薬用植物細胞培養方法
【課題】 有用成分の含有量が多く、免疫賦活能や抗酸化活性などの効能が向上し、しかも品質の安定した薬用植物を培養生産することができる薬用植物細胞培養方法を提供すること。
【解決手段】 カルス１を再分化させる植物細胞培養方法であって、培養時に波長２５０〜７６０ｎｍで４０μｍｏｌ／ｍ2 ／ｓ以上の光を照射する。
【解決手段】 カルス１を再分化させる植物細胞培養方法であって、培養時に波長２５０〜７６０ｎｍで４０μｍｏｌ／ｍ2 ／ｓ以上の光を照射する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、薬用植物細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エゾウコギ（学名：Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｘ ｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓ）はシベリア、中国東北部、日本では北海道東部に分布するウコギ科の落葉灌木である。そして、このエゾウコギは、ａｃａｎｔｈｏｉｃ ａｃｉｄ，β−ｓｉｔｏｓｔｅｒｏｌ，ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｓｉｄｅ Ａ〜Ｇ等、抗疲労、抗ストレス、持久力向上などの効果を発揮する有用成分（生理活性物質）を含有する薬用植物として広く知られるようになり、医薬、健康食品等の分野で注目されている。
【０００３】
しかし、上記エゾウコギのような天然の薬用植物の有用成分の含有量は、産地や気候の違い及び流通における保管状態等により個体差が大きく、このことが薬用植物の品質の安定性に影響を及ぼし、特に薬用植物を用いた製品の開発時に問題となる。また、乱伐による天然の薬用植物の枯渇や生態系の破壊も憂慮されている。
【０００４】
ところで、特許文献１には、エゾウコギの幼植物体の大量生産が可能なエゾウコギ細胞培養方法が記載されている。この方法によれば、エゾウコギを培養生産することができるので、天然のエゾウコギの乱伐による被害が生じない。しかし、上記方法では、得られるエゾウコギの免疫賦活能などの効能の向上を図ることができず、その効能は天然（北海道産）のエゾウコギの効能と同等か若干下回る程度であった。このことは、上記方法により得られるエゾウコギ中に含有される有用成分（免疫賦活能を向上させる有用成分等）の量が、天然のエゾウコギ中に含有される有用成分の量と同等か若干下回っていることに起因すると考えられる。
【特許文献１】特開２０００−２２８９２４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明者らは、鋭意研究を行った結果、エゾウコギなどの薬用植物のカルスを再分化させて細胞を培養する際に、薬用植物細胞に所定の光を照射することにより、薬用植物中の有用成分が増加し、上記免疫賦活能や抗酸化活性などの効能が向上することを見出した。
【０００６】
この発明は上述の事柄に留意してなされたもので、その目的は、有用成分の含有量が多く、免疫賦活能や抗酸化活性などの効能が向上し、しかも品質の安定した薬用植物を培養生産することができる薬用植物細胞培養方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、この発明の薬用植物細胞培養方法は、カルスを再分化させる植物細胞培養方法であって、培養時に波長２５０〜７６０ｎｍで４０μｍｏｌ／ｍ2 ／ｓ以上の光を照射することを特徴としている（請求項１）。
【０００８】
具体的には、前記光を、４０〜１５０μｍｏｌ／ｍ2 ／ｓとすることが好ましい（請求項２）。
【発明の効果】
【０００９】
請求項１および２に係る発明では、有用成分の含有量が多く免疫賦活能や抗酸化活性などの効能が向上した薬用植物を培養することができる薬用植物培養方法が得られる。しかも、前記薬用植物細胞培養方法では、各薬用植物細胞をほぼ同一の条件下で培養することができるので、有用成分の含有量の個体差が小さく、従って、品質の安定した薬用植物を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、この発明の詳細を、図を参照しながら説明する。図１は、この発明の一実施の形態に係る薬用植物細胞培養方法（以下、培養方法という）を概略的に示す説明図である。
【００１１】
この実施例の培養方法では、エゾウコギのカルスを培養して不定胚（球状胚、心臓型胚、魚雷型胚）を誘導し、さらに成長させて幼植物体を得る。すなわち、前記培養方法は、まず、第１ステップとして、エゾウコギの体細胞や種子などから誘導し、インキュベータ（図示していない）で保存（培養）してあるカルス１をＭＳ液体培地（３％スクロースを含む）２で懸濁培養する。具体的には、三角フラスコなどの容器Ｈの中にＭＳ培地２とカルス１を入れて、バイオシェイカー（振とう培養器）で振とう培養する。
【００１２】
そして、この第１ステップを約１週間続行することにより、前記カルス１のほとんどは２００μｍ程度の大きさの球状胚に成長する。
【００１３】
続いて、第２ステップとして、第１ステップにおいてカルス１を培養して得られたエゾウコギ（前記球状胚になったものとなっていないものとの両方を含む。以下、１次培養体という）３を全て培養装置４に移し替えて更に培養する。ここで、この培養装置４は、エアリフト式通気培養槽５と、この通気培養槽５に近接して配置される光源６とを備えている。
【００１４】
詳しくは、通気培養槽５は、１次培養体３およびＭＳ液体培地（２％スクロースを含む）７を収容し、透明な樹脂またはガラスからなる水槽８と、この水槽８内にその下側から滅菌したエアを供給し続け、水槽８内を攪拌し続けるためのエア供給手段９とを備えている。そして、前記エア供給手段９は、前記水槽８内の下部に配置されるエア導出部１０と、このエア導出部１０に接続される流路１１と、この流路の上流側に設けられ、例えばエアポンプやコンプレッサなどからなるエア供給装置１２と、前記流路１１においてエア供給装置１２の下流側に設けられ、エア供給装置１２からのエア中の不純物や菌などを除去するためのフィルタ１３とを有している。
【００１５】
前記光源６は、水槽８に対して赤色光、青色光または白色光を近接照射（４０〜１５０μｍｏｌ／ｍ2 ／ｓ）するように構成されている。ここで、光源６は、水槽８内において培養中の１次培養体３全てに均一に光を照射するように、水槽８の上方、下方、側方および水槽８の内部など適宜の位置に配置されていることが好ましく、光源６の配置箇所は一箇所でも複数箇所でもよい。
【００１６】
そして、この第２ステップでは、光源６からの一定状態の光を水槽８内に照射することにより、水槽８内の１次培養体３に光ストレスを与え、かつ、エア供給手段９により水槽８内に滅菌したエアを供給し続ける状態で、２週間ごとにＭＳ培地７を交換するという条件の下、１次培養体３の通気培養を約１０〜１２週間続行する。この間、前記１次培養体３は、球状胚から心臓型胚・魚雷型胚（５００μｍ〜１ｍｍ程度の大きさ）の形態を経て、そのほとんどが幼植物体（２．８ｍｍ以上の大きさ）となる。
【００１７】
また、第２ステップでは、光源６から水槽８へ１６時間光を照射した後、光の照射を８時間停止するというサイクルを繰り返すようにしてある。このように明暗周期を設けることが１次培養体３の成長を促進させる点で効果的であると考えられるが、明暗周期を設けず、光ストレスを与え続けるようにしてもよい。
【００１８】
その後、第３ステップとして、第２ステップにおいて１次培養体３を培養して得られたエゾウコギ（以下、２次培養体という）１４をＭＳ培地７とともに網状体（２．８ｍｍメッシュ）１５で濾し、網状体１５を通過せずその上に残った２次培養体１４を幼植物体に成長したと判断し、取り出す。以上で、エゾウコギ細胞の培養が完了する。
【００１９】
なお、前記第３ステップにおいて、網状体１５で濾したときに網状体１５を通過し、まだ幼植物体にはなっていないと判断される２次培養体１４については、破棄する。もちろん、前記２次培養体１４を破棄する代わりに、再び第２ステップに戻すことも可能であり、この場合、前記２次培養体１４を第１ステップを経てきた１次培養体３とともに、水槽８内に収容すればよい。
【００２０】
また、上記第３ステップで幼植物体とみなして取り出した２次培養体１４は、例えば、乾燥させた後、粉末状に形成されたり、エキスが抽出されたりし、その後、生薬や健康食品として人体に取り込まれたり、免疫療法でリンパ球を活性化させることに用いられる。
【００２１】
上記培養方法によって得られるエゾウコギ（以下、本発明のエゾウコギという）は、天然（北海道産）のエゾウコギ（以下、天然のエゾウコギという）や特許文献１に記載された方法によって得られるエゾウコギ（以下、従来のエゾウコギという）に比べて、有用成分、特に免疫賦活能を向上させる有用成分の含有量が増加している。以下、このことを明らかにしたＮＫ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ）細胞活性測定（特願平９−３４２６７５）について説明する。
【００２２】
前記ＮＫ細胞活性測定は、以下の（１）〜（３）の手順に従って行われる。
（１）人の血液を採取し、血液からリンパ球（ＮＫ細胞）を分離する。
（２）分離したリンパ球を、乾燥させ粉末にしたエゾウコギが混入された培地で培養し、活性化させる。
（３）前記リンパ球（活性化リンパ球）とガン細胞とを一定比率で混合し、傷害されたガン細胞の割合を測定することによって、リンパ球のガン細胞に対する傷害活性を求める。
【００２３】
今回の測定では、１０名から採血し、従来のエゾウコギと、天然のエゾウコギと、本発明のエゾウコギとについてそれぞれＮＫ細胞活性測定を行った結果を平均した。ここで、本発明のエゾウコギとしては、前記第２ステップ、すなわち通気培養時における光源６の構成を３パターンに変えて３種用意した。すなわち、第１のエゾウコギは、前記第２ステップにおいて、赤色ＬＥＤを光源６として用い、波長が６６０ｎｍで５０μｍｏｌ／ｍ2 ／ｓの赤色単色光を水槽８内の１次培養体３に照射して得られたものである。また、第２のエゾウコギは、第２ステップにおいて、青色ＬＥＤを光源６として用い、波長が４７０ｎｍで１２０μｍｏｌ／ｍ2 ／ｓの青色単色光を水槽８内の１次培養体３に照射して得られたものである。さらに、第３のエゾウコギは、第２ステップにおいて、白色蛍光灯を光源６として用い、波長が２５０〜７６０ｎｍで７０〜１３０μｍｏｌ／ｍ2 ／ｓの白色光を水槽８内の１次培養体３に照射して得られたものである。
【００２４】
そして、図２〜図５に、上記ＮＫ細胞活性測定によって得られた従来のエゾウコギ、天然のエゾウコギおよび３種の本発明のエゾウコギの免疫賦活能について、従来のエゾウコギを基準にして示す。すなわち、図２〜図５の各図において、縦軸にはリンパ球のガン細胞に対する傷害活性（＝免疫賦活能）を、従来のエゾウコギを用いた場合を１．０として示している。また、図２〜図５の各図において、（Ａ）はガン細胞とリンパ球との比率が１：４０である場合、（Ｂ）はガン細胞とリンパ球との比率が１：２０である場合、（Ｃ）はガン細胞とリンパ球との比率が１：１０である場合、（Ｄ）はガン細胞とリンパ球との比率が１：５である場合をそれぞれ示している。
【００２５】
図２（Ａ）〜（Ｄ）には、従来のエゾウコギと天然のエゾウコギの免疫賦活能が示されており、これらの図から明らかなように、従来のエゾウコギの免疫賦活能は、天然のエゾウコギと比べて同等か若干それよりも下回っている。
【００２６】
図３（Ａ）〜（Ｄ）には、従来のエゾウコギと本発明の第１のエゾウコギの免疫賦活能が示されており、これらの図から明らかなように、第１のエゾウコギの免疫賦活能は、従来のエゾウコギをほぼ上回っており、特にガン細胞と活性化リンパ球との比率が１：２０のときには１．１３倍と高くなった。
【００２７】
図４（Ａ）〜（Ｄ）には、従来のエゾウコギと本発明の第２のエゾウコギの免疫賦活能が示されており、これらの図から明らかなように、第２のエゾウコギの免疫賦活能は、従来のエゾウコギを大きく上回っており、特にガン細胞と活性化リンパ球との比率が１：１０のときには１．３８倍と高くなった。
【００２８】
図５（Ａ）〜（Ｄ）には、従来のエゾウコギと本発明の第３のエゾウコギの免疫賦活能が示されており、これらの図から明らかなように、第３のエゾウコギの免疫賦活能は、従来のエゾウコギをかなり大きく上回っており、特にガン細胞と活性化リンパ球との比率が１：５のときには１．７５倍と高くなった。
【００２９】
以上、図３〜図５に示す結果から、本発明の培養方法によれば、天然のエゾウコギや従来のエゾウコギに比べて免疫賦活能がおよそ３０〜５０％高まったエゾウコギが得られ、また、エゾウコギの免疫賦活能と含有する有用成分（免疫賦活能を向上させる有用成分）とはほぼ比例すると考えられるので、本発明の培養方法によれば、有用成分の含有量が多いエゾウコギが得られることになる。しかも、本発明の培養方法では、各エゾウコギ細胞をほぼ同一の条件下で培養することができるので、有用成分の含有量の個体差が小さく、従って、品質の安定したエゾウコギを得ることができる。
【００３０】
上記のことから明らかなように、本発明はエゾウコギの免疫賦活能を高める培養方法を提供するものである。その上、本発明はエゾウコギの抗酸化活性を高める培養方法を提供するものでもあり、このことはＤＰＰＨ（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ）ラジカル消去活性測定法に基づく測定によって明らかとなった。
【００３１】
すなわち、前記ＤＰＰＨラジカル消去活性測定法は、試験管にＤＰＰＨ−エタノール溶液、試料抽出液を加え、１０分後に５１７ｎｍでの吸光度を測定し、ＤＰＰＨラジカルの退色を測定することで行われる。そして、北海道産のエゾウコギの幹から前記試料抽出液を採取して前記測定を行ったときの結果を図６の「北海道産幹」の欄に記載してある。また、本発明に則った光照射を行う培養方法によりエゾウコギ幼植物体を得て、このエゾウコギ幼植物体から前記試料抽出液を採取して前記測定を行ったときの結果を図６の「光照射」の欄に記載してある。さらに、光照射を行わず暗所で培養した以外の点は本発明に則った培養方法によりエゾウコギ幼植物体を得て、このエゾウコギ幼植物体から前記試料抽出液を採取して行ったときの結果を図６の「暗所」の欄に記載してある。
【００３２】
図６から明らかなように、本発明の方法に則りカルス誘導により培養したエゾウコギ幼植物体は、市販のエゾウコギ天然物と比べ高いラジカル消去活性（抗酸化活性）をもつことが判明し、特に光ストレスを与えたときに消去活性が増加することも実証された。これは、強い抗酸化活性を持つクロロゲン酸や１，５−ジカフェオイルキナ酸等のカフェオイルキナ酸類を主体とするポリフェノール類がエゾウコギ幼植物体に含有され、光照射下での培養（光ストレスの付与）により上記のようなポリフェノール類が増加するためであると考えられる。
【００３３】
そこで、各種のエゾウコギ中の総ポリフェノール含量およびクロロゲン酸含量を確認するために、Folin-Denis 法に基づく測定と、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた測定とを行った。すなわち、前記Folin-Denis 法は、試料抽出液に、蒸留水、１０％炭酸ナトリウム水溶液、Folin-Ciocaltus 試薬を加えて、暗所で１時間反応させ吸光度を測定することで行われる。そして、この測定により得られた各試料中の総ポリフェノール含量をクロロゲン酸に換算して求めた値を図７に示した。また、試料抽出液を上記ＨＰＬＣで分析して得られた試料１００ｇ当たりのクロロゲン酸含量を図８に示した。
【００３４】
ここで、図７および図８において、「北海道産幹」の欄には、北海道産のエゾウコギの幹から前記試料抽出液を採取して各測定を行ったときの結果が、また、「中国産根」の欄には、中国産のエゾウコギの根から前記試料抽出液を採取して各測定を行ったときの結果が記載されている。さらに、図７および図８において、「光照射」の欄には、本発明に則った光照射を行う培養方法によりエゾウコギ幼植物体を得て、このエゾウコギ幼植物体から前記試料抽出液を採取して各測定を行ったときの結果が記載され、「暗所」の欄には、光照射を行わず暗所で培養した以外の点は本発明に則った培養方法によりエゾウコギ幼植物体を得て、このエゾウコギ幼植物体から前記試料抽出液を採取して各測定を行ったときの結果が記載されている。
【００３５】
図７および図８から明らかなように、本発明の方法に則りカルス誘導により培養したエゾウコギ幼植物体は、市販のエゾウコギ天然物と比べ含有する総ポリフェノールおよびクロロゲン酸の量が多く、特に光ストレスを与えたときにそれぞれの含有量が増加することが判明した。
【００３６】
上記のように、本発明の培養方法で生産されるエゾウコギ幼植物体は、クロロゲン酸や１，５−ジカフェオイルキナ酸（共にカフェオイルキナ酸類の一つ）など強い抗酸化活性をもつポリフェノール類を多く含有することから、健康食品等の素材として非常に有用である。すなわち、ポリフェノール類の抗酸化活性は、体内の活性酸素の除去などに効果があることが知られており、また、老化抗酸化活性の高い食品には老化防止や生活習慣病に対する予防効果がある。
【００３７】
なお、この発明は上記の実施の形態に限られず、種々に変形して実施することができる。例えば、第１ステップにおけるカルス１の懸濁培養（振とう培養）時においても、第２ステップと同様に、前記光源６を用いて波長２５０〜７６０ｎｍで４０〜１５０μｍｏｌ／ｍ2 ／ｓの光を照射してもよい。
【００３８】
また、大量培養を行う場合には、第２ステップにおいて２週間毎に繰り返し行う液体培地７の交換の最後の交換時に、１次培養体３（このときの１次培養体３は１ｍｍ程度の魚雷型胚が殆どである）を液体培地７とともに容量が例えば５０Ｌ以上の大型培養タンク（図示していない）に移し替えればよい。前記大型培養タンクは、通気培養槽５とほぼ同一構成であり、サイズが大きくなっている点で異なる。大型培養タンクになると液体培地の交換が非常に困難になるため、最後の液体培地７の交換時（その後の培地交換が不要となる段階）に移し替えるようにしている。
【００３９】
さらに、上記実施の形態では、エゾウコギ細胞を培養対象としているが、エゾウコギの他、サンシュユ、オトギリソウ、ツキミソウ、ヌルデ、シナアブラギリ、センブリなどの薬用植物を培養対象としてもよく、培養方法も光照射が可能な他の（液体）培養方法（例えば、カルスから不定胚を誘導するのではなく不定芽や不定根を誘導する液体培養方法等）を用いてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】この発明の一実施の形態に係る薬用植物細胞培養方法を概略的に示す説明図である。
【図２】（Ａ）〜（Ｄ）は、ＮＫ細胞活性測定によって求めた従来のエゾウコギおよび天然のエゾウコギの免疫賦活能の指示値を示すグラフである。
【図３】（Ａ）〜（Ｄ）は、ＮＫ細胞活性測定によって求めた従来のエゾウコギおよび第１のエゾウコギの免疫賦活能の指示値を示すグラフである。
【図４】（Ａ）〜（Ｄ）は、ＮＫ細胞活性測定によって求めた従来のエゾウコギおよび第２のエゾウコギの免疫賦活能の指示値を示すグラフである。
【図５】（Ａ）〜（Ｄ）は、ＮＫ細胞活性測定によって求めた従来のエゾウコギおよび第３のエゾウコギの免疫賦活能の指示値を示すグラフである。
【図６】ＤＰＰＨラジカル消去活性測定法によって求めた各エゾウコギの抗酸化活性を示すグラフである。
【図７】Folin-Denis 法によって求めた各エゾウコギの総ポリフェノール含量を示すグラフである。
【図８】高速液体クロマトグラフィーによって得られた各エゾウコギのクロロゲン酸含量を示すグラフである。
【符号の説明】
【００４１】
１ カルス
【技術分野】
【０００１】
この発明は、薬用植物細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エゾウコギ（学名：Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｘ ｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓ）はシベリア、中国東北部、日本では北海道東部に分布するウコギ科の落葉灌木である。そして、このエゾウコギは、ａｃａｎｔｈｏｉｃ ａｃｉｄ，β−ｓｉｔｏｓｔｅｒｏｌ，ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｓｉｄｅ Ａ〜Ｇ等、抗疲労、抗ストレス、持久力向上などの効果を発揮する有用成分（生理活性物質）を含有する薬用植物として広く知られるようになり、医薬、健康食品等の分野で注目されている。
【０００３】
しかし、上記エゾウコギのような天然の薬用植物の有用成分の含有量は、産地や気候の違い及び流通における保管状態等により個体差が大きく、このことが薬用植物の品質の安定性に影響を及ぼし、特に薬用植物を用いた製品の開発時に問題となる。また、乱伐による天然の薬用植物の枯渇や生態系の破壊も憂慮されている。
【０００４】
ところで、特許文献１には、エゾウコギの幼植物体の大量生産が可能なエゾウコギ細胞培養方法が記載されている。この方法によれば、エゾウコギを培養生産することができるので、天然のエゾウコギの乱伐による被害が生じない。しかし、上記方法では、得られるエゾウコギの免疫賦活能などの効能の向上を図ることができず、その効能は天然（北海道産）のエゾウコギの効能と同等か若干下回る程度であった。このことは、上記方法により得られるエゾウコギ中に含有される有用成分（免疫賦活能を向上させる有用成分等）の量が、天然のエゾウコギ中に含有される有用成分の量と同等か若干下回っていることに起因すると考えられる。
【特許文献１】特開２０００−２２８９２４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明者らは、鋭意研究を行った結果、エゾウコギなどの薬用植物のカルスを再分化させて細胞を培養する際に、薬用植物細胞に所定の光を照射することにより、薬用植物中の有用成分が増加し、上記免疫賦活能や抗酸化活性などの効能が向上することを見出した。
【０００６】
この発明は上述の事柄に留意してなされたもので、その目的は、有用成分の含有量が多く、免疫賦活能や抗酸化活性などの効能が向上し、しかも品質の安定した薬用植物を培養生産することができる薬用植物細胞培養方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、この発明の薬用植物細胞培養方法は、カルスを再分化させる植物細胞培養方法であって、培養時に波長２５０〜７６０ｎｍで４０μｍｏｌ／ｍ2 ／ｓ以上の光を照射することを特徴としている（請求項１）。
【０００８】
具体的には、前記光を、４０〜１５０μｍｏｌ／ｍ2 ／ｓとすることが好ましい（請求項２）。
【発明の効果】
【０００９】
請求項１および２に係る発明では、有用成分の含有量が多く免疫賦活能や抗酸化活性などの効能が向上した薬用植物を培養することができる薬用植物培養方法が得られる。しかも、前記薬用植物細胞培養方法では、各薬用植物細胞をほぼ同一の条件下で培養することができるので、有用成分の含有量の個体差が小さく、従って、品質の安定した薬用植物を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、この発明の詳細を、図を参照しながら説明する。図１は、この発明の一実施の形態に係る薬用植物細胞培養方法（以下、培養方法という）を概略的に示す説明図である。
【００１１】
この実施例の培養方法では、エゾウコギのカルスを培養して不定胚（球状胚、心臓型胚、魚雷型胚）を誘導し、さらに成長させて幼植物体を得る。すなわち、前記培養方法は、まず、第１ステップとして、エゾウコギの体細胞や種子などから誘導し、インキュベータ（図示していない）で保存（培養）してあるカルス１をＭＳ液体培地（３％スクロースを含む）２で懸濁培養する。具体的には、三角フラスコなどの容器Ｈの中にＭＳ培地２とカルス１を入れて、バイオシェイカー（振とう培養器）で振とう培養する。
【００１２】
そして、この第１ステップを約１週間続行することにより、前記カルス１のほとんどは２００μｍ程度の大きさの球状胚に成長する。
【００１３】
続いて、第２ステップとして、第１ステップにおいてカルス１を培養して得られたエゾウコギ（前記球状胚になったものとなっていないものとの両方を含む。以下、１次培養体という）３を全て培養装置４に移し替えて更に培養する。ここで、この培養装置４は、エアリフト式通気培養槽５と、この通気培養槽５に近接して配置される光源６とを備えている。
【００１４】
詳しくは、通気培養槽５は、１次培養体３およびＭＳ液体培地（２％スクロースを含む）７を収容し、透明な樹脂またはガラスからなる水槽８と、この水槽８内にその下側から滅菌したエアを供給し続け、水槽８内を攪拌し続けるためのエア供給手段９とを備えている。そして、前記エア供給手段９は、前記水槽８内の下部に配置されるエア導出部１０と、このエア導出部１０に接続される流路１１と、この流路の上流側に設けられ、例えばエアポンプやコンプレッサなどからなるエア供給装置１２と、前記流路１１においてエア供給装置１２の下流側に設けられ、エア供給装置１２からのエア中の不純物や菌などを除去するためのフィルタ１３とを有している。
【００１５】
前記光源６は、水槽８に対して赤色光、青色光または白色光を近接照射（４０〜１５０μｍｏｌ／ｍ2 ／ｓ）するように構成されている。ここで、光源６は、水槽８内において培養中の１次培養体３全てに均一に光を照射するように、水槽８の上方、下方、側方および水槽８の内部など適宜の位置に配置されていることが好ましく、光源６の配置箇所は一箇所でも複数箇所でもよい。
【００１６】
そして、この第２ステップでは、光源６からの一定状態の光を水槽８内に照射することにより、水槽８内の１次培養体３に光ストレスを与え、かつ、エア供給手段９により水槽８内に滅菌したエアを供給し続ける状態で、２週間ごとにＭＳ培地７を交換するという条件の下、１次培養体３の通気培養を約１０〜１２週間続行する。この間、前記１次培養体３は、球状胚から心臓型胚・魚雷型胚（５００μｍ〜１ｍｍ程度の大きさ）の形態を経て、そのほとんどが幼植物体（２．８ｍｍ以上の大きさ）となる。
【００１７】
また、第２ステップでは、光源６から水槽８へ１６時間光を照射した後、光の照射を８時間停止するというサイクルを繰り返すようにしてある。このように明暗周期を設けることが１次培養体３の成長を促進させる点で効果的であると考えられるが、明暗周期を設けず、光ストレスを与え続けるようにしてもよい。
【００１８】
その後、第３ステップとして、第２ステップにおいて１次培養体３を培養して得られたエゾウコギ（以下、２次培養体という）１４をＭＳ培地７とともに網状体（２．８ｍｍメッシュ）１５で濾し、網状体１５を通過せずその上に残った２次培養体１４を幼植物体に成長したと判断し、取り出す。以上で、エゾウコギ細胞の培養が完了する。
【００１９】
なお、前記第３ステップにおいて、網状体１５で濾したときに網状体１５を通過し、まだ幼植物体にはなっていないと判断される２次培養体１４については、破棄する。もちろん、前記２次培養体１４を破棄する代わりに、再び第２ステップに戻すことも可能であり、この場合、前記２次培養体１４を第１ステップを経てきた１次培養体３とともに、水槽８内に収容すればよい。
【００２０】
また、上記第３ステップで幼植物体とみなして取り出した２次培養体１４は、例えば、乾燥させた後、粉末状に形成されたり、エキスが抽出されたりし、その後、生薬や健康食品として人体に取り込まれたり、免疫療法でリンパ球を活性化させることに用いられる。
【００２１】
上記培養方法によって得られるエゾウコギ（以下、本発明のエゾウコギという）は、天然（北海道産）のエゾウコギ（以下、天然のエゾウコギという）や特許文献１に記載された方法によって得られるエゾウコギ（以下、従来のエゾウコギという）に比べて、有用成分、特に免疫賦活能を向上させる有用成分の含有量が増加している。以下、このことを明らかにしたＮＫ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ）細胞活性測定（特願平９−３４２６７５）について説明する。
【００２２】
前記ＮＫ細胞活性測定は、以下の（１）〜（３）の手順に従って行われる。
（１）人の血液を採取し、血液からリンパ球（ＮＫ細胞）を分離する。
（２）分離したリンパ球を、乾燥させ粉末にしたエゾウコギが混入された培地で培養し、活性化させる。
（３）前記リンパ球（活性化リンパ球）とガン細胞とを一定比率で混合し、傷害されたガン細胞の割合を測定することによって、リンパ球のガン細胞に対する傷害活性を求める。
【００２３】
今回の測定では、１０名から採血し、従来のエゾウコギと、天然のエゾウコギと、本発明のエゾウコギとについてそれぞれＮＫ細胞活性測定を行った結果を平均した。ここで、本発明のエゾウコギとしては、前記第２ステップ、すなわち通気培養時における光源６の構成を３パターンに変えて３種用意した。すなわち、第１のエゾウコギは、前記第２ステップにおいて、赤色ＬＥＤを光源６として用い、波長が６６０ｎｍで５０μｍｏｌ／ｍ2 ／ｓの赤色単色光を水槽８内の１次培養体３に照射して得られたものである。また、第２のエゾウコギは、第２ステップにおいて、青色ＬＥＤを光源６として用い、波長が４７０ｎｍで１２０μｍｏｌ／ｍ2 ／ｓの青色単色光を水槽８内の１次培養体３に照射して得られたものである。さらに、第３のエゾウコギは、第２ステップにおいて、白色蛍光灯を光源６として用い、波長が２５０〜７６０ｎｍで７０〜１３０μｍｏｌ／ｍ2 ／ｓの白色光を水槽８内の１次培養体３に照射して得られたものである。
【００２４】
そして、図２〜図５に、上記ＮＫ細胞活性測定によって得られた従来のエゾウコギ、天然のエゾウコギおよび３種の本発明のエゾウコギの免疫賦活能について、従来のエゾウコギを基準にして示す。すなわち、図２〜図５の各図において、縦軸にはリンパ球のガン細胞に対する傷害活性（＝免疫賦活能）を、従来のエゾウコギを用いた場合を１．０として示している。また、図２〜図５の各図において、（Ａ）はガン細胞とリンパ球との比率が１：４０である場合、（Ｂ）はガン細胞とリンパ球との比率が１：２０である場合、（Ｃ）はガン細胞とリンパ球との比率が１：１０である場合、（Ｄ）はガン細胞とリンパ球との比率が１：５である場合をそれぞれ示している。
【００２５】
図２（Ａ）〜（Ｄ）には、従来のエゾウコギと天然のエゾウコギの免疫賦活能が示されており、これらの図から明らかなように、従来のエゾウコギの免疫賦活能は、天然のエゾウコギと比べて同等か若干それよりも下回っている。
【００２６】
図３（Ａ）〜（Ｄ）には、従来のエゾウコギと本発明の第１のエゾウコギの免疫賦活能が示されており、これらの図から明らかなように、第１のエゾウコギの免疫賦活能は、従来のエゾウコギをほぼ上回っており、特にガン細胞と活性化リンパ球との比率が１：２０のときには１．１３倍と高くなった。
【００２７】
図４（Ａ）〜（Ｄ）には、従来のエゾウコギと本発明の第２のエゾウコギの免疫賦活能が示されており、これらの図から明らかなように、第２のエゾウコギの免疫賦活能は、従来のエゾウコギを大きく上回っており、特にガン細胞と活性化リンパ球との比率が１：１０のときには１．３８倍と高くなった。
【００２８】
図５（Ａ）〜（Ｄ）には、従来のエゾウコギと本発明の第３のエゾウコギの免疫賦活能が示されており、これらの図から明らかなように、第３のエゾウコギの免疫賦活能は、従来のエゾウコギをかなり大きく上回っており、特にガン細胞と活性化リンパ球との比率が１：５のときには１．７５倍と高くなった。
【００２９】
以上、図３〜図５に示す結果から、本発明の培養方法によれば、天然のエゾウコギや従来のエゾウコギに比べて免疫賦活能がおよそ３０〜５０％高まったエゾウコギが得られ、また、エゾウコギの免疫賦活能と含有する有用成分（免疫賦活能を向上させる有用成分）とはほぼ比例すると考えられるので、本発明の培養方法によれば、有用成分の含有量が多いエゾウコギが得られることになる。しかも、本発明の培養方法では、各エゾウコギ細胞をほぼ同一の条件下で培養することができるので、有用成分の含有量の個体差が小さく、従って、品質の安定したエゾウコギを得ることができる。
【００３０】
上記のことから明らかなように、本発明はエゾウコギの免疫賦活能を高める培養方法を提供するものである。その上、本発明はエゾウコギの抗酸化活性を高める培養方法を提供するものでもあり、このことはＤＰＰＨ（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ）ラジカル消去活性測定法に基づく測定によって明らかとなった。
【００３１】
すなわち、前記ＤＰＰＨラジカル消去活性測定法は、試験管にＤＰＰＨ−エタノール溶液、試料抽出液を加え、１０分後に５１７ｎｍでの吸光度を測定し、ＤＰＰＨラジカルの退色を測定することで行われる。そして、北海道産のエゾウコギの幹から前記試料抽出液を採取して前記測定を行ったときの結果を図６の「北海道産幹」の欄に記載してある。また、本発明に則った光照射を行う培養方法によりエゾウコギ幼植物体を得て、このエゾウコギ幼植物体から前記試料抽出液を採取して前記測定を行ったときの結果を図６の「光照射」の欄に記載してある。さらに、光照射を行わず暗所で培養した以外の点は本発明に則った培養方法によりエゾウコギ幼植物体を得て、このエゾウコギ幼植物体から前記試料抽出液を採取して行ったときの結果を図６の「暗所」の欄に記載してある。
【００３２】
図６から明らかなように、本発明の方法に則りカルス誘導により培養したエゾウコギ幼植物体は、市販のエゾウコギ天然物と比べ高いラジカル消去活性（抗酸化活性）をもつことが判明し、特に光ストレスを与えたときに消去活性が増加することも実証された。これは、強い抗酸化活性を持つクロロゲン酸や１，５−ジカフェオイルキナ酸等のカフェオイルキナ酸類を主体とするポリフェノール類がエゾウコギ幼植物体に含有され、光照射下での培養（光ストレスの付与）により上記のようなポリフェノール類が増加するためであると考えられる。
【００３３】
そこで、各種のエゾウコギ中の総ポリフェノール含量およびクロロゲン酸含量を確認するために、Folin-Denis 法に基づく測定と、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた測定とを行った。すなわち、前記Folin-Denis 法は、試料抽出液に、蒸留水、１０％炭酸ナトリウム水溶液、Folin-Ciocaltus 試薬を加えて、暗所で１時間反応させ吸光度を測定することで行われる。そして、この測定により得られた各試料中の総ポリフェノール含量をクロロゲン酸に換算して求めた値を図７に示した。また、試料抽出液を上記ＨＰＬＣで分析して得られた試料１００ｇ当たりのクロロゲン酸含量を図８に示した。
【００３４】
ここで、図７および図８において、「北海道産幹」の欄には、北海道産のエゾウコギの幹から前記試料抽出液を採取して各測定を行ったときの結果が、また、「中国産根」の欄には、中国産のエゾウコギの根から前記試料抽出液を採取して各測定を行ったときの結果が記載されている。さらに、図７および図８において、「光照射」の欄には、本発明に則った光照射を行う培養方法によりエゾウコギ幼植物体を得て、このエゾウコギ幼植物体から前記試料抽出液を採取して各測定を行ったときの結果が記載され、「暗所」の欄には、光照射を行わず暗所で培養した以外の点は本発明に則った培養方法によりエゾウコギ幼植物体を得て、このエゾウコギ幼植物体から前記試料抽出液を採取して各測定を行ったときの結果が記載されている。
【００３５】
図７および図８から明らかなように、本発明の方法に則りカルス誘導により培養したエゾウコギ幼植物体は、市販のエゾウコギ天然物と比べ含有する総ポリフェノールおよびクロロゲン酸の量が多く、特に光ストレスを与えたときにそれぞれの含有量が増加することが判明した。
【００３６】
上記のように、本発明の培養方法で生産されるエゾウコギ幼植物体は、クロロゲン酸や１，５−ジカフェオイルキナ酸（共にカフェオイルキナ酸類の一つ）など強い抗酸化活性をもつポリフェノール類を多く含有することから、健康食品等の素材として非常に有用である。すなわち、ポリフェノール類の抗酸化活性は、体内の活性酸素の除去などに効果があることが知られており、また、老化抗酸化活性の高い食品には老化防止や生活習慣病に対する予防効果がある。
【００３７】
なお、この発明は上記の実施の形態に限られず、種々に変形して実施することができる。例えば、第１ステップにおけるカルス１の懸濁培養（振とう培養）時においても、第２ステップと同様に、前記光源６を用いて波長２５０〜７６０ｎｍで４０〜１５０μｍｏｌ／ｍ2 ／ｓの光を照射してもよい。
【００３８】
また、大量培養を行う場合には、第２ステップにおいて２週間毎に繰り返し行う液体培地７の交換の最後の交換時に、１次培養体３（このときの１次培養体３は１ｍｍ程度の魚雷型胚が殆どである）を液体培地７とともに容量が例えば５０Ｌ以上の大型培養タンク（図示していない）に移し替えればよい。前記大型培養タンクは、通気培養槽５とほぼ同一構成であり、サイズが大きくなっている点で異なる。大型培養タンクになると液体培地の交換が非常に困難になるため、最後の液体培地７の交換時（その後の培地交換が不要となる段階）に移し替えるようにしている。
【００３９】
さらに、上記実施の形態では、エゾウコギ細胞を培養対象としているが、エゾウコギの他、サンシュユ、オトギリソウ、ツキミソウ、ヌルデ、シナアブラギリ、センブリなどの薬用植物を培養対象としてもよく、培養方法も光照射が可能な他の（液体）培養方法（例えば、カルスから不定胚を誘導するのではなく不定芽や不定根を誘導する液体培養方法等）を用いてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】この発明の一実施の形態に係る薬用植物細胞培養方法を概略的に示す説明図である。
【図２】（Ａ）〜（Ｄ）は、ＮＫ細胞活性測定によって求めた従来のエゾウコギおよび天然のエゾウコギの免疫賦活能の指示値を示すグラフである。
【図３】（Ａ）〜（Ｄ）は、ＮＫ細胞活性測定によって求めた従来のエゾウコギおよび第１のエゾウコギの免疫賦活能の指示値を示すグラフである。
【図４】（Ａ）〜（Ｄ）は、ＮＫ細胞活性測定によって求めた従来のエゾウコギおよび第２のエゾウコギの免疫賦活能の指示値を示すグラフである。
【図５】（Ａ）〜（Ｄ）は、ＮＫ細胞活性測定によって求めた従来のエゾウコギおよび第３のエゾウコギの免疫賦活能の指示値を示すグラフである。
【図６】ＤＰＰＨラジカル消去活性測定法によって求めた各エゾウコギの抗酸化活性を示すグラフである。
【図７】Folin-Denis 法によって求めた各エゾウコギの総ポリフェノール含量を示すグラフである。
【図８】高速液体クロマトグラフィーによって得られた各エゾウコギのクロロゲン酸含量を示すグラフである。
【符号の説明】
【００４１】
１ カルス
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルスを再分化させる植物細胞培養方法であって、培養時に波長２５０〜７６０ｎｍで４０μｍｏｌ／ｍ2 ／ｓ以上の光を照射することを特徴とする薬用植物細胞培養方法。
【請求項２】
前記光が、４０〜１５０μｍｏｌ／ｍ2 ／ｓである請求項１に記載の薬用植物細胞培養方法。
【請求項１】
カルスを再分化させる植物細胞培養方法であって、培養時に波長２５０〜７６０ｎｍで４０μｍｏｌ／ｍ2 ／ｓ以上の光を照射することを特徴とする薬用植物細胞培養方法。
【請求項２】
前記光が、４０〜１５０μｍｏｌ／ｍ2 ／ｓである請求項１に記載の薬用植物細胞培養方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００６−２５７８６（Ｐ２００６−２５７８６Ａ）
【公開日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−８９９２７（Ｐ２００５−８９９２７）
【出願日】平成１７年３月２５日（２００５．３．２５）
【出願人】（０００２３１４３１）日本植生株式会社 (88)
【出願人】（３９９００４１８６）免疫分析研究センター株式会社 (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月２５日（２００５．３．２５）
【出願人】（０００２３１４３１）日本植生株式会社 (88)
【出願人】（３９９００４１８６）免疫分析研究センター株式会社 (3)
【Ｆターム（参考）】
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