蛍光プローブ
蛍光プローブであって、下記の式（Ｉ）：
（式中、Ｒ１は水素原子、カルボキシル基、又はスルホン酸基以外の一価の置換基を示し；Ｒ２は水素原子又は一価の置換基を示し；Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子を示し；Ｒ５は測定対象物質との接触により切断される一価の基を示し、ただし、Ｒ１及びＲ２の組み合わせは、それらが結合するベンゼン環の酸化電位が、（１）上記切断の前には、式（Ｉ）で表される化合物が実質的に無蛍光性になるように、かつ（２）上記切断の後には、式（Ｉ）で表される化合物に由来する切断後の化合物が実質的に高い蛍光性になるように選ばれる。）で表される蛍光プローブ。
（式中、Ｒ１は水素原子、カルボキシル基、又はスルホン酸基以外の一価の置換基を示し；Ｒ２は水素原子又は一価の置換基を示し；Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子を示し；Ｒ５は測定対象物質との接触により切断される一価の基を示し、ただし、Ｒ１及びＲ２の組み合わせは、それらが結合するベンゼン環の酸化電位が、（１）上記切断の前には、式（Ｉ）で表される化合物が実質的に無蛍光性になるように、かつ（２）上記切断の後には、式（Ｉ）で表される化合物に由来する切断後の化合物が実質的に高い蛍光性になるように選ばれる。）で表される蛍光プローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は蛍光プローブに関する。より具体的には、酵素などの標的物質を捕捉して蛍光を発する蛍光プローブに関するものである。
【背景技術】
フルオレセインは１９世紀から知られる蛍光物質で、水溶液中で５００ｎｍ付近で励起可能であり、量子収率も高いことから蛍光プローブの母核として汎用されている。例えば、一酸化窒素の蛍光プローブ（特開平１０−２２６６８８号公報）、亜鉛の蛍光プローブ（国際公開ＷＯ ０１／６２７５５）などの母核に利用されている。
フルオレセインのカルボキシル基を水素原子に置き換えた６−ヒドロキシ−９−フェニルフルオロンは蛍光量子収率が低くなるため、このカルボキシル基はフルオレセインの蛍光団としての特性に役割を持つと考えられてきた（Ｌｉｎｄｑｖｉｓｔ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．，４４，１７１１−１２，１９６６）。このような理由から、従来提案されているフルオレセイン誘導体ではフルオレセインの蛍光特性を損なわないようにこのカルボキシル基が保存されており、カルボキシル基を他の官能基に変換した化合物はほとんど知られていない。
【発明の開示】
本発明の課題は、蛍光特性に優れた蛍光プローブを提供することにある。本発明者らはフルオレセインの蛍光物質としての性質を種々検討するうち、その蛍光特性はもっぱら三環のキサンテン骨格に基づくものであり、キサンテン環の９−位に結合する２−カルボキシフェニル基は蛍光特性に実質的に何の影響も与えていないとの結論に至った。そこで、本発明者らは、２−カルボキシフェニル基のカルボキシル基を水素原子以外の置換基、例えばメチル基又はメトキシ基などに置換した化合物の蛍光特性を確認したところ、驚くべきことに、これらの化合物がフルオレセインとほぼ同等の強度の蛍光量子収率を有しており、励起波長及び蛍光波長もほぼ同じであることを発見した。
これらの事実、及びカルボキシル基を水素原子に置き換えた６−ヒドロキシ−９−フェニルフルオロンでは蛍光量子収率が低下する事実から、本発明者らはフルオレセインにおけるカルボキシル基の役割がキサンテン環とベンゼン環部の炭素−炭素単結合による自由回転を防ぐことにあり、これによって励起状態の蛍光団が発光過程を経ずに失活する経路を妨げることにあると結論した。さらに、本発明者らは上記の知見を基にして高い蛍光特性を有する蛍光プローブを創出すべく研究を行った結果、キサンテン環の９−位に結合するフェニル基の電子密度が十分に高い化合物では実質的に非蛍光性であり、該フェニル基の電子密度が十分に低い化合物では高い蛍光性を有すること、及びフルオレセインのカルボキシル基を他の官能基に変換して該フェニル基の電子密度を調節することにより、所望の蛍光特性を有する蛍光プローブを合理的に設計できることを見出し、この発明について特許出願した（ＰＣＴ／ＪＰ０３／８５８５）。
本発明は上記の課題を解決するための別の手段を提供すべくさらに研究を進めた結果、キサンテン環のヒドロキシル基がプロトン化されている場合と脱プロトン化されている場合とを比較すると、両者でキサンテン環の還元電位に大きな差が生じていること、及びこの還元電位差を蛍光のＯＮ／ＯＦＦスイッチとして利用すべくベンゼン環部分（電子ドナー部位）の電子密度を適宜選択することにより、キサンテン環部位に測定対象物質との反応部位を導入した新規蛍光プローブを提供できることを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
すなわち、本発明は、蛍光プローブであって、下記の式（Ｉ）：
（式中、Ｒ１は水素原子、カルボキシル基、又はスルホン酸基以外の一価の置換基を示し；Ｒ２は水素原子又は一価の置換基を示し；Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子を示し；Ｒ５は測定対象物質との接触により切断される一価の基を示し、
ただし、Ｒ１及びＲ２の組み合わせは、それらが結合するベンゼン環の酸化電位が、
（１）上記切断の前には、式（Ｉ）で表される化合物が実質的に無蛍光性になるように、かつ
（２）上記切断の後には、式（Ｉ）で表される化合物に由来する切断後の化合物が実質的に高い蛍光性になるように選ばれる。）
で表される蛍光プローブを提供するものである。
この発明の好ましい態様によれば、該ベンゼン環の酸化電位が１．５５Ｖ〜１．７５ＶになるようにＲ１及びＲ２の組み合わせが選ばれる上記の蛍光プローブ；該ベンゼン環の酸化電位が１．６０Ｖ〜１．７０Ｖの範囲となるようにＲ１及びＲ２の組み合わせが選ばれる上記の蛍光プローブが提供される。本発明のさらに好ましい態様によれば、Ｒ３及びＲ４が水素原子である上記の蛍光プローブ；Ｒ１が低級アルキル基であり、Ｒ２が低級アルコキシ基である上記の蛍光プローブ；Ｒ１が低級アルキル基であり、Ｒ２がキサンテン環残基に対してパラ位の低級アルコキシ基である上記の蛍光プローブ；上記の切断が加水分解により生じる上記の蛍光プローブ；測定対象物質が加水分解酵素である上記の蛍光プローブ；Ｒ５がリン酸エステル加水分解酵素により切断されるホスホノ基である上記の蛍光プローブ；Ｒ５が糖加水分解酵素により切断される糖誘導体の残基である上記の蛍光プローブ；Ｒ５がβ−ガラクトピラノシル基である上記の蛍光プローブ；Ｒ５がβ−ガラクトピラノシル基であり、Ｒ２がカルボキシ置換アルコキシ基又は４−カルボキシブトキシ基である上記の蛍光プローブ；Ｒ５がβ−ラクタマーゼによる切断される環状アミドを含む基である上記の蛍光プローブ；β−ラクタマーゼによる切断される環状アミドを含む基が下記の式で表される基である上記の蛍光プローブ；
が提供される。
別の観点からは、上記の一般式（Ｉ）（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５はそれぞれ上記の定義と同義である）で表される蛍光プローブの設計方法であって、Ｒ１及びＲ２の組み合わせとして、それらが結合するベンゼン環の酸化電位が、
（１）上記切断の前には、式（Ｉ）で表される化合物が実質的に無蛍光性になるように、かつ
（２）上記切断の後には、式（Ｉ）で表される化合物に由来する切断後の化合物が実質的に高い蛍光性になるように
組み合わせを選択する工程を含む方法が本発明により提供される。さらに、上記の設計方法により得られた蛍光プローブも本発明により提供される。
【図面の簡単な説明】
第１図は、フルオレセインのカルボキシル基をアルキル基又はアルコキシ基に変換した誘導体（化合物１〜８）について、各化合物の蛍光量子収率とＰＥＴドナー部分であるベンゼン環部の酸化電位との関係を示した図である。
第２図は、フルオレセインのカルボキシル基をアルキル基又はアルコキシ基に変換した誘導体（化合物１〜８）について、各化合物の蛍光量子収率とＰＥＴドナー部分であるベンゼン環部のＨＯＭＯエネルギーレベルとの関係を示した図である。
第３図は、ＰＥＴの概念図及びフルオレセインについてＰＥＴドナー部と蛍光団の２つの部位を示した図である。
第４図は、本発明蛍光プローブＡとβ−ガラクトシダーゼとの反応により生じる蛍光を経時的に示した図である。図中右側のグラフは反応当初の１５分間の蛍光強度変化を拡大して示したものである。
第５図は、本発明蛍光プローブＡを用いて細胞中のβ−ガラクトシダーゼの測定を行った結果を示した写真である。左側はｌａｃＺ陽性細胞の結果を示し、右側はＬａｃＺ陰性細胞の結果を示す。
第６図は、化合物１１（ＴＧ−Ｐｈｏｓ）をアルカリフォスファターゼに接触させた場合の蛍光強度の経時変化を示した図である。
第７図は、ＴＧ−Ｐｈｏｓのアルカリフォスファターゼによる反応前後の蛍光スペクトル変化（ａ）及び吸収スペクトル（ｂ）変化を示した図である。
第８図は、例９で得た２−Ｍｅ ４−Ｏ（ＣＨ２）４ＣＯＯＡＭ ＴＧ β−Ｇａｌをβ−ガラクトシダーゼに接触させた場合の蛍光強度の経時変化を示した図である。
第９図は、２−Ｍｅ ４−Ｏ（ＣＨ２）４ＣＯＯＡＭ ＴＧ β−Ｇａｌのをβ−ガラクトシダーゼによる反応前後の蛍光スペクトル変化（ａ）及び吸収スペクトル（ｂ）変化を示した図である。
第１０図は、２−Ｍｅ ４−Ｏ（ＣＨ２）４ＣＯＯＡＭ ＴＧ−β Ｇａｌを用いた生細胞系でのβ−ガラクトシダーゼ蛍光アッセイの結果を示した写真である。
第１１図は、ＴＧ−β Ｌａｃを用いたインビトロβ−ラクタマーゼ蛍光アッセイの結果を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明により提供される式（Ｉ）で表される蛍光プローブは、測定対象物質との接触により切断されて蛍光性の化合物（上記式（Ｉ）においてＲ５が切断され、ヒドロキシ基がアニオン状態で存在する化合物に相当する）を生成することができ、測定対象物質の測定のための蛍光プローブとして用いられる。測定対象物質の種類は特に限定されず、酵素、金属イオン（例えば、ナトリウムイオンやリチウムイオンなどのアルカリ金属イオン、カルシウムイオンなどのアルカリ土類金属イオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオンなど）、非金属イオン（炭酸イオンなど）、活性酸素種（例えば、一酸化窒素、ヒドロキシラジカル、一重項酸素、及びスーパーオキシドなど）などのいずれであってもよいが、好ましくは酵素である。酵素としては、例えば、還元酵素、酸化酵素、加水分解酵素などを挙げることができる。例えば、β−ラクタマーゼ、チトクロームＰ４５０酸化酵素、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼ、ラクターゼ、アルカリホスファターゼなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。酵素のうち、特に加水分解酵素が好ましい。加水分解酵素の典型例として、例えばβ−カラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、又はアルカリフォスファターゼなどを挙げることができるが、加水分解酵素は上記のものに限定されるわけではない。
本発明の蛍光プローブは、従来、フルオレセインを母核として種々提案されている各種測定対象物の測定のための蛍光プローブにおいて、キサンテン環の９−位に結合する２−カルボキシフェニル基のカルボキシル基を水素原子、スルホン酸基以外の一価の置換基に変換し、かつ測定対象物質との反応部位をキサンテン骨格のヒドロキシル基としたことを特徴としている。本発明の蛍光プローブはそれ自体は実質的に無蛍光性であるが、測定対象物質との接触により切断され、実質的に高い蛍光性を有する化合物を生成することを特徴としている。
Ｒ１は水素原子、カルボキシル基、又はスルホン酸基以外の一価の置換基を示す。Ｒ２は水素原子又は一価の置換基を示す。これらの基が示す一価の置換基の種類は特に限定されないが、例えば、Ｒ１としてはアルキル基が好ましく、Ｒ２としてはアルコキシ基が好ましい。Ｒ１が示すアルキル基又はＲ２が示すアルコキシ基は、１個又は２個以上の任意の置換基を有していてもよい。Ｒ２が示す置換アルコキシ基としては、例えば、カルボキシル置換Ｃ１−６アルコキシ基又はアルコキシカルボニル置換Ｃ１−６アルコキシ基などが挙げられる。本明細書において、「アルキル基」又はアルキル部分を含む置換基（例えばアルコキシ基など）のアルキル部分は、例えば、炭素数１〜１２個、好ましくは炭素数１〜６個、好ましくは炭素数１〜４個の直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基を意味している。より具体的には、アルキル基として低級アルキル基（炭素数１〜６個のアルキル基）が好ましい。低級アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロプロピルメチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基などを挙げることができる。Ｒ１としては低級アルキル基がより好ましく、Ｒ２としては低級アルコキシ基がより好ましい。特に好ましいのは、Ｒ１がメチル基であり、Ｒ２がメトキシ基である化合物である。また、Ｒ２がモノカルボキシ基置換Ｃ１−６アルコキシ基又はモノアルコキシカルボニル置換Ｃ１−６アルコキシ基である化合物も好ましい。特に好ましいのはＲ２が４−カルボキシブトキシ基又は４−アセトキシメチルオキシカルボニルブトキシ基である化合物である。Ｒ２が４−アセトキシメチルオキシカルボニルブトキシ基である本発明の蛍光プローブは高い脂溶性により細胞内に効率良く取り込まれ、かつ、細胞内に取り込まれると細胞内に存在するエステラーゼにより４−アセトキシメチルオキシカルボニルブトキシ基が加水分解を受け水溶性の高い蛍光プローブに変換され細胞内に滞留しやすくなる優れた特性を有しており、細胞内をイメージングする用途の蛍光プローブとして大変適している。ベンゼン環上のＲ２の置換位置は特に限定されないが、キサンテン環の残基の結合位置に対してパラ位であることが好ましい。Ｒ１及びＲ２が結合するベンゼン環上には、これらの置換基以外に任意の置換基が存在していてもよい。
本明細書においてハロゲン原子という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよく、好ましくはフッ素原子、塩素原子、又は臭素原子である。Ｒ３及びＲ４が示すハロゲン原子としては塩素原子又はフッ素原子が好ましい。Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立に水素原子、塩素原子、又はフッ素原子であることが好ましい。Ｒ５は測定対象物質との組み合わせにより容易に切断されるように適宜選択することができるが、例えば、糖加水分解酵素を測定対象物質として用いる場合には、Ｒ５はとしてその酵素の基質となる糖化合物の残基を用いることができる。糖化合物が有するヒドロキシ基やアミノ基などの官能基は必要に応じて適宜の保護基で保護されていてもよい。このような保護基を有する化合物もすべて本発明の範囲に包含される。
本発明の蛍光プローブにおいて、Ｒ１及びＲ２の組み合わせは、測定対象物質によるＲ５の切断前には、式（Ｉ）で表される化合物が実質的に無蛍光性になるように選択され、かつ（２）測定対象物質によるＲ５の切断後には、式（Ｉ）で表される化合物に由来する切断後の化合物が実質的に高い蛍光性になるように選択される。
Ｒ１及びＲ２の組み合わせの選択に際して、それらが結合するベンゼン環の電子密度の情報を利用することができる。電子密度の情報は、例えば該ベンゼン環の酸化電位を量子化学的手法に従って計算することにより容易に入手することができる。該ベンゼン環の酸化電位が低くなることは該ベンゼン環の電子密度が上昇することを意味しており、これはＨＯＭＯ軌道エネルギーが高くなることに対応している。例えば、該ベンゼン環部位のＨＯＭＯエネルギーを密度汎関数法（Ｂ３ＬＹＰ／６−３１Ｇ（ｄ））により求めることができる。なお、本明細書中に記載された酸化電位はすべて飽和カロメロ電極（ＳＣＥ）を対照に記述しており、硝酸銀電極（Ａｇ／Ａｇ＋）を参照電極とした場合の値とは約０．２４Ｖ基準が異なっている。
本明細書の実施例の例２に具体的に示されているように、一般式（Ｉ）で表される化合物においてＲ５が水素原子である化合物は、ｐＨ１３のアルカリ水溶液中ないし中性水溶液中では、キサンテン環のヒドロキシ基のプロトンが脱離してアニオンになっているが（すなわち該ヒドロキシル基が−Ｏ−となっている）、例えば、この条件下において該ベンゼン環の酸化電位が１．２０Ｖ以下の化合物は実質的に無蛍光性であり、該ベンゼン環の酸化電位が１．６０Ｖ以上では実質的に強い蛍光性の化合物となる場合がある。また、ｐＨ３．４の酸性条件下では、該ヒドロキシル基にプロトンが存在する状態になっているが（すなわち該ヒドロキシル基が−ＯＨとなっている）、例えば、該ベンゼン環の酸化電位が１．６０Ｖ以下の化合物は実質的に無蛍光性であり、該ベンゼン環の酸化電位が１．９０Ｖよりも大きい場合は実質的に強い蛍光性の化合物となる場合がある。この関係を図示したのが第１図である。この第１図には、Ｒ１及びＲ２として種々の組み合わせを有する化合物における該ベンゼン環の酸化電位の変化と、それらの化合物の蛍光量子収率を示した。ｐＨ１３の曲線は脱プロトン化された化合物の酸化電位と蛍光量子収率との関係、ｐＨ３．４の場合はプロトン化された化合物の酸化電位と蛍光量子収率との結果を示している。
該ヒドロキシル基にプロトンが存在する化合物と、Ｒ５が例えばアルキル基などの化合物とを比較した場合、該ベンゼン環部分の酸化電位は実質的に同一であることが実験的に確認されており、Ｒ５の切断が生じる前の化合物における該ベンゼン環の酸化電位は、一般式（Ｉ）で表される化合物においてＲ５が水素原子である化合物をｐＨ３．４の酸性条件下に置いた場合の該ベンゼン環の酸化電位で代用することができる。従って、該ベンゼン環の酸化電位を指標としてＲ１及びＲ２の好ましい組み合わせを選択するためには、例えば第１図を参照しつつ、一般式（Ｉ）で表される化合物においてＲ５が水素原子である化合物について、ｐＨ３．４における蛍光量子収率とｐＨ１３における蛍光量子収率との差が最大になるように選択すればよい。より具体的には、第１図において、該ベンゼン環の酸化電位が１．５５Ｖ〜１．７５ＶになるようにＲ１及びＲ２の組み合わせを選ぶことが好ましく、該ベンゼン環の酸化電位が１．６０Ｖ〜１．７０Ｖの範囲となるようにＲ１及びＲ２の組み合わせを選ぶことがより好ましい。最も好ましいのは、該ベンゼン環の酸化電位が１．６５Ｖ程度となるようにＲ１及びＲ２の組み合わせを選ぶことである。なお、Ｒ１及びＲ２が結合するベンゼン環上にＲ１及びＲ２以外の１又は２以上の置換基が存在する場合には、Ｒ１及びＲ２並びにそ（れら）の置換基を全て含めた状態で該ベンゼン環の酸化電位を上記の範囲となるように選択することが好ましい。
いかなる特定の理論に拘泥するわけではないが、本発明者らが見出した上記の知見はＰＥＴ（Ｐｈｏｔｏｉｎｄｕｃｅｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒ：光誘起電子移動）により説明できる。ＰＥＴとは蛍光消光の１つの方法であり、励起光照射により生成する１重項励起蛍光団が蛍光を発して基底状態に戻る速度よりも速く、近隣の電子供与部位（ＰＥＴドナー）から電子移動が起き、蛍光消光が起こるというものである。式（Ｉ）で表される化合物について、蛍光団として作用するキサンテン環部位と、蛍光を消光する部位であるベンゼン環部位（ＰＥＴドナー）とに分割して考えると、ベンゼン環側の酸化電位が低い（すなわち電子密度が高く、ＨＯＭＯエネルギーが高い）とＰＥＴによりキサンテン環由来の蛍光が消光する。
蛍光プローブとしては、測定対象物質によるＲ５の切断前には実質的に蛍光がなく、測定対象物質によるＲ５の切断後には実質的に強い蛍光性物質に変化する性質を有することが求められるので、蛍光強度の変化が大きいものを好適なプローブとして選択することが望ましい。例えば、測定対象物質によるＲ５の切断前にはＰＥＴにより蛍光が消失しており、測定対象物質によるＲ５の切断後には実質的にＰＥＴが生じないようにプローブを設計することができる。本発明の蛍光プローブ設計法では、ベンゼン環側の酸化電位を固定しておき、Ｒ５の切断の前後でキサンテン環に生じる還元電位の変化を利用して、Ｒ５の切断の前にはＰＥＴにより蛍光が消光しており、切断の後にはＰＥＴに障害が生じて切断後の化合物が強い蛍光を発するように蛍光プローブを設計することができる。
本明細書において用いられる「測定」という用語は、定量、定性、又は診断などの目的で行われる測定、検査、検出などを含めて、最も広義に解釈しなければならない。本発明の蛍光プローブを用いた測定対象物の測定方法は、一般的には、（ａ）上記式（Ｉ）で表される化合物と測定対象物質とを接触させてＲ５を切断させる工程、及び（ｂ）上記工程（ａ）で生成した化合物（Ｒ５が切断された化合物に相当する）の蛍光を測定する工程を含んでいる。例えば、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、又はエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに本発明の蛍光プローブ又はその塩を溶解し、細胞や組織を含む適切な緩衝液中にこの溶液を添加して、蛍光スペクトルを測定すればよい。
測定対象物質によりＲ５が切断された後の化合物の蛍光の測定は通常の方法で行うことができ、インビトロで蛍光スペクトルを測定する方法や、バイオイメージングの手法を用いてインビボで蛍光スペクトルを測定する方法などを採用することができる。例えば、定量を行う場合には、常法に従って予め検量線を作成しておくことが望ましい。
本発明の蛍光プローブとしては、上記式（Ｉ）で表される化合物のほか、その塩を用いてもよい。塩の種類は特に限定されないが、例えば、酸付加塩としては塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩などを挙げることができ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。これらのほか、グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。必要に応じて、試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合して組成物として用いてもよい。例えば、生理的環境で試薬を用いるための添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供される。
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１：化合物の合成
下記の化合物を合成した。これらの化合物は化合物Ｎｏ．が大きくなるほどキサンテン環の９−位に結合するベンゼン環の酸化電位が低くなる（すなわち電子密度が高くなる、換言すればＨＯＭＯ軌動エネルギーが高くなる）ように設計した。また、無置換ベンゼン体及び化合物１の合成スキームを以下に示した（スキーム中、Ｍｅはメチル基を示す）。
キサントンをＰｒｏｃ．Ｉｎｄｉａｎ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｓｅｃｔ．Ａ．，５７，２８０（１９６３）に記載された方法で合成し、得られたキサントンをジ（ｔｅｒｔ−ブチルジメチリシリル）保護体（キサントン−ＴＢＤＭＳ）とした（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１４，８１７１（１９８９））。よく乾燥させた容器にＭｇ １０９ｍｇ（４．５０ｍｍｏｌ）を入れ、真空ポンプで減圧にしながら２５０℃で１８０分間加熱攪拌した。放冷後、アルゴン置換にかえ、２−ブロモトルエン７７ｍｇ（０．４５ｍｍｏｌ）を蒸留したＴＨＦ ２ｍｌに溶解して加え、６０℃まで徐々に加熱した。反応液が暗緑色に変化したのを確認して氷冷した。キサントン−ＴＢＤＭＳ １３７ｍｇ（０．３００ｍｍｏｌ）を蒸留したＴＨＦ ２ｍｌに溶解して加え、１０分間攪拌した。反応液に２Ｎ ＨＣｌ水溶液１０ｍｌを加えて攪拌すると黄色固体が析出した。この固体を濾取した後、少量のＴＨＦで洗浄して乾燥し黄色固体を得た（８７ｍｇ，収率９６％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ２．００（３Ｈ，ｓ），７．０１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１５Ｈｚ），７．１０（２Ｈ，ｓ），７．２１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１５Ｈｚ），７．３１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．１４Ｈｚ），７．５２（３Ｈ，ｍ）
ＭＳ（Ｅｌ）３０２（Ｍ＋）
同様にして化合物２〜化合物８を得た。
化合物２
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １．９７（３Ｈ，ｓ），２．４２（３Ｈ，ｓ），７．０１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１５Ｈｚ），７．１０（２Ｈ，ｓ），７．２１（４Ｈ，ｍ），７．３４（１Ｈ，ｓ）
ＭＳ（Ｅｌ）３１６（Ｍ＋）
化合物３
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １．９５（３Ｈ，ｓ），２．３５（３Ｈ，ｓ），６．９９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１５Ｈｚ），７．０５（２Ｈ，ｓ），７．１２（１Ｈ，ｓ），７．２１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１５Ｈｚ），７．３９（２Ｈ，ｍ）
ＭＳ（Ｅｌ）３１６（Ｍ＋）
化合物４
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ３．７０（３Ｈ，ｓ），７．０２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２０Ｈｚ），７．０８（２Ｈ，ｓ），７．２３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５０Ｈｚ），７．３４（４Ｈ，ｍ），７．６８（１Ｈ，ｍ）
ＭＳ（Ｅｌ）３１８（Ｍ＋）
化合物５
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １．９８（３Ｈ，ｓ），３．８６（３Ｈ，ｓ），６．９６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１５Ｈｚ），７．０３（３Ｈ，ｍ），７．１０（１Ｈ，ｓ），７．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２２Ｈｚ），７．２８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１５Ｈｚ）
ＭＳ（Ｅｌ）３３２（Ｍ＋）
化合物６
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ２．３３（３Ｈ，ｓ），３．６６（３Ｈ，ｓ），７．０７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１５Ｈｚ），７．１４（３Ｈ，ｍ），７．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８８Ｈｚ），７．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１５Ｈｚ），７．４８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８８Ｈｚ）
ＭＳ（Ｅｌ）３３２（Ｍ＋）
化合物７
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ３．７０（３Ｈ，ｓ），３．９１（３Ｈ，ｓ），６．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４３Ｈｚ），６．８９（１Ｈ，ｓ），７．０６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３６Ｈｚ），７．１２（２Ｈ，ｓ），７．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４３Ｈｚ），７．４７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３６Ｈｚ）
ＭＳ（Ｅｌ）３４８（Ｍ＋）
化合物８
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ３．６４（３Ｈ，ｓ），３．７６（３Ｈ，ｓ），６．９６（１Ｈ，ｓ），７．０４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１５Ｈｚ），７．１０（２Ｈ，ｓ），７．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１５Ｈｚ），７．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１５Ｈｚ），７．２３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１５Ｈｚ）
ＭＳ（Ｅｌ）３４８（Ｍ＋）
例２
上記で合成した各化合物の蛍光量子収率とベンゼン環部の酸化電位との関係を調べた。結果を表１及び第１図に示す。図に示した結果から明らかなように、各化合物の蛍光量子収率はベンゼン環部の酸化電位に依存して変化した。ｐＨ１３のアルカリ水溶液中ではキサンテン環のＯＨ基のプロトンは脱離してアニオンになっており、この条件では酸化電位が１．２０Ｖ以下ではほぼ無蛍光となり、１．６５Ｖ以上では量子収率がほぼ１に近い蛍光を有していた。その間は酸化電位が低下するに従って量子収率の減少が見られた。ｐＨ３．４の酸性条件下では、塩基性条件下に比べ蛍光の変化するベンゼン環の酸化電位が変化した。すなわち、酸化電位が１．６０Ｖ以下ではほぼ無蛍光であり、１．９０Ｖ以上では量子収率がほぼ０．３の蛍光を発した。なお、ｐＨ３．４ではキサンテン環のＯＨ基はプロトネートしており、この条件下でのフルオレセインの量子収率はほぼ０．３位であることが知られている。
ａ）０．１Ｎ ＮａＯＨ水溶液中で測定した。
ｂ）データは０．１Ｍ過塩素酸テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＰ）を含むアセトニトリル中で測定した。
ｃ）データはＧａｕｓｓｉａｎ ９８Ｗを用いてＢ３ＬＹＰ／６−３１Ｇ（ｄ）／／Ｂ３ＬＹＰ／６−３１Ｇ（ｄ）により得た。
ｄ）測定せず。
例３
一般に化合物の酸化電位は量子化学計算により予測可能である。そこで、上記化合物のベンゼン環部位のＨＯＭＯエネルギーを密度汎関数法（Ｂ３ＬＹＰ／６−３１Ｇ（ｄ））により求め、これと蛍光量子収率との関係をプロットした。その結果、例２で酸化電位を指標として得られた結果とほぼ同様の関係が得られた（第２図）。この結果から、これらの化合物の蛍光特性は量子化学計算から定量的に予想可能であることが示された。この知見に基づいて、本発明の合理的な蛍光プローブ設計方法を実施することができる。
例４
ＰＥＴ（Ｐｈｏｔｏｉｎｄｕｃｅｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒ：光誘起電子移動）とは蛍光消光の１つの方法であり、励起光照射により生成する１重項励起蛍光団が蛍光を発して基底状態に戻る速度よりも速く、近隣の電子供与部位（ＰＥＴドナー）から電子移動が起き、蛍光消光が起こるというものである。本発明の化合物を蛍光団であるキサンテン部位と、蛍光を消光する部位であるベンゼン環部（ＰＥＴドナー）に分割して考えた場合、ベンゼン環の酸化電位が低い（すなわち電子密度が高い、換言すればＨＯＭＯエネルギーが高い）とＰＥＴによりキサンテン由来の蛍光が消光する。実際、両部位はフルオレセインのＸ線結晶解析からほぼ直交していることが明らかになっており、また化合物１〜８では励起・蛍光波長がほぼ同じであることから、本発明の化合物を２つの部位に分割して考察する仮説は妥当性が高い。ＰＥＴの概念図及びフルオレセインを２つの部位に分割した概念図を第３図に示した。
蛍光プローブは、測定対象物質によりＲ５が切断されていない場合には蛍光が無く、測定対象物質によりＲ５が切断されて初めて蛍光を発する機能を持つ分子である。すなわち、前者の状態ではＰＥＴにより蛍光が消光しており、後者の状態ではＰＥＴが起こらなくなる蛍光プローブを設計することにより、理想的な蛍光プローブが得られる。ベンゼン環部がどの程度の酸化電位を持てば蛍光プローブとして望ましい性質を有するかは、例えば例２に示した実験で容易に明らかにすることが可能であり、また新規の蛍光団に対してもその還元電位を測定することで容易に予想可能である。本発明の化合物では、ＰＥＴドナー部として作用するベンゼン環部位の酸化電位は変化せず、キサンテン環部位の還元電位がＲ５の切断により変化してＰＥＴを障害し、その結果としてＲ５が切断された化合物から蛍光が発せられる。この際、ＰＥＴドナー部の酸化電位は量子化学計算から予想可能である。以上のステップにより、目的とする蛍光プローブを一切の合成無しに設計することが可能となる。
例５：β−ガラクトシダーゼ蛍光プローブの製造
よく乾燥した容器に無水ジメチルホルムアミド（０．５ｍｌ）、化合物５１０ｍｇ（３０μｍｏｌ）、Ｃｓ２ＣＯ３１００ｍｇ（３００μｍｏｌ）、２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシルブロミド１００ｍｇ（２５０μｍｏｌ）を加えた。アルゴン置換し、撹拌しつつ室温にて終夜反応させた。沈殿物を濾去し、母液を減圧濃縮した。得られた残渣を精製水に溶解しジクロロメタンで３回抽出し、有機相を飽和食塩水で洗浄して無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去して黄色粉末を得た。溶出溶媒としてジクロロメタン−メタノール（１００：３）を用い、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し化合物９のオレンジ色粉末を得た（１１．３ｍｇ，５７％）。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ ７．１５−６．３８（ｍ，９Ｈ），５．５２（ｍ，２Ｈ），５．１８−５．１２（ｍ，２Ｈ），４．２５−４．１２（ｍ，３Ｈ），３．９２（ｓ，３Ｈ），３．７０（ｓ，３Ｈ），２．１９（ｓ，３Ｈ），２．１３（ｓ，３Ｈ），２．０７（ｓ，３Ｈ），２．０３（ｓ，３Ｈ）
ＥＩ−ＭＳ：Ｍ＋＝６７８
例６：β−ガラクトシダーゼ蛍光プローブを用いたβ−ガラクトシダーゼの測定
例５で得た化合物９（テトラアセテート体）を無水ジメチルスルホキシドに溶解し１００ｍＭストック溶液を調製した。この溶液を２Ｍナトリウムメトキシドで０℃、一時間処理して糖部分の４つのアセチル基を加水分解した化合物（以下、この化合物を「本発明蛍光プローブＡ」と呼ぶ。）を得た。その後に目的の濃度になるようバッファーで希釈して反応を停止した。インビトロでのβ−ガラクトシダーゼとの反応では、本発明蛍光プローブＡの最終濃度が１μＭとなるように調整し、バッファーとして１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）を用い、最終的に１４．３ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．００１％ジメチルスルホキシド、０．０１％メタノール、６Ｕ β−ガラクトシダーゼを含む溶液３ｍｌを調製して１ｃｍキュベットの中で３７℃にて反応を行った。蛍光強度変化は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＬＳ−５０Ｂ蛍光スペクトル測定装置を用いて観測した。β−ガラクトシダーゼ（分子量５４０，０００，ＥＣ３．２．１．２３）はシグマ−アルドリッチより購入した。生細胞でのアッセイでは本発明蛍光プローブＡの最終濃度が１０μＭとなるように調整し、バッファーとして生理食塩水（ｐＨ７．４；１５０ｍＭ ＮａＣｌ，４ｍＭ ＫＣｌ，２ｍＭ ＣａＣｌ２，１ｍＭ ＭｇＣｌ２，５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，０．１％グルコース；以下ＰＳＳと略す）を用いて調製した溶液を用いた。ＧＰ２９３細胞にＬＮＣＸ２−ｌａｃＺを導入したもの（ｌａｃＺ陽性細胞）をコラーゲンタイプ１でコートした２４ウェルマイクロプレートに播種し、ウェルをＰＳＳで２回洗浄した後、上記の本発明蛍光プローブＡの溶液を加えて３０分間室温でインキュベーションした。ベクターを導入してないＧＰ２９３細胞（ｌａｃＺ陰性細胞）を陰性対照として用いた。蛍光イメージング像は、カメラとしてＤＣ３００Ｆカメラ（ライカ）、対物レンズとしてＵＰｌａｎＦｌ １０ｘ／０．３１対物レンズ（オリンパス光学）を取り付けたＩＸ７０倒立顕微鏡（オリンパス光学）を用い、励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長５１０−５５０ｎｍの条件で撮像した。
本発明蛍光プローブＡはβ−ガラクトシダーゼにより糖部分が容易に切断され、実質的に無蛍光の状態（蛍光量子収率＝０．００９）から強い蛍光性化合物（蛍光量子収率＝０．８４）に変化した。第４図にβ−ガラクトシダーゼ添加後の蛍光の経時変化を示す。比較化合物として公知のフルオレセイン−ジ−Ｏ−ガラクトシド（ＦＤＧ）を用いた。本発明蛍光プローブＡはＦＤＧに比べて反応速度が速く、短時間で高い蛍光強度を与えた。この結果から、本発明蛍光プローブＡにより、β−ガラクトシダーゼ活性を高感度に測定できることがわかる。生細胞を用いた試験結果を第５図に示す。ｌａｃＺ陽性細胞の場合のみに蛍光が認められ、本発明蛍光プローブＡを用いて細胞中のβ−ガラクトシダーゼを高感度に測定できることがわかる。また、本発明蛍光プローブＡは、生理的条件下で細胞膜を透過して容易に細胞内に到達していることも示された。
例７：アルカリフォスファターゼ蛍光プローブの製造
よく乾燥した容器に無水クロロホルム４ｍｌ、化合物５１５．７ｍｇ（４７μｍｏｌ），トリエチルアミン１６．４μｌ（１１８μｍｏｌ），クロロりん酸ジエチル６．８μｌ（４７μｍｏｌ）を加えた。アルゴン置換し、撹拌しつつ室温にて一晩反応させた。反応溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムにて精製（溶出溶媒；ジクロロメタン−メタノール（１００：３））し、化合物１０（２６．２ｍｇ、定量的、オレンジ色粉末）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ １．３９（ｍ，６Ｈ），２．０５（ｓ，３Ｈ），３．８９（ｓ，３Ｈ），４．２７（ｍ，４Ｈ），６．４５（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），６．５８（ｄｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，２．０Ｈｚ），６．８６−７．３５（ｍ，７Ｈ）
ＨＲ−ＭＳ［ＥＳＩ−ＭＳ］：［Ｍ＋Ｈ］＋ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ３６９．１４１６１，ｆｏｕｎｄ ３６９．１３８１０
よく乾燥した容器に無水ジクロロメタン１ｍｌ、化合物１０ ２６．０ｍｇ（５６μｍｏｌ）、ヨードトリメチルシラン１９．７μｌ（１４０μｍｏｌ）を加えた。アルゴン置換し、撹拌しつつ室温にて一時間反応させた。反応溶媒を留去し、得られた残渣を逆相プレパラティブＴＬＣ ＲＰ１８Ｗにて精製（展開溶媒；アセトニトリル／水（１：１））し、化合物１１（ＴＧ−Ｐｈｏｓ）（１．６ｍｇ、収率５．６％、オレンジ色粉末）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＣＤ３ＯＤ）δ ２．０２（ｓ，３Ｈ，ａ），３．９０（ｓ，３Ｈ，ｃ），６．４８（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，ｉ），６．６０（ｄｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，２．０Ｈｚ，ｊ），６．９６−７．７１（ｍ，７Ｈ，ｂ，ｄ，ｅ，ｆ，ｇ，ｈ，ｋ）
ＨＲ−ＭＳ［ＥＳＩ−ＭＳ］：［Ｍ＋Ｎａ］＋ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ４１１．０６３３６，ｆｏｕｎｄ ４１１．０５９３５
Φｆ１（１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ７．４）＝０．０２９
例８：イン・ビトロ アルカリフォスファターゼ蛍光アッセイ
化合物１１を脱水メタノールに溶解し１ｍＭのストック溶液を作製した。その後１μＭになるようにアッセイバッファーに希釈した（アッセイバッファー：０．１Ｍトリス−塩酸バッファー，ｐＨ７．４，０．５ｍＭ塩化マグネシウム，０．１％メタノール）。この希釈液３ｍｌを１ｃｍキュベットに移し、３７℃にてアルカリフォスファターゼ（０．０８ｕｎｉｔｓ／蛍光測定開始後５分に添加）による蛍光強度変化を測定した（第６図）。測定には、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＬＳ−５０Ｂ蛍光スペクトル測定装置を用い励起波長４９１ｎｍ、５１０ｎｍでの蛍光強度変化の経時変化を観察した。アルカリフォスファターゼ（分子量１６０ｋＤａ，ＥＣ ３．１．３．１）は、シグマ−アルドリッチより購入した。第７図には、ＴＧ−Ｐｈｏｓのアルカリフォスファターゼによる反応前後の蛍光スペクトル変化（ａ）及び吸収スペクトル（ｂ）変化を示した。
例９：細胞内滞留型β−ガラクトシダーゼ蛍光プローブの製造
よく乾燥した容器に無水ジメチルホルムアミド１０ｍｌ、４−ブロモ−３−メチルフェノール２ｇ（１０．７ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロライド（ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ）４．８ｇ（３０ｍｍｏｌ）、イミダゾール３．６ｇ（５０ｍｍｏｌ）を加えた。アルゴン置換し、室温にて三時間攪拌後、溶媒を真空ポンプにて留去した。得られた残渣を精製水に溶解しジクロロメタンで三回振りとり、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ジクロロメタンを留去して、化合物１２（３．０４ｇ、収率９４．７％、無色透明液体）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ ７．３３（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），６．７２（ｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，１Ｈ），６．５３（ｄｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２．９Ｈｚ，１Ｈ），２．３２（ｓ，３Ｈ），０．９７（ｓ，９Ｈ），０．１８（ｓ，６Ｈ）
ＥＩ−ＭＳ：Ｍ＋＝ＦＡＢ−ＭＳ；［Ｍ］＋＝３００，３０２
化合物１２１．２８ｇ（４．２７ｍｍｏｌ）を蒸留したテトラヒドロフラン１０ｍｌに溶解し、よく乾燥させアルゴン置換した二頚コルベンにシリンジで加えた。反応液をドライアイス−アセトンで−７８℃に保ち、ｔｅｒｔ−ブチルリチウムｎ−ペンタン溶液４．５ｍｌ（６．５７ｍｍｏｌ）をシリンジで少量ずつ加えた。３０分間攪拌後、蒸留したテトラヒドロフラン２０ｍｌに溶解した３，６−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）キサントン１．０７ｇ（２．３７ｍｍｏｌ）をシリンジで少量ずつ加えた。−７８℃のまま３０分間攪拌後、２Ｎ塩酸で中和し、析出した赤色物質をろ取した。ろ取した物質をシリカゲルカラムにて精製（溶出溶媒；ジクロロメタン−メタノール（１００：３−１００：５））し、化合物１３（７７４．６ｍｇ、収率８２％、オレンジ色粉末）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＣＤ３ＯＤ）δ ７．２７（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），７．１５（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．０１−６．８６（ｍ，６Ｈ），２．０１（ｓ，３Ｈ），１．０６（ｓ，９Ｈ），０．３１（ｓ，６Ｈ）
ＦＡＢ−ＭＳ；［Ｍ＋１］＋＝４３３
蒸留したテトラヒドロフラン２００ｍｌに化合物１３２．６２ｇ（６．２ｍｍｏｌ）を溶解し、フッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）の１Ｍテトラヒドロフラン溶液６．２ｍｌ（６．２ｍｍｏｌ）を加えた。アルゴン置換し、室温にて二時間攪拌後、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムにて精製（溶出溶媒；ジクロロメタン−メタノール（１００：５−１００：７））し、化合物１４（１．１３ｇ、収率５７．７％、オレンジ色粉末）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＣＤ３ＯＤ）δ ７．０６（ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，２Ｈ），６．９４（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．７８（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．７４（ｄｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．６３（ｄｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，２．０Ｈｚ，２Ｈ），６．６３（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，２Ｈ），１．８８（ｓ，３Ｈ）
ＨＲ−ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ３１９．０９７０３，ｆｏｕｎｄ ３１９．０９６５２．
よく乾燥した容器に無水ジメチルホルムアミド１ｍｌ、化合物１４ ６０ｍｇ（０．１８ｍｍｏｌ）、ブロモ酢酸メチル１７μｌ（０．１８ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム４００ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）を加えた。アルゴン置換し、撹拌しつつ室温にて一晩反応させた。沈殿物を桐山ロートにて除去し、母液を真空ポンプにて留去した。得られた残渣を精製水に溶解しジクロロメタンで三回振りとり、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ジクロロメタンを留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムにて精製（溶出溶媒；ジクロロメタン−メタノール（１００：５））し、化合物１５（４１．７ｍｇ、収率５６．９％、赤色粉末）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ ７．１０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．０８（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），６．９５（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ），６．８９（ｄｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２．５Ｈｚ，１Ｈ），６．８４（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，２Ｈ），６．８０（ｄｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２．０Ｈｚ，２Ｈ），４．７３（ｓ，２Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ），２．０３（ｓ，３Ｈ）
ＦＡＢ−ＭＳ：Ｍ＋１＝３９１
Φｆ１（１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ９．０）＝０．８７
よく乾燥した容器に無水ジメチルホルムアミド０．５ｍｌ、化合物１５ ３９ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム２００ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）、２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルブロミド１００ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）を加えた。アルゴン置換し、撹拌しつつ室温にて一晩反応させた。沈殿物を桐山ロートにて除去し、母液を真空ポンプにて留去した。得られた残渣を精製水に溶解しジクロロメタンで三回振りとり、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ジクロロメタンを留去した。残渣をシリカゲルカラムにて精製（溶出溶媒；ジクロロメタン−メタノール（１００：３））し、化合物１６（２−Ｍｅ ４−ＯＣＨ２ＣＯＯＭｅ ＴＧ−β Ｇａｌ）（４１．８ｍｇ、収率５８．１％、オレンジ色粉末）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ ７．１０−６．８０（ｍ，７Ｈ），６．５７（ｄｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，１．９Ｈｚ，１Ｈ），６．４０（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，１Ｈ），５．５７−５．４８（ｍ，２Ｈ），５．１８−５．１２（ｍ，２Ｈ），４．７３（ｓ，２Ｈ），４．２２−４．１６（ｍ，３Ｈ），３．８７（ｓ，３Ｈ），２．１９，２．１３，２．０７，２．０３（ｓ，３Ｈ×４），２．０５（ｓ，３Ｈ）
ＨＲ−ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋Ｎａ］＋ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ７４３．１９５１９，ｆｏｕｎｄ ７４３．１９３０９．
Φｆ１（１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ７．４）＝０．０６９
よく乾燥した容器に無水ジメチルホルムアミド（１ｍｌ）、化合物１４ ６３．８ｍｇ（０．２０ｍｍｏｌ）、５−ブロモ吉草酸メチル２１μｌ（０．１８ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム４００ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）を加えた。アルゴン置換し、撹拌しつつ室温にて一晩反応させた。沈殿物を桐山ロートにて除去し、母液を真空ポンプにて留去した。得られた残渣を精製水に溶解しジクロロメタンで三回振りとり、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ジクロロメタンを留去した。残渣をシリカゲルカラムにて精製（溶出溶媒；ジクロロメタン−メタノール（１００：５））し、化合物１７（５３．７ｍｇ、収率６１．９％、赤色粉末）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ ７．１０（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），７．０７（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），６．９１−６．８４（ｍ，４Ｈ），６．８１（ｄｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２．０Ｈｚ，２Ｈ），４．０６（ｍ，２Ｈ），３．７０（ｓ，３Ｈ），２．４５（ｍ，２Ｈ），２．０２（ｓ，３Ｈ），１．８８（ｍ，４Ｈ）
ＨＲ−ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋Ｎａ］＋ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ４５５．１４７０６，ｆｏｕｎｄ ４５５．１４６９２．
Φｆ１（１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ９．０）＝０．８２
よく乾燥した容器に無水ジメチルホルムアミド０．５ｍｌ、化合物１７ １８．２ｍｇ（４２μｍｏｌ）、炭酸セシウム２５０ｍｇ（０．７７ｍｍｏｌ）、２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルブロミド１００ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）を加えた。アルゴン置換し、撹拌しつつ室温にて一晩反応させた。沈殿物を桐山ロートにて除去し、母液を真空ポンプにて留去した。得られた残渣を精製水に溶解しジクロロメタンで三回振りとり、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ジクロロメタンを留去した。残渣をシリカゲルカラムにて精製（溶出溶媒；酢酸エチル）し、化合物１８（２５ｍｇ、収率７８％、オレンジ色粉末）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ ７．０８−６．８０（ｍ，７Ｈ），６．５７（ｄｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，２．０Ｈｚ，１Ｈ），６．３９（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），５．５６−５．４８（ｍ，２Ｈ），５，１８−５．１２（ｍ，２Ｈ），４．２２−４．１１（ｍ，３Ｈ），４．０６（ｍ，２Ｈ），３．７０（ｓ，３Ｈ），２．１９，２．１３，２．０７，２．０３（ｓ，３Ｈ×４），１．８８（ｍ，４Ｈ）
ＨＲ−ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋Ｎａ］＋ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ７８５．２４２１４，ｆｏｕｎｄ ７８５．２３７２９．
Φｆ１（１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ７．４）＝０．００５
化合物１８ ３７．７ｍｇ（０．０４９ｍｍｏｌ）を２ｍｌのメタノール／水（３：１）溶液に溶解し、２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液１ｍｌ（２ｍｍｏｌ）を加えた。０℃にて３０分間攪拌後、アンバーライトＩＲ−１２０（Ｈ＋）にて反応液を中和し溶媒を留去した。得られた残渣を、展開溶媒をアセトニトリル／水（１：１）として逆相のプレパラティブＴＬＣ（ＲＰ１８Ｗ）にて精製し、化合物１９（２−Ｍｅ ４−Ｏ（ＣＨ２）４ＣＯＯＨ ＴＧ−β Ｇａｌ）（１５．１ｍｇ、収率５３％、オレンジ色粉末）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＣＤ３ＯＤ）δ ７．２６（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．１１（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．０８（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ），７．０３（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．０２（ｄｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２．２Ｈｚ，１Ｈ），６．９４（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ），６．８９（ｄｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２．３Ｈｚ，１Ｈ），６．５３（ｄｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，２．０Ｈｚ，１Ｈ），６．３７（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），４．０１（ｍ，２Ｈ），５．００（ｄｄ，７．７Ｈｚ，２．６Ｈｚ，１Ｈ），３．８３（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，１Ｈ），３．８２−３．６４（ｍ，４Ｈ），３．５３（ｄｄ，９．７Ｈｚ，３．３Ｈｚ，１Ｈ），２．１７（ｍ，２Ｈ），１．９３（ｓ，３Ｈ），１．７４（ｍ，４Ｈ）
ＨＲ−ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋Ｎａ］＋ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ６０３．１８４２３，ｆｏｕｎｄ ６０３．１８２４２．
化合物１９（２−Ｍｅ ４−Ｏ（ＣＨ２）４ＣＯＯＨ ＴＧ−β Ｇａｌ）１０ｍｇ（１７．２μｍｏｌ）をメタノール／アセトニトリル（１ｍｌ／２ｍｌ）に溶解し、そこへアセトニトリル２ｍｌに溶解した酢酸ブロモメチル（ＡＭＢｒ）６８．５μｌ（６９０μｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）２２．３μｌ（１３０μｍｏｌ）を加えた。アルゴン置換し、室温にて１０時間攪拌後、溶媒を留去した。残渣を、展開溶媒をアセトニトリル／水（１：１）として逆相プレパラティブＴＬＣ（ＲＰ１８Ｗ）にて精製し、化合物２０（２−Ｍｅ ４−Ｏ（ＣＨ２）４ＣＯＯＡＭ ＴＧ−β Ｇａｌ）（１０．９ｍｇ、収率９７％、オレンジ色粉末）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＣＤ３ＯＤ）δ ７．２８（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．１３−６．８８（ｍ，６Ｈ），６．５３（ｄｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，２．０Ｈｚ，１Ｈ），６．３８（ｄｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），５．６５（ｓ，２Ｈ），４．０２（ｍ，２Ｈ），５．０１（ｄｄ，８．１Ｈｚ，２．８Ｈｚ，１Ｈ），３．８３（ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ，１Ｈ），３．７９−３．６５（ｍ，４Ｈ），３．５３（ｄｄ，９．５Ｈｚ，３．６Ｈｚ，１Ｈ），２．４２（ｍ，２Ｈ），１．９９（ｓ，３Ｈ），１．９４（ｓ，３Ｈ），１．７８（ｍ，４Ｈ）
ＨＲ−ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋Ｎａ］＋ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ６７５．２０５３６，ｆｏｕｎｄ ６７５．２０３５９
Φｆ１（１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ９．０）＝０．００８
例１０：イン・ビトロ β−ガラクトシダーゼ蛍光アッセイ
２−Ｍｅ ４−Ｏ（ＣＨ２）４ＣＯＯＡＭ ＴＧ−β Ｇａｌを無水ジメチルスルホキシドに溶解し１０ｍＭストック溶液を作製した。その後１μＭになるようアッセイバッファーに希釈した（アッセイバッファー：０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ７．４，１４．３ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．０１％ジメチルスルホキシド）。３ｍｌを１ｃｍキュベットに移し、３７℃にてβ−ガラクトシダーゼ（６ｕｎｉｔｓ／蛍光測定開始後５分に添加）による蛍光強度変化を測定した（第８図及び第９図）。測定には、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＬＳ−５０Ｂ蛍光スペクトル測定装置を用い励起波長４９２ｎｍ、５０９ｎｍでの蛍光強度変化の経時変化を観察した。β−ガラクトシダーゼ（分子量５４０，０００，ＥＣ ３．２．１．２３）はシグマ−アルドリッチより購入した。
例１１：生細胞系でのβ−ガラクトシダーゼ蛍光アッセイ
生細胞でのアッセイは２−Ｍｅ ４−Ｏ（ＣＨ２）４ＣＯＯＡＭ ＴＧ−β Ｇａｌの最終濃度が約１０μＭになるように生理食塩水ｐＨ７．４（１５０ｍＭ ＮａＣｌ，４ｍＭ ＫＣｌ，２ｍＭ ＣａＣｌ２，１ｍ ＭｇＣｌ２，５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，０．１％グルコース；以下ＰＳＳと略す）に調整した。ＧＰ２９３細胞にＬＮＣＸ２−ｌａｃＺを導入したもの（ｌａｃＺ陽性細胞）をコラーゲンタイプ１でコートした２４ウェルマイクロプレートに播種し、ウェルをＰＳＳで２回洗浄した後上記２−Ｍｅ ４−Ｏ（ＣＨ２）４ＣＯＯＡＭ ＴＧ−β Ｇａｌ溶液をロードし、３０分間室温でインキュベーションした。ベクターを導入してないＧＰ２９３細胞（ｌａｃＺ陰性細胞）を陰性対照として用いた。蛍光イメージング像は、対物レンズとしてＵＡｐｏ／３４０ ４０ｘ／１．３５対物レンズ（オリンパス光学）を取り付けたＩＸ７１倒立顕微鏡（オリンパス光学）を用い、励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長５１０−５５０ｎｍの条件で撮像した。結果を第１０図に示す。図中、ＧＰ２９３細胞内部に蛍光が観察され、ＧＰ２９３細胞内部においてβ−ガラクトシダーゼが発現している結果を示す。
例１２：β−ラクタマーゼ蛍光プローブの製造
よく乾燥した容器に無水ジメチルホルムアミド８ｍｌ、化合物５ １２２．４ｍｇ（０．４ｍｍｏｌ）、２−ブロモ−１，１−ジメトキシエタン４００μｌ（４ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム１８０ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）を加えた。アルゴン置換し、１１５℃にて一晩攪拌した。炭酸セシウムを桐山漏斗で濾過後、溶媒を真空ポンプにて留去した。得られた残渣を精製水に溶解しジクロロメタンで三回振りとり、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ジクロロメタンを留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムにて精製（溶出溶媒；ジクロロメタン−メタノール（１００：４））し、化合物２１（７８．３ｍｇ、収率５０．６％、オレンジ色粉末）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ ２．０４（ｓ，３Ｈ），３．４８（ｓ，６Ｈ），３．８９（ｓ，３Ｈ），４．１１（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，２Ｈ），４．７６（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），６．４３（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），６．５７（ｄｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，２．０Ｈｚ，１Ｈ），６．４３−７．１４（ｍ，７Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ １９．９１，５４．３４，５５．２９，６８．１３，１０１．０７，１０１．７１，１０５．６６，１１１．５０，１１３．５４，１１５．０２，１１５．９６，１１８．７９，１２４．４８，１２９．５３，１２９．９８，１３０．３１，１３０．６６，１３７．７９，１４９．４４，１５４．４１，１５８．８９，１６０．３２，１６２．９３，１８５．７４
ＨＲ−ＭＳ［ＥＳＩ−ＭＳ］：［Ｍ＋Ｎａ］＋ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ４４３．１４７０６，ｆｏｕｎｄ ４４３．１４７９４
よく乾燥した容器に蒸留したテトラヒドロフラン８ｍｌ、化合物２１ ５０ｍｇ（１２０μｍｏｌ）を加えた。氷浴にて０℃に保ち濃塩酸４ｍｌをゆっくり加え、アルゴン雰囲気下、一晩攪拌した。溶媒を留去し、ジクロロメタンで三回振りとり、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ジクロロメタンを留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムにて精製（溶出溶媒；ジクロロメタン−メタノール（１００：４））し、化合物２２（４０．７ｍｇ、収率９０％、オレンジ色液体）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＣＤ３ＯＤ）δ ２．０１（ｓ，３Ｈ），３．８８（ｓ，３Ｈ），４．０７（ｄｄ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ，４．９５Ｈｚ，１Ｈ），４．１３（ｄｄ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ，４．９５Ｈｚ，１Ｈ），４．９０（ｔ，Ｊ＝４．９５Ｈｚ，１Ｈ），６．４５（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，
ＨＲ−ＭＳ［ＥＳＩ−ＭＳ］：［Ｍ＋Ｈ］＋ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ３７５．１２３２５，ｆｏｕｎｄ ３７５．１１５４７
よく乾燥した容器に蒸留したアセトン２０ｍｌ、７−フェニルアセタミド−３−クロロメチル−セファロスポラン酸ｐ−メトキシベンジルエステル４９０ｍｇ（１ｍｍｏｌ）、ヨウ化ナトリウム７５０ｍｇ（５ｍｍｏｌ）を加えた。アルゴン置換し、室温で一時間半攪拌した。溶媒を留去し、酢酸エチル２５ｍｌで振りとり、１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液、蒸留水、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。そこへトリフェニルホスフィン３２０ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン置換し、室温で一晩攪拌した。析出物を桐山ロートでろ取し、酢酸エチルで洗い、化合物２３（６６４．３ｍｇ、収率７８．６％、淡黄色粉末）を得た。
ＭＲ−ＭＳ［ＥＳＩ−ＭＳ］：［Ｍ−Ｉ］＋＝７１３
よく乾燥した容器に蒸留したジクロロメタン４ｍｌ、化合物２３ １６８ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液２ｍｌを加えた。室温で一時間攪拌し、分液ロートにてジクロロメタン層を分けとり、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。それを、化合物２２ ２４ｍｇ（６４．２μｍｏｌ）が入ったフラスコに加え、室温にて一晩攪拌した。溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムにて精製（溶出溶媒；ジクロロメタン−メタノール（１００：４））し、化合物２４（１０．３ｍｇ、収率２１％、オレンジ色粉末）を得た。
ＨＲ−ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋Ｎａ］＋ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ８３１．２３５２２，ｆｏｕｎｄ ８３１．２３０７０．
よく乾燥した容器に蒸留したジクロロメタン２ｍｌ、化合物２４ １２２．６ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ）、ｍ−クロロ過安息香酸２６ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ）を加えた。アルゴン置換し、０℃で一晩攪拌した。ジクロロメタンを加え、１Ｎ炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムにて精製（溶出溶媒；ジクロロメタン−メタノール（１００：６））し、化合物２５（１０５ｍｇ、収率８４％、オレンジ色粉末）を得た。
ＨＲ−ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋Ｎａ］＋ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ８４７．２３０１３，ｆｏｕｎｄ ８４７．２３２１０．
よく乾燥した容器に蒸留したジクロロメタン３ｍｌ、化合物２５ ４０ｍｇ（０．２６ｍｍｏｌ）、アニソール１５０μｌ（１．３８ｍｍｏｌ）、トリフルオロ酢酸７５０μｌ（９．７ｍｍｏｌ）を加えた。アルゴン置換し、０℃で４時間攪拌した。溶媒を留去し、得られた残渣を精製水に溶解し酢酸エチルで三回振りとり、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、酢酸エチルを留去した。得られた残渣を逆相プレパラティブＴＬＣ（ＲＰ１８Ｗ）にて精製（溶出溶媒；アセトニトリル／水（１：１））し、化合物２６（ＴＧ−β Ｌａｃ）（９．４ｍｇ、収率２７．６％、オレンジ色粉末）を得た。
ＨＲ−ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ−Ｈ］−ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ７０３．１７５０３，ｆｏｕｎｄ ７０３．１７７１９
例１３：インビトロ β−ラクタマーゼ蛍光アッセイ
ＴＧ−β Ｌａｃ（１μＭ）を含むアッセイバッファー（リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ），Ｃａ２＋，Ｍｇ２＋非含有，ｐＨ７．４，０．１％ジメチルスルホキシド）に、測定開始５分後、０．３ｕｎｉｔのβ−ラクタマーゼを添加し、４９１ｎｍ励起、５１０ｎｍでの蛍光強度変化を経時観察した。結果を第１１図に示す。
【産業上の利用可能性】
本発明により、蛍光特性に優れた蛍光プローブが提供される。また、本発明の設計方法により、蛍光特性に優れた蛍光プローブを合理的に設計できる。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【技術分野】
本発明は蛍光プローブに関する。より具体的には、酵素などの標的物質を捕捉して蛍光を発する蛍光プローブに関するものである。
【背景技術】
フルオレセインは１９世紀から知られる蛍光物質で、水溶液中で５００ｎｍ付近で励起可能であり、量子収率も高いことから蛍光プローブの母核として汎用されている。例えば、一酸化窒素の蛍光プローブ（特開平１０−２２６６８８号公報）、亜鉛の蛍光プローブ（国際公開ＷＯ ０１／６２７５５）などの母核に利用されている。
フルオレセインのカルボキシル基を水素原子に置き換えた６−ヒドロキシ−９−フェニルフルオロンは蛍光量子収率が低くなるため、このカルボキシル基はフルオレセインの蛍光団としての特性に役割を持つと考えられてきた（Ｌｉｎｄｑｖｉｓｔ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．，４４，１７１１−１２，１９６６）。このような理由から、従来提案されているフルオレセイン誘導体ではフルオレセインの蛍光特性を損なわないようにこのカルボキシル基が保存されており、カルボキシル基を他の官能基に変換した化合物はほとんど知られていない。
【発明の開示】
本発明の課題は、蛍光特性に優れた蛍光プローブを提供することにある。本発明者らはフルオレセインの蛍光物質としての性質を種々検討するうち、その蛍光特性はもっぱら三環のキサンテン骨格に基づくものであり、キサンテン環の９−位に結合する２−カルボキシフェニル基は蛍光特性に実質的に何の影響も与えていないとの結論に至った。そこで、本発明者らは、２−カルボキシフェニル基のカルボキシル基を水素原子以外の置換基、例えばメチル基又はメトキシ基などに置換した化合物の蛍光特性を確認したところ、驚くべきことに、これらの化合物がフルオレセインとほぼ同等の強度の蛍光量子収率を有しており、励起波長及び蛍光波長もほぼ同じであることを発見した。
これらの事実、及びカルボキシル基を水素原子に置き換えた６−ヒドロキシ−９−フェニルフルオロンでは蛍光量子収率が低下する事実から、本発明者らはフルオレセインにおけるカルボキシル基の役割がキサンテン環とベンゼン環部の炭素−炭素単結合による自由回転を防ぐことにあり、これによって励起状態の蛍光団が発光過程を経ずに失活する経路を妨げることにあると結論した。さらに、本発明者らは上記の知見を基にして高い蛍光特性を有する蛍光プローブを創出すべく研究を行った結果、キサンテン環の９−位に結合するフェニル基の電子密度が十分に高い化合物では実質的に非蛍光性であり、該フェニル基の電子密度が十分に低い化合物では高い蛍光性を有すること、及びフルオレセインのカルボキシル基を他の官能基に変換して該フェニル基の電子密度を調節することにより、所望の蛍光特性を有する蛍光プローブを合理的に設計できることを見出し、この発明について特許出願した（ＰＣＴ／ＪＰ０３／８５８５）。
本発明は上記の課題を解決するための別の手段を提供すべくさらに研究を進めた結果、キサンテン環のヒドロキシル基がプロトン化されている場合と脱プロトン化されている場合とを比較すると、両者でキサンテン環の還元電位に大きな差が生じていること、及びこの還元電位差を蛍光のＯＮ／ＯＦＦスイッチとして利用すべくベンゼン環部分（電子ドナー部位）の電子密度を適宜選択することにより、キサンテン環部位に測定対象物質との反応部位を導入した新規蛍光プローブを提供できることを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
すなわち、本発明は、蛍光プローブであって、下記の式（Ｉ）：
（式中、Ｒ１は水素原子、カルボキシル基、又はスルホン酸基以外の一価の置換基を示し；Ｒ２は水素原子又は一価の置換基を示し；Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子を示し；Ｒ５は測定対象物質との接触により切断される一価の基を示し、
ただし、Ｒ１及びＲ２の組み合わせは、それらが結合するベンゼン環の酸化電位が、
（１）上記切断の前には、式（Ｉ）で表される化合物が実質的に無蛍光性になるように、かつ
（２）上記切断の後には、式（Ｉ）で表される化合物に由来する切断後の化合物が実質的に高い蛍光性になるように選ばれる。）
で表される蛍光プローブを提供するものである。
この発明の好ましい態様によれば、該ベンゼン環の酸化電位が１．５５Ｖ〜１．７５ＶになるようにＲ１及びＲ２の組み合わせが選ばれる上記の蛍光プローブ；該ベンゼン環の酸化電位が１．６０Ｖ〜１．７０Ｖの範囲となるようにＲ１及びＲ２の組み合わせが選ばれる上記の蛍光プローブが提供される。本発明のさらに好ましい態様によれば、Ｒ３及びＲ４が水素原子である上記の蛍光プローブ；Ｒ１が低級アルキル基であり、Ｒ２が低級アルコキシ基である上記の蛍光プローブ；Ｒ１が低級アルキル基であり、Ｒ２がキサンテン環残基に対してパラ位の低級アルコキシ基である上記の蛍光プローブ；上記の切断が加水分解により生じる上記の蛍光プローブ；測定対象物質が加水分解酵素である上記の蛍光プローブ；Ｒ５がリン酸エステル加水分解酵素により切断されるホスホノ基である上記の蛍光プローブ；Ｒ５が糖加水分解酵素により切断される糖誘導体の残基である上記の蛍光プローブ；Ｒ５がβ−ガラクトピラノシル基である上記の蛍光プローブ；Ｒ５がβ−ガラクトピラノシル基であり、Ｒ２がカルボキシ置換アルコキシ基又は４−カルボキシブトキシ基である上記の蛍光プローブ；Ｒ５がβ−ラクタマーゼによる切断される環状アミドを含む基である上記の蛍光プローブ；β−ラクタマーゼによる切断される環状アミドを含む基が下記の式で表される基である上記の蛍光プローブ；
が提供される。
別の観点からは、上記の一般式（Ｉ）（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５はそれぞれ上記の定義と同義である）で表される蛍光プローブの設計方法であって、Ｒ１及びＲ２の組み合わせとして、それらが結合するベンゼン環の酸化電位が、
（１）上記切断の前には、式（Ｉ）で表される化合物が実質的に無蛍光性になるように、かつ
（２）上記切断の後には、式（Ｉ）で表される化合物に由来する切断後の化合物が実質的に高い蛍光性になるように
組み合わせを選択する工程を含む方法が本発明により提供される。さらに、上記の設計方法により得られた蛍光プローブも本発明により提供される。
【図面の簡単な説明】
第１図は、フルオレセインのカルボキシル基をアルキル基又はアルコキシ基に変換した誘導体（化合物１〜８）について、各化合物の蛍光量子収率とＰＥＴドナー部分であるベンゼン環部の酸化電位との関係を示した図である。
第２図は、フルオレセインのカルボキシル基をアルキル基又はアルコキシ基に変換した誘導体（化合物１〜８）について、各化合物の蛍光量子収率とＰＥＴドナー部分であるベンゼン環部のＨＯＭＯエネルギーレベルとの関係を示した図である。
第３図は、ＰＥＴの概念図及びフルオレセインについてＰＥＴドナー部と蛍光団の２つの部位を示した図である。
第４図は、本発明蛍光プローブＡとβ−ガラクトシダーゼとの反応により生じる蛍光を経時的に示した図である。図中右側のグラフは反応当初の１５分間の蛍光強度変化を拡大して示したものである。
第５図は、本発明蛍光プローブＡを用いて細胞中のβ−ガラクトシダーゼの測定を行った結果を示した写真である。左側はｌａｃＺ陽性細胞の結果を示し、右側はＬａｃＺ陰性細胞の結果を示す。
第６図は、化合物１１（ＴＧ−Ｐｈｏｓ）をアルカリフォスファターゼに接触させた場合の蛍光強度の経時変化を示した図である。
第７図は、ＴＧ−Ｐｈｏｓのアルカリフォスファターゼによる反応前後の蛍光スペクトル変化（ａ）及び吸収スペクトル（ｂ）変化を示した図である。
第８図は、例９で得た２−Ｍｅ ４−Ｏ（ＣＨ２）４ＣＯＯＡＭ ＴＧ β−Ｇａｌをβ−ガラクトシダーゼに接触させた場合の蛍光強度の経時変化を示した図である。
第９図は、２−Ｍｅ ４−Ｏ（ＣＨ２）４ＣＯＯＡＭ ＴＧ β−Ｇａｌのをβ−ガラクトシダーゼによる反応前後の蛍光スペクトル変化（ａ）及び吸収スペクトル（ｂ）変化を示した図である。
第１０図は、２−Ｍｅ ４−Ｏ（ＣＨ２）４ＣＯＯＡＭ ＴＧ−β Ｇａｌを用いた生細胞系でのβ−ガラクトシダーゼ蛍光アッセイの結果を示した写真である。
第１１図は、ＴＧ−β Ｌａｃを用いたインビトロβ−ラクタマーゼ蛍光アッセイの結果を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明により提供される式（Ｉ）で表される蛍光プローブは、測定対象物質との接触により切断されて蛍光性の化合物（上記式（Ｉ）においてＲ５が切断され、ヒドロキシ基がアニオン状態で存在する化合物に相当する）を生成することができ、測定対象物質の測定のための蛍光プローブとして用いられる。測定対象物質の種類は特に限定されず、酵素、金属イオン（例えば、ナトリウムイオンやリチウムイオンなどのアルカリ金属イオン、カルシウムイオンなどのアルカリ土類金属イオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオンなど）、非金属イオン（炭酸イオンなど）、活性酸素種（例えば、一酸化窒素、ヒドロキシラジカル、一重項酸素、及びスーパーオキシドなど）などのいずれであってもよいが、好ましくは酵素である。酵素としては、例えば、還元酵素、酸化酵素、加水分解酵素などを挙げることができる。例えば、β−ラクタマーゼ、チトクロームＰ４５０酸化酵素、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼ、ラクターゼ、アルカリホスファターゼなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。酵素のうち、特に加水分解酵素が好ましい。加水分解酵素の典型例として、例えばβ−カラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、又はアルカリフォスファターゼなどを挙げることができるが、加水分解酵素は上記のものに限定されるわけではない。
本発明の蛍光プローブは、従来、フルオレセインを母核として種々提案されている各種測定対象物の測定のための蛍光プローブにおいて、キサンテン環の９−位に結合する２−カルボキシフェニル基のカルボキシル基を水素原子、スルホン酸基以外の一価の置換基に変換し、かつ測定対象物質との反応部位をキサンテン骨格のヒドロキシル基としたことを特徴としている。本発明の蛍光プローブはそれ自体は実質的に無蛍光性であるが、測定対象物質との接触により切断され、実質的に高い蛍光性を有する化合物を生成することを特徴としている。
Ｒ１は水素原子、カルボキシル基、又はスルホン酸基以外の一価の置換基を示す。Ｒ２は水素原子又は一価の置換基を示す。これらの基が示す一価の置換基の種類は特に限定されないが、例えば、Ｒ１としてはアルキル基が好ましく、Ｒ２としてはアルコキシ基が好ましい。Ｒ１が示すアルキル基又はＲ２が示すアルコキシ基は、１個又は２個以上の任意の置換基を有していてもよい。Ｒ２が示す置換アルコキシ基としては、例えば、カルボキシル置換Ｃ１−６アルコキシ基又はアルコキシカルボニル置換Ｃ１−６アルコキシ基などが挙げられる。本明細書において、「アルキル基」又はアルキル部分を含む置換基（例えばアルコキシ基など）のアルキル部分は、例えば、炭素数１〜１２個、好ましくは炭素数１〜６個、好ましくは炭素数１〜４個の直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基を意味している。より具体的には、アルキル基として低級アルキル基（炭素数１〜６個のアルキル基）が好ましい。低級アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロプロピルメチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基などを挙げることができる。Ｒ１としては低級アルキル基がより好ましく、Ｒ２としては低級アルコキシ基がより好ましい。特に好ましいのは、Ｒ１がメチル基であり、Ｒ２がメトキシ基である化合物である。また、Ｒ２がモノカルボキシ基置換Ｃ１−６アルコキシ基又はモノアルコキシカルボニル置換Ｃ１−６アルコキシ基である化合物も好ましい。特に好ましいのはＲ２が４−カルボキシブトキシ基又は４−アセトキシメチルオキシカルボニルブトキシ基である化合物である。Ｒ２が４−アセトキシメチルオキシカルボニルブトキシ基である本発明の蛍光プローブは高い脂溶性により細胞内に効率良く取り込まれ、かつ、細胞内に取り込まれると細胞内に存在するエステラーゼにより４−アセトキシメチルオキシカルボニルブトキシ基が加水分解を受け水溶性の高い蛍光プローブに変換され細胞内に滞留しやすくなる優れた特性を有しており、細胞内をイメージングする用途の蛍光プローブとして大変適している。ベンゼン環上のＲ２の置換位置は特に限定されないが、キサンテン環の残基の結合位置に対してパラ位であることが好ましい。Ｒ１及びＲ２が結合するベンゼン環上には、これらの置換基以外に任意の置換基が存在していてもよい。
本明細書においてハロゲン原子という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよく、好ましくはフッ素原子、塩素原子、又は臭素原子である。Ｒ３及びＲ４が示すハロゲン原子としては塩素原子又はフッ素原子が好ましい。Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立に水素原子、塩素原子、又はフッ素原子であることが好ましい。Ｒ５は測定対象物質との組み合わせにより容易に切断されるように適宜選択することができるが、例えば、糖加水分解酵素を測定対象物質として用いる場合には、Ｒ５はとしてその酵素の基質となる糖化合物の残基を用いることができる。糖化合物が有するヒドロキシ基やアミノ基などの官能基は必要に応じて適宜の保護基で保護されていてもよい。このような保護基を有する化合物もすべて本発明の範囲に包含される。
本発明の蛍光プローブにおいて、Ｒ１及びＲ２の組み合わせは、測定対象物質によるＲ５の切断前には、式（Ｉ）で表される化合物が実質的に無蛍光性になるように選択され、かつ（２）測定対象物質によるＲ５の切断後には、式（Ｉ）で表される化合物に由来する切断後の化合物が実質的に高い蛍光性になるように選択される。
Ｒ１及びＲ２の組み合わせの選択に際して、それらが結合するベンゼン環の電子密度の情報を利用することができる。電子密度の情報は、例えば該ベンゼン環の酸化電位を量子化学的手法に従って計算することにより容易に入手することができる。該ベンゼン環の酸化電位が低くなることは該ベンゼン環の電子密度が上昇することを意味しており、これはＨＯＭＯ軌道エネルギーが高くなることに対応している。例えば、該ベンゼン環部位のＨＯＭＯエネルギーを密度汎関数法（Ｂ３ＬＹＰ／６−３１Ｇ（ｄ））により求めることができる。なお、本明細書中に記載された酸化電位はすべて飽和カロメロ電極（ＳＣＥ）を対照に記述しており、硝酸銀電極（Ａｇ／Ａｇ＋）を参照電極とした場合の値とは約０．２４Ｖ基準が異なっている。
本明細書の実施例の例２に具体的に示されているように、一般式（Ｉ）で表される化合物においてＲ５が水素原子である化合物は、ｐＨ１３のアルカリ水溶液中ないし中性水溶液中では、キサンテン環のヒドロキシ基のプロトンが脱離してアニオンになっているが（すなわち該ヒドロキシル基が−Ｏ−となっている）、例えば、この条件下において該ベンゼン環の酸化電位が１．２０Ｖ以下の化合物は実質的に無蛍光性であり、該ベンゼン環の酸化電位が１．６０Ｖ以上では実質的に強い蛍光性の化合物となる場合がある。また、ｐＨ３．４の酸性条件下では、該ヒドロキシル基にプロトンが存在する状態になっているが（すなわち該ヒドロキシル基が−ＯＨとなっている）、例えば、該ベンゼン環の酸化電位が１．６０Ｖ以下の化合物は実質的に無蛍光性であり、該ベンゼン環の酸化電位が１．９０Ｖよりも大きい場合は実質的に強い蛍光性の化合物となる場合がある。この関係を図示したのが第１図である。この第１図には、Ｒ１及びＲ２として種々の組み合わせを有する化合物における該ベンゼン環の酸化電位の変化と、それらの化合物の蛍光量子収率を示した。ｐＨ１３の曲線は脱プロトン化された化合物の酸化電位と蛍光量子収率との関係、ｐＨ３．４の場合はプロトン化された化合物の酸化電位と蛍光量子収率との結果を示している。
該ヒドロキシル基にプロトンが存在する化合物と、Ｒ５が例えばアルキル基などの化合物とを比較した場合、該ベンゼン環部分の酸化電位は実質的に同一であることが実験的に確認されており、Ｒ５の切断が生じる前の化合物における該ベンゼン環の酸化電位は、一般式（Ｉ）で表される化合物においてＲ５が水素原子である化合物をｐＨ３．４の酸性条件下に置いた場合の該ベンゼン環の酸化電位で代用することができる。従って、該ベンゼン環の酸化電位を指標としてＲ１及びＲ２の好ましい組み合わせを選択するためには、例えば第１図を参照しつつ、一般式（Ｉ）で表される化合物においてＲ５が水素原子である化合物について、ｐＨ３．４における蛍光量子収率とｐＨ１３における蛍光量子収率との差が最大になるように選択すればよい。より具体的には、第１図において、該ベンゼン環の酸化電位が１．５５Ｖ〜１．７５ＶになるようにＲ１及びＲ２の組み合わせを選ぶことが好ましく、該ベンゼン環の酸化電位が１．６０Ｖ〜１．７０Ｖの範囲となるようにＲ１及びＲ２の組み合わせを選ぶことがより好ましい。最も好ましいのは、該ベンゼン環の酸化電位が１．６５Ｖ程度となるようにＲ１及びＲ２の組み合わせを選ぶことである。なお、Ｒ１及びＲ２が結合するベンゼン環上にＲ１及びＲ２以外の１又は２以上の置換基が存在する場合には、Ｒ１及びＲ２並びにそ（れら）の置換基を全て含めた状態で該ベンゼン環の酸化電位を上記の範囲となるように選択することが好ましい。
いかなる特定の理論に拘泥するわけではないが、本発明者らが見出した上記の知見はＰＥＴ（Ｐｈｏｔｏｉｎｄｕｃｅｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒ：光誘起電子移動）により説明できる。ＰＥＴとは蛍光消光の１つの方法であり、励起光照射により生成する１重項励起蛍光団が蛍光を発して基底状態に戻る速度よりも速く、近隣の電子供与部位（ＰＥＴドナー）から電子移動が起き、蛍光消光が起こるというものである。式（Ｉ）で表される化合物について、蛍光団として作用するキサンテン環部位と、蛍光を消光する部位であるベンゼン環部位（ＰＥＴドナー）とに分割して考えると、ベンゼン環側の酸化電位が低い（すなわち電子密度が高く、ＨＯＭＯエネルギーが高い）とＰＥＴによりキサンテン環由来の蛍光が消光する。
蛍光プローブとしては、測定対象物質によるＲ５の切断前には実質的に蛍光がなく、測定対象物質によるＲ５の切断後には実質的に強い蛍光性物質に変化する性質を有することが求められるので、蛍光強度の変化が大きいものを好適なプローブとして選択することが望ましい。例えば、測定対象物質によるＲ５の切断前にはＰＥＴにより蛍光が消失しており、測定対象物質によるＲ５の切断後には実質的にＰＥＴが生じないようにプローブを設計することができる。本発明の蛍光プローブ設計法では、ベンゼン環側の酸化電位を固定しておき、Ｒ５の切断の前後でキサンテン環に生じる還元電位の変化を利用して、Ｒ５の切断の前にはＰＥＴにより蛍光が消光しており、切断の後にはＰＥＴに障害が生じて切断後の化合物が強い蛍光を発するように蛍光プローブを設計することができる。
本明細書において用いられる「測定」という用語は、定量、定性、又は診断などの目的で行われる測定、検査、検出などを含めて、最も広義に解釈しなければならない。本発明の蛍光プローブを用いた測定対象物の測定方法は、一般的には、（ａ）上記式（Ｉ）で表される化合物と測定対象物質とを接触させてＲ５を切断させる工程、及び（ｂ）上記工程（ａ）で生成した化合物（Ｒ５が切断された化合物に相当する）の蛍光を測定する工程を含んでいる。例えば、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、又はエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに本発明の蛍光プローブ又はその塩を溶解し、細胞や組織を含む適切な緩衝液中にこの溶液を添加して、蛍光スペクトルを測定すればよい。
測定対象物質によりＲ５が切断された後の化合物の蛍光の測定は通常の方法で行うことができ、インビトロで蛍光スペクトルを測定する方法や、バイオイメージングの手法を用いてインビボで蛍光スペクトルを測定する方法などを採用することができる。例えば、定量を行う場合には、常法に従って予め検量線を作成しておくことが望ましい。
本発明の蛍光プローブとしては、上記式（Ｉ）で表される化合物のほか、その塩を用いてもよい。塩の種類は特に限定されないが、例えば、酸付加塩としては塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩などを挙げることができ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。これらのほか、グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。必要に応じて、試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合して組成物として用いてもよい。例えば、生理的環境で試薬を用いるための添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供される。
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１：化合物の合成
下記の化合物を合成した。これらの化合物は化合物Ｎｏ．が大きくなるほどキサンテン環の９−位に結合するベンゼン環の酸化電位が低くなる（すなわち電子密度が高くなる、換言すればＨＯＭＯ軌動エネルギーが高くなる）ように設計した。また、無置換ベンゼン体及び化合物１の合成スキームを以下に示した（スキーム中、Ｍｅはメチル基を示す）。
キサントンをＰｒｏｃ．Ｉｎｄｉａｎ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｓｅｃｔ．Ａ．，５７，２８０（１９６３）に記載された方法で合成し、得られたキサントンをジ（ｔｅｒｔ−ブチルジメチリシリル）保護体（キサントン−ＴＢＤＭＳ）とした（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１４，８１７１（１９８９））。よく乾燥させた容器にＭｇ １０９ｍｇ（４．５０ｍｍｏｌ）を入れ、真空ポンプで減圧にしながら２５０℃で１８０分間加熱攪拌した。放冷後、アルゴン置換にかえ、２−ブロモトルエン７７ｍｇ（０．４５ｍｍｏｌ）を蒸留したＴＨＦ ２ｍｌに溶解して加え、６０℃まで徐々に加熱した。反応液が暗緑色に変化したのを確認して氷冷した。キサントン−ＴＢＤＭＳ １３７ｍｇ（０．３００ｍｍｏｌ）を蒸留したＴＨＦ ２ｍｌに溶解して加え、１０分間攪拌した。反応液に２Ｎ ＨＣｌ水溶液１０ｍｌを加えて攪拌すると黄色固体が析出した。この固体を濾取した後、少量のＴＨＦで洗浄して乾燥し黄色固体を得た（８７ｍｇ，収率９６％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ２．００（３Ｈ，ｓ），７．０１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１５Ｈｚ），７．１０（２Ｈ，ｓ），７．２１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１５Ｈｚ），７．３１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．１４Ｈｚ），７．５２（３Ｈ，ｍ）
ＭＳ（Ｅｌ）３０２（Ｍ＋）
同様にして化合物２〜化合物８を得た。
化合物２
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １．９７（３Ｈ，ｓ），２．４２（３Ｈ，ｓ），７．０１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１５Ｈｚ），７．１０（２Ｈ，ｓ），７．２１（４Ｈ，ｍ），７．３４（１Ｈ，ｓ）
ＭＳ（Ｅｌ）３１６（Ｍ＋）
化合物３
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １．９５（３Ｈ，ｓ），２．３５（３Ｈ，ｓ），６．９９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１５Ｈｚ），７．０５（２Ｈ，ｓ），７．１２（１Ｈ，ｓ），７．２１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１５Ｈｚ），７．３９（２Ｈ，ｍ）
ＭＳ（Ｅｌ）３１６（Ｍ＋）
化合物４
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ３．７０（３Ｈ，ｓ），７．０２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２０Ｈｚ），７．０８（２Ｈ，ｓ），７．２３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５０Ｈｚ），７．３４（４Ｈ，ｍ），７．６８（１Ｈ，ｍ）
ＭＳ（Ｅｌ）３１８（Ｍ＋）
化合物５
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １．９８（３Ｈ，ｓ），３．８６（３Ｈ，ｓ），６．９６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１５Ｈｚ），７．０３（３Ｈ，ｍ），７．１０（１Ｈ，ｓ），７．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２２Ｈｚ），７．２８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１５Ｈｚ）
ＭＳ（Ｅｌ）３３２（Ｍ＋）
化合物６
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ２．３３（３Ｈ，ｓ），３．６６（３Ｈ，ｓ），７．０７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１５Ｈｚ），７．１４（３Ｈ，ｍ），７．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８８Ｈｚ），７．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１５Ｈｚ），７．４８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８８Ｈｚ）
ＭＳ（Ｅｌ）３３２（Ｍ＋）
化合物７
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ３．７０（３Ｈ，ｓ），３．９１（３Ｈ，ｓ），６．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４３Ｈｚ），６．８９（１Ｈ，ｓ），７．０６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３６Ｈｚ），７．１２（２Ｈ，ｓ），７．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４３Ｈｚ），７．４７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３６Ｈｚ）
ＭＳ（Ｅｌ）３４８（Ｍ＋）
化合物８
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ ３．６４（３Ｈ，ｓ），３．７６（３Ｈ，ｓ），６．９６（１Ｈ，ｓ），７．０４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１５Ｈｚ），７．１０（２Ｈ，ｓ），７．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１５Ｈｚ），７．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１５Ｈｚ），７．２３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１５Ｈｚ）
ＭＳ（Ｅｌ）３４８（Ｍ＋）
例２
上記で合成した各化合物の蛍光量子収率とベンゼン環部の酸化電位との関係を調べた。結果を表１及び第１図に示す。図に示した結果から明らかなように、各化合物の蛍光量子収率はベンゼン環部の酸化電位に依存して変化した。ｐＨ１３のアルカリ水溶液中ではキサンテン環のＯＨ基のプロトンは脱離してアニオンになっており、この条件では酸化電位が１．２０Ｖ以下ではほぼ無蛍光となり、１．６５Ｖ以上では量子収率がほぼ１に近い蛍光を有していた。その間は酸化電位が低下するに従って量子収率の減少が見られた。ｐＨ３．４の酸性条件下では、塩基性条件下に比べ蛍光の変化するベンゼン環の酸化電位が変化した。すなわち、酸化電位が１．６０Ｖ以下ではほぼ無蛍光であり、１．９０Ｖ以上では量子収率がほぼ０．３の蛍光を発した。なお、ｐＨ３．４ではキサンテン環のＯＨ基はプロトネートしており、この条件下でのフルオレセインの量子収率はほぼ０．３位であることが知られている。
ａ）０．１Ｎ ＮａＯＨ水溶液中で測定した。
ｂ）データは０．１Ｍ過塩素酸テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＰ）を含むアセトニトリル中で測定した。
ｃ）データはＧａｕｓｓｉａｎ ９８Ｗを用いてＢ３ＬＹＰ／６−３１Ｇ（ｄ）／／Ｂ３ＬＹＰ／６−３１Ｇ（ｄ）により得た。
ｄ）測定せず。
例３
一般に化合物の酸化電位は量子化学計算により予測可能である。そこで、上記化合物のベンゼン環部位のＨＯＭＯエネルギーを密度汎関数法（Ｂ３ＬＹＰ／６−３１Ｇ（ｄ））により求め、これと蛍光量子収率との関係をプロットした。その結果、例２で酸化電位を指標として得られた結果とほぼ同様の関係が得られた（第２図）。この結果から、これらの化合物の蛍光特性は量子化学計算から定量的に予想可能であることが示された。この知見に基づいて、本発明の合理的な蛍光プローブ設計方法を実施することができる。
例４
ＰＥＴ（Ｐｈｏｔｏｉｎｄｕｃｅｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒ：光誘起電子移動）とは蛍光消光の１つの方法であり、励起光照射により生成する１重項励起蛍光団が蛍光を発して基底状態に戻る速度よりも速く、近隣の電子供与部位（ＰＥＴドナー）から電子移動が起き、蛍光消光が起こるというものである。本発明の化合物を蛍光団であるキサンテン部位と、蛍光を消光する部位であるベンゼン環部（ＰＥＴドナー）に分割して考えた場合、ベンゼン環の酸化電位が低い（すなわち電子密度が高い、換言すればＨＯＭＯエネルギーが高い）とＰＥＴによりキサンテン由来の蛍光が消光する。実際、両部位はフルオレセインのＸ線結晶解析からほぼ直交していることが明らかになっており、また化合物１〜８では励起・蛍光波長がほぼ同じであることから、本発明の化合物を２つの部位に分割して考察する仮説は妥当性が高い。ＰＥＴの概念図及びフルオレセインを２つの部位に分割した概念図を第３図に示した。
蛍光プローブは、測定対象物質によりＲ５が切断されていない場合には蛍光が無く、測定対象物質によりＲ５が切断されて初めて蛍光を発する機能を持つ分子である。すなわち、前者の状態ではＰＥＴにより蛍光が消光しており、後者の状態ではＰＥＴが起こらなくなる蛍光プローブを設計することにより、理想的な蛍光プローブが得られる。ベンゼン環部がどの程度の酸化電位を持てば蛍光プローブとして望ましい性質を有するかは、例えば例２に示した実験で容易に明らかにすることが可能であり、また新規の蛍光団に対してもその還元電位を測定することで容易に予想可能である。本発明の化合物では、ＰＥＴドナー部として作用するベンゼン環部位の酸化電位は変化せず、キサンテン環部位の還元電位がＲ５の切断により変化してＰＥＴを障害し、その結果としてＲ５が切断された化合物から蛍光が発せられる。この際、ＰＥＴドナー部の酸化電位は量子化学計算から予想可能である。以上のステップにより、目的とする蛍光プローブを一切の合成無しに設計することが可能となる。
例５：β−ガラクトシダーゼ蛍光プローブの製造
よく乾燥した容器に無水ジメチルホルムアミド（０．５ｍｌ）、化合物５１０ｍｇ（３０μｍｏｌ）、Ｃｓ２ＣＯ３１００ｍｇ（３００μｍｏｌ）、２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシルブロミド１００ｍｇ（２５０μｍｏｌ）を加えた。アルゴン置換し、撹拌しつつ室温にて終夜反応させた。沈殿物を濾去し、母液を減圧濃縮した。得られた残渣を精製水に溶解しジクロロメタンで３回抽出し、有機相を飽和食塩水で洗浄して無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去して黄色粉末を得た。溶出溶媒としてジクロロメタン−メタノール（１００：３）を用い、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し化合物９のオレンジ色粉末を得た（１１．３ｍｇ，５７％）。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ ７．１５−６．３８（ｍ，９Ｈ），５．５２（ｍ，２Ｈ），５．１８−５．１２（ｍ，２Ｈ），４．２５−４．１２（ｍ，３Ｈ），３．９２（ｓ，３Ｈ），３．７０（ｓ，３Ｈ），２．１９（ｓ，３Ｈ），２．１３（ｓ，３Ｈ），２．０７（ｓ，３Ｈ），２．０３（ｓ，３Ｈ）
ＥＩ−ＭＳ：Ｍ＋＝６７８
例６：β−ガラクトシダーゼ蛍光プローブを用いたβ−ガラクトシダーゼの測定
例５で得た化合物９（テトラアセテート体）を無水ジメチルスルホキシドに溶解し１００ｍＭストック溶液を調製した。この溶液を２Ｍナトリウムメトキシドで０℃、一時間処理して糖部分の４つのアセチル基を加水分解した化合物（以下、この化合物を「本発明蛍光プローブＡ」と呼ぶ。）を得た。その後に目的の濃度になるようバッファーで希釈して反応を停止した。インビトロでのβ−ガラクトシダーゼとの反応では、本発明蛍光プローブＡの最終濃度が１μＭとなるように調整し、バッファーとして１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）を用い、最終的に１４．３ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．００１％ジメチルスルホキシド、０．０１％メタノール、６Ｕ β−ガラクトシダーゼを含む溶液３ｍｌを調製して１ｃｍキュベットの中で３７℃にて反応を行った。蛍光強度変化は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＬＳ−５０Ｂ蛍光スペクトル測定装置を用いて観測した。β−ガラクトシダーゼ（分子量５４０，０００，ＥＣ３．２．１．２３）はシグマ−アルドリッチより購入した。生細胞でのアッセイでは本発明蛍光プローブＡの最終濃度が１０μＭとなるように調整し、バッファーとして生理食塩水（ｐＨ７．４；１５０ｍＭ ＮａＣｌ，４ｍＭ ＫＣｌ，２ｍＭ ＣａＣｌ２，１ｍＭ ＭｇＣｌ２，５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，０．１％グルコース；以下ＰＳＳと略す）を用いて調製した溶液を用いた。ＧＰ２９３細胞にＬＮＣＸ２−ｌａｃＺを導入したもの（ｌａｃＺ陽性細胞）をコラーゲンタイプ１でコートした２４ウェルマイクロプレートに播種し、ウェルをＰＳＳで２回洗浄した後、上記の本発明蛍光プローブＡの溶液を加えて３０分間室温でインキュベーションした。ベクターを導入してないＧＰ２９３細胞（ｌａｃＺ陰性細胞）を陰性対照として用いた。蛍光イメージング像は、カメラとしてＤＣ３００Ｆカメラ（ライカ）、対物レンズとしてＵＰｌａｎＦｌ １０ｘ／０．３１対物レンズ（オリンパス光学）を取り付けたＩＸ７０倒立顕微鏡（オリンパス光学）を用い、励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長５１０−５５０ｎｍの条件で撮像した。
本発明蛍光プローブＡはβ−ガラクトシダーゼにより糖部分が容易に切断され、実質的に無蛍光の状態（蛍光量子収率＝０．００９）から強い蛍光性化合物（蛍光量子収率＝０．８４）に変化した。第４図にβ−ガラクトシダーゼ添加後の蛍光の経時変化を示す。比較化合物として公知のフルオレセイン−ジ−Ｏ−ガラクトシド（ＦＤＧ）を用いた。本発明蛍光プローブＡはＦＤＧに比べて反応速度が速く、短時間で高い蛍光強度を与えた。この結果から、本発明蛍光プローブＡにより、β−ガラクトシダーゼ活性を高感度に測定できることがわかる。生細胞を用いた試験結果を第５図に示す。ｌａｃＺ陽性細胞の場合のみに蛍光が認められ、本発明蛍光プローブＡを用いて細胞中のβ−ガラクトシダーゼを高感度に測定できることがわかる。また、本発明蛍光プローブＡは、生理的条件下で細胞膜を透過して容易に細胞内に到達していることも示された。
例７：アルカリフォスファターゼ蛍光プローブの製造
よく乾燥した容器に無水クロロホルム４ｍｌ、化合物５１５．７ｍｇ（４７μｍｏｌ），トリエチルアミン１６．４μｌ（１１８μｍｏｌ），クロロりん酸ジエチル６．８μｌ（４７μｍｏｌ）を加えた。アルゴン置換し、撹拌しつつ室温にて一晩反応させた。反応溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムにて精製（溶出溶媒；ジクロロメタン−メタノール（１００：３））し、化合物１０（２６．２ｍｇ、定量的、オレンジ色粉末）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ １．３９（ｍ，６Ｈ），２．０５（ｓ，３Ｈ），３．８９（ｓ，３Ｈ），４．２７（ｍ，４Ｈ），６．４５（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），６．５８（ｄｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，２．０Ｈｚ），６．８６−７．３５（ｍ，７Ｈ）
ＨＲ−ＭＳ［ＥＳＩ−ＭＳ］：［Ｍ＋Ｈ］＋ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ３６９．１４１６１，ｆｏｕｎｄ ３６９．１３８１０
よく乾燥した容器に無水ジクロロメタン１ｍｌ、化合物１０ ２６．０ｍｇ（５６μｍｏｌ）、ヨードトリメチルシラン１９．７μｌ（１４０μｍｏｌ）を加えた。アルゴン置換し、撹拌しつつ室温にて一時間反応させた。反応溶媒を留去し、得られた残渣を逆相プレパラティブＴＬＣ ＲＰ１８Ｗにて精製（展開溶媒；アセトニトリル／水（１：１））し、化合物１１（ＴＧ−Ｐｈｏｓ）（１．６ｍｇ、収率５．６％、オレンジ色粉末）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＣＤ３ＯＤ）δ ２．０２（ｓ，３Ｈ，ａ），３．９０（ｓ，３Ｈ，ｃ），６．４８（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，ｉ），６．６０（ｄｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，２．０Ｈｚ，ｊ），６．９６−７．７１（ｍ，７Ｈ，ｂ，ｄ，ｅ，ｆ，ｇ，ｈ，ｋ）
ＨＲ−ＭＳ［ＥＳＩ−ＭＳ］：［Ｍ＋Ｎａ］＋ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ４１１．０６３３６，ｆｏｕｎｄ ４１１．０５９３５
Φｆ１（１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ７．４）＝０．０２９
例８：イン・ビトロ アルカリフォスファターゼ蛍光アッセイ
化合物１１を脱水メタノールに溶解し１ｍＭのストック溶液を作製した。その後１μＭになるようにアッセイバッファーに希釈した（アッセイバッファー：０．１Ｍトリス−塩酸バッファー，ｐＨ７．４，０．５ｍＭ塩化マグネシウム，０．１％メタノール）。この希釈液３ｍｌを１ｃｍキュベットに移し、３７℃にてアルカリフォスファターゼ（０．０８ｕｎｉｔｓ／蛍光測定開始後５分に添加）による蛍光強度変化を測定した（第６図）。測定には、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＬＳ−５０Ｂ蛍光スペクトル測定装置を用い励起波長４９１ｎｍ、５１０ｎｍでの蛍光強度変化の経時変化を観察した。アルカリフォスファターゼ（分子量１６０ｋＤａ，ＥＣ ３．１．３．１）は、シグマ−アルドリッチより購入した。第７図には、ＴＧ−Ｐｈｏｓのアルカリフォスファターゼによる反応前後の蛍光スペクトル変化（ａ）及び吸収スペクトル（ｂ）変化を示した。
例９：細胞内滞留型β−ガラクトシダーゼ蛍光プローブの製造
よく乾燥した容器に無水ジメチルホルムアミド１０ｍｌ、４−ブロモ−３−メチルフェノール２ｇ（１０．７ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロライド（ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ）４．８ｇ（３０ｍｍｏｌ）、イミダゾール３．６ｇ（５０ｍｍｏｌ）を加えた。アルゴン置換し、室温にて三時間攪拌後、溶媒を真空ポンプにて留去した。得られた残渣を精製水に溶解しジクロロメタンで三回振りとり、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ジクロロメタンを留去して、化合物１２（３．０４ｇ、収率９４．７％、無色透明液体）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ ７．３３（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），６．７２（ｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，１Ｈ），６．５３（ｄｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２．９Ｈｚ，１Ｈ），２．３２（ｓ，３Ｈ），０．９７（ｓ，９Ｈ），０．１８（ｓ，６Ｈ）
ＥＩ−ＭＳ：Ｍ＋＝ＦＡＢ−ＭＳ；［Ｍ］＋＝３００，３０２
化合物１２１．２８ｇ（４．２７ｍｍｏｌ）を蒸留したテトラヒドロフラン１０ｍｌに溶解し、よく乾燥させアルゴン置換した二頚コルベンにシリンジで加えた。反応液をドライアイス−アセトンで−７８℃に保ち、ｔｅｒｔ−ブチルリチウムｎ−ペンタン溶液４．５ｍｌ（６．５７ｍｍｏｌ）をシリンジで少量ずつ加えた。３０分間攪拌後、蒸留したテトラヒドロフラン２０ｍｌに溶解した３，６−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）キサントン１．０７ｇ（２．３７ｍｍｏｌ）をシリンジで少量ずつ加えた。−７８℃のまま３０分間攪拌後、２Ｎ塩酸で中和し、析出した赤色物質をろ取した。ろ取した物質をシリカゲルカラムにて精製（溶出溶媒；ジクロロメタン−メタノール（１００：３−１００：５））し、化合物１３（７７４．６ｍｇ、収率８２％、オレンジ色粉末）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＣＤ３ＯＤ）δ ７．２７（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），７．１５（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．０１−６．８６（ｍ，６Ｈ），２．０１（ｓ，３Ｈ），１．０６（ｓ，９Ｈ），０．３１（ｓ，６Ｈ）
ＦＡＢ−ＭＳ；［Ｍ＋１］＋＝４３３
蒸留したテトラヒドロフラン２００ｍｌに化合物１３２．６２ｇ（６．２ｍｍｏｌ）を溶解し、フッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）の１Ｍテトラヒドロフラン溶液６．２ｍｌ（６．２ｍｍｏｌ）を加えた。アルゴン置換し、室温にて二時間攪拌後、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムにて精製（溶出溶媒；ジクロロメタン−メタノール（１００：５−１００：７））し、化合物１４（１．１３ｇ、収率５７．７％、オレンジ色粉末）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＣＤ３ＯＤ）δ ７．０６（ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，２Ｈ），６．９４（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．７８（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．７４（ｄｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．６３（ｄｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，２．０Ｈｚ，２Ｈ），６．６３（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，２Ｈ），１．８８（ｓ，３Ｈ）
ＨＲ−ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ３１９．０９７０３，ｆｏｕｎｄ ３１９．０９６５２．
よく乾燥した容器に無水ジメチルホルムアミド１ｍｌ、化合物１４ ６０ｍｇ（０．１８ｍｍｏｌ）、ブロモ酢酸メチル１７μｌ（０．１８ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム４００ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）を加えた。アルゴン置換し、撹拌しつつ室温にて一晩反応させた。沈殿物を桐山ロートにて除去し、母液を真空ポンプにて留去した。得られた残渣を精製水に溶解しジクロロメタンで三回振りとり、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ジクロロメタンを留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムにて精製（溶出溶媒；ジクロロメタン−メタノール（１００：５））し、化合物１５（４１．７ｍｇ、収率５６．９％、赤色粉末）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ ７．１０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．０８（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），６．９５（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ），６．８９（ｄｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２．５Ｈｚ，１Ｈ），６．８４（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，２Ｈ），６．８０（ｄｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２．０Ｈｚ，２Ｈ），４．７３（ｓ，２Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ），２．０３（ｓ，３Ｈ）
ＦＡＢ−ＭＳ：Ｍ＋１＝３９１
Φｆ１（１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ９．０）＝０．８７
よく乾燥した容器に無水ジメチルホルムアミド０．５ｍｌ、化合物１５ ３９ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム２００ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）、２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルブロミド１００ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）を加えた。アルゴン置換し、撹拌しつつ室温にて一晩反応させた。沈殿物を桐山ロートにて除去し、母液を真空ポンプにて留去した。得られた残渣を精製水に溶解しジクロロメタンで三回振りとり、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ジクロロメタンを留去した。残渣をシリカゲルカラムにて精製（溶出溶媒；ジクロロメタン−メタノール（１００：３））し、化合物１６（２−Ｍｅ ４−ＯＣＨ２ＣＯＯＭｅ ＴＧ−β Ｇａｌ）（４１．８ｍｇ、収率５８．１％、オレンジ色粉末）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ ７．１０−６．８０（ｍ，７Ｈ），６．５７（ｄｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，１．９Ｈｚ，１Ｈ），６．４０（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，１Ｈ），５．５７−５．４８（ｍ，２Ｈ），５．１８−５．１２（ｍ，２Ｈ），４．７３（ｓ，２Ｈ），４．２２−４．１６（ｍ，３Ｈ），３．８７（ｓ，３Ｈ），２．１９，２．１３，２．０７，２．０３（ｓ，３Ｈ×４），２．０５（ｓ，３Ｈ）
ＨＲ−ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋Ｎａ］＋ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ７４３．１９５１９，ｆｏｕｎｄ ７４３．１９３０９．
Φｆ１（１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ７．４）＝０．０６９
よく乾燥した容器に無水ジメチルホルムアミド（１ｍｌ）、化合物１４ ６３．８ｍｇ（０．２０ｍｍｏｌ）、５−ブロモ吉草酸メチル２１μｌ（０．１８ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム４００ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）を加えた。アルゴン置換し、撹拌しつつ室温にて一晩反応させた。沈殿物を桐山ロートにて除去し、母液を真空ポンプにて留去した。得られた残渣を精製水に溶解しジクロロメタンで三回振りとり、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ジクロロメタンを留去した。残渣をシリカゲルカラムにて精製（溶出溶媒；ジクロロメタン−メタノール（１００：５））し、化合物１７（５３．７ｍｇ、収率６１．９％、赤色粉末）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ ７．１０（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），７．０７（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），６．９１−６．８４（ｍ，４Ｈ），６．８１（ｄｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２．０Ｈｚ，２Ｈ），４．０６（ｍ，２Ｈ），３．７０（ｓ，３Ｈ），２．４５（ｍ，２Ｈ），２．０２（ｓ，３Ｈ），１．８８（ｍ，４Ｈ）
ＨＲ−ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋Ｎａ］＋ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ４５５．１４７０６，ｆｏｕｎｄ ４５５．１４６９２．
Φｆ１（１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ９．０）＝０．８２
よく乾燥した容器に無水ジメチルホルムアミド０．５ｍｌ、化合物１７ １８．２ｍｇ（４２μｍｏｌ）、炭酸セシウム２５０ｍｇ（０．７７ｍｍｏｌ）、２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルブロミド１００ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）を加えた。アルゴン置換し、撹拌しつつ室温にて一晩反応させた。沈殿物を桐山ロートにて除去し、母液を真空ポンプにて留去した。得られた残渣を精製水に溶解しジクロロメタンで三回振りとり、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ジクロロメタンを留去した。残渣をシリカゲルカラムにて精製（溶出溶媒；酢酸エチル）し、化合物１８（２５ｍｇ、収率７８％、オレンジ色粉末）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ ７．０８−６．８０（ｍ，７Ｈ），６．５７（ｄｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，２．０Ｈｚ，１Ｈ），６．３９（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），５．５６−５．４８（ｍ，２Ｈ），５，１８−５．１２（ｍ，２Ｈ），４．２２−４．１１（ｍ，３Ｈ），４．０６（ｍ，２Ｈ），３．７０（ｓ，３Ｈ），２．１９，２．１３，２．０７，２．０３（ｓ，３Ｈ×４），１．８８（ｍ，４Ｈ）
ＨＲ−ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋Ｎａ］＋ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ７８５．２４２１４，ｆｏｕｎｄ ７８５．２３７２９．
Φｆ１（１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ７．４）＝０．００５
化合物１８ ３７．７ｍｇ（０．０４９ｍｍｏｌ）を２ｍｌのメタノール／水（３：１）溶液に溶解し、２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液１ｍｌ（２ｍｍｏｌ）を加えた。０℃にて３０分間攪拌後、アンバーライトＩＲ−１２０（Ｈ＋）にて反応液を中和し溶媒を留去した。得られた残渣を、展開溶媒をアセトニトリル／水（１：１）として逆相のプレパラティブＴＬＣ（ＲＰ１８Ｗ）にて精製し、化合物１９（２−Ｍｅ ４−Ｏ（ＣＨ２）４ＣＯＯＨ ＴＧ−β Ｇａｌ）（１５．１ｍｇ、収率５３％、オレンジ色粉末）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＣＤ３ＯＤ）δ ７．２６（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．１１（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．０８（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ），７．０３（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．０２（ｄｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２．２Ｈｚ，１Ｈ），６．９４（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ），６．８９（ｄｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２．３Ｈｚ，１Ｈ），６．５３（ｄｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，２．０Ｈｚ，１Ｈ），６．３７（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），４．０１（ｍ，２Ｈ），５．００（ｄｄ，７．７Ｈｚ，２．６Ｈｚ，１Ｈ），３．８３（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，１Ｈ），３．８２−３．６４（ｍ，４Ｈ），３．５３（ｄｄ，９．７Ｈｚ，３．３Ｈｚ，１Ｈ），２．１７（ｍ，２Ｈ），１．９３（ｓ，３Ｈ），１．７４（ｍ，４Ｈ）
ＨＲ−ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋Ｎａ］＋ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ６０３．１８４２３，ｆｏｕｎｄ ６０３．１８２４２．
化合物１９（２−Ｍｅ ４−Ｏ（ＣＨ２）４ＣＯＯＨ ＴＧ−β Ｇａｌ）１０ｍｇ（１７．２μｍｏｌ）をメタノール／アセトニトリル（１ｍｌ／２ｍｌ）に溶解し、そこへアセトニトリル２ｍｌに溶解した酢酸ブロモメチル（ＡＭＢｒ）６８．５μｌ（６９０μｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）２２．３μｌ（１３０μｍｏｌ）を加えた。アルゴン置換し、室温にて１０時間攪拌後、溶媒を留去した。残渣を、展開溶媒をアセトニトリル／水（１：１）として逆相プレパラティブＴＬＣ（ＲＰ１８Ｗ）にて精製し、化合物２０（２−Ｍｅ ４−Ｏ（ＣＨ２）４ＣＯＯＡＭ ＴＧ−β Ｇａｌ）（１０．９ｍｇ、収率９７％、オレンジ色粉末）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＣＤ３ＯＤ）δ ７．２８（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．１３−６．８８（ｍ，６Ｈ），６．５３（ｄｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，２．０Ｈｚ，１Ｈ），６．３８（ｄｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），５．６５（ｓ，２Ｈ），４．０２（ｍ，２Ｈ），５．０１（ｄｄ，８．１Ｈｚ，２．８Ｈｚ，１Ｈ），３．８３（ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ，１Ｈ），３．７９−３．６５（ｍ，４Ｈ），３．５３（ｄｄ，９．５Ｈｚ，３．６Ｈｚ，１Ｈ），２．４２（ｍ，２Ｈ），１．９９（ｓ，３Ｈ），１．９４（ｓ，３Ｈ），１．７８（ｍ，４Ｈ）
ＨＲ−ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋Ｎａ］＋ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ６７５．２０５３６，ｆｏｕｎｄ ６７５．２０３５９
Φｆ１（１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ９．０）＝０．００８
例１０：イン・ビトロ β−ガラクトシダーゼ蛍光アッセイ
２−Ｍｅ ４−Ｏ（ＣＨ２）４ＣＯＯＡＭ ＴＧ−β Ｇａｌを無水ジメチルスルホキシドに溶解し１０ｍＭストック溶液を作製した。その後１μＭになるようアッセイバッファーに希釈した（アッセイバッファー：０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ７．４，１４．３ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．０１％ジメチルスルホキシド）。３ｍｌを１ｃｍキュベットに移し、３７℃にてβ−ガラクトシダーゼ（６ｕｎｉｔｓ／蛍光測定開始後５分に添加）による蛍光強度変化を測定した（第８図及び第９図）。測定には、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＬＳ−５０Ｂ蛍光スペクトル測定装置を用い励起波長４９２ｎｍ、５０９ｎｍでの蛍光強度変化の経時変化を観察した。β−ガラクトシダーゼ（分子量５４０，０００，ＥＣ ３．２．１．２３）はシグマ−アルドリッチより購入した。
例１１：生細胞系でのβ−ガラクトシダーゼ蛍光アッセイ
生細胞でのアッセイは２−Ｍｅ ４−Ｏ（ＣＨ２）４ＣＯＯＡＭ ＴＧ−β Ｇａｌの最終濃度が約１０μＭになるように生理食塩水ｐＨ７．４（１５０ｍＭ ＮａＣｌ，４ｍＭ ＫＣｌ，２ｍＭ ＣａＣｌ２，１ｍ ＭｇＣｌ２，５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，０．１％グルコース；以下ＰＳＳと略す）に調整した。ＧＰ２９３細胞にＬＮＣＸ２−ｌａｃＺを導入したもの（ｌａｃＺ陽性細胞）をコラーゲンタイプ１でコートした２４ウェルマイクロプレートに播種し、ウェルをＰＳＳで２回洗浄した後上記２−Ｍｅ ４−Ｏ（ＣＨ２）４ＣＯＯＡＭ ＴＧ−β Ｇａｌ溶液をロードし、３０分間室温でインキュベーションした。ベクターを導入してないＧＰ２９３細胞（ｌａｃＺ陰性細胞）を陰性対照として用いた。蛍光イメージング像は、対物レンズとしてＵＡｐｏ／３４０ ４０ｘ／１．３５対物レンズ（オリンパス光学）を取り付けたＩＸ７１倒立顕微鏡（オリンパス光学）を用い、励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長５１０−５５０ｎｍの条件で撮像した。結果を第１０図に示す。図中、ＧＰ２９３細胞内部に蛍光が観察され、ＧＰ２９３細胞内部においてβ−ガラクトシダーゼが発現している結果を示す。
例１２：β−ラクタマーゼ蛍光プローブの製造
よく乾燥した容器に無水ジメチルホルムアミド８ｍｌ、化合物５ １２２．４ｍｇ（０．４ｍｍｏｌ）、２−ブロモ−１，１−ジメトキシエタン４００μｌ（４ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム１８０ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）を加えた。アルゴン置換し、１１５℃にて一晩攪拌した。炭酸セシウムを桐山漏斗で濾過後、溶媒を真空ポンプにて留去した。得られた残渣を精製水に溶解しジクロロメタンで三回振りとり、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ジクロロメタンを留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムにて精製（溶出溶媒；ジクロロメタン−メタノール（１００：４））し、化合物２１（７８．３ｍｇ、収率５０．６％、オレンジ色粉末）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ ２．０４（ｓ，３Ｈ），３．４８（ｓ，６Ｈ），３．８９（ｓ，３Ｈ），４．１１（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，２Ｈ），４．７６（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），６．４３（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），６．５７（ｄｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，２．０Ｈｚ，１Ｈ），６．４３−７．１４（ｍ，７Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ／ＣＤＣｌ３）δ １９．９１，５４．３４，５５．２９，６８．１３，１０１．０７，１０１．７１，１０５．６６，１１１．５０，１１３．５４，１１５．０２，１１５．９６，１１８．７９，１２４．４８，１２９．５３，１２９．９８，１３０．３１，１３０．６６，１３７．７９，１４９．４４，１５４．４１，１５８．８９，１６０．３２，１６２．９３，１８５．７４
ＨＲ−ＭＳ［ＥＳＩ−ＭＳ］：［Ｍ＋Ｎａ］＋ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ４４３．１４７０６，ｆｏｕｎｄ ４４３．１４７９４
よく乾燥した容器に蒸留したテトラヒドロフラン８ｍｌ、化合物２１ ５０ｍｇ（１２０μｍｏｌ）を加えた。氷浴にて０℃に保ち濃塩酸４ｍｌをゆっくり加え、アルゴン雰囲気下、一晩攪拌した。溶媒を留去し、ジクロロメタンで三回振りとり、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ジクロロメタンを留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムにて精製（溶出溶媒；ジクロロメタン−メタノール（１００：４））し、化合物２２（４０．７ｍｇ、収率９０％、オレンジ色液体）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＣＤ３ＯＤ）δ ２．０１（ｓ，３Ｈ），３．８８（ｓ，３Ｈ），４．０７（ｄｄ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ，４．９５Ｈｚ，１Ｈ），４．１３（ｄｄ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ，４．９５Ｈｚ，１Ｈ），４．９０（ｔ，Ｊ＝４．９５Ｈｚ，１Ｈ），６．４５（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，
ＨＲ−ＭＳ［ＥＳＩ−ＭＳ］：［Ｍ＋Ｈ］＋ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ３７５．１２３２５，ｆｏｕｎｄ ３７５．１１５４７
よく乾燥した容器に蒸留したアセトン２０ｍｌ、７−フェニルアセタミド−３−クロロメチル−セファロスポラン酸ｐ−メトキシベンジルエステル４９０ｍｇ（１ｍｍｏｌ）、ヨウ化ナトリウム７５０ｍｇ（５ｍｍｏｌ）を加えた。アルゴン置換し、室温で一時間半攪拌した。溶媒を留去し、酢酸エチル２５ｍｌで振りとり、１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液、蒸留水、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。そこへトリフェニルホスフィン３２０ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン置換し、室温で一晩攪拌した。析出物を桐山ロートでろ取し、酢酸エチルで洗い、化合物２３（６６４．３ｍｇ、収率７８．６％、淡黄色粉末）を得た。
ＭＲ−ＭＳ［ＥＳＩ−ＭＳ］：［Ｍ−Ｉ］＋＝７１３
よく乾燥した容器に蒸留したジクロロメタン４ｍｌ、化合物２３ １６８ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液２ｍｌを加えた。室温で一時間攪拌し、分液ロートにてジクロロメタン層を分けとり、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。それを、化合物２２ ２４ｍｇ（６４．２μｍｏｌ）が入ったフラスコに加え、室温にて一晩攪拌した。溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムにて精製（溶出溶媒；ジクロロメタン−メタノール（１００：４））し、化合物２４（１０．３ｍｇ、収率２１％、オレンジ色粉末）を得た。
ＨＲ−ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋Ｎａ］＋ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ８３１．２３５２２，ｆｏｕｎｄ ８３１．２３０７０．
よく乾燥した容器に蒸留したジクロロメタン２ｍｌ、化合物２４ １２２．６ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ）、ｍ−クロロ過安息香酸２６ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ）を加えた。アルゴン置換し、０℃で一晩攪拌した。ジクロロメタンを加え、１Ｎ炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムにて精製（溶出溶媒；ジクロロメタン−メタノール（１００：６））し、化合物２５（１０５ｍｇ、収率８４％、オレンジ色粉末）を得た。
ＨＲ−ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋Ｎａ］＋ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ８４７．２３０１３，ｆｏｕｎｄ ８４７．２３２１０．
よく乾燥した容器に蒸留したジクロロメタン３ｍｌ、化合物２５ ４０ｍｇ（０．２６ｍｍｏｌ）、アニソール１５０μｌ（１．３８ｍｍｏｌ）、トリフルオロ酢酸７５０μｌ（９．７ｍｍｏｌ）を加えた。アルゴン置換し、０℃で４時間攪拌した。溶媒を留去し、得られた残渣を精製水に溶解し酢酸エチルで三回振りとり、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、酢酸エチルを留去した。得られた残渣を逆相プレパラティブＴＬＣ（ＲＰ１８Ｗ）にて精製（溶出溶媒；アセトニトリル／水（１：１））し、化合物２６（ＴＧ−β Ｌａｃ）（９．４ｍｇ、収率２７．６％、オレンジ色粉末）を得た。
ＨＲ−ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ−Ｈ］−ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ７０３．１７５０３，ｆｏｕｎｄ ７０３．１７７１９
例１３：インビトロ β−ラクタマーゼ蛍光アッセイ
ＴＧ−β Ｌａｃ（１μＭ）を含むアッセイバッファー（リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ），Ｃａ２＋，Ｍｇ２＋非含有，ｐＨ７．４，０．１％ジメチルスルホキシド）に、測定開始５分後、０．３ｕｎｉｔのβ−ラクタマーゼを添加し、４９１ｎｍ励起、５１０ｎｍでの蛍光強度変化を経時観察した。結果を第１１図に示す。
【産業上の利用可能性】
本発明により、蛍光特性に優れた蛍光プローブが提供される。また、本発明の設計方法により、蛍光特性に優れた蛍光プローブを合理的に設計できる。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光プローブであって、下記の式（Ｉ）：
（式中、Ｒ１は水素原子、カルボキシル基、又はスルホン酸基以外の一価の置換基を示し；Ｒ２は水素原子又は一価の置換基を示し；Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子を示し；Ｒ５は測定対象物質との接触により切断される一価の基を示し、
ただし、Ｒ１及びＲ２の組み合わせは、それらが結合するベンゼン環の酸化電位が、
（１）上記切断の前には、式（Ｉ）で表される化合物が実質的に無蛍光性になるように、かつ
（２）上記切断の後には、式（Ｉ）で表される化合物に由来する切断後の化合物が実質的に高い蛍光性になるように選ばれる。）
で表される蛍光プローブ。
【請求項２】
該ベンゼン環の酸化電位が１．５５Ｖ〜１．７５Ｖの範囲となるようにＲ１及びＲ２の組み合わせが選ばれる請求の範囲第１項に記載の蛍光プローブ。
【請求項３】
該ベンゼン環の酸化電位が１．６０Ｖ〜１．７０Ｖの範囲となるようにＲ１及びＲ２の組み合わせが選ばれる請求の範囲第１項に記載の蛍光プローブ。
【請求項４】
Ｒ３及びＲ４が水素原子である請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか１項に記載の蛍光プローブ。
【請求項５】
Ｒ１が低級アルキル基であり、Ｒ２が低級アルコキシ基である請求の範囲第４項に記載の蛍光プローブ。
【請求項６】
Ｒ１が低級アルキル基であり、Ｒ２がキサンテン環残基に対してパラ位の低級アルコキシ基である請求の範囲第５項に記載の蛍光プローブ。
【請求項７】
上記の切断が加水分解により生じる請求の範囲第１項ないし第６項のいずれか１項に記載の蛍光プローブ。
【請求項８】
測定対象物質が加水分解酵素である請求の範囲第１項ないし第６項のいずれか１項に記載の蛍光プローブ。
【請求項９】
Ｒ５がリン酸エステル加水分解酵素により切断されるホスホノ基である請求の範囲第８項に記載の蛍光プローブ。
【請求項１０】
Ｒ５が糖加水分解酵素により切断される糖誘導体の残基である請求の範囲第８項に記載の蛍光プローブ。
【請求項１１】
Ｒ５がβ−ガラクトピラノシル基である請求の範囲第１０項に記載の蛍光プローブ。
【請求項１２】
Ｒ５がβ−ガラクトピラノシル基であり、Ｒ２がカルボキシ置換アルコキシ基又は４−カルボキシブトキシ基である請求の範囲第１０項に記載の蛍光プローブ。
【請求項１３】
Ｒ５がβ−ラクタマーゼにより切断される環状アミドを含む基である請求の範囲第８項に記載の蛍光プローブ。
【請求項１４】
環状アミドを含む基が下記の式で表される基である請求の範囲第１３項に記載の蛍光プローブ。
【請求項１５】
蛍光プローブの設計方法であって、請求の範囲第１項に記載の一般式（Ｉ）（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５はそれぞれ上記の定義と同義である）で表される蛍光プローブにおいて、Ｒ１及びＲ２の組み合わせとして、それらが結合するベンゼン環の酸化電位が、
（１）上記切断の前には、式（Ｉ）で表される化合物が実質的に無蛍光性になるように、かつ
（２）上記切断の後には、式（Ｉ）で表される化合物に由来する切断後の化合物が実質的に高い蛍光性になるように
組み合わせを選択する工程を含む方法。
【請求項１６】
請求の範囲第１５項に記載の設計方法により得られた蛍光プローブ。
【請求項１】
蛍光プローブであって、下記の式（Ｉ）：
（式中、Ｒ１は水素原子、カルボキシル基、又はスルホン酸基以外の一価の置換基を示し；Ｒ２は水素原子又は一価の置換基を示し；Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子を示し；Ｒ５は測定対象物質との接触により切断される一価の基を示し、
ただし、Ｒ１及びＲ２の組み合わせは、それらが結合するベンゼン環の酸化電位が、
（１）上記切断の前には、式（Ｉ）で表される化合物が実質的に無蛍光性になるように、かつ
（２）上記切断の後には、式（Ｉ）で表される化合物に由来する切断後の化合物が実質的に高い蛍光性になるように選ばれる。）
で表される蛍光プローブ。
【請求項２】
該ベンゼン環の酸化電位が１．５５Ｖ〜１．７５Ｖの範囲となるようにＲ１及びＲ２の組み合わせが選ばれる請求の範囲第１項に記載の蛍光プローブ。
【請求項３】
該ベンゼン環の酸化電位が１．６０Ｖ〜１．７０Ｖの範囲となるようにＲ１及びＲ２の組み合わせが選ばれる請求の範囲第１項に記載の蛍光プローブ。
【請求項４】
Ｒ３及びＲ４が水素原子である請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか１項に記載の蛍光プローブ。
【請求項５】
Ｒ１が低級アルキル基であり、Ｒ２が低級アルコキシ基である請求の範囲第４項に記載の蛍光プローブ。
【請求項６】
Ｒ１が低級アルキル基であり、Ｒ２がキサンテン環残基に対してパラ位の低級アルコキシ基である請求の範囲第５項に記載の蛍光プローブ。
【請求項７】
上記の切断が加水分解により生じる請求の範囲第１項ないし第６項のいずれか１項に記載の蛍光プローブ。
【請求項８】
測定対象物質が加水分解酵素である請求の範囲第１項ないし第６項のいずれか１項に記載の蛍光プローブ。
【請求項９】
Ｒ５がリン酸エステル加水分解酵素により切断されるホスホノ基である請求の範囲第８項に記載の蛍光プローブ。
【請求項１０】
Ｒ５が糖加水分解酵素により切断される糖誘導体の残基である請求の範囲第８項に記載の蛍光プローブ。
【請求項１１】
Ｒ５がβ−ガラクトピラノシル基である請求の範囲第１０項に記載の蛍光プローブ。
【請求項１２】
Ｒ５がβ−ガラクトピラノシル基であり、Ｒ２がカルボキシ置換アルコキシ基又は４−カルボキシブトキシ基である請求の範囲第１０項に記載の蛍光プローブ。
【請求項１３】
Ｒ５がβ−ラクタマーゼにより切断される環状アミドを含む基である請求の範囲第８項に記載の蛍光プローブ。
【請求項１４】
環状アミドを含む基が下記の式で表される基である請求の範囲第１３項に記載の蛍光プローブ。
【請求項１５】
蛍光プローブの設計方法であって、請求の範囲第１項に記載の一般式（Ｉ）（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５はそれぞれ上記の定義と同義である）で表される蛍光プローブにおいて、Ｒ１及びＲ２の組み合わせとして、それらが結合するベンゼン環の酸化電位が、
（１）上記切断の前には、式（Ｉ）で表される化合物が実質的に無蛍光性になるように、かつ
（２）上記切断の後には、式（Ｉ）で表される化合物に由来する切断後の化合物が実質的に高い蛍光性になるように
組み合わせを選択する工程を含む方法。
【請求項１６】
請求の範囲第１５項に記載の設計方法により得られた蛍光プローブ。
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２４０４９
【国際公開日】平成１７年３月１７日（２００５．３．１７）
【発行日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１３７２６（Ｐ２００５−５１３７２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１３１８５
【国際出願日】平成１６年９月３日（２００４．９．３）
【出願人】（５９５１０８０４４）
【出願人】（３９００３７３２７）第一化学薬品株式会社 (111)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年３月１７日（２００５．３．１７）
【発行日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１３１８５
【国際出願日】平成１６年９月３日（２００４．９．３）
【出願人】（５９５１０８０４４）
【出願人】（３９００３７３２７）第一化学薬品株式会社 (111)
【Ｆターム（参考）】
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