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血液中の浮遊癌細胞を捕捉できるマイクロチップ
説明

血液中の浮遊癌細胞を捕捉できるマイクロチップ

【課題】血液中の浮遊癌細胞の単離又は検出に優れ、生産性が高く安価である樹脂製のマイクロチップの提供を目的とする。
特に血中浮遊癌細胞を単離及び検出するのに有効な樹脂製のマイクロチップの提供を目的とする。
【解決手段】1個の重合性二重結合を有しカルボキシル基および/またはエポキシ基を有する単量体Zと、1個の重合性二重結合を有する単量体Z以外の単量体Xと、架橋反応可能な2個以上の重合性二重結合を有する単量体Yと、重合体Bとからなる混合物を重合固化した重合体組成物からなるマイクロチップであって、当該重合体組成物の表面又は内部に流体を通すことができるミクロな構造を有する流路を有し、当該流路は表面の少なくとも一部に癌細胞表面に存在する抗原と結合する抗体が固定されていることを特徴とする。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は血液中の浮遊癌細胞を単離又は検出するための機能性マイクロチップに関する。
【背景技術】
【0002】
癌の治療や研究において、癌細胞を直接解析する重要性が認識されてはいるものの、その採取は大きな身体的負担が伴うことなどから一般に容易ではない。
一方、近年の研究により、癌の初期段階から末梢血中に癌細胞が存在することが明らかにされており、このような血中の細胞を単離できれば癌細胞を容易に採取できる。
しかし血中の癌細胞濃度は極めて低いため、通常の分離技術では血液が大量に必要となり、現状では実質的に癌細胞の単離は不可能となっている。
非特許文献1は、シリコンウェハを加工したマイクロチップの流路に抗体を固定化し、数mlの血液を流して癌細胞を捕捉する技術を開示する。
しかし、同文献に開示するマイクロチップはシリコンウェハを加工したものであり、加工手順が複雑で高価となること、不透明で透過観察ができないこと、脆いため使用範囲が限定されることなどから、実用性に劣るものであった。
また、特許文献1に金薄膜表面に抗体を固定したマイクロチップを開示するが、やはり構造が複雑で高価であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】特開2010−38628号公報
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology , Sunitha Nagrath et al , Nature Vol.450(2007) , P.1235
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、血液中の浮遊癌細胞の単離又は検出に優れ、生産性が高く安価である樹脂製のマイクロチップの提供を目的とする。
特に血中浮遊癌細胞を単離及び検出するのに有効な樹脂製のマイクロチップの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明に係るマイクロチップは、1個の重合性二重結合を有しカルボキシル基および/またはエポキシ基を有する単量体Zと、1個の重合性二重結合を有する単量体Z以外の単量体Xと、架橋反応可能な2個以上の重合性二重結合を有する単量体Yと、重合体Bとからなる混合物を重合固化した重合体組成物からなるマイクロチップであって、当該重合体組成物の表面又は内部に流体を通すことができるミクロな構造を有する流路を有し、当該流路は表面の少なくとも一部に癌細胞表面に存在する抗原と結合する抗体が固定されていることを特徴とする。
本発明は、マイクロ流路に直接的に癌細胞表面に存在する抗原と結合する抗体を固定したものである。
【0007】
また、本発明は、1個の重合性二重結合を有しカルボキシル基と反応する官能基を有する単量体Zと、1個の重合性二重結合を有する単量体Z以外の単量体Xと、架橋反応可能な2個以上の重合性二重結合を有する単量体Yと、重合体Bとからなる混合物を重合固化した重合体組成物からなるマイクロチップであって、当該重合体組成物の表面又は内部に流体を通すことができるミクロな構造を有する流路を有し、当該流路は表面の少なくとも一部にカルボキシル基を有する水溶性ポリマーを結合してあるとともに当該水溶性ポリマーを介して癌細胞表面に存在する抗原と結合する抗体が固定されていてもよい。
この場合に抗体と結合する水溶性ポリマーをマイクロチップの流路表面に固定化(共有結合)した点に特徴がある。
本発明において、重合体組成物の表面又は内部に流路を有すると表現したのは、重合体組成物の表面にマイクロ流路を形成し、このマイクロ流路の上に透明樹脂プレート又はガラスカバー等の蓋体を重ね合せて血液を送り込む流路を形成してもよく、表面にマイクロ流路を形成した重合体組成物を2つ以上重ね合せて二次元,三次元の立体的な流路を形成してもよい趣旨である。
このようなマイクロチップは光透過性を有し、透過観察ができる。
【0008】
血中に浮遊する癌細胞の表面に存在する抗原に反応する抗体を固定するための、カルボキシル基を有する水溶性のポリマーは、ポリアクリル酸,ポリアクリル酸共重合体,ポリメタクリル酸,ポリメタクリル酸共重合体等が好ましい。
そこで、本発明に係る重合体組成物(樹脂)にカルボキシル基と反応する官能基を有する単量体Zを含有するようにした。
単量体Zは、フリーラジカル重合により重合する1個の重合性二重結合を有するのが好ましく、重合体組成物中に単量体Zは10〜35質量%含有するのが好ましい。
10%未満ではカルボキシル基を有する水溶性ポリマーが十分に付かないからであり、35%を超えると硬度上昇や吸着力の上昇で成形性に問題が生じる。
【0009】
単量体Zは、1個の重合性二重結合を有し、カルボキシル基及び/又はエポキシ基を有するもの、あるいは、カルボキシル基と反応する官能基を有するものであればよい。
このような単量体の例としては、グリシジルアクリレート、グリシジルメタクリレート、アリルグリシジルエーテル、4−ビニルシクロヘキサンモノエポキサイド、2−アミノエチルビニルエーテル、ジメチルアミノエチルアクリレート、ジメチルアミノエチルメタクリレート、ジエチルアミノエチルアクリレート、ジエチルアミノエチルメタクリレート、t−ブチルアミノエチルメタクリレート、N−メチロールアクリルアミド、N−メチロールメタクリルアミド等が挙げられる。
【0010】
単量体Yは、重合時に架橋反応を行わせるためのものである。
単量体Yの重合体組成物中の含有量は5〜35質量%がよい。
5%未満では重合体組成物の粘接着力が高くなり過ぎ、35%を超えると重合体組成物が硬く脆くなり過ぎる。
単量体Yの例としては、ジ(メタ)アクリル酸エチレングリコール、ジ(メタ)アクリル酸ブタンジオール、ジ(メタ)アクリル酸1,6−ヘキサンジオール、ジ(メタ)アクリル酸1,10−デカンジオール、ポリエチレングリコールジ(メタ)アクリレート、アリル(メタ)アクリレートなどが挙げられる。
【0011】
単量体ZとYとの重合体組成物では、柔軟性に劣る場合がある。
そこで、単量体Zと単量体Yの他に、当該単量体Z及びYに均一に混合し、重合体組成物を柔軟化するためのガラス転移温度が10℃以下であり、1個の重合性二重結合を有する単量体Xを含有してもよい。
単量体Xとしては、アルキル基、シクロアルキル基がエステル部分に結合した(メタ)アクリレートが挙げられる。
このような単量体の例としては、メチルアクリレート、エチルアクリレート、プロピルアクリレート、ブチルアクリレート、ヘキシルアクリレート、2−エチルヘキシルアクリレート、ラウリルアクリレート、ノニルアクリレート、シクロヘキシルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、プロピルメタクリレート、ブチルメタクリレート、ヘキシルメタクリレート、2−エチルヘキシルメタクリレート、ラウリルメタクリレート、ノニルメタクリレート、シクロヘキシルメタクリレートなどが挙げられる。
【0012】
上記単量体X,Y及びZからなる重合体組成物は重合時の収縮が大き過ぎたり、弾性に劣る場合もある。
そこで、単量体X,Y及びZに均一に混合又は分散する重合体Bを含有し、重合体Bは重合体組成物の重合収縮を抑えると共に弾性向上を図るものである。
重合体Bは、単量体X,Y及びZの混合液体に溶解またはコロイド状に分散する重合体であれば特に制限はなく、ポリ(メタ)アクリレート類、ビニル系ポリマー類、ジエン系ポリマー類、縮合系ポリマー類等が使用できる。
また、本発明において重合体Bは、コア・シェル型の高分子微粒子であってもよい。
重合体Bをコア・シェル型の高分子微粒子とした場合に、本発明に係る微細構造体を単量体X,Y及びZの混合物に重合体Bを溶解又は分散させ、光重合により硬化させる際に粘度の上昇が抑えられ取扱いが容易となる。
重合体Bのコア・シェル型高分子微粒子は、伸張した歪100%の状態における発生応力が100MPa以下であるのが好ましく、20MPa以下であるのがより好ましい。
前記のとおり微細構造体を構成する重合体組成物には、離型性を向上するために弾性を付与することが必要なため、重合体Bは柔軟であることが好ましい。
コア・シェル粒子の粒子径には特に制限が無いが、製造方法としては乳化重合を使用しやすいことを考慮すると、粒子径は0.01〜10μmの範囲にあるものが使用しやすい。
コア・シェル粒子のシェルに使用される高分子は特に制限は無いが、製造方法として乳化重合を使用しやすいことや蛍光の発生を考慮すると、ポリメチルメタクリレートのような(メタ)アクリレート重合体およびその共重合体、ポリ酢酸ビニルおよびその共重合体などが挙げられる。
コア・シェル粒子のコアに使用される高分子は特に制限は無いが、製造方法として乳化重合を使用しやすいことや蛍光の発生を考慮すると、ポリブチルアクリレートのような(メタ)アクリレート重合体およびその共重合体、ポリ酢酸ビニルおよびその共重合体などが挙げられる。
コア・シェル型の高分子微粒子は、形状を保持するために、少なくともコア部分が架橋されているのが好ましい。
これにより重合体Bは微細構造体を構成する重合体組成物の中で安定に分散相を形成し、柔軟な場合には弾性体として良好に機能することができる。
架橋を形成する単量体については特に制限が無く、ジビニルモノマー類、ジ(メタ)アクリレート類、アリル(メタ)アクリレートなどが挙げられる。
【0013】
本発明に係るマイクロチップは、単量体X,Y,Z及び重合体Bの混合物を鋳型に流し込み、光重合により固化することができる。
光重合開始剤については特に制限はなく、ベンゾインエーテル系、ケタール系、アセトフェノン系、ベンゾフェノン系、チオキサントン系などの光重合開始剤から自由に選択して用いることができる。
また光硬化性樹脂には、本発明の効果を阻害しない範囲で、モノマー、ポリマー、無機フィラーなどを自由に配合しても良い。
光重合に用いる光照射装置については特に制限が無く、高圧水銀ランプ、メタルハライドランプ、UV放電管などを装備した装置を自由に用いることができる。
光硬化性樹脂の硬化は、重合性の観点から窒素雰囲気中で行なうのがより好ましい。
【0014】
本発明に係るマイクロチップは、血液中の浮遊癌細胞を捕捉するのが目的である。
従って、マイクロ流路は血液の流れを確保しつつ、表面積の大きい方が好ましい。
そこで本発明に係るマイクロチップは、流路の深さが50〜150μmであり、流路底面に深さ以下の高さを有する突起を複数個配してあり、隣接する突起間の最小の間隔が50〜100μmであるのが好ましい。
ここで突起の高さを流路深さ以下にしたのは、マイクロ流路の上部に樹脂プレートやガラスカバー等の透明な蓋体を重ね合せた際に突起上部と干渉しないようにするためである。
突起の数は少なくとも100個以上有するのが好ましく、突起形状そのもに限定はない。
なお、流路底面に配した突起がマイクロ柱であり、当該マイクロ柱は外接円直径が50〜200μmであると、マイクロ柱の側面に血液中の浮遊癌細胞を捕捉しやすく、マイクロ柱や突起同士の最小間隔を50〜100μmに設定することで、直径数μm〜数十μmの血液細胞の流れが阻害されない。
【発明の効果】
【0015】
本発明に係るマイクロチップは、樹脂製であることから生産性が高く安価であり、流路中に抗体を固定化できることから、癌細胞表面に存在する抗原と結合する抗体を用いて流体中から浮遊癌細胞を単離及び検出できる。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】本発明に係るマイクロチップの流路拡大像を示す。
【図2】本発明に係るマイクロチップの全体像を示す。
【図3】マイクロチップをホルダに装着した状態の例を示す。
【図4】本発明に係るマイクロチップを用いた癌細胞捕捉試験結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0017】
本発明に係るマイクロチップの製造例について説明する。
単量体Zとして、和光純薬製のメタクリル酸グリシジルを使用した。
単量体Xとして、和光純薬工業製のn−ブチルアクリレート(重合体のガラス転移温度:−50℃)を使用した。
単量体Yとして、日本油脂製のジエチレングリコールジメタクリレートであるブレンマーPDE−100を使用した。
重合体Bとして、クラレ製のパラペットSA−NW201(コア・シェル型高分子微粒子で、歪100%の発生応力11MPa)を使用した。
光重合開始剤として、チバ・スペシャルティ・ケミカルズ製の光重合開始剤DAROCUR 1173(2−ヒドロキシ−2−メチル−1−フェニル−プロパン−1−オン)を使用した。
単量体Z:メタクリル酸グリシジルを40重量部,単量体Y:ブレンマーPDE−100を40重量部,単量体X:n−ブチルアクリレートを40重量部,重合体B:パラペットSA−NW201を20重量部、光重合開始剤:DAROCUR 1173を1重量部の配合割合で均一に混合し、その混合物をマイクロチップの鋳型上に流し込み、その上からガラスプレートをのせてUV表面加工装置(サンエナジー株式会社製 MDC15001Yー03/SKC1102Y−01)で紫外線照射した(紫外線照射は搬送速度0.3m/minで動くコンベアー上に置いて行った)。
硬化後に取り出したマイクロチップの流路部の拡大写真を図1に、全体像を図2示す。
このマイクロチップをポリアクリル酸10%のメタノール溶液に浸漬し、室温でメタノールを蒸発させたのちに150℃で1時間加熱した。加熱後にマイクロチップを蒸留水で洗浄し、未反応のポリアクリル酸を除去した。
流路にポリアクリル酸が固定できたことは、赤外吸収スペクトル測定(ATR法)により確認した。
このようにしてポリアクリル酸を結合したマイクロチップ表面(流路部)に、抗マウスIgG抗体のPBS溶液(抗体濃度20μg/ml)と1−シクロヘキシル−3−(2−モルホリノエチル)カルボジイミド メト−p−トルエンスルホナートのPBS溶液(濃度20mg/ml)とを1:1で混合した溶液をのせて1時間おき、その後にマイクロチップをPBSで洗浄した。
ここでPBS溶液は一般的に使用されているリン酸緩衝生理食塩水をいう。
このようにして抗マウスIgG抗体を固定したマイクロチップ表面に、抗ヒトEpCAM抗体(免疫動物:マウス)のPBS水溶液(抗体濃度20μg/ml)をのせて1時間おき、その後にマイクロチップをPBSで洗浄した。
【0018】
マイクロチップに送液するために、上記のように処理したマイクロチップ本体に樹脂プレートを重ね、ホルダに装着して送液チューブを接続し(図3参照)、送液チューブにはシリンジを接続してシリンジポンプにより細胞懸濁液を送液した。
細胞懸濁液には、食道癌の細胞株であるKYSE220を用い、濃度40万個/mlのPBS懸濁液とした。
細胞懸濁液を流量1ml/hで約1.5ml送液した後にPBSで浮遊物を流出させて捕捉試験したチップを観察した結果を図4に示す。
抗EpCAM抗体を固定した場合にはマイクロ柱の周囲に多数の細胞が捕捉される(図4a)のに対し、抗EpCAM抗体がない場合(抗マウスIgGの固定まで)には細胞が認められなかった(図4b)。
また抗EpCAM抗体を固定したマイクロチップに健常者の血液を用い同様に捕捉試験してチップを観察した場合には、図4bと同様に細胞が認められなかった。
【0019】
次に、前記同様の単量体、重合体、光重合開始剤を使用し、前記と同様の割合で混合し、UV表面加工装置を用いてマイクロチップを作製した。
得られたマイクロチップの表面に、抗マウスIgG抗体のPBS溶液(抗体濃度10μg/ml)をのせて1時間おき、その後にマイクロチップをPBSで洗浄した。
このようにして抗マウスIgG抗体を固定したマイクロチップ表面に、抗ヒトEpCAM抗体(免疫動物:マウス)のPBS水溶液(抗体濃度20μg/ml)をのせて1時間おき、その後にマイクロチップをPBSで洗浄した。
得られたマイクロチップを前記同様にホルダに装着し、シリンジポンプで細胞懸濁液を送液して捕捉試験を行った。
捕捉試験後にマイクロチップを観察すると、図4aと同様にマイクロ柱の周囲に細胞が捕捉された様子が認められた。
このように抗体とマイクロ流路を組み合わせたマイクロチップにより癌細胞が捕捉できることが確認できた。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
1個の重合性二重結合を有しカルボキシル基および/またはエポキシ基を有する単量体Zと、1個の重合性二重結合を有する単量体Z以外の単量体Xと、架橋反応可能な2個以上の重合性二重結合を有する単量体Yと、重合体Bとからなる混合物を重合固化した重合体組成物からなるマイクロチップであって、
当該重合体組成物の表面又は内部に流体を通すことができるミクロな構造を有する流路を有し、当該流路は表面の少なくとも一部に癌細胞表面に存在する抗原と結合する抗体が固定されていることを特徴とするマイクロチップ。
【請求項2】
1個の重合性二重結合を有しカルボキシル基と反応する官能基を有する単量体Zと、1個の重合性二重結合を有する単量体Z以外の単量体Xと、架橋反応可能な2個以上の重合性二重結合を有する単量体Yと、重合体Bとからなる混合物を重合固化した重合体組成物からなるマイクロチップであって、
当該重合体組成物の表面又は内部に流体を通すことができるミクロな構造を有する流路を有し、当該流路は表面の少なくとも一部にカルボキシル基を有する水溶性ポリマーを結合してあるとともに当該水溶性ポリマーを介して癌細胞表面に存在する抗原と結合する抗体が固定されていることを特徴とするマイクロチップ。
【請求項3】
前記単量体Xは、それを単独で重合した時のガラス転移温度が10℃以下であることを特徴とする請求項1又は2記載のマイクロチップ。
【請求項4】
前記重合体Bは、コア・シェル型の高分子微粒子であることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載のマイクロチップ。
【請求項5】
前記流路は深さが50〜150μmであり、流路底面に深さ以下の高さを有する突起を複数個配してあり、隣接する突起間の最小の間隔が50〜100μmであることを特徴とする請求項1〜4のいずれか記載のマイクロチップ。
【請求項6】
前記の流路底面に配した突起がマイクロ柱であり、当該マイクロ柱は外接円直径が50〜200μmであることを特徴とする請求項5記載のマイクロチップ。

【図1】
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【図2】
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【図3】
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【図4】
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【公開番号】特開2013−29391(P2013−29391A)
【公開日】平成25年2月7日(2013.2.7)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2011−164897(P2011−164897)
【出願日】平成23年7月28日(2011.7.28)
【出願人】(000236920)富山県 (197)
【出願人】(305060567)国立大学法人富山大学 (194)
【Fターム(参考)】