蛍光活性を有するルシフェラーゼの活性増強方法
【課題】カルシウム結合型発光蛋白質から誘導される蛍光活性を有するルシフェラーゼ（ＢＦＰ−ａｑ）の発光活性を増強する方法を提供すること。
【解決手段】カルシウム結合型発光蛋白質であるアポ蛋白質を有し、アポ蛋白質の内部にセレンテラミドあるいはその類縁化合物が配位した構成を有する蛍光活性を有するルシフェラーゼ溶液（ＢＦＰ−ａｑ）に対し、該ルシフェラーゼの発光基質であるセレンテラジンあるいはその類縁化合物、及びセレンテラジンあるいはその類縁化合物におけるイミダゾピラジン骨格のピラジン環のＮＨプロトン引き抜き効果のある化合物（例えば、イミダゾール等）を添加する。
【解決手段】カルシウム結合型発光蛋白質であるアポ蛋白質を有し、アポ蛋白質の内部にセレンテラミドあるいはその類縁化合物が配位した構成を有する蛍光活性を有するルシフェラーゼ溶液（ＢＦＰ−ａｑ）に対し、該ルシフェラーゼの発光基質であるセレンテラジンあるいはその類縁化合物、及びセレンテラジンあるいはその類縁化合物におけるイミダゾピラジン骨格のピラジン環のＮＨプロトン引き抜き効果のある化合物（例えば、イミダゾール等）を添加する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的な実験における検出マーカーとして利用することができる蛍光活性を有するルシフェラーゼの発光活性の活性増強方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本願発明者らは、カルシウム結合発光蛋白質イクオリンを用いて、光による励起によって蛍光を発生する蛍光発光活性のみならず、発光基質に作用して酸化的発光を触媒するルシフェラーゼ活性を有する新規蛋白質ＢＦＰ−ａｑの調整法の確立、及びその性質について詳細に検討を行ってきた（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
この新規蛋白質ＢＦＰ−ａｑは、カルシウム結合蛋白質イクオリンのアポ蛋白質の内部にセレンテラミドあるいは類縁化合物が配位し、このアポ蛋白質にカルシウムイオン等が結合した複合体である。
【０００４】
一般に酵素的発光反応は、「ルシフェラーゼ」とよばれる酵素を触媒とし、基質である「ルシフェリン」（低分子有機化合物）を酸化する酸化反応であり、その結果、生成するオキシルシフェリンの励起分子種が基底状態にもどるときに、エネルギーが光（フォトン）として放出される。ルシフェラーゼによって生成される光（フォトン）の検出感度は、蛍光発光蛋白質に励起光を与えることにより生成される蛍光の検出感度の１０〜１０００倍以上高いことが示されている。
【非特許文献１】Inouye，S．（2004）FEBS Lett．105-110．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＢＦＰ−ａｑは、蛍光発光活性を有する以外に、上記のようなルシフェラーゼ発光活性を有し、さらに、他のルシフェラーゼにはない耐熱性を有する蛋白質であるため、産業上の様々な分野において、非常に利用価値が高い。従って、その活性を上げることにより、更なる高感度の検出法を提供でき、応用分野の広がりも期待できる。
【０００６】
以上のような目的に鑑み、本発明の課題は、カルシウム結合型発光蛋白質から誘導される蛍光活性を有するルシフェラーゼ（ＢＦＰ−ａｑ）の発光活性を増強する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、ＢＦＰ−ａｑの発光効率をあげるために、セレンテラジンの発光反応機構に注目した。すなわち、天然型発光基質セレンテラジン（及びその誘導体を基質として）発光反応における有機電子論的機構を検討し、鋭意努力した結果、下記構成を用いることで、本発明の解決方法を見出し、本発明を完成した。本発明は下記のとおりである。［１］アポ蛋白質を有し、該アポ蛋白質の内部にセレンテラミドあるいはその類縁化合物が配位した、蛍光活性を有するルシフェラーゼの発光増強法であって、該蛍光活性を有するルシフェラーゼ溶液に対し、該ルシフェラーゼの発光基質であるセレンテラジンあるいはその類縁化合物、及び該セレンテラジンあるいはその類縁化合物におけるイミダゾピラジン骨格のピラジン環のＮＨプロトン引き抜き効果のある化合物を添加することを特徴とする発光増強法。
【０００８】
［２］前記プロトン引き抜き効果のある化合物がイミダゾールであることを特徴とする［１］項に記載の発光増強法。
【０００９】
［３］前記ルシフェラーゼが、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質とセレンテラミドまたはその類縁化合物およびカルシウムイオンまたはカルシウムイオンと置換可能な２価もしくは３価のイオンからなり、前記ルシフェラーゼ分子内における、該アポ蛋白質と該セレンテラミドまたはその類縁化合物の分子数比が１：１であり、該アポ蛋白質とカルシウムイオンまたはカルシウムイオンと置換可能な２価または３価のイオンの分子数比が１：１〜４であることを特徴とする［１］項または［２］項に記載の発光増強法。
【００１０】
［４］前記アポ蛋白質が、アポイクオリン、アポクライチン、アポオベリン、アポマイトロコミン、アポミネオプシンおよびアポベルボインからなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする［１］〜［３］項のいずれかに記載の発光増強法。
【００１１】
［５］前記蛍光活性を有するルシフェラーゼが、配列番号１〜４で表されるアミノ酸配列を有するアポ蛋白質または配列番号１〜４で表されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された変異体アポ蛋白質を含有することを特徴とする［１］〜［４］項のいずれかに記載の発光増強法。
【００１２】
［６］前記セレンテラミドあるいはその類縁化合物が下記式（１）または式（２）で表されることを特徴とする［１］〜［５］項のいずれかに記載の発光増強法。
式中、
Ｒ1は、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアリールアルキル基、または脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基であり、 Ｒ2は、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアリールアルキル基、置換または非置換のアリールアルケニル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルケニル基、複素環式基であり、Ｒ3は、水素原子、置換または非置換のアルキル基であり、Ｘ1は、水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アルコキシル基またはアミノ基であり、Ｘ2は、水素原子または水酸基であり、Ｙは１〜４個の炭素原子を有する２価の炭化水素基である。
【００１３】
［７］前記式（１）または前記式（２）において、Ｒ1が非置換のアリール基、非置換のアリールアルキル基、水酸基またはハロゲン原子で置換されたアリールアルキル基、またはシクロヘキシル基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基であり、Ｒ2が非置換のアリール基、水酸基で置換されたアリール基、非置換のアリールアルキル基、水酸基で置換されたアリールアルキル基、非置換のアリールアルケニル基、非置換の直鎖または分枝鎖のアルキル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖のアルキル基、分枝鎖のアルケニル基、硫黄を含む複素環式基であり、Ｒ3は、水素原子、メチル基または２−ヒドロキシエチル基であり、Ｘ1は、水素原子、水酸基、フッ素原子、メトキシ基またはアミノ基であり、Ｙはメチレン基、エチレン基、プロピレン基またはビニレン基である［６］項に記載の発光増強法。
【００１４】
［８］前記式（１）または前記式（２）において、Ｒ1がフェニル基、ベンジル基、ｐ−ヒドロキシベンジル基、ｐ−フルオロベンジル基、ｐ−クロロベンジル基、ｐ−ブロモベンジル基、ｐ−ヨードベンジル基、３,４−ジフルオロベンジル基、ペンタフルオロベンジル基、フェニルエチル基、フェニルプロピル基、ナフチルメチル基、シクロヘキシルメチル基、メチル基、１−メチルプロピル基または２−メチルプロピル基であり、Ｒ2がフェニル基、ｐ−ヒドロキシフェニル基、ベンジル基、α−ヒドロキシベンジル基、フェニルエチル基、フェニルビニル基、シクロヘキシル基、シクロヘキシルメチル基、シクロヘキシルエチル基、メチル基、エチル基、プロピル基、２−メチルプロピル基、２−メチルプロぺニル基、アダマンチルメチル基、シクロペンチルメチル基またはチオフェン−２−イル基であることを特徴とする［７］項に記載の発光増強法。
【００１５】
［９］前記セレンテラジンあるいはその類縁化合物が下記式（３）または式（４）で表されることを特徴とする［１］〜［５］項のいずれかに記載の発光増強法。
式中、
Ｒ１は、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアリールアルキル基、または脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基であり、Ｒ２は、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアリールアルキル基、置換または非置換のアリールアルケニル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルケニル基、複素環式基であり、Ｒ３は、水素原子、置換または非置換のアルキル基であり、Ｘ１は、水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アルコキシル基またはアミノ基であり、Ｘ２は、水素原子または水酸基であり、Ｙは１〜４個の炭素原子を有する２価の炭化水素基である。
【００１６】
［１０］前記式（３）または前記式（４）において、Ｒ１が非置換のアリール基、非置換のアリールアルキル基、水酸基またはハロゲン原子で置換されたアリールアルキル基、またはシクロヘキシル基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基であり、Ｒ２が非置換のアリール基、水酸基で置換されたアリール基、非置換のアリールアルキル基、水酸基で置換されたアリールアルキル基、非置換のアリールアルケニル基、非置換の直鎖または分枝鎖のアルキル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖のアルキル基、分枝鎖のアルケニル基、硫黄を含む複素環式基であり、Ｒ３は、水素原子、メチル基または２−ヒドロキシエチル基であり、Ｘ１は、水素原子、水酸基、フッ素原子、メトキシ基またはアミノ基であり、Ｙはメチレン基、エチレン基、プロピレン基またはビニレン基であることを特徴とする［９］項に記載の発光増強法。
【００１７】
［１１］前記式（３）または前記式（４）において、Ｒ１がフェニル基、ベンジル基、p−ヒドロキシベンジル基、p−フルオロベンジル基、p−クロロベンジル基、p−ブロモベンジル基、P−ヨードベンジル基、３，４−ジフルオロベンジル基、ペンタフルオロベンジル基、フェニルエチル基、フェニルプロピル基、ナフチルメチル基、シクロヘキシルメチル基、メチル基、１−メチルプロピル基または２−メチルプロピル基であり、Ｒ２がフェニル基、p−ヒドロキシフェニル基、ベンジル基、α−ヒドロキシベンジル基、フェニルエチル基、フェニルビニル基、シクロヘキシル基、シクロヘキシルメチル基、シクロヘキシルエチル基、メチル基、エチル基、プロピル基、２−メチルプロピル基、２−メチルプロペニル基、アダマンチルメチル基、シクロペンチルメチル基またはチオフェン−２−イル基であることを特徴とする（１０）項に記載の発光増強法。
【００１８】
［１２］前記セレンテラジンの類縁化合物が、h−セレンテラジン、f−セレンテラジン、cp−セレンテラジン、hcp−セレンテラジンから選ばれる少なくとも１種である［１］〜［８］項のいずれかに記載の発光増強法。
【００１９】
［１３］セレンテラジンあるいはその類縁化合物を発光基質として、アポ蛋白質を有し、該アポ蛋白質の内部にセレンテラミドあるいはその類縁化合物が配位した、蛍光活性を有するルシフェラーゼが放射する発光を増強させる発光増強剤であって、該セレンテラジンあるいはその類縁化合物におけるイミダゾピラジン骨格のピラジン環のＮＨプロトン引き抜き効果のある化合物を含有することを特徴とする発光増強剤。
【００２０】
［１４］前記プロトン引き抜き効果のある化合物がイミダゾールであることを特徴とする［１３］項に記載の発光増強剤。
【００２１】
［１５］アポ蛋白質を有し、該アポ蛋白質の内部にセレンテラミドあるいはその類縁化合物が配位した、蛍光活性を有するルシフェラーゼ、発光基質であるセレンテラジンあるいはその類縁化合物、前記ルシフェラーゼの発光を増強させ得る発光増強剤を含むキットであって、前記発光増強剤は、前記セレンテラジンあるいはその類縁化合物におけるイミダゾピラジン骨格のビラジン環のＮＨプロトン引き抜き効果のある化合物であることを特徴とするキット。
【００２２】
［１６］前記プロトン引き抜き効果のある化合物がイミダゾールであることを特徴とする［１５］項に記載のキット。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によって、カルシウム結合型発光蛋白質から誘導される蛍光活性を有するルシフェラーゼ（ＢＦＰ−ａｑ）の発光活性を増強する方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は、カルシウム結合型発光蛋白質から誘導される蛍光活性を有するルシフェラーゼ（ＢＦＰ−ａｑ）溶液に、発光基質であるセレンテラジンおよび類縁化合物におけるイミダゾピラジン骨格のピラジン環のＮＨプロトン引き抜き効果のある化合物を添加することによって、ＢＦＰ−ａｑの発光活性を増強する方法である。
【００２５】
＝＝蛍光活性を有するルシフェラーゼ（ＢＦＰ−ａｑ）＝＝
１．蛍光活性を有するルシフェラーゼ（ＢＦＰ−ａｑ）の構成および構造
本発明に用いる化学発光活性を有する蛍光活性を有するルシフェラーゼ（ＢＦＰ−ａｑは、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質、セレンテラミドまたはその類縁化合物、およびカルシウムイオンまたはカルシウムイオンと置換可能な２価もしくは３価のイオンより構成されており、好ましくはアポ蛋白質とセレンテラミドまたはその類縁化合物のＢＦＰ−ａｑ中の分子数の比は１：１であり、アポ蛋白質とカルシウムイオンまたはカルシウムイオンと置換可能な２価もしくは３価のイオンのＢＦＰ−ａｑ中の分子数の比は１：１〜４である。より好ましくは、アポ蛋白質とカルシウムイオンまたはカルシウムイオンと置換可能な２価もしくは３価のイオンの分子数の比は１：２〜３、さらに好ましくは１：３である。このＢＦＰ−ａｑ内で、セレンテラミドまたはその類縁化合物は、アポ蛋白質の内部に配位しており、カルシウムイオンは主としてアポ蛋白質のＥＦハンドに結合している。
このＢＦＰ−ａｑは、他のルシフェラーゼと比較して熱安定性に優れているので、従来ルシフェラーゼを用いることができなかった分野にも応用が可能である。
【００２６】
２．蛍光活性を有するルシフェラーゼ（ＢＦＰ−ａｑ）の製造
ＢＦＰ−ａｑは、カルシウム結合型発光蛋白質とカルシウムイオンまたはカルシウムイオンと置換可能な２価もしくは３価のイオンを、極めて緩やかな（反応速度が極めて遅い）条件で反応させることにより製造できる。ここで、緩やかに反応させるとは、カルシウム結合型発光蛋白質とカルシウムイオン等のイオンが反応した後に、セレンテラミドまたはその類縁化合物がアポ蛋白質に配位したまま残り、かつ新たなＳ-Ｓ結合が実質上生成しないような条件で反応させることを意味する。
【００２７】
そのような反応条件は、例えば、高粘度のカルシウム結合型発光蛋白質溶液に、非常に希薄なカルシウムイオン等の溶液を重層し、低温で長時間にわたって反応させることである。この場合、反応温度は、好ましくは０℃〜３０℃、より好ましくは４℃である。また反応時間は、蛋白質の濃度によっても異なるが、２４時間以上であることが好ましい。
【００２８】
この際、カルシウムイオンの濃度は低い方が好ましい。カルシウムイオンの濃度が低ければ、カルシウムイオンがカルシウム結合型発光蛋白質と接触（反応）する頻度が低くなるからである。逆に、カルシウム結合型発光蛋白質溶液の濃度は高い方が好ましい。蛋白質溶液の濃度が高ければ、蛋白質溶液の粘度も高くなり、カルシウムイオン溶液と蛋白質溶液との混合がゆっくり進行するからである。
【００２９】
具体的には、１０-7Ｍ（mol／ｌ）以下の濃度のカルシウムイオンまたはカルシウムイオンと置換可能な２価もしくは３価のイオンの水溶液を、カルシウムイオン結合型発光蛋白質に対して１〜４のモル比となるように添加して、両者を反応させる。カルシウムイオン等のイオンとカルシウムイオン結合型発光蛋白質のモル比は、反応が緩やかに進められるならば、目的とする蛍光活性を有するルシフェラーゼ（ＢＦＰ−ａｑ）における分子数の比以上（例えば、４以上）であっても構わない。本発明で必要とされる反応条件を達成するためには、反応容器のデザインの変更、溶媒の選択、半透膜の使用等のバリエーションが考えられ、本明細書に記載されたものに限定されるものではない。
【００３０】
３．蛍光活性を有するルシフェラーゼ（ＢＦＰ−ａｑ）を構成するアポ蛋白質
ＢＦＰ−ａｑを構成するアポ蛋白質として、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質が用いられる。ここでいうカルシウム結合型発光蛋白質とは、カルシウムイオンまたはそれと同等な２価または３価のイオンと反応して発光する蛋白質を指す。例えば、イクオリン、クライチン、オベリン、マイトロコミン、ミネオプシンおよびベルボインを挙げることができる。これらは、天然から採取したものであっても、遺伝子工学的に製造したものであってよい。さらに、上記の発光活性を有すれば、そのアミノ酸配列を天然のものから遺伝子組換え技術によって変異させたものであってもよい。
【００３１】
現在まで、遺伝子が単離されているカルシウム結合発光蛋白質を表１に示した。
【００３２】
【００３３】
これらのアポ蛋白質部分のアミノ酸配列の相同性は６０％以上であり、すべて発光基質セレンテラジンよりカルシウム結合発光蛋白質への再生が可能である。さらに、近年の発光蛋白質であるイクオリンとオベリンとのＸ線結晶解析の結果、アミノ酸配列の相同性以上に、両者の高次構造の主鎖構造はほとんど同じであることが明らかとなっている。このことから、他のカルシウム結合発光蛋白質の高次構造相同性は、容易に類推できる。従って、本願実施例では、代表的なカルシウム結合発光蛋白質であるイクオリンを用いたが、その結果は他のカルシウム結合発光蛋白質に応用できるのは明らかである。
【００３４】
天然型イクオリンのアポ蛋白であるアポイクオリンのアミノ酸配列を配列番号１に示す。配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するもののほか、公知のまたは未知のその変異体であってカルシウム結合型発光蛋白質を形成するものであればすべて使用できる。したがって、本発明で使用されるアポイクオリンには、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するアポイクオリンおよび配列番号１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された変異型アポイクオリンが含まれる。特に好ましい変異型アポイクオリンの例として、配列番号１において１番目のValがAla-Asn-Serで置換されたものが挙げられる。
【００３５】
野生型クライチンのアポ蛋白であるアポクライチンのアミノ酸配列は配列番号２に示される。野生型オベリンのアポ蛋白であるアポオベリンのアミノ酸配列は配列番号３に示される。野生型マイトロコミンのアポ蛋白であるアポマイトロコミンのアミノ酸配列は配列番号４に示される。これらは、それぞれの配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された変異型のものであってもよい。
【００３６】
ＢＦＰ−ａｑは、アポ蛋白質中のシステイン残基の遊離ＳＨ基が酸化されてＳ-Ｓ結合を生成すると、化学発光活性を失う。したがって、遊離のＳＨ基が欠失または置換され、Ｓ-Ｓ結合を生じることができなくなった変異アポ蛋白質は、化学発光活性を失うことがないと考えられ、例えば、システイン残基をセリン残基で置換した蛍光蛋白質は、Ｓ-Ｓ結合を生じないため活性が持続的であると期待される。
【００３７】
４．蛍光活性を有するルシフェラーゼ（ＢＦＰ−ａｑ）を構成するセレンテラミド
セレンテラミドまたはその類縁化合物は、式（１）または式（２）で示される。
式中、
Ｒ1は、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアリールアルキル基、または脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基である。好ましくは、非置換のアリール基、非置換のアリールアルキル基、水酸基もしくはハロゲン原子で置換されたアリールアルキル基、またはシクロヘキシル基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基である。さらに好ましくは、フェニル基、ベンジル基、ｐ−ヒドロキシベンジル基、ｐ−フルオロベンジル基、ｐ−クロロベンジル基、ｐ−ブロモベンジル基、ｐ−ヨードベンジル基、３,４−ジフルオロベンジル基、ペンタフルオロベンジル基、フェニルエチル基、フェニルプロピル基、ナフチルメチル基、シクロヘキシルメチル基、メチル基、１−メチルプロピル基または２−メチルプロピル基である。
Ｒ2は、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアリールアルキル基、置換または非置換のアリールアルケニル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルケニル基、複素環式基である。好ましくは、非置換のアリール基、水酸基で置換されたアリール基、非置換のアリールアルキル基、水酸基で置換されたアリールアルキル基、非置換のアリールアルケニル基、非置換の直鎖または分枝鎖のアルキル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖のアルキル基、分枝鎖のアルケニル基、硫黄を含む複素環式基である。さらに好ましくは、フェニル基、ｐ−ヒドロキシフェニル基、ベンジル基、α−ヒドロキシベンジル基、フェニルエチル基、フェニルビニル基、シクロヘキシル基、シクロヘキシルメチル基、シクロヘキシルエチル基、メチル基、エチル基、プロピル基、２−メチルプロピル基、２−メチルプロぺニル基、アダマンチルメチル基、シクロペンチルメチル基またはチオフェン−２−イル基である。
Ｒ3は、水素原子、置換または非置換のアルキル基である。好ましくは、水素原子、メチル基または２−ヒドロキシエチル基である。
Ｘ1は、水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アルコキシル基またはアミノ基であり、特に好ましくは水素原子、水酸基、フッ素原子、メトキシ基またはアミノ基である。
Ｘ2は、水素原子または水酸基である。
Ｙは１〜４個の炭素原子を有する２価の炭化水素基であり、好ましくはメチレン基、エチレン基、プロピレン基またはビニレン基である。
【００３８】
５．蛍光活性を有するルシフェラーゼはセレンテラジンを発光基質とする。
セレンテラジンまたはその類縁化合物は、下記式（３）または式（４）で表される。
式中のＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｘ1、Ｘ2およびＹは、式（１）および式（２）と同じである。
【００３９】
本発明において、発光基質として、セレンテラジンおよびその類縁化合物であるh−セレンテラジン、f−セレンテラジン、cp−セレンテラジン、hcp−セレンテラジンが特に好ましく利用できる。
【００４０】
以下に、これらの化合物、およびセレンテラミドの化学構造式をまとめて示す。
【００４１】
６．蛍光活性を有するルシフェラーゼ（ＢＦＰ−ａｑ）を構成する金属イオン
ＢＦＰ−ａｑに結合する金属イオンは、カルシウムイオンまたはカルシウムイオンと置換可能な２価もしくは３価のイオンである。ここで、カルシウムイオンと置換可能なイオンとは、カルシウムイオンに代えてイクオリンなどのカルシウム結合型発光蛋白質と反応させた場合に、発光反応を起こすイオンのことである。つまり、カルシウム結合型発光蛋白質に対して、カルシウムイオンと同等の作用をするものである。例えば、マグネシウムイオン（Ｍｇ2+）、ストロンチウムイオン（Ｓｒ2+）、バリウムイオン（Ｂａ2+）、鉛イオン（Ｐｂ2+）、コバルトイオン（Ｃｏ2+）、ニッケルイオン（Ｎｉ2+）、カドミウムイオン（Ｃｄ2+）、イットリウムイオン（Ｙ3+）、ランタンイオン（Ｌａ3+）、サマリウムイオン（Ｓｍ3+）、ユウロピウムイオン（Ｅｕ3+）、ジスプロシウムイオン（Ｄｙ3+）、ツリウムイオン（Ｔｍ3+）、イットリビウムイオン（Ｙｂ3+）を挙げることができる。これらのうち、２価の金属イオンが好ましい。より好ましくは遷移金属以外の２価の金属イオン、例えばＣａ2+、Ｓｒ2+、Ｐｂ2+である。
また、これらのイオンは少なくとも１個が、いわゆるカルシウム結合型発光蛋白質のＥＦハンドに結合していればよいが、２個以上、特に３個のこれらのイオンが結合しているのが好ましい。
【００４２】
代表的なセレンテラジンを基質とするルシフェラーゼを表２に示す。
【００４３】
＝＝ＢＦＰ−ａｑの発光増強方法＝＝
以上のように調整した蛍光活性を有するルシフェラーゼ（ＢＦＰ−ａｑ）に対し、天然型のセレンテラジンを発光基質とした発光反応を行う。この反応において、セレンテラジンのイミダゾピラジノン骨格における−ＮＨ−プロトンを引き抜くための化合物、すなわちプロトンのアクセプターになりうる化合物を発光増強剤として添加する。
【００４４】
発光増強剤としては、上記作用を有する化合物であれば何でもよく、一般的に容易に入手可能な化合物として、例えば、イミダゾール、ヒスタミン、L−ヒスチジン、２−メチルイミダゾール、４−メチルイミダゾール、ウノカニン酸、５−アミノ−４−イミダゾール−カルボキシアミド、L−アルギニン、アセトアミド、グアニジン、L−リジン、尿素、トリエチルアミン等が挙げられる。なかでも、特にイミダゾールが好ましく利用できる。また、これらは、単独で用いてもよいが、複数を併用して用いてもよい。また、この発光反応は水系で行うことが好ましいので、発光増強剤は水溶性であることが好ましい。
【００４５】
反応条件は特に限定されないが、ＢＦＰ−ａｑの蛍光活性が安定であり、ルシフェラーゼ活性が十分発揮できるｐＨ８.０程度が好ましい。また、ＢＦＰ−ａｑの発光反応の至適ｐＨと添加化合物のｐＫａを考慮することで、−ＮＨ−プロトンを引き抜き効果の強さも予測することができるため、用途に応じて、発光増強剤を選択することができる。発光増強剤の濃度は、３０〜３５０ｍＭが利用でき、６０〜３００ｍＭが好ましい。
【００４６】
この発行増強剤を容易に使用することができるように、蛍光活性を有するルシフェラーゼ（ＢＦＰ−ａｑ）、セレンテラジンあるいは類縁化合物とともに、キットとしてもよい。
【実施例】
【００４７】
以下に実施例により本発明を説明するが、実施例は本発明を制限するものではない。
【００４８】
＝＝組換えアポイクオリンの調製＝＝
組換えアポイクオリンを得るために、アポイクオリン遺伝子を有するｐＡＱ４４０（特開昭６１−１３５５８６号公報）から構築されたアポイクオリン遺伝子発現ベクターｐｉＰ−ＨＥ（特開平１−１３２３９７号公報）を用いた。このベクターにコードされた組換えアポイクオリンのＮ−末端は、Ala−Asｎ−Ser−より始まる１９１個のアミノ酸より構成されている（配列表１のＮ−末端のValがAla−Asｎ−Ser−で置換されたもの）。
【００４９】
上記発現ベクターｐｉＰ−ＨＥを、常法により大腸菌ＷＡ８０２株に導入した。得られた形質転換株を、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有する寒天培地上で３０℃で一晩培養した後、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有する５０ｍｌのＬＢ液体培地（水１リットルあたり、バクトトリプトン１０ｇ、イーストイクストラクト５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、ｐＨ７．２）に植菌し、３０℃で８時間前培養した。次いで、その培養物を新たなＬＢ液体培地２リットルに添加し、３７℃で一昼夜（１８時間）培養した。培養後、得られた培養物を、菌体と培養液に低速遠心分離（５０００×ｇ）によって分離した。菌体および培養液はともに発現した組換えアポイクオリンを含むためそれぞれ保存し、イクオリンの精製出発材料とした。
【００５０】
まず、菌体からの組換えアポイクオリンの回収を行った。集菌した菌体を、還元剤であるジチオスレイトール（DTT，和光純薬社製）２００ｍｇを含む４００ｍｌの５０ｍＭ Tris−HCl、１０ｍＭ EDTA、ｐＨ７．６の緩衝液中に懸濁し、氷冷下において超音波破砕装置で２分間処理して菌体を破砕し、１２０００×ｇで２０分間遠心後、上清を集めた。得られた上清に化学合成したセレンテラジン（エタノール溶液）を産生アポイクオリンの１．２倍のモル濃度になるように添加し、４℃で５時間以上放置した。
【００５１】
この上清を直ちに、ＴＥ（２０ｍＭ Tris−HCl、１０ｍＭ EDTA、ｐＨ７．６）緩衝液で平衡化したＱ−セファロースカラム（ファルマシア製、直径２ｃｍ×１０ｃｍ）に添加してイクオリンを吸着させ、カラムから溶液の２８０ｎｍでの吸光度が０．０５以下になるまでＴＥＮ（２０ｍＭ Tris−HCl、１０ｍＭ EDTA、０．１Ｍ NaCl、ｐＨ７．６）でカラムを洗浄した。そして、カラムに吸着したアポイクオリンとイクオリン画分を０．１Ｍ NaCl〜０．４Ｍ NaClの直線濃度勾配で溶出させた。
【００５２】
再生イクオリンと未再生のアポイクオリンとの分離は、疎水性クロマトグラフィーであるブチルセファロース４ファーストフローゲルを用いて行った。即ち、Ｑ−セファロースカラムからのオレンジ色の溶出液に、最終濃度が２Ｍになるように硫酸アンモニウムを溶解した。次いで、不溶画分を遠心分離によって除去し、上清を、２Ｍ 硫酸アンモニウムを含有するＴＥで平衡化したブチルセファロース４ファーストフローカラム（ファルマシア社、カラムサイズ：直径２ｃｍ×８ｃｍ）に通し、硫酸アンモニウム濃度１Ｍまで直線濃度勾配により溶出し、発光活性を有するオレンジ色の再生イクオリン画分を収集した。なお、未再生のアポイクオリンは、ＴＥで溶出された。
【００５３】
再生イクオリン画分について、還元状態で１２％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を行った結果、精製画分について分子量２５ｋＤａ蛋白質に相当する単一バンドが検出され、その純度はデンシトメーターでの測定では９８％以上であった。菌体からのイクオリンの回収率は約８０％で、８０ｍｇの高純度イクオリンを得た。
【００５４】
一方、培養液からの高純度アポイクオリンの精製は、特開平１−１３２３９７号公報に記載の方法に従って実施した。即ち、培養液を酸性化処理してｐＨ５以下にし、４℃で６０分間以上放置した。白色沈殿となったアポイクオリンを遠心分離によって単離し、これを還元剤を含む上述の緩衝液（５０ｍＭ Tris−HCl、１０ｍＭ EDTA、ｐＨ７．６）に溶解させた。そして菌体からのイクオリンの精製工程と同様にイクオリンへの再生後、Ｑ−セファロースカラムクロマト法、ブチルセファロース４ファーストフローカラムクロマト法を用いて、イクオリンを精製した。得られた精製イクオリンについて、還元状態で１２％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を行った結果、分子量２５ｋＤａ蛋白質に相当する単一バンドが検出され、その純度はデンシトメーターでの測定では９８％以上であった。こうして、培養液より得られたアポイクオリン５０ｍｇから高純度イクオリン４５ｍｇを得た。なお、蛋白量はBradford法にもとづく市販のキット（バイオラッド社製）を用い、ウシ血清アルブミン（ピアス社製）を標準物質として用いて決定した。
【００５５】
＝＝蛍光活性を有するルシフェラーゼ（ＢＦＰ−ａｑ）の調製＝＝
実施例１記載の精製イクオリンを、１０ｍＭ Tris−HCl（ｐＨ７．６）、２ｍＭ EDTA、１．２Ｍ 硫酸アンモニウムを含む緩衝液に溶解し、イクオリン濃度が８ｍｇ／ｍｌのイクオリン溶液を調製した。
【００５６】
このイクオリン溶液１ｍｌを、高速限外濾過フィルターである分画分子量１０，０００のポリエーテルスルホン膜を有するビバスピン２カラム（ザルトリウス社製）を用いて、冷却高速遠心機（日立社製：ＣＲ２０Ｂ２型）にて、４℃で、５０００×ｇ、６０分間以上遠心を行い、全量を０．１ｍｌ以下に濃縮した。さらに、濃縮溶液のEDTA濃度を、０．１μＭ以下に下げるために、１ｍｌの０．１μＭ EDTAを含む１０ｍＭ Tris−HClをビバスピン２カラムに加え、再度同一条件で遠心を行い、全量を濃縮するステップを最低２回くり返した。このイクオリン濃縮液は、黄赤色を呈し、肉眼で容易に確認できた。
【００５７】
以下の手順で、ＢＦＰ−ａｑの調製を行った。ビバスピン２カラム内で濃縮イクオリン溶液に、０．９ｍｌの５ｍＭ 塩化カルシウム（和光純薬）、２ｍＭ ジチオスレイトール（和光純薬）を含む５０ｍＭ Tris−HCl（ｐＨ７．６）を重層し、連続発光を開始させ、４℃で２４時間以上放置した。発光反応の終了は、イクオリン溶液の黄赤色の消失によっても確認できた。さらに、ビバスピン２カラム内へ２ｍｌの５ｍＭ塩化カルシウム（和光純薬）、２ｍＭ ジチオスレイトール（和光純薬）を含む５０ｍＭ Tris−HCl（ｐＨ７．６）を加え、上記同一条件で遠心を行い洗浄した。生成したＢＦＰ−ａｑは、長波長のＵＶランプ（極大波長＝３６６ｎｍ）の下で、青色蛍光を発生することを確認した。
【００５８】
＝＝組換えウミシイタケルシフェラーゼの調整法＝＝
ウミシイタケルシフェラーゼはウミシイタケ（Renilla reniformis）に由来する単量体の発光酵素（36kDa）で、基質であるセレンテラジンの酸化を触媒し光を発生させるが、ここでは、蛍光活性を有さないルシフェラーゼの一例として、コントロール（対照実験）に用いた。
【００５９】
ウミシイタケルシフェラーゼを大腸菌内で発現させるため、アミノ酸末端にヒスチジンタグが付加したウミシイタケルシフェラーゼをコードする組換え遺伝子を有する発現ベクターｐＨｉｓ-ＲＬａｓｅを用いた。この発現ベクターｐＨｉｓ-ＲＬａｓｅは、公知の方法（Biochem．Biophys．Res．Commun．233，349-353）に基づいて調整した。
【００６０】
発現ベクターｐＨｉｓ-ＲＬａｓｅを、常法により大腸菌Top10株（インビトロジェン）に導入した。得られた形質転換株をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有する１０ｍｌ ＬＢ液体培地（水１リットルあたり、バクトトリプトン１０ｇ、イーストイクストラクト５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、ｐＨ７．２）にて２４℃で一昼夜（１８時間）前培養をした後、さらに４００ｍｌのＬＢ液体培地で３６℃、２時間培養を行った。その後、イソプロピル−β−Ｄ（−)−チオガラクトピラノシド（IPTG、和光純薬工業社製）を最終濃度０．２ｍＭになるよう培養液に加え、さらに３時間同温で培養を行った。培養後、菌体を遠心回収（５，０００ｒｐｍ×５ｍｉｎ、３，０００×ｇ）し、組換えウミシイタケルシフェラーゼの精製出発材料とした。
【００６１】
集菌した菌体を５０ｍＭ Tris−HCl（ｐＨ７．６）５ｍｌに懸濁し、氷冷下で超音波破砕処理（ブランソン社製、Sonifier model cycle 250）を３分間、２回行った。その菌体破砕液を１２，０００ｒｐｍ（１７，７００×ｇ）で２０分間遠心し上清を回収後、ニッケルキレートカラム（アマシャムバイオサイエンス社、カラムサイズ：直径１．５×５ｃｍ）に添加してウミシイタケルシフェラーゼを吸着させた。吸着ウミシイタケルシフェラーゼを０．５Ｍ イミダゾール（和光純薬工業社製）で溶出を行い、得られたウミシイタケルシフェラーゼ活性画分を５Ｌの０．１Ｍ 炭酸アンモニウム溶液（ｐＨ８．０）に対して、一晩４℃で透析を行った。
【００６２】
透析したウミシイタケルシフェラーゼ活性画分を、再度ニッケルキレートカラム（アマシャムバイオサイエンス社、カラムサイズ：直径１．５×５ｃｍ）に吸着させ、イミダゾール濃度０〜０．３Ｍまで直線濃度勾配により溶出し、さらに精製されたウミシイタケルシフェラーゼ活性画分を得た。イミダゾール濃度０．１２〜０．１３Ｍにてウミシイタケルシフェラーゼの溶出が確認された。
【００６３】
次に、得られたウミシイタケルシフェラーゼ画分をＱ−セファロースカラム（アマシャムバイオサイエンス社、カラムサイズ：直径２．５×５ｃｍ）に添加し吸着させ、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ Tris−HCl（ｐＨ７．６）に、塩化ナトリウム濃度０〜０．４Ｍまで直線濃度勾配により溶出し、さらに精製されたウミシイタケルシフェラーゼ活性画分を得た。塩化ナトリウム濃度０．２〜０．２２Ｍにてウミシイタケルシフェラーゼ活性の溶出が確認され、１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法により純度は９５％以上であることを確認した。
【００６４】
＝＝ウミシイタケルシフェラーゼを用いた発光活性の測定法＝＝
ｐＨ７．６の５０ｍＭ Tris−HCl緩衝液（２００μｌ）を２５℃に保温後、エタノールに溶解した基質セレンテラジン（１μｇ／μｌ）を加え、ウミシイタケルシフェラーゼ（１．２μｇ）を添加することにより発光反応を開始させた。発光測定装置Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ−ＰＳＮ ＡＢ２２００（アトー社製）で６０秒間発光活性の測定を行い、発光活性の最大値（Ｉｍａｘ）で示した。
【００６５】
＝＝ＢＦＰ−ａｑの発光反応の至適ｐＨの検討＝＝
各々ｐＨ５．０〜１０．５の５０ｍＭ Tris−HCl緩衝液（２００μ１）を２５℃に保温後、基質セレンテラジン（１μｇ）を加え、ＢＦＰ−ａｑ（１．２μｇ）を添加し反応を開始させ、発光測定装置Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ−ＰＳＮ ＡＢ２２００（アトー社製）で６０秒間発光活性の測定を行った。５０ｍＭ Tris−HCl（ｐＨ８．０）中でのＢＦＰ−ａｑの発光活性の最大値（Ｉｍａｘ）を１００％とし、各ｐＨでの相対発光活性値を図１に示した。
【００６６】
＝＝有機化合物添加によるＢＦＰ−ａｑ発光増強効果＝＝
表３に示した種々の市販有機化合物をそれぞれ含む５０ｍＭ Tris−HCl（ｐＨ８．０）溶液を調整し、２５℃に保温した。この化合物を含む溶液（２００μｌ）に、基質セレンテラジン（１μｇ）を加え、さらにＢＦＰ−ａｑ（１．２μｇ）添加し撹拌後、発光測定装置Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ−ＰＳＮ ＡＢ２２００（アトー社製）で６０秒間発光活性の測定を行った。５０ｍＭ Tris−HCl（ｐＨ８．０）中でのＢＦＰ−ａｑの発光活性の最大値（Ｉｍａｘ）を１００％とし、相対発光活性値を表４に示した。また各有機化合物の構造式を図２に示す。
【００６７】
【００６８】
表４の相対発光活性値を比較した結果、発光反応系に１５０ｍＭ イミダゾールを加えた場合にのみ顕著な発光活性（Ｉｍａｘ）の増強が起きた。これは、イミダゾールのｐＫａ＝７．０を考慮すると、イミダゾールは図３に示すように、アルカリ条件下では容易にプロトンのアクセプターになる。ｐＨ８．０での発光反応では、図４に示すように、イミダゾールが発光基質であるセレンテラジンの７位のプロトンのアクセプターとなり、プロトンの引き抜きを促進する結果、セレンテラジンへの酸素添加反応を促進するため、発光反応が効率良く進むためであると考えられる。一方、その他の化合物では、発光活性の促進はみられなかった。これは、ｐＨ８．０では、セレンテラジンの７位のプロトンのアクセプターとして化合物が機能していないことを示している。その理由として、ｐＫａ以外にイミダゾールの側鎖の影響、あるいは分子サイズによる物理的障害により、ＢＦＰ−ａｑ内のセレンテラジンと作用できないためであると考えられる。
【００６９】
＝＝イミダゾール添加によるＢＦＰ−ａｑの発光増強効果の至適濃度の決定＝＝
イミダゾールをそれぞれの濃度（０．１，０．３，１，３，１０，３０，６０，１００，１５０，２００，２５０，３００，４００，５００，６００，７００，８００，９００，１０００ｍＭ）を含む５０ｍＭ Tris−HCl（ｐＨ８．０）を調整し、２５℃に保った。イミダゾールを含む溶液（２００μｌ）に、基質セレンテラジン（１μｇ）を加え、さらにＢＦＰ−ａｑ（１．２μｇ）添加し撹拌後、発光測定装置Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ−ＰＳＮ ＡＢ２２００（アトー社製）で６０秒間発光活性の測定を行った。５０ｍＭ Tris−HCl（ｐＨ８．０）中でのＢＦＰ−ａｑの発光活性の最大値（Ｉｍａｘ）を１００％とし、イミダゾール濃度と発光活性の関係を図５に示した。対象実験として、セレンテラジンを発光基質とするウミシイタケルシフェラーゼを用いて同様の実験を行った。その結果、ウミシイタケルシフェラーゼではイミダゾールの濃度が高くなるにつれ発光活性が著しく阻害されるが、ＢＦＰ−ａｑの発光活性はイミダゾール３０ｍＭ〜２５０ｍＭにおいて促進されることが判明した。特に１５０ｍＭ イミダゾールを添加することで、イミダゾールを添加しない系の２倍以上の発光活性を得ることができた。すなわち、イミダゾール添加による発光活性の増強効果は、ＢＦＰ−ａｑに特異的な効果であることが明らかとなった。
【００７０】
＝＝セレンテラジンアナログとイミダゾール添加ＢＦＰ−ａｑの組み合わせによる発光活性増強方法＝＝
１５０ｍＭ イミダゾールを含む５０ｍＭ Tris−HCl（ｐＨ８．０）を調整し、２５℃に保った。この溶液を５本の容器に２００μｌずつ入れ、基質セレンテラジン（ＣＴＺ）及びそのアナログ４種（ｈ−ＣＴＺ，ｃｐ−ＣＴＺ，ｈｃｐ−ＣＴＺ，ｆ−ＣＴＺ）１μｇをそれぞれに加え、さらにＢＦＰ−ａｑ（１．２μｇ）添加し撹拌後、発光測定装置Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ−ＰＳＮ ＡＢ２２００（アトー社製）で６０秒間発光活性の測定を行った。５０ｍＭ Tris−HCl（ｐＨ８．０）中で基質をセレンテラジンとしたＢＦＰ−ａｑの発光活性の最大値（Ｉｍａｘ）および初速を１００％とし、イミダゾール添加の有無による発光活性の影響を調べた。
【００７１】
【００７２】
表５のセレンテラジン基質特異性の相対発光活性値を比較すると、ＢＦＰ−ａｑの発光反応系において、ｈ−セレンテラジン、ｆ−セレンテラジン、ｃｐ−セレンテラジン及びｈｃｐ−セレンテラジンは有効な基質となった。さらに、イミダゾールの添加の有無によるその効果をみると、１５０ｍＭ イミダゾール添加でｈｃｐ−セレンテラジンを基質とした場合、イミダゾール無添加−セレンテラジンの発光活性の最大値にくらべ約４倍上がり、発光反応の初速は約２５倍速くなることが判明した。すなわち、セレンテラジンアナログとイミダゾール添加によるＢＦＰ−ａｑ発光増強が可能であることが示された。
【００７３】
＝＝イミダゾールの添加によるＢＦＰ−ａｑの発光反応速度の決定＝＝
１５０ｍＭ イミダゾールを含む５０ｍＭ Tris−HCl（ｐＨ８．０）２００μｌに、基質セレンテラジンの最終濃度を１．２〜１１．８μＭ範囲内で、各濃度のセレンテラジンを添加し２５℃で保温後、ＢＦＰ−ａｑを１．２μｇ添加し撹拌後、発光測定装置Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ−ＰＳＮ ＡＢ２２００（アトー社製）で６０秒間発光活性の測定を行った。発光反応３秒での発光活性を初速値として、ラインウェーバーバーグプロット法でＫｍ値を決定した。
【００７４】
その結果、１５０ｍＭ イミダゾールの添加系と無添加の反応系ではＫｍ値に顕著な変化はなく、イミダゾールを加えた系においてVmaxのみ約２倍になることが明らかとなった。すなわち、イミダゾール存在による発光活性増強は、基質とＢＦＰ−ａｑの結合に影響を与えるのではなく、セレンテラジンペルオキシドの生成過捏への促進あるいはセレンテラジンのカルバニオンの安定化に関与していると考えられる。
【００７５】
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】本発明にかかる実施例における、蛍光活性を有するルシフェラーゼ（ＢＦＰ−ａｑ）の各ｐＨにおける相対発光活性を示す図である。
【図２】本発明にかかる実施例において、蛍光活性を有するルシフェラーゼの活性増強を促す有機化合物の検索に用いた化合物の構造式を示した図である。
【図３】イミダゾールのプロトン化を示した図である。
【図４】イミダゾールによる蛍光活性を有するルシフェラーゼの活性増強のメカニズムを示した図である。
【図５】本発明にかかる実施例における、各濃度のイミダゾール添加による蛍光活性を有するルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼの相対発光活性を示した図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的な実験における検出マーカーとして利用することができる蛍光活性を有するルシフェラーゼの発光活性の活性増強方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本願発明者らは、カルシウム結合発光蛋白質イクオリンを用いて、光による励起によって蛍光を発生する蛍光発光活性のみならず、発光基質に作用して酸化的発光を触媒するルシフェラーゼ活性を有する新規蛋白質ＢＦＰ−ａｑの調整法の確立、及びその性質について詳細に検討を行ってきた（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
この新規蛋白質ＢＦＰ−ａｑは、カルシウム結合蛋白質イクオリンのアポ蛋白質の内部にセレンテラミドあるいは類縁化合物が配位し、このアポ蛋白質にカルシウムイオン等が結合した複合体である。
【０００４】
一般に酵素的発光反応は、「ルシフェラーゼ」とよばれる酵素を触媒とし、基質である「ルシフェリン」（低分子有機化合物）を酸化する酸化反応であり、その結果、生成するオキシルシフェリンの励起分子種が基底状態にもどるときに、エネルギーが光（フォトン）として放出される。ルシフェラーゼによって生成される光（フォトン）の検出感度は、蛍光発光蛋白質に励起光を与えることにより生成される蛍光の検出感度の１０〜１０００倍以上高いことが示されている。
【非特許文献１】Inouye，S．（2004）FEBS Lett．105-110．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＢＦＰ−ａｑは、蛍光発光活性を有する以外に、上記のようなルシフェラーゼ発光活性を有し、さらに、他のルシフェラーゼにはない耐熱性を有する蛋白質であるため、産業上の様々な分野において、非常に利用価値が高い。従って、その活性を上げることにより、更なる高感度の検出法を提供でき、応用分野の広がりも期待できる。
【０００６】
以上のような目的に鑑み、本発明の課題は、カルシウム結合型発光蛋白質から誘導される蛍光活性を有するルシフェラーゼ（ＢＦＰ−ａｑ）の発光活性を増強する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、ＢＦＰ−ａｑの発光効率をあげるために、セレンテラジンの発光反応機構に注目した。すなわち、天然型発光基質セレンテラジン（及びその誘導体を基質として）発光反応における有機電子論的機構を検討し、鋭意努力した結果、下記構成を用いることで、本発明の解決方法を見出し、本発明を完成した。本発明は下記のとおりである。［１］アポ蛋白質を有し、該アポ蛋白質の内部にセレンテラミドあるいはその類縁化合物が配位した、蛍光活性を有するルシフェラーゼの発光増強法であって、該蛍光活性を有するルシフェラーゼ溶液に対し、該ルシフェラーゼの発光基質であるセレンテラジンあるいはその類縁化合物、及び該セレンテラジンあるいはその類縁化合物におけるイミダゾピラジン骨格のピラジン環のＮＨプロトン引き抜き効果のある化合物を添加することを特徴とする発光増強法。
【０００８】
［２］前記プロトン引き抜き効果のある化合物がイミダゾールであることを特徴とする［１］項に記載の発光増強法。
【０００９】
［３］前記ルシフェラーゼが、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質とセレンテラミドまたはその類縁化合物およびカルシウムイオンまたはカルシウムイオンと置換可能な２価もしくは３価のイオンからなり、前記ルシフェラーゼ分子内における、該アポ蛋白質と該セレンテラミドまたはその類縁化合物の分子数比が１：１であり、該アポ蛋白質とカルシウムイオンまたはカルシウムイオンと置換可能な２価または３価のイオンの分子数比が１：１〜４であることを特徴とする［１］項または［２］項に記載の発光増強法。
【００１０】
［４］前記アポ蛋白質が、アポイクオリン、アポクライチン、アポオベリン、アポマイトロコミン、アポミネオプシンおよびアポベルボインからなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする［１］〜［３］項のいずれかに記載の発光増強法。
【００１１】
［５］前記蛍光活性を有するルシフェラーゼが、配列番号１〜４で表されるアミノ酸配列を有するアポ蛋白質または配列番号１〜４で表されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された変異体アポ蛋白質を含有することを特徴とする［１］〜［４］項のいずれかに記載の発光増強法。
【００１２】
［６］前記セレンテラミドあるいはその類縁化合物が下記式（１）または式（２）で表されることを特徴とする［１］〜［５］項のいずれかに記載の発光増強法。
式中、
Ｒ1は、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアリールアルキル基、または脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基であり、 Ｒ2は、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアリールアルキル基、置換または非置換のアリールアルケニル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルケニル基、複素環式基であり、Ｒ3は、水素原子、置換または非置換のアルキル基であり、Ｘ1は、水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アルコキシル基またはアミノ基であり、Ｘ2は、水素原子または水酸基であり、Ｙは１〜４個の炭素原子を有する２価の炭化水素基である。
【００１３】
［７］前記式（１）または前記式（２）において、Ｒ1が非置換のアリール基、非置換のアリールアルキル基、水酸基またはハロゲン原子で置換されたアリールアルキル基、またはシクロヘキシル基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基であり、Ｒ2が非置換のアリール基、水酸基で置換されたアリール基、非置換のアリールアルキル基、水酸基で置換されたアリールアルキル基、非置換のアリールアルケニル基、非置換の直鎖または分枝鎖のアルキル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖のアルキル基、分枝鎖のアルケニル基、硫黄を含む複素環式基であり、Ｒ3は、水素原子、メチル基または２−ヒドロキシエチル基であり、Ｘ1は、水素原子、水酸基、フッ素原子、メトキシ基またはアミノ基であり、Ｙはメチレン基、エチレン基、プロピレン基またはビニレン基である［６］項に記載の発光増強法。
【００１４】
［８］前記式（１）または前記式（２）において、Ｒ1がフェニル基、ベンジル基、ｐ−ヒドロキシベンジル基、ｐ−フルオロベンジル基、ｐ−クロロベンジル基、ｐ−ブロモベンジル基、ｐ−ヨードベンジル基、３,４−ジフルオロベンジル基、ペンタフルオロベンジル基、フェニルエチル基、フェニルプロピル基、ナフチルメチル基、シクロヘキシルメチル基、メチル基、１−メチルプロピル基または２−メチルプロピル基であり、Ｒ2がフェニル基、ｐ−ヒドロキシフェニル基、ベンジル基、α−ヒドロキシベンジル基、フェニルエチル基、フェニルビニル基、シクロヘキシル基、シクロヘキシルメチル基、シクロヘキシルエチル基、メチル基、エチル基、プロピル基、２−メチルプロピル基、２−メチルプロぺニル基、アダマンチルメチル基、シクロペンチルメチル基またはチオフェン−２−イル基であることを特徴とする［７］項に記載の発光増強法。
【００１５】
［９］前記セレンテラジンあるいはその類縁化合物が下記式（３）または式（４）で表されることを特徴とする［１］〜［５］項のいずれかに記載の発光増強法。
式中、
Ｒ１は、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアリールアルキル基、または脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基であり、Ｒ２は、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアリールアルキル基、置換または非置換のアリールアルケニル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルケニル基、複素環式基であり、Ｒ３は、水素原子、置換または非置換のアルキル基であり、Ｘ１は、水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アルコキシル基またはアミノ基であり、Ｘ２は、水素原子または水酸基であり、Ｙは１〜４個の炭素原子を有する２価の炭化水素基である。
【００１６】
［１０］前記式（３）または前記式（４）において、Ｒ１が非置換のアリール基、非置換のアリールアルキル基、水酸基またはハロゲン原子で置換されたアリールアルキル基、またはシクロヘキシル基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基であり、Ｒ２が非置換のアリール基、水酸基で置換されたアリール基、非置換のアリールアルキル基、水酸基で置換されたアリールアルキル基、非置換のアリールアルケニル基、非置換の直鎖または分枝鎖のアルキル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖のアルキル基、分枝鎖のアルケニル基、硫黄を含む複素環式基であり、Ｒ３は、水素原子、メチル基または２−ヒドロキシエチル基であり、Ｘ１は、水素原子、水酸基、フッ素原子、メトキシ基またはアミノ基であり、Ｙはメチレン基、エチレン基、プロピレン基またはビニレン基であることを特徴とする［９］項に記載の発光増強法。
【００１７】
［１１］前記式（３）または前記式（４）において、Ｒ１がフェニル基、ベンジル基、p−ヒドロキシベンジル基、p−フルオロベンジル基、p−クロロベンジル基、p−ブロモベンジル基、P−ヨードベンジル基、３，４−ジフルオロベンジル基、ペンタフルオロベンジル基、フェニルエチル基、フェニルプロピル基、ナフチルメチル基、シクロヘキシルメチル基、メチル基、１−メチルプロピル基または２−メチルプロピル基であり、Ｒ２がフェニル基、p−ヒドロキシフェニル基、ベンジル基、α−ヒドロキシベンジル基、フェニルエチル基、フェニルビニル基、シクロヘキシル基、シクロヘキシルメチル基、シクロヘキシルエチル基、メチル基、エチル基、プロピル基、２−メチルプロピル基、２−メチルプロペニル基、アダマンチルメチル基、シクロペンチルメチル基またはチオフェン−２−イル基であることを特徴とする（１０）項に記載の発光増強法。
【００１８】
［１２］前記セレンテラジンの類縁化合物が、h−セレンテラジン、f−セレンテラジン、cp−セレンテラジン、hcp−セレンテラジンから選ばれる少なくとも１種である［１］〜［８］項のいずれかに記載の発光増強法。
【００１９】
［１３］セレンテラジンあるいはその類縁化合物を発光基質として、アポ蛋白質を有し、該アポ蛋白質の内部にセレンテラミドあるいはその類縁化合物が配位した、蛍光活性を有するルシフェラーゼが放射する発光を増強させる発光増強剤であって、該セレンテラジンあるいはその類縁化合物におけるイミダゾピラジン骨格のピラジン環のＮＨプロトン引き抜き効果のある化合物を含有することを特徴とする発光増強剤。
【００２０】
［１４］前記プロトン引き抜き効果のある化合物がイミダゾールであることを特徴とする［１３］項に記載の発光増強剤。
【００２１】
［１５］アポ蛋白質を有し、該アポ蛋白質の内部にセレンテラミドあるいはその類縁化合物が配位した、蛍光活性を有するルシフェラーゼ、発光基質であるセレンテラジンあるいはその類縁化合物、前記ルシフェラーゼの発光を増強させ得る発光増強剤を含むキットであって、前記発光増強剤は、前記セレンテラジンあるいはその類縁化合物におけるイミダゾピラジン骨格のビラジン環のＮＨプロトン引き抜き効果のある化合物であることを特徴とするキット。
【００２２】
［１６］前記プロトン引き抜き効果のある化合物がイミダゾールであることを特徴とする［１５］項に記載のキット。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によって、カルシウム結合型発光蛋白質から誘導される蛍光活性を有するルシフェラーゼ（ＢＦＰ−ａｑ）の発光活性を増強する方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は、カルシウム結合型発光蛋白質から誘導される蛍光活性を有するルシフェラーゼ（ＢＦＰ−ａｑ）溶液に、発光基質であるセレンテラジンおよび類縁化合物におけるイミダゾピラジン骨格のピラジン環のＮＨプロトン引き抜き効果のある化合物を添加することによって、ＢＦＰ−ａｑの発光活性を増強する方法である。
【００２５】
＝＝蛍光活性を有するルシフェラーゼ（ＢＦＰ−ａｑ）＝＝
１．蛍光活性を有するルシフェラーゼ（ＢＦＰ−ａｑ）の構成および構造
本発明に用いる化学発光活性を有する蛍光活性を有するルシフェラーゼ（ＢＦＰ−ａｑは、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質、セレンテラミドまたはその類縁化合物、およびカルシウムイオンまたはカルシウムイオンと置換可能な２価もしくは３価のイオンより構成されており、好ましくはアポ蛋白質とセレンテラミドまたはその類縁化合物のＢＦＰ−ａｑ中の分子数の比は１：１であり、アポ蛋白質とカルシウムイオンまたはカルシウムイオンと置換可能な２価もしくは３価のイオンのＢＦＰ−ａｑ中の分子数の比は１：１〜４である。より好ましくは、アポ蛋白質とカルシウムイオンまたはカルシウムイオンと置換可能な２価もしくは３価のイオンの分子数の比は１：２〜３、さらに好ましくは１：３である。このＢＦＰ−ａｑ内で、セレンテラミドまたはその類縁化合物は、アポ蛋白質の内部に配位しており、カルシウムイオンは主としてアポ蛋白質のＥＦハンドに結合している。
このＢＦＰ−ａｑは、他のルシフェラーゼと比較して熱安定性に優れているので、従来ルシフェラーゼを用いることができなかった分野にも応用が可能である。
【００２６】
２．蛍光活性を有するルシフェラーゼ（ＢＦＰ−ａｑ）の製造
ＢＦＰ−ａｑは、カルシウム結合型発光蛋白質とカルシウムイオンまたはカルシウムイオンと置換可能な２価もしくは３価のイオンを、極めて緩やかな（反応速度が極めて遅い）条件で反応させることにより製造できる。ここで、緩やかに反応させるとは、カルシウム結合型発光蛋白質とカルシウムイオン等のイオンが反応した後に、セレンテラミドまたはその類縁化合物がアポ蛋白質に配位したまま残り、かつ新たなＳ-Ｓ結合が実質上生成しないような条件で反応させることを意味する。
【００２７】
そのような反応条件は、例えば、高粘度のカルシウム結合型発光蛋白質溶液に、非常に希薄なカルシウムイオン等の溶液を重層し、低温で長時間にわたって反応させることである。この場合、反応温度は、好ましくは０℃〜３０℃、より好ましくは４℃である。また反応時間は、蛋白質の濃度によっても異なるが、２４時間以上であることが好ましい。
【００２８】
この際、カルシウムイオンの濃度は低い方が好ましい。カルシウムイオンの濃度が低ければ、カルシウムイオンがカルシウム結合型発光蛋白質と接触（反応）する頻度が低くなるからである。逆に、カルシウム結合型発光蛋白質溶液の濃度は高い方が好ましい。蛋白質溶液の濃度が高ければ、蛋白質溶液の粘度も高くなり、カルシウムイオン溶液と蛋白質溶液との混合がゆっくり進行するからである。
【００２９】
具体的には、１０-7Ｍ（mol／ｌ）以下の濃度のカルシウムイオンまたはカルシウムイオンと置換可能な２価もしくは３価のイオンの水溶液を、カルシウムイオン結合型発光蛋白質に対して１〜４のモル比となるように添加して、両者を反応させる。カルシウムイオン等のイオンとカルシウムイオン結合型発光蛋白質のモル比は、反応が緩やかに進められるならば、目的とする蛍光活性を有するルシフェラーゼ（ＢＦＰ−ａｑ）における分子数の比以上（例えば、４以上）であっても構わない。本発明で必要とされる反応条件を達成するためには、反応容器のデザインの変更、溶媒の選択、半透膜の使用等のバリエーションが考えられ、本明細書に記載されたものに限定されるものではない。
【００３０】
３．蛍光活性を有するルシフェラーゼ（ＢＦＰ−ａｑ）を構成するアポ蛋白質
ＢＦＰ−ａｑを構成するアポ蛋白質として、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質が用いられる。ここでいうカルシウム結合型発光蛋白質とは、カルシウムイオンまたはそれと同等な２価または３価のイオンと反応して発光する蛋白質を指す。例えば、イクオリン、クライチン、オベリン、マイトロコミン、ミネオプシンおよびベルボインを挙げることができる。これらは、天然から採取したものであっても、遺伝子工学的に製造したものであってよい。さらに、上記の発光活性を有すれば、そのアミノ酸配列を天然のものから遺伝子組換え技術によって変異させたものであってもよい。
【００３１】
現在まで、遺伝子が単離されているカルシウム結合発光蛋白質を表１に示した。
【００３２】
【００３３】
これらのアポ蛋白質部分のアミノ酸配列の相同性は６０％以上であり、すべて発光基質セレンテラジンよりカルシウム結合発光蛋白質への再生が可能である。さらに、近年の発光蛋白質であるイクオリンとオベリンとのＸ線結晶解析の結果、アミノ酸配列の相同性以上に、両者の高次構造の主鎖構造はほとんど同じであることが明らかとなっている。このことから、他のカルシウム結合発光蛋白質の高次構造相同性は、容易に類推できる。従って、本願実施例では、代表的なカルシウム結合発光蛋白質であるイクオリンを用いたが、その結果は他のカルシウム結合発光蛋白質に応用できるのは明らかである。
【００３４】
天然型イクオリンのアポ蛋白であるアポイクオリンのアミノ酸配列を配列番号１に示す。配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するもののほか、公知のまたは未知のその変異体であってカルシウム結合型発光蛋白質を形成するものであればすべて使用できる。したがって、本発明で使用されるアポイクオリンには、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するアポイクオリンおよび配列番号１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された変異型アポイクオリンが含まれる。特に好ましい変異型アポイクオリンの例として、配列番号１において１番目のValがAla-Asn-Serで置換されたものが挙げられる。
【００３５】
野生型クライチンのアポ蛋白であるアポクライチンのアミノ酸配列は配列番号２に示される。野生型オベリンのアポ蛋白であるアポオベリンのアミノ酸配列は配列番号３に示される。野生型マイトロコミンのアポ蛋白であるアポマイトロコミンのアミノ酸配列は配列番号４に示される。これらは、それぞれの配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された変異型のものであってもよい。
【００３６】
ＢＦＰ−ａｑは、アポ蛋白質中のシステイン残基の遊離ＳＨ基が酸化されてＳ-Ｓ結合を生成すると、化学発光活性を失う。したがって、遊離のＳＨ基が欠失または置換され、Ｓ-Ｓ結合を生じることができなくなった変異アポ蛋白質は、化学発光活性を失うことがないと考えられ、例えば、システイン残基をセリン残基で置換した蛍光蛋白質は、Ｓ-Ｓ結合を生じないため活性が持続的であると期待される。
【００３７】
４．蛍光活性を有するルシフェラーゼ（ＢＦＰ−ａｑ）を構成するセレンテラミド
セレンテラミドまたはその類縁化合物は、式（１）または式（２）で示される。
式中、
Ｒ1は、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアリールアルキル基、または脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基である。好ましくは、非置換のアリール基、非置換のアリールアルキル基、水酸基もしくはハロゲン原子で置換されたアリールアルキル基、またはシクロヘキシル基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基である。さらに好ましくは、フェニル基、ベンジル基、ｐ−ヒドロキシベンジル基、ｐ−フルオロベンジル基、ｐ−クロロベンジル基、ｐ−ブロモベンジル基、ｐ−ヨードベンジル基、３,４−ジフルオロベンジル基、ペンタフルオロベンジル基、フェニルエチル基、フェニルプロピル基、ナフチルメチル基、シクロヘキシルメチル基、メチル基、１−メチルプロピル基または２−メチルプロピル基である。
Ｒ2は、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアリールアルキル基、置換または非置換のアリールアルケニル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルケニル基、複素環式基である。好ましくは、非置換のアリール基、水酸基で置換されたアリール基、非置換のアリールアルキル基、水酸基で置換されたアリールアルキル基、非置換のアリールアルケニル基、非置換の直鎖または分枝鎖のアルキル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖のアルキル基、分枝鎖のアルケニル基、硫黄を含む複素環式基である。さらに好ましくは、フェニル基、ｐ−ヒドロキシフェニル基、ベンジル基、α−ヒドロキシベンジル基、フェニルエチル基、フェニルビニル基、シクロヘキシル基、シクロヘキシルメチル基、シクロヘキシルエチル基、メチル基、エチル基、プロピル基、２−メチルプロピル基、２−メチルプロぺニル基、アダマンチルメチル基、シクロペンチルメチル基またはチオフェン−２−イル基である。
Ｒ3は、水素原子、置換または非置換のアルキル基である。好ましくは、水素原子、メチル基または２−ヒドロキシエチル基である。
Ｘ1は、水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アルコキシル基またはアミノ基であり、特に好ましくは水素原子、水酸基、フッ素原子、メトキシ基またはアミノ基である。
Ｘ2は、水素原子または水酸基である。
Ｙは１〜４個の炭素原子を有する２価の炭化水素基であり、好ましくはメチレン基、エチレン基、プロピレン基またはビニレン基である。
【００３８】
５．蛍光活性を有するルシフェラーゼはセレンテラジンを発光基質とする。
セレンテラジンまたはその類縁化合物は、下記式（３）または式（４）で表される。
式中のＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｘ1、Ｘ2およびＹは、式（１）および式（２）と同じである。
【００３９】
本発明において、発光基質として、セレンテラジンおよびその類縁化合物であるh−セレンテラジン、f−セレンテラジン、cp−セレンテラジン、hcp−セレンテラジンが特に好ましく利用できる。
【００４０】
以下に、これらの化合物、およびセレンテラミドの化学構造式をまとめて示す。
【００４１】
６．蛍光活性を有するルシフェラーゼ（ＢＦＰ−ａｑ）を構成する金属イオン
ＢＦＰ−ａｑに結合する金属イオンは、カルシウムイオンまたはカルシウムイオンと置換可能な２価もしくは３価のイオンである。ここで、カルシウムイオンと置換可能なイオンとは、カルシウムイオンに代えてイクオリンなどのカルシウム結合型発光蛋白質と反応させた場合に、発光反応を起こすイオンのことである。つまり、カルシウム結合型発光蛋白質に対して、カルシウムイオンと同等の作用をするものである。例えば、マグネシウムイオン（Ｍｇ2+）、ストロンチウムイオン（Ｓｒ2+）、バリウムイオン（Ｂａ2+）、鉛イオン（Ｐｂ2+）、コバルトイオン（Ｃｏ2+）、ニッケルイオン（Ｎｉ2+）、カドミウムイオン（Ｃｄ2+）、イットリウムイオン（Ｙ3+）、ランタンイオン（Ｌａ3+）、サマリウムイオン（Ｓｍ3+）、ユウロピウムイオン（Ｅｕ3+）、ジスプロシウムイオン（Ｄｙ3+）、ツリウムイオン（Ｔｍ3+）、イットリビウムイオン（Ｙｂ3+）を挙げることができる。これらのうち、２価の金属イオンが好ましい。より好ましくは遷移金属以外の２価の金属イオン、例えばＣａ2+、Ｓｒ2+、Ｐｂ2+である。
また、これらのイオンは少なくとも１個が、いわゆるカルシウム結合型発光蛋白質のＥＦハンドに結合していればよいが、２個以上、特に３個のこれらのイオンが結合しているのが好ましい。
【００４２】
代表的なセレンテラジンを基質とするルシフェラーゼを表２に示す。
【００４３】
＝＝ＢＦＰ−ａｑの発光増強方法＝＝
以上のように調整した蛍光活性を有するルシフェラーゼ（ＢＦＰ−ａｑ）に対し、天然型のセレンテラジンを発光基質とした発光反応を行う。この反応において、セレンテラジンのイミダゾピラジノン骨格における−ＮＨ−プロトンを引き抜くための化合物、すなわちプロトンのアクセプターになりうる化合物を発光増強剤として添加する。
【００４４】
発光増強剤としては、上記作用を有する化合物であれば何でもよく、一般的に容易に入手可能な化合物として、例えば、イミダゾール、ヒスタミン、L−ヒスチジン、２−メチルイミダゾール、４−メチルイミダゾール、ウノカニン酸、５−アミノ−４−イミダゾール−カルボキシアミド、L−アルギニン、アセトアミド、グアニジン、L−リジン、尿素、トリエチルアミン等が挙げられる。なかでも、特にイミダゾールが好ましく利用できる。また、これらは、単独で用いてもよいが、複数を併用して用いてもよい。また、この発光反応は水系で行うことが好ましいので、発光増強剤は水溶性であることが好ましい。
【００４５】
反応条件は特に限定されないが、ＢＦＰ−ａｑの蛍光活性が安定であり、ルシフェラーゼ活性が十分発揮できるｐＨ８.０程度が好ましい。また、ＢＦＰ−ａｑの発光反応の至適ｐＨと添加化合物のｐＫａを考慮することで、−ＮＨ−プロトンを引き抜き効果の強さも予測することができるため、用途に応じて、発光増強剤を選択することができる。発光増強剤の濃度は、３０〜３５０ｍＭが利用でき、６０〜３００ｍＭが好ましい。
【００４６】
この発行増強剤を容易に使用することができるように、蛍光活性を有するルシフェラーゼ（ＢＦＰ−ａｑ）、セレンテラジンあるいは類縁化合物とともに、キットとしてもよい。
【実施例】
【００４７】
以下に実施例により本発明を説明するが、実施例は本発明を制限するものではない。
【００４８】
＝＝組換えアポイクオリンの調製＝＝
組換えアポイクオリンを得るために、アポイクオリン遺伝子を有するｐＡＱ４４０（特開昭６１−１３５５８６号公報）から構築されたアポイクオリン遺伝子発現ベクターｐｉＰ−ＨＥ（特開平１−１３２３９７号公報）を用いた。このベクターにコードされた組換えアポイクオリンのＮ−末端は、Ala−Asｎ−Ser−より始まる１９１個のアミノ酸より構成されている（配列表１のＮ−末端のValがAla−Asｎ−Ser−で置換されたもの）。
【００４９】
上記発現ベクターｐｉＰ−ＨＥを、常法により大腸菌ＷＡ８０２株に導入した。得られた形質転換株を、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有する寒天培地上で３０℃で一晩培養した後、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有する５０ｍｌのＬＢ液体培地（水１リットルあたり、バクトトリプトン１０ｇ、イーストイクストラクト５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、ｐＨ７．２）に植菌し、３０℃で８時間前培養した。次いで、その培養物を新たなＬＢ液体培地２リットルに添加し、３７℃で一昼夜（１８時間）培養した。培養後、得られた培養物を、菌体と培養液に低速遠心分離（５０００×ｇ）によって分離した。菌体および培養液はともに発現した組換えアポイクオリンを含むためそれぞれ保存し、イクオリンの精製出発材料とした。
【００５０】
まず、菌体からの組換えアポイクオリンの回収を行った。集菌した菌体を、還元剤であるジチオスレイトール（DTT，和光純薬社製）２００ｍｇを含む４００ｍｌの５０ｍＭ Tris−HCl、１０ｍＭ EDTA、ｐＨ７．６の緩衝液中に懸濁し、氷冷下において超音波破砕装置で２分間処理して菌体を破砕し、１２０００×ｇで２０分間遠心後、上清を集めた。得られた上清に化学合成したセレンテラジン（エタノール溶液）を産生アポイクオリンの１．２倍のモル濃度になるように添加し、４℃で５時間以上放置した。
【００５１】
この上清を直ちに、ＴＥ（２０ｍＭ Tris−HCl、１０ｍＭ EDTA、ｐＨ７．６）緩衝液で平衡化したＱ−セファロースカラム（ファルマシア製、直径２ｃｍ×１０ｃｍ）に添加してイクオリンを吸着させ、カラムから溶液の２８０ｎｍでの吸光度が０．０５以下になるまでＴＥＮ（２０ｍＭ Tris−HCl、１０ｍＭ EDTA、０．１Ｍ NaCl、ｐＨ７．６）でカラムを洗浄した。そして、カラムに吸着したアポイクオリンとイクオリン画分を０．１Ｍ NaCl〜０．４Ｍ NaClの直線濃度勾配で溶出させた。
【００５２】
再生イクオリンと未再生のアポイクオリンとの分離は、疎水性クロマトグラフィーであるブチルセファロース４ファーストフローゲルを用いて行った。即ち、Ｑ−セファロースカラムからのオレンジ色の溶出液に、最終濃度が２Ｍになるように硫酸アンモニウムを溶解した。次いで、不溶画分を遠心分離によって除去し、上清を、２Ｍ 硫酸アンモニウムを含有するＴＥで平衡化したブチルセファロース４ファーストフローカラム（ファルマシア社、カラムサイズ：直径２ｃｍ×８ｃｍ）に通し、硫酸アンモニウム濃度１Ｍまで直線濃度勾配により溶出し、発光活性を有するオレンジ色の再生イクオリン画分を収集した。なお、未再生のアポイクオリンは、ＴＥで溶出された。
【００５３】
再生イクオリン画分について、還元状態で１２％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を行った結果、精製画分について分子量２５ｋＤａ蛋白質に相当する単一バンドが検出され、その純度はデンシトメーターでの測定では９８％以上であった。菌体からのイクオリンの回収率は約８０％で、８０ｍｇの高純度イクオリンを得た。
【００５４】
一方、培養液からの高純度アポイクオリンの精製は、特開平１−１３２３９７号公報に記載の方法に従って実施した。即ち、培養液を酸性化処理してｐＨ５以下にし、４℃で６０分間以上放置した。白色沈殿となったアポイクオリンを遠心分離によって単離し、これを還元剤を含む上述の緩衝液（５０ｍＭ Tris−HCl、１０ｍＭ EDTA、ｐＨ７．６）に溶解させた。そして菌体からのイクオリンの精製工程と同様にイクオリンへの再生後、Ｑ−セファロースカラムクロマト法、ブチルセファロース４ファーストフローカラムクロマト法を用いて、イクオリンを精製した。得られた精製イクオリンについて、還元状態で１２％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を行った結果、分子量２５ｋＤａ蛋白質に相当する単一バンドが検出され、その純度はデンシトメーターでの測定では９８％以上であった。こうして、培養液より得られたアポイクオリン５０ｍｇから高純度イクオリン４５ｍｇを得た。なお、蛋白量はBradford法にもとづく市販のキット（バイオラッド社製）を用い、ウシ血清アルブミン（ピアス社製）を標準物質として用いて決定した。
【００５５】
＝＝蛍光活性を有するルシフェラーゼ（ＢＦＰ−ａｑ）の調製＝＝
実施例１記載の精製イクオリンを、１０ｍＭ Tris−HCl（ｐＨ７．６）、２ｍＭ EDTA、１．２Ｍ 硫酸アンモニウムを含む緩衝液に溶解し、イクオリン濃度が８ｍｇ／ｍｌのイクオリン溶液を調製した。
【００５６】
このイクオリン溶液１ｍｌを、高速限外濾過フィルターである分画分子量１０，０００のポリエーテルスルホン膜を有するビバスピン２カラム（ザルトリウス社製）を用いて、冷却高速遠心機（日立社製：ＣＲ２０Ｂ２型）にて、４℃で、５０００×ｇ、６０分間以上遠心を行い、全量を０．１ｍｌ以下に濃縮した。さらに、濃縮溶液のEDTA濃度を、０．１μＭ以下に下げるために、１ｍｌの０．１μＭ EDTAを含む１０ｍＭ Tris−HClをビバスピン２カラムに加え、再度同一条件で遠心を行い、全量を濃縮するステップを最低２回くり返した。このイクオリン濃縮液は、黄赤色を呈し、肉眼で容易に確認できた。
【００５７】
以下の手順で、ＢＦＰ−ａｑの調製を行った。ビバスピン２カラム内で濃縮イクオリン溶液に、０．９ｍｌの５ｍＭ 塩化カルシウム（和光純薬）、２ｍＭ ジチオスレイトール（和光純薬）を含む５０ｍＭ Tris−HCl（ｐＨ７．６）を重層し、連続発光を開始させ、４℃で２４時間以上放置した。発光反応の終了は、イクオリン溶液の黄赤色の消失によっても確認できた。さらに、ビバスピン２カラム内へ２ｍｌの５ｍＭ塩化カルシウム（和光純薬）、２ｍＭ ジチオスレイトール（和光純薬）を含む５０ｍＭ Tris−HCl（ｐＨ７．６）を加え、上記同一条件で遠心を行い洗浄した。生成したＢＦＰ−ａｑは、長波長のＵＶランプ（極大波長＝３６６ｎｍ）の下で、青色蛍光を発生することを確認した。
【００５８】
＝＝組換えウミシイタケルシフェラーゼの調整法＝＝
ウミシイタケルシフェラーゼはウミシイタケ（Renilla reniformis）に由来する単量体の発光酵素（36kDa）で、基質であるセレンテラジンの酸化を触媒し光を発生させるが、ここでは、蛍光活性を有さないルシフェラーゼの一例として、コントロール（対照実験）に用いた。
【００５９】
ウミシイタケルシフェラーゼを大腸菌内で発現させるため、アミノ酸末端にヒスチジンタグが付加したウミシイタケルシフェラーゼをコードする組換え遺伝子を有する発現ベクターｐＨｉｓ-ＲＬａｓｅを用いた。この発現ベクターｐＨｉｓ-ＲＬａｓｅは、公知の方法（Biochem．Biophys．Res．Commun．233，349-353）に基づいて調整した。
【００６０】
発現ベクターｐＨｉｓ-ＲＬａｓｅを、常法により大腸菌Top10株（インビトロジェン）に導入した。得られた形質転換株をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有する１０ｍｌ ＬＢ液体培地（水１リットルあたり、バクトトリプトン１０ｇ、イーストイクストラクト５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、ｐＨ７．２）にて２４℃で一昼夜（１８時間）前培養をした後、さらに４００ｍｌのＬＢ液体培地で３６℃、２時間培養を行った。その後、イソプロピル−β−Ｄ（−)−チオガラクトピラノシド（IPTG、和光純薬工業社製）を最終濃度０．２ｍＭになるよう培養液に加え、さらに３時間同温で培養を行った。培養後、菌体を遠心回収（５，０００ｒｐｍ×５ｍｉｎ、３，０００×ｇ）し、組換えウミシイタケルシフェラーゼの精製出発材料とした。
【００６１】
集菌した菌体を５０ｍＭ Tris−HCl（ｐＨ７．６）５ｍｌに懸濁し、氷冷下で超音波破砕処理（ブランソン社製、Sonifier model cycle 250）を３分間、２回行った。その菌体破砕液を１２，０００ｒｐｍ（１７，７００×ｇ）で２０分間遠心し上清を回収後、ニッケルキレートカラム（アマシャムバイオサイエンス社、カラムサイズ：直径１．５×５ｃｍ）に添加してウミシイタケルシフェラーゼを吸着させた。吸着ウミシイタケルシフェラーゼを０．５Ｍ イミダゾール（和光純薬工業社製）で溶出を行い、得られたウミシイタケルシフェラーゼ活性画分を５Ｌの０．１Ｍ 炭酸アンモニウム溶液（ｐＨ８．０）に対して、一晩４℃で透析を行った。
【００６２】
透析したウミシイタケルシフェラーゼ活性画分を、再度ニッケルキレートカラム（アマシャムバイオサイエンス社、カラムサイズ：直径１．５×５ｃｍ）に吸着させ、イミダゾール濃度０〜０．３Ｍまで直線濃度勾配により溶出し、さらに精製されたウミシイタケルシフェラーゼ活性画分を得た。イミダゾール濃度０．１２〜０．１３Ｍにてウミシイタケルシフェラーゼの溶出が確認された。
【００６３】
次に、得られたウミシイタケルシフェラーゼ画分をＱ−セファロースカラム（アマシャムバイオサイエンス社、カラムサイズ：直径２．５×５ｃｍ）に添加し吸着させ、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ Tris−HCl（ｐＨ７．６）に、塩化ナトリウム濃度０〜０．４Ｍまで直線濃度勾配により溶出し、さらに精製されたウミシイタケルシフェラーゼ活性画分を得た。塩化ナトリウム濃度０．２〜０．２２Ｍにてウミシイタケルシフェラーゼ活性の溶出が確認され、１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法により純度は９５％以上であることを確認した。
【００６４】
＝＝ウミシイタケルシフェラーゼを用いた発光活性の測定法＝＝
ｐＨ７．６の５０ｍＭ Tris−HCl緩衝液（２００μｌ）を２５℃に保温後、エタノールに溶解した基質セレンテラジン（１μｇ／μｌ）を加え、ウミシイタケルシフェラーゼ（１．２μｇ）を添加することにより発光反応を開始させた。発光測定装置Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ−ＰＳＮ ＡＢ２２００（アトー社製）で６０秒間発光活性の測定を行い、発光活性の最大値（Ｉｍａｘ）で示した。
【００６５】
＝＝ＢＦＰ−ａｑの発光反応の至適ｐＨの検討＝＝
各々ｐＨ５．０〜１０．５の５０ｍＭ Tris−HCl緩衝液（２００μ１）を２５℃に保温後、基質セレンテラジン（１μｇ）を加え、ＢＦＰ−ａｑ（１．２μｇ）を添加し反応を開始させ、発光測定装置Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ−ＰＳＮ ＡＢ２２００（アトー社製）で６０秒間発光活性の測定を行った。５０ｍＭ Tris−HCl（ｐＨ８．０）中でのＢＦＰ−ａｑの発光活性の最大値（Ｉｍａｘ）を１００％とし、各ｐＨでの相対発光活性値を図１に示した。
【００６６】
＝＝有機化合物添加によるＢＦＰ−ａｑ発光増強効果＝＝
表３に示した種々の市販有機化合物をそれぞれ含む５０ｍＭ Tris−HCl（ｐＨ８．０）溶液を調整し、２５℃に保温した。この化合物を含む溶液（２００μｌ）に、基質セレンテラジン（１μｇ）を加え、さらにＢＦＰ−ａｑ（１．２μｇ）添加し撹拌後、発光測定装置Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ−ＰＳＮ ＡＢ２２００（アトー社製）で６０秒間発光活性の測定を行った。５０ｍＭ Tris−HCl（ｐＨ８．０）中でのＢＦＰ−ａｑの発光活性の最大値（Ｉｍａｘ）を１００％とし、相対発光活性値を表４に示した。また各有機化合物の構造式を図２に示す。
【００６７】
【００６８】
表４の相対発光活性値を比較した結果、発光反応系に１５０ｍＭ イミダゾールを加えた場合にのみ顕著な発光活性（Ｉｍａｘ）の増強が起きた。これは、イミダゾールのｐＫａ＝７．０を考慮すると、イミダゾールは図３に示すように、アルカリ条件下では容易にプロトンのアクセプターになる。ｐＨ８．０での発光反応では、図４に示すように、イミダゾールが発光基質であるセレンテラジンの７位のプロトンのアクセプターとなり、プロトンの引き抜きを促進する結果、セレンテラジンへの酸素添加反応を促進するため、発光反応が効率良く進むためであると考えられる。一方、その他の化合物では、発光活性の促進はみられなかった。これは、ｐＨ８．０では、セレンテラジンの７位のプロトンのアクセプターとして化合物が機能していないことを示している。その理由として、ｐＫａ以外にイミダゾールの側鎖の影響、あるいは分子サイズによる物理的障害により、ＢＦＰ−ａｑ内のセレンテラジンと作用できないためであると考えられる。
【００６９】
＝＝イミダゾール添加によるＢＦＰ−ａｑの発光増強効果の至適濃度の決定＝＝
イミダゾールをそれぞれの濃度（０．１，０．３，１，３，１０，３０，６０，１００，１５０，２００，２５０，３００，４００，５００，６００，７００，８００，９００，１０００ｍＭ）を含む５０ｍＭ Tris−HCl（ｐＨ８．０）を調整し、２５℃に保った。イミダゾールを含む溶液（２００μｌ）に、基質セレンテラジン（１μｇ）を加え、さらにＢＦＰ−ａｑ（１．２μｇ）添加し撹拌後、発光測定装置Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ−ＰＳＮ ＡＢ２２００（アトー社製）で６０秒間発光活性の測定を行った。５０ｍＭ Tris−HCl（ｐＨ８．０）中でのＢＦＰ−ａｑの発光活性の最大値（Ｉｍａｘ）を１００％とし、イミダゾール濃度と発光活性の関係を図５に示した。対象実験として、セレンテラジンを発光基質とするウミシイタケルシフェラーゼを用いて同様の実験を行った。その結果、ウミシイタケルシフェラーゼではイミダゾールの濃度が高くなるにつれ発光活性が著しく阻害されるが、ＢＦＰ−ａｑの発光活性はイミダゾール３０ｍＭ〜２５０ｍＭにおいて促進されることが判明した。特に１５０ｍＭ イミダゾールを添加することで、イミダゾールを添加しない系の２倍以上の発光活性を得ることができた。すなわち、イミダゾール添加による発光活性の増強効果は、ＢＦＰ−ａｑに特異的な効果であることが明らかとなった。
【００７０】
＝＝セレンテラジンアナログとイミダゾール添加ＢＦＰ−ａｑの組み合わせによる発光活性増強方法＝＝
１５０ｍＭ イミダゾールを含む５０ｍＭ Tris−HCl（ｐＨ８．０）を調整し、２５℃に保った。この溶液を５本の容器に２００μｌずつ入れ、基質セレンテラジン（ＣＴＺ）及びそのアナログ４種（ｈ−ＣＴＺ，ｃｐ−ＣＴＺ，ｈｃｐ−ＣＴＺ，ｆ−ＣＴＺ）１μｇをそれぞれに加え、さらにＢＦＰ−ａｑ（１．２μｇ）添加し撹拌後、発光測定装置Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ−ＰＳＮ ＡＢ２２００（アトー社製）で６０秒間発光活性の測定を行った。５０ｍＭ Tris−HCl（ｐＨ８．０）中で基質をセレンテラジンとしたＢＦＰ−ａｑの発光活性の最大値（Ｉｍａｘ）および初速を１００％とし、イミダゾール添加の有無による発光活性の影響を調べた。
【００７１】
【００７２】
表５のセレンテラジン基質特異性の相対発光活性値を比較すると、ＢＦＰ−ａｑの発光反応系において、ｈ−セレンテラジン、ｆ−セレンテラジン、ｃｐ−セレンテラジン及びｈｃｐ−セレンテラジンは有効な基質となった。さらに、イミダゾールの添加の有無によるその効果をみると、１５０ｍＭ イミダゾール添加でｈｃｐ−セレンテラジンを基質とした場合、イミダゾール無添加−セレンテラジンの発光活性の最大値にくらべ約４倍上がり、発光反応の初速は約２５倍速くなることが判明した。すなわち、セレンテラジンアナログとイミダゾール添加によるＢＦＰ−ａｑ発光増強が可能であることが示された。
【００７３】
＝＝イミダゾールの添加によるＢＦＰ−ａｑの発光反応速度の決定＝＝
１５０ｍＭ イミダゾールを含む５０ｍＭ Tris−HCl（ｐＨ８．０）２００μｌに、基質セレンテラジンの最終濃度を１．２〜１１．８μＭ範囲内で、各濃度のセレンテラジンを添加し２５℃で保温後、ＢＦＰ−ａｑを１．２μｇ添加し撹拌後、発光測定装置Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ−ＰＳＮ ＡＢ２２００（アトー社製）で６０秒間発光活性の測定を行った。発光反応３秒での発光活性を初速値として、ラインウェーバーバーグプロット法でＫｍ値を決定した。
【００７４】
その結果、１５０ｍＭ イミダゾールの添加系と無添加の反応系ではＫｍ値に顕著な変化はなく、イミダゾールを加えた系においてVmaxのみ約２倍になることが明らかとなった。すなわち、イミダゾール存在による発光活性増強は、基質とＢＦＰ−ａｑの結合に影響を与えるのではなく、セレンテラジンペルオキシドの生成過捏への促進あるいはセレンテラジンのカルバニオンの安定化に関与していると考えられる。
【００７５】
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】本発明にかかる実施例における、蛍光活性を有するルシフェラーゼ（ＢＦＰ−ａｑ）の各ｐＨにおける相対発光活性を示す図である。
【図２】本発明にかかる実施例において、蛍光活性を有するルシフェラーゼの活性増強を促す有機化合物の検索に用いた化合物の構造式を示した図である。
【図３】イミダゾールのプロトン化を示した図である。
【図４】イミダゾールによる蛍光活性を有するルシフェラーゼの活性増強のメカニズムを示した図である。
【図５】本発明にかかる実施例における、各濃度のイミダゾール添加による蛍光活性を有するルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼの相対発光活性を示した図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アポ蛋白質を有し、該アポ蛋白質の内部にセレンテラミドあるいはその類縁化合物が配位した、蛍光活性を有するルシフェラーゼの発光増強法であって、該蛍光活性を有するルシフェラーゼ溶液に対し、該ルシフェラーゼの発光基質であるセレンテラジンあるいはその類縁化合物、及び該セレンテラジンあるいはその類縁化合物におけるイミダゾピラジン骨格のピラジン環のＮＨプロトン引き抜き効果のある化合物を添加することを特徴とする発光増強法。
【請求項２】
前記プロトン引き抜き効果のある化合物がイミダゾールであることを特徴とする請求項１に記載の発光増強法。
【請求項３】
前記ルシフェラーゼが、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質とセレンテラミドまたはその類縁化合物およびカルシウムイオンまたはカルシウムイオンと置換可能な２価もしくは３価のイオンからなり、前記ルシフェラーゼ分子内における、該アポ蛋白質と該セレンテラミドまたはその類縁化合物の分子数比が１：１であり、該アポ蛋白質とカルシウムイオンまたはカルシウムイオンと置換可能な２価または３価のイオンの分子数比が１：１〜４である、ことを特徴とする請求項１または２に記載の発光増強法。
【請求項４】
前記アポ蛋白質が、アポイクオリン、アポクライチン、アポオベリン、アポマイトロコミン、アポミネオプシンおよびアポベルボインからなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の発光増強法。
【請求項５】
前記蛍光活性を有するルシフェラーゼが、配列番号１〜４で表されるアミノ酸配列を有するアポ蛋白質または配列番号１〜４で表されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された変異体アポ蛋白質を含有することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の発光増強法。
【請求項６】
前記セレンテラミドあるいはその類縁化合物が下記式（１）または式（２）で表されることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の発光増強法。
【化１】
【化２】
式中、
Ｒ1は、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアリールアルキル基、または脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基であり、 Ｒ2は、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアリールアルキル基、置換または非置換のアリールアルケニル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルケニル基、複素環式基であり、Ｒ3は、水素原子、置換または非置換のアルキル基であり、Ｘ1は、水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アルコキシル基またはアミノ基であり、Ｘ2は、水素原子または水酸基であり、Ｙは１〜４個の炭素原子を有する２価の炭化水素基である。
【請求項７】
前記式（１）または前記式（２）において、Ｒ1が非置換のアリール基、非置換のアリールアルキル基、水酸基またはハロゲン原子で置換されたアリールアルキル基、またはシクロヘキシル基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基であり、Ｒ2が非置換のアリール基、水酸基で置換されたアリール基、非置換のアリールアルキル基、水酸基で置換されたアリールアルキル基、非置換のアリールアルケニル基、非置換の直鎖または分枝鎖のアルキル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖のアルキル基、分枝鎖のアルケニル基、硫黄を含む複素環式基であり、Ｒ3は、水素原子、メチル基または２−ヒドロキシエチル基であり、Ｘ1は、水素原子、水酸基、フッ素原子、メトキシ基またはアミノ基であり、Ｙはメチレン基、エチレン基、プロピレン基またはビニレン基である請求項６に記載の発光増強法。
【請求項８】
前記式（１）または前記式（２）において、Ｒ1がフェニル基、ベンジル基、ｐ−ヒドロキシベンジル基、ｐ−フルオロベンジル基、ｐ−クロロベンジル基、ｐ−ブロモベンジル基、ｐ−ヨードベンジル基、３,４−ジフルオロベンジル基、ペンタフルオロベンジル基、フェニルエチル基、フェニルプロピル基、ナフチルメチル基、シクロヘキシルメチル基、メチル基、１−メチルプロピル基または２−メチルプロピル基であり、Ｒ2がフェニル基、ｐ−ヒドロキシフェニル基、ベンジル基、α−ヒドロキシベンジル基、フェニルエチル基、フェニルビニル基、シクロヘキシル基、シクロヘキシルメチル基、シクロヘキシルエチル基、メチル基、エチル基、プロピル基、２−メチルプロピル基、２−メチルプロぺニル基、アダマンチルメチル基、シクロペンチルメチル基またはチオフェン−２−イル基であることを特徴とする請求項７に記載の発光増強法。
【請求項９】
前記セレンテラジンあるいはその類縁化合物が下記式（３）または式（４）で表されることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の発光増強法。
【化３】
【化４】
式中、
Ｒ１は、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアリールアルキル基、または脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基であり、Ｒ２は、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアリールアルキル基、置換または非置換のアリールアルケニル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルケニル基、複素環式基であり、Ｒ３は、水素原子、置換または非置換のアルキル基であり、Ｘ１は、水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アルコキシル基またはアミノ基であり、Ｘ２は、水素原子または水酸基であり、Ｙは１〜４個の炭素原子を有する２価の炭化水素基である。
【請求項１０】
前記式（３）または前記式（４）において、Ｒ１が非置換のアリール基、非置換のアリールアルキル基、水酸基またはハロゲン原子で置換されたアリールアルキル基、またはシクロヘキシル基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基であり、Ｒ２が非置換のアリール基、水酸基で置換されたアリール基、非置換のアリールアルキル基、水酸基で置換されたアリールアルキル基、非置換のアリールアルケニル基、非置換の直鎖または分枝鎖のアルキル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖のアルキル基、分枝鎖のアルケニル基、硫黄を含む複素環式基であり、Ｒ３は、水素原子、メチル基または２−ヒドロキシエチル基であり、Ｘ１は、水素原子、水酸基、フッ素原子、メトキシ基またはアミノ基であり、Ｙはメチレン基、エチレン基、プロピレン基またはビニレン基であることを特徴とする請求項９に記載の発光増強法。
【請求項１１】
前記式（３）または前記式（４）において、Ｒ１がフェニル基、ベンジル基、p−ヒドロキシベンジル基、p−フルオロベンジル基、p−クロロベンジル基、p−ブロモベンジル基、P−ヨードベンジル基、３，４−ジフルオロベンジル基、ペンタフルオロベンジル基、フェニルエチル基、フェニルプロピル基、ナフチルメチル基、シクロヘキシルメチル基、メチル基、１−メチルプロピル基または２−メチルプロピル基であり、Ｒ２がフェニル基、p−ヒドロキシフェニル基、ベンジル基、α−ヒドロキシベンジル基、フェニルエチル基、フェニルビニル基、シクロヘキシル基、シクロヘキシルメチル基、シクロヘキシルエチル基、メチル基、エチル基、プロピル基、２−メチルプロピル基、２−メチルプロペニル基、アダマンチルメチル基、シクロペンチルメチル基またはチオフェン−２−イル基であることを特徴とする請求項１０に記載の発光増強法。
【請求項１２】
前記セレンテラジンの類縁化合物が、h−セレンテラジン、f−セレンテラジン、cp−セレンテラジン、hcp−セレンテラジンから選ばれる少なくとも１種である請求項１〜８のいずれかに記載の発光増強法。
【請求項１３】
セレンテラジンあるいはその類縁化合物を発光基質として、アポ蛋白質を有し、該アポ蛋白質の内部にセレンテラミドあるいはその類縁化合物が配位した、蛍光活性を有するルシフェラーゼが放射する発光を増強させる発光増強剤であって、該セレンテラジンあるいはその類縁化合物におけるイミダゾピラジン骨格のピラジン環のＮＨプロトン引き抜き効果のある化合物を含有することを特徴とする発光増強剤。
【請求項１４】
前記プロトン引き抜き効果のある化合物がイミダゾールであることを特徴とする請求項１３に記載の発光増強剤。
【請求項１５】
アポ蛋白質を有し、該アポ蛋白質の内部にセレンテラミドあるいはその類縁化合物が配位した、蛍光活性を有するルシフェラーゼ、発光基質であるセレンテラジンあるいはその類縁化合物、前記ルシフェラーゼの発光を増強させ得る発光増強剤を含むキットであって、前記発光増強剤は、前記セレンテラジンあるいはその類縁化合物におけるイミダゾピラジン骨格のピラジン環のＮＨプロトン引き抜き効果のある化合物であることを特徴とするキット。
【請求項１６】
前記プロトン引き抜き効果のある化合物がイミダゾールであることを特徴とする請求項１５に記載のキット。
【請求項１】
アポ蛋白質を有し、該アポ蛋白質の内部にセレンテラミドあるいはその類縁化合物が配位した、蛍光活性を有するルシフェラーゼの発光増強法であって、該蛍光活性を有するルシフェラーゼ溶液に対し、該ルシフェラーゼの発光基質であるセレンテラジンあるいはその類縁化合物、及び該セレンテラジンあるいはその類縁化合物におけるイミダゾピラジン骨格のピラジン環のＮＨプロトン引き抜き効果のある化合物を添加することを特徴とする発光増強法。
【請求項２】
前記プロトン引き抜き効果のある化合物がイミダゾールであることを特徴とする請求項１に記載の発光増強法。
【請求項３】
前記ルシフェラーゼが、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質とセレンテラミドまたはその類縁化合物およびカルシウムイオンまたはカルシウムイオンと置換可能な２価もしくは３価のイオンからなり、前記ルシフェラーゼ分子内における、該アポ蛋白質と該セレンテラミドまたはその類縁化合物の分子数比が１：１であり、該アポ蛋白質とカルシウムイオンまたはカルシウムイオンと置換可能な２価または３価のイオンの分子数比が１：１〜４である、ことを特徴とする請求項１または２に記載の発光増強法。
【請求項４】
前記アポ蛋白質が、アポイクオリン、アポクライチン、アポオベリン、アポマイトロコミン、アポミネオプシンおよびアポベルボインからなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の発光増強法。
【請求項５】
前記蛍光活性を有するルシフェラーゼが、配列番号１〜４で表されるアミノ酸配列を有するアポ蛋白質または配列番号１〜４で表されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された変異体アポ蛋白質を含有することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の発光増強法。
【請求項６】
前記セレンテラミドあるいはその類縁化合物が下記式（１）または式（２）で表されることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の発光増強法。
【化１】
【化２】
式中、
Ｒ1は、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアリールアルキル基、または脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基であり、 Ｒ2は、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアリールアルキル基、置換または非置換のアリールアルケニル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルケニル基、複素環式基であり、Ｒ3は、水素原子、置換または非置換のアルキル基であり、Ｘ1は、水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アルコキシル基またはアミノ基であり、Ｘ2は、水素原子または水酸基であり、Ｙは１〜４個の炭素原子を有する２価の炭化水素基である。
【請求項７】
前記式（１）または前記式（２）において、Ｒ1が非置換のアリール基、非置換のアリールアルキル基、水酸基またはハロゲン原子で置換されたアリールアルキル基、またはシクロヘキシル基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基であり、Ｒ2が非置換のアリール基、水酸基で置換されたアリール基、非置換のアリールアルキル基、水酸基で置換されたアリールアルキル基、非置換のアリールアルケニル基、非置換の直鎖または分枝鎖のアルキル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖のアルキル基、分枝鎖のアルケニル基、硫黄を含む複素環式基であり、Ｒ3は、水素原子、メチル基または２−ヒドロキシエチル基であり、Ｘ1は、水素原子、水酸基、フッ素原子、メトキシ基またはアミノ基であり、Ｙはメチレン基、エチレン基、プロピレン基またはビニレン基である請求項６に記載の発光増強法。
【請求項８】
前記式（１）または前記式（２）において、Ｒ1がフェニル基、ベンジル基、ｐ−ヒドロキシベンジル基、ｐ−フルオロベンジル基、ｐ−クロロベンジル基、ｐ−ブロモベンジル基、ｐ−ヨードベンジル基、３,４−ジフルオロベンジル基、ペンタフルオロベンジル基、フェニルエチル基、フェニルプロピル基、ナフチルメチル基、シクロヘキシルメチル基、メチル基、１−メチルプロピル基または２−メチルプロピル基であり、Ｒ2がフェニル基、ｐ−ヒドロキシフェニル基、ベンジル基、α−ヒドロキシベンジル基、フェニルエチル基、フェニルビニル基、シクロヘキシル基、シクロヘキシルメチル基、シクロヘキシルエチル基、メチル基、エチル基、プロピル基、２−メチルプロピル基、２−メチルプロぺニル基、アダマンチルメチル基、シクロペンチルメチル基またはチオフェン−２−イル基であることを特徴とする請求項７に記載の発光増強法。
【請求項９】
前記セレンテラジンあるいはその類縁化合物が下記式（３）または式（４）で表されることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の発光増強法。
【化３】
【化４】
式中、
Ｒ１は、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアリールアルキル基、または脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基であり、Ｒ２は、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアリールアルキル基、置換または非置換のアリールアルケニル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルケニル基、複素環式基であり、Ｒ３は、水素原子、置換または非置換のアルキル基であり、Ｘ１は、水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アルコキシル基またはアミノ基であり、Ｘ２は、水素原子または水酸基であり、Ｙは１〜４個の炭素原子を有する２価の炭化水素基である。
【請求項１０】
前記式（３）または前記式（４）において、Ｒ１が非置換のアリール基、非置換のアリールアルキル基、水酸基またはハロゲン原子で置換されたアリールアルキル基、またはシクロヘキシル基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基であり、Ｒ２が非置換のアリール基、水酸基で置換されたアリール基、非置換のアリールアルキル基、水酸基で置換されたアリールアルキル基、非置換のアリールアルケニル基、非置換の直鎖または分枝鎖のアルキル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖のアルキル基、分枝鎖のアルケニル基、硫黄を含む複素環式基であり、Ｒ３は、水素原子、メチル基または２−ヒドロキシエチル基であり、Ｘ１は、水素原子、水酸基、フッ素原子、メトキシ基またはアミノ基であり、Ｙはメチレン基、エチレン基、プロピレン基またはビニレン基であることを特徴とする請求項９に記載の発光増強法。
【請求項１１】
前記式（３）または前記式（４）において、Ｒ１がフェニル基、ベンジル基、p−ヒドロキシベンジル基、p−フルオロベンジル基、p−クロロベンジル基、p−ブロモベンジル基、P−ヨードベンジル基、３，４−ジフルオロベンジル基、ペンタフルオロベンジル基、フェニルエチル基、フェニルプロピル基、ナフチルメチル基、シクロヘキシルメチル基、メチル基、１−メチルプロピル基または２−メチルプロピル基であり、Ｒ２がフェニル基、p−ヒドロキシフェニル基、ベンジル基、α−ヒドロキシベンジル基、フェニルエチル基、フェニルビニル基、シクロヘキシル基、シクロヘキシルメチル基、シクロヘキシルエチル基、メチル基、エチル基、プロピル基、２−メチルプロピル基、２−メチルプロペニル基、アダマンチルメチル基、シクロペンチルメチル基またはチオフェン−２−イル基であることを特徴とする請求項１０に記載の発光増強法。
【請求項１２】
前記セレンテラジンの類縁化合物が、h−セレンテラジン、f−セレンテラジン、cp−セレンテラジン、hcp−セレンテラジンから選ばれる少なくとも１種である請求項１〜８のいずれかに記載の発光増強法。
【請求項１３】
セレンテラジンあるいはその類縁化合物を発光基質として、アポ蛋白質を有し、該アポ蛋白質の内部にセレンテラミドあるいはその類縁化合物が配位した、蛍光活性を有するルシフェラーゼが放射する発光を増強させる発光増強剤であって、該セレンテラジンあるいはその類縁化合物におけるイミダゾピラジン骨格のピラジン環のＮＨプロトン引き抜き効果のある化合物を含有することを特徴とする発光増強剤。
【請求項１４】
前記プロトン引き抜き効果のある化合物がイミダゾールであることを特徴とする請求項１３に記載の発光増強剤。
【請求項１５】
アポ蛋白質を有し、該アポ蛋白質の内部にセレンテラミドあるいはその類縁化合物が配位した、蛍光活性を有するルシフェラーゼ、発光基質であるセレンテラジンあるいはその類縁化合物、前記ルシフェラーゼの発光を増強させ得る発光増強剤を含むキットであって、前記発光増強剤は、前記セレンテラジンあるいはその類縁化合物におけるイミダゾピラジン骨格のピラジン環のＮＨプロトン引き抜き効果のある化合物であることを特徴とするキット。
【請求項１６】
前記プロトン引き抜き効果のある化合物がイミダゾールであることを特徴とする請求項１５に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００６−２７１３２７（Ｐ２００６−２７１３２７Ａ）
【公開日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−９９２４４（Ｐ２００５−９９２４４）
【出願日】平成１７年３月３０日（２００５．３．３０）
【出願人】（０００００２０７１）チッソ株式会社 (658)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月３０日（２００５．３．３０）
【出願人】（０００００２０７１）チッソ株式会社 (658)
【Ｆターム（参考）】
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