【課題】スルホン化ジアリールローダミン化合物として、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およびポリペプチドの蛍光標識として有用であるものを提供すること。
【解決手段】本発明の化合物は、蛍光核酸分析（例えば、自動化ＤＮＡ配列決定）およびフラグメント分析、ハイブリダイゼーションアレイにおけるプローブハイブリダイゼーションの検出、核酸増幅産物の検出などの分野における特定の用途を見出している。本発明の別の局面は、エネルギー移動色素化合物を包含し、この化合物は、第一の波長において光を吸収し、かつそれに応答して励起エネルギーを放射し得る、ドナー色素；このドナー色素によって放射された励起エネルギーを吸収し、かつそれに応答して第二の波長において蛍光を発し得る、アクセプター色素；ならびに、このドナー色素およびアクセプター色素を連結するためのリンカー、を含有する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（Ｉ．発明の分野）
本発明は、一般に、蛍光ローダミン色素化合物に関する。より詳細には、本発明は、蛍光標識試薬として有用な、スルホン化ジアリールローダミン色素に関する。
【背景技術】
【０００２】
（ＩＩ．背景）
蛍光標識を利用する生物学的分析の非放射活性検出は、現代の分子生物学において重要な技術である。放射活性標識の必要性を排除することによって、安全性が高められ、そして試薬の処理に関連した環境影響およびコストは、大いに減少する。このような非放射活性蛍光検出を利用する方法の例としては、４色自動化ＤＮＡ配列決定、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション方法、ポリメラーゼ連鎖反応生成物の検出、免疫アッセイなどが挙げられる。
【０００３】
多くの適用において、空間的に重複した複数の分析物の非依存的な検出（例えば、単管の多重化ＤＮＡプローブアッセイおよび４色自動化ＤＮＡ配列決定方法）を達成するために、スペクトルにより識別可能な複数の蛍光標識を使用することは、有益である。多重化ＤＮＡプローブアッセイの場合、スペクトルにより識別可能な蛍光標識を使用することによって、反応管の数は減少され得、これによって、実験プロトコルが単純化され、適用に特異的な試薬キットの作製が容易になる。４色自動化ＤＮＡ配列決定の場合、多色蛍光標識によって、単一レーンにおいて複数塩基の分析が可能となり、これによって、単色方法を超えてスループットが増大し、レーン間の電気泳動の移動度変化に関連した不確実度が減少する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
スペクトルにより識別可能な複数の蛍光標識のセットを構築することは、問題である。多色蛍光検出は、色素標識の選択について（特に、単一の励起光源、電気泳動分離、および／または酵素を用いた処理を必要とする適用（例えば、自動化ＤＮＡ配列決定）について）、少なくとも６つの厳格な制限を課している。第一に、発光スペクトルがスペクトルにより分解される、構造的に類似の色素のセットを見出すことは、困難である。なぜなら、有機蛍光色素に関する代表的な発光バンドの半値幅が、約４０〜８０ナノメートル（ｎｍ）であるからである。第二に、たとえ非重複発光スペクトルを有する色素が同定されたとしても、それぞれの蛍光量子効率が低すぎる場合、このセットは依然として適切であり得ない。第三に、数種の蛍光色素が同時に使用される場合、同時励起は困難になる。なぜなら、色素の吸収バンドは、通常は、広範に分離されているからである。第四に、電荷、分子サイズ、および色素のコンホメーションは、分析物の電気泳動移動度に悪影響を与えてはいけいない。第五に、蛍光色素は、分析物を作製または操作するために使用される化学物質（例えば、ＤＮＡ合成溶媒およびＤＮＡ合成試薬、緩衝液、ポリメラーゼ酵素、リガーゼ酵素など）と適合性でなければならない。第六に、色素は、レーザ励起に抵抗するのに十分な光安定性を有さなければならない。
【０００５】
４色自動化ＤＮＡ配列決定の適用において適切な、現在利用可能な多重化色素セットは、これらのセットを構成する全ての色素から蛍光発光を十分に励起するために青色または青緑色のレーザ光（例えば、アルゴン−イオンレーザ）を必要とする。商業的な自動化ＤＮＡ配列決定システムにおいて青色または青緑色のレーザを使用することは、このようなレーザの高コストおよび制限された寿命に起因して、不利益である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（ＩＩＩ．要旨）
したがって、本発明は以下を提供する。
（１）以下の構造：
【化１】


を有する、スルホン化ジアリールローダミン化合物であって、ここで、 Ｒ^２、Ｒ^２’、Ｒ^１２およびＲ^１２’は、水素、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキルジイル、フェニル、置換フェニル、ベンジル、置換ベンジル、ビフェニル、置換ビフェニル、ナフチル、置換ナフチル、複素環、置換複素環、水溶性基または連結部分であり；そして、
Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５、Ｒ^１６、Ｒ^１７、Ｒ^１８、Ｒ^１９、Ｒ^２０、およびＲ^２１は、水素、フッ素、塩素、Ｃ_１〜Ｃ_８アルキル、カルボキシレート、スルフェート、スルホネート、アルキルスルホネート、アミノメチル（−ＣＨ_２ＮＨ_２）、アミノアルキル、４−ジアルキルアミノピリジニウム、ヒドロキシメチル（−ＣＨ_２ＯＨ）、メトキシ（−ＯＣＨ_３）、ヒドロキシアルキル（−ＲＯＨ）、チオメチル（−ＣＨ_２ＳＨ）、チオアルキル（−ＲＳＨ）、アルキルスルホン（−ＳＯ_２Ｒ）、アリールチオ（−ＳＡｒ）、アリールスルホン（−ＳＯ_２Ａｒ）、スルホンアミド（−ＳＯ_２ＮＲ_２）、アルキルスルホキシド（−ＳＯＲ）、アリールスルホキシド（−ＳＯＡｒ）、アミノ（−ＮＨ_２）、アンモニウム（−ＮＨ_３^＋）、アミド（−ＣＯＮＲ_２）、ニトリル（−ＣＮ）、Ｃ_１〜Ｃ_８アルコキシ（−ＯＲ）、フェノキシ、フェノール類、トリル、フェニル、アリール、ベンジル、複素環、ホスホネート、ホスフェート、第四級アミン、スルフェート、ポリエチレンオキシ、水溶性基、または連結部分であり；
但し、Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５、Ｒ^１６、Ｒ^１７、Ｒ^１８、Ｒ^１９、Ｒ^２０、およびＲ^２１のうちの少なくとも１つがスルホネートである、スルホン化ジアリールローダミン化合物。
（２）Ｒ^２、Ｒ^２’、Ｒ^１２およびＲ^１２’の少なくとも１つがＣ_１〜Ｃ_６アルキルスルホネートまたはＣ_４〜Ｃ_１０アリールスルホネートである、項目１に記載の化合物。
（３）前記アルキルジイル、置換フェニル、置換ベンジル、置換ビフェニル、置換複素環および置換ナフチルがスルホネートで置換されている、請求項１に記載の化合物。
（４）前記アルキルジイル、置換フェニル、置換ベンジル、置換ビフェニル、置換複素環および置換ナフチルがカルボキシルで置換されている、請求項１に記載の化合物。
（５）前記連結部分が、アジド、一置換の第一級アミン、二置換の第二級アミン、チオール、ヒドロキシル、ハライド、エポキシド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、カルボキシル、イソチオシアネート、塩化スルホニル、スルホネートエステル、シリルハライド、クロロトリアジニル、スクシンイミジルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、マレイミド、ハロアセチル、エポキシド、アルキルハライド、アリルハライド、アルデヒド、ケトン、アシルアジド、無水物、ヨードアセトアミドまたは活性化エステルである、項目１に記載の化合物。
（６）前記水溶性基が、カルボキシレート、スルホネート、ホスホネート、ホスフェート、第四級アミン、スルフェート、ポリヒドロキシル、または水溶性ポリマーである、項目１に記載の化合物。
（７）前記複素環が、ピロール、インドール、フラン、ベンゾフラン、チオフェン、ベンゾチオフェン、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−キノリル、３−キノリル、４−キノリル、２−イミダゾール、４−イミダゾール、３−ピラゾール、４−ピラゾール、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、シンノリン、フタラジン、キナゾリン、キノキサリン、３−（１，２，４−Ｎ）−トリアゾリル、５−（１，２，４−Ｎ）−トリアゾリル、５−テトラゾリル、４−（１−Ｏ，３−Ｎ）−オキサゾール、５−（１−Ｏ，３−Ｎ）−オキサゾール、４−（１−Ｓ，３−Ｎ）−トリアゾール、５−（１−Ｓ，３−Ｎ）−チアゾール、２−ベンゾオキサゾール、２−ベンゾチアゾール、４−（１，２，３−Ｎ）−ベンゾトリアゾール、またはベンゾイミダゾールである、項目１に記載の化合物。
（８）Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^６、Ｒ^８、Ｒ^１１、Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５、Ｒ^１６、Ｒ^１７、Ｒ^１８、Ｒ^１９、Ｒ^２０、およびＲ^２１が水素である、請求項１に記載の化合物。
（９）以下：
Ｃ−１２に結合した窒素とＣ−１２炭素およびＣ−１３炭素が一緒になる場合に４〜７員を有する第一の環構造を形成する、第一の架橋基；ならびに／または、
Ｃ−２に結合した窒素とＣ−１炭素およびＣ−２炭素が一緒になる場合に４〜７員を有する第二の環構造を形成する、第二の架橋基、を含有する、項目１に記載の化合物。
（１０）前記第一および第二の環構造の一方または両方が５員を有する、項目９に記載の化合物。
（１１）前記５員の環構造が１つのｇｅｍ二置換炭素を含む、請求項１０に記載の化合物。
（１２）前記ｇｅｍ置換基が（Ｃ_１〜Ｃ_８）アルキルである、請求項１１に記載の化合物。
（１３）前記ｇｅｍ置換基がメチルである、項目１１に記載の化合物。
（１４）前記５員環が連結部分または水溶性基で置換されている、項目１０に記載の化合物。
（１５）以下：
Ｃ−１２に結合した窒素とＣ−１１炭素およびＣ−１２炭素が一緒になる場合に５〜７員を有する第三の環構造を形成する、第三の架橋基；ならびに／または、
Ｃ−２に結合した窒素とＣ−２炭素およびＣ−３炭素が一緒になる場合に５〜７員を有する第四の環構造を形成する、第四の架橋基、を含有する、項目１に記載の化合物。
（１６）前記第三および第四の環構造の一方または両方が６員を有する、項目１５に記載の化合物。
（１７）前記６員環構造が１つのｇｅｍ二置換炭素を含む、項目１６に記載の化合物。
（１８）前記ｇｅｍ置換基が（Ｃ_１〜Ｃ_８）アルキルである、請求項１７に記載の化合物。
（１９）前記ｇｅｍ置換基がメチルである、項目１８に記載の化合物。
（２０）以下の構造：
【化２】


を有する、項目１に記載の化合物であって、ここで、
Ｌ^２およびＬ^１２は、アルキルジイル、置換フェニル、置換ベンジル、置換ビフェニル、置換複素環および置換ナフチルからなる群より選択されるリンカーである、化合物。
（２１）Ｃ−３炭素およびＣ−４炭素、Ｃ−４炭素およびＣ−５炭素、Ｃ−９炭素およびＣ−１０炭素、またはＣ−１０炭素およびＣ−１１炭素にわたって結合した縮合芳香族環（それらの置換形態を含む）を含有する、項目１に記載の化合物。
（２２）Ｃ−３炭素およびＣ−４炭素ならびにＣ−１０炭素およびＣ−１１炭素にわたって結合した縮合芳香族環（それらの置換形態を含む）を含有する、項目１に記載の化合物。
（２３）エネルギー移動色素であって、以下：
第一の波長において光を吸収し、かつそれに応答して励起エネルギーを放射し得る、ドナー色素；
該ドナー色素によって放射された該励起エネルギーを吸収し、かつそれに応答して第二の波長において蛍光を発し得る、アクセプター色素；および、 該ドナー色素および該アクセプター色素を連結するための、リンカー、を含み、ここで、
該ドナー色素およびアクセプター色素の少なくとも一方が、以下の構造：
【化３】


のうちの１つを有するスルホン化ジアリールローダミン化合物（それらの窒素置換形態およびアリール置換形態を含む）であり、但し、Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５、Ｒ^１６、Ｒ^１７、Ｒ^１８、Ｒ^１９、Ｒ^２０、およびＲ^２１の少なくとも１つがスルホネートである、エネルギー移動色素。
（２４）前記アクセプター色素がスルホン化ジアリールローダミン化合物であり、前記ドナー色素がシアニン、フタロシアニン、スクアライン、ボディピー、ベンゾフェノキサジン、フルオレセイン、ジベンゾローダミン、またはローダミン色素である、項目２３に記載のエネルギー移動色素。
（２５）前記アクセプター色素がスルホン化ジアリールローダミン化合物であり、前記ドナー色素が、該アクセプター色素およびポリヌクレオチドに連結した、フルオレセインまたはローダミンである、項目２４に記載のエネルギー移動色素。
（２６）前記ドナー色素が前記ポリヌクレオチドの５’末端に連結されている、項目２５に記載のエネルギー移動色素。
（２７）前記ドナー色素が前記ポリヌクレオチドの３’末端に連結されている、項目２５に記載のエネルギー移動色素。
（２８）前記ドナー色素が前記ポリヌクレオチドの核酸塩基に連結されており、ここで、該核酸塩基がプリンの場合、前記リンカーは、８位で結合しており；該核酸塩基が７−デアザプリンの場合、該リンカーは、７位または８位で結合しており；該核酸塩基がピリミジンの場合、該リンカーは、５位で結合している、項目２５に記載のエネルギー移動色素。
（２９）項目２３に記載のエネルギー移動色素であって、ここで、
前記リンカーは、以下の構造：
【化４】


を有し、ここで、
Ｚは、ＮＨ、ＳおよびＯからなる群より選択され；
Ｒ^２１は、前記ドナー色素に結合したＣ_１〜Ｃ_１２アルキルであり；
Ｒ^２２は、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキルジイル、少なくとも１つの不飽和結合を有する５員環および６員環、ならびにカルボニル炭素に結合した縮合環構造からなる群より選択される置換基であり；
Ｒ^２３は、該リンカーを前記アクセプター色素に結合する官能基を含む、エネルギー移動色素。
（３０）前記リンカーが以下の構造：
【化５】


を有し、ｎが２〜１０の範囲である、項目２９に記載の化合物。
（３１）Ｒ^２３が以下の構造：
【化６】


を有し、ここで、Ｒ^２４がＣ_１〜Ｃ_１２アルキルである、項目２９に記載のエネルギー移動色素。
（３２）前記リンカーが以下の構造：
【化７】


を有する、項目２３に記載のエネルギー移動色素。
（３３）前記リンカーが以下の構造：
【化８】


を有する、項目２３に記載のエネルギー移動色素。
（３４）前記リンカーが以下の構造：
【化９】


を有する、項目２３に記載のエネルギー移動色素。
（３５）前記リンカーが以下の構造：
【化１０】


を有し、ここで、Ｄがドナー色素であり、Ａがアクセプター色素であり、そしてｎが１または２である、項目２３に記載のエネルギー移動色素。
（３６）前記リンカーが前記スルホン化ジアリールローダミン化合物のＲ^２、Ｒ^２’、Ｒ^１２またはＲ^１２’で結合している、項目２３に記載のエネルギー移動色素。
（３７）前記ドナーまたは前記アクセプターに対するリンカーがＲ^２またはＲ^２’に結合しており、ポリヌクレオチドに対するリンカーがＲ^１２またはＲ^１２’に結合している、項目３６に記載のエネルギー移動色素。
（３８）以下の式：
【化１１】


を有する、標識されたヌクレオシドまたはヌクレオチドであって、ここで、
ＤＹＥは、以下の構造：
【化１２】


の１つを有する、スルホン化ジアリールローダミン化合物（その窒素置換形態およびアリール置換形態を含む）であり、但し、Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５、Ｒ^１６、Ｒ^１７、Ｒ^１８、Ｒ^１９、Ｒ^２０、およびＲ^２１の少なくとも１つがスルホネートであるか、または、
ＤＹＥは、以下：
第一の波長において光を吸収し、かつそれに応答して励起エネルギーを放射し得る、ドナー色素；
該ドナー色素によって放射された該励起エネルギーを吸収し、かつそれに応答して第二の波長において蛍光を発し得る、アクセプター色素；ならびに、
該ドナー色素および該アクセプター色素を連結するための、リンカー、を含む、エネルギー移動色素であり；ここで、
該ドナー色素および該アクセプター色素の少なくとも１つは、該スルホン化ジアリールローダミン化合物であり；
Ｂは、核酸塩基であり；
Ｌは、リンカーであり；
Ｒ^２５は、Ｈ、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、チオホスフェート、またはホスフェートアナログであり；そして、
Ｒ^２６およびＲ^２７は、単独である場合、各々独立して、Ｈ、ＨＯ、Ｆ、およびポリメラーゼ媒介性の標的指向性重合をブロックする部分であるか、または一緒になる場合に２’−３’−ジデヒドロリボースを形成する、標識されたヌクレオシドまたはヌクレオチド。
（３９）Ｂがウラシル、チミン、シトシン、アデニン、７−デアザアデニン、グアニン、および７−デアザグアノシンからなる群より選択される、項目３８に記載の標識されたヌクレオシドまたはヌクレオチド。
（４０）Ｌが、以下：
【化１３】


であり、ｎが０、１、または２である、項目３８に記載の標識されたヌクレオシドまたはヌクレオチド。
（４１）酵素学的に組み込み可能である、項目３８に記載の標識されたヌクレオシドまたはヌクレオチド。
（４２）ターミネーターである、項目３８に記載の標識されたヌクレオシドまたはヌクレオチド。
（４３）以下の構造：
【化１４】


を有する、項目４２に記載の標識されたヌクレオシドまたはヌクレオチドであって、ここで、
Ｒ^２６およびＲ^２７は、単独である場合、各々独立して、Ｈ、Ｆ、およびポリメラーゼ媒介性の標的指向性重合をブロックする部分であるか、または一緒になる場合に２’−３’−ジデヒドロリボースを形成する、標識されたヌクレオシドまたはヌクレオチド。
（４４）酵素学的に伸長可能である、項目３８に記載の標識されたヌクレオシドまたはヌクレオチド。
（４５）標識に共有結合したポリヌクレオチドを含有する、標識されたポリヌクレオチドであって、ここで、該標識は、以下の構造：
【化１５】


の１つを有するスルホン化ジアリールローダミン化合物（その窒素置換形態およびアリール置換形態を含む）であり、但し、Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５、Ｒ^１６、Ｒ^１７、Ｒ^１８、Ｒ^１９、Ｒ^２０、およびＲ^２１の少なくとも１つがスルホネートであるか、または、
第一の波長において光を吸収し、かつそれに応答して励起エネルギーを放射し得る、ドナー色素；該ドナー色素によって放射された該励起エネルギーを吸収し、かつそれに応答して第二の波長において蛍光を発し得る、アクセプター色素；ならびに、該ドナー色素および該アクセプター色素を連結するための、リンカー、を含有する、エネルギー移動色素であり；ここで、
該ドナー色素および該アクセプター色素の少なくとも１つは、該スルホン化ジアリールローダミン化合物である、標識されたポリヌクレオチド。
（４６）以下の式：
【化１６】


を含有する、項目４５に記載の標識されたポリヌクレオチドであって、ここで、
ＤＹＥは、スルホン化ジアリールローダミン化合物またはエネルギー移動色素であり；
Ｂは、核酸塩基であり；
Ｌは、リンカーであり；
Ｒ^２７は、Ｈ、ＯＨ、ハライド、アジド、アミン、アルキルアミン、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、アリル、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ、ＯＣＨ_３、またはＯＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２であり；そして、
Ｒ^２８およびＲ^２９は、単独である場合、各々独立して、Ｈ、ホスフェート、ヌクレオチド間ホスホジエステル、またはヌクレオチド間アナログであり；ここで、 該ポリヌクレオチドは、２〜１０００ヌクレオチドを含む、標識されたポリヌクレオチド。
（４７）Ｂがウラシル、チミン、シトシン、アデニン、７−デアザアデニン、グアニン、および７−デアザグアノシンからなる群より選択される、項目４６に記載の標識されたポリヌクレオチド。
（４８）以下の式：
【化１７】


を含有する、項目４６に記載の標識されたポリヌクレオチドであって、ここで、
ＤＹＥは、スルホン化ジアリールローダミン化合物またはエネルギー移動色素であり；
Ｂは、核酸塩基であり；
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、またはＳであり；
Ｌは、リンカーであり；
Ｒ^２７は、Ｈ、ＯＨ、ハライド、アジド、アミン、アルキルアミン、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、アリル、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ、ＯＣＨ_３、またはＯＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２であり；そして、
Ｒ^２８は、ヌクレオチド間ホスホジエステルまたはヌクレオチド間アナログであり；ここで、
該ポリヌクレオチドは、２〜１０００ヌクレオチドを含む、標識されたポリヌクレオチド。
（４９）Ｂがウラシル、チミン、シトシン、アデニン、７−デアザアデニン、グアニン、および７−デアザグアノシンからなる群より選択される、項目４８に記載の標識されたポリヌクレオチド。
（５０）Ｌが、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキルジイルまたは−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−であり、ここで、ｎが１〜１００である、項目４８に記載の標識されたポリヌクレオチド。
（５１）以下の構造：
【化１８】


の１つを有するスルホン化ジアリールローダミン化合物（その窒素置換形態およびアリール置換形態を含む）に共有結合したポリペプチドを含有する、標識されたポリペプチドであって、但し、Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５、Ｒ^１６、Ｒ^１７、Ｒ^１８、Ｒ^１９、Ｒ^２０、およびＲ^２１の少なくとも１つがスルホネートであるか、または、 第一の波長において光を吸収し、かつそれに応答して励起エネルギーを放射し得る、ドナー色素；該ドナー色素によって放射された該励起エネルギーを吸収し、かつそれに応答して第二の波長において蛍光を発し得る、アクセプター色素；ならびに、該ドナー色素および該アクセプター色素を連結するための、リンカー、を含有する、エネルギー移動色素に共有結合したポリペプチドであり；ここで、
該ドナー色素および該アクセプター色素の少なくとも１つは、該スルホン化ジアリールローダミン化合物である、標識されたポリペプチド。
（５２）以下の式：
【化１９】


を有する、ホスホラミダイト化合物であって、ここで、
ＤＹＥは、以下の構造：
【化２０】


の１つを有するスルホン化ジアリールローダミン化合物（その窒素置換形態およびアリール置換形態を含む）であり、但し、Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５、Ｒ^１６、Ｒ^１７、Ｒ^１８、Ｒ^１９、Ｒ^２０、およびＲ^２１の少なくとも１つがスルホネートであるか、または、
ＤＹＥは、以下：
第一の波長において光を吸収し、かつそれに応答して励起エネルギーを放射し得る、ドナー色素；
該ドナー色素によって放射された該励起エネルギーを吸収し、かつそれに応答して第二の波長において蛍光を発し得る、アクセプター色素；ならびに、
該ドナー色素および該アクセプター色素を連結するための、リンカー、を含有する、エネルギー移動色素であり；ここで、
該ドナー色素および該アクセプター色素の少なくとも１つは、該スルホン化ジアリールローダミン化合物であり、
Ｌは、リンカーであり；
別個になったＲ^３０およびＲ^３１は、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２シクロアルキル、およびアリールからなる群より選択されるか；または、窒素原子と一緒になったＲ^３０およびＲ^３１は、飽和窒素複素環を形成し；そして、
Ｒ^３２は、亜リン酸エステル保護基である、ホスホラミダイト化合物。
（５３）Ｒ^３２が、メチル、２−シアノエチル、および２−（４−ニトロフェニル）エチルからなる群より選択される、項目５２に記載のホスホラミダイト化合物。
（５４）Ｒ^３０およびＲ^３１が、各々イソプロピルである、項目５２に記載のホスホラミダイト化合物。
（５５）一緒になったＲ^３０およびＲ^３１がモルホリノである、請求項５２に記載のホスホラミダイト化合物。
（５６）ＬがＣ_１〜Ｃ_１２アルキルジイルである、項目５２に記載のホスホラミダイト化合物。
（５７）Ｌが、前記ＤＹＥのＲ^２、Ｒ^２’、Ｒ^１２またはＲ^１２’で結合している、項目５２に記載のホスホラミダイト化合物。
（５８）以下の構造：
【化２１】


を有する、項目５７に記載のホスホラミダイト化合物。
（５９）Ｌが、
【化２２】


であり、ｎが１〜１０の範囲である、項目５７に記載のホスホラミダイト化合物。
（６０）標識された基質を形成する方法であって、該方法は、請求項１に記載の化合物または項目２３に記載のエネルギー移動色素の連結部分と、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリペプチド、炭水化物、リガンド、粒子、および表面からなる群より選択される基質とを反応させ、これによって標識された基質を形成する工程を包含する、方法。
（６１）前記連結部分がＮ−ヒドロキシスクシンイミドである、請求項６０に記載の方法。
（６２）前記連結部分がホスホラミダイトである、項目６０に記載の方法。
（６３）前記粒子が、ナノ粒子、ミクロスフェア、ビーズ、またはリポソームである、項目６０に記載の方法。
（６４）前記表面がガラスである、項目６０に記載の方法。
（６５）標識されたポリヌクレオチドを合成する方法であって、該方法は、項目５２に記載のホスホラミダイト化合物をポリヌクレオチドにカップリングする工程を包含し、ここで、該ポリヌクレオチドは、固体支持体に結合し、これによって、標識されたポリヌクレオチドを形成する、方法。
（６６）標識されたプライマー伸長産物を作製する方法であって、該方法は、酵素学的に組み込み可能なヌクレオチドを用いてプライマー標識ハイブリッドを伸長させる工程を包含し、ここで、該プライマーまたは該ヌクレオチドは、項目１に記載の化合物または項目２３に記載のエネルギー移動化合物で標識され、これによって、該プライマーが伸長される、方法。
（６７）前記ヌクレオチドが酵素学的に伸長可能である、項目６６に記載の方法。
（６８）前記プライマーが標識されたポリヌクレオチドである、請求項６６に記載の方法であって、該標識されたポリヌクレオチドは、以下の式：
【化２３】


を含み、ここで、
ＤＹＥは、スルホン化ジアリールローダミン化合物またはエネルギー移動色素であり；
Ｂは、ウラシル、チミン、シトシン、アデニン、７−デアザアデニン、グアニン、および７−デアザグアノシンからなる群より選択される核酸塩基であり；
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、またはＳであり；
Ｌは、リンカーであり；
Ｒ^２７は、Ｈ、ＯＨ、ハライド、アジド、アミン、アルキルアミン、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、アリル、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ、ＯＣＨ_３、またはＯＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２であり；そして、
Ｒ^２８は、ヌクレオチド間ホスホジエステルまたはヌクレオチド間アナログであり；ここで、
該ポリヌクレオチドは、２〜１００ヌクレオチドを含有する、方法。
（６９）前記酵素学的に組み込み可能なヌクレオチドが、以下の式：
【化２４】


を有する標識されたヌクレオシドまたはヌクレオチドである、項目６６に記載の方法であって；ここで、
ＤＹＥは、スルホン化ジアリールローダミン化合物またはエネルギー移動色素であり；
Ｂは、ウラシル、チミン、シトシン、アデニン、７−デアザアデニン、グアニン、および７−デアザグアノシンからなる群より選択される核酸塩基であり；
Ｌは、リンカーであり；
Ｒ^２５は、Ｈ、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、チオホスフェート、またはホスフェートアナログであり；そして、
Ｒ^２６およびＲ^２７は、単独である場合、各々独立して、Ｈ、ＨＯ、およびＦである、方法。
（７０）ターミネーターヌクレオチドをさらに含む、項目６６に記載の方法。
（７１）Ｒ^２６およびＲ^２７が、単独である場合、各々独立して、
Ｈ、Ｆ、ポリメラーゼ媒介性の標的指向性プライマー伸長をブロックする部分であるか、または一緒になる場合に２’−３’−ジデヒドロリボースを形成する、項目６９に記載の方法。
（７２）ポリヌクレオチド配列決定の方法であって、該方法は、以下の工程：
第一、第二、第三、および第四のクラスのポリヌクレオチドの混合物を形成する工程であり、該クラスは、以下のようであり：
該第一のクラスの各ポリヌクレオチドは、３’末端ジデオキシアデノシンを含み、かつ第一の色素で標識されており；
該第二のクラスの各ポリヌクレオチドは、３’末端ジデオキシシチジンを含み、かつ第二の色素で標識されており；
該第三のクラスの各ポリヌクレオチドは、３’末端ジデオキシグアノシンを含み、かつ第三の色素で標識されており；そして、
該第四のクラスの各ポリヌクレオチドは、３’末端ジデオキシチミジンを含
み、かつ第四の色素で標識されており；ここで、
該第一、第二、第三、または第四の色素の１つ以上は、項目１に記載のスルホン化ジアリールローダミン化合物または項目２３に記載のエネルギー移動色素であり、他の色素は、スペクトルにより互いに分解可能である、工程；ならびに、
該ポリヌクレオチドを電気泳動によって分離する工程、を包含する、方法。
（７３）蛍光検出によって前記分離したポリヌクレオチドを検出する工程をさらに包含する、項目７２に記載の方法。
（７４）前記色素の蛍光スペクトルによって前記ポリヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドを同定する工程をさらに包含する、項目７２に記載の方法。
（７５）オリゴヌクレオチドのライゲーション方法であって、該方法は、２つのプローブを標的配列にアニーリングする工程、および、一方のプローブの５’末端と他方のプローブの３’末端との間にホスホジエステル結合を形成する工程を包含し；ここで、
プローブの１つまたは両方が、項目１に記載の化合物または項目２３に記載のエネルギー移動色素で標識されている、
方法。
（７６）フラグメントの分析方法であって、該方法は、サイズ依存性分離プロセスによって、標識されたポリヌクレオチドフラグメントを分離する工程、および、該分離プロセスの後に、該分離した標識されたポリヌクレオチドフラグメントを検出する工程を包含し；ここで、
該フラグメントが、項目１に記載の化合物または項目２３に記載のエネルギー移動色素で標識されている、方法。
（７７）前記フラグメントが移動度変更標識で標識されている、請求項７６に記載の方法。
（７８）前記フラグメントがライゲーションによって形成される、項目７６に記載の方法。
（７９）前記サイズ依存性分離プロセスが電気泳動であり、前記標識されたポリヌクレオチドフラグメントが蛍光によって検出される、項目７６に記載の方法。
（８０）増幅方法であって、該方法は、２つ以上のプライマーを標的ポリヌクレオチドにアニーリングする工程、ならびに、ポリメラーゼおよび酵素学的に伸長可能なヌクレオチドの混合物によって該プライマーを伸長させる工程を包含し；ここで、
該プライマーの少なくとも１つが、項目４５に記載の標識されたポリヌクレオチドである、方法。
（８１）増幅方法であって、該方法は、２つ以上のプライマーを標的ポリヌクレオチドにアニーリングする工程、ならびに、ポリメラーゼおよび酵素学的に伸長可能なヌクレオチドの混合物によって該プライマーを伸長させる工程を包含し；ここで、
該ヌクレオチドの少なくとも１つが、項目３８に記載の標識されたヌクレオチドである、方法。
（８２）増幅方法であって、該方法は、２つ以上のプライマーおよび蛍光色素消光剤プローブを標的核酸にアニーリングする工程、ならびに、ポリメラーゼおよび酵素学的に伸長可能なヌクレオチドの混合物によって該プライマーを伸長させる工程を包含し；ここで、
該プローブが、項目４５に記載の標識されたポリヌクレオチドである、方法。
（８３）ハイブリダイゼーション方法であって、該方法は、標的ポリヌクレオチドを固定化プローブにアニーリングする工程、ならびに、標的−プローブ複合体からの蛍光を検出する工程を包含し；ここで；
該標的ポリヌクレオチドが項目４５に記載の標識されたポリヌクレオチドであり、該固定化プローブが平坦表面に共有結合している、方法。
（８４）前記平坦表面がアドレス可能なアレイである、項目８３に記載の方法。
（８５）項目５に記載の連結部分を含むスルホン化ジアリールローダミン化合物およびポリヌクレオチドを備える、ポリヌクレオチドを標識するためのキット。
（８６）項目２３に記載のエネルギー移動色素およびポリヌクレオチドを備える、ポリヌクレオチドを標識するためのキット。
（８７）項目５２に記載のホスホラミダイト化合物およびポリヌクレオチドを備える、ポリヌクレオチドを標識するためのキット。
（８８）１つ以上の酵素学的に組み込み可能なヌクレオチドおよびプライマーを備える、標識したプライマー伸長産物を作製するためのキットであって、該プライマーが項目４５に記載の標識されたポリヌクレオチドである、キット。
（８９）１つ以上の酵素学的に組み込み可能なヌクレオチドおよびプライマーを備える、標識したプライマー伸長産物を作製するためのキットであって、該ヌクレオチドの少なくとも１つが項目３８に記載の標識されたヌクレオチドである、キット。
（９０）前記標識されたヌクレオチドがターミネーターである、請求項８９に記載のキット。
（９１）４つの異なるターミネーターを備える、項目９０に記載のキットであって、これらの１つは標的Ａで終結し、これらの１つは標的Ｇで終結し、これらの１つは標的Ｃで終結し、そしてこれらの１つは標的ＴまたはＵで終結する、キット。
（９２）スルホン化アミノナフタレン化合物およびアミノアントラセン化合物を合成する方法であって、該方法は、以下の工程：
アミノ基を保護基試薬で保護する工程；
該保護したアミノ化合物をクロルスルホン酸と反応させる工程；および、
該アミノ保護基を除去する工程、を包含する、方法。
また、第一の局面において、本発明は、以下の構造：
【０００７】
【化２５】


を有するスルホン化ジアリールローダミン色素化合物（その窒素置換形態およびアリール置換形態を含む）を包含する。Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５、Ｒ^１６、Ｒ^１７、Ｒ^１８、Ｒ^１９、Ｒ^２０、およびＲ^２１の少なくとも１つは、スルホネートである。
【０００８】
窒素置換基、Ｒ^２、Ｒ^２’、Ｒ^１２およびＲ^１２’は、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルスルホネートまたはＣ_４〜Ｃ_１０アリールスルホネートであり得る。特定の実施形態において、アルキルスルホネートは、−（ＣＨ_２）_ｎ−ＳＯ_３Ｈであり、ｎは、１〜６の整数であり、そしてアリールスルホネートは、以下：
【０００９】
【化２６】


であり、ここで、ｎは、０または１である。
【００１０】
他の実施形態において、窒素置換基、Ｒ^２、Ｒ^２’、Ｒ^１２およびＲ^１２’は、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルカルボキシレートまたはＣ_４〜Ｃ_１０アリールカルボキシレート：
【００１１】
【化２７】


（ここでｎは、０または１である）であり得る。
【００１２】
本発明の別の局面は、エネルギー移動色素化合物を包含し、この化合物は、第一の波長において光を吸収し、かつそれに応答して励起エネルギーを放射し得る、ドナー色素；このドナー色素によって放射された励起エネルギーを吸収し、かつそれに応答して第二の波長において蛍光を発し得る、アクセプター色素；ならびに、このドナー色素およびアクセプター色素を連結するためのリンカー、を含有し；ここで、このドナー色素およびアクセプター色素の少なくとも一方は、スルホン化ジアリールローダミン化合物である。
【００１３】
本発明の別の局面は、標識されたヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドであり、ここで、この標識は、スルホン化ジアリールローダミン化合物またはスルホン化ジアリールローダミン化合物を含有するエネルギー移動色素である。
【００１４】
本発明の別の局面は、標識試薬および基質を試薬で標識する方法であり、これらとしては、基質と共有結合を形成する、ホスホラミダイトまたはスルホン化ジアリールローダミン化合物の活性エステル連結部分が挙げられる。
【００１５】
本発明の別の局面は、標識した基質を形成するための方法であり、この方法は、基質を、スルホン化ジアリールローダミン化合物またはスルホン化ジアリールローダミン化合物を含有するエネルギー移動色素の連結部分と反応させる工程を包含する。
【００１６】
本発明の別の局面は、プライマー標的ハイブリッドを酵素学的に組み込み可能なヌクレオチドで伸長させることによって、標識プライマー伸長産物を作製する方法である。このプライマーまたはヌクレオチドは、スルホン化ジアリールローダミン化合物またはスルホン化ジアリールローダミン化合物を含有するエネルギー移動色素で標識され得る。
【００１７】
本発明の別の局面は、４つのクラスのポリヌクレオチドの混合物を形成することによる、ポリヌクレオチド配列決定方法であり、ここで、各クラスは、３’末端ヌクレオチドにおいて、スルホン化ジアリールローダミン化合物またはスルホン化ジアリールローダミン化合物を含有するエネルギー移動色素で標識されており、かつこの標識は、スペクトルにより分解可能である。
【００１８】
本発明の別の局面は、オリゴヌクレオチドライゲーション方法であり、この方法は、２つのプローブを標的配列にアニーリングして、一方のプローブの５’末端と他方のプローブの３’末端との間にホスホジエステル結合を形成することにより、ここで、プローブの１つまたは両方は、スルホン化ジアリールローダミン化合物またはスルホン化ジアリールローダミン化合物を含有するエネルギー移動色素で標識されている。
【００１９】
本発明の別の局面は、増幅方法であり、この方法は、２つ以上のプライマーを標的ポリヌクレオチドにアニーリングして、ポリメラーゼおよび酵素学的に伸長可能なヌクレオチドの混合物によってこのプライマーを伸長させることにより、ここで、このプライマーの少なくとも１つまたはこのヌクレオチドの１つは、スルホン化ジアリールローダミン化合物またはスルホン化ジアリールローダミン化合物を含有するエネルギー移動色素で標識されている。
【００２０】
本発明の別の局面は、試薬のキットであり、このキットは、スルホン化ジアリールローダミン化合物またはスルホン化ジアリールローダミン化合物を含有するエネルギー移動色素を備える。
【００２１】
本発明のこれらおよび他の特徴および利点は、以下の説明、図面、および添付の特許請求の範囲を参照して、より理解されるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、本発明の１−アミノ−３−ヒドロキシナフタレン中間体の合成のための例示的な合成経路を示す。
【図２】図２は、本発明の１−アミノ−３−ヒドロキシナフタレン中間体の合成のための例示的な合成経路を示す。
【図３】図３は、本発明の１−アミノ−３−ヒドロキシナフタレン中間体の合成のための例示的な合成経路を示す。
【図４】図４は、本発明のジベンゾローダミン色素化合物の合成のための一般化された合成経路を示す。
【図５】図５は、本発明のジベンゾローダミン色素化合物の合成のための例示的な合成経路を示す。
【図６】図６は、本発明のジベンゾローダミン色素化合物の合成のための例示的な合成経路を示す。
【図７】図７は、本発明の数種の例示的なジベンゾローダミン色素化合物の構造を示す。
【図８】図８は、化合物１８の合成を示す。
【図９】図９は、化合物５７〜６１の合成を示す。
【図１０】図１０は、化合物６７の合成を示す。
【図１１】図１１は、化合物７２の合成を示す。
【図１２】図１２は、化合物７６の合成を示す。
【図１３】図１３は、化合物８１の合成を示す。
【図１４】図１４は、化合物８２〜８４の合成を示す。
【図１５】図１５は、化合物８５の合成を示す。
【図１６】図１６は、化合物８９の合成を示す。
【図１７Ａ】図１７ａは、化合物９０の合成を示す。
【図１７Ｂ】図１７ｂは、化合物９３の合成を示す。
【図１８】図１８は、化合物９４〜９９を示す。
【図１９】図１９は、化合物１００〜１０５を示す。
【図２０】図２０は、化合物１０６〜１０９を示す。
【図２１】図２１は、スルホン化ジベンゾローダミン化合物（上段）、スルホン化ベンゾ−ナフトローダミン化合物（中段）、およびスルホン化ジナフトローダミン化合物（下段）を形成するための環化反応を示す。
【図２２Ａ】図２２ａは、スルホン化ジベンゾローダミン化合物１１０〜１１３を示す。
【図２２Ｂ】図２２ｂは、スルホン化ベンゾ−ナフトローダミン化合物１１４〜１１６を示す。
【図２２Ｃ】図２２ｃは、スルホン化ジナフトローダミン化合物１１７〜１２０を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
（Ｖ．例示的な実施形態の詳細な説明）
ここで、本発明の特定の実施形態に対して、参照が詳細になされており、これらの例は、添付の図面において例示されている。本発明は、例示した実施形態と共に記載されているが、本発明がこれらの実施形態に限定されることは意図されないことが理解される。これとは対照的に、本発明は、全ての代替物、変更、および等価物を含むことが意図されており、これらは、添付の特許請求の範囲によって規定されるような本発明の範囲内に含まれ得る。
【００２４】
（Ｖ．１．定義）
他に記載がなければ、以下の用語および句は、本明細書中で使用される場合、以下の意味を有することが意図される。
【００２５】
一連の色素を参照して、「スペクトル分解能」とは、色素の蛍光発光バンドが十分に明確であり（すなわち、十分に非重複である）、それぞれの色素が結合した試薬（例えば、ポリヌクレオチド）が、標準的な光検出システムを用いて（例えば、米国特許第４，２３０，５５８号、同第４，８１１，２１８号、またはＷｈｅｅｌｅｓｓら、２１〜７６頁、Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ａｃａｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８５）に記載されるシステムによって例示されるような、バンド通過フィルターおよび光電子増倍管のシステム、荷電連結デバイスおよび分光器などを使用して）、それぞれの色素によって発生される蛍光シグナルに基づいて識別され得ることを意味する。
【００２６】
「複素環」とは、１つ以上の環原子が炭素ではない（すなわち、ヘテロ原子である）、環式化合物を意味する。例示的な複素環としては、ピロール、インドール、フラン、ベンゾフラン、チオフェン、ベンゾチオフェン、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−キノリル、３−キノリル、４−キノリル、２−イミダゾール、４−イミダゾール、３−ピラゾール、４−ピラゾール、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、シンノリン、フタラジン（ｐｔｈａｌａｚｉｎｅ）、キナゾリン、キノキサリン、３−（１，２，４−Ｎ）−トリアゾリル、５−（１，２，４−Ｎ）−トリアゾリル、５−テトラゾリル、４−（１−Ｏ，３−Ｎ）−オキサゾール、５−（１−Ｏ，３−Ｎ）−オキサゾール、４−（１−Ｓ，３−Ｎ）−チアゾール、５−（１−Ｓ，３−Ｎ）−チアゾール、２−ベンズオキサゾール、２−ベンゾチアゾール、４−（１，２，３−Ｎ）−ベンゾトリアゾール、およびベンズイミダゾールが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
「リンカー」とは、共有結合、または標識をポリヌクレオチドに共有結合するか、もしくは１つの標識を別の標識に共有結合する原子鎖を含む、化学的部分を意味する。
【００２８】
「連結部分」とは、別の分子と反応して共有結合、または連鎖を形成し得る、化学的反応性基、置換基または部分（例えば、求核原子または求電子）を意味する。
【００２９】
用語「標識」とは、本明細書中で使用される場合、基質（例えば、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドまたはヌクレオチド５’−トリホスフェート）に結合し得、かつ以下の（ｉ）〜（ｖ）のように機能する任意の部分を意味する：（ｉ）検出可能なシグナルを提供する；（ｉｉ）第二の標識と相互作用して第一または第二の標識によって提供される検出可能なシグナル（例えば、ＦＲＥＴ）を変更する；（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーション（すなわち、二重鎖形成）を安定化する；（ｉｖ）電荷、疎水性、形状、または他の物理的パラメータによって移動度（例えば、電気泳動移動度または細胞透過性）に影響を与える；あるいは、（ｖ）捕獲部分（例えば、親和性、抗体／抗原、またはイオン錯体）を提供する。
【００３０】
「基質」とは、本発明の色素化合物が結合する実体である。基質としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：（ｉ）ポリヌクレオチド、（ｉｉ）ヌクレオシドおよびヌクレオチド、（ｉｉｉ）ポリペプチド、（ｉｖ）炭水化物、（ｖ）リガンド、ならびに（ｖｉ）前述の（ｉ）〜（ｖ）の任意のアナログ。
【００３１】
「置換（された）」とは、本明細書中で使用される場合、１つ以上の水素原子が１つ以上の非水素原子、官能基または部分で置換されている分子をいう。例えば、非置換窒素は、−ＮＨ_２であり、一方、置換窒素は、−ＮＨＣＨ_３である。例示的な置換基としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ハロ（例えば、フッ素および塩素）、（Ｃ_１〜Ｃ_８）アルキル、スルフェート、スルホネート、スルホン、アミノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、フェノキシ、芳香族、フェニル、多環式芳香族、複素環、水溶性基、および連結部分。
【００３２】
「多環式芳香族」とは、複数の環構造を有する芳香族炭化水素を意味し、これには、ビアリールおよび縮合ベンゼノイド炭化水素が挙げられる。ビアリールは、２つ以上の環が単結合によって一緒に連結しているベンゼノイド化合物である。このクラスの親系は、ビフェニルである。縮合ベンゼノイド化合物は、環の各対が２つの炭素を共有するような様式においてオルト位にて一緒に縮合した２つ以上のベンゼン環によって特徴付けられる。この群の最も単純なメンバーは、２つの環を有するナフタレン、および３つの環を有するアントラセンおよびフェナントレンである。
【００３３】
「アルキル」とは、親アルカン、アルケン、またはアルキンの単一の炭素原子から１つの水素原子を除去することによって誘導される、飽和または不飽和の、分枝鎖、直鎖、または環式の炭化水素基を意味する。代表的なアルキル基は、１〜１２個の飽和および／または不飽和の炭素からなり、これらとしては、メチル、エチル、プロピル、ブチルなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３４】
「アルコキシ」とは、−ＯＲ（ここで、Ｒは、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルである）を意味する。
【００３５】
「アルキルジイル」とは、飽和または不飽和の、分枝鎖、直鎖または環式の、１〜２０個の炭素原子の炭化水素基であって、親アルカン、アルケンまたはアルキンの同じかまたは２つの異なる炭素原子から２つの水素原子を除去することによって誘導される、２つの一価のラジカル中心（ｒａｄｉｃａｌ ｃｅｎｔｅｒ）を有する炭化水素基を意味する。代表的なアルキルジイル基としては、１，２−エチルジイル、１，３−プロピルジイル、１，４−ブチルジイルなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３６】
「アリール」とは、親芳香族環系の単一炭素原子から１つの水素原子を除去することによって誘導される、６〜２０個の炭素原子の、一価の芳香族炭化水素基を意味する。代表的なアリール基としては、ベンゼン、置換ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニルなどから誘導される基が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３７】
「アリールジイル」とは、共役共鳴電子系、および親アリール化合物の２つの異なる炭素原子から２つの水素原子を除去することによって誘導される少なくとも２つの一価のラジカル中心を有する、６〜２０個の炭素原子の、不飽和環式基または多環式炭化水素基を意味する。
【００３８】
「置換アルキル」、「置換アルキルジイル」、「置換アリール」および「置換アリールジイル」とは、それぞれ、１つ以上の水素原子が各々独立して別の置換基で置換されている、アルキル、アルキルジイル、アリールおよびアリールジイルを意味する。代表的な置換基としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：−Ｘ、−Ｒ、−Ｏ⁻、−ＯＲ、−ＳＲ、−Ｓ⁻、−ＮＲ_２、−ＮＲ_３、＝ＮＲ、−ＣＸ_３、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、−ＮＯ、−ＮＯ_２、＝Ｎ_２、−Ｎ_３、ＮＣ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ、−Ｓ（Ｏ）_２Ｏ⁻、−Ｓ（Ｏ）_２ＯＨ、−Ｓ（Ｏ）_２Ｒ，−ＯＳ（Ｏ）_２ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−ＯＰ（Ｏ）Ｏ_２ＲＲ、−Ｐ（Ｏ）Ｏ_２ＲＲ、−Ｐ（Ｏ）（Ｏ⁻）_２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）_２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−Ｃ（Ｓ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ⁻、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ、−Ｃ（Ｓ）ＮＲＲ、−Ｃ（ＮＲ）ＮＲＲ（ここで、各Ｘは、独立してハロゲンであり、各Ｒは、独立して−Ｈ、アルキル、アリール、複素環、または連結基である）。
【００３９】
「ヌクレオチド間アナログ」とは、以下のようなオリゴヌクレオチドのリン酸エステルアナログを意味する：（ｉ）アルキルホスホネート（例えば、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキルホスホネート（特に、メチルホスホネート））；（ｉｉ）ホスホラミダイト；（ｉｉｉ）アルキルホスホトリエステル（例えば、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキルホスホトリエステル）；（ｉｖ）ホスホロチオエート；および（ｖ）ホスホロジチオエート。ヌクレオチド間アナログとしてはまた、非ホスフェートアナログが挙げられ、ここで、糖／ホスフェートのサブユニットは、非ホスフェート含有骨格構造によって置換されている。非ホスフェートオリゴヌクレオチドアナログの１つの型は、アミド結合（例えば、ＰＮＡ（Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９１）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｂｙ ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ａ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｐｏｌｙａｍｉｄｅ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７〜１５００）と通常称される、２−アミノエチルグリシンユニット）を有する。
【００４０】
「核酸塩基」とは、相補的な核酸塩基または核酸塩基アナログ（例えば、プリン、７−デアザプリン、またはピリミジン）との対形成においてワトソン−クリック型水素結合を形成し得る窒素含有複素環式部分を意味する。代表的な核酸塩基は、天然に存在する核酸塩基であるアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、および天然に存在する核酸塩基のアナログ（例えば、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、７−デアザ−８−アザアデニン（Ｋｕｔｙａｖｉｎ，米国特許第５，９１２，３４０号）、イノシン、ネブラリン（ｎｅｂｕｌａｒｉｎｅ）、ニトロピロール、ニトロインドール、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、偽ウリジン（ｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ）、偽シトシン、偽イソシトシン、５−プロピニルシトシン、イソシトシン、イソグアニン、７−デアザグアニン、２−チオピリミジン、６−チオグアニン、４−チオチミン、４−チオウラシル、Ｏ^６−メチルグアニン、Ｎ^６−メチルアデニン、Ｏ^４−メチルチミン、５，６−ジヒドロチミン、５，６−ジヒドロウラシル、４−メチルインドール、およびエテノアデニンである（Ｆａｓｍａｎ（１９８９）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３８５〜３９４頁，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌ）。
【００４１】
「ヌクレオシド」は、リボース糖のＣ−１’炭素に連結した核酸塩基を含む化合物を意味する。このリボースは、置換されていても置換されていなくてもよい。置換されたリボース糖としては、１つ以上の炭素原子（例えば、３’炭素原子）が１つ以上の同じかまたは異なる、−Ｒ、−ＯＲ、−ＮＲＲまたはハロゲン基（ここで、各Ｒ基は、独立して、水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルまたはＣ_５〜Ｃ_ｌ４アリールである）で置換されたリボースが挙げられるが、これらに限定されない。リボースとしては、リボース、２’−デオキシリボース、２’，３’−ジデオキシリボース、３’−ハロリボース、３’−フルオロリボース、３’−クロロリボース、３’−アルキルリボース（例えば、２’−Ｏ−メチル、４’−α−アノマーヌクレオチド、１’−α−アノマーヌクレオチド、ならびに２’−４’−連結および他のロックド（ｌｏｃｋｅｄ）二環式糖修飾物）（Ｉｍａｎｉｓｈｉ ＷＯ ９８／２２４８９；Ｉｍａｎｉｓｈｉ ＷＯ ９８／３９３５２；Ｗｅｎｇｅｌ ＷＯ ９９／１４２２６）が挙げられる。核酸塩基がプリン（例えば、ＡまたはＧ）である場合、リボース糖は、核酸塩基のＮ^９位に結合される。核酸塩基がピリミジン（例えば、Ｃ、ＴまたはＵ）である場合、ペントース糖は、核酸塩基のＮ^１位に結合される（ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ，（１９９２）ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，第２版，Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）。
【００４２】
「ヌクレオチド」とは、モノマー単位としてまたは核酸内の、ヌクレオシドのリン酸エステルを意味する。ヌクレオチドは、ときどき、特にリボース糖の構造的特徴を示すために、「ＮＴＰ」、または「ｄＮＴＰ」および「ｄｄＮＴＰ」として記載される。「ヌクレオチド５’三リン酸」は、５’位に三リン酸エステル基を有するヌクレオチドをいう。三リン酸エステル基は、種々の酸素の硫黄での置換がを含み得る（例えば、α−チオヌクレオチド５’三リン酸）。
【００４３】
「酵素学的に組み込み可能な」とは、ヌクレオチドが、ポリメラーゼ酵素の作用を介して、新生ポリヌクレオチド鎖の末端（例えば、３’末端）に、酵素学的に組み込まれることが可能であるヌクレオチドの特性を意味する。
【００４４】
「ターミネーター」とは、生じるポリヌクレオチド鎖へのヌクレオチドのそれ以降の組み込みを妨害し、それによってポリメラーゼ媒介伸長を停止させる、酵素学的に組み込み可能なヌクレオチドを意味する。代表的なターミネーターは、３’−ヒドロキシル置換基を欠き、そしてターミネーターとしては、２’，３’−ジデオキシリボース、２’，３’−ジデヒドロリボース、および２’，３’−ジデオキシ、３’−ハロリボース（例えば、３’−フルオロ）が挙げられる。あるいは、リボフラノースアナログ（例えば、アラビロース）が、使用され得る。例示的なヌクレオチドターミネーターとしては、以下が挙げられる：２’，３’−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル、β−Ｄ−アラビノフラノシル、３’−デオキシ−β−Ｄ−アラビノフラノシル、３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル、および２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオロ−β−Ｄ−リボフラノシル（Ｃｈｉｄｇｅａｖａｄｚｅ（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２：１６７１〜１６８６；およびＣｈｉｄｇｅａｖａｄｚｅ（１９８５）ＦＥＢ．Ｌｅｔｔ．，１８３：２７５〜２７８）。ヌクレオチドターミネーターとしてはまた、リバーシブルヌクレオチドターミネーターが挙げられる（Ｍｅｔｚｋｅｒ（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２（２０）：４２５９）。
【００４５】
「酵素学的に伸長可能な」は、ポリヌクレオチドの末端において酵素学的に組み込み可能であり、かつ得られる伸長ポリヌクレオチドが、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログの引き続く組み込みを行い得る、ヌクレオチドの特性である。
【００４６】
用語「標的配列」および「標的ポリヌクレオチド」とは、相補的なポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの対象であるポリヌクレオチド配列（例えば、プライマーまたはプローブ）を意味する。この配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらのアナログ（それらの組み合わせを含む）から構成され得る。
【００４７】
「水溶性基」とは、水溶液中での本発明の化合物の溶解度を増加させる置換基を意味する。例示的な水溶性基としては、第四級アミン、スルフェート、スルホネート、カルボキシレート、ホスホネート、ホスフェート、ポリエーテル、ポリヒドロキシル、およびボロネートが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、交換可能に使用され、ヌクレオチドモノマーの一本鎖ポリマーおよび二本鎖ポリマーを意味し、これらとしては、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合の連鎖によって連結されている、２’−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）およびリボヌクレオチド（ＲＮＡ）、またはヌクレオチド間アナログ、および付随する対イオン（例えば、Ｈ^＋、ＮＨ_４^＋、トリアルキルアンモニウム、Ｍｇ^２＋、Ｎａ^＋など）が挙げられる。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドから完全に構成されても、それらのキメラ混合物から構成されてもよい。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド間アナログ、核酸塩基アナログおよび糖アナログから構成され得る。ポリヌクレオチドのサイズは、これらがしばしばオリゴヌクレオチドと呼ばれる場合、代表的には、数個のモノマー単位（例えば、５〜４０）〜数千個のモノマーヌクレオチド単位の範囲である。他に記載されない限り、ポリヌクレオチド配列が示される場合はいつでも、このヌクレオチドが左から右に５’→３’の順であり、そして「Ａ」がデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」がデオキシシチジンを示し、「Ｇ」がデオキシグアノシンを示し、そして「Ｔ」がチミジンを示すことが、理解される。
【００４９】
「ローダミン色素」とは、以下の多環式の一般構造：
【００５０】
【化２８】


を含む色素（それらの任意および全ての置換バージョンを含む）をいう。
【００５１】
（Ｖ．２ １−アミノ−３−メトキシナフタレンおよび１−アミノ−３−メトキシアントラセンの中間体）
１−アミノ−３−メトキシナフタレン（式Ｉ）および１−アミノ−３−メトキシアントラセン（式ＩＩ）化合物のクラスは、スルホン化ジアリールローダミン色素の合成における中間体として有用である。式Ｉおよび式ＩＩの化合物はさらに、それらのアリール置換形態および窒素置換形態を含む（本明細書中に提供される全ての分子構造は、示される正確な電子構造だけを含むのではなく、それらの全ての共鳴構造、プロトン化状態および付随する対イオンも含むことに注意のこと）。
【００５２】
【化２９】


式ＩおよびＩＩの化合物の１つの実施形態において、Ｃ−１２に結合した窒素ならびにＣ−１２炭素およびＣ−１３炭素は、４〜７員を有する第一の環構造を形成し得、そして／またはＣ−１２に結合した窒素ならびにＣ−１１炭素およびＣ−１２炭素は、５〜７員を有する第二の環構造を形成する。この第一および第二の環構造は、５員を有し得、ここで、この５員環構造は、１つのｇｅｍ二置換炭素を含み得る。このｇｅｍ置換基は、アルキル（例えば、メチル）であり得る。別の実施形態において、この５員環は、連結部分で置換されている。この実施形態において、Ｃ−１２に結合した窒素ならびにＣ−１２炭素およびＣ−１３炭素は、４〜７員を有する第一の環構造を形成し、そして／またはＣ−１２に結合した窒素ならびにＣ−１１炭素およびＣ−１２炭素は、５〜７員を有する第二の環構造を形成する。
【００５３】
窒素置換基としては、アルキル、フェニル、芳香族、複素環、多環式芳香族、水溶性基、連結部部分、およびそれらの置換形態が挙げられ得る。窒素置換基は、アルキル、フェニル、またはそれらの置換形態であり得、ここで、置換基は、連結部分、スルホネートまたは水溶性基であり得る。例示的な水溶性基は、カルボキシレート、スルホネート、ホスホネート、ホスフェート、第四級アミン、スルフェート、ポリヒドロキシル、および水溶性ポリマーである。１つの実施形態において、窒素置換基は、−Ｌ−Ｒであり、ここで、Ｌは、任意のリンカーであり、Ｒは、連結部分または水溶性基であり得る。特定の実施形態において、Ｌは、以下：
【００５４】
【化３０】


であり、ここで、ｎは、１〜８の範囲である。
【００５５】
式Ｉおよび式ＩＩの化合物は、１つ以上のアリール位（例えば、Ｃ−８〜Ｃ−１１、およびＣ−１３）に１つ以上の置換基を含み得る。置換基としては、ホルミル、ヒドロキシル、フッ素、塩素、アルキル、スルフェート、スルホネート、スルホン、スルホンアミド、スルホキシド、アミノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、フェノキシ、芳香族、フェニル、多環式芳香族、水溶性基、複素環、および連結部分（それらの置換形態を含む）が挙げられ得る。１つの実施形態において、この化合物は、Ｃ−９炭素およびＣ−１０炭素にわたって、またはＣ−１０炭素およびＣ−１１炭素にわたって結合した縮合芳香族環（それらの置換形態（ここで、置換基はスルホネート基である）を含む）を含有する。
【００５６】
式ＩおよびＩＩの非ホルミル化バーションは、以下に詳述されるスルホン化ジアリールローダミン色素を形成するための、環化反応における中間体である。
【００５７】
本発明の代表的な１−アミノ−３−ヒドロキシナフタレン化合物および１−アミノ−３−ヒドロキシアントラセン化合物は、図１〜３（すなわち、化合物４、化合物９、化合物１５、化合物１７、化合物２２、化合物２７および化合物２９）；図１０〜１３（すなわち、化合物６２、化合物６３、化合物６８、化合物７３および化合物８０）；ならびに図１６〜２０（すなわち、化合物８６〜１０９）に示される。
【００５８】
当業者はまた、特に、周囲のｐＨに依存して、本発明の化合物が多数の異なるプロトン化状態で存在し得ることを認識している。本明細書中に提供される構造式は、数種の可能なプロトン化状態のうちの１種の化合物のみを示しているが、これらの構造は単に例示であり、本発明は任意の特定のプロトン化状態に制限されない、すなわち、任意および全てのプロトン化形態の化合物が本発明の範囲内に包含されることが意図されることが理解される。
【００５９】
本発明の化合物は、複数の正電荷または負電荷を有し得る。本発明の色素の正味の電荷は、正または負のいずれかであり得る。色素に付随する対イオンは、代表的には、化合物が得られる合成方法および／または単離方法によって決定される。代表的な対イオンとしては、アンモニウム、ナトリウム、カリウム、リチウム、ハライド、アアセテート、トリフルオロアセテートなど、およびこれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。任意の付随する対イオンの同定は、本発明の重要な特徴ではなく、そして本発明は、対イオンの任意の型に付随する色素を包含することが理解される。さらに、化合物が種々の異なる形態で存在する場合、本発明は、対イオンに付随する色素の形態（例えば、乾燥塩）だけでなく、対イオンに付随しない形態（例えば、水溶液または有機溶液）も包含することが意図される。
【００６０】
上記発明の種々の局面は、多重化蛍光検出のために有用な公知の蛍光色素化合物に対する、予測できない、驚くべき、以下の重要な利点の１つ以上を達成する：（１）目的の色素化合物は、約６３０ｎｍの波長を使用する低コストの赤色レーザによって、効率的に励起され得る；（２）目的の色素化合物の発光スペクトルは、窒素置換基および／またはアリール置換基の型および位置のモニター変化によって調節され得、類似の吸収特性を有するが、なお分解可能な蛍光発光スペクトルを有する色素のセットを作製するのを可能にする；（３）目的の色素化合物は、有利な蛍光特性を損なうことなく、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに容易に結合され得る；（４）目的の色素化合物は、狭い発光バンド幅を有する（すなわち、この発光バンド幅は、約７０ｎｍよりも低い、最大発光強度の半分の全幅を有する）；（５）目的の色素化合物は、緩衝化水溶液に非常に可溶性であるが、高量子収率を維持する；（６）目的の色素化合物は、相対的に光安定性である；そして、（７）目的の色素化合物は、相対的に高い吸光係数（すなわち、約５０，０００よりも大きい）を有する。
【００６１】
いくつかの合成方法が、上記の１−アミノ−３−ヒドロキシナフタレン化合物の合成のために利用可能であり、合成される特定の化合物の環構造の性質および窒素置換基の性質に依存する、種々の方法が好ましい。
【００６２】
１−置換アミノ−３−ヒドロキシナフタレン化合物（例えば、１−シエチルアミノ−３−ヒドロキシナフタレン（４））の合成に適切な、第一の合成方法が、図１に示される。この第一の方法において、３−メトキシ−１−ヒドロキシナフタレン（１）を乾燥トリエチルアミンおよびトリフルオロメタンスルホン酸無水物と反応させて、粗製の３−メトキシナフタレン−１−トリフレート（２）が形成される。次いで、トリフレート（２）を、パラジウムで触媒したトリフレート／アミンのカップリングを用いて、アミン（例えば、第二級アミン（例えば、ジエチルアミン））と反応させて、置換アミン化合物（３）が形成される。次いで、化合物（３）は、三臭化ホウ素脱保護手順を使用して脱保護されて、１−アミノ−３−ヒドロキシナフタレン生成物（例えば、１−ジエチルアミノ−３−ヒドロキシナフタレン（４））が生成される。この合成の例は、以下の実施例１に提供される。
【００６３】
ベンゾインドリン化合物（例えば、Ｎ−フェニル−３，３−ジメチル−４−ヒドロキシベンゾインドリン（９））の合成に適した第二の合成方法もまた、図１に示される。この方法において、３−メトキシナフタレン−１−トリフレート（２）は、パラジウムで触媒したトリフレートカップリング反応を使用して第一級アミン（例えば、アニリン）から誘導体化され、第二級アミン（例えば、１−アニリン−３−メトキシナフタレン（５））が得られる。この第二級アミン（５）は、酸塩化物（例えば、ハロ塩化アセチル）を用いてアセチル化され、二置換アミド（例えば、１−アミド−３−メトキシナフタレン（６））が得られる。この第三級アミン（６）は、ルイス酸を触媒したフリーデル−クラフツ環化手順を使用して（例えば、ＡｌＣｌ_３を使用して）環化され、化合物（７）が得られる。次いで、化合物（７）は、例えば、（水素化アルミニウムリチウム）ＬＡＨを使用して還元されて化合物（８）が得られる。三臭化ホウ素脱保護手順によってメトキシ基を脱保護した後、ベンゾインドリン（例えば、Ｎ−フェニル−３，３−ジメチル−４−ヒドロキシベンゾインドリン（９））が得られる。この合成の例は、以下の実施例２に提供される。
【００６４】
Ｎ−置換−５−ヒドロキシ（テトラヒドロ）ベンゾキノリン化合物（例えば、Ｎ−メチル−５−ヒドロキシ（テトラヒドロ）ベンゾキノリン（１５））の合成に適した第三の合成方法が、図２に示される。この方法において、化合物１０は、ピペリジン触媒を含有するピリジンを使用してマロン酸と縮合することによって、メトキシナフトアルデヒドから合成される。次いで、化合物１０は、ＬＡＨ還元の前に水素で還元され、そして、トリフルオロメタンスルホン酸無水物と反応させてトリフレート（１１）が得られる。このトリフレート（１１）は、ＮａＮ_３と反応され、化合物（１２）が得られる。化合物（１２）を、ルイス酸（例えば、ＡｌＣｌ_３）と錯化して還流し、環化ベンゾキノリン誘導体（１３）が得られる。次に、窒素置換基を加える（例えば、窒素を、従来のアルキル化手順を使用してアルキル化する（例えば、ベンゾキノリン誘導体（１３）を、ｎ−ブチルリチウムおよびアルキル化剤（例えば、ＭｅＩ）と反応させて化合物（１４）が得られるか、またはプロパンスルホン（ｐｒｏｐａｎｅ ｓｕｌｔｏｎｅ）と反応させて化合物（１６）が得られる））。次いで、メトキシ基が、三臭化ホウ素手順によって除去されて、Ｎ−アルキルベンゾキノリン誘導体（例えば、化合物１５または化合物１７）が得られる。この合成の例は、以下の実施例３に提供される。
【００６５】
Ｎ−置換−２，２，４−トリメチル−５−ヒドロキシベンゾキノリン化合物（例えば、Ｎ−メチル−２，２，４−トリメチル−５−ヒドロキシ−（テトラヒドロ）ベンゾキノリン（２２））の合成に適した第四の合成方法が、図３に示される。この方法において、Ｒｏｓｏｗｓｋｙ（１９６５）Ｊｏｕｒ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３０：１８３２、および本明細書中の参考文献の手順に従って、１−アミノ−３−メトキシナフタレン（１８）を、ヨウ素によって触媒されたアセトンと反応させ、次いで、飽和Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_３でクエンチして、ベンゾキノリン化合物（１９）が得られる。次いで、化合物（１９）を、一般的なアルキル化手順に従ってアルキル化剤（例えば、ＭｅＩ）でアルキル化し、化合物２０が得られる。このアルキル化した化合物（２０）を、Ｐｄ／Ｃによって触媒されたＨ_２で還元して、Ｎ−メチルメトキシキノリン中間体（２１）が得られ、続いて、一般的な三臭化ホウ素手順によってメトキシ基を脱保護して、Ｎ−置換−２，２，４−トリメチル−５−ヒドロキシベンゾキノリン化合物（例えば、Ｎ−メチル−２，２，４−トリメチル−５−ヒドロキシ−（テトラヒドロ）ベンゾキノリン（２２）が得られる。この合成の例は、以下の実施例４に提供される。
【００６６】
Ｎ−置換−３，３−ジメチル−４−ヒドロキシベンゾインドリン化合物（例えば、Ｎ−メチル−３，３−ジメチル−４−ヒドロキシベンゾインドリン（２７））の合成に適した第五の合成方法もまた、図３に提供される。この方法において、１−アミノ−３−メトキシナフタレン（１８）は、酸塩化物（例えば、２−ブロモ−２−メチルプロピオニルクロライド）でアセチル化されて、化合物（２３）が得られる。化合物（２３）は、ＡｌＣｌ_３と反応させることによって環化されて、化合物（２４）が得られる。次いで、化合物（２４）は、ＬＡＨで還元されて、３，３−ジメチル−４−メトキシベンゾインドリン（２５）が得られる。次いで、化合物（２５）は、アルキル化剤（例えば、ヨウ化メチル）でアルキル化されて、Ｎ−メチル−３，３−ジメチル−４−メトキシベンゾインドリン（例えば、化合物（２６））が得られる。三臭化ホウ素によるメトキシ基脱保護の後に、化合物（２７）が得られる。この合成の例は、実施例５に提供される。
【００６７】
アミノアントラセン化合物の合成に適した第六の合成方法が、図１７ａに示される。この方法において、アミノアントラセン化合物（メトキシナフトインドリン）９０は、１，３−ジメトキシアントラセン１２１を脱メチル化し、ヒドロキシル基のうちの１つをモノメチル化して調製して１２３を得、トルフレート１２４を形成し、そして、ヒドラジンによって置換して１２５を得る。イソブチルアルデヒドとのヒドラゾンの形成、フッシャーインドリン環化（Ｆｉｓｃｈｅｒ ｉｎｄｏｌｉｎｅ ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ）およびシアノホウ化水素ナトリウムでの還元によって９０が得られる（実施例１５）。
【００６８】
アミノナフタレン化合物およびアミノアントラセン化合物は、スルホン化剤（例えば、クロロスルホン酸）でスルホン化され得る。例えば、アミノナフタレン化合物８６は、初めに、Ｎ−スルホンアミオ化合物８７（図１６、実施例１４）のように窒素保護され、次いで、低温度にて、クロロスルホン酸を含有する酢酸およびジクロロメタンと反応させ、脱保護してスルホン化化合物８９が得られる。同様に、アミノアントラセン化合物９０は、トルフルオロアセチル化化合物９１のように保護され、次いで、スルホン化され、そして脱保護されて、９３（図１７ｂ、実施例１５）が得られる。中間体８９および９３は、スルホン化ジアリールローダミン化合物を合成する際に有用である。
【００６９】
（Ｖ．３ スルホン化ジアリールローダミン色素化合物）
新規なクラスのスルホン化ジアリールローダミン色素化合物は、以下の式ＩＩＩａｂｃに示されるような一般構造（それらのアリール置換形態および窒素置換形態を含む）を有する分子標識として有用である。
【００７０】
【化３１】


式ＩＩＩａｂｃにおいて、少なくとも１つのアリール置換基は、スルホネートである。少なくともアリール−スルホネート基の存在によって、ジアリールローダミン化合物に、予想外の有利な特性（例えば、調節された溶解度、電気泳動移動度、およびスペクトル増強）が与えられ得る。
【００７１】
式ＩＩＩａｂｃの化合物の１つの実施形態において、この化合物は、第一結合基および／または第二結合基を含有する。第一結合基は、Ｃ−１２に結合した窒素ならびにＣ−１２炭素およびＣ−１３炭素が一緒になる場合に、４〜７員を有する第一の環構造を形成し得、第二結合基は、Ｃ−２に結合した窒素ならびにＣ−１炭素およびＣ−２炭素が一緒になる場合に、４〜７員を有する第二の環構造を形成する。この第一および第二の環構造の一方または両方が、５員を有し得る。別の実施形態において、この５員環構造は、１つのｇｅｍ二置換炭素を含み、ここで、このｇｅｍ置換基は、アルキル（例えば、メチル）であり得る。代替の実施形態において、この５員環は、連結基で置換されている。別の実施形態において、この５員環は、以下に記載される１つ以上の窒素置換基を含む。架橋環構造を有する例示的なスルホン化ジアリールローダミン化合物としては、以下が挙げられる：
【００７２】
【化３２】


Ｌ^２およびＬ^１２は、アルキルジイル、置換フェニル、置換ベンジル、置換ビフェニル、および置換ナフチルを含むリンカーである。
【００７３】
本発明のなお別の実施形態において、式ＩＩＩａｂｃの化合物は、１つ以上の窒素置換基、Ｒ^２、Ｒ^２’、Ｒ^１２およびＲ^１２’を含む。このような置換基は、以下からなる群より選択される：アルキル、フェニル、芳香族、複素環、多環式芳香族、水溶性基、連結基、およびそれらの置換形態。また、窒素置換基は、アルキル、フェニル、多環式芳香族、またはそれらの置換形態であり、ここで、例示的な置換基としては、連結基および水溶性基が挙げられる。
【００７４】
本発明の、この第二の局面の別の実施形態において、式ＩＩＩａｂｃの化合物は、第三結合基および／または第四結合基を含有する。第三結合基は、Ｃ−１２に結合した窒素ならびにＣ−１１炭素およびＣ−１２炭素が一緒になる場合に、５〜７員を有する第三の環構造を形成し得、第四結合基は、Ｃ−２に結合した窒素ならびにＣ−２炭素およびＣ−３炭素が一緒になる場合に、５〜７員を有する第四の環構造を形成する。この第三および第四の環構造の一方または両方が、６員を有し得る。この６員環構造は、１つのｇｅｍ二置換炭素を含み得、ここで、このｇｅｍ置換基は、アルキル（例えば、メチル）であり得る。
【００７５】
本発明の別の実施形態において、式ＩＩＩａｂｃの化合物は、１つ以上の炭素（Ｃ−１、Ｃ−３〜Ｃ−６、Ｃ−８〜Ｃ−１１、およびＣ１４〜Ｃ−２１）にてアリール置換基を含む。例示的なアリール置換基としては、以下が挙げられる：水素、フッ素、塩素、アルキル、スルフェート、スルホネート、スルホン、スルホンアミド、スルホキシド、アミノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、フェノキシ、芳香族、フェニル、多環式芳香族、水溶性基、複素環、および連結部分（それらの置換形態を含む）。少なくとも１つのアリール−置換基は、スルホネートである。別の実施形態において、式ＩＩＩａｂｃの化合物は、Ｃ−３炭素およびＣ−４炭素、Ｃ−４炭素およびＣ−５炭素、Ｃ−９炭素およびＣ−１０炭素、またはＣ−１０炭素およびＣ−１１炭素にわたって結合した縮合芳香族環（それらの置換形態を含む）を含む。この縮合芳香族環は、Ｃ−３炭素およびＣ−４炭素ならびにＣ−１０炭素およびＣ−１１炭素、またはＣ−９炭素およびＣ−１０炭素ならびにＣ−４炭素およびＣ−５炭素（それらの置換形態を含む）にわたって結合し得る。
【００７６】
本発明のこの第二の局面に従う数種の例示的な色素化合物は、以下に示される：図７および図１０〜１３（すなわち、化合物４１〜４７および化合物６７、化合物７２、化合物７６および化合物８１）；ならびに、図２１、図２２ａ、図２２ｂ、図２２ｃ（すなわち、予測外の有利なスペクトル特性を有する化合物１１０〜１２０）。吸光率、量子収量および輝度は、非スルホン化アナログジアリールローダミン色素化合物と比較して、スルホン化ジアリールローダミン色素化合物１１１、１１４、１１８、１１９、１２０の全てにおいて増加する。
【００７７】
（アリールスルホン化／非アリールスルホン化）
【００７８】
【化３３】




全ての測定を、８Ｍの尿素および１×Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ緩衝液中で行った。
【００７９】
上表は、非アリール−スルホネートアナログに対する、５つの例示的な色素のうちの２つのアリール−スルホネート基によって生じる吸光率、量子収量および輝度の差を測定している。輝度増加は、吸光率および量子収量を掛けることによって算出される。
【００８０】
一般的に、本発明のスルホン化ジアリールローダミン色素は、以下（図４）のように合成される：無水物誘導体（例えば、無水フタル酸）を、１−アミノ−３−メトキシ中間体３１および３２、ならびにルイス酸（例えば、ＺｎＣｌ_２）と混合する（ここで、化合物３０のＲ置換基は、同じであっても異なっていてもよいが、好ましくは、同じである）。例示的なＲ置換基としては、アセチレン、アルキル、フェニル、複素環、およびそれらの置換形態が挙げられるがこれらに限定されない。この混合物を、融解が観察されるまで、手短に加熱する。溶媒（例えば、１，２−ジクロロベンゼン）を、この反応混合物に加え、そして、不均一な混合物を、約１３０℃〜約１８０℃まで加熱する。粗製反応混合物を冷却し、そして、順相のフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、色素化合物３３を得る。無水物が置換フタル酸無水物の一部（例えば、化合物３４）である場合、２つの異性体が形成される（図５）。これらの異性体３５および３６は、ＰＴＬＣによって分離される。異性学的に（ｉｓｏｍｅｒｉｃａｌｌｙ）純粋な色素は、順相ＴＬＣおよび逆相ＴＬＣでの単一スポットによって、ならびにそれらのＵＶ／可視吸収スペクトルおよびそれらの長い波長蛍光励起スペクトルおよび発光スペクトルによって同定される。
【００８１】
非対称性色素化合物の合成のための代替の手順が、図６に示される。このプロセスにおいて、無水物誘導体（例えば、フタル酸無水物３４）を、乾燥ニトロベンゼンと混合して、加熱する。この混合物を、室温まで冷却し、無水ＡｌＣｌ_３を、攪拌しながら加える。続いて、１−アミノ−３−メトキシ中間体３１を、攪拌しながら加え、この反応物を加熱する。この反応物を冷却し、ＥｔＯＡｃ中に懸濁する。有機層を、飽和ＮＨ_４Ｃｌ、ブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、そして溶媒を減圧下で除去する。得られたケトン中間体３７／３８を精製し、そして、フラッシュクロマトグラフィーまたは再結晶化によって、異なる異性体３７および３８に分離する（Ｃ−１４およびＣ−１７における置換基が同じであり、かつＣ−１５およびＣ−１６における置換基が同じである場合を除く）。異性学的に純粋なケトン中間体３７または３８のメトキシ基を、一般的な三臭化ホウ素脱保護手順に従って除去する。これによって、化合物３８は、アミノヒドロキシナフタレンケトン中間体３９を与える。次いで、アミノヒドロキシナフタレンケトン中間体３９を、１−アミノ−３−メトキシ中間体３２と反応させる。この反応物を冷却して、ＰＴＬＣによってさらに精製され得る、異性学的に純粋でかつ非対称的に置換された生成物４０が得られる。
【００８２】
本発明のジベンゾローダミン色素を合成し、かつＣ−７位で置換されていない色素（例えば、ピロニン色素）の合成に適している別の方法において、色素は、Ｏ−保護してＮ−置換された３−ヒドロキシベンゾインドリン化合物から生成されるヒドロキシベンゾインドリン中間体から合成され、続いて、酸素保護基（例えば、メチル基）を脱保護し、脱メチル化試薬（例えば、塩化アルミニウム）によって脱保護し、そして順相クロマトグラフィーによる精製によって単離する。この合成に従って、色素分子の半分に対応するヒドロキシベンゾインドリン中間体を、最初にホルミル化剤（例えば、メチルホルムアニリド／ＰＯＣｌ_３）と反応し、その後、ホルミル化したヒドロキシベンゾインドリン中間体を、色素分子の半分に対応する異なる（または、同じ）ヒドロキシベンゾインドリン中間体と直接反応させる。この反応を、酸性脱水条件下（例えば、ＰＯＣｌ_３）で行い、そして例えば、１２０〜１６０℃に加熱して、粗製カルボン酸エステル誘導体化ベンゾピロニン色素が得られる。いくつかの場合において、メトキシベンゾインドリン中間体を、メチル基を脱保護する前にホルミル化し、次いで、第２当量のヒドロキシインドリンと反応させてピロニン色素を得る前に、このホルミル化したメトキシインドリン誘導体のメチル基を脱保護して、ホルミル化したヒドロキシベンゾインドリン中間体を得る。純粋な色素を、水性ワークアップおよび順相クロマトグラフィーの後に単離する。次いで、中間体色素のカルボン酸エステルを、酸（例えば、ＨＢｒ）で加水分解して、水性ワークアップおよび順相クロマトグラフィーの後に遊離酸色素誘導体を得る。その後、Ｎ−フェニル置換色素を、スルホン化剤（例えば、ＣｌＳＯ_３Ｈ）でスルホン化して、水性ワークアップおよび順相クロマトグラフィーの後に最終色素が得られ得る。
【００８３】
（Ｖ．４ スルホン化ジアリールローダミン色素を組み込むエネルギー移動色素）
本発明は、式ＩＩＩａｂｃのスルホン化ジアリールローダミン色素化合物を組み込むエネルギー移動色素化合物を含む。一般的に、本発明のエネルギー移動色素化合物は、第一の波長において光を吸収し、かつそれに応答して励起エネルギーを放射する、ドナー色素、このドナー色素によって放射された励起エネルギーを吸収し、かつそれに応答して第二の波長において蛍光を発し得る、アクセプター色素を含む。ドナー色素は、リンカーによってアクセプターに結合しており、このリンカーは、ドナー色素とアクセプター色素との間の効率的なエネルギー移動を促進するのに有効である（Ｌｅｅ「Ｅｎｅｒｇｙ−ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｙｅｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ」、米国特許第５，８００，９９６号； Ｌｅｅ「Ｅｎｅｒｇｙ−ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｙｅｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ」、米国特許第５，９４５，５２６号；Ｍａｔｈｉｅｓ「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌａｂｅｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ ｉｎ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ」；米国特許第５，６５４，４１９号；Ｌｅｅ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２８１６−２２）。あるいは、ドナー色素およびアクセプター色素は、基質上の異なる結合部位において標識され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、５’末端においてドナー色素で標識され得、３’末端においてアクセプター色素で標識され得る。ポリペプチドは、カルボキシル末端においてドナー色素で標識され得、内部システインまたはリジン側鎖においてアクセプター色素で標識され得る（Ｋｏｍｏｒｉｙａ「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｕｓｅ ｔｈｅｒｅｏｆ」、米国特許第５，６０５，８０９号）。本発明のエネルギー移動色素において、基質を標識する、少なくとも１つのドナー色素またはアクセプター色素は、スルホン化ジアリールローダミン色素化合物である。エネルギー移動色素を含有する他の色素は、任意の蛍光部分であり得、この蛍光部分は、スルホン化ジアリールローダミン色素化合物（フルオレセイン、ロドル（ｒｈｏｄｏｌ）、およびローダミンを含む）を用いてエネルギー移動プロセスを行う。他の色素としては、蛍光色素（例えば、シアニン、フタロシアニン、スクアライン（ｓｑｕａｒａｉｎｅ）、ボディピー（ｂｏｄｉｐｙ）、ベンゾフェノキサジン、フルオレセイン、ジアリールローダミン、またはローダミン）のクラスが挙げられる。
【００８４】
エネルギー移動色素は、混合物中の複数の標識された基質を同時に検出（例えば、ＤＮＡ配列決定）する際に使用するのに利点を有する。各色素が通常の波長において強力な吸収を有するように、単一のドナー色素が、エネルギー移動色素のセットにおいて使用され得る。次いで、エネルギー移動セットのアクセプター色素を変更することによって、アクセプター色素は、それらそれぞれの発光最大値によってスペクトルにより分解され得る。エネルギー移動色素はまた、非エネルギー移動色素よりも大きい有効なストークスシフトを提供する。このストロークシフトは、励起最大値（ドナー色素が最大に光を吸収する波長）と発光最大値（アクセプターが最大に光を発する波長）との間で異なる。
【００８５】
一般的に、ドナー色素とアクセプター色素との間のリンカーは、以下の構造：
【００８６】
【化３４】


を有し、ここで、Ｚは、ＮＨ、ＳおよびＯからなる群より選択され；Ｒ^２１は、ドナー色素に結合されたＣ_１〜Ｃ_１２アルキルであり；Ｒ^２２は、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキルジイル、少なくとも１つの不飽和結合を有する、５員環および６員環、ならびにカルボニル炭素に結合した縮合環構造からなる群より選択される置換基であり；そして、Ｒ^２３は、アクセプター色素にリンカーを結合している官能基を含む。Ｒ^２２は、５員環または６員環（例えば、シクロペンテン、シクロヘキセン、シクロペンタジエン、シクロヘキサジエン、フラン、チオフラン、ピロール、イソピロール、イソアゾール、ピラゾール、イソイミダゾール、ピラン、ピロン、ベンゼン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、オキサジン、インデン、ベンゾフラン、チオナフテン、インドールおよびナフタレン）であり得る。詳細には、このリンカーは、以下の構造：
【００８７】
【化３５】


を有し得、ここで、ｎは、２〜１０の範囲である。
【００８８】
一般的にまた、Ｒ^２３は、以下の構造：
【００８９】
【化３６】


を有し得、ここで、Ｒ^２４は、Ｃ_１〜Ｃ_１２である。
【００９０】
１つの実施形態において、ドナー色素とアクセプター色素との間のリンカーは、このリンカーにある程度の構造的な剛性を与える官能基（例えば、アルケン、ジエン、アルキン、少なくとも１つの不飽和結合を有する５員環および６員環、または縮合環構造）を含む（米国特許第５，８２１，３５６号；同第５，７７０，７１６号；同第５，９４８，６４８号；同第６，０９６，８７５号）。エネルギー移動色素のドナー色素およびアクセプター色素は、以下の例示的な構造：
【００９１】
【化３７】


を有するリンカーによって結合されており、ここで、Ｄはドナー色素であり、Ａはアクセプター色素であり、ｎは１または２である。フェニル環は、スルホネート基、ホスホネート基、および他の荷電した基のような基で置換され得る。
【００９２】
エネルギー移動色素のドナー色素とアクセプター色素との間のリンカーの結合部位は、ドナー色素およびアクセプター色素のうちの一方または両方が本発明の化合物である、任意の位置であり得る。例示的な結合部位としては、Ｒ^２、Ｒ^２’、Ｒ^１２およびＲ^１２’が挙げられる。
【００９３】
エネルギー移動色素化合物は、リンカーによって基質に共有結合している。リンカーは、結合、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキルジイルまたはＣ_６〜Ｃ_２０アリールジイルであり得る。このリンカーは、アミド、カルバメート、尿素、チオ尿素、ホスフェート、ホスホネート、スルホネート、ホスホロチオエートなどを含む官能基を有し得る。例示的なリンカーとしては、１，２−エチルジイルおよび１，６−ヘキシジイルが挙げられる。エネルギー移動色素と基質との間のリンカーの結合部位は、ドナー色素およびアクセプター色素のうちの一方または両方が本発明のスルホン化ジアリールローダミン色素である、エネルギー移動色素上の任意の位置であり得る。基質がヌクレオシドまたはヌクレオチドである場合、エネルギー移動色素に対する１つの結合部位は、核酸塩基上にある。この核酸塩基がプリンである場合、リンカーは、８位で結合し得る。核酸塩基が７−デアザプリンである場合、リンカーは、７位または８位で結合し得る。核酸塩基がピリミジンである場合、リンカーは、５位で結合し得る。基質がオリゴヌクレオチドである場合、結合部位は、３’末端および５’末端を含む。他のオリゴヌクレオチド結合部位としては、ヌクレオチド間ホスフェートまたはホスフェートアナログ結合、あるいは、糖上の位置（２’または４’）が挙げられる。基質がポリペプチド（ペプチドまたはタンパク質）である場合、結合部位は、アミノ末端およびカルボキシル末端、ならびにリジン残基のアミノ基を含む。
【００９４】
（Ｖ．５ 標識方法）
本発明は、標識試薬を含み、ここで、スルホン化ジアリールローダミン化合物は、基質と反応するように反応性形態である（すなわち、連結部分を有する）。本発明はまた、本発明の化合物（式ＩＩＩａｂｃ）で標識された（すなわち、結合体化された）基質を含む。基質は、実質的に任意の分子であり得るか、または本発明の色素が結合体化され得る物質（例としては、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリペプチド、炭水化物、リガンド、実質的に鏡像異性的に純粋な化合物、粒子、表面、脂質、固体支持体、有機ポリマーおよび無機ポリマー、ならびにそれらの組み合わせおよび集合（例えば、染色体、核、生きた細胞（例えば、細菌または他の微生物、哺乳動物細胞、組織など））などが挙げられるがこれらに限定されない）であり得る。粒子としては、ナノ粒子、微粒子、ビーズ、またはリポソームが挙げられ得る。表面は、ガラスまたは他の非多孔性平面材料であり得る。本発明の化合物は、種々の手法（疎水性引力、イオン引力、および共有結合を含む）によって、必要に応じて、リンカーを介して基質に結合体化される。
【００９５】
標識は、代表的には、当該分野で周知の結合体化方法（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，（１９９６）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．ｐｐ．４０−５５，６４３−７１）を使用して、連結部分、基質、および適切な溶媒を有するスルホン化ジアリールローダミンを混合することによって生じ、その後、標識された基質、結合体を、任意の非結合開始材料または望ましくない副産物から分離する。結合体は、後に使用するために、乾燥状態でまたは溶液中で保存され得る。
【００９６】
スルホン化ジアリールローダミンは、置換基位置の１つで連結部分を含み得る。この連結部分は、代表的には、求電子性官能基であり、これは、基質上の求核性官能基と反応することによって共有結合を形成し得る。求核性官能基としては、例えば、アルコール、アルコキシド、アミン、ヒドロキシルアミン、およびチオールが挙げられ得る。あるいは、連結部分としては、基質上の求電子性基と反応する求核性官能基が挙げられ得る。連結基の例としては、アジド、一置換の第一級アミン、二置換の第二級アミン、チオール、ヒドロキシル、ハライド、エポキシド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、カルボキシル、イソチオシアネート、塩化スルホニル、スルホン酸エステル、シリルハライド、クロロトリアジニル、スクシンイミジルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、マレイミド、ハロアセチル、エポキシド、アルキルハライド、アリルハライド、アルデヒド、ケトン、アシルアジド、無水物、ヨードアセトアミドおよび活性化エステルが挙げられる。
【００９７】
１つの連結部分は、スルホン化ジアリールローダミン化合物のカルボキシル基のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）である（図１４）。この化合物のＮＨＳエステル形態は、標識試薬である。色素のＮＨＳエステルは、予備形成され得、単離され得、精製され得、そして／または特徴付けされ得るか、あるいは、インサイチュで形成されて、基質の求核性基（例えば、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリペプチドなど）と反応され得る（Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，Ｍ．（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．３：２〜１３）。代表的には、色素のカルボキシル形態は、以下の（１）〜（３）のいくつかの組み合わせと反応させることによって活性化され、色素のＮＨＳエステル（例えば、図１４の化合物８２、化合物８３、化合物８４および図１５の化合物８５）が得られる：（１）カルボジイミド試薬（例えば、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）、ＤＩＰＣＤＩ（ジイソプロピルカルボジイミド））、またはウロニウム（ｕｒｏｎｉｕｍ）試薬（例えば、ＴＳＴＵ（Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート）、ＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＨＡＴＵ（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート））；（２）活性化剤（例えば、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ））；ならびに、（３）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド。
【００９８】
いくつかの場合において、スルホン化ジアリールローダミン化合物および基質は、１つの工程において、化合物をインサイチュでの活性化し、そして基質と反応させて、スルホン化ジアリールローダミン−基質結合体を形成することによって結合され得る。他の活性化剤およびカップリング剤としては、以下が挙げられる：ＴＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１−１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＴＦＦＨ（Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラメチルウロニウム２−フルオロヘキサフルオロホスフェート）、ＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジニノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＥＥＤＱ（２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロ−キノリン）、ＤＣＣ、ＤＩＰＣＤＩ、ＭＳＮＴ（１−（メシチレン−２−スルホニル）−３−ニトロ−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール）、およびアリールスルホニルハライド（例えば、塩化トリイソプロピルベンゼンスルホン酸）。
【００９９】
別の反応性連結基は、スルホン化ジアリールローダミン化合物のホスホラミダイト形態である。ホスホラミダイト色素試薬は、本発明の色素で標識されるオリゴヌクレオチドの自動化合成のために、特に有用である。最も好都合なことに、ホスホラミダイト色素試薬は、固相合成の通常の過程の間に固体支持体に結合されたオリゴヌクレオチドに結合し得る。オリゴヌクレオチドは通常、ホスホラミダイト方法（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．およびＢｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．「Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ」、米国特許第４，４１５，７３２号；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．およびＭａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．「Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」、米国特許第４，４５８，０６６号；Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．およびＩｙｅｒ，Ｒ．（１９９２）「Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｂｙ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４８：２２２３〜２３１１）によって、固体支持体上で合成される。
【０１００】
ホスホラミダイトスルホン化ジアリールローダミン試薬は、ヌクレオシドまたは非ヌクレオシドであり得る。ホスホラミダイト試薬の非ヌクレオシド形態は、一般式ＩＶ：
【０１０１】
【化３８】


を有し、ここで、ＤＹＥは、スルホン化ジアリールローダミンＩＩＩａｂｃ（エネルギー移動色素を含む）の保護形態または非保護形態である。Ｌは、リンカーである。別個になっているＲ^３０およびＲ^３１は、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_４〜Ｃ_１０アリール、および１０個までの炭素原子を含むシクロアルキルであるか、またはホスホラミダイト窒素原子と一緒になったＲ^３０およびＲ^３１は、飽和窒素複素環を形成し得る。Ｒ^３２は、オリゴヌクレオチドの望ましくない伸長を防止する、亜リン酸エステル保護基である。一般的に、Ｒ^３２は、オリゴヌクレオチド合成条件に対して安定であり、オリゴヌクレオチドまたは色素の完全性に悪影響を及ぼさない試薬を用いて、合成オリゴヌクレオチド生成物から除去され得る。Ｒ^３２は、以下であり得る：（ｉ）メチル、（ｉｉ）２−シアノエチル；−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ、または（ｉｉｉ）２−（４−ニトロフェニル）エチル；−ＣＨ_２ＣＨ_２（ｐ−ＮＯ_２Ｐｈ）。ホスホラミダイト試薬の実施形態は、以下を含む：（ｉ）Ｒ^３０およびＲ^３１は、各々イソプロピルである；（ｉｉ）一緒になったＲ^３０およびＲ^３１は、モルホリノである；（ｉｉｉ）Ｌは、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキルである；（ｉｖ）Ｒ^３２は、２−シアノエチルである；そして（ｖ）ＤＹＥは、リンカーによってＲ^１８またはＲ^１９に結合している。あるいは、リンカーＬは、以下であり得る：
【０１０２】
【化３９】


ここで、ｎは、１〜１０の範囲である。ホスホラミダイト試薬ＩＶの例は、以下の構造：
【０１０３】
【化４０】


を有する。
【０１０４】
ホスホラミダイト色素試薬ＩＶは、本発明のスルホン化ジアリールローダミン化合物での基質の標識に影響を与える。基質がオリゴヌクレオチドである場合、色素は、３’から５’方向への代表的な合成の結果として、オリゴヌクレオチドの５’末端で結合しているか、または５’から３’方向への合成方法が行われる場合、オリゴヌクレオチドの３’末端で結合している（Ｗａｇｎｅｒ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １６：１６５７−６０）。試薬ＩＶは、例えば、３’末端を介して固体支持体に結合しているポリヌクレオチドに連結され得る。ヌクレオシドおよび非ヌクレオシドの他のホスホラミダイト色素試薬により、オリゴヌクレオチドの他の部位（例えば、３’末端、核酸塩基、ヌクレオチド間結合、糖）での標識が可能になる。核酸塩基、ヌクレオチド間結合、および糖部位での標識により、蛍光色素での内部標識および複数標識が可能になる。
【０１０５】
本発明のスルホン化ジアリールローダミン化合物は、求核官能基を三価の亜リン酸化試薬で亜リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｉｔｙｌａｔｉｏｎ）する、任意の公知の方法によって、非ヌクレオシドのホスホラミダイト標識試薬に転換され得る。例えば、化合物がカルボキシル基（例えば、１１０〜１２０）を含む場合、カルボキシルは、例えば、ＮＨＳに対して活性化され得、そして、６−アミノ−１−ヘキサノールでアミド化され得る。得られたヒドロキルは、ビス（ジイソプロピルアミノ）シアノエチルホスファイトまたはクロロジイソプロピルアミノシアノエチルホスファイトで亜リン酸化されて、ホスホラミダイト色素標識試薬ＩＶが得られ得る（Ｔｈｅｉｓｅｎ（１９９２）「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ Ｎｏ．２７，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，９９〜１００頁）。あるいは、化合物のカルボキシル基は、ヒドロキシルに還元され、亜リン酸化され得る。
【０１０６】
ホスホラミダイト試薬ＩＶは、穏やかな酸活性化の下でヒドロキシル基（例えば、固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドの５’末端のＯＨ）と反応して、ヌクレオチド間亜リン酸基（これは、次いで、ヌクレオチド間ホスフェート基に酸化される）を形成する。いくつかの例において、スルホン化ジアリールローダミン化合物は、官能基を含有し得、この官能基は、ホスホラミダイト試薬を合成する間または分子（例えば、オリゴヌクレオチド）を標識するために続いて使用する間のいずれかで、保護を必要とする。使用される保護基は、官能基の性質に依存し、そして当業者に明らかである（Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．およびＷｕｔｓ，Ｐ． Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）。一般的に、使用される保護基は、５’−ヒドロキシル保護基（例えば、ジメトキシトリチル）を除去するためにオリゴヌクレオチドの合成において通常使用される酸性条件下（例えば、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸）で安定でなければならなず、かつ合成オリゴヌクレオチドを固体支持体から脱保護および／または切断するために使用される塩基性条件下（例えば、水酸化アンモニウム、水性メチルアミン）で不安定でなければならない。
【０１０７】
ポリペプチド、抗体、ならびにアミノ酸およびアミノ酸アナログから構成される他の生体高分子は、本発明のスルホン化ジアリールローダミン化合物との結合体化によって共有結合的に標識され得る。代表的に、この化合物は、求電子形態（例えば、ＮＨＳ反応性連結基）であり、この化合物は、ペプチドの求核基（例えば、アミノ末端、またはアミノ酸（例えば、リジン）のアミノ側鎖）と反応する。あるいは、この色素は、求核形態（例えば、アミノ反応性連結基またはチオール反応性連結基）であり得、この色素は、ペプチドの求電子基（例えば、カルボキシル末端のＮＨＳまたはアミノ酸のカルボキシル側鎖）と反応し得る。標識されたポリペプチドは、好ましくは、細胞表面および細胞内成分との相互作用の際にそれらの特異的な結合特性および認識特性を維持する。色素として作用するスルホン化ジアリールローダミン化合物により、結合事象または認識事象を局在化、可視化および定量化するための検出エレメントが提供される。ポリペプチドはまた、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を一緒に行う、２つの部分（蛍光レポーターおよび消光剤）で標識され得る。この蛍光レポーターは、インタクトなポリペプチドの消光剤部分によって部分的にかまたは有意にクエンチされ得る。ペプチダーゼまたはプロテアーゼによってポリペプチドを切断する際に、蛍光の検出可能な増加が測定され得る（Ｋｎｉｇｈｔ，Ｃ．（１９９５）「Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２４８：１８〜３４）。
【０１０８】
（Ｖ．６ 標識されたヌクレオチド）
１つのクラスの標識された基質は、本発明のスルホン化ジアリールローダミン化合物で標識される、ヌクレオシドおよびヌクレオチドの結合体を含む。このような標識されたヌクレオシドおよびヌクレオチドは、酵素学的合成によって形成されるポリヌクレオチド（例えば、ＰＣＲ増幅、サンガー型ポリヌクレオチド配列決定、およびニック翻訳反応の状況において使用される、標識されたヌクレオチドの５’トリホスフェート）を標識するために、特に有用である。
【０１０９】
ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、糖部分または核酸塩基部分上の部位で標識され得る。核酸塩基標識部位としては、プリン核酸塩基の８−Ｃ、７−デアザプリン核酸塩基のＣ−７またはＣ−８、およびピリミジン核酸塩基の５位が挙げられる。ヌクレオチシドまたはヌクレオチドと色素との間で、リンカーは、任意の位置において、スルホン化ジアリールローダミン化合物に結合し得る。
【０１１０】
標識されたヌクレオシドまたはヌクレオチドは、酵素学的に組み込み可能かつ酵素学的に伸長可能であり得る。本発明の化合物で標識されるヌクレオシドまたはヌクレオチドは、以下の式Ｖ：
【０１１１】
【化４１】


を有し得、ここで、ＤＹＥは、化合物ＩＩＩａｂｃの保護形態または非保護形態（エネルギー移動色素を含む）である。Ｂは、任意の核酸塩基（例えば、ウラシル、チミン、シトシン、アデニン、７−デアザアデニン、グアニン、および８−デアザグアノシン）であり得る。Ｒ^２５は、Ｈ、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、チオホスフェート、またはリン酸エステルアナログである。Ｒ^２６およびＲ^２７は、単独である場合、各々独立して、Ｈ、ＨＯ、Ｆおよびホスホラミダイトである。Ｒ^２６またはＲ^２７がホスホラミダイトである場合、Ｒ^２５は、自動化合成条件下で後のモノマーカップリングを可能にする、酸で切断可能なヒドロキシル保護基（例えば、ジメトキシトリチル）である（米国特許第４，４１５，７３２号および同第４，４５８，０６６号；Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．ａｎｄ Ｉｙｅｒ，Ｒ．（１９９２）「Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｂｙ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ ａｐｐｒｏａｃｈ」，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４８：２２２３〜２３１１）。
【０１１２】
標識されたヌクレオシまたはヌクレオチドがターミネーターである場合、Ｒ^２６およびＲ^２７は、ポリメラーゼ媒介テンプレート指向性重合を遮断するように選択される。ターミネーターヌクレオチドにおいて、Ｒ^２６およびＲ^２７は、単独である場合、各々独立して、Ｈ、Ｆ、およびポリメラーゼ媒介テンプレート指向性重合を遮断する部分であるか、または一緒になる場合、２’−３’−ジデヒドロリボースを形成する。式Ｖにおいて、Ｒ^２６およびＲ^２７の両方がヒドロキシルである場合、得られる化合物は、標識されたリボヌクレオシドまたはリボヌクレオチド（ＮＴＰ）である。Ｒ^２７が水素であり、かつＲ^２６がヒドロキシルである場合、得られる化合物は、標識された２’−デオキシリボヌクレオシドおよび２’−デオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）である。Ｒ^２６およびＲ^２７が各々水素である場合、得られる化合物は、２’，３’−ジデオキシリボヌクレオシドおよび２’，３’−ジデオキシリボヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）である。標識されたｄｄＮＴＰは、蛍光検出を使用するサンガー型ＤＮＡ配列決定方法におけるターミネーターとしての特定の用途が見出される。標識された２’−デオキシリボヌクレオシド−５’−トリホスフェート（ｄＮＴＰ）は、ＤＮＡポリメラーゼ伸長産物を標識するための試薬としての特定の用途（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応またはニック翻訳において）が見出される。標識されたリボヌクレオシド−５’−トリホスフェート（ＮＴＰ）は、ＲＮＡポリメラーゼ伸長産物を標識するための試薬としての特定の用途が見出される。
【０１１３】
【化４２】


アルキニルアミノ連結化合物Ｖ（ここで、Ｌは、アルキンジイル（ａｌｋｙｎｄｉｙｌ）基を含む）は、スルホン化ジアリールローダミン化合物をヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらのアナログに結合体化するのに有用である。これらの合成は、ＥＰ ８７３０５８４４．０およびＨｏｂｂｓ，（１９８９）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４：３４２０に教示されている。対応するヌクレオシドのモノホスフェート、ジホスフェートおよびトリホスフェートは、標準技術（例えば、米国特許第５，８２１，３５６号；同第５，７７０，７１６号；同第５，９４８，６４８号；同第６，０９６，８７５号に記載される方法）によって得られる。化合物Ｖを改変したプロパルギルエトキシアミド（ｐｒｏｐａｒｇｙｌｅｔｈｏｘｙａｍｉｄｏ）リンカーＬを用いて合成するための方法もまた、これらの特許において見出され得る。構造式Ｖに従う化合物の合成に使用するのに適切な、さらなる合成手順が、例えば、以下に記載される：Ｇｉｂｓｏｎ（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６４５５〜６４６７；Ｇｅｂｅｙｅｈｕ（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：４５１３〜４５３５；Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓ（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：４８５６〜４８７６；Ｎｅｌｓｏｎ（１９８６）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．５（３）：２３３〜２４１；Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：３７４〜３７５；米国特許第４，８５５，２２５号；同第５，２３１，１９１号および同第５，４４９，７６７号（これらは、本明細書中で参考として援用される）。これらの方法のいずれかは、全範囲の標識されたヌクレオシド、ヌクレオチド、および本明細書中に記載されるアナログを合成するために必要な方法として、日常的に適用または変更され得る。
【０１１４】
アルキニルリンカーＬの１つの実施形態は、以下：
【０１１５】
【化４３】


であり得、ここで、ｎは、０、１または２である。
【０１１６】
エネルギー移動色素対は、核酸塩基アミノ基を介して、以下：（ｉ）エネルギー移動色素対の活性化エステルに連結するか、または（ｉｉ）１つの色素（例えば、Ｒ^１１保護アミノメチル、Ｒ^１８カルボキシルフルオレセイン）にカップリングし、次いで、非保護Ｒ^１１アミノメチルを対の第二色素にカップリングして、段階的に連結することによって、ヌクレオチドの５’トリホスフェートに結合体化され得る。
【０１１７】
異なる輻合性スキームを用いた、エネルギー移動ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドに対する代替的な合成経路が、用いられ得る。基質、色素およびリンカーサブユニット、またはシントンが、任意の順序でカップリングするために構築され得る。例えば、ドナー色素およびアクセプター色素のエネルギー移動対は、リンカーによって共有結合され得、次いで、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドにカップリングされ得る。本発明の色素でのヌクレオチドの標識を生じる、多数の異なる合成経路が、用いられ得る。反応性官能基（例えば、カルボン酸基、アミノ基、ヒドロキシル基）は、広範な有機合成分野の方法論を使用する際に、保護を必要とし得る。
【０１１８】
（Ｖ．７ 標識されたオリゴヌクレオチド）
オリゴヌクレオチドは、市販のホスホラミダイトヌクレオシド、支持体（例えば、シリカ）、制御された有孔ガラス（米国特許第４，４５８，０６６号）およびポリスチレン（米国特許第５，０４７，５２４号および同第５，２６２，５３０号）および自動化合成機（Ｍｏｄｅｌｓ ３９２，３９４，３９４８ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒｓ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するホスホラミダイト方法（米国特許第４，４１５，７３２号；同第４，９７３，６７９号；同第４，４５８，０６６号；Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．およびＩｙｅｒ，Ｒ．（１９９２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４８：２２２３〜２３１１）によって、通常、固体支持体上に合成される。
【０１１９】
別のクラスの標識された基質としては、オリゴヌクレオチドと本発明の化合物との結合体が挙げられる。このような結合体は、ＤＮＡ配列決定プライマー、ＰＣＲプライマー、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ、オリゴヌクレオチドライゲーションプローブ、二重標識５’エキソヌクレアーゼ（ＴａｑＭａｎ^ＴＭ）プローブ、電気泳動のためのサイズ標準（すなわち、「レーン標準」または「レーンマーカ」）などとしての有用性が見出され得る（Ｆｕｎｇ、米国特許第４，７５７，１４１号；Ａｎｄｒｕｓ「Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ５’ｎｏｎ−ｉｓｏｔｏｐｉｃ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ ｐｒｉｍｅｒｓ」（１９９５）、ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，３９〜５４項；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，（１９９６）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．４０〜５５項，６４３−７１；Ｍｕｌｌａｈ（１９９８）「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｄｏｕｂｌｅ ｄｙｅ−ｌａｂｅｌｌｅｄ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：１０２６〜１０３１）。標識されたオリゴヌクレオチドは、以下の式ＶＩ：
【０１２０】
【化４４】


を有し得、ここで、このオリゴヌクレオチドは、２〜１０００ヌクレオチドを含む。ＤＹＥは、化合物Ｉまたは化合物ＩＩの保護形態または非保護形態（エネルギー移動色素を含む）である。Ｂは、任意の核酸塩基（例えば、ウラシル、チミン、シトシン、アデニン、７−デアザアデニン、グアニン、および８−デアザグアニシン）である。Ｌは、リンカーである。Ｒ^２７は、Ｈ、ＯＨ、ハライド、アジド、アミン、Ｃ_１〜Ｃ_６アミノアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、アリル、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ、ＯＣＨ_３、またはＯＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２である。Ｒ^２２は、Ｈ、ホスフェート、ヌクレオチド間ホスホジエステル、またはヌクレオチド間アナログである。Ｒ^２９は、Ｈ、ホスフェート、ヌクレオチド間ホスホジエステル、またはヌクレオチド間アナログである。この実施形態において、核酸塩基で標識されたオリゴヌクレオチドＶＩは、核酸塩基によって結合された本発明の複数の色素を有し得る。この核酸塩基で標識されたオリゴヌクレオチドＶＩは、以下によって形成され得る：（ｉ）ＤＮＡポリメラーゼまたはリガーゼによる、酵素学的に組み込み可能なヌクレオチド試薬Ｖの酵素学的組み込み（ここで、Ｒ^２５は、トリホスフェートである）、および（ｉｉ）自動化合成によるヌクレオシドホスホラミダイト試薬のカップリング。これによって、核酸塩基で標識されたオリゴヌクレオチドＶＩは、１つより多くの組み込み可能なヌクレオチドＶの組み込みによって複数標識され得、１つずつ５’標識されたオリゴヌクレオチドを導く、以下の式ＶＩＩ：
【０１２１】
【化４５】


に従う色素標識試薬（例えば、ＩＶ）で標識され、ここで、Ｘは、Ｏ、ＮＨまたはＳであり；Ｒ^２７は、Ｈ、ＯＨ、ハライド、アジド、アミン、Ｃ_１〜Ｃ_６アミノアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、アリル、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ、ＯＣＨ_３またはＯＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２であり；Ｒ^２８は、Ｈ、ホスフェート、ヌクレオチド間ホスホジエステル、またはヌクレオチド間アナログであり；そして、Ｌは、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、アリール、または１００までのエチレンオキシユニットのポリエチレンオキシである。
【０１２２】
式ＶＩまたはＶＩＩ中のリンカーＬは、任意の部位にて、本発明のスルホン化ジアリールローダミン化合物ＩＩＩａｂｃ（ＤＹＥ）に結合され得る。
【０１２３】
合成オリゴヌクレオチドを標識するための第一の方法において、求核官能基（例えば、第一級脂肪族アミン）は、オリゴヌクレオチド上の標識結合部位（例えば、５’末端）に導入される。自動化された固体支持体合成が終了した後、オリゴヌクレオチドが、この支持体から切断され、そして全ての保護基が除去される。求核オリゴヌクレオチドは、求電子部分（例えば、イソチオシアネートまたは活性化エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）））を含有する過剰な標識試薬と、均一溶液条件下で反応される（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，（１９９６）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．ｐｐ．４０−５５，６４３−７１；Ａｎｄｒｕｓ，Ａ．「Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ５’ｎｏｎ−ｉｓｏｔｏｐｉｃ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ ｐｒｉｍｅｒｓ」（１９９５）、ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，３９〜５４頁）。標識されたオリゴヌクレオチドＶＩＩは、色素の反応性連結基形態（例えば、ＮＨＳ）を、５’−アミノアルキルオリゴヌクレオチドと反応させることによって形成され得る（米国特許第４，７５７，１４１号）。
【０１２４】
第二の方法において、標識は、自動化合成の間または自動化合成前に、例えば、支持試薬として（Ｍｕｌｌａｈ，「Ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｒｅｃｔ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ３’−ｌａｂｅｌｌｅｄ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」、米国特許第５，７３６，６２６号；Ｎｅｌｓｏｎ，「Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、米国特許第５，１４１，８１３号）、またはホスホラミダイト試薬ＩＶとして、オリゴヌクレオチドに直接組み込まれる。特定の蛍光色素および他の標識は、５’標識のためのホスホラミダイト試薬として機能化される（Ｔｈｅｉｓｅｎ（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ Ｎｏ．２７，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，９９〜１００頁）。
【０１２５】
一般的に、標識されたオリゴヌクレオチドが酵素学的合成によって作製される場合、以下の手順が使用され得る。標的ＤＮＡは、変性され、そしてオリゴヌクレオチドプライマーは、テンプレートＤＮＡにアニーリングされる。初回刺激された標的（例えば、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰまたはｄＵＴＰを含む混合物）の連続的なテンプレート指向性酵素学的伸長を支持し得る酵素学的に組み込み可能なヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログの混合物が、この初回刺激された標的に添加される。ヌクレオチドの少なくとも１つの画分は、標識されたターミネーターＶ（例えば、ｄｄＮＴＰまたは３’Ｆ−ｄＮＴＰ）であり、これは、スルホン化ジアリールローダミン色素ＩＩＩａｂｃで標識される。次に、ポリメラーゼ酵素は、このポリメラーゼ酵素が活性である条件下でこの混合物に添加される。標識されたオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ媒介性鎖合成の間に、標識されたヌクレオチドまたはターミネーターの組み込みによって形成される。代替的な酵素学的合成方法において、２つのプライマー（標的の（＋）鎖に相補的なプライマーおよび標的の（−）鎖に相補的な別のプライマー）
が、代わりに使用され、ポリメラーゼは、熱安定性ポリメラーゼであり、反応温度は、変性温度と伸長温度との間を循環し、それによって、標的配列に対する標識された相補体がＰＣＲによって指数関数的に合成される（Ｉｎｎｉｓ（１９９０）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）。
【０１２６】
本発明のスルホン化ジアリールローダミン化合物で標識されたポリヌクレオチドは、求電子遊走速度に影響を与える部分（すなわち、移動度変更標識）でさらに標識され得る。移動度変更標識は、ポリエチレンオキシユニット、−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−を含み、ここで、ｎは、１〜１００であり得（米国特許第５，６２４，８００号）、好ましくは、ｎは、２〜２０である。ポリエチレンオキシユニットは、ホスフェート基で引き離され得る。別個でありかつ公知のサイズであるポリエチレンオキシのさらなる標識を伴う、特異的に標識されたスルホン化ジアリールローダミン標識ポリヌクレオチドによって、ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの数に実質的に非依存性の電気泳動による分離が可能になる。すなわち、同じ長さのポリヌクレオチドは、スペクトルにより分解可能な色素標識および移動度変更標識の存在によって識別され得る。色素標識と移動度変更標識との両方を有するポリヌクレオチドは、単一標識されたポリヌクレオチドまたはヌクレオチド構成成分のライゲーションまたはポリメラーゼ伸長によって酵素学的に形成され得る。
【０１２７】
（Ｖ．８ スルホン化ジアリールローダミン色素を使用する方法）
スペクトルにより重複した複数の分析物を同時検出するのに必要な方法は、標識としてのスルホン化ジアリールローダミン色素から利益を獲得し得る。本発明のスルホン化ジアリールローダミン化合物は、以下のような蛍光検出を使用する任意の方法に十分適している：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、ＤＮＡ配列決定、遺伝子発現のアンチセンス転写性制御および翻訳制御、遺伝分析、およびＤＮＡプローブベースの診断試験（Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．（１９９２）Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，３〜２８頁）。蛍光色素により標識されたオリゴヌクレオチドの蛍光検出は、以下のような核酸配列検出アッセイに基づく：５’エキソヌクレアーゼアッセイ（Ｌｉｖａｋ，米国特許第５，７２３，５９１号）、ＦＲＥＴハイブリダイゼーション（Ｔｙａｇｉ，Ｓ．およびＫｒａｍｅｒ，Ｆ．（１９９６）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ：Ｐｒｏｂｅｓ ｔｈａｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ ｕｐｏｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：３０３−０８）、遺伝連鎖マッピング（Ｄｉｂ（１９９６）「Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｐ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ５，２６４ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｓ」Ｎａｔｕｒｅ ３８０：１５２−５４）、およびオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（Ｇｒｏｓｓｍａｎ（１９９４）「Ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ： ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｃｏｄｅｄ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４５２７−３４）。
【０１２８】
本発明は、特に、差次的に標識されたポリヌクレオチドのクラスを検出するのに非常に適しており、これらのポリヌクレオチドは、生化学的分離手順（例えば、電気泳動（ＲｉｃｋｗｏｏｄおよびＨａｍｅｓ、編、Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８１））に供される。電気泳動マトリクスは、シービング（ｓｉｅｖｉｎｇ）ポリマー（例えば、架橋もしくは非架橋のポリアクリルアミド、または約２〜２０重量％の間の濃度（重量／体積）を有する他のアミド含有ポリマー）であり得る（Ｍａｄａｂｈｕｓｈｉ，米国特許第５，５５２，０２８号；同第５，５６７，２９２号；同第５，９１６，４２６号）。この電気泳動マトリクスは、スラブゲルまたはキャピラリーフォーマットで構成され得る（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３９２５−２９；Ｍａｔｈｉｅｓ，米国特許第５，２７４，２４０号）。
【０１２９】
電気泳動分離の後、色素−ポリヌクレオチド結合体は、例えば、高輝度照射の水銀放電灯、レーザなどによって、色素標識ポリヌクレオチドからの蛍光発光を測定することによって検出され得る。この照射手段は、約６００ｎｍより大きい波長の照射ビームを有するレーザであり得る。また、この色素−ポリヌクレオチドは、Ｈｅ−Ｎｅガスレーザまたは固体状態のダイオードレーザによって生じるレーザ光によって照射され得る。次いで、蛍光が、光感受性検出器（例えば、光電子増倍管、荷電結合デバイス（ｃｈａｒｇｅｄ ｃｏｕｐｌｅｄ ｄｅｖｉｃｅ）など）によって検出される。例示的な電気泳動検出システムは、他の箇所（例えば、米国特許第５，５４３，０２６号；同第５，２７４，２４０号；同第４，８７９，０１２号；同第５，０９１，６５２号および同第４，８１１，２１８号）に記載される。
【０１３０】
（Ｖ．８Ａ プライマー伸長）
「フラグメント分析」方法または「遺伝子分析」方法として本明細書中で参照される方法の１つのカテゴリーにおいて、蛍光色素（スルホン化ジアリールローダミン化合物を含む）で標識されたポリヌクレオチドフラグメントは、例えば、ライゲーションまたはポリメラーゼ指向性プライマー伸長によって、標識されたプライマーまたはヌクレオチドを使用するテンプレート指向性酵素学的合成によって生じる。プライマーオリゴヌクレオチドは、標的配列との相補的な塩基対形成によってハイブリダイズし、プライマー−標的ハイブリッドを形成する。プライマー伸長産物は、ハイブリッド中のプライマーの３’末端におけるヌクレオチドの酵素学的組み込みによって生じる。プライマーまたはヌクレオチドが本発明のスルホン化ジアリールローダミン色素で標識される場合、標識されたプライマー伸長産物が生じる。これらのポリヌクレオチドフラグメントは、サイズ依存性分離プロセス（例えば、電気泳動またはクロマトグラフィー）に供され得、分離されたフラグメントは、例えば、レーザ誘導化蛍光（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，米国特許第４，８１１，２１８号）によって分離後に検出される。複数のクラスのポリヌクレオチドが、同時に分離され得、そして種々のクラスが、スペクトルにより分解可能な標識（本発明の色素を含む）によって識別される。電気泳動において、これらのクラスは、電気泳動遊走速度に基づいて分離する。
【０１３１】
（Ｖ．８Ｂ ＤＮＡ配列決定）
スルホン化ジアリールローダミン化合物は、複数色の蛍光検出が可能である、自動化４色ＤＮＡ配列決定システムにおける使用に十分適している。このシステムは、約６３０ｎｍより大きい波長を有する励起光源（例えば、ヘリウム−ネオンガスレーザまたは固体状態のダイオードレーザ）を使用し得る。
【０１３２】
ＤＮＡ配列決定（すなわち、ジデオキシＤＮＡ配列決定、またはサンガー型配列決定）の連鎖停止方法、およびフラグメント分析が、使用され得る（Ｓａｎｇｅｒ（１９７７）「ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｗｉｔｈ ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３〜５４６７）。例示的な連鎖停止ヌクレオチドアナログは、２’，３’−ジデオキシヌクレオチド５’−トリホスフェート（ｄｄＮＴＰ）（これは、３’〜５’ＤＮＡ鎖伸長に必要な３’−ＯＨ基を欠失している）を含む。プライマーまたはｄｄＮＴＰは、本発明のスルホン化ジアリールローダミン色素で標識され得、そして高分解能電気泳動によってフラグメントを分離した後に、蛍光によって検出され得る。色素は、プライマーの５’末端上の官能基（例えば、アミノ（米国特許第４，７５７，１４１号））、オリゴヌクレオチドプライマーの核酸塩基上の官能基；またはジデオキシヌクレオチドの核酸塩基上の官能基（米国特許第５，７７０，７１６号；同第５，８２１，３５６号；同第５，１５１，５０７号）に連結され得る。
【０１３３】
ターミネーターの各々は、異なる蛍光色素を有し、かつこの実験のターミネーターは、集合的に、特異的に分離可能な蛍光標識のセット（１種以上の本発明のスルホン化ジアリールローダミン色素を含む）を有する。例示的なフラグメント分析方法において、色素で標識されたフラグメントは、電気泳動条件下で相対サイズ（すなわち、配列の長さ）によって同定される。フラグメントサイズと配列との間の対応は、４つの可能な終結ヌクレオチド（「ターミネーター」）およびスペクトルにより分解可能な色素のセットのメンバーの組み込みによって確立される（米国特許第５，３６６，８６０号）。スペクトルにより分解可能な色素のセットとしては、少なくとも１つのスルホン化ジアリールローダミン化合物が挙げられる。十分に分解された発光を伴う４つのスルホン化ジアリールローダミン色素の１つのセットは、１１０、１１４、１１５および１１９からなる（図２２ａ、２２ｂ、２２ｃ）。別のセットは、１１０、１１４、１１６および１１９からなる。さらに別のセットは、１１０、１１４、１１９および１２０からなる。色素のセットは、色素１１０〜１２０のいずれかの組み合わせ、または一般的に、任意のスルホン化ジアリールローダミン色素を含み得る。１つのセットは、１種以上のスルホン化ジアリールローダミン色素および他の構造クラス由来の１種以上の色素（例えば、フルオレセイン、非スルホン化ジアリールローダミン、シアニン、スクアラニンなど）を含み得る。
【０１３４】
標識されたヌクレオチドＶは、４つの核酸塩基（Ｂ＝Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ（またはＵ））およびそれらのアナログを含む４つのターミネーターのセットとして、配列決定する際に使用され得る。Ｂ、リンカーＬおよびＤＹＥの組み合わせは、ポリヌクレオチドフラグメントの電気泳動移動度、スペクトル分解能、およびプライマー伸長の間のポリメラーゼの組み込み速度に影響を及ぼす。
【０１３５】
（Ｖ．８Ｃ ライゲーション）
リガーゼ酵素による核酸プローブの共有結合は、分子生物学者に利用可能な最も有用なツールの１つである。２つのプローブがテンプレート核酸にアニーリングされる場合（ここで、これら２つのプローブは隣接しており、かつ介在性ギャップがない）、リガーゼ酵素によって、一方のプローブの５’末端ともう一方のプローブの３’末端との間に、ホスホジエステル結合が形成され得る（Ｗｈｉｔｅｌｅｙ、米国特許第４，８８３，７５０号；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，（１９８８）「Ａ ｌｉｇａｓｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−８０；Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ，「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＤＮＡ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ｕｓｉｎｇ ａｎ ＥＬＩＳＡ−ｂａｓｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｓｓａｙ」（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：８９２３−２７）。オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイは、標的ＤＮＡサンプル中の特定の配列の存在を検出する。一方または両方のプローブが色素で標識される場合、ライゲーション産物が蛍光によって検出され得る。一方または両方のプローブは、スルホン化ジアリールローダミン色素で標識され得る。ライゲーション産物は、電気泳動、クロマトグラフィー、または他のサイズに基づく分離方法もしくは電荷に基づく分離方法によって検出され得る。
【０１３６】
（Ｖ．８Ｄ 増幅）
本発明のスルホン化ジアリールローダミン化合物は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ならびに他の核酸増幅方法および選択方法のための、５’標識されたオリゴヌクレオチドプライマー上の標識としての用途が見出されている。ＰＣＲ増幅は、種々の可変数のタンデム反復（ＶＮＴＲ）、短タンデム反復（ＳＴＲ）、および二重鎖ＤＮＡ（特定の配列の隣接した複数のコピーを含む）の反復領域を増幅するマイクロサテライト法（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍｅｔｈｏｄ）によって遺伝子型を決定する（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）のための、標識されたオリゴヌクレオチドの使用を含み、反復単位の数は、可変である。このようなＰＣＲ遺伝子型決定方法において、ＰＣＲプライマーは、本発明のスルホン化ジアリールローダミンで標識され得る。
【０１３７】
１つの実施形態において、スルホン化ジアリールローダミン化合物は、定量方法およびＰＣＲの間の増幅産物の実時間測定または終点測定を提供する試薬において使用され得る（米国特許第５，２１０，０１５号；同第５，５３８，８４８号）。蛍光色素−消光剤プローブを使用するエキソヌクレアーゼアッセイ（Ｔａｑｍａｎ（登録商標））（米国特許第５，７２３，５９１号；Ｍｕｌｌａｈ（１９９８）「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｄｏｕｂｌｅ ｄｙｅ−ｌａｂｅｌｌｅｄ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：１０２６〜１０３１）は、閉管システムにおいてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物の直接検出を与え、ＰＣＲを行うのに必要とされるサンプル以上のサンプル処理を伴わない。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）アッセイにおいて、プライマー伸長を行いポリヌクレオチドを増幅するポリメラーゼはまた、５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性によって標的配列にアニーリングされたプローブを置換および切断する。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）型アッセイにおいて、プローブは、自己消光し、蛍光色素および消光剤部分で標識され、これらのいずれかは、本発明の色素であり得る。スペクトルの重複によって、プローブがインタクトである場合に、効率的なエネルギー移動（ＦＲＥＴ）が可能となる（Ｃｌｅｇｇ（１９９２）「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ」、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１１：３５３〜３８８）。標的配列にハイブリダイズされる場合、プローブはＰＣＲの間に切断されて、標的プローブハイブリッドの存在量に比例した蛍光シグナルが放射される米国特許第５，５３８，８４８号；同第５，７２３，５９１号）。
【０１３８】
増幅の進行は、連続的にモニタリングされ得る（すなわち、実時間検出）。スペクトルにより分解可能な、本発明のスルホン化ジアリールローダミン色素は、標的をＰＣＲ増幅した後の遺伝子型決定実験において有用である。詳細には、各々異なる色素を用いて５’末端で標識されたプライマーオリゴヌクレオチドのセットは、複数の遺伝子座を増幅し、そして一塩基多型（ＳＮＰ）および対立遺伝子を識別し得る。色素で標識された増幅産物の、サイズ基準を用いた電気泳動分離は、プライマー配列のセットに依存した特定の遺伝子型を示す、プロファイル、すなわち特徴的データセットを確立する。
【０１３９】
（Ｖ．８Ｅ ハイブリダイゼーションアッセイ）
標的核酸にハイブリダイズする特定の蛍光色素−消光剤プローブは、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて有用である。プローブが標的にハイブリダイズされない場合、このプローブは、蛍光色素と蛍光消光を生じる消光剤部分との間を空間的に近位にするコンホメーションを維持し得る。標的へのハイブリダイゼーションの際に、この部分が物理的に分離され、消光が中断または減少され、そして蛍光が増加する。蛍光が検出可能であるかまたは定量化される場合、サンプル中の標的配列の存在が推定される。本発明のスルホン化ジアリールローダミン色素はまた、蛍光色素または消光剤部分として使用され得る。「ヘアピン」領域（いわゆる、「分子ビーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎｓ）」（Ｔｙａｇｉ ａｎｄ Ｋｒａｍｅｒ））を形成する自己相補的配列を有する蛍光色素−消光剤プローブは、それらの相補的な標的配列へのハイブリダイゼーション（例えば、生存細胞中のｍＲＮＡのインサイチュでの定量化）の際に蛍光変化を起こす。異なる蛍光色素で標識されたハイブリダイゼーションプローブ（本発明のスルホン化ジアリールローダミン色素を含む）によって、多重化した均一なハイブリダイゼーションアッセイが密閉された反応管中で行われるのが可能になる。
【０１４０】
ハイブリダイゼーションアッセイはまた、予め決定された位置において固定化されたプローブの固相アレイ上で実施され得、これらの位置は、これらの特異的な試薬の送達またはインタロゲーション／検出によってアドレス可能であり得る。例えば、スルホン化ジアリールローダミン色素で標識された標的ポリヌクレオチドを含有するサンプルは、固定されたプローブのアレイに送達され得る。ポリヌクレオチドが、塩基対によって固定されたプローブにハイブリダイズする場合、その位置での標的−プローブ複合体からの蛍光が検出され得る。蛍光検出パターンおよび／または強度から、ポリヌクレオチドの配列が推定され得、そして、サンプル中の特定のポリヌクレオチド配列の存在が決定され得る。
【０１４１】
（Ｖ．９ キット）
本発明はキットを含み、このキットは、本発明のスルホン化ジアリールローダミン化合物および／またはそれらの標識された結合体を備える。１つの実施形態において、このキットは、連結部分を有するスルホン化ジアリールローダミン化合物を別の分子（例えば、基質）に結合体化するために有用である。このようなキットは、一般に、色素を別の分子または基質に結合体化するのに適切な、本発明のスルホン化ジアリールローダミン（任意の連結部分および試薬、酵素、緩衝液、溶媒などを含む）を備える。スルホン化ジアリールローダミンは、エネルギー移動色素のアクセプターまたはドナーであり得る。
【０１４２】
１つの実施形態において、このキットは、酵素学的に合成されたオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを、本発明のスルホン化ジアリールローダミンで標識するために有用である。このようなキットは、一般に、本発明に従う、酵素学的に組み込み可能な、標識されたクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、連続したプライマー伸長およびポリメラーゼ酵素を支持し得る、酵素学的に組み込み可能なヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログの混合物を備える。酵素学的に組み込み可能な、標識されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、構造Ｖに従う化合物（例えば、標識されたターミネーター）である。ポリメラーゼは、熱安定性であり、これらは、例えば、ＡＭＰＬＩＴＡＱ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）である。
【０１４３】
あるいは、このキットは、１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを備え得る。このプライマーは、スルホン化ジアリールローダミンおよびスルホン化ジアリールローダミンを含むエネルギー移動色素で標識され得る。
【０１４４】
（ＶＩ． 実施例）
本発明は、以下の実施例を考慮することによってさらに明瞭になり、これらの実施例は、本発明の単なる例示であり、いかなる様式においても本発明の範囲を制限しないことが意図される。
【０１４５】
（実施例１）
（１−ジエチルアミノ−３−ヒドロキシナフタレン４の合成（図１））
Ｋ．Ｈ．ＢｅｌｌおよびＬ．Ｆ．ＭｃＣａｆｆｅｒｙ（１９９３），Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．４６：７３１の方法によって、１，３−ジヒドロキシナフタレンから合成した３−メトキシ−１−ヒドロキシナフタレン１（１ｇｍ）を、無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（３０ｍｌ）中に懸濁した。乾燥トリエチルアミン（１．２当量）を加え、この反応物を−５℃まで冷却した。ＣＨ_２Ｃｌ_２（１５ｍｌ）中に懸濁したトリフルオロメタンスルホン酸無水物（１．１当量）を、激しく攪拌しながら２時間にわたって滴下した。この反応物を室温にし、５％ ＨＣｌおよびＣＨ_２Ｃｌ_２を使用する水性ワークアップ（ａｑｕｅｏｕｓ ｗｏｒｋ ｕｐ）に供した。得られた粗製３−メトキシナフタレン−１−トリフレート２を、移動相としてＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１０）を使用する順相フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。
【０１４６】
精製した３−メトキシナフタレン−１−トリフレート２を、Ｊ．Ｐ．ＷｏｌｆｅおよびＳ．Ｌ．Ｂｕｃｈｗａｌｄ（１９９６）Ｊｏｕｒ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６１：１１３３のパラジウムで触媒したトリフレート／アミンカップリング手順を使用して、１−ジエチルアミノ−３−メトキシナフタレン３に転換した。この３−メトキシ−ナフタレン−１−トリフレート２（１ｇ）を、１００ｍｌの乾燥トルエン（０．０１５当量の（Ｓ）−（−）−２，２’−ビス（ジフェニルホスフィノ）−１，１’−ビナフトル（ＢＩＮＡＰ）、０．００５当量のトリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（Ｐｄ_２（ｄｂａ）_３）、および３当量の無水ジエチルアミンを含む）中に懸濁した。この反応物を、アルゴンでパージし、そして、３．３当量の固体ナトリウムｔ−ブトキシドを、攪拌しながら加えた。次いで、この反応物を加熱し、そして、油浴中で８０℃にて１６時間攪拌した。この反応物を室温にし、５％ＨＣｌおよびＣＨ_２Ｃｌ_２を使用する水性ワークアップに供して、粗製１−ジエチルアミノ−３−メトキシナフタレン３を得、これを、移動相としてＥｔＯＡｃ：ヘキサン（１：４９）を使用する順相フラッシュクロマトグラフィーによって精製した（^１ＨＮＭＲ：ＣＤＣｌ_３ ｄ ８．２０（ブロードなｄ，１Ｈ，Ｊ＝９Ｈｚ），７．７２（ブロードなｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．４３（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．２，１．２Ｈｚ），７．３４（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．７，１．２Ｈｚ），６．８８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４Ｈｚ），），６．８２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４Ｈｚ），３．９３（ｓ，３Ｈ），３．２１（ｑ，４Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．０８（ｔ，６Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ））。
【０１４７】
次に、１−ジエチルアミノ−３−メトキシ−ナフタレン３のメチル基を、以下のような三臭化ホウ素脱保護によって除去した。１−アミノ−３−メトキシナフタレン（１００ｍｇ）を、無水ＣＨ_２Ｃ１_２（５ｍｌ）に懸濁し、そして、この混合物を、ドライアイス／アセトン浴中で−７０℃まで冷却した。三臭化ホウ素（１０当量）を滴下し、そしてこの反応物を、３０分間攪拌し、次いで、冷蔵庫内（０℃）に一晩置いた。慎重にＭｅＯＨ（１０ｍｌ）を加えることによって、この反応物を−７０℃にてクエンチした。固体ＮａＨＣＯ_３（３０当量）を加え、そして、この反応物を室温まで温め、次いで、手短に加熱還流した。この混合物を冷却し、そして濾過し、この濾液をＡｃＯＨで酸性化し、そして減圧下で溶媒を除去して、粗製１−ジエチルアミノ−３−ヒドロキシナフタレン４を得、これを、移動相としてＥｔＯＡｃ：ヘキサン（１：４）を使用する順相フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。
【０１４８】
（実施例２）
（Ｎ−フェニル−３，３−ジメチルヒドロキシベンゾインドリン９の合成（図１））
上記実施例１のパラジウムで触媒したトリフレート／アミンカップリング反応に従って、アニリンを用いて、３−メトキシナフタレン−１−トリフレート２を誘導体化して、１−アニリノ−３−メトキシナフタレン５を得た。
【０１４９】
この１−アニリノ−３−メトキシナフタレン５を、以下のようなアミノ基のアセチル化手順によってアセチル化した。この１−アミノ−３−メトキシナフタレン５（５００ｍｇ）および１．２当量の無水Ｅｔ_３Ｎを、１０ｍｌの無水ＣＨ_２Ｃｌ_２中に懸濁し、氷／ＮａＣｌ浴を使用して−５℃まで冷却した。１．１当量の２−ブロモ−２−塩化メチルプロピニルを滴下し、そしてこの反応物を、−５℃にて１時間攪拌し、そして室温にてさらに１時間攪拌した。この反応物を室温にし、そして、５％ ＨＣｌおよび酢酸エチルを使用する水性ワークアップに供し、粗製中間体１−（ブロモアルキル）アミド−３−メトキシナフタレン６を得、これを、移動相としてＥｔＯＡｃ：ヘキサン（１：９）を使用する順相フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。
【０１５０】
この１−（ブロモアルキル）アミド−３−メトキシナフタレン６を、以下のようなＡｌＣｌ_３を触媒したフリーデル−クラフツ環化手順を使用して環化した。１〜３当量のＡｌＣｌ_３を含有するニトロベンゼンを、この１−（ブロモアルキル）アミド−３−ヒドロキシナフタレン６に加えた。この反応物を１３０℃まで加熱し、そして１時間反応させた。ＮＨ_４Ｃ１およびＥｔＯＡｃを使用する水性ワークアップによって、粗製Ｎ−フェニルベンゾインドリノン（Ｎ−ｐｈｅｎｙｌ−ｂｅｎｚｏｉｎｄｏｌｉｎｏｎｅ）中間体７を得、これを、移動相としてＥｔＯＡｃ：ヘキサン（１：４）を使用する順相フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。次いで、Ｎ−フェニルベンゾインドリン中間体７のアミドカルボニル基をＬＡＨで還元して、化合物８を得た（^１ＨＮＭＲ：ＣＤＣｌ_３ ｄ ７．７１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．３２（ｍ，２Ｈ），７．２４（ｍ，２Ｈ），７．０７（ｂｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），６．９６（ｍ，３Ｈ），６．８４（ｓ，１Ｈ），３．９７（ｓ，３Ｈ），３．９２（ｓ，２Ｈ），１．４４（ｓ，６Ｈ）。
【０１５１】
実施例１に記載される三臭化ホウ素脱保護手順を使用して、化合物８のメトキシ基を脱保護し、Ｎ−フェニル−３，３−ジメチルヒドロキシベンゾインドリン９を得た。
【０１５２】
（実施例３）
（Ｎ−メチル−５−ヒドロキシ−（テトラヒドロ）ベンゾキノリン１５の合成（図２））
ピリジン中でピペラジンの触媒作用を使用したメトキシナフトアルデヒドおよびマロン酸の縮合によって、化合物１０を合成した。化合物１０を、１０％ Ｐｄ／炭素上で水素で還元し、続いてＬＡＨで還元し、そして上記化合物２の合成の概要のように、トリフルオロメタンスルホン酸無水物と反応させて、トリフレート１１を得た。次いで、トリフレート１１を、ＤＭＦ中のＮａＮ_３（３当量）と、１００℃にて６時間反応させた。次いで、この反応物を室温にし、そして、純水およびＥｔＯＡｃを使用する水性ワークアップに供し、化合物１２を得た。化合物１２を、無水ＣＨ_２Ｃｌ_２中に懸濁し、３〜５当量の固体ＡｌＣｌ_３と複合体化し、そして２時間還流してコーティング１３を得た。
【０１５３】
化合物１３を、以下のような一般的なアミノ基のアルキル化手順に従ってＭｅＩでアルキル化した。この３−メトキシベンゾキノリン誘導体（１００ｍｇ）１３を、５ｍｌの乾燥ＴＨＦ中に懸濁し、そして−５℃まで冷却した（氷／ＮａＣｌ）。１．１当量のｎ−ブチルリチウム（１Ｍ）を滴下し、そして、この反応物を、１時間攪拌した。３当量のＭｅＩアルキル化剤をゆっくりと加え、この反応物を、室温にて２時間攪拌した。ＮＨ_４ＣｌおよびＥｔＯＡｃを使用する水性ワークアップによって、粗製アルキル化３−メトキシベンゾキノリン中間体１４を得た。次いで、中間体１４を、移動相としてＥｔＯＡｃ：ヘキサン（１：１９）を使用する順相フラッシュクロマトグラフィーによって精製した（^１ＨＮＭＲ：ＣＤＣｌ_３ ｄ ８．１（ブロードなｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．６８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１，１．８Ｈｚ），７．３４（ｍ，２Ｈ），６．８（ｓ，１Ｈ），３．９２（ｓ，３Ｈ），３．２１（ｍ，２Ｈ），２．９４（ｓ，３Ｈ），２．７７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．９２（ｍ，２Ｈ））。上記実施例１の一般的な三臭化ホウ素手順によって化合物のメトキシ基を脱保護した後、Ｎ−メチルヒドロキシベンゾキノリン誘導体１５を得た。
【０１５４】
（実施例４）
（３−（５−ヒドロキシベンゾキノリン−１−イル）プロパンスルホン酸１７の合成（図２））
Ｎ−メチルヒドロキシベンゾキノリン誘導体１５を合成するために、実施例３における上記概要の手順に従って、化合物１３を合成した。次いで、今回は、ＭｅＩではなく１，３−プロパンスルホン（１，３−ｐｒｏｐａｎｅ ｓｕｌｔｏｎｅ）をアルキル化剤として使用して、上記実施例３の一般的なアミノ基のアルキル化手順に従って、化合物１３を合成し、５−メトキシベンゾキノリン−Ｎ−プロパンスルホン酸中間体１６を得た（^１ＨＮＭＲ：ＣＤ_３ＯＤ ｄ ７．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），７．６５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．３２（ｔ，１Ｈ），７．２７（ｔ，１Ｈ），６．８５（ｓ，１Ｈ），４．８９（ｓ，３Ｈ），３．２０（ｍ，２Ｈ），３．０８（ｂｔ，２Ｈ，Ｊ＝６Ｈｚ），２．９１（ｍ，２Ｈ），２．７２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），２．３３（ｍ，２Ｈ），１．８９（ｍ，２Ｈ）。上記実施例１の一般的な三臭化ホウ素手順によって化合物１６のメトキシ基を脱保護した後、３−（５−ヒドロキシベンゾキノリン−１−イル）プロパンスルホン酸１７を得た。
【０１５５】
（実施例５）
（Ｎ−メチル−２，２，４−トリメチル−５−ヒドロキシ−（テトラヒドロ）ベンゾキノリン２２の合成（図３）） Ｇ．Ｔ．ＭｏｒｇａｎおよびＥ．Ｄ．Ｅｖａｎｓ（１９１９），Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：１１２６の手順に従ってか、または実施例１０のように、１−アミノ−３−メトキシナフタレン１８を合成した。Ａ．Ｒｏｓｏｗｓｋｙ ａｎｄ Ｅ．Ｊ．Ｍｏｄｅｓｔ（１９６５）Ｊｏｕｒ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３０：１８３２の手順に従って、１８（１ｇｍ）を、乾燥アセトン（５０ｍｌ）中に懸濁し、そして、０．０１当量のヨウ素をこの溶液に加えた。この反応物を加熱し、そして１６時間攪拌し、冷却し、次いで、飽和Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_３でクエンチした。次いで、この反応混合物を、飽和Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_３およびＥｔＯＡｃを使用する水性ワークアップに供して、粗製メトキシベンゾキノリン１９を得た。このメトキシベンゼンキノリン１９を、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン １：９の移動相を使用するフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。次いで、化合物１９を、上記実施例３の一般的なアミノ基のアルキル化手順に従って、ＭｅＩでアルキル化し、化合物２０を得た。化合物２０を、７０ｐｓｉにて（Ｐａｒｒ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｏｒ）中のＨ_２および１０％ Ｐｄ／Ｃ 触媒で還元して、Ｎ−メチル−２，２，４−トリメチル−５−メトキシベンゼンキノリン中間体２１を得た（^１ＨＮＭＲ：ＣＤＣｌ_３ ｄ ８．２０（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．６５（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．３３（ｍ，２Ｈ），６．８９（ｓ，１Ｈ），３．９４（ｓ，３Ｈ），３．１４（ｂ ｓｅｘｔｅｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），２．８０（３，３Ｈ），１．８９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７），１．４２（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），１．３４（ｓ，３Ｈ），１．０５（ｓ，３Ｈ）。上記実施例１の一般的な三臭化ホウ素手順によって化合物２１のメトキシ基を脱保護した後、Ｎ−メチル−５−ヒドロキシ（テトラヒドロ）ベンゾキノリン２２を得た。
【０１５６】
（実施例６）
（Ｎ−メチル−３，３−ジメチル−４−ヒドロキシベンゾインドリン２７の合成（図３））
上記実施例２の一般的なアミノ基のアセチル化手順に従って、１−アミノ−３−メトキシナフタレン１８を、２−ブロモ−２−塩化メチルプロピニルでアセチル化して、化合物２３を得た。化合物２３を、上記実施例２のフリーデル−クラフツ環化手順によって環化して、化合物２４を得た。次に、化合物２４を、３当量のＬＡＨを含有するＴＨＦで還元して４−メトキシベンゾインドリン２５を得た。アルキル化試薬としてヨードメチル使用する、上記実施例３の一般的なアミノ基のアルキル化手順を使用して、化合物２５をアルキル化し、Ｎ−メチル−３，３−ジメチル−４−メトキシベンゾインドリン中間体２６を得た（^１ＨＮＭＲ ＣＤＣｌ_３ ｄ ８．０７（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．６９（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．３３（ｂｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．２２（ｂｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），６．７０（ｓ，１Ｈ），３．９２（ｓ，３Ｈ），３．３２（ｓ，２Ｈ），３．３２（ｓ，３Ｈ），１．４４（ｓ，６Ｈ）。実施例１の一般的な三臭化ホウ素手順によって化合物２６のメトキシ基を脱保護した後、Ｎ−メチル−３，３−ジメチル−４ヒドロキシベンゾインドリン２７を得た。
【０１５７】
（実施例７）
（Ｎ−エチル−３，３−ジメチル−４−ヒドロキシベンゾインドリン２９の合成（図３））
４−メトキシベンゾインドリン２５を、上記実施例６のように合成した。
【０１５８】
化合物２５を、アルキル化剤としてヨードメチルを使用する実施例３に記載の一般的なアルキル化手順によってアルキル化して、Ｎ−エチル−３，３−ジメチル−４−メトキシベンゾインドリン中間体２８を得た（^１ＨＮＭＲ：ＣＤＣｌ_３ ｄ ７．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），７．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．３２（ｂｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．２２（ｂｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），６．６９（ｓ，１Ｈ），３．８３（ｓ，３Ｈ），３．５２（ｑ，２Ｈ Ｊ＝７．５Ｈｚ），３．３８（ｓ，２Ｈ），１．４６（ｓ，６Ｈ），１．２７（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）。実施例１の一般的な三臭化ホウ素手順によって化合物２８のメトキシ基を脱保護した後、Ｎ−メチル−３，３−ジメチル−４−ヒドロキシベンゾインドリン２９を得た。
【０１５９】
（実施例８）
（選択したジベンゾローダミン色素化合物の合成）
（一般手順Ａ（図５））
固体無水フタル酸誘導体３４を、１．４当量のアミノヒドロキシ中間体３１および２．８当量のＺｎＣｌ_２と混合した。オーブン乾燥反応用容器を、ゴム隔膜でキャップし、アルゴンでパージした。この固体混合物を、融解が観察されるまで（例えば、約１５分後）１３０℃にて手短に加熱した。１，２−ジクロロベンゼン（約１０当量）を、この反応混合物にシリンジによって加え、この異種混合物を、４時間の間１３０〜１７０℃まで加熱した。粗製反応混合物を冷却し、最小量のＭｅＯＨ：ＣＨ_２Ｃｌ_２（１：１９）中に懸濁し、順相フラッシュクロマトグラフィーカラムに直接充填し、そしてこの粗製色素を、ＭｅＯＨ：ＣＨ_２Ｃｌ_２（１：１９）移動相で溶出した。必要に応じて、この色素を精製し、そして、ＭｅＯＨ：ＣＨ_２Ｃｌ_２（１：９）を用いて展開するＰＴＬＣによって、別個の異性体３５および３６に分離した。この異性学的に純粋な色素（これは、１：９ ＭｅＯＨ：ＣＨ_２Ｃｌ_２で溶出するシリカのＴＬＣ上の単一スポットとして遊走される）を、そのＵＶ／可視吸収スペクトル、ならびにその長波長蛍光励起スペクトルおよび発光スペクトルによって同定した。
【０１６０】
（一般手順Ｂ（図６））
図６に概略を示した一般的な手順において、固体無水フタル酸誘導体３４（１００ｍｇ）を、ゴム隔膜でキャップをした丸底フラスコ内に置き、アルゴンでパージした。無水ニトロベンゼン（２ｍｌ）を加え、そして加熱して無水物を溶解した。この混合物を、室温まで冷却し、３〜６当量の無水ＡｌＣｌ_３を攪拌しながら加えて固体を溶解した。その後、１当量の１−アミノ−３−メトキシナフタレン中間体３１を、攪拌しながら加え、この反応物を、１時間１３０℃まで加熱した。次いで、この反応物を冷却し、そしてＥｔＯＡｃ中に懸濁した。有機層を、飽和ＮＨ_４Ｃｌおよびブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、そして、溶媒を、減圧下で除去した。必要に応じて、この得られたケトン中間体３７／３８を精製し、移動相として（ＭｅＯＨ：ＣＨ_２Ｃ１_２、１：１９）を使用する順相フラッシュクロマトグラフィーを使用してかまたは再結晶によって、別個の異性体３７および３８に分離した。異性学的に純粋な中間体３７または３８のメトキシ基を、実施例１に記載される一般的な三臭化ホウ素脱保護手順に従って除去して、アミノヒドロキシナフタレンケトン３９を得た。次いで、このアミノヒドロキシナフタレンケトン３９（１００ｍｇ）を、１当量の１−アミノ−３−ナフタレン中間体３２を含有する無水１，２−ジクロロベンゼン（２ｍｌ）と２時間１３０℃にて反応させた。この反応物を冷却し、異性学的に純粋でかつ非対称的に置換された生成物４０を得、これを、上記一般手順Ａによって精製した。
【０１６１】
（ジベンゾローダミン色素４１の合成（図７））
無水フタル酸誘導体としてジクロロトリメチル酸無水物（すなわち、化合物３４（ここで、Ｃ−１４およびＣ−１７での置換基はＣｌであり、Ｃ−１５での置換基はＣＯ_２Ｈである））、そしてアミノヒドロキシ中間体３１として１−ジエチルアミノ−３−ヒドロキシナフタレン４を使用して、一般手順Ａに従った。
【０１６２】
（ジベンゾローダミン色素４２の合成（図７））
無水フタル酸誘導体としてジクロロトリメチル酸無水物（すなわち、化合物３４（ここで、Ｃ−１４およびＣ−１７での置換基はＣｌであり、Ｃ−１５での置換基はＣＯ_２Ｈである））、そしてアミノヒドロキシ中間体３１としてＮ−メチル−５−ヒドロキシベンゾキノリンを使用して、一般手順Ａに従った。
【０１６３】
（ジベンゾローダミン色素４３の合成（図７））
無水フタル酸誘導体としてジクロロトリメチル酸無水物（すなわち、化合物３４（ここで、Ｃ−１４およびＣ−１７での置換基はＣｌであり、Ｃ−１５での置換基はＣＯ_２Ｈである））、そしてアミノヒドロキシ中間体３１として５−ヒドロキシベンゾキノリン１７を使用して、一般手順Ａに従った。
【０１６４】
（ジベンゾローダミン色素４４の合成（図７））
無水フタル酸誘導体としてジクロロトリメチル酸無水物（すなわち、化合物３４（ここで、Ｃ−１４およびＣ−１７での置換基はＣｌであり、Ｃ−１５での置換基はＣＯ_２Ｈである））、そしてアミノヒドロキシ中間体３１としてＮ−メチル−２，２，４−トリメチル−５−ヒドロキシベンゾキノリン２２を使用して、一般手順Ａに従った。
【０１６５】
（ジベンゾローダミン色素４５の合成（図７））
無水フタル酸誘導体としてジクロロトリメチル酸無水物（すなわち、化合物３４（ここで、Ｃ−１４およびＣ−１７での置換基はＣｌであり、Ｃ−１５での置換基はＣＯ_２Ｈである））、そしてアミノヒドロキシ中間体３１としてＮ−メチル−３，３−ジメチル−４−ヒドロキシベンゾインドリン２７を使用して、一般手順Ａに従った。
【０１６６】
（ジベンゾローダミン色素４６の合成（図７））
無水フタル酸誘導体としてジクロロトリメチル酸無水物（すなわち、化合物３４（ここで、Ｃ−１４およびＣ−１７での置換基はＦである）、そしてアミノヒドロキシ中間体３１としてＮ−エチル−３，３−ジメチル−４ヒドロキシベンゾインドリン２９を使用して、一般手順Ａに従った。
【０１６７】
（ジベンゾローダミン色素４７の合成（図７））
無水フタル酸誘導体としてジクロロトリメチル酸無水物（すなわち、化合物３４（ここで、Ｃ−１４およびＣ−１７での置換基はＣｌであり、Ｃ−１５での置換基はＣＯ_２Ｈである））、そしてアミノヒドロキシ中間体３１としてＮ−フェニル−３，３−ジメチル−４−ヒドロキシベンゾインドリン９を使用して、一般手順Ａに従った。
【０１６８】
（実施例９）
（選択されたジベンゾローダミン色素化合物のスペクトル特性）
以下の表は、本発明の数種の代表的なジベンゾローダミン色素化合物の重要なスペクトル特性を示す。全てのスペクトルは、色素のλ_{ｍａｘ，ａｂｓ}において０．０５の吸収を有する色素のついて、１×ＴＢＥ緩衝液および８Ｍ尿素中で、室温にて記録されている。色素濃度は、約１０^−６Ｍであった。
【０１６９】
【表１】


（実施例１０）
（３，３−ジメチルヒドロキシベンゾインドリン２５の合成（図８および９））
化合物２を、以下のようにパラジウムで触媒したトリフレート／イミンカップリングおよびＢｕｃｈｗａｌｄの加水分解手順（Ｂｕｃｈｗａｌｄ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９７，３８／３６，６３６７〜６３７０）を使用して、１−アミノ−３−メトキシナフタレン１８に転換した。（図８）。
【０１７０】
３−メトキシナフタレン−１−トリフレート２（２５ｇ）を、０．０１３当量のトリス（ジベンジリデンアセトン）−ジパラジウム（Ｐｄ_２（ｄｂａ）_３）、０．０４当量のラセミ酸２，２’−ビス（ジフェニルホスフィノ）−１，１’−ビナフトル（±ＢＩＮＡＰ）、１．３当量の炭酸カリウム、１．３当量の炭酸セシウム、および１．５当量のベンゾフェノンイミンと混合した。あるいは、カリウムまたはナトリウムｔ−ブトキシド（２．６当量）を、この反応のための置換塩基として使用した。この反応混合物を、７５ｍｌの無水トルエンおよび７５ｍｌの無水テトラヒドロフラン中に懸濁し、そして油浴中で２４時間１２０℃にて攪拌した。７５ｍｌのヘキサン／酢酸エチル（９：１）の混合物を、この反応物混合物に加え、そしてこの混合物を、ヘキサン／酢酸エチル（３：２）を用いてシルカゲルによって溶出した。この溶出液を収集し、次いで、減圧下で濃縮した。濃縮したオイルに、ヘキサン／酢酸エチル（９：１）を加えて、ベンゾフェノンイミノ−３メトキシナフタレン４９を黄色結晶として結晶化した（２０．０ｇ、７２．６％）。母液を濃縮し、ヘキサン／酢酸エチル（９：１）を加えて４９の第二群（ｓｅｃｏｎｄ ｃｒｏｐ）を黄色結晶として結晶化した（３．０ｇ、１０．９％）（全収率：８３．５％）。
【０１７１】
化合物４９を、酸性条件下にて加水分解して以下のように１８を得た。化合物４９（２７ｇｍ）を、１５０ｍｌの１，４−ジオキサンおよび１００ｍｌの５％ 硫酸（Ｈ_２ＳＯ_４）中に懸濁した。次いで、この反応物を加熱し、そして油浴中で１時間５０℃にて攪拌した。この反応混合物を室温まで冷却し、そして１５０ｍｌのヘキサン／酢酸エチル（３：２）で洗浄した。次いで、この溶液を、氷冷水性ＮａＯＨでｐＨ１０〜１１まで塩基性化して、酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機抽出物を、硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４）で乾燥し、そして減圧下でエバポレートして、淡褐色オイルとして１８を得、これを、放置したまま結晶化させた（１３．９ｇ、１００％）。
【０１７２】
化合物２５（３，３−ジメチルヒドロキシベンゾインドリン）を、上記実施例６の手順に従って、１８から合成した。
【０１７３】
（実施例１１）
（Ｎ置換メトキシベンゾインドリン中間体５７〜６１の合成（図９））
化合物２５を通常の中間体として用いて、アルキル置換またはパラジウムで触媒した第２級アミン基へのカップリングのいずれかによって、Ｎ−置換誘導体５７〜６１を合成した（図９）。
【０１７４】
（Ｎ−（６−ヘキサン酸）−３，３−ジメチルヒドロキシベンゾインドリン５７の合成）
化合物２５（２．３ｇ）を３当量の市販のメチル−６−ヨードヘキサン酸５２および３当量のジイソプロピルエチルアミンで処理することによってアルキル化した。この混合物を２３ｍｌの無水トルエン中に懸濁し、１８時間攪拌しながら油浴中で１３０℃で加熱した。溶媒を減圧下でエバポレートして、粗製Ｎ−（６−ヘキサン酸）−３，３−ジメチルヒドロキシベンゾインドリン５７を得た。粗製５７をジクロロメタン中に溶解し、ヘキサン／酢酸エチル（９９：１）で溶出する順相フラッシュクロマトグラフィーによって精製した（収率２．５５ｇ，７４％）。
【０１７５】
（Ｎ−（ビフェニル）−３，３−ジメチルヒドロキシベンゾインドリン５８の合成）
化合物２５（２．３ｇ）を以下のように、確立された手順（Ｂｕｃｈｗａｌｄ，ら，Ｊ．Ｏｒｇ．，１９９７，６２，６０６６−６０６８）に従ってパラジウムで触媒したカップリングによってＮ−アリール化した；化合物２５（２ｇ）を１．４当量の４−ブロモビフェニル７、ナトリウムｔ−ブトキシド（１．３当量）、０．０１３当量のトリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（Ｐｄ_２（ｄｂａ）_３）、０．０４当量のラセミ酸２，２’−ビス（ジフェニルホスフィノ）−１，１’−ビナフチル（±ＢＩＮＡＰ）と混合した。この混合物を１００ｍｌの無水トルエン中に懸濁し、十分攪拌し、そして油浴中で１３０℃にて一晩（１６時間）加熱した。この反応混合物を水性塩化アンモニウム（ＮＨ_４Ｃｌ）でクエンチし、酢酸エチルで抽出した（３×）。有機抽出物を無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥した。ヘキサン（等量）をこの粗製反応混合物に加え、それを、ヘキサン／酢酸エチル（１：１）を用いてシリカゲルによって溶出した。溶媒を減圧下でエバポレートし、残渣をヘキサン／酢酸エチル（９８：２）で溶出する順相フラッシュクロマトグラフィーによって精製して、Ｎ（ビフェニル）−３，３−ジメチルヒドロキシベンゾインドリン５８（収率８５％）を白色粉末として得た。
【０１７６】
（Ｎ−（カルボキシビフェニル）−３，３−ジメチルヒドロキシベンゾインドリン５９の合成）
化合物５４をハロホルム反応によって市販のブロモビフェニルメチルケトンから合成して、ブロモビフェニル酸を得、続いて、確立された手順を用いてエステル化した。化合物２５を、以下のように、確立された手順（Ｂｕｃｈｗａｌｄ，ら Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９７，３８／３６，６３５９−６３６２）に従って５４でＮ−アリール化した：化合物２５（０．４ｇ）を１．４当量の化合物５４、０．０１３当量のトリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（Ｐｄ_２（ｄｂａ）_３）、０．０４当量のラセミ酸２，２’−ビス（ジフェニルホスフィノ）−１，１’−ビナフチル（±ＢＩＮＡＰ）、および３当量の炭酸セシウムと混合した。この反応混合物を１００ｍｌの無水トルエンおよび１００ｍｌの無水テトラヒドロフラン中に懸濁し、次いで、油浴中で１３０℃にて加熱し、そして１８時間攪拌した。この反応物を冷却し、粗製混合物にヘキサン（３０ｍｌ）を加えた。この粗製生成物をヘキサン／酢酸エチル（３：２）を用いて、シリカゲルによって溶出した。この溶媒を減圧下で除去し、Ｎ−（カルボキシビフェニル）−３，３−ジメチルヒドロキシベンゾインドリン５９をヘキサン／酢酸エチル：（９５：５）を使用する順相フラッシュクロマトグラフィーによって精製した（明黄色固体収率０．２５ｇ、３２％）。
【０１７７】
（Ｎ−フェニル−３，３−ジメチルヒドロキシベンゾインドリン６０の合成）
化合物２５を、化合物２５からの化合物５８の合成について上述したようにヨードベンゼンまたはブロモベンゼンでＮ−アリール化した。純粋なＮ−フェニル−３，３−ジメチルヒドロキシベンゾインドリン８を、ヘキサン／酢酸エチル：（９８：２）を使用する順相フラッシュクロマトグラフィーの後に単離した。
【０１７８】
（Ｎ−カルボキシフェニル−３，３−ジメチルヒドロキシベンゾインドリン６１の合成）
化合物２５を、化合物５９の合成について上述したようにヨード安息香酸メチルまたは臭化安息香酸メチルでＮ−アリール化した。純粋なＮ−カルボキシフェニル−３，３−メチルヒドロキシベンゾインドリン６１を、ヘキサン／酢酸エチル：（９５：５）を使用する順相フラッシュクロマトグラフィーの後に単離した。
【０１７９】
（実施例１２）
（ジベンゾローダミン色素６７、７２、７６および８１の合成（図１０〜１３）
（色素６７の合成（図１０））
ヒドロキシインドリン６２を、以下の手順に従って塩化アルミニウム（ＡｌＣｌ_３）を使用する化合物５８の脱メチル化によって得た：化合物５８（２ｇ）および塩化アルミニウム（６ｇ）を、アルゴンの強い流れの下で完全に混合し、そしてこの反応混合物を、アルゴンで１０分間パージした。この固体混合物を、アルゴン下で、９０℃〜１２０℃まで油浴中にて２０分間にわたって加熱した。この反応混合物を冷却し、そしてこの固体をジクロロメタン中に懸濁し、氷および希Ｈ_２ＳＯ_４の溶液に移した。水層を、５回抽出し、合わせた有機抽出物を、飽和塩化ナトリウムで洗浄し、そして硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過した後、この溶媒を、減圧下でエバポレートし、そして純粋な６２（０．１３ｇ）を、ジクロロメタン／メタノール（９９：１）を使用する順相フラッシュクロマトグラフィーの後に単離した。ヒドロキシインドリン６３を、化合物６２からの化合物５８の転換と同じ手順を使用して、化合物５９から生成した。
【０１８０】
次に、１当量の１：１のＮ−メチルホルムアニリドおよび無水オキシ塩化物の複合体を含有する無水ジクロオロメタンを、小西洋ナシ形（ｐｅａｒ）フラスコ（５ｍｌフラスコ中１００ｍｇ）中の１当量の６２に加えた。この反応混合物を、アルゴンの流れの下で、ジクロロメタンがエバポレートして暗赤色オイルが残るまで、油浴中で８０℃にて加熱した。ニトロベンゼン（３００μｌ）を加え、続いて２当量のＰＯＣｌ_３を加えた。この上記溶液に、ニトロベンゼン（５００μｌ）に懸濁した１当量の６３を加えた。この反応混合物を、２５分間にわたって８０℃〜１５５℃まで加熱し、次いで、１５分間１５５℃に保った。この反応物を冷却し、ジクロロメタンと共に５％ＨＣｌに移した。水層をブラインで飽和させ、そしてジクロロメタンで３回抽出した。合わせた有機抽出物を分離し、そして減圧下でエバポレートして、粗製の色素誘導体６４を得た。粗製の６４を、酢酸（３ｍｌ）および５％ＨＣｌ（３ｍｌ）中に懸濁し、６０℃にて１時間加熱した。次いで、この反応混合物を、氷冷した塩化ナトリウム飽和水溶液中に注ぎ、ジクロロメタンで３回抽出した。合わせた有機層をエバポレートした後、次いで、純粋なモノカルボキシル化非対称性色素誘導体６５を、ジクロロメタン／メタノール（９：１）で溶出する順相フラッシュクロマトグラフィーによって、他の２種の対称性色素生成物（ビス−ビフェニル色素およびビス−カルボキシフェニル色素）から精製した。
【０１８１】
最後に、この精製した色素誘導体６５をスルホン化して、以下のような色素６７を得た。色素誘導体６５（３０ｍｇ）および３当量の無水硫酸ナトリウムを、アルゴン下で０℃にて、無水クロロメタン（５０ｍｌ）中に懸濁した。上記溶液に、５当量の塩化スルホン酸（ＣｌＳＯ_３Ｈ）を加え、そしてこの反応混合物を、室温にて１８時間攪拌した。この反応混合物を、飽和水性塩化ナトリウム／５％ ＨＣｌでクエンチし、そして水層を、ジクロロメタンで３回抽出した。有機層を減圧下でエバポレートして、粗製色素６６を得た。粗製色素６６を、ジオキｓンおよび５％ＨＣｌ（２：１）の溶液中に懸濁し、そして室温にて２０時間攪拌した。次いで、この溶液を減圧下で濃縮し、飽和水性塩化ナトリウム中に懸濁し、そしてジクロロメタンで３回抽出した。この溶媒をエバポレートして、粗製色素６７を得た。純粋な色素６７を、メタノール／ジクロロメタン（１：４）を用いて展開する順相の分取薄層クロマトグラフィー（ＰＴＬＣ）、メタノール／ジクロロメタン（１：９）を用いるフラッシュカラムクロマトグラフィーによって単離した。
【０１８２】
（色素７２の合成（図１１））
化合物６２を化合物５８に転換するための、上記塩化アルミニウム脱保護手順をともに使用して、化合物６１を脱メチル化して化合物６８を得、そして化合物８を脱メチル化して化合物９を得た。化合物６８を、メチルホルムアニリド／ＰＯＣｌ_３複合体と反応させ、続いて、化合物９と反応させて、化合物６２および６３からの色素誘導体６４の合成について記載したように、色素誘導体７０を生成した。粗製色素誘導体７０を、酸によって加水分解して、上記６４からの色素誘導体６５の生成手順に従って、色素誘導体７１を得た。純粋な非対称性色素誘導体７１を、２種の対称性ビスフェニルおよびビス−カルボキシフェニル色素生成物からのＰＴＬＣによって精製した。次いで、この精製した色素７１をスルホン化および加水分解して、色素誘導体６５からの色素６７の生成について上記したように、粗製色素７２を得た。純粋な色素７２を、メタノール／ジクロロメタン（１：４）を用いて展開する順相の分取薄層クロマトグラフィー（ＰＴＬＣ）、メタノール／ジクロロメタン（１：９）を用いるフラッシュカラムクロマトグラフィーによって単離した。
【０１８３】
（色素７６の合成（図１２））
化合物５７を脱メチル化して、三臭化ホウ素脱保護によって化合物７３を得、そして、化合物８を脱メチル化して、化合物６２からの化合物５８の転換について上記した、塩化アルミニウム脱保護手順を使用して、９を得た。化合物５７を、標準条件下でメチルホルムアニリド／ＰＯＣｌ_３複合体と反応させ、続いて、標準条件下で化合物９と反応させて、上記実施例７のように色素誘導体７４を生成した。粗製色素誘導体７４を、標準的な酸加水分解によって加水分解して、色素誘導体７５を得た。この純粋な非対称性色素誘導体７５を、２種の対称性ビスフェニルおよびビス−ヘキサン色素生成物からのＰＴＬＣによって精製した。次いで、この純粋な色素７５を、６５から６７を形成するために記載された標準的な手順によってスルホン化して、粗製色素７６を得た。純粋な色素７６を、メタノール／ジクロロメタン（１：４）を用いて展開する順相の分取薄層クロマトグラフィー（ＰＴＬＣ）、メタノール／ジクロロメタン（１：９）を用いるフラッシュカラムクロマトグラフィーによって単離した。
【０１８４】
（色素８１の合成（図１３））
化合物５７（０．３１３ｇ）を、室温にて３時間にわたって、７当量の１Ｍ ＫＯＨを含有するメタノールで処理することによって鹸化した。この溶液を、乾燥するまで濃縮し、そしてオイルを酢酸エチルおよび５％塩酸で十分に抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、そして無色オイルになるまで濃縮した。純粋な７７を、５％メタノール／ジクロロメタン／０．１％酢酸を使用する順相クロマトグラフィーによって単離した（収率０．２４３ｇ；８４％）。
【０１８５】
次に、化合物７７（０．３６０ｇｍ）を、無水ジクロロメタン（２ｍｌ）、ならびにジクロロメチルメチルエーテル（２．６当量）および四塩化スズ（４当量）の溶液中に溶解した。この溶液を、１．５時間還流した。この混合物を、酢酸エチルおよび３Ｍ塩酸溶液で抽出した。有機層を、水およびブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、オイルになるまで濃縮し、そして精製することなく使用した。薄層クロマトグラフィーによって、この時点で、ほぼ等モルの化合物７７および７８の混合物が存在した。このオイルを、無水ジクロロメタン（８ｍｌ）中に懸濁し、そして−７８℃まで冷却した。この混合物の脱メチル化を、確立された三臭化ホウ素手順によって行って、化合物７９と化合物８０との混合物を得た。得られた粗製オイルを、無水ジクロロメタン（５ｍｌ）中に溶解し、そしてオキシ塩化リン（２当量）を加え；次いで、ニトロベンゼン（５ｍｌ）を加えた。この混合物を、４５分間にわたって８０〜１５０℃まで加熱し、そして、即座に加熱を停止した（ｒｅｍｏｖｅ）。ワークアップおよび単離を、化合物６７の合成についての実施例１２のように行って、粗製色素８１を得た。純粋な色素８１を、化合物６７の合成について実施例１２で記載したように、ＰＴＬＣによって単離した（収率３２ｍｇ）。
【０１８６】
（実施例１３）
（化合物６７、７２、７６および８１の色素カルボキシＮ−ヒドロキスクシンイミド誘導体の合成、ならびにこの誘導体のヌクレオチドおよびポリヌクレオチドへのカップリング（図１４および１５））
カルボン酸色素６７、７２、７６および８１のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）誘導体化を、２つの方法の１つによって行った。ＮＨＳ色素８２、８３および８４の合成については、方法Ａを、Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート試薬を用いて行い、一方、色素８５については、方法Ｂを、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドを使用して行った。
【０１８７】
（方法Ａ：）
色素を、６当量のジイソプロピルエチルアミンと共に、無水ＤＭＦ（５ｍｇ色素：３００μｌ ＤＭＦ）中に懸濁した。この色素溶液に、１５当量のＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートを加え、そしてこの反応物を室温にて１５分間攪拌した。この反応物を、ジクロロメタンとともに５％ ＨＣｌ（２０ｍｌ）中に移した。水層を、飽和ＮａＣｌを加えることによって塩にし、そしてジクロロメタンで３回抽出した。合わせた有機層を、乾燥するまで濃縮し、そして粗製色素ＮＨＳを、ＭｅＯＨ／ＣＨ_２Ｃｌ_２（１：９）を使用する順相フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。
【０１８８】
（方法Ｂ：）
色素および２０当量のＮ−ヒドロキシスクシンイミドを、無水ジクロロメタン（５ｍｇ：５００μｌ ＣＨ_２Ｃｌ_２）中に懸濁した。９当量のジシクロヘキシルカルボジイミドを加え、そしてこの反応物を、室温にて１時間攪拌した。この反応物をクエンチし、そして純粋な色素ＮＨＳを、方法Ａについてと同様に単離した。
【０１８９】
ＮＨＳ誘導体のヌクレオチドおよびポリヌクレオチドへの結合を、以下のように行った。アミノ基置換オリゴマーまたはターミネーターを、ホルムアミド（５×１０^−４Ｍ）中に懸濁し、そして１５当量のジイソプロピルエチルアミンを加えた。ＤＭＳＯ（５ｍｇ／６０μｌ）中に懸濁した過剰な（５〜１０当量）の無水ＮＨＳを、室温にて攪拌しながら加えた。この反応物を、室温にて４時間攪拌した。この反応混合物に３Ｍ ＮａＯＡｃを加えて、０．５Ｍ ＮａＯＡｃを得た。ＥｔＯＨの反応容量を４回加え、そしてこの混合物を冷却した。沈殿した色素標識オリゴマーを、遠心分離によって単離し、そして３０％ ＡｃＣＮ／０．１×ＴＥＡＡ緩衝液で溶出する逆相ＨＰＬＣによって精製した。
【０１９０】
（実施例１４）
（スルホメトキシベンゾインドリン８９の合成（図１６））
メトキシベンゾインドリン８６（１ｇ、０．００４４ｍｏｌ）を、５０ｍｌの無水ＣＨ_２Ｃｌ_２中に懸濁し、そしてこの溶液を、水／アセトンのドライアイス浴中で−２０℃まで冷却し、そしてアルゴンで十分にパージした（図１６）。この攪拌溶液に、１．１当量（０．８２ｍｌ）の無水トリフルオロメタンスルホン酸を滴下した。この無水物の添加が終わった後、この反応物を、−２０℃に維持し、そして、２当量の無水トリエチルアミン（１．２ｍｌ）を滴下しながら攪拌した。１時間後、この反応物を、５％ ＨＣｌを加えることによって、−２０℃にてクエンチし、そして水相を、ＣＨ_２Ｃｌ_２で３回抽出した。合わせた有機層を、飽和ＮａＨＣＯ_３、ブラインで洗浄し、そしてＮａＳＯ_４で乾燥し、濾過し、そして溶媒を、減圧下で除去した。この粗製生成物を、ヘキサン：ＣＨ_２Ｃｌ_２（３：２）で溶出する順相クロマトグラフィーによって精製して、２．３ｇのスルホンアミド８７を得た（６８％収率）。
【０１９１】
２５０ｍｌの丸底フラスコ中で、スルホンアミド８７（１ｇ、０．００２７９ｍｏｌ）および顆粒状の無水Ｎａ_２ＳＯ_４（０．１ｇ）を、１００ｍｌの無水ＣＨ_２Ｃｌ_２中に懸濁した。この反応混合物をアルゴンでパージし、そして０℃まで冷却した。迅速に攪拌した溶液に、１当量のクロロスルホン酸（１８５μｌ）を滴下した。この反応物を室温まで温め、そしてアルゴン下で１６時間攪拌した。この反応物を、５０ｍｌのＴＨＦ、７５ｍｌの１Ｍ ＮａＯＨを加えることによってクエンチし；そして２時間攪拌した。１当量の硫酸水素テトラブチルアンモニウム（１ｇ）を、この混合物に加え、そして水相を、ＣＨ_２Ｃｌ_２で５回抽出した。有機相を減圧下で濃縮して、油状の８８の固体混合物および他の位置異性体（ｒｅｇｉｏｉｓｏｍｅｒｓ）を得た。ＭｅＯＨ：ＣＨ_２Ｃｌ_２（８：９２）で溶出する順相クロマトグラフィーによる精製によって、１ｇの純粋な８８（５３％収率）のモノテトラブチルアンモニウム塩を得た。
【０１９２】
スルホンアミド８８のテトラブチルアンモニウム塩（１ｇ）を、５０ｍｌの無水ＴＨＦ中に懸濁した。水素化リチウムアルミニウム（２０当量、１ｇ）を慎重に加え、そして、この反応物を、アルゴン下で２時間還流した。この反応物を、氷、次いで、５０ｍｌの１Ｍ ＮａＯＨを慎重に加えることによってクエンチした。テトラブチル硫酸水素アンモニウム（１ｇ）をこの混合物に加え、そしてこの混合物を、減圧下で濃縮して大部分のＴＨＦを除去した。この混合物を、分液漏斗に移し、ＣＨ_２Ｃｌ_２で５回抽出した。合わせた有機層を、減圧下でオイルになるまで濃縮し、そしてＭｅＯＨ：ＣＨ_２Ｃｌ_２（８：９２）で溶出する順相クロマトグラフィーによって精製して、０．７３３ｇの純粋な８９（８９％収率）のテトラブチルアンモニウム塩を得た。
【０１９３】
（実施例１５）
（スルホメトキシナフトインドリン９３の合成（図１７ａおよび１７ｂ））
メトキシナフトインドリン９０を、２４．９ｇの１，３−ジメトキシアントラセン１２１（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ（１９９２）Ｊｏｕｒ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５７：７１２２−２６）を含有する４８％ ＨＢｒ（１７５ｍｌ）および氷状酢酸（４５０ｍｌ）を、９０℃にて１時間加熱することによって調製した（図１７ａ）。この反応混合物を、攪拌しながら、氷および水にゆっくりと注いだ。１，３−ジヒドロキシアントラセン１２２の沈殿物が、直ちに形成され、これを濾過し、３００ｍｌの冷水で洗浄し、そして褐色固体として収集した。化合物１２２を、０．１４Ｍ ＨＣ１を含有するメタノールに５℃にて加え、そしてアルゴン下で３時間５℃にて維持した。この反応混合物を、冷水（１０００ｍｌ）で希釈し、そして３：２ ヘキサン／酢酸エチルの混合物で３回抽出した。合わせた有機抽出物を、飽和ＮａＣｌで洗浄し、そしてＮａ_２ＳＯ_４で乾燥した。濾過した後、減圧下で溶媒を除去し、そして、ヘキサンおよび酢酸エチルで溶出する順相シリカゲルクロマトグラフィーによって、１２３を明黄色固体として得た（６．９３ｇ、６６％）。
【０１９４】
トリフルオロメタンスルホン酸無水物（６．８ｍｌ）を、１２３（７．０ｇ、０．０３１ｍｏｌ）およびジクロロメタン（６００ｍｌ）の攪拌溶液に、アルゴン下で−６０℃にてゆっくりと加えた。２０分後、トリエチルアミン（５．６５ｍｌ）を、この反応物に滴下した。この反応混合物を、−３０℃にて３０分間攪拌し、次いで、５％硫酸中に注いだ。次いで、この混合物を、４００ｍｌのヘキサン：ジクロロメタン ２：３の混合物で抽出し、飽和ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮した。ヘキサンおよび酢酸エチルで溶出する順相シリカゲルクロマトグラフィーによって、淡黄色オイルとして１２４を得、これを、冷却して凝固させた。ヒドラジン（６ｍｌ）を、１２４（６ｇ、０．０１７ｍｏｌ）、Ｃｓ_２ＣＯ_３（３０ｇ）、Ｐｄ_２（ｄｂａ）_３（０．７５ｇ）、ＢＩＮＡＰ（１．５ｇ）、トルエン（１００ｍｌ）、およびＴＨＦ（１００ｍｌ）の攪拌溶液に、アルゴン下で室温にて加え、次いで、９０〜１００℃にて１時間加熱した。冷却した溶液を濾過し、そして溶媒を減圧下で除去して、褐色固体して１２５を得た。１２５を含有する無水エタノールおよびイソブチルアルデヒド（１４ｍｌ）の溶液を、９０〜１００℃にて加熱した。この溶液を、乾燥するまでエバポレートし、そしてヘキサンおよび酢酸エチルで溶出する順相シリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、淡黄色固体として１２６を得た。
【０１９５】
１２６を含有する氷酢酸（１５０ｍｌ）の溶液を、アルゴン下で攪拌しながら、８８℃にて１時間加熱した。この溶液を、氷浴中で冷却し、そしてＮａＣＮＢＨ_３（３ｇ）を、１５分間にわたって一部ずつ加え、室温にてさらに１５分間攪拌した。酢酸を減圧下で除去し、残渣をジクロロメタン中に懸濁し、そして１Ｎ ＮａＯＨ、飽和ＮＨ_４Ｃｌ、および飽和ＮａＣｌで洗浄した。溶媒を、減圧下で除去し、そして残渣を、ヘキサンおよび酢酸エチルで溶出する順相シリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、淡黄色固体として９０を得た（２．５ｇ、５３％）。
【０１９６】
メトキシナフトインドリン９０（１ｇ、３．６ｍｍｏｌ）を、４０ｍｌの無水ＣＨ_２Ｃｌ_２中に懸濁し、溶媒を、氷浴中で０℃まで冷却し、そしてアルゴンでパージした（図１７）。この攪拌溶液に、１．５当量のトリフルオロ酢酸無水物（０．７６ｍｌ）を滴下した。この無水物の添加が終了した後、この反応物を０℃に維持し、２当量の無水トリエチルアミン（１ｍｌ）を滴下しながら攪拌した。１時間後、この反応物を、５％ ＨＣｌを加えることによってクエンチし、そして水相を、飽和ＣＨ_２Ｃｌ_２で３回抽出した。合わせた有機層を、ＮａＨＣＯ_３、ブラインで洗浄し、そして有機層を、ＮａＳＯ_４で乾燥し、濾過し、そして溶媒を減圧下で除去した。粗製生成物を、１：４ ＥｔＯＡｃ：ヘキサンを使用する順相クロマトグラフィーによって精製して、黄色固体として１ｇの９１を得た（収率７４％）。
【０１９７】
トリフルオロアセトアミド９１（１ｇ、２．７ｍｍｏｌ）を、６０ｍｌの氷酢酸および６ｍｌの無水ＣＨ_２Ｃｌ_２中に懸濁した。溶媒を、アルゴンで十分にパージし、そして０℃まで冷却した。この溶液を、十分に攪拌し、そしてクロロスルホン酸（４ｍｌ、２０当量）を滴下した。この反応物を、室温まで温め、そして３日間攪拌した。この反応物を、最少量の氷（約１ｇ）を加えることによってクエンチした。酢酸の除去を補助するためにトルエンを加えながら、この溶媒を減圧下（ｅｎ ｖａｃｕｏ）で除去した。この粗製反応混合物を、最少量の１：４ ＭｅＯＨ：ＣＨ_２Ｃｌ_２中に懸濁し、そして最初にＣＨ_２Ｃｌ_２で溶出し、次いで、１：２０ ＭｅＯＨ：ＣＨ_２Ｃｌ_２まで増加させるシリカゲルプラグを通して部分的に精製して、９２と他のスルホン化位置異性体との混合物を得た。
【０１９８】
９２を含有する混合物を、１００ｍｌのＭｅＯＨ（１ｍｌの水および１．５ｇのＫ_２ＣＯ_３を含有する）中に懸濁することによって脱保護した。この反応物を、室温にて３０分間攪拌した。この粗製反応混合物を、ＭｅＯＨで溶出するシリカゲルのプラグに通し、そして溶媒を、減圧下で除去した。所望の異性体であるスルホメトキシナフトインドリン９３（０．３５０ｇ、収率３７％）を、１：９〜１：６ ＭｅＯＨ：ＣＨ_２Ｃｌ_２の勾配溶出を使用する順相クロマトグラフィーによって、副生成物異性体から分離した。（図１７ｂ）。
【０１９９】
（実施例１６）
（ホルミルスルホメトキシベンゾインドリン１０６の合成（図２０））
メチル−６−ブロモヘキサノエートでの、８９の加熱しながらアルキル化よって、Ｎ−メチルカルボキシヘキシルスルホメトキシベンゾインドリン９４（図１８）を調製した。１００ｍｌの丸底フラスコ中で、テトラブチルアンモニウム塩の混合物として、１ｇ（９１８、１．１ｍｍｏｌ）の９４を、２５ｍｌの無水ＣＨ_２Ｃｌ_２中に懸濁した。この溶液を、アルゴンで十分にパージし、そして氷浴中で０℃まで冷却した。この攪拌溶液に、５当量の新たに作製したＰＯＣｌ_３／ＤＭＦの１：１ Ｖｉｌｓｍｅｙｅｒ複合体を含有するＣＨ_２Ｃｌ_２（５当量の複合体を含有する約１ｍｌのＣＨ_２Ｃｌ_２、以下を参照のこと）を滴下した。この反応物を、氷浴から取り除き、そして室温にて１時間攪拌した。この反応物を、飽和ＮａＨＣＯ_３（１０ｍｌ）およびＴＨＦ（２０ｍｌ）を加えることによってクエンチし、そして室温にて３０分間攪拌した。この混合物を、ＣＨ_２Ｃｌ_２ともに、分液漏斗に移し、有機層を除去し、水層を、ＣＨ_２Ｃｌ_２で３回抽出し、そして合わせた有機層を濃縮して、粗製の１０６を得た（図２０）。この粗製オイルから、純粋なアルデヒド１０６を、ＥｔＯＡｃ：ヘキサン（１：２）を使用する順相クロマトグラフィーによって単離して、黄色固体を得た（０．２２２ｇ、４２％収率）。
【０２００】
（実施例１７）
（ホルミルスルホメトキシナフトインドリン１０８の合成（図２０））
メチル４−（ブロモメチル）ベンゾエートでの、９３（図１８）の加熱しながらのアルキル化によって、スルホメトキシナフトインドリン１０１（図１９）を調製した。１００ｍｌの丸底フラスコ中で、テトラブチルアンモニウム塩として、１ｇ（１ｍｍｏｌ）の１０１を、２５ｍｌの無水ジクロロメタン中に懸濁した。この溶液を、アルゴンで十分にパージし、そして氷浴中で０℃まで冷却した。この攪拌溶液に、５当量の新たに作製したＰＯＣｌ_３／ＤＭＦの１：１ Ｖｉｌｓｍｅｙｅｒ複合体を含有するＣＨ_２Ｃｌ_２（５当量を含有する約１ｍｌのＣＨ_２Ｃｌ_２、以下を参照のこと）を滴下した。室温にて１時間攪拌した後、この反応物を、飽和ＮａＨＣＯ_３（１０ｍｌ）およびＴＨＦ（２０ｍｌ）を加えることによってクエンチし、そして室温にて３０分間攪拌した。この混合物を、ＣＨ_２Ｃｌ_２ともに、分液漏斗に移し、有機層を除去し、水層を、ＣＨ_２Ｃｌ_２で３回抽出した。合わせた有機層濃縮して、粗製の１０８を得た（図２０）。この粗製生成物を、ＥｔＯＡｃ：ヘキサン（１：２）を使用する順相クロマトグラフィーに供して、０．４９７ｇの純粋なアルデヒド生成物１０８を黄色固体として得た（９０％収率）。
【０２０１】
（Ｖｉｌｓｍｅｙｅｒ試薬）
１０ｍｌのフラスコを、８．５ｍｌの無水ＣＨ_２Ｃｌ_２および６６０μｌの無水ＤＭＦでチャージした。この溶液を０℃まで冷却し、そしてアルゴンで十分にパージした。この攪拌溶液に、７９０μ１のＰＯＣｌ_３を滴下した。この反応物を、使用前に０℃にて１５分間攪拌した。次いで、必要量の複合体を、必要に応じてシリンジで取り出した。
【０２０２】
（実施例１８）
（スルホン化ジベンゾローダミン色素１１１の合成（図２２ａ））
１，３−プロパンスルホン（１，３−ｐｒｏｐａｎｅ ｓｕｌｔｏｎｅ）での、８９（図１６）の熱しながらのアルキル化によって、Ｎ−プロピルスルホネートベンゾインドリン９６（図１８）を調製した。２０ｍｌの西洋ナシ形フラスコ中に、５０ｍｇのホルミルベンゾインドリン１０６（図２０）、１．２当量の９６、５ｍｌ 無水ＣＨ_２Ｃｌ_２および３ｍｌ 無水ニトロベンゼンを加えた。この混合物を攪拌し、大部分のＣＨ_２Ｃｌ_２がエバポレートするまで、アルゴン蒸気下で、１１０℃まで加熱した。過剰なオキシ塩化リン（３００μｌ、６０当量）を、一部ずつ加え、そしてこの反応物を、２時間攪拌しながら加熱した。
【０２０３】
この反応物を、手短に冷却し、次いで、５ｍｌのＭｅＯＨを加え、そしてこの反応物を、５分間加熱還流した。ＭｅＯＨおよびいくらか過剰なニトロベンゼンを、減圧下で除去し、そしてこの粗製混合物を、順相シルカゲルカラムに充填した。色素１１１を、１００％ ＣＨ_２Ｃｌ_２〜１：９ ＭｅＯＨ：ＣＨ_２Ｃｌ_２の勾配溶出によって溶出した。エステル化色素１１１を含有する画分を、可視吸収スペクトル（ＭｅＯＨ中において６３８ｎｍで吸収最大値）、蛍光発光スペクトル（ＭｅＯＨ中において６５１ｎｍで発光最大値）、および質量スペクトル（分子イオン＋３メチル基は、８７１．５に相当する、算出値：８７１．３）によって示されるように収集し、オイルになるまで濃縮した。スルホン酸メチルエステル基およびカルボン酸メチルエステル基を、１００ｍｌ ＭｅＯＨ、２０ｍｌ 水、０．８５ｇ ＬｉＯＨ水和物中に懸濁することによって加水分解し、そして８０℃にて１時間加熱した。メタノールのバルクを、減圧下で取り除いた。３当量のテトラブチルアンモニウム塩を加え、そして水層を、ＣＨ_２Ｃｌ_２で５回抽出した。合わせた有機層を、オイルになるまで濃縮し、そして１：３ ＣＨ_３ＣＮ：Ｈ_２Ｏを使用する逆相ＨＰＬＣを行って、２０％の全体の収率において純粋な色素１１１を得た（図２２ａ）。
【０２０４】
（実施例１９）
（スルホン化ベンゾナフトローダミン色素１１５の合成（図２２ｂ））
１，３−プロパンスルホンでの、９３（図１７）の加熱しながらのアルキル化によって、Ｎ−プロピルスルホネートナフトインドリン１０２（図１９）を調製した。ホルミルベンゾインドリン誘導体１０７（図２０）を、９５（図１８）を実施例１７の手順によってホルミル化することによって調製した。
【０２０５】
２０ｍｌの洋ナシ形フラスコ中に、５０ｍｇの１０７、１．２当量の１０２、５ｍｌのＣＨ_２Ｃｌ_２および３ｍｌのニトロベンゼンを加えた。この混合物を攪拌し、そしてアルゴン蒸気下で大部分のＣＨ_２Ｃｌ_２がエバポレートするまで、１２０℃まで加熱した。過剰なオキシ塩化リン（３００μｌ、６０当量）を、一部ずつ加え、そしてこの反応物を、攪拌しながら２時間加熱した。この反応物を、手短に冷却し、次いで、１０ｍｌのＭｅＯＨを加え、この反応物を５分間加熱還流した。ＭｅＯＨおよびいくらか過剰なニトロベンゼンを、減圧下で除去し、そしてこの粗製混合物を、順相シルカゲルカラムに充填した。色素１１５のメチルエステルを、１００％ ＣＨ_２Ｃｌ_２〜１：９ ＭｅＯＨ：ＣＨ_２Ｃｌ_２の勾配溶出によって溶出した。１１５のメチルエステルを含有する画分を、可視吸収スペクトル（ＭｅＯＨ中において６５６ｎｍで吸収最大値）、蛍光発光スペクトル（ＭｅＯＨ中において６７２ｎｍで発光最大値）、および質量スペクトル（分子イオン＋３メチル基は、８８５．３に相当する、算出値：８８５．２）によって示されるように収集し、オイルになるまで濃縮した。スルホン酸メチルエステル基およびカルボン酸メチルエステル基を、１００ｍｌ ＭｅＯＨ、２０ｍｌ水、０．８５ｇ ＬｉＯＨ水和物中に懸濁することによって加水分解し、そして８０℃にて１時間加熱した。メタノールのバルクを、減圧下で取り除いた。３当量のテトラブチルアンモニウム塩を加え、そして水層を、ＣＨ_２Ｃｌ_２で５回抽出した。合わせた有機層を、オイルになるまで濃縮し、そして１：３ ＣＨ_３ＣＮ：Ｈ_２Ｏを使用する逆相クロマトグラフィーを行って、２０％の全体の収率において純粋な色素１１５を得た（図２２ｂ）。
【０２０６】
（実施例２０）
（スルホン化ジナフトローダミン色素１２０の合成（図２２ｃ））
１，３−プロパンスルホンでの、９３（図１７）の加熱しながらのアルキル化によって、Ｎ−プロピルスルホネートナフトインドリン１０２（図１９）を調製した。ホルミルベンゾインドリン誘導体１０８（図２０）を、１０１（図１９１）を実施例１７の手順によってホルミル化することによって調製した。
【０２０７】
２０ｍｌの洋ナシ形フラスコ中に、５０ｍｇの１０８、１．２当量の１０２、５ｍｌのＣＨ_２Ｃｌ_２および３ｍｌのニトロベンゼンを加えた。この混合物を攪拌し、そしてアルゴン蒸気下で大部分のＣＨ_２Ｃｌ_２がエバポレートするまで、１１０℃まで加熱した。過剰なオキシ塩化リン（３００μｌ、６０当量）を、一部ずつ加え、そしてこの反応物を、攪拌しながら２時間加熱した。この反応物を、手短に冷却し、次いで、５ｍｌのＭｅＯＨを加え、この反応物を５分間加熱還流した。ＭｅＯＨおよびいくらか過剰なニトロベンゼンを、減圧下で除去し、そしてこの粗製混合物を、順相シルカゲルカラムに充填した。色素１２０を、１００％ ＣＨ_２Ｃｌ_２〜１：９ ＭｅＯＨ：ＣＨ_２Ｃｌ_２の勾配溶出によって溶出した。エステル化色素１２０を含有する画分を、可視吸収スペクトル（ＭｅＯＨ中において６８６ｎｍで吸収最大値）、蛍光発光スペクトル（６９５ｎｍで発光最大値）、および質量スペクトル（分子イオン＋３メチル基は、９９１．５に相当する、算出値：９９１．３）によって示されるように収集し、オイルになるまで濃縮した。スルホン酸メチルエステル基およびカルボン酸メチルエステル基を、１００ｍｌ ＭｅＯＨ、２０ｍｌ 水、０．８５ｇ ＬｉＯＨ水和物中に懸濁することによって加水分解し、そして８０℃にて１時間加熱した。メタノールのバルクを、減圧下で取り除いた。３当量のテトラブチルアンモニウム塩を加え、そしてこの反応物を、ＣＨ_２Ｃｌ_２で５回抽出した。合わせた有機層を、オイルになるまで濃縮し、そして１：３ ＣＨ_３ＣＮ：Ｈ_２Ｏを使用する逆相クロマトグラフィーを行って、２０％の全体の収率において純粋な色素１２０を得た（図２２ｃ）。
【０２０８】
（実施例２１）
（スルホン化ジアリールローダミン−ターミネーターを用いたｐＧＥＭの配列決定）
米国特許第５，７７０，７１６号；同第５，９４８，６４８号；および同第６，０９６，８７５号の条件に従って、本発明のスルホン化ジアリールローダミン色素で標識されたターミネーターを、サンガー型の４色自動化ＤＮＡ配列決定実験において他の標準試薬とともに使用する。
【０２０９】
色素−ターミネーター配列決定反応を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ^ＴＭ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ Ｍａｎｕａｌ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ４０２１１６）によって提供されるプロトコルに従って、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＦＳを使用して行う。ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）テンプレートの配列決定を、未標識の−２１ Ｍ１３配列決定プライマー（順方向）を用いて行った。試薬（緩衝液、未標識プライマー、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＦＳ）を含む）は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ^ＴＭ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ４０２１１７）由来であり得る。ｄＮＴＰミックスは、各々２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、およびｄＵＴＰまたはｄＴＴＰからなり得る。以下を含有する反応組成物のプレミックスを調製する：５×緩衝液４．０μＬ；ｄＮＴＰミックス １．０μＬ；テンプレート：ｐＧＥＭ（登録商標）−３Ｚｆ（＋）、０．２μｇ／μＬ、２．０μＬ；プライマー：−２１ Ｍ１３（順方向）、０．８ｐｍｏｌ／μＬ、４．０μＬ；ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＦＳ）、０．５μＬ；および、Ｈ_２Ｏ ３．５μＬ（ここで、全ての量は、反応に基づいて与えられる）。
【０２１０】
例示的な反応物を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ４８０ ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ Ｎ８０１−１００またはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００用の０．２ｍｌチューブ）に適用される０．５ｍｌのチューブ内に構築した。１〜２５０ｐｍｏｌの色素ターミネーターを、各反応物に加えた。３０μｌの鉱油を、各反応物の上面に加え、エバポレーションを防止する（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４８０ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを使用する場合）。反応物容量は、２０μＬであり、これは、１５μＬの上記反応プレミックス、変量の色素標識ターミネーター、および全反応物容量を２０μＬにするのに十分な容量の水を含有する。反応を、以下のように熱サイクルする：９６℃で３０秒間、５０℃で１５秒間、および６０℃で４分間を２５サイクル；続いて、４℃での保持サイクル。
【０２１１】
全ての反応物を、製造業者の指示書に従って（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｐ／ｎ ＣＳ−９０１）、Ｃｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐスピンカラムによるスピンカラム精製によって精製する。カラム中のゲル材料を、０．８ｍｌ 脱イオン水で、少なくとも３０分間室温にて水和させる。カラムを水和させ、ゲル材料中に気泡が閉じ込められていない状態にした後、カラムの上端および下端のキャップを取り外し、このカラムを、重力によって排水させる。次いで、カラムを、キットに備えられている洗浄チューブに挿入し、可変速度のミクロ遠心分離機で１３００ｇにて２分間遠心分離し、洗浄チューブから取り除き、そしてサンプル収集チューブに挿入する。この反応混合物を、オイルから慎重に取り除き、そしてゲル材料に充填し、そしてチューブを再遠心分離する。次いで、溶出したサンプルを、減圧遠心分離機内で乾燥する。
【０２１２】
配列決定ゲルに充填する前に、乾燥したサンプルを、２５μｌのＴｅｍｐｌａｔｅ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ４０１６７４）中に再懸濁し、ボルテックスし、９５℃まで２分間加熱し、氷上で冷却し、再度ボルテックスし、そして遠心分離する（１３，０００×ｇ）。１０μＬの懸濁したサンプルを、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ^ＴＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ３１０−００−１００／１２０）に適用されるサンプルバイアル（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ４０１９５７）にアリコートする。３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ上での電気泳動を、ＤＮＡ配列決定分析（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐ／ｎ ４０２８３７または４３１３０８７（ポリマー）およびｐ／ｎ ４０２８４０（キャピラリー））に特異的に適用される、シービング（ｓｉｅｖｉｎｇ）ポリマーおよびキャピラリーを用いて行う。このシービングポリマーは、核酸変性剤を含む。サンプルを、３０秒間、２．５ｋＶにてキャピラリーに動電学的に注入し、１０〜１２．２ｋＶにて２時間まで泳動させ、この時、キャピラリーの外壁は、５０℃で維持され、配列決定データとしてエレクトロフェログラムを作成する。
【０２１３】
スルホン化ジアリールローダミンターミネーターは、プライマー伸長の３’末端、４色配列決定反応間のポリヌクレオチドフラグメントに特異的に組み込まれている。１〜約１０００塩基対の溶出フラグメントが、検出およびプロットされる。エレクトロフェログラムは、長さごとに溶出される標識されたフラグメントのスルホン化ジアリールローダミン色素によって発せられる蛍光強度を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ^ＴＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒによる電気泳動間の時間の関数として、プロットする。
【０２１４】
全ての文献、特許、および本明細書中で参照される特許出願は、各個々の文献、特許、または特許出願が参考として援用されることを特異的かつ個々に示すかのように、同じ程度まで、参考として本明細書中で援用される。
【０２１５】
わずかな実施形態のみが上に詳細に記載されているが、化学分野の当業者は、多くの改変がこれらの実施形態においてその教示から逸脱することなく可能であることを、明確に理解している。このような全ての改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７Ａ】

【図１７Ｂ】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２Ａ】

【図２２Ｂ】

【図２２Ｃ】

【公開番号】特開２０１０−２８５６２５（Ｐ２０１０−２８５６２５Ａ）
【公開日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１６１１１２（Ｐ２０１０−１６１１１２）
【出願日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【分割の表示】特願２００８−３３５６９３（Ｐ２００８−３３５６９３）の分割
【原出願日】平成１３年１１月２７日（２００１．１１．２７）
【出願人】（５０９１３０４１３）アプライド　バイオシステムズ，　エルエルシー (48)
【Ｆターム（参考）】