蛍光タンパク質およびｐＨ測定方法
【課題】ｐＨ依存的に蛍光極大波長が変化する蛍光タンパク質であって、その変化が特定のｐＨにおいて生じる蛍光タンパク質、および当該蛍光タンパク質を利用した精度の高い細胞機能の測定方法を提供する。
【解決手段】刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物に由来し、ｐＨ依存的に蛍光極大波長が変化する蛍光タンパク質であって、当該変化がｐＨ４とｐＨ１１との間において生じる蛍光タンパク質。また、該蛍光タンパク質を利用する、細胞内ｐＨの測定方法。
【解決手段】刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物に由来し、ｐＨ依存的に蛍光極大波長が変化する蛍光タンパク質であって、当該変化がｐＨ４とｐＨ１１との間において生じる蛍光タンパク質。また、該蛍光タンパク質を利用する、細胞内ｐＨの測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属する生物、特にウミサボテンからの遺伝子クローニングによって得られた蛍光タンパク質の変異体、およびそれを用いた細胞機能の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）が見出され、その遺伝子を大腸菌といった原核生物や線虫といった真核生物において発現させることで緑色の蛍光タンパク質をイメージングできるようになった。また、ＧＦＰに他のタンパク質を融合させることで、細胞内局在や発現量の変化をイメージングすることも出来る。さらに、ＧＦＰを動物個体の組織内で発現させることで、ｉｎ ｖｉｖｏのイメージングを非侵襲的にモニタリングすることが出来る。このような性質から、ＧＦＰは一般的な細胞研究のみならず、ガンの基礎研究や治療効果のモニターといった応用研究にも用いられている。
【０００３】
オワンクラゲ由来のＧＦＰは、自ら発色団を形成して蛍光を発する２３８アミノ酸からなる２７ｋＤのタンパク質である。野生型ＧＦＰ（ｗｔＧＦＰ）は、紫外光３９５ｎｍに励起極大波長（４７０ｎｍにマイナーピーク）をもち、５０９ｎｍの緑色蛍光を発するタンパク質である。発色団は、アミノ酸配列中の６４〜６９番目の配列（特に６５〜６７番目の配列）によって形成されている。
【０００４】
また、種々のＧＦＰタンパク質変異体が作製されている。例えば、アミノ酸配列中の６５番目のセリンをスレオニンに置換したＳ６５Ｔ変異体は、励起極大波長が４９０ｎｍと長波長側にシフトしており、ｗｔＧＦＰよりも数倍強い蛍光を発する。また、２０５番目のスレオニンを芳香族アミノ酸に置換した変異体は、蛍光波長が長波長側にシフトするため黄色蛍光タンパク質として利用できる。さらに、６６番目のチロシンを芳香族アミノ酸に置換した変異体は、蛍光波長が短波長側にシフトするため青色蛍光タンパク質として利用できる。その後も様々なＧＦＰタンパク質の改変が行われ、現在までに、より明るい蛍光やタンパク質の安定性、溶解度を高める工夫などが加えられた数多くの変異体が作製されている。
【０００５】
クロンテック社のＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）は、発色団のアミノ酸置換（Ｐ６４Ｌ、Ｓ６５Ｔ等）に加え、哺乳類細胞や植物での翻訳効率を高める目的でヒトのコドン使用頻度に合わせて塩基配列が最適化されており、塩基配列としては１９０箇所以上の変異が導入されている。さらに、蛍光色の変異体ＥＢＦＰ（Ｂｌｕｅ）（Ｙ６６Ｈのアミノ酸置換等）、ＥＣＦＰ（Ｃｙａｎ）（Ｙ６６Ｗのアミノ酸置換等）およびＥＹＦＰ（Ｙｅｌｌｏｗ）（Ｔ２０３Ｙのアミノ酸置換等）は、ヒトのコドン使用頻度に合わせた塩基配列の最適化も行われた上で、ＥＧＦＰとは異なる蛍光色にて観察できる変異体として同社から入手可能である。
【０００６】
非特許文献１には、オワンクラゲＧＦＰに変異（６５番目のセリンをスレオニンに、４８番目のシステインをセリンに、１４８番目のヒスチジンをシステインに、２０３番目のスレオニンをシステインにそれぞれ置換する変異）を導入して、ｐＨ依存的に蛍光波長が変化する変異体を得たことを開示している。当該変異体は、ｐＨ７付近の前後で吸収スペクトルの傾向が変化し、それより酸性側では４００ｎｍ付近における吸収が増大し、アルカリ性側では５００ｎｍ付近の吸収が増大する。この吸収スペクトルの変化に依存して、ｐＨ７より酸性側では４６０ｎｍ付近の蛍光強度が、アルカリ性側では５１０ｎｍ付近の蛍光強度が増加する。非特許文献１は、この性質による細胞内センサーとしての有用性を示している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Green Fluorescent Protein Variants as Rationmetric Dual Emission pH Sensors. 1. Structural Characterization and Preliminary Application. Hanson GT., McAnaney TB., Park ES., Rendell MEP., Yarbrough DK., Chu S., Xi L., Boxer SG., Montrose MH., and Remington SJ. Biochemistry 2002, 41, 15477-15488.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、ｐＨ依存的に蛍光極大波長が変化する蛍光タンパク質であって、その変化が特定のｐＨにおいて生じる蛍光タンパク質、および当該蛍光タンパク質を利用した精度の高い細胞機能の測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の実施態様によれば、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物に由来し、ｐＨ依存的に蛍光極大波長が変化する蛍光タンパク質であって、当該変化がｐＨ４とｐＨ１１との間において生じる蛍光タンパク質が提供される。
【００１０】
また、そのような蛍光タンパク質を対象に導入し、前記蛍光タンパク質が発する蛍光に基づいて前記対象内部のｐＨを測定する方法が提供される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、ｐＨ依存的に蛍光極大波長が変化する蛍光タンパク質であって、当該変化がｐＨ４とｐＨ１１との間において生じる、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物（例えば、ウミサボテン）由来の蛍光タンパク質が提供され、さらに、このような蛍光タンパク質を用いた、細胞内および細胞内小器官等の精度の高いｐＨ測定方法が提供される。
【００１２】
この蛍光タンパク質を用いることによって、２波長励起２波長蛍光または１波長励起２波長蛍光の測定が可能となり、さらに、ｐＨの変化を相対的な蛍光強度の比として計測することが可能となる。そのため、異なった実験条件下における蛍光強度の絶対的な差異をキャンセルでき、種々のデータを互いに比較することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】３８８ｎｍで励起した場合の各ｐＨにおけるＳ１４７Ａ変異体の蛍光スペクトル（横軸：波長（ｎｍ）、縦軸：蛍光強度（任意単位））。
【図２】４５０ｎｍで励起した場合の各ｐＨにおけるＳ１４７Ａ変異体の蛍光スペクトル（横軸：波長（ｎｍ）、縦軸：蛍光強度（任意単位））。
【図３】各ｐＨにおけるＳ１４７Ａ変異体の吸収スペクトル（横軸：波長（ｎｍ）、縦軸：吸光度（任意単位））。
【図４】野生型ウミサボテン蛍光タンパク質およびＣ１５４Ｓ変異体の会合状態をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより比較した図。
【図５】野生型ウミサボテン蛍光タンパク質、Ｃ１５４Ｓ変異体および２種の温度安定化変異体を大腸菌で発現させたときの蛍光を示す図。
【図６】野生型ウミサボテン蛍光タンパク質および温度安定化変異体の会合状態のゲルろ過法による分析結果。
【図７】野生型ウミサボテン蛍光タンパク質とＳ１４７Ａ変異体とのｐＨ依存性に関する比較を示す図。
【図８】野生型ウミサボテン蛍光タンパク質を発現させたＵ２ＯＳ細胞の明視野像（ａ）、ｐＨ＝７における蛍光像（ｂ）およびｐＨ＝４における蛍光像（ｃ）、ならびに、ｂおよびｃの蛍光スペクトル（ｄ）。
【図９】野生型ウミサボテン蛍光タンパク質を発現させた大腸菌がＲＡＷ細胞に貪食される状態を示す蛍光像。
【図１０】ＲＡＷ細胞に貪食される前後の野生型ウミサボテン蛍光タンパク質の蛍光スペクトルおよび蛍光強度比を示す表。
【図１１ａ】３８８ｎｍで励起した場合の各ｐＨにおけるＳ１４７Ｔ変異体の蛍光スペクトル（横軸：波長（ｎｍ）、縦軸：蛍光強度（任意単位））。
【図１１ｂ】４５０ｎｍで励起した場合の各ｐＨにおけるＳ１４７Ｔ変異体の蛍光スペクトル（横軸：波長（ｎｍ）、縦軸：蛍光強度（任意単位））。
【図１１ｃ】各ｐＨにおけるＳ１４７Ｔ変異体の吸収スペクトル（横軸：波長（ｎｍ）、縦軸：吸光度（任意単位））。
【図１２】野生型ウミサボテン蛍光タンパク質とＳ１４７Ｔ変異体とのｐＨ依存性に関する比較を示す図。
【図１３ａ】３８８ｎｍで励起した場合の各ｐＨにおけるＳ１４７Ｇ変異体の蛍光スペクトル（横軸：波長（ｎｍ）、縦軸：蛍光強度（任意単位））。
【図１３ｂ】４５０ｎｍで励起した場合の各ｐＨにおけるＳ１４７Ｇ変異体の蛍光スペクトル（横軸：波長（ｎｍ）、縦軸：蛍光強度（任意単位））。
【図１３ｃ】各ｐＨにおけるＳ１４７Ｇ変異体の吸収スペクトル（横軸：波長（ｎｍ）、縦軸：吸光度（任意単位））。
【図１４】野生型ウミサボテン蛍光タンパク質とＳ１４７Ｇ変異体とのｐＨ依存性に関する比較を示す図。
【図１５ａ】３８８ｎｍで励起した場合の各ｐＨにおけるＳ１４７Ｃ変異体の蛍光スペクトル（横軸：波長（ｎｍ）、縦軸：蛍光強度（任意単位））。
【図１５ｂ】４５０ｎｍで励起した場合の各ｐＨにおけるＳ１４７Ｃ変異体の蛍光スペクトル（横軸：波長（ｎｍ）、縦軸：蛍光強度（任意単位））。
【図１５ｃ】各ｐＨにおけるＳ１４７Ｃ変異体の吸収スペクトル（横軸：波長（ｎｍ）、縦軸：吸光度（任意単位））。
【図１６】野生型ウミサボテン蛍光タンパク質とＳ１４７Ｃ変異体とのｐＨ依存性に関する比較を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜蛍光タンパク質＞
本発明は、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物に由来し、ｐＨ依存的に蛍光極大波長が変化する蛍光タンパク質であって、当該変化がｐＨ４とｐＨ１１との間において生じる蛍光タンパク質に関する。
【００１５】
本発明の蛍光タンパク質はｐＨ依存的に蛍光極大波長が変化する。特に、この変化はｐＨ４からｐＨ１１の間において生じる。すなわち、たとえばｐＨ３付近の環境に置かれた場合に発する蛍光の極大波長と、たとえばｐＨ１２付近の環境に置かれた場合に発する蛍光の極大波長とが異なり、それらを区別することができる。本発明の蛍光タンパク質が有する蛍光特性を言い換えれば、蛍光極大波長が変化する点を「変化点」と称した場合、変化点より大きなｐＨの環境下で蛍光を発し、さらに、変化点より小さなｐＨの環境下においても前記蛍光の波長とは異なる波長の蛍光を発することができる。このため、本発明の蛍光タンパク質は、環境中のｐＨの指標として利用することができる。特に、本発明の蛍光タンパク質は変化点がアルカリ性側にある場合、主にアルカリ性側におけるｐＨ変化の測定に利用できる。
【００１６】
上記変化点は、上記の通りｐＨ４とｐＨ１１との間に存在し、好ましくは、ｐＨ５とｐＨ１１との間、ｐＨ５とｐＨ１０との間またはｐＨ６とｐＨ１０との間に存在する。更に好ましくは、変化点は、ｐＨ９とｐＨ１０との間に存在し、更にはｐＨ９．１とｐＨ９．９との間、ｐＨ９．２とｐＨ９．８との間、ｐＨ９．３とｐＨ９．７との間またはｐＨ９．４とｐＨ９．６との間に存在し、あるいは変化点は好ましくはｐＨ９．５である。また、変化点は、ｐＨ６付近に存在し、例えばｐＨ５．５からｐＨ６．５の間、ｐＨ５．６からｐＨ６．４の間、ｐＨ５．７からｐＨ６．３の間、ｐＨ５．８からｐＨ６．２の間またはｐＨ５．９からｐＨ６．１の間に存在する。また、変化点は、ｐＨ７とｐＨ８との間に存在し、更にはｐＨ７．１とｐＨ７．９との間、ｐＨ７．２とｐＨ７．８との間、ｐＨ７．３とｐＨ７．７との間またはｐＨ７．４とｐＨ７．６との間に存在し、あるいは変化点は好ましくはｐＨ７．５である。また、変化点は、ｐＨ９付近に存在し、例えばｐＨ８．５からｐＨ９．５の間、ｐＨ８．６からｐＨ９．４の間、ｐＨ８．７からｐＨ９．３の間、ｐＨ８．８からｐＨ９．２の間またはｐＨ８．９からｐＨ９．１の間に存在する。
【００１７】
本発明の蛍光タンパク質は、変化が生じるｐＨより低いｐＨにおいて青色の蛍光を発し、変化が生じるｐＨより高いｐＨにおいて緑色の蛍光を発する。
【００１８】
本発明の蛍光タンパク質は、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物に由来する。例えば、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属すカベルヌラリア・オベサ（Ｃａｖｅｒｎｕｌａｒｉａ ｏｂｅｓａ）（和名：ウミサボテン）に由来する。したがって、未だ分類されていない生物または未発見の生物であっても、それが後に刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属すとされ、且つ、それから得られる蛍光タンパク質が上述のような蛍光活性を持てば、本発明に含まれる。なお、ここにいう「由来する」とは、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物が有する野生型の蛍光タンパク質に加えて、その変異体をも含むことを意味する。
【００１９】
＜Ｓ１４７Ａ変異＞
本発明の蛍光タンパク質の好ましい例は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛍光タンパク質である。この蛍光タンパク質は、カベルヌラリア・オベサが発現する野生型のウミサボテン蛍光タンパク質に対し、複数のアミノ酸を置換する変異を加えたものである。具体的には、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する野生型の蛍光タンパク質に対し、変化点がアルカリ性側にシフトする変異（即ち、１４７番目のセリンをアラニンに置換）のほかに、単量体化する変異（即ち、１５４番目のシステインをセリンに置換）および３７℃において安定化する変異（即ち、１２９番目のセリンをグリシンに、１５６番目のアスパラギン酸をグリシンに、２０４番目のリジンをイソロイシンにおよび２０９番目のアスパラギンをチロシンにそれぞれ置換）を加えている。本願では、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛍光タンパク質のことを、「Ｓ１４７Ａ変異型蛍光タンパク質」、「Ｓ１４７Ａ変異型ウミサボテン蛍光タンパク質」または「Ｓ１４７Ａ変異体」等と称する。
【００２０】
図１および２には、Ｓ１４７Ａ変異体の蛍光スペクトルが示される。図１は、ｐＨ４から１１の各段階において、３８８ｎｍの励起光を照射したときの蛍光スペクトルを示す。一方、図２は、ｐＨ８から１１の各段階において、４５０ｎｍの励起光を照射したときの蛍光スペクトルを示す。図１より、３８８ｎｍの励起光を照射した場合、測定した何れのｐＨにおいても４６２ｎｍ付近を蛍光極大波長とする蛍光を発することがわかる。但し、ｐＨが異なると蛍光強度も大きく異なり、ｐＨが１１から下がるにつれて４６２ｎｍの光の強度が上昇し、ｐＨ５のときに最高となり、ｐＨ４にて下降している。また、図２により、４５０ｎｍの励起光を照射した場合、測定した何れのｐＨにおいても５０９ｎｍ付近を蛍光極大波長とする蛍光を発することがわかる。但し、ｐＨの違いによる蛍光強度の変化が大きく、ｐＨ８および９における蛍光強度と比較して、ｐＨ１０および１１における蛍光強度は大きく上昇している。なお、図２による４５０ｎｍ励起の蛍光スペクトルには、ｐＨ８〜１１における測定結果のみを示しているが、ｐＨ４〜７における測定では蛍光がほとんど検出されなかったため表示を省略している。
【００２１】
図３には、Ｓ１４７Ａ変異体の、ｐＨ４から１１の各段階における吸収スペクトルが示される。ｐＨ４から７の環境下では、当該蛍光タンパク質は３９２ｎｍ付近に高い吸収ピークを有するものの、５０２ｎｍ付近においてはほとんどピークを有さない。ｐＨ８および９では、３９２ｎｍ付近に高い吸収ピークを有し、さらに５０２ｎｍ付近においてもやや高い吸収ピークを有する。ｐＨ１０および１１の環境下では、３９２ｎｍ付近ではその他のｐＨの場合と比較して低い吸収ピークを有するが、５０２ｎｍ付近において高い吸収ピークを有する。図１から３の結果から、４６２ｎｍピークの蛍光は、主に３９２ｎｍピークの励起光によって発せられることがわかる。一方、５０９ｎｍピークの蛍光は、５０２ｎｍピークの励起光によって発せられるが、３９２ｎｍピークの励起光によっても発せられることがわかる。
【００２２】
さらに、図７には、ｐＨ依存的な蛍光波長の変化に関して、Ｓ１４７Ａ変異体と野生型ウミサボテン蛍光タンパク質との比較を示す。蛍光タンパク質を含む溶液を、それぞれの蛍光タンパク質について８種作製した。この８種の溶液のｐＨは４〜１１の間で異なるように調整されている。これらを並べて３６５ｎｍの励起光を照射して、生じる蛍光を撮影した。図７は、この撮影した画像をモノクロで示したものである。図中、野生型ウミサボテン蛍光タンパク質をＷｉｌｄ ＣｏＧＦＰと示し（上段）、Ｓ１４７Ａ変異体をＳ１４７Ａ Ｍｕｔａｎｔと示す（下段）。カラーで得られた画像によると、野生型では、ｐＨ４において溶液は青色の光を発し、ｐＨ６およびそれより高いｐＨにおいて緑色の光を発し、ｐＨ５において中間的な光を発している。すなわち、野生型ではｐＨ５前後において蛍光極大波長が変化する。一方、Ｓ１４７Ａ変異体では、ｐＨ９およびそれより低いｐＨにおいて青色の光を発し、ｐＨ１０および１１において緑色の光を発している。すなわち、Ｓ１４７Ａ変異体ではｐＨ９とｐＨ１０との間において蛍光極大波長が変化する。
【００２３】
＜Ｓ１４７Ｔ変異＞
本発明の蛍光タンパク質の好ましい例は、配列番号４２で示されるアミノ酸配列を含む蛍光タンパク質である。この蛍光タンパク質は、カベルヌラリア・オベサが発現する野生型のウミサボテン蛍光タンパク質に対し、複数のアミノ酸を置換する変異を加えたものである。具体的には、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する野生型の蛍光タンパク質に対し、変化点がアルカリ性側にシフトする変異（即ち、１４７番目のセリンをスレオニンに置換）のほかに、単量体化する変異（即ち、１５４番目のシステインをセリンに置換）および３７℃において安定化する変異（即ち、１２９番目のセリンをグリシンに、１５６番目のアスパラギン酸をグリシンに、２０４番目のリジンをイソロイシンにおよび２０９番目のアスパラギンをチロシンにそれぞれ置換）を加えている。本願では、配列番号４２で示されるアミノ酸配列を含む蛍光タンパク質のことを、「Ｓ１４７Ｔ変異型蛍光タンパク質」、「Ｓ１４７Ｔ変異型ウミサボテン蛍光タンパク質」または「Ｓ１４７Ｔ変異体」等と称する。
【００２４】
図１１ａおよび図１１ｂには、Ｓ１４７Ｔ変異体の蛍光スペクトルが示される。図１１ａは、ｐＨ４から１１の各段階において、３８８ｎｍの励起光を照射したときの蛍光スペクトルを示す。一方、図１１ｂは、ｐＨ４から１１の各段階において、４５０ｎｍの励起光を照射したときの蛍光スペクトルを示す。図１１ａより、３８８ｎｍの励起光を照射した場合、各ｐＨにおいて４６０ｎｍ付近のピークと５０７ｎｍ付近のピークとからなるスペクトルが得られた。但し、ｐＨ４からｐＨ７では４６０ｎｍ付近のピークの方がより強い蛍光強度を示し、ｐＨ８からｐＨ１１では５０７ｎｍ付近のピークの方がより強い蛍光強度を示した。また、図１１ｂによると、４５０ｎｍの励起光を照射した場合、測定した何れのｐＨにおいても５０７ｎｍ付近に主要なピークが得られた。但し、ｐＨの違いによる蛍光強度の変化が大きく、ｐＨが下がるに従って、蛍光強度は減少した。
【００２５】
図１１ｃには、Ｓ１４７Ｔ変異体の、ｐＨ４から１１の各段階における吸収スペクトルが示される。ｐＨ４から７では、３８９ｎｍ付近と４９９ｎｍ付近とに主要な２つのピークが得られた。特に、ｐＨ４および５では３８９ｎｍ付近のピークの方が４９９ｎｍ付近のピークと比較して吸収が大きく、ｐＨ６ではそれらのピークにおける吸収が同程度となり、ｐＨ７では４９９ｎｍ付近のピークにおける吸収の方が大きい。さらに、ｐＨ８からｐＨ１１では、３８９ｎｍ付近での吸収ピークはほとんど消失し、４９９ｎｍ付近にて大きな吸収を示した。図１１ａ−ｃの結果から、４６０ｎｍピークの蛍光は、主に３８９ｎｍ付近のピークの励起光によって発せられることがわかる。一方、５０７ｎｍピークの蛍光は、主に４９９ｎｍ付近のピークの励起光によって発せられるが、３８９ｎｍ付近のピークの励起光によっても発せられることがわかる。
【００２６】
さらに、図１２には、ｐＨ依存的な蛍光波長の変化に関して、Ｓ１４７Ｔ変異体と野生型ウミサボテン蛍光タンパク質との比較を示す。蛍光タンパク質を含む溶液を、それぞれの蛍光タンパク質について８種作製した。この８種の溶液のｐＨは４〜１１の間で異なるように調整されている。これらを並べて３６５ｎｍの励起光を照射して、生じる蛍光を撮影した。図１２は、この撮影した画像をモノクロで示したものである。図中、野生型ウミサボテン蛍光タンパク質をＷｉｌｄ ＣｏＧＦＰと示し（上段）、Ｓ１４７Ｔ変異体をＳ１４７Ｔ Ｍｕｔａｎｔと示す（下段）。カラーで得られた画像によると、野生型では、ｐＨ４において溶液は青色の光を発し、ｐＨ６およびそれより高いｐＨにおいて緑色の光を発し、ｐＨ５において中間的な光を発している。すなわち、野生型ではｐＨ５前後において蛍光極大波長が変化する。一方、Ｓ１４７Ｔ変異体では、ｐＨ４および５において青色の光を発し、ｐＨ７以上において緑色の光を発し、ｐＨ６付近において中間的な光を発している。すなわち、Ｓ１４７Ｔ変異体ではｐＨ６付近において蛍光極大波長が変化する。
【００２７】
＜Ｓ１４７Ｇ変異＞
本発明の蛍光タンパク質の好ましい例は、配列番号４６で示されるアミノ酸配列を含む蛍光タンパク質である。この蛍光タンパク質は、カベルヌラリア・オベサが発現する野生型のウミサボテン蛍光タンパク質に対し、複数のアミノ酸を置換する変異を加えたものである。具体的には、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する野生型の蛍光タンパク質に対し、変化点がアルカリ性側にシフトする変異（即ち、１４７番目のセリンをグリシンに置換）のほかに、単量体化する変異（即ち、１５４番目のシステインをセリンに置換）および３７℃において安定化する変異（即ち、１２９番目のセリンをグリシンに、１５６番目のアスパラギン酸をグリシンに、２０４番目のリジンをイソロイシンにおよび２０９番目のアスパラギンをチロシンにそれぞれ置換）を加えている。本願では、配列番号４６で示されるアミノ酸配列を含む蛍光タンパク質のことを、「Ｓ１４７Ｇ変異型蛍光タンパク質」、「Ｓ１４７Ｇ変異型ウミサボテン蛍光タンパク質」または「Ｓ１４７Ｇ変異体」等と称する。
【００２８】
図１３ａおよび図１３ｂには、Ｓ１４７Ｇ変異体の蛍光スペクトルが示される。図１３ａは、ｐＨ４から１１の各段階において、３８８ｎｍの励起光を照射したときの蛍光スペクトルを示す。一方、図１３ｂは、ｐＨ４から１１の各段階において、４５０ｎｍの励起光を照射したときの蛍光スペクトルを示す。図１３ａより、３８８ｎｍの励起光を照射した場合、ｐＨ４からｐＨ９では、主に４６０ｎｍ付近に高いピークを有することがわかる。一方、ｐＨ１０および１１では、４６０ｎｍ付近にもピークはあるものの、それよりもやや高いピークが５０６ｎｍ付近に見られる。但し、ｐＨ１０および１１における蛍光強度は、それ以外のｐＨと比較して全体的に小さい。図１３ｂによると、４５０ｎｍの励起光を照射した場合、ｐＨ５から１１において５０６ｎｍ付近に主要なピークを有することがわかる。但し、ｐＨの違いによる蛍光強度の変化が大きく、ｐＨ１０および１１において高い強度を示し、ｐＨが下がるに従って蛍光強度は小さくなっている。
【００２９】
図１３ｃには、Ｓ１４７Ｇ変異体の、ｐＨ４から１１の各段階における吸収スペクトルが示される。ｐＨ４から６の環境下では、当該蛍光タンパク質は３９４ｎｍ付近に高い吸収ピークを有するものの、４９５ｎｍ付近においてはほとんどピークを有さない。ｐＨ７から９においては、３９４ｎｍ付近と４９５ｎｍ付近との両方において吸収ピークを有するが、ｐＨが大きくなるほど、３９４ｎｍ付近のピークが小さくなり、４９５ｎｍ付近のピークが大きくなっている。ｐＨ１０および１１においては、３９４ｎｍ付近のピークはほとんど消失しており、４９５ｎｍ付近に大きなピークを有する。図１３ａ−ｃの結果から、４６０ｎｍ付近のピークの蛍光は、主に３９４ｎｍ付近のピークの励起光によって発せられることがわかる。一方、５０６ｎｍ付近のピークの蛍光は、４９５ｎｍ付近のピークの励起光によって発せられるが、３９４ｎｍ付近のピークの励起光によっても発せられることがわかる。
【００３０】
さらに、図１４には、ｐＨ依存的な蛍光波長の変化に関して、Ｓ１４７Ｇ変異体と野生型ウミサボテン蛍光タンパク質との比較を示す。蛍光タンパク質を含む溶液を、それぞれの蛍光タンパク質について８種作製した。この８種の溶液のｐＨは４〜１１の間で異なるように調整されている。これらを並べて３６５ｎｍの励起光を照射して、生じる蛍光を撮影した。図１４は、この撮影した画像をモノクロで示したものである。図中、野生型ウミサボテン蛍光タンパク質をＷｉｌｄ ＣｏＧＦＰと示し（上段）、Ｓ１４７Ｇ変異体をＳ１４７Ｇ Ｍｕｔａｎｔと示す（下段）。カラーで得られた画像によると、野生型では、ｐＨ４において溶液は青色の光を発し、ｐＨ６およびそれより高いｐＨにおいて緑色の光を発し、ｐＨ５において中間的な光を発している。すなわち、野生型ではｐＨ５前後において蛍光極大波長が変化する。一方、Ｓ１４７Ｇ変異体では、ｐＨ７以下において青色の光を発し、ｐＨ８以上において緑色の光を発している。すなわち、Ｓ１４７Ｇ変異体ではｐＨ７とｐＨ８との間において蛍光極大波長が変化する。
【００３１】
＜Ｓ１４７Ｃ変異＞
本発明の蛍光タンパク質の好ましい例は、配列番号５０で示されるアミノ酸配列を含む蛍光タンパク質である。この蛍光タンパク質は、カベルヌラリア・オベサが発現する野生型のウミサボテン蛍光タンパク質に対し、複数のアミノ酸を置換する変異を加えたものである。具体的には、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する野生型の蛍光タンパク質に対し、変化点がアルカリ性側にシフトする変異（即ち、１４７番目のセリンをシステインに置換）のほかに、単量体化する変異（即ち、１５４番目のシステインをセリンに置換）および３７℃において安定化する変異（即ち、１２９番目のセリンをグリシンに、１５６番目のアスパラギン酸をグリシンに、２０４番目のリジンをイソロイシンにおよび２０９番目のアスパラギンをチロシンにそれぞれ置換）を加えている。本願では、配列番号５０で示されるアミノ酸配列を含む蛍光タンパク質のことを、「Ｓ１４７Ｃ変異型蛍光タンパク質」、「Ｓ１４７Ｃ変異型ウミサボテン蛍光タンパク質」または「Ｓ１４７Ｃ変異体」等と称する。
【００３２】
図１５ａおよびｂには、Ｓ１４７Ｃ変異体の蛍光スペクトルが示される。図１５ａは、ｐＨ４から１１の各段階において、３８８ｎｍの励起光を照射したときの蛍光スペクトルを示す。一方、図１５ｂは、ｐＨ４から１１の各段階において、４５０ｎｍの励起光を照射したときの蛍光スペクトルを示す。図１５ａより、３８８ｎｍの励起光を照射した場合、測定した何れのｐＨにおいても４６０ｎｍ付近を蛍光極大波長とする蛍光を発することがわかる。特に、ｐＨ４からｐＨ９において大きな蛍光強度を示すことがわかる。また、図１５ｂによると、４５０ｎｍの励起光を照射した場合、ｐＨ８から１１において５１２ｎｍ付近を蛍光極大波長とする蛍光を発することがわかる。但し、ｐＨの違いによる蛍光強度の変化が大きく、ｐＨ１１において最も高い蛍光強度を示し、ｐＨが下がるに従って、蛍光強度が小さくなることがわかる。
【００３３】
図１５ｃには、Ｓ１４７Ｃ変異体の、ｐＨ４から１１の各段階における吸収スペクトルが示される。ｐＨ４から７の環境下では、当該蛍光タンパク質は３９６ｎｍ付近に高い吸収ピークを有するものの、５０５ｎｍ付近においてはほとんどピークを有さない。ｐＨ８および９では、３９６ｎｍ付近および５０５ｎｍ付近の両方に吸収ピークを有する。ｐＨ１０および１１の環境下では、３９６ｎｍ付近のピークはほとんど消失し、５０５ｎｍ付近において高い吸収ピークを有する。図１５ａ−ｃの結果から、４６０ｎｍ付近のピークの蛍光は、主に３９６ｎｍピークの励起光によって発せられることがわかる。一方、５１２ｎｍ付近のピークの蛍光は、主に５０５ｎｍピークの励起光によって発せられることがわかる。
【００３４】
さらに、図１６には、ｐＨ依存的な蛍光波長の変化に関して、Ｓ１４７Ｃ変異体と野生型ウミサボテン蛍光タンパク質との比較を示す。蛍光タンパク質を含む溶液を、それぞれの蛍光タンパク質について８種作製した。この８種の溶液のｐＨは４〜１１の間で異なるように調整されている。これらを並べて３６５ｎｍの励起光を照射して、生じる蛍光を撮影した。図１６は、この撮影した画像をモノクロで示したものである。図中、野生型ウミサボテン蛍光タンパク質をＷｉｌｄ ＣｏＧＦＰと示し（上段）、Ｓ１４７Ｃ変異体をＳ１４７Ｃ Ｍｕｔａｎｔと示す（下段）。カラーで得られた画像によると、野生型では、ｐＨ４において溶液は青色の光を発し、ｐＨ６およびそれより高いｐＨにおいて緑色の光を発し、ｐＨ５において中間的な光を発している。すなわち、野生型ではｐＨ５前後において蛍光極大波長が変化する。一方、Ｓ１４７Ｃ変異体では、ｐＨ８以下において青色の光を発し、ｐＨ１０および１１において緑色の光を発し、ｐＨ９において、若干緑がかった青色を示している。すなわち、Ｓ１４７Ｃ変異体ではｐＨ９付近において蛍光極大波長が変化する。
【００３５】
＜その他の変異＞
本発明の蛍光タンパク質は、野生型のウミサボテン蛍光タンパク質の変異体であってよい。Ｓ１４７Ａ変異体、Ｓ１４７Ｔ変異体、Ｓ１４７Ｇ変異体およびＳ１４７Ｃ変異体はそれぞれ、そのような変異体の１つである。本発明に係る変異体は、ｐＨ依存的に蛍光極大波長が変化する蛍光タンパク質であって、当該変化がアルカリ性側、特にｐＨ４とｐＨ１１との間において生じるという特徴を維持する限りにおいて、どのような変異体であってもよい。また、各種の変異は、１つのタンパク質または遺伝子に対して同時に導入されてよい。ここにおいて、変異体とは、野生型蛍光タンパク質のアミノ酸配列に変異（例えば、アミノ酸の置換、欠失および／または付加等）が生じた蛍光タンパク質を指す。この変異とは、野生型蛍光タンパク質のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸の変異であり、好ましくは、野生型蛍光タンパク質のアミノ酸配列の１から２０のアミノ酸の変異、１から１５のアミノ酸の変異、１から１０のアミノ酸の変異または１から５のアミノ酸の変異である。好ましくは、当該変異体のアミノ酸配列は、野生型蛍光タンパク質のアミノ酸配列との間で７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の相同性を有する。
【００３６】
また、本発明の蛍光タンパク質は、上述のような二峰性の蛍光活性以外の特徴を変化させた変異体を含む。特に、そのような変異は、蛍光タンパク質としての操作性を向上させる変異であることが好ましい。
【００３７】
例えば、本発明に係る蛍光タンパク質には、野生型よりも強度の高い蛍光を発することができる変異体が含まれる。この変異体は、感度の低い測定システムを使用する場合や、タンパク質の発現が弱い細胞にて測定する場合においても、十分な蛍光強度を提供することができる。このような変異体は、当該分野の従来の方法を使用して取得することができ、例えば、野生型の蛍光タンパク質をコードする核酸にランダムに変異を導入した後、それを大腸菌等に発現させ、励起光を照射し、野生型蛍光タンパク質を発現する株よりも強い蛍光を発する株を選択することで取得できる。
【００３８】
また、本発明に係る蛍光タンパク質には、細胞内で単量体として存在できる変異体が含まれる。蛍光タンパク質が二量体を形成する場合、細胞内で凝集を生じたり、細胞内の移動が阻害されたりすることがある。単量体化することによって、そのような問題を回避することができる。特に、蛍光タンパク質に別のタンパク質を融合させる場合、この別のタンパク質の本来の機能に対する影響を最小化することができる。このような単量体化された変異体は、元となる蛍光タンパク質の遺伝子にランダムに変異を導入した後、そのような候補変異体を含むライブラリーから、単量体化され且つ蛍光活性を失っていないものをスクリーニングすることで取得することができる。あるいは、蛍光タンパク質の二量体形成に寄与する可能性が高いアミノ酸に変異を入れた後、単量体化され且つ蛍光活性を失っていないことを確認することで取得することができる。Ｓ１４７Ａ変異体、Ｓ１４７Ｔ変異体、Ｓ１４７Ｇ変異体およびＳ１４７Ｃ変異体はそれぞれ、この変異を含む（１５４番目のシステインがセリンに置換されている）。
【００３９】
また、本発明に係る蛍光タンパク質には、特定の条件の下で安定性の高い変異体が含まれる。そのようなタンパク質には、例えば、測定対象となる細胞の培養に適した温度の下で蛍光発色団の形成効率が高い変異体が含まれる。野生型の蛍光タンパク質はウミサボテン科の生物に由来するため、蛍光タンパク質は当該生物の生活環境において最も安定的である可能性が高い。その生活環境における温度等の条件が実験条件と大きく異なる場合、蛍光タンパク質の安定性が損なわれる可能性がある。したがって、特に実験で使用する条件の下で安定性の高い蛍光タンパク質の変異体を取得することは精度の高い測定を行う上で利点がある。このような変異体は、元となる蛍光タンパク質の遺伝子にランダムに変異を入れた後、それらを大腸菌等に発現させ、特定の条件下で所望の安定性を示す変異体を選択することで取得できる。このような変異体のより具体的な例は、哺乳細胞の培養に適した温度（例えば３７℃付近）において野生型の蛍光タンパク質と比較して蛍光強度の強い変異体である。Ｓ１４７Ａ変異体、Ｓ１４７Ｔ変異体、Ｓ１４７Ｇ変異体およびＳ１４７Ｃ変異体はそれぞれ、３７℃において安定化する変異を含む（即ち、１２９番目のセリンがグリシンに、１５６番目のアスパラギン酸がグリシンに、２０４番目のリジンがイソロイシンにおよび２０９番目のアスパラギンがチロシンにそれぞれ置換されている）。
【００４０】
＜核酸＞
本発明は、本発明に係る蛍光タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸に関する。このような塩基配列は、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物に由来する塩基配列であってよい。ここにおける「由来する」とは、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物が本来有する野生型の塩基配列に変異が生じた塩基配列を含むことを意味する。また、ここにおける変異とは、塩基配列中の特定の塩基の置換、欠失および／または付加等を指す。塩基配列の変異には、コードされるアミノ酸配列に変化を生じさせない変異をも含む。また、核酸とは、特に、ＤＮＡまたはＲＮＡを指す。
【００４１】
本発明の核酸の好ましい例は、配列番号２に示される塩基配列を含む核酸（Ｓ１４７Ａ変異体をコード）、配列番号４３に示される塩基配列を含む核酸（Ｓ１４７Ｔ変異体をコード）、配列番号４７に示される塩基配列を含む核酸（Ｓ１４７Ｇ変異体をコード）、または配列番号５１に示される塩基配列を含む核酸（Ｓ１４７Ｃ変異体をコード）である。
【００４２】
また、本発明は、これらの核酸を含むベクターを含む。当該ベクターには、蛍光タンパク質をコードする核酸以外に、発現を調節するための配列またはマーカー遺伝子の配列を含む核酸等を含んでよい。
【００４３】
＜ｐＨ測定方法＞
本発明は、本発明に係る蛍光タンパク質を対象に導入し、前記蛍光タンパク質が発する蛍光に基づいて前記対象内部のｐＨを測定する方法に関する。
【００４４】
すなわち、本発明の方法では、対象の内部に蛍光タンパク質を導入した後、励起光を照射して蛍光タンパク質が発する蛍光を検出し、当該蛍光の波長に基づいてｐＨを特定する。
【００４５】
ここにおいて、対象は、バクテリアの細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞または哺乳細胞といった細胞であってよい。さらに、対象は、組織または個体であってよい。細胞は、固定したものであってよいし、生きた状態のものであってよい。固定は、ホルマリン、メタノール等による一般的な方法で行うことができる。また、対象としての個体は、ヒトを除く個体であってよい。さらに、対象は、生物学実験で一般的に用いられる溶液であってよい。対象とする細胞、組織および個体に特に限定はなく、従来の取得方法によって得られるものを使用することができる。
【００４６】
対象に蛍光タンパク質を導入するために、細胞等へタンパク質を導入するための当該分野で一般的ないずれの方法を使用してもよい。例えば、対象が細胞である場合、マイクロインジェクション法によって蛍光タンパク質を直接細胞内へ注入してもよい。あるいは、蛍光タンパク質の遺伝子を含む発現ベクターを細胞に導入し、適切に発現させることで導入してもよい。発現ベクター等による遺伝子の導入は、リン酸カルシウム法、リポフェクションまたはエレクトロポレーション等を使用することができる。また、対象が溶液である場合、当該溶液の蛍光タンパク質の導入は、当該溶液に当該蛍光タンパク質を添加することで行われてよい。
【００４７】
蛍光の検出は、目視で行うことも可能であるが、特定の波長の蛍光を測定することが可能な、従来の方法または装置を使用して行うことができる。図７に示されるように、励起光を照射して青色の蛍光を発するか緑色の蛍光を発するかを目視で確認して、ｐＨの変化点より高いｐＨか低いｐＨかを判断することができるが、目視によらず検出装置を用いることで、より詳細にｐＨを特定することが可能となる。例えば、蛍光タンパク質を導入した細胞を蛍光顕微鏡下で観察することで行われる。そのような方法の例としては、蛍光の検出は、３８８ｎｍ励起−４６２ｎｍ蛍光および４９８ｎｍ励起−５０９ｎｍ蛍光に対応したフィルターセットの蛍光キューブを具備した倒立型蛍光顕微鏡において、４６２ｎｍおよび５０９ｎｍピークの試料の蛍光画像をＣＣＤカメラによって撮像する。撮像した画像内のｐＨ測定対象領域の蛍光強度を数値化しｐＨを求めることができる。このとき、細胞を種々の条件で刺激し、その後一定時間ごとに撮像することで、系時的に蛍光画像を取得することもできる。さらに、蛍光の測定は、４６２ｎｍ付近および５０９ｎｍ付近の波長のみでなく、蛍光スペクトルを測定することもできる。この場合、具体的には、顕微鏡のカメラポートに光ファイバーを接続し分光光度計にて測定対象領域の蛍光スペクトルを測定することで行うことができる。
【００４８】
また、ｐＨの算出は、各ｐＨに対する４６２ｎｍおよび５０９ｎｍの蛍光強度並びにそれらの比の値から作成した検量線をもとに行うことができる。検量線は、予め、各ｐＨについて４６２ｎｍの蛍光強度および５０９ｎｍの蛍光強度を測定し、ｐＨごとにそれらの蛍光強度の比を求めて、横軸をｐＨ、縦軸を比としてグラフにプロットすることで作成できる。その後、測定したい対象において４６２ｎｍおよび５０９ｎｍの蛍光強度を測定し、その比を検量線に当てはめて、対象中のｐＨを特定することができる。一般に、独立した実験系で蛍光タンパク質の蛍光活性を測定する場合、測定条件を極力同一にしたとしても、検出される蛍光強度の値は変動する可能性がある。例えば、使用する励起光源の状態等により、検出される蛍光強度の絶対値は変動する。また、測定する細胞の状態や培養液の状態などによって、バッググラウンドが上昇または下降することがある。このような場合、それらの実験系から得られる蛍光強度の値同士を直接比較することは適当ではない。これに対し、単一の実験系にて２つの蛍光強度を取得し、その比をもとめれば、蛍光強度の値の変動をキャンセルすることができ、同一条件の下で得られた比は、実験系間でほぼ一定となると考えられる。また、測定のたびに検量線を作成する必要がなくなり、さらに、独立した実験から得られた結果同士を比較することが可能となる。
【００４９】
本発明の方法は、蛍光タンパク質を単独で対象に導入する場合に限定されず、蛍光タンパク質と、その蛍光タンパク質とは異なるタンパク質とから成る融合タンパク質を対象に導入する方法も含む。例えば、この「異なるタンパク質」を、対象とする細胞が本来発現しているタンパク質とする場合、そのタンパク質が本来局在している細胞内の部位に、本発明の融合タンパク質も局在することが予想される。その状態で、蛍光タンパク質の蛍光を検出することで、「異なるタンパク質」に応じた特定部位のｐＨを測定することが可能となる。「異なるタンパク質」は、測定したい部位や、実験の目的に応じて選択することが可能であり、例えば、ミトコンドリア移行シグナル（ｃｏｘＩＶ）、ゴルジ体移行シグナル（ＧＴ）を使用できる。
【００５０】
本発明のｐＨ測定方法では、蛍光タンパク質の励起を、波長の異なる２つの励起光を照射することで行うことができる。本発明のｐＨ測定方法は、波長の異なる２つの蛍光を測定することを含むが、その２つの蛍光にそれぞれ対応した、波長の異なる２つの励起光を使用することができる。例えば、Ｓ１４７Ａ変異体を使用する場合、４６２ｎｍ付近および５０９ｎｍ付近の蛍光を発生させるために、３８８ｎｍ付近および４５０ｎｍ付近の励起光が使用することができる（図１および図２）。また、本発明のｐＨ測定方法では、蛍光タンパク質の励起を、単一波長の励起光を照射して行うことができる。例えば、Ｓ１４７Ａ変異体を使用する場合、４６２ｎｍ付近および５０９ｎｍ付近の蛍光を発生させるために３８８ｎｍ付近の励起光を使用することができる。単一の励起光を使用することにより、測定のための装置を単純化することが可能となる。
【００５１】
本発明のｐＨ測定方法では、本発明の異なる蛍光タンパク質を複数用いて行うことができる。複数の異なる蛍光タンパク質を使用することで、より正確にｐＨを測定することが可能となる。また、本発明のｐＨ測定方法は、単一の対象（例えば１種の細胞）に対してだけでなく、多種の対象（例えば２種以上の細胞）に対して同時に行うこともできる。好ましくは、本発明のｐＨ測定方法は、Ｓ１４７Ａ変異体（配列番号１）、Ｓ１４７Ｔ変異体（配列番号４２）、Ｓ１４７Ｇ変異体（配列番号４６）およびＳ１４７Ｃ変異体（配列番号５０）から成る群から選択される少なくとも２つの蛍光タンパク質の組み合わせを用いて、単一または多種の対象に対して行われる。
【実施例】
【００５２】
［実施例１：野生型ウミサボテン蛍光タンパク遺伝子のクローニング］
ウミサボテン（Ｃａｖｅｒｎｕｌａｒｉａ ｏｂｅｓａ）から野生型蛍光タンパク質を抽出および精製し、その部分的なアミノ酸配列を読み取った後、当該配列をもとに遺伝子配列を決定することで蛍光タンパク質遺伝子のクローニングを行った。
【００５３】
蛍光タンパク質の抽出精製およびアミノ酸配列分析
島根近海で採取したウミサボテン１５個体（約２００ｇ）を５００ｍｌのＳＤＳ−グリシンバッファー中ですり潰し、蛍光活性を持つタンパクを含む可溶性タンパクを抽出した。遠心機を用いて残渣を取り除き、蛍光活性を持つタンパク質を含む溶液を抽出した。この抽出溶液に、最終濃度が８０％になるように硫酸アンモニウムを加えて硫安沈殿を行った。具体的には、抽出溶液５００ｍｌに２６２ｇの硫酸アンモニウムを加えた。得られた沈殿を、５０ｍｌのトリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ）に再溶解させた。これに２倍量のエタノールを加え、タンパク質を再度沈殿させた。さらに、この沈殿にトリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ）を加えて再溶解させた。この溶液５０ｍｌを、十分量のトリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ）および透析膜２７／３２（三光純薬株式会社）を用いて透析した。透析後の溶液を、ＤＥＡＥ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を装着したクロマトグラフィーシステムＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いてイオン交換分離精製した。このイオン交換は、低塩濃度トリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ）で十分に平衡化した後、サンプルを添加し、高塩濃度トリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１Ｍ ＮａＣｌ）でＮａＣｌ濃度を０．４Ｍまで上昇させることで行い、その結果、蛍光活性のあるフラクションを分取した。蛍光活性を持つタンパクを含むフラクションの選択は、ＵＶ／ＢＬＵＥ ＣＯＮＶＥＲＴＥＲ ＰＬＡＴＥ（ＵＶＰ）を用いて行った。得られたフラクションを、十分量のトリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ）および透析膜２７／３２（三光純薬株式会社）を用いて透析した。透析後の溶液を、限外ろ過アミコンウルトラ：分画分子量３０ｋＤａ（日本ミリポア株式会社）を用いて濃縮した。次に、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）およびトリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ）を用いてゲルろ過を行った。ゲルろ過後、得られた蛍光活性のあるフラクションをｍｏｎｏＱ ５／５０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）によってイオン交換分離した。このイオン交換は、低塩濃度トリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ）で十分に平衡化した後、サンプルを添加し、高塩濃度トリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１Ｍ ＮａＣｌ）でＮａＣｌ濃度を０．４Ｍまで上昇させることで行い、その結果、蛍光活性のあるフラクションを得た。この活性のあるフラクションを限外ろ過アミコンウルトラ：分画分子量３０ｋＤａ（日本ミリポア株式会社）を用いて濃縮し、その後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）およびトリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ）を用いてゲルろ過分離を行い、蛍光活性のあるフラクションを得た。このサンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離してアミノ酸配列を分析した。分析の結果、２２残基のアミノ酸配列（ＩＰＤ ＹＦＶ ＱＳＦ ＰＥＧ ＦＴＦ ＥＲＴ ＬＳＦ Ｅ：配列番号１１）を決定することができた。
【００５４】
蛍光タンパク質遺伝子のクローニング
蛍光タンパク質遺伝子全長のクローニングのために、３’−ＲＡＣＥ ＰＣＲを下記のとおり実施した。Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄ法（以下、ＲＡＣＥと略す）により、蛍光タンパク質遺伝子をクローニングするための混合プライマーを作成した。アミノ酸配列解析によって得られたアミノ酸配列ＩＰＤ ＹＦＶ ＱＳＦ ＰＥＧ ＦＴＦ ＥＲＴ ＬＳＦ Ｅ（配列番号１１）のうち、コドンの塩基組み合わせが少ないＩＰＤＹＦＶおよびＥＧＦＴＦＥＲのアミノ酸領域に注目した。これらのアミノ酸領域をコードする塩基配列を予測し、３’末端ＲＡＣＥ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下ＰＣＲと略す）に用いる蛍光タンパク質特異的混合プライマー（合計１２種類）を以下のように作成した。ＩＰＤＹＦＶアミノ酸領域に結合するプライマーとして、ＣＯＧＦＰ−ＴＴＴ（５’−ＡＴＨ ＣＣＮ ＧＡＴ ＴＡＴ ＴＴＴ ＧＴ−３’）（配列番号１２）、ＣＯＧＦＰ−ＴＴＣ（５’−ＡＴＨ ＣＣＮ ＧＡＴ ＴＡＴ ＴＴＣ ＧＴ−３’）（配列番号１３）、ＣＯＧＦＰ−ＴＣＴ（５’−ＡＴＨ ＣＣＮ ＧＡＴ ＴＡＣ ＴＴＴ ＧＴ−３’）（配列番号１４）、ＣＯＧＦＰ−ＴＣＣ（５’−ＡＴＨ ＣＣＮ ＧＡＴ ＴＡＣ ＴＴＣ ＧＴ−３’）（配列番号１５）、ＣＯＧＦＰ−ＣＴＴ（５’−ＡＴＨ ＣＣＮ ＧＡＣ ＴＡＴ ＴＴＴ ＧＴ−３’）（配列番号１６）、ＣＯＧＦＰ−ＣＴＣ（５’−ＡＴＨ ＣＣＮ ＧＡＣ ＴＡＴ ＴＴＣ ＧＴ−３’）（配列番号１７）、ＣＯＧＦＰ−ＣＣＴ（５’−ＡＴＨ ＣＣＮ ＧＡＣ ＴＡＣ ＴＴＴ ＧＴ−３’）（配列番号１８）およびＣＯＧＦＰ−ＣＣＣ（５’−ＡＴＨ ＣＣＮ ＧＡＣ ＴＡＣ ＴＴＣ ＧＴ−３’）（配列番号１９）を作成し、ならびに、ＥＧＦＴＦＥＲアミノ酸領域に結合するプライマーとして、ＣＯＧＦＰ−ＡＴＴＡＡ（５’−ＧＡＡ ＧＧＮ ＴＴＴ ＡＣＮ ＴＴＴ ＧＡＡ ＡＧ−３’）（配列番号２０）、ＣＯＧＦＰ−ＡＣＣＡＡ（５’−ＧＡＡ ＧＧＮ ＴＴＣ ＡＣＮ ＴＴＣ ＧＡＡ ＡＧ−３’）（配列番号２１）、ＣＯＧＦＰ−ＡＴＴＧＡ（５’−ＧＡＧ ＧＧＮ ＴＴＴ ＡＣＮ ＴＴＴ ＧＡＧ ＡＧ−３’）（配列番号２２）およびＣＯＧＦＰ−ＡＣＣＧＡ（５’−ＧＡＧ ＧＧＮ ＴＴＣ ＡＣＮ ＴＴＣ ＧＡＧ ＡＧ−３’）（配列番号２３）を作成した。プライマー中のＨおよびＮは、混合塩基を示す。
【００５５】
完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（インビトロジェン）を用いて作成したウミサボテン完全長ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、蛍光タンパク質のアミノ酸配列から予測して作成した１２種類の特異的混合プライマーおよび３’末端特異的プライマーであるＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＣＴ ＧＴＣ ＡＡＣ ＧＡＴ ＡＣＧ ＣＴＡ ＣＧＴ ＡＡＣ Ｇ−３’）（配列番号２４）およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＧＣ ＴＡＣ ＧＴＡ ＡＣＧ ＧＣＡ ＴＧＡ ＣＡＧ ＴＧ−３’）（配列番号２５）を用いて３’−ＲＡＣＥ ＰＣＲを行った。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ ＰｒｉｍｅｒおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒは、完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（インビトロジェン社）に含まれており、これを使用した。３’−ＲＡＣＥ ＰＣＲによって効果的に蛍光タンパク質遺伝子を増幅させるため、一度ＰＣＲによって増幅した遺伝子を鋳型とし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ポリメラーゼＥｘ−Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。
【００５６】
一度目のＰＣＲは、ＩＰＤＹＦＶアミノ酸領域で作成した８種類プライマー（ＣＯＧＦＰ−ＴＴＴ、ＣＯＧＦＰ−ＴＴＣ、ＣＯＧＦＰ−ＴＣＴ、ＣＯＧＦＰ−ＴＣＣ、ＣＯＧＦＰ−ＣＴＴ、ＣＯＧＦＰ−ＣＴＣ、ＣＯＧＦＰ−ＣＣＴ、ＣＯＧＦＰ−ＣＣＣ）のいずれかとＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｐｒｉｍｅｒとの計８つのプライマー対で蛍光タンパク質遺伝子の増幅を行った。１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋添加）を最終濃度等倍、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）を最終濃度各０．２ｍＭ、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を最終濃度０．０５Ｕ／μｌ、８種類のプライマーのうちの１つを最終濃度０．４μＭおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’Ｐｒｉｍｅｒを最終濃度０．４μＭとして２０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、ウミサボテン完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液を０．２μｌ加えた。ＰＣＲ反応条件として、最初に９４℃１分間の熱変性を行い、次に、９４℃３０秒、４５℃３０秒および７２℃２分のサイクルを３０回行い、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応溶液２μｌを１％トリス酢酸緩衝液（以下、ＴＡＥと略す）アガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。８つの反応溶液でわずかに遺伝子増幅が認められたため、このＰＣＲ反応溶液を鋳型としてｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応を実施した。
【００５７】
ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲは、ＥＧＦＴＦＥＲアミノ酸領域で作成した４種類プライマー（ＣＯＧＦＰ−ＡＴＴＡＡ、ＣＯＧＦＰ−ＡＣＣＡＡ、ＣＯＧＦＰ−ＡＴＴＧＡ、ＣＯＧＦＰ−ＡＣＣＧＡ）の何れかとＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒとの計４つのプライマー対で蛍光タンパク質遺伝子の増幅を行った。１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋添加）を最終濃度等倍、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）を最終濃度各０．２ｍＭ、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を最終濃度０．０５Ｕ／μｌ、４種類のプライマーのうちの１つを最終濃度０．４μＭおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒを最終濃度０．４μＭとして１０μｌのｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応溶液を作製し、１度目のＰＣＲ反応溶液を鋳型として０．２μｌを加えた。ＰＣＲ反応条件として、最初に９４℃１分間の熱変性を行い、次に、９４℃３０秒、４５℃３０秒および７２℃２分のサイクルを３０回行い、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応溶液２μｌを１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。
【００５８】
その結果、１度目のＰＣＲ反応として、ＣＯＧＦＰ−ＴＴＣとＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて実施し、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応として、得られたＰＣＲ反応溶液を鋳型としてＣＯＧＦＰ−ＡＣＣＡＡとＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて実施した場合に、顕著な遺伝子増幅を確認できた。この増幅した遺伝子の塩基配列を決定し、ウミサボテン蛍光タンパク質遺伝子のウミサボテン３’末端側の塩基配列（配列番号２６）とした。
【００５９】
蛍光タンパク質の５’末端クローニングのための５’−ＲＡＣＥを下記の通り行った。一連の３’−ＲＡＣＥ解析によって得られたウミサボテン蛍光タンパク質遺伝子の３’末端側の塩基配列をもとに、５’末端クローニングのための５’−ＲＡＣＥに用いるプライマーを作成した。作成した５’末端クローニング用のプライマーは、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ１（５’−ＧＣＴ ＡＴＡ ＧＣＣ ＧＴＣ ＴＣＡ ＴＧＴ ＴＧＣ ＴＣＧ Ｔ−３’）（配列番号２７）、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ２（５’−ＡＧＣ ＣＧＴ ＣＴＣ ＡＴＧ ＴＴＧ ＣＴＣ ＧＴＡ ＧＴＡ Ｇ−３’）（配列番号２８）およびＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ３（５’−ＡＴＧ ＴＴＧ ＣＴＣ ＧＴＡ ＧＴＡ ＧＴＴ ＧＣＣ ＴＴＣ ＣＴＣ ＧＡＣ−３’）（配列番号２９）の３種類である。ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ１、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ２、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ３の順で５’末端に近い位置に結合し、順次ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応のプライマーとして用いる。
【００６０】
完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒを用いて作成したウミサボテン完全長ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、３種類の５’末端クローニング用のプライマーならびに５’末端特異的プライマーであるＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＧＡ ＣＴＧ ＧＡＧ ＣＡＣ ＧＡＧ ＧＡＣ ＡＣＴ ＧＡ−３’）（配列番号３０）およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＧＡ ＣＡＣ ＴＧＡ ＣＡＴ ＧＧＡ ＣＴＧ ＡＡＧ ＧＡＧ ＴＡ−３’）（配列番号３１）を用いて、５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲを行った。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ ＰｒｉｍｅｒおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒは完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（インビトロジェン社）に含まれており、これを使用した。５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲによって効果的に蛍光タンパク質遺伝子を増幅させるため、一度ＰＣＲによって増幅した遺伝子を鋳型にし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行った。ＰＣＲにはポリメラーゼＥｘ−Ｔａｑを用いて、マニュアルに従って実施した。
【００６１】
一度目の５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲとして、３’−ＲＡＣＥで増幅した遺伝子の塩基配列をもとに作成したＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ１とＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて、蛍光タンパク質遺伝子を増幅した。１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋添加）を最終濃度等倍とし、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）を最終濃度各０．２ｍＭとし、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を最終濃度０．０５Ｕ／μｌとし、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ１を最終濃度０．４μＭとし、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｐｒｉｍｅｒを最終濃度０．４μＭとして、１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、ウミサボテン完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液を０．２μｌを加えた。ＰＣＲ反応条件として、最初に９４℃１分間の熱変性を行い、次に、９４℃３０秒、４５℃３０秒および７２℃２分のサイクルを３０回行い、最後に、７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応溶液２μｌを、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。この５’−ＲＡＣＥでわずかに遺伝子増幅が認められたため、このＰＣＲ反応溶液を鋳型としてｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応を実施した。
【００６２】
ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲとして、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ２とＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて蛍光タンパク質ＧＦＰ遺伝子を増幅した。１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋添加）を最終濃度等倍とし、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）を最終濃度各０．２ｍＭとし、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を最終濃度０．０５Ｕ／μｌとし、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ２を最終濃度０．４μＭとし、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒを最終濃度０．４μＭとして、１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、１度目のＰＣＲ反応溶液を鋳型として０．２μｌを加えた。ＰＣＲ反応条件として、最初に９４℃１分間の熱変性を行い、次に、９４℃３０秒、４５℃３０秒および７２℃２分のサイクルを３０回行い、最後に、７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応溶液２μｌを、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。
【００６３】
その結果、１度目のＰＣＲ反応として、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ１とＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて実施し、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応として、得られたＰＣＲ反応溶液を鋳型としてＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ２とＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて実施した場合に、顕著な遺伝子増幅を確認できた。しかし、非特異的な複数の遺伝子の増幅が認められたため、このＰＣＲ反応溶液を鋳型として、異なるプライマー対を用いて再度ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応を実施した。
【００６４】
二度目のｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲとして、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ３とＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて、ＧＦＰ遺伝子を増幅した。１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋添加）を最終濃度等倍とし、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）を最終濃度各０．２ｍＭとし、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を最終濃度０．０５Ｕ／μｌとし、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ３を最終濃度０．４μＭとし、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒを最終濃度０．４μＭとして、２０μｌのｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応溶液を作製し、１度目のｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応溶液を鋳型として０．４μｌを加えた。ＰＣＲ反応条件として、最初に９４℃１分間の熱変性を行い、次に、９４℃３０秒、４５℃３０秒および７２℃２分のサイクルを３０回行い、最後に、７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応溶液２μｌを、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。その結果、一連のｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応で顕著な遺伝子増幅を確認できた。この増幅した遺伝子の塩基配列を決定し、ウミサボテン蛍光タンパク質遺伝子の５’末端側の塩基配列（配列番号３２）とした。
【００６５】
次に、蛍光タンパク質遺伝子の完全長の増幅を下記のとおりに行った。上述した３’−ＲＡＣＥおよび５’−ＲＡＣＥ解析によって得られたウミサボテン由来の蛍光タンパク質遺伝子の５’末端側の塩基配列をもとに、完全長蛍光タンパク質遺伝子クローニングのための３’−ＲＡＣＥに用いるプライマーを作成した。作成した完全長ＧＦＰ遺伝子クローニング用のプライマーは、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ３（５’−ＡＴＴ ＴＡＧ ＧＴＧ ＧＣＴ ＧＣＧ ＴＡＣ ＡＧ−３’）（配列番号３３）、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ４（５’−ＡＴＴ ＴＡＧ ＧＴＧ ＧＣＴ ＧＣＧ ＴＡＣ ＡＧＴ ＴＡＡ ＣＡＣ−３’）（配列番号３４）の２種類である。ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ３、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ４の順で３’末端に近い位置に結合する。ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ４をｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応のプライマーとして用いる。
【００６６】
完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒを用いて作成したウミサボテン完全長ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、２種類の完全長蛍光タンパク質遺伝子クローニング用のプライマーならびに３’末端特異的プライマーであるＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＣＴ ＧＴＣ ＡＡＣ ＧＡＴ ＡＣＧ ＣＴＡ ＣＧＴ ＡＡＣ Ｇ−３’）（配列番号２４）およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＧＣ ＴＡＣ ＧＴＡ ＡＣＧ ＧＣＡ ＴＧＡ ＣＡＧ ＴＧ−３’）（配列番号２５）を用いて、３’−ＲＡＣＥ ＰＣＲを行った。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ ＰｒｉｍｅｒおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒは、完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（インビトロジェン社）に含まれているので、これを使用した。３’−ＲＡＣＥ ＰＣＲによって効果的に完全長蛍光タンパク質遺伝子を増幅させるため、一度ＰＣＲによって増幅した遺伝子を鋳型にし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行った。ＰＣＲにはポリメラーゼＥｘ−Ｔａｑを用いてマニュアルに従って実施した。
【００６７】
一度目のＰＣＲとして、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ３とＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて蛍光タンパク質遺伝子を増幅した。１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋添加）を最終濃度等倍とし、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）を最終濃度各０．２ｍＭとし、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を最終濃度０．０５Ｕ／μｌとし、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ３を最終濃度０．４μＭとし、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｐｒｉｍｅｒを最終濃度０．４μＭとして、１０μｌのｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応溶液を作製し、ウミサボテン完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液を０．２μｌを加えた。ＰＣＲ反応条件として、最初に９４℃１分間の熱変性を行い、次に、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃１分のサイクルを３０回行い、最後に、７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応溶液２μｌを１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。一度目の５’−ＲＡＣＥでわずかに遺伝子増幅が認められたため、このＰＣＲ反応溶液を鋳型としてｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応を実施した。
【００６８】
ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲとしてＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ４とＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて、蛍光タンパク質遺伝子を増幅した。１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋添加）を最終濃度等倍とし、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）を最終濃度各０．２ｍＭとし、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を最終濃度０．０５Ｕ／μｌとし、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ４を最終濃度０．４μＭとし、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒを最終濃度０．４μＭとして、１０μｌのｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応溶液を作製し、１度目のＰＣＲ反応溶液を鋳型として０．２μｌを加えた。ＰＣＲ反応条件として、最初に９４℃１分間の熱変性を行い、次に、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃１分のサイクルを３０回行い、最後に、７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応溶液２μｌを１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。その結果、顕著な遺伝子増幅を確認できた。この増幅した遺伝子の塩基配列を決定して、完全長ウミサボテン蛍光タンパク質遺伝子の５’末端側の塩基配列（配列番号３５）とした。
【００６９】
得られた完全長ウミサボテン蛍光タンパク質の塩基配列から、配列情報解析ソフトウェアＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏを用いてウミサボテンＧＦＰ遺伝子のオープンリーディングフレームの塩基配列を予想した（配列番号４）。さらに、このオープンリーディングフレームを翻訳してウミサボテン蛍光タンパク質のアミノ酸配列を得た（配列番号３）。このアミノ酸配列は、ウミサボテンから精製し、アミノ酸分析によって得られた２２残基の配列（配列番号１１）を完全一致の状態で含むことから、ウミサボテンに由来する野生型蛍光タンパク質遺伝子であると決定した。この遺伝子をｐＲＳＥＴベクター（インビトロジェン）に組み込み、大腸菌にトランスフォーメーションし、ＵＶ／ＢＬＵＥ ＣＯＮＶＥＲＴＥＲ ＰＬＡＴＥ（ＵＶＰ）を用いて観察したところ顕著な蛍光活性が示された。
【００７０】
［実施例２：ウミサボテン蛍光タンパク質の単量体化］
以下の方法によって、野生型蛍光タンパク質のアミノ酸配列の１５４番目のシステインをセリンに置換した。変異の導入には、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いた。ｐＲＳＥＴ−Ａ（インビトロジェン社）にウミサボテン蛍光タンパク質遺伝子をクローニングしたプラスミドを鋳型とし、Ｐｉｒｍｅｒ１（ＣＡＡＴＧＴＡＴＧＴＡＴＣＧＧＡＣＧＡＣＡＣＴＴＴＧＧ）（配列番号３６）およびＰｒｉｍｅｒ２（ＣＣＡＡＡＧＴＧＴＣＧＴＣＣＧＡＴＡＣＡＴＡＣＡＴＴＧ）（配列番号３７）を使用して、キットに添付されているマニュアルに準じてＰＣＲ反応を行った。反応後、３７度にてＤｐｎＩで処理し、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株にトランスフォームした。
【００７１】
トランスフォームされた菌を培養してベクターを取り出し、蛍光タンパク質遺伝子の塩基配列をシーケンサーによって読み取った。その結果、配列番号８の配列が得られ、狙い通りに変異が導入できたことが確認できた。この遺伝子から、１５４番目がセリンに置換された蛍光タンパク質（配列番号５）が発現する。
【００７２】
また、トランスフォーム後の大腸菌を、２８度にて培養した後、溶菌してライセートを作製した。これにＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを加え、熱を加えずにサンプルを調製して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果を図４に示す。図４から、野生型蛍光タンパク質（左レーン）では出現する２量体のバンドが、変異体蛍光タンパク質（右レーン）において消失していることがわかる。このことから、蛍光タンパク質が単量体化されたことが確認された。
【００７３】
［実施例３：ウミサボテン蛍光タンパク質の発色団形成温度の改変］
実施例２で得られた単量体化した変異体蛍光タンパク質に対してランダムに変異を導入し、３７℃において発色団形成が安定化する変異体をスクリーニングした。
【００７４】
変異の導入は、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ ＩＩ ＥＺＣｌｏｎｅ Ｄｏｍａｉｎ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いた。ｐＲＳＥＴ−Ａ（インビトロジェン社）に単量体化変異体（１５４番目のシステインがセリンに置換）の遺伝子がクローニングされたプラスミドを鋳型とし、Ｐｉｒｍｅｒ１（ＡＴＧＡＧＴＡＴＴＣＣＡＧＡＧＡＡＴＴＣＧＧＧＣＴＴＡＡＣＡＧ）（配列番号３８）およびＰｒｉｍｅｒ２（ＴＣＡＴＧＧＴＴＴＡＧＣＴＡＴＧＧＣＣＧＴＣＴＣＡＴＧ）（配列番号３９）を加えて、キットに添付されているマニュアルに準じてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応後、１％アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、目的とするＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて精製した。精製後、マニュアルに準じてＰＣＲ反応を行い、３７℃にてＤｐｎＩで処理した後に、エタノール沈殿を行った。沈殿後、少量の蒸留水にＤＮＡを溶かして、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ社）を用いてエレクトロポレーション法にてＪＭ１０９（ＤＥ３）にトランスフォームした。トランスフォーム後の大腸菌を、２５ｃｍ四方のＬＢ（５０ｎｇ／ｍｌのアンピシリンを添加済み）プレートに播種して、３７℃で培養してコロニーを形成させた。コロニー形成後、ＵＶ／ＢＬＵＥ ＣＯＮＶＥＲＴＥＲ ＰＬＡＴＥ（ＵＶＰ）を使用して、野生型蛍光タンパク質を発現するコロニーと比べて、強い蛍光を発するコロニー（それぞれ変異体１および変異体２と名付ける）を２つ選択し、再度培養した。その後、それらが保持するプラスミドの塩基配列を決定した。それぞれの配列は配列番号９および配列番号１０に示される。
【００７５】
さらに、これらの塩基配列をアミノ酸配列に変換し（変異体１は配列番号６、変異体２は配列番号７）、野生型のアミノ酸配列と比較した。変異体１は、１２６番目のアスパラギンがチロシンに置換され、１５４番目のシステインがセリンに置換され、１６６番目のチロシンがフェニルアラニンに置換されていることがわかった。変異体２は、１２９番目のセリンがグリシンに置換され、１５４番目のシステインがセリンに置換され、１５６番目のアスパラギン酸がグリシンに置換され、２０４番目のリジンがイソロイシンに置換され、２０９番目のアスパラギンがチロシンに置換されていることがわかった。
【００７６】
また、変異体１および２の３７℃における発色団形成の安定性を、野生型蛍光タンパク質および単量体化蛍光タンパク質と比較した。ｐＲＳＥＴ−Ａ（インビトロジェン社）に、野生型遺伝子、実施例２で作製した単量体化変異体の遺伝子、変異体１の遺伝子および変異体２の遺伝子をそれぞれクローニングし、それぞれＪＭ１０９（ＤＥ３）株にトランスフォームした。これらの株をプレートに塗布し、３７℃で培養して蛍光タンパク質を発現させた。その状態をＵＶ／ＢＬＵＥ ＣＯＮＶＥＲＴＥＲ ＰＬＡＴＥ（ＵＶＰ）で観察して、画像を撮影した。図５は、それをモノクロで表した画像である。蛍光は、実際の画像では緑色の光として観察されたが、図５では白色で示され、白色が濃いほど、蛍光強度が高い。野生型および単量体化変異体と比較して、変異体１および２は非常に強い蛍光を発していることがわかる。特に、変異体１に比べて、変異体２のほうが強い蛍光を発していることがわかる。
【００７７】
次に、ゲルろ過クロマトグラフィーにて、蛍光タンパク質の会合状態を調べた。野生型蛍光タンパク質を発現する大腸菌および変異体２を発現する大腸菌から、それぞれ蛍光タンパク質を精製し解析した。その結果を図６に示す。野生型では６６ｋＤａｌ付近にピークが得られ、一方、変異体２では３７ｋＤａｌ付近でピークが得られた。これらの結果は、野生型蛍光タンパク質が２量体を形成しているのに対し、変異体２の蛍光タンパク質が単量体を形成していることを示唆する。
【００７８】
［実施例４：Ｓ１４７Ａ変異体の作製］
実施例３で得られた遺伝子に対し、蛍光極大波長の変更点をアルカリ性側にシフトする変異を、Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて導入した。詳細は下記に述べる。
【００７９】
ｐＲＳＥＴ−Ｂ（インビトロジェン社）に、変異体２（１２９番目のセリンがグリシンに置換、１５４番目のシステインがセリンに置換、１５６番目のアスパラギン酸がグリシンに置換、２０４番目のリジンがイソロイシンに置換、２０９番目のアスパラギンがチロシンに置換）の遺伝子を挿入したプラスミドを鋳型として、Ｓ１４７Ａプライマー１（ＣＣＡＡＡＣＴＡＧＡＡＣＣＧＧＣＧＡＧＴＧＡＧＴＣＡＡＴＧ、配列番号４０）およびＳ１４７Ａプライマー２（ＣＡＴＴＧＡＣＴＣＡＣＴＣＧＣＣＧＧＴＴＣＴＡＧＴＴＴＧＧ、配列番号４１）を使用して、キットに添付されているマニュアルに準じてＰＣＲ反応を行った。反応後、反応産物にＤｐｎＩを加えて３７度で処理した後に、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株に形質転換した。形質転換された大腸菌を増殖させてプラスミドＤＮＡを精製し、目的の変異が導入された遺伝子が作製されたことを確認した。このプラスミドを保持する大腸菌を３７度にて培養してＳ１４７Ａ変異体を発現させ、溶菌して、Ｎｉ−ＮＴＡ（Ｑｕｉａｇｅｎ社）カラムクロマトグラフィーを行って当該変異体を精製した。
【００８０】
精製されたＳ１４７Ａ変異体を異なるｐＨの溶液に添加し、蛍光色をＵＶハンディライト（３６５ｎｍ）で確認したところ、ｐＨ９からｐＨ１０の間において蛍光色が青色から緑色に変化した（図７）。
【００８１】
さらに、分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ Ｕ−３０１０）、蛍光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ Ｆ−２５００）を用いて、吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを測定した（図１から３）。その結果、主にｐＨ９以下において４６２ｎｍ付近に蛍光極大波長を有し（３８８ｎｍ励起、図１）、ｐＨ１０以上において５０９ｎｍ付近に蛍光極大波長を有することがわかった（４５０ｎｍ励起、図２）。また、主にｐＨ９以下において３９５ｎｍ、主にｐＨ１０以上において５０９ｎｍに吸収極大を持つことが分かった（図３）。
【００８２】
［実施例５：Ｓ１４７Ｔ変異体の作製］
実施例３で得られた遺伝子に対し、蛍光極大波長の変更点をアルカリ性側にシフトする変異を、Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて導入した。詳細は下記に述べる。
【００８３】
ｐＲＳＥＴ−Ｂ（インビトロジェン社）に、変異体２（１２９番目のセリンがグリシンに置換、１５４番目のシステインがセリンに置換、１５６番目のアスパラギン酸がグリシンに置換、２０４番目のリジンがイソロイシンに置換、２０９番目のアスパラギンがチロシンに置換）の遺伝子を挿入したプラスミドを鋳型として、Ｓ１４７Ｔプライマー１（ＣＣＡＡＡＣＴＡＧＡＡＣＣＧＡＣＣＡＧＴＧＡＧＴＣＡＡＴＧ、配列番号４４）およびＳ１４７Ｔプライマー２（ＣＡＴＴＧＡＣＴＣＡＣＴＧＧＴＣＧＧＴＴＣＴＡＧＴＴＴＧＧ、配列番号４５）を使用して、キットに添付されているマニュアルに準じてＰＣＲ反応を行った。反応後、反応産物にＤｐｎＩを加えて３７度で処理した後に、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株に形質転換した。形質転換された大腸菌を増殖させてプラスミドＤＮＡを精製し、目的の変異が導入された遺伝子が作製されたことを確認した。このプラスミドを保持する大腸菌を３７度にて培養してＳ１４７Ｔ変異体を発現させ、溶菌して、Ｎｉ−ＮＴＡ（Ｑｕｉａｇｅｎ社）カラムクロマトグラフィーを行って当該変異体を精製した。
【００８４】
精製されたＳ１４７Ｔ変異体を異なるｐＨの溶液に添加し、蛍光色をＵＶハンディライト（３６５ｎｍ）で確認したところ、ｐＨ６付近において蛍光色が青色から緑色に変化した（図１２）。
【００８５】
さらに、分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ Ｕ−３０１０）、蛍光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ Ｆ−２５００）を用いて、吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを測定した（図１１ａ−ｃ）。その結果、３８８ｎｍの励起光により励起した場合、ｐＨ６以下において主に４６０ｎｍ付近のピークを示し、ｐＨ７では４６０ｎｍ付近のピークと５０７ｎｍ付近のピークとを示し、ｐＨ８以上では主に５０７ｎｍ付近のピークを示した（図１１ａ）。また、４５０ｎｍの励起光により励起した場合、各ｐＨにおいて、主に５０７ｎｍ付近にのみピークを示した（図１１ｂ）。さらに、吸収ピークを見た場合、ｐＨ７以下では３８９ｎｍ付近と４９９ｎｍ付近とに主要な２つのピークを示し、ｐＨ８以上では主に４９９ｎｍ付近にピークを示した（図１１ｃ）。
【００８６】
［実施例６：Ｓ１４７Ｇ変異体の作製］
実施例３で得られた遺伝子に対し、蛍光極大波長の変更点をアルカリ性側にシフトする変異を、Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて導入した。詳細は下記に述べる。
【００８７】
ｐＲＳＥＴ−Ｂ（インビトロジェン社）に、変異体２（１２９番目のセリンがグリシンに置換、１５４番目のシステインがセリンに置換、１５６番目のアスパラギン酸がグリシンに置換、２０４番目のリジンがイソロイシンに置換、２０９番目のアスパラギンがチロシンに置換）の遺伝子を挿入したプラスミドを鋳型として、Ｓ１４７Ｇプライマー１（ＣＣＡＡＡＣＴＡＧＡＡＣＣＧＧＧＣＡＧＴＧＡＧＴＣＡＡＴＧ、配列番号４８）およびＳ１４７Ｇプライマー２（ＣＡＴＴＧＡＣＴＣＡＣＴＧＣＣＣＧＧＴＴＣＴＡＧＴＴＴＧＧ、配列番号４９）を使用して、キットに添付されているマニュアルに準じてＰＣＲ反応を行った。反応後、反応産物にＤｐｎＩを加えて３７度で処理した後に、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株に形質転換した。形質転換された大腸菌を増殖させてプラスミドＤＮＡを精製し、目的の変異が導入された遺伝子が作製されたことを確認した。このプラスミドを保持する大腸菌を３７度にて培養してＳ１４７Ｇ変異体を発現させ、溶菌して、Ｎｉ−ＮＴＡ（Ｑｕｉａｇｅｎ社）カラムクロマトグラフィーを行って当該変異体を精製した。
【００８８】
精製されたＳ１４７Ｇ変異体を異なるｐＨの溶液に添加し、蛍光色をＵＶハンディライト（３６５ｎｍ）で確認したところ、ｐＨ７付近において蛍光色が青色から緑色に変化した（図１４）。
【００８９】
さらに、分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ Ｕ−３０１０）、蛍光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ Ｆ−２５００）を用いて、吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを測定した（図１３ａ−ｃ）。その結果、３８８ｎｍの励起光により励起した場合、ｐＨ９以下において主に４６０ｎｍ付近のピークを示し、ｐＨ１０および１１では、４６０ｎｍ付近および５０６ｎｍ付近にピークを示した（図１３ａ）。また、４５０ｎｍの励起光により励起した場合、ｐＨ５から１１において、主に５０６ｎｍ付近にピークを示した（図１３ｂ）。さらに、吸収ピークを見た場合、ｐＨ６以下では主に３９４ｎｍ付近にピークを示し、ｐＨ７から９では３９４ｎｍ付近および４９５ｎｍ付近においてピークを示し、ｐＨ１０および１１では主に４９５ｎｍ付近に吸収ピークを示した（図１３ｃ）。
【００９０】
［実施例７：Ｓ１４７Ｃ変異体の作製］
実施例３で得られた遺伝子に対し、蛍光極大波長の変更点をアルカリ性側にシフトする変異を、Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて導入した。詳細は下記に述べる。
【００９１】
ｐＲＳＥＴ−Ｂ（インビトロジェン社）に、変異体２（１２９番目のセリンがグリシンに置換、１５４番目のシステインがセリンに置換、１５６番目のアスパラギン酸がグリシンに置換、２０４番目のリジンがイソロイシンに置換、２０９番目のアスパラギンがチロシンに置換）の遺伝子を挿入したプラスミドを鋳型として、Ｓ１４７Ｃプライマー１（ＣＣＡＡＡＣＴＡＧＡＡＣＣＧＴＧＣＡＧＴＧＡＧＴＣＡＡＴＧ、配列番号５２）およびＳ１４７Ｃプライマー２（ＣＡＴＴＧＡＣＴＣＡＣＴＧＣＡＣＧＧＴＴＣＴＡＧＴＴＴＧＧ、配列番号５３）を使用して、キットに添付されているマニュアルに準じてＰＣＲ反応を行った。反応後、反応産物にＤｐｎＩを加えて３７度で処理した後に、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株に形質転換した。形質転換された大腸菌を増殖させてプラスミドＤＮＡを精製し、目的の変異が導入された遺伝子が作製されたことを確認した。このプラスミドを保持する大腸菌を３７度にて培養してＳ１４７Ｃ変異体を発現させ、溶菌して、Ｎｉ−ＮＴＡ（Ｑｕｉａｇｅｎ社）カラムクロマトグラフィーを行って当該変異体を精製した。
【００９２】
精製されたＳ１４７Ｃ変異体を異なるｐＨの溶液に添加し、蛍光色をＵＶハンディライト（３６５ｎｍ）で確認したところ、ｐＨ９付近において蛍光色が青色から緑色に変化した（図１６）。
【００９３】
さらに、分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ Ｕ−３０１０）、蛍光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ Ｆ−２５００）を用いて、吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを測定した（図１５ａ−ｃ）。その結果、３８８ｎｍの励起光により励起した場合、各ｐＨにおいて主に４６０ｎｍ付近のピークを示した（図１３ａ）。また、４５０ｎｍの励起光により励起した場合、ｐＨ８から１１において、主に５１２ｎｍ付近にピークを示した（図１３ｂ）。さらに、吸収ピークを見た場合、ｐＨ７以下では主に３９６ｎｍ付近にピークを示し、ｐＨ８および９では３９６ｎｍ付近および５０５ｎｍ付近においてピークを示し、ｐＨ１０および１１では主に５０５ｎｍ付近に吸収ピークを示した（図１３ｃ）。
【００９４】
［実施例８：固定細胞での細胞内ｐＨの測定］
固定細胞内において、野生型ウミサボテン蛍光タンパク質の蛍光を測定した。
【００９５】
哺乳細胞発現ベクターｐＣＤＡ３．１（インビトロジェン社）に、野生型ウミサボテン蛍光タンパク質のｃＤＮＡを組み込んだ。作製されたプラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロジェン社）を用いてＵ２ＯＳ細胞に導入した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００は取扱説明書に従って使用した。
【００９６】
そのＵ２ＯＳ細胞を一昼夜培養した後、３％中性ホルマリン固定法によって固定し、蛍光顕微鏡（オリンパス社製ＩＸ７０）にて明視野像を撮影した（図８ａ）。その後、細胞をリン酸緩衝液（ｐＨ＝７）で洗浄し、ＩＢ励起用の蛍光キューブＮＩＢＡ（オリンパス社製：励起フィルター４７０−４９０ｎｍ、ダイクロイックミラー５０５ｎｍ、蛍光フィルター５１０−５５０ｎｍ）を使用して蛍光像を撮影した。図８ｂは、それをモノクロで表した画像である。実際の画像において緑色で観察された蛍光は、図８ｂでは白色で示される。次に、細胞を酢酸緩衝液（ｐＨ＝４）で洗浄し、Ｕ励起用蛍光キューブＷＵ（オリンパス社製：励起フィルター３３０−３８５ｎｍ、ダイクロイックミラー４００ｎｍ、蛍光フィルター４２０ｎｍロングパス）を使用して蛍光像を撮影した。図８ｃは、それをモノクロで表した画像である。実際の画像において青色で観察された蛍光は、図８ｃでは白色で示される。これらの画像から、本発明のウミサボテン蛍光タンパク質が、ホルマリン固定された細胞内においても蛍光を発生することができ、さらに、ｐＨに応じてその波長を変化させることが示された。
【００９７】
さらに、各ｐＨにおける蛍光スペクトルを計測した（図８ｄ）。計測には浜松ホトニクス社製のマルチチャンネル検出器ＰＭＡ−１１を用いた。その結果、ｐＨ４では４７２ｎｍに、ｐＨ７では５０９ｎｍに最大波長を示すスペクトルが得られた。
【００９８】
［実施例９：貪食細胞におけるｐＨの測定］
生細胞内における野生型ウミサボテン蛍光タンパク質の蛍光を測定して細胞内のｐＨを推定した。
【００９９】
大腸菌発現ベクターｐＲＳＥＴ（インビトロジェン社）に野生型ウミサボテン蛍光タンパク質のｃＤＮＡを組み込んだ。作製されたプラスミドを大腸菌にトランスフォーメーションし、２５℃で培養して、野生型ウミサボテン蛍光タンパク質を大腸菌内で発現させた。この大腸菌を、マウス由来マクロファージＲＡＷ２６４．７細胞株の培養容器内に加えて、一昼夜培養した。なお、大腸菌はＲＡＷ細胞によって貪食された後、ＲＡＷ細胞内の酸性環境下にある細胞小器官リソソームで消化されることが一般に知られている。
【０１００】
蛍光顕微鏡観察を行う前に、培養液をリン酸緩衝液（ｐＨ＝７）で置換した。その後、大腸菌を貪食中のＲＡＷ細胞をＩＢ励起用の蛍光キューブＮＩＢＡ（オリンパス社製：励起フィルター４７０−４９０ｎｍ、ダイクロイックミラー５０５ｎｍ、蛍光フィルター５１０−５５０ｎｍ）を用いて撮影した。図９の（ａ）は、それをモノクロで表した画像である。蛍光キューブＮＩＢＡを使用すると、主に緑色の蛍光のみを検出することができるが、図９ａ中では、緑色の蛍光は白色で表される。さらに、Ｕ励起用の蛍光キューブＷＵ（オリンパス社製：励起フィルター３３０−３８５ｎｍ、ダイクロイックミラー４００ｎｍ、蛍光フィルター４２０ｎｍロングパス）を用いて撮影した。図９の（ｂ）は、それをモノクロで表した画像である。蛍光キューブＷＵを使用すると、緑色および青色を含む４２０ｎｍ以上の蛍光を検出できるが、図９ｂ中では、緑色および青色の蛍光は、ともに白色で表される。
【０１０１】
図９ａによれば、点在する光を観察することができるが、ＲＡＷ細胞の形を認識することはできない。観察されたこの光は、明視野像（図示せず）との比較から、ＲＡＷ細胞に貪食される前の培養液中に存在する大腸菌に由来する光であることがわかる。このことから、中性の培養液中に存在する大腸菌内の蛍光タンパク質は、緑色の蛍光を発していることがわかった。
【０１０２】
図９ｂに示すように、点在する光に加え、多数の光が集ってＲＡＷ細胞の形を形成している様子も観察された。点在する光は、図９ａと同様に、貪食前の培養液中の大腸菌に由来する光である。一方、ＲＡＷ細胞の形を形成する光は、貪食されＲＡＷ細胞内のリソソームに取り込まれた大腸菌に由来する光である。ここで、実際の画像によれば、点在する光は緑色に、ＲＡＷ細胞の形を形成する光は青色に観察された。これらのことから、ウミサボテン蛍光タンパク質は、中性の培養液では緑色の蛍光を発するが、酸性のリソソーム内に移されることにより、青色の蛍光を発するようになることがわかった。
【０１０３】
さらに、図９ｂにおけるＲＡＷ細胞による貪食の前後における蛍光タンパク質の蛍光スペクトルを図１０に示す。この蛍光スペクトルから得られた４５８ｎｍおよび５０６ｎｍの蛍光強度に基づいて比を求め、予め作成した検量線に当てはめて培養液中およびリソソーム内のｐＨを推定した（図１０下表）。推定されたｐＨは、培養液中のｐＨおよびリソソーム内のｐＨをほぼ反映している。
【０１０４】
以上の結果から、ウミサボテン蛍光タンパク質は、生きた異種細胞内においても中性環境下から酸性環境下へと移されることで、それが発する蛍光の波長を変化させることができることが示された。さらに、そのときの蛍光強度に基づいてウミサボテン蛍光タンパク質の存在する環境中のｐＨを良好に求めることができることが示された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属する生物、特にウミサボテンからの遺伝子クローニングによって得られた蛍光タンパク質の変異体、およびそれを用いた細胞機能の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）が見出され、その遺伝子を大腸菌といった原核生物や線虫といった真核生物において発現させることで緑色の蛍光タンパク質をイメージングできるようになった。また、ＧＦＰに他のタンパク質を融合させることで、細胞内局在や発現量の変化をイメージングすることも出来る。さらに、ＧＦＰを動物個体の組織内で発現させることで、ｉｎ ｖｉｖｏのイメージングを非侵襲的にモニタリングすることが出来る。このような性質から、ＧＦＰは一般的な細胞研究のみならず、ガンの基礎研究や治療効果のモニターといった応用研究にも用いられている。
【０００３】
オワンクラゲ由来のＧＦＰは、自ら発色団を形成して蛍光を発する２３８アミノ酸からなる２７ｋＤのタンパク質である。野生型ＧＦＰ（ｗｔＧＦＰ）は、紫外光３９５ｎｍに励起極大波長（４７０ｎｍにマイナーピーク）をもち、５０９ｎｍの緑色蛍光を発するタンパク質である。発色団は、アミノ酸配列中の６４〜６９番目の配列（特に６５〜６７番目の配列）によって形成されている。
【０００４】
また、種々のＧＦＰタンパク質変異体が作製されている。例えば、アミノ酸配列中の６５番目のセリンをスレオニンに置換したＳ６５Ｔ変異体は、励起極大波長が４９０ｎｍと長波長側にシフトしており、ｗｔＧＦＰよりも数倍強い蛍光を発する。また、２０５番目のスレオニンを芳香族アミノ酸に置換した変異体は、蛍光波長が長波長側にシフトするため黄色蛍光タンパク質として利用できる。さらに、６６番目のチロシンを芳香族アミノ酸に置換した変異体は、蛍光波長が短波長側にシフトするため青色蛍光タンパク質として利用できる。その後も様々なＧＦＰタンパク質の改変が行われ、現在までに、より明るい蛍光やタンパク質の安定性、溶解度を高める工夫などが加えられた数多くの変異体が作製されている。
【０００５】
クロンテック社のＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）は、発色団のアミノ酸置換（Ｐ６４Ｌ、Ｓ６５Ｔ等）に加え、哺乳類細胞や植物での翻訳効率を高める目的でヒトのコドン使用頻度に合わせて塩基配列が最適化されており、塩基配列としては１９０箇所以上の変異が導入されている。さらに、蛍光色の変異体ＥＢＦＰ（Ｂｌｕｅ）（Ｙ６６Ｈのアミノ酸置換等）、ＥＣＦＰ（Ｃｙａｎ）（Ｙ６６Ｗのアミノ酸置換等）およびＥＹＦＰ（Ｙｅｌｌｏｗ）（Ｔ２０３Ｙのアミノ酸置換等）は、ヒトのコドン使用頻度に合わせた塩基配列の最適化も行われた上で、ＥＧＦＰとは異なる蛍光色にて観察できる変異体として同社から入手可能である。
【０００６】
非特許文献１には、オワンクラゲＧＦＰに変異（６５番目のセリンをスレオニンに、４８番目のシステインをセリンに、１４８番目のヒスチジンをシステインに、２０３番目のスレオニンをシステインにそれぞれ置換する変異）を導入して、ｐＨ依存的に蛍光波長が変化する変異体を得たことを開示している。当該変異体は、ｐＨ７付近の前後で吸収スペクトルの傾向が変化し、それより酸性側では４００ｎｍ付近における吸収が増大し、アルカリ性側では５００ｎｍ付近の吸収が増大する。この吸収スペクトルの変化に依存して、ｐＨ７より酸性側では４６０ｎｍ付近の蛍光強度が、アルカリ性側では５１０ｎｍ付近の蛍光強度が増加する。非特許文献１は、この性質による細胞内センサーとしての有用性を示している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Green Fluorescent Protein Variants as Rationmetric Dual Emission pH Sensors. 1. Structural Characterization and Preliminary Application. Hanson GT., McAnaney TB., Park ES., Rendell MEP., Yarbrough DK., Chu S., Xi L., Boxer SG., Montrose MH., and Remington SJ. Biochemistry 2002, 41, 15477-15488.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、ｐＨ依存的に蛍光極大波長が変化する蛍光タンパク質であって、その変化が特定のｐＨにおいて生じる蛍光タンパク質、および当該蛍光タンパク質を利用した精度の高い細胞機能の測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の実施態様によれば、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物に由来し、ｐＨ依存的に蛍光極大波長が変化する蛍光タンパク質であって、当該変化がｐＨ４とｐＨ１１との間において生じる蛍光タンパク質が提供される。
【００１０】
また、そのような蛍光タンパク質を対象に導入し、前記蛍光タンパク質が発する蛍光に基づいて前記対象内部のｐＨを測定する方法が提供される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、ｐＨ依存的に蛍光極大波長が変化する蛍光タンパク質であって、当該変化がｐＨ４とｐＨ１１との間において生じる、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物（例えば、ウミサボテン）由来の蛍光タンパク質が提供され、さらに、このような蛍光タンパク質を用いた、細胞内および細胞内小器官等の精度の高いｐＨ測定方法が提供される。
【００１２】
この蛍光タンパク質を用いることによって、２波長励起２波長蛍光または１波長励起２波長蛍光の測定が可能となり、さらに、ｐＨの変化を相対的な蛍光強度の比として計測することが可能となる。そのため、異なった実験条件下における蛍光強度の絶対的な差異をキャンセルでき、種々のデータを互いに比較することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】３８８ｎｍで励起した場合の各ｐＨにおけるＳ１４７Ａ変異体の蛍光スペクトル（横軸：波長（ｎｍ）、縦軸：蛍光強度（任意単位））。
【図２】４５０ｎｍで励起した場合の各ｐＨにおけるＳ１４７Ａ変異体の蛍光スペクトル（横軸：波長（ｎｍ）、縦軸：蛍光強度（任意単位））。
【図３】各ｐＨにおけるＳ１４７Ａ変異体の吸収スペクトル（横軸：波長（ｎｍ）、縦軸：吸光度（任意単位））。
【図４】野生型ウミサボテン蛍光タンパク質およびＣ１５４Ｓ変異体の会合状態をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより比較した図。
【図５】野生型ウミサボテン蛍光タンパク質、Ｃ１５４Ｓ変異体および２種の温度安定化変異体を大腸菌で発現させたときの蛍光を示す図。
【図６】野生型ウミサボテン蛍光タンパク質および温度安定化変異体の会合状態のゲルろ過法による分析結果。
【図７】野生型ウミサボテン蛍光タンパク質とＳ１４７Ａ変異体とのｐＨ依存性に関する比較を示す図。
【図８】野生型ウミサボテン蛍光タンパク質を発現させたＵ２ＯＳ細胞の明視野像（ａ）、ｐＨ＝７における蛍光像（ｂ）およびｐＨ＝４における蛍光像（ｃ）、ならびに、ｂおよびｃの蛍光スペクトル（ｄ）。
【図９】野生型ウミサボテン蛍光タンパク質を発現させた大腸菌がＲＡＷ細胞に貪食される状態を示す蛍光像。
【図１０】ＲＡＷ細胞に貪食される前後の野生型ウミサボテン蛍光タンパク質の蛍光スペクトルおよび蛍光強度比を示す表。
【図１１ａ】３８８ｎｍで励起した場合の各ｐＨにおけるＳ１４７Ｔ変異体の蛍光スペクトル（横軸：波長（ｎｍ）、縦軸：蛍光強度（任意単位））。
【図１１ｂ】４５０ｎｍで励起した場合の各ｐＨにおけるＳ１４７Ｔ変異体の蛍光スペクトル（横軸：波長（ｎｍ）、縦軸：蛍光強度（任意単位））。
【図１１ｃ】各ｐＨにおけるＳ１４７Ｔ変異体の吸収スペクトル（横軸：波長（ｎｍ）、縦軸：吸光度（任意単位））。
【図１２】野生型ウミサボテン蛍光タンパク質とＳ１４７Ｔ変異体とのｐＨ依存性に関する比較を示す図。
【図１３ａ】３８８ｎｍで励起した場合の各ｐＨにおけるＳ１４７Ｇ変異体の蛍光スペクトル（横軸：波長（ｎｍ）、縦軸：蛍光強度（任意単位））。
【図１３ｂ】４５０ｎｍで励起した場合の各ｐＨにおけるＳ１４７Ｇ変異体の蛍光スペクトル（横軸：波長（ｎｍ）、縦軸：蛍光強度（任意単位））。
【図１３ｃ】各ｐＨにおけるＳ１４７Ｇ変異体の吸収スペクトル（横軸：波長（ｎｍ）、縦軸：吸光度（任意単位））。
【図１４】野生型ウミサボテン蛍光タンパク質とＳ１４７Ｇ変異体とのｐＨ依存性に関する比較を示す図。
【図１５ａ】３８８ｎｍで励起した場合の各ｐＨにおけるＳ１４７Ｃ変異体の蛍光スペクトル（横軸：波長（ｎｍ）、縦軸：蛍光強度（任意単位））。
【図１５ｂ】４５０ｎｍで励起した場合の各ｐＨにおけるＳ１４７Ｃ変異体の蛍光スペクトル（横軸：波長（ｎｍ）、縦軸：蛍光強度（任意単位））。
【図１５ｃ】各ｐＨにおけるＳ１４７Ｃ変異体の吸収スペクトル（横軸：波長（ｎｍ）、縦軸：吸光度（任意単位））。
【図１６】野生型ウミサボテン蛍光タンパク質とＳ１４７Ｃ変異体とのｐＨ依存性に関する比較を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜蛍光タンパク質＞
本発明は、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物に由来し、ｐＨ依存的に蛍光極大波長が変化する蛍光タンパク質であって、当該変化がｐＨ４とｐＨ１１との間において生じる蛍光タンパク質に関する。
【００１５】
本発明の蛍光タンパク質はｐＨ依存的に蛍光極大波長が変化する。特に、この変化はｐＨ４からｐＨ１１の間において生じる。すなわち、たとえばｐＨ３付近の環境に置かれた場合に発する蛍光の極大波長と、たとえばｐＨ１２付近の環境に置かれた場合に発する蛍光の極大波長とが異なり、それらを区別することができる。本発明の蛍光タンパク質が有する蛍光特性を言い換えれば、蛍光極大波長が変化する点を「変化点」と称した場合、変化点より大きなｐＨの環境下で蛍光を発し、さらに、変化点より小さなｐＨの環境下においても前記蛍光の波長とは異なる波長の蛍光を発することができる。このため、本発明の蛍光タンパク質は、環境中のｐＨの指標として利用することができる。特に、本発明の蛍光タンパク質は変化点がアルカリ性側にある場合、主にアルカリ性側におけるｐＨ変化の測定に利用できる。
【００１６】
上記変化点は、上記の通りｐＨ４とｐＨ１１との間に存在し、好ましくは、ｐＨ５とｐＨ１１との間、ｐＨ５とｐＨ１０との間またはｐＨ６とｐＨ１０との間に存在する。更に好ましくは、変化点は、ｐＨ９とｐＨ１０との間に存在し、更にはｐＨ９．１とｐＨ９．９との間、ｐＨ９．２とｐＨ９．８との間、ｐＨ９．３とｐＨ９．７との間またはｐＨ９．４とｐＨ９．６との間に存在し、あるいは変化点は好ましくはｐＨ９．５である。また、変化点は、ｐＨ６付近に存在し、例えばｐＨ５．５からｐＨ６．５の間、ｐＨ５．６からｐＨ６．４の間、ｐＨ５．７からｐＨ６．３の間、ｐＨ５．８からｐＨ６．２の間またはｐＨ５．９からｐＨ６．１の間に存在する。また、変化点は、ｐＨ７とｐＨ８との間に存在し、更にはｐＨ７．１とｐＨ７．９との間、ｐＨ７．２とｐＨ７．８との間、ｐＨ７．３とｐＨ７．７との間またはｐＨ７．４とｐＨ７．６との間に存在し、あるいは変化点は好ましくはｐＨ７．５である。また、変化点は、ｐＨ９付近に存在し、例えばｐＨ８．５からｐＨ９．５の間、ｐＨ８．６からｐＨ９．４の間、ｐＨ８．７からｐＨ９．３の間、ｐＨ８．８からｐＨ９．２の間またはｐＨ８．９からｐＨ９．１の間に存在する。
【００１７】
本発明の蛍光タンパク質は、変化が生じるｐＨより低いｐＨにおいて青色の蛍光を発し、変化が生じるｐＨより高いｐＨにおいて緑色の蛍光を発する。
【００１８】
本発明の蛍光タンパク質は、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物に由来する。例えば、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属すカベルヌラリア・オベサ（Ｃａｖｅｒｎｕｌａｒｉａ ｏｂｅｓａ）（和名：ウミサボテン）に由来する。したがって、未だ分類されていない生物または未発見の生物であっても、それが後に刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属すとされ、且つ、それから得られる蛍光タンパク質が上述のような蛍光活性を持てば、本発明に含まれる。なお、ここにいう「由来する」とは、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物が有する野生型の蛍光タンパク質に加えて、その変異体をも含むことを意味する。
【００１９】
＜Ｓ１４７Ａ変異＞
本発明の蛍光タンパク質の好ましい例は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛍光タンパク質である。この蛍光タンパク質は、カベルヌラリア・オベサが発現する野生型のウミサボテン蛍光タンパク質に対し、複数のアミノ酸を置換する変異を加えたものである。具体的には、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する野生型の蛍光タンパク質に対し、変化点がアルカリ性側にシフトする変異（即ち、１４７番目のセリンをアラニンに置換）のほかに、単量体化する変異（即ち、１５４番目のシステインをセリンに置換）および３７℃において安定化する変異（即ち、１２９番目のセリンをグリシンに、１５６番目のアスパラギン酸をグリシンに、２０４番目のリジンをイソロイシンにおよび２０９番目のアスパラギンをチロシンにそれぞれ置換）を加えている。本願では、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む蛍光タンパク質のことを、「Ｓ１４７Ａ変異型蛍光タンパク質」、「Ｓ１４７Ａ変異型ウミサボテン蛍光タンパク質」または「Ｓ１４７Ａ変異体」等と称する。
【００２０】
図１および２には、Ｓ１４７Ａ変異体の蛍光スペクトルが示される。図１は、ｐＨ４から１１の各段階において、３８８ｎｍの励起光を照射したときの蛍光スペクトルを示す。一方、図２は、ｐＨ８から１１の各段階において、４５０ｎｍの励起光を照射したときの蛍光スペクトルを示す。図１より、３８８ｎｍの励起光を照射した場合、測定した何れのｐＨにおいても４６２ｎｍ付近を蛍光極大波長とする蛍光を発することがわかる。但し、ｐＨが異なると蛍光強度も大きく異なり、ｐＨが１１から下がるにつれて４６２ｎｍの光の強度が上昇し、ｐＨ５のときに最高となり、ｐＨ４にて下降している。また、図２により、４５０ｎｍの励起光を照射した場合、測定した何れのｐＨにおいても５０９ｎｍ付近を蛍光極大波長とする蛍光を発することがわかる。但し、ｐＨの違いによる蛍光強度の変化が大きく、ｐＨ８および９における蛍光強度と比較して、ｐＨ１０および１１における蛍光強度は大きく上昇している。なお、図２による４５０ｎｍ励起の蛍光スペクトルには、ｐＨ８〜１１における測定結果のみを示しているが、ｐＨ４〜７における測定では蛍光がほとんど検出されなかったため表示を省略している。
【００２１】
図３には、Ｓ１４７Ａ変異体の、ｐＨ４から１１の各段階における吸収スペクトルが示される。ｐＨ４から７の環境下では、当該蛍光タンパク質は３９２ｎｍ付近に高い吸収ピークを有するものの、５０２ｎｍ付近においてはほとんどピークを有さない。ｐＨ８および９では、３９２ｎｍ付近に高い吸収ピークを有し、さらに５０２ｎｍ付近においてもやや高い吸収ピークを有する。ｐＨ１０および１１の環境下では、３９２ｎｍ付近ではその他のｐＨの場合と比較して低い吸収ピークを有するが、５０２ｎｍ付近において高い吸収ピークを有する。図１から３の結果から、４６２ｎｍピークの蛍光は、主に３９２ｎｍピークの励起光によって発せられることがわかる。一方、５０９ｎｍピークの蛍光は、５０２ｎｍピークの励起光によって発せられるが、３９２ｎｍピークの励起光によっても発せられることがわかる。
【００２２】
さらに、図７には、ｐＨ依存的な蛍光波長の変化に関して、Ｓ１４７Ａ変異体と野生型ウミサボテン蛍光タンパク質との比較を示す。蛍光タンパク質を含む溶液を、それぞれの蛍光タンパク質について８種作製した。この８種の溶液のｐＨは４〜１１の間で異なるように調整されている。これらを並べて３６５ｎｍの励起光を照射して、生じる蛍光を撮影した。図７は、この撮影した画像をモノクロで示したものである。図中、野生型ウミサボテン蛍光タンパク質をＷｉｌｄ ＣｏＧＦＰと示し（上段）、Ｓ１４７Ａ変異体をＳ１４７Ａ Ｍｕｔａｎｔと示す（下段）。カラーで得られた画像によると、野生型では、ｐＨ４において溶液は青色の光を発し、ｐＨ６およびそれより高いｐＨにおいて緑色の光を発し、ｐＨ５において中間的な光を発している。すなわち、野生型ではｐＨ５前後において蛍光極大波長が変化する。一方、Ｓ１４７Ａ変異体では、ｐＨ９およびそれより低いｐＨにおいて青色の光を発し、ｐＨ１０および１１において緑色の光を発している。すなわち、Ｓ１４７Ａ変異体ではｐＨ９とｐＨ１０との間において蛍光極大波長が変化する。
【００２３】
＜Ｓ１４７Ｔ変異＞
本発明の蛍光タンパク質の好ましい例は、配列番号４２で示されるアミノ酸配列を含む蛍光タンパク質である。この蛍光タンパク質は、カベルヌラリア・オベサが発現する野生型のウミサボテン蛍光タンパク質に対し、複数のアミノ酸を置換する変異を加えたものである。具体的には、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する野生型の蛍光タンパク質に対し、変化点がアルカリ性側にシフトする変異（即ち、１４７番目のセリンをスレオニンに置換）のほかに、単量体化する変異（即ち、１５４番目のシステインをセリンに置換）および３７℃において安定化する変異（即ち、１２９番目のセリンをグリシンに、１５６番目のアスパラギン酸をグリシンに、２０４番目のリジンをイソロイシンにおよび２０９番目のアスパラギンをチロシンにそれぞれ置換）を加えている。本願では、配列番号４２で示されるアミノ酸配列を含む蛍光タンパク質のことを、「Ｓ１４７Ｔ変異型蛍光タンパク質」、「Ｓ１４７Ｔ変異型ウミサボテン蛍光タンパク質」または「Ｓ１４７Ｔ変異体」等と称する。
【００２４】
図１１ａおよび図１１ｂには、Ｓ１４７Ｔ変異体の蛍光スペクトルが示される。図１１ａは、ｐＨ４から１１の各段階において、３８８ｎｍの励起光を照射したときの蛍光スペクトルを示す。一方、図１１ｂは、ｐＨ４から１１の各段階において、４５０ｎｍの励起光を照射したときの蛍光スペクトルを示す。図１１ａより、３８８ｎｍの励起光を照射した場合、各ｐＨにおいて４６０ｎｍ付近のピークと５０７ｎｍ付近のピークとからなるスペクトルが得られた。但し、ｐＨ４からｐＨ７では４６０ｎｍ付近のピークの方がより強い蛍光強度を示し、ｐＨ８からｐＨ１１では５０７ｎｍ付近のピークの方がより強い蛍光強度を示した。また、図１１ｂによると、４５０ｎｍの励起光を照射した場合、測定した何れのｐＨにおいても５０７ｎｍ付近に主要なピークが得られた。但し、ｐＨの違いによる蛍光強度の変化が大きく、ｐＨが下がるに従って、蛍光強度は減少した。
【００２５】
図１１ｃには、Ｓ１４７Ｔ変異体の、ｐＨ４から１１の各段階における吸収スペクトルが示される。ｐＨ４から７では、３８９ｎｍ付近と４９９ｎｍ付近とに主要な２つのピークが得られた。特に、ｐＨ４および５では３８９ｎｍ付近のピークの方が４９９ｎｍ付近のピークと比較して吸収が大きく、ｐＨ６ではそれらのピークにおける吸収が同程度となり、ｐＨ７では４９９ｎｍ付近のピークにおける吸収の方が大きい。さらに、ｐＨ８からｐＨ１１では、３８９ｎｍ付近での吸収ピークはほとんど消失し、４９９ｎｍ付近にて大きな吸収を示した。図１１ａ−ｃの結果から、４６０ｎｍピークの蛍光は、主に３８９ｎｍ付近のピークの励起光によって発せられることがわかる。一方、５０７ｎｍピークの蛍光は、主に４９９ｎｍ付近のピークの励起光によって発せられるが、３８９ｎｍ付近のピークの励起光によっても発せられることがわかる。
【００２６】
さらに、図１２には、ｐＨ依存的な蛍光波長の変化に関して、Ｓ１４７Ｔ変異体と野生型ウミサボテン蛍光タンパク質との比較を示す。蛍光タンパク質を含む溶液を、それぞれの蛍光タンパク質について８種作製した。この８種の溶液のｐＨは４〜１１の間で異なるように調整されている。これらを並べて３６５ｎｍの励起光を照射して、生じる蛍光を撮影した。図１２は、この撮影した画像をモノクロで示したものである。図中、野生型ウミサボテン蛍光タンパク質をＷｉｌｄ ＣｏＧＦＰと示し（上段）、Ｓ１４７Ｔ変異体をＳ１４７Ｔ Ｍｕｔａｎｔと示す（下段）。カラーで得られた画像によると、野生型では、ｐＨ４において溶液は青色の光を発し、ｐＨ６およびそれより高いｐＨにおいて緑色の光を発し、ｐＨ５において中間的な光を発している。すなわち、野生型ではｐＨ５前後において蛍光極大波長が変化する。一方、Ｓ１４７Ｔ変異体では、ｐＨ４および５において青色の光を発し、ｐＨ７以上において緑色の光を発し、ｐＨ６付近において中間的な光を発している。すなわち、Ｓ１４７Ｔ変異体ではｐＨ６付近において蛍光極大波長が変化する。
【００２７】
＜Ｓ１４７Ｇ変異＞
本発明の蛍光タンパク質の好ましい例は、配列番号４６で示されるアミノ酸配列を含む蛍光タンパク質である。この蛍光タンパク質は、カベルヌラリア・オベサが発現する野生型のウミサボテン蛍光タンパク質に対し、複数のアミノ酸を置換する変異を加えたものである。具体的には、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する野生型の蛍光タンパク質に対し、変化点がアルカリ性側にシフトする変異（即ち、１４７番目のセリンをグリシンに置換）のほかに、単量体化する変異（即ち、１５４番目のシステインをセリンに置換）および３７℃において安定化する変異（即ち、１２９番目のセリンをグリシンに、１５６番目のアスパラギン酸をグリシンに、２０４番目のリジンをイソロイシンにおよび２０９番目のアスパラギンをチロシンにそれぞれ置換）を加えている。本願では、配列番号４６で示されるアミノ酸配列を含む蛍光タンパク質のことを、「Ｓ１４７Ｇ変異型蛍光タンパク質」、「Ｓ１４７Ｇ変異型ウミサボテン蛍光タンパク質」または「Ｓ１４７Ｇ変異体」等と称する。
【００２８】
図１３ａおよび図１３ｂには、Ｓ１４７Ｇ変異体の蛍光スペクトルが示される。図１３ａは、ｐＨ４から１１の各段階において、３８８ｎｍの励起光を照射したときの蛍光スペクトルを示す。一方、図１３ｂは、ｐＨ４から１１の各段階において、４５０ｎｍの励起光を照射したときの蛍光スペクトルを示す。図１３ａより、３８８ｎｍの励起光を照射した場合、ｐＨ４からｐＨ９では、主に４６０ｎｍ付近に高いピークを有することがわかる。一方、ｐＨ１０および１１では、４６０ｎｍ付近にもピークはあるものの、それよりもやや高いピークが５０６ｎｍ付近に見られる。但し、ｐＨ１０および１１における蛍光強度は、それ以外のｐＨと比較して全体的に小さい。図１３ｂによると、４５０ｎｍの励起光を照射した場合、ｐＨ５から１１において５０６ｎｍ付近に主要なピークを有することがわかる。但し、ｐＨの違いによる蛍光強度の変化が大きく、ｐＨ１０および１１において高い強度を示し、ｐＨが下がるに従って蛍光強度は小さくなっている。
【００２９】
図１３ｃには、Ｓ１４７Ｇ変異体の、ｐＨ４から１１の各段階における吸収スペクトルが示される。ｐＨ４から６の環境下では、当該蛍光タンパク質は３９４ｎｍ付近に高い吸収ピークを有するものの、４９５ｎｍ付近においてはほとんどピークを有さない。ｐＨ７から９においては、３９４ｎｍ付近と４９５ｎｍ付近との両方において吸収ピークを有するが、ｐＨが大きくなるほど、３９４ｎｍ付近のピークが小さくなり、４９５ｎｍ付近のピークが大きくなっている。ｐＨ１０および１１においては、３９４ｎｍ付近のピークはほとんど消失しており、４９５ｎｍ付近に大きなピークを有する。図１３ａ−ｃの結果から、４６０ｎｍ付近のピークの蛍光は、主に３９４ｎｍ付近のピークの励起光によって発せられることがわかる。一方、５０６ｎｍ付近のピークの蛍光は、４９５ｎｍ付近のピークの励起光によって発せられるが、３９４ｎｍ付近のピークの励起光によっても発せられることがわかる。
【００３０】
さらに、図１４には、ｐＨ依存的な蛍光波長の変化に関して、Ｓ１４７Ｇ変異体と野生型ウミサボテン蛍光タンパク質との比較を示す。蛍光タンパク質を含む溶液を、それぞれの蛍光タンパク質について８種作製した。この８種の溶液のｐＨは４〜１１の間で異なるように調整されている。これらを並べて３６５ｎｍの励起光を照射して、生じる蛍光を撮影した。図１４は、この撮影した画像をモノクロで示したものである。図中、野生型ウミサボテン蛍光タンパク質をＷｉｌｄ ＣｏＧＦＰと示し（上段）、Ｓ１４７Ｇ変異体をＳ１４７Ｇ Ｍｕｔａｎｔと示す（下段）。カラーで得られた画像によると、野生型では、ｐＨ４において溶液は青色の光を発し、ｐＨ６およびそれより高いｐＨにおいて緑色の光を発し、ｐＨ５において中間的な光を発している。すなわち、野生型ではｐＨ５前後において蛍光極大波長が変化する。一方、Ｓ１４７Ｇ変異体では、ｐＨ７以下において青色の光を発し、ｐＨ８以上において緑色の光を発している。すなわち、Ｓ１４７Ｇ変異体ではｐＨ７とｐＨ８との間において蛍光極大波長が変化する。
【００３１】
＜Ｓ１４７Ｃ変異＞
本発明の蛍光タンパク質の好ましい例は、配列番号５０で示されるアミノ酸配列を含む蛍光タンパク質である。この蛍光タンパク質は、カベルヌラリア・オベサが発現する野生型のウミサボテン蛍光タンパク質に対し、複数のアミノ酸を置換する変異を加えたものである。具体的には、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する野生型の蛍光タンパク質に対し、変化点がアルカリ性側にシフトする変異（即ち、１４７番目のセリンをシステインに置換）のほかに、単量体化する変異（即ち、１５４番目のシステインをセリンに置換）および３７℃において安定化する変異（即ち、１２９番目のセリンをグリシンに、１５６番目のアスパラギン酸をグリシンに、２０４番目のリジンをイソロイシンにおよび２０９番目のアスパラギンをチロシンにそれぞれ置換）を加えている。本願では、配列番号５０で示されるアミノ酸配列を含む蛍光タンパク質のことを、「Ｓ１４７Ｃ変異型蛍光タンパク質」、「Ｓ１４７Ｃ変異型ウミサボテン蛍光タンパク質」または「Ｓ１４７Ｃ変異体」等と称する。
【００３２】
図１５ａおよびｂには、Ｓ１４７Ｃ変異体の蛍光スペクトルが示される。図１５ａは、ｐＨ４から１１の各段階において、３８８ｎｍの励起光を照射したときの蛍光スペクトルを示す。一方、図１５ｂは、ｐＨ４から１１の各段階において、４５０ｎｍの励起光を照射したときの蛍光スペクトルを示す。図１５ａより、３８８ｎｍの励起光を照射した場合、測定した何れのｐＨにおいても４６０ｎｍ付近を蛍光極大波長とする蛍光を発することがわかる。特に、ｐＨ４からｐＨ９において大きな蛍光強度を示すことがわかる。また、図１５ｂによると、４５０ｎｍの励起光を照射した場合、ｐＨ８から１１において５１２ｎｍ付近を蛍光極大波長とする蛍光を発することがわかる。但し、ｐＨの違いによる蛍光強度の変化が大きく、ｐＨ１１において最も高い蛍光強度を示し、ｐＨが下がるに従って、蛍光強度が小さくなることがわかる。
【００３３】
図１５ｃには、Ｓ１４７Ｃ変異体の、ｐＨ４から１１の各段階における吸収スペクトルが示される。ｐＨ４から７の環境下では、当該蛍光タンパク質は３９６ｎｍ付近に高い吸収ピークを有するものの、５０５ｎｍ付近においてはほとんどピークを有さない。ｐＨ８および９では、３９６ｎｍ付近および５０５ｎｍ付近の両方に吸収ピークを有する。ｐＨ１０および１１の環境下では、３９６ｎｍ付近のピークはほとんど消失し、５０５ｎｍ付近において高い吸収ピークを有する。図１５ａ−ｃの結果から、４６０ｎｍ付近のピークの蛍光は、主に３９６ｎｍピークの励起光によって発せられることがわかる。一方、５１２ｎｍ付近のピークの蛍光は、主に５０５ｎｍピークの励起光によって発せられることがわかる。
【００３４】
さらに、図１６には、ｐＨ依存的な蛍光波長の変化に関して、Ｓ１４７Ｃ変異体と野生型ウミサボテン蛍光タンパク質との比較を示す。蛍光タンパク質を含む溶液を、それぞれの蛍光タンパク質について８種作製した。この８種の溶液のｐＨは４〜１１の間で異なるように調整されている。これらを並べて３６５ｎｍの励起光を照射して、生じる蛍光を撮影した。図１６は、この撮影した画像をモノクロで示したものである。図中、野生型ウミサボテン蛍光タンパク質をＷｉｌｄ ＣｏＧＦＰと示し（上段）、Ｓ１４７Ｃ変異体をＳ１４７Ｃ Ｍｕｔａｎｔと示す（下段）。カラーで得られた画像によると、野生型では、ｐＨ４において溶液は青色の光を発し、ｐＨ６およびそれより高いｐＨにおいて緑色の光を発し、ｐＨ５において中間的な光を発している。すなわち、野生型ではｐＨ５前後において蛍光極大波長が変化する。一方、Ｓ１４７Ｃ変異体では、ｐＨ８以下において青色の光を発し、ｐＨ１０および１１において緑色の光を発し、ｐＨ９において、若干緑がかった青色を示している。すなわち、Ｓ１４７Ｃ変異体ではｐＨ９付近において蛍光極大波長が変化する。
【００３５】
＜その他の変異＞
本発明の蛍光タンパク質は、野生型のウミサボテン蛍光タンパク質の変異体であってよい。Ｓ１４７Ａ変異体、Ｓ１４７Ｔ変異体、Ｓ１４７Ｇ変異体およびＳ１４７Ｃ変異体はそれぞれ、そのような変異体の１つである。本発明に係る変異体は、ｐＨ依存的に蛍光極大波長が変化する蛍光タンパク質であって、当該変化がアルカリ性側、特にｐＨ４とｐＨ１１との間において生じるという特徴を維持する限りにおいて、どのような変異体であってもよい。また、各種の変異は、１つのタンパク質または遺伝子に対して同時に導入されてよい。ここにおいて、変異体とは、野生型蛍光タンパク質のアミノ酸配列に変異（例えば、アミノ酸の置換、欠失および／または付加等）が生じた蛍光タンパク質を指す。この変異とは、野生型蛍光タンパク質のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸の変異であり、好ましくは、野生型蛍光タンパク質のアミノ酸配列の１から２０のアミノ酸の変異、１から１５のアミノ酸の変異、１から１０のアミノ酸の変異または１から５のアミノ酸の変異である。好ましくは、当該変異体のアミノ酸配列は、野生型蛍光タンパク質のアミノ酸配列との間で７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の相同性を有する。
【００３６】
また、本発明の蛍光タンパク質は、上述のような二峰性の蛍光活性以外の特徴を変化させた変異体を含む。特に、そのような変異は、蛍光タンパク質としての操作性を向上させる変異であることが好ましい。
【００３７】
例えば、本発明に係る蛍光タンパク質には、野生型よりも強度の高い蛍光を発することができる変異体が含まれる。この変異体は、感度の低い測定システムを使用する場合や、タンパク質の発現が弱い細胞にて測定する場合においても、十分な蛍光強度を提供することができる。このような変異体は、当該分野の従来の方法を使用して取得することができ、例えば、野生型の蛍光タンパク質をコードする核酸にランダムに変異を導入した後、それを大腸菌等に発現させ、励起光を照射し、野生型蛍光タンパク質を発現する株よりも強い蛍光を発する株を選択することで取得できる。
【００３８】
また、本発明に係る蛍光タンパク質には、細胞内で単量体として存在できる変異体が含まれる。蛍光タンパク質が二量体を形成する場合、細胞内で凝集を生じたり、細胞内の移動が阻害されたりすることがある。単量体化することによって、そのような問題を回避することができる。特に、蛍光タンパク質に別のタンパク質を融合させる場合、この別のタンパク質の本来の機能に対する影響を最小化することができる。このような単量体化された変異体は、元となる蛍光タンパク質の遺伝子にランダムに変異を導入した後、そのような候補変異体を含むライブラリーから、単量体化され且つ蛍光活性を失っていないものをスクリーニングすることで取得することができる。あるいは、蛍光タンパク質の二量体形成に寄与する可能性が高いアミノ酸に変異を入れた後、単量体化され且つ蛍光活性を失っていないことを確認することで取得することができる。Ｓ１４７Ａ変異体、Ｓ１４７Ｔ変異体、Ｓ１４７Ｇ変異体およびＳ１４７Ｃ変異体はそれぞれ、この変異を含む（１５４番目のシステインがセリンに置換されている）。
【００３９】
また、本発明に係る蛍光タンパク質には、特定の条件の下で安定性の高い変異体が含まれる。そのようなタンパク質には、例えば、測定対象となる細胞の培養に適した温度の下で蛍光発色団の形成効率が高い変異体が含まれる。野生型の蛍光タンパク質はウミサボテン科の生物に由来するため、蛍光タンパク質は当該生物の生活環境において最も安定的である可能性が高い。その生活環境における温度等の条件が実験条件と大きく異なる場合、蛍光タンパク質の安定性が損なわれる可能性がある。したがって、特に実験で使用する条件の下で安定性の高い蛍光タンパク質の変異体を取得することは精度の高い測定を行う上で利点がある。このような変異体は、元となる蛍光タンパク質の遺伝子にランダムに変異を入れた後、それらを大腸菌等に発現させ、特定の条件下で所望の安定性を示す変異体を選択することで取得できる。このような変異体のより具体的な例は、哺乳細胞の培養に適した温度（例えば３７℃付近）において野生型の蛍光タンパク質と比較して蛍光強度の強い変異体である。Ｓ１４７Ａ変異体、Ｓ１４７Ｔ変異体、Ｓ１４７Ｇ変異体およびＳ１４７Ｃ変異体はそれぞれ、３７℃において安定化する変異を含む（即ち、１２９番目のセリンがグリシンに、１５６番目のアスパラギン酸がグリシンに、２０４番目のリジンがイソロイシンにおよび２０９番目のアスパラギンがチロシンにそれぞれ置換されている）。
【００４０】
＜核酸＞
本発明は、本発明に係る蛍光タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸に関する。このような塩基配列は、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物に由来する塩基配列であってよい。ここにおける「由来する」とは、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物が本来有する野生型の塩基配列に変異が生じた塩基配列を含むことを意味する。また、ここにおける変異とは、塩基配列中の特定の塩基の置換、欠失および／または付加等を指す。塩基配列の変異には、コードされるアミノ酸配列に変化を生じさせない変異をも含む。また、核酸とは、特に、ＤＮＡまたはＲＮＡを指す。
【００４１】
本発明の核酸の好ましい例は、配列番号２に示される塩基配列を含む核酸（Ｓ１４７Ａ変異体をコード）、配列番号４３に示される塩基配列を含む核酸（Ｓ１４７Ｔ変異体をコード）、配列番号４７に示される塩基配列を含む核酸（Ｓ１４７Ｇ変異体をコード）、または配列番号５１に示される塩基配列を含む核酸（Ｓ１４７Ｃ変異体をコード）である。
【００４２】
また、本発明は、これらの核酸を含むベクターを含む。当該ベクターには、蛍光タンパク質をコードする核酸以外に、発現を調節するための配列またはマーカー遺伝子の配列を含む核酸等を含んでよい。
【００４３】
＜ｐＨ測定方法＞
本発明は、本発明に係る蛍光タンパク質を対象に導入し、前記蛍光タンパク質が発する蛍光に基づいて前記対象内部のｐＨを測定する方法に関する。
【００４４】
すなわち、本発明の方法では、対象の内部に蛍光タンパク質を導入した後、励起光を照射して蛍光タンパク質が発する蛍光を検出し、当該蛍光の波長に基づいてｐＨを特定する。
【００４５】
ここにおいて、対象は、バクテリアの細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞または哺乳細胞といった細胞であってよい。さらに、対象は、組織または個体であってよい。細胞は、固定したものであってよいし、生きた状態のものであってよい。固定は、ホルマリン、メタノール等による一般的な方法で行うことができる。また、対象としての個体は、ヒトを除く個体であってよい。さらに、対象は、生物学実験で一般的に用いられる溶液であってよい。対象とする細胞、組織および個体に特に限定はなく、従来の取得方法によって得られるものを使用することができる。
【００４６】
対象に蛍光タンパク質を導入するために、細胞等へタンパク質を導入するための当該分野で一般的ないずれの方法を使用してもよい。例えば、対象が細胞である場合、マイクロインジェクション法によって蛍光タンパク質を直接細胞内へ注入してもよい。あるいは、蛍光タンパク質の遺伝子を含む発現ベクターを細胞に導入し、適切に発現させることで導入してもよい。発現ベクター等による遺伝子の導入は、リン酸カルシウム法、リポフェクションまたはエレクトロポレーション等を使用することができる。また、対象が溶液である場合、当該溶液の蛍光タンパク質の導入は、当該溶液に当該蛍光タンパク質を添加することで行われてよい。
【００４７】
蛍光の検出は、目視で行うことも可能であるが、特定の波長の蛍光を測定することが可能な、従来の方法または装置を使用して行うことができる。図７に示されるように、励起光を照射して青色の蛍光を発するか緑色の蛍光を発するかを目視で確認して、ｐＨの変化点より高いｐＨか低いｐＨかを判断することができるが、目視によらず検出装置を用いることで、より詳細にｐＨを特定することが可能となる。例えば、蛍光タンパク質を導入した細胞を蛍光顕微鏡下で観察することで行われる。そのような方法の例としては、蛍光の検出は、３８８ｎｍ励起−４６２ｎｍ蛍光および４９８ｎｍ励起−５０９ｎｍ蛍光に対応したフィルターセットの蛍光キューブを具備した倒立型蛍光顕微鏡において、４６２ｎｍおよび５０９ｎｍピークの試料の蛍光画像をＣＣＤカメラによって撮像する。撮像した画像内のｐＨ測定対象領域の蛍光強度を数値化しｐＨを求めることができる。このとき、細胞を種々の条件で刺激し、その後一定時間ごとに撮像することで、系時的に蛍光画像を取得することもできる。さらに、蛍光の測定は、４６２ｎｍ付近および５０９ｎｍ付近の波長のみでなく、蛍光スペクトルを測定することもできる。この場合、具体的には、顕微鏡のカメラポートに光ファイバーを接続し分光光度計にて測定対象領域の蛍光スペクトルを測定することで行うことができる。
【００４８】
また、ｐＨの算出は、各ｐＨに対する４６２ｎｍおよび５０９ｎｍの蛍光強度並びにそれらの比の値から作成した検量線をもとに行うことができる。検量線は、予め、各ｐＨについて４６２ｎｍの蛍光強度および５０９ｎｍの蛍光強度を測定し、ｐＨごとにそれらの蛍光強度の比を求めて、横軸をｐＨ、縦軸を比としてグラフにプロットすることで作成できる。その後、測定したい対象において４６２ｎｍおよび５０９ｎｍの蛍光強度を測定し、その比を検量線に当てはめて、対象中のｐＨを特定することができる。一般に、独立した実験系で蛍光タンパク質の蛍光活性を測定する場合、測定条件を極力同一にしたとしても、検出される蛍光強度の値は変動する可能性がある。例えば、使用する励起光源の状態等により、検出される蛍光強度の絶対値は変動する。また、測定する細胞の状態や培養液の状態などによって、バッググラウンドが上昇または下降することがある。このような場合、それらの実験系から得られる蛍光強度の値同士を直接比較することは適当ではない。これに対し、単一の実験系にて２つの蛍光強度を取得し、その比をもとめれば、蛍光強度の値の変動をキャンセルすることができ、同一条件の下で得られた比は、実験系間でほぼ一定となると考えられる。また、測定のたびに検量線を作成する必要がなくなり、さらに、独立した実験から得られた結果同士を比較することが可能となる。
【００４９】
本発明の方法は、蛍光タンパク質を単独で対象に導入する場合に限定されず、蛍光タンパク質と、その蛍光タンパク質とは異なるタンパク質とから成る融合タンパク質を対象に導入する方法も含む。例えば、この「異なるタンパク質」を、対象とする細胞が本来発現しているタンパク質とする場合、そのタンパク質が本来局在している細胞内の部位に、本発明の融合タンパク質も局在することが予想される。その状態で、蛍光タンパク質の蛍光を検出することで、「異なるタンパク質」に応じた特定部位のｐＨを測定することが可能となる。「異なるタンパク質」は、測定したい部位や、実験の目的に応じて選択することが可能であり、例えば、ミトコンドリア移行シグナル（ｃｏｘＩＶ）、ゴルジ体移行シグナル（ＧＴ）を使用できる。
【００５０】
本発明のｐＨ測定方法では、蛍光タンパク質の励起を、波長の異なる２つの励起光を照射することで行うことができる。本発明のｐＨ測定方法は、波長の異なる２つの蛍光を測定することを含むが、その２つの蛍光にそれぞれ対応した、波長の異なる２つの励起光を使用することができる。例えば、Ｓ１４７Ａ変異体を使用する場合、４６２ｎｍ付近および５０９ｎｍ付近の蛍光を発生させるために、３８８ｎｍ付近および４５０ｎｍ付近の励起光が使用することができる（図１および図２）。また、本発明のｐＨ測定方法では、蛍光タンパク質の励起を、単一波長の励起光を照射して行うことができる。例えば、Ｓ１４７Ａ変異体を使用する場合、４６２ｎｍ付近および５０９ｎｍ付近の蛍光を発生させるために３８８ｎｍ付近の励起光を使用することができる。単一の励起光を使用することにより、測定のための装置を単純化することが可能となる。
【００５１】
本発明のｐＨ測定方法では、本発明の異なる蛍光タンパク質を複数用いて行うことができる。複数の異なる蛍光タンパク質を使用することで、より正確にｐＨを測定することが可能となる。また、本発明のｐＨ測定方法は、単一の対象（例えば１種の細胞）に対してだけでなく、多種の対象（例えば２種以上の細胞）に対して同時に行うこともできる。好ましくは、本発明のｐＨ測定方法は、Ｓ１４７Ａ変異体（配列番号１）、Ｓ１４７Ｔ変異体（配列番号４２）、Ｓ１４７Ｇ変異体（配列番号４６）およびＳ１４７Ｃ変異体（配列番号５０）から成る群から選択される少なくとも２つの蛍光タンパク質の組み合わせを用いて、単一または多種の対象に対して行われる。
【実施例】
【００５２】
［実施例１：野生型ウミサボテン蛍光タンパク遺伝子のクローニング］
ウミサボテン（Ｃａｖｅｒｎｕｌａｒｉａ ｏｂｅｓａ）から野生型蛍光タンパク質を抽出および精製し、その部分的なアミノ酸配列を読み取った後、当該配列をもとに遺伝子配列を決定することで蛍光タンパク質遺伝子のクローニングを行った。
【００５３】
蛍光タンパク質の抽出精製およびアミノ酸配列分析
島根近海で採取したウミサボテン１５個体（約２００ｇ）を５００ｍｌのＳＤＳ−グリシンバッファー中ですり潰し、蛍光活性を持つタンパクを含む可溶性タンパクを抽出した。遠心機を用いて残渣を取り除き、蛍光活性を持つタンパク質を含む溶液を抽出した。この抽出溶液に、最終濃度が８０％になるように硫酸アンモニウムを加えて硫安沈殿を行った。具体的には、抽出溶液５００ｍｌに２６２ｇの硫酸アンモニウムを加えた。得られた沈殿を、５０ｍｌのトリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ）に再溶解させた。これに２倍量のエタノールを加え、タンパク質を再度沈殿させた。さらに、この沈殿にトリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ）を加えて再溶解させた。この溶液５０ｍｌを、十分量のトリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ）および透析膜２７／３２（三光純薬株式会社）を用いて透析した。透析後の溶液を、ＤＥＡＥ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を装着したクロマトグラフィーシステムＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いてイオン交換分離精製した。このイオン交換は、低塩濃度トリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ）で十分に平衡化した後、サンプルを添加し、高塩濃度トリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１Ｍ ＮａＣｌ）でＮａＣｌ濃度を０．４Ｍまで上昇させることで行い、その結果、蛍光活性のあるフラクションを分取した。蛍光活性を持つタンパクを含むフラクションの選択は、ＵＶ／ＢＬＵＥ ＣＯＮＶＥＲＴＥＲ ＰＬＡＴＥ（ＵＶＰ）を用いて行った。得られたフラクションを、十分量のトリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ）および透析膜２７／３２（三光純薬株式会社）を用いて透析した。透析後の溶液を、限外ろ過アミコンウルトラ：分画分子量３０ｋＤａ（日本ミリポア株式会社）を用いて濃縮した。次に、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）およびトリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ）を用いてゲルろ過を行った。ゲルろ過後、得られた蛍光活性のあるフラクションをｍｏｎｏＱ ５／５０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）によってイオン交換分離した。このイオン交換は、低塩濃度トリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ）で十分に平衡化した後、サンプルを添加し、高塩濃度トリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１Ｍ ＮａＣｌ）でＮａＣｌ濃度を０．４Ｍまで上昇させることで行い、その結果、蛍光活性のあるフラクションを得た。この活性のあるフラクションを限外ろ過アミコンウルトラ：分画分子量３０ｋＤａ（日本ミリポア株式会社）を用いて濃縮し、その後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）およびトリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ）を用いてゲルろ過分離を行い、蛍光活性のあるフラクションを得た。このサンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離してアミノ酸配列を分析した。分析の結果、２２残基のアミノ酸配列（ＩＰＤ ＹＦＶ ＱＳＦ ＰＥＧ ＦＴＦ ＥＲＴ ＬＳＦ Ｅ：配列番号１１）を決定することができた。
【００５４】
蛍光タンパク質遺伝子のクローニング
蛍光タンパク質遺伝子全長のクローニングのために、３’−ＲＡＣＥ ＰＣＲを下記のとおり実施した。Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄ法（以下、ＲＡＣＥと略す）により、蛍光タンパク質遺伝子をクローニングするための混合プライマーを作成した。アミノ酸配列解析によって得られたアミノ酸配列ＩＰＤ ＹＦＶ ＱＳＦ ＰＥＧ ＦＴＦ ＥＲＴ ＬＳＦ Ｅ（配列番号１１）のうち、コドンの塩基組み合わせが少ないＩＰＤＹＦＶおよびＥＧＦＴＦＥＲのアミノ酸領域に注目した。これらのアミノ酸領域をコードする塩基配列を予測し、３’末端ＲＡＣＥ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下ＰＣＲと略す）に用いる蛍光タンパク質特異的混合プライマー（合計１２種類）を以下のように作成した。ＩＰＤＹＦＶアミノ酸領域に結合するプライマーとして、ＣＯＧＦＰ−ＴＴＴ（５’−ＡＴＨ ＣＣＮ ＧＡＴ ＴＡＴ ＴＴＴ ＧＴ−３’）（配列番号１２）、ＣＯＧＦＰ−ＴＴＣ（５’−ＡＴＨ ＣＣＮ ＧＡＴ ＴＡＴ ＴＴＣ ＧＴ−３’）（配列番号１３）、ＣＯＧＦＰ−ＴＣＴ（５’−ＡＴＨ ＣＣＮ ＧＡＴ ＴＡＣ ＴＴＴ ＧＴ−３’）（配列番号１４）、ＣＯＧＦＰ−ＴＣＣ（５’−ＡＴＨ ＣＣＮ ＧＡＴ ＴＡＣ ＴＴＣ ＧＴ−３’）（配列番号１５）、ＣＯＧＦＰ−ＣＴＴ（５’−ＡＴＨ ＣＣＮ ＧＡＣ ＴＡＴ ＴＴＴ ＧＴ−３’）（配列番号１６）、ＣＯＧＦＰ−ＣＴＣ（５’−ＡＴＨ ＣＣＮ ＧＡＣ ＴＡＴ ＴＴＣ ＧＴ−３’）（配列番号１７）、ＣＯＧＦＰ−ＣＣＴ（５’−ＡＴＨ ＣＣＮ ＧＡＣ ＴＡＣ ＴＴＴ ＧＴ−３’）（配列番号１８）およびＣＯＧＦＰ−ＣＣＣ（５’−ＡＴＨ ＣＣＮ ＧＡＣ ＴＡＣ ＴＴＣ ＧＴ−３’）（配列番号１９）を作成し、ならびに、ＥＧＦＴＦＥＲアミノ酸領域に結合するプライマーとして、ＣＯＧＦＰ−ＡＴＴＡＡ（５’−ＧＡＡ ＧＧＮ ＴＴＴ ＡＣＮ ＴＴＴ ＧＡＡ ＡＧ−３’）（配列番号２０）、ＣＯＧＦＰ−ＡＣＣＡＡ（５’−ＧＡＡ ＧＧＮ ＴＴＣ ＡＣＮ ＴＴＣ ＧＡＡ ＡＧ−３’）（配列番号２１）、ＣＯＧＦＰ−ＡＴＴＧＡ（５’−ＧＡＧ ＧＧＮ ＴＴＴ ＡＣＮ ＴＴＴ ＧＡＧ ＡＧ−３’）（配列番号２２）およびＣＯＧＦＰ−ＡＣＣＧＡ（５’−ＧＡＧ ＧＧＮ ＴＴＣ ＡＣＮ ＴＴＣ ＧＡＧ ＡＧ−３’）（配列番号２３）を作成した。プライマー中のＨおよびＮは、混合塩基を示す。
【００５５】
完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（インビトロジェン）を用いて作成したウミサボテン完全長ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、蛍光タンパク質のアミノ酸配列から予測して作成した１２種類の特異的混合プライマーおよび３’末端特異的プライマーであるＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＣＴ ＧＴＣ ＡＡＣ ＧＡＴ ＡＣＧ ＣＴＡ ＣＧＴ ＡＡＣ Ｇ−３’）（配列番号２４）およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＧＣ ＴＡＣ ＧＴＡ ＡＣＧ ＧＣＡ ＴＧＡ ＣＡＧ ＴＧ−３’）（配列番号２５）を用いて３’−ＲＡＣＥ ＰＣＲを行った。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ ＰｒｉｍｅｒおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒは、完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（インビトロジェン社）に含まれており、これを使用した。３’−ＲＡＣＥ ＰＣＲによって効果的に蛍光タンパク質遺伝子を増幅させるため、一度ＰＣＲによって増幅した遺伝子を鋳型とし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ポリメラーゼＥｘ−Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。
【００５６】
一度目のＰＣＲは、ＩＰＤＹＦＶアミノ酸領域で作成した８種類プライマー（ＣＯＧＦＰ−ＴＴＴ、ＣＯＧＦＰ−ＴＴＣ、ＣＯＧＦＰ−ＴＣＴ、ＣＯＧＦＰ−ＴＣＣ、ＣＯＧＦＰ−ＣＴＴ、ＣＯＧＦＰ−ＣＴＣ、ＣＯＧＦＰ−ＣＣＴ、ＣＯＧＦＰ−ＣＣＣ）のいずれかとＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｐｒｉｍｅｒとの計８つのプライマー対で蛍光タンパク質遺伝子の増幅を行った。１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋添加）を最終濃度等倍、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）を最終濃度各０．２ｍＭ、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を最終濃度０．０５Ｕ／μｌ、８種類のプライマーのうちの１つを最終濃度０．４μＭおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’Ｐｒｉｍｅｒを最終濃度０．４μＭとして２０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、ウミサボテン完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液を０．２μｌ加えた。ＰＣＲ反応条件として、最初に９４℃１分間の熱変性を行い、次に、９４℃３０秒、４５℃３０秒および７２℃２分のサイクルを３０回行い、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応溶液２μｌを１％トリス酢酸緩衝液（以下、ＴＡＥと略す）アガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。８つの反応溶液でわずかに遺伝子増幅が認められたため、このＰＣＲ反応溶液を鋳型としてｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応を実施した。
【００５７】
ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲは、ＥＧＦＴＦＥＲアミノ酸領域で作成した４種類プライマー（ＣＯＧＦＰ−ＡＴＴＡＡ、ＣＯＧＦＰ−ＡＣＣＡＡ、ＣＯＧＦＰ−ＡＴＴＧＡ、ＣＯＧＦＰ−ＡＣＣＧＡ）の何れかとＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒとの計４つのプライマー対で蛍光タンパク質遺伝子の増幅を行った。１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋添加）を最終濃度等倍、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）を最終濃度各０．２ｍＭ、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を最終濃度０．０５Ｕ／μｌ、４種類のプライマーのうちの１つを最終濃度０．４μＭおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒを最終濃度０．４μＭとして１０μｌのｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応溶液を作製し、１度目のＰＣＲ反応溶液を鋳型として０．２μｌを加えた。ＰＣＲ反応条件として、最初に９４℃１分間の熱変性を行い、次に、９４℃３０秒、４５℃３０秒および７２℃２分のサイクルを３０回行い、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応溶液２μｌを１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。
【００５８】
その結果、１度目のＰＣＲ反応として、ＣＯＧＦＰ−ＴＴＣとＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて実施し、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応として、得られたＰＣＲ反応溶液を鋳型としてＣＯＧＦＰ−ＡＣＣＡＡとＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて実施した場合に、顕著な遺伝子増幅を確認できた。この増幅した遺伝子の塩基配列を決定し、ウミサボテン蛍光タンパク質遺伝子のウミサボテン３’末端側の塩基配列（配列番号２６）とした。
【００５９】
蛍光タンパク質の５’末端クローニングのための５’−ＲＡＣＥを下記の通り行った。一連の３’−ＲＡＣＥ解析によって得られたウミサボテン蛍光タンパク質遺伝子の３’末端側の塩基配列をもとに、５’末端クローニングのための５’−ＲＡＣＥに用いるプライマーを作成した。作成した５’末端クローニング用のプライマーは、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ１（５’−ＧＣＴ ＡＴＡ ＧＣＣ ＧＴＣ ＴＣＡ ＴＧＴ ＴＧＣ ＴＣＧ Ｔ−３’）（配列番号２７）、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ２（５’−ＡＧＣ ＣＧＴ ＣＴＣ ＡＴＧ ＴＴＧ ＣＴＣ ＧＴＡ ＧＴＡ Ｇ−３’）（配列番号２８）およびＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ３（５’−ＡＴＧ ＴＴＧ ＣＴＣ ＧＴＡ ＧＴＡ ＧＴＴ ＧＣＣ ＴＴＣ ＣＴＣ ＧＡＣ−３’）（配列番号２９）の３種類である。ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ１、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ２、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ３の順で５’末端に近い位置に結合し、順次ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応のプライマーとして用いる。
【００６０】
完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒを用いて作成したウミサボテン完全長ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、３種類の５’末端クローニング用のプライマーならびに５’末端特異的プライマーであるＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＧＡ ＣＴＧ ＧＡＧ ＣＡＣ ＧＡＧ ＧＡＣ ＡＣＴ ＧＡ−３’）（配列番号３０）およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＧＡ ＣＡＣ ＴＧＡ ＣＡＴ ＧＧＡ ＣＴＧ ＡＡＧ ＧＡＧ ＴＡ−３’）（配列番号３１）を用いて、５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲを行った。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ ＰｒｉｍｅｒおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒは完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（インビトロジェン社）に含まれており、これを使用した。５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲによって効果的に蛍光タンパク質遺伝子を増幅させるため、一度ＰＣＲによって増幅した遺伝子を鋳型にし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行った。ＰＣＲにはポリメラーゼＥｘ−Ｔａｑを用いて、マニュアルに従って実施した。
【００６１】
一度目の５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲとして、３’−ＲＡＣＥで増幅した遺伝子の塩基配列をもとに作成したＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ１とＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて、蛍光タンパク質遺伝子を増幅した。１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋添加）を最終濃度等倍とし、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）を最終濃度各０．２ｍＭとし、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を最終濃度０．０５Ｕ／μｌとし、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ１を最終濃度０．４μＭとし、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｐｒｉｍｅｒを最終濃度０．４μＭとして、１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、ウミサボテン完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液を０．２μｌを加えた。ＰＣＲ反応条件として、最初に９４℃１分間の熱変性を行い、次に、９４℃３０秒、４５℃３０秒および７２℃２分のサイクルを３０回行い、最後に、７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応溶液２μｌを、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。この５’−ＲＡＣＥでわずかに遺伝子増幅が認められたため、このＰＣＲ反応溶液を鋳型としてｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応を実施した。
【００６２】
ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲとして、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ２とＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて蛍光タンパク質ＧＦＰ遺伝子を増幅した。１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋添加）を最終濃度等倍とし、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）を最終濃度各０．２ｍＭとし、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を最終濃度０．０５Ｕ／μｌとし、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ２を最終濃度０．４μＭとし、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒを最終濃度０．４μＭとして、１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、１度目のＰＣＲ反応溶液を鋳型として０．２μｌを加えた。ＰＣＲ反応条件として、最初に９４℃１分間の熱変性を行い、次に、９４℃３０秒、４５℃３０秒および７２℃２分のサイクルを３０回行い、最後に、７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応溶液２μｌを、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。
【００６３】
その結果、１度目のＰＣＲ反応として、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ１とＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて実施し、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応として、得られたＰＣＲ反応溶液を鋳型としてＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ２とＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて実施した場合に、顕著な遺伝子増幅を確認できた。しかし、非特異的な複数の遺伝子の増幅が認められたため、このＰＣＲ反応溶液を鋳型として、異なるプライマー対を用いて再度ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応を実施した。
【００６４】
二度目のｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲとして、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ３とＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて、ＧＦＰ遺伝子を増幅した。１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋添加）を最終濃度等倍とし、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）を最終濃度各０．２ｍＭとし、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を最終濃度０．０５Ｕ／μｌとし、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ３を最終濃度０．４μＭとし、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒを最終濃度０．４μＭとして、２０μｌのｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応溶液を作製し、１度目のｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応溶液を鋳型として０．４μｌを加えた。ＰＣＲ反応条件として、最初に９４℃１分間の熱変性を行い、次に、９４℃３０秒、４５℃３０秒および７２℃２分のサイクルを３０回行い、最後に、７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応溶液２μｌを、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。その結果、一連のｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応で顕著な遺伝子増幅を確認できた。この増幅した遺伝子の塩基配列を決定し、ウミサボテン蛍光タンパク質遺伝子の５’末端側の塩基配列（配列番号３２）とした。
【００６５】
次に、蛍光タンパク質遺伝子の完全長の増幅を下記のとおりに行った。上述した３’−ＲＡＣＥおよび５’−ＲＡＣＥ解析によって得られたウミサボテン由来の蛍光タンパク質遺伝子の５’末端側の塩基配列をもとに、完全長蛍光タンパク質遺伝子クローニングのための３’−ＲＡＣＥに用いるプライマーを作成した。作成した完全長ＧＦＰ遺伝子クローニング用のプライマーは、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ３（５’−ＡＴＴ ＴＡＧ ＧＴＧ ＧＣＴ ＧＣＧ ＴＡＣ ＡＧ−３’）（配列番号３３）、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ４（５’−ＡＴＴ ＴＡＧ ＧＴＧ ＧＣＴ ＧＣＧ ＴＡＣ ＡＧＴ ＴＡＡ ＣＡＣ−３’）（配列番号３４）の２種類である。ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ３、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ４の順で３’末端に近い位置に結合する。ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ４をｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応のプライマーとして用いる。
【００６６】
完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒを用いて作成したウミサボテン完全長ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、２種類の完全長蛍光タンパク質遺伝子クローニング用のプライマーならびに３’末端特異的プライマーであるＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＣＴ ＧＴＣ ＡＡＣ ＧＡＴ ＡＣＧ ＣＴＡ ＣＧＴ ＡＡＣ Ｇ−３’）（配列番号２４）およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＧＣ ＴＡＣ ＧＴＡ ＡＣＧ ＧＣＡ ＴＧＡ ＣＡＧ ＴＧ−３’）（配列番号２５）を用いて、３’−ＲＡＣＥ ＰＣＲを行った。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ ＰｒｉｍｅｒおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒは、完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（インビトロジェン社）に含まれているので、これを使用した。３’−ＲＡＣＥ ＰＣＲによって効果的に完全長蛍光タンパク質遺伝子を増幅させるため、一度ＰＣＲによって増幅した遺伝子を鋳型にし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行った。ＰＣＲにはポリメラーゼＥｘ−Ｔａｑを用いてマニュアルに従って実施した。
【００６７】
一度目のＰＣＲとして、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ３とＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて蛍光タンパク質遺伝子を増幅した。１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋添加）を最終濃度等倍とし、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）を最終濃度各０．２ｍＭとし、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を最終濃度０．０５Ｕ／μｌとし、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ３を最終濃度０．４μＭとし、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｐｒｉｍｅｒを最終濃度０．４μＭとして、１０μｌのｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応溶液を作製し、ウミサボテン完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液を０．２μｌを加えた。ＰＣＲ反応条件として、最初に９４℃１分間の熱変性を行い、次に、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃１分のサイクルを３０回行い、最後に、７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応溶液２μｌを１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。一度目の５’−ＲＡＣＥでわずかに遺伝子増幅が認められたため、このＰＣＲ反応溶液を鋳型としてｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応を実施した。
【００６８】
ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲとしてＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ４とＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて、蛍光タンパク質遺伝子を増幅した。１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋添加）を最終濃度等倍とし、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）を最終濃度各０．２ｍＭとし、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を最終濃度０．０５Ｕ／μｌとし、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ４を最終濃度０．４μＭとし、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒを最終濃度０．４μＭとして、１０μｌのｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応溶液を作製し、１度目のＰＣＲ反応溶液を鋳型として０．２μｌを加えた。ＰＣＲ反応条件として、最初に９４℃１分間の熱変性を行い、次に、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃１分のサイクルを３０回行い、最後に、７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応溶液２μｌを１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。その結果、顕著な遺伝子増幅を確認できた。この増幅した遺伝子の塩基配列を決定して、完全長ウミサボテン蛍光タンパク質遺伝子の５’末端側の塩基配列（配列番号３５）とした。
【００６９】
得られた完全長ウミサボテン蛍光タンパク質の塩基配列から、配列情報解析ソフトウェアＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏを用いてウミサボテンＧＦＰ遺伝子のオープンリーディングフレームの塩基配列を予想した（配列番号４）。さらに、このオープンリーディングフレームを翻訳してウミサボテン蛍光タンパク質のアミノ酸配列を得た（配列番号３）。このアミノ酸配列は、ウミサボテンから精製し、アミノ酸分析によって得られた２２残基の配列（配列番号１１）を完全一致の状態で含むことから、ウミサボテンに由来する野生型蛍光タンパク質遺伝子であると決定した。この遺伝子をｐＲＳＥＴベクター（インビトロジェン）に組み込み、大腸菌にトランスフォーメーションし、ＵＶ／ＢＬＵＥ ＣＯＮＶＥＲＴＥＲ ＰＬＡＴＥ（ＵＶＰ）を用いて観察したところ顕著な蛍光活性が示された。
【００７０】
［実施例２：ウミサボテン蛍光タンパク質の単量体化］
以下の方法によって、野生型蛍光タンパク質のアミノ酸配列の１５４番目のシステインをセリンに置換した。変異の導入には、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いた。ｐＲＳＥＴ−Ａ（インビトロジェン社）にウミサボテン蛍光タンパク質遺伝子をクローニングしたプラスミドを鋳型とし、Ｐｉｒｍｅｒ１（ＣＡＡＴＧＴＡＴＧＴＡＴＣＧＧＡＣＧＡＣＡＣＴＴＴＧＧ）（配列番号３６）およびＰｒｉｍｅｒ２（ＣＣＡＡＡＧＴＧＴＣＧＴＣＣＧＡＴＡＣＡＴＡＣＡＴＴＧ）（配列番号３７）を使用して、キットに添付されているマニュアルに準じてＰＣＲ反応を行った。反応後、３７度にてＤｐｎＩで処理し、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株にトランスフォームした。
【００７１】
トランスフォームされた菌を培養してベクターを取り出し、蛍光タンパク質遺伝子の塩基配列をシーケンサーによって読み取った。その結果、配列番号８の配列が得られ、狙い通りに変異が導入できたことが確認できた。この遺伝子から、１５４番目がセリンに置換された蛍光タンパク質（配列番号５）が発現する。
【００７２】
また、トランスフォーム後の大腸菌を、２８度にて培養した後、溶菌してライセートを作製した。これにＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを加え、熱を加えずにサンプルを調製して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果を図４に示す。図４から、野生型蛍光タンパク質（左レーン）では出現する２量体のバンドが、変異体蛍光タンパク質（右レーン）において消失していることがわかる。このことから、蛍光タンパク質が単量体化されたことが確認された。
【００７３】
［実施例３：ウミサボテン蛍光タンパク質の発色団形成温度の改変］
実施例２で得られた単量体化した変異体蛍光タンパク質に対してランダムに変異を導入し、３７℃において発色団形成が安定化する変異体をスクリーニングした。
【００７４】
変異の導入は、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ ＩＩ ＥＺＣｌｏｎｅ Ｄｏｍａｉｎ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いた。ｐＲＳＥＴ−Ａ（インビトロジェン社）に単量体化変異体（１５４番目のシステインがセリンに置換）の遺伝子がクローニングされたプラスミドを鋳型とし、Ｐｉｒｍｅｒ１（ＡＴＧＡＧＴＡＴＴＣＣＡＧＡＧＡＡＴＴＣＧＧＧＣＴＴＡＡＣＡＧ）（配列番号３８）およびＰｒｉｍｅｒ２（ＴＣＡＴＧＧＴＴＴＡＧＣＴＡＴＧＧＣＣＧＴＣＴＣＡＴＧ）（配列番号３９）を加えて、キットに添付されているマニュアルに準じてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応後、１％アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、目的とするＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて精製した。精製後、マニュアルに準じてＰＣＲ反応を行い、３７℃にてＤｐｎＩで処理した後に、エタノール沈殿を行った。沈殿後、少量の蒸留水にＤＮＡを溶かして、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ社）を用いてエレクトロポレーション法にてＪＭ１０９（ＤＥ３）にトランスフォームした。トランスフォーム後の大腸菌を、２５ｃｍ四方のＬＢ（５０ｎｇ／ｍｌのアンピシリンを添加済み）プレートに播種して、３７℃で培養してコロニーを形成させた。コロニー形成後、ＵＶ／ＢＬＵＥ ＣＯＮＶＥＲＴＥＲ ＰＬＡＴＥ（ＵＶＰ）を使用して、野生型蛍光タンパク質を発現するコロニーと比べて、強い蛍光を発するコロニー（それぞれ変異体１および変異体２と名付ける）を２つ選択し、再度培養した。その後、それらが保持するプラスミドの塩基配列を決定した。それぞれの配列は配列番号９および配列番号１０に示される。
【００７５】
さらに、これらの塩基配列をアミノ酸配列に変換し（変異体１は配列番号６、変異体２は配列番号７）、野生型のアミノ酸配列と比較した。変異体１は、１２６番目のアスパラギンがチロシンに置換され、１５４番目のシステインがセリンに置換され、１６６番目のチロシンがフェニルアラニンに置換されていることがわかった。変異体２は、１２９番目のセリンがグリシンに置換され、１５４番目のシステインがセリンに置換され、１５６番目のアスパラギン酸がグリシンに置換され、２０４番目のリジンがイソロイシンに置換され、２０９番目のアスパラギンがチロシンに置換されていることがわかった。
【００７６】
また、変異体１および２の３７℃における発色団形成の安定性を、野生型蛍光タンパク質および単量体化蛍光タンパク質と比較した。ｐＲＳＥＴ−Ａ（インビトロジェン社）に、野生型遺伝子、実施例２で作製した単量体化変異体の遺伝子、変異体１の遺伝子および変異体２の遺伝子をそれぞれクローニングし、それぞれＪＭ１０９（ＤＥ３）株にトランスフォームした。これらの株をプレートに塗布し、３７℃で培養して蛍光タンパク質を発現させた。その状態をＵＶ／ＢＬＵＥ ＣＯＮＶＥＲＴＥＲ ＰＬＡＴＥ（ＵＶＰ）で観察して、画像を撮影した。図５は、それをモノクロで表した画像である。蛍光は、実際の画像では緑色の光として観察されたが、図５では白色で示され、白色が濃いほど、蛍光強度が高い。野生型および単量体化変異体と比較して、変異体１および２は非常に強い蛍光を発していることがわかる。特に、変異体１に比べて、変異体２のほうが強い蛍光を発していることがわかる。
【００７７】
次に、ゲルろ過クロマトグラフィーにて、蛍光タンパク質の会合状態を調べた。野生型蛍光タンパク質を発現する大腸菌および変異体２を発現する大腸菌から、それぞれ蛍光タンパク質を精製し解析した。その結果を図６に示す。野生型では６６ｋＤａｌ付近にピークが得られ、一方、変異体２では３７ｋＤａｌ付近でピークが得られた。これらの結果は、野生型蛍光タンパク質が２量体を形成しているのに対し、変異体２の蛍光タンパク質が単量体を形成していることを示唆する。
【００７８】
［実施例４：Ｓ１４７Ａ変異体の作製］
実施例３で得られた遺伝子に対し、蛍光極大波長の変更点をアルカリ性側にシフトする変異を、Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて導入した。詳細は下記に述べる。
【００７９】
ｐＲＳＥＴ−Ｂ（インビトロジェン社）に、変異体２（１２９番目のセリンがグリシンに置換、１５４番目のシステインがセリンに置換、１５６番目のアスパラギン酸がグリシンに置換、２０４番目のリジンがイソロイシンに置換、２０９番目のアスパラギンがチロシンに置換）の遺伝子を挿入したプラスミドを鋳型として、Ｓ１４７Ａプライマー１（ＣＣＡＡＡＣＴＡＧＡＡＣＣＧＧＣＧＡＧＴＧＡＧＴＣＡＡＴＧ、配列番号４０）およびＳ１４７Ａプライマー２（ＣＡＴＴＧＡＣＴＣＡＣＴＣＧＣＣＧＧＴＴＣＴＡＧＴＴＴＧＧ、配列番号４１）を使用して、キットに添付されているマニュアルに準じてＰＣＲ反応を行った。反応後、反応産物にＤｐｎＩを加えて３７度で処理した後に、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株に形質転換した。形質転換された大腸菌を増殖させてプラスミドＤＮＡを精製し、目的の変異が導入された遺伝子が作製されたことを確認した。このプラスミドを保持する大腸菌を３７度にて培養してＳ１４７Ａ変異体を発現させ、溶菌して、Ｎｉ−ＮＴＡ（Ｑｕｉａｇｅｎ社）カラムクロマトグラフィーを行って当該変異体を精製した。
【００８０】
精製されたＳ１４７Ａ変異体を異なるｐＨの溶液に添加し、蛍光色をＵＶハンディライト（３６５ｎｍ）で確認したところ、ｐＨ９からｐＨ１０の間において蛍光色が青色から緑色に変化した（図７）。
【００８１】
さらに、分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ Ｕ−３０１０）、蛍光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ Ｆ−２５００）を用いて、吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを測定した（図１から３）。その結果、主にｐＨ９以下において４６２ｎｍ付近に蛍光極大波長を有し（３８８ｎｍ励起、図１）、ｐＨ１０以上において５０９ｎｍ付近に蛍光極大波長を有することがわかった（４５０ｎｍ励起、図２）。また、主にｐＨ９以下において３９５ｎｍ、主にｐＨ１０以上において５０９ｎｍに吸収極大を持つことが分かった（図３）。
【００８２】
［実施例５：Ｓ１４７Ｔ変異体の作製］
実施例３で得られた遺伝子に対し、蛍光極大波長の変更点をアルカリ性側にシフトする変異を、Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて導入した。詳細は下記に述べる。
【００８３】
ｐＲＳＥＴ−Ｂ（インビトロジェン社）に、変異体２（１２９番目のセリンがグリシンに置換、１５４番目のシステインがセリンに置換、１５６番目のアスパラギン酸がグリシンに置換、２０４番目のリジンがイソロイシンに置換、２０９番目のアスパラギンがチロシンに置換）の遺伝子を挿入したプラスミドを鋳型として、Ｓ１４７Ｔプライマー１（ＣＣＡＡＡＣＴＡＧＡＡＣＣＧＡＣＣＡＧＴＧＡＧＴＣＡＡＴＧ、配列番号４４）およびＳ１４７Ｔプライマー２（ＣＡＴＴＧＡＣＴＣＡＣＴＧＧＴＣＧＧＴＴＣＴＡＧＴＴＴＧＧ、配列番号４５）を使用して、キットに添付されているマニュアルに準じてＰＣＲ反応を行った。反応後、反応産物にＤｐｎＩを加えて３７度で処理した後に、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株に形質転換した。形質転換された大腸菌を増殖させてプラスミドＤＮＡを精製し、目的の変異が導入された遺伝子が作製されたことを確認した。このプラスミドを保持する大腸菌を３７度にて培養してＳ１４７Ｔ変異体を発現させ、溶菌して、Ｎｉ−ＮＴＡ（Ｑｕｉａｇｅｎ社）カラムクロマトグラフィーを行って当該変異体を精製した。
【００８４】
精製されたＳ１４７Ｔ変異体を異なるｐＨの溶液に添加し、蛍光色をＵＶハンディライト（３６５ｎｍ）で確認したところ、ｐＨ６付近において蛍光色が青色から緑色に変化した（図１２）。
【００８５】
さらに、分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ Ｕ−３０１０）、蛍光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ Ｆ−２５００）を用いて、吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを測定した（図１１ａ−ｃ）。その結果、３８８ｎｍの励起光により励起した場合、ｐＨ６以下において主に４６０ｎｍ付近のピークを示し、ｐＨ７では４６０ｎｍ付近のピークと５０７ｎｍ付近のピークとを示し、ｐＨ８以上では主に５０７ｎｍ付近のピークを示した（図１１ａ）。また、４５０ｎｍの励起光により励起した場合、各ｐＨにおいて、主に５０７ｎｍ付近にのみピークを示した（図１１ｂ）。さらに、吸収ピークを見た場合、ｐＨ７以下では３８９ｎｍ付近と４９９ｎｍ付近とに主要な２つのピークを示し、ｐＨ８以上では主に４９９ｎｍ付近にピークを示した（図１１ｃ）。
【００８６】
［実施例６：Ｓ１４７Ｇ変異体の作製］
実施例３で得られた遺伝子に対し、蛍光極大波長の変更点をアルカリ性側にシフトする変異を、Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて導入した。詳細は下記に述べる。
【００８７】
ｐＲＳＥＴ−Ｂ（インビトロジェン社）に、変異体２（１２９番目のセリンがグリシンに置換、１５４番目のシステインがセリンに置換、１５６番目のアスパラギン酸がグリシンに置換、２０４番目のリジンがイソロイシンに置換、２０９番目のアスパラギンがチロシンに置換）の遺伝子を挿入したプラスミドを鋳型として、Ｓ１４７Ｇプライマー１（ＣＣＡＡＡＣＴＡＧＡＡＣＣＧＧＧＣＡＧＴＧＡＧＴＣＡＡＴＧ、配列番号４８）およびＳ１４７Ｇプライマー２（ＣＡＴＴＧＡＣＴＣＡＣＴＧＣＣＣＧＧＴＴＣＴＡＧＴＴＴＧＧ、配列番号４９）を使用して、キットに添付されているマニュアルに準じてＰＣＲ反応を行った。反応後、反応産物にＤｐｎＩを加えて３７度で処理した後に、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株に形質転換した。形質転換された大腸菌を増殖させてプラスミドＤＮＡを精製し、目的の変異が導入された遺伝子が作製されたことを確認した。このプラスミドを保持する大腸菌を３７度にて培養してＳ１４７Ｇ変異体を発現させ、溶菌して、Ｎｉ−ＮＴＡ（Ｑｕｉａｇｅｎ社）カラムクロマトグラフィーを行って当該変異体を精製した。
【００８８】
精製されたＳ１４７Ｇ変異体を異なるｐＨの溶液に添加し、蛍光色をＵＶハンディライト（３６５ｎｍ）で確認したところ、ｐＨ７付近において蛍光色が青色から緑色に変化した（図１４）。
【００８９】
さらに、分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ Ｕ−３０１０）、蛍光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ Ｆ−２５００）を用いて、吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを測定した（図１３ａ−ｃ）。その結果、３８８ｎｍの励起光により励起した場合、ｐＨ９以下において主に４６０ｎｍ付近のピークを示し、ｐＨ１０および１１では、４６０ｎｍ付近および５０６ｎｍ付近にピークを示した（図１３ａ）。また、４５０ｎｍの励起光により励起した場合、ｐＨ５から１１において、主に５０６ｎｍ付近にピークを示した（図１３ｂ）。さらに、吸収ピークを見た場合、ｐＨ６以下では主に３９４ｎｍ付近にピークを示し、ｐＨ７から９では３９４ｎｍ付近および４９５ｎｍ付近においてピークを示し、ｐＨ１０および１１では主に４９５ｎｍ付近に吸収ピークを示した（図１３ｃ）。
【００９０】
［実施例７：Ｓ１４７Ｃ変異体の作製］
実施例３で得られた遺伝子に対し、蛍光極大波長の変更点をアルカリ性側にシフトする変異を、Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて導入した。詳細は下記に述べる。
【００９１】
ｐＲＳＥＴ−Ｂ（インビトロジェン社）に、変異体２（１２９番目のセリンがグリシンに置換、１５４番目のシステインがセリンに置換、１５６番目のアスパラギン酸がグリシンに置換、２０４番目のリジンがイソロイシンに置換、２０９番目のアスパラギンがチロシンに置換）の遺伝子を挿入したプラスミドを鋳型として、Ｓ１４７Ｃプライマー１（ＣＣＡＡＡＣＴＡＧＡＡＣＣＧＴＧＣＡＧＴＧＡＧＴＣＡＡＴＧ、配列番号５２）およびＳ１４７Ｃプライマー２（ＣＡＴＴＧＡＣＴＣＡＣＴＧＣＡＣＧＧＴＴＣＴＡＧＴＴＴＧＧ、配列番号５３）を使用して、キットに添付されているマニュアルに準じてＰＣＲ反応を行った。反応後、反応産物にＤｐｎＩを加えて３７度で処理した後に、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株に形質転換した。形質転換された大腸菌を増殖させてプラスミドＤＮＡを精製し、目的の変異が導入された遺伝子が作製されたことを確認した。このプラスミドを保持する大腸菌を３７度にて培養してＳ１４７Ｃ変異体を発現させ、溶菌して、Ｎｉ−ＮＴＡ（Ｑｕｉａｇｅｎ社）カラムクロマトグラフィーを行って当該変異体を精製した。
【００９２】
精製されたＳ１４７Ｃ変異体を異なるｐＨの溶液に添加し、蛍光色をＵＶハンディライト（３６５ｎｍ）で確認したところ、ｐＨ９付近において蛍光色が青色から緑色に変化した（図１６）。
【００９３】
さらに、分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ Ｕ−３０１０）、蛍光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ Ｆ−２５００）を用いて、吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを測定した（図１５ａ−ｃ）。その結果、３８８ｎｍの励起光により励起した場合、各ｐＨにおいて主に４６０ｎｍ付近のピークを示した（図１３ａ）。また、４５０ｎｍの励起光により励起した場合、ｐＨ８から１１において、主に５１２ｎｍ付近にピークを示した（図１３ｂ）。さらに、吸収ピークを見た場合、ｐＨ７以下では主に３９６ｎｍ付近にピークを示し、ｐＨ８および９では３９６ｎｍ付近および５０５ｎｍ付近においてピークを示し、ｐＨ１０および１１では主に５０５ｎｍ付近に吸収ピークを示した（図１３ｃ）。
【００９４】
［実施例８：固定細胞での細胞内ｐＨの測定］
固定細胞内において、野生型ウミサボテン蛍光タンパク質の蛍光を測定した。
【００９５】
哺乳細胞発現ベクターｐＣＤＡ３．１（インビトロジェン社）に、野生型ウミサボテン蛍光タンパク質のｃＤＮＡを組み込んだ。作製されたプラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロジェン社）を用いてＵ２ＯＳ細胞に導入した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００は取扱説明書に従って使用した。
【００９６】
そのＵ２ＯＳ細胞を一昼夜培養した後、３％中性ホルマリン固定法によって固定し、蛍光顕微鏡（オリンパス社製ＩＸ７０）にて明視野像を撮影した（図８ａ）。その後、細胞をリン酸緩衝液（ｐＨ＝７）で洗浄し、ＩＢ励起用の蛍光キューブＮＩＢＡ（オリンパス社製：励起フィルター４７０−４９０ｎｍ、ダイクロイックミラー５０５ｎｍ、蛍光フィルター５１０−５５０ｎｍ）を使用して蛍光像を撮影した。図８ｂは、それをモノクロで表した画像である。実際の画像において緑色で観察された蛍光は、図８ｂでは白色で示される。次に、細胞を酢酸緩衝液（ｐＨ＝４）で洗浄し、Ｕ励起用蛍光キューブＷＵ（オリンパス社製：励起フィルター３３０−３８５ｎｍ、ダイクロイックミラー４００ｎｍ、蛍光フィルター４２０ｎｍロングパス）を使用して蛍光像を撮影した。図８ｃは、それをモノクロで表した画像である。実際の画像において青色で観察された蛍光は、図８ｃでは白色で示される。これらの画像から、本発明のウミサボテン蛍光タンパク質が、ホルマリン固定された細胞内においても蛍光を発生することができ、さらに、ｐＨに応じてその波長を変化させることが示された。
【００９７】
さらに、各ｐＨにおける蛍光スペクトルを計測した（図８ｄ）。計測には浜松ホトニクス社製のマルチチャンネル検出器ＰＭＡ−１１を用いた。その結果、ｐＨ４では４７２ｎｍに、ｐＨ７では５０９ｎｍに最大波長を示すスペクトルが得られた。
【００９８】
［実施例９：貪食細胞におけるｐＨの測定］
生細胞内における野生型ウミサボテン蛍光タンパク質の蛍光を測定して細胞内のｐＨを推定した。
【００９９】
大腸菌発現ベクターｐＲＳＥＴ（インビトロジェン社）に野生型ウミサボテン蛍光タンパク質のｃＤＮＡを組み込んだ。作製されたプラスミドを大腸菌にトランスフォーメーションし、２５℃で培養して、野生型ウミサボテン蛍光タンパク質を大腸菌内で発現させた。この大腸菌を、マウス由来マクロファージＲＡＷ２６４．７細胞株の培養容器内に加えて、一昼夜培養した。なお、大腸菌はＲＡＷ細胞によって貪食された後、ＲＡＷ細胞内の酸性環境下にある細胞小器官リソソームで消化されることが一般に知られている。
【０１００】
蛍光顕微鏡観察を行う前に、培養液をリン酸緩衝液（ｐＨ＝７）で置換した。その後、大腸菌を貪食中のＲＡＷ細胞をＩＢ励起用の蛍光キューブＮＩＢＡ（オリンパス社製：励起フィルター４７０−４９０ｎｍ、ダイクロイックミラー５０５ｎｍ、蛍光フィルター５１０−５５０ｎｍ）を用いて撮影した。図９の（ａ）は、それをモノクロで表した画像である。蛍光キューブＮＩＢＡを使用すると、主に緑色の蛍光のみを検出することができるが、図９ａ中では、緑色の蛍光は白色で表される。さらに、Ｕ励起用の蛍光キューブＷＵ（オリンパス社製：励起フィルター３３０−３８５ｎｍ、ダイクロイックミラー４００ｎｍ、蛍光フィルター４２０ｎｍロングパス）を用いて撮影した。図９の（ｂ）は、それをモノクロで表した画像である。蛍光キューブＷＵを使用すると、緑色および青色を含む４２０ｎｍ以上の蛍光を検出できるが、図９ｂ中では、緑色および青色の蛍光は、ともに白色で表される。
【０１０１】
図９ａによれば、点在する光を観察することができるが、ＲＡＷ細胞の形を認識することはできない。観察されたこの光は、明視野像（図示せず）との比較から、ＲＡＷ細胞に貪食される前の培養液中に存在する大腸菌に由来する光であることがわかる。このことから、中性の培養液中に存在する大腸菌内の蛍光タンパク質は、緑色の蛍光を発していることがわかった。
【０１０２】
図９ｂに示すように、点在する光に加え、多数の光が集ってＲＡＷ細胞の形を形成している様子も観察された。点在する光は、図９ａと同様に、貪食前の培養液中の大腸菌に由来する光である。一方、ＲＡＷ細胞の形を形成する光は、貪食されＲＡＷ細胞内のリソソームに取り込まれた大腸菌に由来する光である。ここで、実際の画像によれば、点在する光は緑色に、ＲＡＷ細胞の形を形成する光は青色に観察された。これらのことから、ウミサボテン蛍光タンパク質は、中性の培養液では緑色の蛍光を発するが、酸性のリソソーム内に移されることにより、青色の蛍光を発するようになることがわかった。
【０１０３】
さらに、図９ｂにおけるＲＡＷ細胞による貪食の前後における蛍光タンパク質の蛍光スペクトルを図１０に示す。この蛍光スペクトルから得られた４５８ｎｍおよび５０６ｎｍの蛍光強度に基づいて比を求め、予め作成した検量線に当てはめて培養液中およびリソソーム内のｐＨを推定した（図１０下表）。推定されたｐＨは、培養液中のｐＨおよびリソソーム内のｐＨをほぼ反映している。
【０１０４】
以上の結果から、ウミサボテン蛍光タンパク質は、生きた異種細胞内においても中性環境下から酸性環境下へと移されることで、それが発する蛍光の波長を変化させることができることが示された。さらに、そのときの蛍光強度に基づいてウミサボテン蛍光タンパク質の存在する環境中のｐＨを良好に求めることができることが示された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物に由来し、ｐＨ依存的に蛍光極大波長が変化する蛍光タンパク質であって、当該変化がｐＨ４とｐＨ１１との間において生じる蛍光タンパク質。
【請求項２】
前記変化がｐＨ６とｐＨ１０との間において生じる請求項１に記載の蛍光タンパク質。
【請求項３】
前記変化が生じるｐＨより低いｐＨにおいて青色の蛍光を発し、前記変化が生じるｐＨより高いｐＨにおいて緑色の蛍光を発する請求項１または２に記載の蛍光タンパク質。
【請求項４】
前記変化が生じるｐＨより低いｐＨにおける蛍光極大波長が５０９ｎｍ付近であり、前記変化が生じるｐＨより高いｐＨにおける蛍光極大波長が４６２ｎｍ付近である請求項１から３の何れか１項に記載の蛍光タンパク質。
【請求項５】
前記変化がｐＨ９と１０との間において生じる請求項１から４の何れか１項に記載の蛍光タンパク質。
【請求項６】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む請求項５に記載の蛍光タンパク質。
【請求項７】
前記変化がｐＨ６付近において生じる請求項１から４の何れか１項に記載の蛍光タンパク質。
【請求項８】
配列番号４２で示されるアミノ酸配列を含む請求項７に記載の蛍光タンパク質。
【請求項９】
前記変化がｐＨ７と８との間において生じる請求項１から４の何れか１項に記載の蛍光タンパク質。
【請求項１０】
配列番号４６で示されるアミノ酸配列を含む請求項９に記載の蛍光タンパク質。
【請求項１１】
前記変化がｐＨ９付近において生じる請求項１から４の何れか１項に記載の蛍光タンパク質。
【請求項１２】
配列番号５０で示されるアミノ酸配列を含む請求項１１に記載の蛍光タンパク質。
【請求項１３】
請求項１から１２の何れか１項に記載の蛍光タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸。
【請求項１４】
前記塩基配列が配列番号２、４３、４７または５１に示される塩基配列である請求項１３に記載の核酸。
【請求項１５】
請求項１から１２の何れか１項に記載の蛍光タンパク質を対象に導入し、前記蛍光タンパク質が発する蛍光に基づいて前記対象内部のｐＨを測定する方法。
【請求項１６】
請求項１から１２の何れか１項に記載の蛍光タンパク質と前記蛍光タンパク質とは異なるタンパク質とから成る融合タンパク質を対象に導入し、前記蛍光タンパク質が発する蛍光に基づいて前記対象内部のｐＨを測定する方法。
【請求項１７】
前記対象が、細胞、組織または個体である請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記対象が、固定した細胞または生きた細胞である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記測定が、５０９ｎｍ付近の蛍光強度と４６２ｎｍ付近の蛍光強度との比に基づいて行われる、請求項１５から１８の何れか１項に記載の方法。
【請求項２０】
波長の異なる２つの励起光を前記蛍光タンパク質に照射し、前記蛍光タンパク質から発生する蛍光に基づいて前記対象内部のｐＨを測定する請求項１５から１９の何れか１項に記載の方法。
【請求項２１】
単一の波長の励起光を前記蛍光タンパク質に照射し、前記蛍光タンパク質から発生する蛍光に基づいて前記対象内部のｐＨを測定する請求項１５から１９の何れか１項に記載の方法。
【請求項２２】
請求項５、６、９および１１に記載の蛍光タンパク質から成る群から選択される少なくとも２つの蛍光タンパク質の組み合わせを用いて、単一または多種の対象に対して行う、請求項１５から２１に記載の方法。
【請求項１】
刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物に由来し、ｐＨ依存的に蛍光極大波長が変化する蛍光タンパク質であって、当該変化がｐＨ４とｐＨ１１との間において生じる蛍光タンパク質。
【請求項２】
前記変化がｐＨ６とｐＨ１０との間において生じる請求項１に記載の蛍光タンパク質。
【請求項３】
前記変化が生じるｐＨより低いｐＨにおいて青色の蛍光を発し、前記変化が生じるｐＨより高いｐＨにおいて緑色の蛍光を発する請求項１または２に記載の蛍光タンパク質。
【請求項４】
前記変化が生じるｐＨより低いｐＨにおける蛍光極大波長が５０９ｎｍ付近であり、前記変化が生じるｐＨより高いｐＨにおける蛍光極大波長が４６２ｎｍ付近である請求項１から３の何れか１項に記載の蛍光タンパク質。
【請求項５】
前記変化がｐＨ９と１０との間において生じる請求項１から４の何れか１項に記載の蛍光タンパク質。
【請求項６】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む請求項５に記載の蛍光タンパク質。
【請求項７】
前記変化がｐＨ６付近において生じる請求項１から４の何れか１項に記載の蛍光タンパク質。
【請求項８】
配列番号４２で示されるアミノ酸配列を含む請求項７に記載の蛍光タンパク質。
【請求項９】
前記変化がｐＨ７と８との間において生じる請求項１から４の何れか１項に記載の蛍光タンパク質。
【請求項１０】
配列番号４６で示されるアミノ酸配列を含む請求項９に記載の蛍光タンパク質。
【請求項１１】
前記変化がｐＨ９付近において生じる請求項１から４の何れか１項に記載の蛍光タンパク質。
【請求項１２】
配列番号５０で示されるアミノ酸配列を含む請求項１１に記載の蛍光タンパク質。
【請求項１３】
請求項１から１２の何れか１項に記載の蛍光タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸。
【請求項１４】
前記塩基配列が配列番号２、４３、４７または５１に示される塩基配列である請求項１３に記載の核酸。
【請求項１５】
請求項１から１２の何れか１項に記載の蛍光タンパク質を対象に導入し、前記蛍光タンパク質が発する蛍光に基づいて前記対象内部のｐＨを測定する方法。
【請求項１６】
請求項１から１２の何れか１項に記載の蛍光タンパク質と前記蛍光タンパク質とは異なるタンパク質とから成る融合タンパク質を対象に導入し、前記蛍光タンパク質が発する蛍光に基づいて前記対象内部のｐＨを測定する方法。
【請求項１７】
前記対象が、細胞、組織または個体である請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記対象が、固定した細胞または生きた細胞である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記測定が、５０９ｎｍ付近の蛍光強度と４６２ｎｍ付近の蛍光強度との比に基づいて行われる、請求項１５から１８の何れか１項に記載の方法。
【請求項２０】
波長の異なる２つの励起光を前記蛍光タンパク質に照射し、前記蛍光タンパク質から発生する蛍光に基づいて前記対象内部のｐＨを測定する請求項１５から１９の何れか１項に記載の方法。
【請求項２１】
単一の波長の励起光を前記蛍光タンパク質に照射し、前記蛍光タンパク質から発生する蛍光に基づいて前記対象内部のｐＨを測定する請求項１５から１９の何れか１項に記載の方法。
【請求項２２】
請求項５、６、９および１１に記載の蛍光タンパク質から成る群から選択される少なくとも２つの蛍光タンパク質の組み合わせを用いて、単一または多種の対象に対して行う、請求項１５から２１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１１ｃ】
【図１２】
【図１３ａ】
【図１３ｂ】
【図１３ｃ】
【図１４】
【図１５ａ】
【図１５ｂ】
【図１５ｃ】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１１ｃ】
【図１２】
【図１３ａ】
【図１３ｂ】
【図１３ｃ】
【図１４】
【図１５ａ】
【図１５ｂ】
【図１５ｃ】
【図１６】
【公開番号】特開２０１１−２１２００８（Ｐ２０１１−２１２００８Ａ）
【公開日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１４１９０８（Ｐ２０１０−１４１９０８）
【出願日】平成２２年６月２２日（２０１０．６．２２）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月２２日（２０１０．６．２２）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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