藻類由来のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２遺伝子およびそれによってコードされるタンパク質
本開示は、藻類由来のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２（ＤＧＡＴ２）およびＤＧＡＴ２をコードする遺伝子の単離、精製、および特徴づけに関する。ＤＧＡＴ２は、ＤＧＡＴ１よりも効率的にトリアシルグリセロール内に超長鎖多価不飽和脂肪酸を取り込むことができる。本開示は、ＤＧＡＴ２遺伝子を用いることによって種子の油含有量、脂肪酸合成、および脂肪酸組成を調節する方法、ならびに前記遺伝子で形質転換した組織および植物に関する。本開示はまた、本開示の導入するＤＮＡ配列を含むゲノムを有する遺伝子導入植物、植物組織、および植物の種子、ならびに前記植物および植物の種子を産生する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本願は、「藻類由来のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２遺伝子およびそれによってコードされるタンパク質」について２００７年１２月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／００８，７５２号の出願日の利益を主張する。
【０００２】
技術分野
本開示は、概してバイオテクノロジー、とりわけ植物特性の遺伝子操作に有用な遺伝子に関する。特定の実施形態において、本開示は、単離および／または精製したポリペプチド、およびジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２（ＤＧＡＴ２）をコードする核酸、ならびにそれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
油料種子作物は重要な農産物である。植物の種子油は、人の食物に必須の多価不飽和脂肪酸の主要な供給源であり、かつ化学工業にとっての再生可能な原料である。発達中の種子の色素体中にある脂肪酸合成酵素複合体という酵素は、細胞質のアシルＣｏＡプールに導かれる脂肪酸の生合成に関与して、トリアシルグリセロール蓄積を維持する。トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の生合成は、一次基質としてのグリセロール−３−リン酸および脂肪酸アシルＣｏＡとともに小胞体に位置する。植物の貯蔵脂質の生体集合には、３つのアシル基転移酵素、すなわちグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ、ＥＣ２．３．１．１５）、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＴ、ＥＣ２．３．１．５１）、およびジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ、ＥＣ２．３．１．２０）がある。これら３つのアシルトランスフェラーゼは、ケネディ経路として一般的に知られる生化学過程である、ＴＡＧの形成へのＤＧＡＴによるｓｎ−１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）のアシル化という最終工程でグリセロール骨格の段階的なアシル化を触媒する。ＴＡＧを生成するためのＤＧＡＴが介在するグリセロール骨格のアシル化は、植物の脂質蓄積における律速段階と提唱されている。従って、ＤＧＡＴは植物脂質生合成の遺伝子改変における標的である。
【発明の概要】
【０００４】
発明の開示
本発明者らは、Ｔ．シュードナナ（Ｔ．ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２（ＤＧＡＴ）と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドの属を本明細書において開示する。これらのポリペプチドを用いて、植物における多価不飽和脂肪酸の量を変えることができる。また、タラシオシラ・シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）のＤＧＡＴ２のジアシルグリセロールトランスフェラーゼ触媒ドメインを含むポリペプチド、およびＤＧＡＴ２のジアシルグリセロールトランスフェラーゼ触媒ドメインと少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドも開示する。さらに、Ｔ．シュードナナのＤＧＡＴ２と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、およびＴ．シュードナナのＤＧＡＴ２のジアシルグリセロールトランスフェラーゼドメインと少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを記載する。
【０００５】
本明細書において、本発明者らはＴ．シュードナナ由来の単離および精製したジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２（ＤＧＡＴ）遺伝子およびｃＤＮＡ配列を開示する。また、Ｔ．シュードナナ由来の全長ＤＧＡＴ２ ｃＤＮＡ配列、および前記ＤＧＡＴ２ ｃＤＮＡと少なくとも８０％の配列同一性を有するｃＤＮＡ配列も開示する。一部の実施形態においては、これらのｃＤＮＡ配列はベクター内に含まれていてもよい。商業用植物油の産出量を増加させるため、またはそれらの組成を改変して植物および植物生成物の特定の商業的改良を達成するために、これらのポリヌクレオチドを用いて植物におけるトリアシルグリセロールの天然形成を改変することができる。
【０００６】
Ｔ．シュードナナ、ならびにクラミドモナス・ラインハーディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、オストレオコッカス・ルシマリヌス（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｃｉｍａｒｉｎｕｓ）、オストレオコッカス・タウリ（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ ｔａｕｒｉ）、およびファエオダクチルム・トリコルヌツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）を含む藻類の別の種由来のＤＧＡＴ２ファミリーの別の単離および精製した遺伝子、ならびにｃＤＮＡ配列も開示する。また、商業用植物油の産出量を増加させるため、またはそれらの組成を改変して植物および植物生成物の特定の商業的改良を達成するために、これらのポリヌクレオチドを用いて植物におけるトリアシルグリセロールの天然形成を改変することができる。
【０００７】
核酸構築物を含む遺伝子導入植物も開示する。細胞または植物を形質転換する方法であって、細胞または植物の中に単離した、精製した、または組換えの核酸を導入することを含む方法を記載する。遺伝子的に形質転換された植物の種子を産生するプロセスには、植物の種子の中に核酸を導入することが含まれる。一部の実施形態において、これらの方法は、植物の種子油含有量を変化させるために、植物を改変するのに用いることができる。
【０００８】
最も一般的に述べると、一部の例は、藻類由来のＤＧＡＴ２遺伝子の単離、精製、および特徴づけ、ならびに超長鎖多価不飽和脂肪酸の生成におけるＤＧＡＴ２の有用性を開示する。前述のことは、添付した図面に関連して進む、以下のいくつかの実施形態の詳細な説明からより明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】図１Ａは、Ｔ．シュードナナＤＧＡＴ２の全長ＤＧＡＴ２ ｃＤＮＡ配列（配列番号：２）に相当する推定アミノ酸配列（配列番号：１）を表す。
【図１Ｂ】図１Ａの続き。
【図２Ａ】図２Ａは、配列番号：１（ＴｐＤＧＡ２）とすべて２型ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼであるｇｉ：３７１８２１８７、ｇｉ：５０５４１６８９、ｇｉ：７４６２３３５８、ｇｉ：７４６２３３５９、ｇｉ：８６２７９６３８、およびｇｉ：６２８２５８１３との間の配列アラインメントを表す。前記配列のうち、４以上に共通するアミノ酸を太字で示す。これら２型ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼのジアシルグリセロールトランスフェラーゼ触媒ドメインを含むアミノ酸配列は、２３６−３６５（ＴｐＤＧＡ２）；７９−２０８（ｇｉ：３７１８２１８７）；７６−２０５（ｇｉ：５０５４１６８９）；７６−２０５（ｇｉ：７４６２３３５８）；３４−１６５（ｇｉ：７４６２３３５９）；３３−１６５（ｇｉ：８６２７９６３８）；３６−１６５（ｇｉ：６２８２５８１３）残基からなる。
【図２Ｂ】図２Ａの続き。
【図３】図３Ａは、配列番号：１に相同なポリペプチド配列の一例（配列番号：３）を表す。図３Ｂは、配列番号：２に少なくとも９０％相同であって、配列番号：３のポリペプチドの一部をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号：４）の一部を表す。
【図４】図４Ａは、配列番号：１に相同なポリペプチド配列の別の例（配列番号：５）を表す。図４Ｂは、配列番号：２に少なくとも９０％相同であって、配列番号：５のポリペプチドの一部をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号：６）の一部を表す。
【図５】図５Ａは、配列番号：１に相同なポリペプチド配列の別の例（配列番号：７）を表す。図５Ｂは、配列番号：２に少なくとも９０％相同であって、配列番号：７のポリペプチドの一部をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号：８）の一部を表す。
【図６】図６Ａは、配列番号：１に相同なポリペプチド配列の別の例（配列番号：９）を表す。図６Ｂは、配列番号：２に少なくとも９０％相同であって、配列番号：９のポリペプチドの一部をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号：１０）の一部を表す。
【図７】図７Ａは、配列番号：１に相同なポリペプチド配列の別の例（配列番号：１１）を表す。図７Ｂは、配列番号：２に少なくとも９０％相同であって、配列番号：１１のポリペプチドの一部をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号：１２）の一部を表す。
【図８】図８Ａは、配列番号：１に相同なポリペプチド配列の別の例（配列番号：１３）を表す。図８Ｂは、配列番号：２に少なくとも９０％相同であって、配列番号：１３のポリペプチドの一部をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号：１４）の一部を表す。
【図９】図９は、酵母変異体Ｈ１２４６ＭＡＴ−α（ＤＧＡＴ、ＰＤＡＴ−、ＡＳＡＴ１−、ＡＳＡＴ２−、ＴＡＧ形成を欠失している）でＴｐＤＧＡＴ２およびＡｔＤＧＡＴ１を発現させることによって生成されたＴＡＧの薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析を表す。レーン１はＡｔＤＧＡＴ１の発現を示し、レーン２〜６は、ＴｐＤＧＡＴ２の発現を示す。レーン２〜６ではクリアなＴＡＧ（トリアシルグリセロール）のバンドが観察された。レーン８は空ベクター（ｐＹＥＳ２．１）コントロールを示し、このレーンにはＴＡＧ（トリアシルグリセロール）のバンドは存在しない。レーン８の右側のレーンには、ＴＡＧマーカーとして用いることができるＴＡＧ標準物質をロードした。
【図１０】図１０は、空プラスミド（ｐＹＥＳ２．１コントロール；空のバー）、Ｔ．シュードナナＤＧＡＴ２ ｃＤＮＡ（ｐＹＥＳ：ＤＧＡＴ；点状のバー）、およびシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＤＧＡＴｃＤＮＡ（黒無地のバー）で形質転換された酵母変異体Ｈ１２４６ＭＡＴ−αにおけるＤＧＡＴ活性を示す。誘導した酵母細胞の溶解物から調製したミクロゾーム膜画分を、アシル基供与体としての種々の１４Ｃ標識されたアシルＣｏＡ、および受容体としての標識されていないｓｎ−１，２ジオレインを用いてＤＧＡＴ活性についてアッセイした。本明細書において相対的ＤＧＡＴ活性をＤＰＭ（ＴＡＧ内に取り込まれた１４Ｃ標識された基質の量）として表した。当該結果は、ＴｐＤＧＡＴ２およびＡｔＤＧＡＴ１の基質選択性および相対的活性を示す。
【図１１】図１１は、ＴｐＤＧＡＴ２のアミノ酸配列（ＴｐＤＧＡＴ２−１）とＴ．シュードナナ由来または他の藻類種（Ｃｒ：クラミドモナス・ラインハーディ、Ｏｌ：オストレオコッカス・ルシマリヌス、Ｏｔ：オストレオコッカス・タウリ、Ｐｔ：ファエオダクチルム・トリコルヌツム）由来のそのファミリーメンバーとのホモロジー比較を表す。ＴｐＤＧＡＴ２（ＴｐＤＧＡＴ２−１）は、そのファミリーメンバーであるＴｐＤＧＡＴ２−２、ＴｐＤＧＡＴ２−３、およびＴｐＤＧＡＴ２−４とそれぞれ２４％、２５％、および１７％の配列同一性を共有している。種々の藻類種の中で、ＴｐＤＧＡＴ２（ＴｐＤＧＡＴ２−１）は、ＰｔＤＧＡＴ２−１と高い配列類似性（４８％の配列同一性）を、ＣｒＤＧＡＴ２−１、ＣｒＤＧＡＴ２−２、およびＣｒＤＧＡＴ２−４と比較的高い類似性（それぞれ２０％、２３％、および２４％）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
Ｉ．いくつかの実施形態の概説
本明細書において、Ｔ．シュードナナの単離および精製した２型ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ２）を開示する。他の生物および他の生物由来の細胞の中で超長鎖多価不飽和脂肪酸（ＶＬＣＰＵＦＡ）の合成を改変するこのポリペプチドの驚くべき能力を用いて、所望の脂肪酸組成を有する遺伝子導入植物および植物の種子を産生するために、植物および植物の種子を形質転換する。この開示には、Ｔ．シュードナナＤＧＡＴ２のものと少なくとも９０％の配列同一性のアミノ酸配列を有するＤＧＡＴ２活性を示すポリペプチドが含まれる。特定の実施形態において、これらのポリペプチド配列は、例えば配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、または配列番号１３を含む。また、Ｔ．シュードナナＤＧＡＴ２のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ触媒ドメインと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチドを開示する。特定の実施形態において、これらのポリペプチド配列は、例えば配列番号１５、配列番号：１７、または配列番号：１９を含む。図２にはＴ．シュードナナＤＧＡＴ２のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ触媒ドメインが表されており、それはＴ．シュードナナＤＧＡＴ２の完全な開示されているポリペプチド配列におけるアミノ酸残基２３６〜３６５からなる。
【００１１】
配列番号：１５のポリペプチドは、Ｔ．シュードナナＤＧＡＴ２のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼドメインを含む。一部の実施形態は、配列番号：１５の単離または精製したポリペプチドと少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、または９９．７％の配列同一性を有する配列、例えば配列番号：１を含む単離または精製したポリペプチドに関する。特定の実施形態において、これらのポリペプチドはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する。ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性は、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏの酵素アッセイにより当業者によって容易に測定できる。この方法は実施例４において詳細に記載されており、このアッセイの代表的な結果は図１０に示されている。当業者によって理解されるように、当該開示はまた、配列番号：１５に９０％以上の同一性の推定アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする植物および藻類由来の実質的に相同なＤＮＡ配列にも関する。
【００１２】
ＤＧＡＴ２ファミリーのメンバーである藻類由来の単離または精製した他のポリペプチドは、例えば配列番号：２５（ＴｐＤＧＡＴ２−２）、配列番号：２７（ＴｐＤＧＡＴ２−３）、配列番号：２９（ＴｐＤＧＡＴ２−４）、配列番号：３１（ＣｒＤＧＡＴ２−１）、配列番号：３３（ＣｒＤＧＡＴ２−２）、配列番号：３５（ＣｒＤＧＡＴ２−３）、配列番号：３７（ＣｒＤＧＡＴ２−４）、配列番号：３９（ＣｒＤＧＡＴ２−５）、配列番号：４１（ＯｌＤＧＡＴ２−１）、配列番号：４３（ＯｌＤＧＡＴ２−２）、配列番号：４５（ＯｌＤＧＡＴ２−３）、配列番号：４７（ＯｌＤＧＡＴ２−４）、配列番号：４９（ＯｔＤＧＡＴ２−１）、配列番号：５１（ＯｔＤＧＡＴ２−２）、配列番号：５３（ＯｔＤＧＡＴ２−３）、配列番号：５５（ＯｔＤＧＡＴ２−４）、配列番号：５７（ＰｔＤＧＡＴ２−１）、配列番号：５９（ＰｔＤＧＡＴ２−２）、配列番号：６１（ＰｔＤＧＡＴ２−３）、または配列番号：６３（ＰｔＤＧＡＴ２−４）と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１３】
一部の実施形態は、前述したポリペプチドをコードする単離または精製した核酸（ポリヌクレオチド）に関する。これらポリヌクレオチドの配列は、例えば配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２６（ＴｐＤＧＡＴ２−２）、配列番号：２８（ＴｐＤＧＡＴ２−３）、配列番号：３０（ＴｐＤＧＡＴ２−４）、配列番号：３２（ＣｒＤＧＡＴ２−１）、配列番号：３４（ＣｒＤＧＡＴ２−２）、配列番号：３６（ＣｒＤＧＡＴ２−３）、配列番号：３８（ＣｒＤＧＡＴ２−４）、配列番号：４０（ＣｒＤＧＡＴ２−５）、配列番号：４２（ＯｌＤＧＡＴ２−１）、配列番号：４４（ＯｌＤＧＡＴ２−２）、配列番号：４６（ＯｌＤＧＡＴ２−３）、配列番号：４８（ＯｌＤＧＡＴ２−４）、配列番号：５０（ＯｔＤＧＡＴ２−１）、配列番号：５２（ＯｔＤＧＡＴ２−２）、配列番号：５４（ＯｔＤＧＡＴ２−３）、配列番号：５６（ＯｔＤＧＡＴ２−４）、配列番号：５８（ＰｔＤＧＡＴ２−１）、配列番号：６０（ＰｔＤＧＡＴ２−２）、配列番号：６２（ＰｔＤＧＡＴ２−３）、または配列番号：６４（ＰｔＤＧＡＴ２−４）を含んでもよい。一部の実施形態において、前記ポリヌクレオチド配列は、開示されているポリペプチドをコードする開示されているヌクレオチド配列の塩基と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、または９９．７％のパーセンテージ同一性を有する。そのようなポリヌクレオチドのいくつかの例が、配列番号：２１〜２４である。技術を有する実践者によって理解されるように、核酸配列のわずかな変化は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列を必ずしも変化させない。コードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させる特定の遺伝子配列におけるヌクレオチドの同一性の変化は、当該遺伝子の有効性の低下または増大をもたらし得ること、ならびに一部の応用（すなわち、アンチセンス、共抑制、またはＲＮＡｉ）において、部分的配列はしばしば全長型と同じ程度に効果的に作用することは当業者によって理解されるであろう。遺伝子配列を変更または短くし得る方法は当業者に周知であり、当該改変遺伝子の有効性を調べる方法も同様である。特定の実施形態において、有効性は例えば従来のガスクロマトグラフィーによって容易に調べることができる。従って、当該遺伝子のそのようなすべての変化が本明細書の一部として含まれる。
【００１４】
一部の実施形態は、配列番号：２と少なくとも８０％の相同性を有する単離または精製したポリヌクレオチド、例えば配列番号：２、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２１〜２４を含むベクターに関する。従って、例えば配列番号：２、例えば配列番号：２、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：２０、または配列番号：２１〜２４、あるいはその一部からなる群から選択される配列を含むベクターを調製するための方法、植物細胞内へのアンチセンス方向に当該配列または部分的配列、あるいはその相補鎖を導入するための方法を提供する。
【００１５】
特定の実施形態は、藻類におけるＤＧＡＴ２ファミリーのメンバーと少なくとも８０％の相同性を有するポリヌクレオチドを含むベクターに関する。これらのベクターは、例えば配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６２、または配列番号：６４のポリヌクレオチド配列を含んでもよい。
【００１６】
一部の実施形態において、ＤＧＡＴ２活性を備えるポリペプチドを生成する遺伝子導入植物を作り出すために、前記単離および精製したポリヌクレオチド、ならびにこれらの単離および精製したポリヌクレオチドを含むベクターを用いてもよい。従って、一実施形態は、配列番号：２と少なくとも８０％の相同性を有する単離または精製したポリヌクレオチド、例えば配列番号：２、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：２０、または配列番号：２１〜２４の配列を有するデオキシリボ核酸分子を含む遺伝子導入植物および植物の種子に関する。他の実施形態は、藻類におけるＤＧＡＴ２ファミリーの別のメンバーと少なくとも８０％の相同性を有する単離または精製したポリヌクレオチド、例えば配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６２、または配列番号：６４の配列を有するデオキシリボ核酸分子を含む遺伝子導入植物および植物の種子に関する。これら実施形態の植物は、当該核酸構築物を欠いている植物における量と比較して、種子中の多価不飽和脂肪酸の量が変化していてもよい。前記植物における脂肪酸は、約７０％以上の多価不飽和脂肪酸であってよい。
【００１７】
一実施形態は、そのような植物および植物の種子を産生する方法を含む。前記方法は、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド、または藻類におけるＤＧＡＴ２ファミリーのポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；例えば配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４１、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：６１、または配列番号：６３を含む核酸構築物を作り出すこと、ならびに植物内に当該構築物を導入することを含む。この実施形態の方法は、当業者に公知の任意の方法、非制限的な例であるアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を介して行われる形質転換の方法によって達成され得る。特定の実施形態において、前記方法は、Ｂｒｕｓｉｃａピルビン酸脱水素酵素キナーゼ活性を備えるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ジアシルグリセロールアセチルトランスフェラーゼ活性を備えるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／またはグリセロール−３−リン酸脱水素酵素活性を備えるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、当該植物内に導入することをさらに含む。この方法は、前記植物がシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、ボリジ（Ｂｏｒａｇｏ）種、カノーラ（Ｃａｎｏｌａ）、リキヌス（Ｒｉｃｉｎｕｓ）種、テオブロマ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）種、トウモロコシ（Ｚｅａ）種、ゴシッピウム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）種、ハマナ（Ｃｒａｍｂｅ）種、クフェア（Ｃｕｐｈｅａ）種、アマ（Ｌｉｎｕｍ）種、レスクェレラ（Ｌｅｓｑｕｅｒｅｌｌａ）種、リムナンテス（Ｌｉｍｎａｎｔｈｅｓ）種、リノーラ（Ｌｉｎｏｌａ）、ノウゼンハレン（Ｔｒｏｐａｅｏｌｕｍ）種、マツヨイグサ（Ｏｅｎｏｔｈｅｒａ）種、オリーブ（Ｏｌｅａ）種、アブラヤシ（Ｅｌａｅｉｓ）種、ラッカセイ（Ａｒａｃｈｉｓ）種、ナタネ（ｒａｐｅｓｅｅｄ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ）種、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ）種、ソヤ（Ｓｏｊａ）種、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）種、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）種、ベルノニア（Ｖｅｒｎｏｎｉａ）種、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）種、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ）種、オリザ（Ｏｒｙｚａ）種、カラスムギ（Ａｖｅｎａ）種、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ）種、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ）種、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）、およびイネ科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）植物ファミリーの他のメンバーからなる群から選択されるところで実施してもよい。
【００１８】
一部の実施形態において、前記方法は、導入した核酸構築物を含む植物から種子を収穫すること、および前記収穫した種子から油を抽出することをさらに含む。従って、他の実施形態は、当該方法によって産生した植物、および当該方法によって産生した植物から抽出した油を含む。
【００１９】
ＤＧＡＴ２遺伝子またはその一部を用いることによって可能である操作および成果物のいくつかは、以下の、油含有量が増加または減少した種子、超長鎖多価不飽和脂肪酸含有量が増大した油を含む種子、および超長鎖多価不飽和脂肪酸を蓄積する増大または変化した能力を示す植物を含むが、これに制限されない。
【００２０】
ＩＩ．略語
ＣａＭＶ カリフラワーモザイクウイルス
ｃＤＮＡ 相補的ＤＮＡ
ＣＥＲＶ カーネーションエッチドリングウイルス
ＣｒＤＧＡＴ２ クラミドモナス・ラインハーディ２型ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ
ＤＡＧ ｓｎ−１，２−ジアシルグリセロール
ＤＧＡＴ ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ
ＤＧＡＴ２ ２型ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ
ＤＨＡ ドコサヘキサエン酸
ＤＮＡ デオキシリボ核酸
ＥＰＡ エイコサペンタエン酸
ＧＰＡＴ グリセロール３リン酸アシルトランスフェラーゼ
ＬＰＡＴ リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ
ＯｌＤＧＡＴ２ オストレオコッカス・ルシマリヌス２型ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ
ＯｔＤＧＡＴ２ オストレオコッカス・タウリ２型ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＰｔＤＧＡＴ２ ファエオダクチルム・トリコルヌツ２型ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ
ＲＮＡ リボ核酸
ＲＮＡｉ ＲＮＡ干渉
ＲＴ−ＰＣＲ 逆転写ＰＣＲ
Ｔ３５Ｓ ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター
ＴＡＧ トリアシルグリセロール
ＴＬＣ 薄層クロマトグラフィー
Ｔｍａｓ マンノピン合成ターミネーター
Ｔｎｏｓ ノパリン合成ターミネーター
ＴｐＤＧＡＴ２ Ｔ．シュードナナ２型ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ
ＴｒｂｃＳ リブロース２リン酸カルボキシラーゼ小サブユニット終結領域
ＶＬＣＰＵＦＡ 超長鎖多価不飽和脂肪酸
【００２１】
ＩＩＩ．用語
本開示の種々の実施形態の概説を容易にするために、以下の特定の用語の説明を提供する。
【００２２】
相補的ヌクレオチド配列：配列の「相補的ヌクレオチド配列」とは、そのヌクレオチドが本開示の配列のものと相補的であり、その方向が反転している（逆平行配列である）任意のＤＮＡを意味すると理解される。
【００２３】
配列ホモロジーの程度またはパーセンテージ：「配列ホモロジーの程度またはパーセンテージ」という用語は、最適アラインメント後の２つの配列間の配列同一性の程度またはパーセンテージを表す。配列同一性のパーセンテージ（あるいは程度または同一性）は、比較ウィンドウ上で２つの最適に整列された配列を比較することによって決定されるものであって、前記２つの配列の最適アラインメントについて、比較ウィンドウにおけるペプチドまたはポリヌクレオチド配列の一部は、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。前記パーセンテージは、両配列において一致するアミノ酸残基または核酸塩基が生じている位置の数を測定してマッチした位置の数を出し、マッチした位置の数を比較ウィンドウにおける位置の総数で割り、かつ当該結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを出すことによって算出される。
【００２４】
単離および／または精製した相同配列：「単離および／または精製した相同配列」とは、ヌクレオチド配列の塩基またはポリペプチド配列のアミノ酸と、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、または９９．７％のパーセンテージ同一性を有する単離および／または精製した配列を意味すると理解される。このパーセンテージは完全に統計的なものであり、無作為とそれらの長さ全体にわたる２つのヌクレオチド配列との間で差をもたらす可能性がある。例えば、シングル配列アライメントおよびマルチプル配列アライメントを行うように設計されたコンピュータープログラムによって、配列同一性を測定することができる。当業者によって理解されるように、この開示はコドン使用の縮重を包含すると理解されるであろう。さらに、ポリペプチドのアミノ酸配列において、前記ポリペプチドの構造または作用を崩壊させることなく保存的置換が行われてもよいと当業者によって理解されるであろう。保存的置換は、お互いに対して類似した疎水性、極性、およびＲ鎖長を有するアミノ酸を置換することによって、熟練した技術者によって達成される。また、異なる種由来の相同タンパク質の整列した配列を比較することによって、コードされたタンパク質の基本的作用を変えることなく種間で変異しているアミノ酸残基を位置づけることによって、保存的置換を特定してもよい。
【００２５】
単離した：当業者によって理解されるように、「単離した」とは、それらの天然環境から「単離」されているポリペプチドを表す。
【００２６】
ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または核酸配列：「ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または核酸配列」とは、単量体および二量体の（いわゆる、並行した）形態の２本鎖または１本鎖のＤＮＡ、ならびに前記ＤＮＡの転写産物の両方を意味すると理解されるであろう。
【００２７】
配列同一性：２つのアミノ酸またはヌクレオチドの配列におけるアミノ酸またはヌクレオチドの残基の配列が、以下に記載するように最大の一致を目的として整列させた時に同じである場合、前記２つの配列は「同一」であると言われる。２つ（またはそれより多く）のペプチドまたはポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的に、配列類似性について局所領域を同定および比較するために、断片または「比較ウィンドウ」にわたって最適に整列された２つの配列の配列を比較することによって行われる。比較のための配列の最適な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所的ホモロジーアルゴリズム：Ａｄ．Ａｐｐ．Ｍａｔｈ ２：４８２（１９８１）によって、ＮｅｄｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのホモロジーアラインメントアルゴリズム：Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）によって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似法の探索、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：２４４４（１９８８）によって、これらアルゴリズムのコンピュータによる実施（ウィスコンシン・ジェネティクス・ソフトウェアパッケージのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ，ジェネティクス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ：ＧＣＧ），５７５サイエンスＤｒ．，マディソン，ウィスコンシン州）によって、または目視検査によって行われてよい。
【００２８】
前記で付された配列同一性の定義は、当業者によって用いられるであろう定義である。定義それ自体はいかなるアルゴリズムの支援も必要とせず、前記アルゴリズムは、配列同一性の算出よりもむしろ、配列の最適アラインメントを達成するために唯一有用である。
【００２９】
前記で付された定義から、要するに、２つの比較される配列間の配列同一性について、明確かつ唯一の数値であって、最高または最適なアラインメントに対して得られる数値に相当する数値が存在するということになる。
【００３０】
ｈｔｔｐ：／／ｗｏｒｌｄｗｉｓｅｗｅｂ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂｌ２．ｈｔｍｌのウェブサイトで入手可能であり、２つの配列間の同一性を比較および決定するために、本発明者らおよび一般的に当業者によって習慣的に用いられるソフトウェアであるＢＬＡＳＴ ＮまたはＢＬＡＳＴ Ｐ「ＢＬＡＳＴ２配列」において、比較される配列の長さに依存するギャップコストは、前記ソフトウェアによって直接選択される（すなわち、＞８５の長さに対する置換行列ＢＬＯＳＵＭ−６２には１１．２）。
【００３１】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション：ヌクレオチド配列に関するストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションとは、相補的ＤＮＡの２つのフラグメント間でのハイブリダイゼーションを保持させ得るように選択された温度およびイオン強度の条件下でのハイブリダイゼーションを意味すると理解される。他の生物、例えば植物から得られる本明細書において記載されるＤＧＡＴ２遺伝子のホモログは、前記ホモログを含む適切なライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができ、前記スクリーニングは、本明細書において開示される特定のＤＧＡＴ２遺伝子のヌクレオチド配列、またはその一部もしくはプローブに関して行われるものであり、あるいはＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の配列アラインメント検索プログラムを用いた配列ホモロジー検索によって同定することができる。
【００３２】
ＩＩＩ．藻類由来のＤＧＡＴ２による脂肪酸量の改変
Ａ．概説
アブラギリおよびトウゴマ由来のＤＧＡＴ２に関する最近の研究は、独特な脂肪酸を含む植物において、ＤＧＡＴ２は独特な脂肪酸を種子貯蔵油に導くのに重要な役割を担っている可能性があることを示唆している。脂肪種子における植物脂質生合成の遺伝子改変において、ＤＧＡＴ２は潜在的標的になり得ると同時に、最近特徴づけされた前記酵素は、共役脂肪酸であるエレオステアリン酸（アブラギリＤＧＡＴ２）およびリシノール酸（トウゴマＤＧＡＴ２）の利用にそれぞれ貢献している。どちらの酵素（アブラギリＤＧＡＴ２またはトウゴマＤＧＡＴ２）も、商業的に所望される長鎖オメガ−３多価不飽和脂肪酸であるエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）内への取り込みに関与していない。
【００３３】
海の中心的な珪藻類であるＴ．シュードナナは、ＴＡＧ内に長鎖オメガ−３多価不飽和脂肪酸であるＥＰＡおよびＤＨＡを生成および蓄積することができ、高レベルの超長鎖多価不飽和脂肪酸（ＶＬＣＰＵＦＡ）が蓄積した油の良好な供給源である。そのため、Ｔ．シュードナナのジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２（ＴｐＤＧＡＴ２）遺伝子は、調査および特徴づけされた。驚くべきことに、アブラギリまたはトウゴマ由来のＤＧＡＴ２とは異なり、ＴｐＤＧＡＴ２はＴＡＧ内に超長鎖多価不飽和脂肪酸を効率的に取り込むことができることが発見された。ＴｐＤＧＡＴ２遺伝子を用いてＴ．シュードナナおよび関連する藻類の種由来のポリヌクレオチド配列を調べることによって、藻類におけるＤＧＡＴ２ファミリーの他のメンバーが同定された。従って、藻類ＤＧＡＴ２遺伝子は、遺伝子組換えツールにおいてならびに種子内のＴＡＧの組成および蓄積の改変に対して有用であると判断された。
【００３４】
Ｂ．２型ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ活性を備えるＴ．シュードナナＤＧＡＴ２に相同なポリペプチド
ＮＣＢＩタンパク質データベース等のタンパク質データベースをＢＬＡＳＴ等の検索エンジンを用いて検索することによって、全長Ｔ．シュードナナＤＧＡＴ２に相同であるタンパク質を発見することができる。それらは合理的設計によって同定されてもよい。合理的設計の方法は、所望のポリペプチド配列の長さの範囲内で保存的アミノ酸置換を同定すること、および当該コードされるタンパク質においてそれらの置換を引き起こすことを含む。
【００３５】
Ｔ．シュードナナＤＧＡＴ２の全長アミノ酸配列に関してＮＣＢＩタンパク質データベース（ＢＬＡＳＴＰ）を検索すると、ＴｐＤＧＡＴ２に有意な配列ホモロジーを有するポリペプチドが明らかとなり、そのいくつかはＴｐＤＧＡＴ２とともに整列して図２に示されている。保存されている２型ジアシルグリセロールトランスフェラーゼドメインは図２に整列されており、ＴｐＤＧＡＴ２におけるアミノ酸残基２３６〜３６５と示されている他のＤＧＡＴ２ポリペプチド由来の相当する残基とからなる。前記保存されている２型ジアシルグリセロールトランスフェラーゼドメインは、ＮＣＢＩの保存されているドメインのデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｃｄｄ／ｃｄｄ．ｓｈｔｍｌ）内に記載されている。この保存されているドメインに相同であるポリペプチド配列は、それが含まれるタンパク質にＴｐＤＧＡＴ２の２型ジアシルグリセロール活性を付与する。
【００３６】
相同配列を有するポリペプチドは、それらのホモログと同じ構造及び作用を示すように設計され得ると当業者によって理解される。熟練した技術者によって、図２の配列アラインメントにより本開示の実施例に具体的に記載されているものと相同なポリペプチドを設計することが可能である。そのような相同なポリペプチドは、本開示のポリペプチドへの保存的置換を含むもの、例えば配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、または配列番号：１９のポリペプチドであってよい。相同タンパク質がＴｐＤＧＡＴ２と同様の２型ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ活性を実質的に示すかどうかを判定する簡易な実験アッセイは当業者に公知である。そのようなアッセイは、過度に時間のかかるものでなく、高価でなく、または技術的に難しいものでない。ＴｐＤＧＡＴ２によって生成されたＴＡＧを検出するために、例えば従来のガスクロマトグラフィーを用いてもよい。これらのアッセイのいくつかは、以下の詳細な実施例に記載されている。
【００３７】
Ｃ．形質転換するためのＤＧＡＴ２活性を有する核酸分子の使用
開示されている実施形態は、天然環境で採取されたゲノム、すなわち、Ｔ．シュードナナ、クラミドモナス・ラインハーディ、オストレオコッカス・ルシマリヌス、オストレオコッカス・タウリ、またはファエオダクチルム・トリコルヌツムの天然ゲノムのヌクレオチド配列を含まないと理解すべきである。一部の実施形態は、例えばイオン交換クロマトグラフィー、分子サイズに基づいた排除による、またはアフィニティーによる、または種々の溶媒中の溶解度に基づいた分画法等の分離方法から始めることによって、あるいは増幅、クローニング、およびそれにより当該配列がベクターによって運搬されることが可能となるサブクローニング等の遺伝子操作の方法から始めることによって、単離、精製または部分的に精製することが可能である配列に関する。
【００３８】
さらに、前記に開示されている配列にハイブリダイズする核酸分子が含まれる。ハイブリダイゼーションの条件は、開示されているＤＧＡＴ２分子をコードする核酸分子と少なくとも９０％、９５％、または９７％の同一性がある場合にハイブリダイゼーションが生じるという点においてストリンジェントであってよい。ストリンジェントな条件は、公知のサザンハイブリダイゼーションに用いられているもの、例えば５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸３ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０マイクログラム／ミリリッターの変性、せん断されたサーモンスパームＤＮＡを有する溶液中で一晩４２℃にてインキュベーション、その後０．１×ＳＳＣ中で約６５℃にてハイブリダイゼーション支持体の洗浄等を含んでよい。他の公知のハイブリダイゼーション条件が周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）に記載されている。
【００３９】
ＤＮＡの単離およびクローニングは、十分に確立されている。同様に、従来技術によって、単離した酵素をコードするＤＮＡをベクター内に挿入および酵母細胞内に形質転換することができる。しかしながら、ＶＬＣＰＵＦＡを効率的に使用し得るＤＧＡＴ２遺伝子がクローニングされていなかったため、ＤＧＡＴ２活性を調節することによる遺伝子改変の可能性に取り組むことは不可能であった。本発明者らは、ＤＧＡＴ２がＴＡＧ合成に関与し、かつＤＧＡＴよりも効率的にＶＬＣＰＵＦＡを利用することを確認した。
【００４０】
ＤＧＡＴ２をコードする核酸分子、例えば配列番号：２、配列番号：１６、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４１、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、または配列番号：６１と少なくとも８０％の同一性を有する配列を、生物、例えば植物内に形質転換してもよい。そのような相同配列は配列番号：２１〜２４によって例示されている。当該技術分野において公知のように、遺伝子および遺伝子構築物を生物、例えば植物内に導入し得る多数の方法があり、形質転換および組織培養の技術の組み合わせは、遺伝子組換え生物、例えば作物を作り出すための効果的戦略内に上手く取り入れられている。これらの方法は、他の場所（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，１９９１；Ｖａｓｉｌ，１９９４；ＷａｌｄｅｎおよびＷｉｎｇｅｎｄｅｒ，１９９５；Ｓｏｎｇｓｔａｄ，ｅｔ ａｌ．，１９９５）で記載されており、当業者に周知である。例えば、減圧浸潤（Ｂｅｃｈｔｏｌｄ，ｅｔ ａｌ．，１９９３）または有傷接種（Ｋａｔａｖｉｃ，ｅｔ ａｌ．，１９９４）によってアグロバクテリウムを介して行われるシロイヌナズナの形質転換に加えて、アグロバクテリウムＴｉ−プラスミドを介して行われる形質転換（例えば、胚軸（ＤｅＢｌｏｃｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）または子葉柄（Ｍｏｌｏｎｅｙ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）の創傷感染）、粒子衝突／微粒子銃法（Ｓａｎｆｏｒｄ，ｅｔ ａｌ．，１９８７；Ｎｅｈｒａ，ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９４）、またはポリエチレングリコールを介したプロトプラスト形質転換法（Ｒｈｏｄｅｓ，ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）を用いることによって、他の植物および作物種を形質転換することが同様に可能であることに当業者は確実に気づくであろう。
【００４１】
植物において、新規の遺伝子を伝達するまたは既存の遺伝子の発現を変えるための遺伝子操作によって達成されている植物代謝に対して成功した改変の例が多数ある。作物の性能（例えば、種子油または塊茎デンプンの含有量／組成；食物改良；除草剤、疾病、または害虫抵抗性；重金属耐性等）を改良するために、農学的に重要な多数の植物種の中に遺伝子を導入することが現在日常的に可能である（ＭａｃＫｅｎｚｉｅおよびＪａｉｎ，１９９７；Ｂｕｄｚｉｓｚｅｗｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，１９９３；ＫｉｓｈｏｒｅおよびＳｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，１９９３）。
【００４２】
当業者に明らかであり、他の場所（Ｍｅｙｅｒ，１９９５；Ｄａｄａ，ｅｔ ａｌ．，１９９７）で記載されているように、構成的プロモーター（例えば、ＣａＭＶ３５Ｓに基づくもの）を用いることによって、あるいは特定の細胞、組織（例えば、発達中の種子の子葉における導入遺伝子の発現に対するナピンプロモーター）、器官（例えば、根）に、特定の発達段階に、または特定の外部刺激（例えば、熱ショック）に応答して、遺伝子発現を標的化することができるプロモーターを用いることによって、導入遺伝子の発現についての任意に意図した上方または下方制御を管理するために、植物プロモーターを利用することができる。
【００４３】
本明細書において使用するためのプロモーターは、誘導可能な、構成的な、または組織特異的な、あるいは前記特性の種々の組み合わせを有するものであってよい。有用なプロモーターは、構成的プロモーター、例えばカーネーションエッチドリングウイルス（ＣＥＲＶ）、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、またはとりわけ２つのＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを直列に含んでいる２倍に増強したカリフラワーモザイクウイルスプロモーター（「ダブル３５Ｓ」プロモーターと称される）を含むが、これに制限されない。
【００４４】
特定の状況では、構成的プロモーターの代わりに組織特異的または発生学的に調節されるプロモーターを用いるのが望ましい可能性がある。組織特異的プロモーターは、他の組織の発現に影響を及ぼすことなく、特定の組織において過剰発現を可能にする。実例として、種子組織における酵素の過剰発現に用いられるプロモーターは、１９９２年１０月２９日に公表されたＰＣＴの国際公開公報第９２／１８６３４号に記載されているようなＡＣＰプロモーターである。
【００４５】
当該プロモーターおよび終結調節領域は、宿主の植物細胞内で機能的であってもよく、前記植物細胞および遺伝子に対して異種（すなわち、天然に存在しない）または同種（前記宿主植物種に由来する）であってもよい。用いることができる適切なプロモーターは、前記に記載されている。
【００４６】
前記終結調節領域は、プロモーターが得られた遺伝子または別の遺伝子の３’領域に由来してもよい。用いることができる適切な終結調節領域は当該技術分野において周知であり、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）・ノパリン合成ターミネーター（Ｔｎｏｓ）、Ａ．ツメファシエンスマンノピン合成ターミネーター（Ｔｍａｓ）、およびＣａＭＶ３５Ｓターミネーター（Ｔ３５Ｓ）、エンドウリブロース２リン酸カルボキシラーゼ小サブユニット終結領域（ＴｒｂｃＳ）、またはＴｎｏｓ終結領域を含んでよい。そのような遺伝子構築物は、アグロバクテリウムを介した宿主植物内への形質転換、および増加したイソプレノイド量についてのスクリーニングによって、活性について適切にスクリーニングすることができる。
【００４７】
適切には、当該遺伝子に対するヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）（米国保健社会福祉省の登録商標）ヌクレオチドデータベースから抽出し、かつ切断しない制限酵素について検索してもよい。ＰＣＲプライマー中にこれらの制限酵素認識部位を組み込むこと等の従来の方法またはサブクローニングによって、これらの制限部位を当該遺伝子に付加してもよい。
【００４８】
好ましくは、本明細書において使用するためのＤＮＡ構築物はベクター、最適には適切な宿主（植物）細胞における発現に適した発現ベクター内に包含されている。導入したＤＮＡ配列を含む植物を産生することができる任意のベクターが十分であると理解されるであろう。
【００４９】
適切なベクターは当業者に周知であり、Ｐｏｕｗｅｌｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８６）等の一般的な技術参考文献に記載されている。特に適切なベクターは、Ｔｉプラスミドベクターを含む。
【００５０】
宿主細胞内にＤＮＡ構築物を導入するための形質転換法は当該技術分野において周知であり、マイクロインジェクション、ポリエチレングリコールの使用、エレクトロポレーション、高速弾道貫通（ｈｉｇｈ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）、またはアグロバクテリウムを介した形質転換等の方法を含む。植物細胞または植物の形質転換後、所望のＤＮＡが組み込まれているそれらの植物細胞または植物を、抗生物質耐性、除草剤抵抗性、アミノ酸類似体に対する寛容等の方法によって、または表現型マーカーを用いることによって選択することができる。
【００５１】
当該植物細胞が遺伝子発現の増加を示すかどうかを判定するために、種々のアッセイ、例えばノーザンブロッティングまたは定量的逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いてもよい。従来の方法によって、形質転換された細胞から遺伝子導入植物全体を再生してもよい。同型株を作り出すために、改良されたイソプレノイド量を有するそのような遺伝子導入植物を繁殖および自家授粉させてもよい。そのような植物は、導入した特性に対する遺伝子を含む種子を産生し、選択された表現型を生じるであろう植物を産生するように成長させることができる。
【００５２】
本開示に従った改変に特に好ましい植物は、シロイヌナズナ、ボリジ（ボリジ種）、カノーラ、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）（リキヌス種）、カカオ豆（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）（テオブロマ種）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）（トウモロコシ種）、綿（ゴシッピウム種）、ハマナ種、クフェア種、亜麻（アマ種）、レスクェレラ種、およびリムナンテス種、リノーラ、ナスタチウム（ノウゼンハレン種）、マツヨイグサ種、オリーブ（オリーブ種）、ヤシ（アブラヤシ種）、ピーナッツ（ラッカセイ種）、ナタネ、ベニバナ（ベニバナ種）、大豆（ダイズ種およびソヤ種）、ヒマワリ（ヒマワリ種）、タバコ（タバコ種）、ベルノニア種、小麦（コムギ種）、大麦（オオムギ種）、米（オリザ種）、オートムギ（カラスムギ種）、モロコシ（モロコシ種）、ライ麦（ライムギ種）、またはイネ科植物ファミリーの他のメンバーを含む。
【００５３】
一部の実施形態を用いて、油料種子作物から生成された油料種子の産出量または組成を改変する。油料種子作物は、食用のまたは産業的に有用な油を商業的に重要な産出量で作り出すことができる植物種であり、前記に挙げた植物種の多くを含む。そのような油料種子作物は当業者に周知である。
【００５４】
一実施例において、ＤＧＡＴ２をコードするヌクレオチド配列で形質転換した植物を栽培する。遺伝子導入植物の種子を収穫して、前記種子の脂肪酸を抽出する。抽出した脂肪酸を、その後の組成物、例えば医薬組成物、栄養補助組成物、または食品組成物内への取り込みに用いる。
【００５５】
特定の実施形態において、形質転換されるべき植物に関して、油の産出を増大または変化させる他の方法（例えば、植物における発現のために、例えばＢｒａｓｓｉｃａピルビン酸脱水素酵素キナーゼ活性を有するペプチドをコードする核酸配列（例えば、Ｍａｒｉｌｌａ，ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第７，２１４，８５９号（２００７年５月８日）、Ｚｏｕ，ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第６，５００，６７０号（２００２年１２月）、およびＲａｎｄａｌｌ，ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第６，２５６，６３６号（２００１年７月）を参照）、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するペプチドをコードする核酸配列（例えば、Ｚｏｕ，ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第７，０１５，３７３号および米国特許第６，５００，６７０号（２００２年１２月）を参照）、およびグリセロール−３−リン酸脱水素酵素活性を有するペプチドをコードする核酸配列（例えば、米国特許第７，１１２，７２４号を参照）、ならびにその組み合わせを含む群から選択される核酸配列を取り込むこと）を用いてもよい。
【００５６】
実施形態は、本明細書において詳細に記載されている具体的な実施例に加えて、種々の改変および代替的形態を受け入れる余地がある。従って、実施形態は開示されている特定の形態に制限されない。むしろ、本開示の範囲は、以下の添付した特許請求の範囲に含まれるすべての改変、同等物、および代替物を包含する。
【実施例】
【００５７】
実施例１：ＤＮＡ操作
ＤＮＡの調製、プラスミドの増殖、および単離には、標準的方法および手順を用いた（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）。配列決定は、Ｔａｑ ＤｙｅＤｅｏｘｙ（商標）ターミネーターサイクルシークエンシングキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のモデル３７３Ａ ＤＮＡシークエンシングシステムで行った。当該ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を、ＢＬＡＳＴプログラムを用いることによって、データバングで入手可能な配列と比較した（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，１９９０）。当該技術分野において公知であるように、ＮＣＢＩのヌクレオチドおよびタンパク質データベースにおける他の脂肪酸ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子とのホモロジーに基づいて、ＤＧＡＴ２クローンを同定した。
【００５８】
実施例２：ＴｐＤＧＡＴ２を発現することによって、酵母形質転換体においてｉｎ ｖｉｖｏ形成されたトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）
ＤＧＡＴ２遺伝子をｐＹＥＳ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）内に挿入した。当該構築物をシークエンシングによって確認し、出芽酵母サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の株Ｈ１２４６ＭＡＴ−αを形質転換するために、ｐＹＥＳ２．１／ＴｐＤＧＡＴ２を用いた。この変異株は４重の変異体である（ＤＧＡＴ−，ＰＤＡＴ−，ＡＳＡＴ−，ＡＳＡＴ２−）。プラスミドＤＮＡを推定される形質転換体から単離し、ｐＹＥＳ２．１／ＴｐＤＧＡＴ２の存在をサザン解析によって確認した。ベクターのみ（ｐＹＥＳ２．１）を含むＨ１２４６ＭＡＴ−α形質転換体をコントロールとして用いた。シロイヌナズナＤＧＡＴ１で形質転換したＨ１２４６ＭＡＴ−αはポジティブコントロールとして働いた。
【００５９】
シングルコロニーを、２０ｍＬのＳＤ培地（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｖｏｌ．２，ｐ．１３．１．３によって記載されているような、グルコースを含み、ウラシルを含まない合成デキストロース培地）中で回転式シェーカー（２７０ｒｐｍ）上で２８℃にて一晩培養した。一晩培養物からの細胞を沈殿させ、５０ｍＬの発現誘導用の培地（ガラクトースを含み、ウラシルを含まないＳＤ培地）中に再懸濁した。細胞を２７０ｒｐｍで振とうさせながら、２８℃にて再びインキュベーションし、４〜６時間後に回収した。ＧＡＬで誘導した酵母形質転換体を、５，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって回収し、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１ｍＭ ＤＴＴを含む１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）中に再懸濁した。
【００６０】
図９を参照すると、ネガティブコントロールである空ベクターではＴＡＧが生成されなかった（レーン８）のに対し、ポジティブコントロール（レーン１）ではＴＡＧバンドを示した。ＤＧＡＴ２を含むベクターのそれぞれ（レーン２〜６）では、ＤＧＡＴ２がＴＡＧを合成する能力を有することを裏付けるＴＡＧバンドを示した。レーン８の右側のレーンには、ＴＡＧマーカーとして用いられるＴＡＧ標準物質をロードした。
【００６１】
実施例３：ＴｐＤＧＡＴ２の基質選択性
Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）によって記載されているように、酸洗浄したガラスビーズを用いて細胞溶解物を調製した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）アッセイを用いて酵母溶解物中のタンパク質を測定し、各溶解物中のタンパク質量を標準化し、アリコート（タンパク質２５０μｇ）をＤＧＡＴ２活性についてアッセイした。
【００６２】
３０℃の水槽中で１００回転／分で１０分間振とうさせながら、ＤＧＡＴアッセイをｐＨ７．４にて行った。アッセイ混合物（最終容量０．５ｍＬ）は、１００μｇ溶解物タンパク質、９０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、２００μＭ ｓｎ−１，２ジオレイン、およびアシル基供与体としての１８μＭ１４ＣアシルＣｏＡ（２ｎＣｉ／ｎｍｏｌ特異的活性）を含んだ。ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸（７０：３０：１ ｖ／ｖ／ｖ）中で展開させたシリカゲルＧプレート上でのＴＬＣによって１４Ｃ標識されたＴＡＧを単離し、Ｗｉｎ−Ｓｃａｎ２Ｄ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏｓｃａｎ社，ワシントンＤＣ，米国）を用いたＢｉｏｓｃａｎ ＡＲ−２０００放射性ＴＬＣスキャナー上で、放射性標識されたＴＡＧバンドを可視化し、当該バンドを切り出して、Ｔａｙｌｏｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）によって記載されているように定量化した。
【００６３】
実施例４：ＴｐＤＧＡＴ２形質転換体の脂肪酸組成
Ｓ．セレヴィシエ株Ｈ１２４６ＭＡＴ−αを、シロイヌナズナ／ｐＹＥＳ２．１またはＴ．シュードナナ／ｐＹＥＳ２．１で形質転換した。形質転換体を３日間２８℃にて培養し、ガラクトースによって誘導した。前記形質転換体を、処理なし（コントロール）、５０ｕＭ ＤＨＡまたは１５０ｕＭ ＤＨＡで処理した。ＡｔＤＧＡＴ１／ｐＹＥＳ２．１を含む３つの形質転換体およびＴｐＤＧＡＴ２／ｐＹＥＳ２．１を含む３つの形質転換体についての脂肪酸プロファイルを、従来のガスクロマトグラフィー分析に基づく表１に示した。
【００６４】
脂肪酸を１６：０、１６：１、１８：０、１８：１（オレイン酸）、および２２：６（ＤＨＡ）として同定し、それぞれの組成を総脂肪酸に対するパーセンテージで表している。ＤＨＡの発現は、コントロール株の０から１５０μＭ ＴｐＤＧＡＴ２／ｐＹＥＳ２．１では６．０１％に増加し、１５０μＭ ＡｔＤＧＡＴ／ｐＹＥＳ２．１のものの２倍以上であった（表１）。これらの結果は、ＴｐＤＧＡＴ２がＤＧＡＴ１よりもＤＨＡ脂肪酸をより効率的に利用することをさらに裏付けた。
【００６５】
表１に示すように、脂肪酸組成に関して、ＤＧＡＴ２ ｃＤＮＡを含む変異株は飽和物全体の減少および不飽和物の増加を示した。そのような変化はすべて、「より健康な」油のプロファイルに向かうものであり、カノーラ、アブラナの他の油料種子、および他の食用油料作物に直接応用して、同様の油組成の改良をもたらすことができる。
【００６６】
（表１） 酵母変異体Ｈ１２４６ＭＡＴ−αにおける、ＤＧＡＴ２およびＤＧＡＴ１によって発現されるＴＡＧの脂肪酸組成
【００６７】
実施例５：野生型シロイヌナズナにおけるＤＧＡＴ２ ｃＤＮＡの過剰発現
全長ＤＧＡＴ２ ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅のための鋳型として用いる。フラグメントを制限エンドヌクレアーゼ消化によって切断し、ベクターの相当する部位にライゲーションする。構築物の完全性を、シークエンシングによって確認する。
【００６８】
前記ベクターをＡ．ツメファシエンス内に導入し、野生型シロイヌナズナを形質転換するために用い、後代を分析する。
【００６９】
実施例６：種子特異的発現のためのＤＧＡＴ２ ｃＤＮＡ植物形質転換ベクターの構築
配列の各末端に新しい制限部位を提供するために、プライマーとともに、全長ＤＧＡＴ２ ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅のための鋳型として用いた。ＰＣＲプロファイルは以下のとおりである：９４℃１分；９４℃３０秒，５５℃３０秒，７２℃１分を３０サイクル；および７２℃５分。その後、ＰＣＲ産物をＰＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にライゲーションする。フラグメントを切断し、ベクターの相当する部位にライゲーションする。構築物の完全性を、シークエンシングによって確認する。
【００７０】
実施例７：植物ＤＧＡＴ２ベクター構築物を用いたアグロバクテリウムの形質転換
エレクトロコンピテント・アグロバクテリウム細胞ＧＶ３１０１（ｐＭＰ９０）株を以下のとおりに調製する。アグロバクテリウム培養物を２ＹＴ中で２４〜４８時間増殖させ、６００ｎｍにおける吸光度が０．５〜０．７に到達した時点で、細胞を氷上で冷やし、遠心分離（ＧＳＡローターで５，０００×ｇ，１０分，４℃）によって沈殿させる。沈殿物を１、０．５、および０．０２容量の冷却した１０％滅菌グリセロール中で洗浄し、０．０１容量の冷却した１０％グリセロールに再懸濁する。その後、当該エレクトロコンピテント細胞を液体Ｎ２中で冷凍し、−７０℃で保存する。メーカーの使用説明書に従って、２０〜５０ｎｇの形質転換ＤＮＡを用いたエレクトロポレーションによって、前記アグロバクテリウム細胞を形質転換し、選択培地（５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ）上にプレーティングし、２８℃にて一晩インキュベーションする。形質転換された単一細胞を、５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび２５μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含む５ｍＬ ＬＢ中で一晩増殖させる（２８℃，２２５ｒ．ｐ．ｍ）。ＤＮＡの抽出および精製を行う。植物の形質転換前に、構築物の忠実度をＤＮＡシークエンシングによって再チェックする。
【００７１】
実施例８：シロイヌナズナの形質転換
シロイヌナズナの種子を１６時間・明／８時間・暗の管理の中、蛍光照明（１２０μＥ・ｍ−２Ｓ−１）の下で２２℃にて栽培する。４〜６個の植物を、湿らせたＴＥＲＲＡ−ＬＩＴＥ ＲＥＤＩ−ＥＡＲＴＨ（Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ＆Ｃｏ．Ｃａｎａｄａ社，エイジャックス，オンタリオ州，カナダ）中で１０ｃｍ２植木鉢で育てる。植木鉢中の土壌混合物が接種培地中に落下するのを防ぐために、土壌をプラットホームのように積み上げて種子を頂上に植え付け、植木鉢全体をナイロン製のウィンドウスクリーンで覆い、ゴム製のバンドで固定する。最初の花が開花し始めた時点で、アグロバクテリウム懸濁液中で植物を減圧浸潤する。
【００７２】
アグロバクテリウムを増殖させるために、５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび２５μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含むＬＢ培地中で５ｍＬ懸濁液を２８℃にて一晩培養する。浸潤の前日に、この「種子培養物」を、５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび２５μｇ／ｍＬゲンタマイシンを補充した２５０ｍＬのＬＢ培地を含む４つのフラスコに分ける。これらの培養物を２８℃にて一晩培養する。翌朝、６００ｎｍにおける吸光度（およそ＝１．０）をチェックした後、遠心分離（ＧＳＡローターで５，０００×ｇ，１０分，室温）によって細胞を回収し、浸潤培地（水中に５％スクロース，０．００５％ Ｓｉｌｗｅｔ−７７）に再懸濁して、６００ｎｍで０．８の吸光度を得る。
【００７３】
アグロバクテリウム懸濁液をビーカーに注ぎ、花およびボルトが浸水するように鉢植えされている植物を前記ビーカーの中に逆さにする。前記ビーカーを大きなベルジャー内に置き、茎表面上で気泡が形成され、かつ溶液がわずかに泡立ち始めるまで、真空ポンプを用いて真空に吸引し、その後真空を急速に解放する。必要な時間および圧力は実験装置によって異なるが、良好な浸潤は、均一に暗くなり水浸しになる組織のように、目に見えて明らかである。植木鉢を前記ビーカーから取り出して、プラスチック製のトレイの中の側に置き、プラスチック製のドームで覆って湿度を維持する。翌日、植物から覆いを取り外して真っ直ぐに立て、Ｋａｔａｖｉｃ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）によって記載されているように、連続的な光条件下、栽培箱中でおよそ４週間成長させる。長角果が成熟して乾燥した時点で、種子を収穫し、陽性の形質転換体について選択する。
【００７４】
実施例９：セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）の形質転換
形質転換は基本的に、Ｍｏｌｏｎｅｙ，ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ８：２３８−２４２によって記載されているように実施する。
【００７５】
Ａ．ツメファシエンス株ＧＶ３１０１／ｐＭＰ９０（Ｋｏｎｃｚ Ｃ．＆Ｓｃｈｅｌｌ，Ｊ．，１９８６，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０４：３８３−３９６）を、形質転換の研究に用いる。ＬＢ培地（Ｄｉｆｃｏ，米国）（１００ｍＬ）中の定常期の細菌培養物を遠心分離によって回収し、抗凍結剤としての１％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）（Ｓｉｇｍａ社，米国）を含む１０ｍＬの新しいＬＢ培地中に再懸濁する。細菌のアリコートを、２％スクロース、５０μＭアセトシリンゴン，ｐＨ５．６を含む２ｍＬのブレインハートインフュージョン培地（Ｄｉｆｃｏ，米国）に添加し、２８℃にて一晩インキュベーションする形質転換に用いるまで、２００μＬのアリコートを−２０℃で保存する。細菌細胞の密度は、およそ１×１０９ 細胞／ｍＬである。
【００７６】
Ｍｏｌｏｎｅｙ，ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．８：２３８−２４２の方法に従って、子葉移植片を植物形質転換ベクターを含むアグロバクテリウムに暴露する。前記移植片の葉柄の切断面を細菌培養物に短時間浸す。切断面が培地に接触するように、前記移植片を共存培養培地の中に入れる。１０個の移植片を、それぞれ１００×１５ｍｍのペトリプレートに置く。共存培養プレートをＳＴＲＥＴＣＨ’Ｎ ＳＥＡＬ（商標）プラスチック製の包装物で密封する。種子の発芽工程に関する前述のような温度および光周期の条件下で、プレートを３日間培養キャビネット内でインキュベーションする。その後、移植片を選択培地に移す。
【００７７】
選択培地において３〜４週間後、再生している若芽（推定上の形質転換体）を切り取り、継続培養のために新しい選択培地に移す。新芽が１．５〜２．０ｃｍの長さに到達した時点で、それらを発根培地に移す。基本的に、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ａ．（１９８７），Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．５：３８７−４０５によって記載されているように、推定上の遺伝子導入された新芽をｇｕｓ遺伝子の発現についてスクリーニングする。青色の染色の存在は、形質転換の証拠として見なされる。
【００７８】
形質転換の確認を、カナマイシン上での選択、サザンブロッティング、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、および後代分析によって立証する。
【００７９】
実施例１０：推定上の形質転換体（遺伝子導入植物）の選択および遺伝子導入植物の解析
各構築物に対して、種子を大量に収穫する。種子を２０％漂白剤および０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む溶液中に種子を２０分間浸すことによって表面滅菌し、その後滅菌水で３回洗浄する。滅菌した種子を、滅菌した０．１％Ｐｈｙｔａｇａｒ（５００〜１，０００個の種子につき約１ｍＬのＰｈｙｔａｇａｒ）中に室温にて再懸濁し、および１５０×１５ｍｍのカナマイシン選択プレート上に２，０００〜４，０００個の種子を含む容量を塗布することによってプレーティングする。プレートを照明をつけずに寒い中で２日間インキュベーションし、７〜１０日間制御された環境の中で（１６時間・明／８時間・暗の管理の中、蛍光照明（１２０μＥ・ｍ−２Ｓ−１）の下で２２℃にて）栽培する。選択培地は、１／２ＭＳＧ培地、０．８％Ｐｈｙｔａｇａｒ、３％スクロース、５０μｇ／ｍＬカナマイシン、および５０μｇ／ｍＬチメンチンを含む。ペトリプレートおよび蓋を、Ｍｉｃｒｏｐｏｒｅ（商標）外科用テープ（３Ｍ カナダ，ロンドン，ＯＮ，カナダ）で密封する。７〜１０日後、緑葉を有し、かつ培地中で根をしっかりと定着させている薬剤耐性植物を形質転換体として同定し、葉３〜５枚の段階で、選択された形質転換体を非常に湿らせた土壌混合物で満たした湿地の中に移植する。形質転換体を成熟させ、成熟した種子（Ｋａｔａｖｉｃ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）で定義されているＴ２世代）を個々の植物から収穫し、さらに分析する。
【００８０】
ゲノムＤＮＡを個々のＴ１植物から単離する。前記Ｔ１形質転換体におけるｃＤＮＡまたは遺伝子の存在をそれぞれ確認するために、ＰＣＲ増幅を行う。挿入したフラグメントのシングルコピーを含む形質転換体を選択するために、サザン分析を行う。ＤＮＡサンプルを制限酵素で消化し、１％アガロースゲル上での電気泳動によって分解し、ナイロン製のフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋，アメルシャム社）を用いてサザンブロッティングを行う。α−［３２Ｐ］ｄＣＴＰ（ＮＥＮ／ＤｕＰｏｎｔ）で標識したＤＧＡＴ２ ｃＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる。ハイブリダイゼーションを６０℃で行う。その後、前記フィルターをＫｏｄａｋ Ｘ−ＯＭＡＴ−ＡＲフィルムに露光する。
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本願は、「藻類由来のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２遺伝子およびそれによってコードされるタンパク質」について２００７年１２月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／００８，７５２号の出願日の利益を主張する。
【０００２】
技術分野
本開示は、概してバイオテクノロジー、とりわけ植物特性の遺伝子操作に有用な遺伝子に関する。特定の実施形態において、本開示は、単離および／または精製したポリペプチド、およびジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２（ＤＧＡＴ２）をコードする核酸、ならびにそれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
油料種子作物は重要な農産物である。植物の種子油は、人の食物に必須の多価不飽和脂肪酸の主要な供給源であり、かつ化学工業にとっての再生可能な原料である。発達中の種子の色素体中にある脂肪酸合成酵素複合体という酵素は、細胞質のアシルＣｏＡプールに導かれる脂肪酸の生合成に関与して、トリアシルグリセロール蓄積を維持する。トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の生合成は、一次基質としてのグリセロール−３−リン酸および脂肪酸アシルＣｏＡとともに小胞体に位置する。植物の貯蔵脂質の生体集合には、３つのアシル基転移酵素、すなわちグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ、ＥＣ２．３．１．１５）、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＴ、ＥＣ２．３．１．５１）、およびジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ、ＥＣ２．３．１．２０）がある。これら３つのアシルトランスフェラーゼは、ケネディ経路として一般的に知られる生化学過程である、ＴＡＧの形成へのＤＧＡＴによるｓｎ−１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）のアシル化という最終工程でグリセロール骨格の段階的なアシル化を触媒する。ＴＡＧを生成するためのＤＧＡＴが介在するグリセロール骨格のアシル化は、植物の脂質蓄積における律速段階と提唱されている。従って、ＤＧＡＴは植物脂質生合成の遺伝子改変における標的である。
【発明の概要】
【０００４】
発明の開示
本発明者らは、Ｔ．シュードナナ（Ｔ．ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２（ＤＧＡＴ）と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドの属を本明細書において開示する。これらのポリペプチドを用いて、植物における多価不飽和脂肪酸の量を変えることができる。また、タラシオシラ・シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）のＤＧＡＴ２のジアシルグリセロールトランスフェラーゼ触媒ドメインを含むポリペプチド、およびＤＧＡＴ２のジアシルグリセロールトランスフェラーゼ触媒ドメインと少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドも開示する。さらに、Ｔ．シュードナナのＤＧＡＴ２と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、およびＴ．シュードナナのＤＧＡＴ２のジアシルグリセロールトランスフェラーゼドメインと少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを記載する。
【０００５】
本明細書において、本発明者らはＴ．シュードナナ由来の単離および精製したジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２（ＤＧＡＴ）遺伝子およびｃＤＮＡ配列を開示する。また、Ｔ．シュードナナ由来の全長ＤＧＡＴ２ ｃＤＮＡ配列、および前記ＤＧＡＴ２ ｃＤＮＡと少なくとも８０％の配列同一性を有するｃＤＮＡ配列も開示する。一部の実施形態においては、これらのｃＤＮＡ配列はベクター内に含まれていてもよい。商業用植物油の産出量を増加させるため、またはそれらの組成を改変して植物および植物生成物の特定の商業的改良を達成するために、これらのポリヌクレオチドを用いて植物におけるトリアシルグリセロールの天然形成を改変することができる。
【０００６】
Ｔ．シュードナナ、ならびにクラミドモナス・ラインハーディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、オストレオコッカス・ルシマリヌス（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｃｉｍａｒｉｎｕｓ）、オストレオコッカス・タウリ（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ ｔａｕｒｉ）、およびファエオダクチルム・トリコルヌツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）を含む藻類の別の種由来のＤＧＡＴ２ファミリーの別の単離および精製した遺伝子、ならびにｃＤＮＡ配列も開示する。また、商業用植物油の産出量を増加させるため、またはそれらの組成を改変して植物および植物生成物の特定の商業的改良を達成するために、これらのポリヌクレオチドを用いて植物におけるトリアシルグリセロールの天然形成を改変することができる。
【０００７】
核酸構築物を含む遺伝子導入植物も開示する。細胞または植物を形質転換する方法であって、細胞または植物の中に単離した、精製した、または組換えの核酸を導入することを含む方法を記載する。遺伝子的に形質転換された植物の種子を産生するプロセスには、植物の種子の中に核酸を導入することが含まれる。一部の実施形態において、これらの方法は、植物の種子油含有量を変化させるために、植物を改変するのに用いることができる。
【０００８】
最も一般的に述べると、一部の例は、藻類由来のＤＧＡＴ２遺伝子の単離、精製、および特徴づけ、ならびに超長鎖多価不飽和脂肪酸の生成におけるＤＧＡＴ２の有用性を開示する。前述のことは、添付した図面に関連して進む、以下のいくつかの実施形態の詳細な説明からより明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】図１Ａは、Ｔ．シュードナナＤＧＡＴ２の全長ＤＧＡＴ２ ｃＤＮＡ配列（配列番号：２）に相当する推定アミノ酸配列（配列番号：１）を表す。
【図１Ｂ】図１Ａの続き。
【図２Ａ】図２Ａは、配列番号：１（ＴｐＤＧＡ２）とすべて２型ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼであるｇｉ：３７１８２１８７、ｇｉ：５０５４１６８９、ｇｉ：７４６２３３５８、ｇｉ：７４６２３３５９、ｇｉ：８６２７９６３８、およびｇｉ：６２８２５８１３との間の配列アラインメントを表す。前記配列のうち、４以上に共通するアミノ酸を太字で示す。これら２型ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼのジアシルグリセロールトランスフェラーゼ触媒ドメインを含むアミノ酸配列は、２３６−３６５（ＴｐＤＧＡ２）；７９−２０８（ｇｉ：３７１８２１８７）；７６−２０５（ｇｉ：５０５４１６８９）；７６−２０５（ｇｉ：７４６２３３５８）；３４−１６５（ｇｉ：７４６２３３５９）；３３−１６５（ｇｉ：８６２７９６３８）；３６−１６５（ｇｉ：６２８２５８１３）残基からなる。
【図２Ｂ】図２Ａの続き。
【図３】図３Ａは、配列番号：１に相同なポリペプチド配列の一例（配列番号：３）を表す。図３Ｂは、配列番号：２に少なくとも９０％相同であって、配列番号：３のポリペプチドの一部をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号：４）の一部を表す。
【図４】図４Ａは、配列番号：１に相同なポリペプチド配列の別の例（配列番号：５）を表す。図４Ｂは、配列番号：２に少なくとも９０％相同であって、配列番号：５のポリペプチドの一部をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号：６）の一部を表す。
【図５】図５Ａは、配列番号：１に相同なポリペプチド配列の別の例（配列番号：７）を表す。図５Ｂは、配列番号：２に少なくとも９０％相同であって、配列番号：７のポリペプチドの一部をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号：８）の一部を表す。
【図６】図６Ａは、配列番号：１に相同なポリペプチド配列の別の例（配列番号：９）を表す。図６Ｂは、配列番号：２に少なくとも９０％相同であって、配列番号：９のポリペプチドの一部をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号：１０）の一部を表す。
【図７】図７Ａは、配列番号：１に相同なポリペプチド配列の別の例（配列番号：１１）を表す。図７Ｂは、配列番号：２に少なくとも９０％相同であって、配列番号：１１のポリペプチドの一部をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号：１２）の一部を表す。
【図８】図８Ａは、配列番号：１に相同なポリペプチド配列の別の例（配列番号：１３）を表す。図８Ｂは、配列番号：２に少なくとも９０％相同であって、配列番号：１３のポリペプチドの一部をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号：１４）の一部を表す。
【図９】図９は、酵母変異体Ｈ１２４６ＭＡＴ−α（ＤＧＡＴ、ＰＤＡＴ−、ＡＳＡＴ１−、ＡＳＡＴ２−、ＴＡＧ形成を欠失している）でＴｐＤＧＡＴ２およびＡｔＤＧＡＴ１を発現させることによって生成されたＴＡＧの薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析を表す。レーン１はＡｔＤＧＡＴ１の発現を示し、レーン２〜６は、ＴｐＤＧＡＴ２の発現を示す。レーン２〜６ではクリアなＴＡＧ（トリアシルグリセロール）のバンドが観察された。レーン８は空ベクター（ｐＹＥＳ２．１）コントロールを示し、このレーンにはＴＡＧ（トリアシルグリセロール）のバンドは存在しない。レーン８の右側のレーンには、ＴＡＧマーカーとして用いることができるＴＡＧ標準物質をロードした。
【図１０】図１０は、空プラスミド（ｐＹＥＳ２．１コントロール；空のバー）、Ｔ．シュードナナＤＧＡＴ２ ｃＤＮＡ（ｐＹＥＳ：ＤＧＡＴ；点状のバー）、およびシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＤＧＡＴｃＤＮＡ（黒無地のバー）で形質転換された酵母変異体Ｈ１２４６ＭＡＴ−αにおけるＤＧＡＴ活性を示す。誘導した酵母細胞の溶解物から調製したミクロゾーム膜画分を、アシル基供与体としての種々の１４Ｃ標識されたアシルＣｏＡ、および受容体としての標識されていないｓｎ−１，２ジオレインを用いてＤＧＡＴ活性についてアッセイした。本明細書において相対的ＤＧＡＴ活性をＤＰＭ（ＴＡＧ内に取り込まれた１４Ｃ標識された基質の量）として表した。当該結果は、ＴｐＤＧＡＴ２およびＡｔＤＧＡＴ１の基質選択性および相対的活性を示す。
【図１１】図１１は、ＴｐＤＧＡＴ２のアミノ酸配列（ＴｐＤＧＡＴ２−１）とＴ．シュードナナ由来または他の藻類種（Ｃｒ：クラミドモナス・ラインハーディ、Ｏｌ：オストレオコッカス・ルシマリヌス、Ｏｔ：オストレオコッカス・タウリ、Ｐｔ：ファエオダクチルム・トリコルヌツム）由来のそのファミリーメンバーとのホモロジー比較を表す。ＴｐＤＧＡＴ２（ＴｐＤＧＡＴ２−１）は、そのファミリーメンバーであるＴｐＤＧＡＴ２−２、ＴｐＤＧＡＴ２−３、およびＴｐＤＧＡＴ２−４とそれぞれ２４％、２５％、および１７％の配列同一性を共有している。種々の藻類種の中で、ＴｐＤＧＡＴ２（ＴｐＤＧＡＴ２−１）は、ＰｔＤＧＡＴ２−１と高い配列類似性（４８％の配列同一性）を、ＣｒＤＧＡＴ２−１、ＣｒＤＧＡＴ２−２、およびＣｒＤＧＡＴ２−４と比較的高い類似性（それぞれ２０％、２３％、および２４％）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
Ｉ．いくつかの実施形態の概説
本明細書において、Ｔ．シュードナナの単離および精製した２型ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ２）を開示する。他の生物および他の生物由来の細胞の中で超長鎖多価不飽和脂肪酸（ＶＬＣＰＵＦＡ）の合成を改変するこのポリペプチドの驚くべき能力を用いて、所望の脂肪酸組成を有する遺伝子導入植物および植物の種子を産生するために、植物および植物の種子を形質転換する。この開示には、Ｔ．シュードナナＤＧＡＴ２のものと少なくとも９０％の配列同一性のアミノ酸配列を有するＤＧＡＴ２活性を示すポリペプチドが含まれる。特定の実施形態において、これらのポリペプチド配列は、例えば配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、または配列番号１３を含む。また、Ｔ．シュードナナＤＧＡＴ２のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ触媒ドメインと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチドを開示する。特定の実施形態において、これらのポリペプチド配列は、例えば配列番号１５、配列番号：１７、または配列番号：１９を含む。図２にはＴ．シュードナナＤＧＡＴ２のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ触媒ドメインが表されており、それはＴ．シュードナナＤＧＡＴ２の完全な開示されているポリペプチド配列におけるアミノ酸残基２３６〜３６５からなる。
【００１１】
配列番号：１５のポリペプチドは、Ｔ．シュードナナＤＧＡＴ２のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼドメインを含む。一部の実施形態は、配列番号：１５の単離または精製したポリペプチドと少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、または９９．７％の配列同一性を有する配列、例えば配列番号：１を含む単離または精製したポリペプチドに関する。特定の実施形態において、これらのポリペプチドはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する。ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性は、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏの酵素アッセイにより当業者によって容易に測定できる。この方法は実施例４において詳細に記載されており、このアッセイの代表的な結果は図１０に示されている。当業者によって理解されるように、当該開示はまた、配列番号：１５に９０％以上の同一性の推定アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする植物および藻類由来の実質的に相同なＤＮＡ配列にも関する。
【００１２】
ＤＧＡＴ２ファミリーのメンバーである藻類由来の単離または精製した他のポリペプチドは、例えば配列番号：２５（ＴｐＤＧＡＴ２−２）、配列番号：２７（ＴｐＤＧＡＴ２−３）、配列番号：２９（ＴｐＤＧＡＴ２−４）、配列番号：３１（ＣｒＤＧＡＴ２−１）、配列番号：３３（ＣｒＤＧＡＴ２−２）、配列番号：３５（ＣｒＤＧＡＴ２−３）、配列番号：３７（ＣｒＤＧＡＴ２−４）、配列番号：３９（ＣｒＤＧＡＴ２−５）、配列番号：４１（ＯｌＤＧＡＴ２−１）、配列番号：４３（ＯｌＤＧＡＴ２−２）、配列番号：４５（ＯｌＤＧＡＴ２−３）、配列番号：４７（ＯｌＤＧＡＴ２−４）、配列番号：４９（ＯｔＤＧＡＴ２−１）、配列番号：５１（ＯｔＤＧＡＴ２−２）、配列番号：５３（ＯｔＤＧＡＴ２−３）、配列番号：５５（ＯｔＤＧＡＴ２−４）、配列番号：５７（ＰｔＤＧＡＴ２−１）、配列番号：５９（ＰｔＤＧＡＴ２−２）、配列番号：６１（ＰｔＤＧＡＴ２−３）、または配列番号：６３（ＰｔＤＧＡＴ２−４）と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１３】
一部の実施形態は、前述したポリペプチドをコードする単離または精製した核酸（ポリヌクレオチド）に関する。これらポリヌクレオチドの配列は、例えば配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２６（ＴｐＤＧＡＴ２−２）、配列番号：２８（ＴｐＤＧＡＴ２−３）、配列番号：３０（ＴｐＤＧＡＴ２−４）、配列番号：３２（ＣｒＤＧＡＴ２−１）、配列番号：３４（ＣｒＤＧＡＴ２−２）、配列番号：３６（ＣｒＤＧＡＴ２−３）、配列番号：３８（ＣｒＤＧＡＴ２−４）、配列番号：４０（ＣｒＤＧＡＴ２−５）、配列番号：４２（ＯｌＤＧＡＴ２−１）、配列番号：４４（ＯｌＤＧＡＴ２−２）、配列番号：４６（ＯｌＤＧＡＴ２−３）、配列番号：４８（ＯｌＤＧＡＴ２−４）、配列番号：５０（ＯｔＤＧＡＴ２−１）、配列番号：５２（ＯｔＤＧＡＴ２−２）、配列番号：５４（ＯｔＤＧＡＴ２−３）、配列番号：５６（ＯｔＤＧＡＴ２−４）、配列番号：５８（ＰｔＤＧＡＴ２−１）、配列番号：６０（ＰｔＤＧＡＴ２−２）、配列番号：６２（ＰｔＤＧＡＴ２−３）、または配列番号：６４（ＰｔＤＧＡＴ２−４）を含んでもよい。一部の実施形態において、前記ポリヌクレオチド配列は、開示されているポリペプチドをコードする開示されているヌクレオチド配列の塩基と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、または９９．７％のパーセンテージ同一性を有する。そのようなポリヌクレオチドのいくつかの例が、配列番号：２１〜２４である。技術を有する実践者によって理解されるように、核酸配列のわずかな変化は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列を必ずしも変化させない。コードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させる特定の遺伝子配列におけるヌクレオチドの同一性の変化は、当該遺伝子の有効性の低下または増大をもたらし得ること、ならびに一部の応用（すなわち、アンチセンス、共抑制、またはＲＮＡｉ）において、部分的配列はしばしば全長型と同じ程度に効果的に作用することは当業者によって理解されるであろう。遺伝子配列を変更または短くし得る方法は当業者に周知であり、当該改変遺伝子の有効性を調べる方法も同様である。特定の実施形態において、有効性は例えば従来のガスクロマトグラフィーによって容易に調べることができる。従って、当該遺伝子のそのようなすべての変化が本明細書の一部として含まれる。
【００１４】
一部の実施形態は、配列番号：２と少なくとも８０％の相同性を有する単離または精製したポリヌクレオチド、例えば配列番号：２、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２１〜２４を含むベクターに関する。従って、例えば配列番号：２、例えば配列番号：２、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：２０、または配列番号：２１〜２４、あるいはその一部からなる群から選択される配列を含むベクターを調製するための方法、植物細胞内へのアンチセンス方向に当該配列または部分的配列、あるいはその相補鎖を導入するための方法を提供する。
【００１５】
特定の実施形態は、藻類におけるＤＧＡＴ２ファミリーのメンバーと少なくとも８０％の相同性を有するポリヌクレオチドを含むベクターに関する。これらのベクターは、例えば配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６２、または配列番号：６４のポリヌクレオチド配列を含んでもよい。
【００１６】
一部の実施形態において、ＤＧＡＴ２活性を備えるポリペプチドを生成する遺伝子導入植物を作り出すために、前記単離および精製したポリヌクレオチド、ならびにこれらの単離および精製したポリヌクレオチドを含むベクターを用いてもよい。従って、一実施形態は、配列番号：２と少なくとも８０％の相同性を有する単離または精製したポリヌクレオチド、例えば配列番号：２、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：２０、または配列番号：２１〜２４の配列を有するデオキシリボ核酸分子を含む遺伝子導入植物および植物の種子に関する。他の実施形態は、藻類におけるＤＧＡＴ２ファミリーの別のメンバーと少なくとも８０％の相同性を有する単離または精製したポリヌクレオチド、例えば配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６２、または配列番号：６４の配列を有するデオキシリボ核酸分子を含む遺伝子導入植物および植物の種子に関する。これら実施形態の植物は、当該核酸構築物を欠いている植物における量と比較して、種子中の多価不飽和脂肪酸の量が変化していてもよい。前記植物における脂肪酸は、約７０％以上の多価不飽和脂肪酸であってよい。
【００１７】
一実施形態は、そのような植物および植物の種子を産生する方法を含む。前記方法は、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド、または藻類におけるＤＧＡＴ２ファミリーのポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；例えば配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４１、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：６１、または配列番号：６３を含む核酸構築物を作り出すこと、ならびに植物内に当該構築物を導入することを含む。この実施形態の方法は、当業者に公知の任意の方法、非制限的な例であるアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を介して行われる形質転換の方法によって達成され得る。特定の実施形態において、前記方法は、Ｂｒｕｓｉｃａピルビン酸脱水素酵素キナーゼ活性を備えるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ジアシルグリセロールアセチルトランスフェラーゼ活性を備えるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／またはグリセロール−３−リン酸脱水素酵素活性を備えるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、当該植物内に導入することをさらに含む。この方法は、前記植物がシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、ボリジ（Ｂｏｒａｇｏ）種、カノーラ（Ｃａｎｏｌａ）、リキヌス（Ｒｉｃｉｎｕｓ）種、テオブロマ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）種、トウモロコシ（Ｚｅａ）種、ゴシッピウム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）種、ハマナ（Ｃｒａｍｂｅ）種、クフェア（Ｃｕｐｈｅａ）種、アマ（Ｌｉｎｕｍ）種、レスクェレラ（Ｌｅｓｑｕｅｒｅｌｌａ）種、リムナンテス（Ｌｉｍｎａｎｔｈｅｓ）種、リノーラ（Ｌｉｎｏｌａ）、ノウゼンハレン（Ｔｒｏｐａｅｏｌｕｍ）種、マツヨイグサ（Ｏｅｎｏｔｈｅｒａ）種、オリーブ（Ｏｌｅａ）種、アブラヤシ（Ｅｌａｅｉｓ）種、ラッカセイ（Ａｒａｃｈｉｓ）種、ナタネ（ｒａｐｅｓｅｅｄ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ）種、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ）種、ソヤ（Ｓｏｊａ）種、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）種、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）種、ベルノニア（Ｖｅｒｎｏｎｉａ）種、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）種、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ）種、オリザ（Ｏｒｙｚａ）種、カラスムギ（Ａｖｅｎａ）種、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ）種、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ）種、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）、およびイネ科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）植物ファミリーの他のメンバーからなる群から選択されるところで実施してもよい。
【００１８】
一部の実施形態において、前記方法は、導入した核酸構築物を含む植物から種子を収穫すること、および前記収穫した種子から油を抽出することをさらに含む。従って、他の実施形態は、当該方法によって産生した植物、および当該方法によって産生した植物から抽出した油を含む。
【００１９】
ＤＧＡＴ２遺伝子またはその一部を用いることによって可能である操作および成果物のいくつかは、以下の、油含有量が増加または減少した種子、超長鎖多価不飽和脂肪酸含有量が増大した油を含む種子、および超長鎖多価不飽和脂肪酸を蓄積する増大または変化した能力を示す植物を含むが、これに制限されない。
【００２０】
ＩＩ．略語
ＣａＭＶ カリフラワーモザイクウイルス
ｃＤＮＡ 相補的ＤＮＡ
ＣＥＲＶ カーネーションエッチドリングウイルス
ＣｒＤＧＡＴ２ クラミドモナス・ラインハーディ２型ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ
ＤＡＧ ｓｎ−１，２−ジアシルグリセロール
ＤＧＡＴ ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ
ＤＧＡＴ２ ２型ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ
ＤＨＡ ドコサヘキサエン酸
ＤＮＡ デオキシリボ核酸
ＥＰＡ エイコサペンタエン酸
ＧＰＡＴ グリセロール３リン酸アシルトランスフェラーゼ
ＬＰＡＴ リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ
ＯｌＤＧＡＴ２ オストレオコッカス・ルシマリヌス２型ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ
ＯｔＤＧＡＴ２ オストレオコッカス・タウリ２型ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＰｔＤＧＡＴ２ ファエオダクチルム・トリコルヌツ２型ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ
ＲＮＡ リボ核酸
ＲＮＡｉ ＲＮＡ干渉
ＲＴ−ＰＣＲ 逆転写ＰＣＲ
Ｔ３５Ｓ ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター
ＴＡＧ トリアシルグリセロール
ＴＬＣ 薄層クロマトグラフィー
Ｔｍａｓ マンノピン合成ターミネーター
Ｔｎｏｓ ノパリン合成ターミネーター
ＴｐＤＧＡＴ２ Ｔ．シュードナナ２型ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ
ＴｒｂｃＳ リブロース２リン酸カルボキシラーゼ小サブユニット終結領域
ＶＬＣＰＵＦＡ 超長鎖多価不飽和脂肪酸
【００２１】
ＩＩＩ．用語
本開示の種々の実施形態の概説を容易にするために、以下の特定の用語の説明を提供する。
【００２２】
相補的ヌクレオチド配列：配列の「相補的ヌクレオチド配列」とは、そのヌクレオチドが本開示の配列のものと相補的であり、その方向が反転している（逆平行配列である）任意のＤＮＡを意味すると理解される。
【００２３】
配列ホモロジーの程度またはパーセンテージ：「配列ホモロジーの程度またはパーセンテージ」という用語は、最適アラインメント後の２つの配列間の配列同一性の程度またはパーセンテージを表す。配列同一性のパーセンテージ（あるいは程度または同一性）は、比較ウィンドウ上で２つの最適に整列された配列を比較することによって決定されるものであって、前記２つの配列の最適アラインメントについて、比較ウィンドウにおけるペプチドまたはポリヌクレオチド配列の一部は、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。前記パーセンテージは、両配列において一致するアミノ酸残基または核酸塩基が生じている位置の数を測定してマッチした位置の数を出し、マッチした位置の数を比較ウィンドウにおける位置の総数で割り、かつ当該結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを出すことによって算出される。
【００２４】
単離および／または精製した相同配列：「単離および／または精製した相同配列」とは、ヌクレオチド配列の塩基またはポリペプチド配列のアミノ酸と、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、または９９．７％のパーセンテージ同一性を有する単離および／または精製した配列を意味すると理解される。このパーセンテージは完全に統計的なものであり、無作為とそれらの長さ全体にわたる２つのヌクレオチド配列との間で差をもたらす可能性がある。例えば、シングル配列アライメントおよびマルチプル配列アライメントを行うように設計されたコンピュータープログラムによって、配列同一性を測定することができる。当業者によって理解されるように、この開示はコドン使用の縮重を包含すると理解されるであろう。さらに、ポリペプチドのアミノ酸配列において、前記ポリペプチドの構造または作用を崩壊させることなく保存的置換が行われてもよいと当業者によって理解されるであろう。保存的置換は、お互いに対して類似した疎水性、極性、およびＲ鎖長を有するアミノ酸を置換することによって、熟練した技術者によって達成される。また、異なる種由来の相同タンパク質の整列した配列を比較することによって、コードされたタンパク質の基本的作用を変えることなく種間で変異しているアミノ酸残基を位置づけることによって、保存的置換を特定してもよい。
【００２５】
単離した：当業者によって理解されるように、「単離した」とは、それらの天然環境から「単離」されているポリペプチドを表す。
【００２６】
ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または核酸配列：「ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または核酸配列」とは、単量体および二量体の（いわゆる、並行した）形態の２本鎖または１本鎖のＤＮＡ、ならびに前記ＤＮＡの転写産物の両方を意味すると理解されるであろう。
【００２７】
配列同一性：２つのアミノ酸またはヌクレオチドの配列におけるアミノ酸またはヌクレオチドの残基の配列が、以下に記載するように最大の一致を目的として整列させた時に同じである場合、前記２つの配列は「同一」であると言われる。２つ（またはそれより多く）のペプチドまたはポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的に、配列類似性について局所領域を同定および比較するために、断片または「比較ウィンドウ」にわたって最適に整列された２つの配列の配列を比較することによって行われる。比較のための配列の最適な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所的ホモロジーアルゴリズム：Ａｄ．Ａｐｐ．Ｍａｔｈ ２：４８２（１９８１）によって、ＮｅｄｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのホモロジーアラインメントアルゴリズム：Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）によって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似法の探索、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：２４４４（１９８８）によって、これらアルゴリズムのコンピュータによる実施（ウィスコンシン・ジェネティクス・ソフトウェアパッケージのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ，ジェネティクス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ：ＧＣＧ），５７５サイエンスＤｒ．，マディソン，ウィスコンシン州）によって、または目視検査によって行われてよい。
【００２８】
前記で付された配列同一性の定義は、当業者によって用いられるであろう定義である。定義それ自体はいかなるアルゴリズムの支援も必要とせず、前記アルゴリズムは、配列同一性の算出よりもむしろ、配列の最適アラインメントを達成するために唯一有用である。
【００２９】
前記で付された定義から、要するに、２つの比較される配列間の配列同一性について、明確かつ唯一の数値であって、最高または最適なアラインメントに対して得られる数値に相当する数値が存在するということになる。
【００３０】
ｈｔｔｐ：／／ｗｏｒｌｄｗｉｓｅｗｅｂ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂｌ２．ｈｔｍｌのウェブサイトで入手可能であり、２つの配列間の同一性を比較および決定するために、本発明者らおよび一般的に当業者によって習慣的に用いられるソフトウェアであるＢＬＡＳＴ ＮまたはＢＬＡＳＴ Ｐ「ＢＬＡＳＴ２配列」において、比較される配列の長さに依存するギャップコストは、前記ソフトウェアによって直接選択される（すなわち、＞８５の長さに対する置換行列ＢＬＯＳＵＭ−６２には１１．２）。
【００３１】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション：ヌクレオチド配列に関するストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションとは、相補的ＤＮＡの２つのフラグメント間でのハイブリダイゼーションを保持させ得るように選択された温度およびイオン強度の条件下でのハイブリダイゼーションを意味すると理解される。他の生物、例えば植物から得られる本明細書において記載されるＤＧＡＴ２遺伝子のホモログは、前記ホモログを含む適切なライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができ、前記スクリーニングは、本明細書において開示される特定のＤＧＡＴ２遺伝子のヌクレオチド配列、またはその一部もしくはプローブに関して行われるものであり、あるいはＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の配列アラインメント検索プログラムを用いた配列ホモロジー検索によって同定することができる。
【００３２】
ＩＩＩ．藻類由来のＤＧＡＴ２による脂肪酸量の改変
Ａ．概説
アブラギリおよびトウゴマ由来のＤＧＡＴ２に関する最近の研究は、独特な脂肪酸を含む植物において、ＤＧＡＴ２は独特な脂肪酸を種子貯蔵油に導くのに重要な役割を担っている可能性があることを示唆している。脂肪種子における植物脂質生合成の遺伝子改変において、ＤＧＡＴ２は潜在的標的になり得ると同時に、最近特徴づけされた前記酵素は、共役脂肪酸であるエレオステアリン酸（アブラギリＤＧＡＴ２）およびリシノール酸（トウゴマＤＧＡＴ２）の利用にそれぞれ貢献している。どちらの酵素（アブラギリＤＧＡＴ２またはトウゴマＤＧＡＴ２）も、商業的に所望される長鎖オメガ−３多価不飽和脂肪酸であるエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）内への取り込みに関与していない。
【００３３】
海の中心的な珪藻類であるＴ．シュードナナは、ＴＡＧ内に長鎖オメガ−３多価不飽和脂肪酸であるＥＰＡおよびＤＨＡを生成および蓄積することができ、高レベルの超長鎖多価不飽和脂肪酸（ＶＬＣＰＵＦＡ）が蓄積した油の良好な供給源である。そのため、Ｔ．シュードナナのジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２（ＴｐＤＧＡＴ２）遺伝子は、調査および特徴づけされた。驚くべきことに、アブラギリまたはトウゴマ由来のＤＧＡＴ２とは異なり、ＴｐＤＧＡＴ２はＴＡＧ内に超長鎖多価不飽和脂肪酸を効率的に取り込むことができることが発見された。ＴｐＤＧＡＴ２遺伝子を用いてＴ．シュードナナおよび関連する藻類の種由来のポリヌクレオチド配列を調べることによって、藻類におけるＤＧＡＴ２ファミリーの他のメンバーが同定された。従って、藻類ＤＧＡＴ２遺伝子は、遺伝子組換えツールにおいてならびに種子内のＴＡＧの組成および蓄積の改変に対して有用であると判断された。
【００３４】
Ｂ．２型ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ活性を備えるＴ．シュードナナＤＧＡＴ２に相同なポリペプチド
ＮＣＢＩタンパク質データベース等のタンパク質データベースをＢＬＡＳＴ等の検索エンジンを用いて検索することによって、全長Ｔ．シュードナナＤＧＡＴ２に相同であるタンパク質を発見することができる。それらは合理的設計によって同定されてもよい。合理的設計の方法は、所望のポリペプチド配列の長さの範囲内で保存的アミノ酸置換を同定すること、および当該コードされるタンパク質においてそれらの置換を引き起こすことを含む。
【００３５】
Ｔ．シュードナナＤＧＡＴ２の全長アミノ酸配列に関してＮＣＢＩタンパク質データベース（ＢＬＡＳＴＰ）を検索すると、ＴｐＤＧＡＴ２に有意な配列ホモロジーを有するポリペプチドが明らかとなり、そのいくつかはＴｐＤＧＡＴ２とともに整列して図２に示されている。保存されている２型ジアシルグリセロールトランスフェラーゼドメインは図２に整列されており、ＴｐＤＧＡＴ２におけるアミノ酸残基２３６〜３６５と示されている他のＤＧＡＴ２ポリペプチド由来の相当する残基とからなる。前記保存されている２型ジアシルグリセロールトランスフェラーゼドメインは、ＮＣＢＩの保存されているドメインのデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｃｄｄ／ｃｄｄ．ｓｈｔｍｌ）内に記載されている。この保存されているドメインに相同であるポリペプチド配列は、それが含まれるタンパク質にＴｐＤＧＡＴ２の２型ジアシルグリセロール活性を付与する。
【００３６】
相同配列を有するポリペプチドは、それらのホモログと同じ構造及び作用を示すように設計され得ると当業者によって理解される。熟練した技術者によって、図２の配列アラインメントにより本開示の実施例に具体的に記載されているものと相同なポリペプチドを設計することが可能である。そのような相同なポリペプチドは、本開示のポリペプチドへの保存的置換を含むもの、例えば配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、または配列番号：１９のポリペプチドであってよい。相同タンパク質がＴｐＤＧＡＴ２と同様の２型ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ活性を実質的に示すかどうかを判定する簡易な実験アッセイは当業者に公知である。そのようなアッセイは、過度に時間のかかるものでなく、高価でなく、または技術的に難しいものでない。ＴｐＤＧＡＴ２によって生成されたＴＡＧを検出するために、例えば従来のガスクロマトグラフィーを用いてもよい。これらのアッセイのいくつかは、以下の詳細な実施例に記載されている。
【００３７】
Ｃ．形質転換するためのＤＧＡＴ２活性を有する核酸分子の使用
開示されている実施形態は、天然環境で採取されたゲノム、すなわち、Ｔ．シュードナナ、クラミドモナス・ラインハーディ、オストレオコッカス・ルシマリヌス、オストレオコッカス・タウリ、またはファエオダクチルム・トリコルヌツムの天然ゲノムのヌクレオチド配列を含まないと理解すべきである。一部の実施形態は、例えばイオン交換クロマトグラフィー、分子サイズに基づいた排除による、またはアフィニティーによる、または種々の溶媒中の溶解度に基づいた分画法等の分離方法から始めることによって、あるいは増幅、クローニング、およびそれにより当該配列がベクターによって運搬されることが可能となるサブクローニング等の遺伝子操作の方法から始めることによって、単離、精製または部分的に精製することが可能である配列に関する。
【００３８】
さらに、前記に開示されている配列にハイブリダイズする核酸分子が含まれる。ハイブリダイゼーションの条件は、開示されているＤＧＡＴ２分子をコードする核酸分子と少なくとも９０％、９５％、または９７％の同一性がある場合にハイブリダイゼーションが生じるという点においてストリンジェントであってよい。ストリンジェントな条件は、公知のサザンハイブリダイゼーションに用いられているもの、例えば５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸３ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０マイクログラム／ミリリッターの変性、せん断されたサーモンスパームＤＮＡを有する溶液中で一晩４２℃にてインキュベーション、その後０．１×ＳＳＣ中で約６５℃にてハイブリダイゼーション支持体の洗浄等を含んでよい。他の公知のハイブリダイゼーション条件が周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）に記載されている。
【００３９】
ＤＮＡの単離およびクローニングは、十分に確立されている。同様に、従来技術によって、単離した酵素をコードするＤＮＡをベクター内に挿入および酵母細胞内に形質転換することができる。しかしながら、ＶＬＣＰＵＦＡを効率的に使用し得るＤＧＡＴ２遺伝子がクローニングされていなかったため、ＤＧＡＴ２活性を調節することによる遺伝子改変の可能性に取り組むことは不可能であった。本発明者らは、ＤＧＡＴ２がＴＡＧ合成に関与し、かつＤＧＡＴよりも効率的にＶＬＣＰＵＦＡを利用することを確認した。
【００４０】
ＤＧＡＴ２をコードする核酸分子、例えば配列番号：２、配列番号：１６、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４１、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、または配列番号：６１と少なくとも８０％の同一性を有する配列を、生物、例えば植物内に形質転換してもよい。そのような相同配列は配列番号：２１〜２４によって例示されている。当該技術分野において公知のように、遺伝子および遺伝子構築物を生物、例えば植物内に導入し得る多数の方法があり、形質転換および組織培養の技術の組み合わせは、遺伝子組換え生物、例えば作物を作り出すための効果的戦略内に上手く取り入れられている。これらの方法は、他の場所（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，１９９１；Ｖａｓｉｌ，１９９４；ＷａｌｄｅｎおよびＷｉｎｇｅｎｄｅｒ，１９９５；Ｓｏｎｇｓｔａｄ，ｅｔ ａｌ．，１９９５）で記載されており、当業者に周知である。例えば、減圧浸潤（Ｂｅｃｈｔｏｌｄ，ｅｔ ａｌ．，１９９３）または有傷接種（Ｋａｔａｖｉｃ，ｅｔ ａｌ．，１９９４）によってアグロバクテリウムを介して行われるシロイヌナズナの形質転換に加えて、アグロバクテリウムＴｉ−プラスミドを介して行われる形質転換（例えば、胚軸（ＤｅＢｌｏｃｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）または子葉柄（Ｍｏｌｏｎｅｙ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）の創傷感染）、粒子衝突／微粒子銃法（Ｓａｎｆｏｒｄ，ｅｔ ａｌ．，１９８７；Ｎｅｈｒａ，ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９４）、またはポリエチレングリコールを介したプロトプラスト形質転換法（Ｒｈｏｄｅｓ，ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）を用いることによって、他の植物および作物種を形質転換することが同様に可能であることに当業者は確実に気づくであろう。
【００４１】
植物において、新規の遺伝子を伝達するまたは既存の遺伝子の発現を変えるための遺伝子操作によって達成されている植物代謝に対して成功した改変の例が多数ある。作物の性能（例えば、種子油または塊茎デンプンの含有量／組成；食物改良；除草剤、疾病、または害虫抵抗性；重金属耐性等）を改良するために、農学的に重要な多数の植物種の中に遺伝子を導入することが現在日常的に可能である（ＭａｃＫｅｎｚｉｅおよびＪａｉｎ，１９９７；Ｂｕｄｚｉｓｚｅｗｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，１９９３；ＫｉｓｈｏｒｅおよびＳｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，１９９３）。
【００４２】
当業者に明らかであり、他の場所（Ｍｅｙｅｒ，１９９５；Ｄａｄａ，ｅｔ ａｌ．，１９９７）で記載されているように、構成的プロモーター（例えば、ＣａＭＶ３５Ｓに基づくもの）を用いることによって、あるいは特定の細胞、組織（例えば、発達中の種子の子葉における導入遺伝子の発現に対するナピンプロモーター）、器官（例えば、根）に、特定の発達段階に、または特定の外部刺激（例えば、熱ショック）に応答して、遺伝子発現を標的化することができるプロモーターを用いることによって、導入遺伝子の発現についての任意に意図した上方または下方制御を管理するために、植物プロモーターを利用することができる。
【００４３】
本明細書において使用するためのプロモーターは、誘導可能な、構成的な、または組織特異的な、あるいは前記特性の種々の組み合わせを有するものであってよい。有用なプロモーターは、構成的プロモーター、例えばカーネーションエッチドリングウイルス（ＣＥＲＶ）、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、またはとりわけ２つのＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを直列に含んでいる２倍に増強したカリフラワーモザイクウイルスプロモーター（「ダブル３５Ｓ」プロモーターと称される）を含むが、これに制限されない。
【００４４】
特定の状況では、構成的プロモーターの代わりに組織特異的または発生学的に調節されるプロモーターを用いるのが望ましい可能性がある。組織特異的プロモーターは、他の組織の発現に影響を及ぼすことなく、特定の組織において過剰発現を可能にする。実例として、種子組織における酵素の過剰発現に用いられるプロモーターは、１９９２年１０月２９日に公表されたＰＣＴの国際公開公報第９２／１８６３４号に記載されているようなＡＣＰプロモーターである。
【００４５】
当該プロモーターおよび終結調節領域は、宿主の植物細胞内で機能的であってもよく、前記植物細胞および遺伝子に対して異種（すなわち、天然に存在しない）または同種（前記宿主植物種に由来する）であってもよい。用いることができる適切なプロモーターは、前記に記載されている。
【００４６】
前記終結調節領域は、プロモーターが得られた遺伝子または別の遺伝子の３’領域に由来してもよい。用いることができる適切な終結調節領域は当該技術分野において周知であり、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）・ノパリン合成ターミネーター（Ｔｎｏｓ）、Ａ．ツメファシエンスマンノピン合成ターミネーター（Ｔｍａｓ）、およびＣａＭＶ３５Ｓターミネーター（Ｔ３５Ｓ）、エンドウリブロース２リン酸カルボキシラーゼ小サブユニット終結領域（ＴｒｂｃＳ）、またはＴｎｏｓ終結領域を含んでよい。そのような遺伝子構築物は、アグロバクテリウムを介した宿主植物内への形質転換、および増加したイソプレノイド量についてのスクリーニングによって、活性について適切にスクリーニングすることができる。
【００４７】
適切には、当該遺伝子に対するヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）（米国保健社会福祉省の登録商標）ヌクレオチドデータベースから抽出し、かつ切断しない制限酵素について検索してもよい。ＰＣＲプライマー中にこれらの制限酵素認識部位を組み込むこと等の従来の方法またはサブクローニングによって、これらの制限部位を当該遺伝子に付加してもよい。
【００４８】
好ましくは、本明細書において使用するためのＤＮＡ構築物はベクター、最適には適切な宿主（植物）細胞における発現に適した発現ベクター内に包含されている。導入したＤＮＡ配列を含む植物を産生することができる任意のベクターが十分であると理解されるであろう。
【００４９】
適切なベクターは当業者に周知であり、Ｐｏｕｗｅｌｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８６）等の一般的な技術参考文献に記載されている。特に適切なベクターは、Ｔｉプラスミドベクターを含む。
【００５０】
宿主細胞内にＤＮＡ構築物を導入するための形質転換法は当該技術分野において周知であり、マイクロインジェクション、ポリエチレングリコールの使用、エレクトロポレーション、高速弾道貫通（ｈｉｇｈ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）、またはアグロバクテリウムを介した形質転換等の方法を含む。植物細胞または植物の形質転換後、所望のＤＮＡが組み込まれているそれらの植物細胞または植物を、抗生物質耐性、除草剤抵抗性、アミノ酸類似体に対する寛容等の方法によって、または表現型マーカーを用いることによって選択することができる。
【００５１】
当該植物細胞が遺伝子発現の増加を示すかどうかを判定するために、種々のアッセイ、例えばノーザンブロッティングまたは定量的逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いてもよい。従来の方法によって、形質転換された細胞から遺伝子導入植物全体を再生してもよい。同型株を作り出すために、改良されたイソプレノイド量を有するそのような遺伝子導入植物を繁殖および自家授粉させてもよい。そのような植物は、導入した特性に対する遺伝子を含む種子を産生し、選択された表現型を生じるであろう植物を産生するように成長させることができる。
【００５２】
本開示に従った改変に特に好ましい植物は、シロイヌナズナ、ボリジ（ボリジ種）、カノーラ、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）（リキヌス種）、カカオ豆（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）（テオブロマ種）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）（トウモロコシ種）、綿（ゴシッピウム種）、ハマナ種、クフェア種、亜麻（アマ種）、レスクェレラ種、およびリムナンテス種、リノーラ、ナスタチウム（ノウゼンハレン種）、マツヨイグサ種、オリーブ（オリーブ種）、ヤシ（アブラヤシ種）、ピーナッツ（ラッカセイ種）、ナタネ、ベニバナ（ベニバナ種）、大豆（ダイズ種およびソヤ種）、ヒマワリ（ヒマワリ種）、タバコ（タバコ種）、ベルノニア種、小麦（コムギ種）、大麦（オオムギ種）、米（オリザ種）、オートムギ（カラスムギ種）、モロコシ（モロコシ種）、ライ麦（ライムギ種）、またはイネ科植物ファミリーの他のメンバーを含む。
【００５３】
一部の実施形態を用いて、油料種子作物から生成された油料種子の産出量または組成を改変する。油料種子作物は、食用のまたは産業的に有用な油を商業的に重要な産出量で作り出すことができる植物種であり、前記に挙げた植物種の多くを含む。そのような油料種子作物は当業者に周知である。
【００５４】
一実施例において、ＤＧＡＴ２をコードするヌクレオチド配列で形質転換した植物を栽培する。遺伝子導入植物の種子を収穫して、前記種子の脂肪酸を抽出する。抽出した脂肪酸を、その後の組成物、例えば医薬組成物、栄養補助組成物、または食品組成物内への取り込みに用いる。
【００５５】
特定の実施形態において、形質転換されるべき植物に関して、油の産出を増大または変化させる他の方法（例えば、植物における発現のために、例えばＢｒａｓｓｉｃａピルビン酸脱水素酵素キナーゼ活性を有するペプチドをコードする核酸配列（例えば、Ｍａｒｉｌｌａ，ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第７，２１４，８５９号（２００７年５月８日）、Ｚｏｕ，ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第６，５００，６７０号（２００２年１２月）、およびＲａｎｄａｌｌ，ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第６，２５６，６３６号（２００１年７月）を参照）、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するペプチドをコードする核酸配列（例えば、Ｚｏｕ，ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第７，０１５，３７３号および米国特許第６，５００，６７０号（２００２年１２月）を参照）、およびグリセロール−３−リン酸脱水素酵素活性を有するペプチドをコードする核酸配列（例えば、米国特許第７，１１２，７２４号を参照）、ならびにその組み合わせを含む群から選択される核酸配列を取り込むこと）を用いてもよい。
【００５６】
実施形態は、本明細書において詳細に記載されている具体的な実施例に加えて、種々の改変および代替的形態を受け入れる余地がある。従って、実施形態は開示されている特定の形態に制限されない。むしろ、本開示の範囲は、以下の添付した特許請求の範囲に含まれるすべての改変、同等物、および代替物を包含する。
【実施例】
【００５７】
実施例１：ＤＮＡ操作
ＤＮＡの調製、プラスミドの増殖、および単離には、標準的方法および手順を用いた（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）。配列決定は、Ｔａｑ ＤｙｅＤｅｏｘｙ（商標）ターミネーターサイクルシークエンシングキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のモデル３７３Ａ ＤＮＡシークエンシングシステムで行った。当該ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を、ＢＬＡＳＴプログラムを用いることによって、データバングで入手可能な配列と比較した（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，１９９０）。当該技術分野において公知であるように、ＮＣＢＩのヌクレオチドおよびタンパク質データベースにおける他の脂肪酸ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子とのホモロジーに基づいて、ＤＧＡＴ２クローンを同定した。
【００５８】
実施例２：ＴｐＤＧＡＴ２を発現することによって、酵母形質転換体においてｉｎ ｖｉｖｏ形成されたトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）
ＤＧＡＴ２遺伝子をｐＹＥＳ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）内に挿入した。当該構築物をシークエンシングによって確認し、出芽酵母サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の株Ｈ１２４６ＭＡＴ−αを形質転換するために、ｐＹＥＳ２．１／ＴｐＤＧＡＴ２を用いた。この変異株は４重の変異体である（ＤＧＡＴ−，ＰＤＡＴ−，ＡＳＡＴ−，ＡＳＡＴ２−）。プラスミドＤＮＡを推定される形質転換体から単離し、ｐＹＥＳ２．１／ＴｐＤＧＡＴ２の存在をサザン解析によって確認した。ベクターのみ（ｐＹＥＳ２．１）を含むＨ１２４６ＭＡＴ−α形質転換体をコントロールとして用いた。シロイヌナズナＤＧＡＴ１で形質転換したＨ１２４６ＭＡＴ−αはポジティブコントロールとして働いた。
【００５９】
シングルコロニーを、２０ｍＬのＳＤ培地（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｖｏｌ．２，ｐ．１３．１．３によって記載されているような、グルコースを含み、ウラシルを含まない合成デキストロース培地）中で回転式シェーカー（２７０ｒｐｍ）上で２８℃にて一晩培養した。一晩培養物からの細胞を沈殿させ、５０ｍＬの発現誘導用の培地（ガラクトースを含み、ウラシルを含まないＳＤ培地）中に再懸濁した。細胞を２７０ｒｐｍで振とうさせながら、２８℃にて再びインキュベーションし、４〜６時間後に回収した。ＧＡＬで誘導した酵母形質転換体を、５，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって回収し、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１ｍＭ ＤＴＴを含む１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）中に再懸濁した。
【００６０】
図９を参照すると、ネガティブコントロールである空ベクターではＴＡＧが生成されなかった（レーン８）のに対し、ポジティブコントロール（レーン１）ではＴＡＧバンドを示した。ＤＧＡＴ２を含むベクターのそれぞれ（レーン２〜６）では、ＤＧＡＴ２がＴＡＧを合成する能力を有することを裏付けるＴＡＧバンドを示した。レーン８の右側のレーンには、ＴＡＧマーカーとして用いられるＴＡＧ標準物質をロードした。
【００６１】
実施例３：ＴｐＤＧＡＴ２の基質選択性
Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）によって記載されているように、酸洗浄したガラスビーズを用いて細胞溶解物を調製した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）アッセイを用いて酵母溶解物中のタンパク質を測定し、各溶解物中のタンパク質量を標準化し、アリコート（タンパク質２５０μｇ）をＤＧＡＴ２活性についてアッセイした。
【００６２】
３０℃の水槽中で１００回転／分で１０分間振とうさせながら、ＤＧＡＴアッセイをｐＨ７．４にて行った。アッセイ混合物（最終容量０．５ｍＬ）は、１００μｇ溶解物タンパク質、９０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、２００μＭ ｓｎ−１，２ジオレイン、およびアシル基供与体としての１８μＭ１４ＣアシルＣｏＡ（２ｎＣｉ／ｎｍｏｌ特異的活性）を含んだ。ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸（７０：３０：１ ｖ／ｖ／ｖ）中で展開させたシリカゲルＧプレート上でのＴＬＣによって１４Ｃ標識されたＴＡＧを単離し、Ｗｉｎ−Ｓｃａｎ２Ｄ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏｓｃａｎ社，ワシントンＤＣ，米国）を用いたＢｉｏｓｃａｎ ＡＲ−２０００放射性ＴＬＣスキャナー上で、放射性標識されたＴＡＧバンドを可視化し、当該バンドを切り出して、Ｔａｙｌｏｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）によって記載されているように定量化した。
【００６３】
実施例４：ＴｐＤＧＡＴ２形質転換体の脂肪酸組成
Ｓ．セレヴィシエ株Ｈ１２４６ＭＡＴ−αを、シロイヌナズナ／ｐＹＥＳ２．１またはＴ．シュードナナ／ｐＹＥＳ２．１で形質転換した。形質転換体を３日間２８℃にて培養し、ガラクトースによって誘導した。前記形質転換体を、処理なし（コントロール）、５０ｕＭ ＤＨＡまたは１５０ｕＭ ＤＨＡで処理した。ＡｔＤＧＡＴ１／ｐＹＥＳ２．１を含む３つの形質転換体およびＴｐＤＧＡＴ２／ｐＹＥＳ２．１を含む３つの形質転換体についての脂肪酸プロファイルを、従来のガスクロマトグラフィー分析に基づく表１に示した。
【００６４】
脂肪酸を１６：０、１６：１、１８：０、１８：１（オレイン酸）、および２２：６（ＤＨＡ）として同定し、それぞれの組成を総脂肪酸に対するパーセンテージで表している。ＤＨＡの発現は、コントロール株の０から１５０μＭ ＴｐＤＧＡＴ２／ｐＹＥＳ２．１では６．０１％に増加し、１５０μＭ ＡｔＤＧＡＴ／ｐＹＥＳ２．１のものの２倍以上であった（表１）。これらの結果は、ＴｐＤＧＡＴ２がＤＧＡＴ１よりもＤＨＡ脂肪酸をより効率的に利用することをさらに裏付けた。
【００６５】
表１に示すように、脂肪酸組成に関して、ＤＧＡＴ２ ｃＤＮＡを含む変異株は飽和物全体の減少および不飽和物の増加を示した。そのような変化はすべて、「より健康な」油のプロファイルに向かうものであり、カノーラ、アブラナの他の油料種子、および他の食用油料作物に直接応用して、同様の油組成の改良をもたらすことができる。
【００６６】
（表１） 酵母変異体Ｈ１２４６ＭＡＴ−αにおける、ＤＧＡＴ２およびＤＧＡＴ１によって発現されるＴＡＧの脂肪酸組成
【００６７】
実施例５：野生型シロイヌナズナにおけるＤＧＡＴ２ ｃＤＮＡの過剰発現
全長ＤＧＡＴ２ ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅のための鋳型として用いる。フラグメントを制限エンドヌクレアーゼ消化によって切断し、ベクターの相当する部位にライゲーションする。構築物の完全性を、シークエンシングによって確認する。
【００６８】
前記ベクターをＡ．ツメファシエンス内に導入し、野生型シロイヌナズナを形質転換するために用い、後代を分析する。
【００６９】
実施例６：種子特異的発現のためのＤＧＡＴ２ ｃＤＮＡ植物形質転換ベクターの構築
配列の各末端に新しい制限部位を提供するために、プライマーとともに、全長ＤＧＡＴ２ ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅のための鋳型として用いた。ＰＣＲプロファイルは以下のとおりである：９４℃１分；９４℃３０秒，５５℃３０秒，７２℃１分を３０サイクル；および７２℃５分。その後、ＰＣＲ産物をＰＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にライゲーションする。フラグメントを切断し、ベクターの相当する部位にライゲーションする。構築物の完全性を、シークエンシングによって確認する。
【００７０】
実施例７：植物ＤＧＡＴ２ベクター構築物を用いたアグロバクテリウムの形質転換
エレクトロコンピテント・アグロバクテリウム細胞ＧＶ３１０１（ｐＭＰ９０）株を以下のとおりに調製する。アグロバクテリウム培養物を２ＹＴ中で２４〜４８時間増殖させ、６００ｎｍにおける吸光度が０．５〜０．７に到達した時点で、細胞を氷上で冷やし、遠心分離（ＧＳＡローターで５，０００×ｇ，１０分，４℃）によって沈殿させる。沈殿物を１、０．５、および０．０２容量の冷却した１０％滅菌グリセロール中で洗浄し、０．０１容量の冷却した１０％グリセロールに再懸濁する。その後、当該エレクトロコンピテント細胞を液体Ｎ２中で冷凍し、−７０℃で保存する。メーカーの使用説明書に従って、２０〜５０ｎｇの形質転換ＤＮＡを用いたエレクトロポレーションによって、前記アグロバクテリウム細胞を形質転換し、選択培地（５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ）上にプレーティングし、２８℃にて一晩インキュベーションする。形質転換された単一細胞を、５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび２５μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含む５ｍＬ ＬＢ中で一晩増殖させる（２８℃，２２５ｒ．ｐ．ｍ）。ＤＮＡの抽出および精製を行う。植物の形質転換前に、構築物の忠実度をＤＮＡシークエンシングによって再チェックする。
【００７１】
実施例８：シロイヌナズナの形質転換
シロイヌナズナの種子を１６時間・明／８時間・暗の管理の中、蛍光照明（１２０μＥ・ｍ−２Ｓ−１）の下で２２℃にて栽培する。４〜６個の植物を、湿らせたＴＥＲＲＡ−ＬＩＴＥ ＲＥＤＩ−ＥＡＲＴＨ（Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ＆Ｃｏ．Ｃａｎａｄａ社，エイジャックス，オンタリオ州，カナダ）中で１０ｃｍ２植木鉢で育てる。植木鉢中の土壌混合物が接種培地中に落下するのを防ぐために、土壌をプラットホームのように積み上げて種子を頂上に植え付け、植木鉢全体をナイロン製のウィンドウスクリーンで覆い、ゴム製のバンドで固定する。最初の花が開花し始めた時点で、アグロバクテリウム懸濁液中で植物を減圧浸潤する。
【００７２】
アグロバクテリウムを増殖させるために、５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび２５μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含むＬＢ培地中で５ｍＬ懸濁液を２８℃にて一晩培養する。浸潤の前日に、この「種子培養物」を、５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび２５μｇ／ｍＬゲンタマイシンを補充した２５０ｍＬのＬＢ培地を含む４つのフラスコに分ける。これらの培養物を２８℃にて一晩培養する。翌朝、６００ｎｍにおける吸光度（およそ＝１．０）をチェックした後、遠心分離（ＧＳＡローターで５，０００×ｇ，１０分，室温）によって細胞を回収し、浸潤培地（水中に５％スクロース，０．００５％ Ｓｉｌｗｅｔ−７７）に再懸濁して、６００ｎｍで０．８の吸光度を得る。
【００７３】
アグロバクテリウム懸濁液をビーカーに注ぎ、花およびボルトが浸水するように鉢植えされている植物を前記ビーカーの中に逆さにする。前記ビーカーを大きなベルジャー内に置き、茎表面上で気泡が形成され、かつ溶液がわずかに泡立ち始めるまで、真空ポンプを用いて真空に吸引し、その後真空を急速に解放する。必要な時間および圧力は実験装置によって異なるが、良好な浸潤は、均一に暗くなり水浸しになる組織のように、目に見えて明らかである。植木鉢を前記ビーカーから取り出して、プラスチック製のトレイの中の側に置き、プラスチック製のドームで覆って湿度を維持する。翌日、植物から覆いを取り外して真っ直ぐに立て、Ｋａｔａｖｉｃ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）によって記載されているように、連続的な光条件下、栽培箱中でおよそ４週間成長させる。長角果が成熟して乾燥した時点で、種子を収穫し、陽性の形質転換体について選択する。
【００７４】
実施例９：セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）の形質転換
形質転換は基本的に、Ｍｏｌｏｎｅｙ，ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ８：２３８−２４２によって記載されているように実施する。
【００７５】
Ａ．ツメファシエンス株ＧＶ３１０１／ｐＭＰ９０（Ｋｏｎｃｚ Ｃ．＆Ｓｃｈｅｌｌ，Ｊ．，１９８６，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０４：３８３−３９６）を、形質転換の研究に用いる。ＬＢ培地（Ｄｉｆｃｏ，米国）（１００ｍＬ）中の定常期の細菌培養物を遠心分離によって回収し、抗凍結剤としての１％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）（Ｓｉｇｍａ社，米国）を含む１０ｍＬの新しいＬＢ培地中に再懸濁する。細菌のアリコートを、２％スクロース、５０μＭアセトシリンゴン，ｐＨ５．６を含む２ｍＬのブレインハートインフュージョン培地（Ｄｉｆｃｏ，米国）に添加し、２８℃にて一晩インキュベーションする形質転換に用いるまで、２００μＬのアリコートを−２０℃で保存する。細菌細胞の密度は、およそ１×１０９ 細胞／ｍＬである。
【００７６】
Ｍｏｌｏｎｅｙ，ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．８：２３８−２４２の方法に従って、子葉移植片を植物形質転換ベクターを含むアグロバクテリウムに暴露する。前記移植片の葉柄の切断面を細菌培養物に短時間浸す。切断面が培地に接触するように、前記移植片を共存培養培地の中に入れる。１０個の移植片を、それぞれ１００×１５ｍｍのペトリプレートに置く。共存培養プレートをＳＴＲＥＴＣＨ’Ｎ ＳＥＡＬ（商標）プラスチック製の包装物で密封する。種子の発芽工程に関する前述のような温度および光周期の条件下で、プレートを３日間培養キャビネット内でインキュベーションする。その後、移植片を選択培地に移す。
【００７７】
選択培地において３〜４週間後、再生している若芽（推定上の形質転換体）を切り取り、継続培養のために新しい選択培地に移す。新芽が１．５〜２．０ｃｍの長さに到達した時点で、それらを発根培地に移す。基本的に、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ａ．（１９８７），Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．５：３８７−４０５によって記載されているように、推定上の遺伝子導入された新芽をｇｕｓ遺伝子の発現についてスクリーニングする。青色の染色の存在は、形質転換の証拠として見なされる。
【００７８】
形質転換の確認を、カナマイシン上での選択、サザンブロッティング、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、および後代分析によって立証する。
【００７９】
実施例１０：推定上の形質転換体（遺伝子導入植物）の選択および遺伝子導入植物の解析
各構築物に対して、種子を大量に収穫する。種子を２０％漂白剤および０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む溶液中に種子を２０分間浸すことによって表面滅菌し、その後滅菌水で３回洗浄する。滅菌した種子を、滅菌した０．１％Ｐｈｙｔａｇａｒ（５００〜１，０００個の種子につき約１ｍＬのＰｈｙｔａｇａｒ）中に室温にて再懸濁し、および１５０×１５ｍｍのカナマイシン選択プレート上に２，０００〜４，０００個の種子を含む容量を塗布することによってプレーティングする。プレートを照明をつけずに寒い中で２日間インキュベーションし、７〜１０日間制御された環境の中で（１６時間・明／８時間・暗の管理の中、蛍光照明（１２０μＥ・ｍ−２Ｓ−１）の下で２２℃にて）栽培する。選択培地は、１／２ＭＳＧ培地、０．８％Ｐｈｙｔａｇａｒ、３％スクロース、５０μｇ／ｍＬカナマイシン、および５０μｇ／ｍＬチメンチンを含む。ペトリプレートおよび蓋を、Ｍｉｃｒｏｐｏｒｅ（商標）外科用テープ（３Ｍ カナダ，ロンドン，ＯＮ，カナダ）で密封する。７〜１０日後、緑葉を有し、かつ培地中で根をしっかりと定着させている薬剤耐性植物を形質転換体として同定し、葉３〜５枚の段階で、選択された形質転換体を非常に湿らせた土壌混合物で満たした湿地の中に移植する。形質転換体を成熟させ、成熟した種子（Ｋａｔａｖｉｃ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）で定義されているＴ２世代）を個々の植物から収穫し、さらに分析する。
【００８０】
ゲノムＤＮＡを個々のＴ１植物から単離する。前記Ｔ１形質転換体におけるｃＤＮＡまたは遺伝子の存在をそれぞれ確認するために、ＰＣＲ増幅を行う。挿入したフラグメントのシングルコピーを含む形質転換体を選択するために、サザン分析を行う。ＤＮＡサンプルを制限酵素で消化し、１％アガロースゲル上での電気泳動によって分解し、ナイロン製のフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋，アメルシャム社）を用いてサザンブロッティングを行う。α−［３２Ｐ］ｄＣＴＰ（ＮＥＮ／ＤｕＰｏｎｔ）で標識したＤＧＡＴ２ ｃＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる。ハイブリダイゼーションを６０℃で行う。その後、前記フィルターをＫｏｄａｋ Ｘ−ＯＭＡＴ−ＡＲフィルムに露光する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１５と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む単離または精製したポリペプチド。
【請求項２】
配列番号：１と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の単離または精製したポリペプチド。
【請求項３】
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する、請求項１に記載の単離または精製したポリペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載の単離または精製したポリペプチドをコードする、単離または精製した核酸配列。
【請求項５】
ベクター内に存在する、請求項４に記載の核酸配列。
【請求項６】
請求項４に記載の核酸配列を含む遺伝子導入植物。
【請求項７】
前記核酸配列を欠いている植物における量と比較して、種子中の多価不飽和脂肪酸の量が変化している、請求項４に記載の核酸配列を含む遺伝子導入植物。
【請求項８】
前記植物中の脂肪酸が約７０％以上の多価不飽和脂肪酸である、請求項４に記載の核酸配列を含む遺伝子導入植物。
【請求項９】
請求項４に記載の核酸配列で形質転換した酵母細胞。
【請求項１０】
配列番号：１、１５、２５、２７、２８、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、および６１からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を植物内に導入する段階を含む、植物における超長鎖多価不飽和脂肪酸の量を変化させる方法。
【請求項１１】
アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を介した形質転換によって前記植物内に核酸構築物を導入する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ｂｒｕｓｉｃａピルビン酸脱水素酵素キナーゼ活性を備えるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを前記植物内に導入する段階をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を備えるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入する段階をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
グリセロール−３−リン酸脱水素酵素活性を備えるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入する段階をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記植物が、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、ボリジ種（Ｂｏｒａｇｏ ｓｐｐ．）、カノーラ（Ｃａｎｏｌａ）、リキヌス種（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｓｐｐ．）、テオブロマ種（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｓｐｐ．）、トウモロコシ種（Ｚｅａ ｓｐｐ．）、ゴシッピウム種（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｓｐｐ．）、ハマナ種（Ｃｒａｍｂｅ ｓｐｐ．）、クフェア種（Ｃｕｐｈｅａ ｓｐｐ．）、アマ種（Ｌｉｎｕｍ ｓｐｐ．）、レスクェレラ種（Ｌｅｓｑｕｅｒｅｌｌａ ｓｐｐ．）、リムナンテス種（Ｌｉｍｎａｎｔｈｅｓ ｓｐｐ．）、リノーラ（Ｌｉｎｏｌａ）、ノウゼンハレン種（Ｔｒｏｐａｅｏｌｕｍ ｓｐｐ．）、マツヨイグサ種（Ｏｅｎｏｔｈｅｒａ ｓｐｐ．）、オリーブ種（Ｏｌｅａ ｓｐｐ．）、アブラヤシ種（Ｅｌａｅｉｓ ｓｐｐ．）、ラッカセイ種（Ａｒａｃｈｉｓ ｓｐｐ．）、ナタネ（ｒａｐｅｓｅｅｄ）、ベニバナ種（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｓｐｐ．）、ダイズ種（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｓｐｐ．）、ソヤ種（ＳｏＪａ ｓｐｐ．）、ヒマワリ種（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｓｐｐ．）、タバコ種（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｐｐ．）、ベルノニア種（Ｖｅｒｎｏｎｉａ ｓｐｐ．）、コムギ種（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｓｐｐ．）、オオムギ種（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｓｐｐ．）、オリザ種（Ｏｒｙｚａ ｓｐｐ．）、カラスムギ種（Ａｖｅｎａ ｓｐｐ．）、モロコシ種（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｓｐｐ．）、ライムギ種（Ｓｅｃａｌｅ ｓｐｐ．）、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）、およびイネ科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）植物ファミリーの他のメンバーからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１０に記載の方法によって産生した植物。
【請求項１７】
請求項１０に記載の方法によって産生した前記植物から収穫した種子。
【請求項１８】
請求項１０に記載の方法によって産生した前記植物から抽出した油。
【請求項１９】
前記核酸構築物を含む植物から種子を収穫する段階、および前記収穫した種子から油を抽出する段階をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１】
配列番号：１５と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む単離または精製したポリペプチド。
【請求項２】
配列番号：１と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の単離または精製したポリペプチド。
【請求項３】
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する、請求項１に記載の単離または精製したポリペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載の単離または精製したポリペプチドをコードする、単離または精製した核酸配列。
【請求項５】
ベクター内に存在する、請求項４に記載の核酸配列。
【請求項６】
請求項４に記載の核酸配列を含む遺伝子導入植物。
【請求項７】
前記核酸配列を欠いている植物における量と比較して、種子中の多価不飽和脂肪酸の量が変化している、請求項４に記載の核酸配列を含む遺伝子導入植物。
【請求項８】
前記植物中の脂肪酸が約７０％以上の多価不飽和脂肪酸である、請求項４に記載の核酸配列を含む遺伝子導入植物。
【請求項９】
請求項４に記載の核酸配列で形質転換した酵母細胞。
【請求項１０】
配列番号：１、１５、２５、２７、２８、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、および６１からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を植物内に導入する段階を含む、植物における超長鎖多価不飽和脂肪酸の量を変化させる方法。
【請求項１１】
アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を介した形質転換によって前記植物内に核酸構築物を導入する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ｂｒｕｓｉｃａピルビン酸脱水素酵素キナーゼ活性を備えるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを前記植物内に導入する段階をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を備えるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入する段階をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
グリセロール−３−リン酸脱水素酵素活性を備えるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入する段階をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記植物が、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、ボリジ種（Ｂｏｒａｇｏ ｓｐｐ．）、カノーラ（Ｃａｎｏｌａ）、リキヌス種（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｓｐｐ．）、テオブロマ種（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｓｐｐ．）、トウモロコシ種（Ｚｅａ ｓｐｐ．）、ゴシッピウム種（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｓｐｐ．）、ハマナ種（Ｃｒａｍｂｅ ｓｐｐ．）、クフェア種（Ｃｕｐｈｅａ ｓｐｐ．）、アマ種（Ｌｉｎｕｍ ｓｐｐ．）、レスクェレラ種（Ｌｅｓｑｕｅｒｅｌｌａ ｓｐｐ．）、リムナンテス種（Ｌｉｍｎａｎｔｈｅｓ ｓｐｐ．）、リノーラ（Ｌｉｎｏｌａ）、ノウゼンハレン種（Ｔｒｏｐａｅｏｌｕｍ ｓｐｐ．）、マツヨイグサ種（Ｏｅｎｏｔｈｅｒａ ｓｐｐ．）、オリーブ種（Ｏｌｅａ ｓｐｐ．）、アブラヤシ種（Ｅｌａｅｉｓ ｓｐｐ．）、ラッカセイ種（Ａｒａｃｈｉｓ ｓｐｐ．）、ナタネ（ｒａｐｅｓｅｅｄ）、ベニバナ種（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｓｐｐ．）、ダイズ種（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｓｐｐ．）、ソヤ種（ＳｏＪａ ｓｐｐ．）、ヒマワリ種（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｓｐｐ．）、タバコ種（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｐｐ．）、ベルノニア種（Ｖｅｒｎｏｎｉａ ｓｐｐ．）、コムギ種（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｓｐｐ．）、オオムギ種（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｓｐｐ．）、オリザ種（Ｏｒｙｚａ ｓｐｐ．）、カラスムギ種（Ａｖｅｎａ ｓｐｐ．）、モロコシ種（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｓｐｐ．）、ライムギ種（Ｓｅｃａｌｅ ｓｐｐ．）、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）、およびイネ科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）植物ファミリーの他のメンバーからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１０に記載の方法によって産生した植物。
【請求項１７】
請求項１０に記載の方法によって産生した前記植物から収穫した種子。
【請求項１８】
請求項１０に記載の方法によって産生した前記植物から抽出した油。
【請求項１９】
前記核酸構築物を含む植物から種子を収穫する段階、および前記収穫した種子から油を抽出する段階をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２０１１−５０７５１３（Ｐ２０１１−５０７５１３Ａ）
【公表日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３９４７２（Ｐ２０１０−５３９４７２）
【出願日】平成２０年１２月１６日（２００８．１２．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１３８１１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８５１６９
【国際公開日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【出願人】（５１０１７０６９３）ナショナル リサーチ カウンシル オブ カナダ (1)
【出願人】（５０５４１２４４３）ダウ アグロサイエンシズ リミテッド ライアビリティー カンパニー (10)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月１６日（２００８．１２．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１３８１１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８５１６９
【国際公開日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【出願人】（５１０１７０６９３）ナショナル リサーチ カウンシル オブ カナダ (1)
【出願人】（５０５４１２４４３）ダウ アグロサイエンシズ リミテッド ライアビリティー カンパニー (10)
【Ｆターム（参考）】
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