薬剤選択融合遺伝子を含む高生産性細胞の樹立のための発現ベクター
【課題】目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する形質転換細胞を効率的に樹立するのに効果的な発現ベクターを提供する。
【解決手段】（１）薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセット、（２）遺伝子発現安定化エレメント、及び（３）目的タンパク質遺伝子発現カセットを少なくとも有する発現ベクター。
【解決手段】（１）薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセット、（２）遺伝子発現安定化エレメント、及び（３）目的タンパク質遺伝子発現カセットを少なくとも有する発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質転換細胞の中から目的とするタンパク質の遺伝子を高レベルで発現する細胞を効率よく樹立するための発現ベクター、及び形質転換された高生産性細胞に関する。本発明の発現ベクターは、遺伝子工学的手法により、動物細胞、特に哺乳類動物細胞において医薬品などの有用タンパク質を生産するために有用である。
【背景技術】
【０００２】
組換えタンパク質を産生する細胞を樹立する方法としては、一般に、目的タンパク質の遺伝子を発現する遺伝子構築物を宿主細胞へ遺伝子導入し、得られた形質転換細胞の中からこの遺伝子構築物が宿主細胞のゲノム上に安定導入された細胞を選別する。この際、前記遺伝子構築物に、薬剤選択マーカーとなる薬剤耐性遺伝子を目的タンパク質の遺伝子と同一プロモーター下あるいは別個のプロモーター下で発現するように挿入しておき、薬剤選択によって生き残った細胞を目的タンパク質の遺伝子が安定導入された細胞として選別する。本発明者らは、薬剤選択マーカーの発現を減弱化するｍＲＮＡ不安定化配列を発明し、薬剤選択の効果を飛躍的に向上させることに成功した（特許文献１）。
【０００３】
さらに、ゲノム導入部位の位置効果による発現低下を低減させるため、本発明者らは遺伝子発現安定化エレメントを発明し、高発現を長時間維持することができた。さらに、ｍＲＮＡ不安定化配列と遺伝子発現安定化エレメントを組み合わせることにより、その相乗効果によって、目的遺伝子を高度に発現する細胞を効率的に選択し、かつそれらの高発現細胞の安定的な維持ができた（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４４９１８０８号
【特許文献２】特許第４５２５８６３号
【特許文献３】国際公開第２０１０／０２３７８７号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂａｋｈｅｅｔ Ｔ，Ｆｒｅｖｅｌ Ｍ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｂ．Ｒ．Ｇ、 Ｇｒｅｅｒ Ｗ，Ｋｈａｂａｒ Ｋ．Ｓ．Ａ．（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２９：２４６−２５４
【非特許文献２】Ｌａｇｎａｄｏ Ｃ．Ａ，Ｂｒｏｗｎ Ｃ．Ｌ，Ｇｏｏｄａｌｌ Ｇ．Ｊ．（１９９４） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １４：７９８４−７９９５
【非特許文献３】Ｚｕｂｉａｇａ Ａ．Ｍ，Ｂｅｌａｓｃｏ Ｊ．Ｇ，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ Ｍ．Ｅ．（１９９５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １５：２２１９−２２３０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、動物細胞、特に哺乳類動物細胞において、組換えタンパク質の生産性の高い細胞を迅速、かつ効率よく樹立するのに効果的な発現ベクター、及び高生産性細胞を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、ｍＲＮＡ不安定化配列を含む薬剤選択マーカー遺伝子、及び遺伝子発現安定化エレメントを有する発現ベクターにさらに遺伝子増幅を誘起するシステムを組み合わせることにより、これらの相乗効果によって目的タンパク質の生産量が飛躍的に向上することを見出し、本発明に至った。
【０００８】
本発明の特徴は、薬剤選択マーカー遺伝子の発現カセットとジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子の発現カセットを独立に存在させるのではなく、薬剤選択マーカー遺伝子とジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を１つの発現カセットで発現させたことである。
【０００９】
すなわち、以下の発明が提供される。
【００１０】
［１］ 発現ベクター
［１−１］
下記（１）〜（３）を少なくとも有する発現ベクター。
（１）薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセット、
（２）遺伝子発現安定化エレメント、及び
（３）目的タンパク質遺伝子発現カセット
［１−２］
下記（１）〜（３）を少なくとも有する発現ベクター
（１）薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列を含む発現カセット、
（２）遺伝子発現安定化エレメント、及び
（３）目的タンパク質遺伝子発現カセット
［１−３］
ｍＲＮＡ不安定化配列が、サイトカイン、インターロイキン、又は癌原遺伝子の３’非翻訳領域に存在するＡＴリッチ配列に由来することを特徴とする［１−２］に記載の発現ベクター。
［１−４］
ｍＲＮＡ不安定化配列が、ＴＴＡＴＴＴＡ（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｔ）のモチーフ配列を有することを特徴とする［１−２］に記載の発現ベクター。
［１−５］
モチーフ配列が、２回以上繰り返されていることを特徴とする［１−４］に記載の発現ベクター。
［１−６］
モチーフ配列の繰り返し間に１塩基以上のスペーサー配列を含むことを特徴とする［１−５］に記載の発現ベクター。
［１−７］
ｍＲＮＡ不安定化配列中に１ないし数塩基の置換、挿入または欠失を含むことを特徴とする［１−３］〜［１−６］のいずれかに記載の発現ベクター。
［１−８］
遺伝子発現安定化エレメントが以下のいずれかである、［１−１］〜［１−７］のいずれかに記載の発現ベクター。
（Ｉ）配列番号１５で示す配列のうち４１６０１〜４６７４６番目までの配列からなるＤＮＡ、もしくは４１６０１〜４６７４６番目までの配列の部分配列であって少なくとも４１６０１〜４２７００番目までの配列を含む塩基配列からなるＤＮＡ
（ＩＩ）上記（Ｉ）の配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ遺伝子発現安定化機能を有する塩基配列からなるＤＮＡ
（ＩＩＩ）上記（Ｉ）または（ＩＩ）の配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ
［１−９］
遺伝子発現安定化エレメントを２つ以上含む、［１−１］〜［１−８］のいずれかに記載の発現ベクター。
［１−１０］
薬剤選択マーカー遺伝子が、タンパク質合成阻害系抗生物質耐性遺伝子である、［１−１］〜［１−９］のいずれかに記載の発現ベクター。
［１−１１］
薬剤選択マーカー遺伝子がピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ及びネオマイシンホスホトランスフェラーゼからなる群より選択される、［１−１０］に記載の発現ベクター。
［１−１２］
目的タンパク質の遺伝子発現カセットが、所望の目的タンパク質遺伝子を挿入するためのマルチクローニングサイトを備えていることを特徴とする［１−１］〜［１−１１］のいずれかに記載の発現ベクター。
［１−１３］
目的タンパク質遺伝子が抗体の重鎖及び／または軽鎖ポリペプチド遺伝子である、［１−１］〜［１−１２］のいずれかに記載の発現ベクター。
【００１１】
［２］ 発現カセット
［２−１］
薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列を含む発現カセット。
【００１２】
［３］ 高生産細胞の作製方法
［３−１］
以下の工程を含む、高生産細胞を作製する方法。
（ａ）［１−１］〜［１−１３］のいずれかに記載の発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程
（ｂ）形質転換された細胞を薬剤存在下で培養する工程
（ｃ）形質転換された細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下で培養する工程
（ｄ）高発現を示す細胞株を単離する工程。
［３−２］
以下の工程を含む、高生産細胞を作製する方法。
（ａ）［１−１］〜［１−１３］のいずれかに記載の発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程
（ｂ）形質転換された細胞をヒポキサンチンおよびチミジン不含培地で培養する工程
（ｃ）形質転換された細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下で培養する工程
（ｄ）高発現を示す細胞株を単離する工程。
［３−３］
以下の工程を含む、高生産細胞を作製する方法。
（ａ）［１−１］〜［１−１３］のいずれかに記載の発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程
（ｂ）形質転換された細胞を、ヒポキサンチンおよびチミジンを含まず、かつ薬剤存在下で培養する工程
（ｃ）形質転換された細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下で培養する工程
（ｄ）高発現を示す細胞株を単離する工程。
［３−４］
［３−１］〜［３−３］のいずれかに記載の方法において、（ｃ）形質転換された細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下で培養する工程、及び（ｄ）高発現を示す細胞株を単離する工程を複数回繰り返す、高生産細胞を作製する方法。
［３−５］
宿主細胞が哺乳類動物細胞由来の細胞である、［３−１］〜［３−４］のいずれかに記載の高生産細胞を作製する方法。
［３−６］
宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）由来の細胞である、［３−１］〜［３−４］のいずれかに記載の高生産細胞を作製する方法。
［３−７］
宿主細胞がジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子欠損細胞である、［３−１］〜［３−４］のいずれかに記載の高生産細胞を作製する方法。
［３−８］
宿主細胞が無血清馴化された細胞である、［３−１］〜［３−４］のいずれかに記載の高生産細胞を作製する方法。
【００１３】
［４］高生産細胞
［４−１］
［３−１］〜［３−７］のいずれかに記載の方法により得られた高生産細胞。
【００１４】
［５］高生産細胞を用いて生産する方法
［５−１］
［３−１］〜［３−７］のいずれかに記載の方法により得られた高生産細胞を用いてポリペプチドを生産する方法。
［５−２］
［３−１］〜［３−７］のいずれかに記載の方法により得られた高生産細胞を用いて抗体を生産する方法。
［５−３］
［３−１］〜［３−７］のいずれかに記載の方法により得られた高生産細胞を用いてワクチンを生産する方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明では、薬剤選択によって形質転換細胞を薬剤選択するとともに、細胞の培養工程中にメトトレキセート（ＭＴＸ）に代表される薬剤を存在させ、遺伝子増幅を引き起こすことにより、宿主細胞に多数の遺伝子コピーを有する細胞株を作出することができる。しかしながら、発現ベクターに発現カセットを複数存在させた場合、転写干渉が生じることにより各発現カセットの発現量が低下し、各遺伝子の機能が十分に発揮されない。この転写干渉は、目的タンパク質の発現にも影響を及ぼし、全体としてタンパク質生産性の低下を招く。そこで本発明は、薬剤選択マーカー遺伝子とジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を隣接させ、いわゆる融合遺伝子として１つの発現カセットで発現させることにより、転写干渉を低減させて、より生産性を向上させることができる。
【００１６】
本発明の別の態様においては、薬剤選択マーカー遺伝子及びジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセットにｍＲＮＡ不安定化配列が挿入されているため、ｍＲＮＡ不安定化配列を有さない従来の薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットに比べて薬剤選択マーカーの発現が減弱化されており、宿主細胞ゲノム内の高発現領域に組み込まれないと、薬剤存在下で形質転換細胞の生存が困難となる。このため、薬剤選択マーカー遺伝子及び目的タンパク質遺伝子が宿主細胞ゲノム内の高発現領域に組み込まれた形質転換細胞のみが薬剤選択によって生き残ることができる。また、遺伝子増幅についても、少量のＭＴＸ等の薬剤で最大の効果を得ることができる。その結果、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する高発現細胞を効率的に選別することができる。
【００１７】
本発明の遺伝子発現安定化エレメントにより、細胞ゲノムにおける組換えタンパク質遺伝子への隣接染色体や調節エレメントの影響を低減させて、組換えタンパク質遺伝子の遺伝子発現を安定化し、高発現を長期間維持することができる。そこで本発明は、これらの相乗効果によって、非常に高いレベルのタンパク質生産性を示す高生産細胞株を迅速、容易、且つ効率的に樹立することができる。
【００１８】
すなわち本発明によれば、目的タンパク質遺伝子が宿主細胞の高発現領域に導入されている特長、高発現領域に導入された目的タンパク質遺伝子が多数の遺伝子コピーを有している特長、これらの遺伝子発現が安定している特長を有する高生産性細胞を極めて迅速、容易、且つ効率的に樹立することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ｐＰＵＲ・Ｎ４の構築を示す図である。以下、図中、Ｐｕｒとは、ピューロマイシン耐性遺伝子のことである。また、図中、ｉＰＣＲとは、Ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲのことである。
【図２】ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２の構築を示す図である。以下、図中、Ｎｅｏとは、ネオマイシン耐性遺伝子のことである。
【図３】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２の構築を示す図である。
【図４】ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ／１．１ｋの構築を示す図である。
【図５】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−１．１ｋ／１．１ｋの構築を示す図である。
【図６】ｐＥＨＸのベクターマップを示す図である。
【図７】ｐＥＬＸのベクターマップを示す図である。
【図８】ｐＥＬＸ２のベクターマップを示す図である。
【図９】ｐＥＨＸ−ｄｈｆｒ・Ｎ４のベクターマップを示す図である。
【図１０】ｐＥＨＸ−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ、ｐＥＨＸ−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４の構築を示す図である。
【図１１】ｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）の構築を示す図である。
【図１２】ｐＥＬＨ２−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ（ＫＯＤ３Ｇ８）、ｐＥＬＨ２−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）の構築を示す図である。
【図１３】ピューロマイシン耐性遺伝子、ｄｈｆｒ遺伝子のそれぞれについて、下流にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加した発現カセットを含むもの（Ｐｕｒ・Ｎ４＋ｄｈｆｒ・Ｎ４）、ピューロマイシン耐性遺伝子（上流）とｄｈｆｒ遺伝子（下流）の融合タンパク質遺伝子の発現カセットを含むもの（Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ）、ピューロマイシン耐性遺伝子（上流）とｄｈｆｒ遺伝子（下流）の融合タンパク質遺伝子の下流にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加した発現カセットを含むもの（Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４）、について、ポリクローンの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した、抗体生産量をプロットしたグラフである。
【図１４】６ウェルプレートの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した、各クローンの抗体生産量をプロットしたグラフである。ピューロマイシン耐性遺伝子、ｄｈｆｒ遺伝子のそれぞれについて、下流にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加した発現カセットを含むもの（Ｐｕｒ・Ｎ４＋ｄｈｆｒ・Ｎ４）、ピューロマイシン耐性遺伝子（上流）とｄｈｆｒ遺伝子（下流）の融合タンパク質遺伝子の発現カセットを含むもの（Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ）、ピューロマイシン耐性遺伝子（上流）とｄｈｆｒ遺伝子（下流）の融合タンパク質遺伝子の下流にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加した発現カセットを含むもの（Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４）、について、それぞれ生産量上位５クローンをプロットしている。
【図１５】６ウェルプレートの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した、ＭＴＸでの選択培養後のポリクローンでの抗体生産量をプロットしたグラフである。ピューロマイシン耐性遺伝子、ｄｈｆｒ遺伝子のそれぞれについて、下流にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加した発現カセットを含むもの（Ｐｕｒ・Ｎ４＋ｄｈｆｒ・Ｎ４）、ピューロマイシン耐性遺伝子（上流）とｄｈｆｒ遺伝子（下流）の融合タンパク質遺伝子の発現カセットを含むもの（Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ）、ピューロマイシン耐性遺伝子（上流）とｄｈｆｒ遺伝子（下流）の融合タンパク質遺伝子の下流にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加した発現カセットを含むもの（Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４）、について、それぞれピューロマイシンで選択して取得した生産量上位１０クローンをＭＴＸで選択培養後に得られた細胞集団の、生産量上位５クローンの結果をプロットしている。
【図１６】ｐＥＨＸ−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４の構築を示す図である。
【図１７】ｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）の構築を示す図である。
【図１８】ピューロマイシン耐性遺伝子（上流）とｄｈｆｒ遺伝子（下流）の融合タンパク質遺伝子の下流にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加した発現カセットを含むもの（Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４）、ｄｈｆｒ遺伝子（上流）とピューロマイシン耐性遺伝子（下流）の融合タンパク質遺伝子の下流にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加した発現カセットを含むもの（ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４）について、ポリクローンの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した、抗体生産量をプロットしたグラフである。
【図１９】ｄｈｆｒ遺伝子（上流）とピューロマイシン耐性遺伝子（下流）の融合タンパク質遺伝子の下流にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加した発現カセットを含むもの（ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４）について、６ウェルプレートの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い各クローンの抗体生産量を算出し、生産量上位５クローンをプロットしたグラフである。
【図２０】６ウェルプレートの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した、ＭＴＸで選択後のポリクローンの細胞集団の抗体生産量をプロットしたグラフである。ｄｈｆｒ遺伝子（上流）とピューロマイシン耐性遺伝子（下流）の融合タンパク質遺伝子の下流にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加した発現カセットを含むもの（ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４）について、ピューロマイシンで選択して取得した生産量上位１０クローンをＭＴＸで選択培養後に得られた細胞集団の、生産量上位５クローンの結果をプロットしている。
【図２１】６ウェルプレートの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した、ピューロマイシンで選択後の高発現株の１細胞、1日あたりの抗体生産量をプロットしたグラフである。ｄｈｆｒ遺伝子（上流）とピューロマイシン耐性遺伝子（下流）の融合タンパク質遺伝子の下流にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加した発現カセットを含むもの（ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４）について、無血清馴化されたＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞へ遺伝子導入し、ピューロマイシンで選択して取得した生産量上位５クローンの結果をプロットしている。
【図２２】６ウェルプレートの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した、ＭＴＸで選択後のポリクローンの細胞集団の１細胞、1日あたりの抗体生産量をプロットしたグラフである。ｄｈｆｒ遺伝子（上流）とピューロマイシン耐性遺伝子（下流）の融合タンパク質遺伝子の下流にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加した発現カセットを含むもの（ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４）について、無血清馴化されたＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞へ遺伝子導入し、ピューロマイシンで選択して取得した生産量上位１０クローンをＭＴＸで選択培養後に得られた細胞集団の、生産量上位５クローンの結果をプロットしている。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００２１】
本発明の第一の側面によれば、（１）薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセット、（２）遺伝子発現安定化エレメント、及び（３）目的タンパク質遺伝子発現カセットを少なくとも有することを特徴とする発現ベクターが提供される。
【００２２】
本発明の第二の側面によれば、（１）薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列を含む発現カセット、（２）遺伝子発現安定化エレメント、及び（３）目的タンパク質遺伝子発現カセットを少なくとも有することを特徴とする発現ベクターが提供される。
【００２３】
本発明において、発現カセットとは、プロモーターから遺伝子コード配列、ターミネーター配列（ポリアデニレーションシグナル）までの遺伝子発現の単位をいう。加えて、イントロン、スペーサー配列、翻訳増強領域等を含むこともある。したがって、例えば「目的タンパク質遺伝子発現カセット」という場合、前記発現カセットの遺伝子コード配列が目的とするタンパク質の遺伝子のコード配列であるものをいう。
【００２４】
（薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセット）
【００２５】
薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセットとは、薬剤選択マーカー遺伝子及びジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を遺伝子コード配列として含む発現カセットをいう。
【００２６】
本発明の薬剤選択マーカー遺伝子を用いた薬剤選択に使用される薬剤としては、タンパク質合成阻害系抗生物質としてブラストサイジン（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）、ジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（Ｇ４１８）、ハイグロマイシン（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ；Ｈｙｇ）、ピューロマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ；Ｐｕｒ）が例示される。また、本発明の薬剤選択マーカー遺伝子としては、薬剤選択に一般的に使用される薬剤に対して耐性を示す遺伝子が好適に用いられる。タンパク質合成阻害系抗生物質を薬剤として用いる場合には、タンパク質合成阻害系抗生物質耐性遺伝子を用いることが好ましい。特に限定されるものではないが、ネオマイシン耐性遺伝子（ジェネティシン耐性遺伝子としての機能も有する）として、Ｔｎ５由来ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ３’−ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（Ｎｅｏ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子として、Ｅ．ｃｏｌｉ由来ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（Ｈｐｈ、実施例および図面ではＨｙｇと記載）、ピューロマイシン耐性遺伝子として、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｃ、実施例および図面ではＰｕｒと記載）、ブラストサイジン耐性遺伝子として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ由来ブラストサイジン耐性遺伝子（ｂｓｒ）などが例示される。これらの中でも、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼが好ましく、より好ましくはピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼであり、さらに好ましくはピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼである。
【００２７】
ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ／ｄｈｆｒ）は核酸の生合成に必須の酵素であり、ｄｈｆｒ遺伝子を欠損する細胞は核酸を含まない培地で生育できない。ｄｈｆｒ遺伝子を欠損する細胞を、ｄｈｆｒ遺伝子を有する発現ベクターで形質転換すると、核酸要求性が回復した形質転換体を得ることができる。
【００２８】
細胞ゲノムにおいて、外から適当な圧力をかけると、特定の遺伝子の重複（増幅）が選択的に起こり安定化することが知られている。ｄｈｆｒ遺伝子を有する発現ベクターで形質転換された培養細胞にＤＨＦＲの拮抗阻害剤であるメトトレキセート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ、ＭＴＸ）を加えると、ほとんどの細胞は死んでしまうがごくまれに生き残るものがある。このような細胞はｄｈｆｒ遺伝子のコピー数が増加しており、大量のＤＨＦＲを合成できるため、ＭＴＸに阻害されないＤＨＦＲが、細胞が生き続け増殖するのに必要なテトラヒドロ葉酸を作り出すことができる。段階的に選択を続けると、通常は１もしくは数コピーしかないｄｈｆｒ遺伝子が最終的には１００〜１０００倍にも増幅された変異細胞を得ることができる。動物細胞において遺伝子増幅が起こる場合、選択圧をかけたｄｈｆｒ遺伝子そのものだけでなく、その遺伝子の近傍に存在する他の遺伝子も同時に増幅されるので、結果として目的タンパク質遺伝子も同時に増幅される。
【００２９】
本発明におけるｄｈｆｒ遺伝子は公知のものを使用することができ、由来は限定されないが、マウス由来のｄｈｆｒ遺伝子が好ましい。ｄｈｆｒ遺伝子は市販のベクターから入手することができ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）やｐＯｐｔｉＶＥＣ−ＴＯＰＯ（登録商標）（インビトロジェン社）が例示されるが、人工合成により入手することもできる。
【００３０】
薬剤選択マーカー遺伝子とｄｈｆｒ遺伝子が「隣接して存在する」とは、薬剤選択マーカー遺伝子とｄｈｆｒ遺伝子を融合タンパク質として発現させることを意味し、上流側の遺伝子の終止コドンを削除することで成し遂げられる。薬剤選択マーカー遺伝子とｄｈｆｒ遺伝子との間は、例えばグリシン・セリンリンカー等の実質的に機能を持たない配列が存在してもよいし、配列を存在させず直接つなげてもよい。下流側の遺伝子から開始コドンのメチオニンをコードするＡＴＧ配列を除去することも好ましい。
【００３１】
薬剤選択マーカー遺伝子とｄｆｈｒ遺伝子の配置順序はいずれでもよい。
【００３２】
本発明の薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセットにおけるプロモーターとしては、動物細胞、特に哺乳類細胞で発現可能なプロモーターであれば特に限定されるものではないが、ヒトやマウスのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ヒトヘルペス単純ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）プロモーター、などのウイルスに由来するものや、マウスｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ−ｋｉｎａｓｅ１遺伝子（ＰＧＫ）プロモーターなどの非ウイルス性の細胞遺伝子に由来するプロモーター、及び由来の異なるプロモーターのハイブリッドが挙げられる。ここで、プロモーターは、プロモーターのコア領域に限るものではなく、エンハンサー領域を含む場合もある。薬剤選択マーカーの発現を減弱化するため、転写活性が低いものがより好ましい。転写活性の低いプロモーターとして変異型のプロモーターなどを利用してもよいし、コザック配列を置換してもよい。さらに、ｍＲＮＡ不安定化配列のモチーフ配列の繰り返しの回数を少なくし、転写活性の弱いプロモーターを併用するのも１つの想定される実施態様である。
【００３３】
本発明の薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセットにおけるポリアデニレーションシグナル（ターミネーター配列）としては、ＳＶ４０ウイルス由来ｌａｔｅ ｐｏｌｙＡシグナル、ｅａｒｌｙ ｐｏｌｙＡシグナル、ＨＳＶ−ｔｋ由来ｐｏｌｙＡシグナル、ウシ成長因子遺伝子由来ｐｏｌｙＡシグナル、ウサギβ−グロビン遺伝子由来ｐｏｌｙＡシグナルなどが例示されるが、特に限定されるものではない。
【００３４】
本発明の薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセット中でのプロモーター、薬剤選択マーカー遺伝子及びｄｈｆｒ遺伝子、並びにポリアデニレーションシグナルの配置順序は、薬剤選択マーカー遺伝子及びｄｈｆｒ遺伝子の発現が可能である限り特に限定されないが、一般的にプロモーター、薬剤選択マーカー遺伝子及びｄｆｈｒ遺伝子、並びにポリアデニレーションシグナルをこの順序で上流から下流に向かって配置する。これらの三つの要素は、相互に直接連結されている必要はなく、所望により、イントロン、スペーサー配列、翻訳増強領域等を間に有していてもよい。
【００３５】
（薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列を含む発現カセット）
本発明で使用する発現カセットは、ｍＲＮＡ不安定化配列を有することを除いては、前記薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセットと同様の構成を有する。そこで、ｍＲＮＡ不安定化配列について説明する。
【００３６】
「ｍＲＮＡ不安定化配列」とは、この配列を有するＤＮＡから転写されたｍＲＮＡの細胞内半減期を低減させる機能を有するヌクレオチド配列のことであり、自然界では初期応答遺伝子などに存在することが見出されている。
【００３７】
ｍＲＮＡ不安定化配列は、いくつかの遺伝子ではコード配列中、あるいは５’ＵＴＲ（非翻訳領域）に存在するものもあるが、多くは３’ＵＴＲに存在する。３’ＵＴＲに存在するｍＲＮＡ不安定化配列としては、ＡＵ−ｒｉｃｈ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＡＲＥ）、ｈｉｓｔｏｎｅ ｍＲＮＡ ３’−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ、ｉｒｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＩＲＥ）、ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、ｌｏｎｇ ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐなどが知られている。これらの中でもＡＲＥは、恒常的にｍＲＮＡを不安定化できることから、本発明に用いるｍＲＮＡ不安定化配列として好ましい。
【００３８】
ＡＲＥとは、ｍＲＮＡにおける「ＡＵが豊富なエレメント」、すなわちアデニン（Ａ）及びウラシル（Ｕ）を高い割合で含む配列もしくは領域を意味する。またＡＲＥとは、前記エレメントをコードするＤＮＡにおける「ＡＴが豊富なエレメント」、すなわちアデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）を高い割合で含む配列もしくは領域を指すためにも用いられる。
【００３９】
ＡＲＥは、造血細胞増殖因子遺伝子、成長因子遺伝子、インターロイキン遺伝子、インターフェロン等のサイトカイン遺伝子、及びいくつかの癌原遺伝子（プロトオンコジーン）などに見られる（非特許文献１）。本発明の発現カセットでは、これらの遺伝子中のＡＲＥに相当する核酸配列をそのまま利用してもよいが、ＡＲＥ中のモチーフ配列として知られるＴＡＴＴＴＡＴ（非特許文献２）やＴＴＡＴＴＴＡ（Ｔ／Ａ）（Ｔ／Ａ）（非特許文献３）などを利用する方が、不要な制限酵素認識配列を発現ベクターに挿入してしまうことを避けることができ、利便性が高い。
【００４０】
ＡＲＥを持つ遺伝子の例としては、造血細胞増殖因子についてはＧｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｉｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｇ ｆａｃｔｏｒ（ＧＭ−ＣＳＦ），インターロイキンについてはＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β、２，３、４、６、８、１０、１１、インターフェロンについてはＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−α、癌原遺伝子についてはｃ−ｆｏｓ，ｃ−ｍｙｃ，ｃ−ｊｕｎ，ｃ−ｍｙｂ，Ｐｉｍ−１などが例示される。このほかにもＴｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ，Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１，Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ，Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｙｐｅ２など多くの遺伝子がＡＲＥを持つことが知られており、例示された遺伝子に限定されない。
【００４１】
本発明おいて使用することができるｍＲＮＡ不安定化配列としては、下記のものが例示される。
ＡＴＴＴのモチーフ配列の１ないし２回以上の繰り返し。
ＡＴＴＴＡのモチーフ配列の１ないし２回以上の繰り返し。
ＴＡＴＴＴＡＴのモチーフ配列の１ないし２回以上の繰り返し。
ＴＴＡＴＴＴＡ（Ｔ／Ａ）（Ｔ／Ａ）のモチーフ配列の１ないし２回以上の繰り返し。
（Ｔ／Ａ）はＴまたはＡのいずれかである。
【００４２】
これらの配列は、１ないし数塩基の置換／挿入／欠失を含んでもよく、ＤＮＡの複製の誤りや突然変異などの自然変異によるもの、人為的な変異導入によるもの等が想定される。また、モチーフ配列の繰り返し間には１〜１００塩基程度のスペーサー配列またはリンカー配列を含んでもよい。加えて、モチーフ配列の逆位を含むものであってもよい。
【００４３】
これらのモチーフ配列の繰り返し数は、１回でもよいが、２回以上、より好ましくは４回以上とすることにより、ｍＲＮＡの不安定化効果を一層高めることができ、選別効率を顕著に増大させることができる。
【００４４】
繰り返しの回数の上限は特に限定されないが、細胞へのベクターの取り込みの観点から、発現ベクターが最大１０ｋｂｐ〜２５ｋｂｐ長となるようなものが望ましい。ただし、繰り返し配列数が増えるにしたがって、ｍＲＮＡの不安定化の効果は飽和に向かい、一定の繰り返し数を超えるとそれ以上の顕著な効果を望めなくなる。上限値を定めるものではないが、１０回以上の繰り返し配列は実用上意味がない。
【００４５】
本発明の薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列を含む発現カセット中でのプロモーター、薬剤選択マーカー遺伝子及びｄｈｆｒ遺伝子、ｍＲＮＡ不安定化配列、並びにポリアデニレーションシグナルの配置順序は、薬剤選択マーカー遺伝子及びｄｈｆｒ遺伝子の発現が可能である限り特に限定されないが、一般的にプロモーター、薬剤選択マーカー遺伝子及びｄｆｈｒ遺伝子、ｍＲＮＡ不安定化配列、並びにポリアデニレーションシグナルをこの順序で上流から下流に向かって配置する。これらの四つの要素は、相互に直接連結されている必要はなく、所望により、イントロン、スペーサー配列、翻訳増強領域等を間に有していてもよい。
【００４６】
（遺伝子発現安定化エレメント）
本発明における「遺伝子発現安定化エレメント」とは、目的タンパク質遺伝子発現カセットが宿主ゲノムに挿入された部位近傍のゲノムの転写の活性化の状況に影響を受けてしまう、という位置効果を解消し、遺伝子発現を安定化する機能を有する核酸領域を意味する。
【００４７】
遺伝子発現を安定化する機能を有する核酸配列としては、インスレーター、スキャフォールド／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）、遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）、遍在作用性クロマチンオープニングエレメント（ＵＣＯＥ）などが利用できる。
【００４８】
インスレーターとしては、ニワトリβ-グロビンＬＣＲに由来する１．２ｋｂ ＤＮａｓｅＩ Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓｉｔｅ（ｃＨＳ４），バフンウニ由来ＵＲ１などが例示される。Ｓ／ＭＡＲとしては、ニワトリリゾチーム５’ＭＡＲエレメント、ヒトβ−グロビンＭＡＲエレメントやヒトインターフェロンβＳＡＲエレメントなどが例示される。
【００４９】
目的遺伝子を宿主細胞ゲノムへ導入するための遺伝子構築物として、プラスミドベクターが一般に用いられるが、プラスミドベクターの長さは最大１０ないし２５ｋｂｐであることから、遺伝子発現安定化エレメントの鎖長は出来るだけ短い方が好ましい。好ましい長さとしては５ｋｂｐ以下、より好ましくは１ｋｂｐ程度である。
【００５０】
本発明における実施態様では、遺伝子発現安定化エレメントとして、下記（ａ）〜（ｅ）のいずれか又はその組み合わせが使用できる。
【００５１】
（ａ）配列番号１５で示す配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１５で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１５で示す配列のうち４１８２０番目から４１８３９番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１５で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１５で示す配列のうち４１８２１番目から４１８４０番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；
（ｄ）配列番号１５で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１５で示す配列のうち４５１８２番目から４５２００番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；及び
（ｅ）配列番号１５で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１５で示す配列のうち９１０９４番目から９１１１３番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ。
【００５２】
本発明の遺伝子発現安定化エレメントの好ましい態様では、前記（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡは、配列番号１５で示す配列のうち４１６０１番目から４６７４６番目までの塩基配列で示す領域、又は配列番号１５で示す配列のうち４１６０１番目から４６７４６番目までの配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ遺伝子発現安定化機能を有する塩基配列領域である。また、これらの領域からなるＤＮＡと相補的な塩基配列も含まれる。本発明の遺伝子発現安定化エレメントのさらに好ましい態様では、前記（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡは、（１）配列番号１５で示す配列のうち４１６０１〜４６７４６番目までの配列からなるＤＮＡ、もしくは４１６０１〜４６７４６番目までの配列の部分配列であって少なくとも４１６０１〜４２７００番目までの配列を含む塩基配列からなるＤＮＡ、又は（２）（１）で示すＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ遺伝子発現安定化機能を有する塩基配列からなるＤＮＡであり、又は（３）これらの領域からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡである。
【００５３】
これらのエレメントは、発明者らがＣＨＯゲノム（ＣＨＯ ＤＲ１０００Ｌ−４Ｎ株）から単離同定したものであるが（特許文献３）、これらのエレメントと相同なエレメントは、他の哺乳類細胞ゲノムにも存在することが予想される。従って、（ｆ）配列番号１５で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、宿主細胞中で外来遺伝子発現カセットと近接するように配置された際に、外来遺伝子発現カセットに含まれる外来遺伝子から目的組換えタンパク質の発現を増大または安定化させることができるＤＮＡも、遺伝子発現安定化エレメントとして使用することができる。このような相同エレメントは、この技術分野の周知の技術、例えば、種間ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲなどによって容易に単離同定されることができる。
【００５４】
また、（ｇ）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかのＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ遺伝子発現安定化機能を有するＤＮＡも当然、遺伝子発現安定化エレメントとして使用することができる。本発明の遺伝子発現安定化エレメントは、これらの（ａ）〜（ｇ）のいずれか一つ又はそれらの任意の組合せからなる。さらに、（ｈ）前記（ａ）〜（ｇ）のいずれかのＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡも、遺伝子発現安定化機能を有し、遺伝子発現安定化エレメントとして使用することができるため、本発明に含まれる。
【００５５】
ストリンジェントな条件とは、用いられるプローブ・標識方法によっても異なるが、例えば、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中４０〜５０℃または０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中５５〜６５℃の条件下ハイブリダイズする塩基配列である。さらにストリンジェントな条件は、結合する核酸の融解温度（Ｔｍ値）に基づいて決定することができる。また、ハイブリダイズ後の洗浄条件として、「６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、Ｔｍ値よりも約１５〜３０℃低い温度」程度の条件をあげることができる。より高いストリンジェントな条件としては「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、Ｔｍ値よりも約５〜１５℃低い温度」程度、更に高いストリンジェントな条件としては「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、Ｔｍ値よりも約５〜１５℃低い温度」程度の洗浄条件をあげることができる。更に高いストリンジェントな条件としては「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ」程度の洗浄条件が例示される。
【００５６】
本発明の遺伝子発現安定化エレメントがその発現安定化効果を奏するためには、エレメントが宿主細胞ゲノム中で目的タンパク質遺伝子発現カセットの導入部位に近接する位置に配置されることが必要である。本発明において、用語「近接する」とは、特に制限されるものではないが、好ましくは本発明の遺伝子発現安定化エレメントと目的タンパク質遺伝子発現カセットとの間の距離が５０００ｂｐ以下、さらに好ましくは５００ｂｐ以下であることを意味する。
【００５７】
このような近接配置は、本発明のエレメントを含む核酸配列断片と、外来遺伝子の発現カセットを含む核酸配列断片との混合物をエレクトロポレーションやトランスフェクションなどによって宿主細胞内へ導入し、外来遺伝子の発現量の高い宿主細胞クローンを選択することによって実現することもできるが、近接配置を確実に達成させるためには、本発明の遺伝子発現安定化エレメント、及びそれに近接して配置された外来遺伝子発現カセットを含む外来遺伝子発現ベクターをあらかじめ作成しておき、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換させることが望ましい。
【００５８】
（目的タンパク質遺伝子発現カセット）
本発明における目的タンパク質遺伝子の発現カセットは、プロモーター、遺伝子コード配列、及びターミネーター配列（ポリアデニレーションシグナル）からなる。加えて、イントロンやスペーサー配列、翻訳増強領域を含むこともある。目的タンパク質遺伝子の発現プロモーターとしてはできるだけ転写活性の高いものが好ましく、ヒトやマウスのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターなどのウイルスに由来するものや、ヒトやマウス、さらにはＣＨＯ由来のＥｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ １（ＥＦ１α）遺伝子、ユビキチン遺伝子、β−アクチン遺伝子など、非ウイルス性の細胞遺伝子に由来するプロモーター、及び由来の異なるプロモーター／エンハンサーのハイブリッド、例えばＣＡＧプロモーターなどが挙げられる。
【００５９】
目的タンパク質遺伝子発現カセットには、該タンパク質遺伝子のコード配列の代わりに、複数の制限酵素認識配列からなるマルチクローニングサイトを配置することができる。外来遺伝子のｃＤＮＡやコード配列を導入する際に、クローニング作業が簡便であり、好ましい。
【００６０】
他の実施態様としては、目的タンパク質が抗体の重鎖及び／または軽鎖のポリペプチドである、目的タンパク質遺伝子発現カセットである。この場合、目的タンパク質遺伝子の発現カセットは、複数配置してもよく、あるいは複数のポリペプチド遺伝子をＩＲＥＳでつなぎ、ポリシストロン性の１つの発現カセットの形でもよい。
【００６１】
（発現ベクター）
本発明において、発現ベクターとは、遺伝子工学に利用されるベクターである。発現ベクターは、プラスミドベクターであることができる。しかし、これに限らず、例えば、ウイルスベクター、コスミドベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）及び他の非プラスミドベクターも使用できる。
【００６２】
本発明における発現ベクターの実施態様の１つは、目的タンパク質遺伝子発現カセット、薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセットが配置されており、その上流若しくは下流に、遺伝子発現安定化エレメントが配置された発現ベクターである。好ましくは、目的タンパク質遺伝子発現カセット、薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセットの上流に、遺伝子発現安定化エレメントが配置された発現ベクターである。この場合、目的タンパク質遺伝子発現カセットと薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセットとはいずれが上流であってもよいが、好ましくは目的タンパク質遺伝子発現カセットが上流に配置されたものである。
【００６３】
本発明における発現ベクターの好ましい実施態様は、目的タンパク質遺伝子発現カセット、薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセットが配置されており、その上流及び下流に、それらの発現カセットを挟むように遺伝子発現安定化エレメントが配置されたベクターである。目的タンパク質遺伝子発現カセット、薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセットの順序は問わないが、目的タンパク質遺伝子発現カセットが上流に配置されていることが好ましい。
【００６４】
遺伝子発現安定化エレメントは、目的タンパク質遺伝子発現カセットと薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセットとの間に配置されていてもよい。
【００６５】
遺伝子発現安定化エレメント、目的タンパク質遺伝子発現カセット、および薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセットとの間は、隣接していてもよいし、スペーサー配列等が挿入されていてもよい。
【００６６】
薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセットは、１つのベクターに２つ以上含まれていても良い。この場合、同一の薬剤選択マーカーが選ばれる場合もあるし、それぞれ異なる薬剤選択マーカーが選ばれる場合もある。また、各発現カセットは隣接して配置されても良いし、離れて配置されていても良い。
【００６７】
目的タンパク質が抗体の重鎖、軽鎖のように複数のポリペプチドからなる場合、目的タンパク質遺伝子の発現カセットを複数配置してもよく、あるいは複数のポリペプチド遺伝子をＩＲＥＳでつなぎ、ポリシストロン性の１つの発現カセットの形にしてもよい。
【００６８】
また、複数のポリペプチド発現カセットをそれぞれ異なるベクターに挿入し、それぞれのベクターを１つの宿主細胞へ導入して形質転換細胞を作製し、目的タンパク質を生産することができる。この場合、各ベクターに遺伝子発現安定化エレメント及び／または薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセットを配置することができ、それぞれ同一の薬剤選択マーカーを用いることもできるが、異なる薬剤選択マーカーを用いる方が、各ポリペプチドが全て高発現を示す細胞を効率よく取得する点で有利であり、好ましい。
【００６９】
抗体を生産する場合、抗体の重鎖ポリペプチド遺伝子と軽鎖ポリペプチド遺伝子をそれぞれ異なるベクターに挿入して発現させてもよいが、抗体の重鎖ポリペプチド遺伝子と軽鎖ポリペプチド遺伝子とを同一のベクターに挿入して発現させると、同一ベクター上の一種類の薬剤耐性遺伝子を使うことになり導入遺伝子数の差異を軽減でき、抗体の重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの生産バランスがとれ、重鎖・軽鎖の２つのポリペプチドが２本ずつから成る抗体としての生産性が安定するため、好ましい。
【００７０】
本発明の第三の側面では、薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列を含む発現カセットのみを提供する。これは、本発明の発現ベクターに限らず、いずれの発現ベクターにも適用できるものである。
【００７１】
本発明の第四の側面によれば、以下の工程を含む、高生産細胞を作製する方法が提供される。
（ａ）薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセット、遺伝子発現安定化エレメント、並びに目的タンパク質遺伝子発現カセットを有する発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程
（ｂ）形質転換された細胞を薬剤存在下で培養する工程
（ｃ）形質転換された細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下で培養する工程
（ｄ）高発現を示す細胞株を単離する工程。
【００７２】
本発明の側面の別の実施形態は、以下の工程を含む、高生産細胞を作製する方法である。
（ａ）薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセット、遺伝子発現安定化エレメント、並びに目的タンパク質遺伝子発現カセットを有する発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程
（ｂ）形質転換された細胞をヒポキサンチンおよびチミジン不含培地で培養する工程
（ｃ）形質転換された細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下で培養する工程
（ｄ）高発現を示す細胞株を単離する工程。
【００７３】
本発明の側面のさらなる別の実施形態は、以下の工程を含む、高生産細胞を作製する方法である。
（ａ）薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセット、遺伝子発現安定化エレメント、並びに目的タンパク質遺伝子発現カセットを有する発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程
（ｂ）形質転換された細胞を、ヒポキサンチンおよびチミジンを含まず、かつ薬剤存在下で培養する工程
（ｄ）形質転換された細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下で培養する工程
（ｅ）高発現を示す細胞株を単離する工程。
【００７４】
前記実施形態と同様、下記の工程を含む高生産細胞を作製する方法も提供される。
（ａ）薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列を含む発現カセット、遺伝子発現安定化エレメント、並びに目的タンパク質遺伝子発現カセットを有する発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程
（ｂ）形質転換された細胞を薬剤存在下で培養する工程
（ｃ）形質転換された細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下で培養する工程
（ｄ）高発現を示す細胞株を単離する工程。
【００７５】
（ａ）薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列を含む発現カセット、遺伝子発現安定化エレメント、並びに目的タンパク質遺伝子発現カセットを有する発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程
（ｂ）形質転換された細胞をヒポキサンチンおよびチミジン不含培地で培養する工程
（ｃ）形質転換された細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下で培養する工程
（ｄ）高発現を示す細胞株を単離する工程。
【００７６】
（ａ）薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列を含む発現カセット、遺伝子発現安定化エレメント、並びに目的タンパク質遺伝子発現カセットを有する発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程
（ｂ）形質転換された細胞を、ヒポキサンチンおよびチミジンを含まず、かつ薬剤存在下で培養する工程
（ｄ）形質転換された細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下で培養する工程
（ｅ）高発現を示す細胞株を単離する工程。
【００７７】
前記実施形態において、（ｃ）形質転換された細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下で培養する工程、及び（ｄ）高発現を示す細胞株を単離する工程は複数回繰り返すことができる。
【００７８】
宿主細胞としては、組換えタンパク質の産生に一般的に用いられるチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）の他、マウスミエローマ細胞（ＮＳＯ）、ベビーハムスターキドニー細胞（ＢＨＫ）、ヒト繊維肉腫細胞（ＨＴ１０８０）、ＣＯＳ細胞などの哺乳類由来の細胞が例示されるが、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）が好適に使用される。
【００７９】
宿主細胞がジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を欠損した細胞でなくても遺伝子増幅を含む本発明の効果を得ることができるが、ｄｈｆｒ遺伝子を有する発現ベクターにより形質転換された細胞のみが生き残れるようにするため、宿主細胞はｄｈｆｒ遺伝子欠損細胞を用いることが好ましい。ｄｈｆｒ遺伝子欠損細胞の具体例としては、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞やＣＨＯ ＤＵＫＸ−Ｂ１１細胞、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞などがある。
【００８０】
一般にバイオ医薬品などの工業生産には、ウイルスなどの有害成分の混入を排除するため、動物成分を含まない培地、より好ましくは化学的に組成の明らかな（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ）な培地で生産細胞を培養することが求められる。このため、一般的に使用されるウシ胎児血清などを含有した培地で高生産細胞をスクリーニングした後、１〜２ヶ月程度かけて動物成分非含有培地やＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄとされる培地へ細胞を適応させること（無血清馴化）が必要とされる。しかしながら、せっかく取得した高生産性細胞も上手く馴化できないケースもある。そこで、あらかじめ無血清馴化された細胞に遺伝子導入することは、無血清馴化工程を省略して生産細胞の樹立時間を短縮でき、非常に有効である。このような課題達成のため、本発明に用いられる宿主細胞には、ＣＨＯ細胞等における無血清馴化済み細胞を使用することがさらに例示される。
【００８１】
宿主細胞の形質転換方法は、当業者であれば適宜選択しうるが、例えばリポフェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション等が挙げられる。
【００８２】
形質転換された細胞を薬剤存在下で培養する工程において、薬剤選択に使用する薬剤は、薬剤選択マーカー遺伝子の種類に応じて決定される。また、使用する薬剤の濃度としては、一般に使用される濃度の範囲で高発現細胞の濃縮が可能であるが、少し高めの濃度が好ましい。最適な濃度は、宿主細胞や用いる培地の種類によって変化する。これらの濃度の設定方法は当業者にとっては公知であり、適宜設定しうる。例えば、１０％ウシ胎児血清を含むＩＭＤＭ培地での培養条件下で、ピューロマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列をこの順で含む発現カセットを有する発現ベクターで形質転換されたＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞に対するピューロマイシンの濃度としては、５μｇ／ｍｌ以上が好ましく、７．５μｇ／ｍｌ以上がより好ましく、上限として１５μｇ／ｍｌ以下が好ましい。同様に、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列をこの順で含む発現カセットを有する発現ベクターで形質転換されたＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞に対するピューロマイシンの濃度としては、５μｇ／ｍｌ以上が好ましく、７．５μｇ／ｍｌ以上がより好ましく、上限として１０μｇ／ｍｌ以下が好ましい。
【００８３】
本方法を使用した選別方法では、薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列を含む発現カセットを有する発現ベクターで形質転換した細胞の方が、薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含み、ｍＲＮＡ不安定化配列を含まない発現カセットを有する発現ベクターを形質転換して薬剤選択を行った細胞群に比べて、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する細胞の割合が有意に高くなる。本発明によれば、薬剤選択マーカーのｍＲＮＡ不安定化を含む薬剤選択のみによって、選別の候補となるサンプル数を大幅に絞ることができる。本発明の選別方法を用いれば、薬剤選択後も生存する細胞群（ポリクローン）の状態で目的タンパク質生産量が有意に上昇していて、これらの細胞群から細胞を単離し、培養することにより、容易に高発現を示す細胞株（モノクローン）を取得することができる。本発明の実施態様の一例として、４．０×１０５個の細胞に本発明の薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列を含む発現カセットが挿入されたベクターを遺伝子導入した後、薬剤選択を行って生じた細胞群から１００の細胞株をランダムに選択して、個々の細胞株の発現量を調べることにより目的タンパク質の高発現株を容易に取得することができる。
【００８４】
本発明の一部の実施形態において、形質転換された細胞をヒポキサンチンおよびチミジン（ＨＴ）不含培地中で培養する工程が含まれる。ｄｈｆｒ遺伝子欠損細胞は、細胞増殖のためにヒポキサンチンおよびチミジンを必要とし、培地にヒポキサンチンおよびチミジンを添加しなければ生育することができない。したがって、ヒポキサンチンおよびチミジン不含培地で培養することによって、ｄｈｆｒ遺伝子を含む発現ベクターにより形質転換が成功した細胞を選択することができる。ヒポキサンチンおよびチミジンの濃度は当業者であれば適宜設定しうる。
【００８５】
本発明は、形質転換された細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下で培養する工程を含む。ＭＴＸはＤＨＦＲの拮抗阻害剤であり、ＭＴＸ耐性を獲得しなければ細胞は生育することはできない。一般的に、動物細胞はｄｈｆｒ遺伝子の遺伝子増幅によりＭＴＸ耐性を獲得するが、その際にｄｈｆｒ遺伝子近傍に存在する他の遺伝子も同時に増幅されることを出願人らは利用している。ＭＴＸの濃度は１ｎＭ〜１０００ｎＭの間で使用することが望ましい。１ｎＭ未満であれば遺伝子増幅の効果が小さく、１０００ｎＭより高い濃度では細胞が死滅してしまう。ＭＴＸの存在下で培養する工程は、一定のＭＴＸの濃度下で培養しても良いし、まず低いＭＴＸ濃度で培養し、その後段階的に濃度を上昇させて培養しても良い。遺伝子増幅はすべての細胞に同時に起こるのではなく、一部の細胞でさまざまなタイミングで起こるため、ＭＴＸの濃度は低い濃度から段階的に上昇させることが好ましい。形質転換細胞を多段階のＭＴＸの濃度で培養する場合、宿主細胞をいきなり高濃度のＭＴＸにさらせば、遺伝子増幅が起こる前に死滅する細胞が多くなる。また、ＭＴＸの濃度を急激に上昇させれば、遺伝子増幅以外の機構でＭＴＸ耐性を獲得する細胞の出現頻度が高まる。
【００８６】
最適なＭＴＸ濃度および最適なＭＴＸ濃度を上昇させる方法は、細胞の種類、薬剤選択マーカー遺伝子の種類、薬剤選択マーカー遺伝子とジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子の配置、ｍＲＮＡ不安定化配列の有無により異なる。薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列を含む発現カセットを有する発現ベクターで宿主細胞を形質転換する場合、ＤＨＦＲの発現量はｍＲＮＡ不安定化配列により減弱されている。ＭＴＸ耐性も減弱されているため、ｍＲＮＡ不安定化配列を有さない薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセットを有する発現ベクターで形質転換された細胞に比べて低濃度のＭＴＸで遺伝子増幅の効果を得ることができる。一例として、ピューロマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列をこの順で含む発現カセットを有する発現ベクターで形質転換された細胞を培養する場合は、ＭＴＸ濃度は２０ｎＭ以下が好ましい。多段階のＭＴＸの濃度で培養する場合は、例えば１段階目は４ｎＭ、２段階目は１０ｎＭ、３段階目は２０ｎＭで培養することができる。
【００８７】
ＭＴＸ存在下で培養する工程は、形質転換細胞を薬剤存在下で培養する工程を行った後に行うことが好ましい。薬剤選択により、細胞の高発現領域に遺伝子導入された細胞群を取得することができるため、薬剤存在下で培養する工程の後に本工程をおこなうことにより、遺伝子増幅が高発現領域内で起こることになり、より効率的に遺伝子発現することを期待できるからである。
【００８８】
高生産を示す細胞株を単離する工程は、まず細胞群（ポリクローン）から細胞株を取得し、次いで細胞株の発現レベルを調べ、高生産を示す細胞株を選択することにより行われる。細胞群（ポリクローン）から細胞株を取得する方法としては、ポリクローンを限界希釈する方法がある。限界希釈は、例えばポリクローンの状態の細胞集団にトリプシン処理を行って細胞を分散し、細胞数が１．０／ウェル以下の濃度となるよう９６ウェルプレートに細胞を播種し培養することにより行うことができる。必要に応じて、希釈濃度を変更したり（例えば３．０細胞／ウェル以下の濃度など）、Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ Ｍｅｄｉｕｍと通常の培地を混合した培地で培養したりすることが当業者間では行われる。
【００８９】
細胞の発現レベルはレポーター遺伝子の発現量により調べることができる。一例として、ＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子（Ｃｏｖａｌｙｓ社）やＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子等の蛍光タンパク質遺伝子を含む発現カセットを本発明の発現ベクターに導入し、ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）等のフローサイトメーターを用いて蛍光強度を解析することにより調べることができる。別の例として、ルシフェラーゼ遺伝子を含む発現カセットを本発明による発現ベクターに導入後、細胞溶解液にＤ−ルシフェリンを添加してルミノメーターで発光量を測定することにより調べることができる。また、レポーター遺伝子に限らず、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）等を利用することで抗体等の目的タンパク質の発現を調べることもできる。
【００９０】
本工程は、形質転換された細胞を薬剤存在下で培養する工程の後、もしくは形質転換された細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下で培養する工程の後、または両工程の後のどの段階で行ってもよい。
【００９１】
本発明の第四の側面における高生産細胞を作製する方法をより具体的に例示する。
【００９２】
第一の例は、以下の手順で行う。（１）目的タンパク質遺伝子を挿入した本発明による発現ベクターをｄｈｆｒ遺伝子欠損宿主細胞にトランスフェクションする。（２）形質転換された細胞を薬剤（例えば、ジェネティシン）存在下で培養する。（３）高発現を示すポリクローン（細胞群）を選択し、ＭＴＸ存在下で培養する。（４）ＭＴＸ存在下で培養後さらに高発現を示すポリクローンを選択し、モノクローン（細胞株）に単離する。（５）それぞれの細胞株の発現量を調べ、高発現を示す細胞株を選択する。
【００９３】
第二の例は、以下の手順で行う。（１）目的タンパク質遺伝子を挿入した本発明による発現ベクターをｄｈｆｒ遺伝子欠損宿主細胞にトランスフェクションする。（２）形質転換された細胞を薬剤（例えば、ジェネティシン）存在下で培養する。（３）高い発現レベルを示すポリクローンを選択し、モノクローンに単離する。（４）それぞれの細胞株の発現量を調べ、高発現を示す細胞株を選択し、ＭＴＸ存在下で培養する。（５）ＭＴＸで選択培養後の細胞集団を再度限界希釈して細胞株を単離し、一定期間培養する。（６）（５）で単離された細胞株の発現量を調べ、高発現を示す細胞株を選択する。
【００９４】
第三の例は、以下の手順で行う。（１）目的タンパク質遺伝子を挿入した本発明による発現ベクターをｄｈｆｒ遺伝子欠損宿主細胞にトランスフェクションする。（２）形質転換された細胞をヒポキサンチンおよびチミジン（ＨＴ）不含培地で培養する。（３）ＨＴ不含条件下で高発現を示すポリクローンを選択し、ＭＴＸ存在下で培養する。（４）ＭＴＸ存在下で培養後さらに高発現を示すポリクローンを選択し、モノクローンに単離する。（５）それぞれのモノクローンの発現量を調べ、高発現を示す細胞株を選択する。
【００９５】
第四の例は、以下の手順で行う。（１）目的タンパク質遺伝子を挿入した本発明による発現ベクターをｄｈｆｒ遺伝子欠損宿主細胞にトランスフェクションする。（２）形質転換された細胞を、ヒポキサンチンおよびチミジン（ＨＴ）を含まない培地で、薬剤（例えば、ジェネティシン）存在下で培養する。（３）高発現を示すポリクローンを選択し、ＭＴＸ存在下で培養する。（４）ＭＴＸ存在下で培養後さらに高発現を示すポリクローンを選択し、モノクローンに単離する。（５）それぞれの細胞株の発現量を調べ、高発現を示す細胞株を選択する。
【００９６】
第五の例は、以下の手順で行う。（１）目的タンパク質遺伝子を挿入した本発明による発現ベクターをｄｈｆｒ遺伝子欠損宿主細胞にトランスフェクションする。（２）形質転換された細胞を、ヒポキサンチンおよびチミジン（ＨＴ）を含まない培地で、薬剤（例えば、ジェネティシン）存在下で培養する。（３）高発現を示すポリクローンを選択し、モノクローンに単離する。（４）高発現を示す細胞株を選択し、ＭＴＸ存在下で培養する。（５）ＭＴＸで選択培養後の細胞集団を再度限界希釈して細胞株を単離し、一定期間培養する。（６）（５）で単離された細胞株の発現量を調べ、高発現を示す細胞株を選択する。
【００９７】
第六の例は、以下の手順で行う。（１）目的タンパク質遺伝子を挿入した本発明による発現ベクターをｄｈｆｒ遺伝子欠損宿主細胞にトランスフェクションする。（２）形質転換された細胞を、ヒポキサンチンおよびチミジン（ＨＴ）を含まない培地で、薬剤（例えば、ジェネティシン）存在下で培養する。（３）高発現を示すポリクローンを選択し、モノクローンに単離する。（４）高発現を示す細胞株を選択し、ＭＴＸ存在下で培養する。（５）ＭＴＸで選択培養後の細胞集団を再度限界希釈して細胞株を単離し、一定期間培養する。（６）（５）で単離された細胞株の発現量を調べ、高発現を示す細胞株を選択する。（７）再度ＭＴＸ存在下で一定期間培養する。（８）（７）で単離された細胞株の発現量を調べ、高発現を示す細胞株を選択する。
【００９８】
本発明により、細胞選別の工程及び時間を大幅に短縮することができると共に、高発現を示す細胞の割合が上昇することにより、短時間で効率的に目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する細胞を取得することができ、従来技術と比べて極めて顕著な効果を示す。
【００９９】
本発明の第五の側面は、本発明の第四の側面における方法により得られた形質転換細胞である。
【０１００】
本発明の第六の側面によれば、本発明の第四の側面における方法により得られた形質転換細胞を用いることを特徴とする、タンパク質を生産する方法が提供される。
【０１０１】
一つの実施態様では、生産されるタンパク質は、抗体である。この場合、抗体の重鎖ポリペプチド遺伝子と軽鎖ポリペプチド遺伝子は同一のベクター（シングルベクター）に挿入されていても良いし、それぞれ異なるベクターに挿入されて２コンストラクトとされていても良い。
【０１０２】
哺乳類の抗体には、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥの５種類のクラスが存在することが明らかとなっているが、ヒトの各種疾患の診断、予防及び治療には血中半減期が長く、各種エフェクター機能を有する等の機能特性からヒトＩｇＧクラスの抗体が主として利用されている。抗体は、形質転換細胞の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる。また、その他に通常、タンパク質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、二次元電気泳動等により測定することができる。
【０１０３】
本発明の方法により生産された抗体は、医薬として使用することができる。かかる医薬は、治療薬として単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野にて公知の任意の方法により製造した医薬製剤として提供されるのが好ましい。
【０１０４】
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができ、抗体製剤の場合、好ましくは静脈内投与をあげることができる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
【０１０５】
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
【０１０６】
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。または、ヒト化抗体を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を調製することもできる。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該化合物そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該化合物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。
【０１０７】
担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該化合物および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
【０１０８】
別の実施態様では、生産されるタンパク質は、ワクチンである。
【０１０９】
ワクチンとしては、病原体のエピトープのアミノ酸配列からなるタンパク質をワクチンとして使用することができる。また、ウイルス体の構成タンパク質すべてを生産するのみならず、エンベロープタンパク等を生産し、ワクチンとして使用することができる。
【０１１０】
ワクチンは任意の経路の投与のための製剤とすることができる。粘膜型投与、例えば、経口経路、経鼻経路、経気道経路、経膣経路、経直腸経路の他、非粘膜経路による投与、例えば皮下、静脈内もしくは筋肉内投与のためのワクチン製剤が挙げられる。
【実施例】
【０１１１】
以下、実施例を例示することによって、本発明の効果をより一層明確なものとする。
【０１１２】
実施例１
各種プラスミドベクターの構築
実施例１−１
ｍＲＮＡ不安定化配列を有するベクター
（１）ｐＰＵＲ・Ｎ４の構築
図１に示すスキームに従って、ｐＰＵＲ（クロンテック社製）のＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子のコード配列の３‘末端に、配列番号１、２のプライマーとＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（東洋紡績社製）を用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、ＡＲＥ配列モチーフＴＴＡＴＴＴＡＴＴの４回繰り返し配列（以下、「Ｎ４」と言う。）を挿入してｐＰＵＲ・Ｎ４を構築した。
【０１１３】
（２）ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２の構築
次に、目的遺伝子発現カセットのプロモーターをＥＦ１αプロモーターに置換したプラスミドを構築した。本実験では、図２に示すスキームに従って構築されたプラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２を利用した。即ち、まず、ＣＭＶプロモーターをＥＦ−１αプロモーターに置換したｐＣＩ−ｎｅｏプラスミド（プロメガ社製）の制限酵素ＸｂａＩ−ＮｏｔＩサイトに抗ＫＯＤ抗体の重鎖を挿入したプラスミドのｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号３、４のプライマーを使って発現カセット上流に制限酵素ＳａｌＩおよびＮｈｅＩサイトを付加したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥを構築した。更に本プラスミドを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号５、６のプライマーを使って発現カセット下流に制限酵素ＢｓｉＷＩおよびＸｈｏＩサイトを付加して構築されたプラスミドがｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２である。
【０１１４】
このｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２を用いて、図３に示すスキームに従って、プラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４およびｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２を構築した。即ち、プラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２から制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩで抗ＫＯＤ抗体の重鎖遺伝子を切出した。一方、ＳＮＡＰｍ発現プラスミドｐＳＮＡＰｍからＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子を配列番号７、８のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２プラスミドの制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩサイトに導入してｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２を構築した。本プラスミドから制限酵素ＡｆｌＩＩ、ＢｓｔＢＩでネオマイシン耐性遺伝子を切出した。一方、前記（１）で構築したｐＰＵＲ・Ｎ４から下流にＮ４配列を付加したＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子を配列番号９，１０のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−ＲＥ２プラスミドの制限酵素ＡｆｌＩＩ、ＢｓｔＢＩサイトに導入してｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４を構築した。続いて、本プラスミドを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号１１、１２のプライマーを使ってＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子下流のＮ４配列を削除したプラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２を構築した。
【０１１５】
実施例１−２
ｍＲＮＡ不安定化配列と遺伝子発現安定化エレメントとを有するベクター
（１）ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの構築
本実験では図４に記載のｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ／１．１ｋを利用した。即ち、まず、実施例１−１の途中で構築されたｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２の発現カセット上流の制限酵素ＮｈｅＩ、ＢｇｌＩＩサイトに、配列番号１３、１４のプライマーセットを使ってＰＣＲで増幅した被検配列ＣＨＯ５Δ３−３（配列番号１５の４１６０１番目〜４２７００番目からなる塩基配列。以下、コンストラクト中では１．１ｋと表記）を挿入して、プラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋを構築した。更にプラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋの発現カセット下流の制限酵素ＢｓｉＷＩ、ＸｈｏＩサイトに配列番号１６、１７のプライマーセットを使ってＰＣＲで増幅した被検配列ＣＨＯ５Δ３−３を挿入して構築されたプラスミドがｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ／１．１ｋである。
【０１１６】
一方、実施例１−１で構築したプラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４およびｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２を鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号１８、１９のプライマーを使ってＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子内に存在する制限酵素ＢｓｉＷＩサイトを削除したプラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ４およびｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２−ＲＥ２を構築した。
【０１１７】
続いて、図５に示すスキームに従って、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。即ち、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ４、から制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢｓｉＷＩで、ＳＮＡＰｍ−ｐＡ−ＳＶ４０Ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ｐｕｒ２・Ｎ４−ｐＡを切出し、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ／１．１ｋの制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢｓｉＷＩサイトに導入してｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。
【０１１８】
実施例１−３
発現ベクターにおける各配列要素から制限酵素認識配列を削除したベクター
（１）遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３からの制限酵素認識配列の削除
続いて、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３から制限酵素認識配列を削除した。まず、実施例１−２に記載のｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号２２、２３のプライマーを使ってＣＨＯ５Δ３−３内に存在する制限酵素ＳａｃＩサイトを削除したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥを構築した。次に、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号２４、２５のプライマーを使ってＣＨＯ５Δ３−３内に存在する制限酵素ＳｍａＩサイトを削除したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ２を構築した。更に、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ２を鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号２６、２７のプライマーを使ってＣＨＯ５Δ３−３内に存在する制限酵素ＢａｍＨＩサイトを削除したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ３を構築した。最後に、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ３を鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号２８、２９のプライマーを使ってＣＨＯ５Δ３−３内に存在する制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイトを削除したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ４を構築した。
【０１１９】
（２）ｐＥＨＸの構築
マルチクローニングサイトと、上記実施例１−３（１）で作成した４箇所の制限酵素認識配列を削除した遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセット上流および下流に配する図６に記載のｐＥＨＸを構築した。具体的には、実施例１−２に記載のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ４を鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号３０、３１のプライマーを使ってＳＶ４０ ｐｒｏｍｏｔｅｒ下流に存在する制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイトを削除したｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ４−ΔＨを構築した。続いて、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ４−ΔＨを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号３２、３３のプライマーを使ってＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子内に存在する制限酵素ＳａｌＩサイトを削除したｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ３・Ｎ４−ΔＨを構築した。更に、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ３・Ｎ４−ΔＨを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号３４、３５のプライマーを使ってＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子内に存在する制限酵素ＳｍａＩサイトを削除したｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨを構築した。その後、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号３６、３７のプライマーを使ってｆ１ ｏｒｉを削除したｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１を構築した。次に、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１を鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号３８、３９のプライマーを使って制限酵素ＮｈｅＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩサイトを挿入したｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１−ＲＥを構築した。続いて、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１−ＲＥを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号４０、４１のプライマーを使って制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢｓｉＷＩ、ＸｂａＩ、ＢｃｌＩサイトを挿入したｐＥＦ１α−ＭＣＳｐｒｅ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１−ＲＥを構築した。そして、ｐＥＦ１α−ＭＣＳｐｒｅ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１−ＲＥのＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩサイトに、配列番号４２、４３のプライマーを混合後、９５度から６０度まで徐々に温度を下げアニールさせて作成したＤＮＡ断片を挿入し、ｐＥＦ１α−ＭＣＳ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１−ＲＥを構築した。次に、ｐＥＦ１α−ＭＣＳ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１−ＲＥのＮｈｅＩ、ＥｃｏＲＩサイトに、配列番号４４、４５のプライマーセットを使ってｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ４を鋳型にＰＣＲで増幅した、４箇所の制限酵素認識配列を削除したＣＨＯ５Δ３−３を挿入し、ｐＥＦ１α−ＭＣＳ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−１．１ｋを構築した。更に、ｐＥＦ１α−ＭＣＳ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−１．１ｋのＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩサイトに、配列番号１６、４６のプライマーセットを使ってｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ４を鋳型にＰＣＲで増幅した、４箇所の制限酵素認識配列を削除したＣＨＯ５Δ３−３を挿入し、ｐＥＨＸを構築した。
【０１２０】
実施例１−４
抗体遺伝子を挿入した、各配列要素から制限酵素認識配列を削除したベクター
【０１２１】
（１）ｐＥＬＸの構築
マルチクローニングサイトを含む図７に記載のｐＥＬＸを構築した。
【０１２２】
具体的には、ＣＭＶプロモーターをＥＦ１αプロモーターに変更したｐＣＩ−ｎｅｏプラスミド（プロメガ社製）の制限酵素ＸｂａＩ−ＮｏｔＩサイトに抗ＫＯＤ抗体の軽鎖を挿入したプラスミドのｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号３、４のプライマーを使って発現カセット上流に制限酵素ＳａｌＩおよびＮｈｅＩサイトを付加したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥを構築した。更に本プラスミドを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号５、６のプライマーを使って発現カセット下流に制限酵素ＢｓｉＷＩおよびＸｈｏＩサイトを付加して、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥ２プラスミドを構築した。このｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥ２をＡｆｌＩＩ、ＢｓｔＢＩで処理し、ネオマイシン耐性遺伝子を切出した。一方、ｐＴＫ−Ｈｙｇ（クロンテック社製）からハイグロマイシン耐性遺伝子を配列番号４７、４８のプライマーを使ってＰＣＲで増幅し、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥ２の制限酵素ＡｆｌＩＩ、ＢｓｔＢＩサイトに導入してｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ２を構築した。
【０１２３】
ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ２を鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号４９、５０のプライマーを使って制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＳａｌＩサイトを挿入したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ３を構築した。続いて、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ３を鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号５１、５２のプライマーを使って、ｆ１ ｏｒｉとハイグロマイシン耐性遺伝子の発現カセットを削除し、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩサイトを挿入したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥ４を構築した。その後、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥ４を鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号４０、４１のプライマーを使って制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢｓｉＷＩ、ＸｂａＩ、ＢｃｌＩサイトを挿入したｐＥＦ１α−ＭＣＳｐｒｅ−ＲＥ４を構築した。そして、ｐＥＦ１α−ＭＣＳｐｒｅ−ＲＥ４の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩサイトに、配列番号４２、４３のプライマーを混合後、９５度から６０度まで徐々に温度を下げアニールさせて作成したＤＮＡ断片を挿入し、ｐＥＬＸを構築した。
【０１２４】
（２）ｐＥＬＸ２の構築
実施例１−４（１）で構築したｐＥＬＸの発現カセット下流に、４箇所の制限酵素認識配列を削除した遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を配した、図８に記載のｐＥＬＸ２を構築した。具体的には、実施例１−４（１）で構築したｐＥＬＸを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号５１、５３のプライマーを使って発現カセット下流に制限酵素ＮｈｅＩサイトを追加したｐＥＬＸ−Ｎを構築した。そして、ｐＥＬＸ−ＮのＮｈｅＩ、ＥｃｏＲＩサイトに、配列番号１３、５４のプライマーセットを使って、実施例１−３で構築したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ４を鋳型にＰＣＲで増幅した、４箇所の制限酵素認識配列を削除したＣＨＯ５Δ３−３を挿入し、ｐＥＬＸ２を構築した。
【０１２５】
（３）ｐＥＬ２（ＫＯＤ３Ｇ８）の構築
ｐＥＬＸ２の制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩサイトに、抗ＫＯＤ抗体の軽鎖遺伝子を挿入しｐＥＬ２（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。具体的には、実施例１−４（１）に記載のｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣから配列番号２０，２１のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩで処理して調製した抗ＫＯＤ抗体の軽鎖遺伝子を、ｐＥＬＸ２の制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩサイトに導入して、ｐＥＬ２（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。
【０１２６】
実施例２
抗ＫＯＤ抗体発現系における、ピューロマイシン耐性遺伝子とｄｈｆｒ遺伝子の融合タンパク質遺伝子とmRNA不安定化配列の組み合わせ効果の検討
続いて、ｄｈｆｒ遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子とｄｈｆｒ遺伝子の融合タンパク質遺伝子、および、ピューロマイシン耐性遺伝子とｄｈｆｒ遺伝子の融合タンパク質遺伝子の下流にmRNA不安定化配列を付加したもの、それぞれの効果を比較検討するため、抗ＫＯＤ抗体発現系においてピューロマイシンで選択して取得したモノクローンの細胞を、更にＭＴＸで選択して得られたポリクローンの細胞の生産性を評価した。
実施例２−１
ｄｈｆｒ遺伝子を有する発現ベクターの構築
（１）ｐＥＨＸ−ｄｈｆｒ・Ｎ４の構築
実施例１−３で構築したｐＥＨＸへｄｈｆｒ遺伝子の発現カセットを挿入した、図９に記載のｐＥＨＸ−ｄｈｆｒ・Ｎ４を構築した。具体的には、ｐＥＨＸのＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩサイトに、配列番号５５、５６のプライマーセットを使ってｐＥＨＸを鋳型にＰＣＲで増幅し、制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＸｈｏＩで処理して調製したＳＶ４０ ｐｒｏｍｏｔｅｒを挿入し、ｐＥＨＸ−ｐを構築した。続いて、ｐＥＨＸ−ｐのＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩサイトに、配列番号５７、５８のプライマーセットを使って実施例１−３に記載のｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ４を鋳型にＰＣＲで増幅し、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩで処理して調製した、４箇所の制限酵素認識配列を削除したＣＨＯ５Δ３−３を挿入し、ｐＥＨＸ−ｐ２を構築した。次に、ｐＥＨＸ−ｐ２のＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩサイトに、配列番号５９、６０のプライマーセットを使ってｐＥＨＸを鋳型にＰＣＲで増幅し、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩで処理して調製したＳＶ４０ ｐＡを挿入し、ｐＥＨＸ−ｐ３を構築した。一方、ｄｈｆｒ遺伝子の３’末端にタンパク質分解促進配列のＰＥＳＴ配列を付加した配列番号６１のＤＮＡを人工合成して、プラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社製）にＴＯＰＯ ＴＡクローニングし、ｐＣＲ２．１−ｄｈｆｒ・ＰＥＳＴを構築した。続いて、ｐＣＲ２．１−ｄｈｆｒ・ＰＥＳＴを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号６２、６３のプライマーを使って、ｄｈｆｒ遺伝子の３’末端からＰＥＳＴ配列を削除しＮ４配列を付加したｐＣＲ２．１−ｄｈｆｒ・Ｎ４を構築した。そして、ｐＥＨＸ−ｐ３のＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩサイトに、配列番号６４、６５のプライマーセットを使ってｐＣＲ２．１−ｄｈｆｒ・Ｎ４を鋳型にＰＣＲで増幅し、制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＳａｌＩで処理して調製したＤＮＡ断片を挿入し、ｐＥＨＸ−ｄｈｆｒ・Ｎ４を構築した。
【０１２７】
（２）ピューロマイシン耐性遺伝子（上流）とｄｈｆｒ遺伝子（下流）の融合タンパク質遺伝子を有する発現ベクター：ｐＥＨＸ−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ、ｐＥＨＸ−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４の構築
図１０に示すスキームに従って、実施例１−３で構築したｐＥＨＸ中の、Ｎ４配列を下流に付加したピューロマイシン耐性遺伝子の代わりに、ピューロマイシン耐性遺伝子とｄｈｆｒ遺伝子の融合タンパク質遺伝子、あるいは、Ｎ４配列を下流に付加したピューロマイシン耐性遺伝子とｄｈｆｒ遺伝子の融合タンパク質遺伝子を挿入した、ｐＥＨＸ−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ、および、ｐＥＨＸ−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４を構築した。具体的には、まず、配列番号３６、６６のプライマーセットを使ってｐＥＨＸを鋳型にＰＣＲで増幅したＳＶ４０ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ピューロマイシン耐性遺伝子から成るＤＮＡ断片と、配列番号６７、６８、あるいは、配列番号６７、６９のプライマーセットを使ってｐＣＲ２．１−ｄｈｆｒ・Ｎ４を鋳型にＰＣＲで増幅したｄｈｆｒ遺伝子、あるいは、ｄｈｆｒ遺伝子、Ｎ４配列から成るＤＮＡ断片を、ｏｖｅｒｌａｐ−ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲによりアセンブリし、配列番号３６、６８、あるいは、配列番号３６、６９のプライマーセットを使って、ＳＶ４０ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ピューロマイシン耐性遺伝子、ｄｈｆｒ遺伝子から成るＤＮＡ断片、あるいは、ＳＶ４０ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ピューロマイシン耐性遺伝子、ｄｈｆｒ遺伝子、Ｎ４配列から成るＤＮＡ断片を調製した。これらのＤＮＡ断片をＫｐｎＩ、Ｃｓｐ４５Ｉで消化し、ｐＥＨＸのＫｐｎＩ、Ｃｓｐ４５Ｉサイトに挿入し、ｐＥＨＸ−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ、および、ｐＥＨＸ−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４を構築した。
【０１２８】
（３）抗ＫＯＤ抗体発現ベクター：ｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）、ｐＥＬＨ２−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ（ＫＯＤ３Ｇ８）、ｐＥＬＨ２−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）の構築
続いて、抗ＫＯＤ抗体発現系で遺伝子増幅の効果を確認すべく、ｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）、ｐＥＬＨ２−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ（ＫＯＤ３Ｇ８）、および、ｐＥＬＨ２−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。
【０１２９】
まず、ｐＥＨＸ−ｄｈｆｒ・Ｎ４、ｐＥＨＸ−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ、および、ｐＥＨＸ−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４の制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩサイトに、それぞれ抗ＫＯＤ抗体の重鎖遺伝子を挿入し、ｐＥＨ−ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）、ｐＥＨ−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ（ＫＯＤ３Ｇ８）、および、ｐＥＨ−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。具体的には、実施例１−１に記載のｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣから配列番号２０，２１のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩで処理して調製した抗ＫＯＤ抗体の重鎖遺伝子を、ｐＥＨＸ−ｄｈｆｒ・Ｎ４、ｐＥＨＸ−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ、および、ｐＥＨＸ−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４の制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩサイトに導入して、ｐＥＨ−ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）、ｐＥＨ−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ（ＫＯＤ３Ｇ８）、および、ｐＥＨ−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。
【０１３０】
そして、図１１に示すスキームに従って、実施例１−４に記載のｐＥＬ２（ＫＯＤ３Ｇ８）をＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｃａＩで処理して調製した抗ＫＯＤ抗体の軽鎖発現カセットを、ｐＥＨ−ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）の制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩサイトに挿入し、ｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。同様にして、図１２に示すスキームに従って、ｐＥＬ２（ＫＯＤ３Ｇ８）をＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｃａＩで処理して調製した抗ＫＯＤ抗体の軽鎖発現カセットを、ｐＥＨ−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ（ＫＯＤ３Ｇ８）、および、ｐＥＨ−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）の制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩサイトに挿入し、ｐＥＬＨ２−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ（ＫＯＤ３Ｇ８）、ｐＥＬＨ２−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。
【０１３１】
実施例２−２
抗ＫＯＤ抗体発現系においてピューロマイシンで選択して取得したポリクローンの細胞の生産性評価
【０１３２】
ｄｈｆｒ欠損株のＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−９０９６）を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整し、１２ウェルプレートに２ｍｌずつ前日に播種し、一晩培養して、トランスフェクション用のＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞を準備した。この際、培地として１０％牛胎児血清、４ｍＭ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ナカライ社製）、１ｘＨＴサプリメント（インビトロジェン社製）を添加したＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（シグマ社製）を使用した。
【０１３３】
一方、実施例２−１で構築した抗ＫＯＤ抗体発現ベクターを制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした。トランスフェクションは、リニア化したプラスミド１．６μｇを２００μｌ Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍで希釈した後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ（インビトロジェン社製）４μｌを加え、３０分間放置した後、この混合液を前記ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞に加え、２４時間インキュベートすることにより行った。トランスフェクションの１日後、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、１０μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、１０％牛胎児血清、４ｍＭ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを添加したＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ中で２週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、１ウェル当たり１．８４×１０５細胞を６ウェルプレートに播き込んだ。
【０１３４】
３日間培養後、培養上清を回収し、ピューロマイシンで選択して取得したポリクローンの細胞でのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量をＥＬＩＳＡにて測定した。標準品から作成した検量線をもとに抗体濃度を算出した。
【０１３５】
具体的には、３０μｇ／ｍｌ濃度のＫＯＤ１由来のＤＮＡポリメラーゼ抗原を固相化したＥＬＩＳＡプレートに、培養上清を添加し、３５℃で２時間インキュベートした。次に、ＰＢＳ−Ｔ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝生理食塩水）で３回洗浄し、１００００倍希釈した抗マウス抗体−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ社製）を５０μｌ添加して３５℃で１時間インキュベートした後、さらにＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＴＭＢ＋（３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ；ＤＡＫＯ社製）で５分間反応させた。５０μｌの１Ｎ硫酸を加えて反応停止後、プレートリーダー（製品名 ；ＳＰＥＣＴＲＡ ＣＬＡＳＳＩＣ、ＴＥＣＡＮ Ａｕｃｔｒｉａ社製）（主波長４５０ｎｍ、副波長６２０ｎｍ）で吸光度を測定した。なお、標準品として、ＫＯＤ１由来のＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体を産生するマウスハイブリドーマ細胞系３Ｇ８（入手先：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６０５６）から得られた抗体を用いた。
【０１３６】
結果を図１３に示す。その結果、ピューロマイシン耐性遺伝子、ｄｈｆｒ遺伝子の両方の発現カセットを含むｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）では、ピューロマイシン耐性遺伝子にｍＲＮＡ不安定化配列を付加しているにも関わらず、発現量は低かった。発現量が低い原因として、４つの発現カセットを１つのコンストラクトにコードさせたことによる転写干渉が考えられた。一方、ピューロマイシン耐性遺伝子とｄｈｆｒ遺伝子の融合タンパク質遺伝子を採用したｐＥＬＨ２−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ（ＫＯＤ３Ｇ８）では、発現カセットを３つに減らすことができ、ｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）と比較すると発現量は高い値となった。さらに、ピューロマイシン耐性遺伝子とｄｈｆｒ遺伝子の融合タンパク質遺伝子にｍＲＮＡ不安定化配列を付加して弱化させたｐＥＬＨ２−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）では、ポリクローンでの発現量は極めて高く、ｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）の約１．９倍、ｐＥＬＨ２−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ（ＫＯＤ３Ｇ８）の約１．５倍の生産量を示すことがわかった。
【０１３７】
実施例２−３
抗ＫＯＤ抗体発現系においてピューロマイシンで選択して取得したモノクローンの細胞の生産性評価
【０１３８】
続いて、モノクローンでの生産性を比較すべく、限界希釈を行った。具体的には、前記実施例２−２で取得したＫＯＤ３Ｇ８抗体を安定導入したポリクローンの細胞を、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、０．７５細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに播き込んだ。２週間培養後、培養上清を回収し、ＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を前記実施例２−２と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。標準品から作成した検量線をもとに各クローンの抗体生産量を算出した。そして、選択した発現量上位クローンを拡大培養した後、１ウェル当たり１．８４×１０５細胞を６ウェルプレートに播き込んだ。３日間培養後、培養上清を回収し、ピューロマイシンで選択して取得したモノクローンの細胞でのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を前記実施例２−２と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。
【０１３９】
標準品から作成した検量線をもとに各クローンの抗体生産量を算出した。結果を図１４に示す。その結果、ポリクローンでの結果と同様、ピューロマイシン耐性遺伝子、ｄｈｆｒ遺伝子の両方の発現カセットを含むｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）では最大６ｍｇ／Ｌであったが、ピューロマイシン耐性遺伝子とｄｈｆｒ遺伝子の融合タンパク質遺伝子を採用したｐＥＬＨ２−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ（ＫＯＤ３Ｇ８）では、最大１０ｍｇ／Ｌであった。一方、ピューロマイシン耐性遺伝子とｄｈｆｒ遺伝子の融合タンパク質遺伝子にｍＲＮＡ不安定化配列を付加して弱化させたｐＥＬＨ２−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）では、発現量がさらに顕著に高く、その値は最大で１８ｍｇ／Ｌに達した。
【０１４０】
実施例２−４
抗ＫＯＤ抗体発現系においてピューロマイシンで選択して取得したモノクローンの細胞を、更にＭＴＸで選択して取得したポリクローンの細胞の生産性評価
【０１４１】
次に、前記実施例２−３で取得した、各々の抗ＫＯＤ抗体発現ベクターを遺伝子導入し、ピューロマイシンで選択して取得した発現量上位１０クローンずつについて、１０μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、透析した１０％牛胎児血清、４ｍＭ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを添加したＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ中で２週間継代培養した。その後、更に、１０ｎＭ ＭＴＸ（シグマ社製）、１０μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、透析した１０％牛胎児血清、４ｍＭ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを添加したＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ中で６週間選択培養を行った。
【０１４２】
選択培養終了後、得られたポリクローンの細胞を２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、１ウェル当たり１．８４×１０５細胞を６ウェルプレートに播き込んだ。３日間培養後、培養上清を回収し、ＭＴＸで選択して取得したポリクローンの細胞でのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を、前記実施例２−２と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。
【０１４３】
標準品から作成した検量線をもとに抗体濃度を算出した。結果を図１５に示す。その結果、ｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）では、ＭＴＸでの選択により２倍程度の発現量の上昇が見られたが、最も生産性の高いものでも１１ｍｇ／Ｌであった。一方、ｐＥＬＨ２−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ（ＫＯＤ３Ｇ８）では、最も生産性の高いものでも１２ｍｇ／Ｌであった。原因としては、ｄｈｆｒ遺伝子が弱化されていないため、ＭＴＸ選択による発現量の上昇はあまり見られなかったと考えられる。他方、ピューロマイシンで選択した時点で発現量の高いクローンを取得できていたｐＥＬＨ２−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）では、ＭＴＸでの選択により２倍程度の発現量の上昇が見られ、最も生産性の高いものは４５ｍｇ／Ｌであった。ピューロマイシン耐性遺伝子とｄｈｆｒ遺伝子を融合させて選択遺伝子とし、更にその3‘末端にｍＲＮＡ不安定化配列を付加して弱化させた発現カセットを使用することで、相乗効果によって効果的に発現量の上昇が可能であった。
【０１４４】
実施例３
ｄｈｆｒ遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子の配置順序の検討
続いて、ｄｈｆｒ遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子の配置順序を検討するため、上流側にｄｈｆｒ遺伝子を配置し下流側にピューロマイシン耐性遺伝子を配置した融合タンパク質遺伝子を有する発現ベクターを構築し、抗ＫＯＤ抗体発現系においてピューロマイシンで選択して取得したモノクローンの細胞を、更にＭＴＸで選択して得られたポリクローンの細胞の生産性を評価した。
実施例３−１
ｄｈｆｒ遺伝子を有する発現ベクターの構築
（１）ｄｈｆｒ遺伝子（上流）とピューロマイシン耐性遺伝子（下流）の融合タンパク質遺伝子を有する発現ベクター：ｐＥＨＸ−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４の構築
図１６に示すスキームに従って、実施例１−３で構築したｐＥＨＸ中の、Ｎ４配列を下流に付加したピューロマイシン耐性遺伝子の代わりに、Ｎ４配列を下流に付加したｄｈｆｒ遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子の融合タンパク質遺伝子を挿入したｐＥＨＸ−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４を構築した。具体的には、まず、配列番号１１、７０のプライマーセットを使ってｐＥＨＸ−ｄｈｆｒ・Ｎ４を鋳型にＰＣＲで増幅したＳＶ４０ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｄｈｆｒ遺伝子から成るＤＮＡ断片と、配列番号６９、７１のプライマーセットを使ってｐＥＨＸを鋳型にＰＣＲで増幅したＮ４配列を下流に付加したピューロマイシン耐性遺伝子を、ｏｖｅｒｌａｐ−ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲによりアセンブリ、配列番号１１、６９のプライマーセットを使って、ＳＶ４０ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｄｈｆｒ遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、Ｎ４配列から成るＤＮＡ断片を調製した。このＤＮＡ断片をＫｐｎＩ、Ｃｓｐ４５Ｉで消化し、ｐＥＨＸのＫｐｎＩ、Ｃｓｐ４５Ｉサイトに挿入し、ｐＥＨＸ−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４を構築した。
【０１４５】
（２）抗ＫＯＤ抗体発現ベクター：ｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）の構築
続いて、抗ＫＯＤ抗体発現系で遺伝子増幅の効果を確認すべく、ｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。
【０１４６】
まず、ｐＥＨＸ−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４の制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩサイトに抗ＫＯＤ抗体の重鎖遺伝子を挿入し、ｐＥＨ−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。具体的には、実施例１−１に記載のｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣから配列番号２０，２１のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩで処理して調製した抗ＫＯＤ抗体の重鎖遺伝子を、ｐＥＨＸ−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４の制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩサイトに導入して、ｐＥＨ−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。
【０１４７】
そして、図１７に示すスキームに従って、実施例１−４に記載のｐＥＬ２（ＫＯＤ３Ｇ８）をＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｃａＩで処理して調製した抗ＫＯＤ抗体の軽鎖発現カセットを、ｐＥＨ−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）の制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩサイトに挿入し、ｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。
【０１４８】
実施例３−２
抗ＫＯＤ抗体発現系においてピューロマイシンで選択して取得したポリクローンの細胞の生産性評価
ｄｈｆｒ遺伝子をピューロマイシン耐性遺伝子の上流に配置した効果を抗ＫＯＤ抗体発現系で検討した。ｄｈｆｒ遺伝子をピューロマイシン耐性遺伝子の上流に配した抗ＫＯＤ抗体発現用シングルベクターとして、実施例３−１で構築したｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）を、ｄｈｆｒ遺伝子をピューロマイシン耐性遺伝子の下流に配した抗ＫＯＤ抗体発現用シングルベクターとして、実施例２−１で構築したｐＥＬＨ２−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）を用いた。制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズしたプラスミド１．６μｇを、実施例２−２に記載の方法で準備しておいたＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞にトランスフェクションし、２４時間インキュベートした。翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、７．５μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、１０％牛胎児血清、４ｍＭ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを添加したＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ中で２週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、１ウェル当たり１．８４×１０５細胞を６ウェルプレートに播き込んだ。３日間培養後、培養上清を回収し、ピューロマイシンで選択して取得したポリクローンの細胞でのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を前記実施例２−２と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。
【０１４９】
標準品から作成した検量線をもとに抗体生産量を算出した。結果を図１８に示す。ｄｈｆｒ遺伝子をピューロマイシン耐性遺伝子の下流に配したｐＥＬＨ２−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）、および、ｄｈｆｒ遺伝子をピューロマイシン耐性遺伝子の上流に配置したｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）の抗体生産量は共に７ｍｇ／Ｌと高い値であった。また、両者に差は認められず、ｄｈｆｒ遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子はどちらが上流に配置された場合でも、ピューロマイシンで選択後に高発現細胞集団の取得が可能であることがわかった。
【０１５０】
実施例３−３
抗ＫＯＤ抗体発現系においてピューロマイシンで選択して取得したモノクローンの細胞の生産性評価
【０１５１】
続いて、モノクローンでの生産性を比較すべく、限界希釈を行った。具体的には、前記実施例３−２で取得したｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）を遺伝子導入し、ピューロマイシンで選択して取得したポリクローンの細胞を、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、０．７５細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに播き込んだ。２週間培養後、培養上清を回収し、ＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を前記実施例２−２と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。標準品から作成した検量線をもとに各クローンの抗体生産量を算出した。そして、選択した発現量上位クローンを拡大培養した後、１ウェル当たり１．８４×１０５細胞を６ウェルプレートに播き込んだ。３日間培養後、培養上清を回収し、ピューロマイシンで選択して取得したモノクローンの細胞でのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を前記実施例２−２と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。
【０１５２】
標準品から作成した検量線をもとに各クローンの抗体生産量を算出した。結果を図１９に示す。その結果、ポリクローンでの結果と同様、ｄｈｆｒ遺伝子をピューロマイシン耐性遺伝子の上流に配置したｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）では、発現量が高いクローンを取得でき、その値は最大で２２ｍｇ／Ｌに達した。
【０１５３】
実施例３−４
抗ＫＯＤ抗体発現系においてピューロマイシンで選択して取得したモノクローンの細胞を、更にＭＴＸで選択して取得したポリクローンの細胞の生産性評価
【０１５４】
次に、前記実施例３−３で取得した、ｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）を遺伝子導入し、ピューロマイシンで選択して取得した発現量上位１０クローンについて、７．５μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、透析した１０％牛胎児血清、４ｍＭ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを添加したＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ中で２週間継代培養した。その後、更に、１０ｎＭ ＭＴＸ（シグマ社製）、７．５μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、透析した１０％牛胎児血清、４ｍＭ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを添加したＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ中で６週間選択培養を行った。
【０１５５】
選択培養終了後、得られたポリクローンの細胞を２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、１ウェル当たり１．８４×１０５細胞を６ウェルプレートに播き込んだ。３日間培養後、培養上清を回収し、ＭＴＸで選択して取得したポリクローンの細胞でのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を、前記実施例２−２と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。
【０１５６】
標準品から作成した検量線をもとに抗体濃度を算出した。結果を図２０に示す。その結果、ｐＥＬＨ２−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）の場合と同様に、ｄｈｆｒ遺伝子をピューロマイシン耐性遺伝子の上流に配したｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）でも、ＭＴＸ選択によって発現量の上昇が見られ、最も生産性の高いものは３５ｍｇ／Ｌであった。以上より、ピューロマイシン耐性遺伝子とｄｈｆｒ遺伝子の配置順序に関わらず、ピューロマイシン耐性遺伝子とｄｈｆｒ遺伝子を融合させて選択遺伝子とし、更にその3‘末端にｍＲＮＡ不安定化配列を付加して弱化させた発現カセットを使用することで、ピューロマイシンで選択後に高発現細胞株を取得でき、かつ、この細胞株をＭＴＸで選択培養することで、更に発現量を上昇させることが可能であった。
【０１５７】
実施例４
無血清馴化ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞を用いた、抗ＫＯＤ抗体発現系における、ｄｈｆｒ遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子の融合タンパク質遺伝子とmRNA不安定化配列の組み合わせ効果の検討
次に、あらかじめ無血清馴化したＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞を用いて、下流にmRNA不安定化配列を付加したｄｈｆｒ遺伝子（上流）とピューロマイシン耐性遺伝子（下流）の融合タンパク質遺伝子の効果を検討した。
【０１５８】
実施例４−１
抗ＫＯＤ抗体発現系においてピューロマイシンで選択して取得したモノクローンの細胞の生産性評価
【０１５９】
１ｘＹｅａｓｔｏｌａｔｅ ＵＦ溶液（ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、１ｘＨＴサプリメント、４ｍＭ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを添加したＩＳ ＣＨＯ−ＣＤ， Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｄ Ｍｅｄｉａ ｆｏｒ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞を無血清馴化した。無血清馴化したＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞を２．５Ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように、１ｘＨＴサプリメントを添加したＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍに懸濁し、超低接着表面２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）の２ウェルに１ｍｌずつ播種した。
【０１６０】
一方、実施例３−２で調製した制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズしたｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）３μｇを４００μｌ Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍで希釈した後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ １０μｌを加え、３０分間放置した。その後、半量ずつ前記の２ウェルの無血清馴化したＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞に加え、２４時間インキュベートした。トランスフェクションの１日後、細胞を回収して８００ｇＸ３分間遠心して上清を除去し、４ｍｌの１ｘＹｅａｓｔｏｌａｔｅ ＵＦ溶液、１ｘＨＴサプリメント、４ｍＭ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを添加したＩＳ ＣＨＯ−ＣＤ， Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｄ Ｍｅｄｉａ ｆｏｒ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ培地に懸濁し、７．５μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを加え、選択培養した。
【０１６１】
選択培養終了後、１０％牛胎児血清、４ｍＭ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１ｘＨＴサプリメントを添加したＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍを使用して、ポリクローンの細胞を１２ウェルプレートに播き込み、接着状態で培養した。２日間培養後、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、０．７５細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに播き込み、接着状態で限界希釈を行った。２週間培養後、培養上清を回収し、ＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を前記実施例２−２と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。標準品から作成した検量線をもとに各クローンの抗体生産量を算出した。そして、選択した発現量上位クローンについて、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、１ｘＹｅａｓｔｏｌａｔｅ ＵＦ溶液、１ｘＨＴサプリメント、４ｍＭ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを添加したＩＳ ＣＨＯ−ＣＤ， Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｄ Ｍｅｄｉａ ｆｏｒ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ培地を用いて、浮遊状態で拡大培養を行った後、１ウェル当たり４．０×１０５細胞を超低接着表面６ウェルプレートに播き込んだ。３日間培養後、培養上清を回収し、ピューロマイシンで選択して取得したモノクローンの細胞でのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を前記実施例２−２と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。更に、標準品から作成した検量線をもとに算出した抗体生産量、3日間培養後に計数した細胞数から、１細胞、1日あたりの生産性（ｐｃｄ：ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙ）を算出した。結果を図２１に示す。その結果、あらかじめ無血清馴化したＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞を宿主に用いた場合でも、ピューロマイシンで選択後に高発現株を取得することができた。
【０１６２】
実施例４−２
抗ＫＯＤ抗体発現系においてピューロマイシンで選択して取得したモノクローンの細胞を、更にＭＴＸで選択して取得したポリクローンの細胞の生産性評価
【０１６３】
次に、前記実施例４−１で取得した、ｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）を遺伝子導入し、ピューロマイシンで選択して取得した発現量上位１０クローンについて、７．５μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、１ｘＹｅａｓｔｏｌａｔｅ ＵＦ溶液、４ｍＭ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを添加したＩＳ ＣＨＯ−ＣＤ， Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｄ Ｍｅｄｉａ ｆｏｒ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ培地で２週間継代培養した。その後、まずは、７．５μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、３ｎＭ ＭＴＸ、１ｘＹｅａｓｔｏｌａｔｅ ＵＦ溶液、４ｍＭ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを添加したＩＳ ＣＨＯ−ＣＤ， Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｄ Ｍｅｄｉａ ｆｏｒ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ培地で、続いて、７．５μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、１０ｎＭ ＭＴＸ、１ｘＹｅａｓｔｏｌａｔｅ ＵＦ溶液、４ｍＭ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを添加したＩＳ ＣＨＯ−ＣＤ， Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｄ Ｍｅｄｉａ ｆｏｒ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ培地で、更に、７．５μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、３０ｎＭ ＭＴＸ、１ｘＹｅａｓｔｏｌａｔｅ ＵＦ溶液、４ｍＭ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを添加したＩＳ ＣＨＯ−ＣＤ， Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｄ Ｍｅｄｉａ ｆｏｒ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ培地で、計６週間選択培養を行った。
【０１６４】
選択培養終了後、得られたポリクローンの細胞について、１ウェル当たり４．０×１０５細胞を超低接着表面６ウェルプレートに播き込んだ。３日間培養後、培養上清を回収し、ＭＴＸで選択して取得したポリクローンの細胞でのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を前記実施例２−２と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。更に、標準品から作成した検量線をもとに算出した抗体生産量、3日間培養後に計数した細胞数から、１細胞、1日あたりの生産性（ｐｃｄ：ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙ）を算出した。結果を図２２に示す。以上より、あらかじめ無血清馴化したＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞を宿主に用いた場合でも、ピューロマイシン耐性遺伝子とｄｈｆｒ遺伝子を融合させて選択遺伝子とし、更にその3‘末端にｍＲＮＡ不安定化配列を付加して弱化させた発現カセットを使用することで、ピューロマイシンで選択後に高発現細胞株を取得でき、かつ、この細胞株をＭＴＸで選択培養することで、更に発現量を上昇させることが可能であった。
【産業上の利用可能性】
【０１６５】
本発明の薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列を含む発現カセット、遺伝子発現安定化エレメント、並びに目的タンパク質遺伝子発現カセットを有する発現ベクターは、目的タンパク質遺伝子のクローニングから組換えタンパク質の生産性の高い細胞を樹立するに至るまでを、迅速、かつ効率よく行うために大いに効果を発揮する。従って、本発明の発現ベクターを使用した細胞発現システムは、種々の動物細胞、特に哺乳類動物細胞のタンパク質の機能解析は勿論、バイオ医薬品として創薬・医療などの産業界に寄与することが大である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質転換細胞の中から目的とするタンパク質の遺伝子を高レベルで発現する細胞を効率よく樹立するための発現ベクター、及び形質転換された高生産性細胞に関する。本発明の発現ベクターは、遺伝子工学的手法により、動物細胞、特に哺乳類動物細胞において医薬品などの有用タンパク質を生産するために有用である。
【背景技術】
【０００２】
組換えタンパク質を産生する細胞を樹立する方法としては、一般に、目的タンパク質の遺伝子を発現する遺伝子構築物を宿主細胞へ遺伝子導入し、得られた形質転換細胞の中からこの遺伝子構築物が宿主細胞のゲノム上に安定導入された細胞を選別する。この際、前記遺伝子構築物に、薬剤選択マーカーとなる薬剤耐性遺伝子を目的タンパク質の遺伝子と同一プロモーター下あるいは別個のプロモーター下で発現するように挿入しておき、薬剤選択によって生き残った細胞を目的タンパク質の遺伝子が安定導入された細胞として選別する。本発明者らは、薬剤選択マーカーの発現を減弱化するｍＲＮＡ不安定化配列を発明し、薬剤選択の効果を飛躍的に向上させることに成功した（特許文献１）。
【０００３】
さらに、ゲノム導入部位の位置効果による発現低下を低減させるため、本発明者らは遺伝子発現安定化エレメントを発明し、高発現を長時間維持することができた。さらに、ｍＲＮＡ不安定化配列と遺伝子発現安定化エレメントを組み合わせることにより、その相乗効果によって、目的遺伝子を高度に発現する細胞を効率的に選択し、かつそれらの高発現細胞の安定的な維持ができた（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４４９１８０８号
【特許文献２】特許第４５２５８６３号
【特許文献３】国際公開第２０１０／０２３７８７号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂａｋｈｅｅｔ Ｔ，Ｆｒｅｖｅｌ Ｍ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｂ．Ｒ．Ｇ、 Ｇｒｅｅｒ Ｗ，Ｋｈａｂａｒ Ｋ．Ｓ．Ａ．（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２９：２４６−２５４
【非特許文献２】Ｌａｇｎａｄｏ Ｃ．Ａ，Ｂｒｏｗｎ Ｃ．Ｌ，Ｇｏｏｄａｌｌ Ｇ．Ｊ．（１９９４） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １４：７９８４−７９９５
【非特許文献３】Ｚｕｂｉａｇａ Ａ．Ｍ，Ｂｅｌａｓｃｏ Ｊ．Ｇ，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ Ｍ．Ｅ．（１９９５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １５：２２１９−２２３０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、動物細胞、特に哺乳類動物細胞において、組換えタンパク質の生産性の高い細胞を迅速、かつ効率よく樹立するのに効果的な発現ベクター、及び高生産性細胞を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、ｍＲＮＡ不安定化配列を含む薬剤選択マーカー遺伝子、及び遺伝子発現安定化エレメントを有する発現ベクターにさらに遺伝子増幅を誘起するシステムを組み合わせることにより、これらの相乗効果によって目的タンパク質の生産量が飛躍的に向上することを見出し、本発明に至った。
【０００８】
本発明の特徴は、薬剤選択マーカー遺伝子の発現カセットとジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子の発現カセットを独立に存在させるのではなく、薬剤選択マーカー遺伝子とジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を１つの発現カセットで発現させたことである。
【０００９】
すなわち、以下の発明が提供される。
【００１０】
［１］ 発現ベクター
［１−１］
下記（１）〜（３）を少なくとも有する発現ベクター。
（１）薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセット、
（２）遺伝子発現安定化エレメント、及び
（３）目的タンパク質遺伝子発現カセット
［１−２］
下記（１）〜（３）を少なくとも有する発現ベクター
（１）薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列を含む発現カセット、
（２）遺伝子発現安定化エレメント、及び
（３）目的タンパク質遺伝子発現カセット
［１−３］
ｍＲＮＡ不安定化配列が、サイトカイン、インターロイキン、又は癌原遺伝子の３’非翻訳領域に存在するＡＴリッチ配列に由来することを特徴とする［１−２］に記載の発現ベクター。
［１−４］
ｍＲＮＡ不安定化配列が、ＴＴＡＴＴＴＡ（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｔ）のモチーフ配列を有することを特徴とする［１−２］に記載の発現ベクター。
［１−５］
モチーフ配列が、２回以上繰り返されていることを特徴とする［１−４］に記載の発現ベクター。
［１−６］
モチーフ配列の繰り返し間に１塩基以上のスペーサー配列を含むことを特徴とする［１−５］に記載の発現ベクター。
［１−７］
ｍＲＮＡ不安定化配列中に１ないし数塩基の置換、挿入または欠失を含むことを特徴とする［１−３］〜［１−６］のいずれかに記載の発現ベクター。
［１−８］
遺伝子発現安定化エレメントが以下のいずれかである、［１−１］〜［１−７］のいずれかに記載の発現ベクター。
（Ｉ）配列番号１５で示す配列のうち４１６０１〜４６７４６番目までの配列からなるＤＮＡ、もしくは４１６０１〜４６７４６番目までの配列の部分配列であって少なくとも４１６０１〜４２７００番目までの配列を含む塩基配列からなるＤＮＡ
（ＩＩ）上記（Ｉ）の配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ遺伝子発現安定化機能を有する塩基配列からなるＤＮＡ
（ＩＩＩ）上記（Ｉ）または（ＩＩ）の配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ
［１−９］
遺伝子発現安定化エレメントを２つ以上含む、［１−１］〜［１−８］のいずれかに記載の発現ベクター。
［１−１０］
薬剤選択マーカー遺伝子が、タンパク質合成阻害系抗生物質耐性遺伝子である、［１−１］〜［１−９］のいずれかに記載の発現ベクター。
［１−１１］
薬剤選択マーカー遺伝子がピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ及びネオマイシンホスホトランスフェラーゼからなる群より選択される、［１−１０］に記載の発現ベクター。
［１−１２］
目的タンパク質の遺伝子発現カセットが、所望の目的タンパク質遺伝子を挿入するためのマルチクローニングサイトを備えていることを特徴とする［１−１］〜［１−１１］のいずれかに記載の発現ベクター。
［１−１３］
目的タンパク質遺伝子が抗体の重鎖及び／または軽鎖ポリペプチド遺伝子である、［１−１］〜［１−１２］のいずれかに記載の発現ベクター。
【００１１】
［２］ 発現カセット
［２−１］
薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列を含む発現カセット。
【００１２】
［３］ 高生産細胞の作製方法
［３−１］
以下の工程を含む、高生産細胞を作製する方法。
（ａ）［１−１］〜［１−１３］のいずれかに記載の発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程
（ｂ）形質転換された細胞を薬剤存在下で培養する工程
（ｃ）形質転換された細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下で培養する工程
（ｄ）高発現を示す細胞株を単離する工程。
［３−２］
以下の工程を含む、高生産細胞を作製する方法。
（ａ）［１−１］〜［１−１３］のいずれかに記載の発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程
（ｂ）形質転換された細胞をヒポキサンチンおよびチミジン不含培地で培養する工程
（ｃ）形質転換された細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下で培養する工程
（ｄ）高発現を示す細胞株を単離する工程。
［３−３］
以下の工程を含む、高生産細胞を作製する方法。
（ａ）［１−１］〜［１−１３］のいずれかに記載の発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程
（ｂ）形質転換された細胞を、ヒポキサンチンおよびチミジンを含まず、かつ薬剤存在下で培養する工程
（ｃ）形質転換された細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下で培養する工程
（ｄ）高発現を示す細胞株を単離する工程。
［３−４］
［３−１］〜［３−３］のいずれかに記載の方法において、（ｃ）形質転換された細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下で培養する工程、及び（ｄ）高発現を示す細胞株を単離する工程を複数回繰り返す、高生産細胞を作製する方法。
［３−５］
宿主細胞が哺乳類動物細胞由来の細胞である、［３−１］〜［３−４］のいずれかに記載の高生産細胞を作製する方法。
［３−６］
宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）由来の細胞である、［３−１］〜［３−４］のいずれかに記載の高生産細胞を作製する方法。
［３−７］
宿主細胞がジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子欠損細胞である、［３−１］〜［３−４］のいずれかに記載の高生産細胞を作製する方法。
［３−８］
宿主細胞が無血清馴化された細胞である、［３−１］〜［３−４］のいずれかに記載の高生産細胞を作製する方法。
【００１３】
［４］高生産細胞
［４−１］
［３−１］〜［３−７］のいずれかに記載の方法により得られた高生産細胞。
【００１４】
［５］高生産細胞を用いて生産する方法
［５−１］
［３−１］〜［３−７］のいずれかに記載の方法により得られた高生産細胞を用いてポリペプチドを生産する方法。
［５−２］
［３−１］〜［３−７］のいずれかに記載の方法により得られた高生産細胞を用いて抗体を生産する方法。
［５−３］
［３−１］〜［３−７］のいずれかに記載の方法により得られた高生産細胞を用いてワクチンを生産する方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明では、薬剤選択によって形質転換細胞を薬剤選択するとともに、細胞の培養工程中にメトトレキセート（ＭＴＸ）に代表される薬剤を存在させ、遺伝子増幅を引き起こすことにより、宿主細胞に多数の遺伝子コピーを有する細胞株を作出することができる。しかしながら、発現ベクターに発現カセットを複数存在させた場合、転写干渉が生じることにより各発現カセットの発現量が低下し、各遺伝子の機能が十分に発揮されない。この転写干渉は、目的タンパク質の発現にも影響を及ぼし、全体としてタンパク質生産性の低下を招く。そこで本発明は、薬剤選択マーカー遺伝子とジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を隣接させ、いわゆる融合遺伝子として１つの発現カセットで発現させることにより、転写干渉を低減させて、より生産性を向上させることができる。
【００１６】
本発明の別の態様においては、薬剤選択マーカー遺伝子及びジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセットにｍＲＮＡ不安定化配列が挿入されているため、ｍＲＮＡ不安定化配列を有さない従来の薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットに比べて薬剤選択マーカーの発現が減弱化されており、宿主細胞ゲノム内の高発現領域に組み込まれないと、薬剤存在下で形質転換細胞の生存が困難となる。このため、薬剤選択マーカー遺伝子及び目的タンパク質遺伝子が宿主細胞ゲノム内の高発現領域に組み込まれた形質転換細胞のみが薬剤選択によって生き残ることができる。また、遺伝子増幅についても、少量のＭＴＸ等の薬剤で最大の効果を得ることができる。その結果、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する高発現細胞を効率的に選別することができる。
【００１７】
本発明の遺伝子発現安定化エレメントにより、細胞ゲノムにおける組換えタンパク質遺伝子への隣接染色体や調節エレメントの影響を低減させて、組換えタンパク質遺伝子の遺伝子発現を安定化し、高発現を長期間維持することができる。そこで本発明は、これらの相乗効果によって、非常に高いレベルのタンパク質生産性を示す高生産細胞株を迅速、容易、且つ効率的に樹立することができる。
【００１８】
すなわち本発明によれば、目的タンパク質遺伝子が宿主細胞の高発現領域に導入されている特長、高発現領域に導入された目的タンパク質遺伝子が多数の遺伝子コピーを有している特長、これらの遺伝子発現が安定している特長を有する高生産性細胞を極めて迅速、容易、且つ効率的に樹立することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ｐＰＵＲ・Ｎ４の構築を示す図である。以下、図中、Ｐｕｒとは、ピューロマイシン耐性遺伝子のことである。また、図中、ｉＰＣＲとは、Ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲのことである。
【図２】ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２の構築を示す図である。以下、図中、Ｎｅｏとは、ネオマイシン耐性遺伝子のことである。
【図３】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２の構築を示す図である。
【図４】ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ／１．１ｋの構築を示す図である。
【図５】ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−１．１ｋ／１．１ｋの構築を示す図である。
【図６】ｐＥＨＸのベクターマップを示す図である。
【図７】ｐＥＬＸのベクターマップを示す図である。
【図８】ｐＥＬＸ２のベクターマップを示す図である。
【図９】ｐＥＨＸ−ｄｈｆｒ・Ｎ４のベクターマップを示す図である。
【図１０】ｐＥＨＸ−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ、ｐＥＨＸ−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４の構築を示す図である。
【図１１】ｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）の構築を示す図である。
【図１２】ｐＥＬＨ２−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ（ＫＯＤ３Ｇ８）、ｐＥＬＨ２−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）の構築を示す図である。
【図１３】ピューロマイシン耐性遺伝子、ｄｈｆｒ遺伝子のそれぞれについて、下流にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加した発現カセットを含むもの（Ｐｕｒ・Ｎ４＋ｄｈｆｒ・Ｎ４）、ピューロマイシン耐性遺伝子（上流）とｄｈｆｒ遺伝子（下流）の融合タンパク質遺伝子の発現カセットを含むもの（Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ）、ピューロマイシン耐性遺伝子（上流）とｄｈｆｒ遺伝子（下流）の融合タンパク質遺伝子の下流にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加した発現カセットを含むもの（Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４）、について、ポリクローンの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した、抗体生産量をプロットしたグラフである。
【図１４】６ウェルプレートの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した、各クローンの抗体生産量をプロットしたグラフである。ピューロマイシン耐性遺伝子、ｄｈｆｒ遺伝子のそれぞれについて、下流にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加した発現カセットを含むもの（Ｐｕｒ・Ｎ４＋ｄｈｆｒ・Ｎ４）、ピューロマイシン耐性遺伝子（上流）とｄｈｆｒ遺伝子（下流）の融合タンパク質遺伝子の発現カセットを含むもの（Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ）、ピューロマイシン耐性遺伝子（上流）とｄｈｆｒ遺伝子（下流）の融合タンパク質遺伝子の下流にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加した発現カセットを含むもの（Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４）、について、それぞれ生産量上位５クローンをプロットしている。
【図１５】６ウェルプレートの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した、ＭＴＸでの選択培養後のポリクローンでの抗体生産量をプロットしたグラフである。ピューロマイシン耐性遺伝子、ｄｈｆｒ遺伝子のそれぞれについて、下流にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加した発現カセットを含むもの（Ｐｕｒ・Ｎ４＋ｄｈｆｒ・Ｎ４）、ピューロマイシン耐性遺伝子（上流）とｄｈｆｒ遺伝子（下流）の融合タンパク質遺伝子の発現カセットを含むもの（Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ）、ピューロマイシン耐性遺伝子（上流）とｄｈｆｒ遺伝子（下流）の融合タンパク質遺伝子の下流にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加した発現カセットを含むもの（Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４）、について、それぞれピューロマイシンで選択して取得した生産量上位１０クローンをＭＴＸで選択培養後に得られた細胞集団の、生産量上位５クローンの結果をプロットしている。
【図１６】ｐＥＨＸ−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４の構築を示す図である。
【図１７】ｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）の構築を示す図である。
【図１８】ピューロマイシン耐性遺伝子（上流）とｄｈｆｒ遺伝子（下流）の融合タンパク質遺伝子の下流にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加した発現カセットを含むもの（Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４）、ｄｈｆｒ遺伝子（上流）とピューロマイシン耐性遺伝子（下流）の融合タンパク質遺伝子の下流にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加した発現カセットを含むもの（ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４）について、ポリクローンの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した、抗体生産量をプロットしたグラフである。
【図１９】ｄｈｆｒ遺伝子（上流）とピューロマイシン耐性遺伝子（下流）の融合タンパク質遺伝子の下流にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加した発現カセットを含むもの（ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４）について、６ウェルプレートの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い各クローンの抗体生産量を算出し、生産量上位５クローンをプロットしたグラフである。
【図２０】６ウェルプレートの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した、ＭＴＸで選択後のポリクローンの細胞集団の抗体生産量をプロットしたグラフである。ｄｈｆｒ遺伝子（上流）とピューロマイシン耐性遺伝子（下流）の融合タンパク質遺伝子の下流にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加した発現カセットを含むもの（ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４）について、ピューロマイシンで選択して取得した生産量上位１０クローンをＭＴＸで選択培養後に得られた細胞集団の、生産量上位５クローンの結果をプロットしている。
【図２１】６ウェルプレートの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した、ピューロマイシンで選択後の高発現株の１細胞、1日あたりの抗体生産量をプロットしたグラフである。ｄｈｆｒ遺伝子（上流）とピューロマイシン耐性遺伝子（下流）の融合タンパク質遺伝子の下流にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加した発現カセットを含むもの（ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４）について、無血清馴化されたＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞へ遺伝子導入し、ピューロマイシンで選択して取得した生産量上位５クローンの結果をプロットしている。
【図２２】６ウェルプレートの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した、ＭＴＸで選択後のポリクローンの細胞集団の１細胞、1日あたりの抗体生産量をプロットしたグラフである。ｄｈｆｒ遺伝子（上流）とピューロマイシン耐性遺伝子（下流）の融合タンパク質遺伝子の下流にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加した発現カセットを含むもの（ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４）について、無血清馴化されたＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞へ遺伝子導入し、ピューロマイシンで選択して取得した生産量上位１０クローンをＭＴＸで選択培養後に得られた細胞集団の、生産量上位５クローンの結果をプロットしている。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００２１】
本発明の第一の側面によれば、（１）薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセット、（２）遺伝子発現安定化エレメント、及び（３）目的タンパク質遺伝子発現カセットを少なくとも有することを特徴とする発現ベクターが提供される。
【００２２】
本発明の第二の側面によれば、（１）薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列を含む発現カセット、（２）遺伝子発現安定化エレメント、及び（３）目的タンパク質遺伝子発現カセットを少なくとも有することを特徴とする発現ベクターが提供される。
【００２３】
本発明において、発現カセットとは、プロモーターから遺伝子コード配列、ターミネーター配列（ポリアデニレーションシグナル）までの遺伝子発現の単位をいう。加えて、イントロン、スペーサー配列、翻訳増強領域等を含むこともある。したがって、例えば「目的タンパク質遺伝子発現カセット」という場合、前記発現カセットの遺伝子コード配列が目的とするタンパク質の遺伝子のコード配列であるものをいう。
【００２４】
（薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセット）
【００２５】
薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセットとは、薬剤選択マーカー遺伝子及びジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を遺伝子コード配列として含む発現カセットをいう。
【００２６】
本発明の薬剤選択マーカー遺伝子を用いた薬剤選択に使用される薬剤としては、タンパク質合成阻害系抗生物質としてブラストサイジン（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）、ジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（Ｇ４１８）、ハイグロマイシン（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ；Ｈｙｇ）、ピューロマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ；Ｐｕｒ）が例示される。また、本発明の薬剤選択マーカー遺伝子としては、薬剤選択に一般的に使用される薬剤に対して耐性を示す遺伝子が好適に用いられる。タンパク質合成阻害系抗生物質を薬剤として用いる場合には、タンパク質合成阻害系抗生物質耐性遺伝子を用いることが好ましい。特に限定されるものではないが、ネオマイシン耐性遺伝子（ジェネティシン耐性遺伝子としての機能も有する）として、Ｔｎ５由来ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ３’−ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（Ｎｅｏ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子として、Ｅ．ｃｏｌｉ由来ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（Ｈｐｈ、実施例および図面ではＨｙｇと記載）、ピューロマイシン耐性遺伝子として、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｃ、実施例および図面ではＰｕｒと記載）、ブラストサイジン耐性遺伝子として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ由来ブラストサイジン耐性遺伝子（ｂｓｒ）などが例示される。これらの中でも、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼが好ましく、より好ましくはピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼであり、さらに好ましくはピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼである。
【００２７】
ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ／ｄｈｆｒ）は核酸の生合成に必須の酵素であり、ｄｈｆｒ遺伝子を欠損する細胞は核酸を含まない培地で生育できない。ｄｈｆｒ遺伝子を欠損する細胞を、ｄｈｆｒ遺伝子を有する発現ベクターで形質転換すると、核酸要求性が回復した形質転換体を得ることができる。
【００２８】
細胞ゲノムにおいて、外から適当な圧力をかけると、特定の遺伝子の重複（増幅）が選択的に起こり安定化することが知られている。ｄｈｆｒ遺伝子を有する発現ベクターで形質転換された培養細胞にＤＨＦＲの拮抗阻害剤であるメトトレキセート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ、ＭＴＸ）を加えると、ほとんどの細胞は死んでしまうがごくまれに生き残るものがある。このような細胞はｄｈｆｒ遺伝子のコピー数が増加しており、大量のＤＨＦＲを合成できるため、ＭＴＸに阻害されないＤＨＦＲが、細胞が生き続け増殖するのに必要なテトラヒドロ葉酸を作り出すことができる。段階的に選択を続けると、通常は１もしくは数コピーしかないｄｈｆｒ遺伝子が最終的には１００〜１０００倍にも増幅された変異細胞を得ることができる。動物細胞において遺伝子増幅が起こる場合、選択圧をかけたｄｈｆｒ遺伝子そのものだけでなく、その遺伝子の近傍に存在する他の遺伝子も同時に増幅されるので、結果として目的タンパク質遺伝子も同時に増幅される。
【００２９】
本発明におけるｄｈｆｒ遺伝子は公知のものを使用することができ、由来は限定されないが、マウス由来のｄｈｆｒ遺伝子が好ましい。ｄｈｆｒ遺伝子は市販のベクターから入手することができ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）やｐＯｐｔｉＶＥＣ−ＴＯＰＯ（登録商標）（インビトロジェン社）が例示されるが、人工合成により入手することもできる。
【００３０】
薬剤選択マーカー遺伝子とｄｈｆｒ遺伝子が「隣接して存在する」とは、薬剤選択マーカー遺伝子とｄｈｆｒ遺伝子を融合タンパク質として発現させることを意味し、上流側の遺伝子の終止コドンを削除することで成し遂げられる。薬剤選択マーカー遺伝子とｄｈｆｒ遺伝子との間は、例えばグリシン・セリンリンカー等の実質的に機能を持たない配列が存在してもよいし、配列を存在させず直接つなげてもよい。下流側の遺伝子から開始コドンのメチオニンをコードするＡＴＧ配列を除去することも好ましい。
【００３１】
薬剤選択マーカー遺伝子とｄｆｈｒ遺伝子の配置順序はいずれでもよい。
【００３２】
本発明の薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセットにおけるプロモーターとしては、動物細胞、特に哺乳類細胞で発現可能なプロモーターであれば特に限定されるものではないが、ヒトやマウスのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ヒトヘルペス単純ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）プロモーター、などのウイルスに由来するものや、マウスｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ−ｋｉｎａｓｅ１遺伝子（ＰＧＫ）プロモーターなどの非ウイルス性の細胞遺伝子に由来するプロモーター、及び由来の異なるプロモーターのハイブリッドが挙げられる。ここで、プロモーターは、プロモーターのコア領域に限るものではなく、エンハンサー領域を含む場合もある。薬剤選択マーカーの発現を減弱化するため、転写活性が低いものがより好ましい。転写活性の低いプロモーターとして変異型のプロモーターなどを利用してもよいし、コザック配列を置換してもよい。さらに、ｍＲＮＡ不安定化配列のモチーフ配列の繰り返しの回数を少なくし、転写活性の弱いプロモーターを併用するのも１つの想定される実施態様である。
【００３３】
本発明の薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセットにおけるポリアデニレーションシグナル（ターミネーター配列）としては、ＳＶ４０ウイルス由来ｌａｔｅ ｐｏｌｙＡシグナル、ｅａｒｌｙ ｐｏｌｙＡシグナル、ＨＳＶ−ｔｋ由来ｐｏｌｙＡシグナル、ウシ成長因子遺伝子由来ｐｏｌｙＡシグナル、ウサギβ−グロビン遺伝子由来ｐｏｌｙＡシグナルなどが例示されるが、特に限定されるものではない。
【００３４】
本発明の薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセット中でのプロモーター、薬剤選択マーカー遺伝子及びｄｈｆｒ遺伝子、並びにポリアデニレーションシグナルの配置順序は、薬剤選択マーカー遺伝子及びｄｈｆｒ遺伝子の発現が可能である限り特に限定されないが、一般的にプロモーター、薬剤選択マーカー遺伝子及びｄｆｈｒ遺伝子、並びにポリアデニレーションシグナルをこの順序で上流から下流に向かって配置する。これらの三つの要素は、相互に直接連結されている必要はなく、所望により、イントロン、スペーサー配列、翻訳増強領域等を間に有していてもよい。
【００３５】
（薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列を含む発現カセット）
本発明で使用する発現カセットは、ｍＲＮＡ不安定化配列を有することを除いては、前記薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセットと同様の構成を有する。そこで、ｍＲＮＡ不安定化配列について説明する。
【００３６】
「ｍＲＮＡ不安定化配列」とは、この配列を有するＤＮＡから転写されたｍＲＮＡの細胞内半減期を低減させる機能を有するヌクレオチド配列のことであり、自然界では初期応答遺伝子などに存在することが見出されている。
【００３７】
ｍＲＮＡ不安定化配列は、いくつかの遺伝子ではコード配列中、あるいは５’ＵＴＲ（非翻訳領域）に存在するものもあるが、多くは３’ＵＴＲに存在する。３’ＵＴＲに存在するｍＲＮＡ不安定化配列としては、ＡＵ−ｒｉｃｈ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＡＲＥ）、ｈｉｓｔｏｎｅ ｍＲＮＡ ３’−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ、ｉｒｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＩＲＥ）、ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、ｌｏｎｇ ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐなどが知られている。これらの中でもＡＲＥは、恒常的にｍＲＮＡを不安定化できることから、本発明に用いるｍＲＮＡ不安定化配列として好ましい。
【００３８】
ＡＲＥとは、ｍＲＮＡにおける「ＡＵが豊富なエレメント」、すなわちアデニン（Ａ）及びウラシル（Ｕ）を高い割合で含む配列もしくは領域を意味する。またＡＲＥとは、前記エレメントをコードするＤＮＡにおける「ＡＴが豊富なエレメント」、すなわちアデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）を高い割合で含む配列もしくは領域を指すためにも用いられる。
【００３９】
ＡＲＥは、造血細胞増殖因子遺伝子、成長因子遺伝子、インターロイキン遺伝子、インターフェロン等のサイトカイン遺伝子、及びいくつかの癌原遺伝子（プロトオンコジーン）などに見られる（非特許文献１）。本発明の発現カセットでは、これらの遺伝子中のＡＲＥに相当する核酸配列をそのまま利用してもよいが、ＡＲＥ中のモチーフ配列として知られるＴＡＴＴＴＡＴ（非特許文献２）やＴＴＡＴＴＴＡ（Ｔ／Ａ）（Ｔ／Ａ）（非特許文献３）などを利用する方が、不要な制限酵素認識配列を発現ベクターに挿入してしまうことを避けることができ、利便性が高い。
【００４０】
ＡＲＥを持つ遺伝子の例としては、造血細胞増殖因子についてはＧｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｉｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｇ ｆａｃｔｏｒ（ＧＭ−ＣＳＦ），インターロイキンについてはＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β、２，３、４、６、８、１０、１１、インターフェロンについてはＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−α、癌原遺伝子についてはｃ−ｆｏｓ，ｃ−ｍｙｃ，ｃ−ｊｕｎ，ｃ−ｍｙｂ，Ｐｉｍ−１などが例示される。このほかにもＴｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ，Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１，Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ，Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｙｐｅ２など多くの遺伝子がＡＲＥを持つことが知られており、例示された遺伝子に限定されない。
【００４１】
本発明おいて使用することができるｍＲＮＡ不安定化配列としては、下記のものが例示される。
ＡＴＴＴのモチーフ配列の１ないし２回以上の繰り返し。
ＡＴＴＴＡのモチーフ配列の１ないし２回以上の繰り返し。
ＴＡＴＴＴＡＴのモチーフ配列の１ないし２回以上の繰り返し。
ＴＴＡＴＴＴＡ（Ｔ／Ａ）（Ｔ／Ａ）のモチーフ配列の１ないし２回以上の繰り返し。
（Ｔ／Ａ）はＴまたはＡのいずれかである。
【００４２】
これらの配列は、１ないし数塩基の置換／挿入／欠失を含んでもよく、ＤＮＡの複製の誤りや突然変異などの自然変異によるもの、人為的な変異導入によるもの等が想定される。また、モチーフ配列の繰り返し間には１〜１００塩基程度のスペーサー配列またはリンカー配列を含んでもよい。加えて、モチーフ配列の逆位を含むものであってもよい。
【００４３】
これらのモチーフ配列の繰り返し数は、１回でもよいが、２回以上、より好ましくは４回以上とすることにより、ｍＲＮＡの不安定化効果を一層高めることができ、選別効率を顕著に増大させることができる。
【００４４】
繰り返しの回数の上限は特に限定されないが、細胞へのベクターの取り込みの観点から、発現ベクターが最大１０ｋｂｐ〜２５ｋｂｐ長となるようなものが望ましい。ただし、繰り返し配列数が増えるにしたがって、ｍＲＮＡの不安定化の効果は飽和に向かい、一定の繰り返し数を超えるとそれ以上の顕著な効果を望めなくなる。上限値を定めるものではないが、１０回以上の繰り返し配列は実用上意味がない。
【００４５】
本発明の薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列を含む発現カセット中でのプロモーター、薬剤選択マーカー遺伝子及びｄｈｆｒ遺伝子、ｍＲＮＡ不安定化配列、並びにポリアデニレーションシグナルの配置順序は、薬剤選択マーカー遺伝子及びｄｈｆｒ遺伝子の発現が可能である限り特に限定されないが、一般的にプロモーター、薬剤選択マーカー遺伝子及びｄｆｈｒ遺伝子、ｍＲＮＡ不安定化配列、並びにポリアデニレーションシグナルをこの順序で上流から下流に向かって配置する。これらの四つの要素は、相互に直接連結されている必要はなく、所望により、イントロン、スペーサー配列、翻訳増強領域等を間に有していてもよい。
【００４６】
（遺伝子発現安定化エレメント）
本発明における「遺伝子発現安定化エレメント」とは、目的タンパク質遺伝子発現カセットが宿主ゲノムに挿入された部位近傍のゲノムの転写の活性化の状況に影響を受けてしまう、という位置効果を解消し、遺伝子発現を安定化する機能を有する核酸領域を意味する。
【００４７】
遺伝子発現を安定化する機能を有する核酸配列としては、インスレーター、スキャフォールド／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）、遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）、遍在作用性クロマチンオープニングエレメント（ＵＣＯＥ）などが利用できる。
【００４８】
インスレーターとしては、ニワトリβ-グロビンＬＣＲに由来する１．２ｋｂ ＤＮａｓｅＩ Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓｉｔｅ（ｃＨＳ４），バフンウニ由来ＵＲ１などが例示される。Ｓ／ＭＡＲとしては、ニワトリリゾチーム５’ＭＡＲエレメント、ヒトβ−グロビンＭＡＲエレメントやヒトインターフェロンβＳＡＲエレメントなどが例示される。
【００４９】
目的遺伝子を宿主細胞ゲノムへ導入するための遺伝子構築物として、プラスミドベクターが一般に用いられるが、プラスミドベクターの長さは最大１０ないし２５ｋｂｐであることから、遺伝子発現安定化エレメントの鎖長は出来るだけ短い方が好ましい。好ましい長さとしては５ｋｂｐ以下、より好ましくは１ｋｂｐ程度である。
【００５０】
本発明における実施態様では、遺伝子発現安定化エレメントとして、下記（ａ）〜（ｅ）のいずれか又はその組み合わせが使用できる。
【００５１】
（ａ）配列番号１５で示す配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１５で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１５で示す配列のうち４１８２０番目から４１８３９番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１５で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１５で示す配列のうち４１８２１番目から４１８４０番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；
（ｄ）配列番号１５で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１５で示す配列のうち４５１８２番目から４５２００番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；及び
（ｅ）配列番号１５で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１５で示す配列のうち９１０９４番目から９１１１３番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ。
【００５２】
本発明の遺伝子発現安定化エレメントの好ましい態様では、前記（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡは、配列番号１５で示す配列のうち４１６０１番目から４６７４６番目までの塩基配列で示す領域、又は配列番号１５で示す配列のうち４１６０１番目から４６７４６番目までの配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ遺伝子発現安定化機能を有する塩基配列領域である。また、これらの領域からなるＤＮＡと相補的な塩基配列も含まれる。本発明の遺伝子発現安定化エレメントのさらに好ましい態様では、前記（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡは、（１）配列番号１５で示す配列のうち４１６０１〜４６７４６番目までの配列からなるＤＮＡ、もしくは４１６０１〜４６７４６番目までの配列の部分配列であって少なくとも４１６０１〜４２７００番目までの配列を含む塩基配列からなるＤＮＡ、又は（２）（１）で示すＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ遺伝子発現安定化機能を有する塩基配列からなるＤＮＡであり、又は（３）これらの領域からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡである。
【００５３】
これらのエレメントは、発明者らがＣＨＯゲノム（ＣＨＯ ＤＲ１０００Ｌ−４Ｎ株）から単離同定したものであるが（特許文献３）、これらのエレメントと相同なエレメントは、他の哺乳類細胞ゲノムにも存在することが予想される。従って、（ｆ）配列番号１５で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、宿主細胞中で外来遺伝子発現カセットと近接するように配置された際に、外来遺伝子発現カセットに含まれる外来遺伝子から目的組換えタンパク質の発現を増大または安定化させることができるＤＮＡも、遺伝子発現安定化エレメントとして使用することができる。このような相同エレメントは、この技術分野の周知の技術、例えば、種間ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲなどによって容易に単離同定されることができる。
【００５４】
また、（ｇ）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかのＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ遺伝子発現安定化機能を有するＤＮＡも当然、遺伝子発現安定化エレメントとして使用することができる。本発明の遺伝子発現安定化エレメントは、これらの（ａ）〜（ｇ）のいずれか一つ又はそれらの任意の組合せからなる。さらに、（ｈ）前記（ａ）〜（ｇ）のいずれかのＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡも、遺伝子発現安定化機能を有し、遺伝子発現安定化エレメントとして使用することができるため、本発明に含まれる。
【００５５】
ストリンジェントな条件とは、用いられるプローブ・標識方法によっても異なるが、例えば、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中４０〜５０℃または０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中５５〜６５℃の条件下ハイブリダイズする塩基配列である。さらにストリンジェントな条件は、結合する核酸の融解温度（Ｔｍ値）に基づいて決定することができる。また、ハイブリダイズ後の洗浄条件として、「６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、Ｔｍ値よりも約１５〜３０℃低い温度」程度の条件をあげることができる。より高いストリンジェントな条件としては「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、Ｔｍ値よりも約５〜１５℃低い温度」程度、更に高いストリンジェントな条件としては「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、Ｔｍ値よりも約５〜１５℃低い温度」程度の洗浄条件をあげることができる。更に高いストリンジェントな条件としては「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ」程度の洗浄条件が例示される。
【００５６】
本発明の遺伝子発現安定化エレメントがその発現安定化効果を奏するためには、エレメントが宿主細胞ゲノム中で目的タンパク質遺伝子発現カセットの導入部位に近接する位置に配置されることが必要である。本発明において、用語「近接する」とは、特に制限されるものではないが、好ましくは本発明の遺伝子発現安定化エレメントと目的タンパク質遺伝子発現カセットとの間の距離が５０００ｂｐ以下、さらに好ましくは５００ｂｐ以下であることを意味する。
【００５７】
このような近接配置は、本発明のエレメントを含む核酸配列断片と、外来遺伝子の発現カセットを含む核酸配列断片との混合物をエレクトロポレーションやトランスフェクションなどによって宿主細胞内へ導入し、外来遺伝子の発現量の高い宿主細胞クローンを選択することによって実現することもできるが、近接配置を確実に達成させるためには、本発明の遺伝子発現安定化エレメント、及びそれに近接して配置された外来遺伝子発現カセットを含む外来遺伝子発現ベクターをあらかじめ作成しておき、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換させることが望ましい。
【００５８】
（目的タンパク質遺伝子発現カセット）
本発明における目的タンパク質遺伝子の発現カセットは、プロモーター、遺伝子コード配列、及びターミネーター配列（ポリアデニレーションシグナル）からなる。加えて、イントロンやスペーサー配列、翻訳増強領域を含むこともある。目的タンパク質遺伝子の発現プロモーターとしてはできるだけ転写活性の高いものが好ましく、ヒトやマウスのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターなどのウイルスに由来するものや、ヒトやマウス、さらにはＣＨＯ由来のＥｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ １（ＥＦ１α）遺伝子、ユビキチン遺伝子、β−アクチン遺伝子など、非ウイルス性の細胞遺伝子に由来するプロモーター、及び由来の異なるプロモーター／エンハンサーのハイブリッド、例えばＣＡＧプロモーターなどが挙げられる。
【００５９】
目的タンパク質遺伝子発現カセットには、該タンパク質遺伝子のコード配列の代わりに、複数の制限酵素認識配列からなるマルチクローニングサイトを配置することができる。外来遺伝子のｃＤＮＡやコード配列を導入する際に、クローニング作業が簡便であり、好ましい。
【００６０】
他の実施態様としては、目的タンパク質が抗体の重鎖及び／または軽鎖のポリペプチドである、目的タンパク質遺伝子発現カセットである。この場合、目的タンパク質遺伝子の発現カセットは、複数配置してもよく、あるいは複数のポリペプチド遺伝子をＩＲＥＳでつなぎ、ポリシストロン性の１つの発現カセットの形でもよい。
【００６１】
（発現ベクター）
本発明において、発現ベクターとは、遺伝子工学に利用されるベクターである。発現ベクターは、プラスミドベクターであることができる。しかし、これに限らず、例えば、ウイルスベクター、コスミドベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）及び他の非プラスミドベクターも使用できる。
【００６２】
本発明における発現ベクターの実施態様の１つは、目的タンパク質遺伝子発現カセット、薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセットが配置されており、その上流若しくは下流に、遺伝子発現安定化エレメントが配置された発現ベクターである。好ましくは、目的タンパク質遺伝子発現カセット、薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセットの上流に、遺伝子発現安定化エレメントが配置された発現ベクターである。この場合、目的タンパク質遺伝子発現カセットと薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセットとはいずれが上流であってもよいが、好ましくは目的タンパク質遺伝子発現カセットが上流に配置されたものである。
【００６３】
本発明における発現ベクターの好ましい実施態様は、目的タンパク質遺伝子発現カセット、薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセットが配置されており、その上流及び下流に、それらの発現カセットを挟むように遺伝子発現安定化エレメントが配置されたベクターである。目的タンパク質遺伝子発現カセット、薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセットの順序は問わないが、目的タンパク質遺伝子発現カセットが上流に配置されていることが好ましい。
【００６４】
遺伝子発現安定化エレメントは、目的タンパク質遺伝子発現カセットと薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセットとの間に配置されていてもよい。
【００６５】
遺伝子発現安定化エレメント、目的タンパク質遺伝子発現カセット、および薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセットとの間は、隣接していてもよいし、スペーサー配列等が挿入されていてもよい。
【００６６】
薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセットは、１つのベクターに２つ以上含まれていても良い。この場合、同一の薬剤選択マーカーが選ばれる場合もあるし、それぞれ異なる薬剤選択マーカーが選ばれる場合もある。また、各発現カセットは隣接して配置されても良いし、離れて配置されていても良い。
【００６７】
目的タンパク質が抗体の重鎖、軽鎖のように複数のポリペプチドからなる場合、目的タンパク質遺伝子の発現カセットを複数配置してもよく、あるいは複数のポリペプチド遺伝子をＩＲＥＳでつなぎ、ポリシストロン性の１つの発現カセットの形にしてもよい。
【００６８】
また、複数のポリペプチド発現カセットをそれぞれ異なるベクターに挿入し、それぞれのベクターを１つの宿主細胞へ導入して形質転換細胞を作製し、目的タンパク質を生産することができる。この場合、各ベクターに遺伝子発現安定化エレメント及び／または薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセットを配置することができ、それぞれ同一の薬剤選択マーカーを用いることもできるが、異なる薬剤選択マーカーを用いる方が、各ポリペプチドが全て高発現を示す細胞を効率よく取得する点で有利であり、好ましい。
【００６９】
抗体を生産する場合、抗体の重鎖ポリペプチド遺伝子と軽鎖ポリペプチド遺伝子をそれぞれ異なるベクターに挿入して発現させてもよいが、抗体の重鎖ポリペプチド遺伝子と軽鎖ポリペプチド遺伝子とを同一のベクターに挿入して発現させると、同一ベクター上の一種類の薬剤耐性遺伝子を使うことになり導入遺伝子数の差異を軽減でき、抗体の重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの生産バランスがとれ、重鎖・軽鎖の２つのポリペプチドが２本ずつから成る抗体としての生産性が安定するため、好ましい。
【００７０】
本発明の第三の側面では、薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列を含む発現カセットのみを提供する。これは、本発明の発現ベクターに限らず、いずれの発現ベクターにも適用できるものである。
【００７１】
本発明の第四の側面によれば、以下の工程を含む、高生産細胞を作製する方法が提供される。
（ａ）薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセット、遺伝子発現安定化エレメント、並びに目的タンパク質遺伝子発現カセットを有する発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程
（ｂ）形質転換された細胞を薬剤存在下で培養する工程
（ｃ）形質転換された細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下で培養する工程
（ｄ）高発現を示す細胞株を単離する工程。
【００７２】
本発明の側面の別の実施形態は、以下の工程を含む、高生産細胞を作製する方法である。
（ａ）薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセット、遺伝子発現安定化エレメント、並びに目的タンパク質遺伝子発現カセットを有する発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程
（ｂ）形質転換された細胞をヒポキサンチンおよびチミジン不含培地で培養する工程
（ｃ）形質転換された細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下で培養する工程
（ｄ）高発現を示す細胞株を単離する工程。
【００７３】
本発明の側面のさらなる別の実施形態は、以下の工程を含む、高生産細胞を作製する方法である。
（ａ）薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセット、遺伝子発現安定化エレメント、並びに目的タンパク質遺伝子発現カセットを有する発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程
（ｂ）形質転換された細胞を、ヒポキサンチンおよびチミジンを含まず、かつ薬剤存在下で培養する工程
（ｄ）形質転換された細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下で培養する工程
（ｅ）高発現を示す細胞株を単離する工程。
【００７４】
前記実施形態と同様、下記の工程を含む高生産細胞を作製する方法も提供される。
（ａ）薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列を含む発現カセット、遺伝子発現安定化エレメント、並びに目的タンパク質遺伝子発現カセットを有する発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程
（ｂ）形質転換された細胞を薬剤存在下で培養する工程
（ｃ）形質転換された細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下で培養する工程
（ｄ）高発現を示す細胞株を単離する工程。
【００７５】
（ａ）薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列を含む発現カセット、遺伝子発現安定化エレメント、並びに目的タンパク質遺伝子発現カセットを有する発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程
（ｂ）形質転換された細胞をヒポキサンチンおよびチミジン不含培地で培養する工程
（ｃ）形質転換された細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下で培養する工程
（ｄ）高発現を示す細胞株を単離する工程。
【００７６】
（ａ）薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列を含む発現カセット、遺伝子発現安定化エレメント、並びに目的タンパク質遺伝子発現カセットを有する発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程
（ｂ）形質転換された細胞を、ヒポキサンチンおよびチミジンを含まず、かつ薬剤存在下で培養する工程
（ｄ）形質転換された細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下で培養する工程
（ｅ）高発現を示す細胞株を単離する工程。
【００７７】
前記実施形態において、（ｃ）形質転換された細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下で培養する工程、及び（ｄ）高発現を示す細胞株を単離する工程は複数回繰り返すことができる。
【００７８】
宿主細胞としては、組換えタンパク質の産生に一般的に用いられるチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）の他、マウスミエローマ細胞（ＮＳＯ）、ベビーハムスターキドニー細胞（ＢＨＫ）、ヒト繊維肉腫細胞（ＨＴ１０８０）、ＣＯＳ細胞などの哺乳類由来の細胞が例示されるが、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）が好適に使用される。
【００７９】
宿主細胞がジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を欠損した細胞でなくても遺伝子増幅を含む本発明の効果を得ることができるが、ｄｈｆｒ遺伝子を有する発現ベクターにより形質転換された細胞のみが生き残れるようにするため、宿主細胞はｄｈｆｒ遺伝子欠損細胞を用いることが好ましい。ｄｈｆｒ遺伝子欠損細胞の具体例としては、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞やＣＨＯ ＤＵＫＸ−Ｂ１１細胞、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞などがある。
【００８０】
一般にバイオ医薬品などの工業生産には、ウイルスなどの有害成分の混入を排除するため、動物成分を含まない培地、より好ましくは化学的に組成の明らかな（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ）な培地で生産細胞を培養することが求められる。このため、一般的に使用されるウシ胎児血清などを含有した培地で高生産細胞をスクリーニングした後、１〜２ヶ月程度かけて動物成分非含有培地やＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄとされる培地へ細胞を適応させること（無血清馴化）が必要とされる。しかしながら、せっかく取得した高生産性細胞も上手く馴化できないケースもある。そこで、あらかじめ無血清馴化された細胞に遺伝子導入することは、無血清馴化工程を省略して生産細胞の樹立時間を短縮でき、非常に有効である。このような課題達成のため、本発明に用いられる宿主細胞には、ＣＨＯ細胞等における無血清馴化済み細胞を使用することがさらに例示される。
【００８１】
宿主細胞の形質転換方法は、当業者であれば適宜選択しうるが、例えばリポフェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション等が挙げられる。
【００８２】
形質転換された細胞を薬剤存在下で培養する工程において、薬剤選択に使用する薬剤は、薬剤選択マーカー遺伝子の種類に応じて決定される。また、使用する薬剤の濃度としては、一般に使用される濃度の範囲で高発現細胞の濃縮が可能であるが、少し高めの濃度が好ましい。最適な濃度は、宿主細胞や用いる培地の種類によって変化する。これらの濃度の設定方法は当業者にとっては公知であり、適宜設定しうる。例えば、１０％ウシ胎児血清を含むＩＭＤＭ培地での培養条件下で、ピューロマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列をこの順で含む発現カセットを有する発現ベクターで形質転換されたＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞に対するピューロマイシンの濃度としては、５μｇ／ｍｌ以上が好ましく、７．５μｇ／ｍｌ以上がより好ましく、上限として１５μｇ／ｍｌ以下が好ましい。同様に、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列をこの順で含む発現カセットを有する発現ベクターで形質転換されたＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞に対するピューロマイシンの濃度としては、５μｇ／ｍｌ以上が好ましく、７．５μｇ／ｍｌ以上がより好ましく、上限として１０μｇ／ｍｌ以下が好ましい。
【００８３】
本方法を使用した選別方法では、薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列を含む発現カセットを有する発現ベクターで形質転換した細胞の方が、薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含み、ｍＲＮＡ不安定化配列を含まない発現カセットを有する発現ベクターを形質転換して薬剤選択を行った細胞群に比べて、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する細胞の割合が有意に高くなる。本発明によれば、薬剤選択マーカーのｍＲＮＡ不安定化を含む薬剤選択のみによって、選別の候補となるサンプル数を大幅に絞ることができる。本発明の選別方法を用いれば、薬剤選択後も生存する細胞群（ポリクローン）の状態で目的タンパク質生産量が有意に上昇していて、これらの細胞群から細胞を単離し、培養することにより、容易に高発現を示す細胞株（モノクローン）を取得することができる。本発明の実施態様の一例として、４．０×１０５個の細胞に本発明の薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列を含む発現カセットが挿入されたベクターを遺伝子導入した後、薬剤選択を行って生じた細胞群から１００の細胞株をランダムに選択して、個々の細胞株の発現量を調べることにより目的タンパク質の高発現株を容易に取得することができる。
【００８４】
本発明の一部の実施形態において、形質転換された細胞をヒポキサンチンおよびチミジン（ＨＴ）不含培地中で培養する工程が含まれる。ｄｈｆｒ遺伝子欠損細胞は、細胞増殖のためにヒポキサンチンおよびチミジンを必要とし、培地にヒポキサンチンおよびチミジンを添加しなければ生育することができない。したがって、ヒポキサンチンおよびチミジン不含培地で培養することによって、ｄｈｆｒ遺伝子を含む発現ベクターにより形質転換が成功した細胞を選択することができる。ヒポキサンチンおよびチミジンの濃度は当業者であれば適宜設定しうる。
【００８５】
本発明は、形質転換された細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下で培養する工程を含む。ＭＴＸはＤＨＦＲの拮抗阻害剤であり、ＭＴＸ耐性を獲得しなければ細胞は生育することはできない。一般的に、動物細胞はｄｈｆｒ遺伝子の遺伝子増幅によりＭＴＸ耐性を獲得するが、その際にｄｈｆｒ遺伝子近傍に存在する他の遺伝子も同時に増幅されることを出願人らは利用している。ＭＴＸの濃度は１ｎＭ〜１０００ｎＭの間で使用することが望ましい。１ｎＭ未満であれば遺伝子増幅の効果が小さく、１０００ｎＭより高い濃度では細胞が死滅してしまう。ＭＴＸの存在下で培養する工程は、一定のＭＴＸの濃度下で培養しても良いし、まず低いＭＴＸ濃度で培養し、その後段階的に濃度を上昇させて培養しても良い。遺伝子増幅はすべての細胞に同時に起こるのではなく、一部の細胞でさまざまなタイミングで起こるため、ＭＴＸの濃度は低い濃度から段階的に上昇させることが好ましい。形質転換細胞を多段階のＭＴＸの濃度で培養する場合、宿主細胞をいきなり高濃度のＭＴＸにさらせば、遺伝子増幅が起こる前に死滅する細胞が多くなる。また、ＭＴＸの濃度を急激に上昇させれば、遺伝子増幅以外の機構でＭＴＸ耐性を獲得する細胞の出現頻度が高まる。
【００８６】
最適なＭＴＸ濃度および最適なＭＴＸ濃度を上昇させる方法は、細胞の種類、薬剤選択マーカー遺伝子の種類、薬剤選択マーカー遺伝子とジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子の配置、ｍＲＮＡ不安定化配列の有無により異なる。薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列を含む発現カセットを有する発現ベクターで宿主細胞を形質転換する場合、ＤＨＦＲの発現量はｍＲＮＡ不安定化配列により減弱されている。ＭＴＸ耐性も減弱されているため、ｍＲＮＡ不安定化配列を有さない薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセットを有する発現ベクターで形質転換された細胞に比べて低濃度のＭＴＸで遺伝子増幅の効果を得ることができる。一例として、ピューロマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列をこの順で含む発現カセットを有する発現ベクターで形質転換された細胞を培養する場合は、ＭＴＸ濃度は２０ｎＭ以下が好ましい。多段階のＭＴＸの濃度で培養する場合は、例えば１段階目は４ｎＭ、２段階目は１０ｎＭ、３段階目は２０ｎＭで培養することができる。
【００８７】
ＭＴＸ存在下で培養する工程は、形質転換細胞を薬剤存在下で培養する工程を行った後に行うことが好ましい。薬剤選択により、細胞の高発現領域に遺伝子導入された細胞群を取得することができるため、薬剤存在下で培養する工程の後に本工程をおこなうことにより、遺伝子増幅が高発現領域内で起こることになり、より効率的に遺伝子発現することを期待できるからである。
【００８８】
高生産を示す細胞株を単離する工程は、まず細胞群（ポリクローン）から細胞株を取得し、次いで細胞株の発現レベルを調べ、高生産を示す細胞株を選択することにより行われる。細胞群（ポリクローン）から細胞株を取得する方法としては、ポリクローンを限界希釈する方法がある。限界希釈は、例えばポリクローンの状態の細胞集団にトリプシン処理を行って細胞を分散し、細胞数が１．０／ウェル以下の濃度となるよう９６ウェルプレートに細胞を播種し培養することにより行うことができる。必要に応じて、希釈濃度を変更したり（例えば３．０細胞／ウェル以下の濃度など）、Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ Ｍｅｄｉｕｍと通常の培地を混合した培地で培養したりすることが当業者間では行われる。
【００８９】
細胞の発現レベルはレポーター遺伝子の発現量により調べることができる。一例として、ＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子（Ｃｏｖａｌｙｓ社）やＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子等の蛍光タンパク質遺伝子を含む発現カセットを本発明の発現ベクターに導入し、ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）等のフローサイトメーターを用いて蛍光強度を解析することにより調べることができる。別の例として、ルシフェラーゼ遺伝子を含む発現カセットを本発明による発現ベクターに導入後、細胞溶解液にＤ−ルシフェリンを添加してルミノメーターで発光量を測定することにより調べることができる。また、レポーター遺伝子に限らず、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）等を利用することで抗体等の目的タンパク質の発現を調べることもできる。
【００９０】
本工程は、形質転換された細胞を薬剤存在下で培養する工程の後、もしくは形質転換された細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下で培養する工程の後、または両工程の後のどの段階で行ってもよい。
【００９１】
本発明の第四の側面における高生産細胞を作製する方法をより具体的に例示する。
【００９２】
第一の例は、以下の手順で行う。（１）目的タンパク質遺伝子を挿入した本発明による発現ベクターをｄｈｆｒ遺伝子欠損宿主細胞にトランスフェクションする。（２）形質転換された細胞を薬剤（例えば、ジェネティシン）存在下で培養する。（３）高発現を示すポリクローン（細胞群）を選択し、ＭＴＸ存在下で培養する。（４）ＭＴＸ存在下で培養後さらに高発現を示すポリクローンを選択し、モノクローン（細胞株）に単離する。（５）それぞれの細胞株の発現量を調べ、高発現を示す細胞株を選択する。
【００９３】
第二の例は、以下の手順で行う。（１）目的タンパク質遺伝子を挿入した本発明による発現ベクターをｄｈｆｒ遺伝子欠損宿主細胞にトランスフェクションする。（２）形質転換された細胞を薬剤（例えば、ジェネティシン）存在下で培養する。（３）高い発現レベルを示すポリクローンを選択し、モノクローンに単離する。（４）それぞれの細胞株の発現量を調べ、高発現を示す細胞株を選択し、ＭＴＸ存在下で培養する。（５）ＭＴＸで選択培養後の細胞集団を再度限界希釈して細胞株を単離し、一定期間培養する。（６）（５）で単離された細胞株の発現量を調べ、高発現を示す細胞株を選択する。
【００９４】
第三の例は、以下の手順で行う。（１）目的タンパク質遺伝子を挿入した本発明による発現ベクターをｄｈｆｒ遺伝子欠損宿主細胞にトランスフェクションする。（２）形質転換された細胞をヒポキサンチンおよびチミジン（ＨＴ）不含培地で培養する。（３）ＨＴ不含条件下で高発現を示すポリクローンを選択し、ＭＴＸ存在下で培養する。（４）ＭＴＸ存在下で培養後さらに高発現を示すポリクローンを選択し、モノクローンに単離する。（５）それぞれのモノクローンの発現量を調べ、高発現を示す細胞株を選択する。
【００９５】
第四の例は、以下の手順で行う。（１）目的タンパク質遺伝子を挿入した本発明による発現ベクターをｄｈｆｒ遺伝子欠損宿主細胞にトランスフェクションする。（２）形質転換された細胞を、ヒポキサンチンおよびチミジン（ＨＴ）を含まない培地で、薬剤（例えば、ジェネティシン）存在下で培養する。（３）高発現を示すポリクローンを選択し、ＭＴＸ存在下で培養する。（４）ＭＴＸ存在下で培養後さらに高発現を示すポリクローンを選択し、モノクローンに単離する。（５）それぞれの細胞株の発現量を調べ、高発現を示す細胞株を選択する。
【００９６】
第五の例は、以下の手順で行う。（１）目的タンパク質遺伝子を挿入した本発明による発現ベクターをｄｈｆｒ遺伝子欠損宿主細胞にトランスフェクションする。（２）形質転換された細胞を、ヒポキサンチンおよびチミジン（ＨＴ）を含まない培地で、薬剤（例えば、ジェネティシン）存在下で培養する。（３）高発現を示すポリクローンを選択し、モノクローンに単離する。（４）高発現を示す細胞株を選択し、ＭＴＸ存在下で培養する。（５）ＭＴＸで選択培養後の細胞集団を再度限界希釈して細胞株を単離し、一定期間培養する。（６）（５）で単離された細胞株の発現量を調べ、高発現を示す細胞株を選択する。
【００９７】
第六の例は、以下の手順で行う。（１）目的タンパク質遺伝子を挿入した本発明による発現ベクターをｄｈｆｒ遺伝子欠損宿主細胞にトランスフェクションする。（２）形質転換された細胞を、ヒポキサンチンおよびチミジン（ＨＴ）を含まない培地で、薬剤（例えば、ジェネティシン）存在下で培養する。（３）高発現を示すポリクローンを選択し、モノクローンに単離する。（４）高発現を示す細胞株を選択し、ＭＴＸ存在下で培養する。（５）ＭＴＸで選択培養後の細胞集団を再度限界希釈して細胞株を単離し、一定期間培養する。（６）（５）で単離された細胞株の発現量を調べ、高発現を示す細胞株を選択する。（７）再度ＭＴＸ存在下で一定期間培養する。（８）（７）で単離された細胞株の発現量を調べ、高発現を示す細胞株を選択する。
【００９８】
本発明により、細胞選別の工程及び時間を大幅に短縮することができると共に、高発現を示す細胞の割合が上昇することにより、短時間で効率的に目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する細胞を取得することができ、従来技術と比べて極めて顕著な効果を示す。
【００９９】
本発明の第五の側面は、本発明の第四の側面における方法により得られた形質転換細胞である。
【０１００】
本発明の第六の側面によれば、本発明の第四の側面における方法により得られた形質転換細胞を用いることを特徴とする、タンパク質を生産する方法が提供される。
【０１０１】
一つの実施態様では、生産されるタンパク質は、抗体である。この場合、抗体の重鎖ポリペプチド遺伝子と軽鎖ポリペプチド遺伝子は同一のベクター（シングルベクター）に挿入されていても良いし、それぞれ異なるベクターに挿入されて２コンストラクトとされていても良い。
【０１０２】
哺乳類の抗体には、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥの５種類のクラスが存在することが明らかとなっているが、ヒトの各種疾患の診断、予防及び治療には血中半減期が長く、各種エフェクター機能を有する等の機能特性からヒトＩｇＧクラスの抗体が主として利用されている。抗体は、形質転換細胞の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる。また、その他に通常、タンパク質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、二次元電気泳動等により測定することができる。
【０１０３】
本発明の方法により生産された抗体は、医薬として使用することができる。かかる医薬は、治療薬として単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野にて公知の任意の方法により製造した医薬製剤として提供されるのが好ましい。
【０１０４】
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができ、抗体製剤の場合、好ましくは静脈内投与をあげることができる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
【０１０５】
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
【０１０６】
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。または、ヒト化抗体を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を調製することもできる。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該化合物そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該化合物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。
【０１０７】
担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該化合物および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
【０１０８】
別の実施態様では、生産されるタンパク質は、ワクチンである。
【０１０９】
ワクチンとしては、病原体のエピトープのアミノ酸配列からなるタンパク質をワクチンとして使用することができる。また、ウイルス体の構成タンパク質すべてを生産するのみならず、エンベロープタンパク等を生産し、ワクチンとして使用することができる。
【０１１０】
ワクチンは任意の経路の投与のための製剤とすることができる。粘膜型投与、例えば、経口経路、経鼻経路、経気道経路、経膣経路、経直腸経路の他、非粘膜経路による投与、例えば皮下、静脈内もしくは筋肉内投与のためのワクチン製剤が挙げられる。
【実施例】
【０１１１】
以下、実施例を例示することによって、本発明の効果をより一層明確なものとする。
【０１１２】
実施例１
各種プラスミドベクターの構築
実施例１−１
ｍＲＮＡ不安定化配列を有するベクター
（１）ｐＰＵＲ・Ｎ４の構築
図１に示すスキームに従って、ｐＰＵＲ（クロンテック社製）のＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子のコード配列の３‘末端に、配列番号１、２のプライマーとＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（東洋紡績社製）を用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、ＡＲＥ配列モチーフＴＴＡＴＴＴＡＴＴの４回繰り返し配列（以下、「Ｎ４」と言う。）を挿入してｐＰＵＲ・Ｎ４を構築した。
【０１１３】
（２）ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２の構築
次に、目的遺伝子発現カセットのプロモーターをＥＦ１αプロモーターに置換したプラスミドを構築した。本実験では、図２に示すスキームに従って構築されたプラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２を利用した。即ち、まず、ＣＭＶプロモーターをＥＦ−１αプロモーターに置換したｐＣＩ−ｎｅｏプラスミド（プロメガ社製）の制限酵素ＸｂａＩ−ＮｏｔＩサイトに抗ＫＯＤ抗体の重鎖を挿入したプラスミドのｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号３、４のプライマーを使って発現カセット上流に制限酵素ＳａｌＩおよびＮｈｅＩサイトを付加したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥを構築した。更に本プラスミドを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号５、６のプライマーを使って発現カセット下流に制限酵素ＢｓｉＷＩおよびＸｈｏＩサイトを付加して構築されたプラスミドがｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２である。
【０１１４】
このｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２を用いて、図３に示すスキームに従って、プラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４およびｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２を構築した。即ち、プラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２から制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩで抗ＫＯＤ抗体の重鎖遺伝子を切出した。一方、ＳＮＡＰｍ発現プラスミドｐＳＮＡＰｍからＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子を配列番号７、８のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２プラスミドの制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩサイトに導入してｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２を構築した。本プラスミドから制限酵素ＡｆｌＩＩ、ＢｓｔＢＩでネオマイシン耐性遺伝子を切出した。一方、前記（１）で構築したｐＰＵＲ・Ｎ４から下流にＮ４配列を付加したＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子を配列番号９，１０のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−ＲＥ２プラスミドの制限酵素ＡｆｌＩＩ、ＢｓｔＢＩサイトに導入してｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４を構築した。続いて、本プラスミドを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号１１、１２のプライマーを使ってＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子下流のＮ４配列を削除したプラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２を構築した。
【０１１５】
実施例１−２
ｍＲＮＡ不安定化配列と遺伝子発現安定化エレメントとを有するベクター
（１）ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの構築
本実験では図４に記載のｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ／１．１ｋを利用した。即ち、まず、実施例１−１の途中で構築されたｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２の発現カセット上流の制限酵素ＮｈｅＩ、ＢｇｌＩＩサイトに、配列番号１３、１４のプライマーセットを使ってＰＣＲで増幅した被検配列ＣＨＯ５Δ３−３（配列番号１５の４１６０１番目〜４２７００番目からなる塩基配列。以下、コンストラクト中では１．１ｋと表記）を挿入して、プラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋを構築した。更にプラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋの発現カセット下流の制限酵素ＢｓｉＷＩ、ＸｈｏＩサイトに配列番号１６、１７のプライマーセットを使ってＰＣＲで増幅した被検配列ＣＨＯ５Δ３−３を挿入して構築されたプラスミドがｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ／１．１ｋである。
【０１１６】
一方、実施例１−１で構築したプラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４およびｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２を鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号１８、１９のプライマーを使ってＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子内に存在する制限酵素ＢｓｉＷＩサイトを削除したプラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ４およびｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２−ＲＥ２を構築した。
【０１１７】
続いて、図５に示すスキームに従って、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。即ち、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ４、から制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢｓｉＷＩで、ＳＮＡＰｍ−ｐＡ−ＳＶ４０Ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ｐｕｒ２・Ｎ４−ｐＡを切出し、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ／１．１ｋの制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢｓｉＷＩサイトに導入してｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。
【０１１８】
実施例１−３
発現ベクターにおける各配列要素から制限酵素認識配列を削除したベクター
（１）遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３からの制限酵素認識配列の削除
続いて、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３から制限酵素認識配列を削除した。まず、実施例１−２に記載のｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号２２、２３のプライマーを使ってＣＨＯ５Δ３−３内に存在する制限酵素ＳａｃＩサイトを削除したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥを構築した。次に、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号２４、２５のプライマーを使ってＣＨＯ５Δ３−３内に存在する制限酵素ＳｍａＩサイトを削除したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ２を構築した。更に、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ２を鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号２６、２７のプライマーを使ってＣＨＯ５Δ３−３内に存在する制限酵素ＢａｍＨＩサイトを削除したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ３を構築した。最後に、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ３を鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号２８、２９のプライマーを使ってＣＨＯ５Δ３−３内に存在する制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイトを削除したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ４を構築した。
【０１１９】
（２）ｐＥＨＸの構築
マルチクローニングサイトと、上記実施例１−３（１）で作成した４箇所の制限酵素認識配列を削除した遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセット上流および下流に配する図６に記載のｐＥＨＸを構築した。具体的には、実施例１−２に記載のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ４を鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号３０、３１のプライマーを使ってＳＶ４０ ｐｒｏｍｏｔｅｒ下流に存在する制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイトを削除したｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ４−ΔＨを構築した。続いて、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ４−ΔＨを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号３２、３３のプライマーを使ってＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子内に存在する制限酵素ＳａｌＩサイトを削除したｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ３・Ｎ４−ΔＨを構築した。更に、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ３・Ｎ４−ΔＨを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号３４、３５のプライマーを使ってＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子内に存在する制限酵素ＳｍａＩサイトを削除したｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨを構築した。その後、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号３６、３７のプライマーを使ってｆ１ ｏｒｉを削除したｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１を構築した。次に、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１を鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号３８、３９のプライマーを使って制限酵素ＮｈｅＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩサイトを挿入したｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１−ＲＥを構築した。続いて、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１−ＲＥを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号４０、４１のプライマーを使って制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢｓｉＷＩ、ＸｂａＩ、ＢｃｌＩサイトを挿入したｐＥＦ１α−ＭＣＳｐｒｅ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１−ＲＥを構築した。そして、ｐＥＦ１α−ＭＣＳｐｒｅ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１−ＲＥのＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩサイトに、配列番号４２、４３のプライマーを混合後、９５度から６０度まで徐々に温度を下げアニールさせて作成したＤＮＡ断片を挿入し、ｐＥＦ１α−ＭＣＳ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１−ＲＥを構築した。次に、ｐＥＦ１α−ＭＣＳ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１−ＲＥのＮｈｅＩ、ＥｃｏＲＩサイトに、配列番号４４、４５のプライマーセットを使ってｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ４を鋳型にＰＣＲで増幅した、４箇所の制限酵素認識配列を削除したＣＨＯ５Δ３−３を挿入し、ｐＥＦ１α−ＭＣＳ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−１．１ｋを構築した。更に、ｐＥＦ１α−ＭＣＳ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−１．１ｋのＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩサイトに、配列番号１６、４６のプライマーセットを使ってｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ４を鋳型にＰＣＲで増幅した、４箇所の制限酵素認識配列を削除したＣＨＯ５Δ３−３を挿入し、ｐＥＨＸを構築した。
【０１２０】
実施例１−４
抗体遺伝子を挿入した、各配列要素から制限酵素認識配列を削除したベクター
【０１２１】
（１）ｐＥＬＸの構築
マルチクローニングサイトを含む図７に記載のｐＥＬＸを構築した。
【０１２２】
具体的には、ＣＭＶプロモーターをＥＦ１αプロモーターに変更したｐＣＩ−ｎｅｏプラスミド（プロメガ社製）の制限酵素ＸｂａＩ−ＮｏｔＩサイトに抗ＫＯＤ抗体の軽鎖を挿入したプラスミドのｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号３、４のプライマーを使って発現カセット上流に制限酵素ＳａｌＩおよびＮｈｅＩサイトを付加したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥを構築した。更に本プラスミドを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号５、６のプライマーを使って発現カセット下流に制限酵素ＢｓｉＷＩおよびＸｈｏＩサイトを付加して、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥ２プラスミドを構築した。このｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥ２をＡｆｌＩＩ、ＢｓｔＢＩで処理し、ネオマイシン耐性遺伝子を切出した。一方、ｐＴＫ−Ｈｙｇ（クロンテック社製）からハイグロマイシン耐性遺伝子を配列番号４７、４８のプライマーを使ってＰＣＲで増幅し、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥ２の制限酵素ＡｆｌＩＩ、ＢｓｔＢＩサイトに導入してｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ２を構築した。
【０１２３】
ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ２を鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号４９、５０のプライマーを使って制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＳａｌＩサイトを挿入したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ３を構築した。続いて、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ３を鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号５１、５２のプライマーを使って、ｆ１ ｏｒｉとハイグロマイシン耐性遺伝子の発現カセットを削除し、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩサイトを挿入したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥ４を構築した。その後、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥ４を鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号４０、４１のプライマーを使って制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢｓｉＷＩ、ＸｂａＩ、ＢｃｌＩサイトを挿入したｐＥＦ１α−ＭＣＳｐｒｅ−ＲＥ４を構築した。そして、ｐＥＦ１α−ＭＣＳｐｒｅ−ＲＥ４の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩサイトに、配列番号４２、４３のプライマーを混合後、９５度から６０度まで徐々に温度を下げアニールさせて作成したＤＮＡ断片を挿入し、ｐＥＬＸを構築した。
【０１２４】
（２）ｐＥＬＸ２の構築
実施例１−４（１）で構築したｐＥＬＸの発現カセット下流に、４箇所の制限酵素認識配列を削除した遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を配した、図８に記載のｐＥＬＸ２を構築した。具体的には、実施例１−４（１）で構築したｐＥＬＸを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号５１、５３のプライマーを使って発現カセット下流に制限酵素ＮｈｅＩサイトを追加したｐＥＬＸ−Ｎを構築した。そして、ｐＥＬＸ−ＮのＮｈｅＩ、ＥｃｏＲＩサイトに、配列番号１３、５４のプライマーセットを使って、実施例１−３で構築したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ４を鋳型にＰＣＲで増幅した、４箇所の制限酵素認識配列を削除したＣＨＯ５Δ３−３を挿入し、ｐＥＬＸ２を構築した。
【０１２５】
（３）ｐＥＬ２（ＫＯＤ３Ｇ８）の構築
ｐＥＬＸ２の制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩサイトに、抗ＫＯＤ抗体の軽鎖遺伝子を挿入しｐＥＬ２（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。具体的には、実施例１−４（１）に記載のｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣから配列番号２０，２１のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩで処理して調製した抗ＫＯＤ抗体の軽鎖遺伝子を、ｐＥＬＸ２の制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩサイトに導入して、ｐＥＬ２（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。
【０１２６】
実施例２
抗ＫＯＤ抗体発現系における、ピューロマイシン耐性遺伝子とｄｈｆｒ遺伝子の融合タンパク質遺伝子とmRNA不安定化配列の組み合わせ効果の検討
続いて、ｄｈｆｒ遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子とｄｈｆｒ遺伝子の融合タンパク質遺伝子、および、ピューロマイシン耐性遺伝子とｄｈｆｒ遺伝子の融合タンパク質遺伝子の下流にmRNA不安定化配列を付加したもの、それぞれの効果を比較検討するため、抗ＫＯＤ抗体発現系においてピューロマイシンで選択して取得したモノクローンの細胞を、更にＭＴＸで選択して得られたポリクローンの細胞の生産性を評価した。
実施例２−１
ｄｈｆｒ遺伝子を有する発現ベクターの構築
（１）ｐＥＨＸ−ｄｈｆｒ・Ｎ４の構築
実施例１−３で構築したｐＥＨＸへｄｈｆｒ遺伝子の発現カセットを挿入した、図９に記載のｐＥＨＸ−ｄｈｆｒ・Ｎ４を構築した。具体的には、ｐＥＨＸのＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩサイトに、配列番号５５、５６のプライマーセットを使ってｐＥＨＸを鋳型にＰＣＲで増幅し、制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＸｈｏＩで処理して調製したＳＶ４０ ｐｒｏｍｏｔｅｒを挿入し、ｐＥＨＸ−ｐを構築した。続いて、ｐＥＨＸ−ｐのＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩサイトに、配列番号５７、５８のプライマーセットを使って実施例１−３に記載のｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ４を鋳型にＰＣＲで増幅し、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩで処理して調製した、４箇所の制限酵素認識配列を削除したＣＨＯ５Δ３−３を挿入し、ｐＥＨＸ−ｐ２を構築した。次に、ｐＥＨＸ−ｐ２のＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩサイトに、配列番号５９、６０のプライマーセットを使ってｐＥＨＸを鋳型にＰＣＲで増幅し、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩで処理して調製したＳＶ４０ ｐＡを挿入し、ｐＥＨＸ−ｐ３を構築した。一方、ｄｈｆｒ遺伝子の３’末端にタンパク質分解促進配列のＰＥＳＴ配列を付加した配列番号６１のＤＮＡを人工合成して、プラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社製）にＴＯＰＯ ＴＡクローニングし、ｐＣＲ２．１−ｄｈｆｒ・ＰＥＳＴを構築した。続いて、ｐＣＲ２．１−ｄｈｆｒ・ＰＥＳＴを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号６２、６３のプライマーを使って、ｄｈｆｒ遺伝子の３’末端からＰＥＳＴ配列を削除しＮ４配列を付加したｐＣＲ２．１−ｄｈｆｒ・Ｎ４を構築した。そして、ｐＥＨＸ−ｐ３のＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩサイトに、配列番号６４、６５のプライマーセットを使ってｐＣＲ２．１−ｄｈｆｒ・Ｎ４を鋳型にＰＣＲで増幅し、制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＳａｌＩで処理して調製したＤＮＡ断片を挿入し、ｐＥＨＸ−ｄｈｆｒ・Ｎ４を構築した。
【０１２７】
（２）ピューロマイシン耐性遺伝子（上流）とｄｈｆｒ遺伝子（下流）の融合タンパク質遺伝子を有する発現ベクター：ｐＥＨＸ−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ、ｐＥＨＸ−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４の構築
図１０に示すスキームに従って、実施例１−３で構築したｐＥＨＸ中の、Ｎ４配列を下流に付加したピューロマイシン耐性遺伝子の代わりに、ピューロマイシン耐性遺伝子とｄｈｆｒ遺伝子の融合タンパク質遺伝子、あるいは、Ｎ４配列を下流に付加したピューロマイシン耐性遺伝子とｄｈｆｒ遺伝子の融合タンパク質遺伝子を挿入した、ｐＥＨＸ−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ、および、ｐＥＨＸ−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４を構築した。具体的には、まず、配列番号３６、６６のプライマーセットを使ってｐＥＨＸを鋳型にＰＣＲで増幅したＳＶ４０ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ピューロマイシン耐性遺伝子から成るＤＮＡ断片と、配列番号６７、６８、あるいは、配列番号６７、６９のプライマーセットを使ってｐＣＲ２．１−ｄｈｆｒ・Ｎ４を鋳型にＰＣＲで増幅したｄｈｆｒ遺伝子、あるいは、ｄｈｆｒ遺伝子、Ｎ４配列から成るＤＮＡ断片を、ｏｖｅｒｌａｐ−ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲによりアセンブリし、配列番号３６、６８、あるいは、配列番号３６、６９のプライマーセットを使って、ＳＶ４０ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ピューロマイシン耐性遺伝子、ｄｈｆｒ遺伝子から成るＤＮＡ断片、あるいは、ＳＶ４０ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ピューロマイシン耐性遺伝子、ｄｈｆｒ遺伝子、Ｎ４配列から成るＤＮＡ断片を調製した。これらのＤＮＡ断片をＫｐｎＩ、Ｃｓｐ４５Ｉで消化し、ｐＥＨＸのＫｐｎＩ、Ｃｓｐ４５Ｉサイトに挿入し、ｐＥＨＸ−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ、および、ｐＥＨＸ−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４を構築した。
【０１２８】
（３）抗ＫＯＤ抗体発現ベクター：ｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）、ｐＥＬＨ２−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ（ＫＯＤ３Ｇ８）、ｐＥＬＨ２−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）の構築
続いて、抗ＫＯＤ抗体発現系で遺伝子増幅の効果を確認すべく、ｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）、ｐＥＬＨ２−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ（ＫＯＤ３Ｇ８）、および、ｐＥＬＨ２−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。
【０１２９】
まず、ｐＥＨＸ−ｄｈｆｒ・Ｎ４、ｐＥＨＸ−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ、および、ｐＥＨＸ−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４の制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩサイトに、それぞれ抗ＫＯＤ抗体の重鎖遺伝子を挿入し、ｐＥＨ−ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）、ｐＥＨ−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ（ＫＯＤ３Ｇ８）、および、ｐＥＨ−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。具体的には、実施例１−１に記載のｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣから配列番号２０，２１のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩで処理して調製した抗ＫＯＤ抗体の重鎖遺伝子を、ｐＥＨＸ−ｄｈｆｒ・Ｎ４、ｐＥＨＸ−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ、および、ｐＥＨＸ−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４の制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩサイトに導入して、ｐＥＨ−ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）、ｐＥＨ−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ（ＫＯＤ３Ｇ８）、および、ｐＥＨ−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。
【０１３０】
そして、図１１に示すスキームに従って、実施例１−４に記載のｐＥＬ２（ＫＯＤ３Ｇ８）をＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｃａＩで処理して調製した抗ＫＯＤ抗体の軽鎖発現カセットを、ｐＥＨ−ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）の制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩサイトに挿入し、ｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。同様にして、図１２に示すスキームに従って、ｐＥＬ２（ＫＯＤ３Ｇ８）をＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｃａＩで処理して調製した抗ＫＯＤ抗体の軽鎖発現カセットを、ｐＥＨ−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ（ＫＯＤ３Ｇ８）、および、ｐＥＨ−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）の制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩサイトに挿入し、ｐＥＬＨ２−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ（ＫＯＤ３Ｇ８）、ｐＥＬＨ２−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。
【０１３１】
実施例２−２
抗ＫＯＤ抗体発現系においてピューロマイシンで選択して取得したポリクローンの細胞の生産性評価
【０１３２】
ｄｈｆｒ欠損株のＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−９０９６）を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整し、１２ウェルプレートに２ｍｌずつ前日に播種し、一晩培養して、トランスフェクション用のＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞を準備した。この際、培地として１０％牛胎児血清、４ｍＭ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ナカライ社製）、１ｘＨＴサプリメント（インビトロジェン社製）を添加したＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（シグマ社製）を使用した。
【０１３３】
一方、実施例２−１で構築した抗ＫＯＤ抗体発現ベクターを制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした。トランスフェクションは、リニア化したプラスミド１．６μｇを２００μｌ Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍで希釈した後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ（インビトロジェン社製）４μｌを加え、３０分間放置した後、この混合液を前記ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞に加え、２４時間インキュベートすることにより行った。トランスフェクションの１日後、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、１０μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、１０％牛胎児血清、４ｍＭ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを添加したＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ中で２週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、１ウェル当たり１．８４×１０５細胞を６ウェルプレートに播き込んだ。
【０１３４】
３日間培養後、培養上清を回収し、ピューロマイシンで選択して取得したポリクローンの細胞でのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量をＥＬＩＳＡにて測定した。標準品から作成した検量線をもとに抗体濃度を算出した。
【０１３５】
具体的には、３０μｇ／ｍｌ濃度のＫＯＤ１由来のＤＮＡポリメラーゼ抗原を固相化したＥＬＩＳＡプレートに、培養上清を添加し、３５℃で２時間インキュベートした。次に、ＰＢＳ−Ｔ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝生理食塩水）で３回洗浄し、１００００倍希釈した抗マウス抗体−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ社製）を５０μｌ添加して３５℃で１時間インキュベートした後、さらにＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＴＭＢ＋（３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ；ＤＡＫＯ社製）で５分間反応させた。５０μｌの１Ｎ硫酸を加えて反応停止後、プレートリーダー（製品名 ；ＳＰＥＣＴＲＡ ＣＬＡＳＳＩＣ、ＴＥＣＡＮ Ａｕｃｔｒｉａ社製）（主波長４５０ｎｍ、副波長６２０ｎｍ）で吸光度を測定した。なお、標準品として、ＫＯＤ１由来のＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体を産生するマウスハイブリドーマ細胞系３Ｇ８（入手先：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６０５６）から得られた抗体を用いた。
【０１３６】
結果を図１３に示す。その結果、ピューロマイシン耐性遺伝子、ｄｈｆｒ遺伝子の両方の発現カセットを含むｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）では、ピューロマイシン耐性遺伝子にｍＲＮＡ不安定化配列を付加しているにも関わらず、発現量は低かった。発現量が低い原因として、４つの発現カセットを１つのコンストラクトにコードさせたことによる転写干渉が考えられた。一方、ピューロマイシン耐性遺伝子とｄｈｆｒ遺伝子の融合タンパク質遺伝子を採用したｐＥＬＨ２−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ（ＫＯＤ３Ｇ８）では、発現カセットを３つに減らすことができ、ｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）と比較すると発現量は高い値となった。さらに、ピューロマイシン耐性遺伝子とｄｈｆｒ遺伝子の融合タンパク質遺伝子にｍＲＮＡ不安定化配列を付加して弱化させたｐＥＬＨ２−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）では、ポリクローンでの発現量は極めて高く、ｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）の約１．９倍、ｐＥＬＨ２−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ（ＫＯＤ３Ｇ８）の約１．５倍の生産量を示すことがわかった。
【０１３７】
実施例２−３
抗ＫＯＤ抗体発現系においてピューロマイシンで選択して取得したモノクローンの細胞の生産性評価
【０１３８】
続いて、モノクローンでの生産性を比較すべく、限界希釈を行った。具体的には、前記実施例２−２で取得したＫＯＤ３Ｇ８抗体を安定導入したポリクローンの細胞を、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、０．７５細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに播き込んだ。２週間培養後、培養上清を回収し、ＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を前記実施例２−２と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。標準品から作成した検量線をもとに各クローンの抗体生産量を算出した。そして、選択した発現量上位クローンを拡大培養した後、１ウェル当たり１．８４×１０５細胞を６ウェルプレートに播き込んだ。３日間培養後、培養上清を回収し、ピューロマイシンで選択して取得したモノクローンの細胞でのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を前記実施例２−２と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。
【０１３９】
標準品から作成した検量線をもとに各クローンの抗体生産量を算出した。結果を図１４に示す。その結果、ポリクローンでの結果と同様、ピューロマイシン耐性遺伝子、ｄｈｆｒ遺伝子の両方の発現カセットを含むｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）では最大６ｍｇ／Ｌであったが、ピューロマイシン耐性遺伝子とｄｈｆｒ遺伝子の融合タンパク質遺伝子を採用したｐＥＬＨ２−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ（ＫＯＤ３Ｇ８）では、最大１０ｍｇ／Ｌであった。一方、ピューロマイシン耐性遺伝子とｄｈｆｒ遺伝子の融合タンパク質遺伝子にｍＲＮＡ不安定化配列を付加して弱化させたｐＥＬＨ２−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）では、発現量がさらに顕著に高く、その値は最大で１８ｍｇ／Ｌに達した。
【０１４０】
実施例２−４
抗ＫＯＤ抗体発現系においてピューロマイシンで選択して取得したモノクローンの細胞を、更にＭＴＸで選択して取得したポリクローンの細胞の生産性評価
【０１４１】
次に、前記実施例２−３で取得した、各々の抗ＫＯＤ抗体発現ベクターを遺伝子導入し、ピューロマイシンで選択して取得した発現量上位１０クローンずつについて、１０μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、透析した１０％牛胎児血清、４ｍＭ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを添加したＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ中で２週間継代培養した。その後、更に、１０ｎＭ ＭＴＸ（シグマ社製）、１０μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、透析した１０％牛胎児血清、４ｍＭ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを添加したＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ中で６週間選択培養を行った。
【０１４２】
選択培養終了後、得られたポリクローンの細胞を２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、１ウェル当たり１．８４×１０５細胞を６ウェルプレートに播き込んだ。３日間培養後、培養上清を回収し、ＭＴＸで選択して取得したポリクローンの細胞でのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を、前記実施例２−２と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。
【０１４３】
標準品から作成した検量線をもとに抗体濃度を算出した。結果を図１５に示す。その結果、ｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）では、ＭＴＸでの選択により２倍程度の発現量の上昇が見られたが、最も生産性の高いものでも１１ｍｇ／Ｌであった。一方、ｐＥＬＨ２−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ（ＫＯＤ３Ｇ８）では、最も生産性の高いものでも１２ｍｇ／Ｌであった。原因としては、ｄｈｆｒ遺伝子が弱化されていないため、ＭＴＸ選択による発現量の上昇はあまり見られなかったと考えられる。他方、ピューロマイシンで選択した時点で発現量の高いクローンを取得できていたｐＥＬＨ２−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）では、ＭＴＸでの選択により２倍程度の発現量の上昇が見られ、最も生産性の高いものは４５ｍｇ／Ｌであった。ピューロマイシン耐性遺伝子とｄｈｆｒ遺伝子を融合させて選択遺伝子とし、更にその3‘末端にｍＲＮＡ不安定化配列を付加して弱化させた発現カセットを使用することで、相乗効果によって効果的に発現量の上昇が可能であった。
【０１４４】
実施例３
ｄｈｆｒ遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子の配置順序の検討
続いて、ｄｈｆｒ遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子の配置順序を検討するため、上流側にｄｈｆｒ遺伝子を配置し下流側にピューロマイシン耐性遺伝子を配置した融合タンパク質遺伝子を有する発現ベクターを構築し、抗ＫＯＤ抗体発現系においてピューロマイシンで選択して取得したモノクローンの細胞を、更にＭＴＸで選択して得られたポリクローンの細胞の生産性を評価した。
実施例３−１
ｄｈｆｒ遺伝子を有する発現ベクターの構築
（１）ｄｈｆｒ遺伝子（上流）とピューロマイシン耐性遺伝子（下流）の融合タンパク質遺伝子を有する発現ベクター：ｐＥＨＸ−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４の構築
図１６に示すスキームに従って、実施例１−３で構築したｐＥＨＸ中の、Ｎ４配列を下流に付加したピューロマイシン耐性遺伝子の代わりに、Ｎ４配列を下流に付加したｄｈｆｒ遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子の融合タンパク質遺伝子を挿入したｐＥＨＸ−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４を構築した。具体的には、まず、配列番号１１、７０のプライマーセットを使ってｐＥＨＸ−ｄｈｆｒ・Ｎ４を鋳型にＰＣＲで増幅したＳＶ４０ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｄｈｆｒ遺伝子から成るＤＮＡ断片と、配列番号６９、７１のプライマーセットを使ってｐＥＨＸを鋳型にＰＣＲで増幅したＮ４配列を下流に付加したピューロマイシン耐性遺伝子を、ｏｖｅｒｌａｐ−ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲによりアセンブリ、配列番号１１、６９のプライマーセットを使って、ＳＶ４０ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｄｈｆｒ遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、Ｎ４配列から成るＤＮＡ断片を調製した。このＤＮＡ断片をＫｐｎＩ、Ｃｓｐ４５Ｉで消化し、ｐＥＨＸのＫｐｎＩ、Ｃｓｐ４５Ｉサイトに挿入し、ｐＥＨＸ−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４を構築した。
【０１４５】
（２）抗ＫＯＤ抗体発現ベクター：ｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）の構築
続いて、抗ＫＯＤ抗体発現系で遺伝子増幅の効果を確認すべく、ｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。
【０１４６】
まず、ｐＥＨＸ−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４の制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩサイトに抗ＫＯＤ抗体の重鎖遺伝子を挿入し、ｐＥＨ−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。具体的には、実施例１−１に記載のｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣから配列番号２０，２１のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩで処理して調製した抗ＫＯＤ抗体の重鎖遺伝子を、ｐＥＨＸ−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４の制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩサイトに導入して、ｐＥＨ−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。
【０１４７】
そして、図１７に示すスキームに従って、実施例１−４に記載のｐＥＬ２（ＫＯＤ３Ｇ８）をＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｃａＩで処理して調製した抗ＫＯＤ抗体の軽鎖発現カセットを、ｐＥＨ−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）の制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩサイトに挿入し、ｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。
【０１４８】
実施例３−２
抗ＫＯＤ抗体発現系においてピューロマイシンで選択して取得したポリクローンの細胞の生産性評価
ｄｈｆｒ遺伝子をピューロマイシン耐性遺伝子の上流に配置した効果を抗ＫＯＤ抗体発現系で検討した。ｄｈｆｒ遺伝子をピューロマイシン耐性遺伝子の上流に配した抗ＫＯＤ抗体発現用シングルベクターとして、実施例３−１で構築したｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）を、ｄｈｆｒ遺伝子をピューロマイシン耐性遺伝子の下流に配した抗ＫＯＤ抗体発現用シングルベクターとして、実施例２−１で構築したｐＥＬＨ２−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）を用いた。制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズしたプラスミド１．６μｇを、実施例２−２に記載の方法で準備しておいたＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞にトランスフェクションし、２４時間インキュベートした。翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、７．５μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、１０％牛胎児血清、４ｍＭ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを添加したＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ中で２週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、１ウェル当たり１．８４×１０５細胞を６ウェルプレートに播き込んだ。３日間培養後、培養上清を回収し、ピューロマイシンで選択して取得したポリクローンの細胞でのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を前記実施例２−２と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。
【０１４９】
標準品から作成した検量線をもとに抗体生産量を算出した。結果を図１８に示す。ｄｈｆｒ遺伝子をピューロマイシン耐性遺伝子の下流に配したｐＥＬＨ２−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）、および、ｄｈｆｒ遺伝子をピューロマイシン耐性遺伝子の上流に配置したｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）の抗体生産量は共に７ｍｇ／Ｌと高い値であった。また、両者に差は認められず、ｄｈｆｒ遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子はどちらが上流に配置された場合でも、ピューロマイシンで選択後に高発現細胞集団の取得が可能であることがわかった。
【０１５０】
実施例３−３
抗ＫＯＤ抗体発現系においてピューロマイシンで選択して取得したモノクローンの細胞の生産性評価
【０１５１】
続いて、モノクローンでの生産性を比較すべく、限界希釈を行った。具体的には、前記実施例３−２で取得したｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）を遺伝子導入し、ピューロマイシンで選択して取得したポリクローンの細胞を、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、０．７５細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに播き込んだ。２週間培養後、培養上清を回収し、ＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を前記実施例２−２と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。標準品から作成した検量線をもとに各クローンの抗体生産量を算出した。そして、選択した発現量上位クローンを拡大培養した後、１ウェル当たり１．８４×１０５細胞を６ウェルプレートに播き込んだ。３日間培養後、培養上清を回収し、ピューロマイシンで選択して取得したモノクローンの細胞でのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を前記実施例２−２と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。
【０１５２】
標準品から作成した検量線をもとに各クローンの抗体生産量を算出した。結果を図１９に示す。その結果、ポリクローンでの結果と同様、ｄｈｆｒ遺伝子をピューロマイシン耐性遺伝子の上流に配置したｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）では、発現量が高いクローンを取得でき、その値は最大で２２ｍｇ／Ｌに達した。
【０１５３】
実施例３−４
抗ＫＯＤ抗体発現系においてピューロマイシンで選択して取得したモノクローンの細胞を、更にＭＴＸで選択して取得したポリクローンの細胞の生産性評価
【０１５４】
次に、前記実施例３−３で取得した、ｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）を遺伝子導入し、ピューロマイシンで選択して取得した発現量上位１０クローンについて、７．５μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、透析した１０％牛胎児血清、４ｍＭ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを添加したＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ中で２週間継代培養した。その後、更に、１０ｎＭ ＭＴＸ（シグマ社製）、７．５μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、透析した１０％牛胎児血清、４ｍＭ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを添加したＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ中で６週間選択培養を行った。
【０１５５】
選択培養終了後、得られたポリクローンの細胞を２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、１ウェル当たり１．８４×１０５細胞を６ウェルプレートに播き込んだ。３日間培養後、培養上清を回収し、ＭＴＸで選択して取得したポリクローンの細胞でのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を、前記実施例２−２と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。
【０１５６】
標準品から作成した検量線をもとに抗体濃度を算出した。結果を図２０に示す。その結果、ｐＥＬＨ２−Ｐｕｒｏ・ｄｈｆｒ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）の場合と同様に、ｄｈｆｒ遺伝子をピューロマイシン耐性遺伝子の上流に配したｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）でも、ＭＴＸ選択によって発現量の上昇が見られ、最も生産性の高いものは３５ｍｇ／Ｌであった。以上より、ピューロマイシン耐性遺伝子とｄｈｆｒ遺伝子の配置順序に関わらず、ピューロマイシン耐性遺伝子とｄｈｆｒ遺伝子を融合させて選択遺伝子とし、更にその3‘末端にｍＲＮＡ不安定化配列を付加して弱化させた発現カセットを使用することで、ピューロマイシンで選択後に高発現細胞株を取得でき、かつ、この細胞株をＭＴＸで選択培養することで、更に発現量を上昇させることが可能であった。
【０１５７】
実施例４
無血清馴化ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞を用いた、抗ＫＯＤ抗体発現系における、ｄｈｆｒ遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子の融合タンパク質遺伝子とmRNA不安定化配列の組み合わせ効果の検討
次に、あらかじめ無血清馴化したＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞を用いて、下流にmRNA不安定化配列を付加したｄｈｆｒ遺伝子（上流）とピューロマイシン耐性遺伝子（下流）の融合タンパク質遺伝子の効果を検討した。
【０１５８】
実施例４−１
抗ＫＯＤ抗体発現系においてピューロマイシンで選択して取得したモノクローンの細胞の生産性評価
【０１５９】
１ｘＹｅａｓｔｏｌａｔｅ ＵＦ溶液（ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、１ｘＨＴサプリメント、４ｍＭ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを添加したＩＳ ＣＨＯ−ＣＤ， Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｄ Ｍｅｄｉａ ｆｏｒ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞を無血清馴化した。無血清馴化したＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞を２．５Ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように、１ｘＨＴサプリメントを添加したＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍに懸濁し、超低接着表面２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）の２ウェルに１ｍｌずつ播種した。
【０１６０】
一方、実施例３−２で調製した制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズしたｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）３μｇを４００μｌ Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍで希釈した後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ １０μｌを加え、３０分間放置した。その後、半量ずつ前記の２ウェルの無血清馴化したＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞に加え、２４時間インキュベートした。トランスフェクションの１日後、細胞を回収して８００ｇＸ３分間遠心して上清を除去し、４ｍｌの１ｘＹｅａｓｔｏｌａｔｅ ＵＦ溶液、１ｘＨＴサプリメント、４ｍＭ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを添加したＩＳ ＣＨＯ−ＣＤ， Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｄ Ｍｅｄｉａ ｆｏｒ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ培地に懸濁し、７．５μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを加え、選択培養した。
【０１６１】
選択培養終了後、１０％牛胎児血清、４ｍＭ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１ｘＨＴサプリメントを添加したＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍを使用して、ポリクローンの細胞を１２ウェルプレートに播き込み、接着状態で培養した。２日間培養後、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、０．７５細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに播き込み、接着状態で限界希釈を行った。２週間培養後、培養上清を回収し、ＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を前記実施例２−２と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。標準品から作成した検量線をもとに各クローンの抗体生産量を算出した。そして、選択した発現量上位クローンについて、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、１ｘＹｅａｓｔｏｌａｔｅ ＵＦ溶液、１ｘＨＴサプリメント、４ｍＭ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを添加したＩＳ ＣＨＯ−ＣＤ， Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｄ Ｍｅｄｉａ ｆｏｒ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ培地を用いて、浮遊状態で拡大培養を行った後、１ウェル当たり４．０×１０５細胞を超低接着表面６ウェルプレートに播き込んだ。３日間培養後、培養上清を回収し、ピューロマイシンで選択して取得したモノクローンの細胞でのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を前記実施例２−２と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。更に、標準品から作成した検量線をもとに算出した抗体生産量、3日間培養後に計数した細胞数から、１細胞、1日あたりの生産性（ｐｃｄ：ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙ）を算出した。結果を図２１に示す。その結果、あらかじめ無血清馴化したＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞を宿主に用いた場合でも、ピューロマイシンで選択後に高発現株を取得することができた。
【０１６２】
実施例４−２
抗ＫＯＤ抗体発現系においてピューロマイシンで選択して取得したモノクローンの細胞を、更にＭＴＸで選択して取得したポリクローンの細胞の生産性評価
【０１６３】
次に、前記実施例４−１で取得した、ｐＥＬＨ２−ｄｈｆｒ・Ｐｕｒｏ・Ｎ４（ＫＯＤ３Ｇ８）を遺伝子導入し、ピューロマイシンで選択して取得した発現量上位１０クローンについて、７．５μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、１ｘＹｅａｓｔｏｌａｔｅ ＵＦ溶液、４ｍＭ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを添加したＩＳ ＣＨＯ−ＣＤ， Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｄ Ｍｅｄｉａ ｆｏｒ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ培地で２週間継代培養した。その後、まずは、７．５μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、３ｎＭ ＭＴＸ、１ｘＹｅａｓｔｏｌａｔｅ ＵＦ溶液、４ｍＭ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを添加したＩＳ ＣＨＯ−ＣＤ， Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｄ Ｍｅｄｉａ ｆｏｒ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ培地で、続いて、７．５μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、１０ｎＭ ＭＴＸ、１ｘＹｅａｓｔｏｌａｔｅ ＵＦ溶液、４ｍＭ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを添加したＩＳ ＣＨＯ−ＣＤ， Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｄ Ｍｅｄｉａ ｆｏｒ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ培地で、更に、７．５μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、３０ｎＭ ＭＴＸ、１ｘＹｅａｓｔｏｌａｔｅ ＵＦ溶液、４ｍＭ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅを添加したＩＳ ＣＨＯ−ＣＤ， Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｄ Ｍｅｄｉａ ｆｏｒ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ培地で、計６週間選択培養を行った。
【０１６４】
選択培養終了後、得られたポリクローンの細胞について、１ウェル当たり４．０×１０５細胞を超低接着表面６ウェルプレートに播き込んだ。３日間培養後、培養上清を回収し、ＭＴＸで選択して取得したポリクローンの細胞でのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を前記実施例２−２と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。更に、標準品から作成した検量線をもとに算出した抗体生産量、3日間培養後に計数した細胞数から、１細胞、1日あたりの生産性（ｐｃｄ：ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙ）を算出した。結果を図２２に示す。以上より、あらかじめ無血清馴化したＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞を宿主に用いた場合でも、ピューロマイシン耐性遺伝子とｄｈｆｒ遺伝子を融合させて選択遺伝子とし、更にその3‘末端にｍＲＮＡ不安定化配列を付加して弱化させた発現カセットを使用することで、ピューロマイシンで選択後に高発現細胞株を取得でき、かつ、この細胞株をＭＴＸで選択培養することで、更に発現量を上昇させることが可能であった。
【産業上の利用可能性】
【０１６５】
本発明の薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列を含む発現カセット、遺伝子発現安定化エレメント、並びに目的タンパク質遺伝子発現カセットを有する発現ベクターは、目的タンパク質遺伝子のクローニングから組換えタンパク質の生産性の高い細胞を樹立するに至るまでを、迅速、かつ効率よく行うために大いに効果を発揮する。従って、本発明の発現ベクターを使用した細胞発現システムは、種々の動物細胞、特に哺乳類動物細胞のタンパク質の機能解析は勿論、バイオ医薬品として創薬・医療などの産業界に寄与することが大である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）〜（３）を少なくとも有する発現ベクター。
（１）薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセット、
（２）遺伝子発現安定化エレメント、及び
（３）目的タンパク質遺伝子発現カセット
【請求項２】
下記（１）〜（３）を少なくとも有する発現ベクター
（１）薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列を含む発現カセット、
（２）遺伝子発現安定化エレメント、及び
（３）目的タンパク質遺伝子発現カセット
【請求項３】
ｍＲＮＡ不安定化配列が、サイトカイン、インターロイキン、又は癌原遺伝子の３’非翻訳領域に存在するＡＴリッチ配列に由来することを特徴とする請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項４】
ｍＲＮＡ不安定化配列が、ＴＴＡＴＴＴＡ（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｔ）のモチーフ配列を有することを特徴とする請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項５】
モチーフ配列が、２回以上繰り返されていることを特徴とする請求項４に記載の発現ベクター。
【請求項６】
モチーフ配列の繰り返し間に１塩基以上のスペーサー配列を含むことを特徴とする請求項５に記載の発現ベクター。
【請求項７】
ｍＲＮＡ不安定化配列中に１ないし数塩基の置換、挿入または欠失を含むことを特徴とする請求項３〜６のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項８】
遺伝子発現安定化エレメントが以下のいずれかである、請求項１〜７のいずれかに記載の発現ベクター。
（Ｉ）配列番号１５で示す配列のうち４１６０１〜４６７４６番目までの配列からなるＤＮＡ、もしくは４１６０１〜４６７４６番目までの配列の部分配列であって少なくとも４１６０１〜４２７００番目までの配列を含む塩基配列からなるＤＮＡ
（ＩＩ）上記（Ｉ）の配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ遺伝子発現安定化機能を有する塩基配列からなるＤＮＡ
（ＩＩＩ）上記（Ｉ）または（ＩＩ）の配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ
【請求項９】
遺伝子発現安定化エレメントを２つ以上含む、請求項１〜８のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項１０】
薬剤選択マーカー遺伝子が、タンパク質合成阻害系抗生物質耐性遺伝子である、請求項１〜９のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項１１】
薬剤選択マーカー遺伝子がピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ及びネオマイシンホスホトランスフェラーゼからなる群より選択される、請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
目的タンパク質の遺伝子発現カセットが、所望の目的タンパク質遺伝子を挿入するためのマルチクローニングサイトを備えていることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項１３】
目的タンパク質遺伝子が抗体の重鎖及び／または軽鎖ポリペプチド遺伝子である、請求項１〜１２のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項１４】
薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列を含む発現カセット。
【請求項１５】
以下の工程を含む、高生産細胞を作製する方法。
（ａ）請求項１〜１３のいずれかに記載の発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程
（ｂ）形質転換された細胞を薬剤存在下で培養する工程
（ｃ）形質転換された細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下で培養する工程
（ｄ）高発現を示す細胞株を単離する工程。
【請求項１６】
以下の工程を含む、高生産細胞を作製する方法。
（ａ）請求項１〜１３のいずれかに記載の発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程
（ｂ）形質転換された細胞をヒポキサンチンおよびチミジン不含培地で培養する工程
（ｃ）形質転換された細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下で培養する工程
（ｄ）高発現を示す細胞株を単離する工程。
【請求項１７】
以下の工程を含む、高生産細胞を作製する方法。
（ａ）請求項１〜１３のいずれかに記載の発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程
（ｂ）形質転換された細胞を、ヒポキサンチンおよびチミジンを含まず、かつ薬剤存在下で培養する工程
（ｃ）形質転換された細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下で培養する工程
（ｄ）高発現を示す細胞株を単離する工程。
【請求項１８】
請求項１５〜１７のいずれかに記載の方法において、（ｃ）形質転換された細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下で培養する工程、及び（ｄ）高発現を示す細胞株を単離する工程を複数回繰り返す、高生産細胞を作製する方法。
【請求項１９】
宿主細胞が哺乳類動物細胞由来の細胞である、請求項１５〜１８のいずれかに記載の高生産細胞を作製する方法。
【請求項２０】
宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）由来の細胞である、請求項１５〜１８のいずれかに記載の高生産細胞を作製する方法。
【請求項２１】
宿主細胞がジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子欠損細胞である、請求項１５〜１８のいずれかに記載の高生産細胞を作製する方法。
【請求項２２】
宿主細胞が無血清馴化された細胞である、請求項１５〜１８のいずれかに記載の高生産細胞を作製する方法。
【請求項２３】
請求項１５〜２２のいずれかに記載の方法により得られた高生産細胞。
【請求項２４】
請求項１５〜２２のいずれかに記載の方法により得られた高生産細胞を用いてポリペプチドを生産する方法。
【請求項２５】
請求項１５〜２２のいずれかに記載の方法により得られた高生産細胞を用いて抗体を生産する方法。
【請求項２６】
請求項１５〜２２のいずれかに記載の方法により得られた高生産細胞を用いてワクチンを生産する方法。
【請求項１】
下記（１）〜（３）を少なくとも有する発現ベクター。
（１）薬剤選択マーカー遺伝子及び薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現カセット、
（２）遺伝子発現安定化エレメント、及び
（３）目的タンパク質遺伝子発現カセット
【請求項２】
下記（１）〜（３）を少なくとも有する発現ベクター
（１）薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列を含む発現カセット、
（２）遺伝子発現安定化エレメント、及び
（３）目的タンパク質遺伝子発現カセット
【請求項３】
ｍＲＮＡ不安定化配列が、サイトカイン、インターロイキン、又は癌原遺伝子の３’非翻訳領域に存在するＡＴリッチ配列に由来することを特徴とする請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項４】
ｍＲＮＡ不安定化配列が、ＴＴＡＴＴＴＡ（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｔ）のモチーフ配列を有することを特徴とする請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項５】
モチーフ配列が、２回以上繰り返されていることを特徴とする請求項４に記載の発現ベクター。
【請求項６】
モチーフ配列の繰り返し間に１塩基以上のスペーサー配列を含むことを特徴とする請求項５に記載の発現ベクター。
【請求項７】
ｍＲＮＡ不安定化配列中に１ないし数塩基の置換、挿入または欠失を含むことを特徴とする請求項３〜６のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項８】
遺伝子発現安定化エレメントが以下のいずれかである、請求項１〜７のいずれかに記載の発現ベクター。
（Ｉ）配列番号１５で示す配列のうち４１６０１〜４６７４６番目までの配列からなるＤＮＡ、もしくは４１６０１〜４６７４６番目までの配列の部分配列であって少なくとも４１６０１〜４２７００番目までの配列を含む塩基配列からなるＤＮＡ
（ＩＩ）上記（Ｉ）の配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ遺伝子発現安定化機能を有する塩基配列からなるＤＮＡ
（ＩＩＩ）上記（Ｉ）または（ＩＩ）の配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ
【請求項９】
遺伝子発現安定化エレメントを２つ以上含む、請求項１〜８のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項１０】
薬剤選択マーカー遺伝子が、タンパク質合成阻害系抗生物質耐性遺伝子である、請求項１〜９のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項１１】
薬剤選択マーカー遺伝子がピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ及びネオマイシンホスホトランスフェラーゼからなる群より選択される、請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
目的タンパク質の遺伝子発現カセットが、所望の目的タンパク質遺伝子を挿入するためのマルチクローニングサイトを備えていることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項１３】
目的タンパク質遺伝子が抗体の重鎖及び／または軽鎖ポリペプチド遺伝子である、請求項１〜１２のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項１４】
薬剤選択マーカー遺伝子、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して存在するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びｍＲＮＡ不安定化配列を含む発現カセット。
【請求項１５】
以下の工程を含む、高生産細胞を作製する方法。
（ａ）請求項１〜１３のいずれかに記載の発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程
（ｂ）形質転換された細胞を薬剤存在下で培養する工程
（ｃ）形質転換された細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下で培養する工程
（ｄ）高発現を示す細胞株を単離する工程。
【請求項１６】
以下の工程を含む、高生産細胞を作製する方法。
（ａ）請求項１〜１３のいずれかに記載の発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程
（ｂ）形質転換された細胞をヒポキサンチンおよびチミジン不含培地で培養する工程
（ｃ）形質転換された細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下で培養する工程
（ｄ）高発現を示す細胞株を単離する工程。
【請求項１７】
以下の工程を含む、高生産細胞を作製する方法。
（ａ）請求項１〜１３のいずれかに記載の発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程
（ｂ）形質転換された細胞を、ヒポキサンチンおよびチミジンを含まず、かつ薬剤存在下で培養する工程
（ｃ）形質転換された細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下で培養する工程
（ｄ）高発現を示す細胞株を単離する工程。
【請求項１８】
請求項１５〜１７のいずれかに記載の方法において、（ｃ）形質転換された細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下で培養する工程、及び（ｄ）高発現を示す細胞株を単離する工程を複数回繰り返す、高生産細胞を作製する方法。
【請求項１９】
宿主細胞が哺乳類動物細胞由来の細胞である、請求項１５〜１８のいずれかに記載の高生産細胞を作製する方法。
【請求項２０】
宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）由来の細胞である、請求項１５〜１８のいずれかに記載の高生産細胞を作製する方法。
【請求項２１】
宿主細胞がジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子欠損細胞である、請求項１５〜１８のいずれかに記載の高生産細胞を作製する方法。
【請求項２２】
宿主細胞が無血清馴化された細胞である、請求項１５〜１８のいずれかに記載の高生産細胞を作製する方法。
【請求項２３】
請求項１５〜２２のいずれかに記載の方法により得られた高生産細胞。
【請求項２４】
請求項１５〜２２のいずれかに記載の方法により得られた高生産細胞を用いてポリペプチドを生産する方法。
【請求項２５】
請求項１５〜２２のいずれかに記載の方法により得られた高生産細胞を用いて抗体を生産する方法。
【請求項２６】
請求項１５〜２２のいずれかに記載の方法により得られた高生産細胞を用いてワクチンを生産する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【公開番号】特開２０１３−３４４７４（Ｐ２０１３−３４４７４Ａ）
【公開日】平成２５年２月２１日（２０１３．２．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１５１２４８（Ｐ２０１２−１５１２４８）
【出願日】平成２４年７月５日（２０１２．７．５）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年２月２１日（２０１３．２．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年７月５日（２０１２．７．５）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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