菌体触媒の保存方法
【課題】 ニトリラーゼ活性を有する微生物菌体を培養液から回収した後、凍結や添加物を新たに加えることなしに、使用時まで安定に保存できる、簡便で工業的に有利な微生物菌体触媒の保存方法を提供すること。
【解決の手段】 ニトリラーゼ活性を有する微生物菌体を、ブリックス（Ｂｒｉｘ）値で０．３〜３．０％の範囲で選択される濃度の前記微生物の培養液成分を含む水性媒体に懸濁した状態で、保存温度５〜２５℃で保存する。ブリックス値で０．３〜３．０％の範囲で選択される濃度の微生物の培養液成分は、例えばニトリラーゼ活性を有する微生物の培養液を遠心分離して得られる菌体沈殿物に含まれる培養液成分を脱イオン水を用いて希釈することにより調製することができる。
【解決の手段】 ニトリラーゼ活性を有する微生物菌体を、ブリックス（Ｂｒｉｘ）値で０．３〜３．０％の範囲で選択される濃度の前記微生物の培養液成分を含む水性媒体に懸濁した状態で、保存温度５〜２５℃で保存する。ブリックス値で０．３〜３．０％の範囲で選択される濃度の微生物の培養液成分は、例えばニトリラーゼ活性を有する微生物の培養液を遠心分離して得られる菌体沈殿物に含まれる培養液成分を脱イオン水を用いて希釈することにより調製することができる。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ニトリラーゼ活性を有する微生物菌体を培養した後、かかる微生物菌体を水性媒体に懸濁した状態でそのニトリラーゼ活性を維持したまま、簡便に長期間保存することができる微生物菌体触媒の保存方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】微生物菌体を触媒として用いる物質生産においては、培養して得られた菌体又はその固定化物を使用時まで安定に保存しておく必要がある。すなわち、微生物菌体の触媒能を低下させることなく、溶菌を生じさせることなく、また雑菌の繁殖がないように保存する必要がある。そのため、従来、菌体培養物から培地成分を除き、凍結保存や緩衝液等に懸濁した状態で冷蔵保存する方法や、あるいは保存剤を添加して保存する方法（特開平７−１１１８８７号公報）が知られている。また、特にニトリラーゼ等の活性を有する菌体の保存方法に関しては、１００ｍＭ乃至飽和濃度の無機塩類水溶液中で保存する方法（特開平８−１１２０８９号公報）が知られている。さらに、保存液に防菌又は防黴効果のある薬剤が添加されることも知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】これまでに知られている微生物菌体の保存方法のうち、菌体を凍結保存する方法は、工業的に多量の菌体を保存する場合に冷却コストの面で負担が大きく、また凍結、融解操作により菌体触媒能の低下を招く可能性が大きいという問題があり、また、無機塩類、保存剤、あるいは薬剤を添加して保存する方法は、生産物質あるいは目的製品へこれら添加物が混入するのを防ぐために、使用前にそれらの添加物の除去工程が必要となり、操作が煩雑になるとともに、洗浄液等の廃液が多量に発生するという問題も生ずる。本発明の課題は、ニトリラーゼ活性を有する微生物菌体を培養液から回収した後、凍結や添加物を新たに加えることなしに、使用時まで安定に保存できる、簡便で工業的に有利な微生物菌体触媒の保存方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究した結果、培養液成分を一部残存させた低濃度の培養液成分を含む水性媒体に、培養後の微生物菌体触媒を懸濁した状態で保存するという簡便かつ実用的な方法により、微生物菌体触媒がその触媒活性を維持したまま長期間安定に保存することができることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】すなわち本発明は、ニトリラーゼ活性を有する微生物菌体を、ブリックス（Ｂｒｉｘ）値で０．３〜３．０％の範囲で選択される濃度の前記微生物の培養液成分を含む水性媒体に懸濁した状態で保存することを特徴とする微生物菌体触媒の保存方法(請求項１)や、保存温度５〜２５℃で保存することを特徴とする請求項１記載の微生物菌体触媒の保存方法（請求項２）や、ニトリラーゼ活性を有する微生物の培養液から分離して得られる菌体濃縮物に含まれる培養液成分を脱イオン水を用いて希釈し、ブリックス（Ｂｒｉｘ）値で０．３〜３．０％の範囲で選択される濃度の微生物の培養液成分を調製することを特徴とする請求項１又は２記載の微生物菌体触媒の保存方法（請求項３）に関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明におけるニトリラーゼ活性を有する微生物としては、ニトリラーゼ産生能を有する微生物であれば特に限定されるものでなく、例えば、アースロバクター（Arthrobacter）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、ゴルドナ（Gordona）属等の微生物やニトリラーゼ遺伝子が導入された遺伝子組換え微生物等を挙げることができるが、好ましい微生物として、アースロバクター エスピー（sp.）ＮＳＳＣ１０４株（ＦＥＲＭ Ｐ−１５４２４）を具体的に挙げることができる。アースロバクター エスピー ＮＳＳＣ１０４株は公知の菌株であり、その菌学的性質はＷＯ９７３２０３０号公報に記載されている。また、かかる微生物菌体として固定化微生物をも使用することができる。
【０００７】本発明においてニトリラーゼ活性を有する微生物の培養液としては、ニトリラーゼ活性を有する微生物の培養に用いることができる液体培地であればどのようなものでもよいが、ニトリラーゼ酵素の誘導物質、微生物が資化しうる炭素源、窒素源、無機イオン、さらに必要ならば有機栄養源等の通常の培地成分を含む培養液を挙げることができ、前記微生物の培養液成分としては、ベンゾニトリル、イソブチロニトリル、サクシノニトリル等のニトリル化合物、ε−カプロラクタム、イソブチルアミド、プロピオンアミド等のアミド化合物などの酵素誘導物質や、マルトース、グルコース、フラクトース、ショ糖等の炭水化物、エタノール等のアルコール類、有機酸などの炭素源や、酵母エキス、アミノ酸、ペプトン、硝酸塩、アンモニウム塩などの窒素源や、リン酸イオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、硫酸イオン、鉄イオンなどの無機イオンや、ビタミン、アミノ酸及びこれらを含有するコーンスチープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ポリペプトンなどの有機栄養源を具体的に例示することができる。
【０００８】また、上記ニトリラーゼ活性を有する微生物の培養液を用いた微生物菌体の培養は、例えば、該培養液のｐＨが６〜１０の範囲、培養の温度が２５〜３７℃の範囲で、１〜７日間好気的に行い、活性が最大となるまで行う方法を例示することができる。
【０００９】本発明における水性媒体は、ブリックス（Ｂｒｉｘ）値で０．３〜３．０％の範囲で選択される濃度の前記培養液成分を含むものであり、水性媒体中の培養液成分の濃度は、培養液が種々の成分から構成されていることからブリックス値で表示されている。ここで、ブリックス値とは、ブリックス計 ＲＡ−４１０（京都電子工業株式会社製）で測定し、２０℃における値に換算した値である。
【００１０】本発明の微生物菌体触媒の保存方法は、上記水性媒体に懸濁した状態でニトリラーゼ活性を有する微生物菌体を保存することを特徴とする。そして、ブリックス値で０．３〜３．０％の範囲で選択される濃度の培養液成分を含む水性媒体に懸濁した状態のニトリラーゼ活性を有する微生物菌体の調製方法としては、以下の方法を具体的に挙げることができる。■ニトリラーゼ活性を有する微生物の培養後、培養液に水を直接添加して培養液を希釈し、所定のブリックス値濃度の培養液成分を含む水性媒体とする保存用微生物菌体懸濁液の調製方法で、この直接希釈調製方法の場合、例えば水として塩酸水溶液を用いてｐＨを中性付近に調整することが好ましい。■ニトリラーゼ活性を有する微生物の培養後、例えば遠心分離機や膜分離装置等を使用することにより微生物菌体を分離回収或いは濃縮し、分離回収された菌体沈殿物或いは濃縮された菌体スラリー等の菌体濃縮物に水を添加して培養液成分を希釈し、さらに必要に応じて水で微生物菌体を洗浄し、所定のブリックス値濃度の培養液成分を含む水性媒体とする保存用微生物菌体懸濁液の調製方法で、この方法の場合水として脱イオン水（イオン交換水）を用いることが好ましい。なお、ブリックス値濃度は、いずれの方法においても微生物菌体懸濁液の上清で測定する。
【００１１】上記調製された保存用微生物菌体懸濁液を、０〜３５℃、好ましくは５〜２５℃、特に好ましくは１０℃で静置、振とう、或いは撹拌しながら保存することにより、微生物菌体触媒をニトリラーゼ活性を有効に維持することができる。また、水性媒体に懸濁した状態のニトリラーゼ活性を有する微生物菌体の保存時の菌体濃度には特に制限はないが、湿菌体で通常１〜８０重量％の範囲とすることが好ましい。
【００１２】本発明の微生物菌体触媒の保存方法により保存された微生物菌体を触媒として物質生産に使用する場合は、これらの微生物菌体懸濁液又は固定化微生物菌体を直接或いは希釈して反応液中に投入するか、もしくは必要に応じてこれらをさらに水又は緩衝液で洗浄して投入してもよい。
【００１３】
【実施例】以下、実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
実施例１（前培養）前培養用培地として、０．５重量％グルコース、０．５重量％酵母エキス、０．５重量％ε−カプロラクタム、０．１重量％リン酸二カリウム、０．１重量％リン酸一カリウム、０．０２重量％硫酸マグネシウム七水和物，０．１重量％塩化ナトリウム、０．００１重量％硫酸第一鉄七水和物を含み、１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ７．２に調整した培地２００ｍｌを３リットル容三角フラスコに入れ、１２１℃で２０分間滅菌した（硫酸第一鉄のみは別にろ過滅菌して加えた）ものを用い、この培地にアースロバクター エスピー ＮＳＳＣ１０４株を接種し、３３℃で３日間振盪培養して前培養を行った。
【００１４】（本培養）本培養用培地として、１０．０重量％コーンスチープリカー抽出液、２．０重量％ショ糖、０．５重量％ε−カプロラクタムからなる培地６．０リットルを１０リットル容ジャーファメンターに用意した。コーンスチープリカー抽出液はろ過滅菌し、他の培地成分は１１０℃で２０分間滅菌して用いた。この培地に前培養液６０ｍｌを植菌して、３３℃で４日間通気撹拌培養した。ここでコーンスチープリカー抽出液とは、コーンスチープリカー４０重量％を含み、１０Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ７．０に調整した溶液から不溶物を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分間）によって除いた上清液である（以下同じ）。
【００１５】（微生物菌体の保存）本培養終了後、この培養液に５Ｎ塩酸溶液を加えてｐＨ７に調整したものを保存用菌体懸濁液として、４０ｍｌずつ３本のファルコン社製コニカルチューブに小分けし、５℃、１０℃、２０℃に静置保存した。この場合の湿菌体濃度は、４．８％で、上清のブリックス値は１．７０％であった。保存３０日後に菌体懸濁液の一部を取り出してニトリラーゼの残存活性を測定した。
【００１６】（ニトリラーゼ活性の測定）上記の微生物菌体懸濁液１０ｍｌを遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１０分間、５℃）して得られた菌体に１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を加えて１０ｍｌ懸濁液とし、この菌体懸濁液０．２ｍｌにクロトノニトリル １２３μｍｏｌを含む同緩衝液０．３ｍｌを添加して、３５℃で３０分間反応を行った。反応後、直ちに遠心分離（１６，０００ｒｐｍ、５分、室温）で菌体を除き、反応液中に生成したクロトン酸を高速液体クロマトグラフィーにて定量した。１分間に１μｍｏｌのクロトン酸を生成する活性を１単位（Ｕ）とした。
【００１７】（ニトリラーゼの残存活性）保存用菌体懸濁液の調製時、即ち保存０日目の菌体懸濁液１ｍｌの活性を１００としたときの相対活性値を表１に示す。
【００１８】
【表１】
【００１９】実施例２（微生物菌体の培養及び保存）実施例１と同様にして、前培養、本培養を行った。培養終了後、この培養液から遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分間、５℃）により湿菌体沈殿物を集め、この湿菌体沈殿物と同量の脱イオン水に懸濁して５０重量％湿菌体懸濁液を調製した。この菌体懸濁液を１０ｍｌずつ３本のファルコン社製コニカルチューブに小分けし、５℃、１０℃、２５℃に静置保存した。この場合の上清のブリックス値は０．７３％であった。保存３２日後に菌体懸濁液の一部を取り出してニトリラーゼの残存活性を測定した。
【００２０】（ニトリラーゼ活性の測定）上記の菌体懸濁液を１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で１０倍に希釈し、その希釈液０．２ｍｌにクロトノニトリル １２３μｍｏｌを含む同緩衝液０．３ｍｌを添加して、３５℃で３０分間反応を行った。反応後、直ちに遠心分離（１６，０００ｒｐｍ、５分、室温）で菌体を除き、反応液中に生成したクロトン酸を高速液体クロマトグラフィーにて定量した。１分間に１μｍｏｌのクロトン酸を生成する活性を１単位（Ｕ）とした。
【００２１】（ニトリラーゼの残存活性）保存０日目の菌体懸濁液１ｍｌの活性を１００としたときの相対活性値を表２に示す。
【００２２】
【表２】
【００２３】実施例３（微生物菌体の培養）実施例１と同様にして、前培養を行った。本培養用培地として、５．３重量％コーンスチープリカー抽出液、０．４重量％ラクトアミノサンＳＬ（コスモ食品株式会社製）、０．４重量％グルコース、０．５重量％ε−カプロラクタムからなる培地２．８５リットルを１０リットル容ジャーファメンターに用意した。コーンスチープリカー抽出液とラクトアミノサンＳＬ溶液はろ過滅菌し、他の培地成分は１１０℃で２０分間滅菌して用いた。この培地に前培養液６０ｍｌを植菌して、３３℃で通気撹拌培養した。培養開始後、グルコース濃度が０．１〜０．２重量％になるように、同様に調製した６１．５重量％コーンスチープリカー抽出液、５．０重量％ラクトアミノサンＳＬ、４．９重量％グルコース、０．７重量％ε−カプロラクタムからなる追加培地２．１９リットルを流加した。続いて同様に調製した５０重量％グルコース水溶液９６０ｍｌを培養液中のグルコース濃度が０．１〜０．２重量％になるように流加した。流加中は、培養液中の溶存酸素が２０〜４０％になるように酸素混合ガスを通気した。流加終了後、引き続き３３℃で通気撹拌培養を４日間行った。
【００２４】（微生物菌体の保存）この培養液から遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分間、５℃）により菌体を集め、脱イオン水で希釈を繰り返し、培養液成分の濃度の異なる４０％湿菌体懸濁液を各８０ｍｌ調製し、それぞれ１０℃で静置保存した。保存２８日後に菌体懸濁液の一部を取り出してニトリラーゼの残存活性を実施例２と同様にして測定した。
【００２５】（ニトリラーゼの残存活性）保存０日目の菌体懸濁液上清のブリックス値と菌体懸濁液１ｍｌの活性を１００とした時の相対活性値を表３に示す。
【００２６】
【表３】
【００２７】実施例４（微生物菌体の培養と保存）実施例３におけるラクトアミノサンＳＬの代わりにアミノサンパウダーＳＬ（コスモ食品株式会社製）を用いる他は、実施例３と同様に培養を行った。培養後の微生物菌体は中空糸膜モジュール（０．０５μｍ、３，９００cm2）を用いて濃縮後、上清のブリックス値が０．８０になるように脱イオン水で洗浄を繰り返して、３５％湿菌体懸濁液を調製した。それを１０℃で静置保存し、経時的に菌体懸濁液の一部を取り出してニトリラーゼの残存活性を実施例２と同様にして測定した。
【００２８】（ニトリラーゼの残存活性）保存０日目の菌体懸濁液１ｍｌの活性を１００とした時の相対活性値を表４に示す。
【００２９】
【表４】
【００３０】
【発明の効果】本発明の微生物菌体触媒の保存方法によれば、ニトリラーゼ活性を有する多量の菌体を凍結や安定剤を添加することなしに使用時まで長期間安定に保存することが可能となり、凍結保存のための冷却コスト削減や安定剤の除去・洗浄工程及び多量の洗浄廃液の大幅な軽減が期待できる。また、本発明の微生物菌体触媒の保存方法は簡便かつ実用的であることから、ニトリラーゼ活性を有する微生物菌体を工業的に有利に保存することができる。
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ニトリラーゼ活性を有する微生物菌体を培養した後、かかる微生物菌体を水性媒体に懸濁した状態でそのニトリラーゼ活性を維持したまま、簡便に長期間保存することができる微生物菌体触媒の保存方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】微生物菌体を触媒として用いる物質生産においては、培養して得られた菌体又はその固定化物を使用時まで安定に保存しておく必要がある。すなわち、微生物菌体の触媒能を低下させることなく、溶菌を生じさせることなく、また雑菌の繁殖がないように保存する必要がある。そのため、従来、菌体培養物から培地成分を除き、凍結保存や緩衝液等に懸濁した状態で冷蔵保存する方法や、あるいは保存剤を添加して保存する方法（特開平７−１１１８８７号公報）が知られている。また、特にニトリラーゼ等の活性を有する菌体の保存方法に関しては、１００ｍＭ乃至飽和濃度の無機塩類水溶液中で保存する方法（特開平８−１１２０８９号公報）が知られている。さらに、保存液に防菌又は防黴効果のある薬剤が添加されることも知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】これまでに知られている微生物菌体の保存方法のうち、菌体を凍結保存する方法は、工業的に多量の菌体を保存する場合に冷却コストの面で負担が大きく、また凍結、融解操作により菌体触媒能の低下を招く可能性が大きいという問題があり、また、無機塩類、保存剤、あるいは薬剤を添加して保存する方法は、生産物質あるいは目的製品へこれら添加物が混入するのを防ぐために、使用前にそれらの添加物の除去工程が必要となり、操作が煩雑になるとともに、洗浄液等の廃液が多量に発生するという問題も生ずる。本発明の課題は、ニトリラーゼ活性を有する微生物菌体を培養液から回収した後、凍結や添加物を新たに加えることなしに、使用時まで安定に保存できる、簡便で工業的に有利な微生物菌体触媒の保存方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究した結果、培養液成分を一部残存させた低濃度の培養液成分を含む水性媒体に、培養後の微生物菌体触媒を懸濁した状態で保存するという簡便かつ実用的な方法により、微生物菌体触媒がその触媒活性を維持したまま長期間安定に保存することができることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】すなわち本発明は、ニトリラーゼ活性を有する微生物菌体を、ブリックス（Ｂｒｉｘ）値で０．３〜３．０％の範囲で選択される濃度の前記微生物の培養液成分を含む水性媒体に懸濁した状態で保存することを特徴とする微生物菌体触媒の保存方法(請求項１)や、保存温度５〜２５℃で保存することを特徴とする請求項１記載の微生物菌体触媒の保存方法（請求項２）や、ニトリラーゼ活性を有する微生物の培養液から分離して得られる菌体濃縮物に含まれる培養液成分を脱イオン水を用いて希釈し、ブリックス（Ｂｒｉｘ）値で０．３〜３．０％の範囲で選択される濃度の微生物の培養液成分を調製することを特徴とする請求項１又は２記載の微生物菌体触媒の保存方法（請求項３）に関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明におけるニトリラーゼ活性を有する微生物としては、ニトリラーゼ産生能を有する微生物であれば特に限定されるものでなく、例えば、アースロバクター（Arthrobacter）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、ゴルドナ（Gordona）属等の微生物やニトリラーゼ遺伝子が導入された遺伝子組換え微生物等を挙げることができるが、好ましい微生物として、アースロバクター エスピー（sp.）ＮＳＳＣ１０４株（ＦＥＲＭ Ｐ−１５４２４）を具体的に挙げることができる。アースロバクター エスピー ＮＳＳＣ１０４株は公知の菌株であり、その菌学的性質はＷＯ９７３２０３０号公報に記載されている。また、かかる微生物菌体として固定化微生物をも使用することができる。
【０００７】本発明においてニトリラーゼ活性を有する微生物の培養液としては、ニトリラーゼ活性を有する微生物の培養に用いることができる液体培地であればどのようなものでもよいが、ニトリラーゼ酵素の誘導物質、微生物が資化しうる炭素源、窒素源、無機イオン、さらに必要ならば有機栄養源等の通常の培地成分を含む培養液を挙げることができ、前記微生物の培養液成分としては、ベンゾニトリル、イソブチロニトリル、サクシノニトリル等のニトリル化合物、ε−カプロラクタム、イソブチルアミド、プロピオンアミド等のアミド化合物などの酵素誘導物質や、マルトース、グルコース、フラクトース、ショ糖等の炭水化物、エタノール等のアルコール類、有機酸などの炭素源や、酵母エキス、アミノ酸、ペプトン、硝酸塩、アンモニウム塩などの窒素源や、リン酸イオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、硫酸イオン、鉄イオンなどの無機イオンや、ビタミン、アミノ酸及びこれらを含有するコーンスチープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ポリペプトンなどの有機栄養源を具体的に例示することができる。
【０００８】また、上記ニトリラーゼ活性を有する微生物の培養液を用いた微生物菌体の培養は、例えば、該培養液のｐＨが６〜１０の範囲、培養の温度が２５〜３７℃の範囲で、１〜７日間好気的に行い、活性が最大となるまで行う方法を例示することができる。
【０００９】本発明における水性媒体は、ブリックス（Ｂｒｉｘ）値で０．３〜３．０％の範囲で選択される濃度の前記培養液成分を含むものであり、水性媒体中の培養液成分の濃度は、培養液が種々の成分から構成されていることからブリックス値で表示されている。ここで、ブリックス値とは、ブリックス計 ＲＡ−４１０（京都電子工業株式会社製）で測定し、２０℃における値に換算した値である。
【００１０】本発明の微生物菌体触媒の保存方法は、上記水性媒体に懸濁した状態でニトリラーゼ活性を有する微生物菌体を保存することを特徴とする。そして、ブリックス値で０．３〜３．０％の範囲で選択される濃度の培養液成分を含む水性媒体に懸濁した状態のニトリラーゼ活性を有する微生物菌体の調製方法としては、以下の方法を具体的に挙げることができる。
【００１１】上記調製された保存用微生物菌体懸濁液を、０〜３５℃、好ましくは５〜２５℃、特に好ましくは１０℃で静置、振とう、或いは撹拌しながら保存することにより、微生物菌体触媒をニトリラーゼ活性を有効に維持することができる。また、水性媒体に懸濁した状態のニトリラーゼ活性を有する微生物菌体の保存時の菌体濃度には特に制限はないが、湿菌体で通常１〜８０重量％の範囲とすることが好ましい。
【００１２】本発明の微生物菌体触媒の保存方法により保存された微生物菌体を触媒として物質生産に使用する場合は、これらの微生物菌体懸濁液又は固定化微生物菌体を直接或いは希釈して反応液中に投入するか、もしくは必要に応じてこれらをさらに水又は緩衝液で洗浄して投入してもよい。
【００１３】
【実施例】以下、実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
実施例１（前培養）前培養用培地として、０．５重量％グルコース、０．５重量％酵母エキス、０．５重量％ε−カプロラクタム、０．１重量％リン酸二カリウム、０．１重量％リン酸一カリウム、０．０２重量％硫酸マグネシウム七水和物，０．１重量％塩化ナトリウム、０．００１重量％硫酸第一鉄七水和物を含み、１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ７．２に調整した培地２００ｍｌを３リットル容三角フラスコに入れ、１２１℃で２０分間滅菌した（硫酸第一鉄のみは別にろ過滅菌して加えた）ものを用い、この培地にアースロバクター エスピー ＮＳＳＣ１０４株を接種し、３３℃で３日間振盪培養して前培養を行った。
【００１４】（本培養）本培養用培地として、１０．０重量％コーンスチープリカー抽出液、２．０重量％ショ糖、０．５重量％ε−カプロラクタムからなる培地６．０リットルを１０リットル容ジャーファメンターに用意した。コーンスチープリカー抽出液はろ過滅菌し、他の培地成分は１１０℃で２０分間滅菌して用いた。この培地に前培養液６０ｍｌを植菌して、３３℃で４日間通気撹拌培養した。ここでコーンスチープリカー抽出液とは、コーンスチープリカー４０重量％を含み、１０Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ７．０に調整した溶液から不溶物を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分間）によって除いた上清液である（以下同じ）。
【００１５】（微生物菌体の保存）本培養終了後、この培養液に５Ｎ塩酸溶液を加えてｐＨ７に調整したものを保存用菌体懸濁液として、４０ｍｌずつ３本のファルコン社製コニカルチューブに小分けし、５℃、１０℃、２０℃に静置保存した。この場合の湿菌体濃度は、４．８％で、上清のブリックス値は１．７０％であった。保存３０日後に菌体懸濁液の一部を取り出してニトリラーゼの残存活性を測定した。
【００１６】（ニトリラーゼ活性の測定）上記の微生物菌体懸濁液１０ｍｌを遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１０分間、５℃）して得られた菌体に１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を加えて１０ｍｌ懸濁液とし、この菌体懸濁液０．２ｍｌにクロトノニトリル １２３μｍｏｌを含む同緩衝液０．３ｍｌを添加して、３５℃で３０分間反応を行った。反応後、直ちに遠心分離（１６，０００ｒｐｍ、５分、室温）で菌体を除き、反応液中に生成したクロトン酸を高速液体クロマトグラフィーにて定量した。１分間に１μｍｏｌのクロトン酸を生成する活性を１単位（Ｕ）とした。
【００１７】（ニトリラーゼの残存活性）保存用菌体懸濁液の調製時、即ち保存０日目の菌体懸濁液１ｍｌの活性を１００としたときの相対活性値を表１に示す。
【００１８】
【表１】
【００１９】実施例２（微生物菌体の培養及び保存）実施例１と同様にして、前培養、本培養を行った。培養終了後、この培養液から遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分間、５℃）により湿菌体沈殿物を集め、この湿菌体沈殿物と同量の脱イオン水に懸濁して５０重量％湿菌体懸濁液を調製した。この菌体懸濁液を１０ｍｌずつ３本のファルコン社製コニカルチューブに小分けし、５℃、１０℃、２５℃に静置保存した。この場合の上清のブリックス値は０．７３％であった。保存３２日後に菌体懸濁液の一部を取り出してニトリラーゼの残存活性を測定した。
【００２０】（ニトリラーゼ活性の測定）上記の菌体懸濁液を１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で１０倍に希釈し、その希釈液０．２ｍｌにクロトノニトリル １２３μｍｏｌを含む同緩衝液０．３ｍｌを添加して、３５℃で３０分間反応を行った。反応後、直ちに遠心分離（１６，０００ｒｐｍ、５分、室温）で菌体を除き、反応液中に生成したクロトン酸を高速液体クロマトグラフィーにて定量した。１分間に１μｍｏｌのクロトン酸を生成する活性を１単位（Ｕ）とした。
【００２１】（ニトリラーゼの残存活性）保存０日目の菌体懸濁液１ｍｌの活性を１００としたときの相対活性値を表２に示す。
【００２２】
【表２】
【００２３】実施例３（微生物菌体の培養）実施例１と同様にして、前培養を行った。本培養用培地として、５．３重量％コーンスチープリカー抽出液、０．４重量％ラクトアミノサンＳＬ（コスモ食品株式会社製）、０．４重量％グルコース、０．５重量％ε−カプロラクタムからなる培地２．８５リットルを１０リットル容ジャーファメンターに用意した。コーンスチープリカー抽出液とラクトアミノサンＳＬ溶液はろ過滅菌し、他の培地成分は１１０℃で２０分間滅菌して用いた。この培地に前培養液６０ｍｌを植菌して、３３℃で通気撹拌培養した。培養開始後、グルコース濃度が０．１〜０．２重量％になるように、同様に調製した６１．５重量％コーンスチープリカー抽出液、５．０重量％ラクトアミノサンＳＬ、４．９重量％グルコース、０．７重量％ε−カプロラクタムからなる追加培地２．１９リットルを流加した。続いて同様に調製した５０重量％グルコース水溶液９６０ｍｌを培養液中のグルコース濃度が０．１〜０．２重量％になるように流加した。流加中は、培養液中の溶存酸素が２０〜４０％になるように酸素混合ガスを通気した。流加終了後、引き続き３３℃で通気撹拌培養を４日間行った。
【００２４】（微生物菌体の保存）この培養液から遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分間、５℃）により菌体を集め、脱イオン水で希釈を繰り返し、培養液成分の濃度の異なる４０％湿菌体懸濁液を各８０ｍｌ調製し、それぞれ１０℃で静置保存した。保存２８日後に菌体懸濁液の一部を取り出してニトリラーゼの残存活性を実施例２と同様にして測定した。
【００２５】（ニトリラーゼの残存活性）保存０日目の菌体懸濁液上清のブリックス値と菌体懸濁液１ｍｌの活性を１００とした時の相対活性値を表３に示す。
【００２６】
【表３】
【００２７】実施例４（微生物菌体の培養と保存）実施例３におけるラクトアミノサンＳＬの代わりにアミノサンパウダーＳＬ（コスモ食品株式会社製）を用いる他は、実施例３と同様に培養を行った。培養後の微生物菌体は中空糸膜モジュール（０．０５μｍ、３，９００cm2）を用いて濃縮後、上清のブリックス値が０．８０になるように脱イオン水で洗浄を繰り返して、３５％湿菌体懸濁液を調製した。それを１０℃で静置保存し、経時的に菌体懸濁液の一部を取り出してニトリラーゼの残存活性を実施例２と同様にして測定した。
【００２８】（ニトリラーゼの残存活性）保存０日目の菌体懸濁液１ｍｌの活性を１００とした時の相対活性値を表４に示す。
【００２９】
【表４】
【００３０】
【発明の効果】本発明の微生物菌体触媒の保存方法によれば、ニトリラーゼ活性を有する多量の菌体を凍結や安定剤を添加することなしに使用時まで長期間安定に保存することが可能となり、凍結保存のための冷却コスト削減や安定剤の除去・洗浄工程及び多量の洗浄廃液の大幅な軽減が期待できる。また、本発明の微生物菌体触媒の保存方法は簡便かつ実用的であることから、ニトリラーゼ活性を有する微生物菌体を工業的に有利に保存することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 ニトリラーゼ活性を有する微生物菌体を、ブリックス（Ｂｒｉｘ）値で０．３〜３．０％の範囲で選択される濃度の前記微生物の培養液成分を含む水性媒体に懸濁した状態で保存することを特徴とする微生物菌体触媒の保存方法。
【請求項２】 保存温度５〜２５℃で保存することを特徴とする請求項１記載の微生物菌体触媒の保存方法。
【請求項３】 ニトリラーゼ活性を有する微生物の培養液から分離して得られる菌体濃縮物に含まれる培養液成分を脱イオン水を用いて希釈し、ブリックス（Ｂｒｉｘ）値で０．３〜３．０％の範囲で選択される濃度の微生物の培養液成分を調製することを特徴とする請求項１又は２記載の微生物菌体触媒の保存方法。
【請求項１】 ニトリラーゼ活性を有する微生物菌体を、ブリックス（Ｂｒｉｘ）値で０．３〜３．０％の範囲で選択される濃度の前記微生物の培養液成分を含む水性媒体に懸濁した状態で保存することを特徴とする微生物菌体触媒の保存方法。
【請求項２】 保存温度５〜２５℃で保存することを特徴とする請求項１記載の微生物菌体触媒の保存方法。
【請求項３】 ニトリラーゼ活性を有する微生物の培養液から分離して得られる菌体濃縮物に含まれる培養液成分を脱イオン水を用いて希釈し、ブリックス（Ｂｒｉｘ）値で０．３〜３．０％の範囲で選択される濃度の微生物の培養液成分を調製することを特徴とする請求項１又は２記載の微生物菌体触媒の保存方法。
【公開番号】特開２００１−１４９０６５（Ｐ２００１−１４９０６５Ａ）
【公開日】平成１３年６月５日（２００１．６．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願平１１−３３３４４８
【出願日】平成１１年１１月２４日（１９９９．１１．２４）
【出願人】（０００００４３０７）日本曹達株式会社 (434)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１３年６月５日（２００１．６．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１１年１１月２４日（１９９９．１１．２４）
【出願人】（０００００４３０７）日本曹達株式会社 (434)
【Ｆターム（参考）】
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