乃至、酵素活性を測定できる方法であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ペクチン分解酵素と前記ペクチン分解酵素に対する抗体との抗原抗体反応を利用した測定方法、前記ペクチン分解酵素と前記ペクチン分解酵素の基質（ペクチン）との反応を利用した測定方法などが挙げられる。
また、前記「ペクチン分解酵素を放出する真菌」を検出する方法としては、前記被検試料中のペクチン分解酵素を放出する真菌の、真菌量、乃至、真菌活性を測定できる方法であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記真菌と前記真菌に対する抗体との抗原抗体反応を利用した測定方法、前記真菌を分離・培養しコロニー数を調べる測定方法などが挙げられる。
【００４４】
なお、前記工程（ｂ’）では、前記被検試料について、前記ペクチン分解酵素のみを検出してもよいし、前記ペクチン分解酵素を放出する真菌のみを検出してもよいし、双方を検出してもよい。
【００４５】
前記花粉症の検査方法では、前記工程（ｂ’）の検出結果に基づき、例えば、前記被検体が花粉症であるか否か、前記被検体の花粉症の重症度、などを判断することができる。
前記判断方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記工程（ａ’）と並行して、花粉症の疑いの無い健常者からの対照試料を準備し、この対照試料と比較して、前記工程（ａ’）の被検体から得られた被検試料では、前記ペクチン分解酵素及び／又は前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の、量が多い、乃至は、活性が高いときに、前記被検試料を採取した被検体は、花粉症であると判断することができる。また、前記ペクチン分解酵素及び／又は前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の、量の多さの程度、乃至は、活性の高さの程度に応じて、前記被検体の花粉症の重症度を判断することができる。
【００４６】
前記花粉症の検査方法は、例えば、花粉症の疑いのある患者が花粉症であるか否か、また、花粉症患者の花粉症の重症度、などを診断するために使用することができる。また、前記花粉症の検査方法は、花粉症の患者に対する好適な薬剤を選択するためにも有用である。前記花粉症の検査により、花粉症であると判断された患者の予防又は治療には、ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌の活性を抑制することが有効であると考えられ、即ち、前記したような、ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有する物質を有効成分とする本発明の薬剤が好適であると判断することができる。
【００４７】
（花粉症の検査用薬剤）
本発明の花粉症の検査用薬剤（以下、単に「検査用薬剤」と称することがある）は、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれか（ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌）に対する抗体を含み、必要に応じてその他の成分を含んでなる。
【００４８】
−ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対する抗体−
ここで、前記「ペクチン分解酵素」、及び、前記「ペクチン分解酵素を放出する真菌」としては、前記した本発明の評価方法、本発明のスクリーニング方法の項目と同様である。
前記「ペクチン分解酵素」に対する抗体としては、前記ペクチン分解酵素を認識可能な抗体であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ペクチン分解酵素の全体又は一部を抗原として用い、公知の手法により、目的に応じて適宜作製することができる。
前記「ペクチン分解酵素を放出する真菌」に対する抗体としても、前記ペクチン分解酵素を放出する真菌を認識可能な抗体であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の全体又は一部、例えば膜タンパク質などを抗原として用い、公知の手法により、目的に応じて適宜作製することができる。
また、前記抗体はポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。また、前記抗体は、標識されていてもよい。また、前記抗体としては、市販品を使用することもできる。
【００４９】
なお、前記抗体が、ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有する場合、このような抗体は、前記した本発明の薬剤の有効成分としても使用することができる。
【００５０】
前記検査用薬剤中の前記抗体の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、また、前記検査用薬剤は、前記抗体そのものであってもよい。
また、前記抗体は１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。２種以上を併用する場合の、前記検査用薬剤中の各々の抗体の含有量比としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５１】
−その他の成分−
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記抗体を保存するための保存液などが挙げられる。
前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５２】
前記検査用薬剤の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記抗体と前記その他の成分とを混合することにより製造することができる。
【００５３】
前記花粉症の検査用薬剤は、例えば、前記した本発明の花粉症の検査方法に好適に利用可能である。例えば、花粉症の疑いのある患者から採取した被検試料に、前記検査用薬剤を加え、適宜公知の手法により、前記被検試料における抗原抗体反応を検出することにより、前記患者が花粉症であるか否か、また、その花粉症の重症度を判断することができる。
また、前記花粉症の検査用薬剤は、例えば、前記抗原抗体反応を検出するための検出用薬剤などと組合せ、花粉症の検査用キットとして使用されてもよい。
【００５４】
［効果］
本発明の評価方法及びスクリーニング方法によれば、ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対する阻害活性を指標として、容易に、かつ効率的に、花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質を評価乃至スクリーニングすることができる。また、本発明の製造方法によれば、前記評価乃至スクリーニングされた花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質を有効成分とする、花粉症の予防又は治療のための薬剤を効率的に製造することができる。したがって、前記評価方法、スクリーニング方法、及び製造方法は、新たな花粉症用の薬剤の開発に非常に有用である。
また、本発明の薬剤は、ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有する物質を有効成分として含むので、例えば鼻腔粘膜などに存在する真菌が放出するペクチン分解酵素による花粉内膜の分解を抑制することができ、そのため、スギ花粉の内容物である抗原の放出を抑制し、くしゃみや鼻水などの花粉症のアレルギー症状を抑制することができる。したがって、前記薬剤は、花粉症の予防又は治療に非常に有用である。
また、本発明の花粉症の検査方法及び検査用薬剤によれば、被検体から採取した被検試料中のペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌を検出することにより、前記被検体が花粉症であるか否か、前記被検体の花粉症の重症度、などを検査することができる。したがって、前記花粉症の検査方法及び検査用薬剤は、花粉症の診断に非常に有用である。
【実施例】
【００５５】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００５６】
（実施例１：ペクチン分解酵素に対するスギ花粉内膜の感受性）
従来から、鼻水等のアルカリ性条件下で花粉が形態変化を起こすという現象は、当該技術分野において知られており、この形態変化は、花粉の外膜（細胞壁）が割れ、内膜（細胞膜）に覆われた原形質が現れることから、花粉の「破壊」、「破裂」等とも呼ばれている。目や鼻に侵入し、形態変化を起こした花粉は、現れた内膜（細胞膜）が更に分解されることにより、内容物、即ち花粉のアレルゲンであるとされる抗原、Ｃｒｙｊ１、Ｃｒｙｊ２タンパク質を放出し、くしゃみや鼻水などの花粉症のアレルギー症状を引き起こすと考えられている。
本実施例１では、スギ花粉が前記したような形態変化を起こすことにより現れるスギ花粉内膜の、ペクチン分解酵素に対する感受性を検討した。
【００５７】
５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８、弱アルカリ性）中で形態変化を起こさせたスギ花粉（０．１ｇ／２ｍｌ）懸濁液に、希塩酸を加えてｐＨ５とし、アスペルギウス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のペクチン分解酵素（シグマ社から購入）２８ユニットを加えた。３７℃で１時間インキュベーションした後、スギ花粉の形態を位相差顕微鏡により観察した。結果を図１に示す。
【００５８】
図１の結果から、ペクチン分解酵素を加えなかった場合（コントロール）には、スギ花粉内膜は形態を保持していた（図１、上段）のに対し、ペクチン分解酵素を加えた場合には、多くのスギ花粉内膜が消失した（図１、下段）ことがわかる。
この結果から、スギ花粉内膜は、ペクチンから構成される膜であり、ペクチン分解酵素により分解されることが示された。目や鼻に侵入し、形態変化を起こしたスギ花粉は、このようなペクチン分解酵素の作用により内膜が分解され、内容物、即ちスギ花粉の抗原、Ｃｒｙｊ１、Ｃｒｙｊ２タンパク質を放出し、花粉症の症状を引き起こしているものと考えられる。
【００５９】
（実施例２：スギ花粉保存液からの真菌の分離）
−スギ花粉含有寒天培地の作製−
スギ花粉５ｇを、５０ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４を含む水溶液（ｐＨ９、弱アルカリ性）５０ｍｌに懸濁して形態変化を引き起こさせた。一方、寒天３ｇ、及び馬鈴薯澱粉１０ｇを含む水１５０ｍｌをオートクレーブ処理（１２１℃、２０分）後、５５℃に冷却した。前記スギ花粉液及び前記寒天液を、均一になるまで混合した後、２５ｍｌを直径１０ｃｍの滅菌したシャーレに流し込み、室温にて冷却させ、固化させてスギ花粉含有寒天培地を作製した。
【００６０】
−スギ花粉保存液からの真菌の分離−
スギ花粉１２．４ｇを、４８０ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．２）水溶液中に懸濁し、超音波処理後、５０ｍｌの遠心管に分注して、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を除いた後、室温にて１ヶ月間保存したところ、表面に赤色及び緑色のカビが現れた。このスギ花粉保存液に生じた緑色及び赤色のカビは、前記スギ花粉含有寒天培地上で増殖し、コロニーを形成した。
【００６１】
−青カビ上清によるスギ花粉内膜の分解−
前記スギ花粉含有寒天培地上でコロニーを形成した緑色のカビ（青カビ）をサブロー液体培地で培養し、遠心（８，０００ｒｐｍ、５分）して上清を得た。この青カビの培養上清に、リン酸２カリウム水溶液（ｐＨ９、弱アルカリ性）中で形態変化を起こしたスギ花粉を懸濁し、３７℃にて２６時間インキュベーションし、位相差顕微鏡下で観察した。結果を図２に示す。
【００６２】
図２の結果から、サブロー液体培地に懸濁した場合（コントロール）には、スギ花粉内膜は形態を保持していた（図２、上段）のに対し、青カビの培養上清とインキュベーションした場合には、スギ花粉内膜は消失した（図２、下段）ことがわかる。
この結果から、前記スギ花粉含有寒天培地上で分離された青カビは、スギ花粉内膜を分解する作用を有することが示された。この青カビが、ペクチン分解酵素を培地中に放出し、そのペクチン分解酵素が、スギ花粉内膜を分解したものと考えられる。
【００６３】
（実施例３：ヒト鼻腔からの真菌の分離）
−スギ花粉含有寒天培地の作製−
前記実施例２と同様にして、スギ花粉含有寒天培地を作製した。
【００６４】
−ヒト鼻腔からの真菌の分離−
ちり紙の代わりに包装用ラップを用いて鼻をかみ、ヒト鼻腔サンプルを採取した（被検体：花粉症患者）。前記スギ花粉含有寒天培地に前記ヒト鼻腔サンプルを塗布し、３０℃にて３日間培養した。
【００６５】
結果、前記スギ花粉含有寒天培地上に、多数の真菌と思われる色調の薄いコロニーが現れた。また、このコロニーは、別のスギ花粉を含む寒天培地上に塗布して、更に培養できることが確認できた。
用いたスギ花粉含有寒天培地には、ペクチン膜からなる内膜で覆われたスギ花粉以外には窒素源を供給する物質は含まれていないことから、出現したコロニーは、スギ花粉の内膜を破壊し、内部の窒素源を利用して生育したものと考えられる。したがって、この結果から、ヒト（例えば、花粉症患者）の鼻腔内には、ペクチン分解酵素を放出し、ペクチン膜からなるスギ花粉の内膜を破壊する真菌が存在している可能性が示唆された。
【００６６】
前記実施例１〜３の結果から、ペクチン分解酵素によるスギ花粉内膜の分解が花粉症のアレルギー症状を引き起こす一因であること、更には、ペクチン分解酵素を放出する真菌の存在が花粉症のアレルギー症状を引き起こす一因であることが示唆された。
前記したようなペクチン分解酵素を放出する真菌は、例えば花粉症患者の鼻腔粘膜などに存在していることが考えられる。即ち、目や鼻に侵入し、鼻水等のアルカリ性条件下で形態変化を起こした花粉の内膜は、鼻腔粘膜などに存在する真菌が放出するペクチン分解酵素により分解され、内容物、即ちスギ花粉のアレルゲンであるとされる抗原、Ｃｒｙｊ１、Ｃｒｙｊ２タンパク質を放出して、花粉症のアレルギー症状を引き起こすというメカニズムが考えられる。
したがって、ペクチン分解酵素の働きを阻害し得る物質を作用させることにより、また、前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の働きを阻害し得る物質を作用させることにより、花粉症のアレルギー症状は効果的に抑制できるものと考えられる。
以上のことから、ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対する阻害活性を指標として、花粉症の予防又は治療作用を有する物質を、容易、かつ効率的に評価乃至スクリーニングできること、並びに、前記評価乃至スクリーニングされた物質を有効成分として、花粉症の予防又は治療のための薬剤を効率的に製造できることが示された。また、ペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌に対して阻害活性を有する物質を有効成分として含む薬剤が、花粉症の予防又は治療に効果的であることが示された。また、被検体から採取した被検試料中のペクチン分解酵素及び／又はペクチン分解酵素を放出する真菌を検出することにより、花粉症の検査を行うことができることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明の評価方法、本発明のスクリーニング方法、及び本発明の製造方法は、新たな花粉症用の薬剤の開発に非常に有用であり、また、本発明の薬剤は、花粉症の予防又は治療に非常に有用である。また、本発明の花粉症の検査方法及び検査用薬剤は、花粉症の診断に非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、ペクチン分解酵素によりスギ花粉内膜が分解されたことを示す図である。
【図２】図２は、スギ花粉含有寒天培地で分離された青カビ培養上清によりスギ花粉内膜が分解されたことを示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質が、花粉症に対する予防又は治療作用を有するか否かを評価する方法であって、
（ａ）前記被検物質が、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有するか否かを評価する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被検物質が、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有するか否かを評価する工程、並びに、
（ｂ）前記工程（ａ）で前記ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有すると評価された物質を選択する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
花粉症の予防又は治療のための薬剤の製造方法であって、
（ａ）被検物質が、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有するか否かを評価する工程、
（ｂ）前記工程（ａ）で前記ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有すると評価された物質を選択する工程、
（ｃ）前記工程（ｂ）で選択された物質を生成する工程、並びに、
（ｄ）前記工程（ｃ）で生成された物質と、薬学的に許容され得る担体とを混合する工程
を含むことを特徴とする製造方法。
【請求項４】
花粉症の予防又は治療のための薬剤であって、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有する物質を有効成分とすることを特徴とする薬剤。
【請求項５】
（ａ’）被検体から被検試料を採取する工程、並びに、
（ｂ’）前記工程（ａ’）で採取した被検試料について、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかを検出する工程
を含むことを特徴とする花粉症の検査方法。
【請求項６】
ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対する抗体を含むことを特徴とする花粉症の検査用薬剤。
【請求項１】
被検物質が、花粉症に対する予防又は治療作用を有するか否かを評価する方法であって、
（ａ）前記被検物質が、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有するか否かを評価する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
花粉症に対する予防又は治療作用を有する物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被検物質が、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有するか否かを評価する工程、並びに、
（ｂ）前記工程（ａ）で前記ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有すると評価された物質を選択する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
花粉症の予防又は治療のための薬剤の製造方法であって、
（ａ）被検物質が、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有するか否かを評価する工程、
（ｂ）前記工程（ａ）で前記ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有すると評価された物質を選択する工程、
（ｃ）前記工程（ｂ）で選択された物質を生成する工程、並びに、
（ｄ）前記工程（ｃ）で生成された物質と、薬学的に許容され得る担体とを混合する工程
を含むことを特徴とする製造方法。
【請求項４】
花粉症の予防又は治療のための薬剤であって、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対して阻害活性を有する物質を有効成分とすることを特徴とする薬剤。
【請求項５】
（ａ’）被検体から被検試料を採取する工程、並びに、
（ｂ’）前記工程（ａ’）で採取した被検試料について、ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかを検出する工程
を含むことを特徴とする花粉症の検査方法。
【請求項６】
ペクチン分解酵素及び前記ペクチン分解酵素を放出する真菌の少なくともいずれかに対する抗体を含むことを特徴とする花粉症の検査用薬剤。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００８−１２５４３８（Ｐ２００８−１２５４３８Ａ）
【公開日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３１４２５４（Ｐ２００６−３１４２５４）
【出願日】平成１８年１１月２１日（２００６．１１．２１）
【出願人】（５０１４８１４９２）株式会社ゲノム創薬研究所 (25)
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月２１日（２００６．１１．２１）
【出願人】（５０１４８１４９２）株式会社ゲノム創薬研究所 (25)
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
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