説明

蛍光タンパク質およびpH測定方法

【課題】アルカリ性側だけでなく酸性側においても十分な蛍光活性を示す蛍光タンパク質、および、当該蛍光タンパク質を利用した精度の高い細胞機能の測定方法を提供する。
【解決手段】刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物に由来し、アルカリ性環境下および酸性環境下において、互いに蛍光ピーク波長の異なる蛍光活性をそれぞれ有する蛍光タンパク質。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属する生物、特にウミサボテンから遺伝子クローニングによって得られた蛍光タンパク質およびその変異体、ならびに、それらを用いた細胞機能の測定方法に関する。
【背景技術】
【0002】
オワンクラゲ(Aequorea victoria)から、緑色蛍光タンパク質GFP(Green Fluorescent Protein)をコードする遺伝子がクローニングされ、そのリコンビナントGFPが大腸菌や哺乳細胞で発現することが確認された。その結果、このようなリコンビナントGFPは、GFPの蛍光発色団形成に特別なコファクターが不要であり、あらゆる種の細胞にて利用できると認識され、タンパク質の局在や遺伝子の発現をin vivo、in situ、in real timeでモニタリングするための画期的なツールとして用いられるようになった。更に、個体レベルでも用いられ、非侵襲的に生かした状態で観察することが可能となっている。
【0003】
オワンクラゲ由来のGFPは、自ら発色団を形成して蛍光を発する、238アミノ酸からなる27kDのタンパク質である。野生型GFP(wtGFP)は、紫外光395nmに励起極大波長(470nmにマイナーピーク)をもち、509nmの緑色蛍光を発するタンパク質である。発色団は、アミノ酸配列中の64〜69番目の配列(特に65〜67番目の配列)によって形成されている。
【0004】
また、GFPタンパク質の変異体も作製され、中でも65番目のセリンをスレオニンに置換したS65T変異体は、励起極大波長が490nmと長波長側にシフトしており、wtGFPよりも数倍強い蛍光を発する。その後も様々なGFPタンパク質の改変が行われ、現在までに、より明るい蛍光やタンパク質の安定性、溶解度を高める工夫などが加えられた数多くの変異体が作製されている。
【0005】
クロンテック社のEGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein)は、発色団のアミノ酸置換(P64L、S65T等)に加え、晴乳類細胞や植物での翻訳効率を高める目的でヒトのコドン使用頻度に合わせて塩基配列が最適化されており、塩基配列としては190箇所以上の変異が導入されている。さらに、蛍光色の変異体EBFP(Blue)(Y66Hのアミノ酸置換等)、ECFP(Cyan)(Y66Wのアミノ酸置換等)およびEYFP(Yellow)(T203Yのアミノ酸置換等)は、ヒトのコドン使用頻度に合わせた塩基配列の最適化も行われた上で、EGFPとは異なる蛍光色にて観察できる変異体として同社から入手可能である。
【0006】
また、近年、GFP様の蛍光タンパク質を有する生物種が、オワンクラゲ以外にも発見されており、そのような生物種から、それまでに作製されたGFP変異体のどれよりも長波長側にシフトした蛍光(赤い蛍光色)を発する蛍光タンパク質の遺伝子がクローニングされ、利用されるようになった。DsRedは、ディスコソーマ・ストリアタ(Discosoma striata)に由来し、225アミノ酸から成る26kDのタンパク質であり、オワンクラゲGFPと同様に自ら蛍光を発するタンパク質である。DsRedの取得により、オワンクラゲGFPの誘導体では得られなかった、赤色の蛍光(励起極大波長558nm、蛍光波長583nm)を使用することが可能となった。
【0007】
蛍光タンパク質の特性の1つはpH感受性(pKa)である。pKaは、蛍光強度が最大値の50%の値を示すときのpHの値に等しい。ほとんどのGPFはpH(プロトン)に対して感受性を示し、酸性条件では蛍光強度が急速に低下する。野生型のGFPではpH5.5〜12の範囲で蛍光を観察できるが、pH5.5以下では急速に蛍光を失う。酸性側での蛍光活性の失活は、プロトンによる吸光度(モル吸光係数)の低下と、量子収率の低下が考えられるが、GFPに人為的なアミノ酸の変異を施すことによって様々なpH感受性をもつ改変型が開発されてきた。
【0008】
中性付近でイメージングを行う場合、細胞内pHの変化による蛍光量の変化の影響を防ぐため、一般にpKaが6以下のGFPが用いられる。ゴルジ体や分泌小胞などの酸性オルガネラのイメージングを行う場合には、pKaが更に低い改変GFPを使わないと定量的な測定ができない。pKaの低いpH非感受性のGFPとしては、GFPuvやECFP(クロンテック社)が用いられることが多い。
【0009】
一方、pH感受性によって、GFPをpHセンサーとして利用することができる。GFPは、タンパク質であるため、低分子有機化合物から成るpH指示薬(BCECF、SNARF等)とは異なり、移行シグナルペプチド等と融合させることができ、細胞内のオルガネラに局在させることが可能である。そのため、細胞質や核以外にも、ゴルジ体、小胞体、ミトコンドリア等の細胞内小器官でのpH動態が、様々なpKaを示す改変GFPを用いて調べられている。
【0010】
例えば、非特許文献1では、pH依存的にアルカリ性側に蛍光活性を持つEGFPおよびEYFPのそれぞれに、ミトコンドリア移行シグナル(coxIV; cytochrome oxidase subunit IV)またはゴルジ体移行シグナル(GT;galactosyl transferase)を融合させたベクターをHeLa細胞に導入し、融合タンパク質を発現させて、ミトコンドリアまたはゴルジ体に局在したEGFPおよびEYFPの蛍光強度の変化を、各種刺激に応答したpHの変化として捉えている。また、GT−EYFP、および、pHによる蛍光強度変化の少ないECFPにGTを融合させたGT−CFPを用い、ゴルジ体におけるpHの変化をGT−EYFPおよびGT−ECFPの蛍光強度の比によっても計測している。
【0011】
また、非特許文献2では、オワンクラゲ由来のGFPを改変することで、pH依存的に励起スペクトルが変化するGFPを作製し、2波長励起による1波長の蛍光強度を測定し、それぞれの波長で励起したときの蛍光強度の比から細胞内のpHを測定している。しかしながら、当該GFPは、pHによって蛍光スペクトルが変化するものではない。
【0012】
このような従来の蛍光タンパク質では、pH感受性を利用して、細胞内および細胞内小器官のpH変化を測定しようとする場合、1波長で励起し1波長の蛍光強度をモニターする。この方法では、pHの変化を蛍光強度の変化として捉えるため、異なった実験系での数値データを互いに比較することは困難である。
【0013】
また、pH感受性を持つ従来の蛍光タンパク質は、アルカリ性側に蛍光活性を有し、酸性側での蛍光強度は極めて低い。そのため、酸性側からアルカリ性側まで広範囲にカバーすることは難しく、特に酸性側で精度よく測定するには問題がある。
【0014】
さらに、非特許文献1で行われているように、pH感受性の異なる2種類の蛍光タンパク質を用い、それぞれの蛍光強度の比からpHを求めることも可能であるが、両者とも酸性側での蛍光強度が低いため、比をとることによって酸性側での精度が著しく向上するわけではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0015】
【非特許文献1】Llopis et al (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 6803-6808.
【非特許文献2】Miesenbock et al (1998) Nature 394: 192-195.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0016】
本発明の目的は、アルカリ性側だけでなく酸性側においても十分な蛍光活性を示す蛍光タンパク質、および、当該蛍光タンパク質を利用した精度の高い細胞機能の測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0017】
本発明の実施態様によれば、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物に由来し、アルカリ性環境下および酸性環境下において、互いに蛍光ピーク波長の異なる蛍光活性をそれぞれ有する蛍光タンパク質が提供される。
【0018】
また、そのような蛍光タンパク質を対象に導入し、前記蛍光タンパク質が発する蛍光に基づいて前記対象内部のpHを測定する方法が提供される。
【発明の効果】
【0019】
本発明により、1種類の蛍光タンパク質の中に2種類の蛍光特性、すなわち、アルカリ性側にpH依存性を示す蛍光特性と酸性側にpH依存性を示す蛍光特性とを持ち合わせた刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物(例えば、ウミサボテン)由来の蛍光タンパク質が提供され、さらに、このような蛍光タンパク質を用いた、細胞内および細胞内小器官等の精度の高いpH測定方法が提供される。ここにおいて、これらの2種類の蛍光特性は、それぞれ異なった蛍光波長を有している。
【0020】
この互いに反対のpH特性をもつ蛍光タンパク質を用いることによって、2波長励起2波長蛍光または1波長励起2波長蛍光の測定が可能となり、さらに、pHの変化を相対的な蛍光強度の比として計測することが可能となる。そのため、異なった実験条件下における蛍光強度の絶対的な差異をキャンセルでき、種々のデータを互いに比較することができる。また、アルカリ性側および酸性側の両方に蛍光活性を持つことにより、広範囲にpHを測定でき、さらに、酸性側での測定精度も確保できる。
【0021】
また、このような性質を持つウミサボテン由来の蛍光タンパク質は、野生型の状態では多量体を形成するが、人為的にアミノ酸置換を施して単量体化することで、細胞内での凝集および細胞内移動における制限が抑制された変異体が提供される。
【0022】
さらに、野生型のウミサボテン由来蛍光タンパク質は、蛍光発色団の形成が25℃付近で最も高いが、人為的にアミノ酸置換を施すことで、哺乳細胞の培養等に適した温度(例えば37℃付近)において蛍光発色団の形成の最適化され、強い蛍光を発する変異体が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】遺伝子クローニングによって得られたウミサボテン蛍光タンパク質のアミノ酸配列および塩基配列。
【図2a】388nmで励起した場合のpH5、7および9環境下でのウミサボテン蛍光タンパク質の蛍光スペクトル(横軸:波長(nm)、縦軸:蛍光強度(任意単位))。
【図2b】450nmで励起した場合のpH5、7および9環境下でのウミサボテン蛍光タンパク質の蛍光スペクトル(横軸:波長(nm)、縦軸:蛍光強度(任意単位))。
【図3】pH5、7および9環境下でのウミサボテン蛍光タンパク質の吸収スペクトル(横軸:波長(nm)、縦軸:吸光度(任意単位))。
【図4】ウミサボテン蛍光タンパク質の458nmピークの蛍光(388nm励起)および507nmピークの蛍光(450nm励起)におけるpH感受性(横軸:pH、縦軸:蛍光強度(任意単位))。
【図5】ウミサボテン蛍光タンパク質の388nmピークおよび450nmピークの吸収におけるpH感受性(横軸:pH、縦軸:吸光度)。
【図6】各pHにおけるウミサボテン蛍光タンパク質の458nm蛍光(388nm励起)と507nm蛍光(450nm励起)との蛍光強度比(横軸:pH、縦軸:蛍光強度比)。
【図7】各pHにおけるウミサボテン蛍光タンパク質の458nm蛍光と507nm蛍光と(ともに388nm励起)の蛍光強度比(横軸:pH、縦軸:蛍光強度比)。
【図8】野生型蛍光タンパク質および変異体蛍光タンパク質(154番目システインをセリンに置換)の会合状態をSDS−PAGEにより比較した図。
【図9】変異体蛍光タンパク質(37℃で安定化)を大腸菌で発現させたときの蛍光を示す図。
【図10】野生型蛍光タンパク質および変異体蛍光タンパク質(37℃で安定化)の会合状態のゲルろ過法による分析結果。
【図11】ウミサボテン蛍光タンパク質を発現させたU2OS細胞の明視野像(a)、pH=7における蛍光像(b)およびpH=4における蛍光像(c)、ならびに、bおよびcの蛍光スペクトル(d)。
【図12】ウミサボテン蛍光タンパク質を発現させた大腸菌がRAW細胞に貪食される状態を示す蛍光像。
【図13】RAW細胞に貪食される前後のウミサボテン蛍光タンパク質の蛍光スペクトルおよび蛍光強度比を示す表。
【発明を実施するための形態】
【0024】
<蛍光タンパク質>
本発明は、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物に由来し、アルカリ性環境下および酸性環境下において、互いに蛍光ピーク波長の異なる蛍光活性をそれぞれ有する蛍光タンパク質に関する。
【0025】
すなわち、本発明の蛍光タンパク質は、pH>7のいずれかのpHの環境下で蛍光を発し、さらに、pH<7のいずれかのpHの環境下においても前記蛍光の波長とは異なる波長の蛍光を発することができる。このため、本発明の蛍光タンパク質は、環境中のpHの指標として利用することができる。特に、本発明の蛍光タンパク質は、酸性環境下においても十分な強度の蛍光を発生することができるため、従来の蛍光タンパク質と比較して精度の高いpHの指標となる。
【0026】
また、本発明の蛍光タンパク質は、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物に由来する。例えば、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属すカベルヌラリア・オベサ(Cavernularia obesa)(和名:ウミサボテン)に由来する。したがって、未だ分類されていない生物または未発見の生物であっても、それが後に刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属すとされ、且つ、それから得られる蛍光タンパク質が上述のような二峰性の蛍光活性を持てば、本発明に含まれる。なお、ここにいう「由来する」とは、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物が有する野生型の蛍光タンパク質に加えて、その変異体をも含むことを意味する。
【0027】
本発明の蛍光タンパク質の好ましい例は、配列番号1、配列番号3、配列番号4、配列番号5または配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む蛍光タンパク質である。また、本発明の蛍光タンパク質の好ましい例は、これらの配列番号で示されるアミノ酸配列に変異を含むアミノ酸配列を含む蛍光タンパク質である。
【0028】
<野生型>
図1には、このような蛍光タンパク質の一例のアミノ酸配列(配列番号1)および塩基配列(配列番号2)が示される。この蛍光タンパク質の遺伝子は、カベルヌラリア・オベサからクローニングされた。また、当該蛍光タンパク質は、通常、細胞内において二量体を形成する。
【0029】
図2aおよび図2bには、図1にアミノ酸配列を示した蛍光タンパク質の蛍光スペクトルが示される。図2aは、当該蛍光タンパク質を、pH5、7および9の環境下において、388nmの波長の光によって励起したときの蛍光スペクトルである。この場合、pHを9から5へとシフトするほど、458nm付近のピークが大きくなる。特にpH5では、506nm付近のピークも残っているものの、それよりも強い強度で458nmのピークが生じている。一方、図2bは、当該蛍光タンパク質を、pH5、7および9の環境下において、450nmの波長の光によって励起したときの蛍光スペクトルである。この場合、pHを5から9へとシフトするほど、506nm付近のピークが大きくなる。特に、pH9では、506nm付近に単一のピークが生じる。これらのことから、当該蛍光タンパク質は、酸性側において458nm付近に最大のピークを持つ蛍光を発し、アルカリ性側において506nm付近にピークを持つ蛍光を発することがわかる。
【0030】
図3には、図1にアミノ酸配列を示した蛍光タンパク質の、pH5、7および9の環境下における吸収スペクトルが示される。この図から、当該蛍光タンパク質は、pH7および9では498nm付近に主な吸収ピークを持ち、pH5では、388nm付近に最大の吸収ピークを持ち、498nm付近にも吸収ピークを持つことがわかる。
【0031】
図4および図5には、図1にアミノ酸配列を示した蛍光タンパク質の蛍光および吸収のpH感受性が示される。
【0032】
図4は、横軸をpH、縦軸を蛍光強度として、pHの変化と458nm付近または507nm付近の蛍光強度の変化との関係を示している。なお、458nm付近の蛍光強度は388nm付近の励起光を用いて測定し、507nm付近の蛍光強度は450nm付近の蛍光強度を用いて測定した。この図から、507nm付近の蛍光ピークはアルカリ性側に活性を持ち、458nm付近の蛍光ピークは酸性側に活性を持つことがわかる。このとき、507nm付近の蛍光ピークにおけるpKa(すなわち、蛍光強度が、最大値の50%となるpH)は6.5であり、458nm付近の蛍光ピークにおけるpKaは6.0である。すなわち、507nm付近の蛍光は、pH6.5よりもアルカリ性側において最大値の50%を超える蛍光強度を示し、一方、458nm付近の蛍光は、pH6.0よりも酸性側において最大値の50%を超える蛍光強度を示す。このことから、これらの蛍光強度のピークは適度に分離していることがわかる。
【0033】
図5は、横軸をpH、縦軸を吸光度として、pHの変化と388nm付近または498nm付近の励起光の吸収の変化との関係を示している。この図から、498nm付近の励起光はアルカリ性側で吸収され、388nm付近の励起光は酸性側で吸収されることがわかる。
【0034】
また、図6および図7には、各pHにおける、458nm付近の蛍光強度と507nm付近の蛍光強度との比が示される。図6は、2つの励起光を用いた場合、すなわち、388nm付近の励起光を用いて458nm付近の蛍光を検出し、450nm付近の励起光を用いて507nm付近の蛍光を検出した場合である。一方、図7は、1つの励起光を用いた場合、すなわち、388nm付近の励起光を用いて458nm付近および507nm付近の蛍光を検出した場合である。2励起光を用いる場合(図6)、pH6付近を境に、アルカリ性側で507nm/458nmの比が高くなり、酸性側で458nm/507nmの比が高くなることがわかる。一方、1励起光を用いる場合(図7)、pH5.5付近を境に、アルカリ性側で506nm/458nmの比が高くなり、酸性側で458nm/506nmの比が高くなることがわかる。
【0035】
なお、一般に、独立した実験系で蛍光タンパク質の蛍光活性を測定する場合、測定条件を極力同一にしたとしても、検出される蛍光強度の値は変動する可能性がある。例えば、使用する励起光源の状態等により、検出される蛍光強度の絶対値は変動する。また、測定する細胞の状態や培養液の状態などによって、バッググラウンドが上昇または下降することがある。このような場合、それらの実験系から得られる蛍光強度の値同士を直接比較することは適当ではない。これに対し、単一の実験系にて2つの蛍光強度を取得し、その比をもとめれば、蛍光強度の値の変動をキャンセルすることができ、同一条件の下で得られた比は、実験系間でほぼ一定となると考えられる。この点で、図6および7に示されるグラフは、蛍光強度比の検量線として使用することができる。
【0036】
<変異体>
また、本発明の蛍光タンパク質は、野生型のウミサボテン蛍光タンパク質の様々な変異体であってもよい。当該変異体は、アルカリ性環境下および酸性環境下において、互いに蛍光ピーク波長の異なる蛍光活性をそれぞれ有するという特徴を維持する限りにおいて、どのような変異体であってもよい。ここにおいて、変異体とは、野生型蛍光タンパク質のアミノ酸配列に変異(例えば、アミノ酸の置換、欠失および/または付加等)が生じた蛍光タンパク質を指す。この変異とは、野生型蛍光タンパク質のアミノ酸配列の1以上のアミノ酸の変異であり、好ましくは、野生型蛍光タンパク質のアミノ酸配列の1から20のアミノ酸の変異、1から15のアミノ酸の変異、1から10のアミノ酸の変異または1から5のアミノ酸の変異である。好ましくは、当該変異体のアミノ酸配列は、野生型蛍光タンパク質のアミノ酸配列との間で75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上または99%以上の相同性を有する。
【0037】
また、本発明の蛍光タンパク質は、上述のような二峰性の蛍光活性以外の特徴を変化させた変異体を含む。特に、そのような変異は、蛍光タンパク質としての操作性を向上させる変異であることが好ましい。
【0038】
例えば、本発明の蛍光タンパク質には、野生型よりも強度の高い蛍光を発することができる変異体が含まれる。この変異体は、感度の低い測定システムを使用する場合や、タンパク質の発現が弱い細胞にて測定する場合においても、十分な蛍光強度を提供することができる。このような変異体は、当該分野の従来の方法を使用して取得することができ、例えば、野生型の蛍光タンパク質をコードする核酸にランダムに変異を導入した後、それを大腸菌等に発現させ、励起光を照射し、野生型蛍光タンパク質を発現する株よりも強い蛍光を発する株を選択することで取得できる。このような変異体の例は、配列番号3に示されるアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質である。この蛍光タンパク質は、図1に示されるアミノ酸配列の154座位のシステインがアルギニンに置換されたものである。この蛍光タンパク質は、二量体を形成する性質は維持されているが、野生型と比較して蛍光強度が向上している。
【0039】
また、本発明の蛍光タンパク質として、細胞内で単量体として存在できる変異体が含まれる。蛍光タンパク質が二量体を形成する場合、細胞内で凝集を生じたり、細胞内の移動が阻害されたりすることがある。単量体化することによって、そのような問題を回避することができる。特に、蛍光タンパク質に別のタンパク質を融合させる場合、この別のタンパク質の本来の機能に対する影響を最小化することができる。このような単量体化された変異体は、野生型蛍光タンパク質の遺伝子にランダムに変異を導入した後、そのような候補変異体を含むライブラリーから、単量体化され且つ蛍光活性を失っていないものをスクリーニングすることで取得することができる。あるいは、蛍光タンパク質の二量体形成に寄与する可能性が高いアミノ酸に変異を入れた後、単量体化され且つ蛍光活性を失っていないことを確認することで取得することができる。このような単量体化された変異体の例は、配列番号4に示されるアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質である。当該蛍光タンパク質は、図1に示されるアミノ酸配列の154座位のシステインがセリンに置換されたものである。この蛍光タンパク質は、図8に示されるように二量体を形成せず単量体で存在する(右レーンが当該変異体、2量体のバンドが消失している)。
【0040】
また、本発明の蛍光タンパク質として、特定の条件の下で安定性の高い変異体が含まれる。そのようなタンパク質には、例えば、測定対象となる細胞の培養に適した温度の下で蛍光発色団の形成効率が高い変異体が含まれる。野生型の蛍光タンパク質はウミサボテン科の生物に由来するため、蛍光タンパク質は当該生物の生活環境において最も安定的である可能性が高い。その生活環境における温度等の条件が実験条件と大きく異なる場合、蛍光タンパク質の安定性が損なわれる可能性がある。したがって、特に実験で使用する条件の下で安定性の高い蛍光タンパク質の変異体を取得することは精度の高い測定を行う上で利点がある。このような変異体は、図1にアミノ酸配列が示される野生型に対して、または、配列番号4に示されるアミノ酸配列を有する単量体化した変異体に対してランダムに変異を入れた後、それらを大腸菌等に発現させ、特定の条件下で所望の安定性を示す変異体を選択することで取得できる。
【0041】
このような変異体のより具体的な例は、哺乳細胞の培養に適した温度(例えば37℃付近)において野生型の蛍光タンパク質と比較して蛍光強度の強い変異体である。この一例は、配列番号5で示されるアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質である。当該蛍光タンパク質は、図1に示されるアミノ酸配列の126座位のアスパラギンがチロシンに置換され、154座位のシステインがセリンに置換され、および166座位のチロシンがフェニルアラニンに置換されたものである。また別の例は、配列番号6で示されるアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質である。当該蛍光タンパク質は、図1に示されるアミノ酸配列の129座位のセリンがグリシンに置換され、154座位のシステインがセリンに置換され、156座位のアスパラギン酸がグリシンに置換され、204座位のリジンがイソロイシンに置換され、および、209座位のアスパラギンがチロシンに置換されたものである。これら2つの変異体は、上述の単量体化された変異体と同様に154座位のシステインがセリンに置換された変異を含むため単量体で存在する。
【0042】
<核酸>
本発明は、さらに、上述したような野生型蛍光タンパク質または変異体蛍光タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸に関する。このような塩基配列は、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物に由来する塩基配列であってよい。ここにおける「由来する」とは、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物が本来有する野生型の塩基配列に加えて、そこに変異が生じた塩基配列をも含むことを意味する。ここにおける変異とは、塩基配列中の特定の塩基の置換、欠失および/または付加等を指す。塩基配列の変異には、コードされるアミノ酸配列に変化を生じさせない変異をも含む。また、核酸とは、特に、DNAまたはRNAを指す。
【0043】
本発明の核酸の好ましい例は、ウミサボテン由来の野生型蛍光タンパク質をコードする配列番号2の塩基配列を含む核酸、当該野生型タンパク質よりも蛍光強度が増大した変異体(C154R)をコードする配列番号7の塩基配列を含む核酸、当該野生型蛍光タンパク質を単量体化(C154S)した変異体をコードする配列番号8の塩基配列を含む核酸、当該野生型蛍光タンパク質を単量体化し、且つ、哺乳細胞の培養に適した温度での安定性を増大させた変異体(N126Y、C154S、Y166F)(S129G、C154S、D156G、K204I、N209Y)をコードする配列番号9または配列番号10の塩基配列を含む核酸を含む。
【0044】
また、本発明は、これらの核酸を含むベクターを含む。当該ベクターには、蛍光タンパク質をコードする核酸以外に、発現を調節するための配列またはマーカー遺伝子の配列を含む核酸等を含んでよい。
【0045】
<pH測定方法>
また本発明は、本発明に係る蛍光タンパク質を対象に導入し、前記蛍光タンパク質が発する蛍光に基づいて前記対象内部のpHを測定する方法に関する。
【0046】
すなわち、本発明の方法では、対象の内部に蛍光タンパク質を導入した後、励起光を照射して蛍光タンパク質が発する蛍光を検出し、当該蛍光の波長に基づいてpHを特定する。
【0047】
ここにおいて、対象は、バクテリアの細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞または哺乳細胞といった細胞であってよい。さらに、対象は、組織または個体であってよい。細胞は、固定したものであってよいし、生きた状態のものであってよい。固定は、ホルマリン、メタノール等による一般的な方法で行うことができる。また、対象としての個体は、ヒトを除く個体であってよい。さらに、対象は、生物学実験で一般的に用いられる溶液であってよい。対象とする細胞、組織および個体に特に限定はなく、従来の取得方法によって得られるものを使用することができる。
【0048】
対象に蛍光タンパク質を導入するために、細胞等へタンパク質を導入するための当該分野で一般的ないずれの方法を使用してもよい。例えば、対象が細胞である場合、マイクロインジェクション法によって蛍光タンパク質を直接細胞内へ注入してもよい。あるいは、蛍光タンパク質の遺伝子を含む発現ベクターを細胞に導入し、適切に発現させることで導入してもよい。
【0049】
蛍光の検出は、特定の波長の蛍光を測定することが可能な、従来の方法または装置を使用して行うことができる。例えば、蛍光タンパク質を導入した細胞を蛍光顕微鏡下で観察することで行われる。そのような方法の1例において、蛍光の検出は、388nm励起−458nm蛍光および498nm励起−506nm蛍光に対応したフィルターセットの蛍光キューブを具備した倒立型蛍光顕微鏡において、458nmおよび506nmピークの試料の蛍光画像をCCDカメラによって撮像する。撮像した画像内のpH測定対象領域の蛍光強度を数値化しpHを求めることができる。このとき、細胞を種々の条件で刺激し、その後一定時間ごとに撮像することで、系時的に蛍光画像を取得することもできる。さらに、蛍光の測定は、458nm付近および506nm付近の波長のみでなく、蛍光スペクトルを測定することもできる。この場合、具体的には、顕微鏡のカメラポートに光ファイバーを接続し分光光度計にて測定対象領域の蛍光スペクトルを測定することで行うことができる。
【0050】
また、pHの算出は、各pHに対する458nmおよび506nmの蛍光強度並びにそれらの比の値から作成した検量線をもとに行うことができる。検量線は、予め、各pHについて458nmの蛍光強度および506nmの蛍光強度を測定し、それらの比を求めて図6または図7のようにグラフにプロットすることで作成できる。その後、測定したい対象において458nmおよび506nmの蛍光強度を測定し、その比を検量線に当てはめて、対象中のpHを特定することができる。pHの特定を、蛍光強度の絶対値によらず、蛍光強度比によって行うことで、独立した実験から得られた蛍光強度値の間の変動をキャンセルすることが可能となり、測定のたびに検量線を作成する必要がなくなり、また、独立した実験から得られた結果同士を比較することが可能となる。
【0051】
本発明の方法は、蛍光タンパク質を単独で対象に導入する場合に限定されず、蛍光タンパク質と、その蛍光タンパク質とは異なるタンパク質とから成る融合タンパク質を対象に導入する方法も含む。例えば、この「異なるタンパク質」を、対象とする細胞が本来発現しているタンパク質とする場合、そのタンパク質が本来局在している細胞内の部位に、本発明の融合タンパク質も局在することが予想される。その状態で、蛍光タンパク質の蛍光を検出することで、「異なるタンパク質」に応じた特定部位のpHを測定することが可能となる。「異なるタンパク質」は、測定したい部位や、実験の目的に応じて選択することが可能であり、例えば、ミトコンドリア移行シグナル(coxIV)、ゴルジ体移行シグナル(GT)を使用できる。
【0052】
本発明のpH測定方法では、蛍光タンパク質の励起を、波長の異なる2つの励起光を照射することで行うことができる。本発明のpH測定方法は、波長の異なる2つの蛍光を測定することを含むが、その2つの蛍光にそれぞれ対応した、波長の異なる2つの励起光を使用することができる。例えば、図1の蛍光タンパク質を使用する場合、458nm付近および506nm付近の蛍光を発生させるために、388nm付近および450nm付近の励起光が使用することができる(図2aおよび図2b)。また、本発明のpH測定方法では、蛍光タンパク質の励起を、単一波長の励起光を照射して行うことができる。例えば、図1の蛍光タンパク質を使用する場合、458nm付近および506nm付近の蛍光を発生させるために388nm付近の励起光を使用することができる(図2a)。単一の励起光を使用することにより、測定のための装置を単純化することが可能となる。
【実施例】
【0053】
[実施例1:ウミサボテン蛍光タンパク遺伝子のクローニング]
ウミサボテン(Cavernularia obesa)から蛍光タンパク質を抽出および精製し、その部分的なアミノ酸配列を読み取った後、当該配列をもとに遺伝子配列を決定することで蛍光タンパク質遺伝子のクローニングを行った。
【0054】
蛍光タンパク質の抽出精製およびアミノ酸配列分析
島根近海で採取したウミサボテン15個体(約200g)を500mlのSDS−グリシンバッファー中ですり潰し、蛍光活性を持つタンパクを含む可溶性タンパクを抽出した。遠心機を用いて残渣を取り除き、蛍光活性を持つタンパクを含む溶液を抽出した。この抽出溶液に、最終濃度が80%になるように硫酸アンモニウムを加えて硫安沈殿を行った。具体的には、抽出溶液500mlに262gの硫酸アンモニウムを加えた。得られた沈殿を、50mlのトリスバッファー(20mM Tris−HCl(pH7.0)、20mM NaCl)に再溶解させた。これに2倍量のエタノールを加え、タンパク質を再度沈殿させた。さらに、この沈殿にトリスバッファー(20mM Tris−HCl(pH7.0)、20mM NaCl)を加えて再溶解させた。この溶液50mlを、十分量のトリスバッファー(20mM Tris−HCl(pH7.0)、20mM NaCl)および透析膜27/32(三光純薬株式会社)を用いて透析した。透析後の溶液を、DEAE SepharoseCL−6Bカラム(GEヘルスケアバイオサイエンス)を装着したクロマトグラフィーシステムAKTAexplorer(GEヘルスケアバイオサイエンス)を用いてイオン交換分離精製した。このイオン交換は、低塩濃度トリスバッファー(20mM Tris−HCl(pH7.0)、20mM NaCl)で十分に平衡化した後、サンプルを添加し、高塩濃度トリスバッファー(20mM Tris−HCl(pH7.0)、1M NaCl)でNaCl濃度を0.4Mまで上昇させることで行い、その結果、蛍光活性のあるフラクションを分取した。蛍光活性を持つタンパクを含むフラクションの選択は、UV/BLUE CONVERTER PLATE(UVP)を用いて行った。得られたフラクションを、十分量のトリスバッファー(20mM Tris−HCl(pH7.0)、20mM NaCl)および透析膜27/32(三光純薬株式会社)を用いて透析した。透析後の溶液を、限外ろ過アミコンウルトラ:分画分子量30kDa(日本ミリポア株式会社)を用いて濃縮した。次に、Sephacryl S−200 High Resolution(GEヘルスケアバイオサイエンス)およびトリスバッファー(20mM Tris−HCl(pH7.0)、20mM NaCl)を用いてゲルろ過を行った。ゲルろ過後、得られた蛍光活性のあるフラクションをmonoQ 5/50(GEヘルスケアバイオサイエンス)によってイオン交換分離した。このイオン交換は、低塩濃度トリスバッファー(20mM Tris−HCl(pH7.0)、20mM NaCl)で十分に平衡化した後、サンプルを添加し、高塩濃度トリスバッファー(20mM Tris−HCl(pH7.0)、1M NaCl)でNaCl濃度を0.4Mまで上昇させることで行い、その結果、蛍光活性のあるフラクションを得た。この活性のあるフラクションを限外ろ過アミコンウルトラ:分画分子量30kDa(日本ミリポア株式会社)を用いて濃縮し、その後、Superdex 75 10/300 GL(GEヘルスケアバイオサイエンス)およびトリスバッファー(20mM Tris−HCl(pH7.0)、20mM NaCl)を用いてゲルろ過分離を行い、蛍光活性のあるフラクションを得た。このサンプルをSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離してアミノ酸配列を分析した。分析の結果、22残基のアミノ酸配列(IPD YFV QSF PEG FTF ERT LSF E:配列番号11)を決定することができた。
【0055】
蛍光タンパク質遺伝子のクローニング
蛍光タンパク質遺伝子全長のクローニングのために、3’−RACE PCRを下記のとおり実施した。Rapid Amplification of cDNA End法(以下、RACEと略す)により、蛍光タンパク質遺伝子をクローニングするための混合プライマーを作成した。アミノ酸配列解析によって得られたアミノ酸配列IPD YFV QSF PEG FTF ERT LSF E(配列番号11)のうち、コドンの塩基組み合わせが少ないIPDYFVおよびEGFTFERのアミノ酸領域に注目した。これらのアミノ酸領域をコードする塩基配列を予測し、3’末端RACE polymerase chain reaction(以下PCRと略す)に用いる蛍光タンパク質特異的混合プライマー(合計12種類)を以下のように作成した。IPDYFVアミノ酸領域に結合するプライマーとして、COGFP−TTT(5’−ATH CCN GAT TAT TTT GT−3’)(配列番号12)、COGFP−TTC(5’−ATH CCN GAT TAT TTC GT−3’)(配列番号13)、COGFP−TCT(5’−ATH CCN GAT TAC TTT GT−3’)(配列番号14)、COGFP−TCC(5’−ATH CCN GAT TAC TTC GT−3’)(配列番号15)、COGFP−CTT(5’−ATH CCN GAC TAT TTT GT−3’)(配列番号16)、COGFP−CTC(5’−ATH CCN GAC TAT TTC GT−3’)(配列番号17)、COGFP−CCT(5’−ATH CCN GAC TAC TTT GT−3’)(配列番号18)およびCOGFP−CCC(5’−ATH CCN GAC TAC TTC GT−3’)(配列番号19)を作成し、ならびに、EGFTFERアミノ酸領域に結合するプライマーとして、COGFP−ATTAA(5’−GAA GGN TTT ACN TTT GAA AG−3’)(配列番号20)、COGFP−ACCAA(5’−GAA GGN TTC ACN TTC GAA AG−3’)(配列番号21)、COGFP−ATTGA(5’−GAG GGN TTT ACN TTT GAG AG−3’)(配列番号22)およびCOGFP−ACCGA(5’−GAG GGN TTC ACN TTC GAG AG−3’)(配列番号23)を作成した。プライマー中のT、HおよびNは、混合塩基を示す。
【0056】
完全長cDNA合成試薬GeneRacer(インビトロジェン)を用いて作成したウミサボテン完全長cDNAライブラリーを鋳型とし、蛍光タンパク質のアミノ酸配列から予測して作成した12種類の特異的混合プライマーおよび3’末端特異的プライマーであるGeneRacer3’ Primer(5’−GCT GTC AAC GAT ACG CTA CGT AAC G−3’)(配列番号24)およびGeneRacer3’ Nested Primer(5’−CGC TAC GTA ACG GCA TGA CAG TG−3’)(配列番号25)を用いて3’−RACE PCRを行った。GeneRacer3’ PrimerおよびGeneRacer3’ Nested Primerは、完全長cDNA合成試薬GeneRacerキット(インビトロジェン社)に含まれており、これを使用した。3’−RACE PCRによって効果的に蛍光タンパク質遺伝子を増幅させるため、一度PCRによって増幅した遺伝子を鋳型とし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるnested PCRを行った。PCRは、ポリメラーゼEx−Taq(タカラバイオ株式会社)を用いて、マニュアルに従って実施した。
【0057】
一度目のPCRは、IPDYFVアミノ酸領域で作成した8種類プライマー(COGFP−TTT、COGFP−TTC、COGFP−TCT、COGFP−TCC、COGFP−CTT、COGFP−CTC、COGFP−CCT、COGFP−CCC)のいずれかとGeneRacer3’ Primerとの計8つのプライマー対で蛍光タンパク質遺伝子の増幅を行った。10×Ex Taq Buffer(20mM Mg2+添加)を最終濃度等倍、dNTP Mixture(各2.5mM)を最終濃度各0.2mM、TaKaRa Ex Taq(5U/μl)を最終濃度0.05U/μl、8種類のプライマーのうちの1つを最終濃度0.4μMおよびGeneRacer3’Primerを最終濃度0.4μMとして20μlのPCR反応溶液を作製し、ウミサボテン完全長cDNAライブラリー溶液を0.2μl加えた。PCR反応条件として、最初に94℃1分間の熱変性を行い、次に、94℃30秒、45℃30秒および72℃2分のサイクルを30回行い、最後に72℃5分間の伸長反応を行った。PCR反応後、PCR反応溶液2μlを1%トリス酢酸緩衝液(以下、TAEと略す)アガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。8つの反応溶液でわずかに遺伝子増幅が認められたため、このPCR反応溶液を鋳型としてnested PCR反応を実施した。
【0058】
nested PCRは、EGFTFERアミノ酸領域で作成した4種類プライマー(COGFP−ATTAA、COGFP−ACCAA、COGFP−ATTGA、COGFP−ACCGA)の何れかとGeneRacer3’Nested Primerとの計4つのプライマー対で蛍光タンパク質遺伝子の増幅を行った。10×Ex Taq Buffer(20mM Mg2+添加)を最終濃度等倍、dNTP Mixture(各2.5mM)を最終濃度各0.2mM、TaKaRa Ex Taq(5U/μl)を最終濃度0.05U/μl、4種類のプライマーのうちの1つを最終濃度0.4μMおよびGeneRacer3’ Nested Primerを最終濃度0.4μMとして10μlのnested PCR反応溶液を作製し、1度目のPCR反応溶液を鋳型として0.2μlを加えた。PCR反応条件として、最初に94℃1分間の熱変性を行い、次に、94℃30秒、45℃30秒および72℃2分のサイクルを30回行い、最後に72℃5分間の伸長反応を行った。PCR反応後、PCR反応溶液2μlを1%TAEアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。
【0059】
その結果、1度目のPCR反応として、COGFP−TTCとGeneRacer3’ Primerとのプライマー対を用いて実施し、nested PCR反応として、得られたPCR反応溶液を鋳型としてCOGFP−ACCAAとGeneRacer3’ Nested Primerとのプライマー対を用いて実施した場合に、顕著な遺伝子増幅を確認できた。この増幅した遺伝子の塩基配列を決定し、ウミサボテン蛍光タンパク質遺伝子のウミサボテン3’末端側の塩基配列(配列番号26)とした。
【0060】
蛍光タンパク質の5’末端クローニングのための5’−RACEを下記の通り行った。一連の3’−RACE解析によって得られたウミサボテン蛍光タンパク質遺伝子の3’末端側の塩基配列をもとに、5’末端クローニングのための5’−RACEに用いるプライマーを作成した。作成した5’末端クローニング用のプライマーは、COGFP−A−R1(5’−GCT ATA GCC GTC TCA TGT TGC TCG T−3’)(配列番号27)、COGFP−A−R2(5’−AGC CGT CTC ATG TTG CTC GTA GTA G−3’)(配列番号28)およびCOGFP−A−R3(5’−ATG TTG CTC GTA GTA GTT GCC TTC CTC GAC−3’)(配列番号29)の3種類である。COGFP−A−R1、COGFP−A−R2、COGFP−A−R3の順で5’末端に近い位置に結合し、順次nested PCR反応のプライマーとして用いる。
【0061】
完全長cDNA合成試薬GeneRacerを用いて作成したウミサボテン完全長cDNAライブラリーを鋳型とし、3種類の5’末端クローニング用のプライマーならびに5’末端特異的プライマーであるGeneRacer5’ Primer(5’−CGA CTG GAG CAC GAG GAC ACT GA−3’)(配列番号30)およびGeneRacer5’ Nested Primer(5’−GGA CAC TGA CAT GGA CTG AAG GAG TA−3’)(配列番号31)を用いて、5’−RACE PCRを行った。GeneRacer5’ PrimerおよびGeneRacer5’ Nested Primerは完全長cDNA合成試薬GeneRacerキット(インビトロジェン社)に含まれており、これを使用した。5’−RACE PCRによって効果的に蛍光タンパク質遺伝子を増幅させるため、一度PCRによって増幅した遺伝子を鋳型にし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるnested PCRを行った。PCRにはポリメラーゼEx−Taqを用いて、マニュアルに従って実施した。
【0062】
一度目の5’−RACE PCRとして、3’−RACEで増幅した遺伝子の塩基配列をもとに作成したCOGFP−A−R1とGeneRacer5’Primerとのプライマー対を用いて、蛍光タンパク質遺伝子を増幅した。10×Ex Taq Buffer(20mM Mg2+添加)を最終濃度等倍とし、dNTP Mixture(各2.5mM)を最終濃度各0.2mMとし、TaKaRa Ex Taq(5U/μl)を最終濃度0.05U/μlとし、COGFP−A−R1を最終濃度0.4μMとし、GeneRacer5’ Primerを最終濃度0.4μMとして、10μlのPCR反応溶液を作製し、ウミサボテン完全長cDNAライブラリー溶液を0.2μlを加えた。PCR反応条件として、最初に94℃1分間の熱変性を行い、次に、94℃30秒、45℃30秒および72℃2分のサイクルを30回行い、最後に、72℃5分間の伸長反応を行った。PCR反応後、PCR反応溶液2μlを、1%TAEアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。この5’−RACEでわずかに遺伝子増幅が認められたため、このPCR反応溶液を鋳型としてnested PCR反応を実施した。
【0063】
nested PCRとして、COGFP−A−R2とGeneRacer5’ Nested Primerとのプライマー対を用いて蛍光タンパク質GFP遺伝子を増幅した。10×Ex Taq Buffer(20mM Mg2+添加)を最終濃度等倍とし、dNTP Mixture(各2.5mM)を最終濃度各0.2mMとし、TaKaRa Ex Taq(5U/μl)を最終濃度0.05U/μlとし、COGFP−A−R2を最終濃度0.4μMとし、GeneRacer5’ Nested Primerを最終濃度0.4μMとして、10μlのPCR反応溶液を作製し、1度目のPCR反応溶液を鋳型として0.2μlを加えた。PCR反応条件として、最初に94℃1分間の熱変性を行い、次に、94℃30秒、45℃30秒および72℃2分のサイクルを30回行い、最後に、72℃5分間の伸長反応を行った。PCR反応後、PCR反応溶液2μlを、1%TAEアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。
【0064】
その結果、1度目のPCR反応として、COGFP−A−R1とGeneRacer5’ Primerとのプライマー対を用いて実施し、nested PCR反応として、得られたPCR反応溶液を鋳型としてCOGFP−A−R2とGeneRacer5’ Nested Primerとのプライマー対を用いて実施した場合に、顕著な遺伝子増幅を確認できた。しかし、非特異的な複数の遺伝子の増幅が認められたため、このPCR反応溶液を鋳型として、異なるプライマー対を用いて再度nested PCR反応を実施した。
【0065】
二度目のnested PCRとして、COGFP−A−R3とGeneRacer5’ Nested Primerとのプライマー対を用いて、GFP遺伝子を増幅した。10×Ex Taq Buffer(20mM Mg2+添加)を最終濃度等倍とし、dNTP Mixture(各2.5mM)を最終濃度各0.2mMとし、TaKaRa Ex Taq(5U/μl)を最終濃度0.05U/μlとし、COGFP−A−R3を最終濃度0.4μMとし、GeneRacer5’ Nested Primerを最終濃度0.4μMとして、20μlのnested PCR反応溶液を作製し、1度目のnested PCR反応溶液を鋳型として0.4μlを加えた。PCR反応条件として、最初に94℃1分間の熱変性を行い、次に、94℃30秒、45℃30秒および72℃2分のサイクルを30回行い、最後に、72℃5分間の伸長反応を行った。PCR反応後、PCR反応溶液2μlを、1%TAEアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。その結果、一連のnested PCR反応で顕著な遺伝子増幅を確認できた。この増幅した遺伝子の塩基配列を決定し、ウミサボテン蛍光タンパク質遺伝子の5’末端側の塩基配列(配列番号32)とした。
【0066】
次に、蛍光タンパク質遺伝子の完全長の増幅を下記のとおりに行った。上述した3’−RACEおよび5’−RACE解析によって得られたウミサボテン由来の蛍光タンパク質遺伝子の5’末端側の塩基配列をもとに、完全長蛍光タンパク質遺伝子クローニングのための3’−RACEに用いるプライマーを作成した。作成した完全長GFP遺伝子クローニング用のプライマーは、COGFP−A−Full−F3(5’−ATT TAG GTG GCT GCG TAC AG−3’)(配列番号33)、COGFP−A−Full−F4(5’−ATT TAG GTG GCT GCG TAC AGT TAA CAC−3’)(配列番号34)の2種類である。COGFP−A−Full−F3、COGFP−A−Full−F4の順で3’末端に近い位置に結合する。COGFP−A−Full−F4をnested PCR反応のプライマーとして用いる。
【0067】
完全長cDNA合成試薬GeneRacerを用いて作成したウミサボテン完全長cDNAライブラリーを鋳型とし、2種類の完全長蛍光タンパク質遺伝子クローニング用のプライマーならびに3’末端特異的プライマーであるGeneRacer3’ Primer(5’−GCT GTC AAC GAT ACG CTA CGT AAC G−3’)(配列番号24)およびGeneRacer3’ Nested Primer(5’−CGC TAC GTA ACG GCA TGA CAG TG−3’)(配列番号25)を用いて、3’−RACE PCRを行った。GeneRacer3’ PrimerおよびGeneRacer3’ Nested Primerは、完全長cDNA合成試薬GeneRacerキット(インビトロジェン社)に含まれているので、これを使用した。3’−RACE PCRによって効果的に完全長蛍光タンパク質遺伝子を増幅させるため、一度PCRによって増幅した遺伝子を鋳型にし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるnested PCRを行った。PCRにはポリメラーゼEx−Taqを用いてマニュアルに従って実施した。
【0068】
一度目のPCRとして、COGFP−A−Full−F3とGeneRacer3’ Primerとのプライマー対を用いて蛍光タンパク質遺伝子を増幅した。10×Ex Taq Buffer(20mM Mg2+添加)を最終濃度等倍とし、dNTP Mixture(各2.5mM)を最終濃度各0.2mMとし、TaKaRa Ex Taq(5U/μl)を最終濃度0.05U/μlとし、COGFP−A−Full−F3を最終濃度0.4μMとし、GeneRacer3’ Primerを最終濃度0.4μMとして、10μlのnested PCR反応溶液を作製し、ウミサボテン完全長cDNAライブラリー溶液を0.2μlを加えた。PCR反応条件として、最初に94℃1分間の熱変性を行い、次に、94℃30秒、50℃30秒および72℃1分のサイクルを30回行い、最後に、72℃5分間の伸長反応を行った。PCR反応後、PCR反応溶液2μlを1%TAEアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。一度目の5’−RACEでわずかに遺伝子増幅が認められたため、このPCR反応溶液を鋳型としてnested PCR反応を実施した。
【0069】
nested PCRとしてCOGFP−A−Full−F4とGeneRacer5’ Nested Primerとのプライマー対を用いて、蛍光タンパク質遺伝子を増幅した。10×Ex Taq Buffer(20mM Mg2+添加)を最終濃度等倍とし、dNTP Mixture(各2.5mM)を最終濃度各0.2mMとし、TaKaRa Ex Taq(5U/μl)を最終濃度0.05U/μlとし、COGFP−A−Full−F4を最終濃度0.4μMとし、GeneRacer5’ Nested Primerを最終濃度0.4μMとして、10μlのnested PCR反応溶液を作製し、1度目のPCR反応溶液を鋳型として0.2μlを加えた。PCR反応条件として、最初に94℃1分間の熱変性を行い、次に、94℃30秒、50℃30秒および72℃1分のサイクルを30回行い、最後に、72℃5分間の伸長反応を行った。PCR反応後、PCR反応溶液2μlを1%TAEアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。その結果、顕著な遺伝子増幅を確認できた。この増幅した遺伝子の塩基配列を決定して、完全長ウミサボテン蛍光タンパク質遺伝子の5’末端側の塩基配列(配列番号35)とした。
【0070】
得られた完全長ウミサボテン蛍光タンパク質の塩基配列から、配列情報解析ソフトウェアDNASIS Proを用いてウミサボテンGFP遺伝子のオープンリーディングフレームの塩基配列を予想した(配列番号2)。さらに、このオープンリーディングフレームを翻訳してウミサボテン蛍光タンパク質のアミノ酸配列を得た(配列番号1)。このアミノ酸配列は、ウミサボテンから精製し、アミノ酸分析によって得られた22残基の配列(配列番号11)を完全一致の状態で含むことから、ウミサボテンに由来する蛍光タンパク質遺伝子であると決定した。この遺伝子をpRSETベクター(インビトロジェン)に組み込み、大腸菌にトランスフォーメーションし、UV/BLUE CONVERTER PLATE(UVP)を用いて観察したところ顕著な蛍光活性が示された。
【0071】
[実施例2:ウミサボテン蛍光タンパク質の蛍光強度の増強]
野生型ウミサボテン蛍光タンパク質の遺伝子にランダムに変異を導入し、それらを大腸菌に発現させて、野生型よりも強い蛍光強度を示す変異体をスクリーニングした。
【0072】
変異の導入には、GeneMorph II EZClone Domain Mutagenesis Kit(Stratagene社)を用いた。pRSET−A(インビトロジェン社)に野生型のウミサボテン蛍光タンパク質遺伝子がクローニングされたプラスミドを鋳型とし、Pirmer1(ATGAGTATTCCAGAGAATTCGGGCTTAACAG)(配列番号38)およびPrimer2(TCATGGTTTAGCTATGGCCGTCTCATG)(配列番号39)を加えて、キットに添付されているマニュアルに準じてPCR反応を行った。PCR反応後、1%アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、目的とするPCR産物を、Wizard SV Gel and PCR Clean−Up(Promega社)を用いて精製した。精製後、マニュアルに準じてPCR反応を行い、37℃にてDpnIで処理した後に、エタノール沈殿を行った。沈殿後、少量の蒸留水にDNAを溶かして、MicroPulser(BioRad社)を用いてエレクトロポレーション法にてJM109(DE3)にトランスフォームした。トランスフォーム後の大腸菌を、25cm四方のLB(50ng/mlのアンピシリンを添加済み)プレートに播種して、37℃で培養してコロニーを形成させた。コロニー形成後、UV/BLUE CONVERTER PLATE(UVP)を使用して、野生型蛍光タンパク質を発現するコロニーと比べて、強い蛍光を発するコロニーを選択し、再度培養した。その後、それが保持するプラスミドの塩基配列を決定した(配列番号7)。
【0073】
さらに、この塩基配列をアミノ酸配列に変換し(配列番号3)、野生型のアミノ酸配列と比較した結果、154番目のシステインがアルギニンに置換されていることがわかった。
【0074】
[実施例3:ウミサボテン蛍光タンパク質の単量体化]
以下の方法によって、野生型蛍光タンパク質のアミノ酸配列の154番目のシステインをセリンに置換した。変異の導入には、QuickChange II Site−Directed Mutagenesis Kit (Stratagene社)を用いた。pRSET−A(インビトロジェン社)にウミサボテン蛍光タンパク質遺伝子をクローニングしたプラスミドを鋳型とし、Pirmer1(CAATGTATGTATCGGACGACACTTTGG)(配列番号36)およびPrimer2(CCAAAGTGTCGTCCGATACATACATTG)(配列番号37)を使用して、キットに添付されているマニュアルに準じてPCR反応を行った。反応後、37度にてDpnIで処理し、大腸菌JM109(DE3)株にトランスフォームした。
【0075】
トランスフォームされた菌を培養してベクターを取り出し、蛍光タンパク質遺伝子の塩基配列をシーケンサーによって読み取った。その結果、配列番号8の配列が得られ、狙い通りに変異が導入できたことが確認できた。この遺伝子から、154番目がセリンに置換された蛍光タンパク質(配列番号4)が発現する。
【0076】
また、トランスフォーム後の大腸菌を、28度にて培養した後、溶菌してライセートを作製した。これにSDS−PAGEサンプルバッファーを加え、熱を加えずにサンプルを調製して、SDS−PAGEを行った。その結果を図8に示す。図8から、野生型蛍光タンパク質(左レーン)では出現する2量体のバンドが、変異体蛍光タンパク質(右レーン)において消失していることがわかる。このことから、蛍光タンパク質が単量体化されたことが確認された。
【0077】
[実施例4:ウミサボテン蛍光タンパク質の発色団形成温度の改変]
実施例3で得られた単量体化した変異体蛍光タンパク質に対してランダムに変異を導入し、37℃において発色団形成が安定化する変異体をスクリーニングした。
【0078】
変異の導入は、GeneMorph II EZClone Domain Mutagenesis Kit(Stratagene社)を用いた。pRSET−A(インビトロジェン社)に単量体化変異体(154番目のシステインがセリンに置換)の遺伝子がクローニングされたプラスミドを鋳型とし、Pirmer1(ATGAGTATTCCAGAGAATTCGGGCTTAACAG)(配列番号38)およびPrimer2(TCATGGTTTAGCTATGGCCGTCTCATG)(配列番号39)を加えて、キットに添付されているマニュアルに準じてPCR反応を行った。PCR反応後、1%アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、目的とするPCR産物をWizard SV Gel and PCR Clean−Up(Promega社)を用いて精製した。精製後、マニュアルに準じてPCR反応を行い、37℃にてDpnIで処理した後に、エタノール沈殿を行った。沈殿後、少量の蒸留水にDNAを溶かして、MicroPulser(BioRad社)を用いてエレクトロポレーション法にてJM109(DE3)にトランスフォームした。トランスフォーム後の大腸菌を、25cm四方のLB(50ng/mlのアンピシリンを添加済み)プレートに播種して、37℃で培養してコロニーを形成させた。コロニー形成後、UV/BLUE CONVERTER PLATE(UVP)を使用して、野生型蛍光タンパク質を発現するコロニーと比べて、強い蛍光を発するコロニー(それぞれ変異体1および変異体2と名付ける)を2つ選択し、再度培養した。その後、それらが保持するプラスミドの塩基配列を決定した。それぞれの配列は配列番号9および配列番号10に示される。
【0079】
さらに、これらの塩基配列をアミノ酸配列に変換し(変異体1は配列番号5、変異体2は配列番号6)、野生型のアミノ酸配列と比較した。変異体1は、126番目のアスパラギンがチロシンに置換され、154番目のシステインがセリンに置換され、166番目のチロシンがフェニルアラニンに置換されていることがわかった。変異体2は、129番目のセリンがグリシンに置換され、154番目のシステインがセリンに置換され、156番目のアスパラギン酸がグリシンに置換され、204番目のリジンがイソロイシンに置換され、209番目のアスパラギンがチロシンに置換されていることがわかった。
【0080】
また、変異体1および2の37℃における発色団形成の安定性を、野生型蛍光タンパク質および単量体化蛍光タンパク質と比較した。pRSET−A(インビトロジェン社)に、野生型遺伝子、実施例3で作製した単量体化変異体の遺伝子、変異体1の遺伝子および変異体2の遺伝子をそれぞれクローニングし、それぞれJM109(DE3)株にトランスフォームした。これらの株をプレートに塗布し、37℃で培養して蛍光タンパク質を発現させた。その状態をUV/BLUE CONVERTER PLATE(UVP)で観察して、画像を撮影した。図9は、それをモノクロで表した画像である。蛍光は、実際の画像では緑色の光として観察されたが、図9では白色で示され、白色が濃いほど、蛍光強度が高い。野生型および単量体化変異体と比較して、変異体1および2は非常に強い蛍光を発していることがわかる。特に、変異体1に比べて、変異体2のほうが強い蛍光を発していることがわかる。
【0081】
次に、ゲルろ過クロマトグラフィーにて、蛍光タンパク質の会合状態を調べた。野生型蛍光タンパク質を発現する大腸菌および変異体2を発現する大腸菌から、それぞれ蛍光タンパク質を精製し解析した。その結果を図10に示す。野生型では66kDal付近にピークが得られ、一方、変異体2では37kDal付近でピークが得られた。これらの結果は、野生型蛍光タンパク質が2量体を形成しているのに対し、変異体2の蛍光タンパク質が単量体を形成していることを示唆する。
【0082】
[実施例5:固定細胞での細胞内pHの測定]
固定細胞内において、野生型ウミサボテン蛍光タンパク質の蛍光を測定した。
【0083】
哺乳細胞発現ベクターpCDA3.1(インビトロジェン社)に、野生型ウミサボテン蛍光タンパク質のcDNAを組み込んだ。作製されたプラスミドをLipofectamine2000(インビトロジェン社)を用いてU2OS細胞に導入した。Lipofectamine2000は取扱説明書に従って使用した。
【0084】
そのU2OS細胞を一昼夜培養した後、3%中性ホルマリン固定法によって固定し、蛍光顕微鏡(オリンパス社製IX70)にて明視野像を撮影した(図11a)。その後、細胞をリン酸緩衝液(pH=7)で洗浄し、IB励起用の蛍光キューブNIBA(オリンパス社製:励起フィルター470−490nm、ダイクロイックミラー505nm、蛍光フィルター510−550nm)を使用して蛍光像を撮影した。図11bは、それをモノクロで表した画像である。実際の画像において緑色で観察された蛍光は、図11bでは白色で示される。次に、細胞を酢酸緩衝液(pH=4)で洗浄し、U励起用蛍光キューブWU(オリンパス社製:励起フィルター330−385nm、ダイクロイックミラー400nm、蛍光フィルター420nmロングパス)を使用して蛍光像を撮影した。図11cは、それをモノクロで表した画像である。実際の画像において青色で観察された蛍光は、図11cでは白色で示される。これらの画像から、本発明のウミサボテン蛍光タンパク質が、ホルマリン固定された細胞内においても蛍光を発生することができ、さらに、pHに応じてその波長を変化させることが示された。
【0085】
さらに、各pHにおける蛍光スペクトルを計測した(図11d)。計測には浜松ホトニクス社製のマルチチャンネル検出器PMA−11を用いた。その結果、pH4では472nmに、pH7では509nmに最大波長を示すスペクトルが得られた。
【0086】
[実施例6:貪食細胞におけるpHの測定]
生細胞内における野生型ウミサボテン蛍光タンパク質の蛍光を測定して細胞内のpHを推定した。
【0087】
大腸菌発現ベクターpRSET(インビトロジェン社)に野生型ウミサボテン蛍光タンパク質のcDNAを組み込んだ。作製されたプラスミドを大腸菌にトランスフォーメーションし、25℃で培養して、野生型ウミサボテン蛍光タンパク質を大腸菌内で発現させた。この大腸菌を、マウス由来マクロファージRAW264.7細胞株の培養容器内に加えて、一昼夜培養した。なお、大腸菌はRAW細胞によって貪食された後、RAW細胞内の酸性環境下にある細胞小器官リソソームで消化されることが一般に知られている。
【0088】
蛍光顕微鏡観察を行う前に、培養液をリン酸緩衝液(pH=7)で置換した。その後、大腸菌を貪食中のRAW細胞をIB励起用の蛍光キューブNIBA(オリンパス社製:励起フィルター470−490nm、ダイクロイックミラー505nm、蛍光フィルター510−550nm)を用いて撮影した。図12の(a)は、それをモノクロで表した画像である。蛍光キューブNIBAを使用すると、主に緑色の蛍光のみを検出することができるが、図12a中では、緑色の蛍光は白色で表される。さらに、U励起用の蛍光キューブWU(オリンパス社製:励起フィルター330−385nm、ダイクロイックミラー400nm、蛍光フィルター420nmロングパス)を用いて撮影した。図12の(b)は、それをモノクロで表した画像である。蛍光キューブWUを使用すると、緑色および青色を含む420nm以上の蛍光を検出できるが、図12b中では、緑色および青色の蛍光は、ともに白色で表される。
【0089】
図12aによれば、点在する光を観察することができるが、RAW細胞の形を認識することはできない。観察されたこの光は、明視野像(図示せず)との比較から、RAW細胞に貪食される前の培養液中に存在する大腸菌に由来する光であることがわかる。このことから、中性の培養液中に存在する大腸菌内の蛍光タンパク質は、緑色の蛍光を発していることがわかった。
【0090】
図12bに示すように、点在する光に加え、多数の光が集ってRAW細胞の形を形成している様子も観察された。点在する光は、図12aと同様に、貪食前の培養液中の大腸菌に由来する光である。一方、RAW細胞の形を形成する光は、貪食されRAW細胞内のリソソームに取り込まれた大腸菌に由来する光である。ここで、実際の画像によれば、点在する光は緑色に、RAW細胞の形を形成する光は青色に観察された。これらのことから、ウミサボテン蛍光タンパク質は、中性の培養液では緑色の蛍光を発するが、酸性のリソソーム内に移されることにより、青色の蛍光を発するようになることがわかった。
【0091】
さらに、図12bにおけるRAW細胞による貪食の前後における蛍光タンパク質の蛍光スペクトルを図13に示す。この蛍光スペクトルから得られた458nmおよび506nmの蛍光強度に基づいて比を求め、それを図7に示される検量線に当てはめて培養液中およびリソソーム内のpHを推定した(図13下表)。推定されたpHは、培養液中のpHおよびリソソーム内のpHをほぼ反映している。
【0092】
以上の結果から、ウミサボテン蛍光タンパク質は、生きた異種細胞内においても中性環境下から酸性環境下へと移されることで、それが発する蛍光の波長を変化させることができることが示された。さらに、そのときの蛍光強度に基づいてウミサボテン蛍光タンパク質の存在する環境中のpHを良好に求めることができることが示された。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物に由来し、アルカリ性環境下および酸性環境下において、互いに蛍光ピーク波長の異なる蛍光活性をそれぞれ有する蛍光タンパク質。
【請求項2】
アルカリ性環境下における前記蛍光活性が、蛍光ピーク波長が506nm付近且つpKa=6.5であり、酸性環境下における前記蛍光活性が、蛍光ピーク波長が458nm付近且つpKa=6.0である、請求項1に記載の蛍光タンパク質。
【請求項3】
配列番号1で示されるアミノ酸配列を含む請求項1または2に記載の蛍光タンパク質。
【請求項4】
配列番号1で示されるアミノ酸配列に変異を含むアミノ酸配列を含む請求項1または2に記載の蛍光タンパク質。
【請求項5】
前記変異を含むアミノ酸配列が、配列番号3で示されるアミノ酸配列である請求項4に記載の蛍光タンパク質。
【請求項6】
単量体で存在する請求項4に記載の蛍光タンパク質。
【請求項7】
前記変異を含むアミノ酸配列が、配列番号4で示されるアミノ酸配列である請求項6に記載の蛍光タンパク質。
【請求項8】
哺乳細胞の培養に適した温度において、配列番号1で示されるアミノ酸配列を含む蛍光タンパク質よりも強い蛍光を発する請求項4または6に記載の蛍光タンパク質。
【請求項9】
前記変異を含むアミノ酸配列が、配列番号5で示されるアミノ酸配列である請求項8に記載の蛍光タンパク質。
【請求項10】
前記変異を含むアミノ酸配列が、配列番号6で示されるアミノ酸配列である請求項8に記載の蛍光タンパク質。
【請求項11】
請求項1から10の何れか1項に記載の蛍光タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸。
【請求項12】
請求項1から10の何れか1項に記載の蛍光タンパク質を対象に導入し、前記蛍光タンパク質が発する蛍光に基づいて前記対象内部のpHを測定する方法。
【請求項13】
請求項1から10の何れか1項に記載の蛍光タンパク質と前記蛍光タンパク質とは異なるタンパク質とから成る融合タンパク質を対象に導入し、前記蛍光タンパク質が発する蛍光に基づいて前記対象内部のpHを測定する方法。
【請求項14】
前記対象が、細胞、組織または個体である請求項12または13に記載の方法。
【請求項15】
前記対象が、固定した細胞または生きた細胞である請求項15に記載の方法。
【請求項16】
前記測定が、506nm付近の蛍光強度と458nm付近の蛍光強度との比に基づいて行われる、請求項12から15の何れか1項に記載の方法。
【請求項17】
波長の異なる2つの励起光を前記蛍光タンパク質に照射し、前記蛍光タンパク質から発生する蛍光に基づいて前記対象内部のpHを測定する請求項12から16の何れか1項に記載の方法。
【請求項18】
単一の波長の励起光を前記蛍光タンパク質に照射し、前記蛍光タンパク質から発生する蛍光に基づいて前記対象内部のpHを測定する請求項12から16の何れか1項に記載の方法。

【図1】
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【図2a】
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【図2b】
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【図3】
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【図4】
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【図5】
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【図6】
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【図7】
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【図8】
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【図9】
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【図10】
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【図11】
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【図12】
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【図13】
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【公開番号】特開2011−135781(P2011−135781A)
【公開日】平成23年7月14日(2011.7.14)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2009−295976(P2009−295976)
【出願日】平成21年12月25日(2009.12.25)
【出願人】(000000376)オリンパス株式会社 (11,466)
【Fターム(参考)】