蛍光顕微鏡システムおよび蛍光物質の定量方法
【課題】計測標本の蛍光物質を常に高精度で定量できる蛍光顕微鏡システムを提供する。
【解決手段】蛍光顕微鏡10により計測標本30の蛍光画像を取得し、その取得した蛍光画像から検量線を用いて蛍光物質を定量する蛍光顕微鏡システムであって、蛍光画像を取得する計測標本30の表面からの距離を測定する距離測定部110と、計測標本30の表面からの距離に応じた複数の検量線を記憶する記憶部120と、距離測定部110で測定された距離に対応する検量線を記憶部120から選択し、該選択された検量線を用いて蛍光画像から蛍光物質を定量する蛍光物質定量部130と、を備える。
【解決手段】蛍光顕微鏡10により計測標本30の蛍光画像を取得し、その取得した蛍光画像から検量線を用いて蛍光物質を定量する蛍光顕微鏡システムであって、蛍光画像を取得する計測標本30の表面からの距離を測定する距離測定部110と、計測標本30の表面からの距離に応じた複数の検量線を記憶する記憶部120と、距離測定部110で測定された距離に対応する検量線を記憶部120から選択し、該選択された検量線を用いて蛍光画像から蛍光物質を定量する蛍光物質定量部130と、を備える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、計測標本の蛍光物質を定量する蛍光顕微鏡システムおよび蛍光物質の定量方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
組織や細胞等の計測標本の蛍光物質を定量する蛍光顕微鏡システムにおいては、蛍光顕微鏡を用いて計測標本の蛍光画像を取得し、その取得した蛍光画像から、蛍光強度と濃度との関係を示す検量線を用いて蛍光物質を定量するようにしている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００７−１５５５４９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところが、従来の蛍光顕微鏡システムにあっては、一つの検量線を用いて計測標本の蛍光物質を定量するようにしている。そのため、例えば、検量線用の標準標本の表面から短い距離（浅い位置）の蛍光物質により作成された検量線を用いて、計測標本の表面から長い距離（深い位置）の蛍光物質の定量を行うと、蛍光の散乱の影響が無視できなくなって、定量精度が低下することが懸念される。
【０００５】
したがって、かかる点に鑑みてなされた本発明の目的は、計測標本の蛍光物質を常に高精度で定量できる蛍光顕微鏡システムおよび蛍光物質の定量方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成する第１の観点に係る蛍光顕微鏡システムの発明は、
蛍光顕微鏡により計測標本の蛍光画像を取得し、その取得した蛍光画像から検量線を用いて蛍光物質を定量する蛍光顕微鏡システムであって、
前記蛍光画像を取得する前記計測標本の表面からの距離を測定する距離測定部と、
前記計測標本の表面からの距離に応じた複数の検量線を記憶する記憶部と、
前記距離測定部で測定された距離に対応する検量線を前記記憶部から選択し、該選択された検量線を用いて前記蛍光画像から前記蛍光物質を定量する蛍光物質定量部と、
を備えることを特徴とするものである。
【０００７】
第２の観点に係る発明は、第１の観点に係る蛍光顕微鏡システムにおいて、
前記蛍光顕微鏡は、前記蛍光画像を結像するための対物レンズのレンズ位置を検出するレンズ位置検出部を有し、
前記距離測定部は、前記レンズ位置検出部からのレンズ位置情報に対する前記対物レンズのフォーカス位置を示すフォーカス位置特性に基づいて前記計測標本の表面からの距離を測定する、ことを特徴とするものである。
【０００８】
第３の観点に係る発明は、第１または２の観点に係る蛍光顕微鏡システムにおいて、
前記蛍光顕微鏡は、共焦点レーザ顕微鏡からなる、ことを特徴とするものである。
【０００９】
第４の観点に係る発明は、第１または２の観点に係る蛍光顕微鏡システムにおいて、
前記蛍光顕微鏡は、透過型蛍光顕微鏡からなり、暗視野観察により前記蛍光画像を取得する、ことを特徴とするものである。
【００１０】
第５の観点に係る発明は、第１乃至４のいずれかの観点に係る蛍光顕微鏡システムにおいて、
前記蛍光顕微鏡は、前記計測標本から近赤外領域の蛍光画像を取得するものである、ことを特徴とするものである。
【００１１】
第６の観点に係る発明は、第１乃至４のいずれかの観点に係る蛍光顕微鏡システムにおいて、
前記蛍光顕微鏡は、前記蛍光画像を取得するマルチスペクトルカメラを有する、ことを特徴とするものである。
【００１２】
さらに、上記目的を達成する第７の観点に係る蛍光物質の定量方法の発明は、
蛍光顕微鏡により計測標本の蛍光画像を取得し、その取得した蛍光画像から検量線を用いて蛍光物質を定量するにあたり、
距離測定部において、前記蛍光画像を取得する前記計測標本の表面からの距離を測定するステップと、
蛍光物質定量部において、測定された前記距離に対応する検量線を記憶部から選択し、その選択された検量線を用いて前記蛍光画像から前記蛍光物質を定量するステップと、
を含むことを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、計測標本の蛍光物質を常に高精度で定量できる蛍光顕微鏡システムおよび蛍光物質の定量方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の第１実施の形態に係る蛍光顕微鏡システムの要部の構成を示す概略図である。
【図２】図１のプレパラートの拡大図である。
【図３】図１の距離測定部のブロック図である。
【図４】図１の記憶部に記憶される検量線を示す図である。
【図５】図４の検量線と計測標本の表面からの距離との対応関係を示す図である。
【図６】図１の蛍光物質定量部のブロック図である。
【図７】第１実施の形態の動作を説明するフローチャートである。
【図８】第２実施の形態におけるプレパラートの拡大図である。
【図９】第２実施の形態の動作を説明するフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について、図を参照して説明する。
【００１６】
（第１実施の形態）
図１は、本発明の第１実施の形態に係る蛍光顕微鏡システムの要部の構成を示す概略図である。図１に示す蛍光顕微鏡システムは、蛍光顕微鏡１０と演算処理部１００とを有する。
【００１７】
蛍光顕微鏡１０は、公知の蛍光顕微鏡、例えば透過型蛍光顕微鏡、落射型蛍光顕微鏡、共焦点レーザ顕微鏡等からなる。図１は、蛍光顕微鏡１０が落射型蛍光顕微鏡の場合を例示するもので、観察用光源１１、標本ステージ１２、蛍光励起用光源１３、対物レンズ１４、レンズ位置検出部１５、カメラ１６を有する。
【００１８】
標本ステージ１２には、蛍光物質で染色（標識）された組織等の計測標本３０を有するプレパラート３１が載置される。プレパラート３１は、図２に拡大して示すように、スライドグラス３２とカバーグラス３３との間に、計測標本３０を封入剤３４とともに保持して作製される。本実施の形態では、カバーグラス３３として、厚さｄ１が既知のもの、例えばｄ１＝５０μｍで、計測標本３０が位置しない領域の上面および下面に、それぞれ測定対象の蛍光色素３５，３６が塗布されたものを使用する。
【００１９】
蛍光励起用光源１３は、超高圧水銀灯、キセノンランプ、紫外線ＬＣＤ、レーザ光源等からなり、計測標本３０の蛍光物質を定量する場合に駆動される。この蛍光励起用光源１３から射出される励起光は、例えば励起フィルタ１７を経てダイクロイックミラー１８で反射されて、対物レンズ１４を経て計測標本３０に照射される。これにより計測標本３０の蛍光物質が励起されて、計測標本３０から蛍光が発生する。この蛍光は、対物レンズ１４、ダイクロイックミラー１８および吸収フィルタ１９を経てカメラ１６に入射されて、蛍光画像が形成される。
【００２０】
対物レンズ１４は、フォーカスハンドルやオートフォーカス機構のフォーカス調整機構により、手動的または自動的にフォーカス位置が調整される。なお、オートフォーカス機構は、パッシブ光路差法、コントラスト法、ナイフエッジを用いるアクティブ位相差法等の公知の方式が採用可能である。
【００２１】
レンズ位置検出部１５は、対物レンズ１４のレンズ位置を検出する。検出されたレンズ位置情報は、演算処理部１００に供給される。カメラ１６は、撮像する蛍光画像に応じて、ＣＣＤカメラ、ＣＭＯＳカメラ、フォトマルチプライヤ、マルチスペクトルカメラ等を用いて構成される。カメラ１６で撮像された計測標本３０の画像信号は、演算処理部１００に供給される。
【００２２】
なお、観察用光源１１は、計測標本３０の透過光学像を観察する場合に駆動される。この観察用光源１１から射出された照明光は、反射ミラー２０を含む照明光学系を経て計測標本３０に照射され、その透過光が対物レンズ１４を経て、図示しない接眼光学系や、カメラ１６に導かれる。これにより、蛍光画像と同様に、接眼光学系を経て計測標本３０の透過光学像が観察可能となっており、カメラ１６で撮像された透過光学像が、専用の表示部や後述する演算処理部１００の表示部に表示されるようになっている。
【００２３】
演算処理部１００は、距離測定部１１０、記憶部１２０、蛍光物質定量部１３０、制御部１４０、表示部１５０を有する。
【００２４】
距離測定部１１０は、計測標本３０の蛍光画像を取得する表面からの距離を測定するもので、例えば図３に示すように、記憶部１１１および距離算出部１１２を有する。記憶部１１１には、計測標本３０のプレパラート３１の作製に使用されるカバーグラス３３の厚さ情報が記憶されるとともに、レンズ位置検出部１５からのレンズ位置情報、およびカメラ１６からの画像信号が記憶される。また、記憶部１１１には、後述する対物レンズ１４のレンズ位置情報に対するフォーカス位置を示すフォーカス位置特性が記憶される。記憶部１１１に記憶された画像信号は、適宜、蛍光物質定量部１３０に出力される。
【００２５】
距離算出部１１２は、記憶部１１１に記憶されたカバーグラス３３の厚さ情報およびレンズ位置情報に基づいて、フォーカス位置特性を算出して記憶部１１１に記憶する。また、距離算出部１１２は、記憶部１１１に記憶されたフォーカス位置特性と、レンズ位置検出部１５からのレンズ位置情報とに基づいて、カバーグラス３３の下面からのフォーカス位置の距離、つまり計測標本３０の蛍光画像を取得する表面からの距離を算出する。距離算出部１１２で算出された距離は、距離情報として蛍光物質定量部１３０に出力される。
【００２６】
記憶部１２０は、例えば図４に示すような、計測標本３０の表面からの距離に応じた蛍光強度と濃度との関係を示す複数の検量線や、定量結果等の各種のデータを記憶する。なお、図４は、検量線１から検量線５までの５種類の検量線を示しており、各検量線と計測標本３０の表面からの距離との対応関係は、図５に示すようになっている。図４および図５から明らかなように、同じ濃度でも、計測標本３０の表面からの距離が長くなるに従って、蛍光強度は低くなる。
【００２７】
蛍光物質定量部１３０は、例えば図６に示すように、検量線選択部１３１および蛍光分子定量部１３２を有する。検量線選択部１３１は、距離算出部１１２からの距離情報に基づいて、対応する検量線を記憶部１２０から選択する。蛍光分子定量部１３２は、検量線選択部１３１で選択された検量線を用いて、距離算出部１１２からの画像信号（蛍光画像）の蛍光物質を定量する。その定量結果は、定量情報として制御部１４０に出力される。
【００２８】
制御部１４０は、蛍光顕微鏡１０および演算処理部１００の全体の動作を制御するもので、例えばパーソナルコンピュータで構成される。そして、制御部１４０は、蛍光物質定量部１３０からの定量情報を表示部１５０に表示する。また、制御部１４０は、必要に応じて、表示部１５０に、蛍光顕微鏡１０で取得した計測標本３０の蛍光画像や透過光学像を表示する。
【００２９】
以下、本実施の形態に係る蛍光顕微鏡システムによる蛍光物質の定量方法について、図７に示すフローチャートを参照しながら説明する。
【００３０】
本実施の形態では、蛍光顕微鏡１０の標本ステージ１２に、図２に示したようなプレパラート３１をセットし、蛍光励起用光源１３を点灯させて蛍光物質を定量する。ここで、プレパラート３１は、例えば、計測標本３０が肺腺癌患者の病理組織標本の場合、採取されたヒト肺癌病理標本に、ヒト肺癌細胞の核に特異的に結合する蛍光標識抗ＴＦＦ１抗体を結合させて作製する。
【００３１】
先ず、距離測定部１１０において、対物レンズ１４がカバーガラス３３の上面にフォーカスされた際に、レンズ位置検出部１５から出力されるレンズ位置情報を取得する（ステップＳ１１）。ここで、カバーガラス３３の上面への対物レンズ１４のフォーカス動作は、カバーガラス３３の上面に塗布された蛍光色素３５の像を参照して、手動または自動で行われる。このカバーガラス３３の上面のレンズ位置情報は、記憶部１１１に記憶される。
【００３２】
次に、距離測定部１１０において、対物レンズ１４がカバーガラス３３の下面にフォーカスされた際に、レンズ位置検出部１５から出力されるレンズ位置情報を取得する（ステップＳ１２）。ここで、カバーガラス３３の下面への対物レンズ１４のフォーカス動作は、ステップＳ１１の場合と同様に、カバーガラス３３の下面に塗布された蛍光色素３６の像を参照して、手動または自動で行われる。このカバーガラス３３の下面のレンズ位置情報は、記憶部１１１に記憶される。なお、ステップＳ１１とステップＳ１２とは、逆の順序で行ってもよい。
【００３３】
その後、距離測定部１１０は、距離算出部１１２において、記憶部１１１に記憶されているカバーグラス３３の厚さ情報と、取得されたカバーガラス３３の上下面のフォーカス位置に対応するレンズ位置情報とに基づいて、対物レンズ１４のレンズ位置情報に対するフォーカス位置を示すフォーカス位置特性を算出する（ステップＳ１３）。このフォーカス位置特性は、記憶部１１１に記憶される。
【００３４】
以上のようにして対物レンズ１４のフォーカス位置特性を算出したら、その後、距離算出部１１２は、レンズ位置検出部１５からのレンズ位置情報および画像信号を受けると、算出されたフォーカス位置特性を用いてレンズ位置情報に対応する計測標本３０の表面からのフォーカス位置の距離を算出する（ステップＳ１４）。この算出された距離情報は、記憶部１１１に記憶されるとともに、蛍光物質定量部１３０に出力される。また、そのときの画像信号も蛍光物質定量部１３０に出力される。
【００３５】
蛍光物質定量部１３０は、距離測定部１１０から距離情報を受けると、検量線選択部１３１において、受信した距離情報に対応する検量線を記憶部１２０から選択する（ステップＳ１５）。この選択された検量線情報は、蛍光分子定量部１３２に供給される。
【００３６】
その後、蛍光分子定量部１３２は、選択された検量線情報を用いて、受信した画像信号（蛍光画像）の蛍光物質を定量する（ステップＳ１６）。その定量結果は、制御部１４０を介して表示部１５０に表示される（ステップＳ１７）。
【００３７】
このように、本実施の形態に係る蛍光顕微鏡システムによると、対物レンズ１４がフォーカスされた計測標本３０の表面からの距離に応じた検量線を選択して、当該フォーカス位置で取得された蛍光画像から蛍光物質を定量するので、蛍光の散乱の影響を低減でき、蛍光物質を高精度で定量することができる。特に、蛍光物質の蛍光波長領域が近赤外領域の波長の場合は、標本表面からの距離に応じた適切な検量線を選択することにより、標本表面からの距離がより長い場合においても、組織の散乱に影響されず正確に定量することが可能となる。
【００３８】
また、本実施の形態においては、対物レンズ１４のレンズ位置情報に対するフォーカス位置を示すフォーカス位置特性に基づいて、計測標本３０の表面からの距離を測定するので、迅速な距離の測定が可能となり、測定時間の短縮が図れる。
【００３９】
また、計測標本３０が複数種類の蛍光物質で染色されている場合は、カメラ１６として公知のマルチスペクトルカメラを用いることにより、複数種類の蛍光分子を自動で正確に定量することが可能となる。
【００４０】
また、蛍光顕微鏡１０として、共焦点レーザ顕微鏡を用いた場合は、蛍光の励起範囲を正確に限定することができるので、蛍光物質をより高精度で定量することが可能となる。
【００４１】
（第２実施の形態）
本発明の第２実施の形態においては、第１実施の形態で説明した蛍光顕微鏡システムにおいて、プレパラート３１のカバーグラス３３の代わりにスライドグラス３２を用いて、対物レンズ１４のレンズ位置情報に対するフォーカス位置を示すフォーカス位置特性を算出する。そのため、図８にプレパラート３１を拡大して示すように、スライドグラス３２として、厚さｄ２が既知のもの、例えばｄ２＝１０００μｍで、計測標本３０が位置しない領域の上面および下面の位置に、それぞれ測定対象の蛍光色素３７，３８が塗布されているものを使用する。また、スライドグラス３２上に載置される計測標本３０は、厚さｄ３が、例えばｄ３≒５μｍとする。
【００４２】
また、距離測定部１１０の記憶部１１１には、使用されるスライドグラス３２の厚さ情報の他、計測標本３０の厚さ情報も記憶される。その他の構成は、第１実施の形態と同様である。
【００４３】
以下、本実施の形態に係る蛍光顕微鏡システムによる蛍光物質の定量方法について、第１実施の形態の構成および図８を参照しながら、図９に示すフローチャートに従って説明する。
【００４４】
先ず、距離測定部１１０において、対物レンズ１４がスライドグラス３２の上面に塗布された蛍光色素３７にフォーカスされた際に、レンズ位置検出部１５から出力されるレンズ位置情報を取得する（ステップＳ２１）。次に、距離測定部１１０において、対物レンズ１４がスライドグラス３２の下面に塗布された蛍光色素３８にフォーカスされた際に、レンズ位置検出部１５から出力されるレンズ位置情報を、距離測定部１１０で取得する（ステップＳ２２）。
【００４５】
その後、距離算出部１１２において、記憶部１１１に記憶されているスライドグラス３２の厚さ情報と、取得されたスライドグラス３２の上下面のフォーカス位置に対応するレンズ位置情報とに基づいて、対物レンズ１４のレンズ位置情報に対するフォーカス位置を示すフォーカス位置特性を算出する（ステップＳ２３）。
【００４６】
以上のようにして対物レンズ１４のフォーカス位置特性を算出したら、その後、距離算出部１１２は、レンズ位置検出部１５からのレンズ位置情報および画像信号を受けると、算出されたフォーカス位置特性および計測標本３０の厚さ情報を用いて、レンズ位置情報に対応する計測標本３０の表面からのフォーカス位置の距離を算出する（ステップＳ２４）。
【００４７】
ここで、計測標本３０は、厚さｄ３がｄ３≒５μｍに規定されている。したがって、受信したレンズ位置情報に基づいて、例えばスライドグラス３２の上面からのフォーカス位置の距離を算出し、その距離を計測標本３０の厚さである５μｍから減算すれば、計測標本３０の表面からのフォーカス位置の距離が算出される。この算出された距離情報は、記憶部１１１に記憶されるとともに、蛍光物質定量部１３０に出力される。また、そのときの画像信号も蛍光物質定量部１３０に出力される。
【００４８】
以後は、図７のステップＳ１５〜Ｓ１７と同様にして、蛍光物質定量部１３０の検量線選択部１３１により、受信した距離情報に対応する検量線が記憶部１２０から選択され（ステップＳ２５）、その選択された検量線情報を用いて、蛍光分子定量部１３２により、受信した画像信号（蛍光画像）の蛍光物質が定量され（ステップＳ２６）、その定量結果が制御部１４０を介して表示部１５０に表示される（ステップＳ２７）。
【００４９】
したがって、本実施の形態においても、第１実施の形態と同様の効果を得ることができる。
【００５０】
なお、本発明は、上記実施の形態にのみ限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。例えば、蛍光顕微鏡として透過型蛍光顕微鏡を用い、暗視野観察により蛍光画像を取得して蛍光物質を定量することも可能である。この場合、バックグランドが真っ暗となり、微弱な蛍光から高いコントラストの画像を得ることができる。したがって、計測標本の表面からの距離（深さ）に応じた検量線を選択することと相俟って、蛍光物質を高精度かつ高感度で定量することが可能となる。
【００５１】
また、蛍光顕微鏡のフォーカス位置特性は、対物レンズを含む顕微鏡光学系によって決定される。したがって、蛍光顕微鏡のフォーカス位置特性を利用し、そのフォーカス位置特性に、厚さが既知のカバーグラスの上面または裏面、あるいは厚さが既知のスライド上面または裏面のレンズ位置を予め対応付けることで、所望のレンズ位置情報に対する計測標本の表面からのフォーカス位置の距離を算出することも可能である。
【００５２】
また、上記実施の形態では、対物レンズをカバーグラスやスライドグラスの上下面にフォーカスさせるために、それらの面に蛍光色素を塗布したが、使用する蛍光励起用光源によっては、蛍光色素以外の対物レンズをフォーカス可能な任意のマーカとすることが可能である。
【符号の説明】
【００５３】
１０ 蛍光顕微鏡
１１ 観察用光源
１２ 標本ステージ
１３ 蛍光励起用光源
１４ 対物レンズ
１５ レンズ位置検出部
１６ カメラ
３０ 計測標本
３１ プレパラート
３２ スライドグラス
３３ カバーグラス
３４ 封入剤
３５，３６，３７，３８ 蛍光色素
１００ 演算処理部
１１０ 距離測定部
１１１ 記憶部
１１２ 距離算出部
１２０ 記憶部
１３０ 蛍光物質定量部
１３１ 検量線選択部
１３２ 蛍光分子定量部
１４０ 制御部
１５０ 表示部
【技術分野】
【０００１】
本発明は、計測標本の蛍光物質を定量する蛍光顕微鏡システムおよび蛍光物質の定量方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
組織や細胞等の計測標本の蛍光物質を定量する蛍光顕微鏡システムにおいては、蛍光顕微鏡を用いて計測標本の蛍光画像を取得し、その取得した蛍光画像から、蛍光強度と濃度との関係を示す検量線を用いて蛍光物質を定量するようにしている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００７−１５５５４９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところが、従来の蛍光顕微鏡システムにあっては、一つの検量線を用いて計測標本の蛍光物質を定量するようにしている。そのため、例えば、検量線用の標準標本の表面から短い距離（浅い位置）の蛍光物質により作成された検量線を用いて、計測標本の表面から長い距離（深い位置）の蛍光物質の定量を行うと、蛍光の散乱の影響が無視できなくなって、定量精度が低下することが懸念される。
【０００５】
したがって、かかる点に鑑みてなされた本発明の目的は、計測標本の蛍光物質を常に高精度で定量できる蛍光顕微鏡システムおよび蛍光物質の定量方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成する第１の観点に係る蛍光顕微鏡システムの発明は、
蛍光顕微鏡により計測標本の蛍光画像を取得し、その取得した蛍光画像から検量線を用いて蛍光物質を定量する蛍光顕微鏡システムであって、
前記蛍光画像を取得する前記計測標本の表面からの距離を測定する距離測定部と、
前記計測標本の表面からの距離に応じた複数の検量線を記憶する記憶部と、
前記距離測定部で測定された距離に対応する検量線を前記記憶部から選択し、該選択された検量線を用いて前記蛍光画像から前記蛍光物質を定量する蛍光物質定量部と、
を備えることを特徴とするものである。
【０００７】
第２の観点に係る発明は、第１の観点に係る蛍光顕微鏡システムにおいて、
前記蛍光顕微鏡は、前記蛍光画像を結像するための対物レンズのレンズ位置を検出するレンズ位置検出部を有し、
前記距離測定部は、前記レンズ位置検出部からのレンズ位置情報に対する前記対物レンズのフォーカス位置を示すフォーカス位置特性に基づいて前記計測標本の表面からの距離を測定する、ことを特徴とするものである。
【０００８】
第３の観点に係る発明は、第１または２の観点に係る蛍光顕微鏡システムにおいて、
前記蛍光顕微鏡は、共焦点レーザ顕微鏡からなる、ことを特徴とするものである。
【０００９】
第４の観点に係る発明は、第１または２の観点に係る蛍光顕微鏡システムにおいて、
前記蛍光顕微鏡は、透過型蛍光顕微鏡からなり、暗視野観察により前記蛍光画像を取得する、ことを特徴とするものである。
【００１０】
第５の観点に係る発明は、第１乃至４のいずれかの観点に係る蛍光顕微鏡システムにおいて、
前記蛍光顕微鏡は、前記計測標本から近赤外領域の蛍光画像を取得するものである、ことを特徴とするものである。
【００１１】
第６の観点に係る発明は、第１乃至４のいずれかの観点に係る蛍光顕微鏡システムにおいて、
前記蛍光顕微鏡は、前記蛍光画像を取得するマルチスペクトルカメラを有する、ことを特徴とするものである。
【００１２】
さらに、上記目的を達成する第７の観点に係る蛍光物質の定量方法の発明は、
蛍光顕微鏡により計測標本の蛍光画像を取得し、その取得した蛍光画像から検量線を用いて蛍光物質を定量するにあたり、
距離測定部において、前記蛍光画像を取得する前記計測標本の表面からの距離を測定するステップと、
蛍光物質定量部において、測定された前記距離に対応する検量線を記憶部から選択し、その選択された検量線を用いて前記蛍光画像から前記蛍光物質を定量するステップと、
を含むことを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、計測標本の蛍光物質を常に高精度で定量できる蛍光顕微鏡システムおよび蛍光物質の定量方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の第１実施の形態に係る蛍光顕微鏡システムの要部の構成を示す概略図である。
【図２】図１のプレパラートの拡大図である。
【図３】図１の距離測定部のブロック図である。
【図４】図１の記憶部に記憶される検量線を示す図である。
【図５】図４の検量線と計測標本の表面からの距離との対応関係を示す図である。
【図６】図１の蛍光物質定量部のブロック図である。
【図７】第１実施の形態の動作を説明するフローチャートである。
【図８】第２実施の形態におけるプレパラートの拡大図である。
【図９】第２実施の形態の動作を説明するフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について、図を参照して説明する。
【００１６】
（第１実施の形態）
図１は、本発明の第１実施の形態に係る蛍光顕微鏡システムの要部の構成を示す概略図である。図１に示す蛍光顕微鏡システムは、蛍光顕微鏡１０と演算処理部１００とを有する。
【００１７】
蛍光顕微鏡１０は、公知の蛍光顕微鏡、例えば透過型蛍光顕微鏡、落射型蛍光顕微鏡、共焦点レーザ顕微鏡等からなる。図１は、蛍光顕微鏡１０が落射型蛍光顕微鏡の場合を例示するもので、観察用光源１１、標本ステージ１２、蛍光励起用光源１３、対物レンズ１４、レンズ位置検出部１５、カメラ１６を有する。
【００１８】
標本ステージ１２には、蛍光物質で染色（標識）された組織等の計測標本３０を有するプレパラート３１が載置される。プレパラート３１は、図２に拡大して示すように、スライドグラス３２とカバーグラス３３との間に、計測標本３０を封入剤３４とともに保持して作製される。本実施の形態では、カバーグラス３３として、厚さｄ１が既知のもの、例えばｄ１＝５０μｍで、計測標本３０が位置しない領域の上面および下面に、それぞれ測定対象の蛍光色素３５，３６が塗布されたものを使用する。
【００１９】
蛍光励起用光源１３は、超高圧水銀灯、キセノンランプ、紫外線ＬＣＤ、レーザ光源等からなり、計測標本３０の蛍光物質を定量する場合に駆動される。この蛍光励起用光源１３から射出される励起光は、例えば励起フィルタ１７を経てダイクロイックミラー１８で反射されて、対物レンズ１４を経て計測標本３０に照射される。これにより計測標本３０の蛍光物質が励起されて、計測標本３０から蛍光が発生する。この蛍光は、対物レンズ１４、ダイクロイックミラー１８および吸収フィルタ１９を経てカメラ１６に入射されて、蛍光画像が形成される。
【００２０】
対物レンズ１４は、フォーカスハンドルやオートフォーカス機構のフォーカス調整機構により、手動的または自動的にフォーカス位置が調整される。なお、オートフォーカス機構は、パッシブ光路差法、コントラスト法、ナイフエッジを用いるアクティブ位相差法等の公知の方式が採用可能である。
【００２１】
レンズ位置検出部１５は、対物レンズ１４のレンズ位置を検出する。検出されたレンズ位置情報は、演算処理部１００に供給される。カメラ１６は、撮像する蛍光画像に応じて、ＣＣＤカメラ、ＣＭＯＳカメラ、フォトマルチプライヤ、マルチスペクトルカメラ等を用いて構成される。カメラ１６で撮像された計測標本３０の画像信号は、演算処理部１００に供給される。
【００２２】
なお、観察用光源１１は、計測標本３０の透過光学像を観察する場合に駆動される。この観察用光源１１から射出された照明光は、反射ミラー２０を含む照明光学系を経て計測標本３０に照射され、その透過光が対物レンズ１４を経て、図示しない接眼光学系や、カメラ１６に導かれる。これにより、蛍光画像と同様に、接眼光学系を経て計測標本３０の透過光学像が観察可能となっており、カメラ１６で撮像された透過光学像が、専用の表示部や後述する演算処理部１００の表示部に表示されるようになっている。
【００２３】
演算処理部１００は、距離測定部１１０、記憶部１２０、蛍光物質定量部１３０、制御部１４０、表示部１５０を有する。
【００２４】
距離測定部１１０は、計測標本３０の蛍光画像を取得する表面からの距離を測定するもので、例えば図３に示すように、記憶部１１１および距離算出部１１２を有する。記憶部１１１には、計測標本３０のプレパラート３１の作製に使用されるカバーグラス３３の厚さ情報が記憶されるとともに、レンズ位置検出部１５からのレンズ位置情報、およびカメラ１６からの画像信号が記憶される。また、記憶部１１１には、後述する対物レンズ１４のレンズ位置情報に対するフォーカス位置を示すフォーカス位置特性が記憶される。記憶部１１１に記憶された画像信号は、適宜、蛍光物質定量部１３０に出力される。
【００２５】
距離算出部１１２は、記憶部１１１に記憶されたカバーグラス３３の厚さ情報およびレンズ位置情報に基づいて、フォーカス位置特性を算出して記憶部１１１に記憶する。また、距離算出部１１２は、記憶部１１１に記憶されたフォーカス位置特性と、レンズ位置検出部１５からのレンズ位置情報とに基づいて、カバーグラス３３の下面からのフォーカス位置の距離、つまり計測標本３０の蛍光画像を取得する表面からの距離を算出する。距離算出部１１２で算出された距離は、距離情報として蛍光物質定量部１３０に出力される。
【００２６】
記憶部１２０は、例えば図４に示すような、計測標本３０の表面からの距離に応じた蛍光強度と濃度との関係を示す複数の検量線や、定量結果等の各種のデータを記憶する。なお、図４は、検量線１から検量線５までの５種類の検量線を示しており、各検量線と計測標本３０の表面からの距離との対応関係は、図５に示すようになっている。図４および図５から明らかなように、同じ濃度でも、計測標本３０の表面からの距離が長くなるに従って、蛍光強度は低くなる。
【００２７】
蛍光物質定量部１３０は、例えば図６に示すように、検量線選択部１３１および蛍光分子定量部１３２を有する。検量線選択部１３１は、距離算出部１１２からの距離情報に基づいて、対応する検量線を記憶部１２０から選択する。蛍光分子定量部１３２は、検量線選択部１３１で選択された検量線を用いて、距離算出部１１２からの画像信号（蛍光画像）の蛍光物質を定量する。その定量結果は、定量情報として制御部１４０に出力される。
【００２８】
制御部１４０は、蛍光顕微鏡１０および演算処理部１００の全体の動作を制御するもので、例えばパーソナルコンピュータで構成される。そして、制御部１４０は、蛍光物質定量部１３０からの定量情報を表示部１５０に表示する。また、制御部１４０は、必要に応じて、表示部１５０に、蛍光顕微鏡１０で取得した計測標本３０の蛍光画像や透過光学像を表示する。
【００２９】
以下、本実施の形態に係る蛍光顕微鏡システムによる蛍光物質の定量方法について、図７に示すフローチャートを参照しながら説明する。
【００３０】
本実施の形態では、蛍光顕微鏡１０の標本ステージ１２に、図２に示したようなプレパラート３１をセットし、蛍光励起用光源１３を点灯させて蛍光物質を定量する。ここで、プレパラート３１は、例えば、計測標本３０が肺腺癌患者の病理組織標本の場合、採取されたヒト肺癌病理標本に、ヒト肺癌細胞の核に特異的に結合する蛍光標識抗ＴＦＦ１抗体を結合させて作製する。
【００３１】
先ず、距離測定部１１０において、対物レンズ１４がカバーガラス３３の上面にフォーカスされた際に、レンズ位置検出部１５から出力されるレンズ位置情報を取得する（ステップＳ１１）。ここで、カバーガラス３３の上面への対物レンズ１４のフォーカス動作は、カバーガラス３３の上面に塗布された蛍光色素３５の像を参照して、手動または自動で行われる。このカバーガラス３３の上面のレンズ位置情報は、記憶部１１１に記憶される。
【００３２】
次に、距離測定部１１０において、対物レンズ１４がカバーガラス３３の下面にフォーカスされた際に、レンズ位置検出部１５から出力されるレンズ位置情報を取得する（ステップＳ１２）。ここで、カバーガラス３３の下面への対物レンズ１４のフォーカス動作は、ステップＳ１１の場合と同様に、カバーガラス３３の下面に塗布された蛍光色素３６の像を参照して、手動または自動で行われる。このカバーガラス３３の下面のレンズ位置情報は、記憶部１１１に記憶される。なお、ステップＳ１１とステップＳ１２とは、逆の順序で行ってもよい。
【００３３】
その後、距離測定部１１０は、距離算出部１１２において、記憶部１１１に記憶されているカバーグラス３３の厚さ情報と、取得されたカバーガラス３３の上下面のフォーカス位置に対応するレンズ位置情報とに基づいて、対物レンズ１４のレンズ位置情報に対するフォーカス位置を示すフォーカス位置特性を算出する（ステップＳ１３）。このフォーカス位置特性は、記憶部１１１に記憶される。
【００３４】
以上のようにして対物レンズ１４のフォーカス位置特性を算出したら、その後、距離算出部１１２は、レンズ位置検出部１５からのレンズ位置情報および画像信号を受けると、算出されたフォーカス位置特性を用いてレンズ位置情報に対応する計測標本３０の表面からのフォーカス位置の距離を算出する（ステップＳ１４）。この算出された距離情報は、記憶部１１１に記憶されるとともに、蛍光物質定量部１３０に出力される。また、そのときの画像信号も蛍光物質定量部１３０に出力される。
【００３５】
蛍光物質定量部１３０は、距離測定部１１０から距離情報を受けると、検量線選択部１３１において、受信した距離情報に対応する検量線を記憶部１２０から選択する（ステップＳ１５）。この選択された検量線情報は、蛍光分子定量部１３２に供給される。
【００３６】
その後、蛍光分子定量部１３２は、選択された検量線情報を用いて、受信した画像信号（蛍光画像）の蛍光物質を定量する（ステップＳ１６）。その定量結果は、制御部１４０を介して表示部１５０に表示される（ステップＳ１７）。
【００３７】
このように、本実施の形態に係る蛍光顕微鏡システムによると、対物レンズ１４がフォーカスされた計測標本３０の表面からの距離に応じた検量線を選択して、当該フォーカス位置で取得された蛍光画像から蛍光物質を定量するので、蛍光の散乱の影響を低減でき、蛍光物質を高精度で定量することができる。特に、蛍光物質の蛍光波長領域が近赤外領域の波長の場合は、標本表面からの距離に応じた適切な検量線を選択することにより、標本表面からの距離がより長い場合においても、組織の散乱に影響されず正確に定量することが可能となる。
【００３８】
また、本実施の形態においては、対物レンズ１４のレンズ位置情報に対するフォーカス位置を示すフォーカス位置特性に基づいて、計測標本３０の表面からの距離を測定するので、迅速な距離の測定が可能となり、測定時間の短縮が図れる。
【００３９】
また、計測標本３０が複数種類の蛍光物質で染色されている場合は、カメラ１６として公知のマルチスペクトルカメラを用いることにより、複数種類の蛍光分子を自動で正確に定量することが可能となる。
【００４０】
また、蛍光顕微鏡１０として、共焦点レーザ顕微鏡を用いた場合は、蛍光の励起範囲を正確に限定することができるので、蛍光物質をより高精度で定量することが可能となる。
【００４１】
（第２実施の形態）
本発明の第２実施の形態においては、第１実施の形態で説明した蛍光顕微鏡システムにおいて、プレパラート３１のカバーグラス３３の代わりにスライドグラス３２を用いて、対物レンズ１４のレンズ位置情報に対するフォーカス位置を示すフォーカス位置特性を算出する。そのため、図８にプレパラート３１を拡大して示すように、スライドグラス３２として、厚さｄ２が既知のもの、例えばｄ２＝１０００μｍで、計測標本３０が位置しない領域の上面および下面の位置に、それぞれ測定対象の蛍光色素３７，３８が塗布されているものを使用する。また、スライドグラス３２上に載置される計測標本３０は、厚さｄ３が、例えばｄ３≒５μｍとする。
【００４２】
また、距離測定部１１０の記憶部１１１には、使用されるスライドグラス３２の厚さ情報の他、計測標本３０の厚さ情報も記憶される。その他の構成は、第１実施の形態と同様である。
【００４３】
以下、本実施の形態に係る蛍光顕微鏡システムによる蛍光物質の定量方法について、第１実施の形態の構成および図８を参照しながら、図９に示すフローチャートに従って説明する。
【００４４】
先ず、距離測定部１１０において、対物レンズ１４がスライドグラス３２の上面に塗布された蛍光色素３７にフォーカスされた際に、レンズ位置検出部１５から出力されるレンズ位置情報を取得する（ステップＳ２１）。次に、距離測定部１１０において、対物レンズ１４がスライドグラス３２の下面に塗布された蛍光色素３８にフォーカスされた際に、レンズ位置検出部１５から出力されるレンズ位置情報を、距離測定部１１０で取得する（ステップＳ２２）。
【００４５】
その後、距離算出部１１２において、記憶部１１１に記憶されているスライドグラス３２の厚さ情報と、取得されたスライドグラス３２の上下面のフォーカス位置に対応するレンズ位置情報とに基づいて、対物レンズ１４のレンズ位置情報に対するフォーカス位置を示すフォーカス位置特性を算出する（ステップＳ２３）。
【００４６】
以上のようにして対物レンズ１４のフォーカス位置特性を算出したら、その後、距離算出部１１２は、レンズ位置検出部１５からのレンズ位置情報および画像信号を受けると、算出されたフォーカス位置特性および計測標本３０の厚さ情報を用いて、レンズ位置情報に対応する計測標本３０の表面からのフォーカス位置の距離を算出する（ステップＳ２４）。
【００４７】
ここで、計測標本３０は、厚さｄ３がｄ３≒５μｍに規定されている。したがって、受信したレンズ位置情報に基づいて、例えばスライドグラス３２の上面からのフォーカス位置の距離を算出し、その距離を計測標本３０の厚さである５μｍから減算すれば、計測標本３０の表面からのフォーカス位置の距離が算出される。この算出された距離情報は、記憶部１１１に記憶されるとともに、蛍光物質定量部１３０に出力される。また、そのときの画像信号も蛍光物質定量部１３０に出力される。
【００４８】
以後は、図７のステップＳ１５〜Ｓ１７と同様にして、蛍光物質定量部１３０の検量線選択部１３１により、受信した距離情報に対応する検量線が記憶部１２０から選択され（ステップＳ２５）、その選択された検量線情報を用いて、蛍光分子定量部１３２により、受信した画像信号（蛍光画像）の蛍光物質が定量され（ステップＳ２６）、その定量結果が制御部１４０を介して表示部１５０に表示される（ステップＳ２７）。
【００４９】
したがって、本実施の形態においても、第１実施の形態と同様の効果を得ることができる。
【００５０】
なお、本発明は、上記実施の形態にのみ限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。例えば、蛍光顕微鏡として透過型蛍光顕微鏡を用い、暗視野観察により蛍光画像を取得して蛍光物質を定量することも可能である。この場合、バックグランドが真っ暗となり、微弱な蛍光から高いコントラストの画像を得ることができる。したがって、計測標本の表面からの距離（深さ）に応じた検量線を選択することと相俟って、蛍光物質を高精度かつ高感度で定量することが可能となる。
【００５１】
また、蛍光顕微鏡のフォーカス位置特性は、対物レンズを含む顕微鏡光学系によって決定される。したがって、蛍光顕微鏡のフォーカス位置特性を利用し、そのフォーカス位置特性に、厚さが既知のカバーグラスの上面または裏面、あるいは厚さが既知のスライド上面または裏面のレンズ位置を予め対応付けることで、所望のレンズ位置情報に対する計測標本の表面からのフォーカス位置の距離を算出することも可能である。
【００５２】
また、上記実施の形態では、対物レンズをカバーグラスやスライドグラスの上下面にフォーカスさせるために、それらの面に蛍光色素を塗布したが、使用する蛍光励起用光源によっては、蛍光色素以外の対物レンズをフォーカス可能な任意のマーカとすることが可能である。
【符号の説明】
【００５３】
１０ 蛍光顕微鏡
１１ 観察用光源
１２ 標本ステージ
１３ 蛍光励起用光源
１４ 対物レンズ
１５ レンズ位置検出部
１６ カメラ
３０ 計測標本
３１ プレパラート
３２ スライドグラス
３３ カバーグラス
３４ 封入剤
３５，３６，３７，３８ 蛍光色素
１００ 演算処理部
１１０ 距離測定部
１１１ 記憶部
１１２ 距離算出部
１２０ 記憶部
１３０ 蛍光物質定量部
１３１ 検量線選択部
１３２ 蛍光分子定量部
１４０ 制御部
１５０ 表示部
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光顕微鏡により計測標本の蛍光画像を取得し、その取得した蛍光画像から検量線を用いて蛍光物質を定量する蛍光顕微鏡システムであって、
前記蛍光画像を取得する前記計測標本の表面からの距離を測定する距離測定部と、
前記計測標本の表面からの距離に応じた複数の検量線を記憶する記憶部と、
前記距離測定部で測定された距離に対応する検量線を前記記憶部から選択し、該選択された検量線を用いて前記蛍光画像から前記蛍光物質を定量する蛍光物質定量部と、
を備えることを特徴とする蛍光顕微鏡システム。
【請求項２】
前記蛍光顕微鏡は、前記蛍光画像を結像するための対物レンズのレンズ位置を検出するレンズ位置検出部を有し、
前記距離測定部は、前記レンズ位置検出部からのレンズ位置情報に対する前記対物レンズのフォーカス位置を示すフォーカス位置特性に基づいて前記計測標本の表面からの距離を測定する、ことを特徴とする請求項１に記載の蛍光顕微鏡システム。
【請求項３】
前記蛍光顕微鏡は、共焦点レーザ顕微鏡からなる、ことを特徴とする請求項１または２に記載の蛍光顕微鏡システム。
【請求項４】
前記蛍光顕微鏡は、透過型蛍光顕微鏡からなり、暗視野観察により前記蛍光画像を取得する、ことを特徴とする請求項１または２に記載の蛍光顕微鏡システム。
【請求項５】
前記蛍光顕微鏡は、前記計測標本から近赤外領域の蛍光画像を取得するものである、ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の蛍光顕微鏡システム。
【請求項６】
前記蛍光顕微鏡は、前記蛍光画像を取得するマルチスペクトルカメラを有する、ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の蛍光顕微鏡システム。
【請求項７】
蛍光顕微鏡により計測標本の蛍光画像を取得し、その取得した蛍光画像から検量線を用いて蛍光物質を定量するにあたり、
距離測定部において、前記蛍光画像を取得する前記計測標本の表面からの距離を測定するステップと、
蛍光物質定量部において、測定された前記距離に対応する検量線を記憶部から選択し、その選択された検量線を用いて前記蛍光画像から前記蛍光物質を定量するステップと、
を含むことを特徴とする蛍光物質の定量方法。
【請求項１】
蛍光顕微鏡により計測標本の蛍光画像を取得し、その取得した蛍光画像から検量線を用いて蛍光物質を定量する蛍光顕微鏡システムであって、
前記蛍光画像を取得する前記計測標本の表面からの距離を測定する距離測定部と、
前記計測標本の表面からの距離に応じた複数の検量線を記憶する記憶部と、
前記距離測定部で測定された距離に対応する検量線を前記記憶部から選択し、該選択された検量線を用いて前記蛍光画像から前記蛍光物質を定量する蛍光物質定量部と、
を備えることを特徴とする蛍光顕微鏡システム。
【請求項２】
前記蛍光顕微鏡は、前記蛍光画像を結像するための対物レンズのレンズ位置を検出するレンズ位置検出部を有し、
前記距離測定部は、前記レンズ位置検出部からのレンズ位置情報に対する前記対物レンズのフォーカス位置を示すフォーカス位置特性に基づいて前記計測標本の表面からの距離を測定する、ことを特徴とする請求項１に記載の蛍光顕微鏡システム。
【請求項３】
前記蛍光顕微鏡は、共焦点レーザ顕微鏡からなる、ことを特徴とする請求項１または２に記載の蛍光顕微鏡システム。
【請求項４】
前記蛍光顕微鏡は、透過型蛍光顕微鏡からなり、暗視野観察により前記蛍光画像を取得する、ことを特徴とする請求項１または２に記載の蛍光顕微鏡システム。
【請求項５】
前記蛍光顕微鏡は、前記計測標本から近赤外領域の蛍光画像を取得するものである、ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の蛍光顕微鏡システム。
【請求項６】
前記蛍光顕微鏡は、前記蛍光画像を取得するマルチスペクトルカメラを有する、ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の蛍光顕微鏡システム。
【請求項７】
蛍光顕微鏡により計測標本の蛍光画像を取得し、その取得した蛍光画像から検量線を用いて蛍光物質を定量するにあたり、
距離測定部において、前記蛍光画像を取得する前記計測標本の表面からの距離を測定するステップと、
蛍光物質定量部において、測定された前記距離に対応する検量線を記憶部から選択し、その選択された検量線を用いて前記蛍光画像から前記蛍光物質を定量するステップと、
を含むことを特徴とする蛍光物質の定量方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１３−１１５２７（Ｐ２０１３−１１５２７Ａ）
【公開日】平成２５年１月１７日（２０１３．１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１４４７４８（Ｐ２０１１−１４４７４８）
【出願日】平成２３年６月２９日（２０１１．６．２９）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年１月１７日（２０１３．１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年６月２９日（２０１１．６．２９）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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