虚血関連状態の治療方法
本発明は、虚血関連状態の治療方法であって、そのような治療を必要とする患者に対してチオセミカルバゾン化合物を投与することによる虚血関連状態の治療方法に関する。本発明の好ましい実施例は、アルツハイマー病、パーキンソン病、冠動脈バイパス術、心停止による全脳虚血、局所性脳梗塞、脳出血、出血性梗塞、 高血圧性出血、頭蓋内血管異常の破裂による出血、頭蓋内動脈瘤の破裂によるくも膜下出血、高血圧性脳症、脳虚血につながる頸動脈狭窄症または閉塞、心原性血栓塞栓症、脊髄卒中および脊髄損傷、アテローム性動脈硬化などの脳血管障害、脈管炎、黄斑変性症、心筋梗塞、心虚血および上室性頻拍性不整脈を含むが、それらに限定されない特定の虚血関連状態の治療方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、アルツハイマー病などの変性疾患に加えて、突然の酸素喪失による神経疾患および心疾患を含む虚血関連疾患および障害の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
中枢神経系（ＣＮＳ）は脊髄、脳および網膜で構成され、極めて複雑な機能を遂行できるネットワークを形成する何兆もの神経細胞（ニューロン）を含む。ＣＮＳニューロンは、生存してその生理的機能を果たすためにエネルギーを必要とする。ＣＮＳニューロンにとって唯一のエネルギー源が血液によって運ばれるグルコースと酸素であることは一般に認識されている。ＣＮＳ全体または一部への血液供給が遮断され、それによってニューロンから酸素とグルコースが奪われると（虚血として知られる状態）、それらが奪われたニューロンは急速に変性する。この不適切な血流状態は、臨床神経学では一般に「脳卒中」として知られている。例えば呼吸停止、窒息または溺水によって脳への酸素供給のみが遮断される場合、当該状態を「低酸素」という。例えば、糖尿病患者がインシュリンを大量に摂取した時など、グルコース供給のみが遮断される場合は、当該状態を「低血糖」という。これらの状態はすべてエネルギーの欠乏によって生じ、臨床医学では脳障害を起こしうる原因として認識されている。以下では、「エネルギー欠乏」または「虚血」という語を同義的に使用して、ＣＮＳへのエネルギー障害を伴うこれらの状態を示す。
【０００３】
近年、神経科学者はエネルギー欠乏が引き起こす神経変性の機序についての理解を深めている。虚血状態が生じると、正常で健康な状況下において重要な興奮性神経伝達物質としてＣＮＳで機能するグルタミン酸が、「興奮毒性」と呼ばれる 神経毒性を発揮することは知られている。通常グルタミン酸は細胞内に閉じ込められており、隣接するニューロン上のグルタミン酸受容体と連絡する目的でシナプス接合部の神経細胞から少量放出されるだけである。これによって、神経シグナルが受容体を有する細胞に送られる。正常な状態で、シナプス接合部の細胞外液に放出されるグルタミン酸は、極めて効率的な輸送プロセスによって数ミリ秒以内にニューロン内へ送り戻される。
【０００４】
グルタミン酸の興奮毒性は、当該輸送プロセスが正常に機能している限り抑制されている。しかし、この輸送プロセスはエネルギー依存であるため、虚血状態（エネルギー欠乏状態）では、グルタミン酸を輸送できず、伝達物質として放出されるグルタミン酸分子が細胞外シナプス液に蓄積する。これによって、グルタミン酸が絶えずその興奮性受容体と接触することになり、それら受容体を過度に刺激する。この状況によって、ニューロンが文字どおり興奮死する可能性がある。さらに二つの要素が事態を複雑化し悪化させる。一つは、過度に刺激されたニューロンが他のシナプス接合部でグルタミン酸を過剰に放出するため、さらに多くのニューロンが過度に刺激され、虚血の初期域を超える神経毒性カスケードに引き込まれてしまうこと。もう一つは、過度に刺激されたニューロンが使用可能なグルコースまた酸素の供給を通常よりも速く利用し始めるため、これらの限られたエネルギー源の消耗が加速し、グルタミン酸輸送プロセスの障害が進行することである。このため脳卒中、心不全、呼吸停止、低酸素または低血糖などのエネルギー欠乏状態が、複合機序 によって脳にダメージを与える。初期原因機序は虚血そのものであるが、これがグルタミン酸輸送システムの障害、およびその後の脳障害に大きく関与する一連のグルタミン酸媒介の興奮毒性イベントを引き起こす。
【０００５】
前記の状態に加え最近では、ニューロンがエネルギー物質（グルコースおよび酸素）を利用してそのエネルギーレベルを維持する能力における様々な障害も、ニューロン死につながる興奮毒性プロセスを誘発し得ることが認識されている。これはアルツハイマー認知症、パーキンソニズム、ハンチントン舞踏病および筋萎縮性側索硬化症などの神経系疾患において神経変性を引き起こす機序であると仮定されている。例えば、細胞内エネルギー代謝の不全を示す証拠がアルツハイマー病患者の脳から生検で取り出された組織例において明らかになっている。これは、アルツハイマー病においてグルタミン酸の興奮毒性誘発し、ニューロン死を引き起こす原因機序として提示されており、そのためこの機序はエネルギー関連興奮毒性プロセスであると説明されている。また、細胞内エネルギー代謝の内因性不全を示す証拠がパーキンソニズムおよびハンチントン舞踏病において報告されている。このため、これらの疾患における神経変性を回避するための合理的な治療方針には、エネルギー欠乏を解消する方法または興奮毒性神経変性を回避する方法が含まれる。
【０００６】
神経変性病は、ほとんどの場合神経細胞死につながる正常な神経機能の変化を特徴とする一群の疾患である（これら疾患の大部分は、特に末期段階で深刻な神経細胞の欠損を伴う）。大部分の例において、その病因学的原因は不明であるが、漸進的に発達する。神経変性病は結果として、例外なくその患者およびさらに広いコミュニティーに多大な精神的、肉体的、経済的負担を伴う。
【０００７】
特にアルツハイマー病またはパーキンソン病において、神経変性障害を進行させる最も一貫した危険因子は加齢である。過去１００年で、先進国における６５歳以上の人口成長率は 全人口の成長率をはるかに上回っている。このため、次の１００年で高齢者人口が２倍になり、それに伴ってある種の神経変性障害に苦しむ人の数も倍増することが予測できる。これらの障害を引き起こす病気に関連する患者、介護者、および社会への精神的、肉体的、経済的負担の増加が容易に予見できるため、この予測は、医療界および立法者の間で高まっている懸念の中心となっている。今日までに幾つかの薬剤が承認され、幾つかの神経変性病の症状をある程度は軽減しているが、それらの薬剤を長期的に使用すると、しばしば衰弱といった副作用を伴うため、どの承認薬も変性プロセスの進行を止めることができないという事実が問題を悪化させている。これに伴い、神経変性病におけるニューロン死の原因および機序に関する我々の知識不足によって、効果的な予防療法または保護療法の開発が妨げられている。この暗い見通しにも関わらず、幾つかの 神経生物学的解明により、数々の神経変性障害の秘密が明らかになり、効果的な治療方法が使用可能になる日が近づきつつある。
【０００８】
ＣＮＳ虚血に関連する神経細胞の損傷を予防または軽減する方法の開発において、重大な進歩が見られる。この分野では、受容体特異的な拮抗薬（医薬用語では、その受容体での作用を誘発することなく細胞表面にある特定の受容体を占有し、ブロックする薬をその受容体の拮抗薬と呼ぶ）を使用して、グルタミン酸受容体での興奮作用を抑制する方法に関して最も活発な研究が行われている。興奮毒性神経変性を調節できるグルタミン酸受容体は、大まかに「ＮＭＤＡ」受容体および「非ＮＭＤＡ」受容体と呼ばれる２つの広範なカテゴリーに分類される。ＮＭＤＡ受容体は、Ｎ‐メチル‐Ｄ‐アスパラギン酸にちなんで名づけられており、脳内では自然発生しないが、特定のグルタミン酸受容体と強固に結合することが発見されているため、「ＮＭＤＡ」受容体と呼ばれる薬物である。最近では、グルタミン酸受容体の「非ＮＭＤＡ」類がＫＡ（カイニン酸）受容体およびＡＭＰＡ受容体（旧称ＱＵＩＳ受容体）と呼ばれるさらに２つの明確なカテゴリーに細分化されている。
【０００９】
インビトロ試験および多くのインビボ動物モデルの両方において、ＮＭＤＡ受容体拮抗薬がＣＮＡ虚血性神経変性を防ぐことができることが繰返し証明されているが、最近の様々な研究結果から、ＮＭＤＡ拮抗薬は「広範囲の虚血」として知られる主要タイプの虚血には効果がなく、「局所的な」虚血として知られる別のタイプの虚血において部分的な保護しか提供しないことが明らかになっている。さらに、有効な保護を提供するには、虚血の発症後直ちにＮＭＤＡ拮抗薬を投与する必要があると考えられる。非ＮＭＤＡ拮抗薬に関して実験から証明されていることは限られているが、数例のインビボ動物実験では、虚血の発症後に適用した場合でも、これらの拮抗薬が虚血性神経変性に対して相当の保護作用を及ぼし得ることが提示されている。
【００１０】
ＮＭＤＡまたは非ＮＭＤＡのいずれかを単独で使用すると、ＣＮＳ虚血に対して相当の保護作用を提供できるという説がある一方、一連の証拠から、ＮＭＤＡまたは非ＮＭＤＡ拮抗薬のいずれかを単独使用することで得られる保護レベルは比較的低いことが提示されている。
【００１１】
虚血性神経変性に対する神経保護薬としてのグルタミン酸受容体拮抗薬の重大な限界は、それらが変性に対して一時的にニューロンを保護するだけであって、エネルギー欠陥について、またはそのエネルギー欠陥に対して二次的に発生するその他の異常については何も改善しない。そのため、これらの拮抗薬は実験動物モデルにおける虚血性神経変性に対してある程度の保護を提供するが、その保護は部分的でしかなく、そのような部分的な保護は、上記のように変性の発生時期を遅らせるだけである。しかしながら、遅延期間中に補足的および／または継続的な保護を提供するために適用できる他の薬物あるいは手順がある場合は、変性の発生を遅らせることが大変有意義であることに注記することが重要である。
【００１２】
大部分の虚血研究において適切に報告されていない重要な要素の一つは、有害な（虚血性）イベントに関連する薬物投与のタイミングについてである。これは重要な考慮事項である。予測可能な虚血イベントもあるが（例えば、開胸手術に伴う）、大部分は予測できない。またほとんどの場合、治療は虚血イベント中あるいはその後に開始されるだけである。ＣＮＳ細胞は虚血の発症直後に変性し始めるため、ＣＮＳニューロンが変性を開始した後に適用する効果的な新しい神経保護方法が明らかに必要である。
【００１３】
別の重要な考慮事項は、虚血が一時的（例えば、心不全の発作中）であるか、または永続的（例えば、ＣＮＳ血管の血栓または塞栓による閉塞に続く）であるかということである。一時的な虚血であれば、酸素とグルコースをＣＮＳに運ぶ血液供給がすぐに回復し、神経変性あるいは虚血障害の進行を防ぐ薬剤が血液循環によって虚血状態の組織に届けられる。
【００１４】
脳のある領域への血液供給が凝結塊によって永続的に遮断される場合、虚血状態の組織から酸素とグルコースが永続的に奪われ、血管が遮断されて薬剤が虚血状態の組織に送達されないため、現行の方法では虚血状態の領域の中心に起こる神経変性を防ぐことは不可能である。しかしながら、虚血状態の領域の周辺端には周縁部として知られ、隣接するＣＮＳ領域から血液を受け取る大きな組織領域があり、この組織領域が薬物治療の標的となり得る。さらに、心臓発作を起こした患者の治療に現在使用されている血液凝固を溶解する薬剤（ストレプトキナーゼおよび組織プラスミノゲン活性因子などの血栓溶解剤）が、発作後ＣＮＳへの血液供給を回復できるかについて研究開発されている。そのような薬剤がヒトのＣＮＳに対して広く使用可能になれば、それらを使用して血管を開き、虚血状態のＣＮＳ組織が酸素およびグルコースだけでなく、神経変性を防ぎ、あるいは虚血障害からの回復を促進できる本明細書に開示の薬剤を受け取ることができる。
【００１５】
最後に、眼の網膜に血液を供給する主要な動脈が血栓によって閉塞するといった特別な状況があるが、これは本明細書に開示する当該薬剤により救済することができる。この血管が閉塞した場合は、本発明の薬剤を眼の硝子体（例えば、眼球内の透明な液体）に直接注入することによって、当該薬剤を虚血状態の網膜に送達することができる。当該薬剤は硝子体から網膜に素早く拡散する。
【００１６】
急性あるいは慢性に関わらず、虚血イベントの結果として起こる疾病／障害を予防または治療できる薬剤の開発が強く望まれる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
発明の要旨
本発明は、化学式Ｉ
【００１８】
【化１】
【００１９】
の化合物またはそのプロドラッグを虚血関連状態の治療を必要とする患者に投与することを含む虚血関連状態の治療法方であって、
式中、
Ｅは酸素、硫黄、ＮＨまたはＮ‐Ｃ1-6アルキルであり、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4は水素、任意で置換されるアルキル、任意で置換されるアルケニル、任意で置換されるアルキニル、任意で置換されるシクロアルキル、任意で置換されるハロアルキル、任意で置換されるアリール、任意で置換されるアミノアルキル、任意で置換されるヒドロキシアルキル、任意で置換されるアルコキシアルキル、および任意で置換されるアルカノイルで構成されるグループから独立して選択され、あるいはＺ
ＮＲ1Ｒ2を結合してＮ、Ｏ、およびＳから選択されるゼロ、１つ、または２つの追加環へテロ原子で構成されてよい３から７員環を形成し、および
ＨＥＴはＮ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４環へテロ原子で構成され、任意で置換される５から７員へテロアリール残基である化合物、あるいはそのプロドラッグを虚血関連状態の治療を必要とする患者に投与することを含む、虚血関連状態の治療方法に関する。
【００２０】
好ましい実施例は、ＨＥＴが化学式
【００２１】
【化２】
【００２２】
の残基であって、
式中、
ｍはゼロまたは１であり、
ｍがゼロの場合は、Ｚ1、Ｚ2、およびＺ3がＮ、Ｏ、Ｓ、またはＣＲから独立して選択され、あるいは
ｍが１の場合は、Ｚ1、Ｚ2、およびＺ3がＮまたはＣＲから独立して選択され、
Ｒは水素、ハロゲン化物、ヒドロキシ、チオール、アミノ、ヒドロキシアミノ、モノ‐Ｃ1-8アルキルアミノ、ジ（Ｃ1-8アルキル）アミノ、Ｃ1-8アルコキシ、Ｃ1-8アルキル、Ｃ2-8アルケニル、およびＣ2-8アルキニルで構成されるグループから発現ごとに独立して選択され、また
ｘがゼロから４の整数である本発明の方法に使用される組成に関する。
【００２３】
さらに好ましい実施例は、
ＨＥＴが任意で置換されるピリジル、任意で置換されるピラジニル、ピリミジニル、ピロリル、イミダゾリル、トリアゾリル、オキサゾリル、チオキサゾリルで構成されるグループから選択される残基であり、また
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4が水素、Ｃ1-8アルキル、Ｃ2-8アルケニル、Ｃ2-8アルキニル、Ｃ3-8シクロアルキル、Ｃ1-8ハロアルキル、Ｃ6-10アリール、アミノ‐Ｃ1-8アルキル、ヒドロキシ‐Ｃ1-8アルキル、Ｃ1-8アルコキシ‐Ｃ1-8アルキル、およびＣ1-8アルカノイルで構成されるグループから独立して選択され、あるいは
ＮＲ1Ｒ2を結合してＮ、Ｏ、およびＳから選択されるゼロ、１つ、または２つの追加環へテロ原子で構成されてよい３から７員環を形成する組成の使用を含む。
【００２４】
本発明の別の実施例は、化学式ＩＩ
【００２５】
【化３】
【００２６】
の化合物、あるいはそのプロドラッグを虚血関連状態の治療を必要とする患者に投与することを含む虚血関連状態の治療方法であって、
式中、
Ｒ，Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4は水素、任意で置換されるアルキル、任意で置換されるアルケニル、任意で置換されるアルキニル、任意で置換されるシクロアルキル、任意で置換されるハロアルキル、任意で置換されるアリール、任意で置換されるアミノアルキル、任意で置換されるヒドロキシアルキル、任意で置換されるアルコキシアルキル、および任意で置換されるアルカノイルで構成されるグループから独立して選択され、あるいは
ＮＲ1Ｒ2を結合してＮ、Ｏ、およびＳから選択されるゼロ、１つ、または２つの追加環へテロ原子で構成さてよい３から７員環を形成し、また
ｘがゼロから５の整数であって、
さらに詳しくは、
式中、
ｘがゼロ、１、２、または３であり、
Ｒ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4が水素、Ｃ1-8アルキル、Ｃ2-8アルケニル、Ｃ2-8アルキニル、Ｃ3-8シクロアルキル、Ｃ1-8ハロアルキル、Ｃ6-10アリール、アミノ‐Ｃ1-8アルキル、ヒドロキシ‐Ｃ1-8アルキル、Ｃ1-8アルコキシ‐Ｃ1-8アルキル、およびＣ1-8アルカノイルで構成されるグループから独立して選択され、あるいは
ＮＲ1Ｒ2を結合してＮ、Ｏ、およびＳから選択されるゼロ、１つ、または２つの追加環へテロ原子で構成されてよい３から７員環を形成する化合物、またはそのプロドラッグを虚血関連状態の治療を必要とする患者に投与することを含む、虚血関連状態の治療方法に関する。
【００２７】
本発明のさらに別の実施例は、化学式ＩＩＩ
【００２８】
【化４】
【００２９】
の化合物、あるいはそのプロドラッグを虚血関連状態の治療を必要とする患者に投与することを含む虚血関連状態の治療方法であって、
式中、
Ｒ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4は水素、Ｃ1-8アルキル、Ｃ2-8アルケニル、Ｃ2-8アルキニル、Ｃ3-8シクロアルキル、Ｃ1-8ハロアルキル、Ｃ6-10アリール、アミノ‐Ｃ1-8アルキル、ヒドロキシ‐Ｃ1-8アルキル、Ｃ1-8アルコキシ‐Ｃ1-8アルキル、およびＣ1-8アルカノイルで構成されるグループから独立して選択され、あるいは
ＮＲ1Ｒ2を結合してＮ、Ｏ、およびＳから選択されるゼロ、１つ、または２つの追加環へテロ原子で構成されてよい３から７員環を形成し、および
Ｒ6は水素、ヒドロキシ、アミノ、またはＣ1-8アルキルであり、
Ｒ5およびＲ7は水素、ハロゲン化物、ヒドロキシ、チオール、アミノ、ヒドロキシアミノ、モノ‐Ｃ1-8アルキルアミノ、ジ‐（Ｃ1-8アルキル）アミノ、 Ｃ1-8アルコキシ、Ｃ1-8アルキル、Ｃ2-8アルケニル、およびＣ2-8アルキニルで構成されるグループから独立して選択される化合物またはプロドラッグを虚血関連状態の治療を必要とする患者に投与することを含む虚血関連状態の治療方法に関する。
【００３０】
本発明の最も好ましい実施例は、以下の化学式
【００３１】
【化５】
【００３２】
のＰＡＮ８１１（３‐アミノピリジン‐２‐カルボキサデルヒド・チオセミカルバゾン）を虚血関連状態の治療を必要とする患者に投与することを含む、虚血関連状態の治療方法に関する。
【００３３】
本発明の好ましい実施例は、アルツハイマー病、パーキンソン病、冠動脈バイパス術、心停止による全脳虚血、局所性脳梗塞、脳出血、出血性梗塞、 高血圧性出血、頭蓋内血管異常の破裂による出血、頭蓋内動脈瘤の破裂によるくも膜下出血、高血圧性脳症、脳虚血につながる頸動脈狭窄症または閉塞、心原性血栓塞栓症、脊髄卒中および脊髄損傷、アテローム性動脈硬化などの脳血管障害、脈管炎、黄斑変性症、心筋梗塞、心虚血および上室性頻拍性不整脈を含むが、これらに限定されない特定の虚血関連状態の治療方法に関する。
【００３４】
発明の詳細な説明
本発明の特徴および他の詳細を特許請求の範囲において詳しく記載する。本発明の特定の実施例を図によって示すが、それらが本発明を制限するものでないことを理解されたい。本発明の主要な特徴は、本発明の範囲を逸脱することなく様々な実施例において機能することができる。
【００３５】
虚血関連障害／疾病の病理は、一般に網膜症、急性腎不全、心筋梗塞および脳卒中などで血管が狭窄あるいは閉塞されて起こる体内器官、組織または身体部分に対する血液供給の減少に関わる。それらは急性イベント（例えば、心臓発作）またはイベントの慢性進行（例えば、神経変性病）の結果として起こる。
【００３６】
本発明は、化学式Ｉ
【００３７】
【化６】
【００３８】
の化合物またはそのプロドラッグを虚血関連状態の治療を必要とする患者に投与することを含む虚血関連状態の治療法方であって、
式中、
Ｅは酸素、硫黄、ＮＨまたはＮ‐Ｃ1-6アルキルであり、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4は水素、任意で置換されるアルキル、任意で置換されるアルケニル、任意で置換されるアルキニル、任意で置換されるシクロアルキル、任意で置換されるハロアルキル、任意で置換されるアリール、任意で置換されるアミノアルキル、任意で置換されるヒドロキシアルキル、任意で置換されるアルコキシアルキル、および任意で置換されるアルカノイルで構成されるグループから独立して選択され、あるいは
ＮＲ1Ｒ2を結合してＮ、Ｏ、およびＳから選択されるゼロ、１つ、または２つの追加環へテロ原子で構成されてよい３から７員環を形成し、および
ＨＥＴはＮ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４環へテロ原子で構成され、任意で置換される５から７員へテロアリール残基である化合物、あるいはそのプロドラッグを虚血関連状態の治療を必要とする患者に投与することを含む、虚血関連状態の治療方法に関する。
【００３９】
好ましい実施例は、ＨＥＴが化学式
【００４０】
【化７】
【００４１】
の残基であって、
式中、
ｍはゼロまたは１であり、
ｍがゼロの場合は、Ｚ1、Ｚ2、およびＺ3がＮ、Ｏ、Ｓ、またはＣＲから独立して選択され、あるいは
ｍが１の場合は、Ｚ1、Ｚ2、およびＺ3がＮまたはＣＲから独立して選択され、
Ｒは水素、ハロゲン化物、ヒドロキシ、チオール、アミノ、ヒドロキシアミノ、モノ‐Ｃ1-8アルキルアミノ、ジ（Ｃ1-8アルキル）アミノ、Ｃ1-8アルコキシ、Ｃ1-8アルキル、Ｃ2-8アルケニル、およびＣ2-8アルキニルで構成されるグループから発現ごとに独立して選択され、また
ｘがゼロから４の整数である本発明の方法に使用される組成に関する。
【００４２】
さらに好ましい実施例は、
ＨＥＴが任意で置換されるピリジル、任意で置換されるピラジニル、ピリミジニル、ピロリル、イミダゾリル、トリアゾリル、オキサゾリル、チオキサゾリルで構成されるグループから選択される残基であり、また
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4が水素、Ｃ1-8アルキル、Ｃ2-8アルケニル、Ｃ2-8アルキニル、Ｃ3-8シクロアルキル、Ｃ1-8ハロアルキル、Ｃ6-10アリール、アミノ‐Ｃ1-8アルキル、ヒドロキシ‐Ｃ1-8アルキル、Ｃ1-8アルコキシ‐Ｃ1-8アルキル、およびＣ1-8アルカノイルで構成されるグループから独立して選択され、あるいは
ＮＲ1Ｒ2を結合してＮ、Ｏ、およびＳから選択されるゼロ、１つ、または２つの追加環へテロ原子で構成されてよい３から７員環を形成する組成の使用を含む。
【００４３】
本発明の別の実施例は、化学式ＩＩ
【００４４】
【化８】
【００４５】
の化合物、あるいはそのプロドラッグを虚血関連状態の治療を必要とする患者に投与することを含む虚血関連状態の治療方法であって、
式中、
Ｒ，Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4は水素、任意で置換されるアルキル、任意で置換されるアルケニル、任意で置換されるアルキニル、任意で置換されるシクロアルキル、任意で置換されるハロアルキル、任意で置換されるアリール、任意で置換されるアミノアルキル、任意で置換されるヒドロキシアルキル、任意で置換されるアルコキシアルキル、および任意で置換されるアルカノイルで構成されるグループから独立して選択され、あるいは
ＮＲ1Ｒ2を結合してＮ、Ｏ、およびＳから選択されるゼロ、１つ、または２つの追加環へテロ原子で構成されてよい３から７員環を形成し、また
ｘがゼロから５の整数であって、
さらに詳しくは、
式中、
ｘがゼロ、１、２、または３であり、
Ｒ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4が水素、Ｃ1-8アルキル、Ｃ2-8アルケニル、Ｃ2-8アルキニル、Ｃ3-8シクロアルキル、Ｃ1-8ハロアルキル、Ｃ6-10アリール、アミノ‐Ｃ1-8アルキル、ヒドロキシ‐Ｃ1-8アルキル、Ｃ1-8アルコキシ‐Ｃ1-8アルキル、およびＣ1-8アルカノイルで構成されるグループから独立して選択され、あるいは
ＮＲ1Ｒ2を結合してＮ、Ｏ、およびＳから選択されるゼロ、１つ、または２つの追加環へテロ原子で構成されてよい３から７員環を形成する化合物、またはそのプロドラッグを虚血関連状態の治療を必要とする患者に投与することを含む、虚血関連状態の治療方法に関する。
【００４６】
本発明のさらに別の実施例は、化学式ＩＩＩ
【００４７】
【化９】
【００４８】
の化合物あるいはそのプロドラッグを虚血関連状態の治療を必要とする患者に投与することを含む虚血関連状態の治療方法であって、
式中、
Ｒ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4は水素、Ｃ1-8アルキル、Ｃ2-8アルケニル、Ｃ2-8アルキニル、Ｃ3-8シクロアルキル、Ｃ1-8ハロアルキル、Ｃ6-10アリール、アミノ‐Ｃ1-8アルキル、ヒドロキシ‐Ｃ1-8アルキル、Ｃ1-8アルコキシ‐Ｃ1-8アルキル、およびＣ1-8アルカノイルで構成されるグループから独立して選択され、あるいは
ＮＲ1Ｒ2を結合してＮ、Ｏ、およびＳから選択されるゼロ、１つ、または２つの追加環へテロ原子で構成されてよい３から７員環を形成し、および
Ｒ6は水素、ヒドロキシ、アミノ、またはＣ1-8アルキルであり、
Ｒ5およびＲ7は水素、ハロゲン化物、ヒドロキシ、チオール、アミノ、ヒドロキシアミノ、モノ‐Ｃ1-8アルキルアミノ、ジ‐（Ｃ1-8アルキル）アミノ、 Ｃ1-8アルコキシ、Ｃ1-8アルキル、Ｃ2-8アルケニル、およびＣ2-8アルキニルで構成されるグループから独立して選択される化合物またはプロドラッグを虚血関連状態の治療を必要とする患者に投与することを含む、虚血関連状態の治療方法に関する。
【００４９】
本発明の最も好ましい実施例は、以下の化学式
【００５０】
【化１０】
【００５１】
のＰＡＮ８１１（３‐アミノピリジン‐２‐カルボキサデルヒド・チオセミカルバゾン）を虚血関連状態の治療を必要とする患者に投与することを含む、虚血関連状態の治療方法に関する。
【００５２】
本発明の好ましい実施例は、アルツハイマー病、パーキンソン病、冠動脈バイパス術、心停止による全脳虚血、局所性脳梗塞、脳出血、出血性梗塞、 高血圧性出血、頭蓋内血管異常の破裂による出血、頭蓋内動脈瘤の破裂によるくも膜下出血、高血圧性脳症、脳虚血につながる頸動脈狭窄症または閉塞、心原性血栓塞栓症、脊髄卒中および脊髄損傷、アテローム性動脈硬化などの脳血管障害、脈管炎、黄斑変性症、心筋梗塞、心虚血および上室性頻拍性不整脈を含むが、これらに限定されない特定の虚血関連状態の治療方法に関する。
【００５３】
本発明の方法に有効な化合物の合成方法は、当該技術分野においてよく知られている。そのような合成スキームは、米国特許：５，２８１，７１５、５，７６７，１３４、４，４４７，４２７、５，８６９，６７６および５，７２１，２５９において開示されており、これらは参照することにより全体が本書に組み込まれる。
【００５４】
医薬組成
本発明の別の側面は、本発明の方法に有効なチオセミカルバゾンの医薬組成に関する。本発明の当該医薬組成は、主に本発明の方法に有効な化合物および医薬的に許容し得る担体で構成されている。ここで使用する「医薬的に許容し得る担体」は、あらゆる溶媒、分散媒体、膜、抗菌剤および抗真剤、等張剤および吸収遅延剤、および生理的に適合する同等物を含む。担体の種類は、意図する投与経路に基づいて選択できる。様々な実施例において、当該担体は、静脈、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、経皮あるいは経口投与に適している。医薬的に許容し得る担体は、無菌水溶液あるいは分散液、および無菌注入液または分散液の即時調整用無菌粉末を含む。医薬的に活性の物質にそのような媒体および媒介物を使用することは、当該技術分野においてよく知られている。従来の任意の媒体または媒介物が活性化合物と適合しない場合を除いて、本発明の医薬組成におけるその使用が考慮されている。補足的な活性化合物を当該組成に組み込むこともできる。
【００５５】
通常、治療組成は製造および保存状態において無菌で安定する必要がある。当該組成は、溶媒、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高薬物濃度に適した他の秩序構造として処方することができる。当該担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物を含む溶媒または分散媒体となる。例えばレシチンなどの膜の使用、分散する場合は必要とされる分子サイズの維持、また界面活性剤の使用によって適切な流動性を維持できる。多くの場合、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、あるいは塩化ナトリウムを当該組成に含むことが好まれる。例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンといった吸収遅延剤を組成に含めることによって、注入可能な組成を長期的に吸収させることができる。さらに、例えば徐放ポリマーを含む組成においては、徐放製剤で当該組成を投与することもできる。活性化合物は、埋め込み型およびマイクロカプセル化した送達システムを含む放出制御製剤で高速放出から化合物を保護する担体を用いて生成できる。エチレン酢酸ビニル、無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオーソエステル、ポリ乳酸およびポリグリコール共重合体（ＰＬＧ）などの生分解性、生適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤の多くの生成方法は、当業者には一般に知られている。
【００５６】
無菌の注入溶液は、上記の材料の１つまたは複数を組み合わせた適切な溶媒に必要量の活性化合物を組み込むことによって生成することができ、必要に応じてろ過滅菌を行う。一般に分散液は、基本的な分散媒体および必要とされる上記の他の材料を含む無菌媒体に活性化合物を組み込むことによって生成する。無菌注入溶液生成用無菌粉末の場合、好ましい生成方法は、真空乾燥および事前に無菌ろ過された溶液から活性材料に加えて追加の望ましい材料の粉末を産出する凍結乾燥である。
【００５７】
投与経路によって、酵素、酸、および薬剤を不活性にすることがある他の自然状態の作用から化合物を保護するために、当該化合物を物質でコーティングしてもよい。例えば、酵素阻害剤とともに適切な担体または希釈液において当該化合物を対象に投与するか、またはリポソームなどの適切な担体で投与することができる。医薬的に許容し得る希釈液は、生理食塩水および水性緩衝液を含む。酵素阻害剤は、膵トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＥＰ）およびトラジロールを含む。リポソームは従来のリポソームと同様に、油中水乳剤を含む（Ｓｔｒｅｊａｎら、（１９８４）Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ ７:２７）。分散液はグリセロール、液体ポリエチレングリコール、その混合液、および油中で生成することもできる。従来の保存および使用状態では、微生物の成長を防ぐために保存料を含めて生成してもよい。
【００５８】
当該組成中の活性剤（例えば、１つまたは複数のチオセミカルバゾン）は、好ましくは治療上有効な量の組成で調整される。「治療上有効な量」とは、望ましい治療結果を得て、それによって特定の病状の治療過程に影響を及ぼすのに効果的な量、必要な用量および期間を意味する。治療上有効な量の活性剤は、個人の病状、年齢、性別、および体重などの要素によって、またその個人に望ましい反応を誘引する薬剤の能力によって異なる。用法用量は、最適な治療効果をもたらすうに調整してよい。治療上有効な量は、治療上有益な効果が当該活性剤の毒性または有害な効果を上回る量でもある。別の実施例において、当該活性剤は予防的に有効な量の組成で処方される。「予防的に有効な量」は、望ましい予防効果を得るために効果的な量、必要な用量および期間を示す。一般に、予防的な用量は病気の発症前、または初期段階に使用されるため、予防的に有効な量は治療上有効な量よりも少なくなる。
【００５９】
当該組成における活性化合物の量は、個人の病状、年齢、性別および体重によって変えてよい。用法用量は最適な治療効果をもたらすように調整してよい。例えば、ボーラスを単回投与するか、長期に渡って用量を複数回に分けて投与するか、あるいは治療状況の要件に示されるように、用量の比率を増減させてもよい。容易な投与と用法の統一のために、服用単位フォームとして非経口組成を処方することが特に有効である。ここで使用される服用単位フォームは、治療を受ける哺乳類対象に対する単一の用法に適した物理的不連続単位を示す。各単位は、必要とされる医薬担体と関連して、望ましい治療効果を挙げるよう事前に設定された量の活性化合物を含む。本発明の用法単位フォームに関する仕様は、（ａ）活性化合物固有の特性および得られる特定の治療効果、および（ｂ）個人の治療感受性に対してそのような活性化合物を合成する技術に特有の制限事項に直接依存する。
【００６０】
本発明の化合物は医薬組成に組み込むことができる。ここで当該化合物はそこで唯一の活性剤である。代替として、当該医薬組成は追加の活性剤を含むことができる。例えば、本発明の２つ以上の化合物を組み合わせて使用してもよい。
【００６１】
本発明は、以下の実施例によって詳述されるがそれらに制限されると解釈されるものではない。本出願を通して引用されるすべての参照文献、特許、および公開特許出願の内容は、ならびに図は、参照することにより本書に組み込まれる。
【実施例】
【００６２】
例証
実施例１
ＰＡＮ‐８１１および他の周知の神経保護剤の神経保護能力比較
目的
本研究の目的は、アルツハイマー病関連の酸化的ストレスの細胞ベースモデルにおけるＰＡＮ‐８１１（３‐アミノピリジン‐２‐カルボキサルデヒド・チオセミカルバゾン；Ｃ7Ｈ9Ｎ5Ｓ；ＭＷ＝１９５）の神経保護能力をビタミンＥ、リポ酸、およびイチョウの葉などの周知の神経保護剤と比較することである。
【００６３】
１．材料および方法
１．１．研究デザイン
１．１．１．細胞の分離および受容
初代皮質ニューロンを１７日齢のラット胚脳から分離し、９６ウェルプレート上に標準神経細胞用基礎培地中５０，０００細胞／ウェルの密度で２〜３週間播種した。培地の半量を、抗酸化剤を含まない新たな神経細胞用基礎培地と２回置き換えた。
【００６４】
１．１．２．ＰＡＮ‐８１１、他の周知の神経保護剤および過酸化水素による処理
ＰＡＮ‐８１１を１ｍｇ／ｍｌ（〜５ｍＭ）のＥｔＯＨに溶解し、さらに最終濃度０．１μＭ、１μＭ、および１０μＭの媒体で希釈した。他の周知の神経保護剤を適切な溶媒に溶解し、前記の最終濃度の媒体で希釈した。ニューロンをＰＡＮ‐８１１、周知の神経保護剤あるいは媒体で２４時間事前処理した後、過酸化水素（最終濃度１５０μＭ）により誘引される酸化的ストレスをかける。対照には、未処理の細胞（化合物および過酸化水素による処理をしていない細胞）、化合物のみで処理された細胞、および化合物ではなく過酸化水素に曝露された細胞が含まれる。未処理の細胞を対照として使用し、ニューロンの毒性および向上した生存能力を評価した。各試験は３回繰り返し行った。
【００６５】
細胞機能の評価
２４時間後、標準ＭＴＳ試験（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して生存能力およびミトコンドリア作用を評価した。製造者のプロトコルは以下のとおりである。
【００６６】
１．２．材料
・ 神経細胞用基礎媒地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
・ Ｂ２７‐ＡＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
・ ＰＡＮ‐８１１（Ｖｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ, Ｉｎｃ．）
・ 過酸化水素（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）
・ ＥｔＯＨ（Ｓｉｇｍａ社）
・ ビタミンＥ（Ｓｉｇｍａ社）
・ リポ酸（Ｓｉｇｍａ社）
・ イチョウの葉（ＣＶＳ）
・ ＭＴＳ試験キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）
・
１．３．装置
・ バランス（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ， Ｉｎｃ．）
・ 可調整ピペット（Ｆｉｎｎｐｉｐｅｔｔｅ社）
・ 細胞培養フード（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｏｒｍａ社）
・ 細胞培養器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｏｒｍａ社）
・ プレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｍｏｄｅｌ ５５０）。
【００６７】
２．結果
２．１ 実験
上記の研究デザインに記載の手順に従って実験を行った。ＰＡＮ‐８１１を１ｍｇ／ｍｌのＥｔＯＨ（〜５ｍＭ）に溶解し、さらに神経細胞用基礎培地で最終濃度０．１μＭ、１μＭ、および１０μＭまで希釈した。リポ酸を２４０ｍＭのＥｔＯＨに溶解し、さらに神経細胞用基礎培地で最終濃度１０μＭ、２５μＭ、５０μＭ、および１００μＭまで希釈した。ビタミンＥを１００ｍＭ濃度のＥｔＯＨに溶解し、神経細胞用基礎培地で最終濃度５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、および４００μＭまで希釈した。イチョウの葉は、６ｍｇ／ｍｌのｄＨ2Ｏに溶解し、神経細胞用基礎培地で最終濃度２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌまで希釈した。処理の最後に媒体を、Ｂ２７（‐ＡＯ）を加えた１００μｌの新しい加温済み神経細胞用基礎培地と取り替えた。プレートを３７℃で５％ＣＯ2の培養器に１時間戻した。次に２０μｌＭＴＳ試薬を各ウェルに加え、プレートを３７℃で５％ＣＯ2の培養器でさらに２時間培養した。各ウェルの４９０ｎｍでの吸収度をＢｉｏＲａｄプレートリーダー（モデル５５０）で記録した。培地のみを含むウェルをブランクとして使用した。各データポイントは、３つの個別の試験ウェルの平均である。未処理の細胞を対照として使用し、細胞の生存能力および神経保護能力を算出した。当該研究には２週齢の初代培地を使用した。結果については図１を参照のこと。
【００６８】
結論
ＰＡＮ‐８１１は、過酷な過酸化水素処理下においても１〜１０μＭ濃度で良好な神経保護能力を示した。ビタミンEおよびリポ酸は、過酷な処理下で最小限の神経保護能力を示した。イチョウの葉は過酷な処理下である程度の神経保護を示した。
【００６９】
ＰＡＮ‐８１１は、過酷な過酸化水素下においても最終濃度１〜１０μＭで著しい神経保護を示した。ＰＡＮ‐８１１の神経保護の有効性は、他の周知の神経保護剤、ビタミンＥ、リポ酸、およびイチョウの葉の有効性をはるかに上回っていた。
【００７０】
実施例２
神経細胞における活性酸素種（ＲＯＳ）産生に対するＰＡＮ‐８１１の効果
目的
本研究の目的は、ＰＡＮ‐８１１のアルツハイマー病関連酸化的ストレスの細胞ベースモデルにおけるＲＯＳ産生の削減能力を評価することである。
【００７１】
１． 材料および方法
１．１ 研究デザイン
１．１．１．細胞の分離および受容
初代皮質ニューロンを１７日齢のラット胚脳から分離し、９６ウェルプレートに標準神経細胞用基礎培地中５０，０００細胞／ウェルの密度で２〜３週間播種した。培地の半量を、酸化防止剤を含まない新たな神経細胞用基礎培地と２回置き換えた。
【００７２】
１．１．２ ．細胞のＣＭ‐Ｈ2ＤＣＦＤＡ色素事前負荷およびＰＡＮ‐８１１と過酸化水素による処理
初代皮質ニューロンをＨＢＳＳ緩衝液で１回洗浄し、１０μＭの５‐（および‐６）クロロメチル‐２’，７’‐ジクロロジヒドロフルオロセインニ酢酸アセチルエステル（ＣＭ‐Ｈ2ＤＣＦＤＡ）で培養して色素を事前に含ませた。その後、細胞をＨＢＳＳ緩衝液で１回洗浄し、最終濃度０．１、１、５、および１０μＭのＰＡＮ‐８１１で１時間処理した後、３００μＭの過酸化水素によって誘導される酸化的ストレスを２時間かけた。
【００７３】
１．１．３．神経細胞におけるＲＯＳ産生の評価
各ウェルの４８５／５２０ｎｍ（Ｅｘ／Ｅｍ）におけるｃ‐ＤＣＦ蛍光体をＢＭG Ｐｏｌａｒｓｔａｒプレートリーダーで記録し、それを使用して細胞におけるＲＯＳ産生を評価した。色素を含む未処理の細胞を対照として使用し、ｃ‐ＤＣＦ蛍光体の変化を算出した。各試験は３回繰り返し行った。
【００７４】
１．２ 材料
・ 神経細胞用基礎培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
・ Ｂ２７‐ＡＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
・ ＨＢＳＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
・ ＣＭ‐Ｈ2ＤＣＦＤＡ（分子プローブ）
・ ＰＡＮ‐８１１（Ｖｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．）
・ 過酸化水素（Ｃａｌｉｂｉｏｃｈｅｍ社）
・ ＥｔＯＨ（Ｓｉｇｍａ社）
・ ＰＥＧ‐３００（Ｓｉｇｍａ社）
１．３ 装置
・ バランス（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ， Ｉｎｃ．）
・ 可調整ピペット（Ｆｉｎｎｐｉｐｅｔｔｅ社）
・ 細胞培養フード（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｏｒｍａ社）
・ 細胞培養器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｏｒｍａ社）
・ Ｐｏｌａｒｓｔａｒ蛍光プレートリーダー（ＢＭＧ）。
【００７５】
２．０ 結果
２．１ 実験
上記の研究デザインに記載の手順に従って実験を行った。各ウェルの４８５／５２０ｎｍ（Ｅｘ／Ｅｍ）でのｃ‐ＤＣＦ蛍光体をＢＭＧ Ｐｏｌａｒｓｔａｒプレートリーダーで記録した。色素のない細胞を含むウェルをブランクとして使用した。各データポイントは、３つの個別の試験ウェルの平均である。色素含む未処理の細胞を対照として使用し、ｃ‐ＤＣＦ蛍光体の変化を算出した。当該研究には２週齢の初代培養を使用した。
【００７６】
３．０ 考察
ＣＭ‐Ｈ2ＤＣＦＤＡは、細胞内エステラーゼによって酢酸基が取り除かれ、細胞内で酸化が起こるまでの非蛍光性ＲＯＳの細胞透過指標である。これは、細胞および動物における活性酸素種（ＲＯＳ）産生の検出に広く使用されている。ここでは研究デザインに記載の手順に従って、神経細胞におけるＲＯＳ産生に対するＰＡＮ‐８１１の効果を判定するツールとして使用している。図２は、ＰＡＮ‐８１１が神経細胞における基礎レベルのＲＯＳ産生と同様に、過酸化水素誘導ＲＯＳ産生を削減する良好な能力を示したことを図示している。ＰＡＮ‐８１１の代わりに、緩衝液ＰＧＥ‐３００／ＥｔＯＨを使用した平行対照実験は、細胞におけるＲＯＳ産生に対する効果を示さなかった。異なる細胞群で４回実験を繰り返したところ、同様の結果が得られた。代表的な実験については、図２を参照のこと。
【００７７】
４．０ 結論
ＰＡＮ‐８１１は、初代神経細胞において、過酸化水素誘導ＲＯＳ産生（１０μＭで最高３０％）および初期レベルのＲＯＳ産生（１０μＭで最高５０％）を大幅に削減した。
【００７８】
文献
（１）． Ｇｉｂｓｏｎ ＧＥ， Ｚｈａｎｇ Ｈ， Ｘｕ Ｈ， Ｐａｒｋ ＬＣ， Ｊｅｉｔｎｅｒ ＴＭ． （２００１）． Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃａｌｃｉｕｍ ｓｔｏｒｅｓ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ａ ｋｅｙ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｅｎｚｙｍｅ． Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ． Ｍａｒ １６；１５８６（２）：１７７−８９．
（２）． Ｃｈｉｇｎｅｌｌ ＣＦ， Ｓｉｋ ＲＨ． （２００３）． Ａ ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｌｏａｄｅｄ ｗｉｔｈ ２’，７’−ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ＵＶＡ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ． Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ． Ａｐｒ １５；３４（８）：１０２９−３４。
【００７９】
実施例３
低酸素誘導神経毒性または低酸素／低血糖誘導神経毒性に対する潜在的神経保護剤ＰＡＮ‐８１１
１．０ はじめに
虚血性発作後、最初の数分における神経損傷を軽減することが効果的な治療につながる重要な方法である。脳卒中の発作の間、動脈が血栓／塞栓によって閉塞するため脳の局所領域への酸素およびグルコースの輸送が遮断され、これによって梗塞の中核に神経細胞の欠損が生じる。中核の細胞死は壊死機序を介して非常に速く進行する。虚血性梗塞を取り囲む脳領域は、その構造は保持するが機能的（電気的）には無反応であり、周縁部と呼ばれる。梗塞に至るまでの進化が比較的漸進的な現象であるため、当該周縁部は一時的な領域である（Ｔｏｕｚａｎｉら、２００１）。この領域は、幾つかの脳の機能を保護する可能性を提供し、周縁部の治療のための治療濃度域は梗塞領域のそれよりはるかに長い。当該周縁部は、エネルギー代謝が保護される血液供給抑制領域として説明することもできる。そのため当該周縁部は、休止状態のニューロンを再活性させる高圧酸素などの作用因子および神経保護治療のターゲットである。ＣＮＳ外傷における損傷直後のダメージは回復不可能であるが、脳の損傷、主として全脳低酸素／虚血を悪化させる一連のイベントの進行を神経保護の効果的な方法によって回避することができる。例えば、冠動脈バイパス術（ＣＡＢＧ）前および術中に神経保護剤を投与することによって、術中に脳への血流が短期間変化すること（軽度の低酸素／低血糖状態につながる）によって生じる神経変性を効果的に防ぐことができる。このため、顕著な神経保護および損傷を受けた後のニューロン救済の両方が可能な化合物が重要である。
【００８０】
２．０ 目的
本研究の目的は、ＰＡＮ‐８１１がインビトロで低酸素誘導神経毒性または低酸素／低血糖（Ｈ／Ｈ）誘導神経毒性を保護できるかどうかを理解することである。ＰＡＮ‐８１１は、関連する研究において、過酸化水素で処理した初代ニューロンに対して顕著な神経保護を提供することが既に示されている。
【００８１】
３．０ 材料および方法
３．１ 材料
・ 神経細胞用基礎培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
・ Ｂ２７‐ＡＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
・ ＰＡＮ‐８１１（Ｖｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）
・ ＥｔＯＨ（Ｓｉｇｍａ社）
・ ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ社）
・ ＰＥＧ‐３００（Ｓｉｇｍａ社）
・ ＭＴＳ試験キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）
・ ＬＤＨ試験キット（Ｓｉｇｍａ社）
２．２ 装置
・ バランス（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ， Ｉｎｃ．）
・ 可調整ピペット（Ｆｉｎｎｐｉｐｅｔｔｅ社）
・ 細胞培養フード（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｏｒｍａ社）
・ 細胞培養器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｏｒｍａ社）
・ プレートリーダー（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ Ｍｏｄｅｌ５５０）
・ ＦＹＲＩＴＥガス分析計（Ｂａｃｈａｒａｃｈ， Ｉｎｃ）
・ モジュール培養室‐１０１ＴＭ（Ｂｉｌｌｕｐｓ‐Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ，Ｉｎｃ．）
３．３ 略称
ＢＳＳ＝平衡塩類溶液（Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）
ＣＡＢＧ＝冠動脈バイパス術（Ｃｏｒｏｎａｒｙ Ａｒｔｅｒｙ Ｂｙｐａｓｓ Ｇｒａｆｔ）
ｄ．ｉ．ｖ．＝試験管内日数（Ｄａｙｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
ＥｔＯＨ＝エタノール（Ｅｔｈａｎｏｌ）
Ｈ／Ｈ＝低酸素／低血糖（Ｈｙｐｏｘｉａ／Ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉａ）
ＬＤＨ＝乳酸脱水素酵素（Ｌａｃｔａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）
ＭＣＡＯ＝中大脳動脈閉塞（Ｍｉｄｄｌｅ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ａｒｔｅｒｙ Ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）
ＮＢ＝神経細胞用基礎培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ）
ＮＭＤＡ＝Ｎ‐メチル‐Ｄ‐アスパラギン酸
ＰＥＧ＝ポリエチレングリコール（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）。
【００８２】
３．４ 研究デザイン
３．４．１ 神経培養
９６ウェルプレート形式で実験を行った。ポリ‐Ｄ‐リシンでコーティングされた表面に皮質ニューロンを５０，０００細胞／ウェルの密度で播種し、無血清培地（ＮＢにＢ２７を補足）で培養してニューロンの富栄養培地を得る。ニューロンを１４日以上試験管内で培養し、興奮性アミノ酸に対する細胞の感受性を増加させる（チヤン（Ｊｉａｎｇ）ら、２００１）。定量分析を容易にするため、６つの複製ウェルを１グループとして処理した。
【００８３】
３．４．２ 神経毒性の誘導‐インビトロモデル
以下の表に示すように、脳内のグルコース濃度は通常２．２ｍＭ以上である。虚血の間、中核および周縁部のグルコース濃度はそれぞれ０．２ｍＭおよび１．４ｍＭまで低下する。再循環後１、２時間でグルコースレベルは正常に戻る（Ｆｏｌｂｅｒｇｒｏｖaら、１９９５）。
【００８４】
【表１】
【００８５】
低酸素誘導神経毒性に対するグルコース濃度の効果を理解するため、異なる用量のグルコースをテストした。図３に示すように、グルコース濃度が２５ｍＭである正常状態と比較して、グルコース濃度が２．９ｍＭまで低下しても神経細胞死を生じなかった。 グルコース濃度が０．４ｍＭまで低下した場合、ＭＴＳ試験が示すように確固たる細胞死が発生した。
【００８６】
脳卒中の脳環境を再現するために、３つのインビトロモデルシステムを確立した。極度のＨ／Ｈモデル（０．４ｍＭグルコース）は梗塞の中核における環境の再現であり、軽度のＨ／Ｈモデル（１．６３ｍＭグルコース）はＭＣＡＯ中の周縁部における環境の再現、また低酸素のみのモデル（正常なインビトログルコース濃度‐２５ｍＭ中のニューロン）は、再かん流後の周縁部の環境を再現している。これは、再かん流後に起こり得る細胞死が主にエネルギー欠陥よりも低酸素の影響の結果であるためである。
【００８７】
極度のＨ／Ｈの場合は０．４ｍＭ、軽度のＨ／Ｈの場合は１．６３ｍＭまでグルコース濃度を下げることによって、低酸素／低血糖状態を得た。ＢＳＳ（１１６．０ｍＭのＮａＣｌ、５．４ｍＭのＫＣｌ、０．８ｍＭのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１．８ｍＭのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２６．２ｍＭのＮａＨＣＯ３、および０．０１ｍＭのグリシン）あるいは２５ｍＭのグルコースを含むＢＳＳは、５分間脱気した後使用した。低酸素用のプレート中の培地をＢＳＳあるいはグルコースを含むＢＳＳと置き換えた。一方、正常酸素用のプレート中の培地は、非脱気ＢＳＳあるいはグルコースを含むＢＳＳと置き換えた。プレートを密封容器（モジュール培養室‐１０１TM、Ｂｉｌｌｕｐｓ‐Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ，Ｉｎｃ．）に移し、２０分間真空処理して酸素または他のガスを培地から除去した後、室内に５％ＣＯ2および９５％Ｎ2を３０ｐｓｉの圧力で１分間再充填して、細胞を低酸素状態に置いた。室内の酸素レベルはＯ2指示計（ＦＹＲＩＴＥガス分析計、Ｂａｃｈａｒａｃｈ，Ｉｎｃ．）でゼロとした。当該室内に培養プレートを６時間維持した。実験対照として、複製した培養プレートを正常な培養条件下（５％ＣＯ2および９５％環境大気）で同期間維持した。６時間の処理後、プレートを当該室から取り出し、低酸素および正常酸素培養における培地を、２５ｍＭグルコースを含む最終溶液（１ｘピルビン酸ナトリウム、１０．０ｍＭのＨＥＰＥＳ、および１ｘＮ2サプリメントで補完されたＤＭＥＭ）と置き換え、５％ＣＯ2および９５％環境大気中で培養した。ニューロンを様々な濃度のＰＡＮ‐８１１あるいは負の対照としての媒体で処理した。ＭＫ８０１は正の対照として使用した。ミトコンドリア作用および細胞死はＨ／Ｈ状態に置いてから２４時間または４８時間後にＭＴＳおよびＬＤＨ分析で評価した（以下参照）。
【００８８】
低酸素のみのモデルにおいて、ニューロンを溶媒またはＰＡＮ‐８１１で２４時間または４８時間事前処理した。薬剤による処理を２４時間の低酸素期間中および期間後も継続した。低酸素状態に置いてから２４時間または４８時間後に細胞形態および機能（ＭＴＳおよびＬＤＨ試験）を計測した。
【００８９】
３．４．３ 形態のモニタリング
形態学的に評価した神経細胞死を図４に示す。低酸素状態前のニューロンは健康で、様相の優れた細胞体（矢じり）および正常な神経突起（白抜き矢印）を持つ。当該プロセスおよびそれらの分枝がバックグラウンドに密なネットワークを形成する。低酸素状態は細胞体の収縮および神経突起やネットワークの崩壊を招く。用量５μＭのグルタミン酸ＮＭＤＡ受容体拮抗薬ＭＫ８０１と同様に、ＰＡＮ‐８１１は神経細胞死から効果的に保護し、神経突起を部分的に留保することを示した。
【００９０】
３．４．４ ＭＴＳ試験
ＭＴＳ試験は、代謝的に活発な細胞におけるミトコンドリア作用を測定する比色試験である。この測定は直接細胞生存能力に反映する。ＭＴＳテトラゾリウム化合物は、代謝的に活発なミトコンドリア中では減少し、組織培地において溶解可能な有色のホルマザン生成物になり、４９０ｎｍの吸収度で検出できる。２０μｌのＭＴＳ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を、１００μｌの培地にサンプルを含む９６ウェル試験プレートの各ウェルに添加する。次に当該プレートを３７℃の加湿した５％ＣＯ2雰囲気中で１〜２時間、完全に発色するまで培養する。Ｂｉｏ‐Ｒａｄ９６ウェルプレートリーダーを使用して、４９０ｎｍの吸収度を記録した。
【００９１】
３．４．５ ＬＤＨ試験
乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）試験は、ＬＤＨの作用によるＮＡＤの減少に基づいている。結果として減少するＮＡＤ（ＮＡＤＨ）をテトラゾリウム染色の化学量論的変換に使用する。異なる処理を行った培養物から得た無細胞のアリコート培地を試験する場合、膜の完全性の作用と同様に、ＬＤＨの作用量を関連する細胞死の指標として使用することができる。試験した９６ウェルプレート中のウェルから得た５０μｌアリコートの培地を未使用のプレート中のウェルに移し、均等に混合した基質、酵素および染色溶液（Ｓｉｇｍａ社）２５μｌで補完した。当該生成物を室温で２０〜３０分間培養した後、４９０ｎｍの波長で分光光度法的に測定した。
【００９２】
３．結果
４．１ 低酸素のみのモデル
３．１．１．ＰＡＮ‐８１１の有効性および毒性
低酸素前の４８時間、皮質ニューロンをＰＡＮ‐８１１で処理した。ＰＡＮ‐８１１を低酸素状態で２４時間、その後４８時間静置した。用量２μＭのＰＡＮ‐８１１は細胞死を完全にブロックしたが、５０μＭでは毒性を示した（図５を参照）。
【００９３】
３．１．２．他の神経保護剤との比較
低酸素期間の２４時間前、低酸素期間中、およびその後２４時間、皮質ニューロンを２μＭのＰＡＮ‐８１１、１：８０の緑茶、または５μＭのＭＫ８０１で処理した。テストした試薬の中で、ＰＡＮ‐８１１は最も高い有効性を示し、神経細胞死およびミトコンドリア作用不全を完全にブロックした。
【００９４】
軽度のＨ／Ｈモデル
３．１．３． 低酸素期間前および期間中、ＰＡＮ‐８１１はニューロンを軽度のＨ／Ｈ誘導神経毒性から保護した。
【００９５】
胚（Ｅ１７）ラット皮質ニューロンを１５日間培養し、低酸素／低血糖前の２４時間およびその期間中（６時間）、ＰＡＮ‐８１１および媒体で処理した。当該発作の１７時間後にＭＴＳ試験およびＬＤＨ試験を実施した。５μＭのＰＡＮ‐８１１は、低酸素／低血糖誘導ミトコンドリア作用不全および神経細胞死を完全に防いだが、ＰＥＧ：ＥｔＯＨ＝１：１の５２０希釈液（５μＭのＰＡＮ‐８１１の媒体量に対応する）は防御しなかった。
【００９６】
代表的なデータを図６に示す。２〜５０μＭの濃度範囲をカバーする６実験の要約を以下の表２に示す。
【００９７】
【表２】
【００９８】
４．２．２． 発作中、特に発作後に、ＰＡＮ‐８１１は軽度のＨ／Ｈ誘導神経毒性から細胞を保護した。
【００９９】
ニューロンを１５日間培養し、ＰＡＮ‐８１１またはＰＥＧ：ＥｔＯＨ（７：３）を媒体として用いて６時間のＨ／Ｈ前の２４時間処理した（Ｈ／Ｈ前グループ）。代替として、ニューロンを１６日間培養し、６時間のＨ／Ｈ中に上記の試薬で処理し（Ｈ／Ｈ中グループ）、６時間のＨ／Ｈ期間中およびＨ／Ｈ後４８時間処理する（Ｈ／Ｈ中およびＨ／Ｈ後グループ）、あるいはＨ／Ｈ後４８時間処理した（Ｈ／Ｈ後グループ）。Ｈ／Ｈ期間後４８時間にＬＤＨ試験を実施した。Ｈ／Ｈの直前ではなく、Ｈ／Ｈ中および特にＨ／Ｈ後にニューロンを処理した場合、ＰＡＮ‐８１１は神経細胞死から保護した。図７を参照のこと。
【０１００】
３．２．極度のＨ／Ｈモデル
５０μＭ以下のＰＡＮ‐８１１は、神経細胞死を防がなかった（データ表示せず）。
【０１０１】
４．結論
４．１． ２μＭのＰＡＮ‐８１１は低酸素誘導神経毒性および軽度のＨ／Ｈ誘導神経毒性を完全に防いだ。１００μＭのＰＡＮ‐８１１は、極度のＨ／Ｈ誘導神経細胞死を一部ブロックしたにすぎず、エネルギー代謝に関与しているとは考えにくい。
【０１０２】
４．２． 低酸素または虚血発作中、あるいはその後のいずれかに投与した場合、ＰＡＮ‐８１１はニューロンを細胞死から顕著に保護した。
【０１０３】
４．３． ＰＡＮ‐８１１の有効性は、ＭＫ８０１および／または緑茶よりはるかに優れている。
【０１０４】
４．４． ５０μＭのＰＡＮ‐８１１を長期的に接触させると、ニューロンにとって毒性となる（１２０時間曝露）。
【０１０５】
５．参照文献
１． Ｊｉａｎｇ， Ｚ．−Ｇ．， Ｐｉｇｇｅｅ， Ｃ．Ａ．， Ｈｅｙｅｓ， Ｍ．Ｐ．， Ｍｕｒｐｈｙ， Ｃ．Ｍ．， Ｑｕｅａｒｒｙ， Ｂ．， Ｚｈｅｎｇ， Ｊ．， Ｇｅｎｄｅｌｍａｎ， Ｈ．Ｅ．， ａｎｄ Ｍａｒｋｅｙ， Ｓ．Ｐ． Ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｉｓ ａ ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｏｆ ＨＩＶ−１−ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｕｍａｎ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １１７（１ ２）：９７−１０７， ２００１．
２． Ｆｏｌｂｅｒｇｒｏｖa， Ｊ．， Ｚｈａｏ， Ｑ．， Ｋａｔｓｕｒａ， Ｋ．， ａｎｄ Ｓｉｅｓｊo， Ｂ．Ｋ． Ｎ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ-ｐｈｅｎｙｌｎｉｔｒｏｎｅ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｅｎｅｒｇｙ ｓｔａｔｅ ｉｎ ｒａｔｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｆｏｃａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：５０５７−５０６１， １９９５．
３． Ｔｏｕｚａｎｉ， Ｏ．， Ｒｏｕｓｓｅｌ， Ｓ．， ａｎｄ ＭａｃＫｅｎｚｉｅ， Ｅ．Ｔ． Ｔｈｅ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｐｅｎｕｍｂｒａ． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｎｅｕｒｏｌ． １４：８３−８， ２００１。
【０１０６】
実施例４
一時的な局所脳虚血のインビボモデルにおいて顕著な神経保護を示すＰＡＮ‐８１１
１．はじめに
発作後最初の数分における神経損傷を軽減することが効果的な治療につながる重要な方法である。脳卒中の発作の間、動脈が血栓／塞栓によって閉塞するため脳の局所領域への酸素およびグルコースの輸送が遮断され、これによって梗塞の中核に神経細胞の欠損が生じる。中核の細胞死は壊死機序を介して非常に速く進行する。虚血性梗塞を取り囲む脳領域は、その構造は保持するが機能的（電気的）には無反応であり、周縁部と呼ばれる。梗塞に至るまでの進化が比較的漸進的な現象であるため、当該周縁部は一時的な領域である（Ｔｏｕｚａｎｉら、２００１）。この領域は、幾つかの脳の機能を保護する可能性を提供し、周縁部の治療のための治療濃度域は梗塞領域のそれよりはるかに長い。当該周縁部は、エネルギー代謝が保護される血液供給抑制領域として説明することもできる。そのため当該周縁部は、休止状態のニューロンを再活性させる高圧酸素などの作用因子および神経保護治療のターゲットである。ＣＮＳ外傷における損傷直後のダメージは回復不可能であるが、脳の損傷、主として全脳低酸素／虚血を悪化させる一連のイベントの進行を神経保護の効果的な方法によって回避することができる。例えば、冠動脈バイパス術（ＣＡＢＧ）前および術中に神経保護剤を投与することによって、術中に脳への血流が短期間変化すること（軽度の低酸素／低血糖状態につながる）によって生じる神経変性を効果的に防ぐことができる。このため、顕著な神経保護および損傷を受けた後のニューロン救済の両方が可能な化合物が重要である。
【０１０７】
２．目的
ＰＡＮ‐８１１は、酸化的ストレスおよび虚血のインビトロモデルにおいて顕著な神経保護を示している。周知の毒性プロファイルおよび薬物動態データを含め、先の研究は脳卒中の治療におけるその可能性を高く示唆している。
【０１０８】
３．材料および方法
３．１ 材料
・ ＰＡＮ‐８１１（Ｖｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）
・ ＥｔＯＨ（Ｓｉｇｍａ社）
・ ＰＥＧ‐３００（Ｓｉｇｍａ社）
・ ＭＴＳ試験キット（Ｓｉｇｍａ社）
３．２ 略称
ＣＡＢＧ＝冠動脈バイパス術（Ｃｏｒｏｎａｒｙ Ａｒｔｅｒｙ Ｂｙｐａｓｓ Ｇｒａｆｔ）
ＥｔＯＨ＝エタノール（Ｅｔｈａｎｏｌ）
Ｈ／Ｈ＝低酸素／低血糖（Ｈｙｐｏｘｉａ／Ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉａ）
ＭＣＡＯ＝中大脳動脈閉塞（Ｍｉｄｄｌｅ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ａｒｔｅｒｙ Ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）
ＰＥＧ＝ポリエチレングリコール（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）
３．３ 研究デザイン
３．３．１ インビトロ研究
インビボ研究に着手する前に、ＰＡＮ‐８１１を幾つかの神経変性細胞モデルにおいてテストした。
【０１０９】
３．３．１．１．神経培養
富養神経培養物を１５日齢のＳｐｒａｇｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙラット胚から生成した。無菌技術を使用して、ラット胚を子宮から取り出し、無菌神経細胞用培地に配置した。解剖顕微鏡を使用して、髄膜および血管を除去するように注意しながら脳組織を各胚から取り出した。小脳を顕微鏡下、全体切開によって分離し、小脳組織のみを培養に使用した。組織を粉砕して細胞を分離し、ポリ（Ｌ‐リシン）で事前にコーティングされた４８ウェルプレートに５ｘ１０5細胞／ウェルの密度で播種した。Ｅａｇｌｅの基礎培地（グルタミンを含まない）の同等部および１０％加熱不活性化ウマ血清、１０％ウシ胎孔血清、グルコース６００μｇ／ｍｌ、グルタミン１００μｇ／ｍｌ、ペニシリン５０Ｕ／ｍｌ、およびストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌで補完したＨａｍのF‐１２ｋ媒体を含む媒体で培養を維持した。４８時間後、１０μＭのシトシンアラビノシドを加えて非神経細胞分裂を阻害した。培養７日後の細胞を実験に使用した。
【０１１０】
３．３．１．２．ＰＡＮ‐８１１の神経毒性
様々な量のＰＡＮ‐８１１（０〜１００μＭ）で２４時間細胞を処理した。細胞の生存能力はＭＴＴ試験で判定した。
【０１１１】
３．３．１．３．神経毒性の誘導‐インビトロモデル
４つのインビトロモデルにおいて興奮毒性を調べた。細胞をＨ／Ｈ状態に３時間置くか、あるいはグルタミン酸（１００μＭ）、スタウロスポリン（１μＭ）、あるいはベラトリジン（１０μＭ）のいずれかで４５分間処理した。Ｌｏｃｋｅ溶液中でＰＡＮ‐８１１（１０μＭ）を用いて、または用いずに、すべての細胞を併せて処理した。それぞれの興奮毒性照射の最後に、条件培地（オリジナル）を置き換えた。９５％窒素および５％ＣＯ2で飽和した加湿気密室内で、グルコースを添加しないＬｏｃｋｅ溶液中で３時間細胞を培養することによってＨ／Ｈを誘導した。
【０１１２】
３．３．１．４．ＭＴＴ試験
２４時間後に興奮毒性発作細胞の生存能力を試験した。細胞の損傷は、３‐（４，５‐ジメチルチアゾール‐２‐ｙｌ）‐２，５‐ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、ミズーリ州セントルイス）を用いたテトラゾリウム塩比色試験を使用して定量的に試験した。つまり、色素を各ウェル（最終濃度１．５ｍｇ／ｍｌ）に添加し、細胞をＭＴＴ‐酸性化イソプロパノール（イソプロパノール中０．１Ｎ ＨＣｌ）で培養して、各サンプルの吸収度（５４０ｎｍ）を９６ウェルプレートリーダーで測定した。各プレート上に維持された媒体処理済み対照細胞に相対する値が示され、細胞の生存能力の比率変化を計算した。
【０１１３】
３．１．２ インビボ研究
３．１．２．１．ＭＣＡＯ
本研究には３６匹の雄Ｓｐｒａｇｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙラット（２７０‐３３０ｇ；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ、バージニア州ローリー）を使用した。麻酔は酸素で送達される５％のハロタンで誘導し、２％のハロタンで維持した。体温は恒温性の暖房装置を使用して手術の全工程を通じて正常温度（３７±１℃）に維持した（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、マサチューセッツ州サウスナティック）。術前および術後に、必要に応じて食べ物と水を与え、１２時間の明暗サイクル下で１匹ずつ保管した。ラットに麻酔をかけ、中大脳動脈閉塞のフィラメント法および再かん流を使用して一時的な局所虚血状態を用意した。つまり、右外頸動脈を分離し、その分枝を凝固させた。先端が丸くコーティングしていない３‐０モノフィラメントナイロン縫合を、外頸動脈を介して内頚動脈に導入し、わずかな抵抗が見られ、ＭＣＡの起点を閉塞するまで進めた（頸動脈分岐部から約２２ｍｍ）。血管内縫合は２時間同位置に維持した後、ＭＣＡに血液が再かん流するよう縫合を除去した。ＭＣＡＯ手術後、環境大気温度を２２℃に維持しながらラットを回復ケージに入れた。実験中の体温を正常温度に維持するため、２時間の虚血期間および虚血後最初の６時間、７５ワットの加温ランプを各ケージの上部に直接配置した。
【０１１４】
３．１．２．２．ＰＡＮ‐８１１による処理
ＭＣＡＯに先立って、ラットに１ｍｇ／ｋｇのＰＡＮ‐８１１をＩＶ注射して１０分間処理した。ＰＡＮ‐８１１を７０％ＰＥＧ３００、３０％ＥｔＯＨの原液として生成した。この原液を無菌の生理食塩水で５倍に希釈して注入した（最終濃度１ｍｇ／ｍｌ）。
【０１１５】
３．１．２．３．損傷量の測定
各ラット脳について、虚血による脳損傷の分析を総梗塞量として測定した。これは、７つの冠状断面（厚さ２‐ｍｍ）から染まる２，３，５‐トリフェニル塩化テトラゾリウム（ＴＴＣ）を使用して行った。脳の断面は、前頭極から１ｍｍのところから、皮小脳境界部のすぐ吻側まで取った。コンピューターによる画像解析を使用して、梗塞量を計算した。つまり、各ＴＴＣ染色された前頭断面の後面をデジタル画像処理し（Ｌｏａｔｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、メリーランド州ウェストミンスター）、虚血による損傷領域を定量した（平方ミリメートル）。
【０１１６】
４．結果
４．１ インビトロ研究
４．１．１ ＰＡＮ‐８１１の神経毒性
結果を図１に示す。基本的にＰＡＮ‐８１１は１００μＭまでの濃度でわずかな毒性を示しただけであった。最大毒性は、テストした最高濃度で７．８％にすぎなかった（図８を参照）。
【０１１７】
４．１．２ ＰＡＮ‐８１１による神経保護
ＰＡＮ‐８１１は異なる興奮毒性発作からニューロンを顕著に保護することが分かった（図２）。１０μＭのＰＡＮ‐８１１でニューロンを事前処理することで、３時間の低酸素／低血糖により誘導されるダメージから（９２％保護）、１００μＭのグルタミン酸（最高７５％）、１μＭのスタウロスポリン、タンパク質キナーゼＣの阻害剤およびアポトーシス誘導剤（最高４７％）、およびナトリウムチャンネル阻害剤である１０μＭのベラトリジン（最高３９％）から細胞を保護した。図９を参照のこと。
【０１１８】
４．２ インビボ研究
この実験の結果を表３に示す。当該実験には合計３６匹のラットを使用したが、そのうち１１匹は以下の理由により除外した。４匹は出血を併発しない重度の卒中で死亡したため、４匹は亜急性の出血のため（うち３匹は２４時間以内に死亡）、１匹は術中に火災訓練があったため、１匹は統計的に異常値を示したため、および１匹はハロタンの過剰投与により死亡したため除外。死亡した７匹のうち（４匹はＳＡＨを伴わない重度の卒中、３匹はＳＡＨを伴う）、６匹は未処理の（媒体）ラットであり、１匹のみをＰＡＮ‐８１１で処理した。媒体処理したラットは、１９８．７５〜３５５．８１の範囲で２９２．９６ｍｍ3のわずかな梗塞量を示した。ＰＡＮ‐８１１処理したラットは、４２．３６〜３８７．０８の範囲で２２５．８５ｍｍ3のわずかな梗塞量を示した。これは２３％（ｐ＜０．０５）の神経保護を示す。理由はまだ明らかになっていないが、正常に測定される対照群においてさらに重度の損傷が観察された。従って、ＰＡＮ‐８１１処理した動物の梗塞サイズは、著名な神経保護に期待されるサイズよりも大きい。この問題に関わらず、両方の処理群は良好な生存能力を示し（ＳＥＭの１０％以下）、そうでない場合でも公開済みの我々の研究の大部分よりも優れていた。
【０１１９】
５．結論
１１．１ ＰＡＮ‐８１１はインビトロおよびインビボモデルシステムにおいて優れた耐性を示し、比較的非毒性である。
【０１２０】
１１．２ １０μＭのＰＡＮ‐８１１でニューロンを事前処理すると、神経変性につながる興奮毒性発作に対して顕著な保護を提供した。
【０１２１】
１１．３ 一時的な局所性脳虚血前の１０分間に、ＰＡＮ‐８１１（１ｍｇ／ｋｇ）を単回投与してラットを事前処理すると、平均梗塞量が２３％減少した。
【０１２２】
６．参照文献
６．１文献
５．１．１．Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＡＪ， Ｄａｖｅ ＪＲ， Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ＪＢ， Ｌｉｎ Ｙ， ＭｃＣａｂｅ ＲＴ， ａｎｄ Ｔｏｒｔｅｌｌａ ＦＣ． （２０００） Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｗｉｎｄｏｗ ｏｆ ｔｈｅ ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ｃｏｎａｎｔｏｋｉｎ−Ｇ： ｉｎ ｖｉｔｒｏ （ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ｎｅｕｒｏｎｓ） ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ （ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｆｏｃａｌ ｂｒａｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉａ） ｓｔｕｄｉｅｓ． Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ． Ｊｕｌ；２９４（１）：３７８−８６。
【０１２３】
【表３】
【０１２４】
実施例５
ＰＡＮ‐８１１による過酸化水素誘導酸化的ストレスからのニューロン保護
１．０ 目的
本研究の目的は、アルツハイマー病に関連する酸化的ストレスの細胞ベースモデルにおけるＰＡＮ‐８１１の神経保護剤としての有効性を判定することである。神経保護および細胞毒性を判別する。様々な溶媒をテストして、ＰＡＮ‐８１１の送達用媒体としての適性を判断した。
【０１２５】
２ 材料および方法
２．１ 材料
・ 神経細胞用基礎培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
・ Ｂ２７‐ＡＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
・ ＰＡＮ‐８１１（Ｖｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）
・ 過酸化水素（Ｃａｌｉｂｉｏｃｈｅｍ社）
・ ＥｔＯＨ（Ｓｉｇｍａ社）
・ ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ社）
・ ＰＥＧ‐３００（Ｓｉｇｍａ社）
・ ＭＴＳ試験キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）
２．２ 装置
・ バランス（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ， Ｉｎｃ．）
・ 可調整ピペット（Ｆｉｎｎｐｉｐｅｔｔｅ社）
・ 細胞培養フード（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｏｒｍａ社）
・ 細胞培養器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｏｒｍａ社）
・ プレートリーダー（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ Ｍｏｄｅｌ５５０）
２．３ 研究デイン
２．３．１ 細胞の分離および受容
初代皮質ニューロンを１７日齢のラット胚脳から分離し、９６ウェルプレート上に標準神経細胞用基礎培地中５０，０００細胞／ウェルの密度で２〜３週間播種した。培地の半量を、抗酸化剤を含まない新しい神経細胞用基礎培地と２回置き換えた。
【０１２６】
２．３．２ ＰＡＮ‐８１１および過酸化水素による処理
ＰＡＮ‐８１１を１ｍｇ／ｍｌ（〜５ｍＭ）のＥｔＯＨあるいはＤＭＳＯのいずれか、５ｍｇ／ｍｌ（〜２５ｍＭ）のＰＥＧ‐３００／ＥｔＯＨ（７０％／３０％）に溶解し、さらに培地で最終濃度１μＭ、５μＭ、２０μＭ、および５０μＭまで希釈した。ニューロンをＰＡＮ‐８１１または媒体で２４時間事前処理し、その後過酸化水素（最終濃度６０〜７０μＭ）によって誘引された酸化的ストレスをかけた。対照には、未処理の細胞（ＰＡＮ‐８１１および過酸化水素処理を行っていない細胞）、ＰＡＮ‐８１１のみで処理した細胞、ＰＡＮ‐８１１ではなく過酸化水素に曝露された細胞を含む。未処理の細胞を対照として使用し、ニューロンの毒性および向上した生存能力の両方を評価した。各試験は３回繰り返し行った。等量の溶媒（ＥｔＯＨ、ＤＭＳＯ，およびＰＥＧ‐３００／ＥｔＯＨ）を細胞に加え、当該試験に対する溶媒の効果をテストした。
【０１２７】
２．３．３．細胞機能の評価
２４時間後、標準ＭＴＳ試験（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して、培養物の生存能力およびミトコンドリア作用を評価した。製造者のプロトコルは以下のとおりである。
【０１２８】
３．結果
３．１ 実験１
研究デザインに記載の手順に従って実験を行った。処理の最後に、すべての処理および媒体を、Ｂ２７（‐ＡＯ）を加えた１００μＭの新しい加温済神経細胞用基礎培地と置き換えた。５％ＣＯ2を含む３７℃の培養器に当該プレートを１時間戻し、その後２０μｌのＭＴＳ試薬を各ウェルに添加して、５％ＣＯ2を含む３７℃の培養器でさらに２時間プレートを培養した。各ウェルの４９０ｎｍ吸収度をＢｉｏＲａｄプレートリーダー（モデル５５０）で記録した。媒体のみを含むウェルはブランクとして使用した。各データポイントは、３つの個別の試験ウェルの平均である。未処理の細胞を対照として使用し、細胞の生存能力および神経保護能力を算出した。この一連の研究には３週齢の初代培地を使用した。結果については図１０を参照のこと。
【０１２９】
３．２ 実験２
実験１と同様の手順に従って実験を行った。この研究には２週齢の初代培地を使用した。結果については図１１を参照のこと。
【０１３０】
４．考察
３つの溶媒すべてが１〜１０μＭのＰＡＮ‐８１１最終濃度に対応する希釈での定量法において最低限の効果を示した。ＤＭＳＯはＰＡＮ‐８１１の最終濃度２０μＭまたはそれ以上に対応する希釈である程度の神経保護を示した。ＥｔＯＨおよびＰＥＧ‐３００／ＥｔＯＨは、最終濃度５０μＭのＰＡＮ‐８１１に対応する希釈である程度の神経保護能力を示した。ＰＡＮ‐８１１は、１〜１０μＭで良好な神経保護能力を示した。ＰＡＮ‐８１１は、ＥｔＯｈ担体と比較して、ＰＥＧ‐３００／ＥｔＯＨ中で良好な溶解度を示した。
【０１３１】
５．結論
ＰＡＮ‐８１１は、最終濃度１〜１０μＭで良好な神経保護能力を示した。ＰＥＧ‐３００／ＥｔＯＨは、１〜２０μＭのＰＡＮ‐８１１に対応する希釈での定量法でほとんど干渉を示さなかったことから、テストした３つの溶媒の中でＰＡＮ‐８１１に最も適した溶媒である。
【０１３２】
当業者であれば、本発明が目的の遂行に適しており、本来の結果および利点に加えて、上記の結果および利点が得られることは容易に理解できるであろう。本発明の実施において、本発明の精神あるいは範囲から逸脱することなく、様々な修正および変更を行うことができることは当業者には明らかである。特許請求の範囲に定義される発明の精神に包含される変更および他の使用は、当業者であれば容易に思い当たるものである。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】図１は、ＰＡＮ‐８１１（Ａ）あるいは周知の神経保護剤であるビタミンＥ（Ｂ）、リポ酸（Ｃ）、またはイチョウの葉（Ｄ）を用いて事前処理を行い、過酸化水素で処理した後の細胞の生存能力（左パネル）および神経保護能力（右パネル）を図解している。
【図２】図２は、神経細胞におけるＲＯＳ産生に対するＰＡＮ‐８１１の効果（Ａ）、神経細胞における過酸化水素誘導ＲＯＳ産生に対するＰＡＮ‐８１１の効果（Ｂ）、神経細胞における基礎レベルのＲＯＳ産生に対するＰＡＮ‐８１１の効果を図解している。
【図３】図３は、低酸素状態における神経毒性のグルコース濃度依存を示す図である。
【図４】図４は、神経保護剤ＭＫ８０１およびＰＡＮ‐８１１を使用した場合としない場合の低酸素状態における細胞の組織学的写真を示す。
【図５】図５は、正常酸素状態および低酸素状態におけるＰＡＮ‐８１１の神経保護効果を示す図である。
【図６】図６は、低酸素／低血糖状態におけるＰＡＮ‐８１１の毒性を示す図である。
【図７】図７は、軽度の低酸素／低血糖状態におけるＰＡＮ‐８１１の神経細胞死に対する保護効果を示す図である。
【図８】図８は、皮質ニューロンをＰＡＮ‐８１１で２４時間処理した場合のＰＡＮ‐８１１の神経毒性を示す図である。
【図９】図９は、虚血による毒性に対するＰＡＮ‐８１１の保護効果を示す図である。
【図１０】図１０は、ＰＡＮ‐８１１または溶媒で事前処理し、過酸化水素で処理した後の細胞生存を示す図である。
【図１１】図１１は、ＰＡＮ‐８１１または溶媒で事前処理し、過酸化水素で処理した後の細胞生存を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、アルツハイマー病などの変性疾患に加えて、突然の酸素喪失による神経疾患および心疾患を含む虚血関連疾患および障害の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
中枢神経系（ＣＮＳ）は脊髄、脳および網膜で構成され、極めて複雑な機能を遂行できるネットワークを形成する何兆もの神経細胞（ニューロン）を含む。ＣＮＳニューロンは、生存してその生理的機能を果たすためにエネルギーを必要とする。ＣＮＳニューロンにとって唯一のエネルギー源が血液によって運ばれるグルコースと酸素であることは一般に認識されている。ＣＮＳ全体または一部への血液供給が遮断され、それによってニューロンから酸素とグルコースが奪われると（虚血として知られる状態）、それらが奪われたニューロンは急速に変性する。この不適切な血流状態は、臨床神経学では一般に「脳卒中」として知られている。例えば呼吸停止、窒息または溺水によって脳への酸素供給のみが遮断される場合、当該状態を「低酸素」という。例えば、糖尿病患者がインシュリンを大量に摂取した時など、グルコース供給のみが遮断される場合は、当該状態を「低血糖」という。これらの状態はすべてエネルギーの欠乏によって生じ、臨床医学では脳障害を起こしうる原因として認識されている。以下では、「エネルギー欠乏」または「虚血」という語を同義的に使用して、ＣＮＳへのエネルギー障害を伴うこれらの状態を示す。
【０００３】
近年、神経科学者はエネルギー欠乏が引き起こす神経変性の機序についての理解を深めている。虚血状態が生じると、正常で健康な状況下において重要な興奮性神経伝達物質としてＣＮＳで機能するグルタミン酸が、「興奮毒性」と呼ばれる 神経毒性を発揮することは知られている。通常グルタミン酸は細胞内に閉じ込められており、隣接するニューロン上のグルタミン酸受容体と連絡する目的でシナプス接合部の神経細胞から少量放出されるだけである。これによって、神経シグナルが受容体を有する細胞に送られる。正常な状態で、シナプス接合部の細胞外液に放出されるグルタミン酸は、極めて効率的な輸送プロセスによって数ミリ秒以内にニューロン内へ送り戻される。
【０００４】
グルタミン酸の興奮毒性は、当該輸送プロセスが正常に機能している限り抑制されている。しかし、この輸送プロセスはエネルギー依存であるため、虚血状態（エネルギー欠乏状態）では、グルタミン酸を輸送できず、伝達物質として放出されるグルタミン酸分子が細胞外シナプス液に蓄積する。これによって、グルタミン酸が絶えずその興奮性受容体と接触することになり、それら受容体を過度に刺激する。この状況によって、ニューロンが文字どおり興奮死する可能性がある。さらに二つの要素が事態を複雑化し悪化させる。一つは、過度に刺激されたニューロンが他のシナプス接合部でグルタミン酸を過剰に放出するため、さらに多くのニューロンが過度に刺激され、虚血の初期域を超える神経毒性カスケードに引き込まれてしまうこと。もう一つは、過度に刺激されたニューロンが使用可能なグルコースまた酸素の供給を通常よりも速く利用し始めるため、これらの限られたエネルギー源の消耗が加速し、グルタミン酸輸送プロセスの障害が進行することである。このため脳卒中、心不全、呼吸停止、低酸素または低血糖などのエネルギー欠乏状態が、複合機序 によって脳にダメージを与える。初期原因機序は虚血そのものであるが、これがグルタミン酸輸送システムの障害、およびその後の脳障害に大きく関与する一連のグルタミン酸媒介の興奮毒性イベントを引き起こす。
【０００５】
前記の状態に加え最近では、ニューロンがエネルギー物質（グルコースおよび酸素）を利用してそのエネルギーレベルを維持する能力における様々な障害も、ニューロン死につながる興奮毒性プロセスを誘発し得ることが認識されている。これはアルツハイマー認知症、パーキンソニズム、ハンチントン舞踏病および筋萎縮性側索硬化症などの神経系疾患において神経変性を引き起こす機序であると仮定されている。例えば、細胞内エネルギー代謝の不全を示す証拠がアルツハイマー病患者の脳から生検で取り出された組織例において明らかになっている。これは、アルツハイマー病においてグルタミン酸の興奮毒性誘発し、ニューロン死を引き起こす原因機序として提示されており、そのためこの機序はエネルギー関連興奮毒性プロセスであると説明されている。また、細胞内エネルギー代謝の内因性不全を示す証拠がパーキンソニズムおよびハンチントン舞踏病において報告されている。このため、これらの疾患における神経変性を回避するための合理的な治療方針には、エネルギー欠乏を解消する方法または興奮毒性神経変性を回避する方法が含まれる。
【０００６】
神経変性病は、ほとんどの場合神経細胞死につながる正常な神経機能の変化を特徴とする一群の疾患である（これら疾患の大部分は、特に末期段階で深刻な神経細胞の欠損を伴う）。大部分の例において、その病因学的原因は不明であるが、漸進的に発達する。神経変性病は結果として、例外なくその患者およびさらに広いコミュニティーに多大な精神的、肉体的、経済的負担を伴う。
【０００７】
特にアルツハイマー病またはパーキンソン病において、神経変性障害を進行させる最も一貫した危険因子は加齢である。過去１００年で、先進国における６５歳以上の人口成長率は 全人口の成長率をはるかに上回っている。このため、次の１００年で高齢者人口が２倍になり、それに伴ってある種の神経変性障害に苦しむ人の数も倍増することが予測できる。これらの障害を引き起こす病気に関連する患者、介護者、および社会への精神的、肉体的、経済的負担の増加が容易に予見できるため、この予測は、医療界および立法者の間で高まっている懸念の中心となっている。今日までに幾つかの薬剤が承認され、幾つかの神経変性病の症状をある程度は軽減しているが、それらの薬剤を長期的に使用すると、しばしば衰弱といった副作用を伴うため、どの承認薬も変性プロセスの進行を止めることができないという事実が問題を悪化させている。これに伴い、神経変性病におけるニューロン死の原因および機序に関する我々の知識不足によって、効果的な予防療法または保護療法の開発が妨げられている。この暗い見通しにも関わらず、幾つかの 神経生物学的解明により、数々の神経変性障害の秘密が明らかになり、効果的な治療方法が使用可能になる日が近づきつつある。
【０００８】
ＣＮＳ虚血に関連する神経細胞の損傷を予防または軽減する方法の開発において、重大な進歩が見られる。この分野では、受容体特異的な拮抗薬（医薬用語では、その受容体での作用を誘発することなく細胞表面にある特定の受容体を占有し、ブロックする薬をその受容体の拮抗薬と呼ぶ）を使用して、グルタミン酸受容体での興奮作用を抑制する方法に関して最も活発な研究が行われている。興奮毒性神経変性を調節できるグルタミン酸受容体は、大まかに「ＮＭＤＡ」受容体および「非ＮＭＤＡ」受容体と呼ばれる２つの広範なカテゴリーに分類される。ＮＭＤＡ受容体は、Ｎ‐メチル‐Ｄ‐アスパラギン酸にちなんで名づけられており、脳内では自然発生しないが、特定のグルタミン酸受容体と強固に結合することが発見されているため、「ＮＭＤＡ」受容体と呼ばれる薬物である。最近では、グルタミン酸受容体の「非ＮＭＤＡ」類がＫＡ（カイニン酸）受容体およびＡＭＰＡ受容体（旧称ＱＵＩＳ受容体）と呼ばれるさらに２つの明確なカテゴリーに細分化されている。
【０００９】
インビトロ試験および多くのインビボ動物モデルの両方において、ＮＭＤＡ受容体拮抗薬がＣＮＡ虚血性神経変性を防ぐことができることが繰返し証明されているが、最近の様々な研究結果から、ＮＭＤＡ拮抗薬は「広範囲の虚血」として知られる主要タイプの虚血には効果がなく、「局所的な」虚血として知られる別のタイプの虚血において部分的な保護しか提供しないことが明らかになっている。さらに、有効な保護を提供するには、虚血の発症後直ちにＮＭＤＡ拮抗薬を投与する必要があると考えられる。非ＮＭＤＡ拮抗薬に関して実験から証明されていることは限られているが、数例のインビボ動物実験では、虚血の発症後に適用した場合でも、これらの拮抗薬が虚血性神経変性に対して相当の保護作用を及ぼし得ることが提示されている。
【００１０】
ＮＭＤＡまたは非ＮＭＤＡのいずれかを単独で使用すると、ＣＮＳ虚血に対して相当の保護作用を提供できるという説がある一方、一連の証拠から、ＮＭＤＡまたは非ＮＭＤＡ拮抗薬のいずれかを単独使用することで得られる保護レベルは比較的低いことが提示されている。
【００１１】
虚血性神経変性に対する神経保護薬としてのグルタミン酸受容体拮抗薬の重大な限界は、それらが変性に対して一時的にニューロンを保護するだけであって、エネルギー欠陥について、またはそのエネルギー欠陥に対して二次的に発生するその他の異常については何も改善しない。そのため、これらの拮抗薬は実験動物モデルにおける虚血性神経変性に対してある程度の保護を提供するが、その保護は部分的でしかなく、そのような部分的な保護は、上記のように変性の発生時期を遅らせるだけである。しかしながら、遅延期間中に補足的および／または継続的な保護を提供するために適用できる他の薬物あるいは手順がある場合は、変性の発生を遅らせることが大変有意義であることに注記することが重要である。
【００１２】
大部分の虚血研究において適切に報告されていない重要な要素の一つは、有害な（虚血性）イベントに関連する薬物投与のタイミングについてである。これは重要な考慮事項である。予測可能な虚血イベントもあるが（例えば、開胸手術に伴う）、大部分は予測できない。またほとんどの場合、治療は虚血イベント中あるいはその後に開始されるだけである。ＣＮＳ細胞は虚血の発症直後に変性し始めるため、ＣＮＳニューロンが変性を開始した後に適用する効果的な新しい神経保護方法が明らかに必要である。
【００１３】
別の重要な考慮事項は、虚血が一時的（例えば、心不全の発作中）であるか、または永続的（例えば、ＣＮＳ血管の血栓または塞栓による閉塞に続く）であるかということである。一時的な虚血であれば、酸素とグルコースをＣＮＳに運ぶ血液供給がすぐに回復し、神経変性あるいは虚血障害の進行を防ぐ薬剤が血液循環によって虚血状態の組織に届けられる。
【００１４】
脳のある領域への血液供給が凝結塊によって永続的に遮断される場合、虚血状態の組織から酸素とグルコースが永続的に奪われ、血管が遮断されて薬剤が虚血状態の組織に送達されないため、現行の方法では虚血状態の領域の中心に起こる神経変性を防ぐことは不可能である。しかしながら、虚血状態の領域の周辺端には周縁部として知られ、隣接するＣＮＳ領域から血液を受け取る大きな組織領域があり、この組織領域が薬物治療の標的となり得る。さらに、心臓発作を起こした患者の治療に現在使用されている血液凝固を溶解する薬剤（ストレプトキナーゼおよび組織プラスミノゲン活性因子などの血栓溶解剤）が、発作後ＣＮＳへの血液供給を回復できるかについて研究開発されている。そのような薬剤がヒトのＣＮＳに対して広く使用可能になれば、それらを使用して血管を開き、虚血状態のＣＮＳ組織が酸素およびグルコースだけでなく、神経変性を防ぎ、あるいは虚血障害からの回復を促進できる本明細書に開示の薬剤を受け取ることができる。
【００１５】
最後に、眼の網膜に血液を供給する主要な動脈が血栓によって閉塞するといった特別な状況があるが、これは本明細書に開示する当該薬剤により救済することができる。この血管が閉塞した場合は、本発明の薬剤を眼の硝子体（例えば、眼球内の透明な液体）に直接注入することによって、当該薬剤を虚血状態の網膜に送達することができる。当該薬剤は硝子体から網膜に素早く拡散する。
【００１６】
急性あるいは慢性に関わらず、虚血イベントの結果として起こる疾病／障害を予防または治療できる薬剤の開発が強く望まれる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
発明の要旨
本発明は、化学式Ｉ
【００１８】
【化１】
【００１９】
の化合物またはそのプロドラッグを虚血関連状態の治療を必要とする患者に投与することを含む虚血関連状態の治療法方であって、
式中、
Ｅは酸素、硫黄、ＮＨまたはＮ‐Ｃ1-6アルキルであり、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4は水素、任意で置換されるアルキル、任意で置換されるアルケニル、任意で置換されるアルキニル、任意で置換されるシクロアルキル、任意で置換されるハロアルキル、任意で置換されるアリール、任意で置換されるアミノアルキル、任意で置換されるヒドロキシアルキル、任意で置換されるアルコキシアルキル、および任意で置換されるアルカノイルで構成されるグループから独立して選択され、あるいはＺ
ＮＲ1Ｒ2を結合してＮ、Ｏ、およびＳから選択されるゼロ、１つ、または２つの追加環へテロ原子で構成されてよい３から７員環を形成し、および
ＨＥＴはＮ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４環へテロ原子で構成され、任意で置換される５から７員へテロアリール残基である化合物、あるいはそのプロドラッグを虚血関連状態の治療を必要とする患者に投与することを含む、虚血関連状態の治療方法に関する。
【００２０】
好ましい実施例は、ＨＥＴが化学式
【００２１】
【化２】
【００２２】
の残基であって、
式中、
ｍはゼロまたは１であり、
ｍがゼロの場合は、Ｚ1、Ｚ2、およびＺ3がＮ、Ｏ、Ｓ、またはＣＲから独立して選択され、あるいは
ｍが１の場合は、Ｚ1、Ｚ2、およびＺ3がＮまたはＣＲから独立して選択され、
Ｒは水素、ハロゲン化物、ヒドロキシ、チオール、アミノ、ヒドロキシアミノ、モノ‐Ｃ1-8アルキルアミノ、ジ（Ｃ1-8アルキル）アミノ、Ｃ1-8アルコキシ、Ｃ1-8アルキル、Ｃ2-8アルケニル、およびＣ2-8アルキニルで構成されるグループから発現ごとに独立して選択され、また
ｘがゼロから４の整数である本発明の方法に使用される組成に関する。
【００２３】
さらに好ましい実施例は、
ＨＥＴが任意で置換されるピリジル、任意で置換されるピラジニル、ピリミジニル、ピロリル、イミダゾリル、トリアゾリル、オキサゾリル、チオキサゾリルで構成されるグループから選択される残基であり、また
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4が水素、Ｃ1-8アルキル、Ｃ2-8アルケニル、Ｃ2-8アルキニル、Ｃ3-8シクロアルキル、Ｃ1-8ハロアルキル、Ｃ6-10アリール、アミノ‐Ｃ1-8アルキル、ヒドロキシ‐Ｃ1-8アルキル、Ｃ1-8アルコキシ‐Ｃ1-8アルキル、およびＣ1-8アルカノイルで構成されるグループから独立して選択され、あるいは
ＮＲ1Ｒ2を結合してＮ、Ｏ、およびＳから選択されるゼロ、１つ、または２つの追加環へテロ原子で構成されてよい３から７員環を形成する組成の使用を含む。
【００２４】
本発明の別の実施例は、化学式ＩＩ
【００２５】
【化３】
【００２６】
の化合物、あるいはそのプロドラッグを虚血関連状態の治療を必要とする患者に投与することを含む虚血関連状態の治療方法であって、
式中、
Ｒ，Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4は水素、任意で置換されるアルキル、任意で置換されるアルケニル、任意で置換されるアルキニル、任意で置換されるシクロアルキル、任意で置換されるハロアルキル、任意で置換されるアリール、任意で置換されるアミノアルキル、任意で置換されるヒドロキシアルキル、任意で置換されるアルコキシアルキル、および任意で置換されるアルカノイルで構成されるグループから独立して選択され、あるいは
ＮＲ1Ｒ2を結合してＮ、Ｏ、およびＳから選択されるゼロ、１つ、または２つの追加環へテロ原子で構成さてよい３から７員環を形成し、また
ｘがゼロから５の整数であって、
さらに詳しくは、
式中、
ｘがゼロ、１、２、または３であり、
Ｒ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4が水素、Ｃ1-8アルキル、Ｃ2-8アルケニル、Ｃ2-8アルキニル、Ｃ3-8シクロアルキル、Ｃ1-8ハロアルキル、Ｃ6-10アリール、アミノ‐Ｃ1-8アルキル、ヒドロキシ‐Ｃ1-8アルキル、Ｃ1-8アルコキシ‐Ｃ1-8アルキル、およびＣ1-8アルカノイルで構成されるグループから独立して選択され、あるいは
ＮＲ1Ｒ2を結合してＮ、Ｏ、およびＳから選択されるゼロ、１つ、または２つの追加環へテロ原子で構成されてよい３から７員環を形成する化合物、またはそのプロドラッグを虚血関連状態の治療を必要とする患者に投与することを含む、虚血関連状態の治療方法に関する。
【００２７】
本発明のさらに別の実施例は、化学式ＩＩＩ
【００２８】
【化４】
【００２９】
の化合物、あるいはそのプロドラッグを虚血関連状態の治療を必要とする患者に投与することを含む虚血関連状態の治療方法であって、
式中、
Ｒ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4は水素、Ｃ1-8アルキル、Ｃ2-8アルケニル、Ｃ2-8アルキニル、Ｃ3-8シクロアルキル、Ｃ1-8ハロアルキル、Ｃ6-10アリール、アミノ‐Ｃ1-8アルキル、ヒドロキシ‐Ｃ1-8アルキル、Ｃ1-8アルコキシ‐Ｃ1-8アルキル、およびＣ1-8アルカノイルで構成されるグループから独立して選択され、あるいは
ＮＲ1Ｒ2を結合してＮ、Ｏ、およびＳから選択されるゼロ、１つ、または２つの追加環へテロ原子で構成されてよい３から７員環を形成し、および
Ｒ6は水素、ヒドロキシ、アミノ、またはＣ1-8アルキルであり、
Ｒ5およびＲ7は水素、ハロゲン化物、ヒドロキシ、チオール、アミノ、ヒドロキシアミノ、モノ‐Ｃ1-8アルキルアミノ、ジ‐（Ｃ1-8アルキル）アミノ、 Ｃ1-8アルコキシ、Ｃ1-8アルキル、Ｃ2-8アルケニル、およびＣ2-8アルキニルで構成されるグループから独立して選択される化合物またはプロドラッグを虚血関連状態の治療を必要とする患者に投与することを含む虚血関連状態の治療方法に関する。
【００３０】
本発明の最も好ましい実施例は、以下の化学式
【００３１】
【化５】
【００３２】
のＰＡＮ８１１（３‐アミノピリジン‐２‐カルボキサデルヒド・チオセミカルバゾン）を虚血関連状態の治療を必要とする患者に投与することを含む、虚血関連状態の治療方法に関する。
【００３３】
本発明の好ましい実施例は、アルツハイマー病、パーキンソン病、冠動脈バイパス術、心停止による全脳虚血、局所性脳梗塞、脳出血、出血性梗塞、 高血圧性出血、頭蓋内血管異常の破裂による出血、頭蓋内動脈瘤の破裂によるくも膜下出血、高血圧性脳症、脳虚血につながる頸動脈狭窄症または閉塞、心原性血栓塞栓症、脊髄卒中および脊髄損傷、アテローム性動脈硬化などの脳血管障害、脈管炎、黄斑変性症、心筋梗塞、心虚血および上室性頻拍性不整脈を含むが、これらに限定されない特定の虚血関連状態の治療方法に関する。
【００３４】
発明の詳細な説明
本発明の特徴および他の詳細を特許請求の範囲において詳しく記載する。本発明の特定の実施例を図によって示すが、それらが本発明を制限するものでないことを理解されたい。本発明の主要な特徴は、本発明の範囲を逸脱することなく様々な実施例において機能することができる。
【００３５】
虚血関連障害／疾病の病理は、一般に網膜症、急性腎不全、心筋梗塞および脳卒中などで血管が狭窄あるいは閉塞されて起こる体内器官、組織または身体部分に対する血液供給の減少に関わる。それらは急性イベント（例えば、心臓発作）またはイベントの慢性進行（例えば、神経変性病）の結果として起こる。
【００３６】
本発明は、化学式Ｉ
【００３７】
【化６】
【００３８】
の化合物またはそのプロドラッグを虚血関連状態の治療を必要とする患者に投与することを含む虚血関連状態の治療法方であって、
式中、
Ｅは酸素、硫黄、ＮＨまたはＮ‐Ｃ1-6アルキルであり、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4は水素、任意で置換されるアルキル、任意で置換されるアルケニル、任意で置換されるアルキニル、任意で置換されるシクロアルキル、任意で置換されるハロアルキル、任意で置換されるアリール、任意で置換されるアミノアルキル、任意で置換されるヒドロキシアルキル、任意で置換されるアルコキシアルキル、および任意で置換されるアルカノイルで構成されるグループから独立して選択され、あるいは
ＮＲ1Ｒ2を結合してＮ、Ｏ、およびＳから選択されるゼロ、１つ、または２つの追加環へテロ原子で構成されてよい３から７員環を形成し、および
ＨＥＴはＮ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４環へテロ原子で構成され、任意で置換される５から７員へテロアリール残基である化合物、あるいはそのプロドラッグを虚血関連状態の治療を必要とする患者に投与することを含む、虚血関連状態の治療方法に関する。
【００３９】
好ましい実施例は、ＨＥＴが化学式
【００４０】
【化７】
【００４１】
の残基であって、
式中、
ｍはゼロまたは１であり、
ｍがゼロの場合は、Ｚ1、Ｚ2、およびＺ3がＮ、Ｏ、Ｓ、またはＣＲから独立して選択され、あるいは
ｍが１の場合は、Ｚ1、Ｚ2、およびＺ3がＮまたはＣＲから独立して選択され、
Ｒは水素、ハロゲン化物、ヒドロキシ、チオール、アミノ、ヒドロキシアミノ、モノ‐Ｃ1-8アルキルアミノ、ジ（Ｃ1-8アルキル）アミノ、Ｃ1-8アルコキシ、Ｃ1-8アルキル、Ｃ2-8アルケニル、およびＣ2-8アルキニルで構成されるグループから発現ごとに独立して選択され、また
ｘがゼロから４の整数である本発明の方法に使用される組成に関する。
【００４２】
さらに好ましい実施例は、
ＨＥＴが任意で置換されるピリジル、任意で置換されるピラジニル、ピリミジニル、ピロリル、イミダゾリル、トリアゾリル、オキサゾリル、チオキサゾリルで構成されるグループから選択される残基であり、また
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4が水素、Ｃ1-8アルキル、Ｃ2-8アルケニル、Ｃ2-8アルキニル、Ｃ3-8シクロアルキル、Ｃ1-8ハロアルキル、Ｃ6-10アリール、アミノ‐Ｃ1-8アルキル、ヒドロキシ‐Ｃ1-8アルキル、Ｃ1-8アルコキシ‐Ｃ1-8アルキル、およびＣ1-8アルカノイルで構成されるグループから独立して選択され、あるいは
ＮＲ1Ｒ2を結合してＮ、Ｏ、およびＳから選択されるゼロ、１つ、または２つの追加環へテロ原子で構成されてよい３から７員環を形成する組成の使用を含む。
【００４３】
本発明の別の実施例は、化学式ＩＩ
【００４４】
【化８】
【００４５】
の化合物、あるいはそのプロドラッグを虚血関連状態の治療を必要とする患者に投与することを含む虚血関連状態の治療方法であって、
式中、
Ｒ，Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4は水素、任意で置換されるアルキル、任意で置換されるアルケニル、任意で置換されるアルキニル、任意で置換されるシクロアルキル、任意で置換されるハロアルキル、任意で置換されるアリール、任意で置換されるアミノアルキル、任意で置換されるヒドロキシアルキル、任意で置換されるアルコキシアルキル、および任意で置換されるアルカノイルで構成されるグループから独立して選択され、あるいは
ＮＲ1Ｒ2を結合してＮ、Ｏ、およびＳから選択されるゼロ、１つ、または２つの追加環へテロ原子で構成されてよい３から７員環を形成し、また
ｘがゼロから５の整数であって、
さらに詳しくは、
式中、
ｘがゼロ、１、２、または３であり、
Ｒ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4が水素、Ｃ1-8アルキル、Ｃ2-8アルケニル、Ｃ2-8アルキニル、Ｃ3-8シクロアルキル、Ｃ1-8ハロアルキル、Ｃ6-10アリール、アミノ‐Ｃ1-8アルキル、ヒドロキシ‐Ｃ1-8アルキル、Ｃ1-8アルコキシ‐Ｃ1-8アルキル、およびＣ1-8アルカノイルで構成されるグループから独立して選択され、あるいは
ＮＲ1Ｒ2を結合してＮ、Ｏ、およびＳから選択されるゼロ、１つ、または２つの追加環へテロ原子で構成されてよい３から７員環を形成する化合物、またはそのプロドラッグを虚血関連状態の治療を必要とする患者に投与することを含む、虚血関連状態の治療方法に関する。
【００４６】
本発明のさらに別の実施例は、化学式ＩＩＩ
【００４７】
【化９】
【００４８】
の化合物あるいはそのプロドラッグを虚血関連状態の治療を必要とする患者に投与することを含む虚血関連状態の治療方法であって、
式中、
Ｒ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4は水素、Ｃ1-8アルキル、Ｃ2-8アルケニル、Ｃ2-8アルキニル、Ｃ3-8シクロアルキル、Ｃ1-8ハロアルキル、Ｃ6-10アリール、アミノ‐Ｃ1-8アルキル、ヒドロキシ‐Ｃ1-8アルキル、Ｃ1-8アルコキシ‐Ｃ1-8アルキル、およびＣ1-8アルカノイルで構成されるグループから独立して選択され、あるいは
ＮＲ1Ｒ2を結合してＮ、Ｏ、およびＳから選択されるゼロ、１つ、または２つの追加環へテロ原子で構成されてよい３から７員環を形成し、および
Ｒ6は水素、ヒドロキシ、アミノ、またはＣ1-8アルキルであり、
Ｒ5およびＲ7は水素、ハロゲン化物、ヒドロキシ、チオール、アミノ、ヒドロキシアミノ、モノ‐Ｃ1-8アルキルアミノ、ジ‐（Ｃ1-8アルキル）アミノ、 Ｃ1-8アルコキシ、Ｃ1-8アルキル、Ｃ2-8アルケニル、およびＣ2-8アルキニルで構成されるグループから独立して選択される化合物またはプロドラッグを虚血関連状態の治療を必要とする患者に投与することを含む、虚血関連状態の治療方法に関する。
【００４９】
本発明の最も好ましい実施例は、以下の化学式
【００５０】
【化１０】
【００５１】
のＰＡＮ８１１（３‐アミノピリジン‐２‐カルボキサデルヒド・チオセミカルバゾン）を虚血関連状態の治療を必要とする患者に投与することを含む、虚血関連状態の治療方法に関する。
【００５２】
本発明の好ましい実施例は、アルツハイマー病、パーキンソン病、冠動脈バイパス術、心停止による全脳虚血、局所性脳梗塞、脳出血、出血性梗塞、 高血圧性出血、頭蓋内血管異常の破裂による出血、頭蓋内動脈瘤の破裂によるくも膜下出血、高血圧性脳症、脳虚血につながる頸動脈狭窄症または閉塞、心原性血栓塞栓症、脊髄卒中および脊髄損傷、アテローム性動脈硬化などの脳血管障害、脈管炎、黄斑変性症、心筋梗塞、心虚血および上室性頻拍性不整脈を含むが、これらに限定されない特定の虚血関連状態の治療方法に関する。
【００５３】
本発明の方法に有効な化合物の合成方法は、当該技術分野においてよく知られている。そのような合成スキームは、米国特許：５，２８１，７１５、５，７６７，１３４、４，４４７，４２７、５，８６９，６７６および５，７２１，２５９において開示されており、これらは参照することにより全体が本書に組み込まれる。
【００５４】
医薬組成
本発明の別の側面は、本発明の方法に有効なチオセミカルバゾンの医薬組成に関する。本発明の当該医薬組成は、主に本発明の方法に有効な化合物および医薬的に許容し得る担体で構成されている。ここで使用する「医薬的に許容し得る担体」は、あらゆる溶媒、分散媒体、膜、抗菌剤および抗真剤、等張剤および吸収遅延剤、および生理的に適合する同等物を含む。担体の種類は、意図する投与経路に基づいて選択できる。様々な実施例において、当該担体は、静脈、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、経皮あるいは経口投与に適している。医薬的に許容し得る担体は、無菌水溶液あるいは分散液、および無菌注入液または分散液の即時調整用無菌粉末を含む。医薬的に活性の物質にそのような媒体および媒介物を使用することは、当該技術分野においてよく知られている。従来の任意の媒体または媒介物が活性化合物と適合しない場合を除いて、本発明の医薬組成におけるその使用が考慮されている。補足的な活性化合物を当該組成に組み込むこともできる。
【００５５】
通常、治療組成は製造および保存状態において無菌で安定する必要がある。当該組成は、溶媒、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高薬物濃度に適した他の秩序構造として処方することができる。当該担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物を含む溶媒または分散媒体となる。例えばレシチンなどの膜の使用、分散する場合は必要とされる分子サイズの維持、また界面活性剤の使用によって適切な流動性を維持できる。多くの場合、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、あるいは塩化ナトリウムを当該組成に含むことが好まれる。例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンといった吸収遅延剤を組成に含めることによって、注入可能な組成を長期的に吸収させることができる。さらに、例えば徐放ポリマーを含む組成においては、徐放製剤で当該組成を投与することもできる。活性化合物は、埋め込み型およびマイクロカプセル化した送達システムを含む放出制御製剤で高速放出から化合物を保護する担体を用いて生成できる。エチレン酢酸ビニル、無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオーソエステル、ポリ乳酸およびポリグリコール共重合体（ＰＬＧ）などの生分解性、生適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤の多くの生成方法は、当業者には一般に知られている。
【００５６】
無菌の注入溶液は、上記の材料の１つまたは複数を組み合わせた適切な溶媒に必要量の活性化合物を組み込むことによって生成することができ、必要に応じてろ過滅菌を行う。一般に分散液は、基本的な分散媒体および必要とされる上記の他の材料を含む無菌媒体に活性化合物を組み込むことによって生成する。無菌注入溶液生成用無菌粉末の場合、好ましい生成方法は、真空乾燥および事前に無菌ろ過された溶液から活性材料に加えて追加の望ましい材料の粉末を産出する凍結乾燥である。
【００５７】
投与経路によって、酵素、酸、および薬剤を不活性にすることがある他の自然状態の作用から化合物を保護するために、当該化合物を物質でコーティングしてもよい。例えば、酵素阻害剤とともに適切な担体または希釈液において当該化合物を対象に投与するか、またはリポソームなどの適切な担体で投与することができる。医薬的に許容し得る希釈液は、生理食塩水および水性緩衝液を含む。酵素阻害剤は、膵トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＥＰ）およびトラジロールを含む。リポソームは従来のリポソームと同様に、油中水乳剤を含む（Ｓｔｒｅｊａｎら、（１９８４）Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ ７:２７）。分散液はグリセロール、液体ポリエチレングリコール、その混合液、および油中で生成することもできる。従来の保存および使用状態では、微生物の成長を防ぐために保存料を含めて生成してもよい。
【００５８】
当該組成中の活性剤（例えば、１つまたは複数のチオセミカルバゾン）は、好ましくは治療上有効な量の組成で調整される。「治療上有効な量」とは、望ましい治療結果を得て、それによって特定の病状の治療過程に影響を及ぼすのに効果的な量、必要な用量および期間を意味する。治療上有効な量の活性剤は、個人の病状、年齢、性別、および体重などの要素によって、またその個人に望ましい反応を誘引する薬剤の能力によって異なる。用法用量は、最適な治療効果をもたらすうに調整してよい。治療上有効な量は、治療上有益な効果が当該活性剤の毒性または有害な効果を上回る量でもある。別の実施例において、当該活性剤は予防的に有効な量の組成で処方される。「予防的に有効な量」は、望ましい予防効果を得るために効果的な量、必要な用量および期間を示す。一般に、予防的な用量は病気の発症前、または初期段階に使用されるため、予防的に有効な量は治療上有効な量よりも少なくなる。
【００５９】
当該組成における活性化合物の量は、個人の病状、年齢、性別および体重によって変えてよい。用法用量は最適な治療効果をもたらすように調整してよい。例えば、ボーラスを単回投与するか、長期に渡って用量を複数回に分けて投与するか、あるいは治療状況の要件に示されるように、用量の比率を増減させてもよい。容易な投与と用法の統一のために、服用単位フォームとして非経口組成を処方することが特に有効である。ここで使用される服用単位フォームは、治療を受ける哺乳類対象に対する単一の用法に適した物理的不連続単位を示す。各単位は、必要とされる医薬担体と関連して、望ましい治療効果を挙げるよう事前に設定された量の活性化合物を含む。本発明の用法単位フォームに関する仕様は、（ａ）活性化合物固有の特性および得られる特定の治療効果、および（ｂ）個人の治療感受性に対してそのような活性化合物を合成する技術に特有の制限事項に直接依存する。
【００６０】
本発明の化合物は医薬組成に組み込むことができる。ここで当該化合物はそこで唯一の活性剤である。代替として、当該医薬組成は追加の活性剤を含むことができる。例えば、本発明の２つ以上の化合物を組み合わせて使用してもよい。
【００６１】
本発明は、以下の実施例によって詳述されるがそれらに制限されると解釈されるものではない。本出願を通して引用されるすべての参照文献、特許、および公開特許出願の内容は、ならびに図は、参照することにより本書に組み込まれる。
【実施例】
【００６２】
例証
実施例１
ＰＡＮ‐８１１および他の周知の神経保護剤の神経保護能力比較
目的
本研究の目的は、アルツハイマー病関連の酸化的ストレスの細胞ベースモデルにおけるＰＡＮ‐８１１（３‐アミノピリジン‐２‐カルボキサルデヒド・チオセミカルバゾン；Ｃ7Ｈ9Ｎ5Ｓ；ＭＷ＝１９５）の神経保護能力をビタミンＥ、リポ酸、およびイチョウの葉などの周知の神経保護剤と比較することである。
【００６３】
１．材料および方法
１．１．研究デザイン
１．１．１．細胞の分離および受容
初代皮質ニューロンを１７日齢のラット胚脳から分離し、９６ウェルプレート上に標準神経細胞用基礎培地中５０，０００細胞／ウェルの密度で２〜３週間播種した。培地の半量を、抗酸化剤を含まない新たな神経細胞用基礎培地と２回置き換えた。
【００６４】
１．１．２．ＰＡＮ‐８１１、他の周知の神経保護剤および過酸化水素による処理
ＰＡＮ‐８１１を１ｍｇ／ｍｌ（〜５ｍＭ）のＥｔＯＨに溶解し、さらに最終濃度０．１μＭ、１μＭ、および１０μＭの媒体で希釈した。他の周知の神経保護剤を適切な溶媒に溶解し、前記の最終濃度の媒体で希釈した。ニューロンをＰＡＮ‐８１１、周知の神経保護剤あるいは媒体で２４時間事前処理した後、過酸化水素（最終濃度１５０μＭ）により誘引される酸化的ストレスをかける。対照には、未処理の細胞（化合物および過酸化水素による処理をしていない細胞）、化合物のみで処理された細胞、および化合物ではなく過酸化水素に曝露された細胞が含まれる。未処理の細胞を対照として使用し、ニューロンの毒性および向上した生存能力を評価した。各試験は３回繰り返し行った。
【００６５】
細胞機能の評価
２４時間後、標準ＭＴＳ試験（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して生存能力およびミトコンドリア作用を評価した。製造者のプロトコルは以下のとおりである。
【００６６】
１．２．材料
・ 神経細胞用基礎媒地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
・ Ｂ２７‐ＡＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
・ ＰＡＮ‐８１１（Ｖｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ, Ｉｎｃ．）
・ 過酸化水素（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）
・ ＥｔＯＨ（Ｓｉｇｍａ社）
・ ビタミンＥ（Ｓｉｇｍａ社）
・ リポ酸（Ｓｉｇｍａ社）
・ イチョウの葉（ＣＶＳ）
・ ＭＴＳ試験キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）
・
１．３．装置
・ バランス（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ， Ｉｎｃ．）
・ 可調整ピペット（Ｆｉｎｎｐｉｐｅｔｔｅ社）
・ 細胞培養フード（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｏｒｍａ社）
・ 細胞培養器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｏｒｍａ社）
・ プレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｍｏｄｅｌ ５５０）。
【００６７】
２．結果
２．１ 実験
上記の研究デザインに記載の手順に従って実験を行った。ＰＡＮ‐８１１を１ｍｇ／ｍｌのＥｔＯＨ（〜５ｍＭ）に溶解し、さらに神経細胞用基礎培地で最終濃度０．１μＭ、１μＭ、および１０μＭまで希釈した。リポ酸を２４０ｍＭのＥｔＯＨに溶解し、さらに神経細胞用基礎培地で最終濃度１０μＭ、２５μＭ、５０μＭ、および１００μＭまで希釈した。ビタミンＥを１００ｍＭ濃度のＥｔＯＨに溶解し、神経細胞用基礎培地で最終濃度５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、および４００μＭまで希釈した。イチョウの葉は、６ｍｇ／ｍｌのｄＨ2Ｏに溶解し、神経細胞用基礎培地で最終濃度２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌまで希釈した。処理の最後に媒体を、Ｂ２７（‐ＡＯ）を加えた１００μｌの新しい加温済み神経細胞用基礎培地と取り替えた。プレートを３７℃で５％ＣＯ2の培養器に１時間戻した。次に２０μｌＭＴＳ試薬を各ウェルに加え、プレートを３７℃で５％ＣＯ2の培養器でさらに２時間培養した。各ウェルの４９０ｎｍでの吸収度をＢｉｏＲａｄプレートリーダー（モデル５５０）で記録した。培地のみを含むウェルをブランクとして使用した。各データポイントは、３つの個別の試験ウェルの平均である。未処理の細胞を対照として使用し、細胞の生存能力および神経保護能力を算出した。当該研究には２週齢の初代培地を使用した。結果については図１を参照のこと。
【００６８】
結論
ＰＡＮ‐８１１は、過酷な過酸化水素処理下においても１〜１０μＭ濃度で良好な神経保護能力を示した。ビタミンEおよびリポ酸は、過酷な処理下で最小限の神経保護能力を示した。イチョウの葉は過酷な処理下である程度の神経保護を示した。
【００６９】
ＰＡＮ‐８１１は、過酷な過酸化水素下においても最終濃度１〜１０μＭで著しい神経保護を示した。ＰＡＮ‐８１１の神経保護の有効性は、他の周知の神経保護剤、ビタミンＥ、リポ酸、およびイチョウの葉の有効性をはるかに上回っていた。
【００７０】
実施例２
神経細胞における活性酸素種（ＲＯＳ）産生に対するＰＡＮ‐８１１の効果
目的
本研究の目的は、ＰＡＮ‐８１１のアルツハイマー病関連酸化的ストレスの細胞ベースモデルにおけるＲＯＳ産生の削減能力を評価することである。
【００７１】
１． 材料および方法
１．１ 研究デザイン
１．１．１．細胞の分離および受容
初代皮質ニューロンを１７日齢のラット胚脳から分離し、９６ウェルプレートに標準神経細胞用基礎培地中５０，０００細胞／ウェルの密度で２〜３週間播種した。培地の半量を、酸化防止剤を含まない新たな神経細胞用基礎培地と２回置き換えた。
【００７２】
１．１．２ ．細胞のＣＭ‐Ｈ2ＤＣＦＤＡ色素事前負荷およびＰＡＮ‐８１１と過酸化水素による処理
初代皮質ニューロンをＨＢＳＳ緩衝液で１回洗浄し、１０μＭの５‐（および‐６）クロロメチル‐２’，７’‐ジクロロジヒドロフルオロセインニ酢酸アセチルエステル（ＣＭ‐Ｈ2ＤＣＦＤＡ）で培養して色素を事前に含ませた。その後、細胞をＨＢＳＳ緩衝液で１回洗浄し、最終濃度０．１、１、５、および１０μＭのＰＡＮ‐８１１で１時間処理した後、３００μＭの過酸化水素によって誘導される酸化的ストレスを２時間かけた。
【００７３】
１．１．３．神経細胞におけるＲＯＳ産生の評価
各ウェルの４８５／５２０ｎｍ（Ｅｘ／Ｅｍ）におけるｃ‐ＤＣＦ蛍光体をＢＭG Ｐｏｌａｒｓｔａｒプレートリーダーで記録し、それを使用して細胞におけるＲＯＳ産生を評価した。色素を含む未処理の細胞を対照として使用し、ｃ‐ＤＣＦ蛍光体の変化を算出した。各試験は３回繰り返し行った。
【００７４】
１．２ 材料
・ 神経細胞用基礎培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
・ Ｂ２７‐ＡＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
・ ＨＢＳＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
・ ＣＭ‐Ｈ2ＤＣＦＤＡ（分子プローブ）
・ ＰＡＮ‐８１１（Ｖｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．）
・ 過酸化水素（Ｃａｌｉｂｉｏｃｈｅｍ社）
・ ＥｔＯＨ（Ｓｉｇｍａ社）
・ ＰＥＧ‐３００（Ｓｉｇｍａ社）
１．３ 装置
・ バランス（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ， Ｉｎｃ．）
・ 可調整ピペット（Ｆｉｎｎｐｉｐｅｔｔｅ社）
・ 細胞培養フード（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｏｒｍａ社）
・ 細胞培養器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｏｒｍａ社）
・ Ｐｏｌａｒｓｔａｒ蛍光プレートリーダー（ＢＭＧ）。
【００７５】
２．０ 結果
２．１ 実験
上記の研究デザインに記載の手順に従って実験を行った。各ウェルの４８５／５２０ｎｍ（Ｅｘ／Ｅｍ）でのｃ‐ＤＣＦ蛍光体をＢＭＧ Ｐｏｌａｒｓｔａｒプレートリーダーで記録した。色素のない細胞を含むウェルをブランクとして使用した。各データポイントは、３つの個別の試験ウェルの平均である。色素含む未処理の細胞を対照として使用し、ｃ‐ＤＣＦ蛍光体の変化を算出した。当該研究には２週齢の初代培養を使用した。
【００７６】
３．０ 考察
ＣＭ‐Ｈ2ＤＣＦＤＡは、細胞内エステラーゼによって酢酸基が取り除かれ、細胞内で酸化が起こるまでの非蛍光性ＲＯＳの細胞透過指標である。これは、細胞および動物における活性酸素種（ＲＯＳ）産生の検出に広く使用されている。ここでは研究デザインに記載の手順に従って、神経細胞におけるＲＯＳ産生に対するＰＡＮ‐８１１の効果を判定するツールとして使用している。図２は、ＰＡＮ‐８１１が神経細胞における基礎レベルのＲＯＳ産生と同様に、過酸化水素誘導ＲＯＳ産生を削減する良好な能力を示したことを図示している。ＰＡＮ‐８１１の代わりに、緩衝液ＰＧＥ‐３００／ＥｔＯＨを使用した平行対照実験は、細胞におけるＲＯＳ産生に対する効果を示さなかった。異なる細胞群で４回実験を繰り返したところ、同様の結果が得られた。代表的な実験については、図２を参照のこと。
【００７７】
４．０ 結論
ＰＡＮ‐８１１は、初代神経細胞において、過酸化水素誘導ＲＯＳ産生（１０μＭで最高３０％）および初期レベルのＲＯＳ産生（１０μＭで最高５０％）を大幅に削減した。
【００７８】
文献
（１）． Ｇｉｂｓｏｎ ＧＥ， Ｚｈａｎｇ Ｈ， Ｘｕ Ｈ， Ｐａｒｋ ＬＣ， Ｊｅｉｔｎｅｒ ＴＭ． （２００１）． Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃａｌｃｉｕｍ ｓｔｏｒｅｓ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ａ ｋｅｙ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｅｎｚｙｍｅ． Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ． Ｍａｒ １６；１５８６（２）：１７７−８９．
（２）． Ｃｈｉｇｎｅｌｌ ＣＦ， Ｓｉｋ ＲＨ． （２００３）． Ａ ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｌｏａｄｅｄ ｗｉｔｈ ２’，７’−ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ＵＶＡ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ． Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ． Ａｐｒ １５；３４（８）：１０２９−３４。
【００７９】
実施例３
低酸素誘導神経毒性または低酸素／低血糖誘導神経毒性に対する潜在的神経保護剤ＰＡＮ‐８１１
１．０ はじめに
虚血性発作後、最初の数分における神経損傷を軽減することが効果的な治療につながる重要な方法である。脳卒中の発作の間、動脈が血栓／塞栓によって閉塞するため脳の局所領域への酸素およびグルコースの輸送が遮断され、これによって梗塞の中核に神経細胞の欠損が生じる。中核の細胞死は壊死機序を介して非常に速く進行する。虚血性梗塞を取り囲む脳領域は、その構造は保持するが機能的（電気的）には無反応であり、周縁部と呼ばれる。梗塞に至るまでの進化が比較的漸進的な現象であるため、当該周縁部は一時的な領域である（Ｔｏｕｚａｎｉら、２００１）。この領域は、幾つかの脳の機能を保護する可能性を提供し、周縁部の治療のための治療濃度域は梗塞領域のそれよりはるかに長い。当該周縁部は、エネルギー代謝が保護される血液供給抑制領域として説明することもできる。そのため当該周縁部は、休止状態のニューロンを再活性させる高圧酸素などの作用因子および神経保護治療のターゲットである。ＣＮＳ外傷における損傷直後のダメージは回復不可能であるが、脳の損傷、主として全脳低酸素／虚血を悪化させる一連のイベントの進行を神経保護の効果的な方法によって回避することができる。例えば、冠動脈バイパス術（ＣＡＢＧ）前および術中に神経保護剤を投与することによって、術中に脳への血流が短期間変化すること（軽度の低酸素／低血糖状態につながる）によって生じる神経変性を効果的に防ぐことができる。このため、顕著な神経保護および損傷を受けた後のニューロン救済の両方が可能な化合物が重要である。
【００８０】
２．０ 目的
本研究の目的は、ＰＡＮ‐８１１がインビトロで低酸素誘導神経毒性または低酸素／低血糖（Ｈ／Ｈ）誘導神経毒性を保護できるかどうかを理解することである。ＰＡＮ‐８１１は、関連する研究において、過酸化水素で処理した初代ニューロンに対して顕著な神経保護を提供することが既に示されている。
【００８１】
３．０ 材料および方法
３．１ 材料
・ 神経細胞用基礎培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
・ Ｂ２７‐ＡＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
・ ＰＡＮ‐８１１（Ｖｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）
・ ＥｔＯＨ（Ｓｉｇｍａ社）
・ ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ社）
・ ＰＥＧ‐３００（Ｓｉｇｍａ社）
・ ＭＴＳ試験キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）
・ ＬＤＨ試験キット（Ｓｉｇｍａ社）
２．２ 装置
・ バランス（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ， Ｉｎｃ．）
・ 可調整ピペット（Ｆｉｎｎｐｉｐｅｔｔｅ社）
・ 細胞培養フード（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｏｒｍａ社）
・ 細胞培養器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｏｒｍａ社）
・ プレートリーダー（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ Ｍｏｄｅｌ５５０）
・ ＦＹＲＩＴＥガス分析計（Ｂａｃｈａｒａｃｈ， Ｉｎｃ）
・ モジュール培養室‐１０１ＴＭ（Ｂｉｌｌｕｐｓ‐Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ，Ｉｎｃ．）
３．３ 略称
ＢＳＳ＝平衡塩類溶液（Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）
ＣＡＢＧ＝冠動脈バイパス術（Ｃｏｒｏｎａｒｙ Ａｒｔｅｒｙ Ｂｙｐａｓｓ Ｇｒａｆｔ）
ｄ．ｉ．ｖ．＝試験管内日数（Ｄａｙｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
ＥｔＯＨ＝エタノール（Ｅｔｈａｎｏｌ）
Ｈ／Ｈ＝低酸素／低血糖（Ｈｙｐｏｘｉａ／Ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉａ）
ＬＤＨ＝乳酸脱水素酵素（Ｌａｃｔａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）
ＭＣＡＯ＝中大脳動脈閉塞（Ｍｉｄｄｌｅ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ａｒｔｅｒｙ Ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）
ＮＢ＝神経細胞用基礎培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ）
ＮＭＤＡ＝Ｎ‐メチル‐Ｄ‐アスパラギン酸
ＰＥＧ＝ポリエチレングリコール（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）。
【００８２】
３．４ 研究デザイン
３．４．１ 神経培養
９６ウェルプレート形式で実験を行った。ポリ‐Ｄ‐リシンでコーティングされた表面に皮質ニューロンを５０，０００細胞／ウェルの密度で播種し、無血清培地（ＮＢにＢ２７を補足）で培養してニューロンの富栄養培地を得る。ニューロンを１４日以上試験管内で培養し、興奮性アミノ酸に対する細胞の感受性を増加させる（チヤン（Ｊｉａｎｇ）ら、２００１）。定量分析を容易にするため、６つの複製ウェルを１グループとして処理した。
【００８３】
３．４．２ 神経毒性の誘導‐インビトロモデル
以下の表に示すように、脳内のグルコース濃度は通常２．２ｍＭ以上である。虚血の間、中核および周縁部のグルコース濃度はそれぞれ０．２ｍＭおよび１．４ｍＭまで低下する。再循環後１、２時間でグルコースレベルは正常に戻る（Ｆｏｌｂｅｒｇｒｏｖaら、１９９５）。
【００８４】
【表１】
【００８５】
低酸素誘導神経毒性に対するグルコース濃度の効果を理解するため、異なる用量のグルコースをテストした。図３に示すように、グルコース濃度が２５ｍＭである正常状態と比較して、グルコース濃度が２．９ｍＭまで低下しても神経細胞死を生じなかった。 グルコース濃度が０．４ｍＭまで低下した場合、ＭＴＳ試験が示すように確固たる細胞死が発生した。
【００８６】
脳卒中の脳環境を再現するために、３つのインビトロモデルシステムを確立した。極度のＨ／Ｈモデル（０．４ｍＭグルコース）は梗塞の中核における環境の再現であり、軽度のＨ／Ｈモデル（１．６３ｍＭグルコース）はＭＣＡＯ中の周縁部における環境の再現、また低酸素のみのモデル（正常なインビトログルコース濃度‐２５ｍＭ中のニューロン）は、再かん流後の周縁部の環境を再現している。これは、再かん流後に起こり得る細胞死が主にエネルギー欠陥よりも低酸素の影響の結果であるためである。
【００８７】
極度のＨ／Ｈの場合は０．４ｍＭ、軽度のＨ／Ｈの場合は１．６３ｍＭまでグルコース濃度を下げることによって、低酸素／低血糖状態を得た。ＢＳＳ（１１６．０ｍＭのＮａＣｌ、５．４ｍＭのＫＣｌ、０．８ｍＭのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１．８ｍＭのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２６．２ｍＭのＮａＨＣＯ３、および０．０１ｍＭのグリシン）あるいは２５ｍＭのグルコースを含むＢＳＳは、５分間脱気した後使用した。低酸素用のプレート中の培地をＢＳＳあるいはグルコースを含むＢＳＳと置き換えた。一方、正常酸素用のプレート中の培地は、非脱気ＢＳＳあるいはグルコースを含むＢＳＳと置き換えた。プレートを密封容器（モジュール培養室‐１０１TM、Ｂｉｌｌｕｐｓ‐Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ，Ｉｎｃ．）に移し、２０分間真空処理して酸素または他のガスを培地から除去した後、室内に５％ＣＯ2および９５％Ｎ2を３０ｐｓｉの圧力で１分間再充填して、細胞を低酸素状態に置いた。室内の酸素レベルはＯ2指示計（ＦＹＲＩＴＥガス分析計、Ｂａｃｈａｒａｃｈ，Ｉｎｃ．）でゼロとした。当該室内に培養プレートを６時間維持した。実験対照として、複製した培養プレートを正常な培養条件下（５％ＣＯ2および９５％環境大気）で同期間維持した。６時間の処理後、プレートを当該室から取り出し、低酸素および正常酸素培養における培地を、２５ｍＭグルコースを含む最終溶液（１ｘピルビン酸ナトリウム、１０．０ｍＭのＨＥＰＥＳ、および１ｘＮ2サプリメントで補完されたＤＭＥＭ）と置き換え、５％ＣＯ2および９５％環境大気中で培養した。ニューロンを様々な濃度のＰＡＮ‐８１１あるいは負の対照としての媒体で処理した。ＭＫ８０１は正の対照として使用した。ミトコンドリア作用および細胞死はＨ／Ｈ状態に置いてから２４時間または４８時間後にＭＴＳおよびＬＤＨ分析で評価した（以下参照）。
【００８８】
低酸素のみのモデルにおいて、ニューロンを溶媒またはＰＡＮ‐８１１で２４時間または４８時間事前処理した。薬剤による処理を２４時間の低酸素期間中および期間後も継続した。低酸素状態に置いてから２４時間または４８時間後に細胞形態および機能（ＭＴＳおよびＬＤＨ試験）を計測した。
【００８９】
３．４．３ 形態のモニタリング
形態学的に評価した神経細胞死を図４に示す。低酸素状態前のニューロンは健康で、様相の優れた細胞体（矢じり）および正常な神経突起（白抜き矢印）を持つ。当該プロセスおよびそれらの分枝がバックグラウンドに密なネットワークを形成する。低酸素状態は細胞体の収縮および神経突起やネットワークの崩壊を招く。用量５μＭのグルタミン酸ＮＭＤＡ受容体拮抗薬ＭＫ８０１と同様に、ＰＡＮ‐８１１は神経細胞死から効果的に保護し、神経突起を部分的に留保することを示した。
【００９０】
３．４．４ ＭＴＳ試験
ＭＴＳ試験は、代謝的に活発な細胞におけるミトコンドリア作用を測定する比色試験である。この測定は直接細胞生存能力に反映する。ＭＴＳテトラゾリウム化合物は、代謝的に活発なミトコンドリア中では減少し、組織培地において溶解可能な有色のホルマザン生成物になり、４９０ｎｍの吸収度で検出できる。２０μｌのＭＴＳ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を、１００μｌの培地にサンプルを含む９６ウェル試験プレートの各ウェルに添加する。次に当該プレートを３７℃の加湿した５％ＣＯ2雰囲気中で１〜２時間、完全に発色するまで培養する。Ｂｉｏ‐Ｒａｄ９６ウェルプレートリーダーを使用して、４９０ｎｍの吸収度を記録した。
【００９１】
３．４．５ ＬＤＨ試験
乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）試験は、ＬＤＨの作用によるＮＡＤの減少に基づいている。結果として減少するＮＡＤ（ＮＡＤＨ）をテトラゾリウム染色の化学量論的変換に使用する。異なる処理を行った培養物から得た無細胞のアリコート培地を試験する場合、膜の完全性の作用と同様に、ＬＤＨの作用量を関連する細胞死の指標として使用することができる。試験した９６ウェルプレート中のウェルから得た５０μｌアリコートの培地を未使用のプレート中のウェルに移し、均等に混合した基質、酵素および染色溶液（Ｓｉｇｍａ社）２５μｌで補完した。当該生成物を室温で２０〜３０分間培養した後、４９０ｎｍの波長で分光光度法的に測定した。
【００９２】
３．結果
４．１ 低酸素のみのモデル
３．１．１．ＰＡＮ‐８１１の有効性および毒性
低酸素前の４８時間、皮質ニューロンをＰＡＮ‐８１１で処理した。ＰＡＮ‐８１１を低酸素状態で２４時間、その後４８時間静置した。用量２μＭのＰＡＮ‐８１１は細胞死を完全にブロックしたが、５０μＭでは毒性を示した（図５を参照）。
【００９３】
３．１．２．他の神経保護剤との比較
低酸素期間の２４時間前、低酸素期間中、およびその後２４時間、皮質ニューロンを２μＭのＰＡＮ‐８１１、１：８０の緑茶、または５μＭのＭＫ８０１で処理した。テストした試薬の中で、ＰＡＮ‐８１１は最も高い有効性を示し、神経細胞死およびミトコンドリア作用不全を完全にブロックした。
【００９４】
軽度のＨ／Ｈモデル
３．１．３． 低酸素期間前および期間中、ＰＡＮ‐８１１はニューロンを軽度のＨ／Ｈ誘導神経毒性から保護した。
【００９５】
胚（Ｅ１７）ラット皮質ニューロンを１５日間培養し、低酸素／低血糖前の２４時間およびその期間中（６時間）、ＰＡＮ‐８１１および媒体で処理した。当該発作の１７時間後にＭＴＳ試験およびＬＤＨ試験を実施した。５μＭのＰＡＮ‐８１１は、低酸素／低血糖誘導ミトコンドリア作用不全および神経細胞死を完全に防いだが、ＰＥＧ：ＥｔＯＨ＝１：１の５２０希釈液（５μＭのＰＡＮ‐８１１の媒体量に対応する）は防御しなかった。
【００９６】
代表的なデータを図６に示す。２〜５０μＭの濃度範囲をカバーする６実験の要約を以下の表２に示す。
【００９７】
【表２】
【００９８】
４．２．２． 発作中、特に発作後に、ＰＡＮ‐８１１は軽度のＨ／Ｈ誘導神経毒性から細胞を保護した。
【００９９】
ニューロンを１５日間培養し、ＰＡＮ‐８１１またはＰＥＧ：ＥｔＯＨ（７：３）を媒体として用いて６時間のＨ／Ｈ前の２４時間処理した（Ｈ／Ｈ前グループ）。代替として、ニューロンを１６日間培養し、６時間のＨ／Ｈ中に上記の試薬で処理し（Ｈ／Ｈ中グループ）、６時間のＨ／Ｈ期間中およびＨ／Ｈ後４８時間処理する（Ｈ／Ｈ中およびＨ／Ｈ後グループ）、あるいはＨ／Ｈ後４８時間処理した（Ｈ／Ｈ後グループ）。Ｈ／Ｈ期間後４８時間にＬＤＨ試験を実施した。Ｈ／Ｈの直前ではなく、Ｈ／Ｈ中および特にＨ／Ｈ後にニューロンを処理した場合、ＰＡＮ‐８１１は神経細胞死から保護した。図７を参照のこと。
【０１００】
３．２．極度のＨ／Ｈモデル
５０μＭ以下のＰＡＮ‐８１１は、神経細胞死を防がなかった（データ表示せず）。
【０１０１】
４．結論
４．１． ２μＭのＰＡＮ‐８１１は低酸素誘導神経毒性および軽度のＨ／Ｈ誘導神経毒性を完全に防いだ。１００μＭのＰＡＮ‐８１１は、極度のＨ／Ｈ誘導神経細胞死を一部ブロックしたにすぎず、エネルギー代謝に関与しているとは考えにくい。
【０１０２】
４．２． 低酸素または虚血発作中、あるいはその後のいずれかに投与した場合、ＰＡＮ‐８１１はニューロンを細胞死から顕著に保護した。
【０１０３】
４．３． ＰＡＮ‐８１１の有効性は、ＭＫ８０１および／または緑茶よりはるかに優れている。
【０１０４】
４．４． ５０μＭのＰＡＮ‐８１１を長期的に接触させると、ニューロンにとって毒性となる（１２０時間曝露）。
【０１０５】
５．参照文献
１． Ｊｉａｎｇ， Ｚ．−Ｇ．， Ｐｉｇｇｅｅ， Ｃ．Ａ．， Ｈｅｙｅｓ， Ｍ．Ｐ．， Ｍｕｒｐｈｙ， Ｃ．Ｍ．， Ｑｕｅａｒｒｙ， Ｂ．， Ｚｈｅｎｇ， Ｊ．， Ｇｅｎｄｅｌｍａｎ， Ｈ．Ｅ．， ａｎｄ Ｍａｒｋｅｙ， Ｓ．Ｐ． Ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｉｓ ａ ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｏｆ ＨＩＶ−１−ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｕｍａｎ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １１７（１ ２）：９７−１０７， ２００１．
２． Ｆｏｌｂｅｒｇｒｏｖa， Ｊ．， Ｚｈａｏ， Ｑ．， Ｋａｔｓｕｒａ， Ｋ．， ａｎｄ Ｓｉｅｓｊo， Ｂ．Ｋ． Ｎ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ-ｐｈｅｎｙｌｎｉｔｒｏｎｅ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｅｎｅｒｇｙ ｓｔａｔｅ ｉｎ ｒａｔｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｆｏｃａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：５０５７−５０６１， １９９５．
３． Ｔｏｕｚａｎｉ， Ｏ．， Ｒｏｕｓｓｅｌ， Ｓ．， ａｎｄ ＭａｃＫｅｎｚｉｅ， Ｅ．Ｔ． Ｔｈｅ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｐｅｎｕｍｂｒａ． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｎｅｕｒｏｌ． １４：８３−８， ２００１。
【０１０６】
実施例４
一時的な局所脳虚血のインビボモデルにおいて顕著な神経保護を示すＰＡＮ‐８１１
１．はじめに
発作後最初の数分における神経損傷を軽減することが効果的な治療につながる重要な方法である。脳卒中の発作の間、動脈が血栓／塞栓によって閉塞するため脳の局所領域への酸素およびグルコースの輸送が遮断され、これによって梗塞の中核に神経細胞の欠損が生じる。中核の細胞死は壊死機序を介して非常に速く進行する。虚血性梗塞を取り囲む脳領域は、その構造は保持するが機能的（電気的）には無反応であり、周縁部と呼ばれる。梗塞に至るまでの進化が比較的漸進的な現象であるため、当該周縁部は一時的な領域である（Ｔｏｕｚａｎｉら、２００１）。この領域は、幾つかの脳の機能を保護する可能性を提供し、周縁部の治療のための治療濃度域は梗塞領域のそれよりはるかに長い。当該周縁部は、エネルギー代謝が保護される血液供給抑制領域として説明することもできる。そのため当該周縁部は、休止状態のニューロンを再活性させる高圧酸素などの作用因子および神経保護治療のターゲットである。ＣＮＳ外傷における損傷直後のダメージは回復不可能であるが、脳の損傷、主として全脳低酸素／虚血を悪化させる一連のイベントの進行を神経保護の効果的な方法によって回避することができる。例えば、冠動脈バイパス術（ＣＡＢＧ）前および術中に神経保護剤を投与することによって、術中に脳への血流が短期間変化すること（軽度の低酸素／低血糖状態につながる）によって生じる神経変性を効果的に防ぐことができる。このため、顕著な神経保護および損傷を受けた後のニューロン救済の両方が可能な化合物が重要である。
【０１０７】
２．目的
ＰＡＮ‐８１１は、酸化的ストレスおよび虚血のインビトロモデルにおいて顕著な神経保護を示している。周知の毒性プロファイルおよび薬物動態データを含め、先の研究は脳卒中の治療におけるその可能性を高く示唆している。
【０１０８】
３．材料および方法
３．１ 材料
・ ＰＡＮ‐８１１（Ｖｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）
・ ＥｔＯＨ（Ｓｉｇｍａ社）
・ ＰＥＧ‐３００（Ｓｉｇｍａ社）
・ ＭＴＳ試験キット（Ｓｉｇｍａ社）
３．２ 略称
ＣＡＢＧ＝冠動脈バイパス術（Ｃｏｒｏｎａｒｙ Ａｒｔｅｒｙ Ｂｙｐａｓｓ Ｇｒａｆｔ）
ＥｔＯＨ＝エタノール（Ｅｔｈａｎｏｌ）
Ｈ／Ｈ＝低酸素／低血糖（Ｈｙｐｏｘｉａ／Ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉａ）
ＭＣＡＯ＝中大脳動脈閉塞（Ｍｉｄｄｌｅ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ａｒｔｅｒｙ Ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）
ＰＥＧ＝ポリエチレングリコール（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）
３．３ 研究デザイン
３．３．１ インビトロ研究
インビボ研究に着手する前に、ＰＡＮ‐８１１を幾つかの神経変性細胞モデルにおいてテストした。
【０１０９】
３．３．１．１．神経培養
富養神経培養物を１５日齢のＳｐｒａｇｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙラット胚から生成した。無菌技術を使用して、ラット胚を子宮から取り出し、無菌神経細胞用培地に配置した。解剖顕微鏡を使用して、髄膜および血管を除去するように注意しながら脳組織を各胚から取り出した。小脳を顕微鏡下、全体切開によって分離し、小脳組織のみを培養に使用した。組織を粉砕して細胞を分離し、ポリ（Ｌ‐リシン）で事前にコーティングされた４８ウェルプレートに５ｘ１０5細胞／ウェルの密度で播種した。Ｅａｇｌｅの基礎培地（グルタミンを含まない）の同等部および１０％加熱不活性化ウマ血清、１０％ウシ胎孔血清、グルコース６００μｇ／ｍｌ、グルタミン１００μｇ／ｍｌ、ペニシリン５０Ｕ／ｍｌ、およびストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌで補完したＨａｍのF‐１２ｋ媒体を含む媒体で培養を維持した。４８時間後、１０μＭのシトシンアラビノシドを加えて非神経細胞分裂を阻害した。培養７日後の細胞を実験に使用した。
【０１１０】
３．３．１．２．ＰＡＮ‐８１１の神経毒性
様々な量のＰＡＮ‐８１１（０〜１００μＭ）で２４時間細胞を処理した。細胞の生存能力はＭＴＴ試験で判定した。
【０１１１】
３．３．１．３．神経毒性の誘導‐インビトロモデル
４つのインビトロモデルにおいて興奮毒性を調べた。細胞をＨ／Ｈ状態に３時間置くか、あるいはグルタミン酸（１００μＭ）、スタウロスポリン（１μＭ）、あるいはベラトリジン（１０μＭ）のいずれかで４５分間処理した。Ｌｏｃｋｅ溶液中でＰＡＮ‐８１１（１０μＭ）を用いて、または用いずに、すべての細胞を併せて処理した。それぞれの興奮毒性照射の最後に、条件培地（オリジナル）を置き換えた。９５％窒素および５％ＣＯ2で飽和した加湿気密室内で、グルコースを添加しないＬｏｃｋｅ溶液中で３時間細胞を培養することによってＨ／Ｈを誘導した。
【０１１２】
３．３．１．４．ＭＴＴ試験
２４時間後に興奮毒性発作細胞の生存能力を試験した。細胞の損傷は、３‐（４，５‐ジメチルチアゾール‐２‐ｙｌ）‐２，５‐ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、ミズーリ州セントルイス）を用いたテトラゾリウム塩比色試験を使用して定量的に試験した。つまり、色素を各ウェル（最終濃度１．５ｍｇ／ｍｌ）に添加し、細胞をＭＴＴ‐酸性化イソプロパノール（イソプロパノール中０．１Ｎ ＨＣｌ）で培養して、各サンプルの吸収度（５４０ｎｍ）を９６ウェルプレートリーダーで測定した。各プレート上に維持された媒体処理済み対照細胞に相対する値が示され、細胞の生存能力の比率変化を計算した。
【０１１３】
３．１．２ インビボ研究
３．１．２．１．ＭＣＡＯ
本研究には３６匹の雄Ｓｐｒａｇｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙラット（２７０‐３３０ｇ；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ、バージニア州ローリー）を使用した。麻酔は酸素で送達される５％のハロタンで誘導し、２％のハロタンで維持した。体温は恒温性の暖房装置を使用して手術の全工程を通じて正常温度（３７±１℃）に維持した（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、マサチューセッツ州サウスナティック）。術前および術後に、必要に応じて食べ物と水を与え、１２時間の明暗サイクル下で１匹ずつ保管した。ラットに麻酔をかけ、中大脳動脈閉塞のフィラメント法および再かん流を使用して一時的な局所虚血状態を用意した。つまり、右外頸動脈を分離し、その分枝を凝固させた。先端が丸くコーティングしていない３‐０モノフィラメントナイロン縫合を、外頸動脈を介して内頚動脈に導入し、わずかな抵抗が見られ、ＭＣＡの起点を閉塞するまで進めた（頸動脈分岐部から約２２ｍｍ）。血管内縫合は２時間同位置に維持した後、ＭＣＡに血液が再かん流するよう縫合を除去した。ＭＣＡＯ手術後、環境大気温度を２２℃に維持しながらラットを回復ケージに入れた。実験中の体温を正常温度に維持するため、２時間の虚血期間および虚血後最初の６時間、７５ワットの加温ランプを各ケージの上部に直接配置した。
【０１１４】
３．１．２．２．ＰＡＮ‐８１１による処理
ＭＣＡＯに先立って、ラットに１ｍｇ／ｋｇのＰＡＮ‐８１１をＩＶ注射して１０分間処理した。ＰＡＮ‐８１１を７０％ＰＥＧ３００、３０％ＥｔＯＨの原液として生成した。この原液を無菌の生理食塩水で５倍に希釈して注入した（最終濃度１ｍｇ／ｍｌ）。
【０１１５】
３．１．２．３．損傷量の測定
各ラット脳について、虚血による脳損傷の分析を総梗塞量として測定した。これは、７つの冠状断面（厚さ２‐ｍｍ）から染まる２，３，５‐トリフェニル塩化テトラゾリウム（ＴＴＣ）を使用して行った。脳の断面は、前頭極から１ｍｍのところから、皮小脳境界部のすぐ吻側まで取った。コンピューターによる画像解析を使用して、梗塞量を計算した。つまり、各ＴＴＣ染色された前頭断面の後面をデジタル画像処理し（Ｌｏａｔｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、メリーランド州ウェストミンスター）、虚血による損傷領域を定量した（平方ミリメートル）。
【０１１６】
４．結果
４．１ インビトロ研究
４．１．１ ＰＡＮ‐８１１の神経毒性
結果を図１に示す。基本的にＰＡＮ‐８１１は１００μＭまでの濃度でわずかな毒性を示しただけであった。最大毒性は、テストした最高濃度で７．８％にすぎなかった（図８を参照）。
【０１１７】
４．１．２ ＰＡＮ‐８１１による神経保護
ＰＡＮ‐８１１は異なる興奮毒性発作からニューロンを顕著に保護することが分かった（図２）。１０μＭのＰＡＮ‐８１１でニューロンを事前処理することで、３時間の低酸素／低血糖により誘導されるダメージから（９２％保護）、１００μＭのグルタミン酸（最高７５％）、１μＭのスタウロスポリン、タンパク質キナーゼＣの阻害剤およびアポトーシス誘導剤（最高４７％）、およびナトリウムチャンネル阻害剤である１０μＭのベラトリジン（最高３９％）から細胞を保護した。図９を参照のこと。
【０１１８】
４．２ インビボ研究
この実験の結果を表３に示す。当該実験には合計３６匹のラットを使用したが、そのうち１１匹は以下の理由により除外した。４匹は出血を併発しない重度の卒中で死亡したため、４匹は亜急性の出血のため（うち３匹は２４時間以内に死亡）、１匹は術中に火災訓練があったため、１匹は統計的に異常値を示したため、および１匹はハロタンの過剰投与により死亡したため除外。死亡した７匹のうち（４匹はＳＡＨを伴わない重度の卒中、３匹はＳＡＨを伴う）、６匹は未処理の（媒体）ラットであり、１匹のみをＰＡＮ‐８１１で処理した。媒体処理したラットは、１９８．７５〜３５５．８１の範囲で２９２．９６ｍｍ3のわずかな梗塞量を示した。ＰＡＮ‐８１１処理したラットは、４２．３６〜３８７．０８の範囲で２２５．８５ｍｍ3のわずかな梗塞量を示した。これは２３％（ｐ＜０．０５）の神経保護を示す。理由はまだ明らかになっていないが、正常に測定される対照群においてさらに重度の損傷が観察された。従って、ＰＡＮ‐８１１処理した動物の梗塞サイズは、著名な神経保護に期待されるサイズよりも大きい。この問題に関わらず、両方の処理群は良好な生存能力を示し（ＳＥＭの１０％以下）、そうでない場合でも公開済みの我々の研究の大部分よりも優れていた。
【０１１９】
５．結論
１１．１ ＰＡＮ‐８１１はインビトロおよびインビボモデルシステムにおいて優れた耐性を示し、比較的非毒性である。
【０１２０】
１１．２ １０μＭのＰＡＮ‐８１１でニューロンを事前処理すると、神経変性につながる興奮毒性発作に対して顕著な保護を提供した。
【０１２１】
１１．３ 一時的な局所性脳虚血前の１０分間に、ＰＡＮ‐８１１（１ｍｇ／ｋｇ）を単回投与してラットを事前処理すると、平均梗塞量が２３％減少した。
【０１２２】
６．参照文献
６．１文献
５．１．１．Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＡＪ， Ｄａｖｅ ＪＲ， Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ＪＢ， Ｌｉｎ Ｙ， ＭｃＣａｂｅ ＲＴ， ａｎｄ Ｔｏｒｔｅｌｌａ ＦＣ． （２０００） Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｗｉｎｄｏｗ ｏｆ ｔｈｅ ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ｃｏｎａｎｔｏｋｉｎ−Ｇ： ｉｎ ｖｉｔｒｏ （ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ｎｅｕｒｏｎｓ） ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ （ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｆｏｃａｌ ｂｒａｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉａ） ｓｔｕｄｉｅｓ． Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ． Ｊｕｌ；２９４（１）：３７８−８６。
【０１２３】
【表３】
【０１２４】
実施例５
ＰＡＮ‐８１１による過酸化水素誘導酸化的ストレスからのニューロン保護
１．０ 目的
本研究の目的は、アルツハイマー病に関連する酸化的ストレスの細胞ベースモデルにおけるＰＡＮ‐８１１の神経保護剤としての有効性を判定することである。神経保護および細胞毒性を判別する。様々な溶媒をテストして、ＰＡＮ‐８１１の送達用媒体としての適性を判断した。
【０１２５】
２ 材料および方法
２．１ 材料
・ 神経細胞用基礎培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
・ Ｂ２７‐ＡＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
・ ＰＡＮ‐８１１（Ｖｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）
・ 過酸化水素（Ｃａｌｉｂｉｏｃｈｅｍ社）
・ ＥｔＯＨ（Ｓｉｇｍａ社）
・ ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ社）
・ ＰＥＧ‐３００（Ｓｉｇｍａ社）
・ ＭＴＳ試験キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）
２．２ 装置
・ バランス（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ， Ｉｎｃ．）
・ 可調整ピペット（Ｆｉｎｎｐｉｐｅｔｔｅ社）
・ 細胞培養フード（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｏｒｍａ社）
・ 細胞培養器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｏｒｍａ社）
・ プレートリーダー（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ Ｍｏｄｅｌ５５０）
２．３ 研究デイン
２．３．１ 細胞の分離および受容
初代皮質ニューロンを１７日齢のラット胚脳から分離し、９６ウェルプレート上に標準神経細胞用基礎培地中５０，０００細胞／ウェルの密度で２〜３週間播種した。培地の半量を、抗酸化剤を含まない新しい神経細胞用基礎培地と２回置き換えた。
【０１２６】
２．３．２ ＰＡＮ‐８１１および過酸化水素による処理
ＰＡＮ‐８１１を１ｍｇ／ｍｌ（〜５ｍＭ）のＥｔＯＨあるいはＤＭＳＯのいずれか、５ｍｇ／ｍｌ（〜２５ｍＭ）のＰＥＧ‐３００／ＥｔＯＨ（７０％／３０％）に溶解し、さらに培地で最終濃度１μＭ、５μＭ、２０μＭ、および５０μＭまで希釈した。ニューロンをＰＡＮ‐８１１または媒体で２４時間事前処理し、その後過酸化水素（最終濃度６０〜７０μＭ）によって誘引された酸化的ストレスをかけた。対照には、未処理の細胞（ＰＡＮ‐８１１および過酸化水素処理を行っていない細胞）、ＰＡＮ‐８１１のみで処理した細胞、ＰＡＮ‐８１１ではなく過酸化水素に曝露された細胞を含む。未処理の細胞を対照として使用し、ニューロンの毒性および向上した生存能力の両方を評価した。各試験は３回繰り返し行った。等量の溶媒（ＥｔＯＨ、ＤＭＳＯ，およびＰＥＧ‐３００／ＥｔＯＨ）を細胞に加え、当該試験に対する溶媒の効果をテストした。
【０１２７】
２．３．３．細胞機能の評価
２４時間後、標準ＭＴＳ試験（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して、培養物の生存能力およびミトコンドリア作用を評価した。製造者のプロトコルは以下のとおりである。
【０１２８】
３．結果
３．１ 実験１
研究デザインに記載の手順に従って実験を行った。処理の最後に、すべての処理および媒体を、Ｂ２７（‐ＡＯ）を加えた１００μＭの新しい加温済神経細胞用基礎培地と置き換えた。５％ＣＯ2を含む３７℃の培養器に当該プレートを１時間戻し、その後２０μｌのＭＴＳ試薬を各ウェルに添加して、５％ＣＯ2を含む３７℃の培養器でさらに２時間プレートを培養した。各ウェルの４９０ｎｍ吸収度をＢｉｏＲａｄプレートリーダー（モデル５５０）で記録した。媒体のみを含むウェルはブランクとして使用した。各データポイントは、３つの個別の試験ウェルの平均である。未処理の細胞を対照として使用し、細胞の生存能力および神経保護能力を算出した。この一連の研究には３週齢の初代培地を使用した。結果については図１０を参照のこと。
【０１２９】
３．２ 実験２
実験１と同様の手順に従って実験を行った。この研究には２週齢の初代培地を使用した。結果については図１１を参照のこと。
【０１３０】
４．考察
３つの溶媒すべてが１〜１０μＭのＰＡＮ‐８１１最終濃度に対応する希釈での定量法において最低限の効果を示した。ＤＭＳＯはＰＡＮ‐８１１の最終濃度２０μＭまたはそれ以上に対応する希釈である程度の神経保護を示した。ＥｔＯＨおよびＰＥＧ‐３００／ＥｔＯＨは、最終濃度５０μＭのＰＡＮ‐８１１に対応する希釈である程度の神経保護能力を示した。ＰＡＮ‐８１１は、１〜１０μＭで良好な神経保護能力を示した。ＰＡＮ‐８１１は、ＥｔＯｈ担体と比較して、ＰＥＧ‐３００／ＥｔＯＨ中で良好な溶解度を示した。
【０１３１】
５．結論
ＰＡＮ‐８１１は、最終濃度１〜１０μＭで良好な神経保護能力を示した。ＰＥＧ‐３００／ＥｔＯＨは、１〜２０μＭのＰＡＮ‐８１１に対応する希釈での定量法でほとんど干渉を示さなかったことから、テストした３つの溶媒の中でＰＡＮ‐８１１に最も適した溶媒である。
【０１３２】
当業者であれば、本発明が目的の遂行に適しており、本来の結果および利点に加えて、上記の結果および利点が得られることは容易に理解できるであろう。本発明の実施において、本発明の精神あるいは範囲から逸脱することなく、様々な修正および変更を行うことができることは当業者には明らかである。特許請求の範囲に定義される発明の精神に包含される変更および他の使用は、当業者であれば容易に思い当たるものである。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】図１は、ＰＡＮ‐８１１（Ａ）あるいは周知の神経保護剤であるビタミンＥ（Ｂ）、リポ酸（Ｃ）、またはイチョウの葉（Ｄ）を用いて事前処理を行い、過酸化水素で処理した後の細胞の生存能力（左パネル）および神経保護能力（右パネル）を図解している。
【図２】図２は、神経細胞におけるＲＯＳ産生に対するＰＡＮ‐８１１の効果（Ａ）、神経細胞における過酸化水素誘導ＲＯＳ産生に対するＰＡＮ‐８１１の効果（Ｂ）、神経細胞における基礎レベルのＲＯＳ産生に対するＰＡＮ‐８１１の効果を図解している。
【図３】図３は、低酸素状態における神経毒性のグルコース濃度依存を示す図である。
【図４】図４は、神経保護剤ＭＫ８０１およびＰＡＮ‐８１１を使用した場合としない場合の低酸素状態における細胞の組織学的写真を示す。
【図５】図５は、正常酸素状態および低酸素状態におけるＰＡＮ‐８１１の神経保護効果を示す図である。
【図６】図６は、低酸素／低血糖状態におけるＰＡＮ‐８１１の毒性を示す図である。
【図７】図７は、軽度の低酸素／低血糖状態におけるＰＡＮ‐８１１の神経細胞死に対する保護効果を示す図である。
【図８】図８は、皮質ニューロンをＰＡＮ‐８１１で２４時間処理した場合のＰＡＮ‐８１１の神経毒性を示す図である。
【図９】図９は、虚血による毒性に対するＰＡＮ‐８１１の保護効果を示す図である。
【図１０】図１０は、ＰＡＮ‐８１１または溶媒で事前処理し、過酸化水素で処理した後の細胞生存を示す図である。
【図１１】図１１は、ＰＡＮ‐８１１または溶媒で事前処理し、過酸化水素で処理した後の細胞生存を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学式Ｉ
【化１】
の化合物またはそのプロドラッグを患者に投与することを含む虚血関連状態の治療法方であって、
式中、
Ｅは酸素、硫黄、NHまたはN-C1-6アルキルであり、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4は水素、任意で置換されるアルキル、任意で置換されるアルケニル、任意で置換されるアルキニル、任意で置換されるシクロアルキル、任意で置換されるハロアルキル、任意で置換されるアリール、任意で置換されるアミノアルキル、任意で置換されるヒドロキシアルキル、任意で置換されるアルコキシアルキル、および任意で置換されるアルカノイルで構成されるグループから独立して選択され、あるいは
ＮＲ1Ｒ2を結合してＮ、Ｏ、およびＳから選択されるゼロ、１つ、または２つの追加環へテロ原子で構成されてよい３から７員環を形成し、および
ＨＥＴはＮ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４環へテロ原子で構成され、任意で置換される５から７員へテロアリール残基である化合物、あるいはそのプロドラッグを患者に投与することを含む、虚血関連状態の治療方法。
【請求項２】
Ｅが硫黄である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＨＥＴが化学式
【化２】
の残基であって、
式中、
ｍはゼロまたは１であり、
ｍがゼロの場合は、Ｚ1、Ｚ2、およびＺ3がＮ、Ｏ、Ｓ、またはＣＲから独立して選択され、あるいは
ｍが１の場合は、Ｚ1、Ｚ2、およびＺ3がＮまたはＣＲから独立して選択され、
Ｒは水素、ハロゲン化物、ヒドロキシ、チオール、アミノ、ヒドロキシアミノ、１‐Ｃ1-8アルキルアミノ、２‐（Ｃ1-8アルキル）アミノ、Ｃ1-8アルコキシ、Ｃ1-8アルキル、Ｃ2-8アルケニル、およびＣ2-8アルキニルで構成されるグループから発現ごとに独立して選択され 、また
ｘがゼロから４の整数である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｚ1、Ｚ2、またはＺ3のうち多くても１つがＮであり、残りのＺ1、Ｚ2、およびＺ3がＣＲである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＨＥＴが任意で置換されるピリジル、任意で置換されるピラジニル、ピリミジニル、ピロリル、イミダゾリル、トリアゾリル、オキサゾリルおよびチオキサゾリルで構成されるグループから選択される残基である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＨＥＴが任意で置換されるピリジル残基である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ｅが硫黄であり、
ＨＥＴが任意で置換されるピリジル、任意で置換されるピラジニル、ピリミジニル、ピロリル、イミダゾリル、トリアゾリル、オキサゾリル、チオキサゾリルで構成されるグループから選択される残基であり、また
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4が水素、Ｃ1-8アルキル、Ｃ2-8アルケニル、Ｃ2-8アルキニル、Ｃ3-8シクロアルキル、Ｃ1-8ハロアルキル、Ｃ6-10アリール、アミノ‐Ｃ1-8アルキル、ヒドロキシ‐Ｃ1-8アルキル、Ｃ1-8アルコキシ‐Ｃ1-8アルキル、およびＣ1-8アルカノイルで構成されるグループから独立して選択され、あるいは
ＮＲ1Ｒ2を結合してＮ、Ｏ、およびＳから選択されるゼロ、１つ、または２つの追加環へテロ原子で構成されてよい３から７員環を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
化学式ＩＩ
【化３】
の化合物、あるいはそのプロドラッグを患者に投与することを含む虚血関連状態の治療方法であって、
式中、
Ｒ，Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4は水素、任意で置換されるアルキル、任意で置換されるアルケニル、任意で置換されるアルキニル、任意で置換されるシクロアルキル、任意で置換されるハロアルキル、任意で置換されるアリール、任意で置換されるアミノアルキル、任意で置換されるヒドロキシアルキル、任意で置換されるアルコキシアルキル、および任意で置換されるアルカノイルで構成されるグループから独立して選択され、あるいは
ＮＲ1Ｒ2を結合してＮ、Ｏ、およびＳから選択されるゼロ、１つ、または２つの追加環へテロ原子で構成されてよい３から７員環を形成し、および
ｘがゼロから５の整数である化合物、あるいはそのプロドラッグを患者に投与することを含む、虚血関連状態の治療方法。
【請求項９】
ｘがゼロ、１、２、または３であり、
Ｒ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4は水素、Ｃ1-8アルキル、Ｃ2-8アルケニル、Ｃ2-8アルキニル、Ｃ3-8シクロアルキル、Ｃ1-8ハロアルキル、Ｃ6-10アリール、アミノ‐Ｃ1-8アルキル、ヒドロキシ‐Ｃ1-8アルキル、Ｃ1-8アルコキシ‐Ｃ1-8アルキル、およびＣ1-8アルカノイルで構成されるグループから独立して選択され、あるいは
ＮＲ1Ｒ2を結合してＮ、Ｏ、およびＳから選択されるゼロ、１つ、または２つの追加環へテロ原子で構成されてよい３から７員環を形成する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｒ、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3はＣ1-4アルキル、Ｃ1-2ハロアルキル、フェニル、アミノ‐Ｃ1-4アルキル、ヒドロキシ‐Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシ‐Ｃ148アルキル、およびＣ1-4アルカノイルで構成されるグループから独立して選択され、あるいは
ＮＲ1Ｒ2を結合してＮ、Ｏ、およびＳから選択されるゼロ、または１つの追加環へテロ原子で構成されてよい３から７員環を形成する請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
化学式ＩＩＩ
【化４】
の化合物、あるいはそのプロドラッグが投与される請求項８に記載の方法であって、
式中、
Ｒ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4は水素、Ｃ1-8アルキル、Ｃ2-8アルケニル、Ｃ2-8アルキニル、Ｃ3-8シクロアルキル、Ｃ1-8ハロアルキル、Ｃ6-10アリール、アミノ‐Ｃ1-8アルキル、ヒドロキシ‐Ｃ1-8アルキル、Ｃ1-8アルコキシ‐Ｃ1-8アルキル、およびＣ1-8アルカノイルで構成されるグループから独立して選択され、あるいは
ＮＲ1Ｒ2を結合してＮ、Ｏ、およびＳから選択されるゼロ、１つ、または２つの追加環へテロ原子で構成されてよい３から７員環を形成し、および
Ｒ6は水素、ヒドロキシ、アミノ、またはＣ1-8アルキルであり、
Ｒ5およびＲ7は水素、ハロゲン化物、ヒドロキシ、チオール、アミノ、ヒドロキシアミノ、Ｃ1-8モノアルキルアミノ、（Ｃ1-8アルキル）ジアミノ、 Ｃ1-8アルコキシ、Ｃ1-8アルキル、Ｃ2-8アルケニル、およびＣ2-8アルキニルで構成されるグループから独立して選択される化合物、あるいはそのプロドラッグが投与される請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
Ｒ4が水素またはＣ1-6アルキルである請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
Ｒ4が水素、メチル、エチル、ｎ‐プロピル、イソプロピルである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｒ5は水素または任意で置換されるアミノから選択され、
Ｒ6は水素またはＣ1-4アルキルであり、および
Ｒ7は水素、任意で置換されるアミノ、またはヒドロキシであり、少なくともＲ5アミノ、Ｎ‐ヒドロキシルアミノ、モノ‐またはジ‐（Ｃ1-4アルキル）アミノ、またはＮ‐（Ｃ1-4アルキル）‐Ｎ‐（ヒドロキシ）アミノのうちの１つであり、また
Ｒ5は水素、ヒドロキシアミノ、モノ‐およびジ‐（Ｃ1-8アルキル）アミノ、ヒドロキシ、およびＣ1-8アルコキシで構成されるグループから選択され、
Ｒ6は水素、ヒドロキシアミノ、モノ‐およびジ‐（Ｃ1-8アルキル）アミノで構成されるグループから選択され、さらに
Ｒ5がＲ6とは異なり、Ｒ5またはＲ6が水素である請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
Ｒ4は水素またはＣ1-6アルキルであり、
Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は水素、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-2ハロアルキル、フェニル、アミノ‐Ｃ1-4アルキル、ヒドロキシ‐Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシ‐Ｃ148アルキル、およびＣ1-4アルカノイルで構成されるグループから独立して選択され、あるいは
ＮＲ1Ｒ2を結合してＮ、Ｏ、およびＳから選択されるゼロまたは１つの追加環へテロ原子で構成されてよい３から７員環を形成する請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
Ｒ4が水素、メチル、エチル、ｎ‐プロピルまたはイソプロピルであり、
Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が水素、メチル、エチル、アセチル、ホルミルで構成されるグループから独立して選択され、あるいは
ＮＲ1Ｒ2を結合してピペラジニル、ピロリジニル、モルホリニル、チオモルホリニルを形成する請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
Ｒ4が水素、メチルまたはエチルであり、
Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が水素、メチル、エチルおよびアセチルで構成されるグループから独立して選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
虚血関連障害がアルツハイマー病、パーキンソン病、冠動脈バイパス術、心停止による全脳虚血、局所性脳梗塞、脳出血、出血性梗塞、 高血圧性出血、頭蓋内血管異常の破裂による出血、頭蓋内動脈瘤の破裂によるくも膜下出血、高血圧性脳症、脳虚血につながる頸動脈狭窄症または閉塞、心原性血栓塞栓症、脊髄卒中および脊髄損傷、アテローム性動脈硬化などの脳血管障害、脈管炎、黄斑変性症、心筋梗塞、心虚血および上室性頻拍性不整脈で構成されるグループから選択される請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
以下の化学式
【化５】
の化合物を患者に投与することを含む、虚血関連状態の治療方法。
【請求項２０】
虚血関連障害がアルツハイマー病、パーキンソン病、冠動脈バイパス術、心停止による全脳虚血、局所性脳梗塞、脳出血、出血性梗塞、 高血圧性出血、頭蓋内血管異常の破裂による出血、頭蓋内動脈瘤の破裂によるくも膜下出血、高血圧性脳症、脳虚血につながる頸動脈狭窄症または閉塞、心原性血栓塞栓症、脊髄卒中および脊髄損傷、アテローム性動脈硬化などの脳血管障害、脈管炎、黄斑変性症、心筋梗塞、心虚血および上室性頻拍性不整脈で構成されるグループから選択される請求項１９に記載の方法。
【請求項１】
化学式Ｉ
【化１】
の化合物またはそのプロドラッグを患者に投与することを含む虚血関連状態の治療法方であって、
式中、
Ｅは酸素、硫黄、NHまたはN-C1-6アルキルであり、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4は水素、任意で置換されるアルキル、任意で置換されるアルケニル、任意で置換されるアルキニル、任意で置換されるシクロアルキル、任意で置換されるハロアルキル、任意で置換されるアリール、任意で置換されるアミノアルキル、任意で置換されるヒドロキシアルキル、任意で置換されるアルコキシアルキル、および任意で置換されるアルカノイルで構成されるグループから独立して選択され、あるいは
ＮＲ1Ｒ2を結合してＮ、Ｏ、およびＳから選択されるゼロ、１つ、または２つの追加環へテロ原子で構成されてよい３から７員環を形成し、および
ＨＥＴはＮ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４環へテロ原子で構成され、任意で置換される５から７員へテロアリール残基である化合物、あるいはそのプロドラッグを患者に投与することを含む、虚血関連状態の治療方法。
【請求項２】
Ｅが硫黄である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＨＥＴが化学式
【化２】
の残基であって、
式中、
ｍはゼロまたは１であり、
ｍがゼロの場合は、Ｚ1、Ｚ2、およびＺ3がＮ、Ｏ、Ｓ、またはＣＲから独立して選択され、あるいは
ｍが１の場合は、Ｚ1、Ｚ2、およびＺ3がＮまたはＣＲから独立して選択され、
Ｒは水素、ハロゲン化物、ヒドロキシ、チオール、アミノ、ヒドロキシアミノ、１‐Ｃ1-8アルキルアミノ、２‐（Ｃ1-8アルキル）アミノ、Ｃ1-8アルコキシ、Ｃ1-8アルキル、Ｃ2-8アルケニル、およびＣ2-8アルキニルで構成されるグループから発現ごとに独立して選択され 、また
ｘがゼロから４の整数である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｚ1、Ｚ2、またはＺ3のうち多くても１つがＮであり、残りのＺ1、Ｚ2、およびＺ3がＣＲである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＨＥＴが任意で置換されるピリジル、任意で置換されるピラジニル、ピリミジニル、ピロリル、イミダゾリル、トリアゾリル、オキサゾリルおよびチオキサゾリルで構成されるグループから選択される残基である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＨＥＴが任意で置換されるピリジル残基である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ｅが硫黄であり、
ＨＥＴが任意で置換されるピリジル、任意で置換されるピラジニル、ピリミジニル、ピロリル、イミダゾリル、トリアゾリル、オキサゾリル、チオキサゾリルで構成されるグループから選択される残基であり、また
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4が水素、Ｃ1-8アルキル、Ｃ2-8アルケニル、Ｃ2-8アルキニル、Ｃ3-8シクロアルキル、Ｃ1-8ハロアルキル、Ｃ6-10アリール、アミノ‐Ｃ1-8アルキル、ヒドロキシ‐Ｃ1-8アルキル、Ｃ1-8アルコキシ‐Ｃ1-8アルキル、およびＣ1-8アルカノイルで構成されるグループから独立して選択され、あるいは
ＮＲ1Ｒ2を結合してＮ、Ｏ、およびＳから選択されるゼロ、１つ、または２つの追加環へテロ原子で構成されてよい３から７員環を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
化学式ＩＩ
【化３】
の化合物、あるいはそのプロドラッグを患者に投与することを含む虚血関連状態の治療方法であって、
式中、
Ｒ，Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4は水素、任意で置換されるアルキル、任意で置換されるアルケニル、任意で置換されるアルキニル、任意で置換されるシクロアルキル、任意で置換されるハロアルキル、任意で置換されるアリール、任意で置換されるアミノアルキル、任意で置換されるヒドロキシアルキル、任意で置換されるアルコキシアルキル、および任意で置換されるアルカノイルで構成されるグループから独立して選択され、あるいは
ＮＲ1Ｒ2を結合してＮ、Ｏ、およびＳから選択されるゼロ、１つ、または２つの追加環へテロ原子で構成されてよい３から７員環を形成し、および
ｘがゼロから５の整数である化合物、あるいはそのプロドラッグを患者に投与することを含む、虚血関連状態の治療方法。
【請求項９】
ｘがゼロ、１、２、または３であり、
Ｒ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4は水素、Ｃ1-8アルキル、Ｃ2-8アルケニル、Ｃ2-8アルキニル、Ｃ3-8シクロアルキル、Ｃ1-8ハロアルキル、Ｃ6-10アリール、アミノ‐Ｃ1-8アルキル、ヒドロキシ‐Ｃ1-8アルキル、Ｃ1-8アルコキシ‐Ｃ1-8アルキル、およびＣ1-8アルカノイルで構成されるグループから独立して選択され、あるいは
ＮＲ1Ｒ2を結合してＮ、Ｏ、およびＳから選択されるゼロ、１つ、または２つの追加環へテロ原子で構成されてよい３から７員環を形成する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｒ、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3はＣ1-4アルキル、Ｃ1-2ハロアルキル、フェニル、アミノ‐Ｃ1-4アルキル、ヒドロキシ‐Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシ‐Ｃ148アルキル、およびＣ1-4アルカノイルで構成されるグループから独立して選択され、あるいは
ＮＲ1Ｒ2を結合してＮ、Ｏ、およびＳから選択されるゼロ、または１つの追加環へテロ原子で構成されてよい３から７員環を形成する請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
化学式ＩＩＩ
【化４】
の化合物、あるいはそのプロドラッグが投与される請求項８に記載の方法であって、
式中、
Ｒ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4は水素、Ｃ1-8アルキル、Ｃ2-8アルケニル、Ｃ2-8アルキニル、Ｃ3-8シクロアルキル、Ｃ1-8ハロアルキル、Ｃ6-10アリール、アミノ‐Ｃ1-8アルキル、ヒドロキシ‐Ｃ1-8アルキル、Ｃ1-8アルコキシ‐Ｃ1-8アルキル、およびＣ1-8アルカノイルで構成されるグループから独立して選択され、あるいは
ＮＲ1Ｒ2を結合してＮ、Ｏ、およびＳから選択されるゼロ、１つ、または２つの追加環へテロ原子で構成されてよい３から７員環を形成し、および
Ｒ6は水素、ヒドロキシ、アミノ、またはＣ1-8アルキルであり、
Ｒ5およびＲ7は水素、ハロゲン化物、ヒドロキシ、チオール、アミノ、ヒドロキシアミノ、Ｃ1-8モノアルキルアミノ、（Ｃ1-8アルキル）ジアミノ、 Ｃ1-8アルコキシ、Ｃ1-8アルキル、Ｃ2-8アルケニル、およびＣ2-8アルキニルで構成されるグループから独立して選択される化合物、あるいはそのプロドラッグが投与される請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
Ｒ4が水素またはＣ1-6アルキルである請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
Ｒ4が水素、メチル、エチル、ｎ‐プロピル、イソプロピルである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｒ5は水素または任意で置換されるアミノから選択され、
Ｒ6は水素またはＣ1-4アルキルであり、および
Ｒ7は水素、任意で置換されるアミノ、またはヒドロキシであり、少なくともＲ5アミノ、Ｎ‐ヒドロキシルアミノ、モノ‐またはジ‐（Ｃ1-4アルキル）アミノ、またはＮ‐（Ｃ1-4アルキル）‐Ｎ‐（ヒドロキシ）アミノのうちの１つであり、また
Ｒ5は水素、ヒドロキシアミノ、モノ‐およびジ‐（Ｃ1-8アルキル）アミノ、ヒドロキシ、およびＣ1-8アルコキシで構成されるグループから選択され、
Ｒ6は水素、ヒドロキシアミノ、モノ‐およびジ‐（Ｃ1-8アルキル）アミノで構成されるグループから選択され、さらに
Ｒ5がＲ6とは異なり、Ｒ5またはＲ6が水素である請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
Ｒ4は水素またはＣ1-6アルキルであり、
Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は水素、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-2ハロアルキル、フェニル、アミノ‐Ｃ1-4アルキル、ヒドロキシ‐Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシ‐Ｃ148アルキル、およびＣ1-4アルカノイルで構成されるグループから独立して選択され、あるいは
ＮＲ1Ｒ2を結合してＮ、Ｏ、およびＳから選択されるゼロまたは１つの追加環へテロ原子で構成されてよい３から７員環を形成する請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
Ｒ4が水素、メチル、エチル、ｎ‐プロピルまたはイソプロピルであり、
Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が水素、メチル、エチル、アセチル、ホルミルで構成されるグループから独立して選択され、あるいは
ＮＲ1Ｒ2を結合してピペラジニル、ピロリジニル、モルホリニル、チオモルホリニルを形成する請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
Ｒ4が水素、メチルまたはエチルであり、
Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が水素、メチル、エチルおよびアセチルで構成されるグループから独立して選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
虚血関連障害がアルツハイマー病、パーキンソン病、冠動脈バイパス術、心停止による全脳虚血、局所性脳梗塞、脳出血、出血性梗塞、 高血圧性出血、頭蓋内血管異常の破裂による出血、頭蓋内動脈瘤の破裂によるくも膜下出血、高血圧性脳症、脳虚血につながる頸動脈狭窄症または閉塞、心原性血栓塞栓症、脊髄卒中および脊髄損傷、アテローム性動脈硬化などの脳血管障害、脈管炎、黄斑変性症、心筋梗塞、心虚血および上室性頻拍性不整脈で構成されるグループから選択される請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
以下の化学式
【化５】
の化合物を患者に投与することを含む、虚血関連状態の治療方法。
【請求項２０】
虚血関連障害がアルツハイマー病、パーキンソン病、冠動脈バイパス術、心停止による全脳虚血、局所性脳梗塞、脳出血、出血性梗塞、 高血圧性出血、頭蓋内血管異常の破裂による出血、頭蓋内動脈瘤の破裂によるくも膜下出血、高血圧性脳症、脳虚血につながる頸動脈狭窄症または閉塞、心原性血栓塞栓症、脊髄卒中および脊髄損傷、アテローム性動脈硬化などの脳血管障害、脈管炎、黄斑変性症、心筋梗塞、心虚血および上室性頻拍性不整脈で構成されるグループから選択される請求項１９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２００７−５２７８５４（Ｐ２００７−５２７８５４Ａ）
【公表日】平成１９年１０月４日（２００７．１０．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１３４６３（Ｐ２００６−５１３４６３）
【出願日】平成１６年４月３０日（２００４．４．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１３３３４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９９３７１
【国際公開日】平成１６年１１月１８日（２００４．１１．１８）
【出願人】（５０３０１０２１０）パナシア ファーマシューティカルズ インコーポレーテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１０月４日（２００７．１０．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年４月３０日（２００４．４．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１３３３４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９９３７１
【国際公開日】平成１６年１１月１８日（２００４．１１．１８）
【出願人】（５０３０１０２１０）パナシア ファーマシューティカルズ インコーポレーテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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