虚血性及び糖尿病性創傷の治癒を促進する組成物、キット及び方法
ＳＤＦ−１αが成熟内皮細胞（ＥＣ）におけるＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートして、ＥＣ−内皮前駆細胞（ＥＰＣ）間の接着及びＥＰＣホーミングを増加させるという発見に基づく、組成物、キット、及び糖尿病性創傷の治癒を促進する方法。糖尿病の対象における創傷治癒を促進する方法は、Ｅ−セレクチンタンパク質又はＥ−セレクチンタンパク質をコードする核酸、及び任意に、Ｅ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートする薬剤（例えば、ＳＤＦ−１α）、を含有する治療有効量の組成物を提供する工程を含む。前記方法は、対象に高圧酸素療法を実施する工程をもまた含む場合がある。組成物の対象への投与は、骨髄由来前駆細胞の創傷への遊走、創傷治癒の促進、及び対象におけるＥ−セレクチンの発現のアップレギュレーションをもたらす。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、医療及び遺伝子治療の分野に関する。より詳細には、本発明は糖尿病の対象における創傷治癒を促進する組成物、キット及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
欠陥のある創傷治癒は、糖尿病患者における重大な臨床上の問題であり、また下肢切断の主要な原因である。現在の治療の成功率は低く、糖尿病性の微小血管病理に対する取り組みは不十分である。糖尿病性創傷治癒の不良は、不十分な血管形成及び脈管形成によって特徴付けられる。脈管形成はＢＭ由来前駆細胞からの新生血管の成長を含み、後天性の血管新生過程及び創傷治癒に寄与する。骨髄（ＢＭ）由来の内皮前駆細胞（ＥＰＣ）は脈管形成において機能する重要な細胞であり、虚血に反応して末梢組織にホーミングする。ＥＰＣの動員及びリクルートメント（すなわち虚血）に対する初期の生理的刺激が、糖尿病の宿主においては、なぜ治療的なＥＰＣ介在性血管新生及び治癒を誘導しないのかは未だに解明されていない。
【０００３】
そのため、現在においても、糖尿病性創傷治癒を高める治療薬及び方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書においては、ＳＤＦ−１αが成熟ＥＣにおけるＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートし、ＥＣ−ＥＰＣ間接着及びＥＰＣホーミングの増加を引き起こすという発見に基づく、虚血性（例えば、糖尿病性）創傷の治癒を促進する組成物、キット及び方法が記載される。ＥＰＣの標的組織へのホーミング機序には、ＥＰＣの骨髄ニッチからの離脱、血管内への移行、及び循環系内での移動、ホーミングシグナルの感知、毛細血管の単層内皮細胞（ＥＣ）上での回転及び接着、そしてその後のＥＰＣ−ＥＣ間の直接的な相互作用が必要とされる経内皮遊走を含む、連続したイベントのカスケードが含まれる。本明細書に記載される実施例においては、ＥＰＣの標的組織へのホーミングを達成するためには、毛細血管内膜のＥＣと循環しているＥＰＣとの間の直接的な細胞間相互作用が必要かどうか、及び、ＥＣ単層における特異的な接着分子の制御により、少なくとも部分的には、ＥＰＣホーミングにおけるＳＤＦ−１αの効果が仲介されるかどうかについて調べた。ＳＤＦ−１α誘導性のＥＰＣホーミングを仲介する接着分子として、Ｅ−セレクチンを特定した。本明細書において記載した実施例の結果は、マウス及びヒトの成熟ＥＣ単層においては、ＳＤＦ−１αがＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートすること、Ｅ−セレクチンはＥＰＣのＥＣ単層への接着を高めることにより、ＥＰＣホーミング及びそれらの経内皮遊走におけるＳＤＦ−１αの効果を仲介する原因となること、並びにこれらの効果が創傷性血管新生及び創傷治癒（血管新生）の有意な増大を生じること、を示した。これら新規の知見は、ＥＰＣホーミングにおけるＳＤＦ−１αの生物学的な効果の根底にある分子メカニズム（シグナル）への洞察を提供するばかりでなく、Ｅ−セレクチンが虚血性（例えば、糖尿病性）創傷の治癒における治療的適応の新しい標的であることを明らかにした。
【０００５】
別段の指定のない限り、本明細書で使用される全ての専門用語は、本発明が属する分野の当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。
【０００６】
本明細書で使用する場合、「核酸」又は「核酸分子」は、ＲＮＡ（リボ核酸）及びＤＮＡ（デオキシリボ核酸）のような２つ以上のヌクレオチドの鎖、及び化学的に修飾したヌクレオチドを意味する。「精製した」核酸分子は、その核酸が天然に生じる細胞又は生物中におけるその他の核酸配列から実質的に分離された核酸分子である（汚染物質を、例えば、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９、１００％含まない）。この用語は、例えば、ベクター、プラスミド、ウイルスに組み入れられた組換え核酸分子、又は原核生物又は真核生物のゲノムを含む。精製した核酸の例としては、ｃＤＮＡ、ゲノム核酸の断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生産した核酸、ゲノム核酸の制限酵素処理によって形成した核酸、組換え核酸、及び化学的に合成した核酸分子が挙げられる。「組換え」核酸分子は、例えば、化学的な合成によって、又は遺伝子工学技術による単離した核酸セグメントの操作によって、そういうことをしなければ分離していた２つの配列セグメントを人工的に組み合わせることによって作出した核酸分子である。
【０００７】
「遺伝子」という用語は、特定のタンパク質又は、特定の例においては、機能性若しくは構造性ＲＮＡ分子をコードする核酸分子を意味する。
【０００８】
「Ｅ−セレクチン遺伝子」、「Ｅ−セレクチンポリヌクレオチド」、又は「Ｅ−セレクチン核酸」という用語は、天然のヒトＥ−セレクチン又はＥ−セレクチンをコードする核酸配列、例えば、天然のヒトＥ−セレクチン遺伝子（アクセッション番号 ＮＭ＿０００４５０）、Ｅ−セレクチンｃＤＮＡを転写することができる配列由来の配列を含む核酸；及び／又は対立変異体及び前述したもののホモログを意味する。この用語は、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡを包含する。
【０００９】
「ＳＤＦ−１α遺伝子」、「ＳＤＦ−１αポリヌクレオチド」、又は「ＳＤＦ−１α核酸」という用語は、天然のヒトＳＤＦ−１α又はＳＤＦ−１αをコードする核酸配列、例えば、天然のヒトＳＤＦ−１α遺伝子（アクセッション番号 ＮＭ＿１９９１６８、ＮＭ＿０００６０９、ＮＭ＿００１０３３８８６）、ＳＤＦ−１α ｃＤＮＡを転写することができる配列由来の配列を含む核酸；及び／又は対立変異体及び前述したもののホモログを意味する。この用語は、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡを包含する。
【００１０】
核酸分子における突然変異について言及する場合、「サイレントな」変化とは、ヌクレオチド配列中の１つ以上の塩基対が置換されるが、その配列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列が変化しない変化である。「保存的な」変化とは、核酸のタンパク質コード領域の少なくとも１つのコドンを、この核酸配列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸のうちの少なくとも１つが、類似した特徴を有するその他のアミノ酸に置換されるように変化する、変化である。
【００１１】
ペプチド、オリゴペプチド又はタンパク質におけるアミノ酸残基について言及する場合、「アミノ酸残基」、「アミノ酸」及び「残基」という用語は区別なく用いられ、本明細書で使用する場合、アミド結合又は模倣アミド結合を介して少なくとも１つの他のアミノ酸又は模倣アミノ酸に共有結合した、アミノ酸又は模倣アミノ酸を意味する。
【００１２】
本明細書で使用する場合、「タンパク質」及び「ポリペプチド」は同義的に用いられ、長さ又はグリコシル化若しくはリン酸化のような翻訳後修飾に関わらず、任意のペプチド結合したアミノ酸の鎖を意味する。
【００１３】
「Ｅ−セレクチンタンパク質」又は「Ｅ−セレクチン」という用語は、天然のヒトＥ−セレクチンタンパク質（アクセッション番号 ＡＡＱ６７７０２、ＮＰ＿０００４４１．２）のようなＥ−セレクチン遺伝子の発現産物、又は前述したものと少なくとも６５％（しかし好ましくは７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％）のアミノ酸配列同一性を有し、かつ、天然のＥ−セレクチンタンパク質の機能活性を示すタンパク質を意味する。タンパク質の「機能活性」とは、そのタンパク質の生理機能に関連する任意の活性である。例えば、天然のＥ−セレクチンタンパク質の機能活性には、ＥＣ−ＥＰＣ間接着の仲介及び、細胞と血管内膜との接着を仲介することによる、炎症部位での白血球の蓄積の促進が含まれ得る。
【００１４】
「ＳＤＦ−１αタンパク質」又は「ＳＤＦ−１α」という用語は、天然のヒトＳＤＦ−１αタンパク質（アクセッション番号 ＣＡＧ２９２７９．１）のようなＳＤＦ−１α遺伝子の発現産物、又は前述したものと少なくとも６５％（しかし好ましくは７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％）のアミノ酸配列同一性を有し、かつ、天然のＳＤＦ−１αタンパク質の機能活性を示すタンパク質を意味する。タンパク質の「機能活性」とは、そのタンパク質の生理機能に関連する任意の活性である。例えば、天然のＳＤＦ−１αタンパク質の機能活性には、細胞成長又は血管形成に対する刺激が含まれ得る。ＳＤＦ−１αは、ＥＰＣへの強力なホーミングシグナルとして作用するケモカインである（Ｌａｐｉｄｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９３８：８３−９５，２００１；米国特許第２００８／００３７６０号を参照のこと）。
【００１５】
核酸分子、ポリペプチド、又は感染性病原体について言及する場合には、「天然の」という用語は、天然に生じる（例えば、野生型（ＷＴ））核酸、ポリペプチド、又は感染性病原体を意味する。
【００１６】
「血管形成」という用語は、既存の血管に由来する新しい血管の成長を意味する。血管形成は、分岐のない血管セグメントの数の測定（単位面積当たりのセグメント数）、機能性血管密度（単位面積当たりに潅流する血管の全長）、血管径、又は血管容量密度（単位面積当たりの各セグメントの長さ及び直径に基づいて算出した全血管容量）により、評価することができる。
【００１７】
「特異的な結合」及び「特異的に結合する」という用語は、酵素／基質、受容体／アゴニスト、抗体／抗原、などのような対になった種の間に生じ、かつ、共有若しくは非共有相互作用、又は共有及び非共有相互作用の組み合わせが介在する可能性のある結合を意味する。２つの種の相互作用が非共有的に結合した複合体を生産する場合、生じる結合は、一般的には静電、水素結合、又は親油性相互作用の結果である。従って、「特異的な結合」は、抗体／抗原又は酵素／基質相互作用の特徴を有する結合した複合体を生産する、２つの対になった相互作用のある種の間に生じる。具体的には、特異的な結合は、対をなすメンバーの片方が特定の種へは結合するが、化合物ファミリー（結合するメンバーに対応するメンバーが属する）内のその他の種には結合しないことによって特徴付けられる。
【００１８】
本明細書で使用する場合、「配列同一性」という句は、サブユニットの一致が最大になるように（すなわちギャップ及び挿入を考慮に入れて）２つの配列を整列させた場合に、２つの配列（例えば、核酸配列、アミノ酸配列）において対応する位置にある、同一のサブユニットのパーセンテージを意味する。配列同一性は、配列解析ソフトウェア（例えば、Ａｃｃｅｌｒｙｓ ＣＧＣ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡのＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ）を用いて測定することができる。
【００１９】
「単離した」又は「生物学的に純粋」という句は、天然の状態で見られるように、その材料に通常付随する成分を実質的に又は本質的に含まない材料を意味する。
【００２０】
「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体、ヒト化抗体、可溶性又は結合形態において標識することができる抗体に対する抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、並びに、例えば酵素的開裂、ペプチド合成、若しくは組換え技術を含むがこれらには限定されない、任意の既知の技術によって提供される断片、領域又はその誘導体、を含むことを意味する。
【００２１】
本明細書で使用する場合、「慢性創傷」及び「難治性創傷」及び「糖尿病性創傷」という用語は、持続的な解剖学的及び機能的な結果が達成されず、また、壊死片及び感染の除去、炎症の消失、結合組織マトリックスの修復、血管形成、及び表面再建を含む通常の創傷治癒方法では治癒しない創傷を指す。例えば、病理学的に低酸素症が上昇した場合、創傷治癒は不全であり、かつ、創傷感染率も上昇する。通常の治癒において必須な部分は、肉芽組織形成とも呼ばれる、一時的な創傷マトリックス中での新しい血管の形成である。
【００２２】
一実施形態においては、「血管形成」という用語は、創傷に隣接した血管網の在住内皮細胞の増殖による過程、並びにその他の実施形態においては、繊維芽細胞のような成熟ストローマ細胞に補助される、最初は無血管である創傷組織中に成長する新生血管への遊走及びリモデリング、を指す。別の実施形態においては、「脈管形成」という用語は、創傷にリクルートされたＥＰＣが、内皮細胞へと分化し、血管網の置換を引き起こすデノボ過程を指す。
【００２３】
「前駆細胞」、又は「内皮前駆細胞」又は「ＥＰＣ」という用語は、分化及び増殖によって完全に分化した機能的な後代を生成する能力を有する、任意の体細胞を意味する。別の実施形態においては、前駆細胞は、任意の組織又は血液、神経、筋肉、皮膚、消化管、骨、腎臓、肝臓、膵臓、胸腺、などを含むがこれらには限定されない器官系からの前駆細胞を含む。前駆細胞は、「分化した細胞」とは区別され、別の実施形態においては、これらは、増殖（すなわち自己複製）する能力を有しても有さなくてもよいが、通常の生理学的な条件においては異なる細胞型へのさらなる分化はしない、細胞と定義される。一実施形態においては、前駆細胞はさらに、増殖（自己複製）するが、未成熟又は未分化であるように見えるにもかかわらず通常さらには分化しない、癌細胞、特に白血病細胞のような異常な細胞からは区別される。
【００２４】
本明細書で使用する場合、「全能性を有する」という用語は、胚性幹細胞（すなわち全ての型の成熟細胞の生成に必要、かつ、十分である）のような不確定な前駆細胞を意味する。全ての膵臓細胞系統を生成する能力を保持するが、自己更新できない前駆細胞は、「多能性を有する」と呼ばれる。別の実施形態においては、全てではないが内皮系統のいくつかの細胞を生産することができ、かつ、自己更新できな前駆細胞は、「いろいろな能力を有する」と呼ばれる。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「骨髄由来前駆細胞」及び「ＢＭ由来前駆細胞」という句は、骨髄幹細胞系統から派生した前駆細胞を意味する。骨髄由来前駆細胞の例としては、骨髄由来間葉幹細胞（ＭＳＣ）及びＥＰＣが挙げられる。
【００２６】
「ホーミング」という用語は、治癒に関わる細胞が、損傷部位に遊走し修復を補助するように誘導及び刺激するシグナルを指す。
【００２７】
「治療有効量」及び「有効量」という句は、治療上（例えば臨床上）期待される結果（結果の正確な特性は治療される障害の特性によって多様になり得る）を生じるのに有効な量を意味する。例えば、治療する障害が非治癒性の糖尿病性創傷である場合、結果は創傷の治癒となり得る（ＥＣ−ＥＰＣ間接着の増大、ＥＰＣホーミング及び創傷血管新生の増大を誘導する、成熟ＥＣにおけるＥ−セレクチン発現の特異的なアップレギュレートによる）。本明細書において記載される組成物及びワクチンは、１日当たり１回以上から１週間当たり１回以上までの間で投与することができる。当業者は、対象を効果的に治療するには、疾患又は障害の重篤度、それまでの治療、総体的な健康及び／又は対象の年齢、並びにその他に見つかる疾患を含むがこれらには限定されない特定の因子が、その投与量及びタイミングに影響をおよぼす可能性があることを理解するだろう。さらに、治療有効量の本発明の組成物又はワクチンを用いた対象の治療は、単独治療であっても又は一連の治療であってもよい。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「治療」という用語は、本明細書において記載した若しくは本明細書において記載した方法により特定した治療薬の、患者への、適用又は投与、又は、疾患、疾患の症状、又は疾病素因を、治す、治癒する、軽減する、救助する、変質させる、治療する、回復させる、改善する又は作用する目的における、疾患、疾患の症状若しくは疾病素因を有する患者から単離した組織又は細胞株への治療薬の適用又は投与、と定義される。
【００２９】
「患者」、「対象」及び「個体」という用語は、本明細書においては区別なく用いられ、好ましくはヒト患者である、治療を受ける哺乳類対象を意味する。いくつかの例においては、本発明の方法は、マウス、ラット及びハムスターのような齧歯類、並びに非ヒト霊長類を含むがこれらには限定されない、実験動物における、獣医学的適用における、及び疾患への動物モデルの開発における利用法を見いだす。
【００３０】
従って、本明細書においては、糖尿病の対象における糖尿病性創傷の治療を促進する方法が記載される。この方法は以下の工程を含む：Ｅ−セレクチンタンパク質、Ｅ−セレクチンタンパク質をコードする核酸、及びＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートする薬剤からなる群より選択される少なくとも１つの治療薬と、薬学的に許容可能な担体とを含む、治療有効量の組成物を提供する工程；及び、対象において骨髄由来前駆細胞（例えば、ＥＰＣ）の創傷への遊走が増加する条件で、組成物を対象に投与する工程。組成物を、例えば、経口的に、局所的に、静脈内に直接、又は血管内カテーテルを介して、創傷又は創傷に隣接した部位に投与することができる。対象への組成物の投与は、創傷治癒の促進もたらす。一実施形態においては、組成物は、Ｅ−セレクチンタンパク質又はＥ−セレクチンタンパク質をコードする核酸、及びＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートする薬剤、ここでこのＥ−セレクチン発現を特異的にアップレギュレートする薬剤はＳＤＦ−１αタンパク質又はＳＤＦ−１αタンパク質をコードする核酸である、を含む。この方法はさらに、対象に高圧酸素両方を実施する工程を含んでいてもよい。
【００３１】
本明細書においては、糖尿病性創傷を有する糖尿病の対象においてＥ−セレクチン発現をアップレギュレートする方法がさらに記載される。この方法は、第一のＡＡＶ逆方向末端反復と第二のＡＡＶ逆方向末端反復との間に挿入されたＥ−セレクチンをコードするポリヌクレオチドを含有する少なくとも１つのｒＡＡＶビリオンを包含する組成物を、Ｅ−セレクチンの発現をアップレギュレートし、骨髄由来前駆細胞（例えば、ＥＰＣ）の創傷への遊走を誘導し、かつ対象における創傷の治癒を促進するために有効な量で、糖尿病の対象に投与する工程を含む。少なくとも１つのｒＡＡＶビリオンは、血清型２カプシドタンパク質を含有する場合がある。組成物を、例えば、創傷又は創傷に隣接した部位に直接投与してもよい。この方法は、ＳＤＦ−１αタンパク質又はＳＤＦ−１αタンパク質をコードする核酸を対象に投与する工程及び／又は対象に高圧酸素療法を実施する工程、をさらに含む場合もある。
【００３２】
本明細書においては、哺乳類対象における少なくとも１つの糖尿病性創傷を治療するキットがさらに記載される。このキットは、Ｅ−セレクチンタンパク質、Ｅ−セレクチンタンパク質をコードする核酸、及びＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートする薬剤からなる群より選択される少なくとも１つの治療薬と、薬学的に許容可能な担体とを含む、治療有効量の組成物；及び使用説明書を含む。一実施形態においては、この組成物は、Ｅ−セレクチンタンパク質又はＥ−セレクチンタンパク質をコードする核酸、及びＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートする薬剤を含み、ここでこのＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートする薬剤はＳＤＦ−１αタンパク質又はＳＤＦ−１αタンパク質をコードする核酸である。一実施形態においては、使用説明書は、対象に高圧酸素療法を実施するための説明を含む。
【００３３】
本明細書においては、糖尿病の対象における糖尿病性創傷の治癒を促進する方法もまた記載される。この方法は、薬学的に許容可能な担体と複数の骨髄由来前駆細胞（Ｅ−セレクチンをコードするポリヌクレオチドを含有する）とを含む組成物を提供する工程、及び骨髄由来前駆細胞（例えば、ＥＰＣ）の創傷への遊走を増加させ、対象における創傷治癒を促進するために有効な量の組成物を対象に投与する工程、を含む。Ｅ−セレクチンをコードするポリヌクレオチドは、ウイルスベクター、例えば、ウイルス粒子中に含まれるウイルスベクター中にあってもよい（例えば、ＡＡＶ粒子中のｒＡＡＶベクター）。組成物は、ＳＤＦ−１αタンパク質又はＳＤＦ−１αタンパク質をコードする核酸をさらに含んでいてもよく、創傷又は創傷に隣接した部位に直接投与することもできる。一実施形態においては、この方法は、対象に高圧酸素療法を実施する工程をさらに含む。
【００３４】
本発明の実施及び試験においては、本明細書において記載したものと類似又は同等な組成物、キット及び方法を用いることができるが、好適な組成物、キット及び方法を以下に記載する。本明細書において言及する全ての出版物、特許出願、及び特許は、その全体が参照することにより組み入れられる。不一致が生じる場合には、定義を含む本明細書が優先される。以下で議論される特定の実施形態は説明するためだけのものであり、発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、ＳＤＦ−１αを改変したＢＭＤＦが血管新生及び糖尿病性創傷治癒を促進することを示す、細胞の一連の顕微鏡写真及びグラフである。（Ａ）左：回復のパーセンテージで表した創傷治癒率。２つの群のＮＯＤマウスに創傷を作製し、ｍＳＤＦ−１α／ＢＭＤＦ又はＧＦＰ／ＢＭＤＦで処理した。デジタル写真を用いて、最初の創傷面積の画分を毎日測定し、創傷が治癒するまでＩｍａｇｅＪ解析を行った。ＧＦＰ／ＢＭＤＦで処理した対照と比較して、ｍＳＤＦ−１α／ＢＭＤＦで処理した糖尿病マウスでは、３日目以降、有意に創傷閉塞率が改善した。右：各群におけるそれぞれの日数での代表的な創傷を示す。（Ｂ）Ｄｉｌ色素を用いた創傷血管潅流。上段：５日目にレーザー走査共焦点顕微鏡を用いて測定した、Ｄｉｌ染色創傷血管の代表的な画像を各群について示す。下段：創傷における血管密度の定量。閾値のパーセンテージは、検出した全ての血管を、全創傷面積のパーセンテージとして含む。対照と比較して、ｍＳＤＦ−１α／ＢＭＤＦで処理した創傷は有意に高い血管密度を有した。データは、各群における４つの創傷の平均±ＳＤとして表した。（Ｃ）ｍＳＤＦ−１αを検出するために、ｍＳＤＦ−１α／ＢＭＤＦ又はＧＦＰ／ＢＭＤＦを注入した創傷組織のＩＨＣ。ＧＦＰ／ＢＭＤＦで処理した創傷と比較して、ｍＳＤＦ−１α／ＢＭＤＦで処理した創傷ではより強いｍＳＤＦ−１αの発現（茶色）が観察された（４０Ｘ）。
【図２】図２は、ＳＤＦ−１αで刺激したＥＣ単層へのＥＰＣの接着がインビトロで増加したことを示す、ＥＣ単層の写真及びグラフである。Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ−標識ＥＰＣを、ＳＤＦ−１α又はＢＳＡで刺激したＥＣ単層に添加した。３０分後、結合しなかったＥＰＣを洗い流した。蛍光スキャニングにより結合したＥＰＣを定量した。（Ａ）：代表的な画像。（Ｂ）：定量したデータ。データは、二組の試料を用いた３回の独立したアッセイの、平均±ＳＤとして表す。
【図３】図３は、ＳＤＦ−１αによる刺激が、ＥＣ単層でのＥ−セレクチンの発現をアップレギュレートすることを示す、グラフ、電気泳動を行ったゲルの写真、ＮＯＤマウス創傷の一連の顕微鏡写真、及び創傷組織の顕微鏡写真である。（Ａ）ＨＭＶＥＣをＳＤＦ−１α又はＢＳＡで４時間刺激し、トータルＲＮＡを抽出した。細胞外マトリックスの発現及び接着分子をＲＴ２ ＰＣＲ Ａｒｒａｙを用いて解析した。ＳＤＦ−１αの刺激により、Ｅ−セレクチンの発現がアップレギュレートされた。ＢＳＡで処理したＥＣにおけるｍＲＮＡのレベルを「１」と設定し、ＳＤＦ−１αで処理したＥＣでのレベルと比較した。（Ｂ）：Ｅ−セレクチンの発現をウェスタンブロット解析により確認した。ＨＭＶＥＣをＳＤＦ−１α又はＢＳＡで刺激し、様々な時点で細胞を回収した。ローディングコントロールとしてはβ−アクチンを用いた。（Ｃ）ＬａｃＺ／ＡＡＶを注入した場合と比較して、ｍＳＤＦ−１α／ＡＡＶを注入したＮＯＤマウス創傷では、Ｅ−セレクチンの血管での発現が増加した。血管中でのＫＤＲ（赤）とＥ−セレクチン（緑）の共発現（黄色）を免疫染色により検出した。（Ｄ）ｍＳＤＦ−１α／ＡＡＶを注入した創傷組織におけるＳＤＦ−１発現の増加をＩＨＣにより検出した。
【図４】図４は、ＥＣ単層でのＳＤＦ−１α誘導性Ｅ−セレクチンが、ＥＰＣ接着及び経内皮遊走を増大させることを示す一対のグラフと一連の顕微鏡写真である。（Ａ）より多くのＥＰＣが、ＢＳＡで処理したＥＣ単層によりも、ＳＤＦ−１αで刺激したＥＣ単層に接着した。さらにＥ−セレクチンに対するＡｂをブロッキングすると、この細胞間接着アッセイにおいては、ＳＤＦ−１αで刺激したＥＣとＥＰＣとの相互作用が阻害された。データは、二組の試料を用いた３回の独立したアッセイの平均±ＳＤとして表す。（Ｂ、上段）より多数のＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ標識ＥＰＣが、ＢＳＡで処理したＥＣ単層を入れたチャンバーよりも、ＳＤＦ−１αで刺激したＥＣ単層を入れたトランスウェルの下チャンバーへ遊出することが観察された。Ｅ−セレクチンに対するＡｂをブロッキングすると、このＥＰＣ経内皮遊走が阻害された。（Ｂ、下段）トランスウェルの下チャンバーのＤｉｌ−ＥＰＣを、蛍光スキャニングにより定量した。Ｅ−セレクチンに対するＡｂをブロッキングすると、ＳＤＦ−１αで刺激したＥＣとＥＰＣとの相互作用が阻害された。データは、二組の試料を用いた３回の独立したアッセイの平均±ＳＤとして表す。
【図５】図５は、ＳＤＦ−１がＥＰＣにおけるＥ−セレクチンリガンドの発現を誘導することを示す、ウェスタンブロットの写真である。ＥＰＣをＳＤＦ−１αで刺激し、様々な時点で細胞を回収した。Ｅ−セレクチンのリガンドであるＣＤ１６２とＣＤ４４の発現をウェスタンブロッティングアッセイで試験した。ローディングコントロールとしてはβ−アクチンを用いた。実験は２回繰り返して行った。
【図６】図６は、後肢虚血と皮膚創傷のマウスモデルを用いた、ＳＤＦ−１α誘導性ＥＰＣホーミング、血管新生及び創傷の治癒におけるＥ−セレクチンの関与を示す一連の写真及びグラフである。（Ａ）上段：Ｅ−ｓｅｌ−／−又はＷＴマウスにおいて、大腿動脈の結合／切除後に、血流が虚血性後肢内へ自然に戻ることを示す非侵襲性のＬＤＩ測定の代表的な画像である。下段：ＬＤＩ測定の定量データ。様々な時点での、２つの群のマウスにおける虚血性後肢対正常な後肢の比。データは、各群（ｎ＝６／群）の平均±ＳＤとして表す。（Ｂ）Ｅ−ｓｅｌ−／−又はＷＴにおける創傷閉塞率。上段：Ｅ−ｓｅｌ−／−及びＷＴマウスにおける創傷治癒の代表的な画像。Ｅ−セレクチンの欠損が創傷治癒を遅延させる。下段：Ｅ−ｓｅｌ−／−又はＷＴマウスの定量的創傷閉塞率。データは、各群（ｎ＝６／群）の創傷閉塞（回復）のパーセンテージを平均±ＳＤとして表す。（Ｃ）Ｄｉｌ色素を用いた創傷血管潅流。上段：各群について、７日目に共焦点レーザー走査写真撮影術により検出したＤｉｌ染色創傷血管の代表的な画像。下段：７日目の残留創傷の全面積における血管密度をソフトウェアを用いて定量し、蛍光のパーセンテージとして表した。ＷＴマウスの創傷は、Ｅ−ｓｅｌ−／−マウスと比較して、有意に高い血管密度を有した。データは、各群の３つの創傷における平均±ＳＤとして表す。（Ｄ）Ｅ−ｓｅｌは、創傷病変へのＥＰＣホーミングに必須である。ＲＯＳＡ２６（ＬａｃＺ＋）マウス由来の骨髄細胞（１ｘ１０７個）をＥ−ｓｅｌ−／−及びＷＴマウスそれぞれに移植した。虚血性後肢創傷を作出し、ＳＤＦ−１αを創傷に注入した。細胞を移植して７日後、創傷を回収し、凍結した試料をＸ−ｇａｌ（青）及び抗ＫＤＲ（茶色）染色に用いた。上段：二重染色の代表的な画像。下段：創傷試料の５つの無作為に選択した視野から、両方の染色で陽性だった細胞を計測した。データは、各群（ｎ＝３創傷／群）のパーセンテージの平均±ＳＤとして表す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
詳細な説明
本明細書に記載した組成物、方法及びキットは、ＥＣ及び循環するＥＰＣにより成熟したＳＤＦ−１αが仲介するＥＰＣホーミングを調節するシグナルの発見に基づいている。下記に記載する実験において、細胞を用いた治療を介した創傷におけるＳＤＦ−１αレベルの上昇が、糖尿病マウスでの治癒を促進することを示した（３日目における治癒の上昇率は〜２０％、Ｐ＝０．００６）。ＳＤＦ−１αはＥＣ−ＥＰＣ間接着を増加させ、そしてヒト毛細血管ＥＣでは、Ｅ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートした（４．６倍の上昇、Ｐ＜０．０１）。この効果は実験マウスの血管においてもまた有意であり、創傷血管新生の増加をもたらした。ＥＣ−ＥＰＣ間接着及びＥＰＣホーミングにおけるＳＤＦ−１αの制御作用はＥ−セレクチンによって特異的に仲介され、そのため、Ｅ−セレクチンアンタゴニストの適用はＳＤＦ−１α誘導性のＥＣ−ＥＰＣ間接着、ＥＰＣホーミング、創傷血管新生、及び創傷治癒を有意に阻害する。Ｅ−ｓｅｌ−／−マウスモデルを用いて、ＳＤＦ−１α誘導性の創傷治癒の仲介におけるＥ−セレクチンの必要性を示した。ＳＤＦ−１αを改変した細胞を用いた治療は、成熟ＥＣにおけるＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートしてＥＣ−ＥＰＣ間接着及びＥＰＣホーミングの増加を引き起こし、そして創傷血管新生を増大することにより、マウスにおける糖尿病性創傷の治癒を促進する。これらの発見は、ＥＰＣホーミングにおけるＳＤＦ−１αの生物学的な作用の根底にあるシグナルへの新規の洞察を提供し、そして、Ｅ−セレクチンが虚血性（例えば、糖尿病性）創傷の治癒において、ＥＰＣ輸送を治療的に操作するための新しい、潜在的な標的であることを示すものである。
【００３７】
以下に記載する好ましい実施形態は、これらの組成物、ワクチン、キット及び方法の適用を説明する。しかし、これらの実施形態の詳細な説明により、以下に提供した説明に基づいて、本発明のその他の態様を作出及び／又は実施することができる。
生物学的方法
【００３８】
本明細書においては、標準的な分子生物学的技術を含む方法を記載する。このような技術は通常当該分野において一般的に既知であり、かつ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄ．， ｖｏｌ． １−３， ｅｄ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， ２００１；及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｅｄ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９２（定期的な更新を含む）のような方法論に詳細に記述されている。免疫学的技術は通常当該分野において一般的に既知であり、かつ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ｖｏｌｕｍｅ ９３， ｅｄ． Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｗ． Ａｌｔ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ， ＭＡ， ２００７； Ｍａｋｉｎｇ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， ｅｄｓ． Ｇａｒｙ Ｃ． Ｈｏｗａｒｄ ａｎｄ Ｍａｔｔｈｅｗ Ｒ． Ｋａｓｅｒ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌ， ２００６； Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ６ｔｈ ｅｄ．， ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｇａｂｒｉｅｌ Ｖｉｒｅｌｌａ， Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｅｎｇｌａｎｄ， ２００７；及びＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８８のような方法論に詳細に記述されている。遺伝子導入及び遺伝子治療の標準的な方法もまた本発明での使用に適している場合がある。例えば、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｅｄ． Ｔ． Ｂｌａｃｋｅｎｓｔｅｉｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， １９９９； 及びＧｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）， ｅｄ． Ｐ．Ｄ． Ｒｏｂｂｉｎｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， １９９７を参照のこと。
虚血性創傷の治癒を促進する組成物
【００３９】
本明細書においては、糖尿病の対象における虚血性（例えば、糖尿病性）創傷の治癒を促進する組成物が記載される。本明細書において記載される組成物は、糖尿病性創傷のような任意の型の虚血性創傷の治癒を促進するために用いることができる。それらの組成物は通常、薬学的に許容可能な担体とＥ−セレクチンタンパク質又はＥ−セレクチンタンパク質をコードする核酸のような少なくとも１つの治療薬とを含有する、治療有効量の組成物を含む。組成物は、Ｅ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートする薬剤をさらに含んでいてもよい。この実施形態においては、Ｅ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートする任意の好適な薬剤を用いることができる。例えば、ＳＤＦ−１αを用いることができる。さらなる例としては、ＩＬ−１、ＴＮＦ−アルファ及びリポ多糖類、ポリサッカライド（ＬＰＳ）が挙げられる。この実施形態においては、組成物はＥ−セレクチンタンパク質又はＥ−セレクチンタンパク質をコードする核酸、及びＳＤＦ−１αタンパク質又はＳＤＦ−１αタンパク質をコードする核酸を含む。対象へのこの組成物の投与は、骨髄由来前駆細胞の創傷への遊走の増加、及び対象における創傷治癒の促進をもたらす。創傷治癒は、創傷の再上皮形成によって特徴付けられる。
【００４０】
Ｅ−セレクチンタンパク質は、任意の好適なプロトコールにより、単離又は合成することができる（例えば、プロテインＡ及びプロテインＧビーズを用いた抗Ｅ−セレクチン抗体捕捉技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））。Ｅ−セレクチンタンパク質を投与する一般的な実施形態においては、細菌細胞（例えば、Ｅ．Ｃｏｌｉ）を形質転換、又は哺乳類細胞をトランスフェクションし、その後細胞からＥ−セレクチンを精製することにより、Ｅ−セレクチンタンパク質が調製／合成される。ＳＤＦ−１αタンパク質も投与される実施形態においては、ＳＤＦ−１αタンパク質が同様に調製される。
【００４１】
別の実施形態においては、糖尿病性創傷を治療するために、Ｅ−セレクチンをコードする核酸を対象に投与してもよい。Ｅ−セレクチンをコードするコード配列は、アクセッション番号ＮＭ＿０００４５０のヌクレオチド配列と同一であってもよく、又は、遺伝子暗号の重複又は縮重の結果異なるコード配列ではあるが、アクセッション番号ＮＭ＿０００４５０のポリヌクレオチドと同じポリペプチドをコードする配列、であってもよい。本明細書において記載されるその他の核酸分子は、断片、アナログ、及び天然のＥ−セレクチンタンパク質の誘導体をコードする核酸分子のような、天然のＥ−セレクチン遺伝子の変異体を含む。このような変異体は、例えば、天然に生じる天然のＥ−セレクチン遺伝子の対立変異体、天然のＥ−セレクチン遺伝子のホモログ、又は天然に生じる天然のＥ−セレクチン遺伝子の変異体であってもよい。これらの変異体は、天然のＥ−セレクチン遺伝子とは塩基が１以上異なるヌクレオチド配列を有する。例えば、それら変異体のヌクレオチド配列は、天然のＥ−セレクチン遺伝子のヌクレオチドの１つ以上の欠損、付加又は置換を特徴とする場合がある。
【００４２】
その他の実施形態においては、コードされたポリペプチドに保存的置換に満たない変化を生じるヌクレオチド置換を作出することにより、構造が実質的に変化した変異型Ｅ−セレクチンタンパク質を生成することができる。そのようなヌクレオチド置換の例としては、（ａ）ポリペプチド骨格の構造；（ｂ）ポリペプチドの電荷又は疎水性；又は（ｃ）アミノ酸側鎖の大部分、における変化を生じる置換が挙げられる。通常タンパク質の特性に大きな変化を生じると予測されるヌクレオチド置換は、コドンに非保存的置換を生じる置換である。タンパク質構造に大きな変化を生じると考えられるコドン変化の例としては、（ａ）親水性残基、例えば、セリン又はトレオニン、の（又はによる）疎水性残基、例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン又はアラニンへの置換；（ｂ）システイン又はプロリンの（又はによる）任意のその他の残基への置換；（ｃ）電気的陽性の側鎖を有する残基、例えば、リジン、アルギニン、又はヒスチジン、の（又はによる）電気的陰性の残基、例えば、グルタミン又アスパラギンへの置換；又は（ｄ）大きな側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニン、の（又はによる）側鎖のない残基、例えば、グリシンへの置換を生じる置換である。
【００４３】
本明細書において記載される天然のＥ−セレクチン遺伝子の天然に生じる対立変異体又は天然のＥ−セレクチンｍＲＮＡは、天然のＥ−セレクチン遺伝子又は天然のＥ−セレクチンｍＲＮＡと少なくとも７５％（例えば、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％）の配列同一性を有し、かつ、天然のＥ−セレクチンタンパク質と類似の構造を有するポリペプチドをコードする、ヒト組織から単離された核酸である。本明細書において記載される天然のＥ−セレクチン遺伝子のホモログ又は天然のＥ−セレクチンｍＲＮＡは、天然のヒトＥ−セレクチン遺伝子又は天然のヒトＥ−セレクチンｍＲＮＡと少なくとも７５％（例えば、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％）の配列同一性を有し、かつ、天然のヒトＥ−セレクチンタンパク質と類似の構造を有するポリペプチドをコードする、その他の種から単離された核酸である。天然のＥ−セレクチン遺伝子又は天然のＥ−セレクチンｍＲＮＡと高いパーセンテージ（例えば、７０、８０、９０％、又はそれ以上）の配列同一性を有するその他の核酸分子を同定するために、公開された及び／又は登録された核酸データベースを検索することができる。
【００４４】
天然に生じないＥ−セレクチン遺伝子又はｍＲＮＡ変異体とは、天然のヒトＥ−セレクチン遺伝子又は天然のヒトＥ−セレクチンｍＲＮＡと少なくとも７５％（例えば、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％）の配列同一性を有し、かつ、天然のヒトＥ−セレクチンタンパク質と類似の構造を有するポリペプチドをコードする、天然には生じない（例えば、人工の）核酸である。天然に生じないＥ−セレクチン遺伝子変異体の例としては、Ｅ−セレクチンタンパク質の断片をコードするもの、天然のＥ−セレクチン遺伝子又は天然のＥ−セレクチン遺伝子の相補鎖にストリンジェント条件下でハイブリダイズするもの、天然のＥ−セレクチン遺伝子又はその相補鎖と少なくとも６５％の配列同一性を有するもの、及びＥ−セレクチン融合タンパク質をコードするもの、が挙げられる。
【００４５】
本明細書において記載した、天然のＥ−セレクチンタンパク質の断片をコードする核酸は、例えば、２、５、１０、２５、５０、１００、１５０、２００又はそれ以上の天然のＥ−セレクチンタンパク質のアミノ酸残基をコードするものである。天然のＥ−セレクチンタンパク質の断片をコードする核酸をコードする又はそれとハイブリダイズするより短いオリゴヌクレオチド（例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、５０、塩基対長）は、プローブ、プライマー、又はアンチセンス分子として用いることができる。天然のＥ−セレクチンタンパク質の断片をコードする核酸は、酵素を用いた消化（例えば、制限酵素を用いて）又は完全長の天然のＥ−セレクチン遺伝子、Ｅ−セレクチンｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡ、又は前述したものの変異体を化学的に分解することよって作製することができる。これまでに報告された天然のヒトＥ−セレクチン遺伝子のヌクレオチド配列及び天然のＥ−セレクチンタンパク質のアミノ酸配列を用いて、当業者は、例えば、標準的な核酸突然変異生成技術又は化学的合成によってそれらのヌクレオチド配列中に僅かな変化を有する核酸分子を作製することができる。変異型Ｅ−セレクチンタンパク質を生産するように、変異型Ｅ−セレクチン核酸分子を発現させることができる。
【００４６】
糖尿病性創傷の治癒を促進する方法
糖尿病の対象における糖尿病性創傷の治癒を促進する方法の一実施形態は、薬学的に許容可能な担体と、Ｅ−セレクチンタンパク質、Ｅ−セレクチンタンパク質をコードする核酸、及びＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートする薬剤のような少なくとも１つの治療薬を含有する治療有効量の組成物を提供する工程；及び対象において骨髄由来前駆細胞（例えば、ＥＰＣ）の創傷への遊走が増加する条件下において、この組成物を対象に投与する工程を含む。例えば、組成物は、Ｅ−セレクチンタンパク質又はＥ−セレクチンタンパク質をコードする核酸、及び、ＳＤＦ−１αタンパク質又はＳＤＦ−１αタンパク質をコードする核酸のようなＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートする薬剤を含む可能性がある。この方法においては、この組成物は任意の好適な経路、例えば、経口的、局所的、静脈内、又は創傷若しくは創傷に隣接した部位に直接、投与することができる。対象への組成物の投与は、創傷治癒の促進をもたらす。
【００４７】
糖尿病の対象における糖尿病性創傷の治癒方法は、対象に高圧酸素療法を実施する工程をさらに含んでいてもよい。本明細書において記載した方法においては、高圧酸素療法（ＨＢＯ２）は通常、毛細血管が少なくなった状況下で、創傷治癒を刺激するために用いられる補助的な治療である。ＨＢＯ２を用いた糖尿病の対象の治療方法は、例えば、参照することにより本明細書に組み入れられる、米国特許第２００８／００３７６０号に記載されている。糖尿病の対象（患者）における創傷治癒の促進方法の一例においては、患者は１日に１回又は２回、絶対気圧（ＡＴＡ）が約２．０から約３．２の間になるように圧をかけたチャンバー内で、１００％ Ｏ２を吸い込む処置を２０回以上受ける。処置時間は通常、約１０分から約２４０分（例えば、約１０、１５、３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０分など）の範囲である。
【００４８】
別の実施形態においては、糖尿病性創傷を有する糖尿病の対象においてＥ−セレクチンの発現をアップレギュレートする方法は、第一のＡＡＶ逆方向末端反復と第二のＡＡＶ逆方向末端反復との間に挿入されたＥ−セレクチンをコードするポリヌクレオチドを含有する少なくとも１つのｒＡＡＶビリオンを包含する組成物を、糖尿病の対象に投与する工程を含む。この実施形態においては、この組成物の量は、Ｅ−セレクチンの発現をアップレギュレートする、骨髄由来前駆細胞（例えば、ＥＰＣ）の創傷への遊走を誘導する、及び対象における創傷治癒を促進するのに有効な量である。この方法においては、少なくとも１つのｒＡＡＶビリオンは、血清型２カプシドタンパク質を含む場合がある。本明細書において記載するその他の実施形態では、組成物を任意の好適な経路、例えば、経口的、局所的、静脈内、又は、創傷若しくは創傷に隣接した部位に直接、投与することができる。この方法は、対象にＳＤＦ−１αタンパク質又はＳＤＦ−１αタンパク質をコードする核酸を投与する工程、及び／又は対象に高圧酸素療法を実施する工程をさらに含んでいてもよい。
【００４９】
さらにその他の実施形態においては、糖尿病の対象における糖尿病性創傷の治癒を促進する方法は、薬学的に許容可能な担体と複数の骨髄由来前駆細胞を含む組成物を提供する工程、及び、この組成物を対象に、骨髄由来前駆細胞（例えば、ＥＰＣ）の創傷への遊走を増加させ、かつ対象における創傷治癒を促進するのに有効な量を、投与する工程を含む。この実施形態においては、骨髄由来前駆細胞は、Ｅ−セレクチンをコードするポリヌクレオチドを含む。Ｅ−セレクチンをコードするポリヌクレオチドを、ｒＡＡＶベクターのようなウイルスベクター中に含有させてもよい。通常、ｒＡＡＶベクターはｒＡＡＶウイルス（粒子）に含有される。この実施形態においては、組成物は、ＳＤＦ−１αタンパク質又はＳＤＦ−１αタンパク質をコードする核酸を、さらに含んでいてもよい。組成物がＳＤＦ−１αをコードする核酸を含む場合、この核酸はｒＡＡＶベクター中、第二のｒＡＡＶベクター中、又はｒＡＡＶ以外のウイルスベクター中に存在する可能性がある。組成物を、任意の好適な経路、例えば、経口的、局所的、静脈内、又は、創傷又は創傷に隣接した部位に直接、投与することができる。この方法は、対象に高圧酸素療法を実施する工程をさらに含んでいてもよい。
【００５０】
本明細書において記載した方法は、数多くの異なる型の創傷の治療に用いることができる。糖尿病性創傷の一例としては、網状皮斑及び白色萎縮に関連した有痛性潰瘍により特徴付けられる障害である、リベド血管炎が挙げられる。糖尿病性創傷の別の例としては、例えば、末梢動脈疾患性潰瘍、静脈鬱血性潰瘍、慢性難治性潰瘍、褥瘡、褥瘡性潰瘍、慢性足潰瘍などの糖尿病性潰瘍がある。創傷は、１以上の上記に挙げた創傷の組み合わせである場合もある。糖尿病の対象は、治療を受ける１つ又は複数の創傷を有する場合もある。対象は、ヒト、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、サル、類人猿、ウサギ、ウシなどのような任意の哺乳類を含む。対象（例えば、哺乳類）は、成人及び小児を含む、発達のいずれの段階にあるものであってもよい。標的組織は、網膜、肝臓、腎臓、心臓、肺、消化管の部分、膵臓、胆嚢、膀胱、中枢神経系（脳を含む）、皮膚、骨などのような、対象におけるいずれの組織であってもよい。
【００５１】
Ｅ−セレクチンをコードする核酸（及び任意にＳＤＦ−１αをコードする核酸又はその他のＥＰＣホーミングを調節する薬剤）を糖尿病の対象に投与する方法においては、本明細書において記載した核酸は、Ｅ−セレクチンをコードする核酸（及び任意にＳＤＦ−１αをコードする核酸又はその他のＥＰＣホーミングを調節する薬剤）に操作可能に連結した、１つ以上の発現制御配列を含む場合がある。数多くのそのような配列が知られている。含まれるそれらの配列は、その他の適用におけるそれらの既知の機能に基づいて選択され得る。発現制御配列の例としては、プロモーター、インシュレーター、サイレンサー、応答エレメント、イントロン、エンハンサー、開始部位、終結シグナル、及びｐＡテールが挙げられる。
【００５２】
Ｅ−セレクチン（及び任意にＳＤＦ−１α）を適切なレベルにするために、標的細胞において使用するのに好適な、任意の数のプロモーターを用いることができる。例えば、異なる強さの構成的プロモーターを用いることができる。本明細書において記載した発現ベクター及びプラスミドは、ウイルス性プロモーター、又は、通常転写の促進において活性を有する哺乳類の遺伝子由来のプロモーターのような、１つ以上の構成的プロモーターを含んでもよい。構成的なウイルス性プロモーターの例としては、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、Ａｄ Ｅ１Ａ及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターが挙げられる。構成的哺乳類プロモーターの例としては、β−アクチンプロモーターのような、様々なハウスキーピング遺伝子のプロモーターが挙げられる。
【００５３】
誘導性プロモーター及び／又は調節エレメントもまた、本明細書において記載した組成物及び方法での使用のために検討されてもよい。好適な誘導性プロモーターの例としては、シトクロムＰ４５０遺伝子、熱ショックタンパク質遺伝子、メタロチオネイン遺伝子、及びホルモン誘導性遺伝子（エストロゲン遺伝子プロモーターなど）のような遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターの別の例には、テトラサイクリン応答性のｔｅｔＶＰ１６プロモーターがある。
【００５４】
組織特異的プロモーター及び／又は調節エレメントは、本明細書において記載した組成物及び方法の特定の実施形態において有用である。本明細書において記載した発現ベクターのような発現ベクターと共に用いることができるそれらプロモーターの例としては、Ｔｉｅ−２又はＫＤＲ＿プロモーターが挙げられる。
【００５５】
本明細書において記載した組成物（例えば、Ｅ−セレクチンをコードするウイルスベクターを含む組成物）を哺乳類対象に、任意の好適な技術により投与することができる。本明細書において記載した組成物及び方法により、細胞中にＥ−セレクチン遺伝子を導入するためのウイルスベクターを用いた、様々な技術が提供される。ウイルスは、それらの遺伝子を宿主細胞中に効率良く送達する、天然に発生した媒体であり、従って、治療的遺伝子の送達のための望ましいベクター系である。好ましいウイルスベクターは宿主細胞に対する低い毒性を示し、かつ、治療的な量のＥ−セレクチンタンパク質を（例えば、組織特異的な方法で）生産するものである。ウイルスベクター法及びプロトコールは、Ｋａｙ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７：３３−４０， ２００１にまとめられている。
【００５６】
以下に記載した実施例はｒＡＡＶ及びレンチウイルスを含むが、任意の好適なウイルスベクターを使用することができる。哺乳類対象に遺伝子を送達するための多くのウイルスベクターが当該分野において既知であり、以下に限定的な例を挙げる。遺伝子治療ベクターとして組換えアデノウイルスを使用する方法は、例えば、Ｗ．Ｃ． Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８１：２５７３−２６０４， ２０００，及びＢｒａｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ６：５９０−５９５， １９９５で議論された。単純ヘルペスウイルスベクターの使用方法については、例えば、Ｃｏｔｔｅｒ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． ＭｏＩ． Ｔｈｅｒ． １：６３３−６４４， １９９９で議論された。ＨＩＶを含む、複製欠損レンチウイルスベクターもまた用いることができる。レンチウイルスベクターの使用方法は、例えば、Ｖｉｇｎａ ａｎｄ Ｎａｌｄｉｎｉ， Ｊ． Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ． ５：３０８−３１６， ２０００ 及び Ｍｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：８１５０−８１５７， １９９８で議論された。マウス白血病ウイルスに基づくベクターを含む、レトロウイルスベクターもまた用いることができる。レトロウイルスに基づくベクターの使用方法は、例えば、Ｈｕ ａｎｄ Ｐａｔｈａｋ， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｒｅｖ． ５２：４９３−５１１， ２０００ 及び Ｆｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｔｈｅｒ． Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ． １７：１−６０， ２０００で議論された。用いることができるその他のウイルスベクターには、セムリキ森林ウイルス及びシンドビスウイルスを含む、アルファウイルスが挙げられる。Ｅ−セレクチン遺伝子を標的組織（例えば、糖尿病性創傷）に送達するために、ハイブリッドウイルスベクターを用いてもよい。ハイブリッドベクターを構築するための標準的な技術は当業者に周知である。そのような技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ又は組換えＤＮＡ技術について議論した多くの実験手引き書において見ることができる。
【００５７】
いくつかの実施形態においては、本明細書において記載した組成物及び方法の核酸は、それらの細胞中への導入を促進するために、ｒＡＡＶベクター及び／又はビリオン中に組み入れられる。有用なｒＡＡＶベクターは、（１）発現する異種配列（例えば、Ｅ−セレクチンタンパク質をコードするポリヌクレオチド）及び（２）異種遺伝子の組換え及び発現を促進するウイルス配列、を含む組換え核酸構築物である。ウイルス配列は、複製、及びＤＮＡのビリオン中へのパッケージング（例えば、機能性ＩＴＲ）のためにシスに必要とされるＡＡＶの配列を含む場合もある。一般的な適用においては、異種遺伝子は、骨髄由来前駆細胞の創傷への遊走を増加し、糖尿病の対象における創傷治癒を促進するのに有用なＥ−セレクチンをコードする。そのようなｒＡＡＶベクターは、マーカー又はレポーター遺伝子をもまた含む場合がある。有用なｒＡＡＶベクターは、その全体又は一部分が欠損しているが機能性ＩＴＲ配列を保持する、１つ以上のＡＡＶ ＷＴ遺伝子を有する。ＡＡＶ ＩＴＲは、特定の適用において好適な任意の血清型（例えば、血清型２由来の）であってよい。ｒＡＡＶベクターの使用方法は、例えば、Ｔａｌ， Ｊ．，Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｓｃｉ． ７：２７９−２９１， ２０００及びＭｏｎａｈａｎ ａｎｄ Ｓａｍｕｌｓｋｉ， Ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ７：２４−３０， ２０００において議論された。
【００５８】
本発明の核酸及びベクターを、その核酸又はベクターの細胞中への導入を促進するために、ｒＡＡＶビリオン中に組み入れることができる。ＡＡＶのカプシドタンパク質は、ビリオンの外部、非核酸部分を含み、かつ、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子によりコードされる。ｃａｐ遺伝子は、ビリオンの集合に必要な３つのウイルス性コートタンパク質であるＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３、をコードする。ｒＡＡＶビリオンについては既に記載がある。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号、同５，１３９，９４１号、同５，８６３，５４１号、及び同５，８６９，３０５号、同６，０５７，１５２号、同６，３７６，２３７号；Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：７９１−８０１、２００２；並びに、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７６：７９１−８０１， ２００２；及びＢｏｗｌｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７７：４２３−４３２， ２００３を参照のこと。
【００５９】
本発明において有用なｒＡＡＶビリオンは、１、２、３、４、５、６、７、８及び９を含む、多数のＡＡＶ血清型由来のビリオンを含む。異なる血清型のＡＡＶベクター及びＡＡＶタンパク質の構築及び使用については、Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．， ＭｏＩ． Ｔｈｅｒ． ２：６１９−６２３， ２０００； Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ９７：３４２８−３４３２， ２０００； Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：２２２４−２２３２， １９９８； Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７４：１５２４−１５３２， ２０００； Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７５：６６１５−６６２４， ２００１；及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎｅｔ． １０：３０７５−３０８１， ２００１において議論された。
【００６０】
本明細書において記載した組成物、キット及び方法においては、偽型ｒＡＡＶもまた有用である。偽型ベクターは、ある特定の偽型血清型のＡＡＶベクターと、その特定の血清型以外の血清型由来のカプシド遺伝子とを含む。偽型ｒＡＡＶビリオンの構築及び使用を含む技術は、当該分野において既知であり、及びＤｕａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ， ７５：７６６２−７６７１， ２００１； Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ， ７４：１５２４−１５３２， ２０００； Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ， Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２８： １５８−１６７， ２００２；及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ， Ｈｕｍ． Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎｅｔ． １０：３０７５−３０８１， ２００１に記載されている。
【００６１】
特定の細胞型に、非変異型カプシドビリオンを用いた場合よりも、より効果的に感染させるために、ビリオンカプシド中に変異を有するＡＡＶビリオンを用いてもよい。例えば、好適なＡＡＶ突然変異体は、ＡＡＶの特異的細胞型へのターゲティングを促進するために、リガンド挿入変異を有する場合もある。挿入変異体、アラニンスクリーニング突然変異体、及びエピトープタグ突然変異体を含むＡＡＶカプシド突然変異体の構築及び解析については、Ｗｕ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７４：８６３５−４５，２０００に記載されている。本明細書において記載した方法及び組成物において使用することができるその他のｒＡＡＶビリオンとしては、ウイルスの分子育種並びにエキソンシャッフリングにより生成されたカプシドハイブリッドがある。Ｓｏｏｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ２５：４３６−４３９， ２０００；及びＫｏｌｍａｎ ａｎｄ Ｓｔｅｍｍｅｒ Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９：４２３−４２８， ２００１を参照のこと。
【００６２】
ウイルスベクター又はウイルス粒子の注入による非経口投与、例えばボーラス注入又は持続注入、を行ってもよい。注入用製剤は、単位容量形態、例えばアンプル中又は複数回投与用の容器中に、保存料を含めて提供してもよい。組成物は、懸濁液、溶液、又は油性若しくは水性媒体中の乳濁液としてそのような形態をとることができ、また、懸濁化剤、安定化剤、及び／又は分散剤のような成形剤を含んでもよい。あるいは、ベクター又はウイルス粒子は、使用前に無菌の発熱物質を含まない水などで構成するための粉末形態（例えば凍結乾燥した）であってもよい。
【００６３】
ウイルスベクターに加え、少なくとも１つの糖尿病性創傷を有する糖尿病の対象へＥ−セレクチンをコードする核酸を導入するのに好適な任意の媒体又はベクターを用いることができる。例えば、超音波を用いた遺伝子送達技術を用いることができる。さらなる例としては、パーティクルボンバードメント及び細胞のエレクトロポレーションが挙げられる。プラスミドＤＮＡと共に多細胞性集合体を形成する、合成遺伝子導入分子もまた有用である。そのような分子には、高分子ＤＮＡ結合性陽イオン（Ｇｕｙ ｅｔ ａｌ．，ＭｏＩ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３：２３７−２４８，１９９５）、陽イオン性両親媒性試薬（リポポリアミン及び陽イオン性脂質、Ｆｅｉｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７２：１２６−１３９，１９９５）、及び陽イオン性リポソーム（Ｆｏｍｉｎａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．２：４５５−４６４，２０００）が含まれる。
【００６４】
いくつかの実施形態においては、ｒＡＡＶ−Ｅ−セレクチンベクター又はウイルスを含むＥＰＣを、１以上の糖尿病性創傷を治療するために糖尿病の対象に投与する。対象にＥＰＣを導入するためには、カテーテルを介した静脈内送達（例えば、血管内カテーテル）又は標的部位、例えば糖尿病性創傷への直接注入を含む複数の方法が用いられ得る。ドナー幹細胞の単離及び、そのような単離した細胞の移植の技術は当該分野において周知である。ｒＡＡＶビリオンを用いて導入した細胞のｅｘ ｖｉｖｏ送達もまた、本明細書において記載した方法に包含される。ｅｘ ｖｉｖｏの遺伝子送達は、移植、例えばｒＡＡＶを導入した宿主細胞（例えばＥＰＣ）を宿主に戻すために用いられる場合がある。好適なｅｘ ｖｉｖｏのプロトコールは複数の工程を含む場合がある。標的組織のセグメント（例えば、ＢＭ由来ＥＰＣ）を宿主から回収してもよく、及びＥ−セレクチンをコードする核酸を対象（すなわち宿主）の細胞に導入するために、ｒＡＡＶビリオンを用いてもよい。これらの遺伝的に改変された細胞をその後、対象に戻すために移植してもよい。細胞を対象に再導入するためには、静脈内注入、腹腔内注入、又は標的組織へのｉｎ ｓｉｔｕ注入を含む複数の方法が用いられ得る。用いることができるその他の技術には、ｅｘ ｖｉｖｏでｒＡＡＶを導入又は感染させた細胞のマイクロカプセル化がある。本発明による自家並びに同種細胞移植を用いてもよい。
【００６５】
ＢＭから非ＢＭ区域（例えば、標的組織）へのＢＭ由来前駆細胞のリクルートメントを増加するために、本明細書において記載した創傷治癒を促進する組成物は、Ｅ−セレクチン及びＳＤＦ−１αに加えて、ＢＭ由来前駆細胞のリクルートメントを促進することができる任意のその他の薬剤を含む場合がある。多数のそのような薬剤が既知である。例えば、国際公開第００／５００４８号に記載されている薬剤；インテグリン（例えば、α４、α５）、接着分子のセレクチンファミリー、ＶＣＡＭ−１、及びコロニー刺激因子を参照のこと。
【００６６】
本明細書において記載した治療方法は通常、治療を必要とする哺乳類（特にヒト）対象（例えば動物、ヒト）に、治療有効量の本明細書において記載した組成物を投与する工程を含む。そのような治療は、対象（特に、疾患、障害、又はその症状に、罹患している、有する、感受性のある、又はリスクを有するヒト）に好適な方法で投与される。「リスクを有する」対象の決定は、診断検査又は対象若しくは健康管理者の意見による、任意の主観的又は客観的判断においてなされる場合がある。本明細書において記載される方法及び組成物は、Ｅ−セレクチンのシグナル伝達、発現、又は活性のダウンレギュレーションを意味すると考えられる、いずれのその他の障害の治療にもまた有用である可能性がある。
【００６７】
一実施形態においては、糖尿病の対象における糖尿病性創傷の治癒を促進する方法は、治療経過をモニタリングする工程を含む。対象における治療経過のモニタリングは通常、創傷の治療を促進するのに十分な治療量の本明細書において記載した組成物を対象に投与する前に、糖尿病性創傷を有する対象における創傷の大きさの測定値又はその他の診断的測定値を決定する工程を含む。治療を促進するのに十分な治療量の本明細書において記載した組成物を対象に投与した後、１回以上の時点において、創傷の大きさの２回目の測定を行い、最初に測定した創傷の大きさと比較する。最初及びその後の大きさを、創傷治癒の経過（例えば創傷の大きさの減少）及びその治療の効果をモニターするために比較する。
【００６８】
キット
哺乳類対象における少なくとも１つの糖尿病性創傷を治療するキットを本明細書において記載した。一般的にはキットは、Ｅ−セレクチンタンパク質、Ｅ−セレクチンタンパク質をコードする核酸、又はＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートする薬剤のような治療薬を少なくとも１つと、薬学的に許容可能な担体とを含有する、治療有効量の組成物、並びに使用説明書を含む。一実施形態においては、キットは、治療有効量のＥ−セレクチンタンパク質又はＥ−セレクチンタンパク質をコードする核酸、及びＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートする薬剤を含有する治療用組成物、並びに使用説明書を含む。例えば、哺乳類対象における少なくとも１つの糖尿病性創傷を治療するキットは、治療有効量のＥ−セレクチンタンパク質又はＥ−セレクチン（例えば、ｒＡＡＶ−Ｅ−セレクチン）をコードする核酸、及び創傷治癒を促進する治療有効量のＳＤＦ−１α、並びに薬学的に許容可能な担体とを単位容量形態で含有する治療用組成物を含む。通常、本明細書において記載したキットは、包装及び使用説明書を含む。いくつかの実施形態においては、このキットは治療用又は予防用組成物を含む無菌的な容器を含む。そのような容器は、箱、アンプル、瓶、バイアル、チューブ、袋、パウチ、ブリスターパック、又はその他の、当該分野において既知の好適な形態の容器であってよい。そのような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属ホイル、又はその他の、薬物を保持するための好適な材料から作製することができる。本明細書において記載した治療用組成物に加えて、治療を受ける対象に高圧酸素療法を実施する実施形態においては、使用説明書は一般的に、対象への高圧酸素療法の実施についての方法を含むだろう。
【００６９】
ＥＰＣ（例えば、ｒＡＡＶ−Ｅ−セレクチンを含むＥＰＣ）を糖尿病の対象に投与する一実施形態では、本明細書において記載したキットは、治療量のＥＰＣと共に、１つ以上の糖尿病性創傷を有する対象への細胞の投与方法についての説明書を含む。細胞を輸送及び保存するために好適な任意の手段で、細胞を包装することができ、そのような方法は当該分野において周知である。使用説明書は通常、細胞；糖尿病性創傷の治療のための投与量計画及び投与；予防策；警告；適応症；不適応症；過剰投与情報；有害反応；動物での薬理；臨床試験；及び／又は参考文献、についての説明を１つ以上含む。この使用説明書は、容器（がある場合）に直接印刷してもよく、又は容器に適用したラベルとして、又は、容器中に若しくは容器と共に提供する別個の紙、パンフレット、カード若しくはホルダーとして印刷してもよい。
【００７０】
組成物の投与
本発明の組成物を、哺乳類（例えば、齧歯類、ヒト）に任意の好適な製剤として投与することができる。例えば本明細書において記載した創傷治癒を促進する組成物（例えば、Ｅ−セレクチン、Ｅ−セレクチンをコードする核酸、ＳＤＦ−１α）を、薬学的に許容可能な担体又は生理食塩水若しくは緩衝塩類溶液のような希釈剤中に処方することができる。方法及び投与経路並びに標準的な薬務に基づき、好適な担体及び希釈剤を選択することができる。薬学的に許容可能な担体及び希釈剤、並びに薬剤処方の例についての説明は、当該分野における標準的な教科書であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、及びＵＳＰ／ＮＦ中に見ることができる。組成物の安定化及び／又は保存のために、その他の物質を加えてもよい。
【００７１】
任意の標準的な技術により、本発明の組成物を哺乳類に投与することができる。一般的には、それらの投与は、局所（例えば、エアロゾル、クリーム、泡、ゲル、液体、軟膏、ペースト、粉末、シャンプー、スプレー、パッチ、円板状、若しくは包帯）又は経口となるであろう。一実施形態において組成物が経口送達用に処方される場合、活性成分は賦形剤に含まれ、摂取可能な錠剤、口腔用錠剤、トローチ、カプセル、エリキシール、懸濁液、シロップ、ウェハース、などの形態において用いられ得る。錠剤、トローチ、丸薬、カプセルなどは、結合剤（トラガカントゴム、アカシアゴム、コーンスターチ、若しくはゼラチンなど）；賦形剤（第二リン酸カルシウムなど）；崩壊剤（コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸など）；滑沢剤（ステアリン酸マグネシウムなど）；及び甘味料（ショ糖、ラクトース、若しくはサッカリンなどを加えてもよい）又は香味料（ペパーミント、イチヤクソウ油、若しくはサクランボ香料）をまた含んでいてもよい。投与量単位形態がカプセルである場合、それは、上述の型の材料に加え、液体担体を含んでもよい。様々なその他の材料を、被覆材として、そうでなければ投与量単位の物理的形状を変化させるものとして含んでもよい。例えば、錠剤、丸薬又はカプセルを、シェラック、糖、又はその両方で被覆してもよい。エリキシールのシロップは、活性化合物、甘味料としてのショ糖、保存剤としてのメチルパラベン及びプロピルパラベン、色素、並びに香味料としてのサクランボ及びオレンジ香料を含む場合がある。加えて、活性化合物を、徐放性、パルス放出性、制御放出性又は遅延放出性調整物及び製剤中に組み入れることもできる。
【００７２】
あるいは、投与は非経口（例えば、静脈内、皮下、腫瘍内、筋内、腹腔内、又は髄腔内導入）であってもよい。本明細書においては、組成物はまた、皮内パッチ、すなわち治療する皮膚部分に隣接して投与するパッチを介しても提供され得る。本明細書で使用する場合、「パッチ」は少なくとも、本明細書において提供される組成物、及びそのパッチが治療する皮膚部分を覆って配置される被覆層を含む。本明細書において提供する組成物の、角質層を介した表皮又は真皮への送達が最大になるように、遅滞時間が減少するように、一様な吸収を促進するように、及び機械的な摩擦落ちを低減させるように、パッチを設計することができる。
【００７３】
組成物を標的部位に、例えば、標的部位の内部若しくは外部への外科的な送達、又は血管から到達することが可能な部位へのカテーテル（例えば、血管内カテーテル）を用いて、直接投与することもできる。糖尿病性創傷を有する対象を治療する場合、静脈内に、直接創傷中に、又は創傷表面に、組成物を対象に投与することができる。組成物を、単一の丸薬、頻回注射として、又は持続注入（例えば、静脈内に、腹膜透析、輸液ポンプ）により投与することができる。非経口投与については、組成物は好ましくは無菌的な発熱物質を含まない形態において処方される。
【００７４】
治療薬（例えば、Ｅ−セレクチンタンパク質、Ｅ−セレクチンをコードする核酸、Ｅ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートする薬剤）を実質的に投与の直後に、又は投与後の任意の予め決められた時間若しくは期間放出するように、本明細書において記載した医薬組成物を処方してもよい。後者の型の組成物は通常、制御放出処方として知られている。長期間にわたって体内の薬の濃度を実質的に一定にする製剤を用いることができる。別の実施形態においては、予め決められた遅滞時間の後に、長期間にわたって体内の薬の濃度を実質的に一定にする製剤を用いることができる。別の例としては、相対的な、一定の、効果的な体内レベルを維持し、同時に、活性物質の血漿レベルにおける変動と関係する望ましくない副作用を最小限にすることにより、予めじめ決められた期間中その作用を持続する製剤を用いることができる。本明細書において記載した組成物は、簡便な投与、例えば投与量の毎週又は隔週に一度の投与、を可能にする製剤、並びに、例えば浸透圧ポンプ又は治療薬を特定の細胞型（例えば、内皮細胞）に送達するための超音波を用いた遺伝子送達技術により糖尿病性創傷を標的とする製剤においてもまた用いられる。
【００７５】
送達される治療薬の放出速度が代謝速度に勝る制御放出を達成するために、数多くの方法が使用可能である。一例において制御放出は、様々な製剤指標、並びに成分（例えば、様々な型の制御放出組成物及び被覆剤を含む）の適切な選択により達成される。治療薬を適切な賦形剤と共に、投与に際して治療薬を制御された方法で放出する医薬組成物として処方することができる。例としては、単一又は複数単位の錠剤若しくはカプセル組成物、油溶液、懸濁液、乳濁液、マイクロカプセル、ミクロスフェア、分子複合体、ナノ粒子、パッチ、及びリポソームが挙げられる。
【００７６】
有効投与量
上述した組成物は、有効量で、すなわち治療される哺乳類において所望される効果（例えば、成熟ＥＣでのＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートし、ＥＣ−ＥＰＣ間接着、ＥＰＣホーミング及び創傷血管新生の増加を誘導することにより、マウスにおける糖尿病性創傷の治癒を促進する）をもたらすことが可能である量で、好ましくは哺乳類（例えば、ヒト）に投与される。そのような治療有効量は以下に記載するように決定することができる。
【００７７】
本発明の方法において用いられる組成物の毒性及び治療上の有効性は、培養細胞、又はＬＤ５０（集団の５０％致死量）を決定するための実験動物のいずれかを用いて、標準的な薬学的手法により決定することができる。毒性と治療効果との間の用量比が治療指数であり、これはＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療指数を示す組成物が好ましい。有毒性の副作用を示す組成物を使用することもできるが、そのような副作用による潜在的な被害を最少にする送達系を設計する治療を用いなくてはならない。好ましい組成物の投与量は、好ましくは、毒性がないまたは毒性がほとんどない、ＥＤ５０を含んだ範囲にある。投与量は、用いられる投与形態及び使用する投与経路により、この範囲内で多様になり得る。
【００７８】
医学及び獣医学の分野において周知であるように、任意のある対象に対する投与量は、対象の大きさ、体表面積、年齢、投与する特定の組成物、投与の時間及び経路、総体的な健康、及び同時に投与されるその他の薬剤、を含む多くの因子に左右される。静脈内に投与する粒子の適切な投与量は、例えば、１つの創傷当たり約１０９のウイルス粒子、及び組換えタンパク質（例えば、ＳＤＦ−１α、Ｅ−セレクチン）の適切な投与量は例えば、２５μｇ／ｋｇの範囲になると予測される。
【００７９】
実施例
本発明を以下の特定の実施例によりさらに説明する。提供した実施例は説明するためだけのものであり、決して本発明の範囲を限定すると解釈されるものではない。
【００８０】
実施例１ Ｅ−セレクチンはＳＤＦ−１αに応答して内皮前駆細胞のホーミングを仲介し、また、正常な四肢血行再建及び創傷治癒率を仲介する：糖尿病に関連した難治性細小血管障害及び難治性創傷への潜在的な臨床的有用性
ＳＤＦ−１αは、骨髄から血管新生を必要とする末梢部位へとＥＰＣをリクルートさせるためのホーミングシグナルを生じるが（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＳＤＦ−ｌα ａｓ ａ ｃｒｉｔｉｃａｌｌｙ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｆａｃｔｏｒ， ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ Ｄｉａｂｅｔｅｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｎｏｎ−ｈｅａｌｉｎｇ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｗｏｕｎｄｓ： Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００７， １１７：１２４９−１２５９）、ＳＤＦ−１αによって循環しているＥＰＣが標的組織へとホーミングするようになる機序は、これまで明かになっていなかった。ＥＰＣの標的組織へのホーミングを達成するためには、毛細血管内膜のＥＣと循環しているＥＰＣとの間の直接的な細胞間相互作用が必要であり、かつ、それらの相互作用が四肢血行再建及び皮膚創傷の治癒率に影響を与えると推測された。本明細書においては、成熟ＥＣにおいてＳＤＦ−１αにより制御される特異的接着分子であって、ＥＰＣホーミング過程を仲介する分子の同定について記載した。マウス及びヒト細胞における研究によるこの新規データから、この分子をＥ−セレクチンと同定した。さらなるデータにより、Ｅ−セレクチンの組織レベルの発現が、四肢血行再建及び創傷治癒に有利に影響を与えることが示された。また、Ｅ−セレクチンを細小血管障害に罹患した難治性創傷（糖尿病を有する患者における難治性創傷のような）へ局所的に送達することが、新しい創傷治癒技術としての有用性をもたらすだろうと推測された。虚血性及び糖尿病性創傷において試験することができる、Ｅ−セレクチンをコードするＡＡＶベクターを開発中である。
【００８１】
ＲＴ２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ ＰＣＲアレイを用いて、ヒト成熟ＥＣにおいてＳＤＦ−１αによって誘導される細胞外マトリックス及び接着分子を解析した。アレイにより、遺伝子発現が有意に増加することが認められた分子については、ウェスタンブロッティング及び免疫組織化学によって確認した。ヒトＥＰＣとＥＣとの間の直接的な細胞間相互作用におけるＳＤＦ−１αの効果を、細胞接着及び経内皮遊走アッセイによって解析した。同定した接着分子の、ＳＤＦ−１α誘導性ＥＣ−ＥＰＣ相互作用、ＥＰＣホーミング、四肢血管再建、及び創傷治癒の仲介における特異的な機能を、アンタゴニストを用いてインビトロ及びインビボで試験した。組織レベルでのＥ−セレクチンの発現がある場合及び発現がない場合のＥＰＣの創傷へのリクルートメント、及び創傷治癒率を調べるために、骨髄移植実験（Ｒａｓａ２６マウス由来の骨髄細胞をＥ−ｓｅｌ＋／＋若しくはＥ−ｓｅｌ−／−マウスに移植した）を行った。データをＡＮＯＶＡにより解析した。
【００８２】
ＳＤＦ−１αは、インビトロでのＥＣ−ＥＰＣ間接着及び経内皮遊走を有意に増加させ、及びインビボでのＥＰＣホーミングを高めた。ＳＤＦ−１αは、培養ヒト成熟微小血管ＥＣ及び実験用マウスの血管におけるＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートしたが、Ｐ−及びＬ−セレクチンの発現は増加させなかった。Ｅ−セレクチンアンタゴニストの適用がＳＤＦ−１α誘導性ＥＣ−ＥＰＣ間接着、遊出及びＥＰＣホーミングを有意に阻害したように、ＥＣ−ＥＰＣ間接着及びＥＰＣホーミングにおけるＳＤＦ−１αの効果はＥ−セレクチンにより特異的に仲介される。インビボにおいてはＥ−セレクチンの組織レベルでの発現が正常な創傷治癒及び血管新生に必要であり、Ｅ−セレクチンの組織レベルでの発現は、糖尿病に関連した難治性創傷の正常な治癒及び不良において重大なこれら２つの生物学的イベントに好都合な影響を及ぼす。
【００８３】
結論として、ＳＤＦ−１αは成熟ＥＣにおけるＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートして、ＥＣ−ＥＰＣ間接着、ＥＰＣホーミング、四肢血管再建、及び創傷治癒の増加を引き起こす。これら新規の知見は、ＥＰＣホーミング及び糖尿病性創傷の治癒に及ぼすＳＤＦ−１αの生物学的効果の根底にある分子機構に対する深い洞察を提供し、その結果、糖尿病に関連した細小血管障害及び難治性皮膚創傷におけるＥＰＣ輸送、血管新生、及び創傷治癒の治療上の取扱いにおいてＥ−セレクチンが新しい標的であることを示す。
【００８４】
実施例２ 後天的な血管新生の制御に対する新規標的としてのＥ−セレクチンの同定：糖尿病性創傷治癒における重要性
糖尿病性創傷においては、ＥＰＣの血管新生部位へのリクルートメントのためのホーミングシグナルであるＳＤＦ−１αがダウンレギュレートされていることがこれまでに報告されている（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００７， １１７：１２４９−１２５９）。以下に記載した実施例では、成熟ＥＣ及び循環しているＥＰＣのＳＤＦ−１α介在性ＥＰＣホーミングを達成するシグナルについての研究を行った。糖尿病性創傷におけるＳＤＦ−１αは、ＳＤＦ−１α改変骨髄由来繊維芽細胞を注入することにより、対照細胞と比較して、治療的に増加した（Ｎ＝４８（２０、ＮＯＤ）、（２８、ＳＴＺ−Ｃ５７））。ＰＣＲアレイによる遺伝子発現の違いを、ウェスタンブロッティング及び免疫組織化学により確認した。さらにアンタゴニストを用いて、ＳＤＦ−１α誘導性ＥＰＣホーミング及び創傷治癒の仲介における接着分子の機能についてインビトロ及びインビボで研究を行った。細胞を用いた治療を介した創傷でのＳＤＦ−１αの増加は、糖尿病性マウスでの治癒を促進した（３日目における治癒率は〜２０％増加した。ｐ＝０．００６）。ＳＤＦ−１αはＥＣ−ＥＰＣ間接着を増加させ、ヒト微小血管ＥＣにおけるＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートした（２．３倍の増加、ｐ＜０．０１）。この効果は実験マウスの血管においても有意であり、そして創傷性血管新生の増加をもたらした。ＥＣ−ＥＰＣ間接着及びＥＰＣホーミングにおけるＳＤＦ−１αの制御効果はＥ−セレクチンによって特異的に仲介され、Ｅ−セレクチンアンタゴニストの適用はＳＤＦ−１α誘導性ＥＣ−ＥＰＣ間接着、ＥＰＣホーミング、創傷性血管新生、及び創傷治癒を有意に阻害した。ＳＤＦ−１α改変細胞を用いた治療は、成熟ＥＣにおけるＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートしてＥＣ−ＥＰＣ間接着の増加、ＥＰＣホーミング、及び創傷性血管新生の増加を引き起こすことにより、マウスにおける糖尿病性創傷治癒を促進した。これらの知見は、ＥＰＣホーミングにおけるＳＤＦ−１αの生物学的効果の根底にあるシグナルについての新規の知見を提供し、かつ、糖尿病性創傷の治癒でのＥＰＣ輸送の治療的取扱いにおいてＥ−セレクチンが新しい標的となることを示すものである。
【００８５】
材料及び方法
正常ヒト真皮からＨＭＶＥＣを単離し、１％ゼラチンでコーティングしたプレート上で培養した。ヒトＥＰＣをＮＤＲＩ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）から購入し、サプリメント及び５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を含む完全ＥＧＭ２培地中で培養した。２９３、２９３Ｔ及びＮＩＨ／３Ｔ３細胞を１０％ ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｓｂａｄ、ＣＡ）中で培養した。細胞は全て、５％ ＣＯ２を含む９８％に加湿した大気中、３７℃で培養した。細胞接着及び経内皮遊走アッセイには、ＥＰＣをＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ（ＢＴ−９０２，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ，ＭＡ）で４時間、３７℃で標識し、その後リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。サブコンフルエントに達したＨＭＶＥＣ又はＥＰＣを組換えヒトＳＤＦ−１α（１００ｎｇ／ｍｌ）で、実施例において示したように様々な時間刺激した。ＢＳＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）を対照として用いた。
【００８６】
８〜１２週齢の野生型（ＷＴ）のメスのＣ５７ＢＬ６マウスはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から購入した。１０〜１２週齢のＮＯＤ（ＮＯＤ／ｓｈｉｌＴＪ）、８週齢のＥ−ｓｅｌ−／−（Ｂ６．１２９Ｓ４−ｓｅｌｅｔｍｉＤｍｉｌ／Ｊ）マウス及び１０〜１２週齢のＲｏｓａ２６（ｌａｃＺ＋）（Ｂ６．１２９Ｓ７−ＧＴ（ＲＯＳＡ）２６ｓｏｒ／Ｊ）マウスはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入した。全ての外科的手法では、８０ｍｇ／ｋｇのケタミン及び２０ｍｇ／ｋｇのキシラジンの腹腔内注入により、マウスを麻酔した。骨髄移植実験には、Ｒｏｓａ２６マウス由来の１ｘ１０７個の骨髄細胞を１００μｌのＰＢＳに懸濁し、尾静脈注射により、Ｅ−ｓｅｌ−／−又はＷＴマウス（Ｃ５７ＢＬ６）中に移植した。
【００８７】
既に記載のあるようにストレプトゾシン（ＳＴＺ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）糖尿病を誘導し、モニターした（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００７，１１７：１２４９−１２５９）。ＮＯＤマウスは一般に、１４〜２０週以内に糖尿病を発症する。全４８匹の糖尿病マウス（Ｎ＝２８、ＳＴＺ−Ｃ５７；Ｎ＝２０、ＮＯＤ）を解析した。グルコメーターを用いて、マウス尾静脈の血清グルコースを測定した。血清グルコースが２５０ｍｇ／ｄｌに達した後、実験での使用に先だって、マウスを３日間毎日測定した。糖尿病マウスにおける平均血清グルコースレベルは４４６ｍｇ／ｄｌであり、その範囲は３５６〜５１２ｍｇ／ｄｌであったが、対照の非糖尿病マウスにおける平均血清グルコースレベルは１２２ｍｇ／ｄｌであり、その範囲は９６〜１３７ｍｇ／ｄｌだった。６ｍｍのパンチ生検を用いてマウス背の背面に創傷を誘導した。完全に肥厚した皮膚を除去し、その下にある筋肉を露出させた。
【００８８】
最適なウイルスの導入効率を記載したこれまでの研究、及び予測された潜在的な臨床的関連に基づき、ＳＤＦ−１αのレベルを操作する道具として、インビトロでの研究のためにレンチウイルスベクターを、インビボ実験のためにアデノ随伴ウイルスベクターを選択した。ｐＨＸベクター中にヒト又はマウスＳＤＦ−１ａ遺伝子を挿入することにより、ヒトＳＤＦ−ｌα／ｌｅｎｔｉを構築した（Ｂａｌｉｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００５，１１５：３１６６−３１７６）。対照ベクターであるＧＦＰ／ｌｅｎｔｉは、これまでの記載に従って構築した（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００６，６６：４１８２−４１９０）。２９３Ｔ細胞と既に記載のある３種類のプラスミドを共にトランスフェクションすることにより、偽型レンチウイルスを作製した（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ ２００６，２０：１００９−１０１１）。形質転換の４８時間後に回収したレンチウイルスの力価は、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞中において、約１０７導入単位／ｍｌであった。レンチウイルスを標的細胞に感染させるには、細胞を６時間、４μｇ／ｍｌポリブレン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）存在下で、ＭＯＩ（感染多重度）５のウイルスに曝露した。その後細胞を洗い、さらに２日間通常の完全培地で培養し、そしてＥＬＩＳＡでタンパク質発現を解析するか、又は個々の実験において示したその後の解析用に蓄えた。マウスＳＤＦ−１α／ＡＡＶ及び対照ベクターであるＬａｃＺ／ＡＡＶを、ＡＡＶ２ベクター中にマウスＳＤＦ−１α又はＬａｃＺ遺伝子を挿入することにより構築した（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００５，５：２８５−２９７）。２９３細胞と３種類のプラスミドをトランスフェクションすることによりＡＡＶを作出し、そしてＡＡＶをヘパリンクロマトグラフ法により精製し、力価を測定した。組換えＡＡＶを用いた局所的な創傷への注入には、ＰＢＳに溶解した１０１２ウイルス単位／ｍｌのＡＡＶ、１００μｌを、創底に注入した。細胞を用いた治療には、マウス骨髄細胞を１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を入れたプラスチック製の容器中で２週間、３日毎に培地を交換しながら培養することにより、骨髄由来繊維芽細胞（ＢＭＤＦ）を作出した。接着細胞は紡錘型、及び筋繊維芽細胞表現型と一致するα−平滑筋アクチン＋（αＳＭＣ＋）を示した。ＢＭＤＦを、マウスＳＤＦ−１α又はＧＦＰ（対照）をコードするレンチウイルスベクターと共に形質導入した。ＢＭＤＦにおける外因性ｍＳＤＦ−１αの発現をＥＬＩＳＡによって確認した（データは示さない）。６ｍｍのパンチ生検皮膚創傷を作製し、１００μｌのＰＢＳに懸濁した１ｘ１０７ｍＳＤＦ−１α／ＢＭＤＦ又はＧＦＰ／ＢＭＤＦを創傷に注入した。
【００８９】
Ｈｕｍａｎ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ＆ ＥＣＭ ＲＴ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（商標）ＰＣＲアレイは、接着分子及びＥＣＭの８４遺伝子の発現を定量的にプロファイリングする（＃ＰＡ−０１１、ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）。Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトータルＲＮＡを抽出し、そしてＲＴ２ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄキット（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲアレイは製造業者によるプロトコールに従って行った。検量線をプロットするためには閾値に達するサイクル（Ｃｔ）での値を用いた。全ての試料は、β−アクチンに対する相対的なレベルとして標準化し、そして結果を相対的なレベルにおける蛍光強度として表した。
【００９０】
培養細胞上清におけるＳＤＦ−１αの濃度を、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ＳＤＦ−１αＥＬＩＳＡキット（ＤＹ４６０，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、製造業者のプロトコールに従って測定した。
【００９１】
ＨＭＶＥＣのＥＣ単層を、コンフルエント近くになるまで、２４ウェルプレート中で培養し、１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＳＤＦ−１α又はＢＳＡを用いて８時間刺激した。その後培地を、ＳＤＦ−１αを含まないＥＧＭ２培地に交換した。予め標識し、２％のアガロースでコーティングされたプレート上で懸濁液として１６時間培養しておいた、１ｘ１０５のＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ標識ＥＰＣをウェル中に加え、ＨＭＶＥＣ単層と共に１時間、３７℃で培養した。結合しなかったＥＰＣをＰＢＳで２回洗い流し、接着Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ−標識ＥＰＣを蛍光スキャナー（ＧＥ Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて測定し、撮影した。
【００９２】
フィブロネクチン（５μｇ／ｍｌ）でコーティングされた２４トランスウェルインサート（８．０μＭ 孔；Ｆａｌｃｏｎ３５３０９７，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）の上部チャンバー内で、ＨＭＶＥＣ細胞を１ウェル当たり１ｘ１０４細胞の密度で培養した。各実験の前に、倒立蛍光顕微鏡を用いて、コンフルエントな単層であることを確認した。ＨＭＶＥＣ単層を、１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＳＤＦ−１α又はＢＳＡを用いて８時間刺激した。先に詳しく記載したように予め標識した１ｘ１０４のＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ−標識ＥＰＣを、０．３ｍＬの基本ＥＧＭ２培地を加えた上部チャンバーに添加した。０．６ｍＬの完全ＥＧＭ２培地を、トランスウェルの下部チャンバーに添加した。細胞を１２時間、３７℃で培養し、トランスウェルの上部チャンバーから下部チャンバーへのＥＰＣの横断を定量した。
【００９３】
免疫ブロットを記載されたように行った（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００３、２３：１４−２５）。膜をＥ−セレクチン（ａｂ−１８９８１）又はβ−アクチン（ＡＣ−１５、Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）に対する抗体（Ａｂ）を用いてプロービングした。これを次にＨＲＰに結合した二次Ａｂ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を用いてプロービングし、そしてＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に用いた。膜をはがし、個々の実験で望まれるように再度ブロッティングした。
【００９４】
免疫染色及び免疫組織化学（ＩＨＣ）用に、５μｍのパラフィン又は凍結切片を作製し、その後、ＦＩＴＣ−抗Ｅ−セレクチン（Ｒ＆ＤＳ ｙｓｔｅｍｓ）、ＰＥ−抗ＫＤＲ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）又は抗ＳＤＦ−１α（ｓｃ２８８７６，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）と４℃で一晩インキュベーションし、次にＨＲＰ結合二次抗体とインキュベーションした。ＤＡＢキット（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）を用いて免疫反応を検出した。ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）又はヘマトキシリン（ＩＨＣ）のいずれかを用いて核を対比染色した。全ての抗体に対するネガティブコントロールとしては、同じ業者から購入した、非免疫原性でアイソタイプが一致するＡｂを一次抗体として置き換えたものを用いた。
【００９５】
四肢虚血を誘導するために、右大腿動脈／静脈血管束の全長（約３〜４ｍｍ）を結紮し、そして切除した（２群のマウスについて試験した：Ｅ−ｓｅｌ−／−マウス（ｎ＝６）及びＷＴマウス（ｎ＝６））。その後５−０ナイロン（Ｅｔｈｉｃｏｎ）を用いて皮膚を縫合した。四肢虚血をレーザードップラー血流画像化装置（Ｌａｓｅｒ Ｄｏｐｐｌｅｒｐｅｒ ｆｕｓｉｏｎ ｉｍａｇｉｎｇ）により確認した。４ｍｍのパンチ生検を用いて、マウス大腿の腹面に、虚血性後肢創傷を誘導した。皮膚の完全な厚さの切片を除去し、大腿部のレベルより遠位の、下層にある筋肉に曝露した。組換えマウスＳＤＦ−１αタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をＰＢＳ中に再構成し、手術直後に、創底に注入した（２５μｇ／ｋｇ）。
【００９６】
オリンパス製デジタルカメラを用いて、創傷を毎日のデジタル写真により連続して観察した。測定を較正可能にするために、目盛りを全ての写真に含めた。画像をＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｉｍａｇｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｊａｖａ（登録商標）， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， ＭＤ）を用いて解析した。毎日創傷部位を測定し、そして創傷の回復率のパーセンテージを｛（最初の創傷面積−その日の創傷面積）／（最初の創傷面積）｝Ｘ１００として表した。
【００９７】
接触すると内皮細胞膜に取り込まれるＤｉＩ（Ｄ−２８２，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を含む、特別に処方した水溶液（７ｍｌ／マウス）を用いた肝潅流により、麻酔したマウスの血管を直接インビボで標識し、そしてこの溶液を動物を実験に用いる前に、直接心内注入によって投与した。Ｄｉｌを潅流した後、７ｍｌの固定液（４％パラホルムアルデヒド）を注入し、そして全創傷組織を回収した。レーザー走査共焦点顕微鏡（Ｖｉｂｒａｔｏｍｅ（ＶＴｌＯＯＯＳ、Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、厚さ又は深さ２００μｍの全創傷組織をスキャニングすることによって、血管網を可視化した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて、スキャンした全創傷面積に対して標準化した、赤色のＤｉｌで標識された血管の総数を評価することにより、血管密度を定量した。
【００９８】
レーザードップラー血流画像化装置（ＬＤＩ）（Ｐｅｒｉｓｃａｎ ＰＩＭ ＩＩ、Ｐｅｒｉｍｅｄ ＡＢ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、各日の四肢潅流を評価した。四肢とは、マウスの大腿部より遠位の、画像化した全ての組織として定義した。温度の変化及び鎮静のレベルによるアーティファクトを最小限にするために重量に基づく鎮静を用い、温度を制御した施設においてＬＤＩを行った。相対的な潅流のデータを、虚血（右）と正常（左）な四肢血流の比として表した。
【００９９】
１０〜１２週齢のＲｏｓａ２６（ＬａｃＺ＋）マウス由来の１ｘ１０７個の骨髄細胞を、虚血性後肢創傷（右）を作製した直後に、尾静脈注入を介してＥ−ｓｅｌ−／−マウス（ｎ＝６）及びＷＴマウス（ｎ＝６）に移植した。β−ガラクトシダーゼアッセイにより、創傷組織にリクルートされ、且つ組織切片内の血管に組み込まれたＬａｃＺ＋ＥＰＣの数を定量した。回収した創傷組織を凍結させ、その後組織切片をＸ−ｇａｌ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｃａｎａｄａ）及び抗ＫＤＲ（ａｂ−２３４９，Ａｂｃａｍ）と共に室温で２時間インキュベーションした。切片をヌクレアファストレッド（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｓｔ ｒｅｄ）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を用いて対比染色した。ＥＰＣの数は、手術後７日目に、切除した創傷の下層にある創傷肉芽組織の一連の切片における、ＫＤＲ＋血管中のβ−ガラクトシダーゼ＋細胞を計測することにより定量した（ｎ＝３）。細胞の計測は、少なくとも３つの連続した切片の、１切片当たり５つの無作為に選択した高倍率視野（ＨＰＦ、４０Ｘ）について行った。
【０１００】
差の統計分析は、ＡＮＯＶＡ及びスチューデントの両側ｔ検定を用いて行った。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）を用いてデータを解析した。データは、平均±標準偏差として表す。ｐ＜０．０５の場合に、値が統計的に有意であると見なされる。
【０１０１】
結果
ＳＤＦ−１α−改変細胞を用いた治療は、皮膚の創傷血管新生及び糖尿病性創傷の治癒を促進する。皮膚創傷の肉芽組織中にある微小血管は、定住繊維芽細胞により生成される結合組織要素によって物理的に支持されている。これらの繊維芽細胞は、血管の新生を促進し、持続させる固有の微小環境を提供する。繊維芽細胞及びそれらの活性化体である筋繊維芽細胞は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の合成、及び様々な可溶性因子を分泌することにより、創傷治癒過程の血管新生の制御において中心的な役割を果たす（Ｔｏｍａｓｅｋ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｒｅｖ ＭｏＩ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００２， ３：３４９−３６３； Ｋａｌｌｕｒｉ ａｎｄ Ｚｅｉｓｂｅｒｇ， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２００６， ６：３９２−４０１； Ｈｉｎｚ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ ２００７， １７０：１８０７−１８１６）。糖尿病性マウス創傷においてはＳＤＦ−１αのレベルが有意に低下していることが既に報告されており、これは部分的には、筋繊維芽細胞におけるＳＤＦ−１αのダウンレギュレーションによる。筋繊維芽細胞は、局所的な定住繊維芽細胞又は循環している間葉前駆体／幹細胞のいずれかから発生する可能性がある（Ｄｅ Ｗｅｖｅｒ ａｎｄ Ｍａｒｅｅｌ， Ｊ Ｐａｔｈｏｌ ２００３， ２００：４２９−４４７； Ｄｉｒｅｋｚｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００４， ６４：８４９２−８４９５）。
【０１０２】
糖尿病性創傷の治癒におけるＳＤＦ−１α改変細胞を用いた治療の有効性を試験した。遺伝的（ＮＯＤ）糖尿病マウスモデルの糖尿病性創傷の治癒における線維芽細胞由来ＳＤＦ−１αの治癒促進効果を試験することを目的とした。糖尿病に関連した創傷を有する患者における成熟した定住皮膚繊維芽細胞は欠陥があることが知られており、そのため潜在的な治療媒体としての臨床的関連をほとんどもたないので、ＢＭＤＦを選択した。１００μｌのＰＢＳに懸濁した１ｘ１０７個のｍＳＤＦ−１α／ＢＭＤＦ又はＧＦＰ／ＢＭＤＦを創傷に注入した。閉塞するまで、創傷を毎日撮影した。ｍＳＤＦ−１α／ＢＭＤＦで処理した糖尿病性創傷は、ＧＦＰ／ＢＭＤＦを注入した創傷よりも、有意に早く完全に治癒した（図１Ａ）。同様の治癒促進効果が、皮膚創傷を有するＳＴＺ−Ｃ５７糖尿病マウスにおいても観察された。ネイキッドベクターを用いた創傷の治療もまた治癒促進反応を示したが、細胞を用いた方法ほど著明ではなかった。最も有意な差は、４及び５日目に見られた。これと一致して、Ｄｉｌ色素を用いて血管還流を行った後の創傷の共焦点レーザー走査顕微鏡像により示されたように、ｍＳＤＦ−１α／ＢＭＤＦを用いて治療した創傷においては、対照の創傷と比較して、有意により活性な血管新生が発達した（図１Ｂ）。創傷を回収し、ＩＨＣ解析に用いた。ＧＦＰ／ＢＭＤＦを注入した場合よりも、ｍＳＤＦ−１α／ＢＭＤＦを注入した創傷においてＳＤＦ−１αがより強く発現することを、ＩＨＣにより確認した（図１Ｃ）。これらの結果は、糖尿病マウスモデルにおけるＳＤＦ−１αの治癒促進及び血管形成促進効果を確認し、並びに、ＳＤＦ−１α改変細胞を用いた治療が糖尿病性創傷の治療における新規ツールとして役立つ可能性があるという前臨床的証拠を提供した。
【０１０３】
インビトロにおける、ＳＤＦ−１αで刺激したＥＣ単層への、ヒトＥＰＣの接着の上昇。ＳＤＦ−１αがＥＰＣホーミングに及ぼす効果が、成熟した内皮細胞上の接着分子の制御により仲介されているという仮説を試すために、インビトロ細胞間接着アッセイにおいて、ＳＤＦ−１αによる刺激が、ＥＣ単層がＥＰＣの接着をより支持するようになるかどうかを試験した。２４ウェルプレート中で培養した、サブコンフルエントなＨＭＶＥＣを、組換えヒトＳＤＦ−１α又はＢＳＡで刺激した。Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ−標識ＥＰＣをウェル中に添加し、ＥＣ単層と共に１時間培養した。結合しなかったＥＰＣをＰＢＳで２回洗い流し、接着したＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ−標識ＥＰＣを蛍光スキャナーを用いて測定した（図２Ａ）。ＳＤＦ−１αで刺激したＥＣ単層では、ＢＳＡで処理した対照と比較して、ＥＰＣ接着の数がおよそ８倍増加した（図２Ｂ）。このデータは、ＳＤＦ−１αでの刺激がＥＰＣ−ＥＣ間の直接的な接着を促進することを示し、このことはＥＣ上の特定の接着分子の発現が、ＳＤＦ−１αによって特異的に制御されている可能性を示唆している。
【０１０４】
ＳＤＦ−１αによる刺激は、ＥＣ単層（インビトロ）及びマウスの創傷毛細血管の内皮（インビボ）でのＥ−セレクチンの発現をアップレギュレートした。ＳＤＦ−１αにより、ＥＣ単層でアップレギュレートされた接着分子を同定するために、ＲＴ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（商標）ＰＣＲアレイを行った。サブコンフルエントなＨＭＶＥＣを、１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＳＤＦ−１αタンパク質又はＢＳＡで４時間刺激した。細胞を回収し、トータルＲＮＡを抽出してＲＴ２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（商標）ＰＣＲアレイに用いた。アレイで試験した８４遺伝子のうち、１３の遺伝子がアップレギュレートされ（＞１．５倍）、２０の遺伝子がダウンレギュレートされ（＜１．５倍）、そして５１の遺伝子が変化しなかった（表１）。特に、Ｅ−セレクチン遺伝子の発現はＳＤＦ−１αによる刺激によって、約２．３倍上昇した（図３Ａ）。観察されたＥ−セレクチンｍＲＮＡの上昇を確認するために、免疫ブロット解析を行い、そして、ＳＤＦ−１αで刺激したＥＣ単層では、ＢＳＡで処理した対照と比較して、Ｅ−セレクチンのタンパク質発現が上昇することを確認した（図３Ｂ）。成熟した内皮細胞における、ＳＤＦ−１αによるＥ−セレクチンの上昇をインビボでさらに確認するために、ｍＳＤＦ−１α／ＡＡＶ又はｌａｃＺ／ＡＡＶを注入した糖尿病ＮＯＤマウス創傷の血管を免疫染色により評価した。ＦＩＴＣ−結合抗Ｅ−セレクチンＡｂを用いてＥ−セレクチンを、そしてＰＥ−結合抗ＫＤＲＡｂを用いてＥＣを染色した。ｍＳＤＦ−１α／ＡＡＶを注入した糖尿病マウス創傷の血管中のＥＣにおいては、ＬａｃＺ／ＡＡＶを注入したものと比較して、より強くＥ−セレクチン（黄色）が発現していた（図３Ｃ）。ｍＳＤＦ−１α／ＡＡＶにおける組織レベルでの上昇をＩＨＣにより示した（図３Ｄ）。これらの実験により、Ｅ−セレクチンが、血管のＥＣにおいてＳＤＦ−１αの下流の標的としてアップレギュレートされる、重要な接着分子の１つであることを確認した。
【０１０５】
【表１】
【０１０６】
アップレギュレートされたＥ−セレクチンは、ＳＤＦ−１αにより高められたＥＣ−ＥＰＣ間相互作用及びＥＰＣ経内皮遊走の仲介に関与する。アップレギュレートされたＥ−セレクチンがＳＤＦ−１αにより高められたＥＣ−ＥＰＣ間接着の仲介に関与しているかどうかを試験するために、ＳＤＦ−１αで刺激したＥＣ単層へのＥＰＣの接着におけるＥ−セレクチンアンタゴニストの効果をインビトロで試験した。２４ウェルプレート中で培養したサブコンフルエントなＨＭＶＥＣを１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＳＤＦ−１α又はＢＳＡで８時間刺激し、そして培地を、Ｅ−セレクチン中和Ａｂ又はアイソタイプが一致した対照Ａｂ（２μｇ／ｍｌ）のいずれかを含み、ＳＤＦ−１αを含まないＥＧＭ２培地と交換し、３７℃で１５分間インキュベーションし、その後ＥＰＣを添加した。その後、先に詳しく記載したように予め標識しておいた１ｘ１０５のＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ−標識ＥＰＣをウェル中に添加し、ＥＣ単層と共に３７℃で１時間培養した。結合しなかったＥＰＣをＰＢＳで２回洗い流し、接着したＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ−標識ＥＰＣを蛍光スキャナーで測定した。Ｅ−セレクチン中和Ａｂの添加は、ＳＤＦ−１αで刺激したＥＣ単層に接着するＥＰＣの数を有意に抑制し、一方対照のＡｂは有意な効果を示さなかった（図４Ａ）。ＥＰＣとＥＣ単層との間の特異的相互作用の仲介におけるＥ−セレクチンの生物学的機能をさらに研究するために、ＥＰＣとＥＣ単層との間の接着の増加が、ＥＣ単層を通じたより多くのＥＰＣ遊出をもたらすかどうかを試験し、もしそうであった場合には、この遊出効果がＥ−セレクチン依存性かどうかを試験した。ＥＰＣ経内皮遊走をインビトロトランスウェル系において試験した。ＨＭＶＥＣ単層を、γｈＳＤＦ−１α又はＢＳＡ存在下で、トランスウェルインサートの上部チャンバー内で培養した。ＥＰＣをインサート中に添加する１５分前に、下部チャンバー内のＥＧＭ２培地を、γｈＳＤＦ−１α又はＢＳＡをそれぞれ含む新しい培地と交換した。上述したように調製した１ｘ１０５のＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ−標識ＥＰＣ懸濁液をインサート中に添加し、そして３７℃で一晩培養した。ＢＳＡで処理したＥＣ単層と比較して、ＳＤＦ−１αで刺激したＥＣ単層では、トランスウェルの上部チャンバーから下部チャンバーへのＥＰＣ遊出の有意な増加が認められた（図４Ｂ）。重要なことは、Ｅ−セレクチンのブロッキング剤である中和Ａｂ（２μｇ／ｍｌ）のトランスウェルへの添加が有意にＥＰＣの経内皮遊走を阻害したことから、この効果が、少なくとも部分的には、Ｅ−セレクチン依存性であることである（図４Ｂ）。全体として、これらの結果は、アップレギュレートされたＥ−セレクチンが、ＳＤＦ−１αにより増加したＥＣ−ＥＰＣ間接着及びＥＰＣ経内皮遊走の仲介に関与することを示した。
【０１０７】
ＳＤＦ−１αによる刺激はＥＰＣでのＥ−セレクチンリガンドの発現をアップレギュレートする。最終的に、創傷部の毛細血管内膜のＥＣと循環しているＥＰＣとの間の直接的な相互作用は、両方の細胞型の表面にある接着分子の相互に関連した対応部に依存すると考えられる。ＳＤＦ−１αが、ＥＣ及びＥＰＣ両方の関連した接着分子の発現を誘導するだろうと予測した。先に詳しく記載した、ＥＣにおいてはＳＤＦ−１α誘導性Ｅ−セレクチンが直接的なＥＣ−ＥＰＣ間相互作用を仲介するという結果に基づき、ＳＤＦ−１αでの刺激に応答した、ＥＰＣ上での２種類のＥ−セレクチンリガンド、ＣＤ４４及びＣＤ１６２（ＰＳＧＰ−１）の発現を解析した。サブコンフルエントなヒトＥＰＣを、γｈＳＤＦ−１α又はＢＳＡ、それぞれを用いて、様々な時間、刺激した。細胞を回収し、免疫ブロット解析に用いた。刺激しなかったＥＰＣでは、強い基礎レベルのＣＤ１６２及び低いレベルのＣＤ４４の発現が認められた。ＳＤＦ−１αによる刺激は、ＥＰＣにおけるＣＤ１６２及びＣＤ４４両方の発現をアップレギュレートした（図５）。ＣＤ１６２及びＣＤ４４の誘導は、ＳＤＦ−１αで刺激してから４時間後に最初に観察され、その後１６時間まで上昇し続けた。これらの実験により、ＥＰＣが基礎レベルのＥ−セレクチンリガンドを発現することが確認され、またＳＤＦ−１αがＥＰＣでのこれらＥ−セレクチンリガンドの発現をアップレギュレートすることが可能であることが示された。このことは、可溶性の因子であるＳＤＦ−１αが、２種類の重要な細胞型である成熟内皮細胞とＥＰＣにおける接着分子のプロファイルを特異的に制御することによりＥＰＣホーミングを仲介するという、全体的な仮説と一致するものであった。
【０１０８】
Ｅ−セレクチンは、マウス虚血性後肢及び皮膚創傷モデルにおいてＳＤＦ−１αが、ＥＰＣホーミング、血管新生及び創傷治癒に及ぼす効果の仲介に必要である。ＥＰＣホーミング、血管新生、及び皮膚創傷の治癒におけるＳＤＦ−１α誘導性Ｅ−セレクチンの特異的な生物学的重要性を試験するために、機能喪失型の方法を、骨髄移植と組み合わせて用いた。Ｅ−ｓｅｌ−／−又はＷＴマウスＡを用いて、大腿動脈の結紮／切除を介した片側後肢虚血のマウスモデルを作出し、その後両側に、４ｍｍの皮膚切除創傷を作製した。直接的な創傷注入により、組換えマウスＳＤＦ−１αを創傷に投与した。血管新生及び創傷の治癒におけるＥＰＣホーミングの貢献度を定量（部分的に）するために、尾静脈を介してマウス中にＲｏｓａ２６（ＬａｃＺ＋）マウス由来の骨髄細胞、１ｘ１０７個を注入することにより、さらなる治療を施した。手術後の四肢虚血の確認、モニター、及び、時間経過に伴って測定した潅流の平均を介した、後肢血流の自然な回復の定量には、ＬＤＩを用いた。デジタル写真撮影により、創傷面積の測定を毎日行った。７日目に半数のマウスから回収した創傷組織を用いた血管Ｄｉｌ潅流とその後のレーザー走査共焦点顕微鏡解析により、創傷組織における血管新生を評価した。残りのマウスについては、創傷を回収し、ＩＨＣに用いた。創傷組織にリクルートされ、血管に組み入れられたＥＰＣを、β−ｇａｌ（青）及び抗ＫＤＲを用いて二重染色した。ＷＴマウスと比較して、Ｅ−ｓｅｌ−／−マウスの虚血性後肢は、有意に低い平均血流測定値によって示されたように、時間経過にわたる潅流において回復の遅れを示した（図６Ａ）。一貫して、Ｅ−ｓｅｌ−／−マウスの虚血性創傷は、ＷＴマウスにおける閉塞率と比較して、有意に遅い閉塞率を有した（図６Ｂ）。加えて、Ｅ−ｓｅｌ−／−マウスの虚血性創傷は、ＷＴマウスのものと比較して、かなり少ない血管化しか示さなかった（図６Ｃ）。ＷＴマウスと比較して、Ｅ−ｓｅｌ−／−マウスの虚血性創傷の血管においては有意に少ないＬａｃＺ＋細胞しか検出されなかったことから（図６Ｄ）、Ｅ−ｓｅｌ−／−マウスの虚血性創傷におけるこの少ない血管新生は、少なくとも部分的には、より少ないＥＰＣホーミングと関連した。これらインビボでの実験は、ＳＤＦ−１α誘導性ＥＰＣホーミング、血管新生及び創傷治癒の仲介に、Ｅ−セレクチンが必要であることを示した。
【０１０９】
本明細書において記載した実験は、ＳＤＦ−１αが成熟ＥＣにおけるＥ−セレクチンの発現及びＥＰＣ上のＥ−セレクチンリガンドを特異的にアップレギュレートし、それにより、ＥＣ−ＥＰＣ間接着及びＥＰＣホーミングを仲介することを示した。これらの知見は、ＳＤＦ−１αがＥＰＣホーミングに及ぼす生物学的効果の根底にある分子機構についての深く、かつ、新規の洞察を提供し、及び、糖尿病に関連した細小血管障害及び創傷治癒の遅延（並びにその他の虚血性創傷）でのＥＰＣホーミングの治療上の操作において、Ｅ−セレクチンが新しい標的であることを示した。ＥＣ及びＥＰＣ中のＥ−セレクチン及びそのリガンドを変化させることは、ＥＰＣに関連した直接的な血管新生反応を制御するばかりでなく、創傷治癒に及ぼすＥＰＣに関連し、糖尿病に関連した皮膚創傷治癒の遅延の未解決な臨床上の問題に本質的に関連する、直接的及び間接的な効果をも提供する。
【０１１０】
その他の実施形態
組成物、キット、及び方法工程の一部分又は全てに、任意の変更を加えてもよい。出版物、特許出願及び特許を含む、本明細書において引用された全ての参考文献は、参照することにより、本明細書に組み入れられる。本明細書において提供された、任意の及び全ての実施例の使用、又は例となる言葉（例えば、「のような」）は、本発明を説明することを目的とし、別途に請求した場合を除き、本発明の範囲を限定するものではない。例えば、本明細書において記載した実験は糖尿病性創傷を扱うが、本明細書において記載した組成物、キット及び方法は、任意の虚血性創傷を含む、多数のその他の治療的及び予防的適用において用いることが可能である。本発明又は好ましい実施形態の本質又は有効性に関する、本明細書における任意の文言は限定することを意図せず、及び添付の請求項もそれらの文言によって限定されると見なされるべきではない。さらに通常、本明細書に明示されていなくても、本発明の実施に必須な請求されていない要素は示されていると解釈されるべきである。本発明は、適用法によって認められるように、全ての変更、及び添付の請求項に記載された対象事項の等価物を含む。さらに別段の指定のない限り、本明細書においては、可能な全変異型の上述した要素の任意の組み合わせが本発明に包含され、そうでない場合は、文脈から明らかである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、医療及び遺伝子治療の分野に関する。より詳細には、本発明は糖尿病の対象における創傷治癒を促進する組成物、キット及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
欠陥のある創傷治癒は、糖尿病患者における重大な臨床上の問題であり、また下肢切断の主要な原因である。現在の治療の成功率は低く、糖尿病性の微小血管病理に対する取り組みは不十分である。糖尿病性創傷治癒の不良は、不十分な血管形成及び脈管形成によって特徴付けられる。脈管形成はＢＭ由来前駆細胞からの新生血管の成長を含み、後天性の血管新生過程及び創傷治癒に寄与する。骨髄（ＢＭ）由来の内皮前駆細胞（ＥＰＣ）は脈管形成において機能する重要な細胞であり、虚血に反応して末梢組織にホーミングする。ＥＰＣの動員及びリクルートメント（すなわち虚血）に対する初期の生理的刺激が、糖尿病の宿主においては、なぜ治療的なＥＰＣ介在性血管新生及び治癒を誘導しないのかは未だに解明されていない。
【０００３】
そのため、現在においても、糖尿病性創傷治癒を高める治療薬及び方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書においては、ＳＤＦ−１αが成熟ＥＣにおけるＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートし、ＥＣ−ＥＰＣ間接着及びＥＰＣホーミングの増加を引き起こすという発見に基づく、虚血性（例えば、糖尿病性）創傷の治癒を促進する組成物、キット及び方法が記載される。ＥＰＣの標的組織へのホーミング機序には、ＥＰＣの骨髄ニッチからの離脱、血管内への移行、及び循環系内での移動、ホーミングシグナルの感知、毛細血管の単層内皮細胞（ＥＣ）上での回転及び接着、そしてその後のＥＰＣ−ＥＣ間の直接的な相互作用が必要とされる経内皮遊走を含む、連続したイベントのカスケードが含まれる。本明細書に記載される実施例においては、ＥＰＣの標的組織へのホーミングを達成するためには、毛細血管内膜のＥＣと循環しているＥＰＣとの間の直接的な細胞間相互作用が必要かどうか、及び、ＥＣ単層における特異的な接着分子の制御により、少なくとも部分的には、ＥＰＣホーミングにおけるＳＤＦ−１αの効果が仲介されるかどうかについて調べた。ＳＤＦ−１α誘導性のＥＰＣホーミングを仲介する接着分子として、Ｅ−セレクチンを特定した。本明細書において記載した実施例の結果は、マウス及びヒトの成熟ＥＣ単層においては、ＳＤＦ−１αがＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートすること、Ｅ−セレクチンはＥＰＣのＥＣ単層への接着を高めることにより、ＥＰＣホーミング及びそれらの経内皮遊走におけるＳＤＦ−１αの効果を仲介する原因となること、並びにこれらの効果が創傷性血管新生及び創傷治癒（血管新生）の有意な増大を生じること、を示した。これら新規の知見は、ＥＰＣホーミングにおけるＳＤＦ−１αの生物学的な効果の根底にある分子メカニズム（シグナル）への洞察を提供するばかりでなく、Ｅ−セレクチンが虚血性（例えば、糖尿病性）創傷の治癒における治療的適応の新しい標的であることを明らかにした。
【０００５】
別段の指定のない限り、本明細書で使用される全ての専門用語は、本発明が属する分野の当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。
【０００６】
本明細書で使用する場合、「核酸」又は「核酸分子」は、ＲＮＡ（リボ核酸）及びＤＮＡ（デオキシリボ核酸）のような２つ以上のヌクレオチドの鎖、及び化学的に修飾したヌクレオチドを意味する。「精製した」核酸分子は、その核酸が天然に生じる細胞又は生物中におけるその他の核酸配列から実質的に分離された核酸分子である（汚染物質を、例えば、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９、１００％含まない）。この用語は、例えば、ベクター、プラスミド、ウイルスに組み入れられた組換え核酸分子、又は原核生物又は真核生物のゲノムを含む。精製した核酸の例としては、ｃＤＮＡ、ゲノム核酸の断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生産した核酸、ゲノム核酸の制限酵素処理によって形成した核酸、組換え核酸、及び化学的に合成した核酸分子が挙げられる。「組換え」核酸分子は、例えば、化学的な合成によって、又は遺伝子工学技術による単離した核酸セグメントの操作によって、そういうことをしなければ分離していた２つの配列セグメントを人工的に組み合わせることによって作出した核酸分子である。
【０００７】
「遺伝子」という用語は、特定のタンパク質又は、特定の例においては、機能性若しくは構造性ＲＮＡ分子をコードする核酸分子を意味する。
【０００８】
「Ｅ−セレクチン遺伝子」、「Ｅ−セレクチンポリヌクレオチド」、又は「Ｅ−セレクチン核酸」という用語は、天然のヒトＥ−セレクチン又はＥ−セレクチンをコードする核酸配列、例えば、天然のヒトＥ−セレクチン遺伝子（アクセッション番号 ＮＭ＿０００４５０）、Ｅ−セレクチンｃＤＮＡを転写することができる配列由来の配列を含む核酸；及び／又は対立変異体及び前述したもののホモログを意味する。この用語は、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡを包含する。
【０００９】
「ＳＤＦ−１α遺伝子」、「ＳＤＦ−１αポリヌクレオチド」、又は「ＳＤＦ−１α核酸」という用語は、天然のヒトＳＤＦ−１α又はＳＤＦ−１αをコードする核酸配列、例えば、天然のヒトＳＤＦ−１α遺伝子（アクセッション番号 ＮＭ＿１９９１６８、ＮＭ＿０００６０９、ＮＭ＿００１０３３８８６）、ＳＤＦ−１α ｃＤＮＡを転写することができる配列由来の配列を含む核酸；及び／又は対立変異体及び前述したもののホモログを意味する。この用語は、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡを包含する。
【００１０】
核酸分子における突然変異について言及する場合、「サイレントな」変化とは、ヌクレオチド配列中の１つ以上の塩基対が置換されるが、その配列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列が変化しない変化である。「保存的な」変化とは、核酸のタンパク質コード領域の少なくとも１つのコドンを、この核酸配列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸のうちの少なくとも１つが、類似した特徴を有するその他のアミノ酸に置換されるように変化する、変化である。
【００１１】
ペプチド、オリゴペプチド又はタンパク質におけるアミノ酸残基について言及する場合、「アミノ酸残基」、「アミノ酸」及び「残基」という用語は区別なく用いられ、本明細書で使用する場合、アミド結合又は模倣アミド結合を介して少なくとも１つの他のアミノ酸又は模倣アミノ酸に共有結合した、アミノ酸又は模倣アミノ酸を意味する。
【００１２】
本明細書で使用する場合、「タンパク質」及び「ポリペプチド」は同義的に用いられ、長さ又はグリコシル化若しくはリン酸化のような翻訳後修飾に関わらず、任意のペプチド結合したアミノ酸の鎖を意味する。
【００１３】
「Ｅ−セレクチンタンパク質」又は「Ｅ−セレクチン」という用語は、天然のヒトＥ−セレクチンタンパク質（アクセッション番号 ＡＡＱ６７７０２、ＮＰ＿０００４４１．２）のようなＥ−セレクチン遺伝子の発現産物、又は前述したものと少なくとも６５％（しかし好ましくは７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％）のアミノ酸配列同一性を有し、かつ、天然のＥ−セレクチンタンパク質の機能活性を示すタンパク質を意味する。タンパク質の「機能活性」とは、そのタンパク質の生理機能に関連する任意の活性である。例えば、天然のＥ−セレクチンタンパク質の機能活性には、ＥＣ−ＥＰＣ間接着の仲介及び、細胞と血管内膜との接着を仲介することによる、炎症部位での白血球の蓄積の促進が含まれ得る。
【００１４】
「ＳＤＦ−１αタンパク質」又は「ＳＤＦ−１α」という用語は、天然のヒトＳＤＦ−１αタンパク質（アクセッション番号 ＣＡＧ２９２７９．１）のようなＳＤＦ−１α遺伝子の発現産物、又は前述したものと少なくとも６５％（しかし好ましくは７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％）のアミノ酸配列同一性を有し、かつ、天然のＳＤＦ−１αタンパク質の機能活性を示すタンパク質を意味する。タンパク質の「機能活性」とは、そのタンパク質の生理機能に関連する任意の活性である。例えば、天然のＳＤＦ−１αタンパク質の機能活性には、細胞成長又は血管形成に対する刺激が含まれ得る。ＳＤＦ−１αは、ＥＰＣへの強力なホーミングシグナルとして作用するケモカインである（Ｌａｐｉｄｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９３８：８３−９５，２００１；米国特許第２００８／００３７６０号を参照のこと）。
【００１５】
核酸分子、ポリペプチド、又は感染性病原体について言及する場合には、「天然の」という用語は、天然に生じる（例えば、野生型（ＷＴ））核酸、ポリペプチド、又は感染性病原体を意味する。
【００１６】
「血管形成」という用語は、既存の血管に由来する新しい血管の成長を意味する。血管形成は、分岐のない血管セグメントの数の測定（単位面積当たりのセグメント数）、機能性血管密度（単位面積当たりに潅流する血管の全長）、血管径、又は血管容量密度（単位面積当たりの各セグメントの長さ及び直径に基づいて算出した全血管容量）により、評価することができる。
【００１７】
「特異的な結合」及び「特異的に結合する」という用語は、酵素／基質、受容体／アゴニスト、抗体／抗原、などのような対になった種の間に生じ、かつ、共有若しくは非共有相互作用、又は共有及び非共有相互作用の組み合わせが介在する可能性のある結合を意味する。２つの種の相互作用が非共有的に結合した複合体を生産する場合、生じる結合は、一般的には静電、水素結合、又は親油性相互作用の結果である。従って、「特異的な結合」は、抗体／抗原又は酵素／基質相互作用の特徴を有する結合した複合体を生産する、２つの対になった相互作用のある種の間に生じる。具体的には、特異的な結合は、対をなすメンバーの片方が特定の種へは結合するが、化合物ファミリー（結合するメンバーに対応するメンバーが属する）内のその他の種には結合しないことによって特徴付けられる。
【００１８】
本明細書で使用する場合、「配列同一性」という句は、サブユニットの一致が最大になるように（すなわちギャップ及び挿入を考慮に入れて）２つの配列を整列させた場合に、２つの配列（例えば、核酸配列、アミノ酸配列）において対応する位置にある、同一のサブユニットのパーセンテージを意味する。配列同一性は、配列解析ソフトウェア（例えば、Ａｃｃｅｌｒｙｓ ＣＧＣ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡのＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ）を用いて測定することができる。
【００１９】
「単離した」又は「生物学的に純粋」という句は、天然の状態で見られるように、その材料に通常付随する成分を実質的に又は本質的に含まない材料を意味する。
【００２０】
「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体、ヒト化抗体、可溶性又は結合形態において標識することができる抗体に対する抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、並びに、例えば酵素的開裂、ペプチド合成、若しくは組換え技術を含むがこれらには限定されない、任意の既知の技術によって提供される断片、領域又はその誘導体、を含むことを意味する。
【００２１】
本明細書で使用する場合、「慢性創傷」及び「難治性創傷」及び「糖尿病性創傷」という用語は、持続的な解剖学的及び機能的な結果が達成されず、また、壊死片及び感染の除去、炎症の消失、結合組織マトリックスの修復、血管形成、及び表面再建を含む通常の創傷治癒方法では治癒しない創傷を指す。例えば、病理学的に低酸素症が上昇した場合、創傷治癒は不全であり、かつ、創傷感染率も上昇する。通常の治癒において必須な部分は、肉芽組織形成とも呼ばれる、一時的な創傷マトリックス中での新しい血管の形成である。
【００２２】
一実施形態においては、「血管形成」という用語は、創傷に隣接した血管網の在住内皮細胞の増殖による過程、並びにその他の実施形態においては、繊維芽細胞のような成熟ストローマ細胞に補助される、最初は無血管である創傷組織中に成長する新生血管への遊走及びリモデリング、を指す。別の実施形態においては、「脈管形成」という用語は、創傷にリクルートされたＥＰＣが、内皮細胞へと分化し、血管網の置換を引き起こすデノボ過程を指す。
【００２３】
「前駆細胞」、又は「内皮前駆細胞」又は「ＥＰＣ」という用語は、分化及び増殖によって完全に分化した機能的な後代を生成する能力を有する、任意の体細胞を意味する。別の実施形態においては、前駆細胞は、任意の組織又は血液、神経、筋肉、皮膚、消化管、骨、腎臓、肝臓、膵臓、胸腺、などを含むがこれらには限定されない器官系からの前駆細胞を含む。前駆細胞は、「分化した細胞」とは区別され、別の実施形態においては、これらは、増殖（すなわち自己複製）する能力を有しても有さなくてもよいが、通常の生理学的な条件においては異なる細胞型へのさらなる分化はしない、細胞と定義される。一実施形態においては、前駆細胞はさらに、増殖（自己複製）するが、未成熟又は未分化であるように見えるにもかかわらず通常さらには分化しない、癌細胞、特に白血病細胞のような異常な細胞からは区別される。
【００２４】
本明細書で使用する場合、「全能性を有する」という用語は、胚性幹細胞（すなわち全ての型の成熟細胞の生成に必要、かつ、十分である）のような不確定な前駆細胞を意味する。全ての膵臓細胞系統を生成する能力を保持するが、自己更新できない前駆細胞は、「多能性を有する」と呼ばれる。別の実施形態においては、全てではないが内皮系統のいくつかの細胞を生産することができ、かつ、自己更新できな前駆細胞は、「いろいろな能力を有する」と呼ばれる。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「骨髄由来前駆細胞」及び「ＢＭ由来前駆細胞」という句は、骨髄幹細胞系統から派生した前駆細胞を意味する。骨髄由来前駆細胞の例としては、骨髄由来間葉幹細胞（ＭＳＣ）及びＥＰＣが挙げられる。
【００２６】
「ホーミング」という用語は、治癒に関わる細胞が、損傷部位に遊走し修復を補助するように誘導及び刺激するシグナルを指す。
【００２７】
「治療有効量」及び「有効量」という句は、治療上（例えば臨床上）期待される結果（結果の正確な特性は治療される障害の特性によって多様になり得る）を生じるのに有効な量を意味する。例えば、治療する障害が非治癒性の糖尿病性創傷である場合、結果は創傷の治癒となり得る（ＥＣ−ＥＰＣ間接着の増大、ＥＰＣホーミング及び創傷血管新生の増大を誘導する、成熟ＥＣにおけるＥ−セレクチン発現の特異的なアップレギュレートによる）。本明細書において記載される組成物及びワクチンは、１日当たり１回以上から１週間当たり１回以上までの間で投与することができる。当業者は、対象を効果的に治療するには、疾患又は障害の重篤度、それまでの治療、総体的な健康及び／又は対象の年齢、並びにその他に見つかる疾患を含むがこれらには限定されない特定の因子が、その投与量及びタイミングに影響をおよぼす可能性があることを理解するだろう。さらに、治療有効量の本発明の組成物又はワクチンを用いた対象の治療は、単独治療であっても又は一連の治療であってもよい。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「治療」という用語は、本明細書において記載した若しくは本明細書において記載した方法により特定した治療薬の、患者への、適用又は投与、又は、疾患、疾患の症状、又は疾病素因を、治す、治癒する、軽減する、救助する、変質させる、治療する、回復させる、改善する又は作用する目的における、疾患、疾患の症状若しくは疾病素因を有する患者から単離した組織又は細胞株への治療薬の適用又は投与、と定義される。
【００２９】
「患者」、「対象」及び「個体」という用語は、本明細書においては区別なく用いられ、好ましくはヒト患者である、治療を受ける哺乳類対象を意味する。いくつかの例においては、本発明の方法は、マウス、ラット及びハムスターのような齧歯類、並びに非ヒト霊長類を含むがこれらには限定されない、実験動物における、獣医学的適用における、及び疾患への動物モデルの開発における利用法を見いだす。
【００３０】
従って、本明細書においては、糖尿病の対象における糖尿病性創傷の治療を促進する方法が記載される。この方法は以下の工程を含む：Ｅ−セレクチンタンパク質、Ｅ−セレクチンタンパク質をコードする核酸、及びＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートする薬剤からなる群より選択される少なくとも１つの治療薬と、薬学的に許容可能な担体とを含む、治療有効量の組成物を提供する工程；及び、対象において骨髄由来前駆細胞（例えば、ＥＰＣ）の創傷への遊走が増加する条件で、組成物を対象に投与する工程。組成物を、例えば、経口的に、局所的に、静脈内に直接、又は血管内カテーテルを介して、創傷又は創傷に隣接した部位に投与することができる。対象への組成物の投与は、創傷治癒の促進もたらす。一実施形態においては、組成物は、Ｅ−セレクチンタンパク質又はＥ−セレクチンタンパク質をコードする核酸、及びＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートする薬剤、ここでこのＥ−セレクチン発現を特異的にアップレギュレートする薬剤はＳＤＦ−１αタンパク質又はＳＤＦ−１αタンパク質をコードする核酸である、を含む。この方法はさらに、対象に高圧酸素両方を実施する工程を含んでいてもよい。
【００３１】
本明細書においては、糖尿病性創傷を有する糖尿病の対象においてＥ−セレクチン発現をアップレギュレートする方法がさらに記載される。この方法は、第一のＡＡＶ逆方向末端反復と第二のＡＡＶ逆方向末端反復との間に挿入されたＥ−セレクチンをコードするポリヌクレオチドを含有する少なくとも１つのｒＡＡＶビリオンを包含する組成物を、Ｅ−セレクチンの発現をアップレギュレートし、骨髄由来前駆細胞（例えば、ＥＰＣ）の創傷への遊走を誘導し、かつ対象における創傷の治癒を促進するために有効な量で、糖尿病の対象に投与する工程を含む。少なくとも１つのｒＡＡＶビリオンは、血清型２カプシドタンパク質を含有する場合がある。組成物を、例えば、創傷又は創傷に隣接した部位に直接投与してもよい。この方法は、ＳＤＦ−１αタンパク質又はＳＤＦ−１αタンパク質をコードする核酸を対象に投与する工程及び／又は対象に高圧酸素療法を実施する工程、をさらに含む場合もある。
【００３２】
本明細書においては、哺乳類対象における少なくとも１つの糖尿病性創傷を治療するキットがさらに記載される。このキットは、Ｅ−セレクチンタンパク質、Ｅ−セレクチンタンパク質をコードする核酸、及びＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートする薬剤からなる群より選択される少なくとも１つの治療薬と、薬学的に許容可能な担体とを含む、治療有効量の組成物；及び使用説明書を含む。一実施形態においては、この組成物は、Ｅ−セレクチンタンパク質又はＥ−セレクチンタンパク質をコードする核酸、及びＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートする薬剤を含み、ここでこのＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートする薬剤はＳＤＦ−１αタンパク質又はＳＤＦ−１αタンパク質をコードする核酸である。一実施形態においては、使用説明書は、対象に高圧酸素療法を実施するための説明を含む。
【００３３】
本明細書においては、糖尿病の対象における糖尿病性創傷の治癒を促進する方法もまた記載される。この方法は、薬学的に許容可能な担体と複数の骨髄由来前駆細胞（Ｅ−セレクチンをコードするポリヌクレオチドを含有する）とを含む組成物を提供する工程、及び骨髄由来前駆細胞（例えば、ＥＰＣ）の創傷への遊走を増加させ、対象における創傷治癒を促進するために有効な量の組成物を対象に投与する工程、を含む。Ｅ−セレクチンをコードするポリヌクレオチドは、ウイルスベクター、例えば、ウイルス粒子中に含まれるウイルスベクター中にあってもよい（例えば、ＡＡＶ粒子中のｒＡＡＶベクター）。組成物は、ＳＤＦ−１αタンパク質又はＳＤＦ−１αタンパク質をコードする核酸をさらに含んでいてもよく、創傷又は創傷に隣接した部位に直接投与することもできる。一実施形態においては、この方法は、対象に高圧酸素療法を実施する工程をさらに含む。
【００３４】
本発明の実施及び試験においては、本明細書において記載したものと類似又は同等な組成物、キット及び方法を用いることができるが、好適な組成物、キット及び方法を以下に記載する。本明細書において言及する全ての出版物、特許出願、及び特許は、その全体が参照することにより組み入れられる。不一致が生じる場合には、定義を含む本明細書が優先される。以下で議論される特定の実施形態は説明するためだけのものであり、発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、ＳＤＦ−１αを改変したＢＭＤＦが血管新生及び糖尿病性創傷治癒を促進することを示す、細胞の一連の顕微鏡写真及びグラフである。（Ａ）左：回復のパーセンテージで表した創傷治癒率。２つの群のＮＯＤマウスに創傷を作製し、ｍＳＤＦ−１α／ＢＭＤＦ又はＧＦＰ／ＢＭＤＦで処理した。デジタル写真を用いて、最初の創傷面積の画分を毎日測定し、創傷が治癒するまでＩｍａｇｅＪ解析を行った。ＧＦＰ／ＢＭＤＦで処理した対照と比較して、ｍＳＤＦ−１α／ＢＭＤＦで処理した糖尿病マウスでは、３日目以降、有意に創傷閉塞率が改善した。右：各群におけるそれぞれの日数での代表的な創傷を示す。（Ｂ）Ｄｉｌ色素を用いた創傷血管潅流。上段：５日目にレーザー走査共焦点顕微鏡を用いて測定した、Ｄｉｌ染色創傷血管の代表的な画像を各群について示す。下段：創傷における血管密度の定量。閾値のパーセンテージは、検出した全ての血管を、全創傷面積のパーセンテージとして含む。対照と比較して、ｍＳＤＦ−１α／ＢＭＤＦで処理した創傷は有意に高い血管密度を有した。データは、各群における４つの創傷の平均±ＳＤとして表した。（Ｃ）ｍＳＤＦ−１αを検出するために、ｍＳＤＦ−１α／ＢＭＤＦ又はＧＦＰ／ＢＭＤＦを注入した創傷組織のＩＨＣ。ＧＦＰ／ＢＭＤＦで処理した創傷と比較して、ｍＳＤＦ−１α／ＢＭＤＦで処理した創傷ではより強いｍＳＤＦ−１αの発現（茶色）が観察された（４０Ｘ）。
【図２】図２は、ＳＤＦ−１αで刺激したＥＣ単層へのＥＰＣの接着がインビトロで増加したことを示す、ＥＣ単層の写真及びグラフである。Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ−標識ＥＰＣを、ＳＤＦ−１α又はＢＳＡで刺激したＥＣ単層に添加した。３０分後、結合しなかったＥＰＣを洗い流した。蛍光スキャニングにより結合したＥＰＣを定量した。（Ａ）：代表的な画像。（Ｂ）：定量したデータ。データは、二組の試料を用いた３回の独立したアッセイの、平均±ＳＤとして表す。
【図３】図３は、ＳＤＦ−１αによる刺激が、ＥＣ単層でのＥ−セレクチンの発現をアップレギュレートすることを示す、グラフ、電気泳動を行ったゲルの写真、ＮＯＤマウス創傷の一連の顕微鏡写真、及び創傷組織の顕微鏡写真である。（Ａ）ＨＭＶＥＣをＳＤＦ−１α又はＢＳＡで４時間刺激し、トータルＲＮＡを抽出した。細胞外マトリックスの発現及び接着分子をＲＴ２ ＰＣＲ Ａｒｒａｙを用いて解析した。ＳＤＦ−１αの刺激により、Ｅ−セレクチンの発現がアップレギュレートされた。ＢＳＡで処理したＥＣにおけるｍＲＮＡのレベルを「１」と設定し、ＳＤＦ−１αで処理したＥＣでのレベルと比較した。（Ｂ）：Ｅ−セレクチンの発現をウェスタンブロット解析により確認した。ＨＭＶＥＣをＳＤＦ−１α又はＢＳＡで刺激し、様々な時点で細胞を回収した。ローディングコントロールとしてはβ−アクチンを用いた。（Ｃ）ＬａｃＺ／ＡＡＶを注入した場合と比較して、ｍＳＤＦ−１α／ＡＡＶを注入したＮＯＤマウス創傷では、Ｅ−セレクチンの血管での発現が増加した。血管中でのＫＤＲ（赤）とＥ−セレクチン（緑）の共発現（黄色）を免疫染色により検出した。（Ｄ）ｍＳＤＦ−１α／ＡＡＶを注入した創傷組織におけるＳＤＦ−１発現の増加をＩＨＣにより検出した。
【図４】図４は、ＥＣ単層でのＳＤＦ−１α誘導性Ｅ−セレクチンが、ＥＰＣ接着及び経内皮遊走を増大させることを示す一対のグラフと一連の顕微鏡写真である。（Ａ）より多くのＥＰＣが、ＢＳＡで処理したＥＣ単層によりも、ＳＤＦ−１αで刺激したＥＣ単層に接着した。さらにＥ−セレクチンに対するＡｂをブロッキングすると、この細胞間接着アッセイにおいては、ＳＤＦ−１αで刺激したＥＣとＥＰＣとの相互作用が阻害された。データは、二組の試料を用いた３回の独立したアッセイの平均±ＳＤとして表す。（Ｂ、上段）より多数のＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ標識ＥＰＣが、ＢＳＡで処理したＥＣ単層を入れたチャンバーよりも、ＳＤＦ−１αで刺激したＥＣ単層を入れたトランスウェルの下チャンバーへ遊出することが観察された。Ｅ−セレクチンに対するＡｂをブロッキングすると、このＥＰＣ経内皮遊走が阻害された。（Ｂ、下段）トランスウェルの下チャンバーのＤｉｌ−ＥＰＣを、蛍光スキャニングにより定量した。Ｅ−セレクチンに対するＡｂをブロッキングすると、ＳＤＦ−１αで刺激したＥＣとＥＰＣとの相互作用が阻害された。データは、二組の試料を用いた３回の独立したアッセイの平均±ＳＤとして表す。
【図５】図５は、ＳＤＦ−１がＥＰＣにおけるＥ−セレクチンリガンドの発現を誘導することを示す、ウェスタンブロットの写真である。ＥＰＣをＳＤＦ−１αで刺激し、様々な時点で細胞を回収した。Ｅ−セレクチンのリガンドであるＣＤ１６２とＣＤ４４の発現をウェスタンブロッティングアッセイで試験した。ローディングコントロールとしてはβ−アクチンを用いた。実験は２回繰り返して行った。
【図６】図６は、後肢虚血と皮膚創傷のマウスモデルを用いた、ＳＤＦ−１α誘導性ＥＰＣホーミング、血管新生及び創傷の治癒におけるＥ−セレクチンの関与を示す一連の写真及びグラフである。（Ａ）上段：Ｅ−ｓｅｌ−／−又はＷＴマウスにおいて、大腿動脈の結合／切除後に、血流が虚血性後肢内へ自然に戻ることを示す非侵襲性のＬＤＩ測定の代表的な画像である。下段：ＬＤＩ測定の定量データ。様々な時点での、２つの群のマウスにおける虚血性後肢対正常な後肢の比。データは、各群（ｎ＝６／群）の平均±ＳＤとして表す。（Ｂ）Ｅ−ｓｅｌ−／−又はＷＴにおける創傷閉塞率。上段：Ｅ−ｓｅｌ−／−及びＷＴマウスにおける創傷治癒の代表的な画像。Ｅ−セレクチンの欠損が創傷治癒を遅延させる。下段：Ｅ−ｓｅｌ−／−又はＷＴマウスの定量的創傷閉塞率。データは、各群（ｎ＝６／群）の創傷閉塞（回復）のパーセンテージを平均±ＳＤとして表す。（Ｃ）Ｄｉｌ色素を用いた創傷血管潅流。上段：各群について、７日目に共焦点レーザー走査写真撮影術により検出したＤｉｌ染色創傷血管の代表的な画像。下段：７日目の残留創傷の全面積における血管密度をソフトウェアを用いて定量し、蛍光のパーセンテージとして表した。ＷＴマウスの創傷は、Ｅ−ｓｅｌ−／−マウスと比較して、有意に高い血管密度を有した。データは、各群の３つの創傷における平均±ＳＤとして表す。（Ｄ）Ｅ−ｓｅｌは、創傷病変へのＥＰＣホーミングに必須である。ＲＯＳＡ２６（ＬａｃＺ＋）マウス由来の骨髄細胞（１ｘ１０７個）をＥ−ｓｅｌ−／−及びＷＴマウスそれぞれに移植した。虚血性後肢創傷を作出し、ＳＤＦ−１αを創傷に注入した。細胞を移植して７日後、創傷を回収し、凍結した試料をＸ−ｇａｌ（青）及び抗ＫＤＲ（茶色）染色に用いた。上段：二重染色の代表的な画像。下段：創傷試料の５つの無作為に選択した視野から、両方の染色で陽性だった細胞を計測した。データは、各群（ｎ＝３創傷／群）のパーセンテージの平均±ＳＤとして表す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
詳細な説明
本明細書に記載した組成物、方法及びキットは、ＥＣ及び循環するＥＰＣにより成熟したＳＤＦ−１αが仲介するＥＰＣホーミングを調節するシグナルの発見に基づいている。下記に記載する実験において、細胞を用いた治療を介した創傷におけるＳＤＦ−１αレベルの上昇が、糖尿病マウスでの治癒を促進することを示した（３日目における治癒の上昇率は〜２０％、Ｐ＝０．００６）。ＳＤＦ−１αはＥＣ−ＥＰＣ間接着を増加させ、そしてヒト毛細血管ＥＣでは、Ｅ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートした（４．６倍の上昇、Ｐ＜０．０１）。この効果は実験マウスの血管においてもまた有意であり、創傷血管新生の増加をもたらした。ＥＣ−ＥＰＣ間接着及びＥＰＣホーミングにおけるＳＤＦ−１αの制御作用はＥ−セレクチンによって特異的に仲介され、そのため、Ｅ−セレクチンアンタゴニストの適用はＳＤＦ−１α誘導性のＥＣ−ＥＰＣ間接着、ＥＰＣホーミング、創傷血管新生、及び創傷治癒を有意に阻害する。Ｅ−ｓｅｌ−／−マウスモデルを用いて、ＳＤＦ−１α誘導性の創傷治癒の仲介におけるＥ−セレクチンの必要性を示した。ＳＤＦ−１αを改変した細胞を用いた治療は、成熟ＥＣにおけるＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートしてＥＣ−ＥＰＣ間接着及びＥＰＣホーミングの増加を引き起こし、そして創傷血管新生を増大することにより、マウスにおける糖尿病性創傷の治癒を促進する。これらの発見は、ＥＰＣホーミングにおけるＳＤＦ−１αの生物学的な作用の根底にあるシグナルへの新規の洞察を提供し、そして、Ｅ−セレクチンが虚血性（例えば、糖尿病性）創傷の治癒において、ＥＰＣ輸送を治療的に操作するための新しい、潜在的な標的であることを示すものである。
【００３７】
以下に記載する好ましい実施形態は、これらの組成物、ワクチン、キット及び方法の適用を説明する。しかし、これらの実施形態の詳細な説明により、以下に提供した説明に基づいて、本発明のその他の態様を作出及び／又は実施することができる。
生物学的方法
【００３８】
本明細書においては、標準的な分子生物学的技術を含む方法を記載する。このような技術は通常当該分野において一般的に既知であり、かつ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄ．， ｖｏｌ． １−３， ｅｄ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， ２００１；及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｅｄ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９２（定期的な更新を含む）のような方法論に詳細に記述されている。免疫学的技術は通常当該分野において一般的に既知であり、かつ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ｖｏｌｕｍｅ ９３， ｅｄ． Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｗ． Ａｌｔ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ， ＭＡ， ２００７； Ｍａｋｉｎｇ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， ｅｄｓ． Ｇａｒｙ Ｃ． Ｈｏｗａｒｄ ａｎｄ Ｍａｔｔｈｅｗ Ｒ． Ｋａｓｅｒ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌ， ２００６； Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ６ｔｈ ｅｄ．， ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｇａｂｒｉｅｌ Ｖｉｒｅｌｌａ， Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｅｎｇｌａｎｄ， ２００７；及びＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８８のような方法論に詳細に記述されている。遺伝子導入及び遺伝子治療の標準的な方法もまた本発明での使用に適している場合がある。例えば、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｅｄ． Ｔ． Ｂｌａｃｋｅｎｓｔｅｉｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， １９９９； 及びＧｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）， ｅｄ． Ｐ．Ｄ． Ｒｏｂｂｉｎｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， １９９７を参照のこと。
虚血性創傷の治癒を促進する組成物
【００３９】
本明細書においては、糖尿病の対象における虚血性（例えば、糖尿病性）創傷の治癒を促進する組成物が記載される。本明細書において記載される組成物は、糖尿病性創傷のような任意の型の虚血性創傷の治癒を促進するために用いることができる。それらの組成物は通常、薬学的に許容可能な担体とＥ−セレクチンタンパク質又はＥ−セレクチンタンパク質をコードする核酸のような少なくとも１つの治療薬とを含有する、治療有効量の組成物を含む。組成物は、Ｅ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートする薬剤をさらに含んでいてもよい。この実施形態においては、Ｅ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートする任意の好適な薬剤を用いることができる。例えば、ＳＤＦ−１αを用いることができる。さらなる例としては、ＩＬ−１、ＴＮＦ−アルファ及びリポ多糖類、ポリサッカライド（ＬＰＳ）が挙げられる。この実施形態においては、組成物はＥ−セレクチンタンパク質又はＥ−セレクチンタンパク質をコードする核酸、及びＳＤＦ−１αタンパク質又はＳＤＦ−１αタンパク質をコードする核酸を含む。対象へのこの組成物の投与は、骨髄由来前駆細胞の創傷への遊走の増加、及び対象における創傷治癒の促進をもたらす。創傷治癒は、創傷の再上皮形成によって特徴付けられる。
【００４０】
Ｅ−セレクチンタンパク質は、任意の好適なプロトコールにより、単離又は合成することができる（例えば、プロテインＡ及びプロテインＧビーズを用いた抗Ｅ−セレクチン抗体捕捉技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））。Ｅ−セレクチンタンパク質を投与する一般的な実施形態においては、細菌細胞（例えば、Ｅ．Ｃｏｌｉ）を形質転換、又は哺乳類細胞をトランスフェクションし、その後細胞からＥ−セレクチンを精製することにより、Ｅ−セレクチンタンパク質が調製／合成される。ＳＤＦ−１αタンパク質も投与される実施形態においては、ＳＤＦ−１αタンパク質が同様に調製される。
【００４１】
別の実施形態においては、糖尿病性創傷を治療するために、Ｅ−セレクチンをコードする核酸を対象に投与してもよい。Ｅ−セレクチンをコードするコード配列は、アクセッション番号ＮＭ＿０００４５０のヌクレオチド配列と同一であってもよく、又は、遺伝子暗号の重複又は縮重の結果異なるコード配列ではあるが、アクセッション番号ＮＭ＿０００４５０のポリヌクレオチドと同じポリペプチドをコードする配列、であってもよい。本明細書において記載されるその他の核酸分子は、断片、アナログ、及び天然のＥ−セレクチンタンパク質の誘導体をコードする核酸分子のような、天然のＥ−セレクチン遺伝子の変異体を含む。このような変異体は、例えば、天然に生じる天然のＥ−セレクチン遺伝子の対立変異体、天然のＥ−セレクチン遺伝子のホモログ、又は天然に生じる天然のＥ−セレクチン遺伝子の変異体であってもよい。これらの変異体は、天然のＥ−セレクチン遺伝子とは塩基が１以上異なるヌクレオチド配列を有する。例えば、それら変異体のヌクレオチド配列は、天然のＥ−セレクチン遺伝子のヌクレオチドの１つ以上の欠損、付加又は置換を特徴とする場合がある。
【００４２】
その他の実施形態においては、コードされたポリペプチドに保存的置換に満たない変化を生じるヌクレオチド置換を作出することにより、構造が実質的に変化した変異型Ｅ−セレクチンタンパク質を生成することができる。そのようなヌクレオチド置換の例としては、（ａ）ポリペプチド骨格の構造；（ｂ）ポリペプチドの電荷又は疎水性；又は（ｃ）アミノ酸側鎖の大部分、における変化を生じる置換が挙げられる。通常タンパク質の特性に大きな変化を生じると予測されるヌクレオチド置換は、コドンに非保存的置換を生じる置換である。タンパク質構造に大きな変化を生じると考えられるコドン変化の例としては、（ａ）親水性残基、例えば、セリン又はトレオニン、の（又はによる）疎水性残基、例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン又はアラニンへの置換；（ｂ）システイン又はプロリンの（又はによる）任意のその他の残基への置換；（ｃ）電気的陽性の側鎖を有する残基、例えば、リジン、アルギニン、又はヒスチジン、の（又はによる）電気的陰性の残基、例えば、グルタミン又アスパラギンへの置換；又は（ｄ）大きな側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニン、の（又はによる）側鎖のない残基、例えば、グリシンへの置換を生じる置換である。
【００４３】
本明細書において記載される天然のＥ−セレクチン遺伝子の天然に生じる対立変異体又は天然のＥ−セレクチンｍＲＮＡは、天然のＥ−セレクチン遺伝子又は天然のＥ−セレクチンｍＲＮＡと少なくとも７５％（例えば、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％）の配列同一性を有し、かつ、天然のＥ−セレクチンタンパク質と類似の構造を有するポリペプチドをコードする、ヒト組織から単離された核酸である。本明細書において記載される天然のＥ−セレクチン遺伝子のホモログ又は天然のＥ−セレクチンｍＲＮＡは、天然のヒトＥ−セレクチン遺伝子又は天然のヒトＥ−セレクチンｍＲＮＡと少なくとも７５％（例えば、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％）の配列同一性を有し、かつ、天然のヒトＥ−セレクチンタンパク質と類似の構造を有するポリペプチドをコードする、その他の種から単離された核酸である。天然のＥ−セレクチン遺伝子又は天然のＥ−セレクチンｍＲＮＡと高いパーセンテージ（例えば、７０、８０、９０％、又はそれ以上）の配列同一性を有するその他の核酸分子を同定するために、公開された及び／又は登録された核酸データベースを検索することができる。
【００４４】
天然に生じないＥ−セレクチン遺伝子又はｍＲＮＡ変異体とは、天然のヒトＥ−セレクチン遺伝子又は天然のヒトＥ−セレクチンｍＲＮＡと少なくとも７５％（例えば、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％）の配列同一性を有し、かつ、天然のヒトＥ−セレクチンタンパク質と類似の構造を有するポリペプチドをコードする、天然には生じない（例えば、人工の）核酸である。天然に生じないＥ−セレクチン遺伝子変異体の例としては、Ｅ−セレクチンタンパク質の断片をコードするもの、天然のＥ−セレクチン遺伝子又は天然のＥ−セレクチン遺伝子の相補鎖にストリンジェント条件下でハイブリダイズするもの、天然のＥ−セレクチン遺伝子又はその相補鎖と少なくとも６５％の配列同一性を有するもの、及びＥ−セレクチン融合タンパク質をコードするもの、が挙げられる。
【００４５】
本明細書において記載した、天然のＥ−セレクチンタンパク質の断片をコードする核酸は、例えば、２、５、１０、２５、５０、１００、１５０、２００又はそれ以上の天然のＥ−セレクチンタンパク質のアミノ酸残基をコードするものである。天然のＥ−セレクチンタンパク質の断片をコードする核酸をコードする又はそれとハイブリダイズするより短いオリゴヌクレオチド（例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、５０、塩基対長）は、プローブ、プライマー、又はアンチセンス分子として用いることができる。天然のＥ−セレクチンタンパク質の断片をコードする核酸は、酵素を用いた消化（例えば、制限酵素を用いて）又は完全長の天然のＥ−セレクチン遺伝子、Ｅ−セレクチンｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡ、又は前述したものの変異体を化学的に分解することよって作製することができる。これまでに報告された天然のヒトＥ−セレクチン遺伝子のヌクレオチド配列及び天然のＥ−セレクチンタンパク質のアミノ酸配列を用いて、当業者は、例えば、標準的な核酸突然変異生成技術又は化学的合成によってそれらのヌクレオチド配列中に僅かな変化を有する核酸分子を作製することができる。変異型Ｅ−セレクチンタンパク質を生産するように、変異型Ｅ−セレクチン核酸分子を発現させることができる。
【００４６】
糖尿病性創傷の治癒を促進する方法
糖尿病の対象における糖尿病性創傷の治癒を促進する方法の一実施形態は、薬学的に許容可能な担体と、Ｅ−セレクチンタンパク質、Ｅ−セレクチンタンパク質をコードする核酸、及びＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートする薬剤のような少なくとも１つの治療薬を含有する治療有効量の組成物を提供する工程；及び対象において骨髄由来前駆細胞（例えば、ＥＰＣ）の創傷への遊走が増加する条件下において、この組成物を対象に投与する工程を含む。例えば、組成物は、Ｅ−セレクチンタンパク質又はＥ−セレクチンタンパク質をコードする核酸、及び、ＳＤＦ−１αタンパク質又はＳＤＦ−１αタンパク質をコードする核酸のようなＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートする薬剤を含む可能性がある。この方法においては、この組成物は任意の好適な経路、例えば、経口的、局所的、静脈内、又は創傷若しくは創傷に隣接した部位に直接、投与することができる。対象への組成物の投与は、創傷治癒の促進をもたらす。
【００４７】
糖尿病の対象における糖尿病性創傷の治癒方法は、対象に高圧酸素療法を実施する工程をさらに含んでいてもよい。本明細書において記載した方法においては、高圧酸素療法（ＨＢＯ２）は通常、毛細血管が少なくなった状況下で、創傷治癒を刺激するために用いられる補助的な治療である。ＨＢＯ２を用いた糖尿病の対象の治療方法は、例えば、参照することにより本明細書に組み入れられる、米国特許第２００８／００３７６０号に記載されている。糖尿病の対象（患者）における創傷治癒の促進方法の一例においては、患者は１日に１回又は２回、絶対気圧（ＡＴＡ）が約２．０から約３．２の間になるように圧をかけたチャンバー内で、１００％ Ｏ２を吸い込む処置を２０回以上受ける。処置時間は通常、約１０分から約２４０分（例えば、約１０、１５、３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０分など）の範囲である。
【００４８】
別の実施形態においては、糖尿病性創傷を有する糖尿病の対象においてＥ−セレクチンの発現をアップレギュレートする方法は、第一のＡＡＶ逆方向末端反復と第二のＡＡＶ逆方向末端反復との間に挿入されたＥ−セレクチンをコードするポリヌクレオチドを含有する少なくとも１つのｒＡＡＶビリオンを包含する組成物を、糖尿病の対象に投与する工程を含む。この実施形態においては、この組成物の量は、Ｅ−セレクチンの発現をアップレギュレートする、骨髄由来前駆細胞（例えば、ＥＰＣ）の創傷への遊走を誘導する、及び対象における創傷治癒を促進するのに有効な量である。この方法においては、少なくとも１つのｒＡＡＶビリオンは、血清型２カプシドタンパク質を含む場合がある。本明細書において記載するその他の実施形態では、組成物を任意の好適な経路、例えば、経口的、局所的、静脈内、又は、創傷若しくは創傷に隣接した部位に直接、投与することができる。この方法は、対象にＳＤＦ−１αタンパク質又はＳＤＦ−１αタンパク質をコードする核酸を投与する工程、及び／又は対象に高圧酸素療法を実施する工程をさらに含んでいてもよい。
【００４９】
さらにその他の実施形態においては、糖尿病の対象における糖尿病性創傷の治癒を促進する方法は、薬学的に許容可能な担体と複数の骨髄由来前駆細胞を含む組成物を提供する工程、及び、この組成物を対象に、骨髄由来前駆細胞（例えば、ＥＰＣ）の創傷への遊走を増加させ、かつ対象における創傷治癒を促進するのに有効な量を、投与する工程を含む。この実施形態においては、骨髄由来前駆細胞は、Ｅ−セレクチンをコードするポリヌクレオチドを含む。Ｅ−セレクチンをコードするポリヌクレオチドを、ｒＡＡＶベクターのようなウイルスベクター中に含有させてもよい。通常、ｒＡＡＶベクターはｒＡＡＶウイルス（粒子）に含有される。この実施形態においては、組成物は、ＳＤＦ−１αタンパク質又はＳＤＦ−１αタンパク質をコードする核酸を、さらに含んでいてもよい。組成物がＳＤＦ−１αをコードする核酸を含む場合、この核酸はｒＡＡＶベクター中、第二のｒＡＡＶベクター中、又はｒＡＡＶ以外のウイルスベクター中に存在する可能性がある。組成物を、任意の好適な経路、例えば、経口的、局所的、静脈内、又は、創傷又は創傷に隣接した部位に直接、投与することができる。この方法は、対象に高圧酸素療法を実施する工程をさらに含んでいてもよい。
【００５０】
本明細書において記載した方法は、数多くの異なる型の創傷の治療に用いることができる。糖尿病性創傷の一例としては、網状皮斑及び白色萎縮に関連した有痛性潰瘍により特徴付けられる障害である、リベド血管炎が挙げられる。糖尿病性創傷の別の例としては、例えば、末梢動脈疾患性潰瘍、静脈鬱血性潰瘍、慢性難治性潰瘍、褥瘡、褥瘡性潰瘍、慢性足潰瘍などの糖尿病性潰瘍がある。創傷は、１以上の上記に挙げた創傷の組み合わせである場合もある。糖尿病の対象は、治療を受ける１つ又は複数の創傷を有する場合もある。対象は、ヒト、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、サル、類人猿、ウサギ、ウシなどのような任意の哺乳類を含む。対象（例えば、哺乳類）は、成人及び小児を含む、発達のいずれの段階にあるものであってもよい。標的組織は、網膜、肝臓、腎臓、心臓、肺、消化管の部分、膵臓、胆嚢、膀胱、中枢神経系（脳を含む）、皮膚、骨などのような、対象におけるいずれの組織であってもよい。
【００５１】
Ｅ−セレクチンをコードする核酸（及び任意にＳＤＦ−１αをコードする核酸又はその他のＥＰＣホーミングを調節する薬剤）を糖尿病の対象に投与する方法においては、本明細書において記載した核酸は、Ｅ−セレクチンをコードする核酸（及び任意にＳＤＦ−１αをコードする核酸又はその他のＥＰＣホーミングを調節する薬剤）に操作可能に連結した、１つ以上の発現制御配列を含む場合がある。数多くのそのような配列が知られている。含まれるそれらの配列は、その他の適用におけるそれらの既知の機能に基づいて選択され得る。発現制御配列の例としては、プロモーター、インシュレーター、サイレンサー、応答エレメント、イントロン、エンハンサー、開始部位、終結シグナル、及びｐＡテールが挙げられる。
【００５２】
Ｅ−セレクチン（及び任意にＳＤＦ−１α）を適切なレベルにするために、標的細胞において使用するのに好適な、任意の数のプロモーターを用いることができる。例えば、異なる強さの構成的プロモーターを用いることができる。本明細書において記載した発現ベクター及びプラスミドは、ウイルス性プロモーター、又は、通常転写の促進において活性を有する哺乳類の遺伝子由来のプロモーターのような、１つ以上の構成的プロモーターを含んでもよい。構成的なウイルス性プロモーターの例としては、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、Ａｄ Ｅ１Ａ及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターが挙げられる。構成的哺乳類プロモーターの例としては、β−アクチンプロモーターのような、様々なハウスキーピング遺伝子のプロモーターが挙げられる。
【００５３】
誘導性プロモーター及び／又は調節エレメントもまた、本明細書において記載した組成物及び方法での使用のために検討されてもよい。好適な誘導性プロモーターの例としては、シトクロムＰ４５０遺伝子、熱ショックタンパク質遺伝子、メタロチオネイン遺伝子、及びホルモン誘導性遺伝子（エストロゲン遺伝子プロモーターなど）のような遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターの別の例には、テトラサイクリン応答性のｔｅｔＶＰ１６プロモーターがある。
【００５４】
組織特異的プロモーター及び／又は調節エレメントは、本明細書において記載した組成物及び方法の特定の実施形態において有用である。本明細書において記載した発現ベクターのような発現ベクターと共に用いることができるそれらプロモーターの例としては、Ｔｉｅ−２又はＫＤＲ＿プロモーターが挙げられる。
【００５５】
本明細書において記載した組成物（例えば、Ｅ−セレクチンをコードするウイルスベクターを含む組成物）を哺乳類対象に、任意の好適な技術により投与することができる。本明細書において記載した組成物及び方法により、細胞中にＥ−セレクチン遺伝子を導入するためのウイルスベクターを用いた、様々な技術が提供される。ウイルスは、それらの遺伝子を宿主細胞中に効率良く送達する、天然に発生した媒体であり、従って、治療的遺伝子の送達のための望ましいベクター系である。好ましいウイルスベクターは宿主細胞に対する低い毒性を示し、かつ、治療的な量のＥ−セレクチンタンパク質を（例えば、組織特異的な方法で）生産するものである。ウイルスベクター法及びプロトコールは、Ｋａｙ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７：３３−４０， ２００１にまとめられている。
【００５６】
以下に記載した実施例はｒＡＡＶ及びレンチウイルスを含むが、任意の好適なウイルスベクターを使用することができる。哺乳類対象に遺伝子を送達するための多くのウイルスベクターが当該分野において既知であり、以下に限定的な例を挙げる。遺伝子治療ベクターとして組換えアデノウイルスを使用する方法は、例えば、Ｗ．Ｃ． Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８１：２５７３−２６０４， ２０００，及びＢｒａｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ６：５９０−５９５， １９９５で議論された。単純ヘルペスウイルスベクターの使用方法については、例えば、Ｃｏｔｔｅｒ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． ＭｏＩ． Ｔｈｅｒ． １：６３３−６４４， １９９９で議論された。ＨＩＶを含む、複製欠損レンチウイルスベクターもまた用いることができる。レンチウイルスベクターの使用方法は、例えば、Ｖｉｇｎａ ａｎｄ Ｎａｌｄｉｎｉ， Ｊ． Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ． ５：３０８−３１６， ２０００ 及び Ｍｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：８１５０−８１５７， １９９８で議論された。マウス白血病ウイルスに基づくベクターを含む、レトロウイルスベクターもまた用いることができる。レトロウイルスに基づくベクターの使用方法は、例えば、Ｈｕ ａｎｄ Ｐａｔｈａｋ， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｒｅｖ． ５２：４９３−５１１， ２０００ 及び Ｆｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｔｈｅｒ． Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ． １７：１−６０， ２０００で議論された。用いることができるその他のウイルスベクターには、セムリキ森林ウイルス及びシンドビスウイルスを含む、アルファウイルスが挙げられる。Ｅ−セレクチン遺伝子を標的組織（例えば、糖尿病性創傷）に送達するために、ハイブリッドウイルスベクターを用いてもよい。ハイブリッドベクターを構築するための標準的な技術は当業者に周知である。そのような技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ又は組換えＤＮＡ技術について議論した多くの実験手引き書において見ることができる。
【００５７】
いくつかの実施形態においては、本明細書において記載した組成物及び方法の核酸は、それらの細胞中への導入を促進するために、ｒＡＡＶベクター及び／又はビリオン中に組み入れられる。有用なｒＡＡＶベクターは、（１）発現する異種配列（例えば、Ｅ−セレクチンタンパク質をコードするポリヌクレオチド）及び（２）異種遺伝子の組換え及び発現を促進するウイルス配列、を含む組換え核酸構築物である。ウイルス配列は、複製、及びＤＮＡのビリオン中へのパッケージング（例えば、機能性ＩＴＲ）のためにシスに必要とされるＡＡＶの配列を含む場合もある。一般的な適用においては、異種遺伝子は、骨髄由来前駆細胞の創傷への遊走を増加し、糖尿病の対象における創傷治癒を促進するのに有用なＥ−セレクチンをコードする。そのようなｒＡＡＶベクターは、マーカー又はレポーター遺伝子をもまた含む場合がある。有用なｒＡＡＶベクターは、その全体又は一部分が欠損しているが機能性ＩＴＲ配列を保持する、１つ以上のＡＡＶ ＷＴ遺伝子を有する。ＡＡＶ ＩＴＲは、特定の適用において好適な任意の血清型（例えば、血清型２由来の）であってよい。ｒＡＡＶベクターの使用方法は、例えば、Ｔａｌ， Ｊ．，Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｓｃｉ． ７：２７９−２９１， ２０００及びＭｏｎａｈａｎ ａｎｄ Ｓａｍｕｌｓｋｉ， Ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ７：２４−３０， ２０００において議論された。
【００５８】
本発明の核酸及びベクターを、その核酸又はベクターの細胞中への導入を促進するために、ｒＡＡＶビリオン中に組み入れることができる。ＡＡＶのカプシドタンパク質は、ビリオンの外部、非核酸部分を含み、かつ、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子によりコードされる。ｃａｐ遺伝子は、ビリオンの集合に必要な３つのウイルス性コートタンパク質であるＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３、をコードする。ｒＡＡＶビリオンについては既に記載がある。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号、同５，１３９，９４１号、同５，８６３，５４１号、及び同５，８６９，３０５号、同６，０５７，１５２号、同６，３７６，２３７号；Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：７９１−８０１、２００２；並びに、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７６：７９１−８０１， ２００２；及びＢｏｗｌｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７７：４２３−４３２， ２００３を参照のこと。
【００５９】
本発明において有用なｒＡＡＶビリオンは、１、２、３、４、５、６、７、８及び９を含む、多数のＡＡＶ血清型由来のビリオンを含む。異なる血清型のＡＡＶベクター及びＡＡＶタンパク質の構築及び使用については、Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．， ＭｏＩ． Ｔｈｅｒ． ２：６１９−６２３， ２０００； Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ９７：３４２８−３４３２， ２０００； Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：２２２４−２２３２， １９９８； Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７４：１５２４−１５３２， ２０００； Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７５：６６１５−６６２４， ２００１；及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎｅｔ． １０：３０７５−３０８１， ２００１において議論された。
【００６０】
本明細書において記載した組成物、キット及び方法においては、偽型ｒＡＡＶもまた有用である。偽型ベクターは、ある特定の偽型血清型のＡＡＶベクターと、その特定の血清型以外の血清型由来のカプシド遺伝子とを含む。偽型ｒＡＡＶビリオンの構築及び使用を含む技術は、当該分野において既知であり、及びＤｕａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ， ７５：７６６２−７６７１， ２００１； Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ， ７４：１５２４−１５３２， ２０００； Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ， Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２８： １５８−１６７， ２００２；及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ， Ｈｕｍ． Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎｅｔ． １０：３０７５−３０８１， ２００１に記載されている。
【００６１】
特定の細胞型に、非変異型カプシドビリオンを用いた場合よりも、より効果的に感染させるために、ビリオンカプシド中に変異を有するＡＡＶビリオンを用いてもよい。例えば、好適なＡＡＶ突然変異体は、ＡＡＶの特異的細胞型へのターゲティングを促進するために、リガンド挿入変異を有する場合もある。挿入変異体、アラニンスクリーニング突然変異体、及びエピトープタグ突然変異体を含むＡＡＶカプシド突然変異体の構築及び解析については、Ｗｕ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７４：８６３５−４５，２０００に記載されている。本明細書において記載した方法及び組成物において使用することができるその他のｒＡＡＶビリオンとしては、ウイルスの分子育種並びにエキソンシャッフリングにより生成されたカプシドハイブリッドがある。Ｓｏｏｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ２５：４３６−４３９， ２０００；及びＫｏｌｍａｎ ａｎｄ Ｓｔｅｍｍｅｒ Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９：４２３−４２８， ２００１を参照のこと。
【００６２】
ウイルスベクター又はウイルス粒子の注入による非経口投与、例えばボーラス注入又は持続注入、を行ってもよい。注入用製剤は、単位容量形態、例えばアンプル中又は複数回投与用の容器中に、保存料を含めて提供してもよい。組成物は、懸濁液、溶液、又は油性若しくは水性媒体中の乳濁液としてそのような形態をとることができ、また、懸濁化剤、安定化剤、及び／又は分散剤のような成形剤を含んでもよい。あるいは、ベクター又はウイルス粒子は、使用前に無菌の発熱物質を含まない水などで構成するための粉末形態（例えば凍結乾燥した）であってもよい。
【００６３】
ウイルスベクターに加え、少なくとも１つの糖尿病性創傷を有する糖尿病の対象へＥ−セレクチンをコードする核酸を導入するのに好適な任意の媒体又はベクターを用いることができる。例えば、超音波を用いた遺伝子送達技術を用いることができる。さらなる例としては、パーティクルボンバードメント及び細胞のエレクトロポレーションが挙げられる。プラスミドＤＮＡと共に多細胞性集合体を形成する、合成遺伝子導入分子もまた有用である。そのような分子には、高分子ＤＮＡ結合性陽イオン（Ｇｕｙ ｅｔ ａｌ．，ＭｏＩ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３：２３７−２４８，１９９５）、陽イオン性両親媒性試薬（リポポリアミン及び陽イオン性脂質、Ｆｅｉｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７２：１２６−１３９，１９９５）、及び陽イオン性リポソーム（Ｆｏｍｉｎａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．２：４５５−４６４，２０００）が含まれる。
【００６４】
いくつかの実施形態においては、ｒＡＡＶ−Ｅ−セレクチンベクター又はウイルスを含むＥＰＣを、１以上の糖尿病性創傷を治療するために糖尿病の対象に投与する。対象にＥＰＣを導入するためには、カテーテルを介した静脈内送達（例えば、血管内カテーテル）又は標的部位、例えば糖尿病性創傷への直接注入を含む複数の方法が用いられ得る。ドナー幹細胞の単離及び、そのような単離した細胞の移植の技術は当該分野において周知である。ｒＡＡＶビリオンを用いて導入した細胞のｅｘ ｖｉｖｏ送達もまた、本明細書において記載した方法に包含される。ｅｘ ｖｉｖｏの遺伝子送達は、移植、例えばｒＡＡＶを導入した宿主細胞（例えばＥＰＣ）を宿主に戻すために用いられる場合がある。好適なｅｘ ｖｉｖｏのプロトコールは複数の工程を含む場合がある。標的組織のセグメント（例えば、ＢＭ由来ＥＰＣ）を宿主から回収してもよく、及びＥ−セレクチンをコードする核酸を対象（すなわち宿主）の細胞に導入するために、ｒＡＡＶビリオンを用いてもよい。これらの遺伝的に改変された細胞をその後、対象に戻すために移植してもよい。細胞を対象に再導入するためには、静脈内注入、腹腔内注入、又は標的組織へのｉｎ ｓｉｔｕ注入を含む複数の方法が用いられ得る。用いることができるその他の技術には、ｅｘ ｖｉｖｏでｒＡＡＶを導入又は感染させた細胞のマイクロカプセル化がある。本発明による自家並びに同種細胞移植を用いてもよい。
【００６５】
ＢＭから非ＢＭ区域（例えば、標的組織）へのＢＭ由来前駆細胞のリクルートメントを増加するために、本明細書において記載した創傷治癒を促進する組成物は、Ｅ−セレクチン及びＳＤＦ−１αに加えて、ＢＭ由来前駆細胞のリクルートメントを促進することができる任意のその他の薬剤を含む場合がある。多数のそのような薬剤が既知である。例えば、国際公開第００／５００４８号に記載されている薬剤；インテグリン（例えば、α４、α５）、接着分子のセレクチンファミリー、ＶＣＡＭ−１、及びコロニー刺激因子を参照のこと。
【００６６】
本明細書において記載した治療方法は通常、治療を必要とする哺乳類（特にヒト）対象（例えば動物、ヒト）に、治療有効量の本明細書において記載した組成物を投与する工程を含む。そのような治療は、対象（特に、疾患、障害、又はその症状に、罹患している、有する、感受性のある、又はリスクを有するヒト）に好適な方法で投与される。「リスクを有する」対象の決定は、診断検査又は対象若しくは健康管理者の意見による、任意の主観的又は客観的判断においてなされる場合がある。本明細書において記載される方法及び組成物は、Ｅ−セレクチンのシグナル伝達、発現、又は活性のダウンレギュレーションを意味すると考えられる、いずれのその他の障害の治療にもまた有用である可能性がある。
【００６７】
一実施形態においては、糖尿病の対象における糖尿病性創傷の治癒を促進する方法は、治療経過をモニタリングする工程を含む。対象における治療経過のモニタリングは通常、創傷の治療を促進するのに十分な治療量の本明細書において記載した組成物を対象に投与する前に、糖尿病性創傷を有する対象における創傷の大きさの測定値又はその他の診断的測定値を決定する工程を含む。治療を促進するのに十分な治療量の本明細書において記載した組成物を対象に投与した後、１回以上の時点において、創傷の大きさの２回目の測定を行い、最初に測定した創傷の大きさと比較する。最初及びその後の大きさを、創傷治癒の経過（例えば創傷の大きさの減少）及びその治療の効果をモニターするために比較する。
【００６８】
キット
哺乳類対象における少なくとも１つの糖尿病性創傷を治療するキットを本明細書において記載した。一般的にはキットは、Ｅ−セレクチンタンパク質、Ｅ−セレクチンタンパク質をコードする核酸、又はＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートする薬剤のような治療薬を少なくとも１つと、薬学的に許容可能な担体とを含有する、治療有効量の組成物、並びに使用説明書を含む。一実施形態においては、キットは、治療有効量のＥ−セレクチンタンパク質又はＥ−セレクチンタンパク質をコードする核酸、及びＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートする薬剤を含有する治療用組成物、並びに使用説明書を含む。例えば、哺乳類対象における少なくとも１つの糖尿病性創傷を治療するキットは、治療有効量のＥ−セレクチンタンパク質又はＥ−セレクチン（例えば、ｒＡＡＶ−Ｅ−セレクチン）をコードする核酸、及び創傷治癒を促進する治療有効量のＳＤＦ−１α、並びに薬学的に許容可能な担体とを単位容量形態で含有する治療用組成物を含む。通常、本明細書において記載したキットは、包装及び使用説明書を含む。いくつかの実施形態においては、このキットは治療用又は予防用組成物を含む無菌的な容器を含む。そのような容器は、箱、アンプル、瓶、バイアル、チューブ、袋、パウチ、ブリスターパック、又はその他の、当該分野において既知の好適な形態の容器であってよい。そのような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属ホイル、又はその他の、薬物を保持するための好適な材料から作製することができる。本明細書において記載した治療用組成物に加えて、治療を受ける対象に高圧酸素療法を実施する実施形態においては、使用説明書は一般的に、対象への高圧酸素療法の実施についての方法を含むだろう。
【００６９】
ＥＰＣ（例えば、ｒＡＡＶ−Ｅ−セレクチンを含むＥＰＣ）を糖尿病の対象に投与する一実施形態では、本明細書において記載したキットは、治療量のＥＰＣと共に、１つ以上の糖尿病性創傷を有する対象への細胞の投与方法についての説明書を含む。細胞を輸送及び保存するために好適な任意の手段で、細胞を包装することができ、そのような方法は当該分野において周知である。使用説明書は通常、細胞；糖尿病性創傷の治療のための投与量計画及び投与；予防策；警告；適応症；不適応症；過剰投与情報；有害反応；動物での薬理；臨床試験；及び／又は参考文献、についての説明を１つ以上含む。この使用説明書は、容器（がある場合）に直接印刷してもよく、又は容器に適用したラベルとして、又は、容器中に若しくは容器と共に提供する別個の紙、パンフレット、カード若しくはホルダーとして印刷してもよい。
【００７０】
組成物の投与
本発明の組成物を、哺乳類（例えば、齧歯類、ヒト）に任意の好適な製剤として投与することができる。例えば本明細書において記載した創傷治癒を促進する組成物（例えば、Ｅ−セレクチン、Ｅ−セレクチンをコードする核酸、ＳＤＦ−１α）を、薬学的に許容可能な担体又は生理食塩水若しくは緩衝塩類溶液のような希釈剤中に処方することができる。方法及び投与経路並びに標準的な薬務に基づき、好適な担体及び希釈剤を選択することができる。薬学的に許容可能な担体及び希釈剤、並びに薬剤処方の例についての説明は、当該分野における標準的な教科書であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、及びＵＳＰ／ＮＦ中に見ることができる。組成物の安定化及び／又は保存のために、その他の物質を加えてもよい。
【００７１】
任意の標準的な技術により、本発明の組成物を哺乳類に投与することができる。一般的には、それらの投与は、局所（例えば、エアロゾル、クリーム、泡、ゲル、液体、軟膏、ペースト、粉末、シャンプー、スプレー、パッチ、円板状、若しくは包帯）又は経口となるであろう。一実施形態において組成物が経口送達用に処方される場合、活性成分は賦形剤に含まれ、摂取可能な錠剤、口腔用錠剤、トローチ、カプセル、エリキシール、懸濁液、シロップ、ウェハース、などの形態において用いられ得る。錠剤、トローチ、丸薬、カプセルなどは、結合剤（トラガカントゴム、アカシアゴム、コーンスターチ、若しくはゼラチンなど）；賦形剤（第二リン酸カルシウムなど）；崩壊剤（コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸など）；滑沢剤（ステアリン酸マグネシウムなど）；及び甘味料（ショ糖、ラクトース、若しくはサッカリンなどを加えてもよい）又は香味料（ペパーミント、イチヤクソウ油、若しくはサクランボ香料）をまた含んでいてもよい。投与量単位形態がカプセルである場合、それは、上述の型の材料に加え、液体担体を含んでもよい。様々なその他の材料を、被覆材として、そうでなければ投与量単位の物理的形状を変化させるものとして含んでもよい。例えば、錠剤、丸薬又はカプセルを、シェラック、糖、又はその両方で被覆してもよい。エリキシールのシロップは、活性化合物、甘味料としてのショ糖、保存剤としてのメチルパラベン及びプロピルパラベン、色素、並びに香味料としてのサクランボ及びオレンジ香料を含む場合がある。加えて、活性化合物を、徐放性、パルス放出性、制御放出性又は遅延放出性調整物及び製剤中に組み入れることもできる。
【００７２】
あるいは、投与は非経口（例えば、静脈内、皮下、腫瘍内、筋内、腹腔内、又は髄腔内導入）であってもよい。本明細書においては、組成物はまた、皮内パッチ、すなわち治療する皮膚部分に隣接して投与するパッチを介しても提供され得る。本明細書で使用する場合、「パッチ」は少なくとも、本明細書において提供される組成物、及びそのパッチが治療する皮膚部分を覆って配置される被覆層を含む。本明細書において提供する組成物の、角質層を介した表皮又は真皮への送達が最大になるように、遅滞時間が減少するように、一様な吸収を促進するように、及び機械的な摩擦落ちを低減させるように、パッチを設計することができる。
【００７３】
組成物を標的部位に、例えば、標的部位の内部若しくは外部への外科的な送達、又は血管から到達することが可能な部位へのカテーテル（例えば、血管内カテーテル）を用いて、直接投与することもできる。糖尿病性創傷を有する対象を治療する場合、静脈内に、直接創傷中に、又は創傷表面に、組成物を対象に投与することができる。組成物を、単一の丸薬、頻回注射として、又は持続注入（例えば、静脈内に、腹膜透析、輸液ポンプ）により投与することができる。非経口投与については、組成物は好ましくは無菌的な発熱物質を含まない形態において処方される。
【００７４】
治療薬（例えば、Ｅ−セレクチンタンパク質、Ｅ−セレクチンをコードする核酸、Ｅ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートする薬剤）を実質的に投与の直後に、又は投与後の任意の予め決められた時間若しくは期間放出するように、本明細書において記載した医薬組成物を処方してもよい。後者の型の組成物は通常、制御放出処方として知られている。長期間にわたって体内の薬の濃度を実質的に一定にする製剤を用いることができる。別の実施形態においては、予め決められた遅滞時間の後に、長期間にわたって体内の薬の濃度を実質的に一定にする製剤を用いることができる。別の例としては、相対的な、一定の、効果的な体内レベルを維持し、同時に、活性物質の血漿レベルにおける変動と関係する望ましくない副作用を最小限にすることにより、予めじめ決められた期間中その作用を持続する製剤を用いることができる。本明細書において記載した組成物は、簡便な投与、例えば投与量の毎週又は隔週に一度の投与、を可能にする製剤、並びに、例えば浸透圧ポンプ又は治療薬を特定の細胞型（例えば、内皮細胞）に送達するための超音波を用いた遺伝子送達技術により糖尿病性創傷を標的とする製剤においてもまた用いられる。
【００７５】
送達される治療薬の放出速度が代謝速度に勝る制御放出を達成するために、数多くの方法が使用可能である。一例において制御放出は、様々な製剤指標、並びに成分（例えば、様々な型の制御放出組成物及び被覆剤を含む）の適切な選択により達成される。治療薬を適切な賦形剤と共に、投与に際して治療薬を制御された方法で放出する医薬組成物として処方することができる。例としては、単一又は複数単位の錠剤若しくはカプセル組成物、油溶液、懸濁液、乳濁液、マイクロカプセル、ミクロスフェア、分子複合体、ナノ粒子、パッチ、及びリポソームが挙げられる。
【００７６】
有効投与量
上述した組成物は、有効量で、すなわち治療される哺乳類において所望される効果（例えば、成熟ＥＣでのＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートし、ＥＣ−ＥＰＣ間接着、ＥＰＣホーミング及び創傷血管新生の増加を誘導することにより、マウスにおける糖尿病性創傷の治癒を促進する）をもたらすことが可能である量で、好ましくは哺乳類（例えば、ヒト）に投与される。そのような治療有効量は以下に記載するように決定することができる。
【００７７】
本発明の方法において用いられる組成物の毒性及び治療上の有効性は、培養細胞、又はＬＤ５０（集団の５０％致死量）を決定するための実験動物のいずれかを用いて、標準的な薬学的手法により決定することができる。毒性と治療効果との間の用量比が治療指数であり、これはＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療指数を示す組成物が好ましい。有毒性の副作用を示す組成物を使用することもできるが、そのような副作用による潜在的な被害を最少にする送達系を設計する治療を用いなくてはならない。好ましい組成物の投与量は、好ましくは、毒性がないまたは毒性がほとんどない、ＥＤ５０を含んだ範囲にある。投与量は、用いられる投与形態及び使用する投与経路により、この範囲内で多様になり得る。
【００７８】
医学及び獣医学の分野において周知であるように、任意のある対象に対する投与量は、対象の大きさ、体表面積、年齢、投与する特定の組成物、投与の時間及び経路、総体的な健康、及び同時に投与されるその他の薬剤、を含む多くの因子に左右される。静脈内に投与する粒子の適切な投与量は、例えば、１つの創傷当たり約１０９のウイルス粒子、及び組換えタンパク質（例えば、ＳＤＦ−１α、Ｅ−セレクチン）の適切な投与量は例えば、２５μｇ／ｋｇの範囲になると予測される。
【００７９】
実施例
本発明を以下の特定の実施例によりさらに説明する。提供した実施例は説明するためだけのものであり、決して本発明の範囲を限定すると解釈されるものではない。
【００８０】
実施例１ Ｅ−セレクチンはＳＤＦ−１αに応答して内皮前駆細胞のホーミングを仲介し、また、正常な四肢血行再建及び創傷治癒率を仲介する：糖尿病に関連した難治性細小血管障害及び難治性創傷への潜在的な臨床的有用性
ＳＤＦ−１αは、骨髄から血管新生を必要とする末梢部位へとＥＰＣをリクルートさせるためのホーミングシグナルを生じるが（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＳＤＦ−ｌα ａｓ ａ ｃｒｉｔｉｃａｌｌｙ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｆａｃｔｏｒ， ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ Ｄｉａｂｅｔｅｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｎｏｎ−ｈｅａｌｉｎｇ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｗｏｕｎｄｓ： Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００７， １１７：１２４９−１２５９）、ＳＤＦ−１αによって循環しているＥＰＣが標的組織へとホーミングするようになる機序は、これまで明かになっていなかった。ＥＰＣの標的組織へのホーミングを達成するためには、毛細血管内膜のＥＣと循環しているＥＰＣとの間の直接的な細胞間相互作用が必要であり、かつ、それらの相互作用が四肢血行再建及び皮膚創傷の治癒率に影響を与えると推測された。本明細書においては、成熟ＥＣにおいてＳＤＦ−１αにより制御される特異的接着分子であって、ＥＰＣホーミング過程を仲介する分子の同定について記載した。マウス及びヒト細胞における研究によるこの新規データから、この分子をＥ−セレクチンと同定した。さらなるデータにより、Ｅ−セレクチンの組織レベルの発現が、四肢血行再建及び創傷治癒に有利に影響を与えることが示された。また、Ｅ−セレクチンを細小血管障害に罹患した難治性創傷（糖尿病を有する患者における難治性創傷のような）へ局所的に送達することが、新しい創傷治癒技術としての有用性をもたらすだろうと推測された。虚血性及び糖尿病性創傷において試験することができる、Ｅ−セレクチンをコードするＡＡＶベクターを開発中である。
【００８１】
ＲＴ２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ ＰＣＲアレイを用いて、ヒト成熟ＥＣにおいてＳＤＦ−１αによって誘導される細胞外マトリックス及び接着分子を解析した。アレイにより、遺伝子発現が有意に増加することが認められた分子については、ウェスタンブロッティング及び免疫組織化学によって確認した。ヒトＥＰＣとＥＣとの間の直接的な細胞間相互作用におけるＳＤＦ−１αの効果を、細胞接着及び経内皮遊走アッセイによって解析した。同定した接着分子の、ＳＤＦ−１α誘導性ＥＣ−ＥＰＣ相互作用、ＥＰＣホーミング、四肢血管再建、及び創傷治癒の仲介における特異的な機能を、アンタゴニストを用いてインビトロ及びインビボで試験した。組織レベルでのＥ−セレクチンの発現がある場合及び発現がない場合のＥＰＣの創傷へのリクルートメント、及び創傷治癒率を調べるために、骨髄移植実験（Ｒａｓａ２６マウス由来の骨髄細胞をＥ−ｓｅｌ＋／＋若しくはＥ−ｓｅｌ−／−マウスに移植した）を行った。データをＡＮＯＶＡにより解析した。
【００８２】
ＳＤＦ−１αは、インビトロでのＥＣ−ＥＰＣ間接着及び経内皮遊走を有意に増加させ、及びインビボでのＥＰＣホーミングを高めた。ＳＤＦ−１αは、培養ヒト成熟微小血管ＥＣ及び実験用マウスの血管におけるＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートしたが、Ｐ−及びＬ−セレクチンの発現は増加させなかった。Ｅ−セレクチンアンタゴニストの適用がＳＤＦ−１α誘導性ＥＣ−ＥＰＣ間接着、遊出及びＥＰＣホーミングを有意に阻害したように、ＥＣ−ＥＰＣ間接着及びＥＰＣホーミングにおけるＳＤＦ−１αの効果はＥ−セレクチンにより特異的に仲介される。インビボにおいてはＥ−セレクチンの組織レベルでの発現が正常な創傷治癒及び血管新生に必要であり、Ｅ−セレクチンの組織レベルでの発現は、糖尿病に関連した難治性創傷の正常な治癒及び不良において重大なこれら２つの生物学的イベントに好都合な影響を及ぼす。
【００８３】
結論として、ＳＤＦ−１αは成熟ＥＣにおけるＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートして、ＥＣ−ＥＰＣ間接着、ＥＰＣホーミング、四肢血管再建、及び創傷治癒の増加を引き起こす。これら新規の知見は、ＥＰＣホーミング及び糖尿病性創傷の治癒に及ぼすＳＤＦ−１αの生物学的効果の根底にある分子機構に対する深い洞察を提供し、その結果、糖尿病に関連した細小血管障害及び難治性皮膚創傷におけるＥＰＣ輸送、血管新生、及び創傷治癒の治療上の取扱いにおいてＥ−セレクチンが新しい標的であることを示す。
【００８４】
実施例２ 後天的な血管新生の制御に対する新規標的としてのＥ−セレクチンの同定：糖尿病性創傷治癒における重要性
糖尿病性創傷においては、ＥＰＣの血管新生部位へのリクルートメントのためのホーミングシグナルであるＳＤＦ−１αがダウンレギュレートされていることがこれまでに報告されている（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００７， １１７：１２４９−１２５９）。以下に記載した実施例では、成熟ＥＣ及び循環しているＥＰＣのＳＤＦ−１α介在性ＥＰＣホーミングを達成するシグナルについての研究を行った。糖尿病性創傷におけるＳＤＦ−１αは、ＳＤＦ−１α改変骨髄由来繊維芽細胞を注入することにより、対照細胞と比較して、治療的に増加した（Ｎ＝４８（２０、ＮＯＤ）、（２８、ＳＴＺ−Ｃ５７））。ＰＣＲアレイによる遺伝子発現の違いを、ウェスタンブロッティング及び免疫組織化学により確認した。さらにアンタゴニストを用いて、ＳＤＦ−１α誘導性ＥＰＣホーミング及び創傷治癒の仲介における接着分子の機能についてインビトロ及びインビボで研究を行った。細胞を用いた治療を介した創傷でのＳＤＦ−１αの増加は、糖尿病性マウスでの治癒を促進した（３日目における治癒率は〜２０％増加した。ｐ＝０．００６）。ＳＤＦ−１αはＥＣ−ＥＰＣ間接着を増加させ、ヒト微小血管ＥＣにおけるＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートした（２．３倍の増加、ｐ＜０．０１）。この効果は実験マウスの血管においても有意であり、そして創傷性血管新生の増加をもたらした。ＥＣ−ＥＰＣ間接着及びＥＰＣホーミングにおけるＳＤＦ−１αの制御効果はＥ−セレクチンによって特異的に仲介され、Ｅ−セレクチンアンタゴニストの適用はＳＤＦ−１α誘導性ＥＣ−ＥＰＣ間接着、ＥＰＣホーミング、創傷性血管新生、及び創傷治癒を有意に阻害した。ＳＤＦ−１α改変細胞を用いた治療は、成熟ＥＣにおけるＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートしてＥＣ−ＥＰＣ間接着の増加、ＥＰＣホーミング、及び創傷性血管新生の増加を引き起こすことにより、マウスにおける糖尿病性創傷治癒を促進した。これらの知見は、ＥＰＣホーミングにおけるＳＤＦ−１αの生物学的効果の根底にあるシグナルについての新規の知見を提供し、かつ、糖尿病性創傷の治癒でのＥＰＣ輸送の治療的取扱いにおいてＥ−セレクチンが新しい標的となることを示すものである。
【００８５】
材料及び方法
正常ヒト真皮からＨＭＶＥＣを単離し、１％ゼラチンでコーティングしたプレート上で培養した。ヒトＥＰＣをＮＤＲＩ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）から購入し、サプリメント及び５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を含む完全ＥＧＭ２培地中で培養した。２９３、２９３Ｔ及びＮＩＨ／３Ｔ３細胞を１０％ ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｓｂａｄ、ＣＡ）中で培養した。細胞は全て、５％ ＣＯ２を含む９８％に加湿した大気中、３７℃で培養した。細胞接着及び経内皮遊走アッセイには、ＥＰＣをＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ（ＢＴ−９０２，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ，ＭＡ）で４時間、３７℃で標識し、その後リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。サブコンフルエントに達したＨＭＶＥＣ又はＥＰＣを組換えヒトＳＤＦ−１α（１００ｎｇ／ｍｌ）で、実施例において示したように様々な時間刺激した。ＢＳＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）を対照として用いた。
【００８６】
８〜１２週齢の野生型（ＷＴ）のメスのＣ５７ＢＬ６マウスはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から購入した。１０〜１２週齢のＮＯＤ（ＮＯＤ／ｓｈｉｌＴＪ）、８週齢のＥ−ｓｅｌ−／−（Ｂ６．１２９Ｓ４−ｓｅｌｅｔｍｉＤｍｉｌ／Ｊ）マウス及び１０〜１２週齢のＲｏｓａ２６（ｌａｃＺ＋）（Ｂ６．１２９Ｓ７−ＧＴ（ＲＯＳＡ）２６ｓｏｒ／Ｊ）マウスはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入した。全ての外科的手法では、８０ｍｇ／ｋｇのケタミン及び２０ｍｇ／ｋｇのキシラジンの腹腔内注入により、マウスを麻酔した。骨髄移植実験には、Ｒｏｓａ２６マウス由来の１ｘ１０７個の骨髄細胞を１００μｌのＰＢＳに懸濁し、尾静脈注射により、Ｅ−ｓｅｌ−／−又はＷＴマウス（Ｃ５７ＢＬ６）中に移植した。
【００８７】
既に記載のあるようにストレプトゾシン（ＳＴＺ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）糖尿病を誘導し、モニターした（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００７，１１７：１２４９−１２５９）。ＮＯＤマウスは一般に、１４〜２０週以内に糖尿病を発症する。全４８匹の糖尿病マウス（Ｎ＝２８、ＳＴＺ−Ｃ５７；Ｎ＝２０、ＮＯＤ）を解析した。グルコメーターを用いて、マウス尾静脈の血清グルコースを測定した。血清グルコースが２５０ｍｇ／ｄｌに達した後、実験での使用に先だって、マウスを３日間毎日測定した。糖尿病マウスにおける平均血清グルコースレベルは４４６ｍｇ／ｄｌであり、その範囲は３５６〜５１２ｍｇ／ｄｌであったが、対照の非糖尿病マウスにおける平均血清グルコースレベルは１２２ｍｇ／ｄｌであり、その範囲は９６〜１３７ｍｇ／ｄｌだった。６ｍｍのパンチ生検を用いてマウス背の背面に創傷を誘導した。完全に肥厚した皮膚を除去し、その下にある筋肉を露出させた。
【００８８】
最適なウイルスの導入効率を記載したこれまでの研究、及び予測された潜在的な臨床的関連に基づき、ＳＤＦ−１αのレベルを操作する道具として、インビトロでの研究のためにレンチウイルスベクターを、インビボ実験のためにアデノ随伴ウイルスベクターを選択した。ｐＨＸベクター中にヒト又はマウスＳＤＦ−１ａ遺伝子を挿入することにより、ヒトＳＤＦ−ｌα／ｌｅｎｔｉを構築した（Ｂａｌｉｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００５，１１５：３１６６−３１７６）。対照ベクターであるＧＦＰ／ｌｅｎｔｉは、これまでの記載に従って構築した（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００６，６６：４１８２−４１９０）。２９３Ｔ細胞と既に記載のある３種類のプラスミドを共にトランスフェクションすることにより、偽型レンチウイルスを作製した（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ ２００６，２０：１００９−１０１１）。形質転換の４８時間後に回収したレンチウイルスの力価は、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞中において、約１０７導入単位／ｍｌであった。レンチウイルスを標的細胞に感染させるには、細胞を６時間、４μｇ／ｍｌポリブレン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）存在下で、ＭＯＩ（感染多重度）５のウイルスに曝露した。その後細胞を洗い、さらに２日間通常の完全培地で培養し、そしてＥＬＩＳＡでタンパク質発現を解析するか、又は個々の実験において示したその後の解析用に蓄えた。マウスＳＤＦ−１α／ＡＡＶ及び対照ベクターであるＬａｃＺ／ＡＡＶを、ＡＡＶ２ベクター中にマウスＳＤＦ−１α又はＬａｃＺ遺伝子を挿入することにより構築した（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００５，５：２８５−２９７）。２９３細胞と３種類のプラスミドをトランスフェクションすることによりＡＡＶを作出し、そしてＡＡＶをヘパリンクロマトグラフ法により精製し、力価を測定した。組換えＡＡＶを用いた局所的な創傷への注入には、ＰＢＳに溶解した１０１２ウイルス単位／ｍｌのＡＡＶ、１００μｌを、創底に注入した。細胞を用いた治療には、マウス骨髄細胞を１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を入れたプラスチック製の容器中で２週間、３日毎に培地を交換しながら培養することにより、骨髄由来繊維芽細胞（ＢＭＤＦ）を作出した。接着細胞は紡錘型、及び筋繊維芽細胞表現型と一致するα−平滑筋アクチン＋（αＳＭＣ＋）を示した。ＢＭＤＦを、マウスＳＤＦ−１α又はＧＦＰ（対照）をコードするレンチウイルスベクターと共に形質導入した。ＢＭＤＦにおける外因性ｍＳＤＦ−１αの発現をＥＬＩＳＡによって確認した（データは示さない）。６ｍｍのパンチ生検皮膚創傷を作製し、１００μｌのＰＢＳに懸濁した１ｘ１０７ｍＳＤＦ−１α／ＢＭＤＦ又はＧＦＰ／ＢＭＤＦを創傷に注入した。
【００８９】
Ｈｕｍａｎ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ＆ ＥＣＭ ＲＴ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（商標）ＰＣＲアレイは、接着分子及びＥＣＭの８４遺伝子の発現を定量的にプロファイリングする（＃ＰＡ−０１１、ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）。Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトータルＲＮＡを抽出し、そしてＲＴ２ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄキット（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲアレイは製造業者によるプロトコールに従って行った。検量線をプロットするためには閾値に達するサイクル（Ｃｔ）での値を用いた。全ての試料は、β−アクチンに対する相対的なレベルとして標準化し、そして結果を相対的なレベルにおける蛍光強度として表した。
【００９０】
培養細胞上清におけるＳＤＦ−１αの濃度を、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ＳＤＦ−１αＥＬＩＳＡキット（ＤＹ４６０，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、製造業者のプロトコールに従って測定した。
【００９１】
ＨＭＶＥＣのＥＣ単層を、コンフルエント近くになるまで、２４ウェルプレート中で培養し、１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＳＤＦ−１α又はＢＳＡを用いて８時間刺激した。その後培地を、ＳＤＦ−１αを含まないＥＧＭ２培地に交換した。予め標識し、２％のアガロースでコーティングされたプレート上で懸濁液として１６時間培養しておいた、１ｘ１０５のＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ標識ＥＰＣをウェル中に加え、ＨＭＶＥＣ単層と共に１時間、３７℃で培養した。結合しなかったＥＰＣをＰＢＳで２回洗い流し、接着Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ−標識ＥＰＣを蛍光スキャナー（ＧＥ Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて測定し、撮影した。
【００９２】
フィブロネクチン（５μｇ／ｍｌ）でコーティングされた２４トランスウェルインサート（８．０μＭ 孔；Ｆａｌｃｏｎ３５３０９７，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）の上部チャンバー内で、ＨＭＶＥＣ細胞を１ウェル当たり１ｘ１０４細胞の密度で培養した。各実験の前に、倒立蛍光顕微鏡を用いて、コンフルエントな単層であることを確認した。ＨＭＶＥＣ単層を、１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＳＤＦ−１α又はＢＳＡを用いて８時間刺激した。先に詳しく記載したように予め標識した１ｘ１０４のＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ−標識ＥＰＣを、０．３ｍＬの基本ＥＧＭ２培地を加えた上部チャンバーに添加した。０．６ｍＬの完全ＥＧＭ２培地を、トランスウェルの下部チャンバーに添加した。細胞を１２時間、３７℃で培養し、トランスウェルの上部チャンバーから下部チャンバーへのＥＰＣの横断を定量した。
【００９３】
免疫ブロットを記載されたように行った（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００３、２３：１４−２５）。膜をＥ−セレクチン（ａｂ−１８９８１）又はβ−アクチン（ＡＣ−１５、Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）に対する抗体（Ａｂ）を用いてプロービングした。これを次にＨＲＰに結合した二次Ａｂ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を用いてプロービングし、そしてＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に用いた。膜をはがし、個々の実験で望まれるように再度ブロッティングした。
【００９４】
免疫染色及び免疫組織化学（ＩＨＣ）用に、５μｍのパラフィン又は凍結切片を作製し、その後、ＦＩＴＣ−抗Ｅ−セレクチン（Ｒ＆ＤＳ ｙｓｔｅｍｓ）、ＰＥ−抗ＫＤＲ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）又は抗ＳＤＦ−１α（ｓｃ２８８７６，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）と４℃で一晩インキュベーションし、次にＨＲＰ結合二次抗体とインキュベーションした。ＤＡＢキット（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）を用いて免疫反応を検出した。ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）又はヘマトキシリン（ＩＨＣ）のいずれかを用いて核を対比染色した。全ての抗体に対するネガティブコントロールとしては、同じ業者から購入した、非免疫原性でアイソタイプが一致するＡｂを一次抗体として置き換えたものを用いた。
【００９５】
四肢虚血を誘導するために、右大腿動脈／静脈血管束の全長（約３〜４ｍｍ）を結紮し、そして切除した（２群のマウスについて試験した：Ｅ−ｓｅｌ−／−マウス（ｎ＝６）及びＷＴマウス（ｎ＝６））。その後５−０ナイロン（Ｅｔｈｉｃｏｎ）を用いて皮膚を縫合した。四肢虚血をレーザードップラー血流画像化装置（Ｌａｓｅｒ Ｄｏｐｐｌｅｒｐｅｒ ｆｕｓｉｏｎ ｉｍａｇｉｎｇ）により確認した。４ｍｍのパンチ生検を用いて、マウス大腿の腹面に、虚血性後肢創傷を誘導した。皮膚の完全な厚さの切片を除去し、大腿部のレベルより遠位の、下層にある筋肉に曝露した。組換えマウスＳＤＦ−１αタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をＰＢＳ中に再構成し、手術直後に、創底に注入した（２５μｇ／ｋｇ）。
【００９６】
オリンパス製デジタルカメラを用いて、創傷を毎日のデジタル写真により連続して観察した。測定を較正可能にするために、目盛りを全ての写真に含めた。画像をＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｉｍａｇｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｊａｖａ（登録商標）， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， ＭＤ）を用いて解析した。毎日創傷部位を測定し、そして創傷の回復率のパーセンテージを｛（最初の創傷面積−その日の創傷面積）／（最初の創傷面積）｝Ｘ１００として表した。
【００９７】
接触すると内皮細胞膜に取り込まれるＤｉＩ（Ｄ−２８２，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を含む、特別に処方した水溶液（７ｍｌ／マウス）を用いた肝潅流により、麻酔したマウスの血管を直接インビボで標識し、そしてこの溶液を動物を実験に用いる前に、直接心内注入によって投与した。Ｄｉｌを潅流した後、７ｍｌの固定液（４％パラホルムアルデヒド）を注入し、そして全創傷組織を回収した。レーザー走査共焦点顕微鏡（Ｖｉｂｒａｔｏｍｅ（ＶＴｌＯＯＯＳ、Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、厚さ又は深さ２００μｍの全創傷組織をスキャニングすることによって、血管網を可視化した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて、スキャンした全創傷面積に対して標準化した、赤色のＤｉｌで標識された血管の総数を評価することにより、血管密度を定量した。
【００９８】
レーザードップラー血流画像化装置（ＬＤＩ）（Ｐｅｒｉｓｃａｎ ＰＩＭ ＩＩ、Ｐｅｒｉｍｅｄ ＡＢ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、各日の四肢潅流を評価した。四肢とは、マウスの大腿部より遠位の、画像化した全ての組織として定義した。温度の変化及び鎮静のレベルによるアーティファクトを最小限にするために重量に基づく鎮静を用い、温度を制御した施設においてＬＤＩを行った。相対的な潅流のデータを、虚血（右）と正常（左）な四肢血流の比として表した。
【００９９】
１０〜１２週齢のＲｏｓａ２６（ＬａｃＺ＋）マウス由来の１ｘ１０７個の骨髄細胞を、虚血性後肢創傷（右）を作製した直後に、尾静脈注入を介してＥ−ｓｅｌ−／−マウス（ｎ＝６）及びＷＴマウス（ｎ＝６）に移植した。β−ガラクトシダーゼアッセイにより、創傷組織にリクルートされ、且つ組織切片内の血管に組み込まれたＬａｃＺ＋ＥＰＣの数を定量した。回収した創傷組織を凍結させ、その後組織切片をＸ−ｇａｌ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｃａｎａｄａ）及び抗ＫＤＲ（ａｂ−２３４９，Ａｂｃａｍ）と共に室温で２時間インキュベーションした。切片をヌクレアファストレッド（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｓｔ ｒｅｄ）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を用いて対比染色した。ＥＰＣの数は、手術後７日目に、切除した創傷の下層にある創傷肉芽組織の一連の切片における、ＫＤＲ＋血管中のβ−ガラクトシダーゼ＋細胞を計測することにより定量した（ｎ＝３）。細胞の計測は、少なくとも３つの連続した切片の、１切片当たり５つの無作為に選択した高倍率視野（ＨＰＦ、４０Ｘ）について行った。
【０１００】
差の統計分析は、ＡＮＯＶＡ及びスチューデントの両側ｔ検定を用いて行った。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）を用いてデータを解析した。データは、平均±標準偏差として表す。ｐ＜０．０５の場合に、値が統計的に有意であると見なされる。
【０１０１】
結果
ＳＤＦ−１α−改変細胞を用いた治療は、皮膚の創傷血管新生及び糖尿病性創傷の治癒を促進する。皮膚創傷の肉芽組織中にある微小血管は、定住繊維芽細胞により生成される結合組織要素によって物理的に支持されている。これらの繊維芽細胞は、血管の新生を促進し、持続させる固有の微小環境を提供する。繊維芽細胞及びそれらの活性化体である筋繊維芽細胞は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の合成、及び様々な可溶性因子を分泌することにより、創傷治癒過程の血管新生の制御において中心的な役割を果たす（Ｔｏｍａｓｅｋ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｒｅｖ ＭｏＩ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００２， ３：３４９−３６３； Ｋａｌｌｕｒｉ ａｎｄ Ｚｅｉｓｂｅｒｇ， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２００６， ６：３９２−４０１； Ｈｉｎｚ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ ２００７， １７０：１８０７−１８１６）。糖尿病性マウス創傷においてはＳＤＦ−１αのレベルが有意に低下していることが既に報告されており、これは部分的には、筋繊維芽細胞におけるＳＤＦ−１αのダウンレギュレーションによる。筋繊維芽細胞は、局所的な定住繊維芽細胞又は循環している間葉前駆体／幹細胞のいずれかから発生する可能性がある（Ｄｅ Ｗｅｖｅｒ ａｎｄ Ｍａｒｅｅｌ， Ｊ Ｐａｔｈｏｌ ２００３， ２００：４２９−４４７； Ｄｉｒｅｋｚｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００４， ６４：８４９２−８４９５）。
【０１０２】
糖尿病性創傷の治癒におけるＳＤＦ−１α改変細胞を用いた治療の有効性を試験した。遺伝的（ＮＯＤ）糖尿病マウスモデルの糖尿病性創傷の治癒における線維芽細胞由来ＳＤＦ−１αの治癒促進効果を試験することを目的とした。糖尿病に関連した創傷を有する患者における成熟した定住皮膚繊維芽細胞は欠陥があることが知られており、そのため潜在的な治療媒体としての臨床的関連をほとんどもたないので、ＢＭＤＦを選択した。１００μｌのＰＢＳに懸濁した１ｘ１０７個のｍＳＤＦ−１α／ＢＭＤＦ又はＧＦＰ／ＢＭＤＦを創傷に注入した。閉塞するまで、創傷を毎日撮影した。ｍＳＤＦ−１α／ＢＭＤＦで処理した糖尿病性創傷は、ＧＦＰ／ＢＭＤＦを注入した創傷よりも、有意に早く完全に治癒した（図１Ａ）。同様の治癒促進効果が、皮膚創傷を有するＳＴＺ−Ｃ５７糖尿病マウスにおいても観察された。ネイキッドベクターを用いた創傷の治療もまた治癒促進反応を示したが、細胞を用いた方法ほど著明ではなかった。最も有意な差は、４及び５日目に見られた。これと一致して、Ｄｉｌ色素を用いて血管還流を行った後の創傷の共焦点レーザー走査顕微鏡像により示されたように、ｍＳＤＦ−１α／ＢＭＤＦを用いて治療した創傷においては、対照の創傷と比較して、有意により活性な血管新生が発達した（図１Ｂ）。創傷を回収し、ＩＨＣ解析に用いた。ＧＦＰ／ＢＭＤＦを注入した場合よりも、ｍＳＤＦ−１α／ＢＭＤＦを注入した創傷においてＳＤＦ−１αがより強く発現することを、ＩＨＣにより確認した（図１Ｃ）。これらの結果は、糖尿病マウスモデルにおけるＳＤＦ−１αの治癒促進及び血管形成促進効果を確認し、並びに、ＳＤＦ−１α改変細胞を用いた治療が糖尿病性創傷の治療における新規ツールとして役立つ可能性があるという前臨床的証拠を提供した。
【０１０３】
インビトロにおける、ＳＤＦ−１αで刺激したＥＣ単層への、ヒトＥＰＣの接着の上昇。ＳＤＦ−１αがＥＰＣホーミングに及ぼす効果が、成熟した内皮細胞上の接着分子の制御により仲介されているという仮説を試すために、インビトロ細胞間接着アッセイにおいて、ＳＤＦ−１αによる刺激が、ＥＣ単層がＥＰＣの接着をより支持するようになるかどうかを試験した。２４ウェルプレート中で培養した、サブコンフルエントなＨＭＶＥＣを、組換えヒトＳＤＦ−１α又はＢＳＡで刺激した。Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ−標識ＥＰＣをウェル中に添加し、ＥＣ単層と共に１時間培養した。結合しなかったＥＰＣをＰＢＳで２回洗い流し、接着したＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ−標識ＥＰＣを蛍光スキャナーを用いて測定した（図２Ａ）。ＳＤＦ−１αで刺激したＥＣ単層では、ＢＳＡで処理した対照と比較して、ＥＰＣ接着の数がおよそ８倍増加した（図２Ｂ）。このデータは、ＳＤＦ−１αでの刺激がＥＰＣ−ＥＣ間の直接的な接着を促進することを示し、このことはＥＣ上の特定の接着分子の発現が、ＳＤＦ−１αによって特異的に制御されている可能性を示唆している。
【０１０４】
ＳＤＦ−１αによる刺激は、ＥＣ単層（インビトロ）及びマウスの創傷毛細血管の内皮（インビボ）でのＥ−セレクチンの発現をアップレギュレートした。ＳＤＦ−１αにより、ＥＣ単層でアップレギュレートされた接着分子を同定するために、ＲＴ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（商標）ＰＣＲアレイを行った。サブコンフルエントなＨＭＶＥＣを、１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＳＤＦ−１αタンパク質又はＢＳＡで４時間刺激した。細胞を回収し、トータルＲＮＡを抽出してＲＴ２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（商標）ＰＣＲアレイに用いた。アレイで試験した８４遺伝子のうち、１３の遺伝子がアップレギュレートされ（＞１．５倍）、２０の遺伝子がダウンレギュレートされ（＜１．５倍）、そして５１の遺伝子が変化しなかった（表１）。特に、Ｅ−セレクチン遺伝子の発現はＳＤＦ−１αによる刺激によって、約２．３倍上昇した（図３Ａ）。観察されたＥ−セレクチンｍＲＮＡの上昇を確認するために、免疫ブロット解析を行い、そして、ＳＤＦ−１αで刺激したＥＣ単層では、ＢＳＡで処理した対照と比較して、Ｅ−セレクチンのタンパク質発現が上昇することを確認した（図３Ｂ）。成熟した内皮細胞における、ＳＤＦ−１αによるＥ−セレクチンの上昇をインビボでさらに確認するために、ｍＳＤＦ−１α／ＡＡＶ又はｌａｃＺ／ＡＡＶを注入した糖尿病ＮＯＤマウス創傷の血管を免疫染色により評価した。ＦＩＴＣ−結合抗Ｅ−セレクチンＡｂを用いてＥ−セレクチンを、そしてＰＥ−結合抗ＫＤＲＡｂを用いてＥＣを染色した。ｍＳＤＦ−１α／ＡＡＶを注入した糖尿病マウス創傷の血管中のＥＣにおいては、ＬａｃＺ／ＡＡＶを注入したものと比較して、より強くＥ−セレクチン（黄色）が発現していた（図３Ｃ）。ｍＳＤＦ−１α／ＡＡＶにおける組織レベルでの上昇をＩＨＣにより示した（図３Ｄ）。これらの実験により、Ｅ−セレクチンが、血管のＥＣにおいてＳＤＦ−１αの下流の標的としてアップレギュレートされる、重要な接着分子の１つであることを確認した。
【０１０５】
【表１】
【０１０６】
アップレギュレートされたＥ−セレクチンは、ＳＤＦ−１αにより高められたＥＣ−ＥＰＣ間相互作用及びＥＰＣ経内皮遊走の仲介に関与する。アップレギュレートされたＥ−セレクチンがＳＤＦ−１αにより高められたＥＣ−ＥＰＣ間接着の仲介に関与しているかどうかを試験するために、ＳＤＦ−１αで刺激したＥＣ単層へのＥＰＣの接着におけるＥ−セレクチンアンタゴニストの効果をインビトロで試験した。２４ウェルプレート中で培養したサブコンフルエントなＨＭＶＥＣを１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＳＤＦ−１α又はＢＳＡで８時間刺激し、そして培地を、Ｅ−セレクチン中和Ａｂ又はアイソタイプが一致した対照Ａｂ（２μｇ／ｍｌ）のいずれかを含み、ＳＤＦ−１αを含まないＥＧＭ２培地と交換し、３７℃で１５分間インキュベーションし、その後ＥＰＣを添加した。その後、先に詳しく記載したように予め標識しておいた１ｘ１０５のＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ−標識ＥＰＣをウェル中に添加し、ＥＣ単層と共に３７℃で１時間培養した。結合しなかったＥＰＣをＰＢＳで２回洗い流し、接着したＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ−標識ＥＰＣを蛍光スキャナーで測定した。Ｅ−セレクチン中和Ａｂの添加は、ＳＤＦ−１αで刺激したＥＣ単層に接着するＥＰＣの数を有意に抑制し、一方対照のＡｂは有意な効果を示さなかった（図４Ａ）。ＥＰＣとＥＣ単層との間の特異的相互作用の仲介におけるＥ−セレクチンの生物学的機能をさらに研究するために、ＥＰＣとＥＣ単層との間の接着の増加が、ＥＣ単層を通じたより多くのＥＰＣ遊出をもたらすかどうかを試験し、もしそうであった場合には、この遊出効果がＥ−セレクチン依存性かどうかを試験した。ＥＰＣ経内皮遊走をインビトロトランスウェル系において試験した。ＨＭＶＥＣ単層を、γｈＳＤＦ−１α又はＢＳＡ存在下で、トランスウェルインサートの上部チャンバー内で培養した。ＥＰＣをインサート中に添加する１５分前に、下部チャンバー内のＥＧＭ２培地を、γｈＳＤＦ−１α又はＢＳＡをそれぞれ含む新しい培地と交換した。上述したように調製した１ｘ１０５のＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ−標識ＥＰＣ懸濁液をインサート中に添加し、そして３７℃で一晩培養した。ＢＳＡで処理したＥＣ単層と比較して、ＳＤＦ−１αで刺激したＥＣ単層では、トランスウェルの上部チャンバーから下部チャンバーへのＥＰＣ遊出の有意な増加が認められた（図４Ｂ）。重要なことは、Ｅ−セレクチンのブロッキング剤である中和Ａｂ（２μｇ／ｍｌ）のトランスウェルへの添加が有意にＥＰＣの経内皮遊走を阻害したことから、この効果が、少なくとも部分的には、Ｅ−セレクチン依存性であることである（図４Ｂ）。全体として、これらの結果は、アップレギュレートされたＥ−セレクチンが、ＳＤＦ−１αにより増加したＥＣ−ＥＰＣ間接着及びＥＰＣ経内皮遊走の仲介に関与することを示した。
【０１０７】
ＳＤＦ−１αによる刺激はＥＰＣでのＥ−セレクチンリガンドの発現をアップレギュレートする。最終的に、創傷部の毛細血管内膜のＥＣと循環しているＥＰＣとの間の直接的な相互作用は、両方の細胞型の表面にある接着分子の相互に関連した対応部に依存すると考えられる。ＳＤＦ−１αが、ＥＣ及びＥＰＣ両方の関連した接着分子の発現を誘導するだろうと予測した。先に詳しく記載した、ＥＣにおいてはＳＤＦ−１α誘導性Ｅ−セレクチンが直接的なＥＣ−ＥＰＣ間相互作用を仲介するという結果に基づき、ＳＤＦ−１αでの刺激に応答した、ＥＰＣ上での２種類のＥ−セレクチンリガンド、ＣＤ４４及びＣＤ１６２（ＰＳＧＰ−１）の発現を解析した。サブコンフルエントなヒトＥＰＣを、γｈＳＤＦ−１α又はＢＳＡ、それぞれを用いて、様々な時間、刺激した。細胞を回収し、免疫ブロット解析に用いた。刺激しなかったＥＰＣでは、強い基礎レベルのＣＤ１６２及び低いレベルのＣＤ４４の発現が認められた。ＳＤＦ−１αによる刺激は、ＥＰＣにおけるＣＤ１６２及びＣＤ４４両方の発現をアップレギュレートした（図５）。ＣＤ１６２及びＣＤ４４の誘導は、ＳＤＦ−１αで刺激してから４時間後に最初に観察され、その後１６時間まで上昇し続けた。これらの実験により、ＥＰＣが基礎レベルのＥ−セレクチンリガンドを発現することが確認され、またＳＤＦ−１αがＥＰＣでのこれらＥ−セレクチンリガンドの発現をアップレギュレートすることが可能であることが示された。このことは、可溶性の因子であるＳＤＦ−１αが、２種類の重要な細胞型である成熟内皮細胞とＥＰＣにおける接着分子のプロファイルを特異的に制御することによりＥＰＣホーミングを仲介するという、全体的な仮説と一致するものであった。
【０１０８】
Ｅ−セレクチンは、マウス虚血性後肢及び皮膚創傷モデルにおいてＳＤＦ−１αが、ＥＰＣホーミング、血管新生及び創傷治癒に及ぼす効果の仲介に必要である。ＥＰＣホーミング、血管新生、及び皮膚創傷の治癒におけるＳＤＦ−１α誘導性Ｅ−セレクチンの特異的な生物学的重要性を試験するために、機能喪失型の方法を、骨髄移植と組み合わせて用いた。Ｅ−ｓｅｌ−／−又はＷＴマウスＡを用いて、大腿動脈の結紮／切除を介した片側後肢虚血のマウスモデルを作出し、その後両側に、４ｍｍの皮膚切除創傷を作製した。直接的な創傷注入により、組換えマウスＳＤＦ−１αを創傷に投与した。血管新生及び創傷の治癒におけるＥＰＣホーミングの貢献度を定量（部分的に）するために、尾静脈を介してマウス中にＲｏｓａ２６（ＬａｃＺ＋）マウス由来の骨髄細胞、１ｘ１０７個を注入することにより、さらなる治療を施した。手術後の四肢虚血の確認、モニター、及び、時間経過に伴って測定した潅流の平均を介した、後肢血流の自然な回復の定量には、ＬＤＩを用いた。デジタル写真撮影により、創傷面積の測定を毎日行った。７日目に半数のマウスから回収した創傷組織を用いた血管Ｄｉｌ潅流とその後のレーザー走査共焦点顕微鏡解析により、創傷組織における血管新生を評価した。残りのマウスについては、創傷を回収し、ＩＨＣに用いた。創傷組織にリクルートされ、血管に組み入れられたＥＰＣを、β−ｇａｌ（青）及び抗ＫＤＲを用いて二重染色した。ＷＴマウスと比較して、Ｅ−ｓｅｌ−／−マウスの虚血性後肢は、有意に低い平均血流測定値によって示されたように、時間経過にわたる潅流において回復の遅れを示した（図６Ａ）。一貫して、Ｅ−ｓｅｌ−／−マウスの虚血性創傷は、ＷＴマウスにおける閉塞率と比較して、有意に遅い閉塞率を有した（図６Ｂ）。加えて、Ｅ−ｓｅｌ−／−マウスの虚血性創傷は、ＷＴマウスのものと比較して、かなり少ない血管化しか示さなかった（図６Ｃ）。ＷＴマウスと比較して、Ｅ−ｓｅｌ−／−マウスの虚血性創傷の血管においては有意に少ないＬａｃＺ＋細胞しか検出されなかったことから（図６Ｄ）、Ｅ−ｓｅｌ−／−マウスの虚血性創傷におけるこの少ない血管新生は、少なくとも部分的には、より少ないＥＰＣホーミングと関連した。これらインビボでの実験は、ＳＤＦ−１α誘導性ＥＰＣホーミング、血管新生及び創傷治癒の仲介に、Ｅ−セレクチンが必要であることを示した。
【０１０９】
本明細書において記載した実験は、ＳＤＦ−１αが成熟ＥＣにおけるＥ−セレクチンの発現及びＥＰＣ上のＥ−セレクチンリガンドを特異的にアップレギュレートし、それにより、ＥＣ−ＥＰＣ間接着及びＥＰＣホーミングを仲介することを示した。これらの知見は、ＳＤＦ−１αがＥＰＣホーミングに及ぼす生物学的効果の根底にある分子機構についての深く、かつ、新規の洞察を提供し、及び、糖尿病に関連した細小血管障害及び創傷治癒の遅延（並びにその他の虚血性創傷）でのＥＰＣホーミングの治療上の操作において、Ｅ−セレクチンが新しい標的であることを示した。ＥＣ及びＥＰＣ中のＥ−セレクチン及びそのリガンドを変化させることは、ＥＰＣに関連した直接的な血管新生反応を制御するばかりでなく、創傷治癒に及ぼすＥＰＣに関連し、糖尿病に関連した皮膚創傷治癒の遅延の未解決な臨床上の問題に本質的に関連する、直接的及び間接的な効果をも提供する。
【０１１０】
その他の実施形態
組成物、キット、及び方法工程の一部分又は全てに、任意の変更を加えてもよい。出版物、特許出願及び特許を含む、本明細書において引用された全ての参考文献は、参照することにより、本明細書に組み入れられる。本明細書において提供された、任意の及び全ての実施例の使用、又は例となる言葉（例えば、「のような」）は、本発明を説明することを目的とし、別途に請求した場合を除き、本発明の範囲を限定するものではない。例えば、本明細書において記載した実験は糖尿病性創傷を扱うが、本明細書において記載した組成物、キット及び方法は、任意の虚血性創傷を含む、多数のその他の治療的及び予防的適用において用いることが可能である。本発明又は好ましい実施形態の本質又は有効性に関する、本明細書における任意の文言は限定することを意図せず、及び添付の請求項もそれらの文言によって限定されると見なされるべきではない。さらに通常、本明細書に明示されていなくても、本発明の実施に必須な請求されていない要素は示されていると解釈されるべきである。本発明は、適用法によって認められるように、全ての変更、及び添付の請求項に記載された対象事項の等価物を含む。さらに別段の指定のない限り、本明細書においては、可能な全変異型の上述した要素の任意の組み合わせが本発明に包含され、そうでない場合は、文脈から明らかである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病の対象における糖尿病性創傷の治癒を促進する方法であって、
Ｅ−セレクチンタンパク質、Ｅ−セレクチンタンパク質をコードする核酸、及びＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートする薬剤からなる群より選択される少なくとも１つの治療薬と、薬学的に許容可能な担体とを含む、治療有効量の組成物を提供する工程；並びに、
前記対象における骨髄由来前駆細胞の前記創傷への遊走を増加させる条件下で、前記組成物を前記対象に投与する工程、を含む方法。
【請求項２】
前記組成物を経口的に、局所的に、又は静脈内に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物を前記創傷又は前記創傷に隣接した部位に直接投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記骨髄由来前駆細胞が内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記組成物の前記対象への投与が創傷治癒の促進をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記組成物がＥ−セレクチンタンパク質又はＥ−セレクチンタンパク質をコードする核酸、及びＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートする薬剤を含み、ここで前記Ｅ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートする薬剤がＳＤＦ−１αタンパク質又はＳＤＦ−１αタンパク質をコードする核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記対象に高圧酸素療法を実施する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
糖尿病性創傷を有する糖尿病の対象においてＥ−セレクチンの発現をアップレギュレートする方法であって、第一のＡＡＶ逆方向末端反復と第二のＡＡＶ逆方向末端反復との間に挿入されたＥ−セレクチンをコードするポリヌクレオチドを含有する、少なくとも１つのｒＡＡＶビリオンを包含する組成物を、Ｅ−セレクチンの発現をアップレギュレートし、骨髄由来前駆細胞の前記創傷への遊走を誘導し、かつ前記対象における前記創傷の治癒を促進するのに有効な量で、前記糖尿病の対象に投与する工程を含む方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つのｒＡＡＶビリオンが血清型２カプシドタンパク質を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物を前記創傷又は前記創傷に隣接した部位に直接投与する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記骨髄由来前駆細胞がＥＰＣを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記対象にＳＤＦ−１αタンパク質又はＳＤＦ−１αタンパク質をコードする核酸を投与する工程をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象に高圧酸素療法を実施する工程をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
糖尿病の対象における糖尿病性創傷の治癒を促進する方法であって、
薬学的に許容可能な担体及びＥ−セレクチンをコードするポリヌクレオチドを含む複数の骨髄由来前駆細胞を含む組成物を提供する工程；並びに、
骨髄由来前駆細胞の前記創傷への遊走を増加させ、かつ前記対象における創傷の治癒を促進するのに有効な量の前記組成物を前記対象に投与する工程、を含む方法。
【請求項１５】
前記Ｅ−セレクチンをコードするポリヌクレオチドがウイルスベクター中に組み込まれている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ウイルスベクターがウイルス粒子中に組み入れられている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ウイルスベクターがｒＡＡＶベクターであり、かつ、前記ウイルス粒子がＡＡＶ粒子である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物がＳＤＦ−１αタンパク質又はＳＤＦ−１αタンパク質をコードする核酸をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物を前記創傷又は前記創傷に隣接した部位に直接投与する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記骨髄由来前駆細胞がＥＰＣを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象に高圧酸素療法を実施する工程をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
哺乳類対象における少なくとも１つの糖尿病性創傷を治療するためのキットであって、
（ａ）Ｅ−セレクチンタンパク質、Ｅ−セレクチンタンパク質をコードする核酸、及びＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートする薬剤、からなる群より選択される少なくとも１つの治療薬と、薬学的に許容可能な担体とを含む、治療有効量の組成物；並びに、
（ｂ）使用説明書
を含むキット。
【請求項２３】
前記組成物がＥ−セレクチンタンパク質又はＥ−セレクチンタンパク質をコードする核酸、及びＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートする薬剤を含み、ここで前記Ｅ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートする薬剤がＳＤＦ−１αタンパク質又はＳＤＦ−１αタンパク質をコードする核酸である、請求項１に記載のキット。
【請求項２４】
前記使用説明書が前記対象への高圧酸素療法の実施方法の説明を含む、請求項１に記載のキット。
【請求項１】
糖尿病の対象における糖尿病性創傷の治癒を促進する方法であって、
Ｅ−セレクチンタンパク質、Ｅ−セレクチンタンパク質をコードする核酸、及びＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートする薬剤からなる群より選択される少なくとも１つの治療薬と、薬学的に許容可能な担体とを含む、治療有効量の組成物を提供する工程；並びに、
前記対象における骨髄由来前駆細胞の前記創傷への遊走を増加させる条件下で、前記組成物を前記対象に投与する工程、を含む方法。
【請求項２】
前記組成物を経口的に、局所的に、又は静脈内に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物を前記創傷又は前記創傷に隣接した部位に直接投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記骨髄由来前駆細胞が内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記組成物の前記対象への投与が創傷治癒の促進をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記組成物がＥ−セレクチンタンパク質又はＥ−セレクチンタンパク質をコードする核酸、及びＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートする薬剤を含み、ここで前記Ｅ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートする薬剤がＳＤＦ−１αタンパク質又はＳＤＦ−１αタンパク質をコードする核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記対象に高圧酸素療法を実施する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
糖尿病性創傷を有する糖尿病の対象においてＥ−セレクチンの発現をアップレギュレートする方法であって、第一のＡＡＶ逆方向末端反復と第二のＡＡＶ逆方向末端反復との間に挿入されたＥ−セレクチンをコードするポリヌクレオチドを含有する、少なくとも１つのｒＡＡＶビリオンを包含する組成物を、Ｅ−セレクチンの発現をアップレギュレートし、骨髄由来前駆細胞の前記創傷への遊走を誘導し、かつ前記対象における前記創傷の治癒を促進するのに有効な量で、前記糖尿病の対象に投与する工程を含む方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つのｒＡＡＶビリオンが血清型２カプシドタンパク質を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物を前記創傷又は前記創傷に隣接した部位に直接投与する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記骨髄由来前駆細胞がＥＰＣを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記対象にＳＤＦ−１αタンパク質又はＳＤＦ−１αタンパク質をコードする核酸を投与する工程をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象に高圧酸素療法を実施する工程をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
糖尿病の対象における糖尿病性創傷の治癒を促進する方法であって、
薬学的に許容可能な担体及びＥ−セレクチンをコードするポリヌクレオチドを含む複数の骨髄由来前駆細胞を含む組成物を提供する工程；並びに、
骨髄由来前駆細胞の前記創傷への遊走を増加させ、かつ前記対象における創傷の治癒を促進するのに有効な量の前記組成物を前記対象に投与する工程、を含む方法。
【請求項１５】
前記Ｅ−セレクチンをコードするポリヌクレオチドがウイルスベクター中に組み込まれている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ウイルスベクターがウイルス粒子中に組み入れられている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ウイルスベクターがｒＡＡＶベクターであり、かつ、前記ウイルス粒子がＡＡＶ粒子である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物がＳＤＦ−１αタンパク質又はＳＤＦ−１αタンパク質をコードする核酸をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物を前記創傷又は前記創傷に隣接した部位に直接投与する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記骨髄由来前駆細胞がＥＰＣを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象に高圧酸素療法を実施する工程をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
哺乳類対象における少なくとも１つの糖尿病性創傷を治療するためのキットであって、
（ａ）Ｅ−セレクチンタンパク質、Ｅ−セレクチンタンパク質をコードする核酸、及びＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートする薬剤、からなる群より選択される少なくとも１つの治療薬と、薬学的に許容可能な担体とを含む、治療有効量の組成物；並びに、
（ｂ）使用説明書
を含むキット。
【請求項２３】
前記組成物がＥ−セレクチンタンパク質又はＥ−セレクチンタンパク質をコードする核酸、及びＥ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートする薬剤を含み、ここで前記Ｅ−セレクチンの発現を特異的にアップレギュレートする薬剤がＳＤＦ−１αタンパク質又はＳＤＦ−１αタンパク質をコードする核酸である、請求項１に記載のキット。
【請求項２４】
前記使用説明書が前記対象への高圧酸素療法の実施方法の説明を含む、請求項１に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１２−５２４７８１（Ｐ２０１２−５２４７８１Ａ）
【公表日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０７２４８（Ｐ２０１２−５０７２４８）
【出願日】平成２２年４月９日（２０１０．４．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３０４７１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２３６９９
【国際公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【出願人】（５９１２７９３５３）ユニバーシティー・オブ・マイアミ (5)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＭＩＡＭＩ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月９日（２０１０．４．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３０４７１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２３６９９
【国際公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【出願人】（５９１２７９３５３）ユニバーシティー・オブ・マイアミ (5)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＭＩＡＭＩ
【Ｆターム（参考）】
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