血液凝固促進剤としてのヘビ第五因子及び使用方法
【解決手段】 本発明は、血液凝固障害の治療のため、第五因子変異体を使用した組成物及び方法を提供するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づいて、２００８年１１月２１日に出願された米国仮出願第６１／１１６，９１３号に対して優先権の主張を行い、その全体の開示は、完全に参照により本明細書に組み込まれる。
３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§２０２（ｃ）に基づいて、米国政府はここに記載された発明において一定の権利を有することを認めている。本発明は、国立保健研究機構、認可番号ＨＬ−０８８０１０及びＰ５０ＨＤ０５５７８４−０１からの資金の一部により行われた。
【０００２】
本発明は医学及び血液学の分野に関するものである。さらに具体的には、本発明は、ヘビ毒由来の第五因子（ＦＶ）の変異体およびそれらの誘導体を、それらを必要とする患者において凝固カスケードを調節するために使用する治療戦略について記述する。
【背景技術】
【０００３】
いくつかの出版物及び特許文献は、本発明の属する技術分野について記述するため明細書に引用されている。これらの引用はそれぞれ、参照として明細書に完全に組み込まれる。
【０００４】
血液凝固ＦＶは、マルチドメインタンパク質（Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２）であり、わずかな凝血原活性、または凝血原活性なしでプロコファクターとして循環する。補因子の活性化状態（ＦＶａ）への転換は、トロンビンによる、グリコシル化された中央Ｂドメインの大部分の分解除去を含む（１）。ＦＶａは、プロトロンビナーゼの形成、プロトロンビンの生理活性のため、カルシウムイオンの存在下で負に帯電した膜表面上のセリンプロテアーゼ因子Ｘａ（ＦＸａ）と会合する（２）。ＦＶａがトロンビンの生成を大幅に高めるため、非活性プロコファクターとしてのＦＶの維持は、正常な止血の維持を発展させるうえで間違いなく重要な役割を果たす。最近では、Ｂドメイン内の個別の配列は、非活性プロコファクターとして持続するＦＶのメカニズムに寄与することが示されている（３，４）。この領域の除去は、タンパク質分解処理を必要とせずにＦＶ活性をもたらす。
【０００５】
ＦＶは、Ａ及びＣドメイン間では高い相同性、Ｂドメイン間では低い相同性を脊椎動物間で広く示される（５，６）。最近のゲノムデータでは、Ｂドメインの長さが一般的に哺乳類の間で共通して保存されている（〜８００残基）のに対し、下等脊椎動物では大きく異なる（例えば、トラフグでは〜５００残基）ことを示している（５，６）；これらの構造変化の機能的な意味は理解されていない。Ｂドメインへの主要な変化の顕著な例は、オーストラリアのヘビのグループ（タイパン（Ｏｘｙｕｒａｎｕｓ ｍｉｃｒｏｌｅｐｉｄｏｔｕｓ）、コブラ・モドキ（Ｐｓｅｕｄｏｎａｊａ ｔｅｘｔｉｌｉｓ）及びコースタルタイパン（Ｏｘｙｕｒａｎｕｓ ｓｃｕｔｅｌｌａｔｕｓ））からきている。これらの種は独特であり、加えて、これらの止血システムの一部としてＦＶは循環しており、その毒にもＦＶを有している。これらの種のそれぞれからの毒由来ＦＶは、同様のドメイン構造を有する哺乳類のＦＶと、〜４４％の配列相同性が共通している。しかしながら、Ｂドメインの長さはヒトのＦＶと比べて飛躍的に短い（８３６残基に対して、〜４６残基）。これらのヘビからの毒は、世界で最も有毒であるとみなされており、強力な血液凝固促進剤であり、及び、いくつかある症状のなかで特に、播種性血管内凝固障害を引き起こす（１０）。これは、大量のＦＶと同様に、共に強力なプロトロンビン活性化因子である複合体を形成するＦＸａ様酵素を含む。コースタルタイパン（オスキュタリンＣ）及びコブラ・モドキ（プスタリンＣ）からの複合体は部分的に精製され、及び粗毒と特徴づけられる。プロトロンビンのトロンビンへの変換もそれらの活性を強化するのもカルシウム及びリン脂質によって程度が異なるが、ＦＶａは影響しない。さらに、プスタリンＣは活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）に対して耐性を示し、強力な毒素としての役割に潜在的に貢献する（７）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によって、それを必要とする患者における血液凝固障害を治療する方法が提供される。例示的な方法では、ＦＶ変異体またはそれらの誘導体の活性型の有効量を投与する工程であって、それによって前記患者の血栓形成を増進し、且つ出血性疾患の症状を改善するものである、前記投与する工程を伴う。一実施形態においては、変異第五因子は配列ＩＤ番号１の配列を有する核酸によってコードされる。他の実施形態においては、変異第五因子は、配列ＩＤ番号２の配列を有する核酸を最適化したコドンによってコードされる。
【０００７】
前記方法及び第五因子凝血原は、血液凝固障害の治療に使用されることもある。血液凝固障害は、これに限定されるわけではないが、血友病ＡおよびＢ、抑制抗体に関連する血友病Ａ及びＢ、凝固因子欠乏症、ビタミンＫエポキシド還元塩素欠乏症、ガンマカルボキシラーゼ欠乏症、外傷に伴う出血、負傷、血栓症、血小板減少症、脳卒中、凝血障害、播種性血管内凝固障害（ＤＩＣ）、過抗凝固治療障害、バーナードスーリエ症候群、グランツマンの血小板無力症、及び貯蔵プール欠乏症を含む。また、血液凝固障害は、ヘパリン、低分子量ヘパリン、五糖類、ワルファリン、低分子抗血栓及びＦｘａ阻害剤の投与によることもある。
【０００８】
本発明の変異第五因子は、患者に直接注入または局所投与することができ、または、それをコードするベクターの形で移送され得る。
【０００９】
また、以下の性質の一つまたはそれ以上を示す、ヒト化及び改善型第五因子変異体が提供される。ＦＶ変異体は、活性化、補因子の状態で合成される；ＦＶ変異体は、膜表面が、セリンプロテアーゼＸａ因子（ＦＸａ）と高い親和性で結合するための通常の条件を回避できるよう、独自の立体構造を有する；及び、ＦＶ変異体は、その重鎖及び軽鎖を接続する固有なジスルフィド結合を含めることにより、活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）による不活性に対して機能的に耐性がある。
【００１０】
本発明の他の実施形態においては、ヘビ第五因子をコードする配列ＩＤ番号２の単離された核酸が提供される。このような核酸は、使用のために発現ベクターに含まれ得る。
【００１１】
さらに別の実施形態では、本発明は、配列ＩＤ番号１の核酸によりコードされた、単離されたヘビ第五因子タンパク質を提供する。ヘビ第五因子タンパク質は、リポソームまたはミセルに含有され得る。また、本発明は、薬学的に許容される賦形剤に含まれるヘビ第五因子タンパク質からなる薬学的組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】精製タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析 タンパク質（３μｇ／レーン）は、還元（パネルＡ、Ｃ）条件下、または、非還元（パネルＢ）条件下でＳＤＳ‐ＰＡＧＥに曝され、及びクマシーブリリアントブルーＲ‐２５０で染色することにより可視化される。レーン１、ｐｔ−ｒＦＶ、レーン２、ｐｔ−ｒＦＶ−ＱＱ、レーン３、ｐｔ−ｒＦＶ プラス トロンビン、レーン４、ｐｔ−ｒＦＶ‐ＱＱ プラス トロンビン、レーン５、ｒＦＸ、レーン６、ｒＦＸａ、レーン７，ｐｔ−ＦＸａ。標準の見かけの分子量が左側に示されている。パネルＡ及びパネルＢは同じマーカーを共有している。ダッシュ（−）は、収率がアミノ酸を正確に割り当てるにはあまりに低量であることを示し、及び、可能性の高いγ−カルボキシグルタミン酸の存在を示す６つの位置である。
【図２】ＰＣＰＳの存在下、または非存在下におけるプロトロンビンの開裂の速度定数の測定 トロンビン生成の初期速度は、５０μＭのＰＣＰＳ及び０．１ｎＭのｐｔ−ＦＸａ及び２０ｎＭのｈＦＶ−８１０（−◆−または−◇−）、ｐｔ−ｒＦＶ（−●−または−○−）、ｐｔ−ｒＦＶ−ＱＱ（−▲−または−△−）、またはｐｔ−ｒＦＶａ（−■−または−□−）と３μＭのＤＡＰＡの存在（パネルＡ）または非存在（パネルＢ）でのプロトロンビンの濃度の増加によって決定される。全てのデータセットの以下の分析は矩形双曲線に描かれ、適した速度定数は表２に示されている。データは、２つの類似した実験においての代表的なものである。
【図３】ＰＣＰＳの存在下、または非存在下におけるプレトロンビン−１の開裂の速度定数の測定 トロンビン生成の初期速度は、５０μＭのＰＣＰＳ及び０．１ｎＭのｐｔ−ＦＸａ及び２０ｎＭのｈＦＶ−８１０（−◆−または−◇−）、ｐｔ−ｒＦＶ（−●−または−○−）、ｐｔ−ｒＦＶ−ＱＱ（−▲−または−△−）、またはｐｔ−ｒＦＶａ（−■−または−□−）と３μＭのＤＡＰＡの存在（パネルＡ）または非存在（パネルＢ）でのプレトロンビン−１の濃度の増加によって決定される。全てのデータセットの以下の分析は矩形双曲線に描かれ、適した速度定数は表２に示されている。データは、２つの類似した実験においての代表的なものである。
【図４Ａ】ＡＰＣによる膜結合型ＦＶ（ａ）の不活性化 ５０μＭのＰＣＰＳ及び５００ｎＭのｐｔ−ｒＦＶ（−●−）、ｐｔ−ｒＦＶａ（−(−）、ｈＦＶ−８１０（−◆−）、またはｒＦＶａ（−(−）を含む反応混合物は１０ｎＭまたは７５０ｎＭ（ｉｎｓｅｔ）のＡＰＣどちらかと保温培養される。選択した時間間隔において、試料は削除され、及び、「実験的手法」（パネルＡ）に記載された方法で、または、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上を走らせ、還元下（パネルＢ）または非還元条件下（パネルＣ）でクマシー ブルー Ｒ２５０で染色して、補因子活性をアッセイ分析した。データは二つの類似した実験においての代表的なものである。
【図４ＢＣ】ＡＰＣによる膜結合型ＦＶ（ａ）の不活性化 ５０μＭのＰＣＰＳ及び５００ｎＭのｐｔ−ｒＦＶ（−●−）、ｐｔ−ｒＦＶａ（−(−）、ｈＦＶ−８１０（−◆−）、またはｒＦＶａ（−(−）を含む反応混合物は１０ｎＭまたは７５０ｎＭ（ｉｎｓｅｔ）のＡＰＣどちらかと保温培養される。選択した時間間隔において、試料は削除され、及び、「実験的手法」（パネルＡ）に記載された方法で、または、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上を走らせ、還元下（パネルＢ）または非還元条件下（パネルＣ）でクマシー ブルー Ｒ２５０で染色して、補因子活性をアッセイ分析した。データは二つの類似した実験においての代表的なものである。
【図５Ａ】第五因子のための核酸コーディング配列 第五因子（配列ＩＤ番号１）に誘導されたヘビ毒の核酸配列は、パネル５Ａ及び５Ｂに示されている。哺乳類系での発現に最適化されたコドンを有する第五因子（配列ＩＤ番号２）に誘導されたヘビ毒の核酸配列はパネル５Ｃ及び５Ｄに示されている。
【図５Ｂ】第五因子のための核酸コーディング配列 第五因子（配列ＩＤ番号１）に誘導されたヘビ毒の核酸配列は、パネル５Ａ及び５Ｂに示されている。哺乳類系での発現に最適化されたコドンを有する第五因子（配列ＩＤ番号２）に誘導されたヘビ毒の核酸配列はパネル５Ｃ及び５Ｄに示されている。
【図５Ｃ】第五因子のための核酸コーディング配列 第五因子（配列ＩＤ番号１）に誘導されたヘビ毒の核酸配列は、パネル５Ａ及び５Ｂに示されている。哺乳類系での発現に最適化されたコドンを有する第五因子（配列ＩＤ番号２）に誘導されたヘビ毒の核酸配列はパネル５Ｃ及び５Ｄに示されている。
【図５Ｄ】第五因子のための核酸コーディング配列 第五因子（配列ＩＤ番号１）に誘導されたヘビ毒の核酸配列は、パネル５Ａ及び５Ｂに示されている。哺乳類系での発現に最適化されたコドンを有する第五因子（配列ＩＤ番号２）に誘導されたヘビ毒の核酸配列はパネル５Ｃ及び５Ｄに示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
毒ヘビは自分自身の防御のため、及び獲物を無力化するために、血液凝固促進剤などのような有毒な化合物の配列を生成する。オーストラリアのブラウンスネーク、コブラ・モドキ（Ｐｓｅｕｄｏｎａｊａ ｔｅｘｔｉｌｉｓ）は、Ｘａ因子（ＦＸａ）及び第五因子（ＦＶ）と一致する、毒由来のプロトロンビン活性化複合体を有する。前記ＦＶ組成物（ｐｔ−ＦＶ）は、ヒトＦＶと同様のドメイン組織を有するが、その中央ドメインはとても少ない（８３６アミノ酸に対して５５）。ここでは、ｐｔ−ＦＶは強力な血液凝固促進剤に変換する機能要素の固有な増加を獲得している。組み換えｐｔ−ＦＶを用いた測定は、それが構造的に活性補因子として合成され、ヒトＦＶとは異なり、活性の発現にタンパク質分解を必要としないことを明らかにした。配列の比較により、非活性プロコファクター状態を安定させるのに役立つＢドメイン内の塩基性アミノ酸の保存クラスターを失っていることが明らかとなった。注目すべきことは、ｐｔ−ＦＶは、負に帯電したリン脂質の非存在下では、高い親和性でヘビＦｘａを結合するように働き、及び、膜の非存在下、または存在下においては、プレトロンビン‐１と同等の運動パラメータを示すことである。さらに、ｐｔ−ＦＶは、重鎖のタンパク質分解によってもたされた濃度であっても、活性タンパク質Ｃに機能的耐性がある。この安定性は、ある程度、重鎖と軽鎖を結合する固有なジスルフィド結合による可能性が高い。同時に、これらの分子の技術革新の合流点は、ｐｔ−ＦＶを血液凝固生物兵器にしている。これらの発見は、ＦＶがプロコファクターとしてどのように保存されるかについて重要な新しい洞察を提供し、及び、ＦＸａ‐ＦＶａ相互作用が、プロトロンビナーゼの拡張作用にどのように寄与するかよりよく理解するために広範な影響を有する。
【００１４】
従って、本発明はまた、第五因子（ＦＶ）の固有な誘導体を提供する。その誘導体は、一般的なブラウンスネーク、コブラ・モドキ（Ｐｓｅｕｄｏｎａｊａ ｔｅｘｔｉｌｉｓ）の毒内で、または異種発現システム（ｐｔ−ＦＶ）、または以下の固有な特徴の一つまたはそれ以上を有する同様のシステムで発現するヒトＦＶ誘導体である。
【００１５】
ａ）ＦＶ変異体は活性化、補因子状態で合成される
ｂ）ＦＶ変異体は、膜表面で、そのセリンプロテアーゼＸａ因子（ＦＸａ）と高い親和性で結合するのに通常必要とされる条件を迂回できるよう、独自の立体構造を有する
ｃ）ＦＶ変異体は、その重鎖及び軽鎖を接続する固有なジスルフィド結合を含めることにより、活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）による不活性に対して機能的に耐性がある。
【００１６】
I.定義
本発明の生体分子に関連する様々な用語は、上述及び明細書及び特許請求の範囲のいたるところに用いられている。
【００１７】
「変異型ＦＶ」という用語は、ヘビまたは他の異種発現システムから得られる、強力な血液凝固活性を示すＦＶ誘導体分子に関するものである。本発明の変異型ＦＶは配列ＩＤ番号１によってコードされ、またはその変異（例えば配列ＩＤ番号２）はヒトでの使用に適合し、望ましいＦＶ血液凝固活性を促進する。
【００１８】
「止血関連疾患」または「血液凝固障害」という用語は、血友病Ａ及びＢ、抑制抗体に関連する血友病Ａ及びＢ、凝固因子欠乏症、ＶＩＩ１ ＩＸ及びＸ、ＸＩ、Ｖ、ＸＩＩ、ＩＩ因子、フォン・ヴィレブランド因子欠乏症、結合ＦＶ／ＦＶ１欠乏症、ビタミンＫエポキシド還元塩素欠乏症、ガンマカルボキシラーゼ欠乏症、外傷に伴う出血、負傷、血栓症、血小板減少症、脳卒中、凝血障害、播種性血管内凝固障害（ＤＩＣ）、ヘパリン、低分子量ヘパリン、五糖類、ワルファリン、低分子抗血栓（例えばＦＸａ阻害剤）に関連する過抗凝固、及びバーナースーリエ症候群、グランツマンの血小板無力症及び貯蔵プール欠乏症のような血小板異常症などの出血障害に関連する。
【００１９】
本発明の核酸を参照するにあたり、「単離された核酸」という用語が時折用いられる。この用語は、ＤＮＡに適用される際に、そこから由来する生物の天然に存在するゲノムにおいて直接に連続する（５’及び３’方向において）配列から離されているＤＮＡ分子を意味する。例えば「単離された核酸」は、プラスミドまたはウイルスベクターなどのようなベクター内に挿入された、または原核生物または真核生物のＤＮＡ内に合成されたＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子からなる。本発明のＲＮＡ分子に関しては、「単離された核酸」という用語は、前記の単離されたＤＮＡによりコードされたＲＮＡ分子を主に意味する。また、この用語は、「実質的に純粋な」形（用語「実質的に純粋な」に関しては、以下に定義する）で存在するように、その自然な状態（例えば、細胞または組織内）で結合されたＲＮＡ分子から十分に分離されたＲＮＡ分子に関するものである。
【００２０】
タンパク質に関して、「単離されたタンパク質」または「単離及び精製されたタンパク質」という用語が、時おり本明細書において使用されている。この用語は、本発明の単離された核酸分子の発現により生成されるタンパク質を主に意味する。また、この用語は、「実質的に純粋な」形で存在するように結合された他のタンパク質から十分に分離されたタンパク質に関するものである。
【００２１】
用語「プロモーター領域」は、遺伝子の転写調節領域に関するものであり、コーディング領域の５’側または３’側、またはコーディング領域内、またはイントロン内でみられることもある。
【００２２】
用語「ベクター」は、そこで複製される宿主細胞内に導入するため挿入されるＤＮＡ配列内の小さな担体ＤＮＡ分子に関するものである。「発現ベクター」は、宿主細胞内での発現に必要とされる調節領域と遺伝子または核酸配列を含む特殊なベクターである。用語「作動的に結合された」はコーディング配列の発現に必要な調節配列が、コーディング配列の発現がなされるようコーディング配列に適切な相対位置内のＤＮＡ分子内に配置されたことを意味する。これと同様の定義が、コーディング配列の配置及び発現ベクター内の転写制御要素（例えばプロモーター、エンハンサー、及び終止要素）に時おり適用される。この定義はまた、ハイブリッド核酸分子が生じる第一及び第二核酸分子の核酸配列の配置においても時おり適用される。
【００２３】
用語「実質的に純粋な」は、少なくとも５０〜６０重量％の対象化合物（例えば核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質など）からなる標本に関するものである。標本は、より好適には少なくとも７５重量％、最も好適には、９０〜９９重量％の対象化合物からなる。純度は対象化合物によって適切な方法（例えば、クロマトグラフィー法、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動法、ＨＰＬＣ分析など）で測定される。
【００２４】
特定のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に関する場合の「本質的に…からなる」は、与えられた配列ＩＤ番号の性質を有する配列を意味する。例えば、アミノ酸配列を参照する場合、この用語は、配列の基本的な及び新規な特徴に作用しない配列自体及び分子の修飾を含む。
【００２５】
本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、本発明のプライマー及びプローブに関するものであり、及び、二つまたはそれ以上、好適には三つ以上のリボ−またはデオキシリボヌクレオチドからなる核酸分子として定義される。オリゴヌクレオチドの正確な大きさは様々な要因及びオリゴヌクレオチドが使用されるそれぞれの適用に依存する。
【００２６】
本明細書で使用される用語「プローブ」は制限酵素消化による精製として自然発生するものであろうと、合成であろうと、アニーリングまたはプローブと相補的な配列と核酸分子に特異的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸、ＲＮＡまたはＤＮＡに関するものである。プローブは単一らせん構造または二重らせん構造どちらもとりうる。プローブの正確な長さは温度、プローブのソース、使用方法を含む様々な要因に依存する。例えば、診断に適用する場合では、標的配列の複雑さに依存し、典型的なオリゴヌクレオチドプローブは、１５〜２５またはそれ以上のヌクレオチドを含むが、それよりも少ないヌクレオチドを含むこともある。
【００２７】
本明細書でのプローブは特定の標的核酸配列の異なるらせん構造と「実質的に」相補的となるよう選択される。これは、事前に定められた条件下でそれぞれの標的らせん構造と「特異的にハイブリダイズ」またはアニールをするためには、プローブが十分に相補的でなければならないということを意味する。例えば、非相補的なヌクレオチドフラグメントは、標的らせん構造と相補的であるプローブ配列の残渣によって、プローブの５’末端または３’末端に付着される。あるいは、プローブ配列が、それと共に特異的にアニールする標的核酸の配列と十分に相補的である条件下で、非相補的塩基または長い配列はプローブ内に組み入れられることができる。用語「特異的にハイブリダイズする」は、当業者において通常使用される事前に定められた条件下でハイブリダイゼーションが可能となるよう十分に相補的な（時おり「実質的に相補的な」と称される）配列の二つの一本鎖核酸分子間のつながりに関するものである。特に、この用語は、本発明の一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子内に含まれる実質的に相補的な配列によるオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに関するものであり、非相補的配列の一本鎖核酸によるオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの実質的な除去に関するものである。
【００２８】
本明細書で使用される用語「プライマー」は、生体システムからの誘導、制限酵素消化による生成であろうと、合成であろうと、適切な条件下に置かれた際に核酸合成依存テンプレートの起始因子として機能的に作用できる一本鎖または二本鎖、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡまたはＤＮＡに関するものである。適当な核酸テンプレート、核酸の適当なヌクレオシド三リン酸、ポリメラーゼ酵素、適当な補因子及び、適当な温度及びｐＨなどのような条件と提供されると、ポリメラーゼの作用またはプライマーの延長生成を増やす同様の活性により、ヌクレオチドが付加され、プライマーは３１末端に延長されることもある。
【００２９】
プライマーは、特定の条件及び適用の求めによって、様々な長さとなることがある。例えば、診断における適用では、オリゴヌクレオチドプライマーは典型的には１５〜２５またはそれ以上のヌクレオチド長さとなる。プライマーは、目的とする延長生成の合成を刺激する所望のテンプレートと十分に相補的である必要があり、それが、ポリメラーゼまたは同様の酵素による合成の起始因子としての使用のために、適当な近位におけるプライマーの３’ヒドロキシル部分を提供する十分な方法において、目的とするらせん構造テンプレートとアニールすることを可能としている。それは、プライマー配列が目的とするテンプレートと正確に相補的であることを示すことは必要としない。例えば、非相補的ヌクレオチド配列は、他の相補的なプライマーの５’末端に付着されることもある。あるいは、非相補的な塩基は、オリゴヌクレオチドプライマー配列内に散在され、プライマー配列は延長生成物の合成のためにテンプレート−プライマー複合体を機能的に提供するらせん構造テンプレートの配列と十分に相補的となるよう提供される。
【００３０】
用語「同一比率」は、核酸またはアミノ酸配列の間での比較に関して本明細書で使用されている。核酸及びアミノ酸配列は、しばしば、核酸またはアミノ酸の配列を一列にし、それにより、二つの間の違いを明らかにするコンピュータープログラムを用いて比較される。本発明の目的のため、核酸配列の比較は、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ９．１によって実行され、これは、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎのｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐによって可能となった。便宜上、プログラムによって指定された初期パラメータ（ギャップクリエーションペナルティー＝１２、ギャップエクステンションペナルティー＝４）は、本明細書において使用するため、同一配列を比較するのに意図されている。あるいは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ワールドワイドウェブにおいてｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ ＭｏＩ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３〜４１０）によって提供された、初期パラメータとギャップ調整に使用するＢｌａｓｔｎ ２．０プログラムは、核酸配列及びアミノ酸配列間の同一及び類似性のレベルを測定するのに使用されることがある。
【００３１】
核酸分子、ポリペプチド及びそれらの誘導体をコードするＦＶの変異体の調製
核酸分子
ＦＶの変異型をコードする核酸分子または本発明のそれらの機能性誘導体は、組み換え型ＤＮＡ技術の方法を用いて調製されることがある。核酸配列情報の可用性は、種々の方法によって、本発明の単離された核酸分子の調節を可能とする。例えば、ＦＶの変異型をコードする核酸配列またはそれらの誘導体ポリペプチドは、当業者において既知である標準プロトコルを使用して適当な生体原料から分離されることがある。
【００３２】
本発明の核酸は、任意の便利なクローニングベクターにおけるＤＮＡとして維持されることがある。好適な実施形態においては、クローンは、適当なＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（カリフォルニア州、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のような、プラスミドクローニング／発現ベクター内で維持される。あるいは、核酸は、哺乳類の最奥での発現に適当なベクター内で維持されることもある。翻訳後修飾がＦＶの変異型またはそれらの機能性誘導体に影響を与える場合において、それは哺乳類の細胞に分子を発現するのに好適である。ＦＶ変異体または核酸分子をコードするそれらの誘導体は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ及び一本鎖または二本鎖であることがあるそれらのフラグメントを含む。従って、この発明は、本発明の核酸分子の少なくとも一つの配列とハイブリダイジングできる配列を有するオリゴヌクレオチド（センスまたはアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡのらせん構造）を提供する。このようなオリゴヌクレオチドは、ＦＶ発現の検出のためのプローブとして有用である。
【００３３】
タンパク質
ＦＶの変異体または本発明のそれらの誘導体ポリペプチドの全長は、既知の方法に従って、様々な方法で調製されることがある。タンパク質は、例えば、ＦＶの活性型を発現する、形質転換された細菌または動物の培養された細胞または組織などの適当な材料から、免疫親和性精製によって生成されることがある。しかしながら、これは、時を選ばず与えられた細胞に存在する可能性のあるタンパク質の低分子量のために好適な方法ではない。ＦＶの変異型またはそれらの誘導体ポリペプチドをコードする核酸分子の可用性は、当業者に既知の方法で体外での発現に使用されるＦＶの変異型またはそれらの誘導体の生成を可能にする。例えば、ｃＤＮＡまたは遺伝子は、体外転写のためのｐＳＰ６４またはｐＳＰ６５のような適当な体外転写ベクター内でクローンされ、続いて、小麦胚芽またはウサギ網状赤血球溶血液のような適当な無細胞翻訳系で無細胞翻訳される。体外での転写及び翻訳システムは、例えばウィスコンシン州ＭａｄｉｓｏｎのＰｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈまたはメリーランド州ＲｏｃｋｖｉｌｌｅのＢＲＬによって市販されている。
【００３４】
あるいは、好適な実施形態によれば、ＦＶの変異型またはそれらの誘導体の多くの量は、適当な原核生物または真核生物発現系においての発現により生成されることがある。例えば、ＦＶの変異型をコードするＤＮＡ分子の一部または全部は、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌性細胞または、ＣＨＯまたはＨｅｌａ細胞のような哺乳類の細胞内での発現に適合したプラスミドベクター内に挿入されることがある。あるいは、好適な実施形態において、ＦＶの変異体またはそれらの誘導体からなる標識された溶融タンパク質が生成されうる。ＦＶ分子またはそれらの誘導体のような標識された溶融タンパク質は、ＤＮＡ分子の一部または全部によってコードされ、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌性細胞または、これに限定されるわけではないが、酵母または哺乳類の細胞のような真核細胞における発現に適合したプラスミドベクター内に挿入された目的とするポリペプチド標識の一部または全部をコードするヌクレオチド配列にリーディングフレームする正確なコドン内で連結反応される。上述されたようなベクターは、宿主細胞内にＤＮＡの発現を可能とするような方法で配置された宿主細胞内でのＤＮＡの発現に必要な調節要素からなる。このような調節要素は、これに限定されるわけではないが、プロモーター配列、転写起始因子配列及びエンハンサー配列を発現に必要とする。
【００３５】
ヘビ毒由来ＦＶ変異体またはそれらの誘導体タンパク質は、当業者において既知の方法に従って、組換え型原核生物または真核生物系においての遺伝子発現によって生成される。好適な実施形態において、市販されている発現／分泌系が、容易に周囲媒質から精製するのに用いられることがある。市販されている発現／分泌系により、組換え型タンパク質が発現され、その後、宿主細胞から分泌される。発現／分泌ベクターが使用されない場合、代替手法は、組換え型タンパク質と特異的に結合する抗体との免疫親和性相互作用のようなアフィニティー分離による組換え型タンパク質の精製またはＮ末端またはＣ末端で６−８ヒスチジン残基により標識された組換え型タンパク質のニッケルカラムによる分離を
含む。代替標識は、ＦＬＡＧエピトープ、ＧＳＴまたは赤血球凝集素エピトープからなることがある。このような方法は当業者によって通常使用されている。
【００３６】
ＦＶまたはそれらの誘導体タンパク質は、上述のような方法で調製され、標準プロトコルによって分析されることがある。例えば、このようなタンパク質は、既知の方法によってアミノ酸配列分析を受けることがある。
【００３７】
上述したように、本発明によるポリペプチドを生成する便利な方法は、発現系において核酸を使用することで、それをコードする核酸を発現させることである。本発明の方法において有用である様々な発現系は、当業者にとって既知である。
【００３８】
したがって、本発明は（開示された）ポリペプチドをつくる方法、ポリペプチド（一般的に核酸）をコードする核酸からの発現を含む方法も含む。これは、ポリペプチドの生成を生じるまたは可能にする適当な条件下で、ベクターを含む宿主細胞を培養することで簡便に達成されることがある。ポリペプチドは網状赤血球溶血液のような体外系において生成されることもある。
【００３９】
核酸及びタンパク質またはそれらの誘導体をコードするＦＶの使用
ＦＶポリペプチドまたはそれらの誘導体または血液凝固活性変化を有するのと同一のものをコードする核酸は、例えば、血液凝固カスケードを調整する治療及び／または予防薬剤として、本発明にしたがって使用されることがある。本発明はこれらの分子が凝固を増加するよう変化し得ることを明らかにした。
【００４０】
本発明の好適な実施形態においては、ＦＶまたはそれらの誘導体は、生物学的に適合した担体の点滴を介して、好適には、静脈注射を介して患者に投与されることがある。本発明のＦＶまたはそれらの誘導体は、任意に、リポソーム内にカプセル化され、または、分子の安定性を増加する他のリン脂質またはミセルと混合される。ＦＶまたはそれらの誘導体は、単独で、または止血を調整するとして既知の他の薬剤と組み合わせて投与されることがある（例えば、ＶＩＩａ、ＦＩＸ、ＦＶＩＩＩまたはＦＸ／Ｘａ因子及びそれらの誘導体）。ＦＶまたはそれらの誘導体を提供するのに適当な化合物は、これに限定されることはないが、患者の状態及び血行状態を含む生理学的に様々なことを考慮した上で、医師によって決定される。異なる適用及び投与経路にふさわしい様々な組成物が当業者に知られており、明細書の以下に記載されている。生成されたＦＶまたはそれらの誘導体を含む調製は、生理学的に許容される材料を含み、医薬品として好適に処方される。調製は、既知の先行技術の方法を実質的に使用することで定式化され得るものであり、塩化ナトリウム、塩化カルシウムのような塩とグリシン及び／またはリシンのようなアミノ酸を含むバッファーと、ｐＨ範囲６〜８で混合され得る。
【００４１】
必要となるまで、第五因子またはその誘導体を含む精製された調製液は、完成した溶液または凍結乾燥した状態または冷凍状態で保管される。好適には、調製液は凍結乾燥した状態で貯蔵され、及び、適切な再構成溶液を使用して視覚的に透明な溶液に溶解する。あるいは、本発明による調製は、調製液または凍った液体として作られることも可能である。
【００４２】
本発明による調製液は、特に安定的であり、例えば、適用の前に長時間溶解した形態で有効である。本発明による調製液は、一つの成分の調製液またはマルチ成分の調製液における他の要因との組み合わせの形態で、ＦＶまたはそれらの誘導体と薬剤的調製液として手に入れられる。
【００４３】
薬剤的調製液内で精製されたタンパク質を処理するのに先行して、精製されたタンパク質は従来の品質管理により管理され、及び、提示の治療形態内に形作られる。特に、精製された調製液は、組み換え製造の間、発現ベクター由来の核酸と同様に細胞核酸の非存在下でテストされ、好適には、ＥＰ０７１４９８７に記載されたような方法が用いられる。
【００４４】
この発明の他の特徴は、高い安定性及び構造的及び構造的完全性を有し、及び、特に不活性因子Ｖ／Ｖａ類似中間体及びタンパク質自動分解生成物を含まず、及び、前記タイプの第五因子類似体の活性化により、及び、適当な調製液内で調剤されることによりつくられるＦＶまたはそれらの誘導体を含む調製液の製造を可能にすることに関するものである。薬剤的調製液は、１０〜１０００μｇ／ｋｇの間、好適には１０〜２５０μｇ／ｋｇの間の投薬量であり、最適には１０〜７５μｇ／ｋｇの間の投薬量と、好適には４０μｇ／ｋｇの変異体第五因子ポリペプチドである。患者は血液診療所で、提示があればすぐに治療を受けることができる。または、患者は１〜３時間毎にボーラス投与され、または、十分に改善がみられる場合には、一日一回のＦＶまたは明細書に記載されたそれらの誘導体の投与となる。
【００４５】
ヘビから得られた核酸をコーディングするＦＶまたはそれらの誘導体は、本発明に従って様々な目的で使用されることがある。本発明の好適な実施形態において、血液凝固を調節するための核酸運搬媒体（例えば発現ベクター）は、ＦＶまたはそれらの誘導体ポリペプチド、または本明細書に記載されたそれらの機能的フラグメントをコーディングする核酸配列からなる発現ベクターなどが提供される。発現ベクターをコードするＦＶまたはそれらの誘導体の患者への投与は、凝固を強化するのに役立つＦＶまたはそれらの誘導体ポリペプチドの発現を生じる。本発明に従って、核酸配列をコードするＦＶまたはそれらの誘導体は、本明細書に記載されたように、その発現が止血を調節するＦＶまたはそれらの誘導体をコードすることがある。
【００４６】
ＦＶまたはそれらの誘導体核酸配列からなる発現ベクターは、単独で投与されることも、または止血を調整するのに有用な他の分子と組み合わせて投与されることもある。本発明に関連して、発現ベクターまたは治療薬の組み合わせは、患者に、単独で、または薬剤的に許容な化合物で、または生物学的に親和性のある化合物で投与されることもある。
【００４７】
本発明の好適な実施形態においては、ＦＶまたはそれらの誘導体をコードする核酸配列からなる発現ベクターは、ウイルスベクターである。本発明で使用されるウイルスベクターは、これに限られるわけではないが、アデノウイルスベクター（特定プロモーター／エンハンサー組織を伴うまたは伴わない）、複数の血清型（例えば、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−７及びＡＡＶ−８）のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター及びハイブリッドＡＡＶベクター、レンチウイルスベクター及び擬似レンチウイルスベクター（例えば、エボラウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、及び猫免疫不全ウイルス（ＦＩＶ））、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター及びレトロウイルスベクターを含む。
【００４８】
本発明の最適な実施形態では、核酸配列ＦＶまたはそれらの誘導体、またはそれらの機能的フラグメントからなるウイルスベクターを投与する方法が提供されている。本発明の方法における実用的なアデノウイルスベクターは、好適には、アデノウイルスベクターＤＮＡの少なくとも主要な部分を含む。明細書に記載されているように、このようなアデノウイルスベクターの投与に続いて、ＦＶまたはそれらの誘導体ポリペプチドは止血を調節するのに役立つ。
【００４９】
組換え型アデノウイルスベクターは、多様な遺伝子治療適用において幅広い実用性を有する。そのような適用におけるそれらの有用性は、様々な臓器の状況で行われる体内での遺伝子転移の高効率によるところが大きい。
【００５０】
アデノウイルス粒子は、適切な遺伝子運搬のための媒体として生かされることがある。このようなウイルス粒子は、二本鎖ＤＮＡ非エンベロープウイルスに関連する構造的特徴及びヒト呼吸系及び消化器官系指向性のような生物学的特徴を含む、これらの適用にとって望ましい特徴を複数有する。さらに、アデノウイルスは、受容体を介した飲食作用により、生体内及び生体外の様々な細胞に影響を与えることが知られている。アデノウイルスベクターの全体的な安全性の証明、アデノウイルスの感染は、軽度のインフルエンザ様症状を含む、ヒトにおける軽度な疾患を引き起こす。
【００５１】
その大きなサイズに起因して（〜３６キロ塩基）、アデノウイルス遺伝子は遺伝子治療媒体として用いられるのに適している。アデノウイルスは、複製において極めて重要なアデノウイルス遺伝子及び非必須領域の除去後、外来ＤＮＡの挿入に適応するからである。このような置換は複製機能及び感染に関して正常に機能しないウイルスベクターを提供する。注目すべきは、アデノウイルスは、遺伝子治療のため及び異常遺伝子の発現のためのベクターとして用いられることである。
【００５２】
遺伝子治療で用いられるアデノウイルスベクターの使用についてのさらに詳細な議論は、Ｂｅｒｋｎｅｒ，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６−６２９及びＴｒａｐｎｅｌｌ，１９９３，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ １２： １８５〜１９９を参照のこと。
【００５３】
例えば、目的とする遺伝子の複数コピー及びそれによる多量の目的遺伝子の生成物を提供できるベクターを導入することが望ましい。アデノウイルスベクターの改良及びこれらのベクターを生成する方法は、Ｍｉｔａｎｉ ａｎｄ Ｋｕｂｏ（２００２，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２（２）：１３５〜４４）；Ｏｌｍｓｔｅｄ−Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００２，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３（１１）：１３３７〜４７）；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ．（２００１，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９（９）：８３８〜４２）；米国特許番号５，９９８，２０５（多重ＤＮＡコピーからなる腫瘍特異的複製ベクターが提供されている）；６，２２８，６４６（ヘルパーアデノウイルスなし、アデノウイルスベクター完全欠損が記載されている）； ６，０９３，６９９（遺伝子治療のためのベクター及び方法が提供されている）；６，１００，２４２（複製欠損アデノウイルスベクターに挿入された導入遺伝子が、生体内で末梢血管疾患及び心疾患の遺伝子治療において有効に用いられることが記載されている）；及び国際特許出願番号ＷＯ ９４／１７８１０及びＷＯ ９４／２３７４４を含む参考文献、特許及び特許出願に詳しく記載されている。
【００５４】
出願によっては、さらに、発現構成は、特に細胞または組織タイプでの発現を促進するのに役立つ調節要素からなる。このような調節要素は、当業者において既知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９９２）において深く論じられている。本発明の発現構成における組織特定調節要素の取り込みは、ＦＶまたはそれらの発現またはそれらの機能的フラグメント発現のための少なくとも部分的な組織指向性を提供する。例えば、サイトメガロ・ウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下で、ＦＶまたはそれらの誘導体をコードする核酸配列からなるＥ１欠損タイプ５アデノウイルスベクターは本発明の方法において生かされることがある。
【００５５】
アデノウイルスベクターを生成するための典型的な方法
組み換え遺伝子発現のためのアデノウイルスベクターは、ヒト胚性腎細胞株２９３において生成される（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９７７，Ｊ，Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．３６：５９〜７２）。この細胞株は、Ｅ１機能不全において、アデノウイルス２（Ａｄ２）及びアデノウイルス５突然変異体の成長を許容する。なぜなら、この細胞株は、アデノウイルス５遺伝子の左末端からなり、従ってＥ１タンパク質を発現するからである。２９３細胞の細胞遺伝子内に導入されたＥ１遺伝子は、除去された遺伝子からウイルスベクターを増幅する発現系としてこれらの細胞の使用を容易にするレベルで発現される。２９３細胞は、独立したクローニングを助け、アデノウイルスベクターを発現するため、Ｅ１突然変異体の分離及び増殖に広範囲にわたって使用される。従って、２９３細胞株のような発現系は、トランスにおいて不可欠なウイルス機能を提供し、それによって、Ｅ１遺伝子に置換された外因性核酸配列において、ウイルスベクターの増殖が可能となる。Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｔｈｅ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎ（１９８４），ｐ．１２５〜１７２を参照のこと。
【００５６】
アデノウイルスベクターの増殖に向いている他の発現系は、当業者において既知であり（例えば、ＨｅＬａ細胞）、及び、他の場でも再検討されている。また、本発明には、ＦＶまたはそれらの誘導体ポリペプチドをコードする核酸運搬媒体と個々の細胞を提供すること、及び、ＦＶまたはそれらの誘導体ポリペプチドが発現する条件下で細胞を培養することからなる止血を調節する方法も含まれる。
【００５７】
前述の議論より、ＦＶ変異体またはそれらの誘導体ポリペプチドまたは同一のものをコードする核酸は、異常血液凝固に関連する疾患の治療において用いられることがわかる。
【００５８】
医薬組成物
本発明の発現ベクターは、生理活性タンパク質（例えば、ＦＶまたはそれらの誘導体ポリペプチドまたは機能的フラグメントまたはそれらの誘導体）が生成できるように、対象に運搬される薬剤的化合物内に組み込まれる。本発明の特定の実施形態では、受容体がＦＶまたはそれらの誘導体ポリペプチドの治療的に有効な量を生成できるよう十分な遺伝子材料からなる薬学的化合物は、対象において止血作用を与えることができる。または、前述したように、変異体第五因子ポリペプチドの有効量は、それらを必要とする患者に直接的に注入される。化合物は、単独で投与、または、安定化化合物のような他の薬剤少なくとも一つと組み合わせて投与され、これに限定されるわけではないが、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース及び水を含む、生体適合性のある薬剤担体に滅菌下で投与されることもある。化合物は、単独で、または、止血に作用する他の薬剤と組み合わせて患者に投与されることもある。好適な実施形態では、薬剤的化合物も薬剤的に許容な賦形剤を含む。このような賦形剤は、化合物を受容する個体に有害な免疫応答をそれ自体で導くことのない任意の薬剤を含み、及び、過度な毒性なしで投与することが可能である。薬学的に許容される賦形剤は、これに限定されるわけではないが、水、生理食塩水、グリセロール、糖類及びエタノールのような液体が含まれる。薬学的に許容される塩には、例えば、塩酸塩、臭化水素塩、リン酸塩、硫酸塩などのような鉱酸塩、及び、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などのような有機酸塩が含まれる。加えて、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤などのような補助剤が、このような賦形剤において存在することがある。薬学的に許容される賦形剤に関する詳細な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ． Ｃｏ．， １８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．［１９９０］）．で入手することができる。
【００５９】
非経口投与に適した薬剤の剤形は、水溶液、好適には、ハンクス溶液、リンガー溶液または生理緩衝食塩水のような生理的に適合性のある緩衝液内で調剤される。水性懸濁注射液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランのような懸濁液の粘性を増加させるような基質を含むことがある。適当な親油性溶媒または媒体は、ゴマ油のような脂肪酸油、または、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドまたはリポソームのような合成脂肪酸エステルを含む。随意に、懸濁液は、高濃度溶液の調製を可能にするため、化合物の溶解度を増加させる適当な安定剤または薬剤も含むことがある。局所または経鼻投与の場合、浸透されるべき特定の障壁に対して適切な浸透剤が製剤に使用されている。このような浸透剤は一般的に当業者において知られている。本発明の薬剤的化合物は当業者において既知の任意の方法（従来の混合、溶解、整粒、糖衣製造、ゲル化、乳化、カプセル化、封入、凍結乾燥処理など）で製造されている。
【００６０】
薬剤的化合物は塩として提供されることがあり、また、これに限定されるわけではないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などの多くの酸と作られることがある。塩は、遊離塩基に対応する溶液よりも水または他のプロトン性溶媒に溶解しやすい傾向にある。他の場合では、好適な調製液は、４．５〜５．５のｐＨ範囲で、１〜５０μＭのヒスチジン、１〜２％のスクロース、及び２〜７％のマンニトールの任意または全てを含む凍結乾燥粉末であることがある。この凍結乾燥粉末は使用前にバッファーに結合される。
【００６１】
薬剤的化合物が調製された後、それらは適切な容器に入れられ、治療のために標識される。ベクターを含むＦＶまたはそれらの誘導体の投与のために、前述の標識には投与の量やしばしば方法が含まれることもある。
【００６２】
本発明の使用に適当な医薬組成物は、活性成分が治療目的を達成するための有効量含まれている化合物を含む。治療に有効な投与量の決定は、本発明において提供される技術を使用する熟練した医療従事者の能力の範囲内で行われる。治療における投与量は、他の要因のなかでも、年齢、対象における一般的条件、異常血液凝固表現型の重症度、ＦＶまたはそれらの誘導体ポリペプチドの発現レベルを調節する制御配列の強さに依存する。したがって、ヒトにおける治療の有効量は、ベクター基本形または、ＦＶまたはそれらの誘導体に感染したタンパク質への個々の患者の応答に基づいて医療従事者により決定される比較的広い範囲に分類される。
【００６３】
投与
ＦＶポリペプチドの活性型変異体は、単独または他の薬剤と組み合わせて、本明細書において上述したように、適切な生理的担体において患者に直接的に注入されることもある。ＦＶまたはそれらの誘導体、またはそれらの機能的フラグメントをコードする核酸配列からなる本発明の発現ベクターは、ＦＶまたはそれらの誘導体ポリペプチドの活性型の予防的及び／または治療的に有効なレベルを達成する及び維持するため（以下、参照の）様々な方法により患者に投与されることもある。当業者は、特定の患者の治療のための本発明の発現ベクターをコードするＦＶまたはそれらの誘導体の活性型を使用するための特定の手順をすぐに見つけることができる。アデノウイルスベクターの生成及び患者への投与のための手順は、米国特許番号５，９９８，２０５、６，２２８，６４６、６，０９３，６９９、６，１００，２４２、及び国際特許出願番号ＷＯ９４／１７８１０及びＷＯ９４／２３７４４において記載され、これらはその全体において参照により本明細書に組み込まれている。本発明のアデノウイルスベクターをコードするＦＶまたはそれらの誘導体の活性型は、任意の既知の方法により投与されることがある。生体内への薬剤的化合物の直接的な運搬は、運搬を強化された対流のような運搬方法が予想されるにもかかわらず、一般的に、従来の注射器を利用する注射により達成される（例えば米国特許番号５，７２０，７２０を参照）。この方法で化合物は、皮下、表皮、皮内、髄腔内、眼窩内、粘膜内、腹腔内、静脈内、動脈内、口腔内、肝内または筋肉内に運ばれることがある。投与の他の方法には、経口投与及び経肺投与、坐薬、及び、経皮投与が含まれる。血液凝固疾患患者の治療の臨床専門医は、これに限定されるわけではないが、患者の状態及び治療の目的（例えば血液凝固の促進）を含む基準数に基づいて、活性型ＦＶまたはそれらの誘導体核酸配列からなるアデノウイルスベクターの投与のために最適な経路を決定している。
【００６４】
また、本発明の組成物は、創傷または外傷において局所的な血液凝固を促すのに使用されることもある。このアプローチでは、本発明の第五因子は局所的に適用するために製剤され、及び、戦場において、または、出血を止めなければならない、または、出血を止めることが重要とされる状況下において使用される。
【００６５】
本発明は、活性型ＦＶまたはそれらのポリペプチド誘導体をコードする核酸配列からなるＡＡＶベクターも含む。
【００６６】
活性型ＦＶまたはそれらのポリペプチド誘導体をコードする核酸配列からなるレンチウイルスまたは疑似レンチウイルスベクターも含まれる。
【００６７】
活性型ＦＶまたはそれらのポリペプチド誘導体をエンコンディーングする核酸配列からなる裸プラスミドまたは発現ベクターも含まれる。
【００６８】
以下に示す材料及び方法は、以下の実施例の実行を容易にするために提供されたものである。
【００６９】
試薬
ベンズアミジン及び４−アミジノフェニルフッ化メタンスルフォニル塩酸塩（ＡＰＭＳＦ）はＳｉｇｍａ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）のものであり、及び、ダンシルアルギニン−Ｎ−（３−エチル−１，５−ペンタンジイル）アミド（ＤＡＰＡ）は、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（バーモント州、Ｅｓｓｅｘ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ）のものである。ペプチジル基質Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ピペコリル−Ｌ−アルギニル−ｐ―ニトロアニリド（Ｓ２２３８）はＤｉａｐｈａｒｍａ社のものである。全ての組織培養試薬は、インスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム（ＩＴＳ；インディアナ州、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を除いて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州、Ｃａｒｌｓｂａｄ）のものである。鶏卵Ｌ−α−ホスファチジルコリン７５％（ｗ／ｗ）とブタ脳Ｌ−α−ホスファチジルセリン２５％（ｗ／ｗ）からなるラメラリン脂質小胞体（ＰＣＰＳ）（アラバマ州、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄｓ）は記載されたように調製され、及び、特徴付けられている。
【００７０】
タンパク質
ヒトプロトロンビンは先述したように血漿から分離される（２３）。プレトロンビン−１及びプレトロンビン２は確立されたやり方によって精製され（１８）、及び、トロンビンは、血液学的技術から得られる。ＦＶ（ｈＦＶ−８１０）、ｒＦＶａ、ｒＦＸ及びｒＦＸａの構成的活性部分Ｂ−ドメインレス型が調製され、（３、２４、２５）に記載したように精製され、特徴付けられる。ｐｓｅｕｔａｒｉｎＣ（ｐｔ−ＦＸａ）の精製された酵素サブユニットは、ＱＲｘＰｈａｒｍａ（オーストラリア、Ｓｙｄｎｅｙ）から豊富に提供される。組み換え型ヒルジンは、ＥＭＤ−Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（カリフォルニア州、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）から得られる。組み換え型ダニ抗凝固タンパク質及びヒトＡＰＣは、Ｄｒ． Ｓｒｉｒａｍ Ｋｒｉｓｈｎａｓｗａｍｙ（Ｔｈｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）より得られる。使用されている様々なたんぱく質の分子量及び吸光係数（Ｅ０．１％，２８０ｎｍ）は、プロトロンビンが７２，０００及び１．４７（１８）；プレトロンビン‐１が１ ４９，９００及び１．７８（１８）；プレトロンビン‐２が３７，５００及び１．９５（１８）；トロンビンが３７，５００及び１．９４ （２６）；ｒＦＸａが４６，０００及び１．１６（２７）；ｒＦＶａ，が１７５，０００及び１．７８（３）；ｒＦＶ−８１０が２１６，０００及び１．５４（３），及びｐｔ−ＦＶが１７０，０００，及び１．５０（本研究による）である。ｐｔ−ＦＸａにために、ヒトタンパク質のための値が使用されている。特別な記載がない限り、全ての機能的アッセイは、２０ｍＭヘペス、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化カルシウム、０．１％ポリエチレングリコール８０００、ｐＨ７．５（アッセイバッファー）において２５℃で行われる。
【００７１】
分析的超遠心分離：
分子量は、光学干渉を用いた分析的超遠心分離機Ｂｅｃｋｍａｎ Ｏｐｔｉｍａ ＸＬ−Ｉで測定される。沈降速度は２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ７．４、ＡＮ６０Ｔｉローターによる毎分２５，０００回転で測定される。タンパク質濃度は、ｐｔ−ｒＦＶが０．６０ｍｇ／ｍＬ（３．６μＭ）及びｐｔ−ＦＸａが０．１８ｍｇ／ｍＬ（３．９μＭ）である。沈降係数及び分子量はｇ（ｓ＊）分析により測定される。減衰係数は、Ｂａｂｕｌ ａｎｄ Ｓｔｅｌｌｗａｇｅｎ（２９）に記載された手順による示差屈折率測定により測定される。
【００７２】
ｒＦＶ変異体の構造
毒腺由来のコブラ・モドキ（Ｐ．ｔｅｘｔｉｌｉｓ）ＦＶ ｃＤＮＡ（８）は、隣接ＸｍａＩ制限酵素認識部位により修飾され、それにより、ｐＥＤ発現プラスミド内にサブクローニングされる（３）。ｃＤＮＡは、さらに、コブラ・モドキ（Ｐ．ｔｅｘｔｉｌｉｓ）ＦＶの信号配列及び重複によるスプライシングの技術を使用するヒトＦＶの信号配列をコードする配列を交換することにより修飾される（３０）。最終的な構成、ｐＥＤ−ＦＶ−ｐｔｅｘ、その後に成熟ベノム由来ｐｔ−ＦＶタンパク質（残渣１から１４３０）が続くヒトＦＶ信号ペプチド（残渣−２８から１）のためにコードされる。
Ｒａｏ ｅｔ ａｌによりレポートされるのと同一の配列を示すコブラ・モドキ（Ｐ．ｔｅｘｔｉｌｉｓ）ＦＶ ｃＤＮＡ（７）は、コドン５０（Ｌｙｓ）及び１３０５（Ｐｈｅ）を除いて、コースタルタイパン（Ｏ．ｓｃｕｔｅｌｌａｔｕｓ）及びタイパン（Ｏ． ｍｉｃｒｏｌｅｐｉｄｏｔｕｓ）の相応する残渣と同一である（８）。Ｇｌｎにより置換されたＡｒｇ７４２及びＡｒｇ７８８を有するｐｔ−ＦＶ変異体は、適当な突然変異誘発性相補的オリゴヌクレオチドを使用するＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位に誘導された突然変異生成キット（カリフォルニア州、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により発生した。これらのアミノ酸は、ヒトＦＶにおいてアルギニン（Ａｒｇ）７０９及びアルギニン（Ａｒｇ）１５４５に相同であり、及び、トロンビン開裂部位を示す。突然変異生成に続いて、ｃＤＮＡ全体は、目的とする突然変異の存在を確認するため、及び、誤って誘導されたポリメラーゼがないことを確かめるために配列される。
【００７３】
ｐｔ−ｒＦＶの発現及び精製：
ＦＶまたはＦＶ−ＱＱ を含むプラスミドは、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞内に誘導され、及び、高生産安定クローンは、（３）に記載されたように確立される。細胞は三角フラスコ内に広がり、ＩＴＳ及び２．５ｍＭの塩化カルシウムを追加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２媒体内で培養される。調製済みの媒体は、４〜６日間かけて収集され、延伸ぶりされ、及び１０μＭ ＡＰＭＳＦ及び１ｍＭベンズアミジンの存在下において２０℃で保存される。精製のために、媒体は３７℃で融解され、２０ｍＭへペス、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カルシウム、ｐＨ７．４で平衡を保たれた３０ｍＬＱ−セファロースカラム（ニュージャージー州、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に装填される。カラムは同じバッファーで洗浄され、塩化ナトリウム０．１５〜１Ｍの濃度勾配で溶出される。画分は、収集され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び（３）記載のＦＶ特定凝固アッセイにより分析される。ｐｔ−ｒＦＶを含む画分は、貯蔵され、及び２０ｍＭのＭＥＳ、２ｍＭ塩化カルシウム、ｐＨ６．０に対して透析され、及び同一のバッファーで平衡を保たれたＰｏｒｏｓ ＨＳ／２０カラム（１０×１００ｍｍ；カリフォルニア州、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に装填される。カラムは２０ｍＭのＭＥＳ、２ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０で洗浄され、及び、塩化ナトリウム０〜０．６Ｍ濃度勾配で溶出される。画分を含むＦＶは貯蔵され、及び、２０ｍＭへペス、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化カルシウム、ｐＨ７．４に対して透析され、及び、タンパク質は−８０℃で保存される。最終収率は、調製済みの媒体１リットルあたりのｐｔ−ｒＦＶに対して〜４ｍｇである。
【００７４】
タンパク質の特徴：
純正タンパク質は、クマシー ブリリアント ブルーＲ−２５０による染色に続くＭＯＰＳバッファーシステムを用いる非還元及び還元条件（５０ｍＭジチオスレイトール）下で、プレキャスト４〜１２％勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価される。Ｎ末端配列分析は、ガルベストンのＴｅｘａｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｒａｎｃｈ大学のＤｒ．Ａｌｅｘ Ｋｕｒｏｓｋｙ及びＳｔｅｖｅ Ｓｍｉｔｈ、またはＣｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ジョージア州、Ａｔｌａｎｔａ）のＤｒ．Ｊａｎ Ｐｏｈｌの研究室で行われる。ｐｔ−ＦＸａにおける化学的γ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）分析は記載した研究室で行われる（２４）。
【００７５】
タンパク質基質開裂の反応速度論：
高分子基質開裂の定常状態における初期速度は、記載されているように、２５℃で不連続に決定される（２５）。プロトロンビナーゼまたはＦＸａ−ＦＶａに触媒作用されたプロトロンビンまたはプレトロンビン−１活性型（Ｋｍ及びＶｍａｘ）の速度パラメータは、高分子基質の濃度を上昇させることでトロンビン構造の初期割合を測定することにより、アッセイバッファーにおいて決定される。アッセイ混合物は、ＰＣＰＳ（５０μＭ）、ＤＡＰＡ（３μＭ）、様々なｐｔ−ｒＦＶ（ａ）補因子種（２０ｎＭ）及び様々な濃度のプロトロンビン（０〜５．０μＭ）またはプレトロンビン−１（０〜１５μＭ）が含まれる。プレトロンビン−２がタンパク質基質として使用されると、それに続く反応条件は、ＰＣＰＳ（５０μＭ）、ＤＡＰＡ（３μＭ）、及びプレトロンビン−２（１．４μＭ）が用いられ、様々なＦＶ（ａ）補因子（０〜４０ｎＭ）と保温培養され、及び、反応はｐｔ−ＦＸａ（５ｎＭ）により開始される。特定の実験においては、ＰＣＰＳは、反応混合物に含まれない（図の説明文を参照）。ｐｔ−ｒＦＶａが使用される実験においては、ｐｔ−ｒＦＶ（６００ｎＭ）は２ｎＭトロンビンと３７℃で１５分間保温培養され、続いて２．４ｎＭヒルジンが加えられる。
【００７６】
ｐｔ−ｒＦＶのＡＰＣ不活性：
ＰＣＰＳ（５０μＭ）存在下における様々な補因子タンパク質（５００ｎＭのｐｔ−ｒＦＶ，ｐｔ−ｒＦＶａ，ｒｈＦＶａ，またはｈ−ＦＶ−８１０）の不活性化は、ＡＰＣ添加（１０μＭまたは７５０ｎＭ）により開始される。反応混合物の一定分量は指定された時間間隔で取り出され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％ゲル）及び機能的活性の評価を通して評価される。このアッセイにおいて、残渣補因子活性は、特に（２５）に記載されたようなプロトロンビン活性におけるＦＶａの作用を測定することにより評価される。アッセイ混合物には、１．４μＭプロトロンビン、５０μＭのＰＣＰＳ、３μＭのＤＡＰＡ、１ｎＭのＦＶａ、及び１ｎＭのｐｔ−ＦＸａが含まれる。ｒｈＦＶａまたはｈＦＶ−８１０と、ヒトｒＦＸａは代わりに使用される。これらの条件下で、反応の初期割合は補因子の濃度と比例している。
【００７７】
データ分析：
データは、マーカード アルゴリズム（Ｍａｒｑｕａｒｄｔ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を使用する非線形最小二乗法による回帰分析から求められる参照式によって分析される（３１）。適合の質は、（３２）に記載の基準により評価した。エラーの報告された推定値は、±２ Ｓ.Ｄを示す。ｐｔ−ＦＸａ及びｐｔ−ｒＦＶ（ａ）間での相互作用における解離定数（Ｋｄ）は、プレトロンビン−２活性型の初期値の１に固定された化学量論と補因子の濃度への依存から得られる（３３）。プロトロンビナーゼによるプロトロンビンまたはプレトロンビン−１の開裂の初期速度測定は、Ｋｍ及びＶｍａｘの近似値を得るため、ヘンリー−ミカエリス−メンテン（Ｈｅｎｒｉ−Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ）の方程式（３４）にデータを適合させることで分析される。
【００７８】
以下に記載の実施例は、本発明の特定の実施形態を示すものとして提供される。これらはいかなる場合においても本発明を制限することを意図していない。
【実施例１】
【００７９】
ヒトの治療における使用のためのヘビ毒由来またはヒト型誘導体の第五因子
本発明はコブラ・モドキ（Ｐ．ｔｅｘｔｉｌｉｓ）からのヘビ毒由来ＦＶの生物学的特性を記述する。これらの固有な性質は、以下に列記するように、凝血原特性を反復するヒトＦＶ誘導体に設計されることもある。これらの性質とは、ａ）ｐｔ−ＦＶが活性状態で存在し、補因子が自然発生の活性ＦＶ変異体の第一実施例のようであること、ｂ）ｐｔ−ＦＶが、セリンプロテアーゼ因子Ｘａ（ＦＸａ）と高い親和性で結合するのを達成する膜表面のための通常要件を回避するような固有な形態を有すること、ｃ）重鎖及び軽鎖を結合するｐｔ−Ｆｖの固有のジスルフィド結合により、ｐｔ−ＦＶは、活性型タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）による不活性に機能的に抵抗すること、である。これらの特徴の一つまたはそれ以上からなるヒトＦＶ誘導体を操作することは、その凝血原特性を強化し、したがって、出血性疾患の治療において有用な治療的ツールを提供する。
【００８０】
本研究においては、非常に精製されたヘビ毒由来Ｆｘａ（ｐｔ−ＦＸａ）と同様に、コブラ・モドキ（Ｐ． ｔｅｘｔｉｌｉｓ）からの組換え型ヘビ毒由来ＦＶ（ｐｔ−ｒＦＶ）による一連の機能的測定値は、ＦＶの固有の形態の生物学的性質を調査し、ヘビ毒由来プロトロンビナーゼ複合体の強力な凝血性質における基本的メカニズムを調べるのに使用される。この働きは、ｐｔ−ｒＦＶが、哺乳類ＦＶにおいては起こることが未知である機能的要素の複数の利益を獲得することで、有力な凝血源に適応したことを証明している。この研究結果は、ＦＶの構造／機能関係の複数の態様に新しい光を投じ、治療的な目的のための生物学ＦＶを容易にし、さらに、選択的優位性のためのタンパク質の既存の特性を強化する性質の驚くべき能力を強調する。
【００８１】
結果
ｐｔ−ｒＦＶの発現及び物理的特徴
天然のヘビ毒の高いプロテアーゼ含有量のために、同種の単離、ｐｔ−ＦＶの未開裂調製は得られない（１２〜１５）。これを回避するために、ＢＨＫ細胞から精製されたｐｔ−ｒＦＶは高い収量で示された。野生型ｐｔ−ｒＦＶ及び重鎖及び軽鎖の側面に位置するトロンビン開裂部位が欠乏する変異体（ｐｔ−ｒＦＶ−ＱＱ）は、還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてシングルバンド（〜１８０ｋＤａ）として主に移行する（図１、パネルＡ）。沈降速度の研究は、ｐｔ−ｒＦＶが、１７０，０００の分子量評価により均一であることを示した。ｐｔ−ｒＦＶ−ＱＱがトロンビンにより開裂されないのに対し、ｐｔ−ｒＦＶはｐｔ−ｒＦＶａに処理され、特有の重鎖及び軽鎖を産出する。Ｎ−末端配列分析は、予測されたトロンビン開裂部位における的確な処理を明らかにした（図１）（７，８）。驚くべきことに、トロンビン処理の後に、ｐｔ−ｒＦＶａの大部分（>６０％）は、非還元条件下においてシングルバンドとして移動し（図１、パネルＢ）、重鎖及び軽鎖が、固有のジスルフィド結合により結合していることを示している。この可能性は、非還元条件下における二重項としてｐｔ−ｒＦＶ及びｐｔ−ｒＦＶ−ＱＱの移行を説明している。配列アラインメントは、重鎖に二つの遊離Ｃｙｓ残基（Ａ２ドメイン、５３９及び６４１）、軽鎖に一つの遊離Ｃｙｓ（Ａ３ドメイン、１０３２）を有するであろうことを示している（７）。
【００８２】
【表１】
【００８３】
コブラ・モドキ（Ｐ．ｔｅｘｔｉｌｉｓ）またはコースタルタイパン（Ｏ．ｓｃｕｔｅｌｌａｔｕｓ）の天然のヘビ毒から精製されたＦＶは、ウシＦＸａの存在下において低活性である（１４、１５）。ｐｔ−ｒＦＶを特徴付ける初期の試みは、これらの観察と矛盾しない。しかしながら、推定値は、ｐｔ−ｒＦＶまたはｐｔ−ｒＦＶａはヒトＦＶａと比較してほぼ＝１／４０ｔｈ活性を示す。低活性は、主にｐｔ−ｒＦＶまたはｐｔ−ｒＦＶａが、確立された経口結合測定値を使用する膜結合ヒトＦＸａ（Ｋｂ>４００ｎＭ）との親和性を減らすことで結合されることにより起因するようである（データは示されていない）（３）。したがって、ｐｔ−ｒＦＶを特徴付けるため、ｐｔ−ＦＸａが全てのそれに続く実験において使用された。ｐｔ−ＦＸａのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、予測される結果を与えたＮ末端配列分析とともに図１に示される。二重項としての軽鎖の外観は、不均一なＯ−グリコシル化に原因があるようだ（８、１６）。さらに、ｐｔ−ＦＸａの化学的Ｇｌａ分析は、配列アラインメントから予測される１１モル Ｇｌａ／ｍｏｌタンパク質から１０．９±０．３４モルＧｌａ／ｍｏｌタンパク質を産出した。
【００８４】
Ｐｔ−ｒＦＶは構成的に活性型補因子である
ｐｔ−ＦＶ Ｂドメインの変わった性質のため、一連の機能的測定は、ヘビ毒由来ＦＶのこのドメインが、プロコファクターとしてのタンパク質を維持するように機能するかどうか確定するために使用された。機能的な測定値に対する一つの懸案事項は、元の位置に生成されたトロンビンによるｐｔ−ｒＦＶのフィードバック・タンパク質分解である。これに適応するために、反応体の濃度はタンパク質分解を最小にするように選ばれ、及び、トロンビンの可逆性抑制剤（ＤＡＰＡ）がアッセイに含まれる。さらに、ｐｔ−ｒＦＶ−ＱＱ、トロンビンによって媒介されるタンパク質分解に抵抗する変異体（図１）が調製された。ヒトＦＶ（１）とは対照的に、膜結合ｐｔ−ＦＸａを有するｐｔ−ｒＦｖの組み立ては、プロトロンビンを急速に活性化させる（図２Ａ）。プロトロンビン転換のための定常状態速度定数は、ヒトプロトロンビナーゼにおいて観察される定常状態速度定数と著しく類似している。（表２）（３、１７）。興味深いことに、ヒトＦＶの誘導体で切断されたＢ−ドメイン、ｈＦＶ−８１０は、ｐｔ−ＦＶ−膜によって集まり、相当する速度パラメータを有するプロトロンビンを活性化することが可能であった（表２）。ｐｔ−ｒＦＶａを生成するまたは、未開裂変異体、ｐｔ−ｒＦＶ−ＱＱを使用するトロンビンによる短いＢ−ドメインの除去は、相当する速度定数を与える（図２Ａ及び表２）。これらのデータは、ヒトＦＶとは異なり、ｐｔ−ＦＶは、構成的に活性型補因子であり、及び、Ｂ−ドメインのタンパク質分解除去が凝血原活性を表すことを必要としないことを示す。これは、ＦＶの構成的活性型の自然な第一実施例を表す。
【００８５】
【表２】
【００８６】
アニオン性膜の非存在下でのＰｔ−ｒＦＶの機能
血液凝固の重要な観点は、凝固タンパク質を細胞表面に（ホスファチジルセリン曝露を介して）結合する膜が正常な止血のためには重要であるということである（２）。オスキュタリン（ｏｓｃｕｔａｒｉｎ）及びプスタリンＣ（ｐｓｅｕｔａｒｉｎ Ｃ）によりみられる変わった観察結果は、ヘビ毒由来ＦＸａ及びＦＶが複合体として同時精製し、陰イオン膜非存在下において、ある程度活性を示すことである。しかしながら、オスキュタリン（ｏｓｃｕｔａｒｉｎ）の活性は、膜存在下において、実質的に増加する（>４００−倍）ことが報告されている（１２〜１５）。さらにこれを調べるために、プロトロンビンを使用する溶液位相ｐｔ−ＦＸａ−ｐｔ−ｒＦＶの活性が評価された。膜非存在下において、ｐｔ−ｒＦＶ、ｐｔ−ｒＦＶ−ＱＱまたはｐｔ−ｒＦＶａを有するｐｔ−ＦＸａを使用するプロトロンビンの初期割合は、同じ酵素濃度で膜存在下において得られる割合と比較して７〜８倍低いものであった（図２Ｂ）。活性の減少は、プロトロンビンのＫｍ増加（〜４倍）及びｋｃａｔの減少（〜４倍）によって反映された。対照的に、膜非存在下において、ｈＦＶ−８１０は、膜結合補因子と比較して非常に低い活性を有した（>１５０倍）（図２Ｂ）。
【００８７】
これらのデータの解釈の困難は、基質、プレトロンビン、トロンビンの生成の割合を高めるのに貢献する結合膜にある。さらに、ｐｔ−ＦＸａ−ｐｔ−ｒＦＶのための溶液位相解離定数に応じて、ｐｔ−ＦＸａはｐｔ−ｒＦＶで飽和することができず、実際の酵素複合体の濃度を低下させ、プロトロンビン活性率の減少へと至った。一点目に取り組むために、膜の存在及び非存在下でのプレトロンビン−１活性の割合が測定される。プレトロンビン−１は、γ−カルボキシグルタミン酸及びクリングル−１ドメインと結合する膜を欠失するプロトロンビンの派生物である（１８）。プロトロンビンを使用している結果と整合して、ｐｔ−ｒＦＶ、ｐｔ−ｒＦＶ−ＱＱまたはｐｔ−ｒＦＶａを使用する膜結合ｐｔ−ＦＸａを有するプレトロンビン−１の反応速度は、等しいものであり（図３Ａ及び表２）及びヒトプロトロンビナーゼを使用する速度パラメータと同等であった（１７）。しかしながら、意外にも、反応混合物からの膜の除去は、溶液位相または膜結合ｐｔ−ＦＸａ−ｐｔ−ｒＦＶにおける運動パラメータが等しいため、プレトロンビン−１活性の割合において感知できるほどの効果は有さない（図３Ｂ及び表２）。これらのデータは、ｐｔ−ＦＸａ−ｐｔ−ｒＦＶを有するプロトロンビン活性割合の減少率が、酵素機能ではなく、むしろ結合している基質膜の除去にあったことを示唆している。
【００８８】
Ｐｔ−ＦＸａ及びｐｔ−ｒＦＶが形成する高親和性複合体
膜の存在または非存在におけるプレトロンビン−１活性の割合が同等になると、データは、ｐｔ−ＦＸａがｐｔ−ｒＦＶと完全に飽和されることを示す。しかしながら、これを直接評価するために、いずれの膜結合または溶液位相ｐｔ−ＦＸａ−ｐｔ−ｒＦＶにおける平衡解離定数を意味する機能的な結合測定が使用された。補因子（ｐｔ−ｒＦＶ、ｐｔ−ｒＦＶ−ＱＱ、ｐｔ−ｒＦＶａまたはｈＦＶ−８１０）の濃度の増加は、ＰＣＰＳの存在下または非存在下において、ｐｔ−ＦＸａの濃度を固定して、単一で培養された。プレトロンビン−２活性の初期割合は測定され、及び、データはｐｔ−ＦＸａと結合している補因子に推定された平衡解離定数を得るために分析された（表３）。ＰＣＰＳの存在下において、補因子の種類に関係なく、ｐｔ−ＦＸａと結合している解離定数はほぼ＝３ｎＭであった。この値は、膜結合ヒトＦＸａ及びＦＶａを使用して得られた解離定数と類似しているものである（３）。驚くべきことに、ｐｔ−ｒＦＶ、ｐｔ−ＦＶ−ＱＱまたはｐｔ−ｒＦＶａにおける解離定数は、膜非存在下において、わずか２〜３倍増加させた（Ｋｄほぼ＝８ｎＭ）。これは、ＦＸａ−ＦＶａにおける溶液位相解離定数がほぼ＝０．８〜３．０μＭである牛におけるシステムとは対照的である（１９、２０）。沈降速度実験では、溶液位相ｐｔ−ｒＦＶ−ｐｔ−ＦＸａが２１３，０００の分子量及び９．３３の沈降係数（ｓ２０，ｗ）と１：１で化学量論複合体を形成していた。これらの値はウシＦＸａ−Ｆｖａによって得られた結果と非常によく一致している（１９）。ヘビ毒由来補因子とは対照的に、溶液位相ｈＦＶ−８１０−ｐｔ−ＦＸａにおける結合定数（表３）は、確立することができず、ｐｔ−ＦＸａ結合が、少なくとも溶液において、ｈＦＶ−８１０に存在しないｐｔ−ｒＦＶにおいて固有な性質を含むことを示唆している。これらのデータは、ｐｔ−ＦＸａ−ｐｔ−ＦＶ複合体は、プロトロンビンを急速に活性化できる１：１複合体が高い親和性を形成するため、負に荷電された膜において通常必要とされるものを回避したことを示す。
【００８９】
【表３】
【００９０】
Ｐｔ−ｒＦＶはＡＰＣに機能的耐性がある
ＡＰＣは止血系及びタンパク質分解の制限を介してＦＶａ及びＦＶＩＩＩａの両方を不活性化する機能における重要な抗凝血剤である（２１）。ヒトＦＶａにとって、Ａｒｇ３０６、Ａｒｇ５０６及びＡｒｇ６７９での開裂は、Ａ２ドメインの解離において、ＦＸａ結合及び最終的には補因子機能の消失を生じる（１）。ｐｔ−ＦＶの配列分析は、これらの部位にＡＰＣ耐性がある可能性の示唆は保存されていない（７）。プスタリンＣの研究はこの論点を支持している（７）；しかしながら、ＦＸａは、データ解釈を複雑にするＡＰＣによる不活性からＦＶａを保護する（１）。ｐｔ−ｒＦＶがＡＰＣに対して耐性を示すかどうか直接調べるために、これらのタンパク質は、ＰＣＰＳ存在下において培養され、及び、様々な時間間隔で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び精製されたプロトロンビンアッセイを使用する補因子活性によって、タンパク質分解を観察した。結果的にｒｈＦＶａまたはｒＦＶ−８１０機能を完全に失ったＡＰＣ濃度（１０ｎＭ）及び反応時間（≦１５分）を使用して、ｐｔ−ｒＦｖまたはｐｔ−ｒＦＶａは完全に活性を保持し（図４Ａ）及び、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、これらのタンパク質の限定された開裂のみを示した（データは示されていない）。しかしながら、長時間における高濃度ＡＰＣ（７５０ｎＭ）とのｐｔ−ｒＦＶの培養は、結果として完全なタンパク質分解ｐｔ−ｒＦＶとなった（図４Ｂ、Ｃ）。Ｎ−末端配列分析と還元及び非還元ゲルの分析はともに、ＡＰＣがＡ２ドメインにおいてｐｔ−ｒＦＶを開裂することを示す。驚くべきことに、ｐｔ−ｒＦＶの完全なタンパク質分解にもかかわらず、補因子は、完全な凝血原活性を保持した（図４Ａに挿入）。
第五因子変異体をコードする核酸配列は図５において提供されている。
【００９１】
議論
多くの血液凝固タンパク質は、不活性な前駆体として合成され、及びその結果としてタンパク質分解活性があり、これらのタンパク質は、血管外傷（２）の場所に位置する細胞表面上に組み立てられる。本研究において、ｐｔ−ＦＶは、これらのパラダイムを、ＦＸａ及び活性型プロトロンビンを結集させる膜表面に必要な構造的活性化補因子及びバイパスとして合成されたものと同様に回避する。さらに、Ｐｔ−ＦＶはＡＰＣ、タンパク質分解的切断後の活性の保持に機能的耐性がある。改良された非共有結合性の相互作用と重鎖及び軽鎖を結合する独自のジスルフィド結合はおそらく機能安定性に貢献する。これらの適用の集密は、強力な凝血促進剤に形質転換されたｐｔ−ＦＶを有し、及び、毒物注入に続いておこる重度の播種凝固による選択的優位性のあるヘビ種をおそらく提供する。
【００９２】
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【００９３】
本発明の特定の好ましい実施形態が明細書において記載され、具体的に例示されているが、本発明は実施形態のように限定されるものと意図していない。以下の請求の範囲から逸脱することなく、本発明に様々な変更がなされることがある。
【技術分野】
【０００１】
この出願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づいて、２００８年１１月２１日に出願された米国仮出願第６１／１１６，９１３号に対して優先権の主張を行い、その全体の開示は、完全に参照により本明細書に組み込まれる。
３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§２０２（ｃ）に基づいて、米国政府はここに記載された発明において一定の権利を有することを認めている。本発明は、国立保健研究機構、認可番号ＨＬ−０８８０１０及びＰ５０ＨＤ０５５７８４−０１からの資金の一部により行われた。
【０００２】
本発明は医学及び血液学の分野に関するものである。さらに具体的には、本発明は、ヘビ毒由来の第五因子（ＦＶ）の変異体およびそれらの誘導体を、それらを必要とする患者において凝固カスケードを調節するために使用する治療戦略について記述する。
【背景技術】
【０００３】
いくつかの出版物及び特許文献は、本発明の属する技術分野について記述するため明細書に引用されている。これらの引用はそれぞれ、参照として明細書に完全に組み込まれる。
【０００４】
血液凝固ＦＶは、マルチドメインタンパク質（Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２）であり、わずかな凝血原活性、または凝血原活性なしでプロコファクターとして循環する。補因子の活性化状態（ＦＶａ）への転換は、トロンビンによる、グリコシル化された中央Ｂドメインの大部分の分解除去を含む（１）。ＦＶａは、プロトロンビナーゼの形成、プロトロンビンの生理活性のため、カルシウムイオンの存在下で負に帯電した膜表面上のセリンプロテアーゼ因子Ｘａ（ＦＸａ）と会合する（２）。ＦＶａがトロンビンの生成を大幅に高めるため、非活性プロコファクターとしてのＦＶの維持は、正常な止血の維持を発展させるうえで間違いなく重要な役割を果たす。最近では、Ｂドメイン内の個別の配列は、非活性プロコファクターとして持続するＦＶのメカニズムに寄与することが示されている（３，４）。この領域の除去は、タンパク質分解処理を必要とせずにＦＶ活性をもたらす。
【０００５】
ＦＶは、Ａ及びＣドメイン間では高い相同性、Ｂドメイン間では低い相同性を脊椎動物間で広く示される（５，６）。最近のゲノムデータでは、Ｂドメインの長さが一般的に哺乳類の間で共通して保存されている（〜８００残基）のに対し、下等脊椎動物では大きく異なる（例えば、トラフグでは〜５００残基）ことを示している（５，６）；これらの構造変化の機能的な意味は理解されていない。Ｂドメインへの主要な変化の顕著な例は、オーストラリアのヘビのグループ（タイパン（Ｏｘｙｕｒａｎｕｓ ｍｉｃｒｏｌｅｐｉｄｏｔｕｓ）、コブラ・モドキ（Ｐｓｅｕｄｏｎａｊａ ｔｅｘｔｉｌｉｓ）及びコースタルタイパン（Ｏｘｙｕｒａｎｕｓ ｓｃｕｔｅｌｌａｔｕｓ））からきている。これらの種は独特であり、加えて、これらの止血システムの一部としてＦＶは循環しており、その毒にもＦＶを有している。これらの種のそれぞれからの毒由来ＦＶは、同様のドメイン構造を有する哺乳類のＦＶと、〜４４％の配列相同性が共通している。しかしながら、Ｂドメインの長さはヒトのＦＶと比べて飛躍的に短い（８３６残基に対して、〜４６残基）。これらのヘビからの毒は、世界で最も有毒であるとみなされており、強力な血液凝固促進剤であり、及び、いくつかある症状のなかで特に、播種性血管内凝固障害を引き起こす（１０）。これは、大量のＦＶと同様に、共に強力なプロトロンビン活性化因子である複合体を形成するＦＸａ様酵素を含む。コースタルタイパン（オスキュタリンＣ）及びコブラ・モドキ（プスタリンＣ）からの複合体は部分的に精製され、及び粗毒と特徴づけられる。プロトロンビンのトロンビンへの変換もそれらの活性を強化するのもカルシウム及びリン脂質によって程度が異なるが、ＦＶａは影響しない。さらに、プスタリンＣは活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）に対して耐性を示し、強力な毒素としての役割に潜在的に貢献する（７）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によって、それを必要とする患者における血液凝固障害を治療する方法が提供される。例示的な方法では、ＦＶ変異体またはそれらの誘導体の活性型の有効量を投与する工程であって、それによって前記患者の血栓形成を増進し、且つ出血性疾患の症状を改善するものである、前記投与する工程を伴う。一実施形態においては、変異第五因子は配列ＩＤ番号１の配列を有する核酸によってコードされる。他の実施形態においては、変異第五因子は、配列ＩＤ番号２の配列を有する核酸を最適化したコドンによってコードされる。
【０００７】
前記方法及び第五因子凝血原は、血液凝固障害の治療に使用されることもある。血液凝固障害は、これに限定されるわけではないが、血友病ＡおよびＢ、抑制抗体に関連する血友病Ａ及びＢ、凝固因子欠乏症、ビタミンＫエポキシド還元塩素欠乏症、ガンマカルボキシラーゼ欠乏症、外傷に伴う出血、負傷、血栓症、血小板減少症、脳卒中、凝血障害、播種性血管内凝固障害（ＤＩＣ）、過抗凝固治療障害、バーナードスーリエ症候群、グランツマンの血小板無力症、及び貯蔵プール欠乏症を含む。また、血液凝固障害は、ヘパリン、低分子量ヘパリン、五糖類、ワルファリン、低分子抗血栓及びＦｘａ阻害剤の投与によることもある。
【０００８】
本発明の変異第五因子は、患者に直接注入または局所投与することができ、または、それをコードするベクターの形で移送され得る。
【０００９】
また、以下の性質の一つまたはそれ以上を示す、ヒト化及び改善型第五因子変異体が提供される。ＦＶ変異体は、活性化、補因子の状態で合成される；ＦＶ変異体は、膜表面が、セリンプロテアーゼＸａ因子（ＦＸａ）と高い親和性で結合するための通常の条件を回避できるよう、独自の立体構造を有する；及び、ＦＶ変異体は、その重鎖及び軽鎖を接続する固有なジスルフィド結合を含めることにより、活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）による不活性に対して機能的に耐性がある。
【００１０】
本発明の他の実施形態においては、ヘビ第五因子をコードする配列ＩＤ番号２の単離された核酸が提供される。このような核酸は、使用のために発現ベクターに含まれ得る。
【００１１】
さらに別の実施形態では、本発明は、配列ＩＤ番号１の核酸によりコードされた、単離されたヘビ第五因子タンパク質を提供する。ヘビ第五因子タンパク質は、リポソームまたはミセルに含有され得る。また、本発明は、薬学的に許容される賦形剤に含まれるヘビ第五因子タンパク質からなる薬学的組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】精製タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析 タンパク質（３μｇ／レーン）は、還元（パネルＡ、Ｃ）条件下、または、非還元（パネルＢ）条件下でＳＤＳ‐ＰＡＧＥに曝され、及びクマシーブリリアントブルーＲ‐２５０で染色することにより可視化される。レーン１、ｐｔ−ｒＦＶ、レーン２、ｐｔ−ｒＦＶ−ＱＱ、レーン３、ｐｔ−ｒＦＶ プラス トロンビン、レーン４、ｐｔ−ｒＦＶ‐ＱＱ プラス トロンビン、レーン５、ｒＦＸ、レーン６、ｒＦＸａ、レーン７，ｐｔ−ＦＸａ。標準の見かけの分子量が左側に示されている。パネルＡ及びパネルＢは同じマーカーを共有している。ダッシュ（−）は、収率がアミノ酸を正確に割り当てるにはあまりに低量であることを示し、及び、可能性の高いγ−カルボキシグルタミン酸の存在を示す６つの位置である。
【図２】ＰＣＰＳの存在下、または非存在下におけるプロトロンビンの開裂の速度定数の測定 トロンビン生成の初期速度は、５０μＭのＰＣＰＳ及び０．１ｎＭのｐｔ−ＦＸａ及び２０ｎＭのｈＦＶ−８１０（−◆−または−◇−）、ｐｔ−ｒＦＶ（−●−または−○−）、ｐｔ−ｒＦＶ−ＱＱ（−▲−または−△−）、またはｐｔ−ｒＦＶａ（−■−または−□−）と３μＭのＤＡＰＡの存在（パネルＡ）または非存在（パネルＢ）でのプロトロンビンの濃度の増加によって決定される。全てのデータセットの以下の分析は矩形双曲線に描かれ、適した速度定数は表２に示されている。データは、２つの類似した実験においての代表的なものである。
【図３】ＰＣＰＳの存在下、または非存在下におけるプレトロンビン−１の開裂の速度定数の測定 トロンビン生成の初期速度は、５０μＭのＰＣＰＳ及び０．１ｎＭのｐｔ−ＦＸａ及び２０ｎＭのｈＦＶ−８１０（−◆−または−◇−）、ｐｔ−ｒＦＶ（−●−または−○−）、ｐｔ−ｒＦＶ−ＱＱ（−▲−または−△−）、またはｐｔ−ｒＦＶａ（−■−または−□−）と３μＭのＤＡＰＡの存在（パネルＡ）または非存在（パネルＢ）でのプレトロンビン−１の濃度の増加によって決定される。全てのデータセットの以下の分析は矩形双曲線に描かれ、適した速度定数は表２に示されている。データは、２つの類似した実験においての代表的なものである。
【図４Ａ】ＡＰＣによる膜結合型ＦＶ（ａ）の不活性化 ５０μＭのＰＣＰＳ及び５００ｎＭのｐｔ−ｒＦＶ（−●−）、ｐｔ−ｒＦＶａ（−(−）、ｈＦＶ−８１０（−◆−）、またはｒＦＶａ（−(−）を含む反応混合物は１０ｎＭまたは７５０ｎＭ（ｉｎｓｅｔ）のＡＰＣどちらかと保温培養される。選択した時間間隔において、試料は削除され、及び、「実験的手法」（パネルＡ）に記載された方法で、または、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上を走らせ、還元下（パネルＢ）または非還元条件下（パネルＣ）でクマシー ブルー Ｒ２５０で染色して、補因子活性をアッセイ分析した。データは二つの類似した実験においての代表的なものである。
【図４ＢＣ】ＡＰＣによる膜結合型ＦＶ（ａ）の不活性化 ５０μＭのＰＣＰＳ及び５００ｎＭのｐｔ−ｒＦＶ（−●−）、ｐｔ−ｒＦＶａ（−(−）、ｈＦＶ−８１０（−◆−）、またはｒＦＶａ（−(−）を含む反応混合物は１０ｎＭまたは７５０ｎＭ（ｉｎｓｅｔ）のＡＰＣどちらかと保温培養される。選択した時間間隔において、試料は削除され、及び、「実験的手法」（パネルＡ）に記載された方法で、または、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上を走らせ、還元下（パネルＢ）または非還元条件下（パネルＣ）でクマシー ブルー Ｒ２５０で染色して、補因子活性をアッセイ分析した。データは二つの類似した実験においての代表的なものである。
【図５Ａ】第五因子のための核酸コーディング配列 第五因子（配列ＩＤ番号１）に誘導されたヘビ毒の核酸配列は、パネル５Ａ及び５Ｂに示されている。哺乳類系での発現に最適化されたコドンを有する第五因子（配列ＩＤ番号２）に誘導されたヘビ毒の核酸配列はパネル５Ｃ及び５Ｄに示されている。
【図５Ｂ】第五因子のための核酸コーディング配列 第五因子（配列ＩＤ番号１）に誘導されたヘビ毒の核酸配列は、パネル５Ａ及び５Ｂに示されている。哺乳類系での発現に最適化されたコドンを有する第五因子（配列ＩＤ番号２）に誘導されたヘビ毒の核酸配列はパネル５Ｃ及び５Ｄに示されている。
【図５Ｃ】第五因子のための核酸コーディング配列 第五因子（配列ＩＤ番号１）に誘導されたヘビ毒の核酸配列は、パネル５Ａ及び５Ｂに示されている。哺乳類系での発現に最適化されたコドンを有する第五因子（配列ＩＤ番号２）に誘導されたヘビ毒の核酸配列はパネル５Ｃ及び５Ｄに示されている。
【図５Ｄ】第五因子のための核酸コーディング配列 第五因子（配列ＩＤ番号１）に誘導されたヘビ毒の核酸配列は、パネル５Ａ及び５Ｂに示されている。哺乳類系での発現に最適化されたコドンを有する第五因子（配列ＩＤ番号２）に誘導されたヘビ毒の核酸配列はパネル５Ｃ及び５Ｄに示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
毒ヘビは自分自身の防御のため、及び獲物を無力化するために、血液凝固促進剤などのような有毒な化合物の配列を生成する。オーストラリアのブラウンスネーク、コブラ・モドキ（Ｐｓｅｕｄｏｎａｊａ ｔｅｘｔｉｌｉｓ）は、Ｘａ因子（ＦＸａ）及び第五因子（ＦＶ）と一致する、毒由来のプロトロンビン活性化複合体を有する。前記ＦＶ組成物（ｐｔ−ＦＶ）は、ヒトＦＶと同様のドメイン組織を有するが、その中央ドメインはとても少ない（８３６アミノ酸に対して５５）。ここでは、ｐｔ−ＦＶは強力な血液凝固促進剤に変換する機能要素の固有な増加を獲得している。組み換えｐｔ−ＦＶを用いた測定は、それが構造的に活性補因子として合成され、ヒトＦＶとは異なり、活性の発現にタンパク質分解を必要としないことを明らかにした。配列の比較により、非活性プロコファクター状態を安定させるのに役立つＢドメイン内の塩基性アミノ酸の保存クラスターを失っていることが明らかとなった。注目すべきことは、ｐｔ−ＦＶは、負に帯電したリン脂質の非存在下では、高い親和性でヘビＦｘａを結合するように働き、及び、膜の非存在下、または存在下においては、プレトロンビン‐１と同等の運動パラメータを示すことである。さらに、ｐｔ−ＦＶは、重鎖のタンパク質分解によってもたされた濃度であっても、活性タンパク質Ｃに機能的耐性がある。この安定性は、ある程度、重鎖と軽鎖を結合する固有なジスルフィド結合による可能性が高い。同時に、これらの分子の技術革新の合流点は、ｐｔ−ＦＶを血液凝固生物兵器にしている。これらの発見は、ＦＶがプロコファクターとしてどのように保存されるかについて重要な新しい洞察を提供し、及び、ＦＸａ‐ＦＶａ相互作用が、プロトロンビナーゼの拡張作用にどのように寄与するかよりよく理解するために広範な影響を有する。
【００１４】
従って、本発明はまた、第五因子（ＦＶ）の固有な誘導体を提供する。その誘導体は、一般的なブラウンスネーク、コブラ・モドキ（Ｐｓｅｕｄｏｎａｊａ ｔｅｘｔｉｌｉｓ）の毒内で、または異種発現システム（ｐｔ−ＦＶ）、または以下の固有な特徴の一つまたはそれ以上を有する同様のシステムで発現するヒトＦＶ誘導体である。
【００１５】
ａ）ＦＶ変異体は活性化、補因子状態で合成される
ｂ）ＦＶ変異体は、膜表面で、そのセリンプロテアーゼＸａ因子（ＦＸａ）と高い親和性で結合するのに通常必要とされる条件を迂回できるよう、独自の立体構造を有する
ｃ）ＦＶ変異体は、その重鎖及び軽鎖を接続する固有なジスルフィド結合を含めることにより、活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）による不活性に対して機能的に耐性がある。
【００１６】
I.定義
本発明の生体分子に関連する様々な用語は、上述及び明細書及び特許請求の範囲のいたるところに用いられている。
【００１７】
「変異型ＦＶ」という用語は、ヘビまたは他の異種発現システムから得られる、強力な血液凝固活性を示すＦＶ誘導体分子に関するものである。本発明の変異型ＦＶは配列ＩＤ番号１によってコードされ、またはその変異（例えば配列ＩＤ番号２）はヒトでの使用に適合し、望ましいＦＶ血液凝固活性を促進する。
【００１８】
「止血関連疾患」または「血液凝固障害」という用語は、血友病Ａ及びＢ、抑制抗体に関連する血友病Ａ及びＢ、凝固因子欠乏症、ＶＩＩ１ ＩＸ及びＸ、ＸＩ、Ｖ、ＸＩＩ、ＩＩ因子、フォン・ヴィレブランド因子欠乏症、結合ＦＶ／ＦＶ１欠乏症、ビタミンＫエポキシド還元塩素欠乏症、ガンマカルボキシラーゼ欠乏症、外傷に伴う出血、負傷、血栓症、血小板減少症、脳卒中、凝血障害、播種性血管内凝固障害（ＤＩＣ）、ヘパリン、低分子量ヘパリン、五糖類、ワルファリン、低分子抗血栓（例えばＦＸａ阻害剤）に関連する過抗凝固、及びバーナースーリエ症候群、グランツマンの血小板無力症及び貯蔵プール欠乏症のような血小板異常症などの出血障害に関連する。
【００１９】
本発明の核酸を参照するにあたり、「単離された核酸」という用語が時折用いられる。この用語は、ＤＮＡに適用される際に、そこから由来する生物の天然に存在するゲノムにおいて直接に連続する（５’及び３’方向において）配列から離されているＤＮＡ分子を意味する。例えば「単離された核酸」は、プラスミドまたはウイルスベクターなどのようなベクター内に挿入された、または原核生物または真核生物のＤＮＡ内に合成されたＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子からなる。本発明のＲＮＡ分子に関しては、「単離された核酸」という用語は、前記の単離されたＤＮＡによりコードされたＲＮＡ分子を主に意味する。また、この用語は、「実質的に純粋な」形（用語「実質的に純粋な」に関しては、以下に定義する）で存在するように、その自然な状態（例えば、細胞または組織内）で結合されたＲＮＡ分子から十分に分離されたＲＮＡ分子に関するものである。
【００２０】
タンパク質に関して、「単離されたタンパク質」または「単離及び精製されたタンパク質」という用語が、時おり本明細書において使用されている。この用語は、本発明の単離された核酸分子の発現により生成されるタンパク質を主に意味する。また、この用語は、「実質的に純粋な」形で存在するように結合された他のタンパク質から十分に分離されたタンパク質に関するものである。
【００２１】
用語「プロモーター領域」は、遺伝子の転写調節領域に関するものであり、コーディング領域の５’側または３’側、またはコーディング領域内、またはイントロン内でみられることもある。
【００２２】
用語「ベクター」は、そこで複製される宿主細胞内に導入するため挿入されるＤＮＡ配列内の小さな担体ＤＮＡ分子に関するものである。「発現ベクター」は、宿主細胞内での発現に必要とされる調節領域と遺伝子または核酸配列を含む特殊なベクターである。用語「作動的に結合された」はコーディング配列の発現に必要な調節配列が、コーディング配列の発現がなされるようコーディング配列に適切な相対位置内のＤＮＡ分子内に配置されたことを意味する。これと同様の定義が、コーディング配列の配置及び発現ベクター内の転写制御要素（例えばプロモーター、エンハンサー、及び終止要素）に時おり適用される。この定義はまた、ハイブリッド核酸分子が生じる第一及び第二核酸分子の核酸配列の配置においても時おり適用される。
【００２３】
用語「実質的に純粋な」は、少なくとも５０〜６０重量％の対象化合物（例えば核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質など）からなる標本に関するものである。標本は、より好適には少なくとも７５重量％、最も好適には、９０〜９９重量％の対象化合物からなる。純度は対象化合物によって適切な方法（例えば、クロマトグラフィー法、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動法、ＨＰＬＣ分析など）で測定される。
【００２４】
特定のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に関する場合の「本質的に…からなる」は、与えられた配列ＩＤ番号の性質を有する配列を意味する。例えば、アミノ酸配列を参照する場合、この用語は、配列の基本的な及び新規な特徴に作用しない配列自体及び分子の修飾を含む。
【００２５】
本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、本発明のプライマー及びプローブに関するものであり、及び、二つまたはそれ以上、好適には三つ以上のリボ−またはデオキシリボヌクレオチドからなる核酸分子として定義される。オリゴヌクレオチドの正確な大きさは様々な要因及びオリゴヌクレオチドが使用されるそれぞれの適用に依存する。
【００２６】
本明細書で使用される用語「プローブ」は制限酵素消化による精製として自然発生するものであろうと、合成であろうと、アニーリングまたはプローブと相補的な配列と核酸分子に特異的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸、ＲＮＡまたはＤＮＡに関するものである。プローブは単一らせん構造または二重らせん構造どちらもとりうる。プローブの正確な長さは温度、プローブのソース、使用方法を含む様々な要因に依存する。例えば、診断に適用する場合では、標的配列の複雑さに依存し、典型的なオリゴヌクレオチドプローブは、１５〜２５またはそれ以上のヌクレオチドを含むが、それよりも少ないヌクレオチドを含むこともある。
【００２７】
本明細書でのプローブは特定の標的核酸配列の異なるらせん構造と「実質的に」相補的となるよう選択される。これは、事前に定められた条件下でそれぞれの標的らせん構造と「特異的にハイブリダイズ」またはアニールをするためには、プローブが十分に相補的でなければならないということを意味する。例えば、非相補的なヌクレオチドフラグメントは、標的らせん構造と相補的であるプローブ配列の残渣によって、プローブの５’末端または３’末端に付着される。あるいは、プローブ配列が、それと共に特異的にアニールする標的核酸の配列と十分に相補的である条件下で、非相補的塩基または長い配列はプローブ内に組み入れられることができる。用語「特異的にハイブリダイズする」は、当業者において通常使用される事前に定められた条件下でハイブリダイゼーションが可能となるよう十分に相補的な（時おり「実質的に相補的な」と称される）配列の二つの一本鎖核酸分子間のつながりに関するものである。特に、この用語は、本発明の一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子内に含まれる実質的に相補的な配列によるオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに関するものであり、非相補的配列の一本鎖核酸によるオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの実質的な除去に関するものである。
【００２８】
本明細書で使用される用語「プライマー」は、生体システムからの誘導、制限酵素消化による生成であろうと、合成であろうと、適切な条件下に置かれた際に核酸合成依存テンプレートの起始因子として機能的に作用できる一本鎖または二本鎖、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡまたはＤＮＡに関するものである。適当な核酸テンプレート、核酸の適当なヌクレオシド三リン酸、ポリメラーゼ酵素、適当な補因子及び、適当な温度及びｐＨなどのような条件と提供されると、ポリメラーゼの作用またはプライマーの延長生成を増やす同様の活性により、ヌクレオチドが付加され、プライマーは３１末端に延長されることもある。
【００２９】
プライマーは、特定の条件及び適用の求めによって、様々な長さとなることがある。例えば、診断における適用では、オリゴヌクレオチドプライマーは典型的には１５〜２５またはそれ以上のヌクレオチド長さとなる。プライマーは、目的とする延長生成の合成を刺激する所望のテンプレートと十分に相補的である必要があり、それが、ポリメラーゼまたは同様の酵素による合成の起始因子としての使用のために、適当な近位におけるプライマーの３’ヒドロキシル部分を提供する十分な方法において、目的とするらせん構造テンプレートとアニールすることを可能としている。それは、プライマー配列が目的とするテンプレートと正確に相補的であることを示すことは必要としない。例えば、非相補的ヌクレオチド配列は、他の相補的なプライマーの５’末端に付着されることもある。あるいは、非相補的な塩基は、オリゴヌクレオチドプライマー配列内に散在され、プライマー配列は延長生成物の合成のためにテンプレート−プライマー複合体を機能的に提供するらせん構造テンプレートの配列と十分に相補的となるよう提供される。
【００３０】
用語「同一比率」は、核酸またはアミノ酸配列の間での比較に関して本明細書で使用されている。核酸及びアミノ酸配列は、しばしば、核酸またはアミノ酸の配列を一列にし、それにより、二つの間の違いを明らかにするコンピュータープログラムを用いて比較される。本発明の目的のため、核酸配列の比較は、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ９．１によって実行され、これは、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎのｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐによって可能となった。便宜上、プログラムによって指定された初期パラメータ（ギャップクリエーションペナルティー＝１２、ギャップエクステンションペナルティー＝４）は、本明細書において使用するため、同一配列を比較するのに意図されている。あるいは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ワールドワイドウェブにおいてｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ ＭｏＩ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３〜４１０）によって提供された、初期パラメータとギャップ調整に使用するＢｌａｓｔｎ ２．０プログラムは、核酸配列及びアミノ酸配列間の同一及び類似性のレベルを測定するのに使用されることがある。
【００３１】
核酸分子、ポリペプチド及びそれらの誘導体をコードするＦＶの変異体の調製
核酸分子
ＦＶの変異型をコードする核酸分子または本発明のそれらの機能性誘導体は、組み換え型ＤＮＡ技術の方法を用いて調製されることがある。核酸配列情報の可用性は、種々の方法によって、本発明の単離された核酸分子の調節を可能とする。例えば、ＦＶの変異型をコードする核酸配列またはそれらの誘導体ポリペプチドは、当業者において既知である標準プロトコルを使用して適当な生体原料から分離されることがある。
【００３２】
本発明の核酸は、任意の便利なクローニングベクターにおけるＤＮＡとして維持されることがある。好適な実施形態においては、クローンは、適当なＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（カリフォルニア州、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のような、プラスミドクローニング／発現ベクター内で維持される。あるいは、核酸は、哺乳類の最奥での発現に適当なベクター内で維持されることもある。翻訳後修飾がＦＶの変異型またはそれらの機能性誘導体に影響を与える場合において、それは哺乳類の細胞に分子を発現するのに好適である。ＦＶ変異体または核酸分子をコードするそれらの誘導体は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ及び一本鎖または二本鎖であることがあるそれらのフラグメントを含む。従って、この発明は、本発明の核酸分子の少なくとも一つの配列とハイブリダイジングできる配列を有するオリゴヌクレオチド（センスまたはアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡのらせん構造）を提供する。このようなオリゴヌクレオチドは、ＦＶ発現の検出のためのプローブとして有用である。
【００３３】
タンパク質
ＦＶの変異体または本発明のそれらの誘導体ポリペプチドの全長は、既知の方法に従って、様々な方法で調製されることがある。タンパク質は、例えば、ＦＶの活性型を発現する、形質転換された細菌または動物の培養された細胞または組織などの適当な材料から、免疫親和性精製によって生成されることがある。しかしながら、これは、時を選ばず与えられた細胞に存在する可能性のあるタンパク質の低分子量のために好適な方法ではない。ＦＶの変異型またはそれらの誘導体ポリペプチドをコードする核酸分子の可用性は、当業者に既知の方法で体外での発現に使用されるＦＶの変異型またはそれらの誘導体の生成を可能にする。例えば、ｃＤＮＡまたは遺伝子は、体外転写のためのｐＳＰ６４またはｐＳＰ６５のような適当な体外転写ベクター内でクローンされ、続いて、小麦胚芽またはウサギ網状赤血球溶血液のような適当な無細胞翻訳系で無細胞翻訳される。体外での転写及び翻訳システムは、例えばウィスコンシン州ＭａｄｉｓｏｎのＰｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈまたはメリーランド州ＲｏｃｋｖｉｌｌｅのＢＲＬによって市販されている。
【００３４】
あるいは、好適な実施形態によれば、ＦＶの変異型またはそれらの誘導体の多くの量は、適当な原核生物または真核生物発現系においての発現により生成されることがある。例えば、ＦＶの変異型をコードするＤＮＡ分子の一部または全部は、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌性細胞または、ＣＨＯまたはＨｅｌａ細胞のような哺乳類の細胞内での発現に適合したプラスミドベクター内に挿入されることがある。あるいは、好適な実施形態において、ＦＶの変異体またはそれらの誘導体からなる標識された溶融タンパク質が生成されうる。ＦＶ分子またはそれらの誘導体のような標識された溶融タンパク質は、ＤＮＡ分子の一部または全部によってコードされ、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌性細胞または、これに限定されるわけではないが、酵母または哺乳類の細胞のような真核細胞における発現に適合したプラスミドベクター内に挿入された目的とするポリペプチド標識の一部または全部をコードするヌクレオチド配列にリーディングフレームする正確なコドン内で連結反応される。上述されたようなベクターは、宿主細胞内にＤＮＡの発現を可能とするような方法で配置された宿主細胞内でのＤＮＡの発現に必要な調節要素からなる。このような調節要素は、これに限定されるわけではないが、プロモーター配列、転写起始因子配列及びエンハンサー配列を発現に必要とする。
【００３５】
ヘビ毒由来ＦＶ変異体またはそれらの誘導体タンパク質は、当業者において既知の方法に従って、組換え型原核生物または真核生物系においての遺伝子発現によって生成される。好適な実施形態において、市販されている発現／分泌系が、容易に周囲媒質から精製するのに用いられることがある。市販されている発現／分泌系により、組換え型タンパク質が発現され、その後、宿主細胞から分泌される。発現／分泌ベクターが使用されない場合、代替手法は、組換え型タンパク質と特異的に結合する抗体との免疫親和性相互作用のようなアフィニティー分離による組換え型タンパク質の精製またはＮ末端またはＣ末端で６−８ヒスチジン残基により標識された組換え型タンパク質のニッケルカラムによる分離を
含む。代替標識は、ＦＬＡＧエピトープ、ＧＳＴまたは赤血球凝集素エピトープからなることがある。このような方法は当業者によって通常使用されている。
【００３６】
ＦＶまたはそれらの誘導体タンパク質は、上述のような方法で調製され、標準プロトコルによって分析されることがある。例えば、このようなタンパク質は、既知の方法によってアミノ酸配列分析を受けることがある。
【００３７】
上述したように、本発明によるポリペプチドを生成する便利な方法は、発現系において核酸を使用することで、それをコードする核酸を発現させることである。本発明の方法において有用である様々な発現系は、当業者にとって既知である。
【００３８】
したがって、本発明は（開示された）ポリペプチドをつくる方法、ポリペプチド（一般的に核酸）をコードする核酸からの発現を含む方法も含む。これは、ポリペプチドの生成を生じるまたは可能にする適当な条件下で、ベクターを含む宿主細胞を培養することで簡便に達成されることがある。ポリペプチドは網状赤血球溶血液のような体外系において生成されることもある。
【００３９】
核酸及びタンパク質またはそれらの誘導体をコードするＦＶの使用
ＦＶポリペプチドまたはそれらの誘導体または血液凝固活性変化を有するのと同一のものをコードする核酸は、例えば、血液凝固カスケードを調整する治療及び／または予防薬剤として、本発明にしたがって使用されることがある。本発明はこれらの分子が凝固を増加するよう変化し得ることを明らかにした。
【００４０】
本発明の好適な実施形態においては、ＦＶまたはそれらの誘導体は、生物学的に適合した担体の点滴を介して、好適には、静脈注射を介して患者に投与されることがある。本発明のＦＶまたはそれらの誘導体は、任意に、リポソーム内にカプセル化され、または、分子の安定性を増加する他のリン脂質またはミセルと混合される。ＦＶまたはそれらの誘導体は、単独で、または止血を調整するとして既知の他の薬剤と組み合わせて投与されることがある（例えば、ＶＩＩａ、ＦＩＸ、ＦＶＩＩＩまたはＦＸ／Ｘａ因子及びそれらの誘導体）。ＦＶまたはそれらの誘導体を提供するのに適当な化合物は、これに限定されることはないが、患者の状態及び血行状態を含む生理学的に様々なことを考慮した上で、医師によって決定される。異なる適用及び投与経路にふさわしい様々な組成物が当業者に知られており、明細書の以下に記載されている。生成されたＦＶまたはそれらの誘導体を含む調製は、生理学的に許容される材料を含み、医薬品として好適に処方される。調製は、既知の先行技術の方法を実質的に使用することで定式化され得るものであり、塩化ナトリウム、塩化カルシウムのような塩とグリシン及び／またはリシンのようなアミノ酸を含むバッファーと、ｐＨ範囲６〜８で混合され得る。
【００４１】
必要となるまで、第五因子またはその誘導体を含む精製された調製液は、完成した溶液または凍結乾燥した状態または冷凍状態で保管される。好適には、調製液は凍結乾燥した状態で貯蔵され、及び、適切な再構成溶液を使用して視覚的に透明な溶液に溶解する。あるいは、本発明による調製は、調製液または凍った液体として作られることも可能である。
【００４２】
本発明による調製液は、特に安定的であり、例えば、適用の前に長時間溶解した形態で有効である。本発明による調製液は、一つの成分の調製液またはマルチ成分の調製液における他の要因との組み合わせの形態で、ＦＶまたはそれらの誘導体と薬剤的調製液として手に入れられる。
【００４３】
薬剤的調製液内で精製されたタンパク質を処理するのに先行して、精製されたタンパク質は従来の品質管理により管理され、及び、提示の治療形態内に形作られる。特に、精製された調製液は、組み換え製造の間、発現ベクター由来の核酸と同様に細胞核酸の非存在下でテストされ、好適には、ＥＰ０７１４９８７に記載されたような方法が用いられる。
【００４４】
この発明の他の特徴は、高い安定性及び構造的及び構造的完全性を有し、及び、特に不活性因子Ｖ／Ｖａ類似中間体及びタンパク質自動分解生成物を含まず、及び、前記タイプの第五因子類似体の活性化により、及び、適当な調製液内で調剤されることによりつくられるＦＶまたはそれらの誘導体を含む調製液の製造を可能にすることに関するものである。薬剤的調製液は、１０〜１０００μｇ／ｋｇの間、好適には１０〜２５０μｇ／ｋｇの間の投薬量であり、最適には１０〜７５μｇ／ｋｇの間の投薬量と、好適には４０μｇ／ｋｇの変異体第五因子ポリペプチドである。患者は血液診療所で、提示があればすぐに治療を受けることができる。または、患者は１〜３時間毎にボーラス投与され、または、十分に改善がみられる場合には、一日一回のＦＶまたは明細書に記載されたそれらの誘導体の投与となる。
【００４５】
ヘビから得られた核酸をコーディングするＦＶまたはそれらの誘導体は、本発明に従って様々な目的で使用されることがある。本発明の好適な実施形態において、血液凝固を調節するための核酸運搬媒体（例えば発現ベクター）は、ＦＶまたはそれらの誘導体ポリペプチド、または本明細書に記載されたそれらの機能的フラグメントをコーディングする核酸配列からなる発現ベクターなどが提供される。発現ベクターをコードするＦＶまたはそれらの誘導体の患者への投与は、凝固を強化するのに役立つＦＶまたはそれらの誘導体ポリペプチドの発現を生じる。本発明に従って、核酸配列をコードするＦＶまたはそれらの誘導体は、本明細書に記載されたように、その発現が止血を調節するＦＶまたはそれらの誘導体をコードすることがある。
【００４６】
ＦＶまたはそれらの誘導体核酸配列からなる発現ベクターは、単独で投与されることも、または止血を調整するのに有用な他の分子と組み合わせて投与されることもある。本発明に関連して、発現ベクターまたは治療薬の組み合わせは、患者に、単独で、または薬剤的に許容な化合物で、または生物学的に親和性のある化合物で投与されることもある。
【００４７】
本発明の好適な実施形態においては、ＦＶまたはそれらの誘導体をコードする核酸配列からなる発現ベクターは、ウイルスベクターである。本発明で使用されるウイルスベクターは、これに限られるわけではないが、アデノウイルスベクター（特定プロモーター／エンハンサー組織を伴うまたは伴わない）、複数の血清型（例えば、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−７及びＡＡＶ−８）のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター及びハイブリッドＡＡＶベクター、レンチウイルスベクター及び擬似レンチウイルスベクター（例えば、エボラウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、及び猫免疫不全ウイルス（ＦＩＶ））、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター及びレトロウイルスベクターを含む。
【００４８】
本発明の最適な実施形態では、核酸配列ＦＶまたはそれらの誘導体、またはそれらの機能的フラグメントからなるウイルスベクターを投与する方法が提供されている。本発明の方法における実用的なアデノウイルスベクターは、好適には、アデノウイルスベクターＤＮＡの少なくとも主要な部分を含む。明細書に記載されているように、このようなアデノウイルスベクターの投与に続いて、ＦＶまたはそれらの誘導体ポリペプチドは止血を調節するのに役立つ。
【００４９】
組換え型アデノウイルスベクターは、多様な遺伝子治療適用において幅広い実用性を有する。そのような適用におけるそれらの有用性は、様々な臓器の状況で行われる体内での遺伝子転移の高効率によるところが大きい。
【００５０】
アデノウイルス粒子は、適切な遺伝子運搬のための媒体として生かされることがある。このようなウイルス粒子は、二本鎖ＤＮＡ非エンベロープウイルスに関連する構造的特徴及びヒト呼吸系及び消化器官系指向性のような生物学的特徴を含む、これらの適用にとって望ましい特徴を複数有する。さらに、アデノウイルスは、受容体を介した飲食作用により、生体内及び生体外の様々な細胞に影響を与えることが知られている。アデノウイルスベクターの全体的な安全性の証明、アデノウイルスの感染は、軽度のインフルエンザ様症状を含む、ヒトにおける軽度な疾患を引き起こす。
【００５１】
その大きなサイズに起因して（〜３６キロ塩基）、アデノウイルス遺伝子は遺伝子治療媒体として用いられるのに適している。アデノウイルスは、複製において極めて重要なアデノウイルス遺伝子及び非必須領域の除去後、外来ＤＮＡの挿入に適応するからである。このような置換は複製機能及び感染に関して正常に機能しないウイルスベクターを提供する。注目すべきは、アデノウイルスは、遺伝子治療のため及び異常遺伝子の発現のためのベクターとして用いられることである。
【００５２】
遺伝子治療で用いられるアデノウイルスベクターの使用についてのさらに詳細な議論は、Ｂｅｒｋｎｅｒ，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６−６２９及びＴｒａｐｎｅｌｌ，１９９３，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ １２： １８５〜１９９を参照のこと。
【００５３】
例えば、目的とする遺伝子の複数コピー及びそれによる多量の目的遺伝子の生成物を提供できるベクターを導入することが望ましい。アデノウイルスベクターの改良及びこれらのベクターを生成する方法は、Ｍｉｔａｎｉ ａｎｄ Ｋｕｂｏ（２００２，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２（２）：１３５〜４４）；Ｏｌｍｓｔｅｄ−Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００２，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３（１１）：１３３７〜４７）；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ．（２００１，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９（９）：８３８〜４２）；米国特許番号５，９９８，２０５（多重ＤＮＡコピーからなる腫瘍特異的複製ベクターが提供されている）；６，２２８，６４６（ヘルパーアデノウイルスなし、アデノウイルスベクター完全欠損が記載されている）； ６，０９３，６９９（遺伝子治療のためのベクター及び方法が提供されている）；６，１００，２４２（複製欠損アデノウイルスベクターに挿入された導入遺伝子が、生体内で末梢血管疾患及び心疾患の遺伝子治療において有効に用いられることが記載されている）；及び国際特許出願番号ＷＯ ９４／１７８１０及びＷＯ ９４／２３７４４を含む参考文献、特許及び特許出願に詳しく記載されている。
【００５４】
出願によっては、さらに、発現構成は、特に細胞または組織タイプでの発現を促進するのに役立つ調節要素からなる。このような調節要素は、当業者において既知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９９２）において深く論じられている。本発明の発現構成における組織特定調節要素の取り込みは、ＦＶまたはそれらの発現またはそれらの機能的フラグメント発現のための少なくとも部分的な組織指向性を提供する。例えば、サイトメガロ・ウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下で、ＦＶまたはそれらの誘導体をコードする核酸配列からなるＥ１欠損タイプ５アデノウイルスベクターは本発明の方法において生かされることがある。
【００５５】
アデノウイルスベクターを生成するための典型的な方法
組み換え遺伝子発現のためのアデノウイルスベクターは、ヒト胚性腎細胞株２９３において生成される（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９７７，Ｊ，Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．３６：５９〜７２）。この細胞株は、Ｅ１機能不全において、アデノウイルス２（Ａｄ２）及びアデノウイルス５突然変異体の成長を許容する。なぜなら、この細胞株は、アデノウイルス５遺伝子の左末端からなり、従ってＥ１タンパク質を発現するからである。２９３細胞の細胞遺伝子内に導入されたＥ１遺伝子は、除去された遺伝子からウイルスベクターを増幅する発現系としてこれらの細胞の使用を容易にするレベルで発現される。２９３細胞は、独立したクローニングを助け、アデノウイルスベクターを発現するため、Ｅ１突然変異体の分離及び増殖に広範囲にわたって使用される。従って、２９３細胞株のような発現系は、トランスにおいて不可欠なウイルス機能を提供し、それによって、Ｅ１遺伝子に置換された外因性核酸配列において、ウイルスベクターの増殖が可能となる。Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｔｈｅ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎ（１９８４），ｐ．１２５〜１７２を参照のこと。
【００５６】
アデノウイルスベクターの増殖に向いている他の発現系は、当業者において既知であり（例えば、ＨｅＬａ細胞）、及び、他の場でも再検討されている。また、本発明には、ＦＶまたはそれらの誘導体ポリペプチドをコードする核酸運搬媒体と個々の細胞を提供すること、及び、ＦＶまたはそれらの誘導体ポリペプチドが発現する条件下で細胞を培養することからなる止血を調節する方法も含まれる。
【００５７】
前述の議論より、ＦＶ変異体またはそれらの誘導体ポリペプチドまたは同一のものをコードする核酸は、異常血液凝固に関連する疾患の治療において用いられることがわかる。
【００５８】
医薬組成物
本発明の発現ベクターは、生理活性タンパク質（例えば、ＦＶまたはそれらの誘導体ポリペプチドまたは機能的フラグメントまたはそれらの誘導体）が生成できるように、対象に運搬される薬剤的化合物内に組み込まれる。本発明の特定の実施形態では、受容体がＦＶまたはそれらの誘導体ポリペプチドの治療的に有効な量を生成できるよう十分な遺伝子材料からなる薬学的化合物は、対象において止血作用を与えることができる。または、前述したように、変異体第五因子ポリペプチドの有効量は、それらを必要とする患者に直接的に注入される。化合物は、単独で投与、または、安定化化合物のような他の薬剤少なくとも一つと組み合わせて投与され、これに限定されるわけではないが、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース及び水を含む、生体適合性のある薬剤担体に滅菌下で投与されることもある。化合物は、単独で、または、止血に作用する他の薬剤と組み合わせて患者に投与されることもある。好適な実施形態では、薬剤的化合物も薬剤的に許容な賦形剤を含む。このような賦形剤は、化合物を受容する個体に有害な免疫応答をそれ自体で導くことのない任意の薬剤を含み、及び、過度な毒性なしで投与することが可能である。薬学的に許容される賦形剤は、これに限定されるわけではないが、水、生理食塩水、グリセロール、糖類及びエタノールのような液体が含まれる。薬学的に許容される塩には、例えば、塩酸塩、臭化水素塩、リン酸塩、硫酸塩などのような鉱酸塩、及び、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などのような有機酸塩が含まれる。加えて、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤などのような補助剤が、このような賦形剤において存在することがある。薬学的に許容される賦形剤に関する詳細な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ． Ｃｏ．， １８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．［１９９０］）．で入手することができる。
【００５９】
非経口投与に適した薬剤の剤形は、水溶液、好適には、ハンクス溶液、リンガー溶液または生理緩衝食塩水のような生理的に適合性のある緩衝液内で調剤される。水性懸濁注射液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランのような懸濁液の粘性を増加させるような基質を含むことがある。適当な親油性溶媒または媒体は、ゴマ油のような脂肪酸油、または、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドまたはリポソームのような合成脂肪酸エステルを含む。随意に、懸濁液は、高濃度溶液の調製を可能にするため、化合物の溶解度を増加させる適当な安定剤または薬剤も含むことがある。局所または経鼻投与の場合、浸透されるべき特定の障壁に対して適切な浸透剤が製剤に使用されている。このような浸透剤は一般的に当業者において知られている。本発明の薬剤的化合物は当業者において既知の任意の方法（従来の混合、溶解、整粒、糖衣製造、ゲル化、乳化、カプセル化、封入、凍結乾燥処理など）で製造されている。
【００６０】
薬剤的化合物は塩として提供されることがあり、また、これに限定されるわけではないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などの多くの酸と作られることがある。塩は、遊離塩基に対応する溶液よりも水または他のプロトン性溶媒に溶解しやすい傾向にある。他の場合では、好適な調製液は、４．５〜５．５のｐＨ範囲で、１〜５０μＭのヒスチジン、１〜２％のスクロース、及び２〜７％のマンニトールの任意または全てを含む凍結乾燥粉末であることがある。この凍結乾燥粉末は使用前にバッファーに結合される。
【００６１】
薬剤的化合物が調製された後、それらは適切な容器に入れられ、治療のために標識される。ベクターを含むＦＶまたはそれらの誘導体の投与のために、前述の標識には投与の量やしばしば方法が含まれることもある。
【００６２】
本発明の使用に適当な医薬組成物は、活性成分が治療目的を達成するための有効量含まれている化合物を含む。治療に有効な投与量の決定は、本発明において提供される技術を使用する熟練した医療従事者の能力の範囲内で行われる。治療における投与量は、他の要因のなかでも、年齢、対象における一般的条件、異常血液凝固表現型の重症度、ＦＶまたはそれらの誘導体ポリペプチドの発現レベルを調節する制御配列の強さに依存する。したがって、ヒトにおける治療の有効量は、ベクター基本形または、ＦＶまたはそれらの誘導体に感染したタンパク質への個々の患者の応答に基づいて医療従事者により決定される比較的広い範囲に分類される。
【００６３】
投与
ＦＶポリペプチドの活性型変異体は、単独または他の薬剤と組み合わせて、本明細書において上述したように、適切な生理的担体において患者に直接的に注入されることもある。ＦＶまたはそれらの誘導体、またはそれらの機能的フラグメントをコードする核酸配列からなる本発明の発現ベクターは、ＦＶまたはそれらの誘導体ポリペプチドの活性型の予防的及び／または治療的に有効なレベルを達成する及び維持するため（以下、参照の）様々な方法により患者に投与されることもある。当業者は、特定の患者の治療のための本発明の発現ベクターをコードするＦＶまたはそれらの誘導体の活性型を使用するための特定の手順をすぐに見つけることができる。アデノウイルスベクターの生成及び患者への投与のための手順は、米国特許番号５，９９８，２０５、６，２２８，６４６、６，０９３，６９９、６，１００，２４２、及び国際特許出願番号ＷＯ９４／１７８１０及びＷＯ９４／２３７４４において記載され、これらはその全体において参照により本明細書に組み込まれている。本発明のアデノウイルスベクターをコードするＦＶまたはそれらの誘導体の活性型は、任意の既知の方法により投与されることがある。生体内への薬剤的化合物の直接的な運搬は、運搬を強化された対流のような運搬方法が予想されるにもかかわらず、一般的に、従来の注射器を利用する注射により達成される（例えば米国特許番号５，７２０，７２０を参照）。この方法で化合物は、皮下、表皮、皮内、髄腔内、眼窩内、粘膜内、腹腔内、静脈内、動脈内、口腔内、肝内または筋肉内に運ばれることがある。投与の他の方法には、経口投与及び経肺投与、坐薬、及び、経皮投与が含まれる。血液凝固疾患患者の治療の臨床専門医は、これに限定されるわけではないが、患者の状態及び治療の目的（例えば血液凝固の促進）を含む基準数に基づいて、活性型ＦＶまたはそれらの誘導体核酸配列からなるアデノウイルスベクターの投与のために最適な経路を決定している。
【００６４】
また、本発明の組成物は、創傷または外傷において局所的な血液凝固を促すのに使用されることもある。このアプローチでは、本発明の第五因子は局所的に適用するために製剤され、及び、戦場において、または、出血を止めなければならない、または、出血を止めることが重要とされる状況下において使用される。
【００６５】
本発明は、活性型ＦＶまたはそれらのポリペプチド誘導体をコードする核酸配列からなるＡＡＶベクターも含む。
【００６６】
活性型ＦＶまたはそれらのポリペプチド誘導体をコードする核酸配列からなるレンチウイルスまたは疑似レンチウイルスベクターも含まれる。
【００６７】
活性型ＦＶまたはそれらのポリペプチド誘導体をエンコンディーングする核酸配列からなる裸プラスミドまたは発現ベクターも含まれる。
【００６８】
以下に示す材料及び方法は、以下の実施例の実行を容易にするために提供されたものである。
【００６９】
試薬
ベンズアミジン及び４−アミジノフェニルフッ化メタンスルフォニル塩酸塩（ＡＰＭＳＦ）はＳｉｇｍａ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）のものであり、及び、ダンシルアルギニン−Ｎ−（３−エチル−１，５−ペンタンジイル）アミド（ＤＡＰＡ）は、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（バーモント州、Ｅｓｓｅｘ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ）のものである。ペプチジル基質Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ピペコリル−Ｌ−アルギニル−ｐ―ニトロアニリド（Ｓ２２３８）はＤｉａｐｈａｒｍａ社のものである。全ての組織培養試薬は、インスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム（ＩＴＳ；インディアナ州、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を除いて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州、Ｃａｒｌｓｂａｄ）のものである。鶏卵Ｌ−α−ホスファチジルコリン７５％（ｗ／ｗ）とブタ脳Ｌ−α−ホスファチジルセリン２５％（ｗ／ｗ）からなるラメラリン脂質小胞体（ＰＣＰＳ）（アラバマ州、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄｓ）は記載されたように調製され、及び、特徴付けられている。
【００７０】
タンパク質
ヒトプロトロンビンは先述したように血漿から分離される（２３）。プレトロンビン−１及びプレトロンビン２は確立されたやり方によって精製され（１８）、及び、トロンビンは、血液学的技術から得られる。ＦＶ（ｈＦＶ−８１０）、ｒＦＶａ、ｒＦＸ及びｒＦＸａの構成的活性部分Ｂ−ドメインレス型が調製され、（３、２４、２５）に記載したように精製され、特徴付けられる。ｐｓｅｕｔａｒｉｎＣ（ｐｔ−ＦＸａ）の精製された酵素サブユニットは、ＱＲｘＰｈａｒｍａ（オーストラリア、Ｓｙｄｎｅｙ）から豊富に提供される。組み換え型ヒルジンは、ＥＭＤ−Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（カリフォルニア州、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）から得られる。組み換え型ダニ抗凝固タンパク質及びヒトＡＰＣは、Ｄｒ． Ｓｒｉｒａｍ Ｋｒｉｓｈｎａｓｗａｍｙ（Ｔｈｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）より得られる。使用されている様々なたんぱく質の分子量及び吸光係数（Ｅ０．１％，２８０ｎｍ）は、プロトロンビンが７２，０００及び１．４７（１８）；プレトロンビン‐１が１ ４９，９００及び１．７８（１８）；プレトロンビン‐２が３７，５００及び１．９５（１８）；トロンビンが３７，５００及び１．９４ （２６）；ｒＦＸａが４６，０００及び１．１６（２７）；ｒＦＶａ，が１７５，０００及び１．７８（３）；ｒＦＶ−８１０が２１６，０００及び１．５４（３），及びｐｔ−ＦＶが１７０，０００，及び１．５０（本研究による）である。ｐｔ−ＦＸａにために、ヒトタンパク質のための値が使用されている。特別な記載がない限り、全ての機能的アッセイは、２０ｍＭヘペス、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化カルシウム、０．１％ポリエチレングリコール８０００、ｐＨ７．５（アッセイバッファー）において２５℃で行われる。
【００７１】
分析的超遠心分離：
分子量は、光学干渉を用いた分析的超遠心分離機Ｂｅｃｋｍａｎ Ｏｐｔｉｍａ ＸＬ−Ｉで測定される。沈降速度は２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ７．４、ＡＮ６０Ｔｉローターによる毎分２５，０００回転で測定される。タンパク質濃度は、ｐｔ−ｒＦＶが０．６０ｍｇ／ｍＬ（３．６μＭ）及びｐｔ−ＦＸａが０．１８ｍｇ／ｍＬ（３．９μＭ）である。沈降係数及び分子量はｇ（ｓ＊）分析により測定される。減衰係数は、Ｂａｂｕｌ ａｎｄ Ｓｔｅｌｌｗａｇｅｎ（２９）に記載された手順による示差屈折率測定により測定される。
【００７２】
ｒＦＶ変異体の構造
毒腺由来のコブラ・モドキ（Ｐ．ｔｅｘｔｉｌｉｓ）ＦＶ ｃＤＮＡ（８）は、隣接ＸｍａＩ制限酵素認識部位により修飾され、それにより、ｐＥＤ発現プラスミド内にサブクローニングされる（３）。ｃＤＮＡは、さらに、コブラ・モドキ（Ｐ．ｔｅｘｔｉｌｉｓ）ＦＶの信号配列及び重複によるスプライシングの技術を使用するヒトＦＶの信号配列をコードする配列を交換することにより修飾される（３０）。最終的な構成、ｐＥＤ−ＦＶ−ｐｔｅｘ、その後に成熟ベノム由来ｐｔ−ＦＶタンパク質（残渣１から１４３０）が続くヒトＦＶ信号ペプチド（残渣−２８から１）のためにコードされる。
Ｒａｏ ｅｔ ａｌによりレポートされるのと同一の配列を示すコブラ・モドキ（Ｐ．ｔｅｘｔｉｌｉｓ）ＦＶ ｃＤＮＡ（７）は、コドン５０（Ｌｙｓ）及び１３０５（Ｐｈｅ）を除いて、コースタルタイパン（Ｏ．ｓｃｕｔｅｌｌａｔｕｓ）及びタイパン（Ｏ． ｍｉｃｒｏｌｅｐｉｄｏｔｕｓ）の相応する残渣と同一である（８）。Ｇｌｎにより置換されたＡｒｇ７４２及びＡｒｇ７８８を有するｐｔ−ＦＶ変異体は、適当な突然変異誘発性相補的オリゴヌクレオチドを使用するＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位に誘導された突然変異生成キット（カリフォルニア州、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により発生した。これらのアミノ酸は、ヒトＦＶにおいてアルギニン（Ａｒｇ）７０９及びアルギニン（Ａｒｇ）１５４５に相同であり、及び、トロンビン開裂部位を示す。突然変異生成に続いて、ｃＤＮＡ全体は、目的とする突然変異の存在を確認するため、及び、誤って誘導されたポリメラーゼがないことを確かめるために配列される。
【００７３】
ｐｔ−ｒＦＶの発現及び精製：
ＦＶまたはＦＶ−ＱＱ を含むプラスミドは、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞内に誘導され、及び、高生産安定クローンは、（３）に記載されたように確立される。細胞は三角フラスコ内に広がり、ＩＴＳ及び２．５ｍＭの塩化カルシウムを追加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２媒体内で培養される。調製済みの媒体は、４〜６日間かけて収集され、延伸ぶりされ、及び１０μＭ ＡＰＭＳＦ及び１ｍＭベンズアミジンの存在下において２０℃で保存される。精製のために、媒体は３７℃で融解され、２０ｍＭへペス、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カルシウム、ｐＨ７．４で平衡を保たれた３０ｍＬＱ−セファロースカラム（ニュージャージー州、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に装填される。カラムは同じバッファーで洗浄され、塩化ナトリウム０．１５〜１Ｍの濃度勾配で溶出される。画分は、収集され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び（３）記載のＦＶ特定凝固アッセイにより分析される。ｐｔ−ｒＦＶを含む画分は、貯蔵され、及び２０ｍＭのＭＥＳ、２ｍＭ塩化カルシウム、ｐＨ６．０に対して透析され、及び同一のバッファーで平衡を保たれたＰｏｒｏｓ ＨＳ／２０カラム（１０×１００ｍｍ；カリフォルニア州、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に装填される。カラムは２０ｍＭのＭＥＳ、２ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０で洗浄され、及び、塩化ナトリウム０〜０．６Ｍ濃度勾配で溶出される。画分を含むＦＶは貯蔵され、及び、２０ｍＭへペス、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化カルシウム、ｐＨ７．４に対して透析され、及び、タンパク質は−８０℃で保存される。最終収率は、調製済みの媒体１リットルあたりのｐｔ−ｒＦＶに対して〜４ｍｇである。
【００７４】
タンパク質の特徴：
純正タンパク質は、クマシー ブリリアント ブルーＲ−２５０による染色に続くＭＯＰＳバッファーシステムを用いる非還元及び還元条件（５０ｍＭジチオスレイトール）下で、プレキャスト４〜１２％勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価される。Ｎ末端配列分析は、ガルベストンのＴｅｘａｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｒａｎｃｈ大学のＤｒ．Ａｌｅｘ Ｋｕｒｏｓｋｙ及びＳｔｅｖｅ Ｓｍｉｔｈ、またはＣｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ジョージア州、Ａｔｌａｎｔａ）のＤｒ．Ｊａｎ Ｐｏｈｌの研究室で行われる。ｐｔ−ＦＸａにおける化学的γ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）分析は記載した研究室で行われる（２４）。
【００７５】
タンパク質基質開裂の反応速度論：
高分子基質開裂の定常状態における初期速度は、記載されているように、２５℃で不連続に決定される（２５）。プロトロンビナーゼまたはＦＸａ−ＦＶａに触媒作用されたプロトロンビンまたはプレトロンビン−１活性型（Ｋｍ及びＶｍａｘ）の速度パラメータは、高分子基質の濃度を上昇させることでトロンビン構造の初期割合を測定することにより、アッセイバッファーにおいて決定される。アッセイ混合物は、ＰＣＰＳ（５０μＭ）、ＤＡＰＡ（３μＭ）、様々なｐｔ−ｒＦＶ（ａ）補因子種（２０ｎＭ）及び様々な濃度のプロトロンビン（０〜５．０μＭ）またはプレトロンビン−１（０〜１５μＭ）が含まれる。プレトロンビン−２がタンパク質基質として使用されると、それに続く反応条件は、ＰＣＰＳ（５０μＭ）、ＤＡＰＡ（３μＭ）、及びプレトロンビン−２（１．４μＭ）が用いられ、様々なＦＶ（ａ）補因子（０〜４０ｎＭ）と保温培養され、及び、反応はｐｔ−ＦＸａ（５ｎＭ）により開始される。特定の実験においては、ＰＣＰＳは、反応混合物に含まれない（図の説明文を参照）。ｐｔ−ｒＦＶａが使用される実験においては、ｐｔ−ｒＦＶ（６００ｎＭ）は２ｎＭトロンビンと３７℃で１５分間保温培養され、続いて２．４ｎＭヒルジンが加えられる。
【００７６】
ｐｔ−ｒＦＶのＡＰＣ不活性：
ＰＣＰＳ（５０μＭ）存在下における様々な補因子タンパク質（５００ｎＭのｐｔ−ｒＦＶ，ｐｔ−ｒＦＶａ，ｒｈＦＶａ，またはｈ−ＦＶ−８１０）の不活性化は、ＡＰＣ添加（１０μＭまたは７５０ｎＭ）により開始される。反応混合物の一定分量は指定された時間間隔で取り出され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％ゲル）及び機能的活性の評価を通して評価される。このアッセイにおいて、残渣補因子活性は、特に（２５）に記載されたようなプロトロンビン活性におけるＦＶａの作用を測定することにより評価される。アッセイ混合物には、１．４μＭプロトロンビン、５０μＭのＰＣＰＳ、３μＭのＤＡＰＡ、１ｎＭのＦＶａ、及び１ｎＭのｐｔ−ＦＸａが含まれる。ｒｈＦＶａまたはｈＦＶ−８１０と、ヒトｒＦＸａは代わりに使用される。これらの条件下で、反応の初期割合は補因子の濃度と比例している。
【００７７】
データ分析：
データは、マーカード アルゴリズム（Ｍａｒｑｕａｒｄｔ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を使用する非線形最小二乗法による回帰分析から求められる参照式によって分析される（３１）。適合の質は、（３２）に記載の基準により評価した。エラーの報告された推定値は、±２ Ｓ.Ｄを示す。ｐｔ−ＦＸａ及びｐｔ−ｒＦＶ（ａ）間での相互作用における解離定数（Ｋｄ）は、プレトロンビン−２活性型の初期値の１に固定された化学量論と補因子の濃度への依存から得られる（３３）。プロトロンビナーゼによるプロトロンビンまたはプレトロンビン−１の開裂の初期速度測定は、Ｋｍ及びＶｍａｘの近似値を得るため、ヘンリー−ミカエリス−メンテン（Ｈｅｎｒｉ−Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ）の方程式（３４）にデータを適合させることで分析される。
【００７８】
以下に記載の実施例は、本発明の特定の実施形態を示すものとして提供される。これらはいかなる場合においても本発明を制限することを意図していない。
【実施例１】
【００７９】
ヒトの治療における使用のためのヘビ毒由来またはヒト型誘導体の第五因子
本発明はコブラ・モドキ（Ｐ．ｔｅｘｔｉｌｉｓ）からのヘビ毒由来ＦＶの生物学的特性を記述する。これらの固有な性質は、以下に列記するように、凝血原特性を反復するヒトＦＶ誘導体に設計されることもある。これらの性質とは、ａ）ｐｔ−ＦＶが活性状態で存在し、補因子が自然発生の活性ＦＶ変異体の第一実施例のようであること、ｂ）ｐｔ−ＦＶが、セリンプロテアーゼ因子Ｘａ（ＦＸａ）と高い親和性で結合するのを達成する膜表面のための通常要件を回避するような固有な形態を有すること、ｃ）重鎖及び軽鎖を結合するｐｔ−Ｆｖの固有のジスルフィド結合により、ｐｔ−ＦＶは、活性型タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）による不活性に機能的に抵抗すること、である。これらの特徴の一つまたはそれ以上からなるヒトＦＶ誘導体を操作することは、その凝血原特性を強化し、したがって、出血性疾患の治療において有用な治療的ツールを提供する。
【００８０】
本研究においては、非常に精製されたヘビ毒由来Ｆｘａ（ｐｔ−ＦＸａ）と同様に、コブラ・モドキ（Ｐ． ｔｅｘｔｉｌｉｓ）からの組換え型ヘビ毒由来ＦＶ（ｐｔ−ｒＦＶ）による一連の機能的測定値は、ＦＶの固有の形態の生物学的性質を調査し、ヘビ毒由来プロトロンビナーゼ複合体の強力な凝血性質における基本的メカニズムを調べるのに使用される。この働きは、ｐｔ−ｒＦＶが、哺乳類ＦＶにおいては起こることが未知である機能的要素の複数の利益を獲得することで、有力な凝血源に適応したことを証明している。この研究結果は、ＦＶの構造／機能関係の複数の態様に新しい光を投じ、治療的な目的のための生物学ＦＶを容易にし、さらに、選択的優位性のためのタンパク質の既存の特性を強化する性質の驚くべき能力を強調する。
【００８１】
結果
ｐｔ−ｒＦＶの発現及び物理的特徴
天然のヘビ毒の高いプロテアーゼ含有量のために、同種の単離、ｐｔ−ＦＶの未開裂調製は得られない（１２〜１５）。これを回避するために、ＢＨＫ細胞から精製されたｐｔ−ｒＦＶは高い収量で示された。野生型ｐｔ−ｒＦＶ及び重鎖及び軽鎖の側面に位置するトロンビン開裂部位が欠乏する変異体（ｐｔ−ｒＦＶ−ＱＱ）は、還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてシングルバンド（〜１８０ｋＤａ）として主に移行する（図１、パネルＡ）。沈降速度の研究は、ｐｔ−ｒＦＶが、１７０，０００の分子量評価により均一であることを示した。ｐｔ−ｒＦＶ−ＱＱがトロンビンにより開裂されないのに対し、ｐｔ−ｒＦＶはｐｔ−ｒＦＶａに処理され、特有の重鎖及び軽鎖を産出する。Ｎ−末端配列分析は、予測されたトロンビン開裂部位における的確な処理を明らかにした（図１）（７，８）。驚くべきことに、トロンビン処理の後に、ｐｔ−ｒＦＶａの大部分（>６０％）は、非還元条件下においてシングルバンドとして移動し（図１、パネルＢ）、重鎖及び軽鎖が、固有のジスルフィド結合により結合していることを示している。この可能性は、非還元条件下における二重項としてｐｔ−ｒＦＶ及びｐｔ−ｒＦＶ−ＱＱの移行を説明している。配列アラインメントは、重鎖に二つの遊離Ｃｙｓ残基（Ａ２ドメイン、５３９及び６４１）、軽鎖に一つの遊離Ｃｙｓ（Ａ３ドメイン、１０３２）を有するであろうことを示している（７）。
【００８２】
【表１】
【００８３】
コブラ・モドキ（Ｐ．ｔｅｘｔｉｌｉｓ）またはコースタルタイパン（Ｏ．ｓｃｕｔｅｌｌａｔｕｓ）の天然のヘビ毒から精製されたＦＶは、ウシＦＸａの存在下において低活性である（１４、１５）。ｐｔ−ｒＦＶを特徴付ける初期の試みは、これらの観察と矛盾しない。しかしながら、推定値は、ｐｔ−ｒＦＶまたはｐｔ−ｒＦＶａはヒトＦＶａと比較してほぼ＝１／４０ｔｈ活性を示す。低活性は、主にｐｔ−ｒＦＶまたはｐｔ−ｒＦＶａが、確立された経口結合測定値を使用する膜結合ヒトＦＸａ（Ｋｂ>４００ｎＭ）との親和性を減らすことで結合されることにより起因するようである（データは示されていない）（３）。したがって、ｐｔ−ｒＦＶを特徴付けるため、ｐｔ−ＦＸａが全てのそれに続く実験において使用された。ｐｔ−ＦＸａのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、予測される結果を与えたＮ末端配列分析とともに図１に示される。二重項としての軽鎖の外観は、不均一なＯ−グリコシル化に原因があるようだ（８、１６）。さらに、ｐｔ−ＦＸａの化学的Ｇｌａ分析は、配列アラインメントから予測される１１モル Ｇｌａ／ｍｏｌタンパク質から１０．９±０．３４モルＧｌａ／ｍｏｌタンパク質を産出した。
【００８４】
Ｐｔ−ｒＦＶは構成的に活性型補因子である
ｐｔ−ＦＶ Ｂドメインの変わった性質のため、一連の機能的測定は、ヘビ毒由来ＦＶのこのドメインが、プロコファクターとしてのタンパク質を維持するように機能するかどうか確定するために使用された。機能的な測定値に対する一つの懸案事項は、元の位置に生成されたトロンビンによるｐｔ−ｒＦＶのフィードバック・タンパク質分解である。これに適応するために、反応体の濃度はタンパク質分解を最小にするように選ばれ、及び、トロンビンの可逆性抑制剤（ＤＡＰＡ）がアッセイに含まれる。さらに、ｐｔ−ｒＦＶ−ＱＱ、トロンビンによって媒介されるタンパク質分解に抵抗する変異体（図１）が調製された。ヒトＦＶ（１）とは対照的に、膜結合ｐｔ−ＦＸａを有するｐｔ−ｒＦｖの組み立ては、プロトロンビンを急速に活性化させる（図２Ａ）。プロトロンビン転換のための定常状態速度定数は、ヒトプロトロンビナーゼにおいて観察される定常状態速度定数と著しく類似している。（表２）（３、１７）。興味深いことに、ヒトＦＶの誘導体で切断されたＢ−ドメイン、ｈＦＶ−８１０は、ｐｔ−ＦＶ−膜によって集まり、相当する速度パラメータを有するプロトロンビンを活性化することが可能であった（表２）。ｐｔ−ｒＦＶａを生成するまたは、未開裂変異体、ｐｔ−ｒＦＶ−ＱＱを使用するトロンビンによる短いＢ−ドメインの除去は、相当する速度定数を与える（図２Ａ及び表２）。これらのデータは、ヒトＦＶとは異なり、ｐｔ−ＦＶは、構成的に活性型補因子であり、及び、Ｂ−ドメインのタンパク質分解除去が凝血原活性を表すことを必要としないことを示す。これは、ＦＶの構成的活性型の自然な第一実施例を表す。
【００８５】
【表２】
【００８６】
アニオン性膜の非存在下でのＰｔ−ｒＦＶの機能
血液凝固の重要な観点は、凝固タンパク質を細胞表面に（ホスファチジルセリン曝露を介して）結合する膜が正常な止血のためには重要であるということである（２）。オスキュタリン（ｏｓｃｕｔａｒｉｎ）及びプスタリンＣ（ｐｓｅｕｔａｒｉｎ Ｃ）によりみられる変わった観察結果は、ヘビ毒由来ＦＸａ及びＦＶが複合体として同時精製し、陰イオン膜非存在下において、ある程度活性を示すことである。しかしながら、オスキュタリン（ｏｓｃｕｔａｒｉｎ）の活性は、膜存在下において、実質的に増加する（>４００−倍）ことが報告されている（１２〜１５）。さらにこれを調べるために、プロトロンビンを使用する溶液位相ｐｔ−ＦＸａ−ｐｔ−ｒＦＶの活性が評価された。膜非存在下において、ｐｔ−ｒＦＶ、ｐｔ−ｒＦＶ−ＱＱまたはｐｔ−ｒＦＶａを有するｐｔ−ＦＸａを使用するプロトロンビンの初期割合は、同じ酵素濃度で膜存在下において得られる割合と比較して７〜８倍低いものであった（図２Ｂ）。活性の減少は、プロトロンビンのＫｍ増加（〜４倍）及びｋｃａｔの減少（〜４倍）によって反映された。対照的に、膜非存在下において、ｈＦＶ−８１０は、膜結合補因子と比較して非常に低い活性を有した（>１５０倍）（図２Ｂ）。
【００８７】
これらのデータの解釈の困難は、基質、プレトロンビン、トロンビンの生成の割合を高めるのに貢献する結合膜にある。さらに、ｐｔ−ＦＸａ−ｐｔ−ｒＦＶのための溶液位相解離定数に応じて、ｐｔ−ＦＸａはｐｔ−ｒＦＶで飽和することができず、実際の酵素複合体の濃度を低下させ、プロトロンビン活性率の減少へと至った。一点目に取り組むために、膜の存在及び非存在下でのプレトロンビン−１活性の割合が測定される。プレトロンビン−１は、γ−カルボキシグルタミン酸及びクリングル−１ドメインと結合する膜を欠失するプロトロンビンの派生物である（１８）。プロトロンビンを使用している結果と整合して、ｐｔ−ｒＦＶ、ｐｔ−ｒＦＶ−ＱＱまたはｐｔ−ｒＦＶａを使用する膜結合ｐｔ−ＦＸａを有するプレトロンビン−１の反応速度は、等しいものであり（図３Ａ及び表２）及びヒトプロトロンビナーゼを使用する速度パラメータと同等であった（１７）。しかしながら、意外にも、反応混合物からの膜の除去は、溶液位相または膜結合ｐｔ−ＦＸａ−ｐｔ−ｒＦＶにおける運動パラメータが等しいため、プレトロンビン−１活性の割合において感知できるほどの効果は有さない（図３Ｂ及び表２）。これらのデータは、ｐｔ−ＦＸａ−ｐｔ−ｒＦＶを有するプロトロンビン活性割合の減少率が、酵素機能ではなく、むしろ結合している基質膜の除去にあったことを示唆している。
【００８８】
Ｐｔ−ＦＸａ及びｐｔ−ｒＦＶが形成する高親和性複合体
膜の存在または非存在におけるプレトロンビン−１活性の割合が同等になると、データは、ｐｔ−ＦＸａがｐｔ−ｒＦＶと完全に飽和されることを示す。しかしながら、これを直接評価するために、いずれの膜結合または溶液位相ｐｔ−ＦＸａ−ｐｔ−ｒＦＶにおける平衡解離定数を意味する機能的な結合測定が使用された。補因子（ｐｔ−ｒＦＶ、ｐｔ−ｒＦＶ−ＱＱ、ｐｔ−ｒＦＶａまたはｈＦＶ−８１０）の濃度の増加は、ＰＣＰＳの存在下または非存在下において、ｐｔ−ＦＸａの濃度を固定して、単一で培養された。プレトロンビン−２活性の初期割合は測定され、及び、データはｐｔ−ＦＸａと結合している補因子に推定された平衡解離定数を得るために分析された（表３）。ＰＣＰＳの存在下において、補因子の種類に関係なく、ｐｔ−ＦＸａと結合している解離定数はほぼ＝３ｎＭであった。この値は、膜結合ヒトＦＸａ及びＦＶａを使用して得られた解離定数と類似しているものである（３）。驚くべきことに、ｐｔ−ｒＦＶ、ｐｔ−ＦＶ−ＱＱまたはｐｔ−ｒＦＶａにおける解離定数は、膜非存在下において、わずか２〜３倍増加させた（Ｋｄほぼ＝８ｎＭ）。これは、ＦＸａ−ＦＶａにおける溶液位相解離定数がほぼ＝０．８〜３．０μＭである牛におけるシステムとは対照的である（１９、２０）。沈降速度実験では、溶液位相ｐｔ−ｒＦＶ−ｐｔ−ＦＸａが２１３，０００の分子量及び９．３３の沈降係数（ｓ２０，ｗ）と１：１で化学量論複合体を形成していた。これらの値はウシＦＸａ−Ｆｖａによって得られた結果と非常によく一致している（１９）。ヘビ毒由来補因子とは対照的に、溶液位相ｈＦＶ−８１０−ｐｔ−ＦＸａにおける結合定数（表３）は、確立することができず、ｐｔ−ＦＸａ結合が、少なくとも溶液において、ｈＦＶ−８１０に存在しないｐｔ−ｒＦＶにおいて固有な性質を含むことを示唆している。これらのデータは、ｐｔ−ＦＸａ−ｐｔ−ＦＶ複合体は、プロトロンビンを急速に活性化できる１：１複合体が高い親和性を形成するため、負に荷電された膜において通常必要とされるものを回避したことを示す。
【００８９】
【表３】
【００９０】
Ｐｔ−ｒＦＶはＡＰＣに機能的耐性がある
ＡＰＣは止血系及びタンパク質分解の制限を介してＦＶａ及びＦＶＩＩＩａの両方を不活性化する機能における重要な抗凝血剤である（２１）。ヒトＦＶａにとって、Ａｒｇ３０６、Ａｒｇ５０６及びＡｒｇ６７９での開裂は、Ａ２ドメインの解離において、ＦＸａ結合及び最終的には補因子機能の消失を生じる（１）。ｐｔ−ＦＶの配列分析は、これらの部位にＡＰＣ耐性がある可能性の示唆は保存されていない（７）。プスタリンＣの研究はこの論点を支持している（７）；しかしながら、ＦＸａは、データ解釈を複雑にするＡＰＣによる不活性からＦＶａを保護する（１）。ｐｔ−ｒＦＶがＡＰＣに対して耐性を示すかどうか直接調べるために、これらのタンパク質は、ＰＣＰＳ存在下において培養され、及び、様々な時間間隔で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び精製されたプロトロンビンアッセイを使用する補因子活性によって、タンパク質分解を観察した。結果的にｒｈＦＶａまたはｒＦＶ−８１０機能を完全に失ったＡＰＣ濃度（１０ｎＭ）及び反応時間（≦１５分）を使用して、ｐｔ−ｒＦｖまたはｐｔ−ｒＦＶａは完全に活性を保持し（図４Ａ）及び、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、これらのタンパク質の限定された開裂のみを示した（データは示されていない）。しかしながら、長時間における高濃度ＡＰＣ（７５０ｎＭ）とのｐｔ−ｒＦＶの培養は、結果として完全なタンパク質分解ｐｔ−ｒＦＶとなった（図４Ｂ、Ｃ）。Ｎ−末端配列分析と還元及び非還元ゲルの分析はともに、ＡＰＣがＡ２ドメインにおいてｐｔ−ｒＦＶを開裂することを示す。驚くべきことに、ｐｔ−ｒＦＶの完全なタンパク質分解にもかかわらず、補因子は、完全な凝血原活性を保持した（図４Ａに挿入）。
第五因子変異体をコードする核酸配列は図５において提供されている。
【００９１】
議論
多くの血液凝固タンパク質は、不活性な前駆体として合成され、及びその結果としてタンパク質分解活性があり、これらのタンパク質は、血管外傷（２）の場所に位置する細胞表面上に組み立てられる。本研究において、ｐｔ−ＦＶは、これらのパラダイムを、ＦＸａ及び活性型プロトロンビンを結集させる膜表面に必要な構造的活性化補因子及びバイパスとして合成されたものと同様に回避する。さらに、Ｐｔ−ＦＶはＡＰＣ、タンパク質分解的切断後の活性の保持に機能的耐性がある。改良された非共有結合性の相互作用と重鎖及び軽鎖を結合する独自のジスルフィド結合はおそらく機能安定性に貢献する。これらの適用の集密は、強力な凝血促進剤に形質転換されたｐｔ−ＦＶを有し、及び、毒物注入に続いておこる重度の播種凝固による選択的優位性のあるヘビ種をおそらく提供する。
【００９２】
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【００９３】
本発明の特定の好ましい実施形態が明細書において記載され、具体的に例示されているが、本発明は実施形態のように限定されるものと意図していない。以下の請求の範囲から逸脱することなく、本発明に様々な変更がなされることがある。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする患者における血液凝固障害を治療する方法であって、ＦＶ変異体またはその誘導体の活性型の有効量を投与する工程であって、これにより前記患者の血栓形成を増進し、且つ前記血液凝固障害の症状を改善するものである、前記投与する工程を有する、方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記活性変異体は、配列ＩＤ番号１及び配列ＩＤ番号２からなる群から選択される核酸によってコードされたものである、方法。
【請求項３】
血友病Ａを治療するための請求項１記載の方法。
【請求項４】
血友病Ｂを治療するための請求項１記載の方法。
【請求項５】
請求項１記載の方法において、前記ＦＶまたはその誘導体の活性型は静脈内にまたは局所的に移送されるものである、方法。
【請求項６】
請求項１記載の方法において、前記ＦＶまたはその誘導体の活性型をコードするベクターは、前記患者に投与されるものである、方法。
【請求項７】
請求項１記載の方法において、前記変異体は血液凝固促進剤であり、及び、前記疾患は血友病Ａ及びＢ、抑制抗体が関連する血友病Ａ及びＢ、血液凝固因子欠乏症、ビタミンＫエポキシド還元塩素欠乏症、ガンマカルボキシラーゼ欠乏症、外傷に伴う出血、負傷、血栓症、血小板減少症、脳卒中、凝血障害、播種性血管内凝固障害（ＤＩＣ）、過抗凝固治療障害、バーナードスーリエ症候群、グランツマンの血小板無力症、及び貯蔵プール欠乏症からなる群から選択されるものである、方法。
【請求項８】
請求項７記載の方法において、前記過抗凝固治療障害は、ヘパリン、低分子量ヘパリン、五糖類、ワルファリン、低分子抗血栓及びＦＸａ阻害剤の投与によるものである、方法。
【請求項９】
請求項１記載の方法において、前記変異体は、一日に少なくとも一回、約１０〜５００μｇ／ｋｇの用量で静脈内投与されるものである、方法。
【請求項１０】
ヘビ第五因子をコードする配列ＩＤ番号２の単離された核酸。
【請求項１１】
発現ベクターに含有される請求項１０記載の核酸。
【請求項１２】
請求項１１記載の核酸を有する単離された宿主細胞。
【請求項１３】
配列ＩＤ番号１の核酸によってコードされた、単離されたヘビ第五因子タンパク質。
【請求項１４】
リポソームまたはミセルに含有される請求項１３記載のタンパク質。
【請求項１５】
請求項１３記載のタンパク質を有する薬学的組成物であって、薬学的に許容される賦形剤に含まれるものである、組成物。
【請求項１】
それを必要とする患者における血液凝固障害を治療する方法であって、ＦＶ変異体またはその誘導体の活性型の有効量を投与する工程であって、これにより前記患者の血栓形成を増進し、且つ前記血液凝固障害の症状を改善するものである、前記投与する工程を有する、方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記活性変異体は、配列ＩＤ番号１及び配列ＩＤ番号２からなる群から選択される核酸によってコードされたものである、方法。
【請求項３】
血友病Ａを治療するための請求項１記載の方法。
【請求項４】
血友病Ｂを治療するための請求項１記載の方法。
【請求項５】
請求項１記載の方法において、前記ＦＶまたはその誘導体の活性型は静脈内にまたは局所的に移送されるものである、方法。
【請求項６】
請求項１記載の方法において、前記ＦＶまたはその誘導体の活性型をコードするベクターは、前記患者に投与されるものである、方法。
【請求項７】
請求項１記載の方法において、前記変異体は血液凝固促進剤であり、及び、前記疾患は血友病Ａ及びＢ、抑制抗体が関連する血友病Ａ及びＢ、血液凝固因子欠乏症、ビタミンＫエポキシド還元塩素欠乏症、ガンマカルボキシラーゼ欠乏症、外傷に伴う出血、負傷、血栓症、血小板減少症、脳卒中、凝血障害、播種性血管内凝固障害（ＤＩＣ）、過抗凝固治療障害、バーナードスーリエ症候群、グランツマンの血小板無力症、及び貯蔵プール欠乏症からなる群から選択されるものである、方法。
【請求項８】
請求項７記載の方法において、前記過抗凝固治療障害は、ヘパリン、低分子量ヘパリン、五糖類、ワルファリン、低分子抗血栓及びＦＸａ阻害剤の投与によるものである、方法。
【請求項９】
請求項１記載の方法において、前記変異体は、一日に少なくとも一回、約１０〜５００μｇ／ｋｇの用量で静脈内投与されるものである、方法。
【請求項１０】
ヘビ第五因子をコードする配列ＩＤ番号２の単離された核酸。
【請求項１１】
発現ベクターに含有される請求項１０記載の核酸。
【請求項１２】
請求項１１記載の核酸を有する単離された宿主細胞。
【請求項１３】
配列ＩＤ番号１の核酸によってコードされた、単離されたヘビ第五因子タンパク質。
【請求項１４】
リポソームまたはミセルに含有される請求項１３記載のタンパク質。
【請求項１５】
請求項１３記載のタンパク質を有する薬学的組成物であって、薬学的に許容される賦形剤に含まれるものである、組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４ＢＣ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４ＢＣ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【公表番号】特表２０１２−５０９６７０（Ｐ２０１２−５０９６７０Ａ）
【公表日】平成２４年４月２６日（２０１２．４．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３７６８２（Ｐ２０１１−５３７６８２）
【出願日】平成２１年１１月２３日（２００９．１１．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６５５１５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６００３５
【国際公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【出願人】（５１０２２６３５８）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年４月２６日（２０１２．４．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月２３日（２００９．１１．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６５５１５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６００３５
【国際公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【出願人】（５１０２２６３５８）
【Ｆターム（参考）】
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