蛍光測定法と、蛍光測定のための測定用チップ及びその製造方法
【課題】表面増強効果の増強率を向上させると共にＳ／Ｎ比を改善することができる、蛍光測定のための測定用チップ等を提供することを課題とする。
【解決手段】蛍光測定のための測定用チップ１であって、基板２と、この基板２の少なくとも一側面に配置した多孔質膜４と、この多孔質膜４における基板４と反対側の面に配置した、少なくとも銀を含有する貴金属層５とを備える。この多孔質膜４は、例えば、複数の微粒子４ａから形成することができる。貴金属層５には、測定対象物質に特異的に結合する結合物質を設けることができる。
【解決手段】蛍光測定のための測定用チップ１であって、基板２と、この基板２の少なくとも一側面に配置した多孔質膜４と、この多孔質膜４における基板４と反対側の面に配置した、少なくとも銀を含有する貴金属層５とを備える。この多孔質膜４は、例えば、複数の微粒子４ａから形成することができる。貴金属層５には、測定対象物質に特異的に結合する結合物質を設けることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面増強効果にて蛍光強度を増強させた蛍光測定法と、この蛍光測定法に使用するための測定用チップ及びその製造方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、試料中に含まれるＤＮＡや蛋白質等の測定対象物質を定量等する手法の一つとして、蛍光測定法が知られている。この蛍光測定法は、抗原抗体反応を利用した免疫学的検出法の一種であり、測定用チップを用いて行われる。この測定用チップは、ガラス基板に形成された多数の微小な反応領域の各々に抗体を配置して形成されており、この測定用チップの表面に試料を加えると、各反応領域に配置した抗体が試料中の測定対象物質を補足する。次いで、この測定用チップの表面に蛍光色素で標識した抗体を加えると、この抗体が、測定用チップの表面に補足されている測定対象物質に結合して、一対の抗体の間に測定対象物質を結合させたサンドイッチ結合を構成する。その後、測定用チップを洗浄して未結合の試料や抗体を洗い流し、測定用チップにレーザ光などの励起光を照射することにより、この励起光の励起によって蛍光色素から蛍光を発生させる。そして、この蛍光を分光素子にて励起光と分離し、この分離された蛍光の信号強度（蛍光信号強度）を蛍光スキャナーや蛍光顕微鏡にて測定することで、試料に含まれる測定対象物質を定量等することができる。
【０００３】
このような蛍光測定法において、凹凸構造を有する貴金属製の基板上では、蛍光色素の蛍光強度が増幅するという現象（表面増強効果）が知られている。この表面増強効果の原理についてより詳細に説明すると、光の波長よりもずっと小さい直径の粒子に光を当てた場合、散乱光が生じると共に、その粒子の周辺で局在した電磁場（近接場光）が発生する。これら散乱光及び近接場光はいずれも、入射光が球に当たったときに、球内部に誘起される電気双極子が源となって発生する電磁場であるが、散乱光は遠方にまで伝わるのに対し、近接場光のエネルギーは球面状に沿うようにして集中し、球から離れた位置では観測することはできない。しかも、近接場光が分布しているのは、粒子からその粒子の直径程度の距離である。貴金属（銀）粒子近傍で発生した近接場光により励起光が増幅され、光を吸収する蛍光分子数が増加すること、更に励起状態から基底状態への戻りが速く、励起され易くなることから（励起サイクル増加）、蛍光強度が増大すると考えられている。このような原理に基づく表面増強効果によれば、測定用チップを形成するガラス基板の表面に貴金属製の微細な凹凸を形成し、この測定用チップを用いて蛍光測定法を実施することで、一層高感度な測定を行うことが可能になり、例えば蛍光色素が比較的少数の場合であっても、試料に含まれる測定対象物質を定量等することが可能になる。
【０００４】
このような表面増強効果を得るために測定用チップに形成される凹凸構造は、理想的には、凹凸構造の密度が均一であること、凹凸の均一性が高いこと、同一の凹凸構造の再現性が高いこと、凹凸構造の製造が容易であること、及び、凹凸構造のサイズが４０〜１００ｎｍのナノサイズであることが好ましい。そして、このような各種条件を満たす凹凸構造を形成する方法として、従来から、ガラス基板の表面に貴金属製（例えば銀製）のナノサイズの微粒子を配置する方法が提案されている。
【０００５】
例えば、非特許文献１及び非特許文献２には、銀島状フィルム（ＳＩＦ：Ｓｉｌｖｅｒ ｉｓｌａｎｄ ｆｉｌｍ）をガラス基板上に配置する点が開示されている。この銀島状フィルムは、例えば、銀イオンを溶液中で還元させることによって、ガラス基板上に配置される。すなわち、この技術では、ナノサイズの微粒子を銀にて形成し、この銀製の微粒子を、相互に間隔を隔てた状態（相互に接触しない状態）で、ガラス基板上に配置している。
【０００６】
また、特許文献１には、表面増強効果を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ：Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）に適用した技術が開示されている。ここで、表面プラズモン共鳴とは、特定の波長の光を、入射角度を変えながら金属膜の表面に照射すると、特定の入射角度によって光子のエネルギーが吸収されて反射されなくなる現象である。この入射角度は共鳴角度と呼ばれ、この共鳴角度は金属膜の表面密度（質量）に応じて変ることから、この共鳴角度の変化を測定することで、金属膜の表面密度を特定することができる。この表面プラズモン共鳴の原理についてより詳細に説明すると、金属薄の裏面の照射光は全反射すると同時に金属膜側に微弱なエネルギー波（エバネッセント波）を生じる。また誘電体に接触した金属表面では粗密波（表面プラズモン）が発生し、両者の波数が一致したときに共鳴して反射光が減衰する（表面プラズモン共鳴現象）。誘電率（屈折率の２乗）はエバネッセント波に影響し、従って金属表面で引き起こされる物質間の相互作用は、誘電率に差異を生じるため、これが表面プラズモンに影響し共鳴の変化として捉えることができる。この特許文献１では、粒径５ｎｍから１００μｍの高分子の微粒子を、基板上に固相化する点が開示されている。
【０００７】
あるいは、非特許文献３には、表面増強ラマン分光（ＳＥＲＳ：Ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）に関する技術ではあるが、基板上に固相化された微粒子に銀を蒸着することにより、銀粒子を作製する点が開示されている。
【０００８】
【非特許文献１】イブジェニア ジー マットビーバ 等（Ｅｖｇｅｎｉａ Ｇ． Ｍａｔｖｅｅｖａ， ｅｔ ａｌ．）著、「金属粒子増強蛍光に基づくミオグロビンの免疫学的検定（Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｅｔａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）」、米国、３０２号、免疫法ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ）、２００５年６月６日、Ｐ．２６−３５
【非特許文献２】ジョセフ アール ラコウィッチ 等（Ｊｏｓｅｐｈ Ｒ． Ｌａｋｏｗｉｃｚ， ｅｔ ａｌ．）著、「蛍光強度、寿命、及び、共鳴エネルギー移動における銀島状フィルムの影響 （Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｓｉｌｖｅｒ Ｉｓｌａｎｄ Ｆｉｌｍｓ ｏｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ， Ｌｉｆｅｔｉｍｅｓ， ａｎｄ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）」、米国、３０１号、分析バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２００２年１月１５日、Ｐ．２６１−２７７
【非特許文献３】チュアン ボ−ディー（Ｔｕａｎ Ｖｏ−Ｄｉｎｈ）著、「金属ナノ構造を用いた表面増強ラマン分光（Ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｕｓｉｎｇ ｍｅｔａｌｌｉｃ ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）」、米国、１７号、分析化学のトレンド（ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９９８年８月９日、Ｐ．５５７−５８２
【特許文献１】特開２０００−５５９２０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、これら特許文献１および非特許文献１〜３に記載されたような、基板上に微粒子のみを相互に非接触状に配置する従来の測定方法では、１０倍程度の増強率しか得られないことが分っており、より高感度の表面増強方法が要望されていた。また、このような従来の表面増強効果では、明るい蛍光色素（量子収率が高い蛍光色素）に対しては、表面増強効果が確認されておらず、逆に、金属のクエンチング効果により蛍光強度が低下していた。このことは、実用的観点から重要な明るい蛍光色素を有効に使用することが困難になることを意味しており、明るい蛍光色素を用いた場合であっても高感度に増強できる方法が要望されていた。さらには、凹凸構造によって基板の自家蛍光が強くなり、この自家蛍光が蛍光色素からの蛍光に対するノイズになるため、蛍光強度測定におけるＳ／Ｎ比（Ｓｉｇｎａｌ／Ｎｏｉｓｅ Ｒａｔｉｏ）が低いという問題があった。
【００１０】
特に、特許文献１に記載された表面プラズモン共鳴や、非特許文献３に記載された表面増強ラマン分光は、蛍光測定とは異なる原理によるものであり、これら表面プラズモン共鳴や表面増強ラマン分光に関する従来技術を蛍光測定に直ちに適用することはできず、あるいは、適用してもその特性が全く異なるものになる。具体的には、表面プラズモン共鳴は、蛍光色素の如き標識を用いない技術であり、少なくともこの点において、上述した蛍光測定とは異なるものである。また、表面増強ラマン分光は、散乱現象であって蛍光現象ではなく、少なくともこの点において、上述した蛍光測定とは異なるものである。従って、これら表面プラズモン共鳴や表面増強ラマン分光において優れた特性を有する測定方法や測定用チップをそのまま蛍光測定に用いても、同様の優れた特性を得ることができるとの単純な予測は全く成り立たず、蛍光測定において所望の特性を得ることができる測定方法や測定用チップを新規に模索する必要がある。例えば、ラマン分光では今までに５桁以上の増強がルーチン的に観察されているが、これに対して、蛍光では10倍程度の増強しか観察されていなかった。
【００１１】
このような問題を解決するため、本発明は、表面増強効果の増強率を向上させると共にＳ／Ｎ比を改善すること等ができる、蛍光測定法と、この蛍光測定法に使用するための測定用チップ及びその製造方法とを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上述した課題を解決し、目的を達成するために、請求項１に記載の測定用チップは、基板と、前記基板の少なくとも一側面に配置した多孔質膜と、前記多孔質膜における前記基板と反対側の面に配置した、少なくとも銀を含有する貴金属層と、を備えたことを特徴とする。
【００１３】
また、請求項１７に記載の測定用チップの製造方法は、基板を準備する工程と、前記基板の少なくとも一側面に多孔質膜を配置する工程と、前記多孔質膜における前記基板と反対側の面に、少なくとも銀を含有する貴金属層を配置する工程と、を含んだことを特徴とする。
【００１４】
また、請求項２３に記載の蛍光測定法は、基板に多孔質膜を配置した後、前記多孔質膜における前記基板と反対側の面に、少なくとも銀を含有する貴金属層を配置することにより、測定用チップを製造する工程と、前記測定用チップの前記貴金属層に、測定対象物質に特異的に結合する結合物質を配置する工程と、前記測定用チップの前記結合物質に測定対象物質を結合させる工程と、前記測定用チップの前記結合物質に結合させた測定対象物質に、蛍光色素で標識した結合物質を結合させる工程と、前記蛍光色素を観察する工程と、を含むことを特徴とする。
【００１５】
また、請求項２４に記載の蛍光測定法は、基板に多孔質膜を配置した後、前記多孔質膜における前記基板と反対側の面に、少なくとも銀を含有する貴金属層を配置することにより、測定用チップを製造する工程と、前記測定用チップの前記貴金属層に、測定対象物質を配置する工程と、前記測定用チップの前記測定対象物質に特異的に結合する結合物質であって、蛍光色素で標識した結合物質を、前記測定対象物質に結合させる工程と、前記蛍光色素を観察する工程と、を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
請求項１に記載の測定用チップによれば、表面増強効果を増大させることにより蛍光信号強度を向上させることができ、従来の増強率より一桁以上高い数十倍の蛍光信号強度を得ることができる。また、量子収率の高い蛍光物質（明るい蛍光物質）においても、従来より数十倍以上高い蛍光信号強度を得ることができるので、明るい蛍光物質の実用性を向上させることができる。さらに、弱励起光でも高い蛍光信号の増強効果を発揮することから、自家蛍光を抑制でき、蛍光信号のＳ／Ｎ比を向上させることができる。さらにまた、当該測定用チップは、基板上からの蛍光信号を検出する分析方法（プレートアッセイ、バイオチップ、ＤＮＡチップ等、ナノセンサー）のほぼ全てに適用でき、各分析方法における感度向上を図ることができる。
【００１７】
請求項１７に記載の測定用チップの製造方法によれば、当該製造方法にて製造した測定用チップを用いることにより、上記請求項１と同様の効果を得ることができる。
【００１８】
また、請求項２３に記載の蛍光測定法は、当該蛍光測定法を実行することにより、上記請求項１と同様の効果を得ることができる。
【００１９】
また、請求項２４に記載の蛍光測定法は、測定対象物が不明なサンプル（細胞を含み得る）を先に測定用チップへ結合又は接近させておき、このサンプルに含まれる測定対象物を、数種類の蛍光標識した結合物質（例えば抗体）で検出する場合においても、上記請求項２３と同様の効果を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下に添付図面を参照して、本発明の各実施の形態に係る蛍光測定法を詳細に説明する。まず、〔Ｉ〕各実施の形態に共通の基本的概念を説明した後、〔II〕各実施の形態の具体的内容についてそれぞれ説明し、〔III〕最後に、各実施の形態に対する変形例について説明する。ただし、各実施の形態により本発明が限定されるものではない。
【００２１】
〔Ｉ〕各実施の形態に共通の基本的概念
まず、各実施の形態に共通の基本的概念について説明する。各実施の形態は蛍光測定法に関するものであり、この蛍光測定法は、特記する点を除いて、従来と同様の手順及び装置にて行われる。ここで、本実施の形態の特徴の一つは、測定用チップの構造やその製造方法にある。すなわち、従来は、表面増強効果を得るためにガラス基板の表面にナノサイズの微粒子を配置する際、単に、貴金属（例えば銀）にて形成した微粒子をガラス基板の表面に配置していた。また、従来は、これら微粒子同士の相互間に間隔を設けなければ感度の高いラマン計測ができないと考えられていたこと、及び、微粒子同士を密に配置することが技術的に困難であったこと等の理由により、微粒子同士の相互間にある程度の間隔を設けていた。しかしながら従来は、このように間隔を設けた場合であっても、上述のように１０倍程度の増強率しか得られない等の様々な問題が生じていた。
【００２２】
これに対して、本実施の形態では、基板に銀製の微粒子を非接触状に配置するのではなく、基板に多孔質膜を配置することによって凹凸構造を形成し、さらに、この凹凸構造の表面に貴金属膜を配置する多層的凹凸構造を採用している。このような新規な構造によれば、実質的には、微粒子同士の相互間に間隔を設けることなく、大部分の微粒子同士を相互にわずかに接触させたのと類似の凹凸構成を形成でき、従来に比べて種々の利点を享受できると共に、凹凸構成を簡易かつ確実に形成することができる。
【００２３】
さらに、本実施の形態の他の特徴の一つは、多孔質膜の具体的構造（材質、膜厚、及び、空孔率等）や、貴金属膜の具体的構造（厚み等）について工夫することで、一層優れた効果を奏することが可能になっている。この点については後述する。
【００２４】
〔II〕各実施の形態の具体的内容
次に、各実施の形態の具体的内容について説明する。
【００２５】
〔実施の形態１〕
最初に、実施の形態１について説明する。この形態は、基板に配置した多孔質膜に、銀を含有する貴金属層をさらに配置して測定用チップを構成した形態である。以下では、実施の形態１に係る測定用チップに関する、構成、製造方法、使用方法、及び、効果について、順次説明する。
【００２６】
（測定用チップの構成）
図１は実施の形態１に係る測定用チップの部分拡大斜視図、図２は実施の形態１に係る測定用チップの部分拡大側面図である。この測定用チップ１は、概略的に、基板２の一側面に、ベース層３、多孔質膜４、及び、貴金属層５を順次配置して構成されている。
【００２７】
基板２は、測定用チップ１の基本構造体であり、例えばガラス、プラスチック、あるいは、金属にて、平面形状を略長方形状とする平板状に形成される。
【００２８】
ベース層３は、基板２に多孔質膜４を配置するためのもので、例えば蒸着やスパッタリングの如き方法にて、基板２の側面に固着されている。このベース層３の材質及び厚みは基本的には任意であるが、後述する微粒子４ａを広範囲に高密度で吸着させるためには、例えば金やシリコンにて薄膜状に形成することが好ましく、その膜厚は、例えば約１０〜５０ｎｍとし、より好ましくは約２０ｎｍとする。なお、このような高密度の吸着作用を要しない場合には、このベース層３を省略し、基板２の側面に多孔質膜４を直接的に配置することもでき、例えば基板２を金属やシリコンにて形成した場合には、ベース層３を省略して、この基板２の一側面に多孔質膜４を直接形成してもよい。
【００２９】
多孔質膜４は、表面増強効果を得るための条件の一つである凹凸構造を形成するための膜状体（例えば薄膜体）である。ここで、多孔質膜４の形成方法としては、少なくとも２つの方法を挙げることができる。第１の形成方法は、平滑状の膜体を形成した後、この膜体に多数の孔を穿設する方法である。第２の形成方法は、多数の微粒子４ａを形成した後、これら多数の微粒子４ａを、基板２又はベース層３に高密度で配置する方法である。以下、本実施の形態では、第２の形成方法を採用した場合について説明する。
【００３０】
このように多孔質膜４を微粒子４ａから形成する場合において、この微粒子４ａの材質は任意であるが、例えば、ポリスチレン、酸化シリコン（ＳｉＯ２）、あるいは、天然ゴム又は合成ゴム（当業者間で一般的にラテックスと呼ばれているもの等）を用いることができる。ただし、この他にも、ベース層３に含まれる金またはシリコン上に微粒子４ａが吸着され得る限りにおいて、任意の材質にて微粒子４ａを構成することができる。
【００３１】
貴金属層５は、表面増強効果を改善するためのものである。従来、ＳＰＲでは銀の酸化による悪影響を回避するため金を用いていたが、本実施の形態では貴金属層５を銀にて形成することで、高い蛍光増強効果を得ている。図３は、貴金属層５の材質の違いによる蛍光信号強度の変化を示すグラフであり、縦軸は蛍光信号強度、横軸は蛍光タンパク質（ＲＰＥ：Ｒ−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）の濃度、グラフ中の各プロットは、基板（基板２に多孔質膜を形成せずに、直接的に蛍光物質を吸着させた場合）、金（貴金属層５を金で形成した場合）、銀（貴金属層５を銀で形成した場合）、をそれぞれ示す。ここでは、多孔質膜４を粒径１００ｎｍの微粒子４ａにて形成し、貴金属層５を１０ｎｍの厚みにて形成した。この図３から明らかなように、貴金属層５を銀で形成した場合には、他の場合に比べて蛍光信号強度が飛躍的に増大しており、従って、貴金属層５を銀にて形成することが表面増強効果の改善に有用であることが分る。以下では、貴金属層５を銀にて形成した場合について説明する。
【００３２】
次に、このような測定用チップ１の構成について、より詳細に説明する。最初に、貴金属層５の膜厚の好適な数値範囲について説明する。図４〜８の各々は、蛍光信号強度と貴金属層５の膜厚との相互関係を示すグラフである。これら図４〜８は、順次、多孔質膜４を形成する微粒子４ａの粒径を、５０、１００、２００、３００、５００ｎｍとした場合を示しており、各図において、縦軸は蛍光信号強度、横軸は貴金属層５の膜厚、グラフ中の各プロットは、蛍光色素の濃度を０、８０、４００、２，０００ｎｇ／ｍｌとした場合を示す。例えば、図４は、微粒子４ａの粒径が５０ｎｍの場合を示しており、蛍光色素の濃度が２，０００ｎｇ／ｍｌの場合には、貴金属層５の膜厚が１０ｎｍである場合において、蛍光信号強度が約６０，０００である。なお、ここで示す微粒子４ａの粒径５０、１００、２００、３００、５００ｎｍは概算値であり、当該実験において実際に使用した微粒子４ａの正確な粒径（使用した各粒子の粒径を正規分布で表したときにおける最も多い粒径）は、それぞれ、５０ｎｍ、１０８ｎｍ、２０２ｎｍ、３５６ｎｍである。なお、全ての粒子の粒径を正確に調整することは困難であり、多少の誤差は生じ得る。
【００３３】
ここで、これら図４〜８に示すように、微粒子４ａの粒径が５０〜５００ｎｍのいずれの場合においても、蛍光信号強度は、貴金属層５の膜厚が約５〜２０ｎｍの場合に高い値を示しており、特に、貴金属層５の膜厚が約１０〜１５ｎｍの場合に顕著に高い値（ピーク値）を示している。従って、貴金属層５の膜厚は、少なくとも約５〜２０ｎｍとすることが好ましく、さらには約１０〜１５ｎｍとすることが一層好ましい。
【００３４】
次に、多孔質膜４の膜厚（ここでは、多孔質膜４を形成する微粒子４ａの粒径）の好適な数値範囲について説明する。先の図４〜７に示すように、微粒子４ａの粒径が５０〜３００ｎｍの場合には、貴金属層５の膜厚が１０〜２０ｎｍの範囲で２，０００以上の蛍光信号強度を得ることができているが、図８に示すように、微粒子４ａの粒径が５００ｎｍの場合には、同範囲で２，０００以下の蛍光信号強度しか得ることができない。これらのことから、微粒子４ａの粒径は、少なくとも約３００ｎｍ（正確には３５６ｎｍ、すなわち約３６０ｎｍ）以下とすることが望ましい。さらに、図４〜６に示すように、微粒子４ａの粒径が５０〜２００ｎｍの場合には、貴金属層５の膜厚の全範囲で１０，０００以上の蛍光信号強度を得ることができているが、図７に示すように、微粒子４ａの粒径が３００ｎｍの場合には、３，０００以下の蛍光信号強度しか得ることができない。これらのことから、微粒子４ａの粒径は、約５０〜２００ｎｍとすることがより好ましい。さらには、図４、５に示す微粒子４ａの粒径が５０〜１００ｎｍの場合と、図６に示す微粒子４ａの粒径が２００ｎｍの場合とでは、貴金属層５の膜厚の各範囲において約２倍又はそれ以上の蛍光信号強度の差異がある。これらのことから、微粒子４ａの粒径は、約５０〜１００ｎｍとすることが一層好ましい。なお、微粒子４ａの粒径を約２０ｎｍ〜５０ｎｍとした場合においても、同様の好適な効果を奏する可能性があるが、微粒子４ａの購入の容易性や粒径の均一性の面を考慮すると、５０〜１００ｎｍの粒径の微粒子４ａを用いることが好ましい。
【００３５】
次に、多孔質膜４の空孔率の好適な数値範囲について説明する。多孔質膜４を形成する微粒子４ａは、近接場光によって励起されるため、微粒子４ａ同士がある程度は相互に近接している方が好ましい。このため、従来の共鳴プラズモンでは、金属と生体分子が表面に近いほど効果が大きい。しかしながら、微粒子４ａ同士が近すぎる場合には、蛍光色素から金属表面へのエネルギーのトランスファーが生じて、蛍光信号強度が低下する。これらのことを考慮し、本願発明者は、近接場光による励起効果が高くかつエネルギーのトランスファーが小さい空孔率を、以下のように見出した（なお、空孔率は、例えば、面積０．０１μｍ２の領域に、直径１００ｎｍの微粒子を１個配置した場合には、空孔率＝（０．１×０．１−０．０５×０．０５×円周率）／０．０１×１００＝２１．５０％のように算定される）。
【００３６】
図９は、蛍光信号強度と蛍光色素の濃度との関係を様々な空孔率について示したものであり、（ａ）は実験結果を示す表、（ｂ）はグラフである。この図９（ｂ）において、縦軸は蛍光信号強度、横軸はＲＰＥの濃度、グラフ中の各プロットは、基板（基板２に多孔質膜を形成せずに、直接的に蛍光物質を吸着させた場合）、Ａ（空孔率＝６３．２％）、Ｂ（空孔率＝８１．１％）、Ｃ（空孔率＝９２．４％）、Ｄ（空孔率＝９６．５％）とした場合を示す。このグラフから明らかなように、蛍光信号強度は、高い順に、空孔率＝８１．１、６３．２、９２．４、９６．５、０％の場合である。このことから、空孔率は、約６０〜９７％であることが好ましく、さらに約８１．１％近辺（例えば７５〜８５％）とすることが一層好ましい。
【００３７】
（測定用チップ１の製造方法）
上記のように構成された測定用チップ１は、例えば、以下のような方法で製造することができる。まず、微粒子溶液に、ＥＤＣ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ］ ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）やＮａＣｌなどの塩を添加（０．５Ｍ以下、好ましくは１００ｍＭ以下）し、混合溶液を作製する。例えば、微粒子溶液１溶に対してＥＤＣ溶液２溶を加える。この混合溶液を、基板２の表面へ塗布する。この際、基板２をガラスやプラスチックにて形成した場合には、この基板２にベース層３を蒸着またはスパッタリングにより形成して、このベース層３の表面へ混合溶液を塗布する。あるいは、基板２をシリコン等の金属にて形成した場合には、ベース層３を形成することなく、この基板２の表面へ混合溶液を塗布する。そして、この基板２を数秒以上放置した後に蒸留水で洗浄して乾燥させ、この基板２の表面に単層高密度に微粒子４ａを吸着させる。その後、この微粒子４ａの上面に、蒸着またはスパッタリングにより貴金属層５を形成することで、測定用チップ１が完成する。このように基板２の表面に単層高密度に微粒子４ａを吸着させる具体的方法は任意であるが、例えば、下記文献に記載の方法で吸着させることができる。
エイチ タケイ（H．Ｔａｋｅｉ）著、「ナノサイズ金属球体を形成するためのテンプレートとしての表面吸収ポリスチレン球体：ナノサイズ金球体の光学特性（Sｕｒｆａｃｅ−ａｂｓｏｒｂｅｄ ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ ｓｐｈｅｒｅｓ ａｓ ａ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｆｏｒ ｎａｎｏｓｉｚｅｄ ｍｅｔａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ：Oｐｔｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｎａｎｏｓｉｚｅｄ Ａｕ ｐａｒｔｉｃｌｅ」、米国、Ｂ １７（５）号、真空科学技術（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖａｃｕｕｍ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１９９９年９月／１０月、Ｐ１９０６−１９１１
【００３８】
ここで、上述した好適な空孔率を有する多孔質膜４を形成するための具体的方法は任意であるが、例えば、上記EDC濃度を変えることによって、多孔質膜４を作製することができる。すなわち、微粒子４ａが、金またはシリコンを含むベース層３には結合するが、他の微粒子４ａには結合しないように、EDC濃度を決定する。一方、多孔質膜４を、平滑状の膜体に多数の孔を穿設することで形成する場合には、例えば、公知の方法で形成した膜体に、ナノインプリンティング（ホットエンボス法）により多数の孔をあけることができる。あるいは、膜体上に、孔を設けた下記溶媒耐性の膜を設置し、その上からHNO3(dil or conc)、 HClO4(dil or conc)、H2SO4(conc)、HCl(conc)+HNO3(conc)等の溶媒で処理することによって、露出している銀膜体を溶解して多数の孔を設けてもよい。
【００３９】
（測定用チップ１の使用方法）
このように製造された測定用チップ１は、従来と同様の方法により、蛍光測定法に使用される。図１０は、本実施の形態１に係る測定用チップ１を用いた蛍光測定法を概念的に示す図であり、（ａ）は測定用チップ１に抗体を配置した状態、（ｂ）はサンドイッチ結合を構成した状態を示す。まず、図１０（ａ）に示すように、測定用チップ１の貴金属層５に抗体１０を配置する。そして、図１０（ｂ）に示すように、測定用チップ１の表面に試料を加えることにより、この試料に含まれる測定対象物質１１を抗体１０によって補足させ、さらに蛍光色素１２で標識した抗体１３を加えることにより、抗体１０、１３の間に測定対象物質１１を結合させたサンドイッチ結合を構成する。その後、従来と同様に、未結合の試料や抗体１３の洗浄後、励起光を照射して蛍光色素１２から蛍光を発生させ、この蛍光の蛍光強度を蛍光スキャナーや蛍光顕微鏡等（好ましくは共焦点スキャナーや共焦点顕微鏡等のニアフィールドの測定が可能なもの）を用いて測定することで、測定対象物質１１を定量等できる。この測定用チップ１では、励起波長による特異性は認められず、また、あらゆる蛍光タンパク質や蛍光物質の利用が可能である。なお、本明細書中において「観察する」とは、共焦点顕微鏡等で観察する意味の他、蛍光強度を測定するという意味を含む。
【００４０】
ここでは、抗体１３を用いているが、測定対象物質に特異的に結合し得る物質であればよく、例えば、抗体１３や抗原以外に、レセプター、DNA、又は、ペプチド等を用いることができる。また、特許請求の範囲における、「測定対象物質に特異的に結合する結合物質」と「蛍光色素で標識した結合物質」とは、同一の結合物質や異なった結合物質のいずれでもよく、あるいは、同一のクラスやサブクラスであってもよい。また、「蛍光色素で標識した結合物質」としては、１種類の物質でもよく、あるいは、複数種類の物質を用いてもよい。さらに、結合物質として抗体を用いる場合には、互いに異なる抗原決定基で結合するものが好ましい。なお、このように用いられる抗原および抗体は、従来公知の方法で得ることができる。
【００４１】
また、本実施の形態で測定され得る「測定対象物」としては、例えば、抗原または抗体が挙げられる。更に具体的には、タンパク質、少なくとも４個のアミノ酸からなるペプチド、ハプテン、核酸、ヌクレオチド、ホルモン、オリゴ糖、多糖、天然または合成薬剤、これらの誘導体または複合体、若しくはこれらに対する抗体等を挙げることができる。さらに、細胞等をチップ上に配置し、細胞膜上にあるタンパク質（レセプター等）を測定対象物としてもよい。ここで、測定対象物質は、測定対象物質に別々に結合できるよう、二種類以上の抗原決定基を持つものが好ましい。
【００４２】
また、蛍光タンパク質（ＲＰＥ等）や蛍光物質（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標：モルキュラープローブス社製）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、フルオレセイン、ローダミン、ウンベリフェロン、フィコエリスリン等）を、測定用チップ１に、直接的に作用させることもできる。この場合は、測定用チップ１と対照基板（プラスチック製やガラス製のスライド、例えばＮｕｎｃ社製のマイクロアレイスライド）を用意し、測定用チップ１と対照基板のそれぞれの表面へＲＰＥ溶液（例えば、０、０．４、２ｐｇ／ｍｌ）を１０μｌを塗布し、室温で３０分以上反応させる。その後、これら測定用チップ１と対照基板とを洗浄し、１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン：Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）を含む緩衝液でブロッキング（室温で３０分以上反応）を行い、更に洗浄乾燥させ、共焦点蛍光スキャナー（例えば、パーキンエルマー社製のＳｃａｎＡｒｒａｙ Ｌｉｔｅ）にて測定する（例えば、励起波長６３３ｎｍ、レーザーパワー８０％、ＰＭＴ Ｇａｉｎ ８０％）。（なお、ＢＳＡによるブロッキングについては実施の形態２において詳述する）。
【００４３】
あるいは、抗体、タンパク質、又は、ＤＮＡ等へ蛍光物質を標識することにより、測定用チップ１に、蛍光タンパク質や蛍光物質を、間接的に作用させることもできる。この場合は、上記と同様に測定用チップ１と対照基板を用意し、測定用チップ１と対照基板のそれぞれの表面へ抗ＩＬ−６抗体溶液（６μｇ／ｍｌ）を１μｌ、室温で１時間反応させる。その後、これら測定用チップ１と対照基板とを洗浄し、１％ＢＳＡを含む緩衝液でブロッキング（室温で３０分以上反応）を行い、更に洗浄した後、ｒＩＬ−６溶液（例えば、０、０．８、４、２０、１００、５００、２５００ｐｇ／ｍｌ）を１μｌ、室温で１時間反応させる。その後、これら測定用チップ１と対照基板とを再び洗浄し、ＲＰＥ標識抗ＩＬ−６抗体溶液（１μｇ／ｍｌ）を１μｌ、室温で３０分反応させる。最後に、これら測定用チップ１と対照基板とを洗浄乾燥し、蛍光スキャナーにて測定する（例えば、励起波長５４３ｎｍ、レーザーパワー８０％、ＰＭＴ Ｇａｉｎ ８０％）。
【００４４】
また、当該使用方法において、直接的又は間接的に作用させる蛍光物質は特に限定されない。具体的には、上述した蛍光タンパク質（ＲＰＥ等）や蛍光物質（Ａｌｅｘａ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、フルオレセイン、ローダミン、ウンベリフェロン、フィコエリスリン等）が挙げられる。このように蛍光物質等で抗体等を標識する方法としては、蛍光物質等と抗体等を共有結合または非共有結合を介して結合させる従来公知の方法を挙げることができる。さらに、共有結合を介して結合させる方法としては、例えば、グルタールアルデヒド法、過ヨウ素酸法、マレイミド法、ピリジル・ジスルフィド法、従来公知の各種架橋剤を用いる方法等を挙げることができる（例えば、「蛋白質核酸酵素」別冊３１号、３７〜４５頁（１９８５）参照）。また、蛍光物質と抗体とを、ウシアルブミンなどのタンパク質やナノ微粒子等を介して結合させても良い。また、非共有結合を介して結合させる方法としては、例えば、物理的吸着法を挙げることができる。すなわち、蛍光物質等と抗体等との間で生じるファンデルワールス力、疎水結合等の分子間引力によって、これらを結合させる。このような非共有結合は、従来公知の方法に従って形成させればよい。さらに、貴金属層へ結合物質を配置させる方法としては、例えば従来公知の物理的吸着法等が挙げられる。この他、金同様に銀表面をチオール化したり、酸化銀に修飾したりして貴金属層に結合物質を配置することもできる。
【００４５】
（実施の形態１に係る測定用チップ１の効果）
次いで、実施の形態１に係る測定用チップ１の効果を、従来の測定用チップとの対比により説明する。図１１は、実施の形態１に係る測定用チップ１と従来の測定用チップ（対照用チップ）との効果を示すもので、（ａ）は実験結果を示す表、（ｂ）はグラフである。この図１１（ｂ）において、縦軸は蛍光信号強度、横軸はｒＩＬ−６の濃度を示す。ここでは、対照用チップとして、基板に直接的に抗体を配置したものを用いている。この図１１から明らかなように、本実施の形態の測定用チップ１は、対照用チップに比べて、ｒＩＬ−６のいずれの濃度においても、蛍光信号強度及びＳ／Ｎ比において優れており、例えば、ｒＩＬ−６濃度が２，５００（ｐｇ／ｍｌ）の場合では、蛍光信号強度が約８．７倍（＝４７，０５１／５，４１０）、Ｓ／Ｎ比が約１．３倍（＝２０．１／１５．７）であり、極めて高強度の蛍光信号を取得可能であることがわかる。
【００４６】
また、図１２は、物理吸着による蛍光信号の増強試験の結果を示すもので、（ａ）は実験結果を示すグラフ、（ｂ）は（ａ）の実験で用いた各チップの構造を模式的に示す図である。この図１２（ａ）において、縦軸は蛍光色素ＲＰＥの濃度を示し、横軸は蛍光信号強度を示す。ここでは、測定用チップとして、構造が異なる５種類のチップを用いており、図１２（ｂ）に示すように、チップＡは基板に直接的に蛍光色素を物理吸着させたもの、チップＢは基板に金製のベース層を形成してその上に蛍光色素を吸着させたもの、チップＣは基板に銀製のベース層を形成してその上に蛍光色素を吸着させたもの、チップＤは基板に金製のベース層を形成してその上に配置した微粒子４ａに蛍光色素を吸着させたもの、及び、チップＥは基板２に金製のベース層３を形成してその上に配置した微粒子４ａに蛍光色素を吸着させたもの（本実施の形態１に係る測定用チップ１）である。この図１２（ａ）から明らかなように、本実施の形態１に係る測定用チップ１（チップＥ）を用いた場合には、他の構造の測定用チップＡ〜Ｄを用いた場合に比べて、蛍光色素の濃度をＢａｒｅから１０，０００（ｐｇ／ｍｌ）に変化させた場合のいずれにおいても、強い蛍光信号強度が得られている。特に、蛍光色素の濃度が２，０００や１０，０００（ｐｇ／ｍｌ）の場合には、蛍光信号強度に顕著な差異が見られる。このことから、実施の形態に係る測定用チップ１を用いることで、幅広い蛍光色素の濃度において、蛍光信号の増強率を大きく高めることができることが分る。
【００４７】
さらに、図１３には、蛍光信号の強度及びＳ／Ｎ比の実証試験の結果の表を示す。ここでは、対照用チップとして、基板に直接的に蛍光色素を物理吸着させたものを用いている。この図１３から明らかなように、本実施の形態に係る測定用チップ１を用いた場合には、他の対照用チップを用いた場合に対して、蛍光信号強度が約５６．５倍（＝６５，３３５／１，１６１）、Ｓ／Ｎ比が約４３．７倍（＝４９３．８／１１．３）であり、蛍光信号の増強率及びＳ／Ｎ比を大きく高めることができることが分る。
【００４８】
〔実施の形態２〕
次に、本発明に係る実施の形態２の具体的内容について説明する。この実施の形態２は、実施の形態１と同様に構成した測定用チップ１の使用方法に主たる特徴を有するものであり、測定用チップ１をＢＳＡ溶液等と反応させることで、自家蛍光やクエンチングを抑制可能とした形態である。なお、実施の形態２の構成は特記する場合を除いて実施の形態１の構成と略同一であり、実施の形態１の構成と略同一の構成についてはこの実施の形態１で用いたのと同一の符号を必要に応じて付して、その説明を省略する。
【００４９】
この実施の形態２では、測定用チップ１を試料と反応させた後、さらにＢＳＡ溶液等と反応させることで、自家蛍光を抑制して、蛍光強度測定におけるＳ／Ｎ比を高め、また同時に、クエンチングを抑制して、明るい蛍光色素に対しても表面増強効果を得ることを可能としている。
【００５０】
図１４は、反応溶液による蛍光信号強度とＳ／Ｎ比との変化を示す表である。ここでは、実施の形態１と同様に構成した測定用チップ１に対して、１０μｌＰＲＥ（０．１Ｍ Ｃｉｔｒａｔｅ緩衝液ｐＨ３．５）を室温で１時間反応させた後、ＰＢ−Ｔ（０．２Ｍりん酸緩衝液０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１０、ｐＨ６．８）で洗浄した、次に、各１％溶液（ＢＳＡ、スキムミルク、カゼインからなる群より選ばれる少なくとも一種）を室温で３０分反応させ、洗浄乾燥させ、共焦点蛍光スキャナー（ＳｃａｎＡｒｒａｙ Ｅｘｐｒｅｓｓ；パーキンエルマー）にて測定（励起波長５４３ｎｍ、レーザーパワー４０％、ＰＭＴ Ｇａｉｎ ８０％）した。ここでは、ｌＰＲＥの濃度を、基板、０、８０、４００、２，０００（ｎｇ／ｍｌ）の４種とし、また同時に、対照のため、ＢＳＡ溶液等を用いない場合（蛍光色素のみの場合）についても測定を行った。
【００５１】
この結果、図１４から明らかなように、ＲＰＥ濃度が８０（ｎｇ／ｍｌ）以上の全範囲において、蛍光色素のみの場合に比べて、ＢＳＡ、スキムミルク、又は、カゼインを用いた場合の方が、蛍光信号強度とＳ／Ｎ比の両面において優れており、両者の間に顕著な差が見られることがわかる。例えば、ＲＰＥ濃度２，０００（ｎｇ／ｍｌ）の場合において、蛍光色素のみの場合とＢＳＡを用いた場合とを比較すると、蛍光信号強度が約１．６倍（＝３０，２９０／１８，７０２）、Ｓ／Ｎ比が約２．３倍（＝７４．９／３２．１）になる。なお、このように自家発光やクエンチングの抑制効果を得るためには、ＢＳＡ、スキムミルク、又は、カゼイン以外にも、任意のタンパク質を用いることができる。また、図１４の試験では、ＢＳＡ、スキムミルク、又は、カゼインの１％溶液を用いたが、当該溶液の濃度は０．１％以上１０％以下の濃度であることが好ましく、この範囲であれば適宜変更して用いることができる。これは、溶液濃度が、０．１％未満だと効果が認められ難く、その一方、１０％を超えると溶け難いために処理しにくくなるためである。
【００５２】
（実施の形態２の効果）
このように実施の形態２によれば、実施の形態１と略同様の効果を得ることができると共に、自家蛍光を抑制して、蛍光強度測定におけるＳ／Ｎ比を高めることができる。また同時に、クエンチングを抑制して、明るい蛍光色素に対しても表面増強効果を得ることができる。
【００５３】
〔実施の形態３〕
次に、本発明に係る実施の形態３の具体的内容について説明する。この実施の形態３は、実施の形態１と同様に構成した測定用チップに、さらに陰イオンを設けた形態である。なお、実施の形態３の構成は特記する場合を除いて実施の形態１の構成と略同一であり、実施の形態１の構成と略同一の構成についてはこの実施の形態１で用いたのと同一の符号を必要に応じて付して、その説明を省略する。
【００５４】
（測定用チップの構成）
まず、実施の形態３に係る測定用チップ６の構成について概説する。図１５は、実施の形態３に係る測定用チップの部分拡大側面図である。この測定用チップ６は、貴金属層５の上に、さらに陰イオン（アニオン）７を設けて構成されている。この陰イオンは、具体的にはハロゲン（ハロゲンイオン：Ｃｌ−）であり、例えば測定用チップを実施の形態１と同様に形成し、試料を反応させた後、所定濃度のＮａＣｌを所定時間反応させることにより、配置することができる。ここで、「配置する」とは、陰イオンを基板と反応させることをいう。このように陰イオンを基板と反応させることにより、銀表面がマイナスに帯電する等の効果を得ることができる。
【００５５】
図１６は、ハロゲンイオンの有無による蛍光信号強度とＳ／Ｎ比との変化を示す図であり、（ａ）は実験結果を示す表、（ｂ）はグラフである。この図１６（ｂ）において、縦軸は蛍光信号強度、横軸はｒＩＬ−６の濃度、グラフ中の各プロットは、対照用の従来の測定用チップ、実施の形態１に係る測定用チップ１、ハロゲンイオンを配置した測定用チップ（本実施の形態３に係る測定用チップ６）を示す。ここでは、各測定用チップに、１０μｌの抗ＩＬ−６抗体（固相用；６μｇ／ｍｌ、０．１Ｍ Ｃｉｔｒａｔｅ緩衝液ｐＨ３．５）を室温で１時間反応させた後、ＰＢ−Ｔ（０．１Ｍりん酸緩衝液０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１０、ｐＨ６．８）で洗浄した。その後、測定用チップに、１ｍＭのＮａＣｌを室温で１５分反応させ、洗浄後ＢＳＡ（１％ＢＳＡ−ＰＢ−Ｔ）室温で３０分反応させ、再び洗浄した後にｒＩＬ−６（０，４，２０，１００，５００，２，５００ｐｇ／ｍｌ）溶液を１０μｌ、室温で１時間反応させる。次いで、測定用チップを洗浄後、この測定用チップに、ＲＰＥ標識抗ＩＬ−６抗体溶液（１μｇ／ｍｌ）を１０μｌ、室温で３０分反応させる。最後に、測定用チップを洗浄乾燥させ、この測定用チップを、共焦点蛍光スキャナー（ＳｃａｎＡｒｒａｙ Ｅｘｐｒｅｓｓ；パーキンエルマー）にて測定（励起波長５４３ｎｍ、レーザーパワー４０％、ＰＭＴ Ｇａｉｎ ８０％）した。
【００５６】
この結果、図１６から明らかなように、ｒＩＬ−６濃度が１００（ｐｇ／ｍｌ）以上の全範囲において、対照用の従来の測定用チップ、実施の形態１に係る測定用チップ１、本実施の形態３に係る測定用チップ６の順で、蛍光信号強度とＳ／Ｎ比が改善されていることがわかる。特に、実施の形態１に係る測定用チップ１と本実施の形態３に係る測定用チップ６とを比較すると、例えば、ｒＩＬ−６濃度が２，５００（ｐｇ／ｍｌ）の場合では、蛍光信号強度が約２．０倍（＝３１，４７６／１５，５３２）、Ｓ／Ｎ比が約２．０倍（＝７４．９／３８．０）になる。なお、陰イオンを構成する材質として、ハロゲンイオン以外に、ＳＯ４２−、ＮＯ３−、又は、ＣＯ３２−を用いても同様の改善が見られることが判明したが、ハロゲンイオンが最も優れた改善効果を得られる。
【００５７】
例えば、図１７は、蛍光信号の増強試験の結果を示すもので、（ａ）は実験結果を示す表、（ｂ）はグラフである。この図１７（ｂ）において、縦軸は蛍光色素ＲＰＥの濃度を示し、横軸は蛍光信号強度を示す。ここでは、測定用チップとして、ｂｕｆｆｅｒを用いた対照用チップ、ハロゲンイオン（Ｃｌ−）を用いたチップ、及び、ＳＯ４２−を用いたチップを使用している。この図１７から明らかなように、Ｃｌ−やＳＯ４２−の如き陰イオンを用いたチップは、対照用チップに比べて、蛍光信号強度とＳ／Ｎ比が改善されていることがわかる。特に、ハロゲンイオン（Ｃｌ−）を用いたチップは、蛍光信号強度とＳ／Ｎ比との改善効果が顕著であり、ハロゲンイオンが最も優れた改善効果を得られることが判る。このことから、陰イオン、特にハロゲンイオンにより、微粒子間に適切な間隔が設けられている可能性があり、このことが蛍光信号強度とＳ／Ｎ比との改善効果に寄与している可能性がある。
【００５８】
（実施の形態３の効果）
このように実施の形態３によれば、実施の形態１と略同様の効果を得ることができると共に、陰イオンを設けることで、蛍光信号強度を一層改善することができ、さらに高感度な蛍光測定を行うことが可能になる。
【００５９】
〔III〕各実施の形態に対する変形例
以上、各実施の形態について説明したが、本発明の具体的な構成及び方法は、特許請求の範囲に記載した各発明の技術的思想の範囲内において、任意に改変及び改良することができる。以下、このような変形例について説明する。
【００６０】
（解決しようとする課題や発明の効果について）
まず、発明が解決しようとする課題や発明の効果は、前記した内容に限定されるものではなく、本発明によって、前記に記載されていない課題を解決したり、前記に記載されていない効果を奏することもでき、また、記載されている課題の一部のみを解決したり、記載されている効果の一部のみを奏することがある。例えば、表面増強効果の増強率が従来と同様の場合であっても、従来と同様の効果を従来と異なる手段にて達成することにより、本願の課題が解決されている。
【００６１】
（構成、製造方法、又は、使用方法について）
前記文書中や図面中で示した各測定用チップの構成、製造方法、又は、使用方法は、あくまで例示であり、特記する場合を除いて任意に変更することができる。
【００６２】
（共鳴効果）
また、本発明では、微粒子４ａの大きさや厚さを変えることで基板２の吸収スペクトルを変え、この基板２の吸収スペクトルと、蛍光ラベルの吸収スペクトルとを相互に合致させることで、これら両スペクトルを相互に共鳴させ、いわゆる共鳴効果を得ることができる。この共鳴効果により、蛍光信号強度を一層増幅させ、測定感度を高めることができる。
【００６３】
（近接場の増強、クエンチングの抑制）
また、本発明では、微粒子４ａの相互間に適切な間隔（ギャップ）を設けることで、近接場の増強と、クエンチングの抑制とを図ることができる。
【００６４】
（付記）
最後に、上記各実施の形態における特徴の一部の要部とその効果を、以下に付記として示す。
【００６５】
（付記１）
基板と、
前記基板の少なくとも一側面に配置した多孔質膜と、
前記多孔質膜における前記基板と反対側の面に配置した、少なくとも銀を含有する貴金属層と、
を備えたことを特徴とする。
【００６６】
（付記１の効果）
この付記１によれば、表面増強効果を増大させることにより蛍光信号強度を向上させることができ、従来の増強率より一桁以上高い数十倍の蛍光信号強度を得ることができる。また、量子収率の高い蛍光物質（明るい蛍光物質）においても、従来より数十倍以上高い蛍光信号強度を得ることができるので、明るい蛍光物質の実用性を向上させることができる。さらに、弱励起光でも高い蛍光信号の増強効果を発揮することから、自家蛍光を抑制でき、蛍光信号のＳ／Ｎ比を向上させることができる。さらにまた、当該測定用チップは、基板上からの蛍光信号を検出する分析方法（プレートアッセイ、バイオチップ、ＤＮＡチップ等、ナノセンサー）のほぼ全てに適用でき、各分析方法における感度向上を図ることができる。
【００６７】
（付記２）
前記貴金属層に配置した、測定対象物質に特異的に結合する結合物質、
を備えたことを特徴とする付記１に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【００６８】
（付記２の効果）
この付記２によれば、結合物質を配置することで、ユーザは自ら結合物質を配置することなく、簡易かつ迅速に蛍光測定を行うことができる。
【００６９】
（付記３）
前記結合物質が、抗原または抗体であること、
を特徴とする付記２に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【００７０】
（付記３の効果）
この付記３によれば、抗原または抗体を結合物質として用いて、付記２の効果を得ることができる。
【００７１】
（付記４）
前記貴金属層の膜厚が、約５〜２０ｎｍであること、
を特徴とする付記１から３のいずれか一項に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【００７２】
（付記４の効果）
この付記４によれば、貴金属層の膜厚を好適な範囲とすることで、蛍光信号強度を一層高めることができる。
【００７３】
（付記５）
前記貴金属層の膜厚が、約１０〜１５ｎｍであること、
を特徴とする付記４に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【００７４】
（付記５の効果）
この付記５によれば、貴金属層の膜厚を一層好適な範囲とすることで、蛍光信号強度をより一層高めることができる。
【００７５】
（付記６）
前記多孔質膜を、平坦上の膜体に複数の孔部を穿設することにより形成したこと、
を特徴とする付記１から５のいずれか一項に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【００７６】
（付記６の効果）
この付記６によれば、膜体に孔部を穿設することで多孔質膜を形成したので、微粒子を形成することが不要になり、多孔質膜を容易に形成できる。
【００７７】
（付記７）
前記多孔質膜を、複数の微粒子から形成したこと、
を特徴とする付記１から５のいずれか一項に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【００７８】
（付記７の効果）
この付記７によれば、微粒子を用いて多孔質膜を形成したので、各微粒子の粒径や空孔率を制御することで、所望の構造の多孔質膜を容易に形成できる。
【００７９】
（付記８）
前記微粒子の粒径が、約３６０ｎｍ以下であること、
を特徴とする付記７に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【００８０】
（付記８の効果）
この付記８によれば、微粒子の粒径を好適な範囲とすることで、蛍光信号強度を一層高めることができる。
【００８１】
（付記９）
前記微粒子の粒径が、約５０〜２００ｎｍであること、
を特徴とする付記８に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【００８２】
（付記９の効果）
この付記９によれば、微粒子の粒径を一層好適な範囲とすることで、蛍光信号強度をより一層高めることができる。
【００８３】
（付記１０）
前記微粒子の粒径が、約５０〜１００ｎｍであること、
を特徴とする付記９に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【００８４】
（付記１０の効果）
この付記１０によれば、微粒子の粒径をさらに一層好適な範囲とすることで、蛍光信号強度をより一層高めることができる。
【００８５】
（付記１１）
前記多孔質膜の空孔率が、約６０〜９７％であること、
を特徴とする付記１から１０のいずれか一項に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【００８６】
（付記１１の効果）
この付記１１によれば、多孔質膜の空孔率を好適な範囲とすることで、蛍光信号強度を一層高めることができる。
【００８７】
（付記１２）
前記多孔質膜の空孔率が、約７５〜８５％であること、
を特徴とする付記１１に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【００８８】
（付記１２効果）
この付記１２によれば、多孔質膜の空孔率を一層好適な範囲とすることで、蛍光信号強度をより一層高めることができる。
【００８９】
（付記１３）
前記基板と前記多孔質膜との相互間に配置した、少なくとも金またはシリコンを含有するベース層、
を備えたことを特徴とする付記１から１２のいずれか一項に記載の特徴とする蛍光測定のための測定用チップ。
【００９０】
（付記１３の効果）
この付記１３によれば、金を含有するベース層を備えることで、多孔質膜（特に微粒子にて形成した多孔質膜）を容易かつ確実に基板上に配置することができる。
【００９１】
（付記１４）
前記基板、前記多孔質膜、及び、前記貴金属層を配置した後、当該測定用チップを、ＢＳＡ、スキムミルク、カゼインからなる群より選ばれる少なくとも一種と反応させたこと、
を特徴とする付記１から１３のいずれか一項に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【００９２】
（付記１４の効果）
この付記１４によれば、測定用チップをＢＳＡ等と反応させることで、自家蛍光を抑制して、蛍光強度測定におけるＳ／Ｎ比を高めることができる。また同時に、クエンチングを抑制して、明るい蛍光色素に対しても表面増強効果を得ることができる。
【００９３】
（付記１５）
前記貴金属層における前記基板と反対側の面に配置した陰イオン、
を備えることを特徴とする付記１から１４のいずれか一項に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【００９４】
（付記１５の効果）
この付記１５によれば、貴金属層に陰イオンを配置することで、蛍光信号強度を一層改善することができ、さらに高感度な蛍光測定を行うことが可能になる。
【００９５】
（付記１６）
前記陰イオンが、ハロゲンイオンであること、
を特徴とする付記１５に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【００９６】
（付記１６の効果）
この付記１６によれば、陰イオンとしてハロゲンイオンを用いることで、蛍光信号強度を一層改善することができ、さらに高感度な蛍光測定を行うことが可能になる。
【００９７】
（付記１７）
基板を準備する工程と、
前記基板の少なくとも一側面に多孔質膜を配置する工程と、
前記多孔質膜における前記基板と反対側の面に、少なくとも銀を含有する貴金属層を配置する工程と、
を含んだことを特徴とする蛍光測定のための測定用チップの製造方法。
【００９８】
（付記１７の効果）
この付記１７によれば、この製造方法にて製造した測定用チップを用いることで、表面増強効果を増大させることにより蛍光信号強度を向上させることができ、従来の増強率より一桁以上高い数十倍の蛍光信号強度を得ることができる。また、量子収率の高い蛍光物質（明るい蛍光物質）においても、従来より数十倍以上高い蛍光信号強度を得ることができるので、明るい蛍光物質の実用性を向上させることができる。さらに、弱励起光でも高い蛍光信号の増強効果を発揮することから、自家蛍光を抑制でき、蛍光信号のＳ／Ｎ比を向上させることができる。さらにまた、当該測定用チップは、基板上からの蛍光信号を検出する分析方法（バイオチップ、ＤＮＡチップ等、ナノセンサー）のほぼ全てに適用でき、各分析方法における感度向上を図ることができる。
【００９９】
（付記１８）
前記貴金属層に、測定対象物質に特異的に結合する結合物質を配置する工程、
を含むことを特徴とする付記１７に記載の測定用チップの製造方法。
【０１００】
（付記１８の効果）
この付記１８によれば、結合物質を配置することで、ユーザは自ら結合物質を配置することなく、簡易かつ迅速に蛍光測定を行うことができる。
【０１０１】
（付記１９）
前記結合物質が、抗原または抗体であること、
を特徴とする付記１８に記載の測定用チップの製造方法。
【０１０２】
（付記１９の効果）
この付記１９によれば、抗原または抗体を結合物質として用いて、付記１８の効果を得ることができる。
【０１０３】
（付記２０）
前記基板を準備する工程の後、前記基板の少なくとも一側面に、少なくとも金を含有するベース層を配置する工程を含み、当該ベース層に前記多孔質膜を配置したこと、
を特徴とする付記１７から１９のいずれか一項に記載の測定用チップの製造方法。
【０１０４】
（付記２０の効果）
この付記２０によれば、金を含有するベース層を備えることで、多孔質膜（特に微粒子にて形成した多孔質膜）を容易かつ確実に基板上に配置することができる。
【０１０５】
（付記２１）
前記貴金属層を配置する工程の後、当該測定用チップを、ＢＳＡ、スキムミルク、カゼインからなる群より選ばれる少なくとも一種と反応させる工程、
を含むことを特徴とする付記１７から２０のいずれか一項に記載の測定用チップの製造方法。
【０１０６】
（付記２１の効果）
この付記２１によれば、測定用チップをＢＳＡ等と反応させることで、自家蛍光を抑制して、蛍光強度測定におけるＳ／Ｎ比を高めることができる。また同時に、クエンチングを抑制して、明るい蛍光色素に対しても表面増強効果を得ることができる。
【０１０７】
（付記２２）
前記貴金属層における前記基板と反対側の面に、陰イオンを配置する工程、
を含むことを特徴とする付記１７から２１のいずれか一項に記載の測定用チップの製造方法。
【０１０８】
（付記２２の効果）
この付記２２によれば、貴金属層に陰イオンを配置することで、蛍光信号強度を一層改善することができ、さらに高感度な蛍光測定を行うことが可能になる。
【０１０９】
（付記２３）
基板に多孔質膜を配置した後、前記多孔質膜における前記基板と反対側の面に、少なくとも銀を含有する貴金属層を配置することにより、測定用チップを製造する工程と、
前記測定用チップの前記貴金属層に、測定対象物質に特異的に結合する結合物質を配置する工程と、
前記測定用チップの前記結合物質に測定対象物質を結合させる工程と、
前記測定用チップの前記結合物質に結合させた測定対象物質に、蛍光色素で標識した結合物質を結合させる工程と、
前記蛍光色素を観察する工程と、
を含むことを特徴とする蛍光測定法。
【０１１０】
（付記２３の効果）
この付記２３によれば、表面増強効果を増大させることにより蛍光信号強度を向上させることができ、従来の増強率より一桁以上高い数十倍の蛍光信号強度を得ることができる。また、量子収率の高い蛍光物質（明るい蛍光物質）においても、従来より数十倍以上高い蛍光信号強度を得ることができるので、明るい蛍光物質の実用性を向上させることができる。さらに、弱励起光でも高い蛍光信号の増強効果を発揮することから、自家蛍光を抑制でき、蛍光信号のＳ／Ｎ比を向上させることができる。さらにまた、当該測定用チップは、基板上からの蛍光信号を検出する分析方法（プレートアッセイ、バイオチップ、ＤＮＡチップ等、ナノセンサー）のほぼ全てに適用でき、各分析方法における感度向上を図ることができる。
【０１１１】
（付記２４）
基板に多孔質膜を配置した後、前記多孔質膜における前記基板と反対側の面に、少なくとも銀を含有する貴金属層を配置することにより、測定用チップを製造する工程と、
前記測定用チップの前記貴金属層に、測定対象物質を配置する工程と、
前記測定用チップの前記測定対象物質に特異的に結合する結合物質であって、蛍光色素で標識した結合物質を、前記測定対象物質に結合させる工程と、
前記蛍光色素を観察する工程と、
を含むことを特徴とする蛍光測定法。
【０１１２】
（付記２４の効果）
この付記２４によれば、測定対象物が不明なサンプル（細胞を含み得る）を先に測定用チップへ結合又は接近させておき、このサンプルに含まれる測定対象物を、数種類の蛍光標識した結合物質（例えば抗体）で検出する場合においても、付記２３と同様の効果を得ることができる。
【０１１３】
（付記２５）
前記結合物質が、抗原または抗体であること、
を特徴とする請求項２３又は２４に記載の蛍光測定法。
【０１１４】
（付記２５の効果）
この付記２５によれば、抗原または抗体を結合物質として用いて、付記２３又は２４の効果を得ることができる。
【０１１５】
（付記２６）
前記測定用チップを製造する工程と前記蛍光色素を観察する工程との相互間に、前記測定用チップを、ＢＳＡ、スキムミルク、又は、カゼインからなる群より選ばれる少なくとも一種と反応させる工程、
を含むことを特徴とする請求項２３から２５のいずれか一項に記載の蛍光測定法。
【０１１６】
（付記２６の効果）
この付記２６によれば、測定用チップをＢＳＡ等と反応させることで、自家蛍光を抑制して、蛍光強度測定におけるＳ／Ｎ比を高めることができる。また同時に、クエンチングを抑制して、明るい蛍光色素に対しても表面増強効果を得ることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
以上のように、本発明に係る蛍光測定法と測定用チップ及びその製造方法は、試料中の測定対象物質の定量等を行うことに有用であり、特に、蛍光信号強度やＳ／Ｎ比を改善して、高感度な測定を行うことに適している。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】本発明の実施の形態１に係る測定用チップの部分拡大斜視図である。
【図２】実施の形態１に係る測定用チップの部分拡大側面図である。
【図３】貴金属層の材質の違いによる蛍光信号強度の変化を示すグラフである。
【図４】蛍光信号強度と貴金属層の膜厚との相互関係を示すグラフであり、微粒子の粒径を５０ｎｍとした場合のグラフである。
【図５】蛍光信号強度と貴金属層の膜厚との相互関係を示すグラフであり、微粒子の粒径を１００ｎｍとした場合のグラフである。
【図６】蛍光信号強度と貴金属層の膜厚との相互関係を示すグラフであり、微粒子の粒径を２００ｎｍとした場合のグラフである。
【図７】蛍光信号強度と貴金属層の膜厚との相互関係を示すグラフであり、微粒子の粒径を３００ｎｍとした場合のグラフである。
【図８】蛍光信号強度と貴金属層の膜厚との相互関係を示すグラフであり、微粒子の粒径を５００ｎｍとした場合のグラフである。
【図９】蛍光信号強度と蛍光色素の濃度との関係を様々な空孔率について示したものであり、（ａ）は実験結果を示す表、（ｂ）はグラフである。
【図１０】実施の形態１に係る測定用チップを用いた蛍光測定法を概念的に示す図であり、（ａ）は測定用チップに抗体を配置した状態、（ｂ）はサンドイッチ結合を構成した状態を示す。
【図１１】実施の形態１に係る測定用チップと対照用チップとの効果を示すもので、（ａ）は実験結果を示す表、（ｂ）はグラフである。
【図１２】物理吸着による蛍光信号の増強試験の結果を示すもので、（ａ）は実験結果を示すグラフ、（ｂ）は（ａ）の実験に用いた各チップの構造を模式的に示す図である。
【図１３】蛍光信号の強度及びＳ／Ｎ比の実証試験の結果を示す表である。
【図１４】実施の形態２に係る、反応溶液による蛍光信号強度とＳ／Ｎ比との変化を示す表である。
【図１５】実施の形態３に係る測定用チップの部分拡大側面図である。
【図１６】ハロゲンイオンの有無による蛍光信号強度とＳ／Ｎ比との変化を示す図であり、（ａ）は実験結果を示す表、（ｂ）はグラフである。
【図１７】蛍光信号の増強試験の結果を示すもので、（ａ）は実験結果を示す表、（ｂ）はグラフである。
【符号の説明】
【０１１９】
１、６ 測定用チップ
２ 基板
３ ベース層
４ 多孔質膜
５ 貴金属層
７ 陰イオン
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面増強効果にて蛍光強度を増強させた蛍光測定法と、この蛍光測定法に使用するための測定用チップ及びその製造方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、試料中に含まれるＤＮＡや蛋白質等の測定対象物質を定量等する手法の一つとして、蛍光測定法が知られている。この蛍光測定法は、抗原抗体反応を利用した免疫学的検出法の一種であり、測定用チップを用いて行われる。この測定用チップは、ガラス基板に形成された多数の微小な反応領域の各々に抗体を配置して形成されており、この測定用チップの表面に試料を加えると、各反応領域に配置した抗体が試料中の測定対象物質を補足する。次いで、この測定用チップの表面に蛍光色素で標識した抗体を加えると、この抗体が、測定用チップの表面に補足されている測定対象物質に結合して、一対の抗体の間に測定対象物質を結合させたサンドイッチ結合を構成する。その後、測定用チップを洗浄して未結合の試料や抗体を洗い流し、測定用チップにレーザ光などの励起光を照射することにより、この励起光の励起によって蛍光色素から蛍光を発生させる。そして、この蛍光を分光素子にて励起光と分離し、この分離された蛍光の信号強度（蛍光信号強度）を蛍光スキャナーや蛍光顕微鏡にて測定することで、試料に含まれる測定対象物質を定量等することができる。
【０００３】
このような蛍光測定法において、凹凸構造を有する貴金属製の基板上では、蛍光色素の蛍光強度が増幅するという現象（表面増強効果）が知られている。この表面増強効果の原理についてより詳細に説明すると、光の波長よりもずっと小さい直径の粒子に光を当てた場合、散乱光が生じると共に、その粒子の周辺で局在した電磁場（近接場光）が発生する。これら散乱光及び近接場光はいずれも、入射光が球に当たったときに、球内部に誘起される電気双極子が源となって発生する電磁場であるが、散乱光は遠方にまで伝わるのに対し、近接場光のエネルギーは球面状に沿うようにして集中し、球から離れた位置では観測することはできない。しかも、近接場光が分布しているのは、粒子からその粒子の直径程度の距離である。貴金属（銀）粒子近傍で発生した近接場光により励起光が増幅され、光を吸収する蛍光分子数が増加すること、更に励起状態から基底状態への戻りが速く、励起され易くなることから（励起サイクル増加）、蛍光強度が増大すると考えられている。このような原理に基づく表面増強効果によれば、測定用チップを形成するガラス基板の表面に貴金属製の微細な凹凸を形成し、この測定用チップを用いて蛍光測定法を実施することで、一層高感度な測定を行うことが可能になり、例えば蛍光色素が比較的少数の場合であっても、試料に含まれる測定対象物質を定量等することが可能になる。
【０００４】
このような表面増強効果を得るために測定用チップに形成される凹凸構造は、理想的には、凹凸構造の密度が均一であること、凹凸の均一性が高いこと、同一の凹凸構造の再現性が高いこと、凹凸構造の製造が容易であること、及び、凹凸構造のサイズが４０〜１００ｎｍのナノサイズであることが好ましい。そして、このような各種条件を満たす凹凸構造を形成する方法として、従来から、ガラス基板の表面に貴金属製（例えば銀製）のナノサイズの微粒子を配置する方法が提案されている。
【０００５】
例えば、非特許文献１及び非特許文献２には、銀島状フィルム（ＳＩＦ：Ｓｉｌｖｅｒ ｉｓｌａｎｄ ｆｉｌｍ）をガラス基板上に配置する点が開示されている。この銀島状フィルムは、例えば、銀イオンを溶液中で還元させることによって、ガラス基板上に配置される。すなわち、この技術では、ナノサイズの微粒子を銀にて形成し、この銀製の微粒子を、相互に間隔を隔てた状態（相互に接触しない状態）で、ガラス基板上に配置している。
【０００６】
また、特許文献１には、表面増強効果を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ：Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）に適用した技術が開示されている。ここで、表面プラズモン共鳴とは、特定の波長の光を、入射角度を変えながら金属膜の表面に照射すると、特定の入射角度によって光子のエネルギーが吸収されて反射されなくなる現象である。この入射角度は共鳴角度と呼ばれ、この共鳴角度は金属膜の表面密度（質量）に応じて変ることから、この共鳴角度の変化を測定することで、金属膜の表面密度を特定することができる。この表面プラズモン共鳴の原理についてより詳細に説明すると、金属薄の裏面の照射光は全反射すると同時に金属膜側に微弱なエネルギー波（エバネッセント波）を生じる。また誘電体に接触した金属表面では粗密波（表面プラズモン）が発生し、両者の波数が一致したときに共鳴して反射光が減衰する（表面プラズモン共鳴現象）。誘電率（屈折率の２乗）はエバネッセント波に影響し、従って金属表面で引き起こされる物質間の相互作用は、誘電率に差異を生じるため、これが表面プラズモンに影響し共鳴の変化として捉えることができる。この特許文献１では、粒径５ｎｍから１００μｍの高分子の微粒子を、基板上に固相化する点が開示されている。
【０００７】
あるいは、非特許文献３には、表面増強ラマン分光（ＳＥＲＳ：Ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）に関する技術ではあるが、基板上に固相化された微粒子に銀を蒸着することにより、銀粒子を作製する点が開示されている。
【０００８】
【非特許文献１】イブジェニア ジー マットビーバ 等（Ｅｖｇｅｎｉａ Ｇ． Ｍａｔｖｅｅｖａ， ｅｔ ａｌ．）著、「金属粒子増強蛍光に基づくミオグロビンの免疫学的検定（Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｅｔａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）」、米国、３０２号、免疫法ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ）、２００５年６月６日、Ｐ．２６−３５
【非特許文献２】ジョセフ アール ラコウィッチ 等（Ｊｏｓｅｐｈ Ｒ． Ｌａｋｏｗｉｃｚ， ｅｔ ａｌ．）著、「蛍光強度、寿命、及び、共鳴エネルギー移動における銀島状フィルムの影響 （Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｓｉｌｖｅｒ Ｉｓｌａｎｄ Ｆｉｌｍｓ ｏｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ， Ｌｉｆｅｔｉｍｅｓ， ａｎｄ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）」、米国、３０１号、分析バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２００２年１月１５日、Ｐ．２６１−２７７
【非特許文献３】チュアン ボ−ディー（Ｔｕａｎ Ｖｏ−Ｄｉｎｈ）著、「金属ナノ構造を用いた表面増強ラマン分光（Ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｕｓｉｎｇ ｍｅｔａｌｌｉｃ ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）」、米国、１７号、分析化学のトレンド（ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９９８年８月９日、Ｐ．５５７−５８２
【特許文献１】特開２０００−５５９２０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、これら特許文献１および非特許文献１〜３に記載されたような、基板上に微粒子のみを相互に非接触状に配置する従来の測定方法では、１０倍程度の増強率しか得られないことが分っており、より高感度の表面増強方法が要望されていた。また、このような従来の表面増強効果では、明るい蛍光色素（量子収率が高い蛍光色素）に対しては、表面増強効果が確認されておらず、逆に、金属のクエンチング効果により蛍光強度が低下していた。このことは、実用的観点から重要な明るい蛍光色素を有効に使用することが困難になることを意味しており、明るい蛍光色素を用いた場合であっても高感度に増強できる方法が要望されていた。さらには、凹凸構造によって基板の自家蛍光が強くなり、この自家蛍光が蛍光色素からの蛍光に対するノイズになるため、蛍光強度測定におけるＳ／Ｎ比（Ｓｉｇｎａｌ／Ｎｏｉｓｅ Ｒａｔｉｏ）が低いという問題があった。
【００１０】
特に、特許文献１に記載された表面プラズモン共鳴や、非特許文献３に記載された表面増強ラマン分光は、蛍光測定とは異なる原理によるものであり、これら表面プラズモン共鳴や表面増強ラマン分光に関する従来技術を蛍光測定に直ちに適用することはできず、あるいは、適用してもその特性が全く異なるものになる。具体的には、表面プラズモン共鳴は、蛍光色素の如き標識を用いない技術であり、少なくともこの点において、上述した蛍光測定とは異なるものである。また、表面増強ラマン分光は、散乱現象であって蛍光現象ではなく、少なくともこの点において、上述した蛍光測定とは異なるものである。従って、これら表面プラズモン共鳴や表面増強ラマン分光において優れた特性を有する測定方法や測定用チップをそのまま蛍光測定に用いても、同様の優れた特性を得ることができるとの単純な予測は全く成り立たず、蛍光測定において所望の特性を得ることができる測定方法や測定用チップを新規に模索する必要がある。例えば、ラマン分光では今までに５桁以上の増強がルーチン的に観察されているが、これに対して、蛍光では10倍程度の増強しか観察されていなかった。
【００１１】
このような問題を解決するため、本発明は、表面増強効果の増強率を向上させると共にＳ／Ｎ比を改善すること等ができる、蛍光測定法と、この蛍光測定法に使用するための測定用チップ及びその製造方法とを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上述した課題を解決し、目的を達成するために、請求項１に記載の測定用チップは、基板と、前記基板の少なくとも一側面に配置した多孔質膜と、前記多孔質膜における前記基板と反対側の面に配置した、少なくとも銀を含有する貴金属層と、を備えたことを特徴とする。
【００１３】
また、請求項１７に記載の測定用チップの製造方法は、基板を準備する工程と、前記基板の少なくとも一側面に多孔質膜を配置する工程と、前記多孔質膜における前記基板と反対側の面に、少なくとも銀を含有する貴金属層を配置する工程と、を含んだことを特徴とする。
【００１４】
また、請求項２３に記載の蛍光測定法は、基板に多孔質膜を配置した後、前記多孔質膜における前記基板と反対側の面に、少なくとも銀を含有する貴金属層を配置することにより、測定用チップを製造する工程と、前記測定用チップの前記貴金属層に、測定対象物質に特異的に結合する結合物質を配置する工程と、前記測定用チップの前記結合物質に測定対象物質を結合させる工程と、前記測定用チップの前記結合物質に結合させた測定対象物質に、蛍光色素で標識した結合物質を結合させる工程と、前記蛍光色素を観察する工程と、を含むことを特徴とする。
【００１５】
また、請求項２４に記載の蛍光測定法は、基板に多孔質膜を配置した後、前記多孔質膜における前記基板と反対側の面に、少なくとも銀を含有する貴金属層を配置することにより、測定用チップを製造する工程と、前記測定用チップの前記貴金属層に、測定対象物質を配置する工程と、前記測定用チップの前記測定対象物質に特異的に結合する結合物質であって、蛍光色素で標識した結合物質を、前記測定対象物質に結合させる工程と、前記蛍光色素を観察する工程と、を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
請求項１に記載の測定用チップによれば、表面増強効果を増大させることにより蛍光信号強度を向上させることができ、従来の増強率より一桁以上高い数十倍の蛍光信号強度を得ることができる。また、量子収率の高い蛍光物質（明るい蛍光物質）においても、従来より数十倍以上高い蛍光信号強度を得ることができるので、明るい蛍光物質の実用性を向上させることができる。さらに、弱励起光でも高い蛍光信号の増強効果を発揮することから、自家蛍光を抑制でき、蛍光信号のＳ／Ｎ比を向上させることができる。さらにまた、当該測定用チップは、基板上からの蛍光信号を検出する分析方法（プレートアッセイ、バイオチップ、ＤＮＡチップ等、ナノセンサー）のほぼ全てに適用でき、各分析方法における感度向上を図ることができる。
【００１７】
請求項１７に記載の測定用チップの製造方法によれば、当該製造方法にて製造した測定用チップを用いることにより、上記請求項１と同様の効果を得ることができる。
【００１８】
また、請求項２３に記載の蛍光測定法は、当該蛍光測定法を実行することにより、上記請求項１と同様の効果を得ることができる。
【００１９】
また、請求項２４に記載の蛍光測定法は、測定対象物が不明なサンプル（細胞を含み得る）を先に測定用チップへ結合又は接近させておき、このサンプルに含まれる測定対象物を、数種類の蛍光標識した結合物質（例えば抗体）で検出する場合においても、上記請求項２３と同様の効果を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下に添付図面を参照して、本発明の各実施の形態に係る蛍光測定法を詳細に説明する。まず、〔Ｉ〕各実施の形態に共通の基本的概念を説明した後、〔II〕各実施の形態の具体的内容についてそれぞれ説明し、〔III〕最後に、各実施の形態に対する変形例について説明する。ただし、各実施の形態により本発明が限定されるものではない。
【００２１】
〔Ｉ〕各実施の形態に共通の基本的概念
まず、各実施の形態に共通の基本的概念について説明する。各実施の形態は蛍光測定法に関するものであり、この蛍光測定法は、特記する点を除いて、従来と同様の手順及び装置にて行われる。ここで、本実施の形態の特徴の一つは、測定用チップの構造やその製造方法にある。すなわち、従来は、表面増強効果を得るためにガラス基板の表面にナノサイズの微粒子を配置する際、単に、貴金属（例えば銀）にて形成した微粒子をガラス基板の表面に配置していた。また、従来は、これら微粒子同士の相互間に間隔を設けなければ感度の高いラマン計測ができないと考えられていたこと、及び、微粒子同士を密に配置することが技術的に困難であったこと等の理由により、微粒子同士の相互間にある程度の間隔を設けていた。しかしながら従来は、このように間隔を設けた場合であっても、上述のように１０倍程度の増強率しか得られない等の様々な問題が生じていた。
【００２２】
これに対して、本実施の形態では、基板に銀製の微粒子を非接触状に配置するのではなく、基板に多孔質膜を配置することによって凹凸構造を形成し、さらに、この凹凸構造の表面に貴金属膜を配置する多層的凹凸構造を採用している。このような新規な構造によれば、実質的には、微粒子同士の相互間に間隔を設けることなく、大部分の微粒子同士を相互にわずかに接触させたのと類似の凹凸構成を形成でき、従来に比べて種々の利点を享受できると共に、凹凸構成を簡易かつ確実に形成することができる。
【００２３】
さらに、本実施の形態の他の特徴の一つは、多孔質膜の具体的構造（材質、膜厚、及び、空孔率等）や、貴金属膜の具体的構造（厚み等）について工夫することで、一層優れた効果を奏することが可能になっている。この点については後述する。
【００２４】
〔II〕各実施の形態の具体的内容
次に、各実施の形態の具体的内容について説明する。
【００２５】
〔実施の形態１〕
最初に、実施の形態１について説明する。この形態は、基板に配置した多孔質膜に、銀を含有する貴金属層をさらに配置して測定用チップを構成した形態である。以下では、実施の形態１に係る測定用チップに関する、構成、製造方法、使用方法、及び、効果について、順次説明する。
【００２６】
（測定用チップの構成）
図１は実施の形態１に係る測定用チップの部分拡大斜視図、図２は実施の形態１に係る測定用チップの部分拡大側面図である。この測定用チップ１は、概略的に、基板２の一側面に、ベース層３、多孔質膜４、及び、貴金属層５を順次配置して構成されている。
【００２７】
基板２は、測定用チップ１の基本構造体であり、例えばガラス、プラスチック、あるいは、金属にて、平面形状を略長方形状とする平板状に形成される。
【００２８】
ベース層３は、基板２に多孔質膜４を配置するためのもので、例えば蒸着やスパッタリングの如き方法にて、基板２の側面に固着されている。このベース層３の材質及び厚みは基本的には任意であるが、後述する微粒子４ａを広範囲に高密度で吸着させるためには、例えば金やシリコンにて薄膜状に形成することが好ましく、その膜厚は、例えば約１０〜５０ｎｍとし、より好ましくは約２０ｎｍとする。なお、このような高密度の吸着作用を要しない場合には、このベース層３を省略し、基板２の側面に多孔質膜４を直接的に配置することもでき、例えば基板２を金属やシリコンにて形成した場合には、ベース層３を省略して、この基板２の一側面に多孔質膜４を直接形成してもよい。
【００２９】
多孔質膜４は、表面増強効果を得るための条件の一つである凹凸構造を形成するための膜状体（例えば薄膜体）である。ここで、多孔質膜４の形成方法としては、少なくとも２つの方法を挙げることができる。第１の形成方法は、平滑状の膜体を形成した後、この膜体に多数の孔を穿設する方法である。第２の形成方法は、多数の微粒子４ａを形成した後、これら多数の微粒子４ａを、基板２又はベース層３に高密度で配置する方法である。以下、本実施の形態では、第２の形成方法を採用した場合について説明する。
【００３０】
このように多孔質膜４を微粒子４ａから形成する場合において、この微粒子４ａの材質は任意であるが、例えば、ポリスチレン、酸化シリコン（ＳｉＯ２）、あるいは、天然ゴム又は合成ゴム（当業者間で一般的にラテックスと呼ばれているもの等）を用いることができる。ただし、この他にも、ベース層３に含まれる金またはシリコン上に微粒子４ａが吸着され得る限りにおいて、任意の材質にて微粒子４ａを構成することができる。
【００３１】
貴金属層５は、表面増強効果を改善するためのものである。従来、ＳＰＲでは銀の酸化による悪影響を回避するため金を用いていたが、本実施の形態では貴金属層５を銀にて形成することで、高い蛍光増強効果を得ている。図３は、貴金属層５の材質の違いによる蛍光信号強度の変化を示すグラフであり、縦軸は蛍光信号強度、横軸は蛍光タンパク質（ＲＰＥ：Ｒ−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）の濃度、グラフ中の各プロットは、基板（基板２に多孔質膜を形成せずに、直接的に蛍光物質を吸着させた場合）、金（貴金属層５を金で形成した場合）、銀（貴金属層５を銀で形成した場合）、をそれぞれ示す。ここでは、多孔質膜４を粒径１００ｎｍの微粒子４ａにて形成し、貴金属層５を１０ｎｍの厚みにて形成した。この図３から明らかなように、貴金属層５を銀で形成した場合には、他の場合に比べて蛍光信号強度が飛躍的に増大しており、従って、貴金属層５を銀にて形成することが表面増強効果の改善に有用であることが分る。以下では、貴金属層５を銀にて形成した場合について説明する。
【００３２】
次に、このような測定用チップ１の構成について、より詳細に説明する。最初に、貴金属層５の膜厚の好適な数値範囲について説明する。図４〜８の各々は、蛍光信号強度と貴金属層５の膜厚との相互関係を示すグラフである。これら図４〜８は、順次、多孔質膜４を形成する微粒子４ａの粒径を、５０、１００、２００、３００、５００ｎｍとした場合を示しており、各図において、縦軸は蛍光信号強度、横軸は貴金属層５の膜厚、グラフ中の各プロットは、蛍光色素の濃度を０、８０、４００、２，０００ｎｇ／ｍｌとした場合を示す。例えば、図４は、微粒子４ａの粒径が５０ｎｍの場合を示しており、蛍光色素の濃度が２，０００ｎｇ／ｍｌの場合には、貴金属層５の膜厚が１０ｎｍである場合において、蛍光信号強度が約６０，０００である。なお、ここで示す微粒子４ａの粒径５０、１００、２００、３００、５００ｎｍは概算値であり、当該実験において実際に使用した微粒子４ａの正確な粒径（使用した各粒子の粒径を正規分布で表したときにおける最も多い粒径）は、それぞれ、５０ｎｍ、１０８ｎｍ、２０２ｎｍ、３５６ｎｍである。なお、全ての粒子の粒径を正確に調整することは困難であり、多少の誤差は生じ得る。
【００３３】
ここで、これら図４〜８に示すように、微粒子４ａの粒径が５０〜５００ｎｍのいずれの場合においても、蛍光信号強度は、貴金属層５の膜厚が約５〜２０ｎｍの場合に高い値を示しており、特に、貴金属層５の膜厚が約１０〜１５ｎｍの場合に顕著に高い値（ピーク値）を示している。従って、貴金属層５の膜厚は、少なくとも約５〜２０ｎｍとすることが好ましく、さらには約１０〜１５ｎｍとすることが一層好ましい。
【００３４】
次に、多孔質膜４の膜厚（ここでは、多孔質膜４を形成する微粒子４ａの粒径）の好適な数値範囲について説明する。先の図４〜７に示すように、微粒子４ａの粒径が５０〜３００ｎｍの場合には、貴金属層５の膜厚が１０〜２０ｎｍの範囲で２，０００以上の蛍光信号強度を得ることができているが、図８に示すように、微粒子４ａの粒径が５００ｎｍの場合には、同範囲で２，０００以下の蛍光信号強度しか得ることができない。これらのことから、微粒子４ａの粒径は、少なくとも約３００ｎｍ（正確には３５６ｎｍ、すなわち約３６０ｎｍ）以下とすることが望ましい。さらに、図４〜６に示すように、微粒子４ａの粒径が５０〜２００ｎｍの場合には、貴金属層５の膜厚の全範囲で１０，０００以上の蛍光信号強度を得ることができているが、図７に示すように、微粒子４ａの粒径が３００ｎｍの場合には、３，０００以下の蛍光信号強度しか得ることができない。これらのことから、微粒子４ａの粒径は、約５０〜２００ｎｍとすることがより好ましい。さらには、図４、５に示す微粒子４ａの粒径が５０〜１００ｎｍの場合と、図６に示す微粒子４ａの粒径が２００ｎｍの場合とでは、貴金属層５の膜厚の各範囲において約２倍又はそれ以上の蛍光信号強度の差異がある。これらのことから、微粒子４ａの粒径は、約５０〜１００ｎｍとすることが一層好ましい。なお、微粒子４ａの粒径を約２０ｎｍ〜５０ｎｍとした場合においても、同様の好適な効果を奏する可能性があるが、微粒子４ａの購入の容易性や粒径の均一性の面を考慮すると、５０〜１００ｎｍの粒径の微粒子４ａを用いることが好ましい。
【００３５】
次に、多孔質膜４の空孔率の好適な数値範囲について説明する。多孔質膜４を形成する微粒子４ａは、近接場光によって励起されるため、微粒子４ａ同士がある程度は相互に近接している方が好ましい。このため、従来の共鳴プラズモンでは、金属と生体分子が表面に近いほど効果が大きい。しかしながら、微粒子４ａ同士が近すぎる場合には、蛍光色素から金属表面へのエネルギーのトランスファーが生じて、蛍光信号強度が低下する。これらのことを考慮し、本願発明者は、近接場光による励起効果が高くかつエネルギーのトランスファーが小さい空孔率を、以下のように見出した（なお、空孔率は、例えば、面積０．０１μｍ２の領域に、直径１００ｎｍの微粒子を１個配置した場合には、空孔率＝（０．１×０．１−０．０５×０．０５×円周率）／０．０１×１００＝２１．５０％のように算定される）。
【００３６】
図９は、蛍光信号強度と蛍光色素の濃度との関係を様々な空孔率について示したものであり、（ａ）は実験結果を示す表、（ｂ）はグラフである。この図９（ｂ）において、縦軸は蛍光信号強度、横軸はＲＰＥの濃度、グラフ中の各プロットは、基板（基板２に多孔質膜を形成せずに、直接的に蛍光物質を吸着させた場合）、Ａ（空孔率＝６３．２％）、Ｂ（空孔率＝８１．１％）、Ｃ（空孔率＝９２．４％）、Ｄ（空孔率＝９６．５％）とした場合を示す。このグラフから明らかなように、蛍光信号強度は、高い順に、空孔率＝８１．１、６３．２、９２．４、９６．５、０％の場合である。このことから、空孔率は、約６０〜９７％であることが好ましく、さらに約８１．１％近辺（例えば７５〜８５％）とすることが一層好ましい。
【００３７】
（測定用チップ１の製造方法）
上記のように構成された測定用チップ１は、例えば、以下のような方法で製造することができる。まず、微粒子溶液に、ＥＤＣ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ］ ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）やＮａＣｌなどの塩を添加（０．５Ｍ以下、好ましくは１００ｍＭ以下）し、混合溶液を作製する。例えば、微粒子溶液１溶に対してＥＤＣ溶液２溶を加える。この混合溶液を、基板２の表面へ塗布する。この際、基板２をガラスやプラスチックにて形成した場合には、この基板２にベース層３を蒸着またはスパッタリングにより形成して、このベース層３の表面へ混合溶液を塗布する。あるいは、基板２をシリコン等の金属にて形成した場合には、ベース層３を形成することなく、この基板２の表面へ混合溶液を塗布する。そして、この基板２を数秒以上放置した後に蒸留水で洗浄して乾燥させ、この基板２の表面に単層高密度に微粒子４ａを吸着させる。その後、この微粒子４ａの上面に、蒸着またはスパッタリングにより貴金属層５を形成することで、測定用チップ１が完成する。このように基板２の表面に単層高密度に微粒子４ａを吸着させる具体的方法は任意であるが、例えば、下記文献に記載の方法で吸着させることができる。
エイチ タケイ（H．Ｔａｋｅｉ）著、「ナノサイズ金属球体を形成するためのテンプレートとしての表面吸収ポリスチレン球体：ナノサイズ金球体の光学特性（Sｕｒｆａｃｅ−ａｂｓｏｒｂｅｄ ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ ｓｐｈｅｒｅｓ ａｓ ａ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｆｏｒ ｎａｎｏｓｉｚｅｄ ｍｅｔａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ：Oｐｔｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｎａｎｏｓｉｚｅｄ Ａｕ ｐａｒｔｉｃｌｅ」、米国、Ｂ １７（５）号、真空科学技術（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖａｃｕｕｍ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１９９９年９月／１０月、Ｐ１９０６−１９１１
【００３８】
ここで、上述した好適な空孔率を有する多孔質膜４を形成するための具体的方法は任意であるが、例えば、上記EDC濃度を変えることによって、多孔質膜４を作製することができる。すなわち、微粒子４ａが、金またはシリコンを含むベース層３には結合するが、他の微粒子４ａには結合しないように、EDC濃度を決定する。一方、多孔質膜４を、平滑状の膜体に多数の孔を穿設することで形成する場合には、例えば、公知の方法で形成した膜体に、ナノインプリンティング（ホットエンボス法）により多数の孔をあけることができる。あるいは、膜体上に、孔を設けた下記溶媒耐性の膜を設置し、その上からHNO3(dil or conc)、 HClO4(dil or conc)、H2SO4(conc)、HCl(conc)+HNO3(conc)等の溶媒で処理することによって、露出している銀膜体を溶解して多数の孔を設けてもよい。
【００３９】
（測定用チップ１の使用方法）
このように製造された測定用チップ１は、従来と同様の方法により、蛍光測定法に使用される。図１０は、本実施の形態１に係る測定用チップ１を用いた蛍光測定法を概念的に示す図であり、（ａ）は測定用チップ１に抗体を配置した状態、（ｂ）はサンドイッチ結合を構成した状態を示す。まず、図１０（ａ）に示すように、測定用チップ１の貴金属層５に抗体１０を配置する。そして、図１０（ｂ）に示すように、測定用チップ１の表面に試料を加えることにより、この試料に含まれる測定対象物質１１を抗体１０によって補足させ、さらに蛍光色素１２で標識した抗体１３を加えることにより、抗体１０、１３の間に測定対象物質１１を結合させたサンドイッチ結合を構成する。その後、従来と同様に、未結合の試料や抗体１３の洗浄後、励起光を照射して蛍光色素１２から蛍光を発生させ、この蛍光の蛍光強度を蛍光スキャナーや蛍光顕微鏡等（好ましくは共焦点スキャナーや共焦点顕微鏡等のニアフィールドの測定が可能なもの）を用いて測定することで、測定対象物質１１を定量等できる。この測定用チップ１では、励起波長による特異性は認められず、また、あらゆる蛍光タンパク質や蛍光物質の利用が可能である。なお、本明細書中において「観察する」とは、共焦点顕微鏡等で観察する意味の他、蛍光強度を測定するという意味を含む。
【００４０】
ここでは、抗体１３を用いているが、測定対象物質に特異的に結合し得る物質であればよく、例えば、抗体１３や抗原以外に、レセプター、DNA、又は、ペプチド等を用いることができる。また、特許請求の範囲における、「測定対象物質に特異的に結合する結合物質」と「蛍光色素で標識した結合物質」とは、同一の結合物質や異なった結合物質のいずれでもよく、あるいは、同一のクラスやサブクラスであってもよい。また、「蛍光色素で標識した結合物質」としては、１種類の物質でもよく、あるいは、複数種類の物質を用いてもよい。さらに、結合物質として抗体を用いる場合には、互いに異なる抗原決定基で結合するものが好ましい。なお、このように用いられる抗原および抗体は、従来公知の方法で得ることができる。
【００４１】
また、本実施の形態で測定され得る「測定対象物」としては、例えば、抗原または抗体が挙げられる。更に具体的には、タンパク質、少なくとも４個のアミノ酸からなるペプチド、ハプテン、核酸、ヌクレオチド、ホルモン、オリゴ糖、多糖、天然または合成薬剤、これらの誘導体または複合体、若しくはこれらに対する抗体等を挙げることができる。さらに、細胞等をチップ上に配置し、細胞膜上にあるタンパク質（レセプター等）を測定対象物としてもよい。ここで、測定対象物質は、測定対象物質に別々に結合できるよう、二種類以上の抗原決定基を持つものが好ましい。
【００４２】
また、蛍光タンパク質（ＲＰＥ等）や蛍光物質（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標：モルキュラープローブス社製）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、フルオレセイン、ローダミン、ウンベリフェロン、フィコエリスリン等）を、測定用チップ１に、直接的に作用させることもできる。この場合は、測定用チップ１と対照基板（プラスチック製やガラス製のスライド、例えばＮｕｎｃ社製のマイクロアレイスライド）を用意し、測定用チップ１と対照基板のそれぞれの表面へＲＰＥ溶液（例えば、０、０．４、２ｐｇ／ｍｌ）を１０μｌを塗布し、室温で３０分以上反応させる。その後、これら測定用チップ１と対照基板とを洗浄し、１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン：Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）を含む緩衝液でブロッキング（室温で３０分以上反応）を行い、更に洗浄乾燥させ、共焦点蛍光スキャナー（例えば、パーキンエルマー社製のＳｃａｎＡｒｒａｙ Ｌｉｔｅ）にて測定する（例えば、励起波長６３３ｎｍ、レーザーパワー８０％、ＰＭＴ Ｇａｉｎ ８０％）。（なお、ＢＳＡによるブロッキングについては実施の形態２において詳述する）。
【００４３】
あるいは、抗体、タンパク質、又は、ＤＮＡ等へ蛍光物質を標識することにより、測定用チップ１に、蛍光タンパク質や蛍光物質を、間接的に作用させることもできる。この場合は、上記と同様に測定用チップ１と対照基板を用意し、測定用チップ１と対照基板のそれぞれの表面へ抗ＩＬ−６抗体溶液（６μｇ／ｍｌ）を１μｌ、室温で１時間反応させる。その後、これら測定用チップ１と対照基板とを洗浄し、１％ＢＳＡを含む緩衝液でブロッキング（室温で３０分以上反応）を行い、更に洗浄した後、ｒＩＬ−６溶液（例えば、０、０．８、４、２０、１００、５００、２５００ｐｇ／ｍｌ）を１μｌ、室温で１時間反応させる。その後、これら測定用チップ１と対照基板とを再び洗浄し、ＲＰＥ標識抗ＩＬ−６抗体溶液（１μｇ／ｍｌ）を１μｌ、室温で３０分反応させる。最後に、これら測定用チップ１と対照基板とを洗浄乾燥し、蛍光スキャナーにて測定する（例えば、励起波長５４３ｎｍ、レーザーパワー８０％、ＰＭＴ Ｇａｉｎ ８０％）。
【００４４】
また、当該使用方法において、直接的又は間接的に作用させる蛍光物質は特に限定されない。具体的には、上述した蛍光タンパク質（ＲＰＥ等）や蛍光物質（Ａｌｅｘａ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、フルオレセイン、ローダミン、ウンベリフェロン、フィコエリスリン等）が挙げられる。このように蛍光物質等で抗体等を標識する方法としては、蛍光物質等と抗体等を共有結合または非共有結合を介して結合させる従来公知の方法を挙げることができる。さらに、共有結合を介して結合させる方法としては、例えば、グルタールアルデヒド法、過ヨウ素酸法、マレイミド法、ピリジル・ジスルフィド法、従来公知の各種架橋剤を用いる方法等を挙げることができる（例えば、「蛋白質核酸酵素」別冊３１号、３７〜４５頁（１９８５）参照）。また、蛍光物質と抗体とを、ウシアルブミンなどのタンパク質やナノ微粒子等を介して結合させても良い。また、非共有結合を介して結合させる方法としては、例えば、物理的吸着法を挙げることができる。すなわち、蛍光物質等と抗体等との間で生じるファンデルワールス力、疎水結合等の分子間引力によって、これらを結合させる。このような非共有結合は、従来公知の方法に従って形成させればよい。さらに、貴金属層へ結合物質を配置させる方法としては、例えば従来公知の物理的吸着法等が挙げられる。この他、金同様に銀表面をチオール化したり、酸化銀に修飾したりして貴金属層に結合物質を配置することもできる。
【００４５】
（実施の形態１に係る測定用チップ１の効果）
次いで、実施の形態１に係る測定用チップ１の効果を、従来の測定用チップとの対比により説明する。図１１は、実施の形態１に係る測定用チップ１と従来の測定用チップ（対照用チップ）との効果を示すもので、（ａ）は実験結果を示す表、（ｂ）はグラフである。この図１１（ｂ）において、縦軸は蛍光信号強度、横軸はｒＩＬ−６の濃度を示す。ここでは、対照用チップとして、基板に直接的に抗体を配置したものを用いている。この図１１から明らかなように、本実施の形態の測定用チップ１は、対照用チップに比べて、ｒＩＬ−６のいずれの濃度においても、蛍光信号強度及びＳ／Ｎ比において優れており、例えば、ｒＩＬ−６濃度が２，５００（ｐｇ／ｍｌ）の場合では、蛍光信号強度が約８．７倍（＝４７，０５１／５，４１０）、Ｓ／Ｎ比が約１．３倍（＝２０．１／１５．７）であり、極めて高強度の蛍光信号を取得可能であることがわかる。
【００４６】
また、図１２は、物理吸着による蛍光信号の増強試験の結果を示すもので、（ａ）は実験結果を示すグラフ、（ｂ）は（ａ）の実験で用いた各チップの構造を模式的に示す図である。この図１２（ａ）において、縦軸は蛍光色素ＲＰＥの濃度を示し、横軸は蛍光信号強度を示す。ここでは、測定用チップとして、構造が異なる５種類のチップを用いており、図１２（ｂ）に示すように、チップＡは基板に直接的に蛍光色素を物理吸着させたもの、チップＢは基板に金製のベース層を形成してその上に蛍光色素を吸着させたもの、チップＣは基板に銀製のベース層を形成してその上に蛍光色素を吸着させたもの、チップＤは基板に金製のベース層を形成してその上に配置した微粒子４ａに蛍光色素を吸着させたもの、及び、チップＥは基板２に金製のベース層３を形成してその上に配置した微粒子４ａに蛍光色素を吸着させたもの（本実施の形態１に係る測定用チップ１）である。この図１２（ａ）から明らかなように、本実施の形態１に係る測定用チップ１（チップＥ）を用いた場合には、他の構造の測定用チップＡ〜Ｄを用いた場合に比べて、蛍光色素の濃度をＢａｒｅから１０，０００（ｐｇ／ｍｌ）に変化させた場合のいずれにおいても、強い蛍光信号強度が得られている。特に、蛍光色素の濃度が２，０００や１０，０００（ｐｇ／ｍｌ）の場合には、蛍光信号強度に顕著な差異が見られる。このことから、実施の形態に係る測定用チップ１を用いることで、幅広い蛍光色素の濃度において、蛍光信号の増強率を大きく高めることができることが分る。
【００４７】
さらに、図１３には、蛍光信号の強度及びＳ／Ｎ比の実証試験の結果の表を示す。ここでは、対照用チップとして、基板に直接的に蛍光色素を物理吸着させたものを用いている。この図１３から明らかなように、本実施の形態に係る測定用チップ１を用いた場合には、他の対照用チップを用いた場合に対して、蛍光信号強度が約５６．５倍（＝６５，３３５／１，１６１）、Ｓ／Ｎ比が約４３．７倍（＝４９３．８／１１．３）であり、蛍光信号の増強率及びＳ／Ｎ比を大きく高めることができることが分る。
【００４８】
〔実施の形態２〕
次に、本発明に係る実施の形態２の具体的内容について説明する。この実施の形態２は、実施の形態１と同様に構成した測定用チップ１の使用方法に主たる特徴を有するものであり、測定用チップ１をＢＳＡ溶液等と反応させることで、自家蛍光やクエンチングを抑制可能とした形態である。なお、実施の形態２の構成は特記する場合を除いて実施の形態１の構成と略同一であり、実施の形態１の構成と略同一の構成についてはこの実施の形態１で用いたのと同一の符号を必要に応じて付して、その説明を省略する。
【００４９】
この実施の形態２では、測定用チップ１を試料と反応させた後、さらにＢＳＡ溶液等と反応させることで、自家蛍光を抑制して、蛍光強度測定におけるＳ／Ｎ比を高め、また同時に、クエンチングを抑制して、明るい蛍光色素に対しても表面増強効果を得ることを可能としている。
【００５０】
図１４は、反応溶液による蛍光信号強度とＳ／Ｎ比との変化を示す表である。ここでは、実施の形態１と同様に構成した測定用チップ１に対して、１０μｌＰＲＥ（０．１Ｍ Ｃｉｔｒａｔｅ緩衝液ｐＨ３．５）を室温で１時間反応させた後、ＰＢ−Ｔ（０．２Ｍりん酸緩衝液０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１０、ｐＨ６．８）で洗浄した、次に、各１％溶液（ＢＳＡ、スキムミルク、カゼインからなる群より選ばれる少なくとも一種）を室温で３０分反応させ、洗浄乾燥させ、共焦点蛍光スキャナー（ＳｃａｎＡｒｒａｙ Ｅｘｐｒｅｓｓ；パーキンエルマー）にて測定（励起波長５４３ｎｍ、レーザーパワー４０％、ＰＭＴ Ｇａｉｎ ８０％）した。ここでは、ｌＰＲＥの濃度を、基板、０、８０、４００、２，０００（ｎｇ／ｍｌ）の４種とし、また同時に、対照のため、ＢＳＡ溶液等を用いない場合（蛍光色素のみの場合）についても測定を行った。
【００５１】
この結果、図１４から明らかなように、ＲＰＥ濃度が８０（ｎｇ／ｍｌ）以上の全範囲において、蛍光色素のみの場合に比べて、ＢＳＡ、スキムミルク、又は、カゼインを用いた場合の方が、蛍光信号強度とＳ／Ｎ比の両面において優れており、両者の間に顕著な差が見られることがわかる。例えば、ＲＰＥ濃度２，０００（ｎｇ／ｍｌ）の場合において、蛍光色素のみの場合とＢＳＡを用いた場合とを比較すると、蛍光信号強度が約１．６倍（＝３０，２９０／１８，７０２）、Ｓ／Ｎ比が約２．３倍（＝７４．９／３２．１）になる。なお、このように自家発光やクエンチングの抑制効果を得るためには、ＢＳＡ、スキムミルク、又は、カゼイン以外にも、任意のタンパク質を用いることができる。また、図１４の試験では、ＢＳＡ、スキムミルク、又は、カゼインの１％溶液を用いたが、当該溶液の濃度は０．１％以上１０％以下の濃度であることが好ましく、この範囲であれば適宜変更して用いることができる。これは、溶液濃度が、０．１％未満だと効果が認められ難く、その一方、１０％を超えると溶け難いために処理しにくくなるためである。
【００５２】
（実施の形態２の効果）
このように実施の形態２によれば、実施の形態１と略同様の効果を得ることができると共に、自家蛍光を抑制して、蛍光強度測定におけるＳ／Ｎ比を高めることができる。また同時に、クエンチングを抑制して、明るい蛍光色素に対しても表面増強効果を得ることができる。
【００５３】
〔実施の形態３〕
次に、本発明に係る実施の形態３の具体的内容について説明する。この実施の形態３は、実施の形態１と同様に構成した測定用チップに、さらに陰イオンを設けた形態である。なお、実施の形態３の構成は特記する場合を除いて実施の形態１の構成と略同一であり、実施の形態１の構成と略同一の構成についてはこの実施の形態１で用いたのと同一の符号を必要に応じて付して、その説明を省略する。
【００５４】
（測定用チップの構成）
まず、実施の形態３に係る測定用チップ６の構成について概説する。図１５は、実施の形態３に係る測定用チップの部分拡大側面図である。この測定用チップ６は、貴金属層５の上に、さらに陰イオン（アニオン）７を設けて構成されている。この陰イオンは、具体的にはハロゲン（ハロゲンイオン：Ｃｌ−）であり、例えば測定用チップを実施の形態１と同様に形成し、試料を反応させた後、所定濃度のＮａＣｌを所定時間反応させることにより、配置することができる。ここで、「配置する」とは、陰イオンを基板と反応させることをいう。このように陰イオンを基板と反応させることにより、銀表面がマイナスに帯電する等の効果を得ることができる。
【００５５】
図１６は、ハロゲンイオンの有無による蛍光信号強度とＳ／Ｎ比との変化を示す図であり、（ａ）は実験結果を示す表、（ｂ）はグラフである。この図１６（ｂ）において、縦軸は蛍光信号強度、横軸はｒＩＬ−６の濃度、グラフ中の各プロットは、対照用の従来の測定用チップ、実施の形態１に係る測定用チップ１、ハロゲンイオンを配置した測定用チップ（本実施の形態３に係る測定用チップ６）を示す。ここでは、各測定用チップに、１０μｌの抗ＩＬ−６抗体（固相用；６μｇ／ｍｌ、０．１Ｍ Ｃｉｔｒａｔｅ緩衝液ｐＨ３．５）を室温で１時間反応させた後、ＰＢ−Ｔ（０．１Ｍりん酸緩衝液０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１０、ｐＨ６．８）で洗浄した。その後、測定用チップに、１ｍＭのＮａＣｌを室温で１５分反応させ、洗浄後ＢＳＡ（１％ＢＳＡ−ＰＢ−Ｔ）室温で３０分反応させ、再び洗浄した後にｒＩＬ−６（０，４，２０，１００，５００，２，５００ｐｇ／ｍｌ）溶液を１０μｌ、室温で１時間反応させる。次いで、測定用チップを洗浄後、この測定用チップに、ＲＰＥ標識抗ＩＬ−６抗体溶液（１μｇ／ｍｌ）を１０μｌ、室温で３０分反応させる。最後に、測定用チップを洗浄乾燥させ、この測定用チップを、共焦点蛍光スキャナー（ＳｃａｎＡｒｒａｙ Ｅｘｐｒｅｓｓ；パーキンエルマー）にて測定（励起波長５４３ｎｍ、レーザーパワー４０％、ＰＭＴ Ｇａｉｎ ８０％）した。
【００５６】
この結果、図１６から明らかなように、ｒＩＬ−６濃度が１００（ｐｇ／ｍｌ）以上の全範囲において、対照用の従来の測定用チップ、実施の形態１に係る測定用チップ１、本実施の形態３に係る測定用チップ６の順で、蛍光信号強度とＳ／Ｎ比が改善されていることがわかる。特に、実施の形態１に係る測定用チップ１と本実施の形態３に係る測定用チップ６とを比較すると、例えば、ｒＩＬ−６濃度が２，５００（ｐｇ／ｍｌ）の場合では、蛍光信号強度が約２．０倍（＝３１，４７６／１５，５３２）、Ｓ／Ｎ比が約２．０倍（＝７４．９／３８．０）になる。なお、陰イオンを構成する材質として、ハロゲンイオン以外に、ＳＯ４２−、ＮＯ３−、又は、ＣＯ３２−を用いても同様の改善が見られることが判明したが、ハロゲンイオンが最も優れた改善効果を得られる。
【００５７】
例えば、図１７は、蛍光信号の増強試験の結果を示すもので、（ａ）は実験結果を示す表、（ｂ）はグラフである。この図１７（ｂ）において、縦軸は蛍光色素ＲＰＥの濃度を示し、横軸は蛍光信号強度を示す。ここでは、測定用チップとして、ｂｕｆｆｅｒを用いた対照用チップ、ハロゲンイオン（Ｃｌ−）を用いたチップ、及び、ＳＯ４２−を用いたチップを使用している。この図１７から明らかなように、Ｃｌ−やＳＯ４２−の如き陰イオンを用いたチップは、対照用チップに比べて、蛍光信号強度とＳ／Ｎ比が改善されていることがわかる。特に、ハロゲンイオン（Ｃｌ−）を用いたチップは、蛍光信号強度とＳ／Ｎ比との改善効果が顕著であり、ハロゲンイオンが最も優れた改善効果を得られることが判る。このことから、陰イオン、特にハロゲンイオンにより、微粒子間に適切な間隔が設けられている可能性があり、このことが蛍光信号強度とＳ／Ｎ比との改善効果に寄与している可能性がある。
【００５８】
（実施の形態３の効果）
このように実施の形態３によれば、実施の形態１と略同様の効果を得ることができると共に、陰イオンを設けることで、蛍光信号強度を一層改善することができ、さらに高感度な蛍光測定を行うことが可能になる。
【００５９】
〔III〕各実施の形態に対する変形例
以上、各実施の形態について説明したが、本発明の具体的な構成及び方法は、特許請求の範囲に記載した各発明の技術的思想の範囲内において、任意に改変及び改良することができる。以下、このような変形例について説明する。
【００６０】
（解決しようとする課題や発明の効果について）
まず、発明が解決しようとする課題や発明の効果は、前記した内容に限定されるものではなく、本発明によって、前記に記載されていない課題を解決したり、前記に記載されていない効果を奏することもでき、また、記載されている課題の一部のみを解決したり、記載されている効果の一部のみを奏することがある。例えば、表面増強効果の増強率が従来と同様の場合であっても、従来と同様の効果を従来と異なる手段にて達成することにより、本願の課題が解決されている。
【００６１】
（構成、製造方法、又は、使用方法について）
前記文書中や図面中で示した各測定用チップの構成、製造方法、又は、使用方法は、あくまで例示であり、特記する場合を除いて任意に変更することができる。
【００６２】
（共鳴効果）
また、本発明では、微粒子４ａの大きさや厚さを変えることで基板２の吸収スペクトルを変え、この基板２の吸収スペクトルと、蛍光ラベルの吸収スペクトルとを相互に合致させることで、これら両スペクトルを相互に共鳴させ、いわゆる共鳴効果を得ることができる。この共鳴効果により、蛍光信号強度を一層増幅させ、測定感度を高めることができる。
【００６３】
（近接場の増強、クエンチングの抑制）
また、本発明では、微粒子４ａの相互間に適切な間隔（ギャップ）を設けることで、近接場の増強と、クエンチングの抑制とを図ることができる。
【００６４】
（付記）
最後に、上記各実施の形態における特徴の一部の要部とその効果を、以下に付記として示す。
【００６５】
（付記１）
基板と、
前記基板の少なくとも一側面に配置した多孔質膜と、
前記多孔質膜における前記基板と反対側の面に配置した、少なくとも銀を含有する貴金属層と、
を備えたことを特徴とする。
【００６６】
（付記１の効果）
この付記１によれば、表面増強効果を増大させることにより蛍光信号強度を向上させることができ、従来の増強率より一桁以上高い数十倍の蛍光信号強度を得ることができる。また、量子収率の高い蛍光物質（明るい蛍光物質）においても、従来より数十倍以上高い蛍光信号強度を得ることができるので、明るい蛍光物質の実用性を向上させることができる。さらに、弱励起光でも高い蛍光信号の増強効果を発揮することから、自家蛍光を抑制でき、蛍光信号のＳ／Ｎ比を向上させることができる。さらにまた、当該測定用チップは、基板上からの蛍光信号を検出する分析方法（プレートアッセイ、バイオチップ、ＤＮＡチップ等、ナノセンサー）のほぼ全てに適用でき、各分析方法における感度向上を図ることができる。
【００６７】
（付記２）
前記貴金属層に配置した、測定対象物質に特異的に結合する結合物質、
を備えたことを特徴とする付記１に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【００６８】
（付記２の効果）
この付記２によれば、結合物質を配置することで、ユーザは自ら結合物質を配置することなく、簡易かつ迅速に蛍光測定を行うことができる。
【００６９】
（付記３）
前記結合物質が、抗原または抗体であること、
を特徴とする付記２に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【００７０】
（付記３の効果）
この付記３によれば、抗原または抗体を結合物質として用いて、付記２の効果を得ることができる。
【００７１】
（付記４）
前記貴金属層の膜厚が、約５〜２０ｎｍであること、
を特徴とする付記１から３のいずれか一項に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【００７２】
（付記４の効果）
この付記４によれば、貴金属層の膜厚を好適な範囲とすることで、蛍光信号強度を一層高めることができる。
【００７３】
（付記５）
前記貴金属層の膜厚が、約１０〜１５ｎｍであること、
を特徴とする付記４に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【００７４】
（付記５の効果）
この付記５によれば、貴金属層の膜厚を一層好適な範囲とすることで、蛍光信号強度をより一層高めることができる。
【００７５】
（付記６）
前記多孔質膜を、平坦上の膜体に複数の孔部を穿設することにより形成したこと、
を特徴とする付記１から５のいずれか一項に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【００７６】
（付記６の効果）
この付記６によれば、膜体に孔部を穿設することで多孔質膜を形成したので、微粒子を形成することが不要になり、多孔質膜を容易に形成できる。
【００７７】
（付記７）
前記多孔質膜を、複数の微粒子から形成したこと、
を特徴とする付記１から５のいずれか一項に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【００７８】
（付記７の効果）
この付記７によれば、微粒子を用いて多孔質膜を形成したので、各微粒子の粒径や空孔率を制御することで、所望の構造の多孔質膜を容易に形成できる。
【００７９】
（付記８）
前記微粒子の粒径が、約３６０ｎｍ以下であること、
を特徴とする付記７に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【００８０】
（付記８の効果）
この付記８によれば、微粒子の粒径を好適な範囲とすることで、蛍光信号強度を一層高めることができる。
【００８１】
（付記９）
前記微粒子の粒径が、約５０〜２００ｎｍであること、
を特徴とする付記８に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【００８２】
（付記９の効果）
この付記９によれば、微粒子の粒径を一層好適な範囲とすることで、蛍光信号強度をより一層高めることができる。
【００８３】
（付記１０）
前記微粒子の粒径が、約５０〜１００ｎｍであること、
を特徴とする付記９に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【００８４】
（付記１０の効果）
この付記１０によれば、微粒子の粒径をさらに一層好適な範囲とすることで、蛍光信号強度をより一層高めることができる。
【００８５】
（付記１１）
前記多孔質膜の空孔率が、約６０〜９７％であること、
を特徴とする付記１から１０のいずれか一項に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【００８６】
（付記１１の効果）
この付記１１によれば、多孔質膜の空孔率を好適な範囲とすることで、蛍光信号強度を一層高めることができる。
【００８７】
（付記１２）
前記多孔質膜の空孔率が、約７５〜８５％であること、
を特徴とする付記１１に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【００８８】
（付記１２効果）
この付記１２によれば、多孔質膜の空孔率を一層好適な範囲とすることで、蛍光信号強度をより一層高めることができる。
【００８９】
（付記１３）
前記基板と前記多孔質膜との相互間に配置した、少なくとも金またはシリコンを含有するベース層、
を備えたことを特徴とする付記１から１２のいずれか一項に記載の特徴とする蛍光測定のための測定用チップ。
【００９０】
（付記１３の効果）
この付記１３によれば、金を含有するベース層を備えることで、多孔質膜（特に微粒子にて形成した多孔質膜）を容易かつ確実に基板上に配置することができる。
【００９１】
（付記１４）
前記基板、前記多孔質膜、及び、前記貴金属層を配置した後、当該測定用チップを、ＢＳＡ、スキムミルク、カゼインからなる群より選ばれる少なくとも一種と反応させたこと、
を特徴とする付記１から１３のいずれか一項に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【００９２】
（付記１４の効果）
この付記１４によれば、測定用チップをＢＳＡ等と反応させることで、自家蛍光を抑制して、蛍光強度測定におけるＳ／Ｎ比を高めることができる。また同時に、クエンチングを抑制して、明るい蛍光色素に対しても表面増強効果を得ることができる。
【００９３】
（付記１５）
前記貴金属層における前記基板と反対側の面に配置した陰イオン、
を備えることを特徴とする付記１から１４のいずれか一項に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【００９４】
（付記１５の効果）
この付記１５によれば、貴金属層に陰イオンを配置することで、蛍光信号強度を一層改善することができ、さらに高感度な蛍光測定を行うことが可能になる。
【００９５】
（付記１６）
前記陰イオンが、ハロゲンイオンであること、
を特徴とする付記１５に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【００９６】
（付記１６の効果）
この付記１６によれば、陰イオンとしてハロゲンイオンを用いることで、蛍光信号強度を一層改善することができ、さらに高感度な蛍光測定を行うことが可能になる。
【００９７】
（付記１７）
基板を準備する工程と、
前記基板の少なくとも一側面に多孔質膜を配置する工程と、
前記多孔質膜における前記基板と反対側の面に、少なくとも銀を含有する貴金属層を配置する工程と、
を含んだことを特徴とする蛍光測定のための測定用チップの製造方法。
【００９８】
（付記１７の効果）
この付記１７によれば、この製造方法にて製造した測定用チップを用いることで、表面増強効果を増大させることにより蛍光信号強度を向上させることができ、従来の増強率より一桁以上高い数十倍の蛍光信号強度を得ることができる。また、量子収率の高い蛍光物質（明るい蛍光物質）においても、従来より数十倍以上高い蛍光信号強度を得ることができるので、明るい蛍光物質の実用性を向上させることができる。さらに、弱励起光でも高い蛍光信号の増強効果を発揮することから、自家蛍光を抑制でき、蛍光信号のＳ／Ｎ比を向上させることができる。さらにまた、当該測定用チップは、基板上からの蛍光信号を検出する分析方法（バイオチップ、ＤＮＡチップ等、ナノセンサー）のほぼ全てに適用でき、各分析方法における感度向上を図ることができる。
【００９９】
（付記１８）
前記貴金属層に、測定対象物質に特異的に結合する結合物質を配置する工程、
を含むことを特徴とする付記１７に記載の測定用チップの製造方法。
【０１００】
（付記１８の効果）
この付記１８によれば、結合物質を配置することで、ユーザは自ら結合物質を配置することなく、簡易かつ迅速に蛍光測定を行うことができる。
【０１０１】
（付記１９）
前記結合物質が、抗原または抗体であること、
を特徴とする付記１８に記載の測定用チップの製造方法。
【０１０２】
（付記１９の効果）
この付記１９によれば、抗原または抗体を結合物質として用いて、付記１８の効果を得ることができる。
【０１０３】
（付記２０）
前記基板を準備する工程の後、前記基板の少なくとも一側面に、少なくとも金を含有するベース層を配置する工程を含み、当該ベース層に前記多孔質膜を配置したこと、
を特徴とする付記１７から１９のいずれか一項に記載の測定用チップの製造方法。
【０１０４】
（付記２０の効果）
この付記２０によれば、金を含有するベース層を備えることで、多孔質膜（特に微粒子にて形成した多孔質膜）を容易かつ確実に基板上に配置することができる。
【０１０５】
（付記２１）
前記貴金属層を配置する工程の後、当該測定用チップを、ＢＳＡ、スキムミルク、カゼインからなる群より選ばれる少なくとも一種と反応させる工程、
を含むことを特徴とする付記１７から２０のいずれか一項に記載の測定用チップの製造方法。
【０１０６】
（付記２１の効果）
この付記２１によれば、測定用チップをＢＳＡ等と反応させることで、自家蛍光を抑制して、蛍光強度測定におけるＳ／Ｎ比を高めることができる。また同時に、クエンチングを抑制して、明るい蛍光色素に対しても表面増強効果を得ることができる。
【０１０７】
（付記２２）
前記貴金属層における前記基板と反対側の面に、陰イオンを配置する工程、
を含むことを特徴とする付記１７から２１のいずれか一項に記載の測定用チップの製造方法。
【０１０８】
（付記２２の効果）
この付記２２によれば、貴金属層に陰イオンを配置することで、蛍光信号強度を一層改善することができ、さらに高感度な蛍光測定を行うことが可能になる。
【０１０９】
（付記２３）
基板に多孔質膜を配置した後、前記多孔質膜における前記基板と反対側の面に、少なくとも銀を含有する貴金属層を配置することにより、測定用チップを製造する工程と、
前記測定用チップの前記貴金属層に、測定対象物質に特異的に結合する結合物質を配置する工程と、
前記測定用チップの前記結合物質に測定対象物質を結合させる工程と、
前記測定用チップの前記結合物質に結合させた測定対象物質に、蛍光色素で標識した結合物質を結合させる工程と、
前記蛍光色素を観察する工程と、
を含むことを特徴とする蛍光測定法。
【０１１０】
（付記２３の効果）
この付記２３によれば、表面増強効果を増大させることにより蛍光信号強度を向上させることができ、従来の増強率より一桁以上高い数十倍の蛍光信号強度を得ることができる。また、量子収率の高い蛍光物質（明るい蛍光物質）においても、従来より数十倍以上高い蛍光信号強度を得ることができるので、明るい蛍光物質の実用性を向上させることができる。さらに、弱励起光でも高い蛍光信号の増強効果を発揮することから、自家蛍光を抑制でき、蛍光信号のＳ／Ｎ比を向上させることができる。さらにまた、当該測定用チップは、基板上からの蛍光信号を検出する分析方法（プレートアッセイ、バイオチップ、ＤＮＡチップ等、ナノセンサー）のほぼ全てに適用でき、各分析方法における感度向上を図ることができる。
【０１１１】
（付記２４）
基板に多孔質膜を配置した後、前記多孔質膜における前記基板と反対側の面に、少なくとも銀を含有する貴金属層を配置することにより、測定用チップを製造する工程と、
前記測定用チップの前記貴金属層に、測定対象物質を配置する工程と、
前記測定用チップの前記測定対象物質に特異的に結合する結合物質であって、蛍光色素で標識した結合物質を、前記測定対象物質に結合させる工程と、
前記蛍光色素を観察する工程と、
を含むことを特徴とする蛍光測定法。
【０１１２】
（付記２４の効果）
この付記２４によれば、測定対象物が不明なサンプル（細胞を含み得る）を先に測定用チップへ結合又は接近させておき、このサンプルに含まれる測定対象物を、数種類の蛍光標識した結合物質（例えば抗体）で検出する場合においても、付記２３と同様の効果を得ることができる。
【０１１３】
（付記２５）
前記結合物質が、抗原または抗体であること、
を特徴とする請求項２３又は２４に記載の蛍光測定法。
【０１１４】
（付記２５の効果）
この付記２５によれば、抗原または抗体を結合物質として用いて、付記２３又は２４の効果を得ることができる。
【０１１５】
（付記２６）
前記測定用チップを製造する工程と前記蛍光色素を観察する工程との相互間に、前記測定用チップを、ＢＳＡ、スキムミルク、又は、カゼインからなる群より選ばれる少なくとも一種と反応させる工程、
を含むことを特徴とする請求項２３から２５のいずれか一項に記載の蛍光測定法。
【０１１６】
（付記２６の効果）
この付記２６によれば、測定用チップをＢＳＡ等と反応させることで、自家蛍光を抑制して、蛍光強度測定におけるＳ／Ｎ比を高めることができる。また同時に、クエンチングを抑制して、明るい蛍光色素に対しても表面増強効果を得ることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
以上のように、本発明に係る蛍光測定法と測定用チップ及びその製造方法は、試料中の測定対象物質の定量等を行うことに有用であり、特に、蛍光信号強度やＳ／Ｎ比を改善して、高感度な測定を行うことに適している。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】本発明の実施の形態１に係る測定用チップの部分拡大斜視図である。
【図２】実施の形態１に係る測定用チップの部分拡大側面図である。
【図３】貴金属層の材質の違いによる蛍光信号強度の変化を示すグラフである。
【図４】蛍光信号強度と貴金属層の膜厚との相互関係を示すグラフであり、微粒子の粒径を５０ｎｍとした場合のグラフである。
【図５】蛍光信号強度と貴金属層の膜厚との相互関係を示すグラフであり、微粒子の粒径を１００ｎｍとした場合のグラフである。
【図６】蛍光信号強度と貴金属層の膜厚との相互関係を示すグラフであり、微粒子の粒径を２００ｎｍとした場合のグラフである。
【図７】蛍光信号強度と貴金属層の膜厚との相互関係を示すグラフであり、微粒子の粒径を３００ｎｍとした場合のグラフである。
【図８】蛍光信号強度と貴金属層の膜厚との相互関係を示すグラフであり、微粒子の粒径を５００ｎｍとした場合のグラフである。
【図９】蛍光信号強度と蛍光色素の濃度との関係を様々な空孔率について示したものであり、（ａ）は実験結果を示す表、（ｂ）はグラフである。
【図１０】実施の形態１に係る測定用チップを用いた蛍光測定法を概念的に示す図であり、（ａ）は測定用チップに抗体を配置した状態、（ｂ）はサンドイッチ結合を構成した状態を示す。
【図１１】実施の形態１に係る測定用チップと対照用チップとの効果を示すもので、（ａ）は実験結果を示す表、（ｂ）はグラフである。
【図１２】物理吸着による蛍光信号の増強試験の結果を示すもので、（ａ）は実験結果を示すグラフ、（ｂ）は（ａ）の実験に用いた各チップの構造を模式的に示す図である。
【図１３】蛍光信号の強度及びＳ／Ｎ比の実証試験の結果を示す表である。
【図１４】実施の形態２に係る、反応溶液による蛍光信号強度とＳ／Ｎ比との変化を示す表である。
【図１５】実施の形態３に係る測定用チップの部分拡大側面図である。
【図１６】ハロゲンイオンの有無による蛍光信号強度とＳ／Ｎ比との変化を示す図であり、（ａ）は実験結果を示す表、（ｂ）はグラフである。
【図１７】蛍光信号の増強試験の結果を示すもので、（ａ）は実験結果を示す表、（ｂ）はグラフである。
【符号の説明】
【０１１９】
１、６ 測定用チップ
２ 基板
３ ベース層
４ 多孔質膜
５ 貴金属層
７ 陰イオン
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と、
前記基板の少なくとも一側面に配置した多孔質膜と、
前記多孔質膜における前記基板と反対側の面に配置した、少なくとも銀を含有する貴金属層と、
を備えたことを特徴とする蛍光測定のための測定用チップ。
【請求項２】
前記貴金属層に配置した、測定対象物質に特異的に結合する結合物質、
を備えたことを特徴とする請求項１に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【請求項３】
前記結合物質が、抗原または抗体であること、
を特徴とする請求項２に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【請求項４】
前記貴金属層の膜厚が、約５〜２０ｎｍであること、
を特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【請求項５】
前記貴金属層の膜厚が、約１０〜１５ｎｍであること、
を特徴とする請求項４に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【請求項６】
前記多孔質膜を、平坦上の膜体に複数の孔部を穿設することにより形成したこと、
を特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【請求項７】
前記多孔質膜を、複数の微粒子から形成したこと、
を特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【請求項８】
前記微粒子の粒径が、約３６０ｎｍ以下であること、
を特徴とする請求項７に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【請求項９】
前記微粒子の粒径が、約５０〜２００ｎｍであること、
を特徴とする請求項８に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【請求項１０】
前記微粒子の粒径が、約５０〜１００ｎｍであること、
を特徴とする請求項９に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【請求項１１】
前記多孔質膜の空孔率が、約６０〜９７％であること、
を特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【請求項１２】
前記多孔質膜の空孔率が、約７５〜８５％であること、
を特徴とする請求項１１に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【請求項１３】
前記基板と前記多孔質膜との相互間に配置した、少なくとも金またはシリコンを含有するベース層、
を備えたことを特徴とする請求項１から１２のいずれか一項に記載の特徴とする蛍光測定のための測定用チップ。
【請求項１４】
前記基板、前記多孔質膜、及び、前記貴金属層を配置した後、当該測定用チップを、ＢＳＡ、スキムミルク、カゼインからなる群より選ばれる少なくとも一種と反応させたこと、
を特徴とする請求項１から１３のいずれか一項に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【請求項１５】
前記貴金属層における前記基板と反対側の面に配置した陰イオン、
を備えることを特徴とする請求項１から１４のいずれか一項に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【請求項１６】
前記陰イオンが、ハロゲンイオンであること、
を特徴とする請求項１５に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【請求項１７】
基板を準備する工程と、
前記基板の少なくとも一側面に多孔質膜を配置する工程と、
前記多孔質膜における前記基板と反対側の面に、少なくとも銀を含有する貴金属層を配置する工程と、
を含んだことを特徴とする蛍光測定のための測定用チップの製造方法。
【請求項１８】
前記貴金属層に、測定対象物質に特異的に結合する結合物質を配置する工程、
を含むことを特徴とする請求項１７に記載の測定用チップの製造方法。
【請求項１９】
前記結合物質が、抗原または抗体であること、
を特徴とする請求項１８に記載の測定用チップの製造方法。
【請求項２０】
前記基板を準備する工程の後、前記基板の少なくとも一側面に、少なくとも金を含有するベース層を配置する工程を含み、当該ベース層に前記多孔質膜を配置したこと、
を特徴とする請求項１７から１９のいずれか一項に記載の測定用チップの製造方法。
【請求項２１】
前記貴金属層を配置する工程の後、当該測定用チップを、ＢＳＡ、スキムミルク、カゼインからなる群より選ばれる少なくとも一種と反応させる工程、
を含むことを特徴とする請求項１７から２０のいずれか一項に記載の測定用チップの製造方法。
【請求項２２】
前記貴金属層における前記基板と反対側の面に、陰イオンを配置する工程、
を含むことを特徴とする請求項１７から２１のいずれか一項に記載の測定用チップの製造方法。
【請求項２３】
基板に多孔質膜を配置した後、前記多孔質膜における前記基板と反対側の面に、少なくとも銀を含有する貴金属層を配置することにより、測定用チップを製造する工程と、
前記測定用チップの前記貴金属層に、測定対象物質に特異的に結合する結合物質を配置する工程と、
前記測定用チップの前記結合物質に測定対象物質を結合させる工程と、
前記測定用チップの前記結合物質に結合させた測定対象物質に、蛍光色素で標識した結合物質を結合させる工程と、
前記蛍光色素を観察する工程と、
を含むことを特徴とする蛍光測定法。
【請求項２４】
基板に多孔質膜を配置した後、前記多孔質膜における前記基板と反対側の面に、少なくとも銀を含有する貴金属層を配置することにより、測定用チップを製造する工程と、
前記測定用チップの前記貴金属層に、測定対象物質を配置する工程と、
前記測定用チップの前記測定対象物質に特異的に結合する結合物質であって、蛍光色素で標識した結合物質を、前記測定対象物質に結合させる工程と、
前記蛍光色素を観察する工程と、
を含むことを特徴とする蛍光測定法。
【請求項２５】
前記結合物質が、抗原または抗体であること、
を特徴とする請求項２３又は２４に記載の蛍光測定法。
【請求項２６】
前記測定用チップを製造する工程と前記蛍光色素を観察する工程との相互間に、前記測定用チップを、ＢＳＡ、スキムミルク、又は、カゼインからなる群より選ばれる少なくとも一種と反応させる工程、
を含むことを特徴とする請求項２３から２５のいずれか一項に記載の蛍光測定法。
【請求項１】
基板と、
前記基板の少なくとも一側面に配置した多孔質膜と、
前記多孔質膜における前記基板と反対側の面に配置した、少なくとも銀を含有する貴金属層と、
を備えたことを特徴とする蛍光測定のための測定用チップ。
【請求項２】
前記貴金属層に配置した、測定対象物質に特異的に結合する結合物質、
を備えたことを特徴とする請求項１に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【請求項３】
前記結合物質が、抗原または抗体であること、
を特徴とする請求項２に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【請求項４】
前記貴金属層の膜厚が、約５〜２０ｎｍであること、
を特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【請求項５】
前記貴金属層の膜厚が、約１０〜１５ｎｍであること、
を特徴とする請求項４に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【請求項６】
前記多孔質膜を、平坦上の膜体に複数の孔部を穿設することにより形成したこと、
を特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【請求項７】
前記多孔質膜を、複数の微粒子から形成したこと、
を特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【請求項８】
前記微粒子の粒径が、約３６０ｎｍ以下であること、
を特徴とする請求項７に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【請求項９】
前記微粒子の粒径が、約５０〜２００ｎｍであること、
を特徴とする請求項８に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【請求項１０】
前記微粒子の粒径が、約５０〜１００ｎｍであること、
を特徴とする請求項９に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【請求項１１】
前記多孔質膜の空孔率が、約６０〜９７％であること、
を特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【請求項１２】
前記多孔質膜の空孔率が、約７５〜８５％であること、
を特徴とする請求項１１に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【請求項１３】
前記基板と前記多孔質膜との相互間に配置した、少なくとも金またはシリコンを含有するベース層、
を備えたことを特徴とする請求項１から１２のいずれか一項に記載の特徴とする蛍光測定のための測定用チップ。
【請求項１４】
前記基板、前記多孔質膜、及び、前記貴金属層を配置した後、当該測定用チップを、ＢＳＡ、スキムミルク、カゼインからなる群より選ばれる少なくとも一種と反応させたこと、
を特徴とする請求項１から１３のいずれか一項に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【請求項１５】
前記貴金属層における前記基板と反対側の面に配置した陰イオン、
を備えることを特徴とする請求項１から１４のいずれか一項に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【請求項１６】
前記陰イオンが、ハロゲンイオンであること、
を特徴とする請求項１５に記載の蛍光測定のための測定用チップ。
【請求項１７】
基板を準備する工程と、
前記基板の少なくとも一側面に多孔質膜を配置する工程と、
前記多孔質膜における前記基板と反対側の面に、少なくとも銀を含有する貴金属層を配置する工程と、
を含んだことを特徴とする蛍光測定のための測定用チップの製造方法。
【請求項１８】
前記貴金属層に、測定対象物質に特異的に結合する結合物質を配置する工程、
を含むことを特徴とする請求項１７に記載の測定用チップの製造方法。
【請求項１９】
前記結合物質が、抗原または抗体であること、
を特徴とする請求項１８に記載の測定用チップの製造方法。
【請求項２０】
前記基板を準備する工程の後、前記基板の少なくとも一側面に、少なくとも金を含有するベース層を配置する工程を含み、当該ベース層に前記多孔質膜を配置したこと、
を特徴とする請求項１７から１９のいずれか一項に記載の測定用チップの製造方法。
【請求項２１】
前記貴金属層を配置する工程の後、当該測定用チップを、ＢＳＡ、スキムミルク、カゼインからなる群より選ばれる少なくとも一種と反応させる工程、
を含むことを特徴とする請求項１７から２０のいずれか一項に記載の測定用チップの製造方法。
【請求項２２】
前記貴金属層における前記基板と反対側の面に、陰イオンを配置する工程、
を含むことを特徴とする請求項１７から２１のいずれか一項に記載の測定用チップの製造方法。
【請求項２３】
基板に多孔質膜を配置した後、前記多孔質膜における前記基板と反対側の面に、少なくとも銀を含有する貴金属層を配置することにより、測定用チップを製造する工程と、
前記測定用チップの前記貴金属層に、測定対象物質に特異的に結合する結合物質を配置する工程と、
前記測定用チップの前記結合物質に測定対象物質を結合させる工程と、
前記測定用チップの前記結合物質に結合させた測定対象物質に、蛍光色素で標識した結合物質を結合させる工程と、
前記蛍光色素を観察する工程と、
を含むことを特徴とする蛍光測定法。
【請求項２４】
基板に多孔質膜を配置した後、前記多孔質膜における前記基板と反対側の面に、少なくとも銀を含有する貴金属層を配置することにより、測定用チップを製造する工程と、
前記測定用チップの前記貴金属層に、測定対象物質を配置する工程と、
前記測定用チップの前記測定対象物質に特異的に結合する結合物質であって、蛍光色素で標識した結合物質を、前記測定対象物質に結合させる工程と、
前記蛍光色素を観察する工程と、
を含むことを特徴とする蛍光測定法。
【請求項２５】
前記結合物質が、抗原または抗体であること、
を特徴とする請求項２３又は２４に記載の蛍光測定法。
【請求項２６】
前記測定用チップを製造する工程と前記蛍光色素を観察する工程との相互間に、前記測定用チップを、ＢＳＡ、スキムミルク、又は、カゼインからなる群より選ばれる少なくとも一種と反応させる工程、
を含むことを特徴とする請求項２３から２５のいずれか一項に記載の蛍光測定法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公開番号】特開２００８−９６１８９（Ｐ２００８−９６１８９Ａ）
【公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２７６３９９（Ｐ２００６−２７６３９９）
【出願日】平成１８年１０月１０日（２００６．１０．１０）
【出願人】（３０６００８７２４）富士レビオ株式会社 (55)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月１０日（２００６．１０．１０）
【出願人】（３０６００８７２４）富士レビオ株式会社 (55)
【Ｆターム（参考）】
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