血小板活性化能の測定方法および抗血小板薬の評価方法
【課題】 抗血小板薬の効果を評価するため、血小板凝集の基となる血小板活性化能を、感度良く測定する方法を提供することをその主な課題とする。
【解決手段】 ヒトから採血した全血を、凝集させない状態に保つ工程；前記全血液に、血小板刺激物質を接触させる工程；前記工程により生じた活性化血小板を固定する工程；蛍光標識抗ＣＤ６１抗体および蛍光標識ＣＤ６２Ｐ抗体を用いて免疫反応を行う工程；およびフローサイトメトリーを使用し、ＣＤ６２Ｐ値を測定する工程；を含む血小板活性化能の測定方法、および該測定方法による結果を指標とする、抗血小板薬の評価方法を提供する。
【解決手段】 ヒトから採血した全血を、凝集させない状態に保つ工程；前記全血液に、血小板刺激物質を接触させる工程；前記工程により生じた活性化血小板を固定する工程；蛍光標識抗ＣＤ６１抗体および蛍光標識ＣＤ６２Ｐ抗体を用いて免疫反応を行う工程；およびフローサイトメトリーを使用し、ＣＤ６２Ｐ値を測定する工程；を含む血小板活性化能の測定方法、および該測定方法による結果を指標とする、抗血小板薬の評価方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血小板活性化能の測定方法および抗血小板薬の評価方法に関し、詳しくは、血中Ｐ−セレクチン（ＣＤ６２Ｐ）測定による血小板活性化能の測定方法、および該測定方法を用いた抗血小板薬の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年における生活習慣の欧米化に伴い、虚血性心疾患や脳血管障害などの血管障害性疾患が、我が国における死因の上位を占めるようになった。これら血管障害性疾患の発症増加には糖尿病、高脂血症、高血圧症および痛風などの生活習慣病の増加が深く関与し、社会的問題になっている。糖尿病や高脂血症では、血管内皮細胞が、高ＬＤＬコレステロールや高血糖状態下で傷害を受け、循環中の血小板を活性化し、凝集を惹起し血栓形成を促進するとされている。このように、血栓には、血小板が活性化されてできる血小板血栓のほか、凝固因子が刺激されることによりできるフィブリン血栓がある。前者にはアスピリンなどによる抗血小板療法が効果的であるとされ、後者にはワーファリンやヘパリンなどによる抗凝固療法が行われている。抗血小板療法や抗凝固療法などの血栓症の治療を行う際に、薬剤効果のモニタリングを行うことは治療効果を上げるためには必要不可欠であるが、抗血小板療法は特別なモニター無しに行われているのが現状である。佐藤らは血小板凝集能検査による抗血小板薬治療効果についてのモニタリングの必要性は高いが、血小板凝集能検査の標準化は行われておらず、その実現化の重要性について報告した（非特許文献１）。
【０００３】
血小板凝集能検査には、従来から使用されている血小板凝集試験（Ｂｏｒｎ法）や、近年開発されたレーザー光散乱法がある。これらの測定法の原理は、刺激物質で血小板を活性化させ、それによって生じた血小板凝集塊を検出する方法である。この方法は、血小板の活性化状態を血小板の凝集状態によって判断するため、測定には専用の機器と大量の試料が必要で、操作の煩雑性、再現性や感度に問題が多いため、広く一般病院で行われていないのが現状である。
【０００４】
近年、血小板凝集を測定する方法として、分子レベルでの測定法も提案されている。特許文献１では、活性化により血小板表面に特異的に出現してくる物質を、免疫学的手法により測定することを明らかにしている。ここでは、活性化糖蛋白質ＩＩｂ／ＩＩＩａに結合する抗体であるＰＡＣ−１を測定し、活性化血小板を検出する方法を示している。特許文献２では、血小板表面に出現してくるＣＤ４０Ｌを、免疫反応を行いウエスタンブロティング法で測定し、血小板凝集を決定する方法を明らかにしている。また、特許文献３では、膜結合および／または可溶性のＰ−セレクチンをモニターして抗血小板薬を評価する方法を明らかにしているが、血小板高含有血漿（ＰＲＰ）あるいは血小板低含有血漿（ＰＰＰ）を用いるため、試験用の血液量を多量に必要とする問題点がある。特許文献４では、全血試料を使用して、Ｐ−セレクチンの発現度を蛍光測定し、血小板活性化度を測定する方法を開示しているが、活性化刺激物質を、凝集の生じやすいクエン酸Ｎａ添加の全血に加えて、血小板の活性化度を測定する従来の活性化方法を用いており、採血した全血を活性化しない状態に保ち、活性化刺激物質でどの程度活性化するか測定する方法を明らかにしたものではない。
【０００５】
微弱な血小板凝集の粒子画像を撮影し判別することにより、生体に近い状態で血小板凝集塊を測定する機器として、フローサイトメトリーが使用されている。フローサイトメトリーに導入して、前方散乱光情報と蛍光情報に基づいて特定することにより、血小板凝集と、骨髄芽球を正確に分類・計数できる測定方法（特許文献５）、フローサイトメトリーを用いて、ヒト末梢血のリンパ球表面抗原のＣＤ４とＣＤ８を染色して分析する方法及び装置（特許文献６）が開示されているが、活性化した血小板表面のＣＤ６２Ｐを検出して血小板の活性化能を測定したものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−１１７１５２号公報（表１）
【特許文献２】特表２００９−５１６２０１号公報（実施例５，図２）
【特許文献３】特表２００１−５２６７７４号公報（表４）
【特許文献４】特表平１０−５１２９５１号公報（例７，例８）
【特許文献５】特開２００７−２６３８９４号公報（実施例１，図１３，図１４）
【特許文献６】特開２００２−３１０８８６号公報（図５，図６）
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】日本検査血液学会 ９：１６７−１７７，２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、抗血小板薬の効果を評価するため、血小板凝集の基となる血小板活性化能を、感度良く測定する方法を提供することをその主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、活性化された血小板表面に表出するＣＤ６２Ｐ値を検出し、血小板活性化能を感度良く測定する方法を開発した。さらに、この測定法を用いた抗血小板薬の評価方法を見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（６）を提供する。
【００１１】
（１）下記の工程（ａ）〜（ｅ）を含む血小板活性化能の測定方法：
（ａ）ヒトから採血した全血を、凝集させない状態に保つ工程；
（ｂ）前記全血液に、血小板刺激物質を接触させる工程；
（ｃ）前記工程により生じた活性化血小板を固定する工程；
（ｄ）蛍光標識抗ＣＤ６１抗体および蛍光標識ＣＤ６２Ｐ抗体を用いて免疫反応を行う工程；および
（ｅ）フローサイトメトリーを使用し、ＣＤ６２Ｐ値を測定する工程。
【００１２】
（２）前記凝集させない状態に保つ工程が、ＥＤＴＡ塩を加えることにより成す工程である上記（１）に記載の測定方法。
【００１３】
（３）前記血小板刺激物質が、ＡＤＰ、コラーゲン、エピネフリン、リストセチン、コンバルキシン、セロトニン、バソプレシン、カルバゾクロム、血液凝固因子（ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ）、トロンビン、イプシロン−アミノカプロン酸、トラネキサム酸、硫酸プロタミン、エタンシラート、フィトナジオン、エストロン硫酸ナトリウム、エクイリン硫酸ナトリウムから選ばれる刺激物質である上記（１）または（２）のいずれかに記載の測定方法。
【００１４】
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の測定方法による結果を指標とする、抗血小板薬の評価方法。
【００１５】
（５）前記抗血小板薬が、アスピリン、シロスタゾール、ジピリダモール、塩酸チクロピジン、クロフィブレート、イコサペント酸エチル、スルフィンピラゾン、クロピドグレル、ベラプロスト、トロンボモジュリン、プロスタグランジンＥ、抗セロトニン系薬剤、クマリン系抗凝固薬や活性プロテインＣから選ばれる薬剤である上記（４）に記載の方法。
【００１６】
（６）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の測定方法に使用するための試薬および容器から成るキット。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の血小板薬活性化能の測定方法は、特異性が高く、また感度の高い方法であるため、非常に少量の血液で測定を行うため、患者の負担が少なく、優れた測定方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】各濃度の刺激物質を添加した時のＣＤ６２Ｐの陽性率を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、血小板の特性である、凝集する前には、血小板が活性化されていることが必須であることを利用して、従来法とは逆に、「凝集させない状態」で、血小板が、刺激物質によりどの程度まで活性化する能力を有しているかを測定する。そして、この測定条件下で、抗血小板薬と称されている薬物が、血小板の活性化をどの程度抑制できるかを測定し、抗血小板薬を評価するものである。さらにまた、上記刺激物質の種類により、血小板が活性化するルートを予測し、抗血小板薬の選択を提案するものである。
【００２０】
血小板凝集の基となる血小板活性化のメカニズムは、主に２つのルートから説明することが出来る。１つ目のルートは、コラーゲンなどのペプチド鎖による血小板の刺激により、リン脂質からホスホリパーゼによる作用で遊離したアラキドン酸に、シクロオキシゲナーゼが作用し、プロスタグランジンＧ２、さらにトロンボキサンＡ２が生合成する。トロンボキサンＡ２は、血小板内Ｃａ濃度を上昇させ、血小板が活性化する。２つ目のルートは、ＡＤＰによる血小板の刺激により、アデニル酸シクラーゼが抑制され、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）から、３‘，５’環状ＡＭＰ（ｃ−ＡＭＰ）への変換が減少する。さらに、ｃ−ＡＭＰは、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）により加水分解されて減少することにより、細胞膜からのＣａイオンの通過が抑制され、血小板内Ｃａ濃度を上昇し、血小板が活性化する。
【００２１】
血小板は活性化すると、血小板内のα顆粒や濃染顆粒から、さまざまな物質を放出する。ＣＤ６２Ｐもその１つである。ＣＤ６２Ｐは、血小板活性のマーカーとして１９８４年にＪｏｈｎｓｔｏｎ ＧＩらにより発見された（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ＧＩ，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１８１６−１８２３，１９８９）。ＣＤ６２Ｐは、分子量１４０ｋＤａ膜貫通型のタイプ１の糖タンパク質であり、血小板のα顆粒や血管内皮細胞のＷｅｉｂｅｌ−Ｐａｌａｄｅ ｂｏｄｙの顆粒膜に存在する。血小板の活性化により、血小板膜表面に表出して血小板の接着を促進し、血小板凝集に重要な役割を果たしている。本発明は、活性化により表出するＣＤ６２Ｐ値から血小板活性能を測定するものである。具体的には、刺激物質の有無によりＣＤ６２Ｐ値がどの程度上昇するかの上昇比率で表すことができる。
【００２２】
活性化状態でのＣＤ６２Ｐ値を測定するために、本発明は、まず、最初の工程として、血小板の「凝集させない状態」を保つ。本発明の「凝集させない状態」とは、採血した血液が、採血直後の状態、すなわち凝固へ進まない状態を表し、この状態を保つ手段としては、血液にヘパリンやキレート剤などの抗凝固剤を接触させ、血小板内Ｃａ濃度を上昇させない処置を行うこと、あるいは脱カルシウム化することである。キレート剤としては、クエン酸ナトリウムなどのクエン酸塩、エチレンジアミン４酢酸２カリウム（ＥＤＴＡ―２Ｋ）、エチレンジアミン４酢酸２ナトリウム（ＥＤＴＡ―２Ｎａ）などのエチレンジアミン４酢酸塩（ＥＤＴＡ）のほか、ジアミノプロパノール４酢酸塩、エチレンジアミンジプロピオン酸塩などがあげられる。血小板薬の評価に使用するキレート剤については、散乱光が安定していること、血小板の屑が出来にくいことが条件であるが、クエン酸Ｎａやヘパリンよりも、ＥＤＴＡ塩を使用することが好ましい。血小板凝集を阻害するのに有効なキレート剤の使用に際しては、ＥＤＴＡ―２Ｋの場合は、血液試料に対して０．０５〜１％程度、ＥＤＴＡ―２Ｎａの場合は、０．１〜２％程度用いるが、ＥＤＴＡ―２Ｋを０．１〜０．５％用いることが、凝集させない状態を保つ手段として最も望ましい。
【００２３】
本発明の「凝集させない状態」の全血液に、血小板刺激物質を接触させる工程は、未凝集状態の活性化血小板を生じさせるための工程である。本発明で、活性化血小板とは、「血小板の接着を促進するＣＤ６２Ｐが、血小板内のα顆粒から血小板膜表面に表出した血小板」をいう。血小板膜表面に表出したＣＤ６２Ｐを測定することにより、血小板が、血小板刺激物質でどの程度まで活性化する能力を有しているかを測定することが出来る。この場合、比較対象として、刺激物質を接触させない血液も同時に取り扱う。血小板刺激物質としては、ＡＤＰ、コラーゲン、エピネフリン、リストセチン、コンバルキシン、セロトニン、バソプレシン、カルバゾクロム、血液凝固因子（ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ）、トロンビン、イプシロン−アミノカプロン酸、トラネキサム酸、硫酸プロタミン、エタンシラート、フィトナジオン、エストロン硫酸ナトリウム、エクイリン硫酸ナトリウムなどがあげられ、該工程においては、上記刺激物質から１種類を選んで用いる。血小板を刺激するのに有効な血小板刺激物質の使用に際しては、ＡＤＰを添加する場合は、試験液に対し０．０１〜１０μＭ／Ｌ程度、コラーゲンを添加する場合は、試験液に対し０．０１〜１０μｇ／ｍｌ程度加えることが望ましい。また、これらの血小板刺激物質との反応は、５〜３０分行うことが出来るが、より効果的な反応時間は１０分である。
【００２４】
本発明の活性化血小板を固定する工程は、前工程で生じたＣＤ６２Ｐを安定な状態で測定するために行う工程である。固定液としては、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グリオキサールなどを、１種または、２種以上を混合して使用することが出来るが、ホルムアルデヒドとグリオキサールを混合して用いることが好ましい。これらの固定剤は、例えばＰＢＳなどの緩衝液に、各々１００ｍＭ〜２０００ｍＭ／Ｌ程度に溶解して用いることが出来るが、ＣＤ６２Ｐ固定剤は６６６ｍＭ／Ｌホルムアルデヒドと１６７ｍＭ／Ｌグリオキサール混合液が好ましく、固定時間は１〜１０分間であるが、１〜５分間が好ましい。
【００２５】
本発明は、蛍光標識抗ＣＤ６１抗体および蛍光標識ＣＤ６２Ｐ抗体を用いて免疫反応を行う工程を有する。当該工程は、血小板の活性化により表出したＣＤ６２Ｐ値と、全血小板に存在するＣＤ６１（血小板糖たんぱくＧＰＩＩＩａ）値とを蛍光免疫法で測定するが、ＣＤ６２Ｐ値は、好ましくはＰＥ（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｒｉｎ）で蛍光標識したＣＤ６２Ｐ抗体を用い、ＣＤ６１値は、好ましくはＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）で蛍光標識したＣＤ６１抗体を用いて測定する。同時に蛍光反応を行うＦＩＴＣとＰＥの二重標識の組み合わせは、両者とも４８８ｎｍで励起され、ＦＩＴＣは５３０ｎｍ付近に緑色の蛍光を発し、ＰＥは５７０ｎｍ付近の赤色の蛍光を発するので明確に区別することができる。また、ＣＤ６２Ｐ値の陰性対照としては、ＦＩＴＣおよびＰＥとそれぞれに結合したマウス−イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）を用いる。
【００２６】
本発明は、ＣＤ６２Ｐ値を測定する手段として、フローサイトメトリーを使用する。すなわち、本発明の血小板活性化能測定の最終工程は、フローサイトメトリーを使用し、上記免疫反応を行ったＣＤ６２Ｐ陽性率、ＣＤ６１陽性率およびＩｇＧ陽性率の測定値をコンピューター解析することにより、ＣＤ６２Ｐ値を測定する工程である。
【００２７】
フローサイトメトリーとは細い流れの中に、細胞やその他の生物学的な粒子を通過させ、レーザー光を照射して発生した散乱光（前方散乱光：ＦＳＣ、側方散乱光：ＳＳＣ）と蛍光を電圧パルスとして測定し、粒子の物理的な性質や化学的な性質を測定する方法である。１９４７年、Ｗａｌｌａｃｅ Ｃｏｕｌｔｅｒにより原理が考案され、１９５３年に流体による細胞数の計測器が実用化され、１９６９年にアルゴンレーザーを搭載したフローサイトメトリーが開発されている。
【００２８】
活性化血小板の測定においては、１００００〜９００００個の血小板をフローサイトメトリーに供することが望ましく、得られたデータは、適したコンピューターソフトにより解析を行う。例えば、全血小板の測定パラメーターを、内部構造を反映するＳＳＣと、サンプルの大きさを反映するＦＳＣを２軸にとり、作成したドットプロットを、ゲーティング（制限や囲みの設定）を行うことにより、活性化血小板と、凝集塊や細胞屑を分離して解析することが出来る。陰性対照のデータから、ゲーティングを行い、次いでヒストグラムを作成する。ＣＤ６２Ｐ値は、ＣＤ６１陽性率の中からＣＤ６２Ｐ陽性率を測定し、ＣＤ６１とＣＤ６２Ｐの両方が陽性である血小板率から求めることができる。すなわち、フローサイトメトリーを用いたＣＤ６２Ｐ陽性率は、血小板表面に表出するＣＤ６２Ｐ値を反映する。
【００２９】
さらに、本発明は、上記ＣＤ６２Ｐ値の結果を指標として、該抗血小板薬の評価方法を提供するものである。抗血小板薬の評価は以下のように行うことができる。すなわち、抗血小板薬を服用する前後に採血して下記の試験を行う。刺激物質無添加をコントロールとて、そのＣＤ６２Ｐ陽性率（Ａ）を測定する。それと同時に血液にＡＤＰあるいはコラーゲン等の刺激物質を添加してＣＤ６２Ｐ陽性率（Ｂ）を測定する。次にＢ÷ＡからＡＤＰあるいはコラーゲン等の刺激物質添加時のＣＤ６２Ｐ陽性率の上昇比率から血小板活性化能を求め、服用前と服用後の上昇比率を比較して、有意に低値を示しているかどうかを調べる。有意に低値を示していた場合に、抗血小板薬の効果があったと評価する。また、抗血小板薬の評価方法の中には、特定の血小板刺激物質による血小板活性化能から、血小板が活性化するルートを予測し、抗血小板薬を選択することも含まれる。
【００３０】
本発明の、抗血小板薬としては、アスピリン、シロスタゾール、ジピリダモール、塩酸チクロピジン、クロフィブレート、イコサペント酸エチル、スルフィンピラゾン、クロピドグレル、ベラプロスト、トロンボモジュリン、プロスタグランジンＥ、抗セロトニン系薬剤、クマリン系抗凝固薬や活性プロテインＣが含まれる。
【００３１】
本発明の、抗血小板薬を評価する試料となる血液は、対象となる抗血小板薬を服用後、効果が認められるとされる時期のヒトから採血した血液および、服用中止後、薬物の有効性が決められている間に採血した血液が対象となる。
【００３２】
また、本発明の抗血小板薬の評価方法には、試料を提供したヒトに適する抗血小板薬の選択も含まれる。
【００３３】
本発明はまた、血小板活性化能の測定を行うための試薬を予め組み合わせたキットを提供する。該キットには、抗体のほか、固定化担体、標識物質、標識の検出に用いられる基質化合物等の試薬の他、容器を含めることもできる。
【００３４】
以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例をあげるが本発明はこれに限定されない。
【実施例１】
【００３５】
［血液試料］
３０人の健康な成人（年齢２１−２３歳、女性２３名、男性７名）から血液を採取し、血液試料を得た。他に、アスピリン（Ｂａｙｅｒ社製）を１日当たり１００ｍｇ毎日３日間服用した７人の健康な成人（年齢２１−２３歳、女性４名、男性３名）からも採血し、血液試料を得た。上記試験参加者は、既往症もなく他の薬物の服用もしていない。全ての試験参加者には、インフォームドコンセントを与え、この試験実施は山口大学医学部倫理委員会にて承認された。止血方法も含め、採取に関する国際的なガイドラインンに従って、血液は静脈より２ｍｌずつ２本のチューブに採血した。最初のチューブの血液は組織等の混入があるため廃棄し、２本目を試験用の血液とした。
【実施例２】
【００３６】
［ＣＤ６２Ｐ値の測定］
実施例１で得られた１．５ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡ−２Ｋ、または０．１ｍｏｌ／Ｌのクエン酸Ｎａを含有させた末梢血全血４５μｌに、血小板刺激物質ＡＤＰ０．１〜１００μＭ／Ｌまたはコラーゲン０．１〜１００μｇ／ｍｌ溶液を各々５μｌずつ添加し、最終濃度がＡＤＰ ０．０１〜１０μＭ／Ｌまたはコラーゲン０．０１〜１０μｇ／ｍｌの状態で１０分間反応させ、固定液［ＰＢＳ中に、６６６ｍＭ（２％）ホルムアルデヒド１６７ｍＭ（１％）グリオキサールを含有］５μｌを混合して５分間固定した後にリン酸緩衝液（ＰＢＳ）４ｍｌを加えて洗浄し、３０００ｒｐｍで５分間遠心する。上清ＰＢＳ１００μｌを残すように上清ＰＢＳを吸引除去し、固定した血小板を上清ＰＢＳ１００μｌに浮遊させ、ＣＤ６２Ｐ値測定用５０μｌと陰性対照用５０μｌに分ける。ＣＤ６２Ｐ値測定用には、５μｌ蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ＣＤ６１抗体（Ｃａｌｔａｇ研究所製）、および２０μｌのＣＤ６２Ｐ結合フィコエリスリン（ＰＥ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ研究所製）を加え２０分間反応させた。陰性対照用は、５０μｌの血小板溶液と、マウス−イムノグロブリンＧ結合ＦＩＴＣおよびＰＥを反応させた。３３３ｍＭ（１％）のホルムアルデヒドのＰＢＳを３００μｌ添加して反応を止め、フローサイトメトリー（Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００、Ｂｅｃｈｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）で血小板１００００個を測定し、パラメーターをビジュアル統計ソフト（Ｓｔａｔ Ｆｌｅｘ Ｖｅｒ．５．０、アーテック社製）を用いたコンピューター解析により、ＣＤ６２Ｐ値を求めた。
【００３７】
図１に、末梢血に抗凝固剤として一般的に使用されているクエン酸Ｎａと、本発明のＥＤＴＡ−２Ｋ加を添加した全血を使用して、ＡＤＰまたはコラーゲンの各３段階濃度で刺激した時の、各試料のＣＤ６２Ｐ値を反映するＣＤ６２Ｐ陽性率を示した。クエン酸Ｎａ加血は、各刺激物質添加により血小板凝集塊や血小板の屑を形成することから、それらの変化を起こさないＥＤＴＡ−２Ｋ加血と比較して、ＣＤ６２Ｐ陽性率が有意に低下した。
【実施例３】
【００３８】
［抗血小板薬の評価］
７人の健康な成人よりアスピリン服用１０日前、１日前とアスピリンの３日間服用を停止した翌日（停止１日後）、停止１０日後の合計４回の採血を行い、各々直ちに試験に供した。血液はＥＤＴＡ−２Ｋ採血管に採取し、実施例２と同様に免疫反応を行い、フローサイトメトリーにより、ＣＤ６２Ｐ陽性率を求めた。
【００３９】
結果を表１に示した。アスピリンを３日間服用し、服用停止１日後では、全ての血液でＣＤ６２Ｐ値を反映するＣＤ６２Ｐ陽性率が低下した。しかしながら、ＡＤＰ刺激ではアスピリン服用前と同様なＣＤ６２Ｐ陽性率の上昇比率を示したのに対し、コラーゲン刺激の血液においては、服用前に比べてＣＤ６２Ｐ陽性率の上昇比率が低値で、抗血小板薬（アスピリン）による血小板の活性化が抑制されていることが明らかになった。さらに、アスピリン服用の効果が消滅したと考えられる服用停止１０日目では服用前のＣＤ６２Ｐ陽性率及びコラーゲン刺激におけるＣＤ６２Ｐ陽性率の上昇比率は元に戻った。このことから、コラーゲンによる血小板凝集に有効だとされている抗血小板薬アスピリンの効果を、本発明の測定法により証明することが可能であることが確認された。また、チクロピジン等の抗血小板薬剤服用時には、ＡＤＰ刺激におけるＣＤ６２Ｐ陽性率の上昇比率が低値になると予測される。この様に健康な成人において、アスピリン服用１０日前と１日前における各ＣＤ６２Ｐの陽性率およびＣＤ６２Ｐ陽性率の上昇比率が変わらないことから、健康な成人の陽性率を対象として、患者の血液中のＣＤ６２Ｐ陽性率及び各種刺激剤におけるＣＤ６２Ｐ陽性率の上昇比率を測定することにより、患者の血栓形成（亢進・抑制）状態を推測することも可能であると推定された。
【００４０】
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明は、全血中のＣＤ６２Ｐ値を測定することによる血小板活性化能を測定する方法であり、少量の試料で感度・再現性が優れていることから、自動血球分析機に搭載可能な検査法である。このため、抗血小板薬の患者における薬剤動態のモニタリングや、抗血小板薬の有効性の評価を行えるなど臨床検査法として有効な方法になる可能性がある。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血小板活性化能の測定方法および抗血小板薬の評価方法に関し、詳しくは、血中Ｐ−セレクチン（ＣＤ６２Ｐ）測定による血小板活性化能の測定方法、および該測定方法を用いた抗血小板薬の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年における生活習慣の欧米化に伴い、虚血性心疾患や脳血管障害などの血管障害性疾患が、我が国における死因の上位を占めるようになった。これら血管障害性疾患の発症増加には糖尿病、高脂血症、高血圧症および痛風などの生活習慣病の増加が深く関与し、社会的問題になっている。糖尿病や高脂血症では、血管内皮細胞が、高ＬＤＬコレステロールや高血糖状態下で傷害を受け、循環中の血小板を活性化し、凝集を惹起し血栓形成を促進するとされている。このように、血栓には、血小板が活性化されてできる血小板血栓のほか、凝固因子が刺激されることによりできるフィブリン血栓がある。前者にはアスピリンなどによる抗血小板療法が効果的であるとされ、後者にはワーファリンやヘパリンなどによる抗凝固療法が行われている。抗血小板療法や抗凝固療法などの血栓症の治療を行う際に、薬剤効果のモニタリングを行うことは治療効果を上げるためには必要不可欠であるが、抗血小板療法は特別なモニター無しに行われているのが現状である。佐藤らは血小板凝集能検査による抗血小板薬治療効果についてのモニタリングの必要性は高いが、血小板凝集能検査の標準化は行われておらず、その実現化の重要性について報告した（非特許文献１）。
【０００３】
血小板凝集能検査には、従来から使用されている血小板凝集試験（Ｂｏｒｎ法）や、近年開発されたレーザー光散乱法がある。これらの測定法の原理は、刺激物質で血小板を活性化させ、それによって生じた血小板凝集塊を検出する方法である。この方法は、血小板の活性化状態を血小板の凝集状態によって判断するため、測定には専用の機器と大量の試料が必要で、操作の煩雑性、再現性や感度に問題が多いため、広く一般病院で行われていないのが現状である。
【０００４】
近年、血小板凝集を測定する方法として、分子レベルでの測定法も提案されている。特許文献１では、活性化により血小板表面に特異的に出現してくる物質を、免疫学的手法により測定することを明らかにしている。ここでは、活性化糖蛋白質ＩＩｂ／ＩＩＩａに結合する抗体であるＰＡＣ−１を測定し、活性化血小板を検出する方法を示している。特許文献２では、血小板表面に出現してくるＣＤ４０Ｌを、免疫反応を行いウエスタンブロティング法で測定し、血小板凝集を決定する方法を明らかにしている。また、特許文献３では、膜結合および／または可溶性のＰ−セレクチンをモニターして抗血小板薬を評価する方法を明らかにしているが、血小板高含有血漿（ＰＲＰ）あるいは血小板低含有血漿（ＰＰＰ）を用いるため、試験用の血液量を多量に必要とする問題点がある。特許文献４では、全血試料を使用して、Ｐ−セレクチンの発現度を蛍光測定し、血小板活性化度を測定する方法を開示しているが、活性化刺激物質を、凝集の生じやすいクエン酸Ｎａ添加の全血に加えて、血小板の活性化度を測定する従来の活性化方法を用いており、採血した全血を活性化しない状態に保ち、活性化刺激物質でどの程度活性化するか測定する方法を明らかにしたものではない。
【０００５】
微弱な血小板凝集の粒子画像を撮影し判別することにより、生体に近い状態で血小板凝集塊を測定する機器として、フローサイトメトリーが使用されている。フローサイトメトリーに導入して、前方散乱光情報と蛍光情報に基づいて特定することにより、血小板凝集と、骨髄芽球を正確に分類・計数できる測定方法（特許文献５）、フローサイトメトリーを用いて、ヒト末梢血のリンパ球表面抗原のＣＤ４とＣＤ８を染色して分析する方法及び装置（特許文献６）が開示されているが、活性化した血小板表面のＣＤ６２Ｐを検出して血小板の活性化能を測定したものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−１１７１５２号公報（表１）
【特許文献２】特表２００９−５１６２０１号公報（実施例５，図２）
【特許文献３】特表２００１−５２６７７４号公報（表４）
【特許文献４】特表平１０−５１２９５１号公報（例７，例８）
【特許文献５】特開２００７−２６３８９４号公報（実施例１，図１３，図１４）
【特許文献６】特開２００２−３１０８８６号公報（図５，図６）
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】日本検査血液学会 ９：１６７−１７７，２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、抗血小板薬の効果を評価するため、血小板凝集の基となる血小板活性化能を、感度良く測定する方法を提供することをその主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、活性化された血小板表面に表出するＣＤ６２Ｐ値を検出し、血小板活性化能を感度良く測定する方法を開発した。さらに、この測定法を用いた抗血小板薬の評価方法を見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（６）を提供する。
【００１１】
（１）下記の工程（ａ）〜（ｅ）を含む血小板活性化能の測定方法：
（ａ）ヒトから採血した全血を、凝集させない状態に保つ工程；
（ｂ）前記全血液に、血小板刺激物質を接触させる工程；
（ｃ）前記工程により生じた活性化血小板を固定する工程；
（ｄ）蛍光標識抗ＣＤ６１抗体および蛍光標識ＣＤ６２Ｐ抗体を用いて免疫反応を行う工程；および
（ｅ）フローサイトメトリーを使用し、ＣＤ６２Ｐ値を測定する工程。
【００１２】
（２）前記凝集させない状態に保つ工程が、ＥＤＴＡ塩を加えることにより成す工程である上記（１）に記載の測定方法。
【００１３】
（３）前記血小板刺激物質が、ＡＤＰ、コラーゲン、エピネフリン、リストセチン、コンバルキシン、セロトニン、バソプレシン、カルバゾクロム、血液凝固因子（ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ）、トロンビン、イプシロン−アミノカプロン酸、トラネキサム酸、硫酸プロタミン、エタンシラート、フィトナジオン、エストロン硫酸ナトリウム、エクイリン硫酸ナトリウムから選ばれる刺激物質である上記（１）または（２）のいずれかに記載の測定方法。
【００１４】
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の測定方法による結果を指標とする、抗血小板薬の評価方法。
【００１５】
（５）前記抗血小板薬が、アスピリン、シロスタゾール、ジピリダモール、塩酸チクロピジン、クロフィブレート、イコサペント酸エチル、スルフィンピラゾン、クロピドグレル、ベラプロスト、トロンボモジュリン、プロスタグランジンＥ、抗セロトニン系薬剤、クマリン系抗凝固薬や活性プロテインＣから選ばれる薬剤である上記（４）に記載の方法。
【００１６】
（６）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の測定方法に使用するための試薬および容器から成るキット。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の血小板薬活性化能の測定方法は、特異性が高く、また感度の高い方法であるため、非常に少量の血液で測定を行うため、患者の負担が少なく、優れた測定方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】各濃度の刺激物質を添加した時のＣＤ６２Ｐの陽性率を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、血小板の特性である、凝集する前には、血小板が活性化されていることが必須であることを利用して、従来法とは逆に、「凝集させない状態」で、血小板が、刺激物質によりどの程度まで活性化する能力を有しているかを測定する。そして、この測定条件下で、抗血小板薬と称されている薬物が、血小板の活性化をどの程度抑制できるかを測定し、抗血小板薬を評価するものである。さらにまた、上記刺激物質の種類により、血小板が活性化するルートを予測し、抗血小板薬の選択を提案するものである。
【００２０】
血小板凝集の基となる血小板活性化のメカニズムは、主に２つのルートから説明することが出来る。１つ目のルートは、コラーゲンなどのペプチド鎖による血小板の刺激により、リン脂質からホスホリパーゼによる作用で遊離したアラキドン酸に、シクロオキシゲナーゼが作用し、プロスタグランジンＧ２、さらにトロンボキサンＡ２が生合成する。トロンボキサンＡ２は、血小板内Ｃａ濃度を上昇させ、血小板が活性化する。２つ目のルートは、ＡＤＰによる血小板の刺激により、アデニル酸シクラーゼが抑制され、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）から、３‘，５’環状ＡＭＰ（ｃ−ＡＭＰ）への変換が減少する。さらに、ｃ−ＡＭＰは、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）により加水分解されて減少することにより、細胞膜からのＣａイオンの通過が抑制され、血小板内Ｃａ濃度を上昇し、血小板が活性化する。
【００２１】
血小板は活性化すると、血小板内のα顆粒や濃染顆粒から、さまざまな物質を放出する。ＣＤ６２Ｐもその１つである。ＣＤ６２Ｐは、血小板活性のマーカーとして１９８４年にＪｏｈｎｓｔｏｎ ＧＩらにより発見された（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ＧＩ，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１８１６−１８２３，１９８９）。ＣＤ６２Ｐは、分子量１４０ｋＤａ膜貫通型のタイプ１の糖タンパク質であり、血小板のα顆粒や血管内皮細胞のＷｅｉｂｅｌ−Ｐａｌａｄｅ ｂｏｄｙの顆粒膜に存在する。血小板の活性化により、血小板膜表面に表出して血小板の接着を促進し、血小板凝集に重要な役割を果たしている。本発明は、活性化により表出するＣＤ６２Ｐ値から血小板活性能を測定するものである。具体的には、刺激物質の有無によりＣＤ６２Ｐ値がどの程度上昇するかの上昇比率で表すことができる。
【００２２】
活性化状態でのＣＤ６２Ｐ値を測定するために、本発明は、まず、最初の工程として、血小板の「凝集させない状態」を保つ。本発明の「凝集させない状態」とは、採血した血液が、採血直後の状態、すなわち凝固へ進まない状態を表し、この状態を保つ手段としては、血液にヘパリンやキレート剤などの抗凝固剤を接触させ、血小板内Ｃａ濃度を上昇させない処置を行うこと、あるいは脱カルシウム化することである。キレート剤としては、クエン酸ナトリウムなどのクエン酸塩、エチレンジアミン４酢酸２カリウム（ＥＤＴＡ―２Ｋ）、エチレンジアミン４酢酸２ナトリウム（ＥＤＴＡ―２Ｎａ）などのエチレンジアミン４酢酸塩（ＥＤＴＡ）のほか、ジアミノプロパノール４酢酸塩、エチレンジアミンジプロピオン酸塩などがあげられる。血小板薬の評価に使用するキレート剤については、散乱光が安定していること、血小板の屑が出来にくいことが条件であるが、クエン酸Ｎａやヘパリンよりも、ＥＤＴＡ塩を使用することが好ましい。血小板凝集を阻害するのに有効なキレート剤の使用に際しては、ＥＤＴＡ―２Ｋの場合は、血液試料に対して０．０５〜１％程度、ＥＤＴＡ―２Ｎａの場合は、０．１〜２％程度用いるが、ＥＤＴＡ―２Ｋを０．１〜０．５％用いることが、凝集させない状態を保つ手段として最も望ましい。
【００２３】
本発明の「凝集させない状態」の全血液に、血小板刺激物質を接触させる工程は、未凝集状態の活性化血小板を生じさせるための工程である。本発明で、活性化血小板とは、「血小板の接着を促進するＣＤ６２Ｐが、血小板内のα顆粒から血小板膜表面に表出した血小板」をいう。血小板膜表面に表出したＣＤ６２Ｐを測定することにより、血小板が、血小板刺激物質でどの程度まで活性化する能力を有しているかを測定することが出来る。この場合、比較対象として、刺激物質を接触させない血液も同時に取り扱う。血小板刺激物質としては、ＡＤＰ、コラーゲン、エピネフリン、リストセチン、コンバルキシン、セロトニン、バソプレシン、カルバゾクロム、血液凝固因子（ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ）、トロンビン、イプシロン−アミノカプロン酸、トラネキサム酸、硫酸プロタミン、エタンシラート、フィトナジオン、エストロン硫酸ナトリウム、エクイリン硫酸ナトリウムなどがあげられ、該工程においては、上記刺激物質から１種類を選んで用いる。血小板を刺激するのに有効な血小板刺激物質の使用に際しては、ＡＤＰを添加する場合は、試験液に対し０．０１〜１０μＭ／Ｌ程度、コラーゲンを添加する場合は、試験液に対し０．０１〜１０μｇ／ｍｌ程度加えることが望ましい。また、これらの血小板刺激物質との反応は、５〜３０分行うことが出来るが、より効果的な反応時間は１０分である。
【００２４】
本発明の活性化血小板を固定する工程は、前工程で生じたＣＤ６２Ｐを安定な状態で測定するために行う工程である。固定液としては、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グリオキサールなどを、１種または、２種以上を混合して使用することが出来るが、ホルムアルデヒドとグリオキサールを混合して用いることが好ましい。これらの固定剤は、例えばＰＢＳなどの緩衝液に、各々１００ｍＭ〜２０００ｍＭ／Ｌ程度に溶解して用いることが出来るが、ＣＤ６２Ｐ固定剤は６６６ｍＭ／Ｌホルムアルデヒドと１６７ｍＭ／Ｌグリオキサール混合液が好ましく、固定時間は１〜１０分間であるが、１〜５分間が好ましい。
【００２５】
本発明は、蛍光標識抗ＣＤ６１抗体および蛍光標識ＣＤ６２Ｐ抗体を用いて免疫反応を行う工程を有する。当該工程は、血小板の活性化により表出したＣＤ６２Ｐ値と、全血小板に存在するＣＤ６１（血小板糖たんぱくＧＰＩＩＩａ）値とを蛍光免疫法で測定するが、ＣＤ６２Ｐ値は、好ましくはＰＥ（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｒｉｎ）で蛍光標識したＣＤ６２Ｐ抗体を用い、ＣＤ６１値は、好ましくはＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）で蛍光標識したＣＤ６１抗体を用いて測定する。同時に蛍光反応を行うＦＩＴＣとＰＥの二重標識の組み合わせは、両者とも４８８ｎｍで励起され、ＦＩＴＣは５３０ｎｍ付近に緑色の蛍光を発し、ＰＥは５７０ｎｍ付近の赤色の蛍光を発するので明確に区別することができる。また、ＣＤ６２Ｐ値の陰性対照としては、ＦＩＴＣおよびＰＥとそれぞれに結合したマウス−イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）を用いる。
【００２６】
本発明は、ＣＤ６２Ｐ値を測定する手段として、フローサイトメトリーを使用する。すなわち、本発明の血小板活性化能測定の最終工程は、フローサイトメトリーを使用し、上記免疫反応を行ったＣＤ６２Ｐ陽性率、ＣＤ６１陽性率およびＩｇＧ陽性率の測定値をコンピューター解析することにより、ＣＤ６２Ｐ値を測定する工程である。
【００２７】
フローサイトメトリーとは細い流れの中に、細胞やその他の生物学的な粒子を通過させ、レーザー光を照射して発生した散乱光（前方散乱光：ＦＳＣ、側方散乱光：ＳＳＣ）と蛍光を電圧パルスとして測定し、粒子の物理的な性質や化学的な性質を測定する方法である。１９４７年、Ｗａｌｌａｃｅ Ｃｏｕｌｔｅｒにより原理が考案され、１９５３年に流体による細胞数の計測器が実用化され、１９６９年にアルゴンレーザーを搭載したフローサイトメトリーが開発されている。
【００２８】
活性化血小板の測定においては、１００００〜９００００個の血小板をフローサイトメトリーに供することが望ましく、得られたデータは、適したコンピューターソフトにより解析を行う。例えば、全血小板の測定パラメーターを、内部構造を反映するＳＳＣと、サンプルの大きさを反映するＦＳＣを２軸にとり、作成したドットプロットを、ゲーティング（制限や囲みの設定）を行うことにより、活性化血小板と、凝集塊や細胞屑を分離して解析することが出来る。陰性対照のデータから、ゲーティングを行い、次いでヒストグラムを作成する。ＣＤ６２Ｐ値は、ＣＤ６１陽性率の中からＣＤ６２Ｐ陽性率を測定し、ＣＤ６１とＣＤ６２Ｐの両方が陽性である血小板率から求めることができる。すなわち、フローサイトメトリーを用いたＣＤ６２Ｐ陽性率は、血小板表面に表出するＣＤ６２Ｐ値を反映する。
【００２９】
さらに、本発明は、上記ＣＤ６２Ｐ値の結果を指標として、該抗血小板薬の評価方法を提供するものである。抗血小板薬の評価は以下のように行うことができる。すなわち、抗血小板薬を服用する前後に採血して下記の試験を行う。刺激物質無添加をコントロールとて、そのＣＤ６２Ｐ陽性率（Ａ）を測定する。それと同時に血液にＡＤＰあるいはコラーゲン等の刺激物質を添加してＣＤ６２Ｐ陽性率（Ｂ）を測定する。次にＢ÷ＡからＡＤＰあるいはコラーゲン等の刺激物質添加時のＣＤ６２Ｐ陽性率の上昇比率から血小板活性化能を求め、服用前と服用後の上昇比率を比較して、有意に低値を示しているかどうかを調べる。有意に低値を示していた場合に、抗血小板薬の効果があったと評価する。また、抗血小板薬の評価方法の中には、特定の血小板刺激物質による血小板活性化能から、血小板が活性化するルートを予測し、抗血小板薬を選択することも含まれる。
【００３０】
本発明の、抗血小板薬としては、アスピリン、シロスタゾール、ジピリダモール、塩酸チクロピジン、クロフィブレート、イコサペント酸エチル、スルフィンピラゾン、クロピドグレル、ベラプロスト、トロンボモジュリン、プロスタグランジンＥ、抗セロトニン系薬剤、クマリン系抗凝固薬や活性プロテインＣが含まれる。
【００３１】
本発明の、抗血小板薬を評価する試料となる血液は、対象となる抗血小板薬を服用後、効果が認められるとされる時期のヒトから採血した血液および、服用中止後、薬物の有効性が決められている間に採血した血液が対象となる。
【００３２】
また、本発明の抗血小板薬の評価方法には、試料を提供したヒトに適する抗血小板薬の選択も含まれる。
【００３３】
本発明はまた、血小板活性化能の測定を行うための試薬を予め組み合わせたキットを提供する。該キットには、抗体のほか、固定化担体、標識物質、標識の検出に用いられる基質化合物等の試薬の他、容器を含めることもできる。
【００３４】
以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例をあげるが本発明はこれに限定されない。
【実施例１】
【００３５】
［血液試料］
３０人の健康な成人（年齢２１−２３歳、女性２３名、男性７名）から血液を採取し、血液試料を得た。他に、アスピリン（Ｂａｙｅｒ社製）を１日当たり１００ｍｇ毎日３日間服用した７人の健康な成人（年齢２１−２３歳、女性４名、男性３名）からも採血し、血液試料を得た。上記試験参加者は、既往症もなく他の薬物の服用もしていない。全ての試験参加者には、インフォームドコンセントを与え、この試験実施は山口大学医学部倫理委員会にて承認された。止血方法も含め、採取に関する国際的なガイドラインンに従って、血液は静脈より２ｍｌずつ２本のチューブに採血した。最初のチューブの血液は組織等の混入があるため廃棄し、２本目を試験用の血液とした。
【実施例２】
【００３６】
［ＣＤ６２Ｐ値の測定］
実施例１で得られた１．５ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡ−２Ｋ、または０．１ｍｏｌ／Ｌのクエン酸Ｎａを含有させた末梢血全血４５μｌに、血小板刺激物質ＡＤＰ０．１〜１００μＭ／Ｌまたはコラーゲン０．１〜１００μｇ／ｍｌ溶液を各々５μｌずつ添加し、最終濃度がＡＤＰ ０．０１〜１０μＭ／Ｌまたはコラーゲン０．０１〜１０μｇ／ｍｌの状態で１０分間反応させ、固定液［ＰＢＳ中に、６６６ｍＭ（２％）ホルムアルデヒド１６７ｍＭ（１％）グリオキサールを含有］５μｌを混合して５分間固定した後にリン酸緩衝液（ＰＢＳ）４ｍｌを加えて洗浄し、３０００ｒｐｍで５分間遠心する。上清ＰＢＳ１００μｌを残すように上清ＰＢＳを吸引除去し、固定した血小板を上清ＰＢＳ１００μｌに浮遊させ、ＣＤ６２Ｐ値測定用５０μｌと陰性対照用５０μｌに分ける。ＣＤ６２Ｐ値測定用には、５μｌ蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ＣＤ６１抗体（Ｃａｌｔａｇ研究所製）、および２０μｌのＣＤ６２Ｐ結合フィコエリスリン（ＰＥ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ研究所製）を加え２０分間反応させた。陰性対照用は、５０μｌの血小板溶液と、マウス−イムノグロブリンＧ結合ＦＩＴＣおよびＰＥを反応させた。３３３ｍＭ（１％）のホルムアルデヒドのＰＢＳを３００μｌ添加して反応を止め、フローサイトメトリー（Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００、Ｂｅｃｈｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）で血小板１００００個を測定し、パラメーターをビジュアル統計ソフト（Ｓｔａｔ Ｆｌｅｘ Ｖｅｒ．５．０、アーテック社製）を用いたコンピューター解析により、ＣＤ６２Ｐ値を求めた。
【００３７】
図１に、末梢血に抗凝固剤として一般的に使用されているクエン酸Ｎａと、本発明のＥＤＴＡ−２Ｋ加を添加した全血を使用して、ＡＤＰまたはコラーゲンの各３段階濃度で刺激した時の、各試料のＣＤ６２Ｐ値を反映するＣＤ６２Ｐ陽性率を示した。クエン酸Ｎａ加血は、各刺激物質添加により血小板凝集塊や血小板の屑を形成することから、それらの変化を起こさないＥＤＴＡ−２Ｋ加血と比較して、ＣＤ６２Ｐ陽性率が有意に低下した。
【実施例３】
【００３８】
［抗血小板薬の評価］
７人の健康な成人よりアスピリン服用１０日前、１日前とアスピリンの３日間服用を停止した翌日（停止１日後）、停止１０日後の合計４回の採血を行い、各々直ちに試験に供した。血液はＥＤＴＡ−２Ｋ採血管に採取し、実施例２と同様に免疫反応を行い、フローサイトメトリーにより、ＣＤ６２Ｐ陽性率を求めた。
【００３９】
結果を表１に示した。アスピリンを３日間服用し、服用停止１日後では、全ての血液でＣＤ６２Ｐ値を反映するＣＤ６２Ｐ陽性率が低下した。しかしながら、ＡＤＰ刺激ではアスピリン服用前と同様なＣＤ６２Ｐ陽性率の上昇比率を示したのに対し、コラーゲン刺激の血液においては、服用前に比べてＣＤ６２Ｐ陽性率の上昇比率が低値で、抗血小板薬（アスピリン）による血小板の活性化が抑制されていることが明らかになった。さらに、アスピリン服用の効果が消滅したと考えられる服用停止１０日目では服用前のＣＤ６２Ｐ陽性率及びコラーゲン刺激におけるＣＤ６２Ｐ陽性率の上昇比率は元に戻った。このことから、コラーゲンによる血小板凝集に有効だとされている抗血小板薬アスピリンの効果を、本発明の測定法により証明することが可能であることが確認された。また、チクロピジン等の抗血小板薬剤服用時には、ＡＤＰ刺激におけるＣＤ６２Ｐ陽性率の上昇比率が低値になると予測される。この様に健康な成人において、アスピリン服用１０日前と１日前における各ＣＤ６２Ｐの陽性率およびＣＤ６２Ｐ陽性率の上昇比率が変わらないことから、健康な成人の陽性率を対象として、患者の血液中のＣＤ６２Ｐ陽性率及び各種刺激剤におけるＣＤ６２Ｐ陽性率の上昇比率を測定することにより、患者の血栓形成（亢進・抑制）状態を推測することも可能であると推定された。
【００４０】
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明は、全血中のＣＤ６２Ｐ値を測定することによる血小板活性化能を測定する方法であり、少量の試料で感度・再現性が優れていることから、自動血球分析機に搭載可能な検査法である。このため、抗血小板薬の患者における薬剤動態のモニタリングや、抗血小板薬の有効性の評価を行えるなど臨床検査法として有効な方法になる可能性がある。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程（ａ）〜（ｅ）を含む血小板活性化能の測定方法：
（ａ）ヒトから採血した全血を、凝集させない状態に保つ工程；
（ｂ）前記全血液に、血小板刺激物質を接触させる工程；
（ｃ）前記工程により生じた活性化血小板を固定する工程；
（ｄ）蛍光標識抗ＣＤ６１抗体および蛍光標識ＣＤ６２Ｐ抗体を用いて免疫反応を行う工程；および
（ｅ）フローサイトメトリーを使用し、ＣＤ６２Ｐ値を測定する工程。
【請求項２】
前記凝集させない状態に保つ工程が、ＥＤＴＡ塩を加えることにより成す工程である請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
前記血小板刺激物質が、ＡＤＰ、コラーゲン、エピネフリン、リストセチン、コンバルキシン、セロトニン、バソプレシン、カルバゾクロム、血液凝固因子（ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ）、トロンビン、イプシロン−アミノカプロン酸、トラネキサム酸、硫酸プロタミン、エタンシラート、フィトナジオン、エストロン硫酸ナトリウム、エクイリン硫酸ナトリウムから選ばれる刺激物質である請求項１または２のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の測定方法による結果を指標とする、抗血小板薬の評価方法。
【請求項５】
前記抗血小板薬が、アスピリン、シロスタゾール、ジピリダモール、塩酸チクロピジン、クロフィブレート、イコサペント酸エチル、スルフィンピラゾン、クロピドグレル、ベラプロスト、トロンボモジュリン、プロスタグランジンＥ、抗セロトニン系薬剤、クマリン系抗凝固薬や活性プロテインＣから選ばれる薬剤である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の測定方法に使用するための試薬および容器から成るキット。
【請求項１】
下記の工程（ａ）〜（ｅ）を含む血小板活性化能の測定方法：
（ａ）ヒトから採血した全血を、凝集させない状態に保つ工程；
（ｂ）前記全血液に、血小板刺激物質を接触させる工程；
（ｃ）前記工程により生じた活性化血小板を固定する工程；
（ｄ）蛍光標識抗ＣＤ６１抗体および蛍光標識ＣＤ６２Ｐ抗体を用いて免疫反応を行う工程；および
（ｅ）フローサイトメトリーを使用し、ＣＤ６２Ｐ値を測定する工程。
【請求項２】
前記凝集させない状態に保つ工程が、ＥＤＴＡ塩を加えることにより成す工程である請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
前記血小板刺激物質が、ＡＤＰ、コラーゲン、エピネフリン、リストセチン、コンバルキシン、セロトニン、バソプレシン、カルバゾクロム、血液凝固因子（ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ）、トロンビン、イプシロン−アミノカプロン酸、トラネキサム酸、硫酸プロタミン、エタンシラート、フィトナジオン、エストロン硫酸ナトリウム、エクイリン硫酸ナトリウムから選ばれる刺激物質である請求項１または２のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の測定方法による結果を指標とする、抗血小板薬の評価方法。
【請求項５】
前記抗血小板薬が、アスピリン、シロスタゾール、ジピリダモール、塩酸チクロピジン、クロフィブレート、イコサペント酸エチル、スルフィンピラゾン、クロピドグレル、ベラプロスト、トロンボモジュリン、プロスタグランジンＥ、抗セロトニン系薬剤、クマリン系抗凝固薬や活性プロテインＣから選ばれる薬剤である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の測定方法に使用するための試薬および容器から成るキット。
【図１】
【公開番号】特開２０１２−８０４４（Ｐ２０１２−８０４４Ａ）
【公開日】平成２４年１月１２日（２０１２．１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１４５１６２（Ｐ２０１０−１４５１６２）
【出願日】平成２２年６月２５日（２０１０．６．２５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ▲１▼第１１回日本検査血液学会学術集会ホームページ平成２２年５月２７日発表 ｈｔｔｐ：／／ａｃｃｅｓｓｂｒａｉｎ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｓｌｈ１１／ ｈｔｔｐ：／／ａｃｃｅｓｓｂｒａｉｎ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｓｌｈ１１／ｐｒｏｇｒａｍ．ｈｔｍｌ ｈｔｔｐ：／／ａｃｃｅｓｓｂｒａｉｎ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｓｌｈ１１／ｐｒｏｇｒａｍ０２．ｐｄｆ ▲２▼日本検査血液学会、日本検査血液学会雑誌 第１１巻 学術集会号 第１１回日本検査血液学術集会、プログラム抄録集（Ｓ１０８、８３）、 平成２２年６月１６日発行
【出願人】（３０４０２０１７７）国立大学法人山口大学 (579)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１月１２日（２０１２．１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月２５日（２０１０．６．２５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ▲１▼第１１回日本検査血液学会学術集会ホームページ平成２２年５月２７日発表 ｈｔｔｐ：／／ａｃｃｅｓｓｂｒａｉｎ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｓｌｈ１１／ ｈｔｔｐ：／／ａｃｃｅｓｓｂｒａｉｎ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｓｌｈ１１／ｐｒｏｇｒａｍ．ｈｔｍｌ ｈｔｔｐ：／／ａｃｃｅｓｓｂｒａｉｎ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｓｌｈ１１／ｐｒｏｇｒａｍ０２．ｐｄｆ ▲２▼日本検査血液学会、日本検査血液学会雑誌 第１１巻 学術集会号 第１１回日本検査血液学術集会、プログラム抄録集（Ｓ１０８、８３）、 平成２２年６月１６日発行
【出願人】（３０４０２０１７７）国立大学法人山口大学 (579)
【Ｆターム（参考）】
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