蛍光タンパク質
【課題】新規の性質を有した有用な蛍光タンパク質およびその利用方法を提供する。
【解決手段】刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物に由来する蛍光タンパク質であり、該蛍光タンパク質は、強アルカリ性環境下で緑色蛍光を発し、弱アルカリ性〜酸性環境下で前記緑色蛍光よりも長波長の蛍光を発する。
【解決手段】刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物に由来する蛍光タンパク質であり、該蛍光タンパク質は、強アルカリ性環境下で緑色蛍光を発し、弱アルカリ性〜酸性環境下で前記緑色蛍光よりも長波長の蛍光を発する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はｐＨ依存的に蛍光活性が変化する蛍光タンパク質およびその利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光タンパク質は、細胞のイメージング等の生物学的研究において重要な役割を果たしている。特に、オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）に由来する緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＰ）が広く利用されている。
【０００３】
また、異なる性質を有した蛍光タンパク質を取得する目的で、様々な試みが行われている。例えば、オワンクラゲ以外の生物から様々な蛍光タンパク質が取得されている。あるいは、既に取得された蛍光タンパク質にアミノ酸置換等の改変を加えることで、異なる性質を付与しようとしている。
【０００４】
非特許文献１には、オワンクラゲＧＦＰの立体構造情報に基づいて、部位特異的に２０３番目のスレオニンをチロシンに置換する変異を導入することで、野生型に比べて吸収波長および蛍光波長が長波長側にシフトした黄色蛍光を発する変異体（ＹＦＰ）を作製したことが記載されている。非特許文献１には、長波長側へのシフトは、２０３番目の残基と発色団とのπ電子間の相互作用により、発色団のπ電子がより広く非局在化することに起因すると記載されている。この変異体は５１３ｎｍ付近に吸収ピークを有し、５２５ｎｍ付近に蛍光ピークを有する。このように取得されたＹＦＰは、細胞内現象のモニタリングに幅広く利用され、また蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）における蛍光を発する受容体としても利用されている。
【０００５】
非特許文献２には、オワンクラゲＧＦＰに変異を導入し（６５番目のセリンがスレオニン、４８番目のシステインがセリン、１４８番目のヒスチジンがシステインおよび２０３番目のスレオニンがシステインにそれぞれ置換される）、ｐＨによって蛍光波長が変化する変異体を作製したことが記載されている。この変異体は、４００ｎｍ付近および５００ｎｍ付近の吸収スペクトルがｐＨ７付近で変化し、酸性側において４００ｎｍ付近が、アルカリ性側において５００ｎｍ付近の吸収がそれぞれ大きくなる。さらに、このような吸収スペクトルの変化に依存して、酸性側において４６０ｎｍ付近の蛍光強度が、アルカリ性側において５１０ｎｍ付近の蛍光強度がそれぞれ増加する。非特許文献２は、この性質を利用した細胞内のセンサーとしての有用性を示唆している。また、各ｐＨにおけるＧＦＰのＸ線結晶構造解析の結果から、このようなｐＨ依存的な蛍光波長の変化は、ｐＨが高くなると１４７番目のセリンの側鎖の向きが変化することに起因すると記載している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Crystal Structure of the Aequorea victoria Green Fluorescent Protein. Ormo,M. et al.(1996), Science, 273:1392-1395
【非特許文献２】Green Fluorescent Protein Variants as Rationmetric Dual Emission pH Sensors. 1. Structural Characterization and Preliminary Application. Hanson GT., McAnaney TB., Park ES., Rendell MEP., Yarbrough DK., Chu S., Xi L., Boxer SG., Montrose MH., and Remington SJ. Biochemistry 2002, 41, 15477-15488
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、新規の性質を有した有用な蛍光タンパク質およびその利用方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の実施態様によれば、強アルカリ性環境下で緑色蛍光を発し、弱アルカリ性〜酸性環境下で前記緑色蛍光よりも長波長の蛍光を発する蛍光タンパク質が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】野生型ウミサボテンＧＦＰおよびＡ−Ｈ１９８Ｙ変異体について、ｐＨによる蛍光の変化を示す図。
【図２】Ａ−Ｈ１９８Ｙ変異体の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを示す図。
【図３】野生型ウミサボテンＧＦＰおよびＨ１９８Ｔ変異体について、ｐＨによる蛍光の変化を示す図。
【図４】Ｈ１９８Ｔ変異体の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを示す図。
【図５】野生型ウミサボテンＧＦＰおよびＨ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体について、ｐＨによる蛍光の変化を示す図。
【図６】Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを示す図。
【図７】野生型ウミサボテンＧＦＰおよびＡ−Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体について、ｐＨによる蛍光の変化を示す図。
【図８】Ａ−Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを示す図。
【図９】各蛍光タンパク質の常温培養時および３７℃培養時における蛍光を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
＜蛍光タンパク質＞
本発明は、強アルカリ性環境下で緑色蛍光を発し、弱アルカリ性〜酸性環境下で前記緑色蛍光よりも長波長の蛍光を発する蛍光タンパク質に関する。
【００１１】
ここにおいて、強アルカリ性とはｐＨが１０から１１付近以上であることを意味し、弱アルカリ性とはｐＨが９から１０付近以下であることを意味する。
【００１２】
本発明に係る蛍光タンパク質は、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物に由来するものであってよい。特に、カベルヌラリア・オベサ（Ｃａｖｅｒｎｕｌａｒｉａ ｏｂｅｓａ）（和名：ウミサボテン）に由来するものであってよい。本願において「由来する」という表現は、その生物から取得された野生型の蛍光タンパク質だけでなく、当該野生型蛍光タンパク質を改変して得られたものも含むことを意味する。
【００１３】
ウミサボテンはＧＦＰを発現するが、これを改変することで本発明に係る蛍光タンパク質を得ることができる。ウミサボテンＧＦＰは、２２１アミノ酸（配列番号９）からなる緑色蛍光タンパク質である。このＧＦＰはｐＨによって蛍光波長が変化する特徴を有している。すなわち、ｐＨ４では４５８ｎｍ付近の青色蛍光を有し、ｐＨ５以上では５０７ｎｍ付近の緑色蛍光を有する。このウミサボテンＧＦＰに対して、蛍光波長が長波長側にシフトする改変、蛍光強度が増大する改変等を行うことで本発明に係る蛍光タンパク質を得ることができる。このような改変には、野生型ウミサボテンＧＦＰの１９８番目のヒスチジンをチロシンまたはスレオニンに置換する変異が含まれる。さらに、１９８番目のヒスチジンをチロシンまたはスレオニンに置換し且つ１４７番目のセリンをスレオニンに置換する変異が含まれる。
【００１４】
本発明に係る蛍光タンパク質に対して、本発明に係る蛍光タンパク質の性質（強アルカリ性環境下で緑色蛍光を発し、弱アルカリ性〜酸性環境下で前記緑色蛍光よりも長波長の蛍光を発する）をもたらす変異の他に、当該タンパク質の研究等への利用性を高めるような変異を導入することができる。例えば、タンパク質を単量体化する変異または特定の温度で安定化する変異を導入することができる。単量体化する変異とは、野生型蛍光タンパク質が本来の状態で多量体を形成する場合に、そのような多量体の形成を回避して単量体で存在できるようにする変異である。ウミサボテンＧＦＰは、野生型では二量体を形成するが、１５４番目のシステインをセリンに置換（Ｃ１５４Ｓ）することで単量体化させることができる。特定の温度で安定化させる変異とは、その温度下でもタンパク質が望ましい状態を維持するような変異を意味し、特に蛍光タンパク質の場合、例えば、その温度においても蛍光活性を維持する変異を意味する。この変異により、蛍光タンパク質を導入する細胞の培養温度においても、十分な強度の蛍光を発するようになる。ウミサボテンＧＦＰの場合、Ｓ１２９Ｇ、Ｄ１５６Ｇ、Ｋ２０４ＩおよびＮ２０９Ｙの４箇所を置換することで、またはＮ１２６ＹおよびＹ１６６Ｆの２箇所を置換することで、３７℃において蛍光強度を高い状態で維持する変異体を得ることができる。
【００１５】
以下に、本発明に係る蛍光タンパク質の具体的な例を説明する。
１つ目は、野生型のウミサボテンＧＦＰに、１９８番目のヒスチジンをチロシンに置換する変異、単量体化する変異および温度安定化する変異を導入した変異体である。具体的には、野生型ウミサボテンＧＦＰに対して、Ｈ１９８Ｙ、Ｃ１５４Ｓ、Ｓ１２９Ｇ、Ｄ１５６Ｇ、Ｋ２０４ＩおよびＮ２０９Ｙのアミノ酸置換を導入している（配列番号１）。本願では、この変異体を「Ａ−Ｈ１９８Ｙ変異体」と称する。この変異体は、ｐＨ４〜９で５１６ｎｍ付近、ｐＨ１０〜１１で５１２ｎｍ付近の蛍光を示し、野生型ウミサボテンＧＦＰと比べて蛍光波長が長波長側にシフトしている。
【００１６】
２つめは、野生型のウミサボテンＧＦＰに、１９８番目のヒスチジンをスレオニンに置換する変異および単量体化する変異を導入した変異体である。具体的には、野生型ウミサボテンＧＦＰに対して、Ｈ１９８ＴおよびＣ１５４Ｓのアミノ酸置換を導入している（配列番号３）。本願では、この変異体を「Ｈ１９８Ｔ変異体」と称する。この変異体は、ｐＨ４〜９で５１５ｎｍ付近、ｐＨ１０〜１１で５０７ｎｍ付近の蛍光を示し、野生型ウミサボテンＧＦＰと比べて蛍光波長が長波長側にシフトしている。さらに、当該変異体は３７℃で培養した場合にも蛍光を発する。よって哺乳細胞などの培養に適した温度条件でも用いることが可能である。
【００１７】
３つめは、野生型のウミサボテンＧＦＰに、１９８番目のヒスチジンをスレオニンに置換する変異、１４７番目のセリンをスレオニンに置換する変異および単量体化する変異を導入した変異体である。具体的には、野生型ウミサボテンＧＦＰに対して、Ｈ１９８Ｔ、Ｓ１４７ＴおよびＣ１５４Ｓのアミノ酸置換を導入している（配列番号５）。本願では、この変異体を「Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体」と称する。この変異体は、ｐＨ４〜１０で５１５ｎｍ付近、ｐＨ１１で５０８ｎｍ付近の蛍光を示し、野生型ウミサボテンＧＦＰと比べて蛍光波長が長波長側にシフトしており、蛍光強度も高まっている。また、Ｈ１９８Ｔ変異体がｐＨ１０付近で蛍光波長が変化するのに対し、当該変異体はｐＨ１１付近で蛍光波長の変化が生じる。
【００１８】
４つめは、野生型のウミサボテンＧＦＰに、１９８番目のヒスチジンをスレオニンに置換する変異、１４７番目のセリンをスレオニンに置換する変異、単量体化する変異および温度安定化する変異を導入した変異体である。具体的には、野生型ウミサボテンＧＦＰに対して、Ｈ１９８Ｔ、Ｓ１４７Ｔ、Ｃ１５４Ｓ、Ｓ１２９Ｇ、Ｄ１５６Ｇ、Ｋ２０４ＩおよびＮ２０９Ｙのアミノ酸置換を導入している（配列番号７）。本願では、この変異体を「Ａ−Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体」と称する。この変異体は、ｐＨ４〜１０で５１４ｎｍ付近、ｐＨ１１で５０８ｎｍ付近の蛍光を示し、野生型ウミサボテンＧＦＰと比べて蛍光波長が長波長側にシフトしており、蛍光強度も高まっている。また、Ｈ１９８Ｔ変異体がｐＨ１０付近で蛍光波長が変化するのに対し、当該変異体はｐＨ１１付近で蛍光波長の変化が生じる。さらに、当該変異体は３７℃で培養した場合にも蛍光を発する。よって哺乳細胞などの培養に適した温度条件でも用いることが可能である。
【００１９】
本発明に係る蛍光タンパク質により、一般的なＧＦＰよりも長波長側の蛍光色を用いて細胞内現象をイメージングすることが可能となる。特に、野生型ウミサボテンＧＦＰは、酸性側で青色、中性〜アルカリ性側で緑色の蛍光活性を有するため、これらとは異なる蛍光色を利用することができる。また、本発明に係る蛍光タンパク質は、より短波長側の蛍光を発するタンパク質（ＣＦＰ等）を供与体としたＦＲＥＴ系等の受容体としても用いることができる。さらに、本発明に係る蛍光タンパク質は、ｐＨによって蛍光波長が変化する性質を有するため、細胞内等のｐＨの測定が可能となる。特に、野生型ウミサボテンＧＦＰとは蛍光色が変化するｐＨの値が異なるため、本発明に係る蛍光タンパク質と野生型ウミサボテンＧＦＰとを組み合わせて使用することで、より精度の高いｐＨ測定が可能となる。
【００２０】
＜核酸＞
本発明は、本発明に係る蛍光タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸に関する。このような塩基配列は、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物に由来する塩基配列であってよい。ここにおける「由来する」とは、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物が本来有する野生型の塩基配列に変異が生じた塩基配列を含むことを意味する。また、ここにおける変異とは、塩基配列中の特定の塩基の置換、欠失および／または付加等を指す。塩基配列の変異には、コードされるアミノ酸配列に変化を生じさせない変異をも含む。また、核酸とは、特に、ＤＮＡまたはＲＮＡを指す。
【００２１】
本発明に係る核酸の好ましい例は、配列番号２に示される塩基配列を含む核酸（Ａ−Ｈ１９８Ｙ変異体をコード）、配列番号４に示される塩基配列を含む核酸（Ｈ１９８Ｔ変異体をコード）、配列番号６に示される塩基配列を含む核酸（Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体をコード）、または配列番号８に示される塩基配列を含む核酸（Ａ−Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体をコード）である。
【００２２】
また、本発明は、これらの核酸を含むベクターを含む。当該ベクターには、蛍光タンパク質をコードする核酸以外に、発現を調節するための配列またはマーカー遺伝子の配列を含む核酸等を含んでよい。
【００２３】
＜イメージング方法＞
本発明は、本発明に係る蛍光タンパク質または本発明に係る核酸を用いた生物試料のイメージング方法に関する。
【００２４】
イメージング方法とは、観察手段を用いて対象を測定または観察することを意味する。その具体的な例は、本発明に係る蛍光タンパク質と特定のタンパク質とを融合させたタンパク質を細胞に発現させ、当該細胞中の動態を蛍光顕微鏡により観察する方法である。
【００２５】
生物試料は、バクテリアの細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞または哺乳細胞といった細胞であってよい。さらに、生物試料は、組織または個体であってよい。細胞は、固定したものであってよいし、生きた状態のものであってよい。固定は、ホルマリン、メタノール等による一般的な方法で行うことができる。また、生物試料としての個体は、ヒトを除く個体であってよい。生物試料とする細胞、組織および個体に特に限定はなく、従来の取得方法によって得られるものを使用することができる。
【００２６】
生物試料に蛍光タンパク質を導入するために、細胞等へタンパク質を導入するための当該分野で一般的ないずれの方法を使用してもよい。例えば、生物試料が細胞である場合、マイクロインジェクション法によって蛍光タンパク質を直接細胞内へ注入してもよい。あるいは、蛍光タンパク質の遺伝子を含む発現ベクターを細胞に導入し、適切に発現させることで導入してもよい。発現ベクター等による遺伝子の導入は、リン酸カルシウム法、リポフェクションまたはエレクトロポレーション等を使用することができる。
【００２７】
観察手段として、特定の波長の蛍光を検出することが可能な、従来の方法または装置を使用することができる。例えば蛍光顕微鏡を使用することができる。測定または観察とは、顕微鏡を介して目視により確認すること、顕微鏡に設置したカメラを利用して撮像すること等を含む。このような測定および観察は、単一の細胞に対して行うことが可能である。
【００２８】
＜ｐＨ測定法＞
本発明は、本発明に係る蛍光タンパク質または本発明に係る核酸を用いた生物試料内のｐＨを測定する方法に関する。
【００２９】
例えば、本発明に係る蛍光タンパク質を対象に導入し、前記蛍光タンパク質が発する蛍光に基づいて前記対象内部のｐＨを測定する方法に関する。すなわち、本発明に係る方法では、対象の内部に蛍光タンパク質を導入した後、励起光を照射して蛍光タンパク質が発する蛍光を検出し、当該蛍光の波長に基づいてｐＨを特定する。
【００３０】
生物試料としては、イメージング方法と同様な試料を使用することができる。
【００３１】
蛍光の検出は、目視で行うことも可能であるが、特定の波長の蛍光を測定することが可能な、従来の方法または装置を使用して行うことができる。例えば蛍光顕微鏡を使用することができる。励起光を照射して蛍光の色を目視で確認してｐＨを判断してもよいが、検出装置を用いることで、より詳細にｐＨを特定することが可能となる。例えば、蛍光タンパク質が発する２種の蛍光に対応したフィルターセットの蛍光キューブを倒立型蛍光顕微鏡に設置し、それぞれの波長の蛍光画像をＣＣＤカメラによって撮像する。撮像した画像内のｐＨ測定対象領域の蛍光強度を数値化しｐＨを求めることができる。このとき、細胞を種々の条件で刺激し、その後一定時間ごとに撮像することで、系時的に蛍光画像を取得することもできる。また、特定の波長だけの測定ではなく、蛍光スペクトルを測定することもできる。この場合、具体的には、顕微鏡のカメラポートに光ファイバーを接続し分光光度計にて測定対象領域の蛍光スペクトルを測定することで行うことができる。
【実施例】
【００３２】
［実施例１：野生型ウミサボテン蛍光タンパク遺伝子のクローニング］
ウミサボテン（Ｃａｖｅｒｎｕｌａｒｉａ ｏｂｅｓａ）から野生型蛍光タンパク質を抽出および精製し、その部分的なアミノ酸配列を読み取った後、当該配列をもとに遺伝子配列を決定することで蛍光タンパク質遺伝子のクローニングを行った。
【００３３】
蛍光タンパク質の抽出精製およびアミノ酸配列分析
島根近海で採取したウミサボテン１５個体（約２００ｇ）を５００ｍｌのＳＤＳ−グリシンバッファー中ですり潰し、蛍光活性を持つタンパクを含む可溶性タンパクを抽出した。遠心機を用いて残渣を取り除き、蛍光活性を持つタンパク質を含む溶液を抽出した。この抽出溶液に、最終濃度が８０％になるように硫酸アンモニウムを加えて硫安沈殿を行った。具体的には、抽出溶液５００ｍｌに２６２ｇの硫酸アンモニウムを加えた。得られた沈殿を、５０ｍｌのトリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ）に再溶解させた。これに２倍量のエタノールを加え、タンパク質を再度沈殿させた。さらに、この沈殿にトリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ）を加えて再溶解させた。この溶液５０ｍｌを、十分量のトリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ）および透析膜２７／３２（三光純薬株式会社）を用いて透析した。透析後の溶液を、ＤＥＡＥ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を装着したクロマトグラフィーシステムＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いてイオン交換分離精製した。このイオン交換は、低塩濃度トリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ）で十分に平衡化した後、サンプルを添加し、高塩濃度トリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１Ｍ ＮａＣｌ）でＮａＣｌ濃度を０．４Ｍまで上昇させることで行い、その結果、蛍光活性のあるフラクションを分取した。蛍光活性を持つタンパクを含むフラクションの選択は、ＵＶ／ＢＬＵＥ ＣＯＮＶＥＲＴＥＲ ＰＬＡＴＥ（ＵＶＰ）を用いて行った。得られたフラクションを、十分量のトリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ）および透析膜２７／３２（三光純薬株式会社）を用いて透析した。透析後の溶液を、限外ろ過アミコンウルトラ：分画分子量３０ｋＤａ（日本ミリポア株式会社）を用いて濃縮した。次に、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）およびトリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ）を用いてゲルろ過を行った。ゲルろ過後、得られた蛍光活性のあるフラクションをｍｏｎｏＱ ５／５０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）によってイオン交換分離した。このイオン交換は、低塩濃度トリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ）で十分に平衡化した後、サンプルを添加し、高塩濃度トリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１Ｍ ＮａＣｌ）でＮａＣｌ濃度を０．４Ｍまで上昇させることで行い、その結果、蛍光活性のあるフラクションを得た。この活性のあるフラクションを限外ろ過アミコンウルトラ：分画分子量３０ｋＤａ（日本ミリポア株式会社）を用いて濃縮し、その後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）およびトリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ）を用いてゲルろ過分離を行い、蛍光活性のあるフラクションを得た。このサンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離してアミノ酸配列を分析した。分析の結果、２２残基のアミノ酸配列（ＩＰＤ ＹＦＶ ＱＳＦ ＰＥＧ ＦＴＦ ＥＲＴ ＬＳＦ Ｅ：配列番号１７）を決定することができた。
【００３４】
蛍光タンパク質遺伝子のクローニング
蛍光タンパク質遺伝子全長のクローニングのために、３’−ＲＡＣＥ ＰＣＲを下記のとおり実施した。Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄ法（以下、ＲＡＣＥと略す）により、蛍光タンパク質遺伝子をクローニングするための混合プライマーを作成した。アミノ酸配列解析によって得られたアミノ酸配列ＩＰＤ ＹＦＶ ＱＳＦ ＰＥＧ ＦＴＦ ＥＲＴ ＬＳＦ Ｅ（配列番号１７）のうち、コドンの塩基組み合わせが少ないＩＰＤＹＦＶおよびＥＧＦＴＦＥＲのアミノ酸領域に注目した。これらのアミノ酸領域をコードする塩基配列を予測し、３’末端ＲＡＣＥ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下ＰＣＲと略す）に用いる蛍光タンパク質特異的混合プライマー（合計１２種類）を以下のように作成した。ＩＰＤＹＦＶアミノ酸領域に結合するプライマーとして、ＣＯＧＦＰ−ＴＴＴ（５’−ＡＴＨ ＣＣＮ ＧＡＴ ＴＡＴ ＴＴＴ ＧＴ−３’）（配列番号１８）、ＣＯＧＦＰ−ＴＴＣ（５’−ＡＴＨ ＣＣＮ ＧＡＴ ＴＡＴ ＴＴＣ ＧＴ−３’）（配列番号１９）、ＣＯＧＦＰ−ＴＣＴ（５’−ＡＴＨ ＣＣＮ ＧＡＴ ＴＡＣ ＴＴＴ ＧＴ−３’）（配列番号２０）、ＣＯＧＦＰ−ＴＣＣ（５’−ＡＴＨ ＣＣＮ ＧＡＴ ＴＡＣ ＴＴＣ ＧＴ−３’）（配列番号２１）、ＣＯＧＦＰ−ＣＴＴ（５’−ＡＴＨ ＣＣＮ ＧＡＣ ＴＡＴ ＴＴＴ ＧＴ−３’）（配列番号２２）、ＣＯＧＦＰ−ＣＴＣ（５’−ＡＴＨ ＣＣＮ ＧＡＣ ＴＡＴ ＴＴＣ ＧＴ−３’）（配列番号２３）、ＣＯＧＦＰ−ＣＣＴ（５’−ＡＴＨ ＣＣＮ ＧＡＣ ＴＡＣ ＴＴＴ ＧＴ−３’）（配列番号２４）およびＣＯＧＦＰ−ＣＣＣ（５’−ＡＴＨ ＣＣＮ ＧＡＣ ＴＡＣ ＴＴＣ ＧＴ−３’）（配列番号２５）を作成し、ならびに、ＥＧＦＴＦＥＲアミノ酸領域に結合するプライマーとして、ＣＯＧＦＰ−ＡＴＴＡＡ（５’−ＧＡＡ ＧＧＮ ＴＴＴ ＡＣＮ ＴＴＴ ＧＡＡ ＡＧ−３’）（配列番号２６）、ＣＯＧＦＰ−ＡＣＣＡＡ（５’−ＧＡＡ ＧＧＮ ＴＴＣ ＡＣＮ ＴＴＣ ＧＡＡ ＡＧ−３’）（配列番号２７）、ＣＯＧＦＰ−ＡＴＴＧＡ（５’−ＧＡＧ ＧＧＮ ＴＴＴ ＡＣＮ ＴＴＴ ＧＡＧ ＡＧ−３’）（配列番号２８）およびＣＯＧＦＰ−ＡＣＣＧＡ（５’−ＧＡＧ ＧＧＮ ＴＴＣ ＡＣＮ ＴＴＣ ＧＡＧ ＡＧ−３’）（配列番号２９）を作成した。プライマー中のＨおよびＮは、混合塩基を示す。
【００３５】
完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（インビトロジェン）を用いて作成したウミサボテン完全長ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、蛍光タンパク質のアミノ酸配列から予測して作成した１２種類の特異的混合プライマーおよび３’末端特異的プライマーであるＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＣＴ ＧＴＣ ＡＡＣ ＧＡＴ ＡＣＧ ＣＴＡ ＣＧＴ ＡＡＣ Ｇ−３’）（配列番号３０）およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＧＣ ＴＡＣ ＧＴＡ ＡＣＧ ＧＣＡ ＴＧＡ ＣＡＧ ＴＧ−３’）（配列番号３１）を用いて３’−ＲＡＣＥ ＰＣＲを行った。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ ＰｒｉｍｅｒおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒは、完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（インビトロジェン社）に含まれており、これを使用した。３’−ＲＡＣＥ ＰＣＲによって効果的に蛍光タンパク質遺伝子を増幅させるため、一度ＰＣＲによって増幅した遺伝子を鋳型とし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ポリメラーゼＥｘ−Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。
【００３６】
一度目のＰＣＲは、ＩＰＤＹＦＶアミノ酸領域で作成した８種類プライマー（ＣＯＧＦＰ−ＴＴＴ、ＣＯＧＦＰ−ＴＴＣ、ＣＯＧＦＰ−ＴＣＴ、ＣＯＧＦＰ−ＴＣＣ、ＣＯＧＦＰ−ＣＴＴ、ＣＯＧＦＰ−ＣＴＣ、ＣＯＧＦＰ−ＣＣＴ、ＣＯＧＦＰ−ＣＣＣ）のいずれかとＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｐｒｉｍｅｒとの計８つのプライマー対で蛍光タンパク質遺伝子の増幅を行った。１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋添加）を最終濃度等倍、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）を最終濃度各０．２ｍＭ、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を最終濃度０．０５Ｕ／μｌ、８種類のプライマーのうちの１つを最終濃度０．４μＭおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’Ｐｒｉｍｅｒを最終濃度０．４μＭとして２０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、ウミサボテン完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液を０．２μｌ加えた。ＰＣＲ反応条件として、最初に９４℃１分間の熱変性を行い、次に、９４℃３０秒、４５℃３０秒および７２℃２分のサイクルを３０回行い、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応溶液２μｌを１％トリス酢酸緩衝液（以下、ＴＡＥと略す）アガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。８つの反応溶液でわずかに遺伝子増幅が認められたため、このＰＣＲ反応溶液を鋳型としてｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応を実施した。
【００３７】
ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲは、ＥＧＦＴＦＥＲアミノ酸領域で作成した４種類プライマー（ＣＯＧＦＰ−ＡＴＴＡＡ、ＣＯＧＦＰ−ＡＣＣＡＡ、ＣＯＧＦＰ−ＡＴＴＧＡ、ＣＯＧＦＰ−ＡＣＣＧＡ）の何れかとＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒとの計４つのプライマー対で蛍光タンパク質遺伝子の増幅を行った。１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋添加）を最終濃度等倍、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）を最終濃度各０．２ｍＭ、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を最終濃度０．０５Ｕ／μｌ、４種類のプライマーのうちの１つを最終濃度０．４μＭおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒを最終濃度０．４μＭとして１０μｌのｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応溶液を作製し、１度目のＰＣＲ反応溶液を鋳型として０．２μｌを加えた。ＰＣＲ反応条件として、最初に９４℃１分間の熱変性を行い、次に、９４℃３０秒、４５℃３０秒および７２℃２分のサイクルを３０回行い、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応溶液２μｌを１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。
【００３８】
その結果、１度目のＰＣＲ反応として、ＣＯＧＦＰ−ＴＴＣとＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて実施し、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応として、得られたＰＣＲ反応溶液を鋳型としてＣＯＧＦＰ−ＡＣＣＡＡとＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて実施した場合に、顕著な遺伝子増幅を確認できた。この増幅した遺伝子の塩基配列を決定し、ウミサボテン蛍光タンパク質遺伝子のウミサボテン３’末端側の塩基配列（配列番号３２）とした。
【００３９】
蛍光タンパク質の５’末端クローニングのための５’−ＲＡＣＥを下記の通り行った。一連の３’−ＲＡＣＥ解析によって得られたウミサボテン蛍光タンパク質遺伝子の３’末端側の塩基配列をもとに、５’末端クローニングのための５’−ＲＡＣＥに用いるプライマーを作成した。作成した５’末端クローニング用のプライマーは、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ１（５’−ＧＣＴ ＡＴＡ ＧＣＣ ＧＴＣ ＴＣＡ ＴＧＴ ＴＧＣ ＴＣＧ Ｔ−３’）（配列番号３３）、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ２（５’−ＡＧＣ ＣＧＴ ＣＴＣ ＡＴＧ ＴＴＧ ＣＴＣ ＧＴＡ ＧＴＡ Ｇ−３’）（配列番号３４）およびＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ３（５’−ＡＴＧ ＴＴＧ ＣＴＣ ＧＴＡ ＧＴＡ ＧＴＴ ＧＣＣ ＴＴＣ ＣＴＣ ＧＡＣ−３’）（配列番号３５）の３種類である。ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ１、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ２、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ３の順で５’末端に近い位置に結合し、順次ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応のプライマーとして用いる。
【００４０】
完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒを用いて作成したウミサボテン完全長ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、３種類の５’末端クローニング用のプライマーならびに５’末端特異的プライマーであるＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＧＡ ＣＴＧ ＧＡＧ ＣＡＣ ＧＡＧ ＧＡＣ ＡＣＴ ＧＡ−３’）（配列番号３６）およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＧＡ ＣＡＣ ＴＧＡ ＣＡＴ ＧＧＡ ＣＴＧ ＡＡＧ ＧＡＧ ＴＡ−３’）（配列番号３７）を用いて、５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲを行った。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ ＰｒｉｍｅｒおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒは完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（インビトロジェン社）に含まれており、これを使用した。５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲによって効果的に蛍光タンパク質遺伝子を増幅させるため、一度ＰＣＲによって増幅した遺伝子を鋳型にし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行った。ＰＣＲにはポリメラーゼＥｘ−Ｔａｑを用いて、マニュアルに従って実施した。
【００４１】
一度目の５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲとして、３’−ＲＡＣＥで増幅した遺伝子の塩基配列をもとに作成したＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ１とＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて、蛍光タンパク質遺伝子を増幅した。１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋添加）を最終濃度等倍とし、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）を最終濃度各０．２ｍＭとし、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を最終濃度０．０５Ｕ／μｌとし、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ１を最終濃度０．４μＭとし、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｐｒｉｍｅｒを最終濃度０．４μＭとして、１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、ウミサボテン完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液を０．２μｌを加えた。ＰＣＲ反応条件として、最初に９４℃１分間の熱変性を行い、次に、９４℃３０秒、４５℃３０秒および７２℃２分のサイクルを３０回行い、最後に、７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応溶液２μｌを、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。この５’−ＲＡＣＥでわずかに遺伝子増幅が認められたため、このＰＣＲ反応溶液を鋳型としてｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応を実施した。
【００４２】
ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲとして、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ２とＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて蛍光タンパク質ＧＦＰ遺伝子を増幅した。１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋添加）を最終濃度等倍とし、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）を最終濃度各０．２ｍＭとし、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を最終濃度０．０５Ｕ／μｌとし、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ２を最終濃度０．４μＭとし、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒを最終濃度０．４μＭとして、１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、１度目のＰＣＲ反応溶液を鋳型として０．２μｌを加えた。ＰＣＲ反応条件として、最初に９４℃１分間の熱変性を行い、次に、９４℃３０秒、４５℃３０秒および７２℃２分のサイクルを３０回行い、最後に、７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応溶液２μｌを、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。
【００４３】
その結果、１度目のＰＣＲ反応として、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ１とＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて実施し、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応として、得られたＰＣＲ反応溶液を鋳型としてＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ２とＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて実施した場合に、顕著な遺伝子増幅を確認できた。しかし、非特異的な複数の遺伝子の増幅が認められたため、このＰＣＲ反応溶液を鋳型として、異なるプライマー対を用いて再度ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応を実施した。
【００４４】
二度目のｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲとして、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ３とＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて、ＧＦＰ遺伝子を増幅した。１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋添加）を最終濃度等倍とし、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）を最終濃度各０．２ｍＭとし、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を最終濃度０．０５Ｕ／μｌとし、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ３を最終濃度０．４μＭとし、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒを最終濃度０．４μＭとして、２０μｌのｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応溶液を作製し、１度目のｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応溶液を鋳型として０．４μｌを加えた。ＰＣＲ反応条件として、最初に９４℃１分間の熱変性を行い、次に、９４℃３０秒、４５℃３０秒および７２℃２分のサイクルを３０回行い、最後に、７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応溶液２μｌを、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。その結果、一連のｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応で顕著な遺伝子増幅を確認できた。この増幅した遺伝子の塩基配列を決定し、ウミサボテン蛍光タンパク質遺伝子の５’末端側の塩基配列（配列番号３８）とした。
【００４５】
次に、蛍光タンパク質遺伝子の完全長の増幅を下記のとおりに行った。上述した３’−ＲＡＣＥおよび５’−ＲＡＣＥ解析によって得られたウミサボテン由来の蛍光タンパク質遺伝子の５’末端側の塩基配列をもとに、完全長蛍光タンパク質遺伝子クローニングのための３’−ＲＡＣＥに用いるプライマーを作成した。作成した完全長ＧＦＰ遺伝子クローニング用のプライマーは、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ３（５’−ＡＴＴ ＴＡＧ ＧＴＧ ＧＣＴ ＧＣＧ ＴＡＣ ＡＧ−３’）（配列番号３９）、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ４（５’−ＡＴＴ ＴＡＧ ＧＴＧ ＧＣＴ ＧＣＧ ＴＡＣ ＡＧＴ ＴＡＡ ＣＡＣ−３’）（配列番号４０）の２種類である。ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ３、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ４の順で３’末端に近い位置に結合する。ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ４をｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応のプライマーとして用いる。
【００４６】
完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒを用いて作成したウミサボテン完全長ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、２種類の完全長蛍光タンパク質遺伝子クローニング用のプライマーならびに３’末端特異的プライマーであるＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＣＴ ＧＴＣ ＡＡＣ ＧＡＴ ＡＣＧ ＣＴＡ ＣＧＴ ＡＡＣ Ｇ−３’）（配列番号３０）およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＧＣ ＴＡＣ ＧＴＡ ＡＣＧ ＧＣＡ ＴＧＡ ＣＡＧ ＴＧ−３’）（配列番号３１）を用いて、３’−ＲＡＣＥ ＰＣＲを行った。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ ＰｒｉｍｅｒおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒは、完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（インビトロジェン社）に含まれているので、これを使用した。３’−ＲＡＣＥ ＰＣＲによって効果的に完全長蛍光タンパク質遺伝子を増幅させるため、一度ＰＣＲによって増幅した遺伝子を鋳型にし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行った。ＰＣＲにはポリメラーゼＥｘ−Ｔａｑを用いてマニュアルに従って実施した。
【００４７】
一度目のＰＣＲとして、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ３とＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて蛍光タンパク質遺伝子を増幅した。１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋添加）を最終濃度等倍とし、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）を最終濃度各０．２ｍＭとし、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を最終濃度０．０５Ｕ／μｌとし、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ３を最終濃度０．４μＭとし、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｐｒｉｍｅｒを最終濃度０．４μＭとして、１０μｌのｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応溶液を作製し、ウミサボテン完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液を０．２μｌを加えた。ＰＣＲ反応条件として、最初に９４℃１分間の熱変性を行い、次に、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃１分のサイクルを３０回行い、最後に、７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応溶液２μｌを１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。一度目の５’−ＲＡＣＥでわずかに遺伝子増幅が認められたため、このＰＣＲ反応溶液を鋳型としてｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応を実施した。
【００４８】
ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲとしてＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ４とＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて、蛍光タンパク質遺伝子を増幅した。１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋添加）を最終濃度等倍とし、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）を最終濃度各０．２ｍＭとし、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を最終濃度０．０５Ｕ／μｌとし、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ４を最終濃度０．４μＭとし、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒを最終濃度０．４μＭとして、１０μｌのｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応溶液を作製し、１度目のＰＣＲ反応溶液を鋳型として０．２μｌを加えた。ＰＣＲ反応条件として、最初に９４℃１分間の熱変性を行い、次に、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃１分のサイクルを３０回行い、最後に、７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応溶液２μｌを１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。その結果、顕著な遺伝子増幅を確認できた。この増幅した遺伝子の塩基配列を決定して、完全長ウミサボテン蛍光タンパク質遺伝子の塩基配列（配列番号４１）とした。
【００４９】
得られた完全長ウミサボテン蛍光タンパク質の塩基配列から、配列情報解析ソフトウェアＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏを用いてウミサボテンＧＦＰ遺伝子のオープンリーディングフレームの塩基配列を予想した（配列番号１０）。さらに、このオープンリーディングフレームを翻訳してウミサボテン蛍光タンパク質のアミノ酸配列を得た（配列番号９）。このアミノ酸配列は、ウミサボテンから精製し、アミノ酸分析によって得られた２２残基の配列（配列番号１７）を完全一致の状態で含むことから、ウミサボテンに由来する野生型蛍光タンパク質遺伝子であると決定した。この遺伝子をｐＲＳＥＴベクター（インビトロジェン）に組み込み、大腸菌にトランスフォーメーションし、ＵＶ／ＢＬＵＥ ＣＯＮＶＥＲＴＥＲ ＰＬＡＴＥ（ＵＶＰ）を用いて観察したところ顕著な蛍光活性が示された。
【００５０】
［実施例２：Ｃ１５４Ｓ変異（単量体化）の導入］
実施例１にて得られた野生型ウミサボテンＧＦＰの遺伝子に対して、Ｃ１５４Ｓ変異を導入した。この変異を導入することで、野生型ウミサボテンＧＦＰを単量体化することができる。
【００５１】
以下の方法によって、野生型蛍光タンパク質のアミノ酸配列の１５４番目のシステインをセリンに置換した。変異の導入には、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いた。ｐＲＳＥＴ−Ａ（インビトロジェン社）にウミサボテン蛍光タンパク質遺伝子をクローニングしたプラスミドを鋳型とし、Ｐｉｒｍｅｒ１（ＣＡＡＴＧＴＡＴＧＴＡＴＣＧＧＡＣＧＡＣＡＣＴＴＴＧＧ）（配列番号４２）およびＰｒｉｍｅｒ２（ＣＣＡＡＡＧＴＧＴＣＧＴＣＣＧＡＴＡＣＡＴＡＣＡＴＴＧ）（配列番号４３）を使用して、キットに添付されているマニュアルに準じてＰＣＲ反応を行った。反応後、３７度にてＤｐｎＩで処理し、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株にトランスフォームした。
【００５２】
トランスフォームされた菌を培養してベクターを取り出し、蛍光タンパク質遺伝子の塩基配列をシーケンサーによって読み取った。その結果、配列番号１４の配列が得られ、狙い通りに変異が導入できたことが確認できた。この遺伝子から、１５４番目がセリンに置換された蛍光タンパク質（配列番号１１）が発現する。
【００５３】
また、トランスフォーム後の大腸菌を、２８度にて培養した後、溶菌してライセートを作製した。これにＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを加え、熱を加えずにサンプルを調製して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果、野生型蛍光タンパク質のレーンで出現する２量体のバンドが、変異体蛍光タンパク質のレーンで消失していた。このことから、蛍光タンパク質が単量体化されたことが確認された。
【００５４】
［実施例３：温度安定化変異の導入］
温度安定化変異の導入について以下に述べる。具体的には、Ｓ１２９Ｇ、Ｄ１５６Ｇ、Ｋ２０４ＩおよびＮ２０９Ｙの４箇所が変異した変異体を得ることができる。これらの変異の導入よって、３７℃において発色団形成を安定化させることができる。
【００５５】
実施例２で得られた単量体化した変異体蛍光タンパク質に対してランダムに変異を導入し、３７℃において発色団形成が安定化する変異体をスクリーニングした。
【００５６】
変異の導入は、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ ＩＩ ＥＺＣｌｏｎｅ Ｄｏｍａｉｎ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いた。ｐＲＳＥＴ−Ａ（インビトロジェン社）に単量体化変異体（１５４番目のシステインがセリンに置換）の遺伝子がクローニングされたプラスミドを鋳型とし、Ｐｉｒｍｅｒ１（ＡＴＧＡＧＴＡＴＴＣＣＡＧＡＧＡＡＴＴＣＧＧＧＣＴＴＡＡＣＡＧ）（配列番号４４）およびＰｒｉｍｅｒ２（ＴＣＡＴＧＧＴＴＴＡＧＣＴＡＴＧＧＣＣＧＴＣＴＣＡＴＧ）（配列番号４５）を加えて、キットに添付されているマニュアルに準じてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応後、１％アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、目的とするＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて精製した。精製後、マニュアルに準じてＰＣＲ反応を行い、３７℃にてＤｐｎＩで処理した後に、エタノール沈殿を行った。沈殿後、少量の蒸留水にＤＮＡを溶かして、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ社）を用いてエレクトロポレーション法にてＪＭ１０９（ＤＥ３）にトランスフォームした。トランスフォーム後の大腸菌を、２５ｃｍ四方のＬＢ（５０ｎｇ／ｍｌのアンピシリンを添加済み）プレートに播種して、３７℃で培養してコロニーを形成させた。コロニー形成後、ＵＶ／ＢＬＵＥ ＣＯＮＶＥＲＴＥＲ ＰＬＡＴＥ（ＵＶＰ）を使用して、野生型蛍光タンパク質を発現するコロニーと比べて、強い蛍光を発するコロニー（それぞれ変異体１および変異体２と名付ける）を２つ選択し、再度培養した。その後、それらが保持するプラスミドの塩基配列を決定した。それぞれの配列は配列番号１５および配列番号１６に示される。
【００５７】
さらに、これらの塩基配列をアミノ酸配列に変換し（変異体１は配列番号１２、変異体２は配列番号１３）、野生型のアミノ酸配列と比較した。変異体１は、１２６番目のアスパラギンがチロシンに置換され、１５４番目のシステインがセリンに置換され、１６６番目のチロシンがフェニルアラニンに置換されていることがわかった。変異体２は、１２９番目のセリンがグリシンに置換され、１５４番目のシステインがセリンに置換され、１５６番目のアスパラギン酸がグリシンに置換され、２０４番目のリジンがイソロイシンに置換され、２０９番目のアスパラギンがチロシンに置換されていることがわかった。
【００５８】
また、変異体１および２の３７℃における発色団形成の安定性を、野生型蛍光タンパク質および単量体化蛍光タンパク質と比較した。ｐＲＳＥＴ−Ａ（インビトロジェン社）に、野生型遺伝子、実施例２で作製した単量体化変異体の遺伝子、変異体１の遺伝子および変異体２の遺伝子をそれぞれクローニングし、それぞれＪＭ１０９（ＤＥ３）株にトランスフォームした。これらの株をプレートに塗布し、３７℃で培養して蛍光タンパク質を発現させた。その状態をＵＶ／ＢＬＵＥ ＣＯＮＶＥＲＴＥＲ ＰＬＡＴＥ（ＵＶＰ）で観察して、画像を撮影した。その結果、野生型および単量体化変異体と比較して、変異体１および２は非常に強い蛍光を発していた。特に、変異体１に比べて、変異体２のほうが強い蛍光を発していた。
【００５９】
次に、ゲルろ過クロマトグラフィーにて、蛍光タンパク質の会合状態を調べた。野生型蛍光タンパク質を発現する大腸菌および変異体２を発現する大腸菌から、それぞれ蛍光タンパク質を精製し解析した。野生型では６６ｋＤａｌ付近にピークが得られ、一方、変異体２では３７ｋＤａｌ付近でピークが得られた。これらの結果から、野生型蛍光タンパク質が２量体を形成しているのに対し、変異体２の蛍光タンパク質が単量体を形成していることが示唆された。
【００６０】
［実施例４：Ｈ１９８Ｙ変異の導入］
実施例３で得られた遺伝子に対し、以下に述べるＨ１９８Ｙのアミノ酸置換の変異を導入し、Ａ−Ｈ１９８Ｙ変異体の遺伝子を得た。この変異は、Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて導入した。
【００６１】
ｐＲＳＥＴ−Ｂ（インビトロジェン社）に、変異体２（１２９番目のセリンがグリシンに置換、１５４番目のシステインがセリンに置換、１５６番目のアスパラギン酸がグリシンに置換、２０４番目のリジンがイソロイシンに置換、２０９番目のアスパラギンがチロシンに置換）の遺伝子を挿入したプラスミドを鋳型として、Ｈ１９８Ｙプライマー１（ＣＡＴＴＡＴＧＴＴＣＡＴＴＡＴＣＧＣＣＴＣＧＡＡＡＡＧ、配列番号４６）およびＨ１９８Ｙプライマー２（ＣＴＴＴＴＣＧＡＧＧＣＧＡＴＡＡＴＧＡＡＣＡＴＡＡＴＧ、配列番号４７）を使用して、キットに添付されているマニュアルに準じてＰＣＲ反応を行った。反応後、反応産物にＤｐｎＩを加えて３７度で処理した後に、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株に形質転換した。形質転換された大腸菌を増殖させてプラスミドＤＮＡを精製し、目的の変異が導入された遺伝子が作製されたことを確認した。
【００６２】
［実施例５：Ｈ１９８Ｔ変異の導入］
実施例２で得られた遺伝子に対し、以下に述べるＨ１９８Ｔのアミノ酸置換の変異を導入し、Ｈ１９８Ｔ変異体の遺伝子を得た。この変異は、Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて導入した。
【００６３】
ｐＲＳＥＴ−Ｂ（インビトロジェン社）に、単量体化変異体（１５４番目のシステインがセリンに置換）の遺伝子を挿入したプラスミドを鋳型として、Ｈ１９８Ｔプライマー１（ＣＡＴＴＡＴＧＴＴＣＡＴＡＣＣＣＧＣＣＴＣＧＡＡＡＡＧ、配列番号４８）およびＨ１９８Ｔプライマー２（ＣＴＴＴＴＣＧＡＧＧＣＧＧＧＴＡＴＧＡＡＣＡＴＡＡＴＧ、配列番号４９）を使用して、キットに添付されているマニュアルに準じてＰＣＲ反応を行った。反応後、反応産物にＤｐｎＩを加えて３７度で処理した後に、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株に形質転換した。形質転換された大腸菌を増殖させてプラスミドＤＮＡを精製し、目的の変異が導入された遺伝子が作製されたことを確認した。
【００６４】
［実施例６：Ｓ１４７Ｔ変異の導入］
実施例５で得られた遺伝子に対し、以下に述べるＳ１４７Ｔのアミノ酸置換の変異を導入し、Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体の遺伝子を得た。また、実施例３で得られた遺伝子に対し実施例５に記載の通りにＨ１９８Ｔ変異を導入した後、さらに以下に述べるＳ１４７Ｔのアミノ酸置換の変異を導入することで、Ａ−Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体の遺伝子を得た。これらの変異は、Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて導入した。
【００６５】
ｐＲＳＥＴ−Ｂ（インビトロジェン社）に、Ｈ１９８Ｔ変異体（１９８番目のヒスチジンがスレオニンに置換および１５４番目のシステインがセリンに置換）の遺伝子を挿入したプラスミド、または単量体化および温度安定化され、さらにＨ１９８Ｔ変異が導入された変異体（１９８番目のヒスチジンがスレオニン、１５４番目のシステインがセリンに置換、１２９番目のセリンがグリシンに置換、１５６番目のアスパラギン酸がグリシンに置換、２０４番目のリジンがイソロイシンに置換および２０９番目のアスパラギンがチロシンに置換）の遺伝子を挿入したプラスミドを鋳型として、Ｓ１４７Ｔプライマー１（ＣＣＡＡＡＣＴＡＧＡＡＣＣＧＡＣＣＡＧＴＧＡＧＴＣＡＡＴＧ、配列番号５０）およびＳ１４７Tプライマー２（ＣＡＴＴＧＡＣＴＣＡＣＴＧＧＴＣＧＧＴＴＣＴＡＧＴＴＴＧＧ、配列番号５１）を使用して、キットに添付されているマニュアルに準じてＰＣＲ反応を行った。反応後、反応産物にＤｐｎＩを加えて３７度で処理した後に、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株に形質転換した。形質転換された大腸菌を増殖させてプラスミドＤＮＡを精製し、目的の変異が導入された遺伝子が作製されたことを確認した。
【００６６】
［実施例７：ｐＨによる蛍光の変化並びに蛍光および吸収スペクトルの測定］
Ａ−Ｈ１９８Ｙ変異体、Ｈ１９８Ｔ変異体、Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体およびＡ−Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体の４種の変異型蛍光タンパク質について、ｐＨによる蛍光の変化並びに蛍光スペクトルおよび吸収スペクトルをそれぞれ測定した。
【００６７】
実施例４から６により取得した、４種の変異体の内いずれかの遺伝子を有するプラスミドを、大腸菌に導入し、３７℃で培養して各種変異型蛍光タンパク質を発現させ、溶菌後、Ｎｉ−ＮＴＡ（Ｑｕｉａｇｅｎ社）カラムクロマトグラフィーにより蛍光タンパク質をそれぞれ精製した。
【００６８】
精製された変異体タンパク質を異なるｐＨの溶液に添加し、ＵＶハンディライト（３６５ｎｍ）を用いて蛍光色を確認した。また、分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ Ｕ−３０１０）および蛍光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ Ｆ−２５００）を用いて、吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを測定した。
【００６９】
以下に、それぞれの変異体の測定結果を説明する。
（Ａ−Ｈ１９８Ｙ変異体）
図１にｐＨによる蛍光の変化の結果をモノクロ画像として示し、図２に蛍光スペクトルおよび吸収スペクトルを示す。
【００７０】
図１中、暗視野画像はＵＶハンディライトを照射したときに発せられる蛍光の画像であり、明視野画像は通常の照明下で確認される画像である。それぞれの上段のチューブには野生型ウミサボテンＧＦＰが、下段のチューブにはＡ−Ｈ１９８Ｙ変異体が、各ｐＨの緩衝液とともに添加されている。なお、後述する図３、５および７についても同様に、上段に野生型が、下段に変異型がそれぞれ配置される。
【００７１】
図１の元となるカラー画像によれば、野生型ウミサボテンＧＦＰでは、ｐＨ４の環境下で青色の蛍光を発し、ｐＨ６以上の環境下で緑色の蛍光を発し、ｐＨ５において中間的な蛍光を発した。また、明視野において、ｐＨ４および５の環境下で緩衝液は透明であり、ｐＨ６の環境下で黄緑色を示し、ｐＨ７以上の環境下で緑色を示した。
【００７２】
これに対し、Ａ−Ｈ１９８Ｙ変異体では、ｐＨ５から１０の環境下で黄色の蛍光を発し、ｐＨ１１の環境下で黄緑色の蛍光を発した。また、明視野において、ｐＨ４から１０の環境下で緩衝液は赤みがかった黄色を示し、ｐＨ１１の環境下で黄色を示した。
【００７３】
図２には、Ａ−Ｈ１９８Ｙ変異体の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトル（４７０ｎｍ励起）が示される。吸収スペクトルでは、全体として４００ｎｍ付近および５００ｎｍ付近の２つのピークを示した。特に、ｐＨ４から５で４０３ｎｍ付近のピークが高く、ｐＨ６から１０で５０９ｎｍ付近のピークが高く、ｐＨ１１では５００ｎｍ付近のピークが高かった。蛍光スペクトルでは、ｐＨ４から９で５１７ｎｍ付近にピークを示し、ｐＨ１０および１１で５１０ｎｍ付近にピークを示した。蛍光強度は、ｐＨの値が大きいほど高い傾向を示した。それぞれのスペクトルについて、ｐＨごとに最大強度を示した波長を以下の表１にまとめる。
【００７４】
【表１】
【００７５】
（Ｈ１９８Ｔ変異体）
図３にｐＨによる蛍光の変化の結果をモノクロ画像として示し、図４に蛍光スペクトルおよび吸収スペクトルを示す。
【００７６】
図３の元となるカラー画像によれば、Ｈ１９８Ｔ変異体は、ｐＨ４から９の環境下で黄色の蛍光を発し、ｐＨ１０および１１の環境下で黄緑色の蛍光を発した。また、明視野において、ｐＨ４から９の環境下で緩衝液は赤みがかった黄色を示し、ｐＨ１０および１１の環境下で黄緑色を示した。
【００７７】
図４には、Ｈ１９８Ｔ変異体の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトル（４９０ｎｍ励起）が示される。吸収スペクトルは、ｐＨ４から１０で５０７ｎｍ付近のピークを、ｐＨ１１で４９８ｎｍ付近のピークを示した。蛍光スペクトルでは、ｐＨ４から９で５１５ｎｍ付近にピークを示し、ｐＨ１０および１１で５０７ｎｍ付近にピークを示した。蛍光強度は、ｐＨの値が大きいほど高い傾向を示した。それぞれのスペクトルについて、ｐＨごとに最大強度を示した波長を以下の表２にまとめる。
【００７８】
【表２】
【００７９】
（Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体）
図５にｐＨによる蛍光の変化の結果をモノクロ画像として示し、図６に蛍光スペクトルおよび吸収スペクトルを示す。
【００８０】
図５の元となるカラー画像によれば、Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体では、ｐＨ４から９の環境下で黄色の蛍光を発し、ｐH１０およびｐＨ１１の環境下で黄緑色の蛍光を発した。また、明視野において、ｐＨ４から９の環境下で緩衝液はオレンジよりの黄色を示し、ｐＨ１０の環境下で黄色、ｐＨ１１の環境下で黄緑色を示した。
【００８１】
図６には、Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトル（４９０ｎｍ励起）が示される。吸収スペクトルでは、ｐＨ４から１０で５０７ｎｍ付近のピークを示し、ｐＨ１１で４９８ｎｍ付近のピークを示した。蛍光スペクトルでは、ｐＨ４から１０で５１５ｎｍ付近にピークを示し、ｐＨ１１で５０８ｎｍ付近にピークを示した。蛍光強度は、ｐＨの値が大きいほど高い傾向を示した。また、ｐＨ７における蛍光強度を同濃度の野生型ウミサボテンＧＦＰと比較した場合、Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体の方が約１．６倍高かった。それぞれのスペクトルについて、ｐＨごとに最大強度を示した波長を以下の表３にまとめる。
【００８２】
【表３】
【００８３】
（Ａ−Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体）
図７にｐＨによる蛍光の変化の結果をモノクロ画像として示し、図８に蛍光スペクトルおよび吸収スペクトルを示す。
【００８４】
図７の元となるカラー画像によれば、Ａ−Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体では、ｐＨ４から１０の環境下で黄色の蛍光を発し、ｐＨ１１の環境下で黄緑色の蛍光を発した。また、明視野において、ｐＨ４から１０の環境下で緩衝液はオレンジよりの黄色を示し、ｐＨ１１の環境下で黄緑色を示した。
【００８５】
図８には、Ａ−Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトル（４９０ｎｍ励起）が示される。吸収スペクトルでは、ｐＨ４から１０で５０７ｎｍ付近のピークを示し、ｐＨ１１で４９８ｎｍ付近のピークを示した。蛍光スペクトルでは、ｐＨ４から１０で５１４ｎｍ付近にピークを示し、ｐＨ１１で５０８ｎｍ付近にピークを示した。蛍光強度は、ｐＨの値が大きいほど高い傾向を示した。また、ｐＨ７における蛍光強度を同濃度の野生型ウミサボテンＧＦＰと比較した場合、Ａ−Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体の方が約１．８倍高かった。それぞれのスペクトルについて、ｐＨごとに最大強度を示した波長を以下の表４にまとめる。
【００８６】
【表４】
【００８７】
［実施例８：蛍光強度の比較］
４種の変異型蛍光タンパク質の蛍光強度を確認した。
【００８８】
１：野生型ウミサボテンＧＦＰ、２：Ｃ１５４Ｓ変異体（単量体化のみを行った変異体）、３：Ｈ１９８Ｙ変異体、４：Ｈ１９８Ｗ変異体、５：Ａ−Ｈ１９８Ｙ変異体、６：Ｈ１９８Ｔ変異体、７：Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体および８：Ａ−Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体について、それぞれの遺伝子を形質転換させた８つの大腸菌を２つのプレートに塗布し、一方を常温で培養し、他方を３７℃にて培養して、各蛍光タンパク質を発現させた。各プレートをＵＶ／ＢＬＵＥ ＣＯＮＶＥＲＴＥＲ ＰＬＡＴＥ（ＵＶＰ）で観察して、画像を撮影した。図９は、それらをモノクロで表した画像である。
【００８９】
３：Ｈ１９８Ｙ変異体および４：Ｈ１９８Ｗ変異体は、先行技術に倣って作製した。非特許文献１によれば、野生型オワンクラゲＧＦＰの２０３番目のスレオニンをチロシンに置換することでＹＦＰを作製している。この２０３番目のアミノ酸に立体構造上対応するウミサボテンＧＦＰの１９８番目のアミノ酸について、先行技術と同様にチロシンまたはトリプトファンに置換した。
【００９０】
図９の常温培養の結果によると、１：野生型および２：Ｃ１５４Ｓ変異体は緑色の蛍光を示した。特に、２：Ｃ１５４Ｓ変異体の方が強い蛍光を示した。３：Ｈ１９８Ｙ変異体および４：Ｈ１９８Ｗ変異体は蛍光を示さなかった。本発明に係る５から８の変異体は黄色から黄緑色の蛍光を示した。特に、６から８の変異体は蛍光が強かった。
【００９１】
３７℃培養の結果によると、１：野生型および２：Ｃ１５４Ｓ変異体は常温培養の場合より弱いものの同色の蛍光を示した。また、３：Ｈ１９８Ｙ変異体、４：Ｈ１９８Ｗ変異体、５：Ａ−Ｈ１９８Ｙ変異体および７：Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体は蛍光を示さなかった。これらに対し、６：Ｈ１９８Ｔ変異体および８：Ａ−Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体は常温培養の場合よりも弱いものの同色の蛍光を示した。
【技術分野】
【０００１】
本発明はｐＨ依存的に蛍光活性が変化する蛍光タンパク質およびその利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光タンパク質は、細胞のイメージング等の生物学的研究において重要な役割を果たしている。特に、オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）に由来する緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＰ）が広く利用されている。
【０００３】
また、異なる性質を有した蛍光タンパク質を取得する目的で、様々な試みが行われている。例えば、オワンクラゲ以外の生物から様々な蛍光タンパク質が取得されている。あるいは、既に取得された蛍光タンパク質にアミノ酸置換等の改変を加えることで、異なる性質を付与しようとしている。
【０００４】
非特許文献１には、オワンクラゲＧＦＰの立体構造情報に基づいて、部位特異的に２０３番目のスレオニンをチロシンに置換する変異を導入することで、野生型に比べて吸収波長および蛍光波長が長波長側にシフトした黄色蛍光を発する変異体（ＹＦＰ）を作製したことが記載されている。非特許文献１には、長波長側へのシフトは、２０３番目の残基と発色団とのπ電子間の相互作用により、発色団のπ電子がより広く非局在化することに起因すると記載されている。この変異体は５１３ｎｍ付近に吸収ピークを有し、５２５ｎｍ付近に蛍光ピークを有する。このように取得されたＹＦＰは、細胞内現象のモニタリングに幅広く利用され、また蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）における蛍光を発する受容体としても利用されている。
【０００５】
非特許文献２には、オワンクラゲＧＦＰに変異を導入し（６５番目のセリンがスレオニン、４８番目のシステインがセリン、１４８番目のヒスチジンがシステインおよび２０３番目のスレオニンがシステインにそれぞれ置換される）、ｐＨによって蛍光波長が変化する変異体を作製したことが記載されている。この変異体は、４００ｎｍ付近および５００ｎｍ付近の吸収スペクトルがｐＨ７付近で変化し、酸性側において４００ｎｍ付近が、アルカリ性側において５００ｎｍ付近の吸収がそれぞれ大きくなる。さらに、このような吸収スペクトルの変化に依存して、酸性側において４６０ｎｍ付近の蛍光強度が、アルカリ性側において５１０ｎｍ付近の蛍光強度がそれぞれ増加する。非特許文献２は、この性質を利用した細胞内のセンサーとしての有用性を示唆している。また、各ｐＨにおけるＧＦＰのＸ線結晶構造解析の結果から、このようなｐＨ依存的な蛍光波長の変化は、ｐＨが高くなると１４７番目のセリンの側鎖の向きが変化することに起因すると記載している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Crystal Structure of the Aequorea victoria Green Fluorescent Protein. Ormo,M. et al.(1996), Science, 273:1392-1395
【非特許文献２】Green Fluorescent Protein Variants as Rationmetric Dual Emission pH Sensors. 1. Structural Characterization and Preliminary Application. Hanson GT., McAnaney TB., Park ES., Rendell MEP., Yarbrough DK., Chu S., Xi L., Boxer SG., Montrose MH., and Remington SJ. Biochemistry 2002, 41, 15477-15488
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、新規の性質を有した有用な蛍光タンパク質およびその利用方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の実施態様によれば、強アルカリ性環境下で緑色蛍光を発し、弱アルカリ性〜酸性環境下で前記緑色蛍光よりも長波長の蛍光を発する蛍光タンパク質が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】野生型ウミサボテンＧＦＰおよびＡ−Ｈ１９８Ｙ変異体について、ｐＨによる蛍光の変化を示す図。
【図２】Ａ−Ｈ１９８Ｙ変異体の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを示す図。
【図３】野生型ウミサボテンＧＦＰおよびＨ１９８Ｔ変異体について、ｐＨによる蛍光の変化を示す図。
【図４】Ｈ１９８Ｔ変異体の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを示す図。
【図５】野生型ウミサボテンＧＦＰおよびＨ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体について、ｐＨによる蛍光の変化を示す図。
【図６】Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを示す図。
【図７】野生型ウミサボテンＧＦＰおよびＡ−Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体について、ｐＨによる蛍光の変化を示す図。
【図８】Ａ−Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを示す図。
【図９】各蛍光タンパク質の常温培養時および３７℃培養時における蛍光を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
＜蛍光タンパク質＞
本発明は、強アルカリ性環境下で緑色蛍光を発し、弱アルカリ性〜酸性環境下で前記緑色蛍光よりも長波長の蛍光を発する蛍光タンパク質に関する。
【００１１】
ここにおいて、強アルカリ性とはｐＨが１０から１１付近以上であることを意味し、弱アルカリ性とはｐＨが９から１０付近以下であることを意味する。
【００１２】
本発明に係る蛍光タンパク質は、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物に由来するものであってよい。特に、カベルヌラリア・オベサ（Ｃａｖｅｒｎｕｌａｒｉａ ｏｂｅｓａ）（和名：ウミサボテン）に由来するものであってよい。本願において「由来する」という表現は、その生物から取得された野生型の蛍光タンパク質だけでなく、当該野生型蛍光タンパク質を改変して得られたものも含むことを意味する。
【００１３】
ウミサボテンはＧＦＰを発現するが、これを改変することで本発明に係る蛍光タンパク質を得ることができる。ウミサボテンＧＦＰは、２２１アミノ酸（配列番号９）からなる緑色蛍光タンパク質である。このＧＦＰはｐＨによって蛍光波長が変化する特徴を有している。すなわち、ｐＨ４では４５８ｎｍ付近の青色蛍光を有し、ｐＨ５以上では５０７ｎｍ付近の緑色蛍光を有する。このウミサボテンＧＦＰに対して、蛍光波長が長波長側にシフトする改変、蛍光強度が増大する改変等を行うことで本発明に係る蛍光タンパク質を得ることができる。このような改変には、野生型ウミサボテンＧＦＰの１９８番目のヒスチジンをチロシンまたはスレオニンに置換する変異が含まれる。さらに、１９８番目のヒスチジンをチロシンまたはスレオニンに置換し且つ１４７番目のセリンをスレオニンに置換する変異が含まれる。
【００１４】
本発明に係る蛍光タンパク質に対して、本発明に係る蛍光タンパク質の性質（強アルカリ性環境下で緑色蛍光を発し、弱アルカリ性〜酸性環境下で前記緑色蛍光よりも長波長の蛍光を発する）をもたらす変異の他に、当該タンパク質の研究等への利用性を高めるような変異を導入することができる。例えば、タンパク質を単量体化する変異または特定の温度で安定化する変異を導入することができる。単量体化する変異とは、野生型蛍光タンパク質が本来の状態で多量体を形成する場合に、そのような多量体の形成を回避して単量体で存在できるようにする変異である。ウミサボテンＧＦＰは、野生型では二量体を形成するが、１５４番目のシステインをセリンに置換（Ｃ１５４Ｓ）することで単量体化させることができる。特定の温度で安定化させる変異とは、その温度下でもタンパク質が望ましい状態を維持するような変異を意味し、特に蛍光タンパク質の場合、例えば、その温度においても蛍光活性を維持する変異を意味する。この変異により、蛍光タンパク質を導入する細胞の培養温度においても、十分な強度の蛍光を発するようになる。ウミサボテンＧＦＰの場合、Ｓ１２９Ｇ、Ｄ１５６Ｇ、Ｋ２０４ＩおよびＮ２０９Ｙの４箇所を置換することで、またはＮ１２６ＹおよびＹ１６６Ｆの２箇所を置換することで、３７℃において蛍光強度を高い状態で維持する変異体を得ることができる。
【００１５】
以下に、本発明に係る蛍光タンパク質の具体的な例を説明する。
１つ目は、野生型のウミサボテンＧＦＰに、１９８番目のヒスチジンをチロシンに置換する変異、単量体化する変異および温度安定化する変異を導入した変異体である。具体的には、野生型ウミサボテンＧＦＰに対して、Ｈ１９８Ｙ、Ｃ１５４Ｓ、Ｓ１２９Ｇ、Ｄ１５６Ｇ、Ｋ２０４ＩおよびＮ２０９Ｙのアミノ酸置換を導入している（配列番号１）。本願では、この変異体を「Ａ−Ｈ１９８Ｙ変異体」と称する。この変異体は、ｐＨ４〜９で５１６ｎｍ付近、ｐＨ１０〜１１で５１２ｎｍ付近の蛍光を示し、野生型ウミサボテンＧＦＰと比べて蛍光波長が長波長側にシフトしている。
【００１６】
２つめは、野生型のウミサボテンＧＦＰに、１９８番目のヒスチジンをスレオニンに置換する変異および単量体化する変異を導入した変異体である。具体的には、野生型ウミサボテンＧＦＰに対して、Ｈ１９８ＴおよびＣ１５４Ｓのアミノ酸置換を導入している（配列番号３）。本願では、この変異体を「Ｈ１９８Ｔ変異体」と称する。この変異体は、ｐＨ４〜９で５１５ｎｍ付近、ｐＨ１０〜１１で５０７ｎｍ付近の蛍光を示し、野生型ウミサボテンＧＦＰと比べて蛍光波長が長波長側にシフトしている。さらに、当該変異体は３７℃で培養した場合にも蛍光を発する。よって哺乳細胞などの培養に適した温度条件でも用いることが可能である。
【００１７】
３つめは、野生型のウミサボテンＧＦＰに、１９８番目のヒスチジンをスレオニンに置換する変異、１４７番目のセリンをスレオニンに置換する変異および単量体化する変異を導入した変異体である。具体的には、野生型ウミサボテンＧＦＰに対して、Ｈ１９８Ｔ、Ｓ１４７ＴおよびＣ１５４Ｓのアミノ酸置換を導入している（配列番号５）。本願では、この変異体を「Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体」と称する。この変異体は、ｐＨ４〜１０で５１５ｎｍ付近、ｐＨ１１で５０８ｎｍ付近の蛍光を示し、野生型ウミサボテンＧＦＰと比べて蛍光波長が長波長側にシフトしており、蛍光強度も高まっている。また、Ｈ１９８Ｔ変異体がｐＨ１０付近で蛍光波長が変化するのに対し、当該変異体はｐＨ１１付近で蛍光波長の変化が生じる。
【００１８】
４つめは、野生型のウミサボテンＧＦＰに、１９８番目のヒスチジンをスレオニンに置換する変異、１４７番目のセリンをスレオニンに置換する変異、単量体化する変異および温度安定化する変異を導入した変異体である。具体的には、野生型ウミサボテンＧＦＰに対して、Ｈ１９８Ｔ、Ｓ１４７Ｔ、Ｃ１５４Ｓ、Ｓ１２９Ｇ、Ｄ１５６Ｇ、Ｋ２０４ＩおよびＮ２０９Ｙのアミノ酸置換を導入している（配列番号７）。本願では、この変異体を「Ａ−Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体」と称する。この変異体は、ｐＨ４〜１０で５１４ｎｍ付近、ｐＨ１１で５０８ｎｍ付近の蛍光を示し、野生型ウミサボテンＧＦＰと比べて蛍光波長が長波長側にシフトしており、蛍光強度も高まっている。また、Ｈ１９８Ｔ変異体がｐＨ１０付近で蛍光波長が変化するのに対し、当該変異体はｐＨ１１付近で蛍光波長の変化が生じる。さらに、当該変異体は３７℃で培養した場合にも蛍光を発する。よって哺乳細胞などの培養に適した温度条件でも用いることが可能である。
【００１９】
本発明に係る蛍光タンパク質により、一般的なＧＦＰよりも長波長側の蛍光色を用いて細胞内現象をイメージングすることが可能となる。特に、野生型ウミサボテンＧＦＰは、酸性側で青色、中性〜アルカリ性側で緑色の蛍光活性を有するため、これらとは異なる蛍光色を利用することができる。また、本発明に係る蛍光タンパク質は、より短波長側の蛍光を発するタンパク質（ＣＦＰ等）を供与体としたＦＲＥＴ系等の受容体としても用いることができる。さらに、本発明に係る蛍光タンパク質は、ｐＨによって蛍光波長が変化する性質を有するため、細胞内等のｐＨの測定が可能となる。特に、野生型ウミサボテンＧＦＰとは蛍光色が変化するｐＨの値が異なるため、本発明に係る蛍光タンパク質と野生型ウミサボテンＧＦＰとを組み合わせて使用することで、より精度の高いｐＨ測定が可能となる。
【００２０】
＜核酸＞
本発明は、本発明に係る蛍光タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸に関する。このような塩基配列は、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物に由来する塩基配列であってよい。ここにおける「由来する」とは、刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物が本来有する野生型の塩基配列に変異が生じた塩基配列を含むことを意味する。また、ここにおける変異とは、塩基配列中の特定の塩基の置換、欠失および／または付加等を指す。塩基配列の変異には、コードされるアミノ酸配列に変化を生じさせない変異をも含む。また、核酸とは、特に、ＤＮＡまたはＲＮＡを指す。
【００２１】
本発明に係る核酸の好ましい例は、配列番号２に示される塩基配列を含む核酸（Ａ−Ｈ１９８Ｙ変異体をコード）、配列番号４に示される塩基配列を含む核酸（Ｈ１９８Ｔ変異体をコード）、配列番号６に示される塩基配列を含む核酸（Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体をコード）、または配列番号８に示される塩基配列を含む核酸（Ａ−Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体をコード）である。
【００２２】
また、本発明は、これらの核酸を含むベクターを含む。当該ベクターには、蛍光タンパク質をコードする核酸以外に、発現を調節するための配列またはマーカー遺伝子の配列を含む核酸等を含んでよい。
【００２３】
＜イメージング方法＞
本発明は、本発明に係る蛍光タンパク質または本発明に係る核酸を用いた生物試料のイメージング方法に関する。
【００２４】
イメージング方法とは、観察手段を用いて対象を測定または観察することを意味する。その具体的な例は、本発明に係る蛍光タンパク質と特定のタンパク質とを融合させたタンパク質を細胞に発現させ、当該細胞中の動態を蛍光顕微鏡により観察する方法である。
【００２５】
生物試料は、バクテリアの細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞または哺乳細胞といった細胞であってよい。さらに、生物試料は、組織または個体であってよい。細胞は、固定したものであってよいし、生きた状態のものであってよい。固定は、ホルマリン、メタノール等による一般的な方法で行うことができる。また、生物試料としての個体は、ヒトを除く個体であってよい。生物試料とする細胞、組織および個体に特に限定はなく、従来の取得方法によって得られるものを使用することができる。
【００２６】
生物試料に蛍光タンパク質を導入するために、細胞等へタンパク質を導入するための当該分野で一般的ないずれの方法を使用してもよい。例えば、生物試料が細胞である場合、マイクロインジェクション法によって蛍光タンパク質を直接細胞内へ注入してもよい。あるいは、蛍光タンパク質の遺伝子を含む発現ベクターを細胞に導入し、適切に発現させることで導入してもよい。発現ベクター等による遺伝子の導入は、リン酸カルシウム法、リポフェクションまたはエレクトロポレーション等を使用することができる。
【００２７】
観察手段として、特定の波長の蛍光を検出することが可能な、従来の方法または装置を使用することができる。例えば蛍光顕微鏡を使用することができる。測定または観察とは、顕微鏡を介して目視により確認すること、顕微鏡に設置したカメラを利用して撮像すること等を含む。このような測定および観察は、単一の細胞に対して行うことが可能である。
【００２８】
＜ｐＨ測定法＞
本発明は、本発明に係る蛍光タンパク質または本発明に係る核酸を用いた生物試料内のｐＨを測定する方法に関する。
【００２９】
例えば、本発明に係る蛍光タンパク質を対象に導入し、前記蛍光タンパク質が発する蛍光に基づいて前記対象内部のｐＨを測定する方法に関する。すなわち、本発明に係る方法では、対象の内部に蛍光タンパク質を導入した後、励起光を照射して蛍光タンパク質が発する蛍光を検出し、当該蛍光の波長に基づいてｐＨを特定する。
【００３０】
生物試料としては、イメージング方法と同様な試料を使用することができる。
【００３１】
蛍光の検出は、目視で行うことも可能であるが、特定の波長の蛍光を測定することが可能な、従来の方法または装置を使用して行うことができる。例えば蛍光顕微鏡を使用することができる。励起光を照射して蛍光の色を目視で確認してｐＨを判断してもよいが、検出装置を用いることで、より詳細にｐＨを特定することが可能となる。例えば、蛍光タンパク質が発する２種の蛍光に対応したフィルターセットの蛍光キューブを倒立型蛍光顕微鏡に設置し、それぞれの波長の蛍光画像をＣＣＤカメラによって撮像する。撮像した画像内のｐＨ測定対象領域の蛍光強度を数値化しｐＨを求めることができる。このとき、細胞を種々の条件で刺激し、その後一定時間ごとに撮像することで、系時的に蛍光画像を取得することもできる。また、特定の波長だけの測定ではなく、蛍光スペクトルを測定することもできる。この場合、具体的には、顕微鏡のカメラポートに光ファイバーを接続し分光光度計にて測定対象領域の蛍光スペクトルを測定することで行うことができる。
【実施例】
【００３２】
［実施例１：野生型ウミサボテン蛍光タンパク遺伝子のクローニング］
ウミサボテン（Ｃａｖｅｒｎｕｌａｒｉａ ｏｂｅｓａ）から野生型蛍光タンパク質を抽出および精製し、その部分的なアミノ酸配列を読み取った後、当該配列をもとに遺伝子配列を決定することで蛍光タンパク質遺伝子のクローニングを行った。
【００３３】
蛍光タンパク質の抽出精製およびアミノ酸配列分析
島根近海で採取したウミサボテン１５個体（約２００ｇ）を５００ｍｌのＳＤＳ−グリシンバッファー中ですり潰し、蛍光活性を持つタンパクを含む可溶性タンパクを抽出した。遠心機を用いて残渣を取り除き、蛍光活性を持つタンパク質を含む溶液を抽出した。この抽出溶液に、最終濃度が８０％になるように硫酸アンモニウムを加えて硫安沈殿を行った。具体的には、抽出溶液５００ｍｌに２６２ｇの硫酸アンモニウムを加えた。得られた沈殿を、５０ｍｌのトリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ）に再溶解させた。これに２倍量のエタノールを加え、タンパク質を再度沈殿させた。さらに、この沈殿にトリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ）を加えて再溶解させた。この溶液５０ｍｌを、十分量のトリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ）および透析膜２７／３２（三光純薬株式会社）を用いて透析した。透析後の溶液を、ＤＥＡＥ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を装着したクロマトグラフィーシステムＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いてイオン交換分離精製した。このイオン交換は、低塩濃度トリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ）で十分に平衡化した後、サンプルを添加し、高塩濃度トリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１Ｍ ＮａＣｌ）でＮａＣｌ濃度を０．４Ｍまで上昇させることで行い、その結果、蛍光活性のあるフラクションを分取した。蛍光活性を持つタンパクを含むフラクションの選択は、ＵＶ／ＢＬＵＥ ＣＯＮＶＥＲＴＥＲ ＰＬＡＴＥ（ＵＶＰ）を用いて行った。得られたフラクションを、十分量のトリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ）および透析膜２７／３２（三光純薬株式会社）を用いて透析した。透析後の溶液を、限外ろ過アミコンウルトラ：分画分子量３０ｋＤａ（日本ミリポア株式会社）を用いて濃縮した。次に、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）およびトリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ）を用いてゲルろ過を行った。ゲルろ過後、得られた蛍光活性のあるフラクションをｍｏｎｏＱ ５／５０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）によってイオン交換分離した。このイオン交換は、低塩濃度トリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ）で十分に平衡化した後、サンプルを添加し、高塩濃度トリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１Ｍ ＮａＣｌ）でＮａＣｌ濃度を０．４Ｍまで上昇させることで行い、その結果、蛍光活性のあるフラクションを得た。この活性のあるフラクションを限外ろ過アミコンウルトラ：分画分子量３０ｋＤａ（日本ミリポア株式会社）を用いて濃縮し、その後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）およびトリスバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ）を用いてゲルろ過分離を行い、蛍光活性のあるフラクションを得た。このサンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離してアミノ酸配列を分析した。分析の結果、２２残基のアミノ酸配列（ＩＰＤ ＹＦＶ ＱＳＦ ＰＥＧ ＦＴＦ ＥＲＴ ＬＳＦ Ｅ：配列番号１７）を決定することができた。
【００３４】
蛍光タンパク質遺伝子のクローニング
蛍光タンパク質遺伝子全長のクローニングのために、３’−ＲＡＣＥ ＰＣＲを下記のとおり実施した。Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄ法（以下、ＲＡＣＥと略す）により、蛍光タンパク質遺伝子をクローニングするための混合プライマーを作成した。アミノ酸配列解析によって得られたアミノ酸配列ＩＰＤ ＹＦＶ ＱＳＦ ＰＥＧ ＦＴＦ ＥＲＴ ＬＳＦ Ｅ（配列番号１７）のうち、コドンの塩基組み合わせが少ないＩＰＤＹＦＶおよびＥＧＦＴＦＥＲのアミノ酸領域に注目した。これらのアミノ酸領域をコードする塩基配列を予測し、３’末端ＲＡＣＥ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下ＰＣＲと略す）に用いる蛍光タンパク質特異的混合プライマー（合計１２種類）を以下のように作成した。ＩＰＤＹＦＶアミノ酸領域に結合するプライマーとして、ＣＯＧＦＰ−ＴＴＴ（５’−ＡＴＨ ＣＣＮ ＧＡＴ ＴＡＴ ＴＴＴ ＧＴ−３’）（配列番号１８）、ＣＯＧＦＰ−ＴＴＣ（５’−ＡＴＨ ＣＣＮ ＧＡＴ ＴＡＴ ＴＴＣ ＧＴ−３’）（配列番号１９）、ＣＯＧＦＰ−ＴＣＴ（５’−ＡＴＨ ＣＣＮ ＧＡＴ ＴＡＣ ＴＴＴ ＧＴ−３’）（配列番号２０）、ＣＯＧＦＰ−ＴＣＣ（５’−ＡＴＨ ＣＣＮ ＧＡＴ ＴＡＣ ＴＴＣ ＧＴ−３’）（配列番号２１）、ＣＯＧＦＰ−ＣＴＴ（５’−ＡＴＨ ＣＣＮ ＧＡＣ ＴＡＴ ＴＴＴ ＧＴ−３’）（配列番号２２）、ＣＯＧＦＰ−ＣＴＣ（５’−ＡＴＨ ＣＣＮ ＧＡＣ ＴＡＴ ＴＴＣ ＧＴ−３’）（配列番号２３）、ＣＯＧＦＰ−ＣＣＴ（５’−ＡＴＨ ＣＣＮ ＧＡＣ ＴＡＣ ＴＴＴ ＧＴ−３’）（配列番号２４）およびＣＯＧＦＰ−ＣＣＣ（５’−ＡＴＨ ＣＣＮ ＧＡＣ ＴＡＣ ＴＴＣ ＧＴ−３’）（配列番号２５）を作成し、ならびに、ＥＧＦＴＦＥＲアミノ酸領域に結合するプライマーとして、ＣＯＧＦＰ−ＡＴＴＡＡ（５’−ＧＡＡ ＧＧＮ ＴＴＴ ＡＣＮ ＴＴＴ ＧＡＡ ＡＧ−３’）（配列番号２６）、ＣＯＧＦＰ−ＡＣＣＡＡ（５’−ＧＡＡ ＧＧＮ ＴＴＣ ＡＣＮ ＴＴＣ ＧＡＡ ＡＧ−３’）（配列番号２７）、ＣＯＧＦＰ−ＡＴＴＧＡ（５’−ＧＡＧ ＧＧＮ ＴＴＴ ＡＣＮ ＴＴＴ ＧＡＧ ＡＧ−３’）（配列番号２８）およびＣＯＧＦＰ−ＡＣＣＧＡ（５’−ＧＡＧ ＧＧＮ ＴＴＣ ＡＣＮ ＴＴＣ ＧＡＧ ＡＧ−３’）（配列番号２９）を作成した。プライマー中のＨおよびＮは、混合塩基を示す。
【００３５】
完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（インビトロジェン）を用いて作成したウミサボテン完全長ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、蛍光タンパク質のアミノ酸配列から予測して作成した１２種類の特異的混合プライマーおよび３’末端特異的プライマーであるＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＣＴ ＧＴＣ ＡＡＣ ＧＡＴ ＡＣＧ ＣＴＡ ＣＧＴ ＡＡＣ Ｇ−３’）（配列番号３０）およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＧＣ ＴＡＣ ＧＴＡ ＡＣＧ ＧＣＡ ＴＧＡ ＣＡＧ ＴＧ−３’）（配列番号３１）を用いて３’−ＲＡＣＥ ＰＣＲを行った。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ ＰｒｉｍｅｒおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒは、完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（インビトロジェン社）に含まれており、これを使用した。３’−ＲＡＣＥ ＰＣＲによって効果的に蛍光タンパク質遺伝子を増幅させるため、一度ＰＣＲによって増幅した遺伝子を鋳型とし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ポリメラーゼＥｘ−Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。
【００３６】
一度目のＰＣＲは、ＩＰＤＹＦＶアミノ酸領域で作成した８種類プライマー（ＣＯＧＦＰ−ＴＴＴ、ＣＯＧＦＰ−ＴＴＣ、ＣＯＧＦＰ−ＴＣＴ、ＣＯＧＦＰ−ＴＣＣ、ＣＯＧＦＰ−ＣＴＴ、ＣＯＧＦＰ−ＣＴＣ、ＣＯＧＦＰ−ＣＣＴ、ＣＯＧＦＰ−ＣＣＣ）のいずれかとＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｐｒｉｍｅｒとの計８つのプライマー対で蛍光タンパク質遺伝子の増幅を行った。１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋添加）を最終濃度等倍、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）を最終濃度各０．２ｍＭ、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を最終濃度０．０５Ｕ／μｌ、８種類のプライマーのうちの１つを最終濃度０．４μＭおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’Ｐｒｉｍｅｒを最終濃度０．４μＭとして２０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、ウミサボテン完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液を０．２μｌ加えた。ＰＣＲ反応条件として、最初に９４℃１分間の熱変性を行い、次に、９４℃３０秒、４５℃３０秒および７２℃２分のサイクルを３０回行い、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応溶液２μｌを１％トリス酢酸緩衝液（以下、ＴＡＥと略す）アガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。８つの反応溶液でわずかに遺伝子増幅が認められたため、このＰＣＲ反応溶液を鋳型としてｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応を実施した。
【００３７】
ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲは、ＥＧＦＴＦＥＲアミノ酸領域で作成した４種類プライマー（ＣＯＧＦＰ−ＡＴＴＡＡ、ＣＯＧＦＰ−ＡＣＣＡＡ、ＣＯＧＦＰ−ＡＴＴＧＡ、ＣＯＧＦＰ−ＡＣＣＧＡ）の何れかとＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒとの計４つのプライマー対で蛍光タンパク質遺伝子の増幅を行った。１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋添加）を最終濃度等倍、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）を最終濃度各０．２ｍＭ、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を最終濃度０．０５Ｕ／μｌ、４種類のプライマーのうちの１つを最終濃度０．４μＭおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒを最終濃度０．４μＭとして１０μｌのｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応溶液を作製し、１度目のＰＣＲ反応溶液を鋳型として０．２μｌを加えた。ＰＣＲ反応条件として、最初に９４℃１分間の熱変性を行い、次に、９４℃３０秒、４５℃３０秒および７２℃２分のサイクルを３０回行い、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応溶液２μｌを１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。
【００３８】
その結果、１度目のＰＣＲ反応として、ＣＯＧＦＰ−ＴＴＣとＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて実施し、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応として、得られたＰＣＲ反応溶液を鋳型としてＣＯＧＦＰ−ＡＣＣＡＡとＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて実施した場合に、顕著な遺伝子増幅を確認できた。この増幅した遺伝子の塩基配列を決定し、ウミサボテン蛍光タンパク質遺伝子のウミサボテン３’末端側の塩基配列（配列番号３２）とした。
【００３９】
蛍光タンパク質の５’末端クローニングのための５’−ＲＡＣＥを下記の通り行った。一連の３’−ＲＡＣＥ解析によって得られたウミサボテン蛍光タンパク質遺伝子の３’末端側の塩基配列をもとに、５’末端クローニングのための５’−ＲＡＣＥに用いるプライマーを作成した。作成した５’末端クローニング用のプライマーは、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ１（５’−ＧＣＴ ＡＴＡ ＧＣＣ ＧＴＣ ＴＣＡ ＴＧＴ ＴＧＣ ＴＣＧ Ｔ−３’）（配列番号３３）、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ２（５’−ＡＧＣ ＣＧＴ ＣＴＣ ＡＴＧ ＴＴＧ ＣＴＣ ＧＴＡ ＧＴＡ Ｇ−３’）（配列番号３４）およびＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ３（５’−ＡＴＧ ＴＴＧ ＣＴＣ ＧＴＡ ＧＴＡ ＧＴＴ ＧＣＣ ＴＴＣ ＣＴＣ ＧＡＣ−３’）（配列番号３５）の３種類である。ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ１、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ２、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ３の順で５’末端に近い位置に結合し、順次ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応のプライマーとして用いる。
【００４０】
完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒを用いて作成したウミサボテン完全長ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、３種類の５’末端クローニング用のプライマーならびに５’末端特異的プライマーであるＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＧＡ ＣＴＧ ＧＡＧ ＣＡＣ ＧＡＧ ＧＡＣ ＡＣＴ ＧＡ−３’）（配列番号３６）およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＧＡ ＣＡＣ ＴＧＡ ＣＡＴ ＧＧＡ ＣＴＧ ＡＡＧ ＧＡＧ ＴＡ−３’）（配列番号３７）を用いて、５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲを行った。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ ＰｒｉｍｅｒおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒは完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（インビトロジェン社）に含まれており、これを使用した。５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲによって効果的に蛍光タンパク質遺伝子を増幅させるため、一度ＰＣＲによって増幅した遺伝子を鋳型にし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行った。ＰＣＲにはポリメラーゼＥｘ−Ｔａｑを用いて、マニュアルに従って実施した。
【００４１】
一度目の５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲとして、３’−ＲＡＣＥで増幅した遺伝子の塩基配列をもとに作成したＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ１とＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて、蛍光タンパク質遺伝子を増幅した。１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋添加）を最終濃度等倍とし、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）を最終濃度各０．２ｍＭとし、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を最終濃度０．０５Ｕ／μｌとし、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ１を最終濃度０．４μＭとし、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｐｒｉｍｅｒを最終濃度０．４μＭとして、１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、ウミサボテン完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液を０．２μｌを加えた。ＰＣＲ反応条件として、最初に９４℃１分間の熱変性を行い、次に、９４℃３０秒、４５℃３０秒および７２℃２分のサイクルを３０回行い、最後に、７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応溶液２μｌを、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。この５’−ＲＡＣＥでわずかに遺伝子増幅が認められたため、このＰＣＲ反応溶液を鋳型としてｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応を実施した。
【００４２】
ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲとして、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ２とＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて蛍光タンパク質ＧＦＰ遺伝子を増幅した。１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋添加）を最終濃度等倍とし、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）を最終濃度各０．２ｍＭとし、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を最終濃度０．０５Ｕ／μｌとし、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ２を最終濃度０．４μＭとし、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒを最終濃度０．４μＭとして、１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、１度目のＰＣＲ反応溶液を鋳型として０．２μｌを加えた。ＰＣＲ反応条件として、最初に９４℃１分間の熱変性を行い、次に、９４℃３０秒、４５℃３０秒および７２℃２分のサイクルを３０回行い、最後に、７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応溶液２μｌを、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。
【００４３】
その結果、１度目のＰＣＲ反応として、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ１とＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて実施し、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応として、得られたＰＣＲ反応溶液を鋳型としてＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ２とＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて実施した場合に、顕著な遺伝子増幅を確認できた。しかし、非特異的な複数の遺伝子の増幅が認められたため、このＰＣＲ反応溶液を鋳型として、異なるプライマー対を用いて再度ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応を実施した。
【００４４】
二度目のｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲとして、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ３とＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて、ＧＦＰ遺伝子を増幅した。１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋添加）を最終濃度等倍とし、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）を最終濃度各０．２ｍＭとし、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を最終濃度０．０５Ｕ／μｌとし、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｒ３を最終濃度０．４μＭとし、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒを最終濃度０．４μＭとして、２０μｌのｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応溶液を作製し、１度目のｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応溶液を鋳型として０．４μｌを加えた。ＰＣＲ反応条件として、最初に９４℃１分間の熱変性を行い、次に、９４℃３０秒、４５℃３０秒および７２℃２分のサイクルを３０回行い、最後に、７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応溶液２μｌを、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。その結果、一連のｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応で顕著な遺伝子増幅を確認できた。この増幅した遺伝子の塩基配列を決定し、ウミサボテン蛍光タンパク質遺伝子の５’末端側の塩基配列（配列番号３８）とした。
【００４５】
次に、蛍光タンパク質遺伝子の完全長の増幅を下記のとおりに行った。上述した３’−ＲＡＣＥおよび５’−ＲＡＣＥ解析によって得られたウミサボテン由来の蛍光タンパク質遺伝子の５’末端側の塩基配列をもとに、完全長蛍光タンパク質遺伝子クローニングのための３’−ＲＡＣＥに用いるプライマーを作成した。作成した完全長ＧＦＰ遺伝子クローニング用のプライマーは、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ３（５’−ＡＴＴ ＴＡＧ ＧＴＧ ＧＣＴ ＧＣＧ ＴＡＣ ＡＧ−３’）（配列番号３９）、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ４（５’−ＡＴＴ ＴＡＧ ＧＴＧ ＧＣＴ ＧＣＧ ＴＡＣ ＡＧＴ ＴＡＡ ＣＡＣ−３’）（配列番号４０）の２種類である。ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ３、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ４の順で３’末端に近い位置に結合する。ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ４をｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応のプライマーとして用いる。
【００４６】
完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒを用いて作成したウミサボテン完全長ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、２種類の完全長蛍光タンパク質遺伝子クローニング用のプライマーならびに３’末端特異的プライマーであるＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＣＴ ＧＴＣ ＡＡＣ ＧＡＴ ＡＣＧ ＣＴＡ ＣＧＴ ＡＡＣ Ｇ−３’）（配列番号３０）およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＧＣ ＴＡＣ ＧＴＡ ＡＣＧ ＧＣＡ ＴＧＡ ＣＡＧ ＴＧ−３’）（配列番号３１）を用いて、３’−ＲＡＣＥ ＰＣＲを行った。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ ＰｒｉｍｅｒおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒは、完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（インビトロジェン社）に含まれているので、これを使用した。３’−ＲＡＣＥ ＰＣＲによって効果的に完全長蛍光タンパク質遺伝子を増幅させるため、一度ＰＣＲによって増幅した遺伝子を鋳型にし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行った。ＰＣＲにはポリメラーゼＥｘ−Ｔａｑを用いてマニュアルに従って実施した。
【００４７】
一度目のＰＣＲとして、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ３とＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて蛍光タンパク質遺伝子を増幅した。１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋添加）を最終濃度等倍とし、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）を最終濃度各０．２ｍＭとし、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を最終濃度０．０５Ｕ／μｌとし、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ３を最終濃度０．４μＭとし、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｐｒｉｍｅｒを最終濃度０．４μＭとして、１０μｌのｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応溶液を作製し、ウミサボテン完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液を０．２μｌを加えた。ＰＣＲ反応条件として、最初に９４℃１分間の熱変性を行い、次に、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃１分のサイクルを３０回行い、最後に、７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応溶液２μｌを１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。一度目の５’−ＲＡＣＥでわずかに遺伝子増幅が認められたため、このＰＣＲ反応溶液を鋳型としてｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応を実施した。
【００４８】
ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲとしてＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ４とＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒとのプライマー対を用いて、蛍光タンパク質遺伝子を増幅した。１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋添加）を最終濃度等倍とし、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）を最終濃度各０．２ｍＭとし、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を最終濃度０．０５Ｕ／μｌとし、ＣＯＧＦＰ−Ａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ４を最終濃度０．４μＭとし、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒを最終濃度０．４μＭとして、１０μｌのｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応溶液を作製し、１度目のＰＣＲ反応溶液を鋳型として０．２μｌを加えた。ＰＣＲ反応条件として、最初に９４℃１分間の熱変性を行い、次に、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃１分のサイクルを３０回行い、最後に、７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応溶液２μｌを１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。その結果、顕著な遺伝子増幅を確認できた。この増幅した遺伝子の塩基配列を決定して、完全長ウミサボテン蛍光タンパク質遺伝子の塩基配列（配列番号４１）とした。
【００４９】
得られた完全長ウミサボテン蛍光タンパク質の塩基配列から、配列情報解析ソフトウェアＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏを用いてウミサボテンＧＦＰ遺伝子のオープンリーディングフレームの塩基配列を予想した（配列番号１０）。さらに、このオープンリーディングフレームを翻訳してウミサボテン蛍光タンパク質のアミノ酸配列を得た（配列番号９）。このアミノ酸配列は、ウミサボテンから精製し、アミノ酸分析によって得られた２２残基の配列（配列番号１７）を完全一致の状態で含むことから、ウミサボテンに由来する野生型蛍光タンパク質遺伝子であると決定した。この遺伝子をｐＲＳＥＴベクター（インビトロジェン）に組み込み、大腸菌にトランスフォーメーションし、ＵＶ／ＢＬＵＥ ＣＯＮＶＥＲＴＥＲ ＰＬＡＴＥ（ＵＶＰ）を用いて観察したところ顕著な蛍光活性が示された。
【００５０】
［実施例２：Ｃ１５４Ｓ変異（単量体化）の導入］
実施例１にて得られた野生型ウミサボテンＧＦＰの遺伝子に対して、Ｃ１５４Ｓ変異を導入した。この変異を導入することで、野生型ウミサボテンＧＦＰを単量体化することができる。
【００５１】
以下の方法によって、野生型蛍光タンパク質のアミノ酸配列の１５４番目のシステインをセリンに置換した。変異の導入には、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いた。ｐＲＳＥＴ−Ａ（インビトロジェン社）にウミサボテン蛍光タンパク質遺伝子をクローニングしたプラスミドを鋳型とし、Ｐｉｒｍｅｒ１（ＣＡＡＴＧＴＡＴＧＴＡＴＣＧＧＡＣＧＡＣＡＣＴＴＴＧＧ）（配列番号４２）およびＰｒｉｍｅｒ２（ＣＣＡＡＡＧＴＧＴＣＧＴＣＣＧＡＴＡＣＡＴＡＣＡＴＴＧ）（配列番号４３）を使用して、キットに添付されているマニュアルに準じてＰＣＲ反応を行った。反応後、３７度にてＤｐｎＩで処理し、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株にトランスフォームした。
【００５２】
トランスフォームされた菌を培養してベクターを取り出し、蛍光タンパク質遺伝子の塩基配列をシーケンサーによって読み取った。その結果、配列番号１４の配列が得られ、狙い通りに変異が導入できたことが確認できた。この遺伝子から、１５４番目がセリンに置換された蛍光タンパク質（配列番号１１）が発現する。
【００５３】
また、トランスフォーム後の大腸菌を、２８度にて培養した後、溶菌してライセートを作製した。これにＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを加え、熱を加えずにサンプルを調製して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果、野生型蛍光タンパク質のレーンで出現する２量体のバンドが、変異体蛍光タンパク質のレーンで消失していた。このことから、蛍光タンパク質が単量体化されたことが確認された。
【００５４】
［実施例３：温度安定化変異の導入］
温度安定化変異の導入について以下に述べる。具体的には、Ｓ１２９Ｇ、Ｄ１５６Ｇ、Ｋ２０４ＩおよびＮ２０９Ｙの４箇所が変異した変異体を得ることができる。これらの変異の導入よって、３７℃において発色団形成を安定化させることができる。
【００５５】
実施例２で得られた単量体化した変異体蛍光タンパク質に対してランダムに変異を導入し、３７℃において発色団形成が安定化する変異体をスクリーニングした。
【００５６】
変異の導入は、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ ＩＩ ＥＺＣｌｏｎｅ Ｄｏｍａｉｎ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いた。ｐＲＳＥＴ−Ａ（インビトロジェン社）に単量体化変異体（１５４番目のシステインがセリンに置換）の遺伝子がクローニングされたプラスミドを鋳型とし、Ｐｉｒｍｅｒ１（ＡＴＧＡＧＴＡＴＴＣＣＡＧＡＧＡＡＴＴＣＧＧＧＣＴＴＡＡＣＡＧ）（配列番号４４）およびＰｒｉｍｅｒ２（ＴＣＡＴＧＧＴＴＴＡＧＣＴＡＴＧＧＣＣＧＴＣＴＣＡＴＧ）（配列番号４５）を加えて、キットに添付されているマニュアルに準じてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応後、１％アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、目的とするＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて精製した。精製後、マニュアルに準じてＰＣＲ反応を行い、３７℃にてＤｐｎＩで処理した後に、エタノール沈殿を行った。沈殿後、少量の蒸留水にＤＮＡを溶かして、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ社）を用いてエレクトロポレーション法にてＪＭ１０９（ＤＥ３）にトランスフォームした。トランスフォーム後の大腸菌を、２５ｃｍ四方のＬＢ（５０ｎｇ／ｍｌのアンピシリンを添加済み）プレートに播種して、３７℃で培養してコロニーを形成させた。コロニー形成後、ＵＶ／ＢＬＵＥ ＣＯＮＶＥＲＴＥＲ ＰＬＡＴＥ（ＵＶＰ）を使用して、野生型蛍光タンパク質を発現するコロニーと比べて、強い蛍光を発するコロニー（それぞれ変異体１および変異体２と名付ける）を２つ選択し、再度培養した。その後、それらが保持するプラスミドの塩基配列を決定した。それぞれの配列は配列番号１５および配列番号１６に示される。
【００５７】
さらに、これらの塩基配列をアミノ酸配列に変換し（変異体１は配列番号１２、変異体２は配列番号１３）、野生型のアミノ酸配列と比較した。変異体１は、１２６番目のアスパラギンがチロシンに置換され、１５４番目のシステインがセリンに置換され、１６６番目のチロシンがフェニルアラニンに置換されていることがわかった。変異体２は、１２９番目のセリンがグリシンに置換され、１５４番目のシステインがセリンに置換され、１５６番目のアスパラギン酸がグリシンに置換され、２０４番目のリジンがイソロイシンに置換され、２０９番目のアスパラギンがチロシンに置換されていることがわかった。
【００５８】
また、変異体１および２の３７℃における発色団形成の安定性を、野生型蛍光タンパク質および単量体化蛍光タンパク質と比較した。ｐＲＳＥＴ−Ａ（インビトロジェン社）に、野生型遺伝子、実施例２で作製した単量体化変異体の遺伝子、変異体１の遺伝子および変異体２の遺伝子をそれぞれクローニングし、それぞれＪＭ１０９（ＤＥ３）株にトランスフォームした。これらの株をプレートに塗布し、３７℃で培養して蛍光タンパク質を発現させた。その状態をＵＶ／ＢＬＵＥ ＣＯＮＶＥＲＴＥＲ ＰＬＡＴＥ（ＵＶＰ）で観察して、画像を撮影した。その結果、野生型および単量体化変異体と比較して、変異体１および２は非常に強い蛍光を発していた。特に、変異体１に比べて、変異体２のほうが強い蛍光を発していた。
【００５９】
次に、ゲルろ過クロマトグラフィーにて、蛍光タンパク質の会合状態を調べた。野生型蛍光タンパク質を発現する大腸菌および変異体２を発現する大腸菌から、それぞれ蛍光タンパク質を精製し解析した。野生型では６６ｋＤａｌ付近にピークが得られ、一方、変異体２では３７ｋＤａｌ付近でピークが得られた。これらの結果から、野生型蛍光タンパク質が２量体を形成しているのに対し、変異体２の蛍光タンパク質が単量体を形成していることが示唆された。
【００６０】
［実施例４：Ｈ１９８Ｙ変異の導入］
実施例３で得られた遺伝子に対し、以下に述べるＨ１９８Ｙのアミノ酸置換の変異を導入し、Ａ−Ｈ１９８Ｙ変異体の遺伝子を得た。この変異は、Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて導入した。
【００６１】
ｐＲＳＥＴ−Ｂ（インビトロジェン社）に、変異体２（１２９番目のセリンがグリシンに置換、１５４番目のシステインがセリンに置換、１５６番目のアスパラギン酸がグリシンに置換、２０４番目のリジンがイソロイシンに置換、２０９番目のアスパラギンがチロシンに置換）の遺伝子を挿入したプラスミドを鋳型として、Ｈ１９８Ｙプライマー１（ＣＡＴＴＡＴＧＴＴＣＡＴＴＡＴＣＧＣＣＴＣＧＡＡＡＡＧ、配列番号４６）およびＨ１９８Ｙプライマー２（ＣＴＴＴＴＣＧＡＧＧＣＧＡＴＡＡＴＧＡＡＣＡＴＡＡＴＧ、配列番号４７）を使用して、キットに添付されているマニュアルに準じてＰＣＲ反応を行った。反応後、反応産物にＤｐｎＩを加えて３７度で処理した後に、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株に形質転換した。形質転換された大腸菌を増殖させてプラスミドＤＮＡを精製し、目的の変異が導入された遺伝子が作製されたことを確認した。
【００６２】
［実施例５：Ｈ１９８Ｔ変異の導入］
実施例２で得られた遺伝子に対し、以下に述べるＨ１９８Ｔのアミノ酸置換の変異を導入し、Ｈ１９８Ｔ変異体の遺伝子を得た。この変異は、Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて導入した。
【００６３】
ｐＲＳＥＴ−Ｂ（インビトロジェン社）に、単量体化変異体（１５４番目のシステインがセリンに置換）の遺伝子を挿入したプラスミドを鋳型として、Ｈ１９８Ｔプライマー１（ＣＡＴＴＡＴＧＴＴＣＡＴＡＣＣＣＧＣＣＴＣＧＡＡＡＡＧ、配列番号４８）およびＨ１９８Ｔプライマー２（ＣＴＴＴＴＣＧＡＧＧＣＧＧＧＴＡＴＧＡＡＣＡＴＡＡＴＧ、配列番号４９）を使用して、キットに添付されているマニュアルに準じてＰＣＲ反応を行った。反応後、反応産物にＤｐｎＩを加えて３７度で処理した後に、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株に形質転換した。形質転換された大腸菌を増殖させてプラスミドＤＮＡを精製し、目的の変異が導入された遺伝子が作製されたことを確認した。
【００６４】
［実施例６：Ｓ１４７Ｔ変異の導入］
実施例５で得られた遺伝子に対し、以下に述べるＳ１４７Ｔのアミノ酸置換の変異を導入し、Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体の遺伝子を得た。また、実施例３で得られた遺伝子に対し実施例５に記載の通りにＨ１９８Ｔ変異を導入した後、さらに以下に述べるＳ１４７Ｔのアミノ酸置換の変異を導入することで、Ａ−Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体の遺伝子を得た。これらの変異は、Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて導入した。
【００６５】
ｐＲＳＥＴ−Ｂ（インビトロジェン社）に、Ｈ１９８Ｔ変異体（１９８番目のヒスチジンがスレオニンに置換および１５４番目のシステインがセリンに置換）の遺伝子を挿入したプラスミド、または単量体化および温度安定化され、さらにＨ１９８Ｔ変異が導入された変異体（１９８番目のヒスチジンがスレオニン、１５４番目のシステインがセリンに置換、１２９番目のセリンがグリシンに置換、１５６番目のアスパラギン酸がグリシンに置換、２０４番目のリジンがイソロイシンに置換および２０９番目のアスパラギンがチロシンに置換）の遺伝子を挿入したプラスミドを鋳型として、Ｓ１４７Ｔプライマー１（ＣＣＡＡＡＣＴＡＧＡＡＣＣＧＡＣＣＡＧＴＧＡＧＴＣＡＡＴＧ、配列番号５０）およびＳ１４７Tプライマー２（ＣＡＴＴＧＡＣＴＣＡＣＴＧＧＴＣＧＧＴＴＣＴＡＧＴＴＴＧＧ、配列番号５１）を使用して、キットに添付されているマニュアルに準じてＰＣＲ反応を行った。反応後、反応産物にＤｐｎＩを加えて３７度で処理した後に、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株に形質転換した。形質転換された大腸菌を増殖させてプラスミドＤＮＡを精製し、目的の変異が導入された遺伝子が作製されたことを確認した。
【００６６】
［実施例７：ｐＨによる蛍光の変化並びに蛍光および吸収スペクトルの測定］
Ａ−Ｈ１９８Ｙ変異体、Ｈ１９８Ｔ変異体、Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体およびＡ−Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体の４種の変異型蛍光タンパク質について、ｐＨによる蛍光の変化並びに蛍光スペクトルおよび吸収スペクトルをそれぞれ測定した。
【００６７】
実施例４から６により取得した、４種の変異体の内いずれかの遺伝子を有するプラスミドを、大腸菌に導入し、３７℃で培養して各種変異型蛍光タンパク質を発現させ、溶菌後、Ｎｉ−ＮＴＡ（Ｑｕｉａｇｅｎ社）カラムクロマトグラフィーにより蛍光タンパク質をそれぞれ精製した。
【００６８】
精製された変異体タンパク質を異なるｐＨの溶液に添加し、ＵＶハンディライト（３６５ｎｍ）を用いて蛍光色を確認した。また、分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ Ｕ−３０１０）および蛍光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ Ｆ−２５００）を用いて、吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを測定した。
【００６９】
以下に、それぞれの変異体の測定結果を説明する。
（Ａ−Ｈ１９８Ｙ変異体）
図１にｐＨによる蛍光の変化の結果をモノクロ画像として示し、図２に蛍光スペクトルおよび吸収スペクトルを示す。
【００７０】
図１中、暗視野画像はＵＶハンディライトを照射したときに発せられる蛍光の画像であり、明視野画像は通常の照明下で確認される画像である。それぞれの上段のチューブには野生型ウミサボテンＧＦＰが、下段のチューブにはＡ−Ｈ１９８Ｙ変異体が、各ｐＨの緩衝液とともに添加されている。なお、後述する図３、５および７についても同様に、上段に野生型が、下段に変異型がそれぞれ配置される。
【００７１】
図１の元となるカラー画像によれば、野生型ウミサボテンＧＦＰでは、ｐＨ４の環境下で青色の蛍光を発し、ｐＨ６以上の環境下で緑色の蛍光を発し、ｐＨ５において中間的な蛍光を発した。また、明視野において、ｐＨ４および５の環境下で緩衝液は透明であり、ｐＨ６の環境下で黄緑色を示し、ｐＨ７以上の環境下で緑色を示した。
【００７２】
これに対し、Ａ−Ｈ１９８Ｙ変異体では、ｐＨ５から１０の環境下で黄色の蛍光を発し、ｐＨ１１の環境下で黄緑色の蛍光を発した。また、明視野において、ｐＨ４から１０の環境下で緩衝液は赤みがかった黄色を示し、ｐＨ１１の環境下で黄色を示した。
【００７３】
図２には、Ａ−Ｈ１９８Ｙ変異体の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトル（４７０ｎｍ励起）が示される。吸収スペクトルでは、全体として４００ｎｍ付近および５００ｎｍ付近の２つのピークを示した。特に、ｐＨ４から５で４０３ｎｍ付近のピークが高く、ｐＨ６から１０で５０９ｎｍ付近のピークが高く、ｐＨ１１では５００ｎｍ付近のピークが高かった。蛍光スペクトルでは、ｐＨ４から９で５１７ｎｍ付近にピークを示し、ｐＨ１０および１１で５１０ｎｍ付近にピークを示した。蛍光強度は、ｐＨの値が大きいほど高い傾向を示した。それぞれのスペクトルについて、ｐＨごとに最大強度を示した波長を以下の表１にまとめる。
【００７４】
【表１】
【００７５】
（Ｈ１９８Ｔ変異体）
図３にｐＨによる蛍光の変化の結果をモノクロ画像として示し、図４に蛍光スペクトルおよび吸収スペクトルを示す。
【００７６】
図３の元となるカラー画像によれば、Ｈ１９８Ｔ変異体は、ｐＨ４から９の環境下で黄色の蛍光を発し、ｐＨ１０および１１の環境下で黄緑色の蛍光を発した。また、明視野において、ｐＨ４から９の環境下で緩衝液は赤みがかった黄色を示し、ｐＨ１０および１１の環境下で黄緑色を示した。
【００７７】
図４には、Ｈ１９８Ｔ変異体の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトル（４９０ｎｍ励起）が示される。吸収スペクトルは、ｐＨ４から１０で５０７ｎｍ付近のピークを、ｐＨ１１で４９８ｎｍ付近のピークを示した。蛍光スペクトルでは、ｐＨ４から９で５１５ｎｍ付近にピークを示し、ｐＨ１０および１１で５０７ｎｍ付近にピークを示した。蛍光強度は、ｐＨの値が大きいほど高い傾向を示した。それぞれのスペクトルについて、ｐＨごとに最大強度を示した波長を以下の表２にまとめる。
【００７８】
【表２】
【００７９】
（Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体）
図５にｐＨによる蛍光の変化の結果をモノクロ画像として示し、図６に蛍光スペクトルおよび吸収スペクトルを示す。
【００８０】
図５の元となるカラー画像によれば、Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体では、ｐＨ４から９の環境下で黄色の蛍光を発し、ｐH１０およびｐＨ１１の環境下で黄緑色の蛍光を発した。また、明視野において、ｐＨ４から９の環境下で緩衝液はオレンジよりの黄色を示し、ｐＨ１０の環境下で黄色、ｐＨ１１の環境下で黄緑色を示した。
【００８１】
図６には、Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトル（４９０ｎｍ励起）が示される。吸収スペクトルでは、ｐＨ４から１０で５０７ｎｍ付近のピークを示し、ｐＨ１１で４９８ｎｍ付近のピークを示した。蛍光スペクトルでは、ｐＨ４から１０で５１５ｎｍ付近にピークを示し、ｐＨ１１で５０８ｎｍ付近にピークを示した。蛍光強度は、ｐＨの値が大きいほど高い傾向を示した。また、ｐＨ７における蛍光強度を同濃度の野生型ウミサボテンＧＦＰと比較した場合、Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体の方が約１．６倍高かった。それぞれのスペクトルについて、ｐＨごとに最大強度を示した波長を以下の表３にまとめる。
【００８２】
【表３】
【００８３】
（Ａ−Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体）
図７にｐＨによる蛍光の変化の結果をモノクロ画像として示し、図８に蛍光スペクトルおよび吸収スペクトルを示す。
【００８４】
図７の元となるカラー画像によれば、Ａ−Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体では、ｐＨ４から１０の環境下で黄色の蛍光を発し、ｐＨ１１の環境下で黄緑色の蛍光を発した。また、明視野において、ｐＨ４から１０の環境下で緩衝液はオレンジよりの黄色を示し、ｐＨ１１の環境下で黄緑色を示した。
【００８５】
図８には、Ａ−Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトル（４９０ｎｍ励起）が示される。吸収スペクトルでは、ｐＨ４から１０で５０７ｎｍ付近のピークを示し、ｐＨ１１で４９８ｎｍ付近のピークを示した。蛍光スペクトルでは、ｐＨ４から１０で５１４ｎｍ付近にピークを示し、ｐＨ１１で５０８ｎｍ付近にピークを示した。蛍光強度は、ｐＨの値が大きいほど高い傾向を示した。また、ｐＨ７における蛍光強度を同濃度の野生型ウミサボテンＧＦＰと比較した場合、Ａ−Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体の方が約１．８倍高かった。それぞれのスペクトルについて、ｐＨごとに最大強度を示した波長を以下の表４にまとめる。
【００８６】
【表４】
【００８７】
［実施例８：蛍光強度の比較］
４種の変異型蛍光タンパク質の蛍光強度を確認した。
【００８８】
１：野生型ウミサボテンＧＦＰ、２：Ｃ１５４Ｓ変異体（単量体化のみを行った変異体）、３：Ｈ１９８Ｙ変異体、４：Ｈ１９８Ｗ変異体、５：Ａ−Ｈ１９８Ｙ変異体、６：Ｈ１９８Ｔ変異体、７：Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体および８：Ａ−Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体について、それぞれの遺伝子を形質転換させた８つの大腸菌を２つのプレートに塗布し、一方を常温で培養し、他方を３７℃にて培養して、各蛍光タンパク質を発現させた。各プレートをＵＶ／ＢＬＵＥ ＣＯＮＶＥＲＴＥＲ ＰＬＡＴＥ（ＵＶＰ）で観察して、画像を撮影した。図９は、それらをモノクロで表した画像である。
【００８９】
３：Ｈ１９８Ｙ変異体および４：Ｈ１９８Ｗ変異体は、先行技術に倣って作製した。非特許文献１によれば、野生型オワンクラゲＧＦＰの２０３番目のスレオニンをチロシンに置換することでＹＦＰを作製している。この２０３番目のアミノ酸に立体構造上対応するウミサボテンＧＦＰの１９８番目のアミノ酸について、先行技術と同様にチロシンまたはトリプトファンに置換した。
【００９０】
図９の常温培養の結果によると、１：野生型および２：Ｃ１５４Ｓ変異体は緑色の蛍光を示した。特に、２：Ｃ１５４Ｓ変異体の方が強い蛍光を示した。３：Ｈ１９８Ｙ変異体および４：Ｈ１９８Ｗ変異体は蛍光を示さなかった。本発明に係る５から８の変異体は黄色から黄緑色の蛍光を示した。特に、６から８の変異体は蛍光が強かった。
【００９１】
３７℃培養の結果によると、１：野生型および２：Ｃ１５４Ｓ変異体は常温培養の場合より弱いものの同色の蛍光を示した。また、３：Ｈ１９８Ｙ変異体、４：Ｈ１９８Ｗ変異体、５：Ａ−Ｈ１９８Ｙ変異体および７：Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体は蛍光を示さなかった。これらに対し、６：Ｈ１９８Ｔ変異体および８：Ａ−Ｈ１９８Ｔ−Ｓ１４７Ｔ変異体は常温培養の場合よりも弱いものの同色の蛍光を示した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
強アルカリ性環境下で緑色蛍光を発し、弱アルカリ性〜酸性環境下で前記緑色蛍光よりも長波長の蛍光を発する蛍光タンパク質。
【請求項２】
刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物に由来する請求項１に記載の蛍光タンパク質。
【請求項３】
ｐＨ１０〜１１の環境下で５１２ｎｍ付近の蛍光活性を有し、ｐＨ４〜９の環境下で５１６ｎｍ付近の蛍光活性を有する、請求項１または２に記載の蛍光タンパク質。
【請求項４】
ｐＨ１０〜１１の環境下で５０７ｎｍ付近の蛍光活性を有し、ｐＨ４〜９の環境下で５１５ｎｍ付近の蛍光活性を有する、請求項１または２に記載の蛍光タンパク質。
【請求項５】
ｐＨ１１の環境下で５０８ｎｍ付近の蛍光活性を有し、ｐＨ４〜１０の環境下で５１５ｎｍ付近の蛍光活性を有する、請求項１または２に記載の蛍光タンパク質。
【請求項６】
ｐＨ１１の環境下で５０８ｎｍ付近の蛍光活性を有し、ｐＨ４〜１０の環境下で５１４ｎｍ付近の蛍光活性を有する、請求項１または２に記載の蛍光タンパク質。
【請求項７】
配列番号１、３、５または７に示されたアミノ酸配列を含む請求項１に記載の蛍光タンパク質。
【請求項８】
請求項１から７の何れか１項に記載の蛍光タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸。
【請求項９】
前記塩基配列が配列番号２、４、６または８に示された塩基配列である請求項８に記載の核酸。
【請求項１０】
請求項１から７の何れか１項に記載の蛍光タンパク質または請求項８または９に記載の核酸を用いた生物試料のイメージング方法。
【請求項１１】
請求項１から７の何れか１項に記載の蛍光タンパク質または請求項８または９に記載の核酸を用いた生物試料内のｐＨを測定する方法。
【請求項１】
強アルカリ性環境下で緑色蛍光を発し、弱アルカリ性〜酸性環境下で前記緑色蛍光よりも長波長の蛍光を発する蛍光タンパク質。
【請求項２】
刺胞動物門花虫綱ウミエラ目ウミサボテン科に属す生物に由来する請求項１に記載の蛍光タンパク質。
【請求項３】
ｐＨ１０〜１１の環境下で５１２ｎｍ付近の蛍光活性を有し、ｐＨ４〜９の環境下で５１６ｎｍ付近の蛍光活性を有する、請求項１または２に記載の蛍光タンパク質。
【請求項４】
ｐＨ１０〜１１の環境下で５０７ｎｍ付近の蛍光活性を有し、ｐＨ４〜９の環境下で５１５ｎｍ付近の蛍光活性を有する、請求項１または２に記載の蛍光タンパク質。
【請求項５】
ｐＨ１１の環境下で５０８ｎｍ付近の蛍光活性を有し、ｐＨ４〜１０の環境下で５１５ｎｍ付近の蛍光活性を有する、請求項１または２に記載の蛍光タンパク質。
【請求項６】
ｐＨ１１の環境下で５０８ｎｍ付近の蛍光活性を有し、ｐＨ４〜１０の環境下で５１４ｎｍ付近の蛍光活性を有する、請求項１または２に記載の蛍光タンパク質。
【請求項７】
配列番号１、３、５または７に示されたアミノ酸配列を含む請求項１に記載の蛍光タンパク質。
【請求項８】
請求項１から７の何れか１項に記載の蛍光タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸。
【請求項９】
前記塩基配列が配列番号２、４、６または８に示された塩基配列である請求項８に記載の核酸。
【請求項１０】
請求項１から７の何れか１項に記載の蛍光タンパク質または請求項８または９に記載の核酸を用いた生物試料のイメージング方法。
【請求項１１】
請求項１から７の何れか１項に記載の蛍光タンパク質または請求項８または９に記載の核酸を用いた生物試料内のｐＨを測定する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１２−１０５５８９（Ｐ２０１２−１０５５８９Ａ）
【公開日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２５６９９９（Ｐ２０１０−２５６９９９）
【出願日】平成２２年１１月１７日（２０１０．１１．１７）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月１７日（２０１０．１１．１７）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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