蛍光検出装置、蛍光検出方法および蛍光検出プログラム
【課題】測定対象物に含有される個々の蛍光色素に由来する蛍光を分離してＳＮ比よく検出する。
【解決手段】蛍光検出装置１は、顕微鏡１０、励起光源２０、検出部３０および処理部４０等を備える。処理部４０に含まれる第１測定データ取得手段４１は、複数の検出波長帯域それぞれにおいて蛍光を検出部３０により略同一の検出時間に亘って検出させて第１測定データを取得する。検出時間設定手段４２は、各検出波長帯域についての第１測定データを互いに比較して、入力光強度が最も低い特定検出波長帯域における検出時間を他の検出波長帯域における検出時間より長く設定する。第２測定データ取得手段４３は、設定された各検出波長帯域の検出時間に亘って蛍光を検出部３０により検出させて第２測定データを取得する。解析手段４４は、第２測定データに基づいて、測定対象物９に含有される各種類の蛍光色素の含有濃度を解析する。
【解決手段】蛍光検出装置１は、顕微鏡１０、励起光源２０、検出部３０および処理部４０等を備える。処理部４０に含まれる第１測定データ取得手段４１は、複数の検出波長帯域それぞれにおいて蛍光を検出部３０により略同一の検出時間に亘って検出させて第１測定データを取得する。検出時間設定手段４２は、各検出波長帯域についての第１測定データを互いに比較して、入力光強度が最も低い特定検出波長帯域における検出時間を他の検出波長帯域における検出時間より長く設定する。第２測定データ取得手段４３は、設定された各検出波長帯域の検出時間に亘って蛍光を検出部３０により検出させて第２測定データを取得する。解析手段４４は、第２測定データに基づいて、測定対象物９に含有される各種類の蛍光色素の含有濃度を解析する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光検出装置および蛍光検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
蛍光色素が含有された測定対象物で発生する蛍光を検出する蛍光検出技術は、最近では生化学分野において重要な技術の１つとなっており、特許文献１や非特許文献１に記載されたものが知られている。例えば、細胞の生理的活動を研究する際に、細胞に含まれる蛋白質などの機能性分子の活性を測定するために、その機能性分子を蛍光色素で標識することで機能性分子を可視化し、この機能性分子で発生する蛍光を顕微鏡像としてイメージングすることが行われている。
【０００３】
また、１つの細胞からより多くの種類の機能性分子の動態を知るために、機能性分子を種類毎に蛍光波長の異なる蛍光色素で標識することにより、マルチカラーの顕微鏡像を得ることも行われる。この場合、それぞれの蛍光は、その波長の観察に適した透過帯をもつバンドパスフィルタで分光することで測定される。
【０００４】
しかし、一般的に、各種の蛍光色素から発生する蛍光のスペクトルは、広い波長域に広がっているので、スペクトル間に重なり（クロストーク）が生じて、バンドパスフィルタだけでは完全に分離できないことが多い。このような状況では、それぞれの機能性分子の分布や量を正確に知ることが困難になる。そこで、特許文献１や非特許文献１に記載された蛍光検出技術は、このような問題を解決することを意図したものであって、演算によってクロストークの影響を除去して、蛍光色素の種類毎に蛍光色素の分布を示す分離画像を得ようとするものである。
【特許文献１】国際公開第２００５／０３６１４３号パンフレット
【非特許文献１】Timo Zimmermann, et al., "Spectral imaging and its applicationin live cell microscopy", FEBS Letters 546 (2003) 87-92.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところが、従来の蛍光検出技術では、複数種類の蛍光色素が含有された測定対象物で発生する蛍光を検出しようとすると、特に蛍光の波長が近くスペクトル形状が似ている蛍光色素の組み合わせのときに、分離画像の画質が元の画像と比べると悪くなることがあった。このような問題は、１次元または２次元の蛍光画像を得る場合だけでなく、単に蛍光強度を得る場合にも存在する。
【０００６】
本発明は、上記問題点を解消する為になされたものであり、複数種類の蛍光色素が含有された測定対象物で発生する蛍光を検出する際に、個々の蛍光色素に由来する蛍光を分離してＳＮ比よく検出することができる蛍光検出装置および蛍光検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に係る蛍光検出装置は、複数種類の蛍光色素が含有された測定対象物で発生する蛍光を検出する蛍光検出装置であって、(a) 複数の検出波長帯域それぞれにおいて入力光強度を検出して当該検出結果を示すデータを出力するともに、複数の検出波長帯域それぞれにおける当該検出時間が可変である検出部と、(b) 検出部における光検出動作を制御するとともに、検出部から出力されるデータを取得して該データを処理する処理部と、を備えることを特徴とする。
【０００８】
更に、本発明に係る蛍光検出装置に含まれる処理部は、(1) 複数の検出波長帯域それぞれにおいて、測定対象物で発生する蛍光を検出部により略同一の検出時間に亘って検出させ、当該検出結果を示す第１測定データを取得する第１測定データ取得手段と、(2) 第１測定データ取得手段により取得された複数の検出波長帯域それぞれについての第１測定データを互いに比較して、その比較結果に基づいて、複数の検出波長帯域のうち入力光強度が最も低い検出波長帯域（以下「特定検出波長帯域」という。）を選択して、複数の検出波長帯域のうち特定検出波長帯域における検出時間を他の検出波長帯域における検出時間より長く設定する検出時間設定手段と、(3) 検出時間設定手段により設定された複数の検出波長帯域それぞれの検出時間に亘って、測定対象物で発生する蛍光を検出部により検出させ、当該検出結果を示す第２測定データを取得する第２測定データ取得手段と、(4) 第２測定データ取得手段により取得された複数の検出波長帯域それぞれについての第２測定データに基づいて、測定対象物に含有される複数種類の蛍光色素それぞれの含有濃度を解析する解析手段と、を含むことを特徴とする。
【０００９】
本発明に係る蛍光検出装置は、検出部および処理部を備え、また、処理部が第１測定データ取得手段，検出時間設定手段，第２測定データ取得手段および解析手段を含んでいて、以下のように作用する。まず、第１測定データ取得手段により、複数の検出波長帯域それぞれにおいて、測定対象物で発生する蛍光が検出部により略同一の検出時間に亘って検出され、当該検出結果を示す第１測定データが取得される。続く検出時間設定手段により、第１測定データ取得手段により取得された複数の検出波長帯域それぞれについての第１測定データが互いに比較されて、その比較結果に基づいて、複数の検出波長帯域のうち入力光強度が最も低い検出波長帯域（特定検出波長帯域）が選択されて、複数の検出波長帯域のうち特定検出波長帯域における検出時間が他の検出波長帯域における検出時間より長く設定される。そして、第２測定データ取得手段により、検出時間設定手段により設定された複数の検出波長帯域それぞれの検出時間に亘って、測定対象物で発生する蛍光が検出部により検出されて、当該検出結果を示す第２測定データが取得される。さらに、解析手段により、第２測定データ取得手段により取得された複数の検出波長帯域それぞれについての第２測定データに基づいて、測定対象物に含有される複数種類の蛍光色素それぞれの含有濃度が解析される。
【００１０】
このように、本発明では、特定検出波長帯域における検出時間が他の検出波長帯域における検出時間より長く設定され、第２測定データ取得手段により、測定対象物で発生する蛍光が検出部により検出されて、当該検出結果を示す第２測定データが取得され、そして、解析手段により、この取得された複数の検出波長帯域それぞれについての第２測定データに基づいて、測定対象物に含有される複数種類の蛍光色素それぞれの含有濃度が解析される。これにより、複数種類の蛍光色素が含有された測定対象物で発生する蛍光を検出する際に、個々の蛍光色素に由来する蛍光を分離してＳＮ比よく検出することができる。
【００１１】
また、本発明に係る蛍光検出方法は、複数種類の蛍光色素が含有された測定対象物で発生する蛍光を検出する蛍光検出方法であって、(1) 複数の検出波長帯域それぞれにおいて入力光強度を検出して当該検出結果を示すデータを出力するともに複数の検出波長帯域それぞれにおける当該検出時間が可変である検出部を用いて、複数の検出波長帯域それぞれにおいて、測定対象物で発生する蛍光を略同一の検出時間に亘って検出し、当該検出結果を示す第１測定データを取得する第１測定データ取得ステップと、(2) 第１測定データ取得ステップにおいて取得された複数の検出波長帯域それぞれについての第１測定データを互いに比較して、その比較結果に基づいて、複数の検出波長帯域のうち入力光強度が最も低い検出波長帯域（特定検出波長帯域）を選択して、複数の検出波長帯域のうち特定検出波長帯域における検出時間を他の検出波長帯域における検出時間より長く設定する検出時間設定ステップと、(3) 検出時間設定ステップにおいて設定された複数の検出波長帯域それぞれの検出時間に亘って、測定対象物で発生する蛍光を検出部により検出し、当該検出結果を示す第２測定データを取得する第２測定データ取得ステップと、(4) 第２測定データ取得ステップにおいて取得された複数の検出波長帯域それぞれについての第２測定データに基づいて、測定対象物に含有される複数種類の蛍光色素それぞれの含有濃度を解析する解析ステップと、を備えることを特徴とする。この本発明に係る蛍光検出方法は、上記の本発明に係る蛍光検出装置と同じ技術的思想に基づくものである。
【００１２】
本発明に係る蛍光検出装置では、検出時間設定手段が、第１測定データ取得手段により取得された複数の検出波長帯域それぞれについての第１測定データの比に対して逆比例関係となるように、複数の検出波長帯域それぞれにおける検出時間の比を設定するのが好適である。また、本発明に係る蛍光検出方法では、検出時間設定ステップにおいて、第１測定データ取得ステップにおいて取得された複数の検出波長帯域それぞれについての第１測定データの比に対して逆比例関係となるように、複数の検出波長帯域それぞれにおける検出時間の比を設定するのが好適である。
【００１３】
本発明に係る蛍光検出装置では、解析手段が、複数種類の蛍光色素のうちの個々の種類の蛍光色素を単独で含む基準試料それぞれで発生した蛍光を複数の検出波長帯域それぞれにおいて検出部により検出して得られた基準データと、第２測定データ取得手段により取得された複数の検出波長帯域それぞれについての第２測定データとに基づいて、測定対象物に含有される複数種類の蛍光色素それぞれの含有濃度を解析するのが好適である。また、本発明に係る蛍光検出方法では、解析ステップにおいて、複数種類の蛍光色素のうちの個々の種類の蛍光色素を単独で含む基準試料それぞれで発生した蛍光を複数の検出波長帯域それぞれにおいて検出部により検出して得られた基準データと、第２測定データ取得ステップにおいて取得された複数の検出波長帯域それぞれについての第２測定データとに基づいて、測定対象物に含有される複数種類の蛍光色素それぞれの含有濃度を解析するのが好適である。
【００１４】
本発明に係る蛍光検出装置では、検出部は、複数の検出波長帯域それぞれにおいて入力光強度に対する出力データのゲインが可変であり、処理部は、第２測定データ取得手段により測定対象物で発生する蛍光を検出部により検出させる際に、検出時間設定手段による比較結果に基づいて複数の検出波長帯域のうち何れかの検出波長帯域において検出部のゲインを調整するのが好適である。また、本発明に係る蛍光検出方法では、検出部は、複数の検出波長帯域それぞれにおいて入力光強度に対する出力データのゲインが可変であり、第２測定データ取得ステップにおいて、検出時間設定ステップにおける比較結果に基づいて複数の検出波長帯域のうち何れかの検出波長帯域において検出部のゲインを調整して、測定対象物で発生する蛍光を検出部により検出するのが好適である。特に、複数の検出波長帯域のうち入力光強度が高いものほどゲインを小さくするのが好ましい。
【００１５】
また、本発明に係る蛍光検出装置または蛍光検出方法では、検出部は、複数の検出波長帯域のうちの個々の検出波長帯域に対応する検出素子を含むのが好適である。
【００１６】
本発明に係る蛍光検出プログラムは、複数種類の蛍光色素が含有された測定対象物で発生する蛍光を検出する処理をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、(1) 複数の検出波長帯域それぞれにおいて入力光強度を検出して当該検出結果を示すデータを出力するともに複数の検出波長帯域それぞれにおける当該検出時間が可変である検出部を用いて、複数の検出波長帯域それぞれにおいて、測定対象物で発生する蛍光を略同一の検出時間に亘って検出し、当該検出結果を示す第１測定データを取得する第１測定データ取得ステップと、(2) 第１測定データ取得ステップにおいて取得された複数の検出波長帯域それぞれについての第１測定データを互いに比較して、その比較結果に基づいて、複数の検出波長帯域のうち入力光強度が最も低い検出波長帯域（特定検出波長帯域）を選択して、複数の検出波長帯域のうち特定検出波長帯域における検出時間を他の検出波長帯域における検出時間より長く設定する検出時間設定ステップと、(3) 検出時間設定ステップにおいて設定された複数の検出波長帯域それぞれの検出時間に亘って、測定対象物で発生する蛍光を検出部により検出し、当該検出結果を示す第２測定データを取得する第２測定データ取得ステップと、(4) 第２測定データ取得ステップにおいて取得された複数の検出波長帯域それぞれについての第２測定データに基づいて、測定対象物に含有される複数種類の蛍光色素それぞれの含有濃度を解析する解析ステップと、をコンピュータに実行させるためのプログラムである。すなわち、本発明に係る蛍光検出プログラムは、上記の本発明に係る蛍光検出方法に含まれる各処理をコンピュータに実行させるためのプログラムである。また、本発明に係る記録媒体は、上記の本発明に係る蛍光検出プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体である。この記録媒体は、磁気テープ、フレキシブルディスク、ＣＤ-ＲＯＭ、ＤＶＤ-ＲＯＭ等、任意のものが利用可能である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、複数種類の蛍光色素が含有された測定対象物で発生する蛍光を検出する際に、個々の蛍光色素に由来する蛍光を分離してＳＮ比よく検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための最良の形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。
【００１９】
図１は、本実施形態に係る蛍光検出装置１の構成図である。この図に示される蛍光検出装置１は、測定対象物９で発生する蛍光を検出する装置であって、顕微鏡１０、励起光源２０、検出部３０、処理部４０、表示部５０、出力部６０および入力部７０を備える。
【００２０】
測定対象物９は、複数種類の蛍光色素が含有された例えば細胞であり、顕微鏡１０のステージ１１に載置される。ステージ１１に載置された測定対象物９は、対物レンズ１２を介して観察される。また、測定対象物９は、励起光源２０から出力された励起光が対物レンズ１２を介して照射され、また、発生した蛍光が対物レンズ１２を介して検出部３０により検出される。なお、顕微鏡１０はダイクロイックミラーを有している。このダイクロイックミラーは、励起光源２０から到達した励起光を反射し、対物レンズ１２を通して測定対象物９へ照射するとともに、対物レンズ１２を通して到達した測定対象物９からの蛍光を透過させて検出部３０へ導く。
【００２１】
励起光源２０は、測定対象物９に照射されるべき励起光を出力する。シャッタ２１は、励起光源２０の光出射位置の直後に配置され、測定対象物９への励起光の照射よび停止を選択的に行う。フィルタ２２は、シャッタ２１の後段に配置され、励起光源２０から出力されシャッタ２１を経た光のうち特定波長域の光を選択的に透過させて、その透過させた光を励起光として測定対象物９へ照射させる。測定対象物９に含有される蛍光色素の種類に応じて、励起光源２０やフィルタ２２が選択されて、測定対象部９に照射される励起光の波長が適切に設定される。
【００２２】
検出部３０は、複数の検出波長帯域それぞれにおいて入力光強度を検出して当該検出結果を示すデータを出力する。また、この検出部３０は、複数の検出波長帯域それぞれにおける当該検出時間が可変である。検出部３０は、複数の検出波長帯域それぞれにおいて、設定された検出時間に亘って、測定対象物９で発生し対物レンズ１２を経て入力した蛍光を検出する。また、検出部３０は、複数の検出波長帯域それぞれにおいて入力光強度に対する出力データのゲインが可変である。
【００２３】
この検出部３０は、２次元の蛍光画像を得ることができるイメージセンサであってもよいし、１次元の蛍光画像を得ることができるラインセンサであってもよいし、また、単に蛍光強度を得ることができるセンサであってもよい。以下では、検出部３０が２次元イメージセンサである場合について説明するが、検出部３０が他のものである場合についても同様である。
【００２４】
このような検出部３０の構成としては種々の態様が可能である。好適には、検出部３０は、複数の検出波長帯域のうちの個々の検出波長帯域に対応する検出素子（例えばＣＣＤ）を含む。すなわち、検出部３０は、検出すべき検出波長帯域の数と同じ個数の検出素子を含み、各検出波長帯域の光を何れかの検出素子により検出する。
【００２５】
処理部４０は、例えばコンピュータを含んで構成され、検出部３０から出力される画像データを取得して該画像データを処理するものである。また、処理部４０は、検出部３０における光検出動作を制御するものであり、例えば、複数の検出波長帯域それぞれにおける検出時間やゲインを設定する。処理部４０は、第１測定データ取得手段４１、検出時間設定手段４２、第２測定データ取得手段４３、解析手段４４および記憶手段４５を含む。これらについては後に詳述する。
【００２６】
表示部５０は、処理部４０により取得された画像や処理後の画像等を表示する。出力部６０は、画像や処理結果の数値等を紙に印刷する。また、入力部７０は、操作者が蛍光検出装置１に対して指示を与えるためのものであり、キーボードやマウス等を含む。処理部４０は、入力部７０により受け付けた操作者の指示に基づいて、データ取得およびデータ解析等の処理を行って、画像や処理結果等を表示部５０により表示させ、或いは、画像や処理結果等を出力部６０により紙に印刷させる。
【００２７】
次に、本実施形態に係る蛍光検出装置１に含まれる処理部４０について詳細に説明する。処理部４０に含まれる第１測定データ取得手段４１、検出時間設定手段４２、第２測定データ取得手段４３および解析手段４４は、主たる構成要素としてＣＰＵを含み、記憶手段４５に格納された蛍光検出プログラムに従って処理を行い、また、処理に用いられる各種データについて記憶手段４５に対して読出または書込を行う。
【００２８】
第１測定データ取得手段４１は、複数の検出波長帯域それぞれにおいて、測定対象物９で発生する蛍光を検出部３０により略同一の検出時間に亘って検出させ、当該検出結果を示す第１測定データを取得する。検出時間設定手段４２は、第１測定データ取得手段４１により取得された複数の検出波長帯域それぞれについての第１測定データを互いに比較して、その比較結果に基づいて、複数の検出波長帯域のうち入力光強度が最も低い検出波長帯域（特定検出波長帯域）を選択して、複数の検出波長帯域のうち特定検出波長帯域における検出時間を他の検出波長帯域における検出時間より長く設定する。
【００２９】
第２測定データ取得手段４３は、検出時間設定手段により設定された複数の検出波長帯域それぞれの検出時間に亘って、測定対象物９で発生する蛍光を検出部３０により検出させ、当該検出結果を示す第２測定データを取得する。解析手段４４は、第２測定データ取得手段４３により取得された複数の検出波長帯域それぞれについての第２測定データに基づいて、測定対象物９に含有される複数種類の蛍光色素それぞれの含有濃度を解析する。
【００３０】
より好ましくは、検出時間設定手段４２は、第１測定データ取得手段４１により取得された複数の検出波長帯域それぞれについての第１測定データの比に対して逆比例関係となるように、複数の検出波長帯域それぞれにおける検出時間の比を設定する。
【００３１】
また、より好ましくは、第２測定データ取得手段４３により測定対象物で発生する蛍光を検出部３０により検出させる際に、検出時間設定手段４２による比較結果に基づいて複数の検出波長帯域のうち何れかの検出波長帯域において検出部３０のゲインを調整する。このとき、第１測定データ取得手段４１により取得された複数の検出波長帯域それぞれについての第１測定データを互いに比較して、その比較結果に基づいて、複数の検出波長帯域のうち入力光強度が高いものほどゲインを小さくするのが好ましい。なお、このゲインを小さくするには、検出部３０から出力される電気信号を電気的に増幅する増幅器の利得を小さくする他、検出部３０に含まれる検出素子の前面にＮＤフィルタを配置することでも可能である。
【００３２】
記憶手段４５は、処理部４０が動作するために必要な蛍光検出プログラムを格納し、第１測定データ取得手段４１や第２測定データ取得手段４３により取得された測定データを記憶し、また、検出時間設定手段４２や解析手段４４による処理の途中で用いられるデータや処理結果のデータを記憶する。記憶手段４５は例えばハードディスクドライブ等を含む。
【００３３】
次に、本実施形態に係る蛍光検出装置１に含まれる処理部４０について更に詳細に説明するとともに、本実施形態に係る蛍光検出方法についても説明する。以下に説明する処理部４０における処理動作または蛍光検出方法は、図１中に示される記録媒体８０に記録されたコンピュータ読み取り可能な蛍光検出プログラムにより実行される。この蛍光検出プログラムは、記録媒体８０により供給されるだけでなく、インターネット通信により供給されることも可能である。また、この蛍光検出プログラムは処理部４０の記憶手段４５により格納され、この記憶手段４５により格納された蛍光検出プログラムが動作時に読み出されて実行される。
【００３４】
図２は、本実施形態に係る蛍光検出方法のフローチャートである。本実施形態に係る蛍光検出方法は、第１測定データ取得ステップＳ１１、検出時間設定ステップＳ１２、第２測定データ取得ステップＳ１３、基準データ取得ステップＳ１４および解析ステップＳ１５を備える。以下では、測定対象物９に含有される蛍光色素が３種類であって、その測定対象物９で発生した蛍光の画像を３つの検出波長帯域（赤（Ｒ），緑（Ｇ），青（Ｂ））において検出部３０により取得して処理部４０により処理するものとする。
【００３５】
第１測定データ取得ステップＳ１１では、第１測定データ取得手段４１により、３つの検出波長帯域それぞれにおいて、測定対象物９で発生する蛍光が検出部３０により略同一の検出時間に亘って検出され、当該検出結果を示す第１測定データが取得される。このとき、３種類の蛍光色素の特性に合わせ、顕微鏡１０に導入される励起光の波長、顕微鏡１０に含まれるダイクロイックミラーの反射および透過の特性、ならびに、取得すべき蛍光の波長が設定される。また、検出時間は、３つの検出波長帯域それぞれで輝度が検出部３０の限度を越えない範囲で設定され、操作者による蛍光像の観察により任意に設定され得る。
【００３６】
検出時間設定ステップＳ１２では、検出時間設定手段４２により、第１測定データ取得ステップＳ１１において取得された３つの検出波長帯域それぞれについての第１測定データが互いに比較されて、その比較結果に基づいて、３つの検出波長帯域のうち入力光強度が最も低い検出波長帯域（特定検出波長帯域）が選択され、３つの検出波長帯域のうち特定検出波長帯域における検出時間が他の検出波長帯域における検出時間より長く設定される。より好ましくは、第１測定データ取得ステップＳ１１において取得された３つの検出波長帯域それぞれについての第１測定データの比に対して逆比例関係となるように、３つの検出波長帯域それぞれにおける検出時間の比が設定される。
【００３７】
第１測定データが２次元の画像データである場合、検出時間設定ステップＳ１２における具体的な処理の一例は以下のとおりである。すなわち、第１測定データである２次元画像において、蛍光の発生が認められる領域に任意の数の輝度測定領域が設定され、各輝度測定領域で３つの検出波長帯域それぞれの輝度平均値が求められる。輝度測定領域の設定は、操作者が画像を見ながら行うことができるようにしてもよいし、また、任意に選ばれた１つの検出波長帯域の画像において輝度測定領域とする範囲が輝度の最小値および最大値の設定に基づいて指定されてもよい。
【００３８】
この輝度平均値が求められる際に、ダークノイズによる輝度分が減算により補正されて輝度平均値が求められる。減算されるべきダークノイズ分の輝度は、励起光が照射されない状態で取得された画像など、ダークノイズとみなされる画像から測定され得る。あるいは、第１測定データの画像内で、蛍光が分布しない背景部の輝度として、そのような領域から測定されてもよい。
【００３９】
また、測定された各輝度測定領域の輝度平均値の中での最大値が、３つの検出波長帯域それぞれで求められる。赤（Ｒ）の検出波長帯域での最大値をＩmax-Ｒとし、緑（Ｇ）の検出波長帯域での最大値をＩmax-Ｇとし、青（Ｂ）の検出波長帯域での最大値をＩmax-Ｂとする。さらに、Ｉmax-Ｒ，Ｉmax-ＧおよびＩmax-Ｂの中での最大値Ｉmax-RGBが求められる。そして、Ｒ，Ｇ，Ｂの各検出波長帯域における検出時間の比（ＥＲ：ＥＧ：ＥＢ）が下記（１）式によって求められる。例えば、Ｉmax-Ｒが２５０であり、Ｉmax-Ｇが２５００であり、Ｉmax-Ｂが５００であるとすると、Ｒ，Ｇ，Ｂの各検出波長帯域における検出時間の比（ＥＲ：ＥＧ：ＥＢ）は１００：１０：５０ となる。
【００４０】
【数１】
【００４１】
この例のように得られる蛍光の多くが緑（Ｇ）の検出波長帯域に集中した場合、従来の蛍光検出方法では、蛍光画像を取得する際の検出時間は、緑（Ｇ）の検出波長帯域の蛍光を検出する検出素子（例えばＣＣＤ）が飽和した時点でそれ以上長くすることができなくなる。これに対して、本実施形態のように３つの検出波長帯域それぞれの検出時間の比が設定されることで、同様の輝度を得るまでに検出時間を１０倍長くすることができる。この効果により、蛍光画像のＳＮ比が向上され、分離画像の画質を改善することができる。
【００４２】
続く第２測定データ取得ステップＳ１３では、第２測定データ取得手段４３により、以上のようにして検出時間設定ステップＳ１２において設定された３つの検出波長帯域それぞれの検出時間に亘って、測定対象物９で発生する蛍光が検出部３０により検出され、当該検出結果を示す第２測定データが取得される。このとき、３つの検出波長帯域それぞれの検出時間が上記比率に保たれるとともに、輝度が検出部３０の検出限界を越えない範囲で設定され、操作者による蛍光像の観察により任意に設定され得る。
【００４３】
基準データ取得ステップＳ１４では、３種類の蛍光色素のうちの個々の種類の蛍光色素を単独で含む３つの基準試料が用意され、各基準試料が順次にステージ９に載置されて、各基準試料で発生した蛍光が３つの検出波長帯域それぞれにおいて検出部３０により検出されて基準データが取得される。なお、この際に、ダークノイズについての補正が行われる。基準データとして、下記（２）式で表される３行３列の行列Ｊが作成される。この行列Ｊの第ｍ行第ｎ列の要素Ｊｍ,ｎは、３種類の蛍光色素のうちの第ｎの蛍光色素を単独で含む基準試料で発生した蛍光であって、３つの検出波長帯域のうちの第ｍの検出波長帯域において検出部３０により検出された蛍光の強度を表す。ここで、ｍ，ｎは、１以上３以下の整数である。なお、基準データ取得ステップＳ１４で、３つの検出波長帯域それぞれにおける検出部３０による検出は、検出時間設定ステップＳ１２において設定される検出時間に亘って行われるのも好ましい。
【００４４】
【数２】
【００４５】
そして、解析ステップＳ１５では、解析手段４４により、第２測定データ取得ステップＳ１３において取得された３つの検出波長帯域それぞれについての第２測定データに基づいて、測定対象物９に含有される３種類の蛍光色素それぞれの含有濃度が解析される。この解析に際しては、３種類の蛍光色素それぞれで発生する蛍光スペクトルのうち何れか２つの蛍光スペクトルが互いに重なっている場合には、一般にアンミキシングと呼ばれる画像演算が行われる。以下では、本実施形態におけるアンミキシング演算について説明する。
【００４６】
アンミキシング演算では、第２測定データ取得手段４３で取得された３つの検出波長帯域それぞれについての第２測定データからダークノイズ成分が除去されたデータに加えて、基準データ取得ステップＳ１４で取得された基準データの行列Ｊ（上記（２）式）が用いられて、各画素について以下のような演算が行われる。第２測定データ取得手段４３で取得された赤（Ｒ）の検出波長帯域についての第２測定データからダークノイズ成分が除去された画素データをＯ１と表し、第２測定データ取得手段４３で取得された緑（Ｇ）の検出波長帯域についての第２測定データからダークノイズ成分が除去された画素データをＯ２と表し、第２測定データ取得手段４３で取得された青（Ｂ）の検出波長帯域についての第２測定データからダークノイズ成分が除去された画素データをＯ３と表す。
【００４７】
また、上記（２）式の基準データの行列Ｊの各要素Ｊｍ,ｎのうち、要素Ｊ１,１，Ｊ１,２，Ｊ１,３が赤（Ｒ）の検出波長帯域についてのデータであり、要素Ｊ２,１，Ｊ２,２，Ｊ２,３が緑（Ｇ）の検出波長帯域についてのデータであり、要素Ｊ３,１，Ｊ３,２，Ｊ３,３が青（Ｂ）の検出波長帯域についてのデータであるとする。当該画素における３種類の蛍光色素それぞれの含有濃度をｃ１〜ｃ３と表すと、これらは下記（３）式で表される。（３）式による演算が画素毎に行われることで、第２測定データ取得ステップＳ１３において取得された３つの検出波長帯域それぞれについての第２測定データに基づいて、測定対象物９に含有される３種類の蛍光色素それぞれの含有濃度分布を表す分離画像が個々に得られる。
【００４８】
【数３】
【００４９】
ところで、基準データＪの各要素が各検出波長帯域での各蛍光色素の強度分布の比率を保って得られていれば、上記のアンミキシング演算により分離画像が作成され得る。ただし、この場合、アンミキシング演算によって求められた分離画像の各画素の“濃度”は、もともと試料が持っていた蛍光色素の量に対してリニアな関係にはあるが、相対的な値として求められている。
【００５０】
絶対的な濃度を求めたい場合には、まず、基準データを得るための基準試料における蛍光色素の濃度が既知であることが必要である。さらに、基準データを得るための画像と第２測定データによる元画像の輝度とを対比できるように、基準試料および測定対象部９それぞれの厚さ（光路長）が互いに同じであり、且つ、これらの画像が検出時間や検出部３０のゲイン等に関して互いに同じ条件で得られていることが必要である。
【００５１】
このような測定は、基準データを得るための基準試料として既知濃度の蛍光色素の溶液を使用し、画像を常に同じ厚さの断層像が得られるコンフォーカル顕微鏡で取得することで行なうことができる。また、基準データ取得ステップＳ１４および解析ステップＳ１５それぞれでは、以下のような処理が行われる。
【００５２】
基準データ取得ステップＳ１４では、使用された蛍光色素ごとに基準データが測定される。このとき、濃度が既知である蛍光色素の溶液が基準試料として用いられ、この基準試料からの蛍光画像が蛍光色素毎に取得される。各検出波長帯域での検出時間は、検出時間設定ステップＳ１２で設定された比とされる。この検出時間で輝度が検出部３０の検出限界を越えないように、基準試料における蛍光色素濃度が調整される。そして、取得された画像に輝度測定領域が設定されて、ダークノイズ分が補正された輝度測定領域のＲ，Ｇ，Ｂごとの平均輝度が測定されることで、各蛍光色素の基準データが測定される。
【００５３】
解析ステップＳ１５におけるアンミキシング演算では、各画素に存在する各蛍光色素の量が、上記（３）式により、基準データの輝度を単位濃度とした濃度ｃとして求められ、この値をもとに分離画像が作成される。さらに、下記（４）式により、各画素の各蛍光色素の濃度ｃが、絶対的な濃度Ｃに変換される。Ｃは、分離画像の絶対的な濃度であり、ｃは、基準データの輝度を単位濃度としたときの分離画像の濃度であり、ｃ'は、基準データを得るための基準試料における蛍光色素濃度である。
【００５４】
【数４】
【００５５】
次に、本実施形態に係る蛍光検出装置１および蛍光検出方法の実施例について説明する。実施例において測定された測定対象物９は、３種類の蛍光色素ＣＦＰ（Cyan FluorescentProtein），ＧＦＰ（GreenFluorescent Protein），ＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protein）の何れかを単独で含むＨｅＬａ細胞（ヒト由来の細胞）が混合されて培養されたものであった。
【００５６】
検出部３０として用いられたものは、浜松ホトニクス社製の３個のＣＣＤを有するカラーカメラＣ７７８０-２０であった。このカメラは、３個のＣＣＤにより赤（Ｒ），緑（Ｇ），青（Ｂ）の３つの検出波長帯域の画像を同時に取得することができ、また、各ＣＣＤについて個別に検出時間が設定され得る。
【００５７】
各蛍光色素の特性に合わせて、励起光源２０から顕微鏡１０に導入される励起光の波長は４４０±１０ｎｍとされ、顕微鏡１０に含まれるダイクロイックミラーの反射・透過の境界の波長は４５５ｎｍとされて、検出部３０の前面に配置したフィルタにより波長４６０ｎｍ以上の蛍光像が取得された。図３は、各蛍光色素の蛍光スペクトルおよびカメラの各ＣＣＤの検出波長帯域を示す図である。解析ステップＳ１５におけるアンミキシング演算に際しては、浜松ホトニクス社製の画像処理装置AQUACOSMOSが用いられた。
【００５８】
第１測定データ取得ステップＳ１１において、この測定対象物９で発生する蛍光が検出部３０により３つの検出波長帯域それぞれで略同一の検出時間（４０ｍ秒）に亘って検出されて、第１測定データとしての蛍光画像が得られた。図４は、第１測定データ取得ステップＳ１１において第１測定データとして得られた蛍光画像および分離画像を示す図である。同図（ａ）は、第１測定データとして得られた３つの検出波長帯域の画像が重ねられたものである。同図（ｂ）〜（ｄ）は、同図（ａ）の画像に基づいてアンミキシング演算が行われて分離された各蛍光色素の分離画像である。同図（ｂ）はＣＦＰの分離画像であり、同図（ｃ）はＧＦＰの分離画像であり、また、同図（ｄ）はＹＦＰの分離画像である。
【００５９】
同図（ａ）に示されるように、３種類の蛍光色素ＣＦＰ，ＧＦＰおよびＹＦＰが含有された測定対象物９で発生する蛍光は、緑（Ｇ）の検出波長帯域で高強度となった。したがって、検出部３０により３つの検出波長帯域それぞれで略同一の検出時間に亘って検出する場合、緑（Ｇ）の検出波長帯域の検出素子（ＣＣＤ）が飽和した時点でそれ以上長くすることができなくなる。
【００６０】
続く検出時間設定ステップＳ１２において、第１測定データ取得ステップＳ１１で得られた蛍光画像中に４つの輝度測定領域が設定され、各輝度測定領域で３つの検出波長帯域それぞれの輝度平均値が求められ、さらに、測定された各輝度測定領域の輝度平均値の中での最大値が３つの検出波長帯域それぞれで求められた。その結果、赤（Ｒ）の検出波長帯域での最大値Ｉmax-Ｒは１２９.４であり、緑（Ｇ）の検出波長帯域での最大値Ｉmax-Ｇは２６０６.３であり、また、青（Ｂ）の検出波長帯域での最大値Ｉmax-Ｂは５４４.９であった。また、上記（１）式で表されるＲ，Ｇ，Ｂの各検出波長帯域における検出時間の比（ＥＲ：ＥＧ：ＥＢ）は１００：５：２４ であった。
【００６１】
続く第２測定データ取得ステップＳ１３において、以上のようにして検出時間設定ステップＳ１２において設定された３つの検出波長帯域それぞれの検出時間に亘って、測定対象物９で発生する蛍光が検出部３０により検出され、当該検出結果を示す第２測定データが取得された。このとき、赤（Ｒ）の検出波長帯域における検出時間は８２７ｍ秒まで延長された。Ｒ，Ｇ，Ｂともに同じ検出時間で画像を取得するときと比べ、検出時間の比（１００：５：２４）で画像を取得するときには、計算上は約２０倍まで検出時間を長くすることができ、実際にもその程度まで検出時間を長くすることができた。
【００６２】
また、基準データ取得ステップＳ１４においても、同じ装置が用いられて、検出時間設定ステップＳ１２において設定された３つの検出波長帯域それぞれの検出時間の比（１００：５：２４）で、各基準試料で発生する蛍光が検出部３０により検出されて、基準データが取得された。また、このとき、蛍光画像中に複数の輝度測定領域が設定され、ダークノイズ補正後のＲ，Ｇ，Ｂの輝度の平均値が求められて、下記の基準データが得られた。
【００６３】
【数５】
【００６４】
そして、続く解析ステップＳ１５においては、第２測定データ取得ステップＳ１３において取得された第２測定データとしての画像データ、基準データ取得ステップＳ１４において取得された基準データとに基づいて、アンミキシング演算が行われた。図５は、第２測定データ取得ステップＳ１３において第２測定データとして得られた蛍光画像および分離画像を示す図である。同図（ａ）は、第２測定データとして得られた３つの検出波長帯域の画像が重ねられたものである。同図（ｂ）〜（ｄ）は、解析ステップＳ１５において同図（ａ）の画像に基づいてアンミキシング演算が行われて分離された各蛍光色素の分離画像である。同図（ｂ）はＣＦＰの分離画像であり、同図（ｃ）はＧＦＰの分離画像であり、また、同図（ｄ）はＹＦＰの分離画像である。
【００６５】
また、比較例として、３つの検出波長帯域それぞれの検出時間の比を１００：１００：１００ として画像データおよび基準データが取得されて、これら画像データおよび基準データに基づいてアンミキシング演算が行われた。比較例における基準データは下記のとおりである。この比較例で得られた分離画像は、図４（ｂ）〜（ｄ）に示されている。
【００６６】
【数６】
【００６７】
実施例（検出時間比１００：５：２４）および比較例（検出時間比１００：１００：１００）それぞれにおいて、アンミキシング演算では、各画素に存在するそれぞれの蛍光色素の量が、基準データの輝度を単位濃度とした濃度といわれる値で求められ、この値をもとに分離画像が作成された。ＣＦＰを含む細胞，ＧＦＰを含む細胞およびＹＦＰを含む細胞が存在する領域上で、それぞれ２５画素が適当に選択され、各分離画像でその画素の濃度値が求められた。その後、下記（７）式により、その画素での各蛍光色素の濃度の比率が求められた。ここで、[ＣＦＰ] はＣＦＰの濃度値であり、[ＧＦＰ] はＧＦＰの濃度値であり、[ＹＦＰ] はＹＦＰの濃度値である。また、[ＸＦＰ] は、ＣＦＰ，ＧＦＰまたはＹＦＰの濃度値であり、ＣＸＦＰは、ＣＦＰ，ＧＦＰまたはＹＦＰの濃度の比率（％）である。
【００６８】
【数７】
【００６９】
例えば、ＣＦＰを含む細胞のみが存在する画素では、理想的には、ＣＦＰの分離画像のみにいくらかの濃度値が存在し、他の蛍光色素の分離画像の濃度は０になるので、ＣＦＰの分離画像での濃度の比率は１００になる。そこで、この数値をもとにアンミキシング演算による分離の精度を評価した。図６は、比較例における各蛍光色素の分離画像での濃度比率の平均および標準偏差を示すグラフである。図７は、実施例における各蛍光色素の分離画像での濃度比率の平均および標準偏差を示すグラフである。
【００７０】
比較例では、ＣＦＰの分離画像でのＣＦＰの濃度の比率については、平均が１００.１であり、標準偏差が６.４であった。ＧＦＰの分離画像でのＧＦＰの濃度の比率については、平均が１０３.１であり、標準偏差が１２.５であった。また、ＹＦＰの分離画像でのＹＦＰの濃度の比率については、平均が１０５.５であり、標準偏差が４６.５であった。
【００７１】
実施例では、ＣＦＰの分離画像でのＣＦＰの濃度の比率については、平均が９８.２であり、標準偏差２.３であった。ＧＦＰの分離画像でのＧＦＰの濃度の比率については、平均が１０１.８であり、標準偏差が５.０であった。また、ＹＦＰの分離画像でのＹＦＰの濃度の比率については、平均が９９.５であり、標準偏差が５.６であった。
【００７２】
実施例および比較例の何れの場合でも、各蛍光色素の分離画像での濃度比率の平均は略１００であった。しかし、画素間の濃度ばらつきの程度を示す標準偏差は、比較例と比べて実施例の方が有意に小さくなっていた。この結果は、比較例と比べて実施例の場合に、アンミキシング演算により得られた分離画像において画素間の輝度ばらつきが小さく、画質が改善された画像になっていることを示す。この効果は、比較例の場合のアンミキシング演算後の分離画像（図４（ｂ）〜（ｄ））と、実施例の場合のアンミキシング演算後の分離画像（図５（ｂ）〜（ｄ））とを対比して、比較例と比べて実施例の場合に細胞内の核の構造が鮮明に観察できることからも明らかである。
【００７３】
実施例と比較例との対比について更に説明すると以下のとおりである。上記のＣＦＰ，ＧＦＰおよびＹＦＰの組み合わせの如く、３種類の蛍光色素それそれの蛍光波長が互いに近く蛍光スペクトルが互いに似ているような場合、比較例のアンミキシング演算により得られる分離画像（図４（ｂ）〜（ｄ））は、元の蛍光画像（図４（ａ））と比較すると、ざらついたようになり、画質が悪い。その理由として以下のようなことが考えられる。
【００７４】
画像として得られる蛍光色素の輝度は、ある程度のゆらぎをもって存在している。仮に蛍光色素が均一に存在している測定対象物の蛍光画像を取得したとしても、通常、各画素での輝度にはばらつきがみられる。それ故、元の蛍光画像の各検出波長帯域の画像では、たまたま選ばれた測定対象物で測定された基準値とぴったりと一致した輝度分布を示す画素は少ない。アンミキシング演算は、元画像に対して画素ごとに行われる。元画像の各画素でみられる基準値との輝度のずれは、演算結果となる分離画像の各画素の輝度にもずれを与え、その各画素の輝度を実際の蛍光像よりも高い方向あるいは低い方向にシフトさせる。この結果、分離画像の輝度の分布にばらつきが生じ画質を劣化させている。この影響は、使われる蛍光色素間の蛍光スペクトルの形が近いほど（すなわち、基準値が近いほど）、大きくなると考えられる。
【００７５】
画像のＳＮ比を上げることにより、元画像の画素間の輝度のゆらぎは小さくなる。画像のＳＮ比を上げるための方法の１つは、検出部として使われるカメラの露光時間を長くして画像を取得することである。しかし、使われる蛍光色素間のスペクトルが近いときには、それぞれの画像を取得する検出波長帯域にこれらの蛍光が互いに重なって入ることになる。この場合、これらの検出波長帯域の蛍光の強度が集中的に大きくなり、短い露光時間でカメラが取得できる光量を超えてしまう状況になる。飽和した輝度を持つ画素では正しい演算が行えないので、全検出波長帯域で、等しい露光時間で画像が取得される従来技術の場合、露光時間を長くすることで画像のＳＮ比を上げることが難しい。また、画像演算の１つであるマスク演算で、近接する画素の輝度を使った計算により画像のＳＮ比を上げることもできるが、この手法では空間的な解像度を落としてしまうという問題がある。
【００７６】
これに対して、本実施形態では、第１測定データ取得ステップＳ１１において、３つの検出波長帯域それぞれにおいて蛍光が検出部３０により略同一の検出時間に亘って検出されて当該検出結果を示す第１測定データが取得され、検出時間設定ステップＳ１２において、取得された３つの検出波長帯域それぞれについての第１測定データが互いに比較されて、入力光強度が最も低い検出波長帯域（特定検出波長帯域）における検出時間が他の検出波長帯域における検出時間より長く設定され、そして、第２測定データ取得ステップＳ１３において蛍光が検出部３０により検出されることにより、実施例の如く処理を行って得られる分離画像（図５（ｂ）〜（ｄ））は、元の蛍光画像（図５（ａ））と比較して、画質の劣化が抑制されている。
【００７７】
以上に説明した本実施形態の説明では、検出部３０は、検出すべき検出波長帯域の数と同じ個数の検出素子を含み、各検出波長帯域の光を何れかの検出素子により検出するものとした。しかし、検出部３０は、他の構成のものであってもよい。
【００７８】
例えば、検出部３０は、単板のＲＧＢカラーカメラ等のように、複数の検出波長帯域の光を１つの検出素子で検出できるものであって、検出波長帯域毎に検出時間（およびゲイン）を個別に調整できるものであってもよい。
【００７９】
また、例えば、検出部３０は、モノクロカメラと、このモノクロカメラに入射する光の波長帯域を切り替えることができるフィルタ切替え装置等と、を組み合わせた構成のものであってもよい。ただし、この場合、各検出波長帯域の画像を取得する際に時間差が生じる。
【００８０】
また、例えば、検出部３０は、測定対象物９から発生する蛍光を複数の検出波長帯域に分光する分光器と、この分光器により分光された各検出波長帯域の光を検出する複数のモノクロカメラと、を備える構成のものであってもよい。この場合には、各検出波長帯域の画像が同時に取得され得る。
【００８１】
また、アンミキシング演算に際して、上記の実施形態では１つの励起波長により複数の検出波長帯域の蛍光画像を取得したが、励起波長を切り替えて１つの検出波長帯域で蛍光画像を取得してもよいし、励起波長および検出波長帯域の両方を切り替えて蛍光画像を取得してもよく、このような測定系でもこの手法を同様に使用することができる。
【００８２】
また、上記の実施例では、測定対象物９に含有される蛍光色素の種類数が３であって、検出波長帯域の数が３であったが、これに限られない。蛍光色素の種類数は２であってもよいし４以上であってもよい。上記いずれの構成においても、検出部３０として、蛍光色素の種類数と等しいか又はそれ以上の検出波長帯域を持つものを使用することで、アンミキシングの演算を行うことができる。
【００８３】
以上、詳細に説明したように、本実施形態に係る蛍光検出装置および蛍光検出方法を用いれば、複数種類の蛍光色素が含有された測定対象物で発生する蛍光を検出する際に、個々の蛍光色素に由来する蛍光を分離してＳＮ比よく検出することができる。また、本実施形態に係る蛍光検出装置および蛍光検出方法の効果について更に説明すると以下のとおりである。
【００８４】
アンミキシング演算により分離画像を得るには、測定する各検出波長帯域の帯域幅を狭くするほど、また、検出波長帯域の数を増やすほど、基準データがより細かく取得され得るので、スペクトルの波長が互いに近い蛍光色素どうしでも、その分離が容易になる。しかし、各検出波長帯域の帯域幅が狭くなると、各検出波長帯域で得られる蛍光量が減少することにより、画質のＳＮ比が落ちる要因になる。
【００８５】
これに対して、本実施形態に係る蛍光検出装置および蛍光検出方法を用いれば、少ない検出波長帯域での測定でも、質のよい分離画像を取得することができる。アンミキシング演算を行うには、設定される検出波長帯域の数は、使われた蛍光色素の種類数と等しいか、これより多いことが必要である。本実施形態によれば、取得する画像の検出波長帯域の数を必要最小限にまで減らすことができ、蛍光画像の取得に要する時間が短縮され、装置や演算の簡素化を図ることができるなど、測定の効率が向上する。
【００８６】
カラーカメラを検出部３０として用いた場合は、その検出波長帯域がＲ，Ｇ，Ｂであって該カメラ内の光学系で固定されている。それ故、使用する蛍光色素の蛍光スペクトルに応じて検出波長帯域を最適に設定することができず、クロストークが多い状態で測らなくてはいけない場合も多い。しかし、本実施形態によれば、カラーカメラを検出部３０として用い、蛍光スペクトルの波長が互いに近い蛍光色素を使用したとしても、質のよい分離画像を得ることができる。
【００８７】
このことは検出光学系を構築する上でも有用である。すなわち、一般的なカラーカメラでは検出波長帯域の数は３までではあるが、異なる検出波長帯域の画像が同時に取得され得る。また、画像間の位置ずれもない。したがって、本実施形態によれば、より性能に優れ簡便化された装置が構築され得る。
【００８８】
一方、他の装置構成として、バンドパスフィルタでそれぞれの蛍光を分光し、波長を切り替えながらモノクロカメラで蛍光画像を取得するものが考えられる。このような装置構成では、測定する検出波長帯域は蛍光色素の蛍光スペクトルに合わせて設定され得るが、検出波長帯域の異なる画像が同時には得られないため、各検出波長帯域の画像の間で時間差が生じてしまう。このような装置構成では、生きている細胞試料のように、その中の分子の分布や活性が常に変化しているようなものを測定対象物とした場合には、これらの正確な測定が困難になる。蛍光を分光する装置と複数のモノクロカメラとを組み合わせることで、複数の検出波長帯域の画像を同時に得ることができる装置構成とすることができるが、各画像間の位置合わせなど測定する上での困難を伴う。
【００８９】
また、検出部３０としてモノクロカメラが使用されたときでも、検出光学系を構築する上で、本実施形態は有用である。従来では、使われる蛍光色素の蛍光スペクトルに合わせて、クロストークが少ない検出波長帯域を吟味し、バンドパスフィルタなどの部品を選択し調達する必要があるが、本実施形態によれば、厳密な波長の設定を行わなくとも画質のよい分離画像を作製することができるようになる。
【００９０】
本実施形態に係る蛍光検出装置および蛍光検出方法は、分離画像のＳＮ比が高められることは、生物試料を測定対象物としたアプリケーションの面からみると、蛍光色素の退色や生物試料の生理的活性への影響を考慮すると、強い励起光を照射できず蛍光の強度を稼げないようなときに有用となる。また、本実施形態では、蛍光色素で標識された分子の局在の解析も従来法に比べて容易になる。蛍光強度の変化から細胞の生理的活動を測定するような場合には、微小な変化を容易に検出できるようになる。例えば、蛍光試薬の輝度変化から細胞内の活動状態を測定するＣａ２＋などの細胞内イオンの測定や、蛍光エネルギ移動による蛋白質分子間の相互作用の測定などに有用である。また、細胞には自家蛍光とよばれる内在性の蛍光分子が存在し、この自家蛍光のクロストークが、標識に使用された蛍光色素の測定精度を低下させる要因になることがある。本実施形態では、自家蛍光を効率的に分離することができるので、その影響を抑えることができる。
【００９１】
本実施形態に係る蛍光検出装置および蛍光検出方法は、検出波長帯域によって検出時間を調整して画像のＳＮ比を向上させることができることから、以下に説明するように、生物試料を測定対象物とした蛍光測定において特に有効である。
【００９２】
蛍光試料のイメージングにおいて蛍光画像のＳＮ比を向上させるには、測定対象物から発せられる蛍光の強度を高めることによっても可能である。そして、測定対象物から発せられる蛍光の強度を高めることは、測定対象物に照射される励起光を強くすることで可能であり、または、測定対象物における蛍光色素の濃度を増やすことでも可能である。
【００９３】
一方、測定対象物が特に細胞などの生物試料である場合、細胞の運動性や形態または細胞内の分子の局在や活性は時間とともに変化しており、これらを測定するためには長時間に亘り連続的または断続的に蛍光画像をモニタする場合が多い。
【００９４】
このような測定上の要求がある中で、測定対象物に照射する励起光を強くすることは、蛍光色素の不可逆的な変性による退色を促し、長期のイメージングを困難にする。また、強い励起光と色素との反応により、活性酸素などの細胞に対して毒性をもつ分子が発生することがある。このような分子は細胞内の分子と反応することでその機能を阻害するので、細胞が正常な状態を長期に維持することを困難にする。
【００９５】
また、測定対象物である細胞内の蛍光色素の量を増やすことは、細胞の生理的状態を撹乱させるおそれがある。例えば、蛍光抗体など、分子の標識に使われる色素は、その分子に選択的に結合するが、多量の色素の導入はその標的分子の活性を抑制させることになる。また、最近では、ＧＦＰなどの蛍光蛋白質を対象の蛋白質に結合させた形で細胞内に発現させる実験がよく行われているが、このように人為的に特定の蛋白質を高濃度に発現させることは、この蛋白質の活性を異常なまでに促進させてしまうおそれがある。このような状況では、正常な生理的状態での細胞の反応を測定することが困難になる。
【００９６】
以上のような問題を回避するためには、できるだけ測定対象物内の蛍光色素量を減らし、励起光の照射強度を弱めて、イメージングを行うことが重要である。上記の状況下であっても、本実施形態に係る蛍光検出装置および蛍光検出方法は、検出波長帯域によって検出時間を調整して画像のＳＮ比を向上させることができることから、測定対象物内の蛍光色素量の増加や励起光照射の高強度化を抑制しつつ、ＳＮ比の高い分離画像を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】本実施形態に係る蛍光検出装置１の構成図である。
【図２】本実施形態に係る蛍光検出方法のフローチャートである。
【図３】各蛍光色素の蛍光スペクトルおよびカメラの各ＣＣＤの検出波長帯域を示す図である。
【図４】第１測定データ取得ステップＳ１１において第１測定データとして得られた蛍光画像および分離画像を示す図である。
【図５】第２測定データ取得ステップＳ１３において第２測定データとして得られた蛍光画像および分離画像を示す図である。
【図６】比較例における各蛍光色素の分離画像での濃度比率の平均および標準偏差を示すグラフである。
【図７】実施例における各蛍光色素の分離画像での濃度比率の平均および標準偏差を示すグラフである。
【符号の説明】
【００９８】
１…蛍光検出装置、９…測定対象物、１０…顕微鏡、１１…ステージ、１２…対物レンズ、２０…励起光源、２１…シャッタ、２２…フィルタ、３０…検出部、４０…処理部、４１…第１測定データ取得手段、４２…検出時間設定手段、４３…第２測定データ取得手段、４４…解析手段、４５…記憶手段、５０…表示部。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光検出装置および蛍光検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
蛍光色素が含有された測定対象物で発生する蛍光を検出する蛍光検出技術は、最近では生化学分野において重要な技術の１つとなっており、特許文献１や非特許文献１に記載されたものが知られている。例えば、細胞の生理的活動を研究する際に、細胞に含まれる蛋白質などの機能性分子の活性を測定するために、その機能性分子を蛍光色素で標識することで機能性分子を可視化し、この機能性分子で発生する蛍光を顕微鏡像としてイメージングすることが行われている。
【０００３】
また、１つの細胞からより多くの種類の機能性分子の動態を知るために、機能性分子を種類毎に蛍光波長の異なる蛍光色素で標識することにより、マルチカラーの顕微鏡像を得ることも行われる。この場合、それぞれの蛍光は、その波長の観察に適した透過帯をもつバンドパスフィルタで分光することで測定される。
【０００４】
しかし、一般的に、各種の蛍光色素から発生する蛍光のスペクトルは、広い波長域に広がっているので、スペクトル間に重なり（クロストーク）が生じて、バンドパスフィルタだけでは完全に分離できないことが多い。このような状況では、それぞれの機能性分子の分布や量を正確に知ることが困難になる。そこで、特許文献１や非特許文献１に記載された蛍光検出技術は、このような問題を解決することを意図したものであって、演算によってクロストークの影響を除去して、蛍光色素の種類毎に蛍光色素の分布を示す分離画像を得ようとするものである。
【特許文献１】国際公開第２００５／０３６１４３号パンフレット
【非特許文献１】Timo Zimmermann, et al., "Spectral imaging and its applicationin live cell microscopy", FEBS Letters 546 (2003) 87-92.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところが、従来の蛍光検出技術では、複数種類の蛍光色素が含有された測定対象物で発生する蛍光を検出しようとすると、特に蛍光の波長が近くスペクトル形状が似ている蛍光色素の組み合わせのときに、分離画像の画質が元の画像と比べると悪くなることがあった。このような問題は、１次元または２次元の蛍光画像を得る場合だけでなく、単に蛍光強度を得る場合にも存在する。
【０００６】
本発明は、上記問題点を解消する為になされたものであり、複数種類の蛍光色素が含有された測定対象物で発生する蛍光を検出する際に、個々の蛍光色素に由来する蛍光を分離してＳＮ比よく検出することができる蛍光検出装置および蛍光検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に係る蛍光検出装置は、複数種類の蛍光色素が含有された測定対象物で発生する蛍光を検出する蛍光検出装置であって、(a) 複数の検出波長帯域それぞれにおいて入力光強度を検出して当該検出結果を示すデータを出力するともに、複数の検出波長帯域それぞれにおける当該検出時間が可変である検出部と、(b) 検出部における光検出動作を制御するとともに、検出部から出力されるデータを取得して該データを処理する処理部と、を備えることを特徴とする。
【０００８】
更に、本発明に係る蛍光検出装置に含まれる処理部は、(1) 複数の検出波長帯域それぞれにおいて、測定対象物で発生する蛍光を検出部により略同一の検出時間に亘って検出させ、当該検出結果を示す第１測定データを取得する第１測定データ取得手段と、(2) 第１測定データ取得手段により取得された複数の検出波長帯域それぞれについての第１測定データを互いに比較して、その比較結果に基づいて、複数の検出波長帯域のうち入力光強度が最も低い検出波長帯域（以下「特定検出波長帯域」という。）を選択して、複数の検出波長帯域のうち特定検出波長帯域における検出時間を他の検出波長帯域における検出時間より長く設定する検出時間設定手段と、(3) 検出時間設定手段により設定された複数の検出波長帯域それぞれの検出時間に亘って、測定対象物で発生する蛍光を検出部により検出させ、当該検出結果を示す第２測定データを取得する第２測定データ取得手段と、(4) 第２測定データ取得手段により取得された複数の検出波長帯域それぞれについての第２測定データに基づいて、測定対象物に含有される複数種類の蛍光色素それぞれの含有濃度を解析する解析手段と、を含むことを特徴とする。
【０００９】
本発明に係る蛍光検出装置は、検出部および処理部を備え、また、処理部が第１測定データ取得手段，検出時間設定手段，第２測定データ取得手段および解析手段を含んでいて、以下のように作用する。まず、第１測定データ取得手段により、複数の検出波長帯域それぞれにおいて、測定対象物で発生する蛍光が検出部により略同一の検出時間に亘って検出され、当該検出結果を示す第１測定データが取得される。続く検出時間設定手段により、第１測定データ取得手段により取得された複数の検出波長帯域それぞれについての第１測定データが互いに比較されて、その比較結果に基づいて、複数の検出波長帯域のうち入力光強度が最も低い検出波長帯域（特定検出波長帯域）が選択されて、複数の検出波長帯域のうち特定検出波長帯域における検出時間が他の検出波長帯域における検出時間より長く設定される。そして、第２測定データ取得手段により、検出時間設定手段により設定された複数の検出波長帯域それぞれの検出時間に亘って、測定対象物で発生する蛍光が検出部により検出されて、当該検出結果を示す第２測定データが取得される。さらに、解析手段により、第２測定データ取得手段により取得された複数の検出波長帯域それぞれについての第２測定データに基づいて、測定対象物に含有される複数種類の蛍光色素それぞれの含有濃度が解析される。
【００１０】
このように、本発明では、特定検出波長帯域における検出時間が他の検出波長帯域における検出時間より長く設定され、第２測定データ取得手段により、測定対象物で発生する蛍光が検出部により検出されて、当該検出結果を示す第２測定データが取得され、そして、解析手段により、この取得された複数の検出波長帯域それぞれについての第２測定データに基づいて、測定対象物に含有される複数種類の蛍光色素それぞれの含有濃度が解析される。これにより、複数種類の蛍光色素が含有された測定対象物で発生する蛍光を検出する際に、個々の蛍光色素に由来する蛍光を分離してＳＮ比よく検出することができる。
【００１１】
また、本発明に係る蛍光検出方法は、複数種類の蛍光色素が含有された測定対象物で発生する蛍光を検出する蛍光検出方法であって、(1) 複数の検出波長帯域それぞれにおいて入力光強度を検出して当該検出結果を示すデータを出力するともに複数の検出波長帯域それぞれにおける当該検出時間が可変である検出部を用いて、複数の検出波長帯域それぞれにおいて、測定対象物で発生する蛍光を略同一の検出時間に亘って検出し、当該検出結果を示す第１測定データを取得する第１測定データ取得ステップと、(2) 第１測定データ取得ステップにおいて取得された複数の検出波長帯域それぞれについての第１測定データを互いに比較して、その比較結果に基づいて、複数の検出波長帯域のうち入力光強度が最も低い検出波長帯域（特定検出波長帯域）を選択して、複数の検出波長帯域のうち特定検出波長帯域における検出時間を他の検出波長帯域における検出時間より長く設定する検出時間設定ステップと、(3) 検出時間設定ステップにおいて設定された複数の検出波長帯域それぞれの検出時間に亘って、測定対象物で発生する蛍光を検出部により検出し、当該検出結果を示す第２測定データを取得する第２測定データ取得ステップと、(4) 第２測定データ取得ステップにおいて取得された複数の検出波長帯域それぞれについての第２測定データに基づいて、測定対象物に含有される複数種類の蛍光色素それぞれの含有濃度を解析する解析ステップと、を備えることを特徴とする。この本発明に係る蛍光検出方法は、上記の本発明に係る蛍光検出装置と同じ技術的思想に基づくものである。
【００１２】
本発明に係る蛍光検出装置では、検出時間設定手段が、第１測定データ取得手段により取得された複数の検出波長帯域それぞれについての第１測定データの比に対して逆比例関係となるように、複数の検出波長帯域それぞれにおける検出時間の比を設定するのが好適である。また、本発明に係る蛍光検出方法では、検出時間設定ステップにおいて、第１測定データ取得ステップにおいて取得された複数の検出波長帯域それぞれについての第１測定データの比に対して逆比例関係となるように、複数の検出波長帯域それぞれにおける検出時間の比を設定するのが好適である。
【００１３】
本発明に係る蛍光検出装置では、解析手段が、複数種類の蛍光色素のうちの個々の種類の蛍光色素を単独で含む基準試料それぞれで発生した蛍光を複数の検出波長帯域それぞれにおいて検出部により検出して得られた基準データと、第２測定データ取得手段により取得された複数の検出波長帯域それぞれについての第２測定データとに基づいて、測定対象物に含有される複数種類の蛍光色素それぞれの含有濃度を解析するのが好適である。また、本発明に係る蛍光検出方法では、解析ステップにおいて、複数種類の蛍光色素のうちの個々の種類の蛍光色素を単独で含む基準試料それぞれで発生した蛍光を複数の検出波長帯域それぞれにおいて検出部により検出して得られた基準データと、第２測定データ取得ステップにおいて取得された複数の検出波長帯域それぞれについての第２測定データとに基づいて、測定対象物に含有される複数種類の蛍光色素それぞれの含有濃度を解析するのが好適である。
【００１４】
本発明に係る蛍光検出装置では、検出部は、複数の検出波長帯域それぞれにおいて入力光強度に対する出力データのゲインが可変であり、処理部は、第２測定データ取得手段により測定対象物で発生する蛍光を検出部により検出させる際に、検出時間設定手段による比較結果に基づいて複数の検出波長帯域のうち何れかの検出波長帯域において検出部のゲインを調整するのが好適である。また、本発明に係る蛍光検出方法では、検出部は、複数の検出波長帯域それぞれにおいて入力光強度に対する出力データのゲインが可変であり、第２測定データ取得ステップにおいて、検出時間設定ステップにおける比較結果に基づいて複数の検出波長帯域のうち何れかの検出波長帯域において検出部のゲインを調整して、測定対象物で発生する蛍光を検出部により検出するのが好適である。特に、複数の検出波長帯域のうち入力光強度が高いものほどゲインを小さくするのが好ましい。
【００１５】
また、本発明に係る蛍光検出装置または蛍光検出方法では、検出部は、複数の検出波長帯域のうちの個々の検出波長帯域に対応する検出素子を含むのが好適である。
【００１６】
本発明に係る蛍光検出プログラムは、複数種類の蛍光色素が含有された測定対象物で発生する蛍光を検出する処理をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、(1) 複数の検出波長帯域それぞれにおいて入力光強度を検出して当該検出結果を示すデータを出力するともに複数の検出波長帯域それぞれにおける当該検出時間が可変である検出部を用いて、複数の検出波長帯域それぞれにおいて、測定対象物で発生する蛍光を略同一の検出時間に亘って検出し、当該検出結果を示す第１測定データを取得する第１測定データ取得ステップと、(2) 第１測定データ取得ステップにおいて取得された複数の検出波長帯域それぞれについての第１測定データを互いに比較して、その比較結果に基づいて、複数の検出波長帯域のうち入力光強度が最も低い検出波長帯域（特定検出波長帯域）を選択して、複数の検出波長帯域のうち特定検出波長帯域における検出時間を他の検出波長帯域における検出時間より長く設定する検出時間設定ステップと、(3) 検出時間設定ステップにおいて設定された複数の検出波長帯域それぞれの検出時間に亘って、測定対象物で発生する蛍光を検出部により検出し、当該検出結果を示す第２測定データを取得する第２測定データ取得ステップと、(4) 第２測定データ取得ステップにおいて取得された複数の検出波長帯域それぞれについての第２測定データに基づいて、測定対象物に含有される複数種類の蛍光色素それぞれの含有濃度を解析する解析ステップと、をコンピュータに実行させるためのプログラムである。すなわち、本発明に係る蛍光検出プログラムは、上記の本発明に係る蛍光検出方法に含まれる各処理をコンピュータに実行させるためのプログラムである。また、本発明に係る記録媒体は、上記の本発明に係る蛍光検出プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体である。この記録媒体は、磁気テープ、フレキシブルディスク、ＣＤ-ＲＯＭ、ＤＶＤ-ＲＯＭ等、任意のものが利用可能である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、複数種類の蛍光色素が含有された測定対象物で発生する蛍光を検出する際に、個々の蛍光色素に由来する蛍光を分離してＳＮ比よく検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための最良の形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。
【００１９】
図１は、本実施形態に係る蛍光検出装置１の構成図である。この図に示される蛍光検出装置１は、測定対象物９で発生する蛍光を検出する装置であって、顕微鏡１０、励起光源２０、検出部３０、処理部４０、表示部５０、出力部６０および入力部７０を備える。
【００２０】
測定対象物９は、複数種類の蛍光色素が含有された例えば細胞であり、顕微鏡１０のステージ１１に載置される。ステージ１１に載置された測定対象物９は、対物レンズ１２を介して観察される。また、測定対象物９は、励起光源２０から出力された励起光が対物レンズ１２を介して照射され、また、発生した蛍光が対物レンズ１２を介して検出部３０により検出される。なお、顕微鏡１０はダイクロイックミラーを有している。このダイクロイックミラーは、励起光源２０から到達した励起光を反射し、対物レンズ１２を通して測定対象物９へ照射するとともに、対物レンズ１２を通して到達した測定対象物９からの蛍光を透過させて検出部３０へ導く。
【００２１】
励起光源２０は、測定対象物９に照射されるべき励起光を出力する。シャッタ２１は、励起光源２０の光出射位置の直後に配置され、測定対象物９への励起光の照射よび停止を選択的に行う。フィルタ２２は、シャッタ２１の後段に配置され、励起光源２０から出力されシャッタ２１を経た光のうち特定波長域の光を選択的に透過させて、その透過させた光を励起光として測定対象物９へ照射させる。測定対象物９に含有される蛍光色素の種類に応じて、励起光源２０やフィルタ２２が選択されて、測定対象部９に照射される励起光の波長が適切に設定される。
【００２２】
検出部３０は、複数の検出波長帯域それぞれにおいて入力光強度を検出して当該検出結果を示すデータを出力する。また、この検出部３０は、複数の検出波長帯域それぞれにおける当該検出時間が可変である。検出部３０は、複数の検出波長帯域それぞれにおいて、設定された検出時間に亘って、測定対象物９で発生し対物レンズ１２を経て入力した蛍光を検出する。また、検出部３０は、複数の検出波長帯域それぞれにおいて入力光強度に対する出力データのゲインが可変である。
【００２３】
この検出部３０は、２次元の蛍光画像を得ることができるイメージセンサであってもよいし、１次元の蛍光画像を得ることができるラインセンサであってもよいし、また、単に蛍光強度を得ることができるセンサであってもよい。以下では、検出部３０が２次元イメージセンサである場合について説明するが、検出部３０が他のものである場合についても同様である。
【００２４】
このような検出部３０の構成としては種々の態様が可能である。好適には、検出部３０は、複数の検出波長帯域のうちの個々の検出波長帯域に対応する検出素子（例えばＣＣＤ）を含む。すなわち、検出部３０は、検出すべき検出波長帯域の数と同じ個数の検出素子を含み、各検出波長帯域の光を何れかの検出素子により検出する。
【００２５】
処理部４０は、例えばコンピュータを含んで構成され、検出部３０から出力される画像データを取得して該画像データを処理するものである。また、処理部４０は、検出部３０における光検出動作を制御するものであり、例えば、複数の検出波長帯域それぞれにおける検出時間やゲインを設定する。処理部４０は、第１測定データ取得手段４１、検出時間設定手段４２、第２測定データ取得手段４３、解析手段４４および記憶手段４５を含む。これらについては後に詳述する。
【００２６】
表示部５０は、処理部４０により取得された画像や処理後の画像等を表示する。出力部６０は、画像や処理結果の数値等を紙に印刷する。また、入力部７０は、操作者が蛍光検出装置１に対して指示を与えるためのものであり、キーボードやマウス等を含む。処理部４０は、入力部７０により受け付けた操作者の指示に基づいて、データ取得およびデータ解析等の処理を行って、画像や処理結果等を表示部５０により表示させ、或いは、画像や処理結果等を出力部６０により紙に印刷させる。
【００２７】
次に、本実施形態に係る蛍光検出装置１に含まれる処理部４０について詳細に説明する。処理部４０に含まれる第１測定データ取得手段４１、検出時間設定手段４２、第２測定データ取得手段４３および解析手段４４は、主たる構成要素としてＣＰＵを含み、記憶手段４５に格納された蛍光検出プログラムに従って処理を行い、また、処理に用いられる各種データについて記憶手段４５に対して読出または書込を行う。
【００２８】
第１測定データ取得手段４１は、複数の検出波長帯域それぞれにおいて、測定対象物９で発生する蛍光を検出部３０により略同一の検出時間に亘って検出させ、当該検出結果を示す第１測定データを取得する。検出時間設定手段４２は、第１測定データ取得手段４１により取得された複数の検出波長帯域それぞれについての第１測定データを互いに比較して、その比較結果に基づいて、複数の検出波長帯域のうち入力光強度が最も低い検出波長帯域（特定検出波長帯域）を選択して、複数の検出波長帯域のうち特定検出波長帯域における検出時間を他の検出波長帯域における検出時間より長く設定する。
【００２９】
第２測定データ取得手段４３は、検出時間設定手段により設定された複数の検出波長帯域それぞれの検出時間に亘って、測定対象物９で発生する蛍光を検出部３０により検出させ、当該検出結果を示す第２測定データを取得する。解析手段４４は、第２測定データ取得手段４３により取得された複数の検出波長帯域それぞれについての第２測定データに基づいて、測定対象物９に含有される複数種類の蛍光色素それぞれの含有濃度を解析する。
【００３０】
より好ましくは、検出時間設定手段４２は、第１測定データ取得手段４１により取得された複数の検出波長帯域それぞれについての第１測定データの比に対して逆比例関係となるように、複数の検出波長帯域それぞれにおける検出時間の比を設定する。
【００３１】
また、より好ましくは、第２測定データ取得手段４３により測定対象物で発生する蛍光を検出部３０により検出させる際に、検出時間設定手段４２による比較結果に基づいて複数の検出波長帯域のうち何れかの検出波長帯域において検出部３０のゲインを調整する。このとき、第１測定データ取得手段４１により取得された複数の検出波長帯域それぞれについての第１測定データを互いに比較して、その比較結果に基づいて、複数の検出波長帯域のうち入力光強度が高いものほどゲインを小さくするのが好ましい。なお、このゲインを小さくするには、検出部３０から出力される電気信号を電気的に増幅する増幅器の利得を小さくする他、検出部３０に含まれる検出素子の前面にＮＤフィルタを配置することでも可能である。
【００３２】
記憶手段４５は、処理部４０が動作するために必要な蛍光検出プログラムを格納し、第１測定データ取得手段４１や第２測定データ取得手段４３により取得された測定データを記憶し、また、検出時間設定手段４２や解析手段４４による処理の途中で用いられるデータや処理結果のデータを記憶する。記憶手段４５は例えばハードディスクドライブ等を含む。
【００３３】
次に、本実施形態に係る蛍光検出装置１に含まれる処理部４０について更に詳細に説明するとともに、本実施形態に係る蛍光検出方法についても説明する。以下に説明する処理部４０における処理動作または蛍光検出方法は、図１中に示される記録媒体８０に記録されたコンピュータ読み取り可能な蛍光検出プログラムにより実行される。この蛍光検出プログラムは、記録媒体８０により供給されるだけでなく、インターネット通信により供給されることも可能である。また、この蛍光検出プログラムは処理部４０の記憶手段４５により格納され、この記憶手段４５により格納された蛍光検出プログラムが動作時に読み出されて実行される。
【００３４】
図２は、本実施形態に係る蛍光検出方法のフローチャートである。本実施形態に係る蛍光検出方法は、第１測定データ取得ステップＳ１１、検出時間設定ステップＳ１２、第２測定データ取得ステップＳ１３、基準データ取得ステップＳ１４および解析ステップＳ１５を備える。以下では、測定対象物９に含有される蛍光色素が３種類であって、その測定対象物９で発生した蛍光の画像を３つの検出波長帯域（赤（Ｒ），緑（Ｇ），青（Ｂ））において検出部３０により取得して処理部４０により処理するものとする。
【００３５】
第１測定データ取得ステップＳ１１では、第１測定データ取得手段４１により、３つの検出波長帯域それぞれにおいて、測定対象物９で発生する蛍光が検出部３０により略同一の検出時間に亘って検出され、当該検出結果を示す第１測定データが取得される。このとき、３種類の蛍光色素の特性に合わせ、顕微鏡１０に導入される励起光の波長、顕微鏡１０に含まれるダイクロイックミラーの反射および透過の特性、ならびに、取得すべき蛍光の波長が設定される。また、検出時間は、３つの検出波長帯域それぞれで輝度が検出部３０の限度を越えない範囲で設定され、操作者による蛍光像の観察により任意に設定され得る。
【００３６】
検出時間設定ステップＳ１２では、検出時間設定手段４２により、第１測定データ取得ステップＳ１１において取得された３つの検出波長帯域それぞれについての第１測定データが互いに比較されて、その比較結果に基づいて、３つの検出波長帯域のうち入力光強度が最も低い検出波長帯域（特定検出波長帯域）が選択され、３つの検出波長帯域のうち特定検出波長帯域における検出時間が他の検出波長帯域における検出時間より長く設定される。より好ましくは、第１測定データ取得ステップＳ１１において取得された３つの検出波長帯域それぞれについての第１測定データの比に対して逆比例関係となるように、３つの検出波長帯域それぞれにおける検出時間の比が設定される。
【００３７】
第１測定データが２次元の画像データである場合、検出時間設定ステップＳ１２における具体的な処理の一例は以下のとおりである。すなわち、第１測定データである２次元画像において、蛍光の発生が認められる領域に任意の数の輝度測定領域が設定され、各輝度測定領域で３つの検出波長帯域それぞれの輝度平均値が求められる。輝度測定領域の設定は、操作者が画像を見ながら行うことができるようにしてもよいし、また、任意に選ばれた１つの検出波長帯域の画像において輝度測定領域とする範囲が輝度の最小値および最大値の設定に基づいて指定されてもよい。
【００３８】
この輝度平均値が求められる際に、ダークノイズによる輝度分が減算により補正されて輝度平均値が求められる。減算されるべきダークノイズ分の輝度は、励起光が照射されない状態で取得された画像など、ダークノイズとみなされる画像から測定され得る。あるいは、第１測定データの画像内で、蛍光が分布しない背景部の輝度として、そのような領域から測定されてもよい。
【００３９】
また、測定された各輝度測定領域の輝度平均値の中での最大値が、３つの検出波長帯域それぞれで求められる。赤（Ｒ）の検出波長帯域での最大値をＩmax-Ｒとし、緑（Ｇ）の検出波長帯域での最大値をＩmax-Ｇとし、青（Ｂ）の検出波長帯域での最大値をＩmax-Ｂとする。さらに、Ｉmax-Ｒ，Ｉmax-ＧおよびＩmax-Ｂの中での最大値Ｉmax-RGBが求められる。そして、Ｒ，Ｇ，Ｂの各検出波長帯域における検出時間の比（ＥＲ：ＥＧ：ＥＢ）が下記（１）式によって求められる。例えば、Ｉmax-Ｒが２５０であり、Ｉmax-Ｇが２５００であり、Ｉmax-Ｂが５００であるとすると、Ｒ，Ｇ，Ｂの各検出波長帯域における検出時間の比（ＥＲ：ＥＧ：ＥＢ）は１００：１０：５０ となる。
【００４０】
【数１】
【００４１】
この例のように得られる蛍光の多くが緑（Ｇ）の検出波長帯域に集中した場合、従来の蛍光検出方法では、蛍光画像を取得する際の検出時間は、緑（Ｇ）の検出波長帯域の蛍光を検出する検出素子（例えばＣＣＤ）が飽和した時点でそれ以上長くすることができなくなる。これに対して、本実施形態のように３つの検出波長帯域それぞれの検出時間の比が設定されることで、同様の輝度を得るまでに検出時間を１０倍長くすることができる。この効果により、蛍光画像のＳＮ比が向上され、分離画像の画質を改善することができる。
【００４２】
続く第２測定データ取得ステップＳ１３では、第２測定データ取得手段４３により、以上のようにして検出時間設定ステップＳ１２において設定された３つの検出波長帯域それぞれの検出時間に亘って、測定対象物９で発生する蛍光が検出部３０により検出され、当該検出結果を示す第２測定データが取得される。このとき、３つの検出波長帯域それぞれの検出時間が上記比率に保たれるとともに、輝度が検出部３０の検出限界を越えない範囲で設定され、操作者による蛍光像の観察により任意に設定され得る。
【００４３】
基準データ取得ステップＳ１４では、３種類の蛍光色素のうちの個々の種類の蛍光色素を単独で含む３つの基準試料が用意され、各基準試料が順次にステージ９に載置されて、各基準試料で発生した蛍光が３つの検出波長帯域それぞれにおいて検出部３０により検出されて基準データが取得される。なお、この際に、ダークノイズについての補正が行われる。基準データとして、下記（２）式で表される３行３列の行列Ｊが作成される。この行列Ｊの第ｍ行第ｎ列の要素Ｊｍ,ｎは、３種類の蛍光色素のうちの第ｎの蛍光色素を単独で含む基準試料で発生した蛍光であって、３つの検出波長帯域のうちの第ｍの検出波長帯域において検出部３０により検出された蛍光の強度を表す。ここで、ｍ，ｎは、１以上３以下の整数である。なお、基準データ取得ステップＳ１４で、３つの検出波長帯域それぞれにおける検出部３０による検出は、検出時間設定ステップＳ１２において設定される検出時間に亘って行われるのも好ましい。
【００４４】
【数２】
【００４５】
そして、解析ステップＳ１５では、解析手段４４により、第２測定データ取得ステップＳ１３において取得された３つの検出波長帯域それぞれについての第２測定データに基づいて、測定対象物９に含有される３種類の蛍光色素それぞれの含有濃度が解析される。この解析に際しては、３種類の蛍光色素それぞれで発生する蛍光スペクトルのうち何れか２つの蛍光スペクトルが互いに重なっている場合には、一般にアンミキシングと呼ばれる画像演算が行われる。以下では、本実施形態におけるアンミキシング演算について説明する。
【００４６】
アンミキシング演算では、第２測定データ取得手段４３で取得された３つの検出波長帯域それぞれについての第２測定データからダークノイズ成分が除去されたデータに加えて、基準データ取得ステップＳ１４で取得された基準データの行列Ｊ（上記（２）式）が用いられて、各画素について以下のような演算が行われる。第２測定データ取得手段４３で取得された赤（Ｒ）の検出波長帯域についての第２測定データからダークノイズ成分が除去された画素データをＯ１と表し、第２測定データ取得手段４３で取得された緑（Ｇ）の検出波長帯域についての第２測定データからダークノイズ成分が除去された画素データをＯ２と表し、第２測定データ取得手段４３で取得された青（Ｂ）の検出波長帯域についての第２測定データからダークノイズ成分が除去された画素データをＯ３と表す。
【００４７】
また、上記（２）式の基準データの行列Ｊの各要素Ｊｍ,ｎのうち、要素Ｊ１,１，Ｊ１,２，Ｊ１,３が赤（Ｒ）の検出波長帯域についてのデータであり、要素Ｊ２,１，Ｊ２,２，Ｊ２,３が緑（Ｇ）の検出波長帯域についてのデータであり、要素Ｊ３,１，Ｊ３,２，Ｊ３,３が青（Ｂ）の検出波長帯域についてのデータであるとする。当該画素における３種類の蛍光色素それぞれの含有濃度をｃ１〜ｃ３と表すと、これらは下記（３）式で表される。（３）式による演算が画素毎に行われることで、第２測定データ取得ステップＳ１３において取得された３つの検出波長帯域それぞれについての第２測定データに基づいて、測定対象物９に含有される３種類の蛍光色素それぞれの含有濃度分布を表す分離画像が個々に得られる。
【００４８】
【数３】
【００４９】
ところで、基準データＪの各要素が各検出波長帯域での各蛍光色素の強度分布の比率を保って得られていれば、上記のアンミキシング演算により分離画像が作成され得る。ただし、この場合、アンミキシング演算によって求められた分離画像の各画素の“濃度”は、もともと試料が持っていた蛍光色素の量に対してリニアな関係にはあるが、相対的な値として求められている。
【００５０】
絶対的な濃度を求めたい場合には、まず、基準データを得るための基準試料における蛍光色素の濃度が既知であることが必要である。さらに、基準データを得るための画像と第２測定データによる元画像の輝度とを対比できるように、基準試料および測定対象部９それぞれの厚さ（光路長）が互いに同じであり、且つ、これらの画像が検出時間や検出部３０のゲイン等に関して互いに同じ条件で得られていることが必要である。
【００５１】
このような測定は、基準データを得るための基準試料として既知濃度の蛍光色素の溶液を使用し、画像を常に同じ厚さの断層像が得られるコンフォーカル顕微鏡で取得することで行なうことができる。また、基準データ取得ステップＳ１４および解析ステップＳ１５それぞれでは、以下のような処理が行われる。
【００５２】
基準データ取得ステップＳ１４では、使用された蛍光色素ごとに基準データが測定される。このとき、濃度が既知である蛍光色素の溶液が基準試料として用いられ、この基準試料からの蛍光画像が蛍光色素毎に取得される。各検出波長帯域での検出時間は、検出時間設定ステップＳ１２で設定された比とされる。この検出時間で輝度が検出部３０の検出限界を越えないように、基準試料における蛍光色素濃度が調整される。そして、取得された画像に輝度測定領域が設定されて、ダークノイズ分が補正された輝度測定領域のＲ，Ｇ，Ｂごとの平均輝度が測定されることで、各蛍光色素の基準データが測定される。
【００５３】
解析ステップＳ１５におけるアンミキシング演算では、各画素に存在する各蛍光色素の量が、上記（３）式により、基準データの輝度を単位濃度とした濃度ｃとして求められ、この値をもとに分離画像が作成される。さらに、下記（４）式により、各画素の各蛍光色素の濃度ｃが、絶対的な濃度Ｃに変換される。Ｃは、分離画像の絶対的な濃度であり、ｃは、基準データの輝度を単位濃度としたときの分離画像の濃度であり、ｃ'は、基準データを得るための基準試料における蛍光色素濃度である。
【００５４】
【数４】
【００５５】
次に、本実施形態に係る蛍光検出装置１および蛍光検出方法の実施例について説明する。実施例において測定された測定対象物９は、３種類の蛍光色素ＣＦＰ（Cyan FluorescentProtein），ＧＦＰ（GreenFluorescent Protein），ＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protein）の何れかを単独で含むＨｅＬａ細胞（ヒト由来の細胞）が混合されて培養されたものであった。
【００５６】
検出部３０として用いられたものは、浜松ホトニクス社製の３個のＣＣＤを有するカラーカメラＣ７７８０-２０であった。このカメラは、３個のＣＣＤにより赤（Ｒ），緑（Ｇ），青（Ｂ）の３つの検出波長帯域の画像を同時に取得することができ、また、各ＣＣＤについて個別に検出時間が設定され得る。
【００５７】
各蛍光色素の特性に合わせて、励起光源２０から顕微鏡１０に導入される励起光の波長は４４０±１０ｎｍとされ、顕微鏡１０に含まれるダイクロイックミラーの反射・透過の境界の波長は４５５ｎｍとされて、検出部３０の前面に配置したフィルタにより波長４６０ｎｍ以上の蛍光像が取得された。図３は、各蛍光色素の蛍光スペクトルおよびカメラの各ＣＣＤの検出波長帯域を示す図である。解析ステップＳ１５におけるアンミキシング演算に際しては、浜松ホトニクス社製の画像処理装置AQUACOSMOSが用いられた。
【００５８】
第１測定データ取得ステップＳ１１において、この測定対象物９で発生する蛍光が検出部３０により３つの検出波長帯域それぞれで略同一の検出時間（４０ｍ秒）に亘って検出されて、第１測定データとしての蛍光画像が得られた。図４は、第１測定データ取得ステップＳ１１において第１測定データとして得られた蛍光画像および分離画像を示す図である。同図（ａ）は、第１測定データとして得られた３つの検出波長帯域の画像が重ねられたものである。同図（ｂ）〜（ｄ）は、同図（ａ）の画像に基づいてアンミキシング演算が行われて分離された各蛍光色素の分離画像である。同図（ｂ）はＣＦＰの分離画像であり、同図（ｃ）はＧＦＰの分離画像であり、また、同図（ｄ）はＹＦＰの分離画像である。
【００５９】
同図（ａ）に示されるように、３種類の蛍光色素ＣＦＰ，ＧＦＰおよびＹＦＰが含有された測定対象物９で発生する蛍光は、緑（Ｇ）の検出波長帯域で高強度となった。したがって、検出部３０により３つの検出波長帯域それぞれで略同一の検出時間に亘って検出する場合、緑（Ｇ）の検出波長帯域の検出素子（ＣＣＤ）が飽和した時点でそれ以上長くすることができなくなる。
【００６０】
続く検出時間設定ステップＳ１２において、第１測定データ取得ステップＳ１１で得られた蛍光画像中に４つの輝度測定領域が設定され、各輝度測定領域で３つの検出波長帯域それぞれの輝度平均値が求められ、さらに、測定された各輝度測定領域の輝度平均値の中での最大値が３つの検出波長帯域それぞれで求められた。その結果、赤（Ｒ）の検出波長帯域での最大値Ｉmax-Ｒは１２９.４であり、緑（Ｇ）の検出波長帯域での最大値Ｉmax-Ｇは２６０６.３であり、また、青（Ｂ）の検出波長帯域での最大値Ｉmax-Ｂは５４４.９であった。また、上記（１）式で表されるＲ，Ｇ，Ｂの各検出波長帯域における検出時間の比（ＥＲ：ＥＧ：ＥＢ）は１００：５：２４ であった。
【００６１】
続く第２測定データ取得ステップＳ１３において、以上のようにして検出時間設定ステップＳ１２において設定された３つの検出波長帯域それぞれの検出時間に亘って、測定対象物９で発生する蛍光が検出部３０により検出され、当該検出結果を示す第２測定データが取得された。このとき、赤（Ｒ）の検出波長帯域における検出時間は８２７ｍ秒まで延長された。Ｒ，Ｇ，Ｂともに同じ検出時間で画像を取得するときと比べ、検出時間の比（１００：５：２４）で画像を取得するときには、計算上は約２０倍まで検出時間を長くすることができ、実際にもその程度まで検出時間を長くすることができた。
【００６２】
また、基準データ取得ステップＳ１４においても、同じ装置が用いられて、検出時間設定ステップＳ１２において設定された３つの検出波長帯域それぞれの検出時間の比（１００：５：２４）で、各基準試料で発生する蛍光が検出部３０により検出されて、基準データが取得された。また、このとき、蛍光画像中に複数の輝度測定領域が設定され、ダークノイズ補正後のＲ，Ｇ，Ｂの輝度の平均値が求められて、下記の基準データが得られた。
【００６３】
【数５】
【００６４】
そして、続く解析ステップＳ１５においては、第２測定データ取得ステップＳ１３において取得された第２測定データとしての画像データ、基準データ取得ステップＳ１４において取得された基準データとに基づいて、アンミキシング演算が行われた。図５は、第２測定データ取得ステップＳ１３において第２測定データとして得られた蛍光画像および分離画像を示す図である。同図（ａ）は、第２測定データとして得られた３つの検出波長帯域の画像が重ねられたものである。同図（ｂ）〜（ｄ）は、解析ステップＳ１５において同図（ａ）の画像に基づいてアンミキシング演算が行われて分離された各蛍光色素の分離画像である。同図（ｂ）はＣＦＰの分離画像であり、同図（ｃ）はＧＦＰの分離画像であり、また、同図（ｄ）はＹＦＰの分離画像である。
【００６５】
また、比較例として、３つの検出波長帯域それぞれの検出時間の比を１００：１００：１００ として画像データおよび基準データが取得されて、これら画像データおよび基準データに基づいてアンミキシング演算が行われた。比較例における基準データは下記のとおりである。この比較例で得られた分離画像は、図４（ｂ）〜（ｄ）に示されている。
【００６６】
【数６】
【００６７】
実施例（検出時間比１００：５：２４）および比較例（検出時間比１００：１００：１００）それぞれにおいて、アンミキシング演算では、各画素に存在するそれぞれの蛍光色素の量が、基準データの輝度を単位濃度とした濃度といわれる値で求められ、この値をもとに分離画像が作成された。ＣＦＰを含む細胞，ＧＦＰを含む細胞およびＹＦＰを含む細胞が存在する領域上で、それぞれ２５画素が適当に選択され、各分離画像でその画素の濃度値が求められた。その後、下記（７）式により、その画素での各蛍光色素の濃度の比率が求められた。ここで、[ＣＦＰ] はＣＦＰの濃度値であり、[ＧＦＰ] はＧＦＰの濃度値であり、[ＹＦＰ] はＹＦＰの濃度値である。また、[ＸＦＰ] は、ＣＦＰ，ＧＦＰまたはＹＦＰの濃度値であり、ＣＸＦＰは、ＣＦＰ，ＧＦＰまたはＹＦＰの濃度の比率（％）である。
【００６８】
【数７】
【００６９】
例えば、ＣＦＰを含む細胞のみが存在する画素では、理想的には、ＣＦＰの分離画像のみにいくらかの濃度値が存在し、他の蛍光色素の分離画像の濃度は０になるので、ＣＦＰの分離画像での濃度の比率は１００になる。そこで、この数値をもとにアンミキシング演算による分離の精度を評価した。図６は、比較例における各蛍光色素の分離画像での濃度比率の平均および標準偏差を示すグラフである。図７は、実施例における各蛍光色素の分離画像での濃度比率の平均および標準偏差を示すグラフである。
【００７０】
比較例では、ＣＦＰの分離画像でのＣＦＰの濃度の比率については、平均が１００.１であり、標準偏差が６.４であった。ＧＦＰの分離画像でのＧＦＰの濃度の比率については、平均が１０３.１であり、標準偏差が１２.５であった。また、ＹＦＰの分離画像でのＹＦＰの濃度の比率については、平均が１０５.５であり、標準偏差が４６.５であった。
【００７１】
実施例では、ＣＦＰの分離画像でのＣＦＰの濃度の比率については、平均が９８.２であり、標準偏差２.３であった。ＧＦＰの分離画像でのＧＦＰの濃度の比率については、平均が１０１.８であり、標準偏差が５.０であった。また、ＹＦＰの分離画像でのＹＦＰの濃度の比率については、平均が９９.５であり、標準偏差が５.６であった。
【００７２】
実施例および比較例の何れの場合でも、各蛍光色素の分離画像での濃度比率の平均は略１００であった。しかし、画素間の濃度ばらつきの程度を示す標準偏差は、比較例と比べて実施例の方が有意に小さくなっていた。この結果は、比較例と比べて実施例の場合に、アンミキシング演算により得られた分離画像において画素間の輝度ばらつきが小さく、画質が改善された画像になっていることを示す。この効果は、比較例の場合のアンミキシング演算後の分離画像（図４（ｂ）〜（ｄ））と、実施例の場合のアンミキシング演算後の分離画像（図５（ｂ）〜（ｄ））とを対比して、比較例と比べて実施例の場合に細胞内の核の構造が鮮明に観察できることからも明らかである。
【００７３】
実施例と比較例との対比について更に説明すると以下のとおりである。上記のＣＦＰ，ＧＦＰおよびＹＦＰの組み合わせの如く、３種類の蛍光色素それそれの蛍光波長が互いに近く蛍光スペクトルが互いに似ているような場合、比較例のアンミキシング演算により得られる分離画像（図４（ｂ）〜（ｄ））は、元の蛍光画像（図４（ａ））と比較すると、ざらついたようになり、画質が悪い。その理由として以下のようなことが考えられる。
【００７４】
画像として得られる蛍光色素の輝度は、ある程度のゆらぎをもって存在している。仮に蛍光色素が均一に存在している測定対象物の蛍光画像を取得したとしても、通常、各画素での輝度にはばらつきがみられる。それ故、元の蛍光画像の各検出波長帯域の画像では、たまたま選ばれた測定対象物で測定された基準値とぴったりと一致した輝度分布を示す画素は少ない。アンミキシング演算は、元画像に対して画素ごとに行われる。元画像の各画素でみられる基準値との輝度のずれは、演算結果となる分離画像の各画素の輝度にもずれを与え、その各画素の輝度を実際の蛍光像よりも高い方向あるいは低い方向にシフトさせる。この結果、分離画像の輝度の分布にばらつきが生じ画質を劣化させている。この影響は、使われる蛍光色素間の蛍光スペクトルの形が近いほど（すなわち、基準値が近いほど）、大きくなると考えられる。
【００７５】
画像のＳＮ比を上げることにより、元画像の画素間の輝度のゆらぎは小さくなる。画像のＳＮ比を上げるための方法の１つは、検出部として使われるカメラの露光時間を長くして画像を取得することである。しかし、使われる蛍光色素間のスペクトルが近いときには、それぞれの画像を取得する検出波長帯域にこれらの蛍光が互いに重なって入ることになる。この場合、これらの検出波長帯域の蛍光の強度が集中的に大きくなり、短い露光時間でカメラが取得できる光量を超えてしまう状況になる。飽和した輝度を持つ画素では正しい演算が行えないので、全検出波長帯域で、等しい露光時間で画像が取得される従来技術の場合、露光時間を長くすることで画像のＳＮ比を上げることが難しい。また、画像演算の１つであるマスク演算で、近接する画素の輝度を使った計算により画像のＳＮ比を上げることもできるが、この手法では空間的な解像度を落としてしまうという問題がある。
【００７６】
これに対して、本実施形態では、第１測定データ取得ステップＳ１１において、３つの検出波長帯域それぞれにおいて蛍光が検出部３０により略同一の検出時間に亘って検出されて当該検出結果を示す第１測定データが取得され、検出時間設定ステップＳ１２において、取得された３つの検出波長帯域それぞれについての第１測定データが互いに比較されて、入力光強度が最も低い検出波長帯域（特定検出波長帯域）における検出時間が他の検出波長帯域における検出時間より長く設定され、そして、第２測定データ取得ステップＳ１３において蛍光が検出部３０により検出されることにより、実施例の如く処理を行って得られる分離画像（図５（ｂ）〜（ｄ））は、元の蛍光画像（図５（ａ））と比較して、画質の劣化が抑制されている。
【００７７】
以上に説明した本実施形態の説明では、検出部３０は、検出すべき検出波長帯域の数と同じ個数の検出素子を含み、各検出波長帯域の光を何れかの検出素子により検出するものとした。しかし、検出部３０は、他の構成のものであってもよい。
【００７８】
例えば、検出部３０は、単板のＲＧＢカラーカメラ等のように、複数の検出波長帯域の光を１つの検出素子で検出できるものであって、検出波長帯域毎に検出時間（およびゲイン）を個別に調整できるものであってもよい。
【００７９】
また、例えば、検出部３０は、モノクロカメラと、このモノクロカメラに入射する光の波長帯域を切り替えることができるフィルタ切替え装置等と、を組み合わせた構成のものであってもよい。ただし、この場合、各検出波長帯域の画像を取得する際に時間差が生じる。
【００８０】
また、例えば、検出部３０は、測定対象物９から発生する蛍光を複数の検出波長帯域に分光する分光器と、この分光器により分光された各検出波長帯域の光を検出する複数のモノクロカメラと、を備える構成のものであってもよい。この場合には、各検出波長帯域の画像が同時に取得され得る。
【００８１】
また、アンミキシング演算に際して、上記の実施形態では１つの励起波長により複数の検出波長帯域の蛍光画像を取得したが、励起波長を切り替えて１つの検出波長帯域で蛍光画像を取得してもよいし、励起波長および検出波長帯域の両方を切り替えて蛍光画像を取得してもよく、このような測定系でもこの手法を同様に使用することができる。
【００８２】
また、上記の実施例では、測定対象物９に含有される蛍光色素の種類数が３であって、検出波長帯域の数が３であったが、これに限られない。蛍光色素の種類数は２であってもよいし４以上であってもよい。上記いずれの構成においても、検出部３０として、蛍光色素の種類数と等しいか又はそれ以上の検出波長帯域を持つものを使用することで、アンミキシングの演算を行うことができる。
【００８３】
以上、詳細に説明したように、本実施形態に係る蛍光検出装置および蛍光検出方法を用いれば、複数種類の蛍光色素が含有された測定対象物で発生する蛍光を検出する際に、個々の蛍光色素に由来する蛍光を分離してＳＮ比よく検出することができる。また、本実施形態に係る蛍光検出装置および蛍光検出方法の効果について更に説明すると以下のとおりである。
【００８４】
アンミキシング演算により分離画像を得るには、測定する各検出波長帯域の帯域幅を狭くするほど、また、検出波長帯域の数を増やすほど、基準データがより細かく取得され得るので、スペクトルの波長が互いに近い蛍光色素どうしでも、その分離が容易になる。しかし、各検出波長帯域の帯域幅が狭くなると、各検出波長帯域で得られる蛍光量が減少することにより、画質のＳＮ比が落ちる要因になる。
【００８５】
これに対して、本実施形態に係る蛍光検出装置および蛍光検出方法を用いれば、少ない検出波長帯域での測定でも、質のよい分離画像を取得することができる。アンミキシング演算を行うには、設定される検出波長帯域の数は、使われた蛍光色素の種類数と等しいか、これより多いことが必要である。本実施形態によれば、取得する画像の検出波長帯域の数を必要最小限にまで減らすことができ、蛍光画像の取得に要する時間が短縮され、装置や演算の簡素化を図ることができるなど、測定の効率が向上する。
【００８６】
カラーカメラを検出部３０として用いた場合は、その検出波長帯域がＲ，Ｇ，Ｂであって該カメラ内の光学系で固定されている。それ故、使用する蛍光色素の蛍光スペクトルに応じて検出波長帯域を最適に設定することができず、クロストークが多い状態で測らなくてはいけない場合も多い。しかし、本実施形態によれば、カラーカメラを検出部３０として用い、蛍光スペクトルの波長が互いに近い蛍光色素を使用したとしても、質のよい分離画像を得ることができる。
【００８７】
このことは検出光学系を構築する上でも有用である。すなわち、一般的なカラーカメラでは検出波長帯域の数は３までではあるが、異なる検出波長帯域の画像が同時に取得され得る。また、画像間の位置ずれもない。したがって、本実施形態によれば、より性能に優れ簡便化された装置が構築され得る。
【００８８】
一方、他の装置構成として、バンドパスフィルタでそれぞれの蛍光を分光し、波長を切り替えながらモノクロカメラで蛍光画像を取得するものが考えられる。このような装置構成では、測定する検出波長帯域は蛍光色素の蛍光スペクトルに合わせて設定され得るが、検出波長帯域の異なる画像が同時には得られないため、各検出波長帯域の画像の間で時間差が生じてしまう。このような装置構成では、生きている細胞試料のように、その中の分子の分布や活性が常に変化しているようなものを測定対象物とした場合には、これらの正確な測定が困難になる。蛍光を分光する装置と複数のモノクロカメラとを組み合わせることで、複数の検出波長帯域の画像を同時に得ることができる装置構成とすることができるが、各画像間の位置合わせなど測定する上での困難を伴う。
【００８９】
また、検出部３０としてモノクロカメラが使用されたときでも、検出光学系を構築する上で、本実施形態は有用である。従来では、使われる蛍光色素の蛍光スペクトルに合わせて、クロストークが少ない検出波長帯域を吟味し、バンドパスフィルタなどの部品を選択し調達する必要があるが、本実施形態によれば、厳密な波長の設定を行わなくとも画質のよい分離画像を作製することができるようになる。
【００９０】
本実施形態に係る蛍光検出装置および蛍光検出方法は、分離画像のＳＮ比が高められることは、生物試料を測定対象物としたアプリケーションの面からみると、蛍光色素の退色や生物試料の生理的活性への影響を考慮すると、強い励起光を照射できず蛍光の強度を稼げないようなときに有用となる。また、本実施形態では、蛍光色素で標識された分子の局在の解析も従来法に比べて容易になる。蛍光強度の変化から細胞の生理的活動を測定するような場合には、微小な変化を容易に検出できるようになる。例えば、蛍光試薬の輝度変化から細胞内の活動状態を測定するＣａ２＋などの細胞内イオンの測定や、蛍光エネルギ移動による蛋白質分子間の相互作用の測定などに有用である。また、細胞には自家蛍光とよばれる内在性の蛍光分子が存在し、この自家蛍光のクロストークが、標識に使用された蛍光色素の測定精度を低下させる要因になることがある。本実施形態では、自家蛍光を効率的に分離することができるので、その影響を抑えることができる。
【００９１】
本実施形態に係る蛍光検出装置および蛍光検出方法は、検出波長帯域によって検出時間を調整して画像のＳＮ比を向上させることができることから、以下に説明するように、生物試料を測定対象物とした蛍光測定において特に有効である。
【００９２】
蛍光試料のイメージングにおいて蛍光画像のＳＮ比を向上させるには、測定対象物から発せられる蛍光の強度を高めることによっても可能である。そして、測定対象物から発せられる蛍光の強度を高めることは、測定対象物に照射される励起光を強くすることで可能であり、または、測定対象物における蛍光色素の濃度を増やすことでも可能である。
【００９３】
一方、測定対象物が特に細胞などの生物試料である場合、細胞の運動性や形態または細胞内の分子の局在や活性は時間とともに変化しており、これらを測定するためには長時間に亘り連続的または断続的に蛍光画像をモニタする場合が多い。
【００９４】
このような測定上の要求がある中で、測定対象物に照射する励起光を強くすることは、蛍光色素の不可逆的な変性による退色を促し、長期のイメージングを困難にする。また、強い励起光と色素との反応により、活性酸素などの細胞に対して毒性をもつ分子が発生することがある。このような分子は細胞内の分子と反応することでその機能を阻害するので、細胞が正常な状態を長期に維持することを困難にする。
【００９５】
また、測定対象物である細胞内の蛍光色素の量を増やすことは、細胞の生理的状態を撹乱させるおそれがある。例えば、蛍光抗体など、分子の標識に使われる色素は、その分子に選択的に結合するが、多量の色素の導入はその標的分子の活性を抑制させることになる。また、最近では、ＧＦＰなどの蛍光蛋白質を対象の蛋白質に結合させた形で細胞内に発現させる実験がよく行われているが、このように人為的に特定の蛋白質を高濃度に発現させることは、この蛋白質の活性を異常なまでに促進させてしまうおそれがある。このような状況では、正常な生理的状態での細胞の反応を測定することが困難になる。
【００９６】
以上のような問題を回避するためには、できるだけ測定対象物内の蛍光色素量を減らし、励起光の照射強度を弱めて、イメージングを行うことが重要である。上記の状況下であっても、本実施形態に係る蛍光検出装置および蛍光検出方法は、検出波長帯域によって検出時間を調整して画像のＳＮ比を向上させることができることから、測定対象物内の蛍光色素量の増加や励起光照射の高強度化を抑制しつつ、ＳＮ比の高い分離画像を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】本実施形態に係る蛍光検出装置１の構成図である。
【図２】本実施形態に係る蛍光検出方法のフローチャートである。
【図３】各蛍光色素の蛍光スペクトルおよびカメラの各ＣＣＤの検出波長帯域を示す図である。
【図４】第１測定データ取得ステップＳ１１において第１測定データとして得られた蛍光画像および分離画像を示す図である。
【図５】第２測定データ取得ステップＳ１３において第２測定データとして得られた蛍光画像および分離画像を示す図である。
【図６】比較例における各蛍光色素の分離画像での濃度比率の平均および標準偏差を示すグラフである。
【図７】実施例における各蛍光色素の分離画像での濃度比率の平均および標準偏差を示すグラフである。
【符号の説明】
【００９８】
１…蛍光検出装置、９…測定対象物、１０…顕微鏡、１１…ステージ、１２…対物レンズ、２０…励起光源、２１…シャッタ、２２…フィルタ、３０…検出部、４０…処理部、４１…第１測定データ取得手段、４２…検出時間設定手段、４３…第２測定データ取得手段、４４…解析手段、４５…記憶手段、５０…表示部。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数種類の蛍光色素が含有された測定対象物で発生する蛍光を検出する蛍光検出装置であって、
複数の検出波長帯域それぞれにおいて入力光強度を検出して当該検出結果を示すデータを出力するともに、前記複数の検出波長帯域それぞれにおける当該検出時間が可変である検出部と、
前記検出部における光検出動作を制御するとともに、前記検出部から出力されるデータを取得して該データを処理する処理部と、
を備え、
前記処理部が、
前記複数の検出波長帯域それぞれにおいて、前記測定対象物で発生する蛍光を前記検出部により略同一の検出時間に亘って検出させ、当該検出結果を示す第１測定データを取得する第１測定データ取得手段と、
前記第１測定データ取得手段により取得された前記複数の検出波長帯域それぞれについての第１測定データを互いに比較して、その比較結果に基づいて、前記複数の検出波長帯域のうち入力光強度が最も低い検出波長帯域（以下「特定検出波長帯域」という。）を選択して、前記複数の検出波長帯域のうち前記特定検出波長帯域における検出時間を他の検出波長帯域における検出時間より長く設定する検出時間設定手段と、
前記検出時間設定手段により設定された前記複数の検出波長帯域それぞれの検出時間に亘って、前記測定対象物で発生する蛍光を前記検出部により検出させ、当該検出結果を示す第２測定データを取得する第２測定データ取得手段と、
前記第２測定データ取得手段により取得された前記複数の検出波長帯域それぞれについての第２測定データに基づいて、前記測定対象物に含有される前記複数種類の蛍光色素それぞれの含有濃度を解析する解析手段と、
を含む、
ことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項２】
前記検出時間設定手段が、前記第１測定データ取得手段により取得された前記複数の検出波長帯域それぞれについての第１測定データの比に対して逆比例関係となるように、前記複数の検出波長帯域それぞれにおける検出時間の比を設定する、ことを特徴とする請求項１記載の蛍光検出装置。
【請求項３】
前記解析手段が、前記複数種類の蛍光色素のうちの個々の種類の蛍光色素を単独で含む基準試料それぞれで発生した蛍光を前記複数の検出波長帯域それぞれにおいて前記検出部により検出して得られた基準データと、前記第２測定データ取得手段により取得された前記複数の検出波長帯域それぞれについての第２測定データとに基づいて、前記測定対象物に含有される前記複数種類の蛍光色素それぞれの含有濃度を解析する、ことを特徴とする請求項１記載の蛍光検出装置。
【請求項４】
前記検出部が、前記複数の検出波長帯域それぞれにおいて入力光強度に対する出力データのゲインが可変であり、
前記処理部が、第２測定データ取得手段により前記測定対象物で発生する蛍光を前記検出部により検出させる際に、前記検出時間設定手段による比較結果に基づいて前記複数の検出波長帯域のうち何れかの検出波長帯域において前記検出部のゲインを調整する、
ことを特徴とする請求項１記載の蛍光検出装置。
【請求項５】
前記検出部が、前記複数の検出波長帯域のうちの個々の検出波長帯域に対応する検出素子を含む、ことを特徴とする請求項１記載の蛍光検出装置。
【請求項６】
複数種類の蛍光色素が含有された測定対象物で発生する蛍光を検出する蛍光検出方法であって、
複数の検出波長帯域それぞれにおいて入力光強度を検出して当該検出結果を示すデータを出力するともに前記複数の検出波長帯域それぞれにおける当該検出時間が可変である検出部を用いて、前記複数の検出波長帯域それぞれにおいて、前記測定対象物で発生する蛍光を略同一の検出時間に亘って検出し、当該検出結果を示す第１測定データを取得する第１測定データ取得ステップと、
前記第１測定データ取得ステップにおいて取得された前記複数の検出波長帯域それぞれについての第１測定データを互いに比較して、その比較結果に基づいて、前記複数の検出波長帯域のうち入力光強度が最も低い検出波長帯域（以下「特定検出波長帯域」という。）を選択して、前記複数の検出波長帯域のうち前記特定検出波長帯域における検出時間を他の検出波長帯域における検出時間より長く設定する検出時間設定ステップと、
前記検出時間設定ステップにおいて設定された前記複数の検出波長帯域それぞれの検出時間に亘って、前記測定対象物で発生する蛍光を前記検出部により検出し、当該検出結果を示す第２測定データを取得する第２測定データ取得ステップと、
前記第２測定データ取得ステップにおいて取得された前記複数の検出波長帯域それぞれについての第２測定データに基づいて、前記測定対象物に含有される前記複数種類の蛍光色素それぞれの含有濃度を解析する解析ステップと、
を備えることを特徴とする蛍光検出方法。
【請求項７】
前記検出時間設定ステップにおいて、前記第１測定データ取得ステップにおいて取得された前記複数の検出波長帯域それぞれについての第１測定データの比に対して逆比例関係となるように、前記複数の検出波長帯域それぞれにおける検出時間の比を設定する、ことを特徴とする請求項６記載の蛍光検出方法。
【請求項８】
前記解析ステップにおいて、前記複数種類の蛍光色素のうちの個々の種類の蛍光色素を単独で含む基準試料それぞれで発生した蛍光を前記複数の検出波長帯域それぞれにおいて前記検出部により検出して得られた基準データと、前記第２測定データ取得ステップにおいて取得された前記複数の検出波長帯域それぞれについての第２測定データとに基づいて、前記測定対象物に含有される前記複数種類の蛍光色素それぞれの含有濃度を解析する、ことを特徴とする請求項６記載の蛍光検出方法。
【請求項９】
前記検出部が、前記複数の検出波長帯域それぞれにおいて入力光強度に対する出力データのゲインが可変であり、
前記第２測定データ取得ステップにおいて、前記検出時間設定ステップにおける比較結果に基づいて前記複数の検出波長帯域のうち何れかの検出波長帯域において前記検出部のゲインを調整して、前記測定対象物で発生する蛍光を前記検出部により検出する、
ことを特徴とする請求項６記載の蛍光検出方法。
【請求項１０】
前記検出部が、前記複数の検出波長帯域のうちの個々の検出波長帯域に対応する検出素子を含む、ことを特徴とする請求項６記載の蛍光検出方法。
【請求項１１】
複数種類の蛍光色素が含有された測定対象物で発生する蛍光を検出する処理をコンピュータに実行させるための蛍光検出プログラムであって、
複数の検出波長帯域それぞれにおいて入力光強度を検出して当該検出結果を示すデータを出力するともに前記複数の検出波長帯域それぞれにおける当該検出時間が可変である検出部を用いて、前記複数の検出波長帯域それぞれにおいて、前記測定対象物で発生する蛍光を略同一の検出時間に亘って検出し、当該検出結果を示す第１測定データを取得する第１測定データ取得ステップと、
前記第１測定データ取得ステップにおいて取得された前記複数の検出波長帯域それぞれについての第１測定データを互いに比較して、その比較結果に基づいて、前記複数の検出波長帯域のうち入力光強度が最も低い検出波長帯域（以下「特定検出波長帯域」という。）を選択して、前記複数の検出波長帯域のうち前記特定検出波長帯域における検出時間を他の検出波長帯域における検出時間より長く設定する検出時間設定ステップと、
前記検出時間設定ステップにおいて設定された前記複数の検出波長帯域それぞれの検出時間に亘って、前記測定対象物で発生する蛍光を前記検出部により検出し、当該検出結果を示す第２測定データを取得する第２測定データ取得ステップと、
前記第２測定データ取得ステップにおいて取得された前記複数の検出波長帯域それぞれについての第２測定データに基づいて、前記測定対象物に含有される前記複数種類の蛍光色素それぞれの含有濃度を解析する解析ステップと、
をコンピュータに実行させるための蛍光検出プログラム。
【請求項１２】
請求項１１記載の蛍光検出プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【請求項１】
複数種類の蛍光色素が含有された測定対象物で発生する蛍光を検出する蛍光検出装置であって、
複数の検出波長帯域それぞれにおいて入力光強度を検出して当該検出結果を示すデータを出力するともに、前記複数の検出波長帯域それぞれにおける当該検出時間が可変である検出部と、
前記検出部における光検出動作を制御するとともに、前記検出部から出力されるデータを取得して該データを処理する処理部と、
を備え、
前記処理部が、
前記複数の検出波長帯域それぞれにおいて、前記測定対象物で発生する蛍光を前記検出部により略同一の検出時間に亘って検出させ、当該検出結果を示す第１測定データを取得する第１測定データ取得手段と、
前記第１測定データ取得手段により取得された前記複数の検出波長帯域それぞれについての第１測定データを互いに比較して、その比較結果に基づいて、前記複数の検出波長帯域のうち入力光強度が最も低い検出波長帯域（以下「特定検出波長帯域」という。）を選択して、前記複数の検出波長帯域のうち前記特定検出波長帯域における検出時間を他の検出波長帯域における検出時間より長く設定する検出時間設定手段と、
前記検出時間設定手段により設定された前記複数の検出波長帯域それぞれの検出時間に亘って、前記測定対象物で発生する蛍光を前記検出部により検出させ、当該検出結果を示す第２測定データを取得する第２測定データ取得手段と、
前記第２測定データ取得手段により取得された前記複数の検出波長帯域それぞれについての第２測定データに基づいて、前記測定対象物に含有される前記複数種類の蛍光色素それぞれの含有濃度を解析する解析手段と、
を含む、
ことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項２】
前記検出時間設定手段が、前記第１測定データ取得手段により取得された前記複数の検出波長帯域それぞれについての第１測定データの比に対して逆比例関係となるように、前記複数の検出波長帯域それぞれにおける検出時間の比を設定する、ことを特徴とする請求項１記載の蛍光検出装置。
【請求項３】
前記解析手段が、前記複数種類の蛍光色素のうちの個々の種類の蛍光色素を単独で含む基準試料それぞれで発生した蛍光を前記複数の検出波長帯域それぞれにおいて前記検出部により検出して得られた基準データと、前記第２測定データ取得手段により取得された前記複数の検出波長帯域それぞれについての第２測定データとに基づいて、前記測定対象物に含有される前記複数種類の蛍光色素それぞれの含有濃度を解析する、ことを特徴とする請求項１記載の蛍光検出装置。
【請求項４】
前記検出部が、前記複数の検出波長帯域それぞれにおいて入力光強度に対する出力データのゲインが可変であり、
前記処理部が、第２測定データ取得手段により前記測定対象物で発生する蛍光を前記検出部により検出させる際に、前記検出時間設定手段による比較結果に基づいて前記複数の検出波長帯域のうち何れかの検出波長帯域において前記検出部のゲインを調整する、
ことを特徴とする請求項１記載の蛍光検出装置。
【請求項５】
前記検出部が、前記複数の検出波長帯域のうちの個々の検出波長帯域に対応する検出素子を含む、ことを特徴とする請求項１記載の蛍光検出装置。
【請求項６】
複数種類の蛍光色素が含有された測定対象物で発生する蛍光を検出する蛍光検出方法であって、
複数の検出波長帯域それぞれにおいて入力光強度を検出して当該検出結果を示すデータを出力するともに前記複数の検出波長帯域それぞれにおける当該検出時間が可変である検出部を用いて、前記複数の検出波長帯域それぞれにおいて、前記測定対象物で発生する蛍光を略同一の検出時間に亘って検出し、当該検出結果を示す第１測定データを取得する第１測定データ取得ステップと、
前記第１測定データ取得ステップにおいて取得された前記複数の検出波長帯域それぞれについての第１測定データを互いに比較して、その比較結果に基づいて、前記複数の検出波長帯域のうち入力光強度が最も低い検出波長帯域（以下「特定検出波長帯域」という。）を選択して、前記複数の検出波長帯域のうち前記特定検出波長帯域における検出時間を他の検出波長帯域における検出時間より長く設定する検出時間設定ステップと、
前記検出時間設定ステップにおいて設定された前記複数の検出波長帯域それぞれの検出時間に亘って、前記測定対象物で発生する蛍光を前記検出部により検出し、当該検出結果を示す第２測定データを取得する第２測定データ取得ステップと、
前記第２測定データ取得ステップにおいて取得された前記複数の検出波長帯域それぞれについての第２測定データに基づいて、前記測定対象物に含有される前記複数種類の蛍光色素それぞれの含有濃度を解析する解析ステップと、
を備えることを特徴とする蛍光検出方法。
【請求項７】
前記検出時間設定ステップにおいて、前記第１測定データ取得ステップにおいて取得された前記複数の検出波長帯域それぞれについての第１測定データの比に対して逆比例関係となるように、前記複数の検出波長帯域それぞれにおける検出時間の比を設定する、ことを特徴とする請求項６記載の蛍光検出方法。
【請求項８】
前記解析ステップにおいて、前記複数種類の蛍光色素のうちの個々の種類の蛍光色素を単独で含む基準試料それぞれで発生した蛍光を前記複数の検出波長帯域それぞれにおいて前記検出部により検出して得られた基準データと、前記第２測定データ取得ステップにおいて取得された前記複数の検出波長帯域それぞれについての第２測定データとに基づいて、前記測定対象物に含有される前記複数種類の蛍光色素それぞれの含有濃度を解析する、ことを特徴とする請求項６記載の蛍光検出方法。
【請求項９】
前記検出部が、前記複数の検出波長帯域それぞれにおいて入力光強度に対する出力データのゲインが可変であり、
前記第２測定データ取得ステップにおいて、前記検出時間設定ステップにおける比較結果に基づいて前記複数の検出波長帯域のうち何れかの検出波長帯域において前記検出部のゲインを調整して、前記測定対象物で発生する蛍光を前記検出部により検出する、
ことを特徴とする請求項６記載の蛍光検出方法。
【請求項１０】
前記検出部が、前記複数の検出波長帯域のうちの個々の検出波長帯域に対応する検出素子を含む、ことを特徴とする請求項６記載の蛍光検出方法。
【請求項１１】
複数種類の蛍光色素が含有された測定対象物で発生する蛍光を検出する処理をコンピュータに実行させるための蛍光検出プログラムであって、
複数の検出波長帯域それぞれにおいて入力光強度を検出して当該検出結果を示すデータを出力するともに前記複数の検出波長帯域それぞれにおける当該検出時間が可変である検出部を用いて、前記複数の検出波長帯域それぞれにおいて、前記測定対象物で発生する蛍光を略同一の検出時間に亘って検出し、当該検出結果を示す第１測定データを取得する第１測定データ取得ステップと、
前記第１測定データ取得ステップにおいて取得された前記複数の検出波長帯域それぞれについての第１測定データを互いに比較して、その比較結果に基づいて、前記複数の検出波長帯域のうち入力光強度が最も低い検出波長帯域（以下「特定検出波長帯域」という。）を選択して、前記複数の検出波長帯域のうち前記特定検出波長帯域における検出時間を他の検出波長帯域における検出時間より長く設定する検出時間設定ステップと、
前記検出時間設定ステップにおいて設定された前記複数の検出波長帯域それぞれの検出時間に亘って、前記測定対象物で発生する蛍光を前記検出部により検出し、当該検出結果を示す第２測定データを取得する第２測定データ取得ステップと、
前記第２測定データ取得ステップにおいて取得された前記複数の検出波長帯域それぞれについての第２測定データに基づいて、前記測定対象物に含有される前記複数種類の蛍光色素それぞれの含有濃度を解析する解析ステップと、
をコンピュータに実行させるための蛍光検出プログラム。
【請求項１２】
請求項１１記載の蛍光検出プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図６】
【図７】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図６】
【図７】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００８−１２８９８２（Ｐ２００８−１２８９８２Ａ）
【公開日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３１７５７０（Ｐ２００６−３１７５７０）
【出願日】平成１８年１１月２４日（２００６．１１．２４）
【出願人】（０００２３６４３６）浜松ホトニクス株式会社 (1,479)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月２４日（２００６．１１．２４）
【出願人】（０００２３６４３６）浜松ホトニクス株式会社 (1,479)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]