薬物代謝能評価システム及びその利用方法
特定の薬物代謝酵素による薬物消費量、及びまたはその代謝物量を、表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーを被覆した充填剤を用い、水系移動相のクロマトグラフィーで温度制御することで測定する。このシステムによれば、簡便な手段で、環境に悪影響を与えることなく、薬物代謝能を的確に評価することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、生物学、医学、薬学等の分野における薬物代謝機能を、表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーを被覆した充填剤を用い、水系移動相のクロマトグラフィーで温度制御することで測定する新規な薬物代謝能評価システムに関する。
【背景技術】
近年、ヒトにおける薬物相互作用やヒト遺伝子多型等を解析するために、薬物の生体内代謝が着目されている。新薬を開発する際にも、生体内の薬物代謝の研究を行うことの重要性は広く認識されており、生体に投与された薬物の質、及び量的変化を追跡して薬物の有効性や毒性に関連する現象を解明しようという努力が払われている。
薬物の代謝は生体内の多くの組織で行われるが、ほとんどの薬における主要な代謝部位は、その活性の強さと重量から、肝臓であるといえる。脂溶性の薬の代謝に関して特に重要な役割を演じているものは、ミクロソームに局在する、いわゆる薬物代謝酵素といわれているチトクロムＰ４５０（スーパーファミリーを形成、ＣＹＰと略される）であり、その基本の反応機構は、ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０還元酵素により還元されたチトクロムＰ４５０による酸素の活性化に伴う薬の酸化反応と、チトクロムＰ４５０の低い酸化還元電位による薬の還元反応である。現在、臨床で用いられている薬の８０％以上がＰ４５０に代謝されるといわれている。特に酸化反応（第一相反応）の結果生成された代謝物は、さらにグルクロン酸抱合、硫酸抱合、アミノ酸抱合、アセチル抱合、グルタチオン抱合など（第二相）により、さらに水溶性の代謝物となり、尿中や胆汁中に排泄されやすくなる。
このＰ４５０における代謝の研究は、これまで、固定相としてオクタデシル基で表面を修飾した疎水化された多孔性のシリカゲルを用い、移動相中の有機溶媒の濃度を連続的に増加させることで溶質を分離するという逆相クロマトグラフィーにより行われてきた。しかしながら、従来の移動相に用いられている有機溶媒や緩衝液は溶出液に夾雑物が含まれ、それらのＵＶ吸収が非常に強くなるために、ベースラインの安定化や感度が著しく低下する欠点があった。また、連続して分析を行う前にカラムを洗浄し、初期の溶出液で平衡化する必要があるため、分析時間が長くなるという欠点もあった。さらに、各溶質によって、溶出液の流速、イオン強度、ｐＨやカラムの温度などの細部にわたる分離条件を決めていかなくはならず、例えば、臨床現場等では、一種類の条件だけで各溶質を分離させられる簡便な方法が強く望まれていた。
現在の臨床現場では、簡便に薬物代謝能を評価する方法として、抗原抗体反応を利用したイムノアッセイ（ＴＤＸ）法が実際に利用されている。しかしながら、これらの方法では１種類しか測定ができず、測定が多項目となるとそれだけ測定回数が必要となり、費用がかかることや工程が煩雑となっていることが現状であった。
【発明の開示】
本発明は、上記のような従来技術の問題点を解決することを意図してなされたものである。すなわち、本発明は、臨床現場でも簡単に利用できる薬物代謝能評価システムを提供することを目的とする。また、本発明は、その利用方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて、研究開発を行った。その結果、特定の薬物代謝酵素による薬物消費量、及びまたはその代謝物量を、表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーを被覆した充填剤を用い、水系移動相のクロマトグラフィーで温度制御することで測定することで簡便な薬物代謝能評価システムが得られることを見いだした。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。
すなわち、本発明は、臨床現場でも簡単に利用できる薬物代謝能評価システムを提供する。
また、本発明は、その薬物代謝能評価システムを利用した薬物代謝能評価方法を提供する。
加えて、本発明は、その薬物代謝能評価システムを利用したチトクロムＰ４５０の遺伝的多型の評価方法を提供する。
更に加えて、本発明は、その薬物代謝能評価システムを利用した肝硬変、肝癌の診断方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、１０℃及び４０℃の温度条件下でテストステロン及びその代謝物の２５４ｎｍおける吸光度を示すチャートである。
図２は、６種類のプローブ薬物の混合資料を用いて、分析用高速液体クロマトグラフィーにより種々の温度において行った一斉分析に結果を示すチャートである。
図３は、生体試料としてＳｅｐ−Ｐａｋ登録商標 Ｐｌｕｓ Ｃ１８ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓを用いて前処理した尿・血清に実施例３の６種プローブ薬をスパイクした試料の分析を行った結果を示すチャートである。
図４は、フェナセチン、アセトアミノフェンをそれぞれ１：１となるよう混合した試料の分析を行った結果を示すチャートである。
図５は、Ｓ−メフェニトインと４’−ヒドロキシメフェニトインをそれぞれ１．５：１となるように混合した試料の分析を行った結果を示すチャートである。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明では、特定の薬物代謝酵素による薬物消費量、及びまたはその代謝物量を、表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーを被覆した充填剤を用い、水系移動相のクロマトグラフィーで温度制御することで測定することで簡便に、しかも複数の薬物代謝酵素による薬物消費量、及びまたはその代謝物量も同時に測定できる薬物代謝能評価システムが得られることを見いだした。
本発明に使われる代表的な薬物代謝酵素としては、チトクロムＰ４５０分子種、アルコール脱水素酵素、エステラーゼ、β−グルクロニダーゼ、フラビン含有モノオキシゲナーゼ、アルデヒド脱水素酵素、モノアミンオキシダーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−キノン還元酵素、ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素、アルデヒド還元酵素、ケトン還元酵素、エポキシドヒドロラーゼ、スルファターゼ、システイニルグリシナーゼ、γ−グルタミン酸転移酵素、ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素、硫酸転移酵素、グルタチオンＳ−転移酵素、Ｎ−アセチル転移酵素、グリシン抱合酵素、メチル化酵素、グルコース転移酵素、ロダネーゼ等が挙げられる。これらの一種を用いても、あるいは二種以上を組み合わせても良いが、それらの種類は、何ら制約されるものではない。
本発明におけるチトクロムＰ４５０分子種としては、例えば、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｆ１、ＣＹＰ３Ａ３、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ２Ａ１、ＣＹＰ２Ａ２、ＣＹＰ２Ａ４、ＣＹＰ２Ａ５、ＣＹＰ２Ｂ１、ＣＹＰ２Ｂ２、ＣＹＰ２Ｂ４、ＣＹＰ２Ｂ５、ＣＹＰ２Ｂ９、ＣＹＰ２Ｃ２、ＣＹＰ２Ｃ３、ＣＹＰ２Ｃ４、ＣＹＰ２Ｃ５、ＣＹＰ２Ｃ６、ＣＹＰ２Ｃ７、ＣＹＰ２Ｃ１１、ＣＹＰ２Ｃ１２、ＣＹＰ２Ｃ１４、ＣＹＰ２Ｃ２９、ＣＹＰ２Ｄ１、ＣＹＰ２Ｄ２、ＣＹＰ２Ｄ９、ＣＹＰ２Ｆ２、ＣＹＰ２Ｇ１、ＣＹＰ３Ａ１、ＣＹＰ３Ａ２、ＣＹＰ３Ａ６、ＣＹＰ４Ａ１、ＣＹＰ４Ｂ１が挙げられる。これらの一種を用いても、あるいは二種以上を組み合わせても良いが、それらの種類は、何ら制約されるものではない。
本発明は充填剤表面に被覆されたポリマーが温度を変えることで水和、脱水和を起こし、そのことが充填剤表面の親水性／疎水性のバランスを変化させることとなり実現する。このことを達成するには、例えば充填剤表面に温度に応答するポリマーを導入することで達成できる。
本発明の充填剤に被覆されているポリマーは温度を変えることで水和、脱水和を起こすものであり、その温度域は０℃〜８０℃、好ましくは１０℃〜５０℃、さらに好ましくは２０℃〜４５℃であることが判明した。８０℃を越えると移動相が水であるので蒸発等の作業性が悪くなり好ましくない。また、０℃より低いと移動相が凍結する場合があり、やはり好ましくない。
本発明に用いる上記温度に応答するポリマー（以下、温度応答性ポリマーという）はホモポリマー、コポリマーのいずれであってもよい。このようなポリマーとしては、例えば、特開平２−２１１８６５号公報に記載されているポリマーが挙げられる。具体的には、例えば、以下のモノマーの単独重合または共重合によって得られる。使用し得るモノマーとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物（（メタ）アクリルアミドは、アクリルアミド及びメタクリルアミドを意味する。以下、同じ。）、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、またはビニルエーテル誘導体が挙げられ、コポリマーの場合は、これらの中で任意の２種以上を使用することができる。更には、上記モノマー以外のモノマー類との共重合、ポリマー同士のグラフトまたは共重合、あるいはポリマー、コポリマーの混合物を用いてもよい。また、ポリマー本来の性質を損なわない範囲で架橋することも可能である。
本発明は、移動相を水系に固定したままで行われる。ここでの水系とは、水のみ、あるいは無機塩類を含む水溶液であって、有機溶媒を含まないものを意味する。また、この場合、水とは蒸留水、脱イオン水、もしくは精製水のいずれかを表す。
本発明は、特定の薬物代謝酵素による薬物消費量、及びまたはその代謝物量を、水系移動相のクロマトグラフィーで温度制御することで測定するものである。測定に使用される試料は特に限定されるものではないが、例えば特定の薬物代謝酵素と薬物、及びまたはその代謝物などが混在したもの、特定の薬物代謝酵素をあらかじめ除去したものなどが挙げられる。特に、本発明は水系移動相であるため、溶剤による特定の薬物代謝酵素の変性もなく、前者の酵素と薬物、及びまたは代謝物が混在した状態の試料のままで直接測定できることとなり、酵素の除去作業が不要となり好都合である。
被覆を施される充填剤としては、通常、クロマトグラフィーに用いられるシリカゲル、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ガラス、改質ガラス等を初めとして、一般に形態付与が可能である物質、例えば、上記以外の高分子化合物、セラミックス類など全て用いることができる。
温度応答性ポリマーの充填剤への被覆方法は、特に制限されないが、例えば、特開平２−２１１８６５号公報に記載されている方法に従ってよい。すなわち、かかる被覆は、充填剤と上記ポリマーを、カップリング剤などによって結合させる方法、上記モノマー或いはポリマーを電子線照射（ＥＢ）、γ線照射、紫外線照射、プラズマ処理、コロナ処理、有機重合反応のいずれかにより、または塗布、混練等の物理的吸着等により行うことができる。
以上のことを温度応答性ポリマーとしてポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を例にとり説明する。ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）は３１℃に下限臨界溶解温度を有するポリマーとして知られ、遊離状態であれば、水中で３１℃以上の温度で脱水和を起こしポリマー鎖が凝集し、白濁する。逆に３１℃以下の温度ではポリマー鎖は水和し、水に溶解した状態となる。本発明では、このポリマーが充填剤の表面に被覆、固定されたものである。したがって、３１℃以上の温度であれば、基材表面のポリマーも同じように脱水和するが、ポリマー鎖が基材表面に被覆、固定されているため、表面が疎水性を示すようになる。逆に、３１℃以下の温度では、基材表面のポリマーは水和するが、ポリマー鎖が基材表面に被覆、固定されているため、基材表面が親水性を示すようになる。
以上より得られる薬物代謝能評価システムは臨床現場において患者の薬物代謝能を簡単に評価する方法として極めて有効な技術となる。また、本システムによりチトクロムＰ４５０の機能を直接測定することでＰ４５０の遺伝的多型の評価手段としても有効なものと考えられる。さらに本システムによりＰ４５０機能を確認することで肝硬変、肝癌の診断することも可能となる。
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
（ａ）片末端にカルボキシル基を有するポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）の合成法
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド２０．０ｇ、３−メルカプトプロピオン酸０．０９ｇ、２，２’−アゾビス（イソブチロニトリル）０．２１ｇをそれぞれ重合管にいれ、乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド５０ｍｌを加えて溶解した。次に液体窒素下で凍結した後真空オイルポンプで重合管中の酸素を脱気し、減圧状態のまま重合管をメタノールに浸しＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の溶存酸素を取り除いた。この凍結脱気の操作を３回繰り返し行った。脱気が完全にできたら７０±１℃のインキュベーターで２０時間反応させた。次に、室温まで下がったら減圧濃縮を行う乾燥ジエチルエーテル中に滴下させ片末端にカルボキシル基を持ったポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を沈殿させた。この沈殿物をＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）フィルター（ポアサイズ３．０μｍ）で濾取し、シリカゲルを入れたデシケーター中で減圧乾燥をし、粗生成物１９．０ｇが得られた。これを乾燥Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド３０ｍｌに溶かした後、乾燥ジエチルエーテル中に滴下し、その沈殿物をテフロンフィルターで濾取した。これをデシケーター中で減圧乾燥をおこない精製ポリ（Ｎ−イソプルピルアクリルアミド）を得た。得られたポリマーはテトラヒドロフランを溶媒としたゲル濾過クロマトグラフィー及び酸−塩基測定によりポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）が分子量１５，０００であり、分子末端に約１個のカルボキシル基を有することを確認した。
（ｂ）片末端にカルボキシル基を有するポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）の活性エステル化
精製ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を１１．３５ｇを乾燥酢酸エチル１００ｍｌ中に溶かし、ジシクロヘキシルカルボジイミド１．２３ｇ及びＮ−ヒドロキシこはく酸イミド０．６９ｇを加えてよく攪拌しながら０℃で２時間、室温（２０〜２５℃）で１２時間反応させた。次に副生成物であるＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシル尿素をＰＴＦＥフィルターで濾取し、その濾液を減圧濃縮した後乾燥ジエチルエーテル中に滴下し沈殿したものをテフロンフィルターで濾取して、常温減圧で溶媒を留去したものについて、活性エステル化ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を得た。
（ｃ）活性エステル化ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）とアミノ基担体との結合
活性エステル化ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）２．０ｇを純水５０ｍｌに溶かし、アミノプロピルシリカゲル６．０ｇを加え、１２時間室温で激しく振とうして反応させた後冷水５００ｍｌで洗浄し、再び活性エステル化ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）２．０ｇを純水５０ｍｌに溶かした溶液中に加え、１２時間室温で激しく振とうした。この操作を３回繰り返し、冷水５００ｍｌで洗浄した後、メタノール１００ｍｌで洗浄し、乾燥した。活性エステル化ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）３．０ｇを６ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解し、これを表面に一級アミノ基を導入したポリスチレン微粒子浮遊液１ｍｌ（直径１．０±０．０３μｍ、原液濃度：５×１０１１個／ｍｌ）を２４ｍｌの純水で希釈した液に１ｍｌづつ３０分間隔で加え、ゆっくりと転倒混和した。全量を加えた後、４℃以下で１６時間転倒混和した。反応終了後遠心分離による回収と冷純化による洗浄を２回繰り返した後、ハンクス平衡塩溶液（ｐＨ７．４）を用いて希釈した（６×１０９、６×１０１０／ｍｌ）
使用した試薬
テストステロン（生化学用、和光純薬工業製）
リン酸二水素カリウム（和光純薬工業製）
リン酸水素二ナトリウム（和光純薬工業製）
ＮＡＤＰＨ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａ（ＮＡＤＰＨ Ａ）（ＢＤ ＧＥＮＴＥＳＴ製）
ＮＡＤＰＨ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｂ（ＮＡＤＰＨ Ｂ）（ＢＤ ＧＥＮＴＥＳＴ製）
ヒトＣＹＰ３Ａ４＋リダクダーゼ ミクロソーム（ＢＤ ＧＥＮＴＥＳＴ製）
ＨＰＬＣ用メタノール（和光純薬工業製）
ＨＰＬＣ用アセトニトリル（和光純薬工業製）
固相抽出Ｓｅｐ−ｐａｋ登録商標Ｐｌｕｓ Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ製）
使用した装置
分析用高速液体クロマトグラフィー
ポンプ（Ｌ−７１００、ＨＩＴＡＣＨＩ製）
ＵＶ検出器（Ｌ−７４０５、ＨＩＴＡＣＨＩ製）
Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ （Ｄ−７０００、ＨＩＴＡＣＨＩ製）
カラムオーブン（ＡＯ−３０Ｃ、Ｓｈｏｄｅｘ製）
充填剤（ポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）固定化充填剤
実験方法
テストステロンをインビトロで代謝を行い、ポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）修飾充填剤を用い、水のみでテストステロンと６β−ヒドロキシテストステロンの分離を行った。
インビトロでの代謝方法は以下の方法に従った。Ｐ４５０（ＣＹＰ３Ａ４）２０ｐｍｏｌ，ＮＡＤＰ＋ １．３ｍＭ，ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ３．３ｍＭ，ＭｇＣｌ２ ３．３ｍＭ，ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅデヒドロゲナーゼ ０．４Ｕ／ｍＬ，テストステロン ０．２ｍＭを含むＮＡＤＰＨ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａ，Ｂを加え全量を０．５ｍＬとするため
２５μＬ，ＮＡＤＰＨ Ｂ：５μＬ，リン酸Ｂｕｆｆｅｒ：４４５μＬ，テストステロン １ｍｇ／ｍＬ メタノール：５μＬ）。１０分間，３７℃でインキュベーションを行い、
エバポレートし後、精製水１ｍＬに溶解し、Ｓｅｐ−ｐａｋ登録商標Ｐｌｕｓ Ｃ１８で固相抽出しメタノール／精製水＝６０：４０で溶出した。この液をエバポレートして精製水１ｍＬに溶解して試料とした。
結果
はじめに、通常用いられているＯＤＳカラムを用いて標準品として市販されているテストステロンとその代謝物６β−ヒドロキシテストステロンの混合物を作り分析を行った。溶離液にメタノールを６０％も含む精製水／メタノール＝４０：６０を用いた。結果は共に分離が可能であり保持時間は６β−ヒドロキシテストステロンで３．９１ｍｉｎ、テストステロンでは１１．４５ｍｉｎであった。
次に、Ｐ−（ＮＩＰＡＡｍ）カラムで分析を行った。結果を図１に示す。条件は水のみで分離を行い、高温・低温にして保持の違いについて検討した。１０℃では、６β−ヒドロキシテストステロンの保持時間が３．０１ｍｉｎとテストステロンの保持時間が６．８８ｍｉｎと共に１０ｍｉｎ以内にあるが良好に分離されているのが確認できた。４０℃でも同様に分析したところ、６β−ヒドロキシテストステロンの保持時間が５．１６ｍｉｎ、テストステロンの保持時間が１８．１１ｍｉｎと共に伸びた。この結果から、このカラムの特徴である溶離液に精製水のみを用いて、カラム温度を変化させて保持時間の調節が可能であることが示された。
次に、インビトロで代謝を行った試料についても同様の分析を行った。代謝を行ったのみの試料では、１０℃では酵素もしくはＮＡＤＰＨ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ由来の夾雑物が混入してしまい分析を行えなかった。そこで、Ｓｅｐ−ｐａｋ登録商標を用いて固相抽出を行ったところ目的のピークを残し、夾雑物を洗い流すことができたので１０℃、４０℃で分析を行った。１０℃では６β−ヒドロキシテストステロンが洗いきれずに残った酵素由来のピークに妨害を受けてしまい良好な分離が行えなかった。そこで、標準品で得られた結果の様に６β−ヒドロキシテストステロンの保持時間を遅らせられることを期待して４０℃での分析を行ったところ、６β−Ｈｙｄｒｏｘｙｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅの保持時間は７．２１ｍｉｎと良好な分離を行うことに成功した。テストステロンの保持時間も７．２１ｍｉｎから１８．１１ｍｉｎと保持の延長が確認された。
これらの結果を図１に示す。なお、測定条件及び１０℃、４０℃における標準品及び代謝物の保持時間は以下の通りである。
＜測定条件＞
ＵＶ＝２５４ｎｍ
水（移動相）流速＝１．０ｍＬ／ｍｉｎ
サンプル投入量＝２０μＬ
【実施例２】
カフェイン、ワルファリン、オメプラゾールの各試薬を水またはＴＨＦに溶かし飽和水溶液を作った。これを０．４５μｍのフィルターでろ過し得られた液を試料とした。
使用した装置
分析用高速液体クロマトグラフィー
ポンプ（Ｌ−７１００、ＨＩＴＡＣＨＩ製）
移動相流速 １．０ｍＬ／ｍｉｎ
Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ （Ｄ−７０００、ＨＩＴＡＣＨＩ製）
カラムオーブン（ＡＯ−３０Ｃ、Ｓｈｏｄｅｘ製）
充填剤（ポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）固定化充填剤
結果
カフェイン、ワルファリン、オメプラゾールの各試料は分析用高速液体クロマトグラフィーにかけて分離し、各々下記の波長のＵＶで１０℃及び５０℃における保持時間を測定した。
カフェイン（移動相：水）（ＵＶ＝２７５ｎｍ）
Ｓ−ワルファリン（移動相：水）（ＵＶ＝３０２ｎｍ）
オメプラゾール（移動相：水）（ＵＶ＝３０２ｎｍ）
結果を表３に示す。
以上の結果より、本技術であれば水のみでこれらＣＹＰのプローブ薬を分離させられることが分かる。
このカラムは溶離液が水のみで分離を行えるため環境に優しい。しかも、テーラーメイド医療技術が強く求められている今日、臨床現場で薬剤師がＣＹＰの表現型（フェノタイプ）の確認に、ＨＰＬＣを用いて行う日が近いことから、溶離液に水のみを用い温度調節のみで分離が行えるＳｙｓｔｅｍが必要になるものと考えられる。
【実施例３】
実施例１に示すポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）固定化充填剤を用い、６種プローブ薬の混合試料の一斉分析を行った。フェナセチン（１Ａ２）、トルブタミド（２Ｃ９）、Ｓ−メフェニトイン（２Ｃ１９）、テストステロン（３Ａ４）、クマリン（２Ａ６）、クロルゾキサゾン（２Ｅ１）を表４に示した濃度にＴＨＦを溶媒として調製した。それぞれの構造式を表５に示す。得られた結果を図２に示す。図２からも分かるように本発明のポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）固定化充填剤を用いることで、有用なプローブ薬の分離が可能であること、分離温度が高い方が個々のシグナルの分離が良好であることが分かる。
【実施例４】
生体試料としてＳｅｐ−Ｐａｋ登録商標 Ｐｌｕｓ Ｃ１８ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓを用いて前処理した尿・血清に実施例３の６種プローブ薬をスパイクした試料の分析を行った。
生体試料の前処理は以下の方法に従った。
尿：ハルンカップに採尿しておき、そこから５ｍＬの尿を量り固相抽出を行った。固相抽出は、メタノール・Ｍｉｌｌｉ−Ｑ ｗａｔｅｒでウォーミングアップしておいたフィルターに尿を通し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ ｗａｔｅｒで親水性の物質を洗い流し、メタノールで目的の物質を回収した。回収したメタノールをエバポレートし溶媒を完全に除去した後、ＴＨＦ５ｍＬに再度溶解させ、ブランク試料とした。
血清：精度管理用凍結乾燥プール血清（Ｎｉｓｓｕｉ）を５ｍＬ量り取り固相抽出を行った。固相抽出は、メタノール・Ｍｉｌｌｉ−Ｑ ｗａｔｅｒ・０．１Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４（ｐＨ＝４．８）でウォーミングアップしておいたフィルターに血清を通し、０．１Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４（ｐＨ＝４．８）で親水性の物質を洗い流し、メタノールで目的の物質を回収した。回収したメタノールをエバポレートし溶媒を完全に除去した後、ＴＨＦ５ｍＬに再度溶解させ、ブランク試料とした。
＜実験条件＞
ポンプ ：Ｌ−７１００（ＨＩＴＡＣＨＩ）
ＵＶ検出器 ：Ｌ−７４００（ＨＩＴＡＣＨＩ）
Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ ：Ｄ−７５００（ＨＩＴＡＣＨＩ）
Ｃｏｌｕｍｎ Ｏｖｅｎ：ＡＯ−３０Ｃ（Ｓｈｏｄｅｘ）
温度の安定性をはかるためにプレヒート管として１ｍの金属製のループを使用した。
溶離液 ：０．１Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４（ｐＨ＝４．８）
流速 ：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長 ：ＵＶ＝２２０ｎｍ
温度 ：１０，２０，３０，４０℃
カラム ：（ポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）固定化充填剤
＜結果＞
得られた結果を図３に示す。図からも分かるように実施例３で挙げたプローブは生体試料が混在された状態でも分離できることが分かる。
【実施例５】
ＣＹＰ１Ａ２はカフェインのＮ３窒素原子上でのＮ−脱メチル化、アセトアミノフェンを形成するフェナセチのＯ−脱エチル化などを触媒する酵素である。カフェイのＮ−脱メチル化はヒトにおけるカフェイン全代謝の８０〜９０％を占め、ＣＹＰ１Ａ２活性に依存することから、ｉｎ ｖｉｖｏでの本酵素のプローブ薬物とされている。しかしｉｎ ｖｉｔｒｏでは、カフェインはＨＰＬＣの検出限界より放射性物質によりラベル化したものや、ＬＣ／ＭＳを使う必要があるため、あまり用いられない。
＜サンプル＞
フェナセチン、アセトアミノフェンをそれぞれ０．２ｍｇ／ｍＬの濃度になるように溶離液（０．１Ｍ酢酸アンモニウム ｐＨ＝４．８）に溶かし試料とした。また、１：１となるよう混合溶液をつくり試料とした。
＜測定＞
ＵＶ＝２２０ｎｍ，
（ポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）固定化充填剤，
Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：５，１０，２０，３０，４０℃
Ｅｌｕｅｎｔ：０．１Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４（ｐＨ＝４．８）
温度の安定化をはかる目的でプレヒートとして１ｍの金属製のループを使用
＜結果＞
得られた結果を図４、及び表６に示す。１０℃時の分析において、フェナセチンとアセトアミノフェンのピークは１０℃、４０℃共に分離することが確認された。ピーク形状も良好であり、溶出順序もｌｏｇＰ値の小さい順に溶出していた。プローブ薬物とその代謝物が同時に分析できることが分かる。
【実施例６】
標準品のＳ−メフェニトイン、４−ヒドロキシメフェニトインの同時分析を行った。ＣＹＰ２Ｃ９酵素はジアゼパのＮ−脱メチル化、イミプラミンのＮ−脱メチル化、オメプラゾールの５−水酸化などを触媒する。基質となる薬物の構造上の特徴は明らかになっていない。ｉｎ ｖｉｔｒｏ代謝実験では、Ｓ−メフェニトインが繁用されている。
＜サンプル＞
Ｓ−メフェニトインと４’−ヒドロキシメフェニトインをそれぞれ飽和の濃度になるように溶離液（０．１Ｍ 酢酸アンモニウム ｐＨ＝４．８）に溶かし試料とした。飽和溶液をＳ−メフェニトイン：４’−ヒドロキシメフェニトイン＝１．５：１の割合で混合した。
＜結果＞
得られた結果を図５、及び表７に示す。基質と代謝物のピーク位置は予想していた順序とは逆であった。疎水性相互作用以外の相互作用も関与しているのではないかと考えられる。しかしながら、分析自体は温度を上げることで良好な分離が達成された。温度による保持時間の変動は、フェナセチン・アセトアミノフェンと比較して大きくなっているのが確認された。プローブ薬物とその代謝物が同時に分析できることが分かる。
【実施例７】
実施例４の尿・血清生体試料をＳｅｐ−Ｐａｋ登録商標 Ｐｌｕｓ Ｃ１８ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓを用いて前処理せずに３種のプローブ薬（クロルゾキサゾン（２Ｅ１酵素プローブ薬物）、トルブタミド（２Ｃ９酵素プローブ薬物）、テストステロン（３Ａ４酵素プローブ薬物））をスパイクした試料の分析を行った。
＜実験条件＞
ポンプ ：Ｌ−７１００（ＨＩＴＡＣＨＩ）
ＵＶ検出器 ：Ｌ−７４００（ＨＩＴＡＣＨＩ）
Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ ：Ｄ−７５００（ＨＩＴＡＣＨＩ）
Ｃｏｌｕｍｎ Ｏｖｅｎ：ＡＯ−３０Ｃ（Ｓｈｏｄｅｘ）
温度の安定性をはかるためにプレヒート管として１ｍの金属製のループを使用した。
溶離液 ：０．１Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４（ｐＨ＝４．８）
流速 ：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長 ：ＵＶ＝２２０ｎｍ
温度 ：１０，２０，３０，４０℃
カラム ：（ポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）固定化充填剤
＜結果＞
４０℃で測定した結果、クロルゾキサゾン（２Ｅ１酵素プローブ薬物）、トルブタミド（２Ｃ９酵素プローブ薬物）、テストステロン（３Ａ４酵素プローブ薬物）のピークを確認できた。生体成分とプローブ薬は生体試料が混在された状態でも分離できることが分かった。
【産業上の利用の可能性】
本発明によれば、簡便な手段で、環境に悪影響を与えることなく、薬物代謝能を的確に評価することができる。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【技術分野】
本発明は、生物学、医学、薬学等の分野における薬物代謝機能を、表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーを被覆した充填剤を用い、水系移動相のクロマトグラフィーで温度制御することで測定する新規な薬物代謝能評価システムに関する。
【背景技術】
近年、ヒトにおける薬物相互作用やヒト遺伝子多型等を解析するために、薬物の生体内代謝が着目されている。新薬を開発する際にも、生体内の薬物代謝の研究を行うことの重要性は広く認識されており、生体に投与された薬物の質、及び量的変化を追跡して薬物の有効性や毒性に関連する現象を解明しようという努力が払われている。
薬物の代謝は生体内の多くの組織で行われるが、ほとんどの薬における主要な代謝部位は、その活性の強さと重量から、肝臓であるといえる。脂溶性の薬の代謝に関して特に重要な役割を演じているものは、ミクロソームに局在する、いわゆる薬物代謝酵素といわれているチトクロムＰ４５０（スーパーファミリーを形成、ＣＹＰと略される）であり、その基本の反応機構は、ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０還元酵素により還元されたチトクロムＰ４５０による酸素の活性化に伴う薬の酸化反応と、チトクロムＰ４５０の低い酸化還元電位による薬の還元反応である。現在、臨床で用いられている薬の８０％以上がＰ４５０に代謝されるといわれている。特に酸化反応（第一相反応）の結果生成された代謝物は、さらにグルクロン酸抱合、硫酸抱合、アミノ酸抱合、アセチル抱合、グルタチオン抱合など（第二相）により、さらに水溶性の代謝物となり、尿中や胆汁中に排泄されやすくなる。
このＰ４５０における代謝の研究は、これまで、固定相としてオクタデシル基で表面を修飾した疎水化された多孔性のシリカゲルを用い、移動相中の有機溶媒の濃度を連続的に増加させることで溶質を分離するという逆相クロマトグラフィーにより行われてきた。しかしながら、従来の移動相に用いられている有機溶媒や緩衝液は溶出液に夾雑物が含まれ、それらのＵＶ吸収が非常に強くなるために、ベースラインの安定化や感度が著しく低下する欠点があった。また、連続して分析を行う前にカラムを洗浄し、初期の溶出液で平衡化する必要があるため、分析時間が長くなるという欠点もあった。さらに、各溶質によって、溶出液の流速、イオン強度、ｐＨやカラムの温度などの細部にわたる分離条件を決めていかなくはならず、例えば、臨床現場等では、一種類の条件だけで各溶質を分離させられる簡便な方法が強く望まれていた。
現在の臨床現場では、簡便に薬物代謝能を評価する方法として、抗原抗体反応を利用したイムノアッセイ（ＴＤＸ）法が実際に利用されている。しかしながら、これらの方法では１種類しか測定ができず、測定が多項目となるとそれだけ測定回数が必要となり、費用がかかることや工程が煩雑となっていることが現状であった。
【発明の開示】
本発明は、上記のような従来技術の問題点を解決することを意図してなされたものである。すなわち、本発明は、臨床現場でも簡単に利用できる薬物代謝能評価システムを提供することを目的とする。また、本発明は、その利用方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて、研究開発を行った。その結果、特定の薬物代謝酵素による薬物消費量、及びまたはその代謝物量を、表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーを被覆した充填剤を用い、水系移動相のクロマトグラフィーで温度制御することで測定することで簡便な薬物代謝能評価システムが得られることを見いだした。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。
すなわち、本発明は、臨床現場でも簡単に利用できる薬物代謝能評価システムを提供する。
また、本発明は、その薬物代謝能評価システムを利用した薬物代謝能評価方法を提供する。
加えて、本発明は、その薬物代謝能評価システムを利用したチトクロムＰ４５０の遺伝的多型の評価方法を提供する。
更に加えて、本発明は、その薬物代謝能評価システムを利用した肝硬変、肝癌の診断方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、１０℃及び４０℃の温度条件下でテストステロン及びその代謝物の２５４ｎｍおける吸光度を示すチャートである。
図２は、６種類のプローブ薬物の混合資料を用いて、分析用高速液体クロマトグラフィーにより種々の温度において行った一斉分析に結果を示すチャートである。
図３は、生体試料としてＳｅｐ−Ｐａｋ登録商標 Ｐｌｕｓ Ｃ１８ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓを用いて前処理した尿・血清に実施例３の６種プローブ薬をスパイクした試料の分析を行った結果を示すチャートである。
図４は、フェナセチン、アセトアミノフェンをそれぞれ１：１となるよう混合した試料の分析を行った結果を示すチャートである。
図５は、Ｓ−メフェニトインと４’−ヒドロキシメフェニトインをそれぞれ１．５：１となるように混合した試料の分析を行った結果を示すチャートである。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明では、特定の薬物代謝酵素による薬物消費量、及びまたはその代謝物量を、表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーを被覆した充填剤を用い、水系移動相のクロマトグラフィーで温度制御することで測定することで簡便に、しかも複数の薬物代謝酵素による薬物消費量、及びまたはその代謝物量も同時に測定できる薬物代謝能評価システムが得られることを見いだした。
本発明に使われる代表的な薬物代謝酵素としては、チトクロムＰ４５０分子種、アルコール脱水素酵素、エステラーゼ、β−グルクロニダーゼ、フラビン含有モノオキシゲナーゼ、アルデヒド脱水素酵素、モノアミンオキシダーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−キノン還元酵素、ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素、アルデヒド還元酵素、ケトン還元酵素、エポキシドヒドロラーゼ、スルファターゼ、システイニルグリシナーゼ、γ−グルタミン酸転移酵素、ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素、硫酸転移酵素、グルタチオンＳ−転移酵素、Ｎ−アセチル転移酵素、グリシン抱合酵素、メチル化酵素、グルコース転移酵素、ロダネーゼ等が挙げられる。これらの一種を用いても、あるいは二種以上を組み合わせても良いが、それらの種類は、何ら制約されるものではない。
本発明におけるチトクロムＰ４５０分子種としては、例えば、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｆ１、ＣＹＰ３Ａ３、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ２Ａ１、ＣＹＰ２Ａ２、ＣＹＰ２Ａ４、ＣＹＰ２Ａ５、ＣＹＰ２Ｂ１、ＣＹＰ２Ｂ２、ＣＹＰ２Ｂ４、ＣＹＰ２Ｂ５、ＣＹＰ２Ｂ９、ＣＹＰ２Ｃ２、ＣＹＰ２Ｃ３、ＣＹＰ２Ｃ４、ＣＹＰ２Ｃ５、ＣＹＰ２Ｃ６、ＣＹＰ２Ｃ７、ＣＹＰ２Ｃ１１、ＣＹＰ２Ｃ１２、ＣＹＰ２Ｃ１４、ＣＹＰ２Ｃ２９、ＣＹＰ２Ｄ１、ＣＹＰ２Ｄ２、ＣＹＰ２Ｄ９、ＣＹＰ２Ｆ２、ＣＹＰ２Ｇ１、ＣＹＰ３Ａ１、ＣＹＰ３Ａ２、ＣＹＰ３Ａ６、ＣＹＰ４Ａ１、ＣＹＰ４Ｂ１が挙げられる。これらの一種を用いても、あるいは二種以上を組み合わせても良いが、それらの種類は、何ら制約されるものではない。
本発明は充填剤表面に被覆されたポリマーが温度を変えることで水和、脱水和を起こし、そのことが充填剤表面の親水性／疎水性のバランスを変化させることとなり実現する。このことを達成するには、例えば充填剤表面に温度に応答するポリマーを導入することで達成できる。
本発明の充填剤に被覆されているポリマーは温度を変えることで水和、脱水和を起こすものであり、その温度域は０℃〜８０℃、好ましくは１０℃〜５０℃、さらに好ましくは２０℃〜４５℃であることが判明した。８０℃を越えると移動相が水であるので蒸発等の作業性が悪くなり好ましくない。また、０℃より低いと移動相が凍結する場合があり、やはり好ましくない。
本発明に用いる上記温度に応答するポリマー（以下、温度応答性ポリマーという）はホモポリマー、コポリマーのいずれであってもよい。このようなポリマーとしては、例えば、特開平２−２１１８６５号公報に記載されているポリマーが挙げられる。具体的には、例えば、以下のモノマーの単独重合または共重合によって得られる。使用し得るモノマーとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物（（メタ）アクリルアミドは、アクリルアミド及びメタクリルアミドを意味する。以下、同じ。）、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、またはビニルエーテル誘導体が挙げられ、コポリマーの場合は、これらの中で任意の２種以上を使用することができる。更には、上記モノマー以外のモノマー類との共重合、ポリマー同士のグラフトまたは共重合、あるいはポリマー、コポリマーの混合物を用いてもよい。また、ポリマー本来の性質を損なわない範囲で架橋することも可能である。
本発明は、移動相を水系に固定したままで行われる。ここでの水系とは、水のみ、あるいは無機塩類を含む水溶液であって、有機溶媒を含まないものを意味する。また、この場合、水とは蒸留水、脱イオン水、もしくは精製水のいずれかを表す。
本発明は、特定の薬物代謝酵素による薬物消費量、及びまたはその代謝物量を、水系移動相のクロマトグラフィーで温度制御することで測定するものである。測定に使用される試料は特に限定されるものではないが、例えば特定の薬物代謝酵素と薬物、及びまたはその代謝物などが混在したもの、特定の薬物代謝酵素をあらかじめ除去したものなどが挙げられる。特に、本発明は水系移動相であるため、溶剤による特定の薬物代謝酵素の変性もなく、前者の酵素と薬物、及びまたは代謝物が混在した状態の試料のままで直接測定できることとなり、酵素の除去作業が不要となり好都合である。
被覆を施される充填剤としては、通常、クロマトグラフィーに用いられるシリカゲル、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ガラス、改質ガラス等を初めとして、一般に形態付与が可能である物質、例えば、上記以外の高分子化合物、セラミックス類など全て用いることができる。
温度応答性ポリマーの充填剤への被覆方法は、特に制限されないが、例えば、特開平２−２１１８６５号公報に記載されている方法に従ってよい。すなわち、かかる被覆は、充填剤と上記ポリマーを、カップリング剤などによって結合させる方法、上記モノマー或いはポリマーを電子線照射（ＥＢ）、γ線照射、紫外線照射、プラズマ処理、コロナ処理、有機重合反応のいずれかにより、または塗布、混練等の物理的吸着等により行うことができる。
以上のことを温度応答性ポリマーとしてポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を例にとり説明する。ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）は３１℃に下限臨界溶解温度を有するポリマーとして知られ、遊離状態であれば、水中で３１℃以上の温度で脱水和を起こしポリマー鎖が凝集し、白濁する。逆に３１℃以下の温度ではポリマー鎖は水和し、水に溶解した状態となる。本発明では、このポリマーが充填剤の表面に被覆、固定されたものである。したがって、３１℃以上の温度であれば、基材表面のポリマーも同じように脱水和するが、ポリマー鎖が基材表面に被覆、固定されているため、表面が疎水性を示すようになる。逆に、３１℃以下の温度では、基材表面のポリマーは水和するが、ポリマー鎖が基材表面に被覆、固定されているため、基材表面が親水性を示すようになる。
以上より得られる薬物代謝能評価システムは臨床現場において患者の薬物代謝能を簡単に評価する方法として極めて有効な技術となる。また、本システムによりチトクロムＰ４５０の機能を直接測定することでＰ４５０の遺伝的多型の評価手段としても有効なものと考えられる。さらに本システムによりＰ４５０機能を確認することで肝硬変、肝癌の診断することも可能となる。
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
（ａ）片末端にカルボキシル基を有するポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）の合成法
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド２０．０ｇ、３−メルカプトプロピオン酸０．０９ｇ、２，２’−アゾビス（イソブチロニトリル）０．２１ｇをそれぞれ重合管にいれ、乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド５０ｍｌを加えて溶解した。次に液体窒素下で凍結した後真空オイルポンプで重合管中の酸素を脱気し、減圧状態のまま重合管をメタノールに浸しＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の溶存酸素を取り除いた。この凍結脱気の操作を３回繰り返し行った。脱気が完全にできたら７０±１℃のインキュベーターで２０時間反応させた。次に、室温まで下がったら減圧濃縮を行う乾燥ジエチルエーテル中に滴下させ片末端にカルボキシル基を持ったポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を沈殿させた。この沈殿物をＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）フィルター（ポアサイズ３．０μｍ）で濾取し、シリカゲルを入れたデシケーター中で減圧乾燥をし、粗生成物１９．０ｇが得られた。これを乾燥Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド３０ｍｌに溶かした後、乾燥ジエチルエーテル中に滴下し、その沈殿物をテフロンフィルターで濾取した。これをデシケーター中で減圧乾燥をおこない精製ポリ（Ｎ−イソプルピルアクリルアミド）を得た。得られたポリマーはテトラヒドロフランを溶媒としたゲル濾過クロマトグラフィー及び酸−塩基測定によりポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）が分子量１５，０００であり、分子末端に約１個のカルボキシル基を有することを確認した。
（ｂ）片末端にカルボキシル基を有するポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）の活性エステル化
精製ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を１１．３５ｇを乾燥酢酸エチル１００ｍｌ中に溶かし、ジシクロヘキシルカルボジイミド１．２３ｇ及びＮ−ヒドロキシこはく酸イミド０．６９ｇを加えてよく攪拌しながら０℃で２時間、室温（２０〜２５℃）で１２時間反応させた。次に副生成物であるＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシル尿素をＰＴＦＥフィルターで濾取し、その濾液を減圧濃縮した後乾燥ジエチルエーテル中に滴下し沈殿したものをテフロンフィルターで濾取して、常温減圧で溶媒を留去したものについて、活性エステル化ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を得た。
（ｃ）活性エステル化ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）とアミノ基担体との結合
活性エステル化ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）２．０ｇを純水５０ｍｌに溶かし、アミノプロピルシリカゲル６．０ｇを加え、１２時間室温で激しく振とうして反応させた後冷水５００ｍｌで洗浄し、再び活性エステル化ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）２．０ｇを純水５０ｍｌに溶かした溶液中に加え、１２時間室温で激しく振とうした。この操作を３回繰り返し、冷水５００ｍｌで洗浄した後、メタノール１００ｍｌで洗浄し、乾燥した。活性エステル化ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）３．０ｇを６ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解し、これを表面に一級アミノ基を導入したポリスチレン微粒子浮遊液１ｍｌ（直径１．０±０．０３μｍ、原液濃度：５×１０１１個／ｍｌ）を２４ｍｌの純水で希釈した液に１ｍｌづつ３０分間隔で加え、ゆっくりと転倒混和した。全量を加えた後、４℃以下で１６時間転倒混和した。反応終了後遠心分離による回収と冷純化による洗浄を２回繰り返した後、ハンクス平衡塩溶液（ｐＨ７．４）を用いて希釈した（６×１０９、６×１０１０／ｍｌ）
使用した試薬
テストステロン（生化学用、和光純薬工業製）
リン酸二水素カリウム（和光純薬工業製）
リン酸水素二ナトリウム（和光純薬工業製）
ＮＡＤＰＨ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａ（ＮＡＤＰＨ Ａ）（ＢＤ ＧＥＮＴＥＳＴ製）
ＮＡＤＰＨ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｂ（ＮＡＤＰＨ Ｂ）（ＢＤ ＧＥＮＴＥＳＴ製）
ヒトＣＹＰ３Ａ４＋リダクダーゼ ミクロソーム（ＢＤ ＧＥＮＴＥＳＴ製）
ＨＰＬＣ用メタノール（和光純薬工業製）
ＨＰＬＣ用アセトニトリル（和光純薬工業製）
固相抽出Ｓｅｐ−ｐａｋ登録商標Ｐｌｕｓ Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ製）
使用した装置
分析用高速液体クロマトグラフィー
ポンプ（Ｌ−７１００、ＨＩＴＡＣＨＩ製）
ＵＶ検出器（Ｌ−７４０５、ＨＩＴＡＣＨＩ製）
Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ （Ｄ−７０００、ＨＩＴＡＣＨＩ製）
カラムオーブン（ＡＯ−３０Ｃ、Ｓｈｏｄｅｘ製）
充填剤（ポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）固定化充填剤
実験方法
テストステロンをインビトロで代謝を行い、ポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）修飾充填剤を用い、水のみでテストステロンと６β−ヒドロキシテストステロンの分離を行った。
インビトロでの代謝方法は以下の方法に従った。Ｐ４５０（ＣＹＰ３Ａ４）２０ｐｍｏｌ，ＮＡＤＰ＋ １．３ｍＭ，ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ３．３ｍＭ，ＭｇＣｌ２ ３．３ｍＭ，ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅデヒドロゲナーゼ ０．４Ｕ／ｍＬ，テストステロン ０．２ｍＭを含むＮＡＤＰＨ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａ，Ｂを加え全量を０．５ｍＬとするため
２５μＬ，ＮＡＤＰＨ Ｂ：５μＬ，リン酸Ｂｕｆｆｅｒ：４４５μＬ，テストステロン １ｍｇ／ｍＬ メタノール：５μＬ）。１０分間，３７℃でインキュベーションを行い、
エバポレートし後、精製水１ｍＬに溶解し、Ｓｅｐ−ｐａｋ登録商標Ｐｌｕｓ Ｃ１８で固相抽出しメタノール／精製水＝６０：４０で溶出した。この液をエバポレートして精製水１ｍＬに溶解して試料とした。
結果
はじめに、通常用いられているＯＤＳカラムを用いて標準品として市販されているテストステロンとその代謝物６β−ヒドロキシテストステロンの混合物を作り分析を行った。溶離液にメタノールを６０％も含む精製水／メタノール＝４０：６０を用いた。結果は共に分離が可能であり保持時間は６β−ヒドロキシテストステロンで３．９１ｍｉｎ、テストステロンでは１１．４５ｍｉｎであった。
次に、Ｐ−（ＮＩＰＡＡｍ）カラムで分析を行った。結果を図１に示す。条件は水のみで分離を行い、高温・低温にして保持の違いについて検討した。１０℃では、６β−ヒドロキシテストステロンの保持時間が３．０１ｍｉｎとテストステロンの保持時間が６．８８ｍｉｎと共に１０ｍｉｎ以内にあるが良好に分離されているのが確認できた。４０℃でも同様に分析したところ、６β−ヒドロキシテストステロンの保持時間が５．１６ｍｉｎ、テストステロンの保持時間が１８．１１ｍｉｎと共に伸びた。この結果から、このカラムの特徴である溶離液に精製水のみを用いて、カラム温度を変化させて保持時間の調節が可能であることが示された。
次に、インビトロで代謝を行った試料についても同様の分析を行った。代謝を行ったのみの試料では、１０℃では酵素もしくはＮＡＤＰＨ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ由来の夾雑物が混入してしまい分析を行えなかった。そこで、Ｓｅｐ−ｐａｋ登録商標を用いて固相抽出を行ったところ目的のピークを残し、夾雑物を洗い流すことができたので１０℃、４０℃で分析を行った。１０℃では６β−ヒドロキシテストステロンが洗いきれずに残った酵素由来のピークに妨害を受けてしまい良好な分離が行えなかった。そこで、標準品で得られた結果の様に６β−ヒドロキシテストステロンの保持時間を遅らせられることを期待して４０℃での分析を行ったところ、６β−Ｈｙｄｒｏｘｙｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅの保持時間は７．２１ｍｉｎと良好な分離を行うことに成功した。テストステロンの保持時間も７．２１ｍｉｎから１８．１１ｍｉｎと保持の延長が確認された。
これらの結果を図１に示す。なお、測定条件及び１０℃、４０℃における標準品及び代謝物の保持時間は以下の通りである。
＜測定条件＞
ＵＶ＝２５４ｎｍ
水（移動相）流速＝１．０ｍＬ／ｍｉｎ
サンプル投入量＝２０μＬ
【実施例２】
カフェイン、ワルファリン、オメプラゾールの各試薬を水またはＴＨＦに溶かし飽和水溶液を作った。これを０．４５μｍのフィルターでろ過し得られた液を試料とした。
使用した装置
分析用高速液体クロマトグラフィー
ポンプ（Ｌ−７１００、ＨＩＴＡＣＨＩ製）
移動相流速 １．０ｍＬ／ｍｉｎ
Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ （Ｄ−７０００、ＨＩＴＡＣＨＩ製）
カラムオーブン（ＡＯ−３０Ｃ、Ｓｈｏｄｅｘ製）
充填剤（ポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）固定化充填剤
結果
カフェイン、ワルファリン、オメプラゾールの各試料は分析用高速液体クロマトグラフィーにかけて分離し、各々下記の波長のＵＶで１０℃及び５０℃における保持時間を測定した。
カフェイン（移動相：水）（ＵＶ＝２７５ｎｍ）
Ｓ−ワルファリン（移動相：水）（ＵＶ＝３０２ｎｍ）
オメプラゾール（移動相：水）（ＵＶ＝３０２ｎｍ）
結果を表３に示す。
以上の結果より、本技術であれば水のみでこれらＣＹＰのプローブ薬を分離させられることが分かる。
このカラムは溶離液が水のみで分離を行えるため環境に優しい。しかも、テーラーメイド医療技術が強く求められている今日、臨床現場で薬剤師がＣＹＰの表現型（フェノタイプ）の確認に、ＨＰＬＣを用いて行う日が近いことから、溶離液に水のみを用い温度調節のみで分離が行えるＳｙｓｔｅｍが必要になるものと考えられる。
【実施例３】
実施例１に示すポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）固定化充填剤を用い、６種プローブ薬の混合試料の一斉分析を行った。フェナセチン（１Ａ２）、トルブタミド（２Ｃ９）、Ｓ−メフェニトイン（２Ｃ１９）、テストステロン（３Ａ４）、クマリン（２Ａ６）、クロルゾキサゾン（２Ｅ１）を表４に示した濃度にＴＨＦを溶媒として調製した。それぞれの構造式を表５に示す。得られた結果を図２に示す。図２からも分かるように本発明のポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）固定化充填剤を用いることで、有用なプローブ薬の分離が可能であること、分離温度が高い方が個々のシグナルの分離が良好であることが分かる。
【実施例４】
生体試料としてＳｅｐ−Ｐａｋ登録商標 Ｐｌｕｓ Ｃ１８ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓを用いて前処理した尿・血清に実施例３の６種プローブ薬をスパイクした試料の分析を行った。
生体試料の前処理は以下の方法に従った。
尿：ハルンカップに採尿しておき、そこから５ｍＬの尿を量り固相抽出を行った。固相抽出は、メタノール・Ｍｉｌｌｉ−Ｑ ｗａｔｅｒでウォーミングアップしておいたフィルターに尿を通し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ ｗａｔｅｒで親水性の物質を洗い流し、メタノールで目的の物質を回収した。回収したメタノールをエバポレートし溶媒を完全に除去した後、ＴＨＦ５ｍＬに再度溶解させ、ブランク試料とした。
血清：精度管理用凍結乾燥プール血清（Ｎｉｓｓｕｉ）を５ｍＬ量り取り固相抽出を行った。固相抽出は、メタノール・Ｍｉｌｌｉ−Ｑ ｗａｔｅｒ・０．１Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４（ｐＨ＝４．８）でウォーミングアップしておいたフィルターに血清を通し、０．１Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４（ｐＨ＝４．８）で親水性の物質を洗い流し、メタノールで目的の物質を回収した。回収したメタノールをエバポレートし溶媒を完全に除去した後、ＴＨＦ５ｍＬに再度溶解させ、ブランク試料とした。
＜実験条件＞
ポンプ ：Ｌ−７１００（ＨＩＴＡＣＨＩ）
ＵＶ検出器 ：Ｌ−７４００（ＨＩＴＡＣＨＩ）
Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ ：Ｄ−７５００（ＨＩＴＡＣＨＩ）
Ｃｏｌｕｍｎ Ｏｖｅｎ：ＡＯ−３０Ｃ（Ｓｈｏｄｅｘ）
温度の安定性をはかるためにプレヒート管として１ｍの金属製のループを使用した。
溶離液 ：０．１Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４（ｐＨ＝４．８）
流速 ：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長 ：ＵＶ＝２２０ｎｍ
温度 ：１０，２０，３０，４０℃
カラム ：（ポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）固定化充填剤
＜結果＞
得られた結果を図３に示す。図からも分かるように実施例３で挙げたプローブは生体試料が混在された状態でも分離できることが分かる。
【実施例５】
ＣＹＰ１Ａ２はカフェインのＮ３窒素原子上でのＮ−脱メチル化、アセトアミノフェンを形成するフェナセチのＯ−脱エチル化などを触媒する酵素である。カフェイのＮ−脱メチル化はヒトにおけるカフェイン全代謝の８０〜９０％を占め、ＣＹＰ１Ａ２活性に依存することから、ｉｎ ｖｉｖｏでの本酵素のプローブ薬物とされている。しかしｉｎ ｖｉｔｒｏでは、カフェインはＨＰＬＣの検出限界より放射性物質によりラベル化したものや、ＬＣ／ＭＳを使う必要があるため、あまり用いられない。
＜サンプル＞
フェナセチン、アセトアミノフェンをそれぞれ０．２ｍｇ／ｍＬの濃度になるように溶離液（０．１Ｍ酢酸アンモニウム ｐＨ＝４．８）に溶かし試料とした。また、１：１となるよう混合溶液をつくり試料とした。
＜測定＞
ＵＶ＝２２０ｎｍ，
（ポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）固定化充填剤，
Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：５，１０，２０，３０，４０℃
Ｅｌｕｅｎｔ：０．１Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４（ｐＨ＝４．８）
温度の安定化をはかる目的でプレヒートとして１ｍの金属製のループを使用
＜結果＞
得られた結果を図４、及び表６に示す。１０℃時の分析において、フェナセチンとアセトアミノフェンのピークは１０℃、４０℃共に分離することが確認された。ピーク形状も良好であり、溶出順序もｌｏｇＰ値の小さい順に溶出していた。プローブ薬物とその代謝物が同時に分析できることが分かる。
【実施例６】
標準品のＳ−メフェニトイン、４−ヒドロキシメフェニトインの同時分析を行った。ＣＹＰ２Ｃ９酵素はジアゼパのＮ−脱メチル化、イミプラミンのＮ−脱メチル化、オメプラゾールの５−水酸化などを触媒する。基質となる薬物の構造上の特徴は明らかになっていない。ｉｎ ｖｉｔｒｏ代謝実験では、Ｓ−メフェニトインが繁用されている。
＜サンプル＞
Ｓ−メフェニトインと４’−ヒドロキシメフェニトインをそれぞれ飽和の濃度になるように溶離液（０．１Ｍ 酢酸アンモニウム ｐＨ＝４．８）に溶かし試料とした。飽和溶液をＳ−メフェニトイン：４’−ヒドロキシメフェニトイン＝１．５：１の割合で混合した。
＜結果＞
得られた結果を図５、及び表７に示す。基質と代謝物のピーク位置は予想していた順序とは逆であった。疎水性相互作用以外の相互作用も関与しているのではないかと考えられる。しかしながら、分析自体は温度を上げることで良好な分離が達成された。温度による保持時間の変動は、フェナセチン・アセトアミノフェンと比較して大きくなっているのが確認された。プローブ薬物とその代謝物が同時に分析できることが分かる。
【実施例７】
実施例４の尿・血清生体試料をＳｅｐ−Ｐａｋ登録商標 Ｐｌｕｓ Ｃ１８ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓを用いて前処理せずに３種のプローブ薬（クロルゾキサゾン（２Ｅ１酵素プローブ薬物）、トルブタミド（２Ｃ９酵素プローブ薬物）、テストステロン（３Ａ４酵素プローブ薬物））をスパイクした試料の分析を行った。
＜実験条件＞
ポンプ ：Ｌ−７１００（ＨＩＴＡＣＨＩ）
ＵＶ検出器 ：Ｌ−７４００（ＨＩＴＡＣＨＩ）
Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ ：Ｄ−７５００（ＨＩＴＡＣＨＩ）
Ｃｏｌｕｍｎ Ｏｖｅｎ：ＡＯ−３０Ｃ（Ｓｈｏｄｅｘ）
温度の安定性をはかるためにプレヒート管として１ｍの金属製のループを使用した。
溶離液 ：０．１Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４（ｐＨ＝４．８）
流速 ：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長 ：ＵＶ＝２２０ｎｍ
温度 ：１０，２０，３０，４０℃
カラム ：（ポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）固定化充填剤
＜結果＞
４０℃で測定した結果、クロルゾキサゾン（２Ｅ１酵素プローブ薬物）、トルブタミド（２Ｃ９酵素プローブ薬物）、テストステロン（３Ａ４酵素プローブ薬物）のピークを確認できた。生体成分とプローブ薬は生体試料が混在された状態でも分離できることが分かった。
【産業上の利用の可能性】
本発明によれば、簡便な手段で、環境に悪影響を与えることなく、薬物代謝能を的確に評価することができる。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の薬物代謝酵素による薬物消費量、及びまたはその代謝物量を、表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーを被覆した充填剤を用い、水系移動相のクロマトグラフィーで温度制御することで測定することを特徴とする薬物代謝能評価システム。
【請求項２】
測定される試料が特定の薬物代謝酵素と薬物、及びまたはその代謝物の混合物である、請求項１記載の薬物代謝能評価システム。
【請求項３】
薬物代謝酵素がチトクロムＰ４５０分子種、アルコール脱水素酵素、エステラーゼ、β−グルクロニダーゼの一種、もしくは二種以上である、請求項１または２記載の薬物代謝能評価システム。
【請求項４】
チトクロムＰ４５０分子種として、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｆ１、ＣＹＰ３Ａ３、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ７の一種、もしくは二種以上の項目を同時に測定することを特徴とする、請求項３記載の薬物代謝能評価システム。
【請求項５】
被覆されている０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーが、遊離された状態で下限臨界溶解温度、及びまたは上限臨界溶解温度を有するものである、請求項１〜４のいずれか１項記載の薬物代謝能評価システム。
【請求項６】
ポリマーが、架橋構造を有するものである、請求項５記載の薬物代謝能評価システム。
【請求項７】
下限臨界溶解温度を有するポリマーが、ポリアルキルアクリルアミド、及び／またはその共重合物である、請求項５または６記載の薬物代謝能評価システム。
【請求項８】
ポリアルキルアクリルアミドが、ポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、及び／またはポリ−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド）である、請求項７記載の薬物代謝能評価システム。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項記載の薬物代謝能評価システムを利用した薬物代謝能評価方法。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項記載の薬物代謝能評価システムを利用したチトクロムＰ４５０の遺伝的多型の評価方法。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項記載の薬物代謝能評価システムを利用した肝硬変、肝癌の診断方法。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか１項記載の薬物代謝能評価システムを利用した肝硬変、肝癌の進行度合いを把握する指標となる、特定の薬物代謝酵素による薬物消費量、及び／またはその代謝物量の測定方法。
【請求項１】
特定の薬物代謝酵素による薬物消費量、及びまたはその代謝物量を、表面に０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーを被覆した充填剤を用い、水系移動相のクロマトグラフィーで温度制御することで測定することを特徴とする薬物代謝能評価システム。
【請求項２】
測定される試料が特定の薬物代謝酵素と薬物、及びまたはその代謝物の混合物である、請求項１記載の薬物代謝能評価システム。
【請求項３】
薬物代謝酵素がチトクロムＰ４５０分子種、アルコール脱水素酵素、エステラーゼ、β−グルクロニダーゼの一種、もしくは二種以上である、請求項１または２記載の薬物代謝能評価システム。
【請求項４】
チトクロムＰ４５０分子種として、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｆ１、ＣＹＰ３Ａ３、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ７の一種、もしくは二種以上の項目を同時に測定することを特徴とする、請求項３記載の薬物代謝能評価システム。
【請求項５】
被覆されている０〜８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーが、遊離された状態で下限臨界溶解温度、及びまたは上限臨界溶解温度を有するものである、請求項１〜４のいずれか１項記載の薬物代謝能評価システム。
【請求項６】
ポリマーが、架橋構造を有するものである、請求項５記載の薬物代謝能評価システム。
【請求項７】
下限臨界溶解温度を有するポリマーが、ポリアルキルアクリルアミド、及び／またはその共重合物である、請求項５または６記載の薬物代謝能評価システム。
【請求項８】
ポリアルキルアクリルアミドが、ポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、及び／またはポリ−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド）である、請求項７記載の薬物代謝能評価システム。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項記載の薬物代謝能評価システムを利用した薬物代謝能評価方法。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項記載の薬物代謝能評価システムを利用したチトクロムＰ４５０の遺伝的多型の評価方法。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項記載の薬物代謝能評価システムを利用した肝硬変、肝癌の診断方法。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか１項記載の薬物代謝能評価システムを利用した肝硬変、肝癌の進行度合いを把握する指標となる、特定の薬物代謝酵素による薬物消費量、及び／またはその代謝物量の測定方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７８９６８
【国際公開日】平成１６年９月１６日（２００４．９．１６）
【発行日】平成１８年６月８日（２００６．６．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０３１０６（Ｐ２００５−５０３１０６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００２７５３
【国際出願日】平成１６年３月４日（２００４．３．４）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
テフロン
【出願人】（５０１３４５２２０）株式会社セルシード (39)
【出願人】（５０３１３１７７７）
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年９月１６日（２００４．９．１６）
【発行日】平成１８年６月８日（２００６．６．８）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００２７５３
【国際出願日】平成１６年３月４日（２００４．３．４）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
テフロン
【出願人】（５０１３４５２２０）株式会社セルシード (39)
【出願人】（５０３１３１７７７）
【Ｆターム（参考）】
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