蛍光寿命を利用した細胞内のｐＨイメージング方法とその装置
【課題】励起光強度や蛍光物質の濃度、及び周辺環境に影響されることなく、高精度に被測定物質のｐＨ測定を可能にする。
【解決手段】生体物質中に含まれる、生体内の酸化還元反応において補酵素として働く所定の蛍光物質Ｐを励起可能な波長を含み、生体物質に組織破壊又は細胞破壊を引き起こさず、且つ、前記生体物質内のｐＨを実質的に変化させない強度を有するパルス励起光を発生させ、該パルス励起光を生体物質の所定の位置に照射し、該照射により励起された前記蛍光物質から生じる蛍光を含む光を受光し、該受光した蛍光の強度を時間分解して前記蛍光の蛍光寿命を算出し、該蛍光寿命から前記生体物質のｐＨを測定する。
【解決手段】生体物質中に含まれる、生体内の酸化還元反応において補酵素として働く所定の蛍光物質Ｐを励起可能な波長を含み、生体物質に組織破壊又は細胞破壊を引き起こさず、且つ、前記生体物質内のｐＨを実質的に変化させない強度を有するパルス励起光を発生させ、該パルス励起光を生体物質の所定の位置に照射し、該照射により励起された前記蛍光物質から生じる蛍光を含む光を受光し、該受光した蛍光の強度を時間分解して前記蛍光の蛍光寿命を算出し、該蛍光寿命から前記生体物質のｐＨを測定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体物質のｐＨを測定する方法、該ｐＨから異常領域を検出する方法、及び、これらの結果より生体物質を分析する方法、並びにこれらを実施する装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内/組織内のｐＨは、生体機能の調節因子として重要であり、細胞内/組織内のエネルギー代謝環境や酸化還元状態と密接に関係している。細胞内/組織内のｐＨ変化が関係している疾患として、癌や臓器機能低下などが挙げられる。
【０００３】
癌及び悪性腫瘍は、日本国内における死亡原因の第1位とされており、その大部分が臓器の細胞が癌化した固形癌によるものである。癌の治療においては、早期発見及び悪性化部位の特定が非常に重要であり、その診断において、疑わしい組織を採取して判断する病理組織検査が行われる。
【０００４】
病理組織検査には、検体を肉眼で観察する方法や、光学顕微鏡を用いて組織学的な検索を行う方法、また、検体を標識して顕微鏡下でその標識の物理特性の検出により生物化学的に診断する方法がある。組織学的な方法は、病理対象の形態により判断されるものであるため、診断者の経験によるところが多いという問題があった。また、検体を標識する方法は、蛍光色素により標識して、その蛍光強度を検出する方法など検出感度が良好な方法であることから多方面で用いられている。
【０００５】
特許文献１には、蛍光色素により標識した細胞のｐＨ変化を、その蛍光強度により測定して腸管の薬剤吸収性を評価する方法が開示されている。また、特許文献２には、蛍光染色することにより細胞を標識して、蛍光スペクトルに応じて細胞をグルーピングする方法が記載されている。しかしながら、蛍光色素は生体に対して有毒であることから、測定対象にダメージを与える可能性があり、また、蛍光強度や蛍光スペクトルは励起光波長や強度、蛍光物質の濃度や退色等の影響を受けて変化するうえ、複数物質からの蛍光や周囲からの蛍光の影響も分析結果に反映されることから精度の高い評価が難しい。
【０００６】
一方、蛍光寿命は、その物質の環境に反映して固有の値を有するため、励起光条件や周囲の不要な蛍光物質の影響を受けずに精度良く生体物質の環境（状態）を知ることのできる有望な情報である。特許文献３には、2つ以上の分光学的手法を組み合わせることにより、生体組織の変化に関連する形態学的変化と生物化学的変化を分離して評価して、当該組織の正確な診断を行う方法が開示されている。特許文献３には、生物化学的変化を評価する分光学的手法として、生体物質中に存在する蛍光物質を標識とし、該蛍光物質を励起して発せられる蛍光（自家蛍光）を時間分解蛍光発光測定（蛍光寿命測定）により、評価する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０００−１３９４６２号公報
【特許文献２】特表２００１−５２３３３４号公報
【特許文献３】特表２００３−５１２０８５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、特許文献３の方法では、分光学的手法による評価を少なくとも２つ実施しなければ正確な診断を行うことができないとされている。診断の簡易性、迅速性を考慮すると、診断にはできるだけ１つの評価により診断可能であることが好ましい。
【０００９】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、測定対象に大きなダメージを与えることなく、迅速に、感度良く生体物質のｐＨを測定することのできるｐＨ測定方法、ならびに、該ｐＨから異常領域を検出する方法、そして、これらの結果から生体物質を分析する方法を提供することを目的とする。
【００１０】
また本発明は、上記ｐＨ測定方法、検出方法、及び生体物質分析方法を実現可能な装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明のｐＨ測定方法は、生体物質中に含まれる、生体内の酸化還元反応において補酵素として働く所定の蛍光物質を励起可能な波長を含み、前記生体物質に組織破壊又は細胞破壊を引き起こさず、且つ、前記生体物質内のｐＨを実質的に変化させない強度を有するパルス励起光を発生させ、該パルス励起光を前記生体物質の所定の位置に照射し、該照射により励起された前記蛍光物質から生じる蛍光を含む光を受光し、該受光した蛍光の強度を時間分解して前記蛍光の蛍光寿命を算出し、該蛍光寿命から前記生体物質のｐＨを測定することを特徴とするものである。
【００１２】
また、本発明のｐＨ測定装置は、生体物質中に含まれる生体内の酸化還元反応において補酵素として働く所定の蛍光物質を励起可能な波長を含み、前記生体物質に組織破壊又は細胞破壊を引き起こさず、且つ、前記生体物質内のｐＨを実質的に変化させない強度を有するパルス励起光を発生する励起光発生手段と、該パルス励起光を前記生体物質の所定の位置に照射する励起光照射手段と、前記パルス励起光が照射されることにより励起された前記蛍光物質から生じる蛍光を含む光を受光する受光手段と、前記パルス励起光の照射と同期して前記蛍光を時間分解する時間分解手段と、該時間分解された前記蛍光を検出する検出手段と、該検出手段により検出された前記蛍光から該蛍光の蛍光寿命を算出し、該蛍光寿命に基づいて前記生体物質のｐＨを測定する測定手段とを備えたことを特徴とするものである。
【００１３】
ここで、蛍光物質によっては細胞内で、プロテインボンド状態とフリー状態などが存在する場合があるが、プロテインボンド状態、フリー状態などいずれの状態でも良い。組織や細胞中のある領域の平均値でも良い。また、「生体物質」とは、ヒト、動物の細胞や組織、体液等の生物組織を意味し、生物から採取したもの、培養したもの、ｉｎ ｖｉｖｏの細胞や組織全てを含むものとする。
【００１４】
本発明のｐＨ測定方法及びｐＨ測定装置において、前記蛍光物質は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、及びＦＡＤからなる群より選ばれる少なくとも１種の蛍光物質であることが好ましい。
【００１５】
本発明のｐＨ測定方法において、前記受光した蛍光を波長分解した蛍光スペクトルとした後、該蛍光スペクトルから波長毎に前記蛍光強度を時間分解して波長毎の前記蛍光の蛍光寿命を算出することが好ましい。従って、本発明のｐＨ測定装置は、かかる蛍光スペクトルを得る受光手段を備えていることが好ましい。
【００１６】
本発明のｐＨ測定方法において、前記蛍光が、多光子励起により励起されるものであることが好ましい。かかる構成では、前記励起光発生手段としてピコ秒からフェムト秒レーザを用いることにより、生体物質の深部の情報を容易に得ることができる。
【００１７】
また、本発明のｐＨ測定方法及びｐＨ測定装置では、前記所定の位置は、複数の位置とすることができる。かかる構成のｐＨ測定装置に、前記生体物質の異常領域を検出する検出手段を備えた構成とすることにより、前記生体物質の異常領域を検出することができる。
【００１８】
異常領域の検出は、前記生体物質の異常領域を画像化して表示して検出してもよい。
【００１９】
本発明のｐＨ測定方法及び検出方法により得られたｐＨや異常領域に基づいて、前記生体物質の病理学的性質を特定して生体物質を分析することができる。
【００２０】
本発明のｐＨ測定装置の好適な態様としては、表面に前記生体物質を接触させて保持するステージであって、前記生体物質の任意の位置に前記パルス励起光を照射できるように３次元方向に可動なステージと、該ステージを３次元方向の任意の位置に動かす位置調節手段とを備え、前記励起光照射手段が、前記パルス励起光を受光して、該パルス励起光を前記生体物質に照射する光学系を備え、前記受光手段は、前記照射により励起された前記蛍光物質から生じる蛍光を含む光を受光して該光を前記時間分解手段に導く光学系を備えた顕微鏡の態様が挙げられる。
【００２１】
また、本発明の測定装置の他の好適な態様としては、表面に前記生体物質を接触させて保持するステージであって、前記生体物質の、少なくとも前記パルス励起光の光軸方向の任意の位置に該パルス励起光を照射できるように可動なステージと、
該ステージを少なくとも光軸方向の任意の位置に動かす第１の位置調節手段と、
前記生体物質の、少なくとも前記パルス励起光の光軸に垂直な面内方向の任意の位置に該パルス励起光を照射できるように前記励起光照射手段を動かす第２の位置調節手段とを更に備えたものであり、
前記励起光照射手段は、前記パルス励起光を受光して、該パルス励起光を前記生体物質に照射する光学系を備えたものであり、
前記受光手段は、前記照射により励起された前記蛍光物質から生じる蛍光を含む光を受光して該光を前記時間分解手段に導く光学系を備えたものが挙げられる。
【００２２】
また、本発明の測定装置の他の好適な態様としては、前記生体物質の３次元方向の任意の位置に、前記パルス励起光を照射できるように前記励起光照射手段を動かす位置調節手段を更に備え、
前記励起光照射手段は、前記パルス励起光を受光して、該パルス励起光を前記生体物質に照射する光学系を備えたものであり、
前記受光手段は、前記照射により励起された前記蛍光物質から生じる蛍光を含む光を受光して該光を前記時間分解手段に導く光学系を備えたものが挙げられる。
【００２３】
また、本発明のｐＨ測定装置の他の好適な態様としては、前記励起光照射手段が、前記パルス励起光を前記生体物質に照射する少なくとも１本の照射用光ファイバを備えたものであり、前記受光手段が、前記照射により励起された前記蛍光物質から生じる蛍光を受光して該蛍光を前記時間分解手段に導く少なくとも１本の受光用光ファイバを備えたファイバプローブの態様が挙げられる。かかる態様では、前記少なくとも１本の照射用光ファイバと前記少なくとも１本の受光用光ファイバとが、１本のバンドルファイバを形成していることが好ましく、このバンドルファイバは、略中心部に配された1本の前記照射用光ファイバの外周を、複数本の前記受光用光ファイバで囲むように束ねられたものであることがより好ましい。
【００２４】
「背景技術」の項において述べたように、特許文献３には、生体物質中に存在する蛍光物質を標識とし、該蛍光物質を励起して発せられる蛍光（自家蛍光）を時間分解蛍光発光測定（蛍光寿命測定）により、生体組織の変化を生物化学的に評価する方法が開示されており、細胞内のｐＨが蛍光寿命の変化に寄与する細胞内環境の１つであることが記載されている。しかしながら、特許文献３には、蛍光寿命測定だけでは正確な診断が難しいことが記載されている。
【００２５】
本発明者は、自家蛍光の蛍光寿命の測定によりｐＨの変化をとらえるだけでは正確な診断ができないとされる原因を解明し、自家蛍光の蛍光寿命測定のみにより正確なｐＨを測定し、該測定の結果から正確な生体組織の変化を生物化学的に評価する方法及びそれを実現する装置を見出した。
【００２６】
本発明者は、細胞内ｐＨが、ピルビン酸から乳酸を産生する産生因子として働くことに注目した。ピルビン酸から乳酸を産生する反応においては、水素イオンが不可欠であり、細胞内ｐＨによる水素イオン濃度によって、ピルビン酸濃度と乳酸濃度が影響される。ピルビン酸からの乳酸の産生、ピルビン酸から産生されたアセチルＣｏＡから始まるクエン酸回路、アセチルＣｏＡからの脂肪酸合成において、いくつかの酸化還元反応が生じるが、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、及びＦＡＤは、これらの酸化還元反応において、補酵素として働く。例えば、ＮＡＤＨはピルビン酸から乳酸の産生やクエン酸回路の過程、ＮＡＤＰＨはアセチルＣｏＡからの脂肪酸合成過程、ＦＡＤはクエン酸回路の過程における補酵素となる。
【００２７】
これらの過程において、上記自家蛍光物質は、自らも酸化還元反応による水素イオンの解離/結合を生じ、吸収スペクトルが変化するため、波長によっては励起できず、蛍光を発しない場合が存在する。更に、これらの物質には、同一の励起波長で励起され、異なる蛍光寿命を有するフリー状態とプロテインボンド状態が存在する（後記実施例を参照）。
【００２８】
つまり、我々の解釈によれば、細胞内ｐＨ変化で生じた酸化還元反応によって、補酵素の水素イオンの解離/結合が生じ、補酵素の吸収スペクトルが変化することで蛍光寿命に寄与する濃度が変化する。そしてこの変化は、プロテインボンド状態に比べ、フリー状態の方が顕著に起こるため、細胞全体の平均的な蛍光寿命が変化することになる。従って、これら補酵素として働く自家蛍光物質の蛍光寿命の変化を測定することで、細胞内ｐＨに対し、精度の良い評価ができることを見出した。
【００２９】
特許文献３には、細胞内のｐＨが蛍光寿命の変化に寄与する細胞内環境の１つとして記載されているのみであり、好ましい自家蛍光物質の存在も示唆していない。このことは、蛍光寿命による評価だけでは正確な評価ができないという記載からも明確である。
【００３０】
本発明は、生体物質のｐＨを考慮して感度の良い蛍光寿命を有する自家蛍光物質を見出し、正常細胞と異常細胞との精度のよい評価を蛍光寿命の評価によるｐＨ測定のみの簡易な方法により初めて実現したものである。
【発明の効果】
【００３１】
本発明は、生体物質に含まれる生体内の酸化還元反応において補酵素として働く自家蛍光物質の蛍光寿命を測定することにより、生体物質のｐＨを高精度に測定し、正常細胞と異常細胞の特定を高精度に実施することを可能にしたものである。蛍光寿命は、物質固有の値であるため、励起光強度や蛍光物質の濃度、及び不要な物質の蛍光に影響されることなく、生体物質のｐＨを測定することができる。従って本発明によれば、励起光強度や蛍光物質の濃度、及び不要な物質の蛍光に影響されることなく、高精度に生体物質のｐＨを測定し、病理学的性質の正常・異常の特定することができる。
【００３２】
また、本発明では、自家蛍光物質の蛍光寿命を測定対象とするので、生体物質に薬物の投与等の必要がない。従って、生体物質に大きなダメージを与えることなくｐＨの測定を実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明の第１の実施形態によるｐＨ測定装置並びに異常領域検出装置、及び、生体物質分析装置の概略構成図
【図２】細胞内のｐＨに対するイメージング画像全体において蛍光寿命が短い自家蛍光成分の平均蛍光寿命測定結果を示す図
【図３Ａ】生物物質中に含まれる主な自家蛍光発光物質の励起光吸収特性を示す図
【図３Ｂ】図３Ａに示される自家蛍光発光物質の蛍光特性を示す図
【図４】時間分解による蛍光寿命の算出方法を示す図
【図５】励起光照射手段の光学系に走査手段を備えたｐＨ測定装置並びに異常領域検出装置、及び、生体物質分析装置の概略構成図
【図６】図５のｐＨ測定装置の受光手段に分光素子を備えたｐＨ測定装置並びに異常領域検出装置、及び、生体物質分析装置の概略構成図
【図７】本発明の第２の実施形態によるｐＨ測定装置並びに異常領域検出装置、及び、生体物質分析装置の概略構成図
【図８Ａ】内視鏡スコープにファイババンドルを備えた場合の内視鏡スコープの構成を示す概略図。
【図８Ｂ】内視鏡スコープにファイバプローブを備えた場合の内視鏡スコープの構成を示す概略図。
【図９Ａ】実施例１のＨｅＬａ細胞の蛍光強度イメージング結果
【図９Ｂ】実施例１のＨｅＬａ細胞の蛍光寿命イメージング結果
【発明を実施するための形態】
【００３４】
「ｐＨ測定装置の第1実施形態（顕微鏡）」
以下、図面を参照して本発明にかかる第1実施形態のｐＨ測定装置およびｐＨ測定方法について説明する。図１は、本実施形態のｐＨ測定装置１の概略構成図である。視認しやすくするため、各部の縮尺は適宜変更して示してある。
【００３５】
図１に示されるように、ｐＨ測定装置１は、生体物質である被測定物質Ｄにパルス励起光Ｌ１（以下、励起光Ｌ１とする）を励起光照射手段２０により照射し、励起光Ｌ１が照射されることにより被測定物質Ｄ中の蛍光物質Ｐから生じる蛍光Ｌｆを含む光Ｌ３を受光手段３０により受光して蛍光を得、この蛍光から所定の蛍光Ｌｆを時間分解手段４０により時間分解し、時間分解された蛍光Ｌｆを検出手段５０により検出し、検出された蛍光Ｌｆの強度から測定手段６０により蛍光減衰曲線を得て蛍光寿命Ｔｆを算出し、蛍光寿命Ｔｆに基づいて被測定物質ＤのｐＨを測定するものである。励起光Ｌ１は、被測定物質Ｄ中に含まれる生体物質中に含まれる、生体内の酸化還元反応において補酵素として働く所定の蛍光物質Ｐを励起可能な波長を含み、生体物質に組織破壊又は細胞破壊を引き起こさず、且つ、生体物質内のｐＨを実質的に変化させない強度を有するパルス励起光である。
【００３６】
蛍光寿命の測定方法は、時間領域測定法と周波数領域測定法に大別され、本実施形態においては時間領域測定法を採用する。時間領域測定法には、ストリークカメラ法、時間相関単一光子計数法、時間ゲート法等があるが、本実施形態では、時間ゲート法により蛍光寿命の測定を行う例について説明する。
【００３７】
時間ゲート法は、パルス励起光の照射と同期して、発光した蛍光をある時間領域で区切り、その範囲の蛍光強度積分値をＣＣＤ等の固体検出器で検出して時間領域を変えて測定することで近似的に蛍光減衰曲線を得る方法である。本実施形態では、ビームスプリッタ２５により励起光Ｌ１から分けられた信号光Ｌ２がフォトダイオード４４により検出されると、同期制御装置４３によりゲートコントローラ４２に対して同期信号Ｓ１が送られる。ゲートコントローラ４２は、同期信号Ｓ１を受けて予め設定された所定の時間領域にゲート信号Ｓ２を発信し、ゲート機能つきイメージインテンシファイア４１を駆動する。ゲート機能つきイメージインテンシファイア４１に入力された蛍光像Ｌｆは、ゲート信号Ｓ２に応じた時間領域において増強されて、検出手段５０により、所定の蛍光Ｌｆの蛍光強度の積分値（蛍光信号）Ｌｔが検出される。この工程をゲート信号Ｓ２に応じて繰り返し、測定手段６０により単一指数関数による解析を行って蛍光寿命Ｔｆを算出する。
【００３８】
本発明者らは、各種自家蛍光物質の蛍光寿命を時間相関単一光子計数法（ＴＣＳＰＣ）、時間ゲート法により測定を重ね、現状の蛍光寿命測定において２つの蛍光寿命を分離できる限界値が蛍光寿命が０．０３ｎｓｅｃであることを見出した。本実施形態のｐＨ測定装置では、正常細胞と異常細胞とのｐＨ変化により、蛍光寿命が０．０３nsec以上異なる自家蛍光物質を励起して、その蛍光寿命を測定することにより高精度にｐＨを測定して生体物質の正常と異常を特定するものである。
【００３９】
既に述べたように、細胞内ｐＨが、ピルビン酸から乳酸の産生因子として働き、細胞内ｐＨによる水素イオン濃度によってピルビン酸濃度と乳酸濃度が影響される。ピルビン酸からの乳酸の産生、ピルビン酸から産生されたアセチルＣｏＡから始まるクエン酸回路、アセチルＣｏＡからの脂肪酸合成において、いくつかの酸化還元反応が生じるが、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、及びＦＡＤは、これらの酸化還元反応において、補酵素として働く。例えば、ＮＡＤＨはピルビン酸から乳酸の産生やクエン酸回路の過程、ＮＡＤＰＨはアセチルＣｏＡからの脂肪酸合成過程、ＦＡＤはクエン酸回路の過程における補酵素となる。
【００４０】
これらの過程において、自らも酸化還元反応による水素イオンの解離/結合を生じ、吸収スペクトルが変化するため、波長によっては励起できず、蛍光を発しない場合が存在する。更に、これらの物質には、同一の励起波長で励起され、異なる蛍光寿命を有するフリー状態とプロテインボンド状態が存在する（後記実施例を参照）。
【００４１】
我々は、細胞内ｐＨ変化で生じた酸化還元反応によって、補酵素の水素イオンの解離/結合が生じ、補酵素の吸収スペクトルが変化することで蛍光寿命に寄与する濃度が変化し、この変化は、プロテインボンド状態に比べ、フリー状態の方が顕著に起こるため、細胞全体の平均的な蛍光寿命が変化すると考えている。従って、これら補酵素として働く自家蛍光物質の蛍光寿命の変化を測定することで、細胞内ｐＨに対し、精度の良い評価ができることを見出した。
【００４２】
図１に示される顕微鏡型のｐＨ測定装置及び異常領域検出装置を用いて、培養したＨｅＬａ細胞のｐＨの測定を行った。
まず、ｐＨの異なるＨｅＬａ細胞を調製し、ＨｅＬａ細胞のｐＨと蛍光寿命との関係を導出した。所定のｐＨのＨｅＬａ細胞は、培地としてＤ-ＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium；ＳＩＧＭＡ社）を用い、石英ガラスボトムディッシュにＨｅＬａ細胞を適量まき、３７℃、５％ＣＯ２下のインキュベータで１〜２日培養した後、0.1 mol/L のＮａＯＨ溶液、ＨＣｌ溶液でｐＨを調整したＫＣｌ-ｒｉｃｈ ｍｅｄｉａに適量のニゲリシンを加え、前記培地をＫＣｌ-ｒｉｃｈ ｍｅｄｉａに置換して調製した。ニゲリシンはエンドソームのｐＨ低下阻害剤であり、Ｋ＋／Ｈ＋のイオノフォアとして働き、細胞内外のｐＨを同じにする役割を果たす。ＨｅＬａ細胞がそれぞれのｐＨになっていることを確認した後、顕微鏡のｘｙｚステージ上に設置したインキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２）に１５分ほどおいて、ｐＨの異なる複数の測定試料を用意した。
【００４３】
これらの試料に対して、蛍光寿命の測定を行った。ここで、励起する自家蛍光物質はＮＡＤＨとＮＡＤＰＨとし、励起光として、１ピコ秒パルス幅のチタンサファイアレーザのＳＨＧ光を使用し、ＮＡＤＨとＮＡＤＰＨの励起波長である３７０ｎｍの光（還元型のみ励起される）となるように励起光の波長を調整し、４１７〜４７７nmの蛍光フィルターを用いて蛍光寿命の測定を行った。このとき、励起光の平均パワーは０．９ｍＷ、パルスエネルギーは１２ｐＪとし、ＨｅＬａ細胞の所定の位置にレーザ光が照射され、レーザ光の焦点がＨｅＬａ細胞に合うようにｘｙｚステージを調整した。測定温度は２３度である。
【００４４】
得られた結果を図２に示す。図２においては、縦軸は細胞内のｐＨに対するイメージング画像全体の平均蛍光寿命を示しており、更に、それぞれのｐＨに対して試料を変え、複数回測定した結果を平均して求めた値とした。図２を最小二乗法でフィッティングした結果、以下の関係式を導出することができた。
【００４５】
[ｐＨ] =３３．３-１１．９×[蛍光寿命(ｎｓｅｃ.)] ・・・（１）
また、図２に示されるように、ＮＡＤＨとＮＡＤＰＨは、ｐＨが６．５から７．５の間で蛍光寿命は０．０８ｎｓｅｃ変化しており、上記した蛍光寿命の測定限界を考慮すると、ｐＨ差０．３〜０．４の測定が十分に可能であり、高い感度を有していることが確認された。
【００４６】
以上の結果より、生体物質に含まれる生体内の酸化還元反応において補酵素として働く自家蛍光物質の蛍光寿命を測定することにより、生体物質のｐＨを高精度に測定し、励起光強度や蛍光物質の濃度、及び不要な物質の蛍光に影響されることなく、高精度に生体物質のｐＨを測定し、病理学的性質の正常・異常の特定することができることがわかった。
【００４７】
細胞内において、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ及びＦＡＤは主に細胞質またはミトコンドリア存在する。従って、細胞質またはミトコンドリアの領域を計測すれば、細胞内のｐＨの分析が可能であり、好ましい。また、核におけるＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ及びＦＡＤの量は少量であるが、核周辺の細胞質またはミトコンドリアからのＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ及びＦＡＤが自家蛍光を発するため、核の領域を計測してもよい。
【００４８】
ｐＨ測定装置１は共焦点系顕微鏡であり、被測定物質Ｄは、位置調節手段９１によりｘｙｚ方向に移動可能なサンプルステージ９０上に接触されており、位置調節手段９１により、サンプルステージ９０の位置を調節して、被測定物質Ｄの所定の位置に対物レンズ（光学系）２１（３１）により集光された励起光Ｌ１を照射することができる。ｐＨ測定装置１には、正確に所定の位置に励起光Ｌ１が照射できるように、被測定物質Ｄの上方から被測定物質Ｄにおける励起光Ｌ１の照射位置を確認することができるように、拡大レンズ等を備えた窓（図史略）を備えた構成としてもよい。
【００４９】
ｐＨ測定装置１において、励起光発生手段１０は、被測定物質Ｄ中の生体物質中に含まれる、生体内の酸化還元反応において補酵素として働く所定の蛍光物質を励起可能な波長を含み、生体物質に組織破壊又は細胞破壊を引き起こさず、且つ、生体物質内のｐＨを実質的に変化させない強度を有するパルス励起光を発生するパルスレーザ１１と、パルスレーザ１１より発振されたパルスを、所定の間隔にて出射させるように間引くパルスピッカー１２とを含む。パルスレーザ１１は、特に制限されないが、超短パルス光を発振できるレーザであることが好ましく、数十フェムト秒〜数十ピコ秒の時間範囲内でパルス発振可能なレーザであることがより好ましい。パルスレーザ１１としては、例えば、発振波長８４０ｎｍのチタンサファイアレーザの第２次高調波（ＳＨＧ）である波長４２０ｎｍ、パルス幅３ｐｓ、繰り返し周波数８０ＭＨｚ、ピークパワー８ｋＷ、平均パワー２Ｗ等を用いることができる。また、励起光発生手段１０には、第３次高調波（ＴＨＧ）や光パラメトリック発信器（Optical Parametric Oscillator:ＯＰＯ）等の波長変換素子を備えた構成としてもよい。本実施形態ではパルスピッカー１２を用いているが、パルスピッカーで間引きせず、所望の繰り返しに調整した光源を使用してもよい。
【００５０】
また、被測定物質Ｄ内において励起される蛍光Ｌｆは多光子励起によるものでもよい。その場合は、多光子励起可能な波長及びパルス幅の励起光Ｌ１として、発振波長８４０ｎｍのチタンサファイアレーザ、パルス幅１００ｆｓ、繰り返し周波数８０ＭＨｚ、ピークパワー１００ｋＷ、平均パワー０．８Ｗ等を用いる。多光子励起では、所望の箇所だけ励起が可能なので、周辺部の蛍光低減ができより低雑音化ができ、また観察箇所より前の部分での吸収減衰を低減できるので効率よく観察箇所に励起光Ｌ１を照射することができる。また、高い空間分解能で分析もできる。
【００５１】
励起光発生手段１０から出射された励起光Ｌ１は、励起光照射手段２０に入射され、励起光照射手段２０により被測定物質Ｄの所定の位置に照射される。励起光照射手段２０の構成は特に制限されないが、本実施形態では、励起光Ｌ１の照射と被測定物質Ｄから発生した、蛍光物質Ｐの励起による蛍光Ｌｆを含む光Ｌ３の受光を同一の対物レンズ（光学系）２１（３１）で行う構成としている。従って、励起光照射手段２０には、被測定物質Ｄの所定位置に励起光Ｌ１を照射し、且つ、光Ｌ３を受光できるように配された対物レンズ２１及び、励起光Ｌ１を対物レンズ２１に入射させ、且つ、光Ｌ３を時間分解手段４０に導くダイクロイックミラー２２（３２）を備えている。対物レンズ２１としては、励起光Ｌ１及び蛍光の透過率が高く、レンズ素材による蛍光の発生の少ないものが好ましい。
【００５２】
また、本実施形態では、励起光Ｌ１の照射と時間分解手段４０を同期して駆動させるため、励起光照射手段２０に同期信号Ｓ１を発信させる信号光Ｌ２を励起光Ｌ１から分割させるビームスプリッタ２５を、そして、励起光Ｌ１を蛍光物質Ｐの励起波長の光に絞り込む励起フィルター２３を備えている。励起光照射手段２０には、必要に応じて励起光Ｌ１を導光するミラー（２４，２６）やレンズ等（図示略）を備えてよい。
【００５３】
受光手段３０は、励起光Ｌ１の照射により被測定物質Ｄにおいて生じた光Ｌ３を受光して時間分解手段４０に目的とする蛍光Ｌｆを出力できれば特に制限されないが、本実施形態では、被測定物質Ｄから発生した光Ｌ３を受光する対物レンズ３１（２１）と、光Ｌ３を時間分解手段４０に導くダイクロイックミラー３２（２２）と、光Ｌ３から散乱光等のノイズ光を除去するフィルター３３とを備えている。
【００５４】
対物レンズ（光学系）３１及びダイクロイックミラー３２については上述の通りである。フィルター３４は、検出する蛍光Ｌｆの波長に応じて、バンドパスフィルターやショートパスフィルタ等適宜選択して用いればよい。複数種類の蛍光Ｌｆを観測するときは、異なる透過波長帯域を有する複数のバンドパスフィルターを用いたり、あるいは透過波長帯域が可変のものを用いるようにしてもよい。
【００５５】
受光手段３０により得られた蛍光Ｌｆは、時間分解手段４０に入力される。時間分解手段４０は、蛍光Ｌｆの、所定の時間領域の蛍光信号Ｌｔを取り出して検出手段５０に出力するものである。蛍光の時間分解は、励起光Ｌ１の照射に対する最初の同期信号Ｓ１の受信時ｔ０から開始する。同期信号Ｓ１は、励起光Ｌ１からビームスプリッタ２５により分けられた信号光Ｌ２が、光検出器４４で電気信号に変換されて同期制御装置４３から、ゲートコントローラ４２に送られる。
【００５６】
受光手段３０により得られた蛍光Ｌｆは、時間分解手段４０に入力される。時間分解手段４０は、所定の蛍光Ｌｆの、所定の時間領域の蛍光像を取り出して検出手段５０に出力するものである。蛍光の時間分解は、励起光Ｌ１の照射に対する最初の同期信号Ｓ１の受信時ｔ０から開始する。同期信号Ｓ１は、励起光Ｌ１からビームスプリッタ２５により分けられた信号光Ｌ２が、光検出器４４で電気信号に変換されて同期制御装置４３から、ゲートコントローラ４２に送られる。
【００５７】
光検出器４４としては特に制限なく、一般的に用いられているフォトダイオード等を用いることが好ましい。
【００５８】
同期制御装置４３は、光検出器４４から出力された信号を受けてゲートコントローラ４２に同期信号Ｓ１を出力できれば特に制限なく、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）等を用いることができる。ゲートコントローラ４２は、同期信号Ｓ１を受けて予め設定された所定の時間領域にゲート信号Ｓ２を発信し、ゲート機能つきイメージインテンシファイア４１のゲートの開閉を指示する。ゲート機能つきイメージインテンシファイア４１には、ＣＣＤカメラ等の検出手段５０が接続されており、ゲート信号Ｓ２に基づいてゲートを開閉し、ゲートが開いているときに受光した蛍光信号Ｌｔを増幅させ、コントラストの向上した蛍光像ＬｓをＣＣＤやＰＭＴ等の検出手段５０により受光して電気信号として蓄積し、検出する。例えば、ゲートコントローラ４２が同期信号Ｓ１を最初に受けた時刻を基準時刻ｔ０として、時間Δｔの間だけゲート機能付きイメージインテンシファイア４１のゲートを開くように指示するゲート信号Ｓ２を出力すると、ゲート機能付きイメージインテンシファイア４１により、ｔ０〜Δｔの間の蛍光信号Ｌｔを増幅させて検出手段５０に出力し、検出手段５０は、その時間範囲の蛍光Ｌｆを検出して、その蛍光強度の積分値Ｓ３を測定手段６０に出力する。この蛍光強度Ｓ３の検出工程を、ゲート信号に応じて繰り返すことにより、時間分解された蛍光強度を測定手段６０に出力する。
【００５９】
測定手段６０としては特に制限ないが、ＰＣ等のコンピュータシステムを用いることが簡易であり好ましい。測定手段６０は、同期制御装置４３とを同じ装置により兼ねてもよい。測定手段６０は、時間分解された蛍光強度Ｓ３から蛍光減衰曲線を求めて蛍光強度時間分布を得る。この蛍光減衰曲線において、蛍光強度が1/eになった時間ｔｆと発光の開始時ｔ０との差を蛍光寿命Ｔｆとして算出する。図４に、時間分解された蛍光強度から得られた蛍光強度時間分布及び蛍光減衰曲線から求められた蛍光寿命Ｔｆを示す。図４において、ｔ０からの経過時間ｔにおける蛍光強度Ｉとt０における蛍光強度Ｉ０とは、下記式の関係で表される。分析手段６０では、Ｓ３がある時間ｔにおける蛍光強度Ｉとなる。
【００６０】
Ｉ＝Ｉ０ｅ−ｔ／Tf
次に、測定手段６０は得られた蛍光寿命Ｔｆに基づいて、被測定物質Ｄの所定の位置におけるｐＨを測定する。自家蛍光物質の蛍光寿命は、その周辺のｐＨにより変化することが知られている。
【００６１】
従って、正常状態の被測定物質Ｄにおける蛍光寿命を予め調べておくことにより、被測定物質Ｄの所定の位置における自家蛍光物質の蛍光寿命から、その位置のｐＨの変化を、また、ｐＨに対する蛍光寿命の変化率を予め得ておくことにより、具体的なｐＨ値を測定することができる。時間ゲート法の蛍光寿命イメージングを利用したｐＨ分析においては、ゲート数を増やして分析することにより、より分析精度は高くなる。
【００６２】
ｐＨ測定装置１では、ステージ９０をｘｙｚ方向（励起光照射面の面内方向及び深さ方向）に移動させることができるので、被測定物質Ｄの複数の所定の位置において２次元あるいは３次元のｐＨの測定が可能である。
【００６３】
また図５に示されるｐＨ測定装置４のように、ステージ９０’をｚ方向のみ可動とし、走査光学系２７をｘｙ方向に走査させる共焦点系の光学系としてもよい。走査光学系２７としては、ガルバノミラーやポリゴンミラー、レゾナントミラー等が挙げられる。
【００６４】
かかる構成とする場合は、励起光Ｌ１により励起される蛍光の種類が複数になる可能性が高いため、図６に示されるｐＨ測定装置７のように、受光手段３０により受光した蛍光Ｌｆを分光して時間分解手段４０に蛍光Ｌｆの蛍光スペクトルＬｓを出力する分光手段３５を備えた構成とすることが好ましい。蛍光Ｌｆを分光して蛍光スペクトルＬｓを時間分解することにより、より高精度に複数の蛍光を分離して所定の波長の蛍光の蛍光寿命を測定することができる。分光素子３５としては、蛍光Ｌｆを分光可能なものであれば特に制限なく、回折格子やプリズム等が挙げられる。
【００６５】
図５又は図６に示される走査光学系を備えた構成は、局所的な励起を行う多光子励起の場合等に、特に好ましく用いることができる。
【００６６】
複数の位置におけるｐＨ測定により、被測定物質Ｄの異常領域を分析する方法については後記する。
本実施形態のｐＨ測定装置１，４，７は以上のように構成されている。
【００６７】
次に、ｐＨ測定装置１を例に本実施形態のｐＨ測定装置の動作例について説明する。
まず、ステージ９０上に被測定物質Ｄを接触させ、所定の位置に励起光Ｌ１が照射されるように位置調節手段９１によりステージ９０の位置を調整する。
【００６８】
励起光発生手段１０からは被測定物質Ｄ中の生体物質中に含まれる、生体内の酸化還元反応において補酵素として働く所定の蛍光物質を励起可能な波長を含み、生体物質に組織破壊又は細胞破壊を引き起こさず、且つ、生体物質内のｐＨを実質的に変化させない強度を有するパルス励起光Ｌ１が出射されて、励起光照射手段２０に入射する。励起光照射手段２０に入射された励起光Ｌ１は、ビームスプリッタ２５により同期用信号光Ｌ２を分離した後、に対物レンズ（光学系）２１により集光されて、被測定物質Ｄの所定の位置に照射される。この照射により、被測定物質Ｄからは、蛍光物質Ｐが励起されて蛍光Ｌｆが発せられる。受光手段３０の対物レンズ３１は、被測定物質Ｄから発せられた光Ｌ３を受光する。光Ｌ３には、蛍光Ｌｆ以外のノイズ光も含まれているが、フィルター３４を通過することにより、ほぼ蛍光Ｌｆ以外の光が排除される。
【００６９】
ほぼ蛍光のみとなった光Ｌ３は、時間分解手段４０に入射されて、所定の蛍光Ｌｆを取り出して時間分解され、検出手段５０により各時間における蛍光強度Ｓ３が検出され、電気信号として測定手段６０に出力される。測定手段６０は、時間分解された蛍光強度から蛍光強度−時間曲線を得、この曲線において、蛍光強度が略１／ｅになった時間ｔｆとｔ０との差を蛍光寿命Ｔｆとして算出し、蛍光寿命Ｔｆに基づいて、被測定物質ＤのｐＨを測定する。
【００７０】
上記のように、本実施形態のｐＨ測定方法及びｐＨ測定装置１，４，７は、生体物質に含まれる生体内の酸化還元反応において補酵素として働く自家蛍光物質の蛍光寿命を測定することにより、生体物質のｐＨを高精度に測定し、正常細胞と異常細胞の特定を高精度に実施することを可能にしたものである。蛍光寿命は、物質固有の値であるため、励起光強度や蛍光物質の濃度、及び不要な物質の蛍光に影響されることなく、生体物質のｐＨを測定することができる。従って本発明によれば、励起光強度や蛍光物質の濃度、及び不要な物質の蛍光に影響されることなく、高精度に生体物質のｐＨを測定し、病理学的性質の正常・異常の特定することができる。
【００７１】
また、本実施形態では、自家蛍光物質の蛍光寿命を測定対象とするので、生体物質に薬物の投与等の必要がない。従って、生体物質に大きなダメージを与えることなくｐＨの測定を実施することができる。
【００７２】
以上述べたｐＨ測定装置１，４，７の効果は、後述の実施形態のｐＨ測定装置も同様に奏するものである。
【００７３】
また、被測定物質に対して照射する励起光のスポット径を絞って微小領域での蛍光寿命を測定し、測定位置をずらして被測定物質の測定対象領域の測定を行う共焦点顕微鏡方式である場合について説明したが、被測定物質に応じて広範囲の画像化が必要な場合等は、励起光のスポット径を絞らずに一度に広範囲のｘｙ面の情報を取得するワイドフィールド方式としてもよく、走査手段を用いずに、検出手段としてＣＣＤカメラ等を用いて画面全体を撮像する。また、この場合、ステージ９０（９０’）をｘｙ方向に走査可能とし、複数のｘｙ面領域を検出しそれらを合成することでより広範囲な領域の画像化が可能となる。
【００７４】
「ｐＨ測定装置の第２実施形態（ファイバプローブ）」
次に、本発明の別の実施形態にかかるｐＨ測定装置について説明する。第１実施形態のｐＨ測定装置１，４，７は、顕微鏡であったが、本実施形態のｐＨ測定装置１０は、ファイバプローブである点で第1実施形態と異なっている。なお、以降の実施形態の説明および図面においては、前述の実施形態の構成要素と実質的に同一の機能を有する構成要素については、同一の符号を付することにより重複説明を省略する。
【００７５】
図７に示されるように、ｐＨ測定装置１０は、第１実施形態の対物レンズ２１（３１）が、バンドルファイバ２１’（３１’）である点を除けば、第１実施形態と同様の構成としている。
【００７６】
バンドルファイバ２１’（３１’）は、中央部にパルス励起光Ｌ１を導光させ、励起光Ｌ１を被測定物質Ｄの所定の位置に照射する照射用光ファイバ２００が略中心部に配され、励起光Ｌ１の照射により被測定物質Ｄ中に含まれる生体内の酸化還元反応において補酵素として働く自家蛍光物質Ｐから生じる蛍光Ｌｆを含む光Ｌ３を受光して、光Ｌ３を時間分解手段４０に導く複数の受光用光ファイバ３００を照射用光ファイバ２００の外周を囲むように配して束ねられた構成としている。図７では、受光用光ファイバ３００が７本である構成を示しているが、その本数は限られるものではなく、照射用光ファイバ及び受光用光ファイバは共に１本以上であれば、受光可能な蛍光強度等に応じて適宜本数及びファイバ径は選択することができる。
【００７７】
バンドルファイバ２１’（３１’）は、照射用光ファイバ２００と受光用光ファイバ３００とを所定の配置となるように、接着剤等により固定して作製される。接着剤としては、使用する励起光Ｌ１に合わせた耐熱温度を有するものが好ましい。要求される耐熱温度が３００℃を超える場合は無機系の耐熱接着剤が用いられる。固定されたバンドルファイバは、体腔内に挿入される略円筒形の長尺のシース内に備えられた構成としたファイバプローブとして使用することができる（図示略）。
【００７８】
照射用光ファイバ２００及び受光用光ファイバ３００としては特に制限ないが、励起光Ｌ１の透過率が良く、また、励起光Ｌ１による劣化を生じない材料を用いることが好ましい。特に、励起光Ｌ１が紫外光や紫外光に近い短波長光である場合は、光エネルギーが大きいため、石英系の光ファイバであることが好ましい。
【００７９】
第２実施形態では、被測定物質Ｄへの励起光Ｌ１の照射と蛍光Ｌｆを含む光Ｌ３の受光をファイバプローブＦで行うことができるため、ｉｎ ｖｉｖｏでの測定など、生体内での測定が可能であり、また、被測定物質Ｄの所定の位置の位置決めも、測定者自身が直接プローブを動かして行うことができる。例えば、図８Ａ及びＢに示されるような内視鏡スコープ１００の鉗子口チャンネル１０１に上記バンドファイバ２１’（３１’）を備えた構成、または、内視鏡スコープ１００の鉗子口チャンネル１０１にファイバプローブＦを通して使用することができる。この場合、図８Ａ及び図８Ｂに示されるように、内視鏡スコープ１００には、体腔内の所定の位置に照明光を照射する照明部１０２と、所定の位置で反射された反射光Ｌ４を撮像する撮像部１０３と、送気送水ノズル１０４が備えられている。照明部１０２は所定の位置を照明可能な光源に接続されており、撮像部１０３は所定の位置を測定者が視認可能なモニター等に接続されているがここでは図示は省略する。
【００８０】
第２実施形態の構成では、動物はもちろん、ヒトの体内の組織のｐＨを直接測定することができる。例えば、ヒトの消化器や気管等の検査に好ましく用いることができる。
【００８１】
「異常領域検出装置（検出装置）」
図１，図５，図６を参照して、本実施形態の異常領域検出装置（検出装置）２，５，８について説明する。
既に述べたように、ｐＨ測定装置１（４，７）では、ステージ９０（９０’）をｘｙ方向（励起光照射面の面内方向）及びｚ方向（光軸方向）に移動させることができるので、被測定物質Ｄの複数の所定の位置においてｐＨの測定が可能である。従って、例えば、複数の所定の位置を被測定物質Ｄのｘ−ｙ面内にむらなく設定することにより、被測定物質Ｄの面内ｐＨ分布を得ることができる。また、２光子蛍光等の多光子励起を利用することにより、被測定物質の深部の蛍光を検出することもできる。従って、その際は、被測定物質Ｄのｚ方向にも測定点を設定することによって３次元のｐＨ分布を得ることができる。
【００８２】
また、ワイドフィールド方式のｐＨ測定装置とした場合でも、上記ｐＨ測定装置の実施形態において述べたように、一度にｘｙ面の情報を取得することができるので、同様に被測定物質Ｄの面内ｐＨ分布を容易に得ることができる。
【００８３】
従って、ｐＨ測定装置１，４，７に、被測定物質ＤのｐＨ分布を検出可能な異常領域検出手段８０を備えた構成とすることにより、例えば、異常領域を検出する異常領域検出装置２（５，８）とすることができる。
【００８４】
異常領域検出手段８０としては、ＣＣＤ又は冷却ＣＣＤ等のアレイ検出器等を用いることができる。
【００８５】
更に、異常領域検出装置２（２’）は、異常領域検出手段８０による検出結果を画像化して表示する表示手段８１を更に備えた構成とすることにより、面内ｐＨ分布や異常領域を明確に視認することができる。画像化の手法は、従来から用いられている方法を用いればよく、面内ｐＨ分布を色別に表示する手法や、３次元的に面内濃度分布を表す手法を用いてもよい。複数画像を取得した場合など、それらを画像合成して表示してもよい。
【００８６】
また、図７に示されるようなファイバプローブ型のｐＨ測定装置１０の場合は、測定者自身が直接プローブを動かして任意の領域におけるｐＨを測定することができるので、ｐＨ測定装置１を用いる場合と同様に、被測定物質ＤのｐＨ分布を検出可能な異常領域検出手段８０を備えた構成とすることにより異常領域検出装置１１とすることができる。
【００８７】
かかる実施形態では、異常領域検出手段８０としては、ファイバプローブの先端に取り付けて使用するＭＥＭＳスキャナ等を使用したり、被測定物質を配置するステージ９０に稼動部９１を設けることにより好適に画像検出を行うことができる。
【００８８】
本実施形態の異常検出装置２（２’）は、上記実施形態のｐＨ測定装置を備えた構成としているので、上記ｐＨ測定装置１（１’）と同様の効果を奏する。
【００８９】
「生体物質分析装置」
図１，図５，図６，図７を参照して、本実施形態の生体物質分析装置３（６，９，１２）について説明する。生体物質分析装置３（６，９，１２）は、上記異常領域検出装置２（５，８，１１）に、測定されたｐＨから、被測定物質Ｄの病理学的性質を特定する分析手段７０を備えた構成としている。
生体組織に異常を生じると、その組織内のｐＨが変化することが知られている。例えば、癌化（悪性腫瘍化）した場合や、肝臓疾患等の疾患の場合は、ｐＨが低くなる。従って、上記ｐＨ測定装置１（４，７，１０）又は、異常領域検出装置２（５，８，１１）に、より、被測定物質Ｄの所定の位置又は領域における、悪性腫瘍状態の有無等の病理学的性質、及びその度合いを特定することができる。
【００９０】
本実施形態の構成では、被測定物質Ｄの面内のｐＨ分布を得ることができることから、被測定物質Ｄの面内において、病理学的性質の異常範囲を特定することができ、また、その範囲内での異常の度合いを特定することができる。
【００９１】
悪性腫瘍（癌）の治療では、患部を切除して摘出する外科療法と、切除せずに放射線を照射することにより癌細胞を死滅させる放射線療法などがある。本実施形態の生体物質分析装置によれば、癌化した範囲を特定できることから、外科療法においては、的確に切除する必要範囲のみを切除することができる。癌腫瘍の摘出手術では、癌細胞が患者の身体に残存すると再発の可能性が高まり好ましくないが、再発を恐れるあまり、過剰に組織を切除するのも患者の身体の負担が増大し好ましくない。そこで、必要範囲と判断される部分のみを摘出し、その後、摘出腫瘍が接していた領域の組織を微少量切り取り、本発明のｐＨ測定装置を用いて癌細胞の有無を調べる、或いは、摘出腫瘍自体を被測定物質（サンプル）とし、その切除面に対してｐＨ測定装置によりｐＨの測定を行い切除面の癌細胞の有無を調べる。いずれの場合も、癌細胞が検出された場合はさらなる切除が必要と判断し、癌細胞が検出されなかった場合は摘出が十分であったと判断することができる
また、放射線療法においても、放射線照射が必要な範囲を的確に認識して照射することができるため、放射線によりダメージを受ける正常細胞を極力少なくすることができる。
【００９２】
上記したように、本実施形態の生体物質分析装置では、高精度にｐＨを測定することのできるｐＨ測定装置を備えた構成としているので、癌化した部分等の患部の高精度なｐＨ情報を、患部の位置情報とともに得ることが可能である。従って、本実施形態の生体物質分析装置によれば、放射線療法において、患部の状態に応じた的確な放射線の種類及び強度を選択することができるため、良好な治療効果を得ることができる。また、内視鏡的粘膜下層剥離術（ＥＳＤ）を施術する場合においても、患部の範囲及び状態を特定することができるため、的確な部位を剥離して、患者への負担を最小限に抑えた治療を行うことができる。
【００９３】
また、癌腫瘍の摘出の判断は手術中に短時間で行う必要がある。上記したように、上記実施形態のｐＨ測定装置は、迅速な測定を行う事ができるため、癌治療の治療方針の決定に用いる分析装置としては、スループットが高く、好ましい。
【００９４】
細胞または組織は個々で細胞環境にばらつきがある。その要因は、同じ正常細胞または癌細胞中における、細胞の活性状態やストレス状態、衰弱状態の違いなどが挙げられる。そのため、細胞または組織からの自家蛍光寿命もまた、その個々の環境に反映してばらついてしまう。
【００９５】
実際の疾患部の測定においては、十分な臨床データから検量線を作成することが必要である。次に、測定したい部位の測定を測定領域を変えて繰り返し、より確からしいデータを取得することが必要である。このように測定することで、ばらつきが大きい細胞や組織においても、より精度の高いｐＨ測定と臨床的判断をすることができる。
【００９６】
一例として、担癌マウスにおける癌組織と正常組織の境界部のｐＨ測定を行った。ここで、励起する自家蛍光物質はＮＡＤＨとＮＡＤＰＨとし、励起光として、１ピコ秒パルス幅のチタンサファイアレーザのＳＨＧ光を使用し、ＮＡＤＨとＮＡＤＰＨの励起波長である３７０ｎｍの光（還元型のみ励起される）となるように励起光の波長を調整し、４１７〜４７７nmの蛍光フィルターを用いて蛍光寿命の測定を行った。このとき、励起光の平均パワーは０．９ｍＷ、パルスエネルギーは１２ｐＪとし、癌組織と正常組織の境界部の所定の位置にレーザ光が照射され、レーザ光の焦点が癌組織と正常組織の境界部に合うようにｘｙｚステージを調整した。
【００９７】
検量線は十分な臨床データから作成したものである。癌組織、正常組織の別々の３領域をそれぞれ測定し、３つの値から蛍光寿命平均値を求め、検量線と比較したところ、癌細胞がｐＨ７．１、正常細胞がpH７．２と求められた。しかし、今度は癌組織、正常組織の別々の１０領域をそれぞれ測定し、１０つの値から蛍光寿命平均値を求めたところ、癌細胞がｐＨ６．８、正常細胞がpH７．３と求められた。ｐＨ差０．５は蛍光寿命によるｐＨ分解能０．３〜０．４より大きな値である。このように、測定回数を増やすことで、より精度の高い測定かつ臨床的判断が可能となった。
【００９８】
「設計変更」
以上、本発明によるｐＨ測定装置、該ｐＨ測定装置を備えた異常領域検出装置、及び生体物質分析装置の好ましい実施の形態について説明したが、本発明は上記実施の形態に限定されるものではなく、発明の要旨を変更しない限りにおいて、種々変更することが可能である。
【００９９】
被測定物質Ｄの病理学的性質の特定は、分析手段７０を用いて行う構成について説明したが、ｐＨと病理学的性質の異常度合いとの関係が明確となっている場合には、上記実施形態のｐＨ測定装置及び異常領域検出装置のみによっても、生体物質の病理学的性質を特定することができる。従って、上記した生体物質分析装置において述べた治療効果は、上記実施形態のｐＨ測定装置及び異常領域検出装置によっても得ることができる。
【実施例】
【０１００】
以下に、本発明に係る実施例について説明する。
（実施例１）
図１に示される顕微鏡型のｐＨ測定装置及び異常領域検出装置を用いて、培養したｐＨ無調整のＨｅＬａ細胞のｐＨの測定を行った。図９に測定したＨｅＬａ細胞の蛍光強度画像（図９Ａ）と蛍光寿命画像（図９Ｂ）を示す。同じ条件のサンプルに対し、測定領域を変えて３回測定した。３枚の画像全体の平均蛍光寿命は２．２４ｎｓｅｃであった。従って、（１）式により、得られた蛍光寿命からｐＨを導出した結果、このＨｅＬａ細胞のｐＨは、６．６であると見積もることができた。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明のｐＨ測定方法、異常領域検出方法、及び生体物質分析方法、並びに各装置は、正常細胞と異常細胞（癌細胞等）の診断及び分離に好ましく用いることができる。
【符号の説明】
【０１０２】
１，４，７，１０ ｐＨ測定装置
２，５，８，１１ 異常領域検出装置
３，６，９，１２ 生体物質分析装置
１０ 励起光発生手段
１１ レーザ（光源）
２０ 励起光照射手段
２１，３１ 対物レンズ（光学系）
２１’，３１’ 光ファイバ（バンドルファイバ）
２００ 照射用光ファイバ
３００ 受光用光ファイバ
３０ 受光手段
４０ 時間分解手段
５０ 検出手段
６０ 測定手段
７０ 分析手段
８０ 異常領域検出手段
８１ 表示手段
９０，９０’ ステージ
９１，９０’ 位置調節手段
１００ 内視鏡スコープ
１０１ 鉗子口チャンネル
１０２ 照明部
１０３ 撮像部
Ｌ１ パルス励起光
Ｌｓ 蛍光スペクトル
Ｌｆ 蛍光
Ｔｆ 蛍光寿命
Ｄ 被測定物質（生体物質）
Ｆ ファイバプローブ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体物質のｐＨを測定する方法、該ｐＨから異常領域を検出する方法、及び、これらの結果より生体物質を分析する方法、並びにこれらを実施する装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内/組織内のｐＨは、生体機能の調節因子として重要であり、細胞内/組織内のエネルギー代謝環境や酸化還元状態と密接に関係している。細胞内/組織内のｐＨ変化が関係している疾患として、癌や臓器機能低下などが挙げられる。
【０００３】
癌及び悪性腫瘍は、日本国内における死亡原因の第1位とされており、その大部分が臓器の細胞が癌化した固形癌によるものである。癌の治療においては、早期発見及び悪性化部位の特定が非常に重要であり、その診断において、疑わしい組織を採取して判断する病理組織検査が行われる。
【０００４】
病理組織検査には、検体を肉眼で観察する方法や、光学顕微鏡を用いて組織学的な検索を行う方法、また、検体を標識して顕微鏡下でその標識の物理特性の検出により生物化学的に診断する方法がある。組織学的な方法は、病理対象の形態により判断されるものであるため、診断者の経験によるところが多いという問題があった。また、検体を標識する方法は、蛍光色素により標識して、その蛍光強度を検出する方法など検出感度が良好な方法であることから多方面で用いられている。
【０００５】
特許文献１には、蛍光色素により標識した細胞のｐＨ変化を、その蛍光強度により測定して腸管の薬剤吸収性を評価する方法が開示されている。また、特許文献２には、蛍光染色することにより細胞を標識して、蛍光スペクトルに応じて細胞をグルーピングする方法が記載されている。しかしながら、蛍光色素は生体に対して有毒であることから、測定対象にダメージを与える可能性があり、また、蛍光強度や蛍光スペクトルは励起光波長や強度、蛍光物質の濃度や退色等の影響を受けて変化するうえ、複数物質からの蛍光や周囲からの蛍光の影響も分析結果に反映されることから精度の高い評価が難しい。
【０００６】
一方、蛍光寿命は、その物質の環境に反映して固有の値を有するため、励起光条件や周囲の不要な蛍光物質の影響を受けずに精度良く生体物質の環境（状態）を知ることのできる有望な情報である。特許文献３には、2つ以上の分光学的手法を組み合わせることにより、生体組織の変化に関連する形態学的変化と生物化学的変化を分離して評価して、当該組織の正確な診断を行う方法が開示されている。特許文献３には、生物化学的変化を評価する分光学的手法として、生体物質中に存在する蛍光物質を標識とし、該蛍光物質を励起して発せられる蛍光（自家蛍光）を時間分解蛍光発光測定（蛍光寿命測定）により、評価する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０００−１３９４６２号公報
【特許文献２】特表２００１−５２３３３４号公報
【特許文献３】特表２００３−５１２０８５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、特許文献３の方法では、分光学的手法による評価を少なくとも２つ実施しなければ正確な診断を行うことができないとされている。診断の簡易性、迅速性を考慮すると、診断にはできるだけ１つの評価により診断可能であることが好ましい。
【０００９】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、測定対象に大きなダメージを与えることなく、迅速に、感度良く生体物質のｐＨを測定することのできるｐＨ測定方法、ならびに、該ｐＨから異常領域を検出する方法、そして、これらの結果から生体物質を分析する方法を提供することを目的とする。
【００１０】
また本発明は、上記ｐＨ測定方法、検出方法、及び生体物質分析方法を実現可能な装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明のｐＨ測定方法は、生体物質中に含まれる、生体内の酸化還元反応において補酵素として働く所定の蛍光物質を励起可能な波長を含み、前記生体物質に組織破壊又は細胞破壊を引き起こさず、且つ、前記生体物質内のｐＨを実質的に変化させない強度を有するパルス励起光を発生させ、該パルス励起光を前記生体物質の所定の位置に照射し、該照射により励起された前記蛍光物質から生じる蛍光を含む光を受光し、該受光した蛍光の強度を時間分解して前記蛍光の蛍光寿命を算出し、該蛍光寿命から前記生体物質のｐＨを測定することを特徴とするものである。
【００１２】
また、本発明のｐＨ測定装置は、生体物質中に含まれる生体内の酸化還元反応において補酵素として働く所定の蛍光物質を励起可能な波長を含み、前記生体物質に組織破壊又は細胞破壊を引き起こさず、且つ、前記生体物質内のｐＨを実質的に変化させない強度を有するパルス励起光を発生する励起光発生手段と、該パルス励起光を前記生体物質の所定の位置に照射する励起光照射手段と、前記パルス励起光が照射されることにより励起された前記蛍光物質から生じる蛍光を含む光を受光する受光手段と、前記パルス励起光の照射と同期して前記蛍光を時間分解する時間分解手段と、該時間分解された前記蛍光を検出する検出手段と、該検出手段により検出された前記蛍光から該蛍光の蛍光寿命を算出し、該蛍光寿命に基づいて前記生体物質のｐＨを測定する測定手段とを備えたことを特徴とするものである。
【００１３】
ここで、蛍光物質によっては細胞内で、プロテインボンド状態とフリー状態などが存在する場合があるが、プロテインボンド状態、フリー状態などいずれの状態でも良い。組織や細胞中のある領域の平均値でも良い。また、「生体物質」とは、ヒト、動物の細胞や組織、体液等の生物組織を意味し、生物から採取したもの、培養したもの、ｉｎ ｖｉｖｏの細胞や組織全てを含むものとする。
【００１４】
本発明のｐＨ測定方法及びｐＨ測定装置において、前記蛍光物質は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、及びＦＡＤからなる群より選ばれる少なくとも１種の蛍光物質であることが好ましい。
【００１５】
本発明のｐＨ測定方法において、前記受光した蛍光を波長分解した蛍光スペクトルとした後、該蛍光スペクトルから波長毎に前記蛍光強度を時間分解して波長毎の前記蛍光の蛍光寿命を算出することが好ましい。従って、本発明のｐＨ測定装置は、かかる蛍光スペクトルを得る受光手段を備えていることが好ましい。
【００１６】
本発明のｐＨ測定方法において、前記蛍光が、多光子励起により励起されるものであることが好ましい。かかる構成では、前記励起光発生手段としてピコ秒からフェムト秒レーザを用いることにより、生体物質の深部の情報を容易に得ることができる。
【００１７】
また、本発明のｐＨ測定方法及びｐＨ測定装置では、前記所定の位置は、複数の位置とすることができる。かかる構成のｐＨ測定装置に、前記生体物質の異常領域を検出する検出手段を備えた構成とすることにより、前記生体物質の異常領域を検出することができる。
【００１８】
異常領域の検出は、前記生体物質の異常領域を画像化して表示して検出してもよい。
【００１９】
本発明のｐＨ測定方法及び検出方法により得られたｐＨや異常領域に基づいて、前記生体物質の病理学的性質を特定して生体物質を分析することができる。
【００２０】
本発明のｐＨ測定装置の好適な態様としては、表面に前記生体物質を接触させて保持するステージであって、前記生体物質の任意の位置に前記パルス励起光を照射できるように３次元方向に可動なステージと、該ステージを３次元方向の任意の位置に動かす位置調節手段とを備え、前記励起光照射手段が、前記パルス励起光を受光して、該パルス励起光を前記生体物質に照射する光学系を備え、前記受光手段は、前記照射により励起された前記蛍光物質から生じる蛍光を含む光を受光して該光を前記時間分解手段に導く光学系を備えた顕微鏡の態様が挙げられる。
【００２１】
また、本発明の測定装置の他の好適な態様としては、表面に前記生体物質を接触させて保持するステージであって、前記生体物質の、少なくとも前記パルス励起光の光軸方向の任意の位置に該パルス励起光を照射できるように可動なステージと、
該ステージを少なくとも光軸方向の任意の位置に動かす第１の位置調節手段と、
前記生体物質の、少なくとも前記パルス励起光の光軸に垂直な面内方向の任意の位置に該パルス励起光を照射できるように前記励起光照射手段を動かす第２の位置調節手段とを更に備えたものであり、
前記励起光照射手段は、前記パルス励起光を受光して、該パルス励起光を前記生体物質に照射する光学系を備えたものであり、
前記受光手段は、前記照射により励起された前記蛍光物質から生じる蛍光を含む光を受光して該光を前記時間分解手段に導く光学系を備えたものが挙げられる。
【００２２】
また、本発明の測定装置の他の好適な態様としては、前記生体物質の３次元方向の任意の位置に、前記パルス励起光を照射できるように前記励起光照射手段を動かす位置調節手段を更に備え、
前記励起光照射手段は、前記パルス励起光を受光して、該パルス励起光を前記生体物質に照射する光学系を備えたものであり、
前記受光手段は、前記照射により励起された前記蛍光物質から生じる蛍光を含む光を受光して該光を前記時間分解手段に導く光学系を備えたものが挙げられる。
【００２３】
また、本発明のｐＨ測定装置の他の好適な態様としては、前記励起光照射手段が、前記パルス励起光を前記生体物質に照射する少なくとも１本の照射用光ファイバを備えたものであり、前記受光手段が、前記照射により励起された前記蛍光物質から生じる蛍光を受光して該蛍光を前記時間分解手段に導く少なくとも１本の受光用光ファイバを備えたファイバプローブの態様が挙げられる。かかる態様では、前記少なくとも１本の照射用光ファイバと前記少なくとも１本の受光用光ファイバとが、１本のバンドルファイバを形成していることが好ましく、このバンドルファイバは、略中心部に配された1本の前記照射用光ファイバの外周を、複数本の前記受光用光ファイバで囲むように束ねられたものであることがより好ましい。
【００２４】
「背景技術」の項において述べたように、特許文献３には、生体物質中に存在する蛍光物質を標識とし、該蛍光物質を励起して発せられる蛍光（自家蛍光）を時間分解蛍光発光測定（蛍光寿命測定）により、生体組織の変化を生物化学的に評価する方法が開示されており、細胞内のｐＨが蛍光寿命の変化に寄与する細胞内環境の１つであることが記載されている。しかしながら、特許文献３には、蛍光寿命測定だけでは正確な診断が難しいことが記載されている。
【００２５】
本発明者は、自家蛍光の蛍光寿命の測定によりｐＨの変化をとらえるだけでは正確な診断ができないとされる原因を解明し、自家蛍光の蛍光寿命測定のみにより正確なｐＨを測定し、該測定の結果から正確な生体組織の変化を生物化学的に評価する方法及びそれを実現する装置を見出した。
【００２６】
本発明者は、細胞内ｐＨが、ピルビン酸から乳酸を産生する産生因子として働くことに注目した。ピルビン酸から乳酸を産生する反応においては、水素イオンが不可欠であり、細胞内ｐＨによる水素イオン濃度によって、ピルビン酸濃度と乳酸濃度が影響される。ピルビン酸からの乳酸の産生、ピルビン酸から産生されたアセチルＣｏＡから始まるクエン酸回路、アセチルＣｏＡからの脂肪酸合成において、いくつかの酸化還元反応が生じるが、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、及びＦＡＤは、これらの酸化還元反応において、補酵素として働く。例えば、ＮＡＤＨはピルビン酸から乳酸の産生やクエン酸回路の過程、ＮＡＤＰＨはアセチルＣｏＡからの脂肪酸合成過程、ＦＡＤはクエン酸回路の過程における補酵素となる。
【００２７】
これらの過程において、上記自家蛍光物質は、自らも酸化還元反応による水素イオンの解離/結合を生じ、吸収スペクトルが変化するため、波長によっては励起できず、蛍光を発しない場合が存在する。更に、これらの物質には、同一の励起波長で励起され、異なる蛍光寿命を有するフリー状態とプロテインボンド状態が存在する（後記実施例を参照）。
【００２８】
つまり、我々の解釈によれば、細胞内ｐＨ変化で生じた酸化還元反応によって、補酵素の水素イオンの解離/結合が生じ、補酵素の吸収スペクトルが変化することで蛍光寿命に寄与する濃度が変化する。そしてこの変化は、プロテインボンド状態に比べ、フリー状態の方が顕著に起こるため、細胞全体の平均的な蛍光寿命が変化することになる。従って、これら補酵素として働く自家蛍光物質の蛍光寿命の変化を測定することで、細胞内ｐＨに対し、精度の良い評価ができることを見出した。
【００２９】
特許文献３には、細胞内のｐＨが蛍光寿命の変化に寄与する細胞内環境の１つとして記載されているのみであり、好ましい自家蛍光物質の存在も示唆していない。このことは、蛍光寿命による評価だけでは正確な評価ができないという記載からも明確である。
【００３０】
本発明は、生体物質のｐＨを考慮して感度の良い蛍光寿命を有する自家蛍光物質を見出し、正常細胞と異常細胞との精度のよい評価を蛍光寿命の評価によるｐＨ測定のみの簡易な方法により初めて実現したものである。
【発明の効果】
【００３１】
本発明は、生体物質に含まれる生体内の酸化還元反応において補酵素として働く自家蛍光物質の蛍光寿命を測定することにより、生体物質のｐＨを高精度に測定し、正常細胞と異常細胞の特定を高精度に実施することを可能にしたものである。蛍光寿命は、物質固有の値であるため、励起光強度や蛍光物質の濃度、及び不要な物質の蛍光に影響されることなく、生体物質のｐＨを測定することができる。従って本発明によれば、励起光強度や蛍光物質の濃度、及び不要な物質の蛍光に影響されることなく、高精度に生体物質のｐＨを測定し、病理学的性質の正常・異常の特定することができる。
【００３２】
また、本発明では、自家蛍光物質の蛍光寿命を測定対象とするので、生体物質に薬物の投与等の必要がない。従って、生体物質に大きなダメージを与えることなくｐＨの測定を実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明の第１の実施形態によるｐＨ測定装置並びに異常領域検出装置、及び、生体物質分析装置の概略構成図
【図２】細胞内のｐＨに対するイメージング画像全体において蛍光寿命が短い自家蛍光成分の平均蛍光寿命測定結果を示す図
【図３Ａ】生物物質中に含まれる主な自家蛍光発光物質の励起光吸収特性を示す図
【図３Ｂ】図３Ａに示される自家蛍光発光物質の蛍光特性を示す図
【図４】時間分解による蛍光寿命の算出方法を示す図
【図５】励起光照射手段の光学系に走査手段を備えたｐＨ測定装置並びに異常領域検出装置、及び、生体物質分析装置の概略構成図
【図６】図５のｐＨ測定装置の受光手段に分光素子を備えたｐＨ測定装置並びに異常領域検出装置、及び、生体物質分析装置の概略構成図
【図７】本発明の第２の実施形態によるｐＨ測定装置並びに異常領域検出装置、及び、生体物質分析装置の概略構成図
【図８Ａ】内視鏡スコープにファイババンドルを備えた場合の内視鏡スコープの構成を示す概略図。
【図８Ｂ】内視鏡スコープにファイバプローブを備えた場合の内視鏡スコープの構成を示す概略図。
【図９Ａ】実施例１のＨｅＬａ細胞の蛍光強度イメージング結果
【図９Ｂ】実施例１のＨｅＬａ細胞の蛍光寿命イメージング結果
【発明を実施するための形態】
【００３４】
「ｐＨ測定装置の第1実施形態（顕微鏡）」
以下、図面を参照して本発明にかかる第1実施形態のｐＨ測定装置およびｐＨ測定方法について説明する。図１は、本実施形態のｐＨ測定装置１の概略構成図である。視認しやすくするため、各部の縮尺は適宜変更して示してある。
【００３５】
図１に示されるように、ｐＨ測定装置１は、生体物質である被測定物質Ｄにパルス励起光Ｌ１（以下、励起光Ｌ１とする）を励起光照射手段２０により照射し、励起光Ｌ１が照射されることにより被測定物質Ｄ中の蛍光物質Ｐから生じる蛍光Ｌｆを含む光Ｌ３を受光手段３０により受光して蛍光を得、この蛍光から所定の蛍光Ｌｆを時間分解手段４０により時間分解し、時間分解された蛍光Ｌｆを検出手段５０により検出し、検出された蛍光Ｌｆの強度から測定手段６０により蛍光減衰曲線を得て蛍光寿命Ｔｆを算出し、蛍光寿命Ｔｆに基づいて被測定物質ＤのｐＨを測定するものである。励起光Ｌ１は、被測定物質Ｄ中に含まれる生体物質中に含まれる、生体内の酸化還元反応において補酵素として働く所定の蛍光物質Ｐを励起可能な波長を含み、生体物質に組織破壊又は細胞破壊を引き起こさず、且つ、生体物質内のｐＨを実質的に変化させない強度を有するパルス励起光である。
【００３６】
蛍光寿命の測定方法は、時間領域測定法と周波数領域測定法に大別され、本実施形態においては時間領域測定法を採用する。時間領域測定法には、ストリークカメラ法、時間相関単一光子計数法、時間ゲート法等があるが、本実施形態では、時間ゲート法により蛍光寿命の測定を行う例について説明する。
【００３７】
時間ゲート法は、パルス励起光の照射と同期して、発光した蛍光をある時間領域で区切り、その範囲の蛍光強度積分値をＣＣＤ等の固体検出器で検出して時間領域を変えて測定することで近似的に蛍光減衰曲線を得る方法である。本実施形態では、ビームスプリッタ２５により励起光Ｌ１から分けられた信号光Ｌ２がフォトダイオード４４により検出されると、同期制御装置４３によりゲートコントローラ４２に対して同期信号Ｓ１が送られる。ゲートコントローラ４２は、同期信号Ｓ１を受けて予め設定された所定の時間領域にゲート信号Ｓ２を発信し、ゲート機能つきイメージインテンシファイア４１を駆動する。ゲート機能つきイメージインテンシファイア４１に入力された蛍光像Ｌｆは、ゲート信号Ｓ２に応じた時間領域において増強されて、検出手段５０により、所定の蛍光Ｌｆの蛍光強度の積分値（蛍光信号）Ｌｔが検出される。この工程をゲート信号Ｓ２に応じて繰り返し、測定手段６０により単一指数関数による解析を行って蛍光寿命Ｔｆを算出する。
【００３８】
本発明者らは、各種自家蛍光物質の蛍光寿命を時間相関単一光子計数法（ＴＣＳＰＣ）、時間ゲート法により測定を重ね、現状の蛍光寿命測定において２つの蛍光寿命を分離できる限界値が蛍光寿命が０．０３ｎｓｅｃであることを見出した。本実施形態のｐＨ測定装置では、正常細胞と異常細胞とのｐＨ変化により、蛍光寿命が０．０３nsec以上異なる自家蛍光物質を励起して、その蛍光寿命を測定することにより高精度にｐＨを測定して生体物質の正常と異常を特定するものである。
【００３９】
既に述べたように、細胞内ｐＨが、ピルビン酸から乳酸の産生因子として働き、細胞内ｐＨによる水素イオン濃度によってピルビン酸濃度と乳酸濃度が影響される。ピルビン酸からの乳酸の産生、ピルビン酸から産生されたアセチルＣｏＡから始まるクエン酸回路、アセチルＣｏＡからの脂肪酸合成において、いくつかの酸化還元反応が生じるが、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、及びＦＡＤは、これらの酸化還元反応において、補酵素として働く。例えば、ＮＡＤＨはピルビン酸から乳酸の産生やクエン酸回路の過程、ＮＡＤＰＨはアセチルＣｏＡからの脂肪酸合成過程、ＦＡＤはクエン酸回路の過程における補酵素となる。
【００４０】
これらの過程において、自らも酸化還元反応による水素イオンの解離/結合を生じ、吸収スペクトルが変化するため、波長によっては励起できず、蛍光を発しない場合が存在する。更に、これらの物質には、同一の励起波長で励起され、異なる蛍光寿命を有するフリー状態とプロテインボンド状態が存在する（後記実施例を参照）。
【００４１】
我々は、細胞内ｐＨ変化で生じた酸化還元反応によって、補酵素の水素イオンの解離/結合が生じ、補酵素の吸収スペクトルが変化することで蛍光寿命に寄与する濃度が変化し、この変化は、プロテインボンド状態に比べ、フリー状態の方が顕著に起こるため、細胞全体の平均的な蛍光寿命が変化すると考えている。従って、これら補酵素として働く自家蛍光物質の蛍光寿命の変化を測定することで、細胞内ｐＨに対し、精度の良い評価ができることを見出した。
【００４２】
図１に示される顕微鏡型のｐＨ測定装置及び異常領域検出装置を用いて、培養したＨｅＬａ細胞のｐＨの測定を行った。
まず、ｐＨの異なるＨｅＬａ細胞を調製し、ＨｅＬａ細胞のｐＨと蛍光寿命との関係を導出した。所定のｐＨのＨｅＬａ細胞は、培地としてＤ-ＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium；ＳＩＧＭＡ社）を用い、石英ガラスボトムディッシュにＨｅＬａ細胞を適量まき、３７℃、５％ＣＯ２下のインキュベータで１〜２日培養した後、0.1 mol/L のＮａＯＨ溶液、ＨＣｌ溶液でｐＨを調整したＫＣｌ-ｒｉｃｈ ｍｅｄｉａに適量のニゲリシンを加え、前記培地をＫＣｌ-ｒｉｃｈ ｍｅｄｉａに置換して調製した。ニゲリシンはエンドソームのｐＨ低下阻害剤であり、Ｋ＋／Ｈ＋のイオノフォアとして働き、細胞内外のｐＨを同じにする役割を果たす。ＨｅＬａ細胞がそれぞれのｐＨになっていることを確認した後、顕微鏡のｘｙｚステージ上に設置したインキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２）に１５分ほどおいて、ｐＨの異なる複数の測定試料を用意した。
【００４３】
これらの試料に対して、蛍光寿命の測定を行った。ここで、励起する自家蛍光物質はＮＡＤＨとＮＡＤＰＨとし、励起光として、１ピコ秒パルス幅のチタンサファイアレーザのＳＨＧ光を使用し、ＮＡＤＨとＮＡＤＰＨの励起波長である３７０ｎｍの光（還元型のみ励起される）となるように励起光の波長を調整し、４１７〜４７７nmの蛍光フィルターを用いて蛍光寿命の測定を行った。このとき、励起光の平均パワーは０．９ｍＷ、パルスエネルギーは１２ｐＪとし、ＨｅＬａ細胞の所定の位置にレーザ光が照射され、レーザ光の焦点がＨｅＬａ細胞に合うようにｘｙｚステージを調整した。測定温度は２３度である。
【００４４】
得られた結果を図２に示す。図２においては、縦軸は細胞内のｐＨに対するイメージング画像全体の平均蛍光寿命を示しており、更に、それぞれのｐＨに対して試料を変え、複数回測定した結果を平均して求めた値とした。図２を最小二乗法でフィッティングした結果、以下の関係式を導出することができた。
【００４５】
[ｐＨ] =３３．３-１１．９×[蛍光寿命(ｎｓｅｃ.)] ・・・（１）
また、図２に示されるように、ＮＡＤＨとＮＡＤＰＨは、ｐＨが６．５から７．５の間で蛍光寿命は０．０８ｎｓｅｃ変化しており、上記した蛍光寿命の測定限界を考慮すると、ｐＨ差０．３〜０．４の測定が十分に可能であり、高い感度を有していることが確認された。
【００４６】
以上の結果より、生体物質に含まれる生体内の酸化還元反応において補酵素として働く自家蛍光物質の蛍光寿命を測定することにより、生体物質のｐＨを高精度に測定し、励起光強度や蛍光物質の濃度、及び不要な物質の蛍光に影響されることなく、高精度に生体物質のｐＨを測定し、病理学的性質の正常・異常の特定することができることがわかった。
【００４７】
細胞内において、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ及びＦＡＤは主に細胞質またはミトコンドリア存在する。従って、細胞質またはミトコンドリアの領域を計測すれば、細胞内のｐＨの分析が可能であり、好ましい。また、核におけるＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ及びＦＡＤの量は少量であるが、核周辺の細胞質またはミトコンドリアからのＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ及びＦＡＤが自家蛍光を発するため、核の領域を計測してもよい。
【００４８】
ｐＨ測定装置１は共焦点系顕微鏡であり、被測定物質Ｄは、位置調節手段９１によりｘｙｚ方向に移動可能なサンプルステージ９０上に接触されており、位置調節手段９１により、サンプルステージ９０の位置を調節して、被測定物質Ｄの所定の位置に対物レンズ（光学系）２１（３１）により集光された励起光Ｌ１を照射することができる。ｐＨ測定装置１には、正確に所定の位置に励起光Ｌ１が照射できるように、被測定物質Ｄの上方から被測定物質Ｄにおける励起光Ｌ１の照射位置を確認することができるように、拡大レンズ等を備えた窓（図史略）を備えた構成としてもよい。
【００４９】
ｐＨ測定装置１において、励起光発生手段１０は、被測定物質Ｄ中の生体物質中に含まれる、生体内の酸化還元反応において補酵素として働く所定の蛍光物質を励起可能な波長を含み、生体物質に組織破壊又は細胞破壊を引き起こさず、且つ、生体物質内のｐＨを実質的に変化させない強度を有するパルス励起光を発生するパルスレーザ１１と、パルスレーザ１１より発振されたパルスを、所定の間隔にて出射させるように間引くパルスピッカー１２とを含む。パルスレーザ１１は、特に制限されないが、超短パルス光を発振できるレーザであることが好ましく、数十フェムト秒〜数十ピコ秒の時間範囲内でパルス発振可能なレーザであることがより好ましい。パルスレーザ１１としては、例えば、発振波長８４０ｎｍのチタンサファイアレーザの第２次高調波（ＳＨＧ）である波長４２０ｎｍ、パルス幅３ｐｓ、繰り返し周波数８０ＭＨｚ、ピークパワー８ｋＷ、平均パワー２Ｗ等を用いることができる。また、励起光発生手段１０には、第３次高調波（ＴＨＧ）や光パラメトリック発信器（Optical Parametric Oscillator:ＯＰＯ）等の波長変換素子を備えた構成としてもよい。本実施形態ではパルスピッカー１２を用いているが、パルスピッカーで間引きせず、所望の繰り返しに調整した光源を使用してもよい。
【００５０】
また、被測定物質Ｄ内において励起される蛍光Ｌｆは多光子励起によるものでもよい。その場合は、多光子励起可能な波長及びパルス幅の励起光Ｌ１として、発振波長８４０ｎｍのチタンサファイアレーザ、パルス幅１００ｆｓ、繰り返し周波数８０ＭＨｚ、ピークパワー１００ｋＷ、平均パワー０．８Ｗ等を用いる。多光子励起では、所望の箇所だけ励起が可能なので、周辺部の蛍光低減ができより低雑音化ができ、また観察箇所より前の部分での吸収減衰を低減できるので効率よく観察箇所に励起光Ｌ１を照射することができる。また、高い空間分解能で分析もできる。
【００５１】
励起光発生手段１０から出射された励起光Ｌ１は、励起光照射手段２０に入射され、励起光照射手段２０により被測定物質Ｄの所定の位置に照射される。励起光照射手段２０の構成は特に制限されないが、本実施形態では、励起光Ｌ１の照射と被測定物質Ｄから発生した、蛍光物質Ｐの励起による蛍光Ｌｆを含む光Ｌ３の受光を同一の対物レンズ（光学系）２１（３１）で行う構成としている。従って、励起光照射手段２０には、被測定物質Ｄの所定位置に励起光Ｌ１を照射し、且つ、光Ｌ３を受光できるように配された対物レンズ２１及び、励起光Ｌ１を対物レンズ２１に入射させ、且つ、光Ｌ３を時間分解手段４０に導くダイクロイックミラー２２（３２）を備えている。対物レンズ２１としては、励起光Ｌ１及び蛍光の透過率が高く、レンズ素材による蛍光の発生の少ないものが好ましい。
【００５２】
また、本実施形態では、励起光Ｌ１の照射と時間分解手段４０を同期して駆動させるため、励起光照射手段２０に同期信号Ｓ１を発信させる信号光Ｌ２を励起光Ｌ１から分割させるビームスプリッタ２５を、そして、励起光Ｌ１を蛍光物質Ｐの励起波長の光に絞り込む励起フィルター２３を備えている。励起光照射手段２０には、必要に応じて励起光Ｌ１を導光するミラー（２４，２６）やレンズ等（図示略）を備えてよい。
【００５３】
受光手段３０は、励起光Ｌ１の照射により被測定物質Ｄにおいて生じた光Ｌ３を受光して時間分解手段４０に目的とする蛍光Ｌｆを出力できれば特に制限されないが、本実施形態では、被測定物質Ｄから発生した光Ｌ３を受光する対物レンズ３１（２１）と、光Ｌ３を時間分解手段４０に導くダイクロイックミラー３２（２２）と、光Ｌ３から散乱光等のノイズ光を除去するフィルター３３とを備えている。
【００５４】
対物レンズ（光学系）３１及びダイクロイックミラー３２については上述の通りである。フィルター３４は、検出する蛍光Ｌｆの波長に応じて、バンドパスフィルターやショートパスフィルタ等適宜選択して用いればよい。複数種類の蛍光Ｌｆを観測するときは、異なる透過波長帯域を有する複数のバンドパスフィルターを用いたり、あるいは透過波長帯域が可変のものを用いるようにしてもよい。
【００５５】
受光手段３０により得られた蛍光Ｌｆは、時間分解手段４０に入力される。時間分解手段４０は、蛍光Ｌｆの、所定の時間領域の蛍光信号Ｌｔを取り出して検出手段５０に出力するものである。蛍光の時間分解は、励起光Ｌ１の照射に対する最初の同期信号Ｓ１の受信時ｔ０から開始する。同期信号Ｓ１は、励起光Ｌ１からビームスプリッタ２５により分けられた信号光Ｌ２が、光検出器４４で電気信号に変換されて同期制御装置４３から、ゲートコントローラ４２に送られる。
【００５６】
受光手段３０により得られた蛍光Ｌｆは、時間分解手段４０に入力される。時間分解手段４０は、所定の蛍光Ｌｆの、所定の時間領域の蛍光像を取り出して検出手段５０に出力するものである。蛍光の時間分解は、励起光Ｌ１の照射に対する最初の同期信号Ｓ１の受信時ｔ０から開始する。同期信号Ｓ１は、励起光Ｌ１からビームスプリッタ２５により分けられた信号光Ｌ２が、光検出器４４で電気信号に変換されて同期制御装置４３から、ゲートコントローラ４２に送られる。
【００５７】
光検出器４４としては特に制限なく、一般的に用いられているフォトダイオード等を用いることが好ましい。
【００５８】
同期制御装置４３は、光検出器４４から出力された信号を受けてゲートコントローラ４２に同期信号Ｓ１を出力できれば特に制限なく、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）等を用いることができる。ゲートコントローラ４２は、同期信号Ｓ１を受けて予め設定された所定の時間領域にゲート信号Ｓ２を発信し、ゲート機能つきイメージインテンシファイア４１のゲートの開閉を指示する。ゲート機能つきイメージインテンシファイア４１には、ＣＣＤカメラ等の検出手段５０が接続されており、ゲート信号Ｓ２に基づいてゲートを開閉し、ゲートが開いているときに受光した蛍光信号Ｌｔを増幅させ、コントラストの向上した蛍光像ＬｓをＣＣＤやＰＭＴ等の検出手段５０により受光して電気信号として蓄積し、検出する。例えば、ゲートコントローラ４２が同期信号Ｓ１を最初に受けた時刻を基準時刻ｔ０として、時間Δｔの間だけゲート機能付きイメージインテンシファイア４１のゲートを開くように指示するゲート信号Ｓ２を出力すると、ゲート機能付きイメージインテンシファイア４１により、ｔ０〜Δｔの間の蛍光信号Ｌｔを増幅させて検出手段５０に出力し、検出手段５０は、その時間範囲の蛍光Ｌｆを検出して、その蛍光強度の積分値Ｓ３を測定手段６０に出力する。この蛍光強度Ｓ３の検出工程を、ゲート信号に応じて繰り返すことにより、時間分解された蛍光強度を測定手段６０に出力する。
【００５９】
測定手段６０としては特に制限ないが、ＰＣ等のコンピュータシステムを用いることが簡易であり好ましい。測定手段６０は、同期制御装置４３とを同じ装置により兼ねてもよい。測定手段６０は、時間分解された蛍光強度Ｓ３から蛍光減衰曲線を求めて蛍光強度時間分布を得る。この蛍光減衰曲線において、蛍光強度が1/eになった時間ｔｆと発光の開始時ｔ０との差を蛍光寿命Ｔｆとして算出する。図４に、時間分解された蛍光強度から得られた蛍光強度時間分布及び蛍光減衰曲線から求められた蛍光寿命Ｔｆを示す。図４において、ｔ０からの経過時間ｔにおける蛍光強度Ｉとt０における蛍光強度Ｉ０とは、下記式の関係で表される。分析手段６０では、Ｓ３がある時間ｔにおける蛍光強度Ｉとなる。
【００６０】
Ｉ＝Ｉ０ｅ−ｔ／Tf
次に、測定手段６０は得られた蛍光寿命Ｔｆに基づいて、被測定物質Ｄの所定の位置におけるｐＨを測定する。自家蛍光物質の蛍光寿命は、その周辺のｐＨにより変化することが知られている。
【００６１】
従って、正常状態の被測定物質Ｄにおける蛍光寿命を予め調べておくことにより、被測定物質Ｄの所定の位置における自家蛍光物質の蛍光寿命から、その位置のｐＨの変化を、また、ｐＨに対する蛍光寿命の変化率を予め得ておくことにより、具体的なｐＨ値を測定することができる。時間ゲート法の蛍光寿命イメージングを利用したｐＨ分析においては、ゲート数を増やして分析することにより、より分析精度は高くなる。
【００６２】
ｐＨ測定装置１では、ステージ９０をｘｙｚ方向（励起光照射面の面内方向及び深さ方向）に移動させることができるので、被測定物質Ｄの複数の所定の位置において２次元あるいは３次元のｐＨの測定が可能である。
【００６３】
また図５に示されるｐＨ測定装置４のように、ステージ９０’をｚ方向のみ可動とし、走査光学系２７をｘｙ方向に走査させる共焦点系の光学系としてもよい。走査光学系２７としては、ガルバノミラーやポリゴンミラー、レゾナントミラー等が挙げられる。
【００６４】
かかる構成とする場合は、励起光Ｌ１により励起される蛍光の種類が複数になる可能性が高いため、図６に示されるｐＨ測定装置７のように、受光手段３０により受光した蛍光Ｌｆを分光して時間分解手段４０に蛍光Ｌｆの蛍光スペクトルＬｓを出力する分光手段３５を備えた構成とすることが好ましい。蛍光Ｌｆを分光して蛍光スペクトルＬｓを時間分解することにより、より高精度に複数の蛍光を分離して所定の波長の蛍光の蛍光寿命を測定することができる。分光素子３５としては、蛍光Ｌｆを分光可能なものであれば特に制限なく、回折格子やプリズム等が挙げられる。
【００６５】
図５又は図６に示される走査光学系を備えた構成は、局所的な励起を行う多光子励起の場合等に、特に好ましく用いることができる。
【００６６】
複数の位置におけるｐＨ測定により、被測定物質Ｄの異常領域を分析する方法については後記する。
本実施形態のｐＨ測定装置１，４，７は以上のように構成されている。
【００６７】
次に、ｐＨ測定装置１を例に本実施形態のｐＨ測定装置の動作例について説明する。
まず、ステージ９０上に被測定物質Ｄを接触させ、所定の位置に励起光Ｌ１が照射されるように位置調節手段９１によりステージ９０の位置を調整する。
【００６８】
励起光発生手段１０からは被測定物質Ｄ中の生体物質中に含まれる、生体内の酸化還元反応において補酵素として働く所定の蛍光物質を励起可能な波長を含み、生体物質に組織破壊又は細胞破壊を引き起こさず、且つ、生体物質内のｐＨを実質的に変化させない強度を有するパルス励起光Ｌ１が出射されて、励起光照射手段２０に入射する。励起光照射手段２０に入射された励起光Ｌ１は、ビームスプリッタ２５により同期用信号光Ｌ２を分離した後、に対物レンズ（光学系）２１により集光されて、被測定物質Ｄの所定の位置に照射される。この照射により、被測定物質Ｄからは、蛍光物質Ｐが励起されて蛍光Ｌｆが発せられる。受光手段３０の対物レンズ３１は、被測定物質Ｄから発せられた光Ｌ３を受光する。光Ｌ３には、蛍光Ｌｆ以外のノイズ光も含まれているが、フィルター３４を通過することにより、ほぼ蛍光Ｌｆ以外の光が排除される。
【００６９】
ほぼ蛍光のみとなった光Ｌ３は、時間分解手段４０に入射されて、所定の蛍光Ｌｆを取り出して時間分解され、検出手段５０により各時間における蛍光強度Ｓ３が検出され、電気信号として測定手段６０に出力される。測定手段６０は、時間分解された蛍光強度から蛍光強度−時間曲線を得、この曲線において、蛍光強度が略１／ｅになった時間ｔｆとｔ０との差を蛍光寿命Ｔｆとして算出し、蛍光寿命Ｔｆに基づいて、被測定物質ＤのｐＨを測定する。
【００７０】
上記のように、本実施形態のｐＨ測定方法及びｐＨ測定装置１，４，７は、生体物質に含まれる生体内の酸化還元反応において補酵素として働く自家蛍光物質の蛍光寿命を測定することにより、生体物質のｐＨを高精度に測定し、正常細胞と異常細胞の特定を高精度に実施することを可能にしたものである。蛍光寿命は、物質固有の値であるため、励起光強度や蛍光物質の濃度、及び不要な物質の蛍光に影響されることなく、生体物質のｐＨを測定することができる。従って本発明によれば、励起光強度や蛍光物質の濃度、及び不要な物質の蛍光に影響されることなく、高精度に生体物質のｐＨを測定し、病理学的性質の正常・異常の特定することができる。
【００７１】
また、本実施形態では、自家蛍光物質の蛍光寿命を測定対象とするので、生体物質に薬物の投与等の必要がない。従って、生体物質に大きなダメージを与えることなくｐＨの測定を実施することができる。
【００７２】
以上述べたｐＨ測定装置１，４，７の効果は、後述の実施形態のｐＨ測定装置も同様に奏するものである。
【００７３】
また、被測定物質に対して照射する励起光のスポット径を絞って微小領域での蛍光寿命を測定し、測定位置をずらして被測定物質の測定対象領域の測定を行う共焦点顕微鏡方式である場合について説明したが、被測定物質に応じて広範囲の画像化が必要な場合等は、励起光のスポット径を絞らずに一度に広範囲のｘｙ面の情報を取得するワイドフィールド方式としてもよく、走査手段を用いずに、検出手段としてＣＣＤカメラ等を用いて画面全体を撮像する。また、この場合、ステージ９０（９０’）をｘｙ方向に走査可能とし、複数のｘｙ面領域を検出しそれらを合成することでより広範囲な領域の画像化が可能となる。
【００７４】
「ｐＨ測定装置の第２実施形態（ファイバプローブ）」
次に、本発明の別の実施形態にかかるｐＨ測定装置について説明する。第１実施形態のｐＨ測定装置１，４，７は、顕微鏡であったが、本実施形態のｐＨ測定装置１０は、ファイバプローブである点で第1実施形態と異なっている。なお、以降の実施形態の説明および図面においては、前述の実施形態の構成要素と実質的に同一の機能を有する構成要素については、同一の符号を付することにより重複説明を省略する。
【００７５】
図７に示されるように、ｐＨ測定装置１０は、第１実施形態の対物レンズ２１（３１）が、バンドルファイバ２１’（３１’）である点を除けば、第１実施形態と同様の構成としている。
【００７６】
バンドルファイバ２１’（３１’）は、中央部にパルス励起光Ｌ１を導光させ、励起光Ｌ１を被測定物質Ｄの所定の位置に照射する照射用光ファイバ２００が略中心部に配され、励起光Ｌ１の照射により被測定物質Ｄ中に含まれる生体内の酸化還元反応において補酵素として働く自家蛍光物質Ｐから生じる蛍光Ｌｆを含む光Ｌ３を受光して、光Ｌ３を時間分解手段４０に導く複数の受光用光ファイバ３００を照射用光ファイバ２００の外周を囲むように配して束ねられた構成としている。図７では、受光用光ファイバ３００が７本である構成を示しているが、その本数は限られるものではなく、照射用光ファイバ及び受光用光ファイバは共に１本以上であれば、受光可能な蛍光強度等に応じて適宜本数及びファイバ径は選択することができる。
【００７７】
バンドルファイバ２１’（３１’）は、照射用光ファイバ２００と受光用光ファイバ３００とを所定の配置となるように、接着剤等により固定して作製される。接着剤としては、使用する励起光Ｌ１に合わせた耐熱温度を有するものが好ましい。要求される耐熱温度が３００℃を超える場合は無機系の耐熱接着剤が用いられる。固定されたバンドルファイバは、体腔内に挿入される略円筒形の長尺のシース内に備えられた構成としたファイバプローブとして使用することができる（図示略）。
【００７８】
照射用光ファイバ２００及び受光用光ファイバ３００としては特に制限ないが、励起光Ｌ１の透過率が良く、また、励起光Ｌ１による劣化を生じない材料を用いることが好ましい。特に、励起光Ｌ１が紫外光や紫外光に近い短波長光である場合は、光エネルギーが大きいため、石英系の光ファイバであることが好ましい。
【００７９】
第２実施形態では、被測定物質Ｄへの励起光Ｌ１の照射と蛍光Ｌｆを含む光Ｌ３の受光をファイバプローブＦで行うことができるため、ｉｎ ｖｉｖｏでの測定など、生体内での測定が可能であり、また、被測定物質Ｄの所定の位置の位置決めも、測定者自身が直接プローブを動かして行うことができる。例えば、図８Ａ及びＢに示されるような内視鏡スコープ１００の鉗子口チャンネル１０１に上記バンドファイバ２１’（３１’）を備えた構成、または、内視鏡スコープ１００の鉗子口チャンネル１０１にファイバプローブＦを通して使用することができる。この場合、図８Ａ及び図８Ｂに示されるように、内視鏡スコープ１００には、体腔内の所定の位置に照明光を照射する照明部１０２と、所定の位置で反射された反射光Ｌ４を撮像する撮像部１０３と、送気送水ノズル１０４が備えられている。照明部１０２は所定の位置を照明可能な光源に接続されており、撮像部１０３は所定の位置を測定者が視認可能なモニター等に接続されているがここでは図示は省略する。
【００８０】
第２実施形態の構成では、動物はもちろん、ヒトの体内の組織のｐＨを直接測定することができる。例えば、ヒトの消化器や気管等の検査に好ましく用いることができる。
【００８１】
「異常領域検出装置（検出装置）」
図１，図５，図６を参照して、本実施形態の異常領域検出装置（検出装置）２，５，８について説明する。
既に述べたように、ｐＨ測定装置１（４，７）では、ステージ９０（９０’）をｘｙ方向（励起光照射面の面内方向）及びｚ方向（光軸方向）に移動させることができるので、被測定物質Ｄの複数の所定の位置においてｐＨの測定が可能である。従って、例えば、複数の所定の位置を被測定物質Ｄのｘ−ｙ面内にむらなく設定することにより、被測定物質Ｄの面内ｐＨ分布を得ることができる。また、２光子蛍光等の多光子励起を利用することにより、被測定物質の深部の蛍光を検出することもできる。従って、その際は、被測定物質Ｄのｚ方向にも測定点を設定することによって３次元のｐＨ分布を得ることができる。
【００８２】
また、ワイドフィールド方式のｐＨ測定装置とした場合でも、上記ｐＨ測定装置の実施形態において述べたように、一度にｘｙ面の情報を取得することができるので、同様に被測定物質Ｄの面内ｐＨ分布を容易に得ることができる。
【００８３】
従って、ｐＨ測定装置１，４，７に、被測定物質ＤのｐＨ分布を検出可能な異常領域検出手段８０を備えた構成とすることにより、例えば、異常領域を検出する異常領域検出装置２（５，８）とすることができる。
【００８４】
異常領域検出手段８０としては、ＣＣＤ又は冷却ＣＣＤ等のアレイ検出器等を用いることができる。
【００８５】
更に、異常領域検出装置２（２’）は、異常領域検出手段８０による検出結果を画像化して表示する表示手段８１を更に備えた構成とすることにより、面内ｐＨ分布や異常領域を明確に視認することができる。画像化の手法は、従来から用いられている方法を用いればよく、面内ｐＨ分布を色別に表示する手法や、３次元的に面内濃度分布を表す手法を用いてもよい。複数画像を取得した場合など、それらを画像合成して表示してもよい。
【００８６】
また、図７に示されるようなファイバプローブ型のｐＨ測定装置１０の場合は、測定者自身が直接プローブを動かして任意の領域におけるｐＨを測定することができるので、ｐＨ測定装置１を用いる場合と同様に、被測定物質ＤのｐＨ分布を検出可能な異常領域検出手段８０を備えた構成とすることにより異常領域検出装置１１とすることができる。
【００８７】
かかる実施形態では、異常領域検出手段８０としては、ファイバプローブの先端に取り付けて使用するＭＥＭＳスキャナ等を使用したり、被測定物質を配置するステージ９０に稼動部９１を設けることにより好適に画像検出を行うことができる。
【００８８】
本実施形態の異常検出装置２（２’）は、上記実施形態のｐＨ測定装置を備えた構成としているので、上記ｐＨ測定装置１（１’）と同様の効果を奏する。
【００８９】
「生体物質分析装置」
図１，図５，図６，図７を参照して、本実施形態の生体物質分析装置３（６，９，１２）について説明する。生体物質分析装置３（６，９，１２）は、上記異常領域検出装置２（５，８，１１）に、測定されたｐＨから、被測定物質Ｄの病理学的性質を特定する分析手段７０を備えた構成としている。
生体組織に異常を生じると、その組織内のｐＨが変化することが知られている。例えば、癌化（悪性腫瘍化）した場合や、肝臓疾患等の疾患の場合は、ｐＨが低くなる。従って、上記ｐＨ測定装置１（４，７，１０）又は、異常領域検出装置２（５，８，１１）に、より、被測定物質Ｄの所定の位置又は領域における、悪性腫瘍状態の有無等の病理学的性質、及びその度合いを特定することができる。
【００９０】
本実施形態の構成では、被測定物質Ｄの面内のｐＨ分布を得ることができることから、被測定物質Ｄの面内において、病理学的性質の異常範囲を特定することができ、また、その範囲内での異常の度合いを特定することができる。
【００９１】
悪性腫瘍（癌）の治療では、患部を切除して摘出する外科療法と、切除せずに放射線を照射することにより癌細胞を死滅させる放射線療法などがある。本実施形態の生体物質分析装置によれば、癌化した範囲を特定できることから、外科療法においては、的確に切除する必要範囲のみを切除することができる。癌腫瘍の摘出手術では、癌細胞が患者の身体に残存すると再発の可能性が高まり好ましくないが、再発を恐れるあまり、過剰に組織を切除するのも患者の身体の負担が増大し好ましくない。そこで、必要範囲と判断される部分のみを摘出し、その後、摘出腫瘍が接していた領域の組織を微少量切り取り、本発明のｐＨ測定装置を用いて癌細胞の有無を調べる、或いは、摘出腫瘍自体を被測定物質（サンプル）とし、その切除面に対してｐＨ測定装置によりｐＨの測定を行い切除面の癌細胞の有無を調べる。いずれの場合も、癌細胞が検出された場合はさらなる切除が必要と判断し、癌細胞が検出されなかった場合は摘出が十分であったと判断することができる
また、放射線療法においても、放射線照射が必要な範囲を的確に認識して照射することができるため、放射線によりダメージを受ける正常細胞を極力少なくすることができる。
【００９２】
上記したように、本実施形態の生体物質分析装置では、高精度にｐＨを測定することのできるｐＨ測定装置を備えた構成としているので、癌化した部分等の患部の高精度なｐＨ情報を、患部の位置情報とともに得ることが可能である。従って、本実施形態の生体物質分析装置によれば、放射線療法において、患部の状態に応じた的確な放射線の種類及び強度を選択することができるため、良好な治療効果を得ることができる。また、内視鏡的粘膜下層剥離術（ＥＳＤ）を施術する場合においても、患部の範囲及び状態を特定することができるため、的確な部位を剥離して、患者への負担を最小限に抑えた治療を行うことができる。
【００９３】
また、癌腫瘍の摘出の判断は手術中に短時間で行う必要がある。上記したように、上記実施形態のｐＨ測定装置は、迅速な測定を行う事ができるため、癌治療の治療方針の決定に用いる分析装置としては、スループットが高く、好ましい。
【００９４】
細胞または組織は個々で細胞環境にばらつきがある。その要因は、同じ正常細胞または癌細胞中における、細胞の活性状態やストレス状態、衰弱状態の違いなどが挙げられる。そのため、細胞または組織からの自家蛍光寿命もまた、その個々の環境に反映してばらついてしまう。
【００９５】
実際の疾患部の測定においては、十分な臨床データから検量線を作成することが必要である。次に、測定したい部位の測定を測定領域を変えて繰り返し、より確からしいデータを取得することが必要である。このように測定することで、ばらつきが大きい細胞や組織においても、より精度の高いｐＨ測定と臨床的判断をすることができる。
【００９６】
一例として、担癌マウスにおける癌組織と正常組織の境界部のｐＨ測定を行った。ここで、励起する自家蛍光物質はＮＡＤＨとＮＡＤＰＨとし、励起光として、１ピコ秒パルス幅のチタンサファイアレーザのＳＨＧ光を使用し、ＮＡＤＨとＮＡＤＰＨの励起波長である３７０ｎｍの光（還元型のみ励起される）となるように励起光の波長を調整し、４１７〜４７７nmの蛍光フィルターを用いて蛍光寿命の測定を行った。このとき、励起光の平均パワーは０．９ｍＷ、パルスエネルギーは１２ｐＪとし、癌組織と正常組織の境界部の所定の位置にレーザ光が照射され、レーザ光の焦点が癌組織と正常組織の境界部に合うようにｘｙｚステージを調整した。
【００９７】
検量線は十分な臨床データから作成したものである。癌組織、正常組織の別々の３領域をそれぞれ測定し、３つの値から蛍光寿命平均値を求め、検量線と比較したところ、癌細胞がｐＨ７．１、正常細胞がpH７．２と求められた。しかし、今度は癌組織、正常組織の別々の１０領域をそれぞれ測定し、１０つの値から蛍光寿命平均値を求めたところ、癌細胞がｐＨ６．８、正常細胞がpH７．３と求められた。ｐＨ差０．５は蛍光寿命によるｐＨ分解能０．３〜０．４より大きな値である。このように、測定回数を増やすことで、より精度の高い測定かつ臨床的判断が可能となった。
【００９８】
「設計変更」
以上、本発明によるｐＨ測定装置、該ｐＨ測定装置を備えた異常領域検出装置、及び生体物質分析装置の好ましい実施の形態について説明したが、本発明は上記実施の形態に限定されるものではなく、発明の要旨を変更しない限りにおいて、種々変更することが可能である。
【００９９】
被測定物質Ｄの病理学的性質の特定は、分析手段７０を用いて行う構成について説明したが、ｐＨと病理学的性質の異常度合いとの関係が明確となっている場合には、上記実施形態のｐＨ測定装置及び異常領域検出装置のみによっても、生体物質の病理学的性質を特定することができる。従って、上記した生体物質分析装置において述べた治療効果は、上記実施形態のｐＨ測定装置及び異常領域検出装置によっても得ることができる。
【実施例】
【０１００】
以下に、本発明に係る実施例について説明する。
（実施例１）
図１に示される顕微鏡型のｐＨ測定装置及び異常領域検出装置を用いて、培養したｐＨ無調整のＨｅＬａ細胞のｐＨの測定を行った。図９に測定したＨｅＬａ細胞の蛍光強度画像（図９Ａ）と蛍光寿命画像（図９Ｂ）を示す。同じ条件のサンプルに対し、測定領域を変えて３回測定した。３枚の画像全体の平均蛍光寿命は２．２４ｎｓｅｃであった。従って、（１）式により、得られた蛍光寿命からｐＨを導出した結果、このＨｅＬａ細胞のｐＨは、６．６であると見積もることができた。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明のｐＨ測定方法、異常領域検出方法、及び生体物質分析方法、並びに各装置は、正常細胞と異常細胞（癌細胞等）の診断及び分離に好ましく用いることができる。
【符号の説明】
【０１０２】
１，４，７，１０ ｐＨ測定装置
２，５，８，１１ 異常領域検出装置
３，６，９，１２ 生体物質分析装置
１０ 励起光発生手段
１１ レーザ（光源）
２０ 励起光照射手段
２１，３１ 対物レンズ（光学系）
２１’，３１’ 光ファイバ（バンドルファイバ）
２００ 照射用光ファイバ
３００ 受光用光ファイバ
３０ 受光手段
４０ 時間分解手段
５０ 検出手段
６０ 測定手段
７０ 分析手段
８０ 異常領域検出手段
８１ 表示手段
９０，９０’ ステージ
９１，９０’ 位置調節手段
１００ 内視鏡スコープ
１０１ 鉗子口チャンネル
１０２ 照明部
１０３ 撮像部
Ｌ１ パルス励起光
Ｌｓ 蛍光スペクトル
Ｌｆ 蛍光
Ｔｆ 蛍光寿命
Ｄ 被測定物質（生体物質）
Ｆ ファイバプローブ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体物質中に含まれる、生体内の酸化還元反応において補酵素として働く所定の蛍光物質を励起可能な波長を含み、前記生体物質に組織破壊又は細胞破壊を引き起こさず、且つ、前記生体物質内のｐＨを実質的に変化させない強度を有するパルス励起光を発生させ、
該パルス励起光を前記生体物質の所定の位置に照射し、
該照射により励起された前記蛍光物質から生じる蛍光を含む光を受光し、
該受光した蛍光の強度を時間分解して前記蛍光の蛍光寿命を算出し、
該蛍光寿命から前記生体物質のｐＨを測定することを特徴とするｐＨ測定方法。
【請求項２】
前記蛍光物質が、ｐＨ６．５〜７．５の範囲において、前記蛍光寿命が０．０３ナノ秒以上変化するものであることを特徴とする請求項１に記載のｐＨ測定方法。
【請求項３】
前記蛍光物質が、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、及びＦＡＤからなる群より選ばれる少なくとも１種の蛍光物質であることを特徴とする請求項１又は２に記載のｐＨ測定方法。
【請求項４】
前記生体物質が細胞質、ミトコンドリア、核であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のｐＨ測定方法。
【請求項５】
前記受光した蛍光を波長分解した蛍光スペクトルとした後、該蛍光スペクトルから波長毎に前記蛍光強度を時間分解して波長毎の前記蛍光の蛍光寿命を算出することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のｐＨ測定方法。
【請求項６】
前記蛍光が、多光子励起により励起されるものであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のｐＨ測定方法。
【請求項７】
前記所定の位置が、複数の位置であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のｐＨ測定方法。
【請求項８】
前記所定の位置が、前記生体物質の所定領域に一様に分布された位置である請求項１〜７のいずれかに記載のｐＨ測定方法により、前記所定の位置のｐＨを測定し、得られた前記所定の位置のｐＨに基づいて、前記所定領域の前記生体物質の異常領域を検出することを特徴とする検出方法。
【請求項９】
前記生体物質の異常領域を画像化して表示して検出することを特徴とする請求項８に記載の検出方法。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれかに記載のｐＨ測定方法により測定したｐＨに基づいて、前記生体物質の病理学的性質を特定することを特徴とする生体物質分析方法。
【請求項１１】
請求項８又は９に記載の検出方法により前記異常領域を検出し、前記所定の領域の病理学的性質を特定することを特徴とする生体物質分析方法。
【請求項１２】
前記病理学的性質が悪性腫瘍状態の有無であることを特徴とする請求項１０又は１１に記載の生体物質分析方法。
【請求項１３】
生体物質中に含まれる生体内の酸化還元反応において補酵素として働く所定の蛍光物質を励起可能な波長を含み、前記生体物質に組織破壊又は細胞破壊を引き起こさず、且つ、前記生体物質内のｐＨを実質的に変化させない強度を有するパルス励起光を発生する励起光発生手段と、
該パルス励起光を前記生体物質の所定の位置に照射する励起光照射手段と、
前記パルス励起光が照射されることにより励起された前記蛍光物質から生じる蛍光を含む光を受光する受光手段と、
前記パルス励起光の照射と同期して前記蛍光を時間分解する時間分解手段と、
該時間分解された前記蛍光を検出する検出手段と、
該検出手段により検出された前記蛍光から該蛍光の蛍光寿命を算出し、該蛍光寿命に基づいて前記生体物質のｐＨを測定する測定手段とを備えたことを特徴とするｐＨ測定装置。
【請求項１４】
前記受光手段により受光した前記蛍光を分光して前記時間分解手段に波長分解された前記蛍光を出力する分光手段を更に備えたことを特徴とする請求項１３に記載のｐＨ測定装置。
【請求項１５】
前記蛍光物質が、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、及びＦＡＤからなる群より選ばれる少なくとも１種の蛍光物質であることを特徴とする請求項１３又は１４に記載のｐＨ測定装置。
【請求項１６】
前記生体物質が細胞質、ミトコンドリア、核であることを特徴とする請求項１３〜１５のいずれかに記載のｐＨ測定装置。
【請求項１７】
前記蛍光が、多光子励起により励起されるものであることを特徴とする請求項１３〜１６のいずれかに記載のｐＨ測定装置。
【請求項１８】
ピコ秒からフェムト秒レーザを前記励起光発生手段に備えたことを特徴とする請求項１７に記載のｐＨ測定装置。
【請求項１９】
表面に前記生体物質を接触させて保持するステージであって、前記生体物質の任意の位置に前記パルス励起光を照射できるように３次元方向に可動なステージと、
該ステージを３次元方向の任意の位置に動かす位置調節手段とを更に備えたものであり、
前記励起光照射手段は、前記パルス励起光を受光して、該パルス励起光を前記生体物質に照射する光学系を備えたものであり、
前記受光手段は、前記照射により励起された前記蛍光物質から生じる蛍光を含む光を受光して該光を前記時間分解手段に導く光学系を備えたものであることを特徴とする請求項１３〜１８のいずれかに記載のｐＨ測定装置。
【請求項２０】
表面に前記生体物質を接触させて保持するステージであって、前記生体物質の、少なくとも前記パルス励起光の光軸方向の任意の位置に該パルス励起光を照射できるように可動なステージと、
該ステージを少なくとも光軸方向の任意の位置に動かす第１の位置調節手段と、
前記生体物質の、少なくとも前記パルス励起光の光軸に垂直な面内方向の任意の位置に該パルス励起光を照射できるように前記励起光照射手段を動かす第２の位置調節手段とを更に備えたものであり、
前記励起光照射手段は、前記パルス励起光を受光して、該パルス励起光を前記生体物質に照射する光学系を備えたものであり、
前記受光手段は、前記照射により励起された前記蛍光物質から生じる蛍光を含む光を受光して該光を前記時間分解手段に導く光学系を備えたものであることを特徴とする請求項１３〜１９のいずれかに記載のｐＨ測定装置。
【請求項２１】
前記生体物質の３次元方向の任意の位置に、前記パルス励起光を照射できるように前記励起光照射手段を動かす位置調節手段を更に備え、
前記励起光照射手段は、前記パルス励起光を受光して、該パルス励起光を前記生体物質に照射する光学系を備えたものであり、
前記受光手段は、前記照射により励起された前記蛍光物質から生じる蛍光を含む光を受光して該光を前記時間分解手段に導く光学系を備えたものであることを特徴とする請求項１３〜１９のいずれかに記載のｐＨ測定装置。
【請求項２２】
前記励起光照射手段は、前記パルス励起光を前記生体物質に照射する少なくとも１本の照射用光ファイバを備えたものであり、前記受光手段は、前記照射により励起された前記蛍光物質から生じる蛍光を含む光を受光して該蛍光を前記時間分解手段１３〜２１のいずれかに記載のｐＨ測定装置。
【請求項２３】
前記少なくとも１本の照射用光ファイバと前記少なくとも１本の受光用光ファイバとが、１本のバンドルファイバを形成していることを特徴とする請求項２２に記載のｐＨ測定装置。
【請求項２４】
前記バンドルファイバは、略中心部に配された1本の前記照射用光ファイバの外周を、複数本の前記受光用光ファイバで囲むように束ねられたものであることを特徴とする請求項２３に記載のｐＨ測定装置。
【請求項２５】
前記バンドルファイバが体腔内に挿入される略円筒形の長尺のシース内に備えられたファイバプローブであることを特徴とする請求項２３又は２４に記載のｐＨ測定装置。
【請求項２６】
前記バンドルファイバが、体腔内の所定の位置に照明光を照射する照明部と、前記所定の位置で反射された反射光を撮像する撮像部と、鉗子チャンネルとを備えた内視鏡スコープの前記鉗子チャンネルに備えられたものであることを特徴とする請求項２３又は２４に記載のｐＨ測定装置。
【請求項２７】
前記ファイバプローブが、体腔内所定の位置に照明光を照射する照明部と、前記所定の位置で反射された反射光を撮像する撮像部と、鉗子チャンネルとを備えた内視鏡スコープの前記鉗子チャンネルに、前記所定の位置側の前記鉗子チャンネルの出口から突出して備えられたことを特徴とする請求項２５に記載のｐＨ測定装置。
【請求項２８】
前記所定の位置が、複数の位置であることを特徴とする請求項１３〜２７のいずれかに記載のｐＨ測定装置。
【請求項２９】
前記複数の所定の位置が、前記生体物質の所定領域に一様に分布された位置である請求項２８に記載のｐＨ測定装置と、
該ｐＨ測定装置により測定された前記複数の位置の前記複数の所定の位置のｐＨに基づいて、前記所定領域の異常領域を検出する検出手段とを備えたことを特徴とする検出装置。
【請求項３０】
前記検出手段において検出された前記異常領域を画像化して表示する表示装置を更に備えたことを特徴とする請求項２９に記載の検出装置。
【請求項３１】
請求項１３〜２８のいずれかに記載の測定装置と、
該ｐＨ測定装置により測定したｐＨに基づいて、前記生体物質の病理学的性質を特定する分析手段とを有することを特徴とする生体物質分析装置。
【請求項３２】
前記病理学的性質が悪性腫瘍状態の有無であることを特徴とする請求項３１に記載の生体物質分析装置。
【請求項３３】
前記検出手段と、
該低検出手段により検出された前記領域の異常領域の病理学的性質を特定する分析手段とを備えたことを特徴とする請求項３１又は３２に記載の生体物質分析装置。
【請求項１】
生体物質中に含まれる、生体内の酸化還元反応において補酵素として働く所定の蛍光物質を励起可能な波長を含み、前記生体物質に組織破壊又は細胞破壊を引き起こさず、且つ、前記生体物質内のｐＨを実質的に変化させない強度を有するパルス励起光を発生させ、
該パルス励起光を前記生体物質の所定の位置に照射し、
該照射により励起された前記蛍光物質から生じる蛍光を含む光を受光し、
該受光した蛍光の強度を時間分解して前記蛍光の蛍光寿命を算出し、
該蛍光寿命から前記生体物質のｐＨを測定することを特徴とするｐＨ測定方法。
【請求項２】
前記蛍光物質が、ｐＨ６．５〜７．５の範囲において、前記蛍光寿命が０．０３ナノ秒以上変化するものであることを特徴とする請求項１に記載のｐＨ測定方法。
【請求項３】
前記蛍光物質が、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、及びＦＡＤからなる群より選ばれる少なくとも１種の蛍光物質であることを特徴とする請求項１又は２に記載のｐＨ測定方法。
【請求項４】
前記生体物質が細胞質、ミトコンドリア、核であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のｐＨ測定方法。
【請求項５】
前記受光した蛍光を波長分解した蛍光スペクトルとした後、該蛍光スペクトルから波長毎に前記蛍光強度を時間分解して波長毎の前記蛍光の蛍光寿命を算出することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のｐＨ測定方法。
【請求項６】
前記蛍光が、多光子励起により励起されるものであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のｐＨ測定方法。
【請求項７】
前記所定の位置が、複数の位置であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のｐＨ測定方法。
【請求項８】
前記所定の位置が、前記生体物質の所定領域に一様に分布された位置である請求項１〜７のいずれかに記載のｐＨ測定方法により、前記所定の位置のｐＨを測定し、得られた前記所定の位置のｐＨに基づいて、前記所定領域の前記生体物質の異常領域を検出することを特徴とする検出方法。
【請求項９】
前記生体物質の異常領域を画像化して表示して検出することを特徴とする請求項８に記載の検出方法。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれかに記載のｐＨ測定方法により測定したｐＨに基づいて、前記生体物質の病理学的性質を特定することを特徴とする生体物質分析方法。
【請求項１１】
請求項８又は９に記載の検出方法により前記異常領域を検出し、前記所定の領域の病理学的性質を特定することを特徴とする生体物質分析方法。
【請求項１２】
前記病理学的性質が悪性腫瘍状態の有無であることを特徴とする請求項１０又は１１に記載の生体物質分析方法。
【請求項１３】
生体物質中に含まれる生体内の酸化還元反応において補酵素として働く所定の蛍光物質を励起可能な波長を含み、前記生体物質に組織破壊又は細胞破壊を引き起こさず、且つ、前記生体物質内のｐＨを実質的に変化させない強度を有するパルス励起光を発生する励起光発生手段と、
該パルス励起光を前記生体物質の所定の位置に照射する励起光照射手段と、
前記パルス励起光が照射されることにより励起された前記蛍光物質から生じる蛍光を含む光を受光する受光手段と、
前記パルス励起光の照射と同期して前記蛍光を時間分解する時間分解手段と、
該時間分解された前記蛍光を検出する検出手段と、
該検出手段により検出された前記蛍光から該蛍光の蛍光寿命を算出し、該蛍光寿命に基づいて前記生体物質のｐＨを測定する測定手段とを備えたことを特徴とするｐＨ測定装置。
【請求項１４】
前記受光手段により受光した前記蛍光を分光して前記時間分解手段に波長分解された前記蛍光を出力する分光手段を更に備えたことを特徴とする請求項１３に記載のｐＨ測定装置。
【請求項１５】
前記蛍光物質が、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、及びＦＡＤからなる群より選ばれる少なくとも１種の蛍光物質であることを特徴とする請求項１３又は１４に記載のｐＨ測定装置。
【請求項１６】
前記生体物質が細胞質、ミトコンドリア、核であることを特徴とする請求項１３〜１５のいずれかに記載のｐＨ測定装置。
【請求項１７】
前記蛍光が、多光子励起により励起されるものであることを特徴とする請求項１３〜１６のいずれかに記載のｐＨ測定装置。
【請求項１８】
ピコ秒からフェムト秒レーザを前記励起光発生手段に備えたことを特徴とする請求項１７に記載のｐＨ測定装置。
【請求項１９】
表面に前記生体物質を接触させて保持するステージであって、前記生体物質の任意の位置に前記パルス励起光を照射できるように３次元方向に可動なステージと、
該ステージを３次元方向の任意の位置に動かす位置調節手段とを更に備えたものであり、
前記励起光照射手段は、前記パルス励起光を受光して、該パルス励起光を前記生体物質に照射する光学系を備えたものであり、
前記受光手段は、前記照射により励起された前記蛍光物質から生じる蛍光を含む光を受光して該光を前記時間分解手段に導く光学系を備えたものであることを特徴とする請求項１３〜１８のいずれかに記載のｐＨ測定装置。
【請求項２０】
表面に前記生体物質を接触させて保持するステージであって、前記生体物質の、少なくとも前記パルス励起光の光軸方向の任意の位置に該パルス励起光を照射できるように可動なステージと、
該ステージを少なくとも光軸方向の任意の位置に動かす第１の位置調節手段と、
前記生体物質の、少なくとも前記パルス励起光の光軸に垂直な面内方向の任意の位置に該パルス励起光を照射できるように前記励起光照射手段を動かす第２の位置調節手段とを更に備えたものであり、
前記励起光照射手段は、前記パルス励起光を受光して、該パルス励起光を前記生体物質に照射する光学系を備えたものであり、
前記受光手段は、前記照射により励起された前記蛍光物質から生じる蛍光を含む光を受光して該光を前記時間分解手段に導く光学系を備えたものであることを特徴とする請求項１３〜１９のいずれかに記載のｐＨ測定装置。
【請求項２１】
前記生体物質の３次元方向の任意の位置に、前記パルス励起光を照射できるように前記励起光照射手段を動かす位置調節手段を更に備え、
前記励起光照射手段は、前記パルス励起光を受光して、該パルス励起光を前記生体物質に照射する光学系を備えたものであり、
前記受光手段は、前記照射により励起された前記蛍光物質から生じる蛍光を含む光を受光して該光を前記時間分解手段に導く光学系を備えたものであることを特徴とする請求項１３〜１９のいずれかに記載のｐＨ測定装置。
【請求項２２】
前記励起光照射手段は、前記パルス励起光を前記生体物質に照射する少なくとも１本の照射用光ファイバを備えたものであり、前記受光手段は、前記照射により励起された前記蛍光物質から生じる蛍光を含む光を受光して該蛍光を前記時間分解手段１３〜２１のいずれかに記載のｐＨ測定装置。
【請求項２３】
前記少なくとも１本の照射用光ファイバと前記少なくとも１本の受光用光ファイバとが、１本のバンドルファイバを形成していることを特徴とする請求項２２に記載のｐＨ測定装置。
【請求項２４】
前記バンドルファイバは、略中心部に配された1本の前記照射用光ファイバの外周を、複数本の前記受光用光ファイバで囲むように束ねられたものであることを特徴とする請求項２３に記載のｐＨ測定装置。
【請求項２５】
前記バンドルファイバが体腔内に挿入される略円筒形の長尺のシース内に備えられたファイバプローブであることを特徴とする請求項２３又は２４に記載のｐＨ測定装置。
【請求項２６】
前記バンドルファイバが、体腔内の所定の位置に照明光を照射する照明部と、前記所定の位置で反射された反射光を撮像する撮像部と、鉗子チャンネルとを備えた内視鏡スコープの前記鉗子チャンネルに備えられたものであることを特徴とする請求項２３又は２４に記載のｐＨ測定装置。
【請求項２７】
前記ファイバプローブが、体腔内所定の位置に照明光を照射する照明部と、前記所定の位置で反射された反射光を撮像する撮像部と、鉗子チャンネルとを備えた内視鏡スコープの前記鉗子チャンネルに、前記所定の位置側の前記鉗子チャンネルの出口から突出して備えられたことを特徴とする請求項２５に記載のｐＨ測定装置。
【請求項２８】
前記所定の位置が、複数の位置であることを特徴とする請求項１３〜２７のいずれかに記載のｐＨ測定装置。
【請求項２９】
前記複数の所定の位置が、前記生体物質の所定領域に一様に分布された位置である請求項２８に記載のｐＨ測定装置と、
該ｐＨ測定装置により測定された前記複数の位置の前記複数の所定の位置のｐＨに基づいて、前記所定領域の異常領域を検出する検出手段とを備えたことを特徴とする検出装置。
【請求項３０】
前記検出手段において検出された前記異常領域を画像化して表示する表示装置を更に備えたことを特徴とする請求項２９に記載の検出装置。
【請求項３１】
請求項１３〜２８のいずれかに記載の測定装置と、
該ｐＨ測定装置により測定したｐＨに基づいて、前記生体物質の病理学的性質を特定する分析手段とを有することを特徴とする生体物質分析装置。
【請求項３２】
前記病理学的性質が悪性腫瘍状態の有無であることを特徴とする請求項３１に記載の生体物質分析装置。
【請求項３３】
前記検出手段と、
該低検出手段により検出された前記領域の異常領域の病理学的性質を特定する分析手段とを備えたことを特徴とする請求項３１又は３２に記載の生体物質分析装置。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【公開番号】特開２０１１−１８５８４３（Ｐ２０１１−１８５８４３Ａ）
【公開日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３２１５（Ｐ２０１０−５３２１５）
【出願日】平成２２年３月１０日（２０１０．３．１０）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人北海道大学 (971)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月１０日（２０１０．３．１０）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人北海道大学 (971)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]