血液凝固第ＶＩＩ因子を活性化するプロテアーゼ
【課題】 新規なＦVII活性化プロテアーゼの発見とその応用。
【解決手段】 ａ）アプロチニンの存在によって阻害され、ｂ）カルシウムイオンおよび／またはヘパリンもしくはヘパリン類縁物質によってその活性が上昇し、またｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、以後の非還元状態での染色では分子量 ５０〜７５ｋＤａの範囲の１個もしくは２個以上のバンドを示し、還元状態では分子量１０〜３５ｋＤａの範囲の１個もしくは２個以上のバンドを示す、血液凝固第VII因子を活性化するプロテアーゼならびにそのプロ酵素は、血漿またはプロトロンビン複合体（ＰＰＳＢ）濃縮物から予め陰イオン交換クロマトグラフィーに付したのち、ヘパリンもしくはヘパリン類縁物質またはデキストラン硫酸を用いる親和性クロマトグラフィーによって得られる。
本発明は、上記プロテアーゼまたはそのプロ酵素の定性的および定量的検出、ならびにその診断的応用のための試験システムおよびフィブリン含有血栓の溶解に適当な量の血液凝固第VII因子を活性化する上記プロテアーゼおよび／またはそのプロ酵素を含有する医薬製剤が含まれる。
【解決手段】 ａ）アプロチニンの存在によって阻害され、ｂ）カルシウムイオンおよび／またはヘパリンもしくはヘパリン類縁物質によってその活性が上昇し、またｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、以後の非還元状態での染色では分子量 ５０〜７５ｋＤａの範囲の１個もしくは２個以上のバンドを示し、還元状態では分子量１０〜３５ｋＤａの範囲の１個もしくは２個以上のバンドを示す、血液凝固第VII因子を活性化するプロテアーゼならびにそのプロ酵素は、血漿またはプロトロンビン複合体（ＰＰＳＢ）濃縮物から予め陰イオン交換クロマトグラフィーに付したのち、ヘパリンもしくはヘパリン類縁物質またはデキストラン硫酸を用いる親和性クロマトグラフィーによって得られる。
本発明は、上記プロテアーゼまたはそのプロ酵素の定性的および定量的検出、ならびにその診断的応用のための試験システムおよびフィブリン含有血栓の溶解に適当な量の血液凝固第VII因子を活性化する上記プロテアーゼおよび／またはそのプロ酵素を含有する医薬製剤が含まれる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は血液凝固第VII因子の活性化のためのプロテアーゼ、それを単離、検出および不活性化する方法ならびにこのプロテアーゼからなる医薬製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液凝固系は、血漿中に存在する血液凝固因子を活性化する２つの異なるカスケード様経路から構成される。その誘導機構によって、内因系または外因系経路が血液凝固の開始に優先的に使用される。
【０００３】
組織が傷害された場合、トロンボプラスチン（組織因子、ＴＦとリン脂質）が外因性凝血経路のスターターとして冒された細胞により暴露される。膜局在性のトロンボプラスチンは、血液凝固第VII因子（ＦVII）および循環する、活性化ＦVII（ＦVIIａ）の両者を結合することができる。カルシウムイオンおよび脂質の存在下に、このＴＦ−ＦVIIａ複合体はＦＸの結合を招き、これは限定された蛋白分解によってその活性化型（ＦＸａ）に変換される。続いてＦＸａはプロトロンビンを活性化してトロンビンを形成させることにより、フィブリンの形成を招来し、それによって最終的に創傷の閉鎖が起こる。
【０００４】
トロンボプラスチン結合ＦVIIの更なる活性化は最初は自触反応によって起こるが、特に、凝血カスケードの開始後には、それはＦＸａおよびトロンビンによって支持され、特に反応カスケードの著しい強化を招くことになる。
【０００５】
ＦVIIａまたはＦVIIａ含有濃縮物の投与はある種の臨床状態に適用されている。たとえば、血友病Ａに冒されＦVIII投与の結果としてＦVIIIに対する抗体が発生している患者では、ＦVIIａのいわゆるＦVIII副経路活性（ＦＥＩＢＡ）が用いられる。現時点で分かっている所見によれば、ＦVIIａはこの関係で十分な耐容性を有し、それは血栓傾向を生じることはなく、限られているが適切な程度の凝血が起こることを保証するのに適している。組換えＦVIIａは既に治療的におよび予防的に使用されている。血漿から単離されたＦVIIはまた、活性化されてから用いることもできる。トロンビンのようなプロテアーゼをこの活性化に使用できるが、しかしながら、これらのプロテアーゼは、それら自体凝血を強力に活性化することが可能で、血栓の危険を招くことがある。この理由から、以後のトロンビンの除去または不活性化が必要であり、損失を生じることになる。それに伴う血栓の危険の結果として、多くの場合、ＦＸａもしくはＦIIａ（トロンビン）の使用は禁忌とされ、緊急時、たとえば血液の著しい喪失および止血不能の出血の関連でのみ適用される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＦVIIａは、健康人の血漿中にはきわめて低濃度でしか見出されない。血液中を循環するＦVIIａの形成および起源についてはこれまでほとんど知られていない。細胞の破壊に伴って発現または放出された痕跡のトロンボプラスチンはこの関連である役割を果たしている可能性がある。第XIIａ因子は、たとえばある種の条件下にＦVIIの活性化を生じることが知られているが、この反応の生理学的な関連はまだ明らかにされていない。
【０００７】
驚くべきことに今回、従来知られているすべてのプロテアーゼとは異なるＦVII活性化プロテアーゼが、ヒト血漿およびある種のプロトロンビン複合体濃縮物の分画に関連し発見された。このプロテアーゼの検討から、それは ChromogenixAB，Swedenからのペプチド基質Ｓ２２８８（ＨＤ−イソロイシル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニン−ｐＮＡ）に対して特に高いアミド分解活性を示すことが示された。このプロテアーゼの特殊な性質は、そのアミド分解活性がアプロチニンによって効果的に阻害されることである。他のインヒビター、たとえばアンチトロンビンIII／ヘパリン複合体もその阻害に適している。他方、その活性はヘパリンおよびヘパリン関連物質たとえばヘパリン硫酸またはデキストラン硫酸およびカルシウムイオンにより上昇する。最後に、このプロテアーゼは、時間およびその濃度に依存する様式でＦVIIをＦVIIａに変換できることが見出された。この反応もアプロチニンによって阻害される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明の主題の一部は、
ａ）アプロチニンの存在によって阻害され、
ｂ）その活性はカルシウムイオンおよび／またはヘパリンもしくはヘパリン関連物質によって上昇し、そして
ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、以後の非還元状態での染色では分子量５０〜７５ｋＤａの範囲に１個もしくは２個以上のバンドを示し、還元状態では分子量４０〜５５ｋＤａに１個のバンドならびに分子量１０〜３５ｋＤａの範囲の１個もしくは２個以上のバンドを示す、
血液凝固第VII因子を活性化するプロテアーゼである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】プロテアーゼとＦVIIIを一定時間インキュベートした場合のプロテアーゼ濃度とＦVIIIの不活性化を示す。
【図２】プロテアーゼ濃度を一定とし、ＦVIIIを様々な時間インキュベートした場合のＦVIIIの不活性化を示す。
【図３】プロテアーゼとＦVIIIを混合物中におけるカルシウム濃度を変動させインキュベートした場合のＦVIIIの不活性化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下の明細書においては、そのプロテアーゼの活性化型を「プロテアーゼ」と呼び、非活性化型を「プロ酵素」と呼ぶ。
【００１１】
このプロテアーゼについてさらに検討し、濃縮または単離後には急速な活性の喪失を受け、それは２０ｍＭ ｔｒｉｓ、０.１５Ｍ ＮａＣｌを含有するｐＨ７.５の溶液中で観察された。濃度０.１％のアルブミンの添加も、このプロテアーゼの活性が室温で１時間後に５０％まで低下するのを防止することはできなかった。他方、５０ｍＭのクエン酸ナトリウムによりｐＨ６.５に緩衝化した溶液中では、このプロテアーゼのきわめて良好な安定化が観察された。溶液をｐＨ４〜７.２好ましくはｐＨ５.０〜７.０に調整すると、プロテアーゼ溶液に特に安定剤を加えなくても活性の喪失は全くまたはきわめてわずかしか認められなかった。しかしながら、溶液には安定化剤を添加することが得策であり、適当な安定剤としてはクエン酸塩のほかに、特にグルタメート、アミノ酸たとえばアルギニン、グリシンまたはリジン、カルシウムイオンおよび糖たとえばグルコース、アラビノースまたはマンノースの１〜２００mmol／L好ましくは５〜１００mmol／L量を挙げることができる。有効な安定化は、グリコールたとえばエチレングリコールまたはグリセロール５〜８０重量％の添加によっても達成され、好ましくは１０〜６０重量％が使用される。その場合、安定化された溶液のｐＨ値は４〜９でなければならない。
【００１２】
新規なプロテアーゼ、および同じくそのプロ酵素は、組換えＤＮＡ法、またはたとえば適当なトランスジェニック動物の乳汁中における産生によって得られ、特に血漿もしくはプロトロンビン複合体（ＰＰＳＢ）濃縮物の分画化によって得ることができる。出発原料をついで最初に陰イオン交換クロマトグラフィーに付し、続いて、溶出液の親和性クロマトグラフィーを行う。親和性クロマトグラフィーにはマトリックス上に固定化されたヘパリンまたはヘパリン関連物質たとえばヘパリン硫酸またはデキストラン硫酸が特に適している。このようなクロマトグラフィー法を用いた場合、新規なプロテアーゼおよび／またはプロ酵素は選択的に結合され、ついで既知の方法を用いて再び溶出することができる。マトルックスにリガンドをカップリングするためには、スペーサーの使用を推薦できる。新規プロテアーゼの単離にはヘパリン−リジンマトリックスが特に適していることが見出されている。
【００１３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続く染色では、この方法によって単離されたプロテアーゼは、非還元状態において、分子量５５〜７５ｋＤａの範囲の互いに接近した存在する１個から数個のバンドを示す。還元後には、分子量１５〜３５ｋＤａの範囲に１個から数個のバンドが観察され、１個のバンドが４０〜５５ｋＤａに観察された。６０〜６５ｋＤａのさらに１個のバンドは、走査および定量的評価後、総タンパク質の５〜１０％を構成し、非活性化プロ酵素も存在することが示された。この結果は、このプロテアーゼに対するモノクローナル抗体を使用する適当な検討によって支持された。したがって、このプロテアーゼのプロ酵素もまた、本発明の方法により調製し、滅菌し、使用することができると結論された。本発明の主題の一部は、したがって、血液凝固第VII因子を活性化するプロテアーゼのプロ酵素である。プロ酵素の比率は６０〜６５ｋＤａのバンドにより指示される。プロ酵素の適当な生理学的アクティベーターの例は、それらの基質特異性に応じて、プロ酵素、トロンビン、カリクレインまたはＦVIIａの活性化領域を構成するアミノ酸配列に相当する。
【００１４】
上述した新規なプロテアーゼの性質の一部、すなわちそれが血漿または血漿に由来するプロトロンビン複合体（ＰＰＳＢ）濃縮物から単離できるという事実、そのアミド分解活性のアプロチニンによる阻害ならびに還元および非還元状態の両者でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける上述の泳動挙動は、Hunfeldら（Ann．Hematol．1997，74：A87，113；Ann．Hematol．1998，76：A101，P294 および Etscheidら，Ann．Hematol．1999，78：A42）によって詳細は定義されていないＰＰＳＢ濃縮物から単離されたプロテアーゼを想起させる。その場合は、調製は主としてアプロチニンマトリックスを用いて達成された。ある種のペプチド基質のアミド分解による切断の結果として、活性はトロンビン様活性と記述されている。Hunfeld らは包括的な血液凝固パラメーターたとえばプロトロンビン時間、クウイックまたは血小板凝集に対する影響は全く見出していない。
【００１５】
Hunfeldらにより記載されたプロテアーゼのＮ末端配列決定は、そのｃＤＮＡがChoi−Miuraら（J．Biochem．119：1157−1165，1996）により報告されたタンパク質の場合と一致を示す。その一次構造では、相当するタンパク質が肝細胞増殖因子活性化酵素（ＨＧＦＡ）と命名されている酵素とホモロジーを示す。
【００１６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥから還元条件下に単離された２つのバンドをＮ末端配列決定に付し、以下の一致が確立された。
バンドの分子量範囲 アミノ酸配列 報告者
１０〜３５kDa IYGGFKSTAGK 本発明
３０kDa IYGGFKSTAG Hunfeldら
１７kDa IYGGFKSTAGKH Choi−Miuraら
４０〜５５kDa LLESLDP 本発明
５０kDa SLDP Hunfeldら
５７kDa SLLESLDPWTPD Choi−Miuraら
一致は他の試験結果たとえば基質特異性および阻害される活性の能力にも見出される。
それにもかかわらず、現時点ではこれらのタンパク質が同一であるとの推定はなお不可能である。いずれにしても、以前に研究された上述のタンパク質にはＦVIIａまたは他の因子の活性化の性質をもつことは報告されていない（下記参照）。
【００１７】
その上述の性質に基づいて、その新規なプロテアーゼは診断的におよび治療的に使用することができる。
【００１８】
１．新規なプロテアーゼを用いる試験システム
新規なプロテアーゼは試験試薬中に診断的に使用することができる。すなわち第VII因子の存在は新規なプロテアーゼの添加により血液凝固試験において定性的および定量的に決定することができる。
【００１９】
それとは逆に、ＦVIIの活性化を測定するために開発されたこの試験システムはプロテアーゼの検出および定量にも使用することができる。このためには、プロテアーゼを含有する溶液をＦVII含有溶液と混合し、適当なインキュベーション時間後に生成したＦVIIａの両を定量する。これは、たとえば Staclot(R)ＦVIIａ−ｒＴＦテスト（Stago／Boehringer Mannheim）を用いて実施できる。好ましい操作を用いた場合は、この試験は供給されるＦVIIの濃度には限定されない。総タンパク質の比率の型でのプロテアーゼ量を知る場合には、その比率は：
−純粋なプロテアーゼプレパレーション中、キエルダール法または本技術分野の熟練者には周知の他のタンパク質のアッセイ法により、または
−たとえば特異的な抗体に基づく抗原試験および適当な免疫化学的測定方法たとえばＥＬＩＳＡを用いて決定することが可能であり、ついでプロテアーゼプレパレーションの比活性を相当する様式で測定することができる。
【００２０】
驚くべきことに、プロテアーゼの特性の更なる解明に伴い、付加的な測定を可能にする性質が新たに見出された。上記プロテアーゼと血液凝固VIII／VIIIａおよびV／Vａ因子のインキュベーション、それに続く定量に関連して、上記血液凝固因子はプロテアーゼ濃度およびインキュベーションの長さには無関係な様式で不活性化されることが明らかにされた。
【００２１】
本発明の主題の他の一部は、したがって、血液凝固第VII因子を活性化するプロテアーゼを定性的および定量的に検出する新規な試験システムであり、このシステムにおいては、プロテアーゼは血液凝固第VIII／VIIIａまたはV／Vａ因子を不活性化するその活性によって定量することができる。この試験システムは、プロテアーゼを含有する溶液を第VIII／VIIIａまたはV／Vａ因子とインキュベートして、残留した第VIII／VIIIａ因子の量または残留した第V／Vａ因子の量を慣用の活性試験によって測定し、ついでこれからプロテアーゼの量を標準曲線との比較により決定する操作に基づくものである。この試験の実施に際し、プロテアーゼ活性のインキュベーションを予め定められた時間、限られた量のアプロチニンの添加によって阻害すると、これらの濃度では試験システムの以後の測定に影響しないという利点がある。その後、血液凝固因子の残留活性を本技術分野の熟練者に周知の試験方法で測定する。このためには、主として第IXおよびX因子を含有し、得られたＦＸａの量をトロンビンインヒビターの存在下に色素原基質の変換により定量するいわゆる Coamatic(R)第VIII因子テスト（Chromogenix AB）を使用可能にする点で（〔０００７〕の記述参照）、特に試験システムの価値が証明されている。一方、この量は、ＦVIIまたはＦVIIａの量に比例する。ついで、残留するＦVIII活性を決定すれば、存在するプロテアーゼの濃度を帰納することが可能になる。
【００２２】
蛋白分解作用によるＦVIII／ＦVIIIａまたはＦV／ＦVａ因子の分解は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって明瞭に証明できる。プロテアーゼをたとえばＦVIII濃縮物とインキュベートした時間に依存して、ＦVIIIに典型的なバンドは消失し、一方、他の新しいバンドが発生し、または弱いバンドの強度が増大する。したがって、プロテアーゼの活性はまた、バンドの減弱または増強を定量することにより関連づけることが可能で、その結果、たとえばプロテアーゼ標品を用いて定量的に測定することができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図におけるバンドの強度、または他の電気泳動法によるバンドの強度の変化を、本技術分野の熟練者には周知のたとえばスキャナーおよび適当なプログラムを用いて定量することができる。これに加えて、上記血液凝固因子に対する抗体はウエスタンブロットに使用可能であり、また上述の方法における評価に採用することができる。減弱したバンドまたは、特に発生したバンドを特異的に検出する抗体が特に適している。これに関連して、これらの抗体は他の免疫化学的試験、たとえばＥＬＩＳＡの確立にも使用することができる。
【００２３】
ＦVIII／ＦVIIIａの場合に記載された蛋白分解的不活性化はまた、ＦVIIIとある程度の構造的ホモロジーを示す第V／Vａ因子とプロテアーゼをインキュベートした場合にも観察される。分解は適当な活性試験システムおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロッティングにおいてモニターできる。
【００２４】
ＦＶおよびＦVIIIの不活性化にもかかわらず、今回、血液、血小板濃縮血漿または血漿へのプロテアーゼの添加は血液凝固時間を短縮すること、すなわち各種のいわゆる「包括的血液凝固試験」において卓越したプロコアギュラント活性を示すことが見出された。これらの試験システムは、たとえば、非活性化部分トロンボプラスチン時間（ＮＡＰＴＴ）、プロトロンビン時間（ＰＴ）およびカルシウム再沈着時間であると理解される。たとえばいわゆる血液凝固計において、血栓弾性記録計により、またはほかに色素原試験で測定されるこれらの時間の短縮化は、血液凝固促進物質の濃度と相関するので、サンプル中のその物質の濃度は、血液凝固時間の検量曲線を使用して逆に推論することができる。「ＦVIIアクティベーター」の濃度は同様、選択された包括的血液凝固試験を用いて決定することができる。
【００２５】
「ＦVIIアクティベーター」は同様に、単一鎖ウロキナーゼ（scuＰＡ、単一鎖ウロキナーゼプラスミノーゲンアクティベーター）、および単一鎖ｔＰＡ（sctＰＡ、単一鎖組織プラスミノーゲンアクティベーター）の効果的なアクティベーターをもたらすことができること、すなわちプラスミノーゲンアクティベーターアクティベーター（ＰＡＡ）として作用できることがまた驚くべきことに見出された。活性化ＰＡの活性はたとえば、色素原物質を用いて測定できる。すなわちこの性質は、したがって、「ＦVIIアクティベーター」の検出および定量化に使用することができる。プラスミノーゲンアクティベーターの活性化はまた、プラスミノーゲンの存在下、プラスミンそれ自身の形成によりまたはプラスミンによってもたらされるフィブリン凝血の溶解により、カップリング反応で決定することができる。
【００２６】
したがって、要約すれば、プロテアーゼはそれをＦVIIIまたはＦVIIIａを含有する溶液とインキュベートし、ついでＦVIII／ＦVIIIａの残留量を適当な活性試験により検出および定量の両者が可能であるということができる。同じ方法でＦVまたはＦVａをプロテアーゼとインキュベートし、ＦV／ＦVａの残留量をついで定量することができる。未知のプロテアーゼ濃度は試験に包含されるプロテアーゼの量の上昇を標準曲線と比較して定量的に決定することができる。様々な包括的血液凝固試験が同様に定量化に適当であり、プロテアーゼ濃度は凝固時間の短縮に基づいて検量曲線から読み取られる。プロテアーゼのＰＡＡ活性も定量の目的に使用することができる。
【００２７】
これらの試験の特徴は、ＦVおよびＦVIII不活性化ならびにＰＡＡ活性が適当な高濃度のカルシウム、好ましくは＞０.００１ｍＭ、特に好ましくは＞０.００５ｍＭをＣaＣl2の形で存在させると、特に良好に発揮されることである。上述のように、ヘパリンおよびヘパリン様物質の両者およびカルシウムもプロテアーゼ活性を上昇させる直接的な色素原アッセイの場合とは対照的に、ＦV／ＦVIIIの不活性化はヘパリンによっては促進されないか、または有意ではない促進が認められるにすぎない。これに反し、ＰＡＡ活性はいずれの物質の存在でも、すなわちカルシウムおよび／またはヘパリンもしくはヘパリン様物質によって刺激される。
【００２８】
プロテアーゼ誘導反応は、プロテアーゼをインヒビター特にヘパリンまたはヘパリン様物質の存在下（好ましくはヘパリンの存在下）アンチトロンビンIII、Ｃ1−エステラーゼインヒビター、α2−アンチプラスミン、インターα−トリプシンインヒビターまたは既知の低分子量プロテアーゼインヒビターたとえば商品名ＦＯＹ(R)として入手できるグアニジノカプロン酸−ｐ−エトキシカルボニルフェニルエステルとインキュベートすることによってきわめて効率的に減弱または防止することができる。これらの物質は、したがって、たとえばインキュベーション時間を正確に決定するため、または試験の特異性をさらに上昇させる目的で、反応を停止させるために使用することができる。混合物中の遊離のカルシウムイオンをたとえばキレート剤で減少させると、この目的に使用することもできる。
【００２９】
２．第Vおよび第VIII因子の安定化されたプレパレーション
血液凝固第Vおよび第VIII因子に対する新規プロテアーゼの蛋白分解活性に関する上述の観察からプロテアーゼ活性の阻害またはその活性の減弱の課題が、生成の喪失および、多分妨害性タンパク質のフラグメントと考えられる断片の形成を回避するために生じる。これはすべて、ＦVおよびＦVIIIが血漿より得られた寒冷沈殿物からカルシウムイオンの存在下に通常調製され、後者はタンパク質のコンフォーメーションの維持に要求されることから、益々重要である。
【００３０】
本発明の主題の他の部分は、したがって、血液凝固第VII因子を活性化するプロテアーゼが阻害されるとい事実の結果としての蛋白分解により形成された第Vおよび第VIII因子フラグメントを含まないＦVまたはＦVIIIの安定化されたプレパレーションである。さらに詳細な検討によって、上記プロテアーゼによる第Vおよび第VIII因子の不活性化は特に０.５ｍＭ以上の濃度のカルシウムイオンの存在下において効率的に起こることが示されたことから、血液凝固第VII因子を活性化するプロテアーゼの阻害のために第Vまたは第VIII因子プレパレーション中のカルシウムイオンの濃度を１.０ｍＭ未満、好ましくは０.５ｍＭ未満に調整すると第Vおよび第VIII因子のプレパレーションを効率的に安定化することができる。プロテアーゼの第Vおよび第VIII因子不活性化作用はこれらの濃度で著しく低下するが、カルシウムイオンの量はＦVおよびＦVIII分子のコンフォーメーションを安定化するのになお十分である。上述のカルシウムイオン量は、単に最終製品においてのみではなく、寒冷沈殿物自体および以後の精製工程でも過剰になってはならない。
【００３１】
プロテアーゼまたはプロ酵素のヘパリンおよびヘパリン様物質に対する上述の親和性により、プロテアーゼ／プロ酵素はＦVIIIまたはＦV含有溶液から、固定化ヘパリンまたは他の免疫性もしくは親和性吸着物質とインキュベートすることによって除去できる。免疫性吸着物質の調製に有用なポリクローナルまたはモノクローナル抗体、それぞれの抗体フラグメントは本技術分野において既知の技術により、プロテアーゼまたはプロ酵素の全体または部分を抗原として用い、容易に入手することができる。
【００３２】
しかしながら、ＦVまたはＦVIIIの蛋白分解を防止するためには、カルシウムイオン量の低下に加え適宜、天然または合成プロテアーゼインヒビターを使用することもできる。アプロチニン、α2−アンチプラスミン、Ｃ1−エステラーゼインヒビターまたはインタートリプシンインヒビターのような蛋白質もインヒビターとして使用できる。本技術分野の熟練者には合成セリンプロテアーゼインヒビターとして知られている低分子量物質もこれに関連して使用することができる。阻害強度がヘパリンまたはヘパリノイドによって上昇するアンチトロンビンIIIのようなインヒビターも同様に添加できる。すなわち、ヘパリンはそれ自身、小色素原物質に対するプロテアーゼのアミド分解活性を増大できるが、それはＦV／ＦVIIIの不活性化を支持しないことが驚くべきことに見出された。
【００３３】
３．新規プロテアーゼからなる医薬
新規なプロテアーゼおよび／またはプロ酵素は治療的に用いることができる。
それらはそれら単独、またはプロテアーゼの活性を増大させる物質、たとえばヘパリンまたはヘパリン関連物質、たとえばヘパリン硫酸、および／またはカルシウムイオンとともに使用することができる。この薬剤にはさらに、第VII因子を同様に添加することも可能である。そのＦVIII副経路活性（ＦＥＩＢＡ）を利用するこのような薬剤の使用は、たとえば、ＦVIIIおよび／またはＦIXおよび／またはＦXIおよび／または接触相タンパク質たとえばＦXIIに対してたとえば抗体の存在のために耐容性が存在する場合、または他のタイプの欠損状態が存在する場合に適用することができる。この関連で、ＦVIIはインビトロ、血漿中、濃縮分画中のいずれかまたは精製ＦVII上に対する作用により活性化することができる。また、新規な血液凝固剤は、全身性の出血の予防のためまたは出血を停止させるためにエキソビボで使用することも可能である。
【００３４】
他方、アプロチニンまたは上述のインヒビターによる新規プロテアーゼの観察された阻害は、プロテアーゼインヒビターからなり血液を凝固させる能力が減弱した薬剤の開発に使用できる。これに加えて、新規なプロテアーゼはまた、それらのプロテアーゼ阻害作用によって血液凝固を損なう生理学的および非生理学的因子たとえば合成ペプチドを同定するためにも使用できる。特に効率的にトランスフォームされる色素原基質、たとえばＳ２２８８（詳細は上記参照）のペプチド配列はこのための構造的基盤として使用することができる。これらのプレパレーションが蛋白分解活性を含まない場合には、凝血プレパレーションに対する適当なインヒビターの添加が、それらの調製時にも必要なことがある。
【００３５】
プロテアーゼの特性がさらに解明されるに伴い、いわゆる「第VII因子アクティベーター」プロテアーゼとしての付加的用途の可能性を開く性質が発見された。一本鎖プラスミノーゲンアクティベーター、たとえば、プロウロキナーゼ（一本鎖ウロキナーゼ、sucＰＡ、一本鎖ウロキナーゼプラスミノーゲンアクティベーター）または sctＰＡ（一本鎖組織プラスミノーゲンアクティベーター）をインキュベートすると、「第VII因子アクティベーター」がこれらのプラスミノーゲンアクティベーター（ＰＡ）の活性化をもたらす。これに関連して、一本鎖ＰＡの蛋白分解には限界があり、二重鎖プロテアーゼの形成を生じ、これは特にプラスミノーゲンの活性化に適している。生成したプラスミンはフィブリン溶解のエフェクター、すなわち血栓の溶解に関与する生理学的システムである。プロウロキナーゼまたはｔＰＡのようなＰＡは、必要に応じて放出され、また既知のようにプラスミンまたはカリクレイン（scuＰＡ）によって活性化される内因性タンパク質である。健康状態においてscuＰＡが活性化される機構は、まだ完全には解明されていない。
【００３６】
プラスミノーゲンアクティベーターは，血栓性疾患または併発症たとえば大腿静脈血栓症、心筋梗塞または卒中に関連した医薬製剤中において、単離もしくは組換えによって調製されたタンパク質として治療的に使用することができる。
【００３７】
今回発見された「第VII因子アクティベーター」の性質により、後者はプラスミノーゲンアクティベーターたとえばウロキナーゼまたはsctＰＡのインビボまたはエキソビボ活性化に使用することができる。この活性はまたこのプロテアーゼを、特に一本鎖または二本鎖プラスミノーゲンアクティベーターまたは抗凝固剤と組合わせて同様に、血栓塞栓性疾患の予防または治療のための使用に適用できる。この使用の可能性は、プロテアーゼがまたプロコアグラント様式で作用できる事実と矛盾しない。２つの反応のどちらが優先するかの問題は生理学的物質の利用性によって多分解決される。現時点での知識によれば、第VII因子は血漿中で中程度に活性化されて、突然の血管障害に直ちに対処できるようにある濃度に絶えず維持されている。他方、組織プラスミノーゲンアクティベーターならびにウロキナーゼプラスミノーゲンアクティベーターは血漿１ml中にわずかナノグラム単位の量で存在するのみである。その濃度がプラスミノーゲンアクティベーターの分泌または合成によって上昇するのはフィブリンの沈着または血栓が起こった場合のみで、それらはついで、局所的に特にそれらが血栓に結合した場合に活性化されたのち、プラスミノーゲンを活性化して、それらの血栓溶解作用を発揮する。一本鎖ＰＡが存在する場合、特に局所的に限定された様式ではそれらの活性化がＦVIIの活性化を上回り、それにより生理学的状態への調整が可能になる。したがって、このプロテアーゼはまた止血を調整し、それによって先天的または後天的欠損状態の症例におけるプロテアーゼおよび／またはプロ酵素による置換に適用される可能性がある。
【００３８】
したがって本発明の主題の他の部分は、血液凝固第VII因子活性化プロテアーゼおよび／またはそのプロ酵素型の、フィブリン含有血栓を溶解するのに十分な量からなる医薬製剤である。この製剤はさらに、一本鎖プラスミノーゲンアクティベーター（ＰＡ）および／または抗凝固剤を含有させることもできる。プロ酵素が存在する場合には、上述の医薬製剤内にまたはそれとともに、適当な活性化剤を使用することも有利である。
【００３９】
「ＦVIIアクティベーター」のプラスミノーゲンアクティベーター増強作用は、特にカルシウムおよび／またはヘパリンおよびヘパリン様物質たとえばデキストラン硫酸によって促進されることが見出されたことから、さらに可溶性カルシウム塩および／またはヘパリンもしくはヘパリン様物質を含有する医薬製剤は、フィブリン含有血栓を本発明によって溶解するために有利に使用できる。これに関連して、プロテアーゼ／プロ酵素はその単独または一本鎖または二本鎖プラスミノーゲンアクティベーターと組合わせ、所望によりプロテアーゼに対して特定の親和性を発揮し、それによって血漿中半減期を延長する担体物質としてまたは表面へのメディエーターとしてその活性を増大させる物質とともに使用することができる。
【００４０】
血液凝固第VII因子活性化プロテアーゼからなる医薬製剤は、その特異的なフィブリン溶解作用により、フィブリン含有血栓によって引き起こされる疾患の処置に使用することができる。フィブリン溶解過程はまた創傷治癒過程に関与する。この関連で、上記プロテアーゼおよび／またはプロ酵素は、静脈内もしくは局部的、皮下、皮内または筋肉内あるいは傷害もしくは創傷の場合は局所的にまたは適当な担体マトリックスに結合させて投与することができる。体液たとえば血液または血漿から単離されたプロテアーゼ／プロ酵素および組換えまたは遺伝子導入により調製されたプロテアーゼ／プロ酵素はいずれもこの関連で使用できる。プロテアーゼ／プロ酵素はまた、いわゆるフィブリン接着剤の成分としても適当で、これにはアプロチニンのようなプロテアーゼ／プロ酵素を阻害する物質を含有してはならない。この場合、プロテアーゼの凝血短縮作用が利用される。
【００４１】
上記プロテアーゼ／プロ酵素は、先天性または後天性止血欠損、（汎発性）出血の発生、各種血栓関連併発症に使用することができる。出血の処置に使用する場合は、プロテアーゼ／プロ酵素をＦVIIIとともに、所望により、さらに他の凝血因子を付加することが有利である。
【００４２】
４．ＦVII活性化プロテアーゼを滅菌する方法
ヒト血漿から単離されたタンパク質であるから、新規なプロテアーゼおよび／またはそのプロ酵素は、予めウイルスを不活性化する処理に付した場合にのみ、医薬製剤として使用することができる。滅菌過程が特にウイルスの不活性化に最も重要な過程として認識されている。しかしながら、処理すべきタンパク質には約６０℃で１０時間までの過熱に適当な安定性が要求される。各タンパク質について至適な安定剤を別個に決定し、それらの濃度を至適化しなければならない。
新規なプロテアーゼおよび／またはそのプロ酵素の場合、滅菌は行わない溶液中のタンパク質を安定化する条件は既に上述した。この場合わずかに酸性のｐＨが特に有利なことが証明されている。しかしながら、これらの条件下に滅菌を行うと、新規なプロテアーゼおよび／またはそのプロ酵素では通常、元の活性の５０％以上が失われる。
【００４３】
新規なプロテアーゼおよび／またはそのプロ酵素からなる医薬製剤の滅菌は、プレパレーションを
ａ）ｐＨ範囲３.５〜８.０、好ましくはｐＨ範囲４.０〜６.８；
ｂ）添加した１種または２種以上のアミノ酸０.０１mol／L以上、好ましくは０.０５mol／L以上の存在下；および／または
ｃ）添加した１種の糖または異なる糖の組合わせ、総濃度０.０５ｇ／ml以上、好ましくは０.２ｇ／ml以上の存在下；および／または
ｄ）添加したカルシウムイオンと錯体を形成できる物質たとえばクエン酸、シュウ酸、エチレンジアミン四酢酸等１種または２種以上の存在下
に調製されると、至適な安定化結果が保証される。
【００４４】
添加物たとえばアルブミン、Haemaccel(R)、ヘパリンおよびヘパリノイド、グリセロール、グリコールおよびポリエチレングリコールを別個にまたは一緒に混合して使用することができる。滅菌が完了したのち、安定剤として添加した糖、アミノ酸および他の添加物は、本技術分野の熟練者には周知の方法を用いてプレパレーションから減量または完全に除去することができる。滅菌過程の結果は実施例１２および１３に示す。
【実施例】
【００４５】
実施例１
調製されたプロテアーゼによるＦVIIの活性化を、Staclot(R)ＦVIIａ−ｒＴＦテストシステム（Stago／Boehringer Mannheim）を用いて証明した。この検出システムは、予め形成された活性化ＦVII（ＦVIIａ）を外因系凝固経路の阻害にのみ使用できる特定の性質の（組換え）可溶性組織因子（ｒＴＦ）に基づくものである。これは、完全な組織因子を用いた場合とは異なり、ＦVIIａの実際の含有量を正確に決定することを可能にする。
【００４６】
単離されたＦVII（Enzyme Research Labs）を用いて活性化実験を行った。このＦVII自体はヒト血漿から単離されたために痕跡のＦVIIａを含んでいる。緩衝液で希釈して濃度をＦVII ０.０５IU／mlに調整した。ＦVIIを試験物質と室温で１０分間インキュベートし、ついで真のＦVIIａ含量を試験した。ＦVIIａ含量は平行して構築した標準曲線を用いて定量した。
【００４７】
本明細書には記載していない予備実験で、用いた濃度ではアプロチニンは調製されたプロテアーゼの活性を完全に阻害したが、ＦVIIａに直接の作用をもたず、ＦVIIａ−ｒＴＦテストシステムに有意な影響を示さないことが確認された。
以下に掲げる結果は、各場合、三重の測定に関する。すなわち、以下の実験は次のようにセットアップされた。
【００４８】
１．ＦVII：
対照アッセイとしては非活性化ＦVIIを使用した。これは、既に痕跡のＦVIIａを（上記参照）をＦVIIａ １０mIU／mlのオーダーで含有している。
【００４９】
２．ＦVII＋アプロチニン：
このアッセイでは、ＦVIIはアプロチニンの存在下にインキュベートし、ＦVIIａ自体は阻害されないことまたテストは用いたアプロチニンによって影響されないことを証明するために、ＦVIIａ−ｒＴＦアッセイを使用した。これは確認された（アッセイ１との比較で）。
【００５０】
３．プロテアーゼ＋ＦVII（インキュベート）ついでアプロチニンの添加：
結果：ＦVIIａ １８mIU／ml
この場合、プロテアーゼにはＦVIIａを活性化する時間を与えた。アプロチニンはプロテアーゼをそがいするために単に添加し、１０分間のインキュベーション後に行われた。得られたＦVIIａをＦVIIａ−ｒＴＦアッセイで定量した。すなわち、ＦVIIａの基底値（アッセイ１）を差し引くと、選択された条件下でのプロテアーゼの活性によってＦVIIａ ８mIU／mlが形成された。
【００５１】
４．プロテアーゼ＋アプロチニン、ついでＦVIIの添加：
結果：ＦVIIａ １１mIU／ml
このアッセイでは、プロテアーゼをＦVIIと接触させる前にアプロチニンで阻害した。以後のＦVIIとのインキュベーションでもまた続くＦVIIａの定量でも、有意なＦVIIａ含量の上昇は生じなかった（アッセイにおける変動の範囲、すなわち、アッセイ１における１１と１０mIU／mlは有意とはみなされない）。
【００５２】
５．プロテアーゼ：
結果：ＦVIIａ ０mIU／ml
このアッセイでは、選択された濃度においてプロテアーゼはそれ自体ＦVIIａ−ｒＴＦテストシステムに何ら影響を与えないことが証明された。
要約すれば、以上から
−記述したプロテアーゼはＦVIIを活性化する；
−プロテアーゼによるＦVIIの活性化は「直接」、すなわち、ｒＴＦの存在とは独立に起こる；
−ＦVIIの活性化はアプロチニンによって阻害される；アプロチニンそれ自体はテストシステムに何ら有意な影響は与えない；
と結論される。
【００５３】
実施例２
この実施例はプロテアーゼの濃度およびプロテアーゼがＦVIIとインキュベートされた時間とは独立の反応において、ＦVIIがいかにして活性化されるかを説明する。テストシステムおよび試薬は実施例１の記載に相当するように選択された。最初のシリーズの実験では、最初に導入されたＦVIIは様々な希釈度（１：５、１：１０および１：２０）のプロテアーゼ含有溶液とプレインキュベートし（室温５分）、ついでアプロチニン（プロテアーゼを阻害する）で処理し、続いて、そのＦVIIａ含量をＦVIIａ−ｒＴＦアッセイにおいて試験した。この場合も、プロテアーゼをＦVIIと接触させる前にアプロチニンによって阻害したアッセイを平行して行い、対照とした。
【００５４】
結果は活性化係数として与える。すなわち、上述の対照アッセイで測定された値のｘ倍に相当する。
アッセイ：プロテアーゼ＋ＦVII、インキュベーション、＋アプロチニン
対照：プロテアーゼ＋アプロチニン、インキュベーション＋ＦVII
【表１】
これから、ＦVIIはプロテアーゼにより、プロテアーゼの濃度に依存する様式で活性化されると結論される。
【００５５】
共反応物質の濃度を一定に保持した場合、ＦVIIはインキュベーションの長さとは独立の様式で、プロテアーゼによって活性化されることも同様に証明された。ＦVII ０.２IU／mlおよび１：１０−希釈プロテアーゼ溶液を含有する溶液の等容量を一緒にインキュベートした場合には、相当時間のインキュベーション後にアプロチニンを添加して(活性化を停止させるため)、以下のＦVIIａ含量が得られた。
【表２】
これから、ＦVIIは、プロテアーゼによって時間依存性の様式で活性化されると結論される。
【００５６】
実施例３
この実施例を用い、ＦVIIのプロテアーゼによる活性化はカルシウムイオンおよびヘパリンの存在によって増大することを証明することとする。
２５μlのプロテアーゼ含有溶液を、５０μlの
−緩衝液（対照）
−１５ｍＭ ＣaＣl2
−ヘパリン ５０ＵＳＰ単位／ml
−Pathromtin（脂質混合物、アリコートを製造業者の指示書に従って溶解）
と室温で５分間混合し、ついで１５０μlのｔｒｉｓ／ＮａＣｌ緩衝液（pH８.２）および２５μlの色素原基質Ｓ２２８８（３mM）で処理し、ついで４０５nmにおける吸光度の経時的変化を測定した（３７℃）。緩衝液対照に対する活性化係数（ｘ倍）は下表に示す。
【表３】
この実施例で用いた条件下には、プロテアーゼ活性の著しい上昇をカルシウムイオンおよび／またはヘパリンの存在下に観察することができる。
【００５７】
実施例４
いずれの場合も、プロテアーゼ１０、１または０.１μg／mlを含有する溶液を、２５μlのＦVII（２IU／ml）と混合したのち、２５μlのＣaＣl2（２５mM）および２５μlのPathromtin(R)(Dade Behring GmbH）を加えた。３７℃において０、３、１０および２０分間インキュベートしたのち、４００μlのアプロチニン（５００KIU／mg）を添加して反応を停止させた。アプロチニンを最初に添加したサンプルを対照として用いた。
【００５８】
各サンプルをｔｒｉｓ緩衝液／ＢＳＡに希釈した。各場合、この溶液５０μlを因子試薬［主としてＦIXａ、ＦXおよびトロンビンインヒビターからなり、Cosmatic(R)ＦVIIIテスト、Chromogenix AB に従って改変］５０μlと混合し、３７℃において１０分間インキュベートした。５０μlの基質（たとえばＳ２７６５、Ｎ−ａ−Ｃbo−Ｄ−Ａrg−Ｇly−Ａrg−pＮＡ）を加えてたのち、既定時間のインキュベーション後に５０μlの酢酸（５０％）を添加して反応を停止させ、ついでＯＤ405nmを測定した。ＦVIIIの標準曲線を用いてサンプル中の濃度を決定した。
【００５９】
結果：
最初のアッセイでは、プロテアーゼをＦVIII（２IU／ml）とインキュベートする時間を一定（１０分）に保持したが、プロテアーゼの濃度は変動させた（０.１、１および１０μg／ml）。反応を停止させ、活性なＦVIIIの残留濃度を測定した。プロテアーゼ濃度が上昇すると、それに対応してＦVIIIは不活性化された（図１）。
サンプルのプロテアーゼ含量は適当な標準曲線を用いて定量化できる。
第二のアッセイではプロテアーゼの濃度を一定に保持して（１０μg／ml）、ＦVIII（２IU／ml）とインキュベーション時間を変動させた。活性なＦVIIIの残留濃度の著しい低下がインキュベーション時間の延長とともに認められた（図２）。
【００６０】
実施例５
第V因子の活性に対する「ＦVIIアクティベーター」の影響を検討した。
２５μlのプロテアーゼ含有溶液（０〜１００μg／ml）を５０μlのＦV（５IU／ml）および２５μlのＣaＣl2 とインキュベートし（０〜２０分）、ついで１００KIU／mlのアプロチニンを含む緩衝液４００μlを加えた。
いずれの場合も、各１００μlのインキュベーションアッセイをついで１００μlのＦV欠乏血漿と３７℃で１分間インキュベートし、次に２００μlのThromborelＳ(R)を加えて混合し、Schnitger & Gross 血液凝固計で血液凝固時間を測定した。ＦVの残留活性を決定した。
結果：
【表４】
この実施例では、ＦVがプロテアーゼによって経時的に不活性化されたことが証明される。
【００６１】
実施例６
「ＦVIIアクティベーター」のいわゆる包括的試験における血液凝固時間に対する影響を、Schnitger & Gross 血液凝固計を用いて検討した。掲げた差の値は、すべてこの量で短縮された血液凝固時間に相当する。
【００６２】
ＮＡＰＴＴ（非活性化部分トロンボプラスチン時間）
プロテアーゼ含有溶液を緩衝液で１００、３０、１０および３μg／mlに希釈した。これらの溶液それぞれ１００μlを、１００μlの加クエン酸血漿（標準血漿プールまたは個々のドナーから）および１００μlのPathromtin(R)と３７℃で２分間インキュベートし、ついで１００μlの２５ｍＭ ＣaＣl2を加え、ついで血液凝固時間を測定した。これらの測定値とプロテアーゼに代えて緩衝液を用いて得られた相当する血液凝固時間の間の差を求めた。
【表５】
ＦVIIアクティベーターの添加はＮＡＰＴＴの濃度依存性の短縮を生じた。
【００６３】
血漿カルシウム再沈殿時間
プロテアーゼ含有溶液を緩衝液で１００、３０、１０および３μg／mlに希釈した。これらの溶液それぞれ１００μｌを、１００μlの加クエン酸血漿（標準血漿プールまたは個々のドナーから）と３７℃で１分間インキュベートし、ついで１００μlの２５ｍＭ ＣａＣｌ2を加え、ついで血液凝固時間を測定した。これらの測定値とプロテアーゼに代えて緩衝液を用いて得られた相当する血液凝固時間の間の差を求めた。
【表６】
【００６４】
ＰＴ（プロトロンビン時間）
プロテアーゼ含有溶液を緩衝液で１００、３０、１０および３μg／mlに希釈した。これらの溶液それぞれ１００μlを、１００μlの加クエン酸血漿（標準血漿プールまたは個々のドナーから）と３７℃で１分間インキュベートし、ついで２００μlのThromborelＳ(R)（Dade Behring GmbH）を加え、ついで血液凝固時間を測定した。
これらの測定値とプロテアーゼに代えて緩衝液を用いて得られた相当する血液凝固時間の間の差を求めた。
【表７】
【００６５】
実施例７
「ＦVIIアクティベーター」のプラスミノーゲンアクティベーター活性化作用を一本鎖ウロキナーゼ（scuＰＡ）および一本鎖ｔＰＡ（sctＰＡ）を使用して検討した。
アッセイ：
０.１ml ＰＡ溶液（20μg／mlのscuPAまたは100μg／mlのsctPA）
＋０.１ml 試験緩衝液または
試験緩衝液中１００Ｕ／mlのヘパリンまたは
試験緩衝液中２０ｍＭ ＣaＣl2
＋０.５ml 試験緩衝液
＋０.１ml プロテアーゼ／サンプル（濃度上昇；２〜10μg／mlのscuPAまた
は50〜200μg／mlのsctPA）
３７℃でインキュベーション
＋０.１ml 試験緩衝液中１００KIU／mlのアプロチニン
３７℃で２分間インキュベーション
＋０.１ml 基質Ｓ−２４４４（３mM）
対照としては、最初のインキュベーションの前に、プラスミノーゲンアクティベーター（ＰＡ）に代えてアプロチニンを最初に導入し、以下、各場合を通して同様に実施する。一方、ＰＡは、以後アプロチニンの代わりに添加するまで加えなかった。
測定値の差（Δ）ΔＯＤ405nmを光学的に測定した。得られた対照値をサンプル／プロテアーゼ値から差し引き、この方法で、ＰＡＡ活性によって生じたＰＡ活性を測定した（ｍＩＵ／分）。
【００６６】
結果：
scuＰＡの活性化（20μg／mlのscuPA、２〜10μg／mlの「ＦVIIアクティベーター」）
【表８】
表は、scuＰＡが「ＦVIIアクティベーター」の濃度およびインキュベーションの長さに依存する様式で活性化される事実を例示する。同時に、ヘパリンおよびカルシウムの両者がプロテアーゼによってもたらされたＰＡの活性化に刺激作用を示した。
【００６７】
scuＰＡの活性化（100μg／mlのsctPA、50〜200μg／mlの「ＦVIIアクティベーター」
）
活性化ｔＰＡの代謝回転速度はｔＰＡプロ酵素に比較して係数３〜４まで上昇するにすぎない（ｕＰＡの場合は係数１０００〜１５００上昇する）ので、分析可能な測定シグナルを得るために、２種の共反応物質の高い濃度を選択しなければならなかった。
【表９】
表は sctＰＡもプロテアーゼの濃度およびインキュベーション時間に依存する様式で活性化されたことを証明する。ヘパリンおよびカルシウムイオンの両者が「ＦVIIアクティベーター」のＰＡの活性化能力に対して刺激作用を示した。
【００６８】
実施例８
２種のＦVIII含有溶液、一方はフォン・ヴィルブラント因子を本質的に含まず、他方はｖＷＦを含有する溶液を上述のプロテアーゼとカルシウムの存在下にインキュベートした。予め定められた時間後に、色素原試験によって残留ＦVIII活性を測定し、プロテアーゼを含まない対照アッセイと関連させた。
【００６９】
このためには、０.１IU／mlのＦVIIIを含有する溶液２５μlを同容量のプロテアーゼ溶液（μg／ml）で処理し、全体を２５μlのＣaＣl2（２５mM）と混合した。０、５、１０および２０分間３７℃でインキュベートしたのち、プロテアーゼの蛋白分解活性を停止させるために各場合、２００KIU／mlのアプロチニンを含有する溶液４００μlで処理した。
予備実験では、アプロチニンのこの濃度はいかに記述するＦVIII活性試験（アッセイ１＋３）に有意な干渉作用をもたないことが示された。アッセイ２においては、プロテアーゼをＦVIIIと接触させる前にアプロチニンとインキュベートし、ついで上述のように操作した。
【００７０】
いずれの場合も、５０μlの停止したサンプル（またはさらに希釈後）をついで主としてＦIX、ＦXおよびトロンビンインヒビターからなる、いわゆる因子試薬で処理し、３７℃において１０分間インキュベートした。活性化ＦXによって切断される色素原基質５０μlの添加に続いて５分間インキュベートしたのち５０μlの酢酸（５０％）を添加して反応を停止させ、ついでΔＯＤ405nmを測定した。ＦVIII活性（mIU）は、ＦVIII濃縮物から調製し、テストに包含された希釈系列を用いて構築した標準曲線を利用して確認した。
【００７１】
ＦVIII活性はプロテアーゼを添加しなかった対照に対する百分率で示す。
結果：
【表１０】
ＣaＣl2（この場合は６.２５ｍＭ）の存在下には、ＦVIIIはプロテアーゼにより、インキュベーションの長さに依存した様式で不活性化された。ｖＷＦは、プロテアーゼによる不活性化からＦVIIIを保護しなかった。ＦVIIIと接触させる前にアプロチニンでプロテアーゼを阻害すると、前者の不活性化は防止された。
【００７２】
実施例９
このシリーズの実験では、実施例１／アッセイ１を実施したが、この場合は、プロテアーゼとＦVIIIの混合物中のカルシウム濃度を変動させた。このためには、ＣaＣl2をカルシウム保存溶液から図３に示す最終濃度まで添加した。
結果：
アッセイ中のカルシウム濃度を１ｍＭ未満に低下させると、これらの条件下に約５０％のＦVIIIが残留する。０.５ｍＭ未満のカルシウムでは残留百分率は６０％以上である（図１）。
【００７３】
実施例１０
「ＦVIIアクティベーター」のいわゆる包括的試験における血液凝固時間に対する影響を血栓弾性記録法によって検討した。
関連血餅の剪断弾性または強度の変化を、Hilgard TEGメーター（Helligeより）を用いて連続的に記録した。いわゆるｒおよびｋ値、それぞれ血液の停止の開始からおよび血液凝固反応の開始からの時間であり、加クエン酸血漿の場合にはＴＥＧ曲線までの再カルシウム沈殿の時間は１mmまで広がり、ｒ値の終点から曲線までの時間は２０mmに広がった（血餅形成時間）。
【００７４】
このためには、５例のドナーからの血液または血漿の１５０μlのアリコートを各場合、測定キューベット中３７℃で２分間インキュベートし、ついで５０μlのサンプル（プロテアーゼ）を加え混合した。１００μlの２５ｍＭ ＣaＣl2を加え、反応を開始させた。アッセイ中「ＦVIIアクティベーター」の終濃度は１５μg／mlであった。ｒ時間の短縮をサンプルに代えて緩衝液を含有するアッセイに関して測定した。
結果：
【表１１】
【００７５】
この実施例は、ほとんどすべての場合、プロテアーゼの添加は血液凝固時間の著しい短縮を起こすことを明らかにするものである。ここに示した例では「ＦVIIアクティベーター」のフィブリン溶解作用はバックグランド中に隠れてしまっていた。この理由は「正常対象」では血漿中のプラスミノーゲンアクティベーターの濃度がナノグラムの領域にあり、インビトロでの血液凝固試験には全く影響しないからである。
【００７６】
実施例１１
プロテアーゼのＦVIII副経路活性は以下の実験的アッセイによって証明された。すなわち、測定技術として血栓弾性記録法を用いた。ｒ時間を評価した（実施例１０参照）。全血サンプルを、天然のＦVIIIインヒビターの存在を刺激するために、そのＦVIII活性阻害作用が分かっているモノクローナル抗体（ＦVIIIに対する抗体）とインキュベートした。サンプルを全血サンプル対照（Ｍａｂに代えて緩衝液）と比較した。プロテアーゼのＦＥＩＢ活性を、Ｍａｂによって阻害された全血サンプルにプロテアーゼ（終濃度１７μg／ml）を加えて試験した。さらにサンプルにプロテアーゼを加え、プロテアーゼ自体のｒ時間に対する影響を測定した。
【００７７】
結果：
【表１２】
抗−ＦVIII ｍＡｂによって引き起こされるｒ時間の延長はこの場合もプロテアーゼの存在により正常化され、これはプロテアーゼのＦＥＩＢ活性を例示するものである。既に上に証明したように、プロテアーゼそれ自体は血液凝固時間を短縮した。
【００７８】
実施例１２
５０μg／mlのＦVII活性化プロテアーゼを含有する溶液に、以下の物質を相当する終濃度になるように加えた。
２５ｍＭ クエン酸ナトリウム
２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ
１００ｍＭ アルギニン
０.７５ｇ／ml スクロース
この溶液を部分に分割し、各場合、アリコートを５.０〜８.６の様々なｐＨ値に調製し、ついで６０℃に１０時間加熱した。
加熱したプロテアーゼ溶液の活性は色素原試験により測定し色素原基質Ｓ２２８８（Ｈ−Ｄ−Ｉle−Ｐro−Ａrg−pＨＡ×２ＨＣl、Chromogenix AB，Sweden）の経時的なアミド分解を記録した。この活性は加熱しないで平行して測定されたアリコートの百分率として表示した。
【００７９】
結果：
【表１３】
この一連の実験は、特に酸性のｐＨ範囲における安定化はプロテアーゼの不活性化を著しく低下させた。ｐＨ５.５におけるわずかな「ブレークスルー」はこの範囲にプロテアーゼの等電点があるという事実によって説明できる。クエン酸ナトリウムは好ましいｐＨ範囲で起こる＞５０％の活性の喪失を防止する。
【００８０】
実施例１３
ｐＨ６.１におけるアッセイ（実施例１）はプロテアーゼの最良の安定化を示した。したがって、様々な活性を実施例１に記載のようにｐＨ６.０で試験して評価した。
以下の終濃度をセットし、プロテアーゼの濃度は５０μg／mlとした。
５０ｍＭ クエン酸ナトリウム／５０ｍＭ ＮaＣl、ｐＨ６.０
０.７５ｇ／mlのスクロース
１００ｍＭのグリシン
１００ｍＭのアルギニン
【００８１】
結果：
【表１４】
スクロースおよび各場合１種のアミノ酸の添加によってプロテアーゼの著しい安定化が証明された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は血液凝固第VII因子の活性化のためのプロテアーゼ、それを単離、検出および不活性化する方法ならびにこのプロテアーゼからなる医薬製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液凝固系は、血漿中に存在する血液凝固因子を活性化する２つの異なるカスケード様経路から構成される。その誘導機構によって、内因系または外因系経路が血液凝固の開始に優先的に使用される。
【０００３】
組織が傷害された場合、トロンボプラスチン（組織因子、ＴＦとリン脂質）が外因性凝血経路のスターターとして冒された細胞により暴露される。膜局在性のトロンボプラスチンは、血液凝固第VII因子（ＦVII）および循環する、活性化ＦVII（ＦVIIａ）の両者を結合することができる。カルシウムイオンおよび脂質の存在下に、このＴＦ−ＦVIIａ複合体はＦＸの結合を招き、これは限定された蛋白分解によってその活性化型（ＦＸａ）に変換される。続いてＦＸａはプロトロンビンを活性化してトロンビンを形成させることにより、フィブリンの形成を招来し、それによって最終的に創傷の閉鎖が起こる。
【０００４】
トロンボプラスチン結合ＦVIIの更なる活性化は最初は自触反応によって起こるが、特に、凝血カスケードの開始後には、それはＦＸａおよびトロンビンによって支持され、特に反応カスケードの著しい強化を招くことになる。
【０００５】
ＦVIIａまたはＦVIIａ含有濃縮物の投与はある種の臨床状態に適用されている。たとえば、血友病Ａに冒されＦVIII投与の結果としてＦVIIIに対する抗体が発生している患者では、ＦVIIａのいわゆるＦVIII副経路活性（ＦＥＩＢＡ）が用いられる。現時点で分かっている所見によれば、ＦVIIａはこの関係で十分な耐容性を有し、それは血栓傾向を生じることはなく、限られているが適切な程度の凝血が起こることを保証するのに適している。組換えＦVIIａは既に治療的におよび予防的に使用されている。血漿から単離されたＦVIIはまた、活性化されてから用いることもできる。トロンビンのようなプロテアーゼをこの活性化に使用できるが、しかしながら、これらのプロテアーゼは、それら自体凝血を強力に活性化することが可能で、血栓の危険を招くことがある。この理由から、以後のトロンビンの除去または不活性化が必要であり、損失を生じることになる。それに伴う血栓の危険の結果として、多くの場合、ＦＸａもしくはＦIIａ（トロンビン）の使用は禁忌とされ、緊急時、たとえば血液の著しい喪失および止血不能の出血の関連でのみ適用される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＦVIIａは、健康人の血漿中にはきわめて低濃度でしか見出されない。血液中を循環するＦVIIａの形成および起源についてはこれまでほとんど知られていない。細胞の破壊に伴って発現または放出された痕跡のトロンボプラスチンはこの関連である役割を果たしている可能性がある。第XIIａ因子は、たとえばある種の条件下にＦVIIの活性化を生じることが知られているが、この反応の生理学的な関連はまだ明らかにされていない。
【０００７】
驚くべきことに今回、従来知られているすべてのプロテアーゼとは異なるＦVII活性化プロテアーゼが、ヒト血漿およびある種のプロトロンビン複合体濃縮物の分画に関連し発見された。このプロテアーゼの検討から、それは ChromogenixAB，Swedenからのペプチド基質Ｓ２２８８（ＨＤ−イソロイシル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニン−ｐＮＡ）に対して特に高いアミド分解活性を示すことが示された。このプロテアーゼの特殊な性質は、そのアミド分解活性がアプロチニンによって効果的に阻害されることである。他のインヒビター、たとえばアンチトロンビンIII／ヘパリン複合体もその阻害に適している。他方、その活性はヘパリンおよびヘパリン関連物質たとえばヘパリン硫酸またはデキストラン硫酸およびカルシウムイオンにより上昇する。最後に、このプロテアーゼは、時間およびその濃度に依存する様式でＦVIIをＦVIIａに変換できることが見出された。この反応もアプロチニンによって阻害される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明の主題の一部は、
ａ）アプロチニンの存在によって阻害され、
ｂ）その活性はカルシウムイオンおよび／またはヘパリンもしくはヘパリン関連物質によって上昇し、そして
ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、以後の非還元状態での染色では分子量５０〜７５ｋＤａの範囲に１個もしくは２個以上のバンドを示し、還元状態では分子量４０〜５５ｋＤａに１個のバンドならびに分子量１０〜３５ｋＤａの範囲の１個もしくは２個以上のバンドを示す、
血液凝固第VII因子を活性化するプロテアーゼである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】プロテアーゼとＦVIIIを一定時間インキュベートした場合のプロテアーゼ濃度とＦVIIIの不活性化を示す。
【図２】プロテアーゼ濃度を一定とし、ＦVIIIを様々な時間インキュベートした場合のＦVIIIの不活性化を示す。
【図３】プロテアーゼとＦVIIIを混合物中におけるカルシウム濃度を変動させインキュベートした場合のＦVIIIの不活性化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下の明細書においては、そのプロテアーゼの活性化型を「プロテアーゼ」と呼び、非活性化型を「プロ酵素」と呼ぶ。
【００１１】
このプロテアーゼについてさらに検討し、濃縮または単離後には急速な活性の喪失を受け、それは２０ｍＭ ｔｒｉｓ、０.１５Ｍ ＮａＣｌを含有するｐＨ７.５の溶液中で観察された。濃度０.１％のアルブミンの添加も、このプロテアーゼの活性が室温で１時間後に５０％まで低下するのを防止することはできなかった。他方、５０ｍＭのクエン酸ナトリウムによりｐＨ６.５に緩衝化した溶液中では、このプロテアーゼのきわめて良好な安定化が観察された。溶液をｐＨ４〜７.２好ましくはｐＨ５.０〜７.０に調整すると、プロテアーゼ溶液に特に安定剤を加えなくても活性の喪失は全くまたはきわめてわずかしか認められなかった。しかしながら、溶液には安定化剤を添加することが得策であり、適当な安定剤としてはクエン酸塩のほかに、特にグルタメート、アミノ酸たとえばアルギニン、グリシンまたはリジン、カルシウムイオンおよび糖たとえばグルコース、アラビノースまたはマンノースの１〜２００mmol／L好ましくは５〜１００mmol／L量を挙げることができる。有効な安定化は、グリコールたとえばエチレングリコールまたはグリセロール５〜８０重量％の添加によっても達成され、好ましくは１０〜６０重量％が使用される。その場合、安定化された溶液のｐＨ値は４〜９でなければならない。
【００１２】
新規なプロテアーゼ、および同じくそのプロ酵素は、組換えＤＮＡ法、またはたとえば適当なトランスジェニック動物の乳汁中における産生によって得られ、特に血漿もしくはプロトロンビン複合体（ＰＰＳＢ）濃縮物の分画化によって得ることができる。出発原料をついで最初に陰イオン交換クロマトグラフィーに付し、続いて、溶出液の親和性クロマトグラフィーを行う。親和性クロマトグラフィーにはマトリックス上に固定化されたヘパリンまたはヘパリン関連物質たとえばヘパリン硫酸またはデキストラン硫酸が特に適している。このようなクロマトグラフィー法を用いた場合、新規なプロテアーゼおよび／またはプロ酵素は選択的に結合され、ついで既知の方法を用いて再び溶出することができる。マトルックスにリガンドをカップリングするためには、スペーサーの使用を推薦できる。新規プロテアーゼの単離にはヘパリン−リジンマトリックスが特に適していることが見出されている。
【００１３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続く染色では、この方法によって単離されたプロテアーゼは、非還元状態において、分子量５５〜７５ｋＤａの範囲の互いに接近した存在する１個から数個のバンドを示す。還元後には、分子量１５〜３５ｋＤａの範囲に１個から数個のバンドが観察され、１個のバンドが４０〜５５ｋＤａに観察された。６０〜６５ｋＤａのさらに１個のバンドは、走査および定量的評価後、総タンパク質の５〜１０％を構成し、非活性化プロ酵素も存在することが示された。この結果は、このプロテアーゼに対するモノクローナル抗体を使用する適当な検討によって支持された。したがって、このプロテアーゼのプロ酵素もまた、本発明の方法により調製し、滅菌し、使用することができると結論された。本発明の主題の一部は、したがって、血液凝固第VII因子を活性化するプロテアーゼのプロ酵素である。プロ酵素の比率は６０〜６５ｋＤａのバンドにより指示される。プロ酵素の適当な生理学的アクティベーターの例は、それらの基質特異性に応じて、プロ酵素、トロンビン、カリクレインまたはＦVIIａの活性化領域を構成するアミノ酸配列に相当する。
【００１４】
上述した新規なプロテアーゼの性質の一部、すなわちそれが血漿または血漿に由来するプロトロンビン複合体（ＰＰＳＢ）濃縮物から単離できるという事実、そのアミド分解活性のアプロチニンによる阻害ならびに還元および非還元状態の両者でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける上述の泳動挙動は、Hunfeldら（Ann．Hematol．1997，74：A87，113；Ann．Hematol．1998，76：A101，P294 および Etscheidら，Ann．Hematol．1999，78：A42）によって詳細は定義されていないＰＰＳＢ濃縮物から単離されたプロテアーゼを想起させる。その場合は、調製は主としてアプロチニンマトリックスを用いて達成された。ある種のペプチド基質のアミド分解による切断の結果として、活性はトロンビン様活性と記述されている。Hunfeld らは包括的な血液凝固パラメーターたとえばプロトロンビン時間、クウイックまたは血小板凝集に対する影響は全く見出していない。
【００１５】
Hunfeldらにより記載されたプロテアーゼのＮ末端配列決定は、そのｃＤＮＡがChoi−Miuraら（J．Biochem．119：1157−1165，1996）により報告されたタンパク質の場合と一致を示す。その一次構造では、相当するタンパク質が肝細胞増殖因子活性化酵素（ＨＧＦＡ）と命名されている酵素とホモロジーを示す。
【００１６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥから還元条件下に単離された２つのバンドをＮ末端配列決定に付し、以下の一致が確立された。
バンドの分子量範囲 アミノ酸配列 報告者
１０〜３５kDa IYGGFKSTAGK 本発明
３０kDa IYGGFKSTAG Hunfeldら
１７kDa IYGGFKSTAGKH Choi−Miuraら
４０〜５５kDa LLESLDP 本発明
５０kDa SLDP Hunfeldら
５７kDa SLLESLDPWTPD Choi−Miuraら
一致は他の試験結果たとえば基質特異性および阻害される活性の能力にも見出される。
それにもかかわらず、現時点ではこれらのタンパク質が同一であるとの推定はなお不可能である。いずれにしても、以前に研究された上述のタンパク質にはＦVIIａまたは他の因子の活性化の性質をもつことは報告されていない（下記参照）。
【００１７】
その上述の性質に基づいて、その新規なプロテアーゼは診断的におよび治療的に使用することができる。
【００１８】
１．新規なプロテアーゼを用いる試験システム
新規なプロテアーゼは試験試薬中に診断的に使用することができる。すなわち第VII因子の存在は新規なプロテアーゼの添加により血液凝固試験において定性的および定量的に決定することができる。
【００１９】
それとは逆に、ＦVIIの活性化を測定するために開発されたこの試験システムはプロテアーゼの検出および定量にも使用することができる。このためには、プロテアーゼを含有する溶液をＦVII含有溶液と混合し、適当なインキュベーション時間後に生成したＦVIIａの両を定量する。これは、たとえば Staclot(R)ＦVIIａ−ｒＴＦテスト（Stago／Boehringer Mannheim）を用いて実施できる。好ましい操作を用いた場合は、この試験は供給されるＦVIIの濃度には限定されない。総タンパク質の比率の型でのプロテアーゼ量を知る場合には、その比率は：
−純粋なプロテアーゼプレパレーション中、キエルダール法または本技術分野の熟練者には周知の他のタンパク質のアッセイ法により、または
−たとえば特異的な抗体に基づく抗原試験および適当な免疫化学的測定方法たとえばＥＬＩＳＡを用いて決定することが可能であり、ついでプロテアーゼプレパレーションの比活性を相当する様式で測定することができる。
【００２０】
驚くべきことに、プロテアーゼの特性の更なる解明に伴い、付加的な測定を可能にする性質が新たに見出された。上記プロテアーゼと血液凝固VIII／VIIIａおよびV／Vａ因子のインキュベーション、それに続く定量に関連して、上記血液凝固因子はプロテアーゼ濃度およびインキュベーションの長さには無関係な様式で不活性化されることが明らかにされた。
【００２１】
本発明の主題の他の一部は、したがって、血液凝固第VII因子を活性化するプロテアーゼを定性的および定量的に検出する新規な試験システムであり、このシステムにおいては、プロテアーゼは血液凝固第VIII／VIIIａまたはV／Vａ因子を不活性化するその活性によって定量することができる。この試験システムは、プロテアーゼを含有する溶液を第VIII／VIIIａまたはV／Vａ因子とインキュベートして、残留した第VIII／VIIIａ因子の量または残留した第V／Vａ因子の量を慣用の活性試験によって測定し、ついでこれからプロテアーゼの量を標準曲線との比較により決定する操作に基づくものである。この試験の実施に際し、プロテアーゼ活性のインキュベーションを予め定められた時間、限られた量のアプロチニンの添加によって阻害すると、これらの濃度では試験システムの以後の測定に影響しないという利点がある。その後、血液凝固因子の残留活性を本技術分野の熟練者に周知の試験方法で測定する。このためには、主として第IXおよびX因子を含有し、得られたＦＸａの量をトロンビンインヒビターの存在下に色素原基質の変換により定量するいわゆる Coamatic(R)第VIII因子テスト（Chromogenix AB）を使用可能にする点で（〔０００７〕の記述参照）、特に試験システムの価値が証明されている。一方、この量は、ＦVIIまたはＦVIIａの量に比例する。ついで、残留するＦVIII活性を決定すれば、存在するプロテアーゼの濃度を帰納することが可能になる。
【００２２】
蛋白分解作用によるＦVIII／ＦVIIIａまたはＦV／ＦVａ因子の分解は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって明瞭に証明できる。プロテアーゼをたとえばＦVIII濃縮物とインキュベートした時間に依存して、ＦVIIIに典型的なバンドは消失し、一方、他の新しいバンドが発生し、または弱いバンドの強度が増大する。したがって、プロテアーゼの活性はまた、バンドの減弱または増強を定量することにより関連づけることが可能で、その結果、たとえばプロテアーゼ標品を用いて定量的に測定することができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図におけるバンドの強度、または他の電気泳動法によるバンドの強度の変化を、本技術分野の熟練者には周知のたとえばスキャナーおよび適当なプログラムを用いて定量することができる。これに加えて、上記血液凝固因子に対する抗体はウエスタンブロットに使用可能であり、また上述の方法における評価に採用することができる。減弱したバンドまたは、特に発生したバンドを特異的に検出する抗体が特に適している。これに関連して、これらの抗体は他の免疫化学的試験、たとえばＥＬＩＳＡの確立にも使用することができる。
【００２３】
ＦVIII／ＦVIIIａの場合に記載された蛋白分解的不活性化はまた、ＦVIIIとある程度の構造的ホモロジーを示す第V／Vａ因子とプロテアーゼをインキュベートした場合にも観察される。分解は適当な活性試験システムおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロッティングにおいてモニターできる。
【００２４】
ＦＶおよびＦVIIIの不活性化にもかかわらず、今回、血液、血小板濃縮血漿または血漿へのプロテアーゼの添加は血液凝固時間を短縮すること、すなわち各種のいわゆる「包括的血液凝固試験」において卓越したプロコアギュラント活性を示すことが見出された。これらの試験システムは、たとえば、非活性化部分トロンボプラスチン時間（ＮＡＰＴＴ）、プロトロンビン時間（ＰＴ）およびカルシウム再沈着時間であると理解される。たとえばいわゆる血液凝固計において、血栓弾性記録計により、またはほかに色素原試験で測定されるこれらの時間の短縮化は、血液凝固促進物質の濃度と相関するので、サンプル中のその物質の濃度は、血液凝固時間の検量曲線を使用して逆に推論することができる。「ＦVIIアクティベーター」の濃度は同様、選択された包括的血液凝固試験を用いて決定することができる。
【００２５】
「ＦVIIアクティベーター」は同様に、単一鎖ウロキナーゼ（scuＰＡ、単一鎖ウロキナーゼプラスミノーゲンアクティベーター）、および単一鎖ｔＰＡ（sctＰＡ、単一鎖組織プラスミノーゲンアクティベーター）の効果的なアクティベーターをもたらすことができること、すなわちプラスミノーゲンアクティベーターアクティベーター（ＰＡＡ）として作用できることがまた驚くべきことに見出された。活性化ＰＡの活性はたとえば、色素原物質を用いて測定できる。すなわちこの性質は、したがって、「ＦVIIアクティベーター」の検出および定量化に使用することができる。プラスミノーゲンアクティベーターの活性化はまた、プラスミノーゲンの存在下、プラスミンそれ自身の形成によりまたはプラスミンによってもたらされるフィブリン凝血の溶解により、カップリング反応で決定することができる。
【００２６】
したがって、要約すれば、プロテアーゼはそれをＦVIIIまたはＦVIIIａを含有する溶液とインキュベートし、ついでＦVIII／ＦVIIIａの残留量を適当な活性試験により検出および定量の両者が可能であるということができる。同じ方法でＦVまたはＦVａをプロテアーゼとインキュベートし、ＦV／ＦVａの残留量をついで定量することができる。未知のプロテアーゼ濃度は試験に包含されるプロテアーゼの量の上昇を標準曲線と比較して定量的に決定することができる。様々な包括的血液凝固試験が同様に定量化に適当であり、プロテアーゼ濃度は凝固時間の短縮に基づいて検量曲線から読み取られる。プロテアーゼのＰＡＡ活性も定量の目的に使用することができる。
【００２７】
これらの試験の特徴は、ＦVおよびＦVIII不活性化ならびにＰＡＡ活性が適当な高濃度のカルシウム、好ましくは＞０.００１ｍＭ、特に好ましくは＞０.００５ｍＭをＣaＣl2の形で存在させると、特に良好に発揮されることである。上述のように、ヘパリンおよびヘパリン様物質の両者およびカルシウムもプロテアーゼ活性を上昇させる直接的な色素原アッセイの場合とは対照的に、ＦV／ＦVIIIの不活性化はヘパリンによっては促進されないか、または有意ではない促進が認められるにすぎない。これに反し、ＰＡＡ活性はいずれの物質の存在でも、すなわちカルシウムおよび／またはヘパリンもしくはヘパリン様物質によって刺激される。
【００２８】
プロテアーゼ誘導反応は、プロテアーゼをインヒビター特にヘパリンまたはヘパリン様物質の存在下（好ましくはヘパリンの存在下）アンチトロンビンIII、Ｃ1−エステラーゼインヒビター、α2−アンチプラスミン、インターα−トリプシンインヒビターまたは既知の低分子量プロテアーゼインヒビターたとえば商品名ＦＯＹ(R)として入手できるグアニジノカプロン酸−ｐ−エトキシカルボニルフェニルエステルとインキュベートすることによってきわめて効率的に減弱または防止することができる。これらの物質は、したがって、たとえばインキュベーション時間を正確に決定するため、または試験の特異性をさらに上昇させる目的で、反応を停止させるために使用することができる。混合物中の遊離のカルシウムイオンをたとえばキレート剤で減少させると、この目的に使用することもできる。
【００２９】
２．第Vおよび第VIII因子の安定化されたプレパレーション
血液凝固第Vおよび第VIII因子に対する新規プロテアーゼの蛋白分解活性に関する上述の観察からプロテアーゼ活性の阻害またはその活性の減弱の課題が、生成の喪失および、多分妨害性タンパク質のフラグメントと考えられる断片の形成を回避するために生じる。これはすべて、ＦVおよびＦVIIIが血漿より得られた寒冷沈殿物からカルシウムイオンの存在下に通常調製され、後者はタンパク質のコンフォーメーションの維持に要求されることから、益々重要である。
【００３０】
本発明の主題の他の部分は、したがって、血液凝固第VII因子を活性化するプロテアーゼが阻害されるとい事実の結果としての蛋白分解により形成された第Vおよび第VIII因子フラグメントを含まないＦVまたはＦVIIIの安定化されたプレパレーションである。さらに詳細な検討によって、上記プロテアーゼによる第Vおよび第VIII因子の不活性化は特に０.５ｍＭ以上の濃度のカルシウムイオンの存在下において効率的に起こることが示されたことから、血液凝固第VII因子を活性化するプロテアーゼの阻害のために第Vまたは第VIII因子プレパレーション中のカルシウムイオンの濃度を１.０ｍＭ未満、好ましくは０.５ｍＭ未満に調整すると第Vおよび第VIII因子のプレパレーションを効率的に安定化することができる。プロテアーゼの第Vおよび第VIII因子不活性化作用はこれらの濃度で著しく低下するが、カルシウムイオンの量はＦVおよびＦVIII分子のコンフォーメーションを安定化するのになお十分である。上述のカルシウムイオン量は、単に最終製品においてのみではなく、寒冷沈殿物自体および以後の精製工程でも過剰になってはならない。
【００３１】
プロテアーゼまたはプロ酵素のヘパリンおよびヘパリン様物質に対する上述の親和性により、プロテアーゼ／プロ酵素はＦVIIIまたはＦV含有溶液から、固定化ヘパリンまたは他の免疫性もしくは親和性吸着物質とインキュベートすることによって除去できる。免疫性吸着物質の調製に有用なポリクローナルまたはモノクローナル抗体、それぞれの抗体フラグメントは本技術分野において既知の技術により、プロテアーゼまたはプロ酵素の全体または部分を抗原として用い、容易に入手することができる。
【００３２】
しかしながら、ＦVまたはＦVIIIの蛋白分解を防止するためには、カルシウムイオン量の低下に加え適宜、天然または合成プロテアーゼインヒビターを使用することもできる。アプロチニン、α2−アンチプラスミン、Ｃ1−エステラーゼインヒビターまたはインタートリプシンインヒビターのような蛋白質もインヒビターとして使用できる。本技術分野の熟練者には合成セリンプロテアーゼインヒビターとして知られている低分子量物質もこれに関連して使用することができる。阻害強度がヘパリンまたはヘパリノイドによって上昇するアンチトロンビンIIIのようなインヒビターも同様に添加できる。すなわち、ヘパリンはそれ自身、小色素原物質に対するプロテアーゼのアミド分解活性を増大できるが、それはＦV／ＦVIIIの不活性化を支持しないことが驚くべきことに見出された。
【００３３】
３．新規プロテアーゼからなる医薬
新規なプロテアーゼおよび／またはプロ酵素は治療的に用いることができる。
それらはそれら単独、またはプロテアーゼの活性を増大させる物質、たとえばヘパリンまたはヘパリン関連物質、たとえばヘパリン硫酸、および／またはカルシウムイオンとともに使用することができる。この薬剤にはさらに、第VII因子を同様に添加することも可能である。そのＦVIII副経路活性（ＦＥＩＢＡ）を利用するこのような薬剤の使用は、たとえば、ＦVIIIおよび／またはＦIXおよび／またはＦXIおよび／または接触相タンパク質たとえばＦXIIに対してたとえば抗体の存在のために耐容性が存在する場合、または他のタイプの欠損状態が存在する場合に適用することができる。この関連で、ＦVIIはインビトロ、血漿中、濃縮分画中のいずれかまたは精製ＦVII上に対する作用により活性化することができる。また、新規な血液凝固剤は、全身性の出血の予防のためまたは出血を停止させるためにエキソビボで使用することも可能である。
【００３４】
他方、アプロチニンまたは上述のインヒビターによる新規プロテアーゼの観察された阻害は、プロテアーゼインヒビターからなり血液を凝固させる能力が減弱した薬剤の開発に使用できる。これに加えて、新規なプロテアーゼはまた、それらのプロテアーゼ阻害作用によって血液凝固を損なう生理学的および非生理学的因子たとえば合成ペプチドを同定するためにも使用できる。特に効率的にトランスフォームされる色素原基質、たとえばＳ２２８８（詳細は上記参照）のペプチド配列はこのための構造的基盤として使用することができる。これらのプレパレーションが蛋白分解活性を含まない場合には、凝血プレパレーションに対する適当なインヒビターの添加が、それらの調製時にも必要なことがある。
【００３５】
プロテアーゼの特性がさらに解明されるに伴い、いわゆる「第VII因子アクティベーター」プロテアーゼとしての付加的用途の可能性を開く性質が発見された。一本鎖プラスミノーゲンアクティベーター、たとえば、プロウロキナーゼ（一本鎖ウロキナーゼ、sucＰＡ、一本鎖ウロキナーゼプラスミノーゲンアクティベーター）または sctＰＡ（一本鎖組織プラスミノーゲンアクティベーター）をインキュベートすると、「第VII因子アクティベーター」がこれらのプラスミノーゲンアクティベーター（ＰＡ）の活性化をもたらす。これに関連して、一本鎖ＰＡの蛋白分解には限界があり、二重鎖プロテアーゼの形成を生じ、これは特にプラスミノーゲンの活性化に適している。生成したプラスミンはフィブリン溶解のエフェクター、すなわち血栓の溶解に関与する生理学的システムである。プロウロキナーゼまたはｔＰＡのようなＰＡは、必要に応じて放出され、また既知のようにプラスミンまたはカリクレイン（scuＰＡ）によって活性化される内因性タンパク質である。健康状態においてscuＰＡが活性化される機構は、まだ完全には解明されていない。
【００３６】
プラスミノーゲンアクティベーターは，血栓性疾患または併発症たとえば大腿静脈血栓症、心筋梗塞または卒中に関連した医薬製剤中において、単離もしくは組換えによって調製されたタンパク質として治療的に使用することができる。
【００３７】
今回発見された「第VII因子アクティベーター」の性質により、後者はプラスミノーゲンアクティベーターたとえばウロキナーゼまたはsctＰＡのインビボまたはエキソビボ活性化に使用することができる。この活性はまたこのプロテアーゼを、特に一本鎖または二本鎖プラスミノーゲンアクティベーターまたは抗凝固剤と組合わせて同様に、血栓塞栓性疾患の予防または治療のための使用に適用できる。この使用の可能性は、プロテアーゼがまたプロコアグラント様式で作用できる事実と矛盾しない。２つの反応のどちらが優先するかの問題は生理学的物質の利用性によって多分解決される。現時点での知識によれば、第VII因子は血漿中で中程度に活性化されて、突然の血管障害に直ちに対処できるようにある濃度に絶えず維持されている。他方、組織プラスミノーゲンアクティベーターならびにウロキナーゼプラスミノーゲンアクティベーターは血漿１ml中にわずかナノグラム単位の量で存在するのみである。その濃度がプラスミノーゲンアクティベーターの分泌または合成によって上昇するのはフィブリンの沈着または血栓が起こった場合のみで、それらはついで、局所的に特にそれらが血栓に結合した場合に活性化されたのち、プラスミノーゲンを活性化して、それらの血栓溶解作用を発揮する。一本鎖ＰＡが存在する場合、特に局所的に限定された様式ではそれらの活性化がＦVIIの活性化を上回り、それにより生理学的状態への調整が可能になる。したがって、このプロテアーゼはまた止血を調整し、それによって先天的または後天的欠損状態の症例におけるプロテアーゼおよび／またはプロ酵素による置換に適用される可能性がある。
【００３８】
したがって本発明の主題の他の部分は、血液凝固第VII因子活性化プロテアーゼおよび／またはそのプロ酵素型の、フィブリン含有血栓を溶解するのに十分な量からなる医薬製剤である。この製剤はさらに、一本鎖プラスミノーゲンアクティベーター（ＰＡ）および／または抗凝固剤を含有させることもできる。プロ酵素が存在する場合には、上述の医薬製剤内にまたはそれとともに、適当な活性化剤を使用することも有利である。
【００３９】
「ＦVIIアクティベーター」のプラスミノーゲンアクティベーター増強作用は、特にカルシウムおよび／またはヘパリンおよびヘパリン様物質たとえばデキストラン硫酸によって促進されることが見出されたことから、さらに可溶性カルシウム塩および／またはヘパリンもしくはヘパリン様物質を含有する医薬製剤は、フィブリン含有血栓を本発明によって溶解するために有利に使用できる。これに関連して、プロテアーゼ／プロ酵素はその単独または一本鎖または二本鎖プラスミノーゲンアクティベーターと組合わせ、所望によりプロテアーゼに対して特定の親和性を発揮し、それによって血漿中半減期を延長する担体物質としてまたは表面へのメディエーターとしてその活性を増大させる物質とともに使用することができる。
【００４０】
血液凝固第VII因子活性化プロテアーゼからなる医薬製剤は、その特異的なフィブリン溶解作用により、フィブリン含有血栓によって引き起こされる疾患の処置に使用することができる。フィブリン溶解過程はまた創傷治癒過程に関与する。この関連で、上記プロテアーゼおよび／またはプロ酵素は、静脈内もしくは局部的、皮下、皮内または筋肉内あるいは傷害もしくは創傷の場合は局所的にまたは適当な担体マトリックスに結合させて投与することができる。体液たとえば血液または血漿から単離されたプロテアーゼ／プロ酵素および組換えまたは遺伝子導入により調製されたプロテアーゼ／プロ酵素はいずれもこの関連で使用できる。プロテアーゼ／プロ酵素はまた、いわゆるフィブリン接着剤の成分としても適当で、これにはアプロチニンのようなプロテアーゼ／プロ酵素を阻害する物質を含有してはならない。この場合、プロテアーゼの凝血短縮作用が利用される。
【００４１】
上記プロテアーゼ／プロ酵素は、先天性または後天性止血欠損、（汎発性）出血の発生、各種血栓関連併発症に使用することができる。出血の処置に使用する場合は、プロテアーゼ／プロ酵素をＦVIIIとともに、所望により、さらに他の凝血因子を付加することが有利である。
【００４２】
４．ＦVII活性化プロテアーゼを滅菌する方法
ヒト血漿から単離されたタンパク質であるから、新規なプロテアーゼおよび／またはそのプロ酵素は、予めウイルスを不活性化する処理に付した場合にのみ、医薬製剤として使用することができる。滅菌過程が特にウイルスの不活性化に最も重要な過程として認識されている。しかしながら、処理すべきタンパク質には約６０℃で１０時間までの過熱に適当な安定性が要求される。各タンパク質について至適な安定剤を別個に決定し、それらの濃度を至適化しなければならない。
新規なプロテアーゼおよび／またはそのプロ酵素の場合、滅菌は行わない溶液中のタンパク質を安定化する条件は既に上述した。この場合わずかに酸性のｐＨが特に有利なことが証明されている。しかしながら、これらの条件下に滅菌を行うと、新規なプロテアーゼおよび／またはそのプロ酵素では通常、元の活性の５０％以上が失われる。
【００４３】
新規なプロテアーゼおよび／またはそのプロ酵素からなる医薬製剤の滅菌は、プレパレーションを
ａ）ｐＨ範囲３.５〜８.０、好ましくはｐＨ範囲４.０〜６.８；
ｂ）添加した１種または２種以上のアミノ酸０.０１mol／L以上、好ましくは０.０５mol／L以上の存在下；および／または
ｃ）添加した１種の糖または異なる糖の組合わせ、総濃度０.０５ｇ／ml以上、好ましくは０.２ｇ／ml以上の存在下；および／または
ｄ）添加したカルシウムイオンと錯体を形成できる物質たとえばクエン酸、シュウ酸、エチレンジアミン四酢酸等１種または２種以上の存在下
に調製されると、至適な安定化結果が保証される。
【００４４】
添加物たとえばアルブミン、Haemaccel(R)、ヘパリンおよびヘパリノイド、グリセロール、グリコールおよびポリエチレングリコールを別個にまたは一緒に混合して使用することができる。滅菌が完了したのち、安定剤として添加した糖、アミノ酸および他の添加物は、本技術分野の熟練者には周知の方法を用いてプレパレーションから減量または完全に除去することができる。滅菌過程の結果は実施例１２および１３に示す。
【実施例】
【００４５】
実施例１
調製されたプロテアーゼによるＦVIIの活性化を、Staclot(R)ＦVIIａ−ｒＴＦテストシステム（Stago／Boehringer Mannheim）を用いて証明した。この検出システムは、予め形成された活性化ＦVII（ＦVIIａ）を外因系凝固経路の阻害にのみ使用できる特定の性質の（組換え）可溶性組織因子（ｒＴＦ）に基づくものである。これは、完全な組織因子を用いた場合とは異なり、ＦVIIａの実際の含有量を正確に決定することを可能にする。
【００４６】
単離されたＦVII（Enzyme Research Labs）を用いて活性化実験を行った。このＦVII自体はヒト血漿から単離されたために痕跡のＦVIIａを含んでいる。緩衝液で希釈して濃度をＦVII ０.０５IU／mlに調整した。ＦVIIを試験物質と室温で１０分間インキュベートし、ついで真のＦVIIａ含量を試験した。ＦVIIａ含量は平行して構築した標準曲線を用いて定量した。
【００４７】
本明細書には記載していない予備実験で、用いた濃度ではアプロチニンは調製されたプロテアーゼの活性を完全に阻害したが、ＦVIIａに直接の作用をもたず、ＦVIIａ−ｒＴＦテストシステムに有意な影響を示さないことが確認された。
以下に掲げる結果は、各場合、三重の測定に関する。すなわち、以下の実験は次のようにセットアップされた。
【００４８】
１．ＦVII：
対照アッセイとしては非活性化ＦVIIを使用した。これは、既に痕跡のＦVIIａを（上記参照）をＦVIIａ １０mIU／mlのオーダーで含有している。
【００４９】
２．ＦVII＋アプロチニン：
このアッセイでは、ＦVIIはアプロチニンの存在下にインキュベートし、ＦVIIａ自体は阻害されないことまたテストは用いたアプロチニンによって影響されないことを証明するために、ＦVIIａ−ｒＴＦアッセイを使用した。これは確認された（アッセイ１との比較で）。
【００５０】
３．プロテアーゼ＋ＦVII（インキュベート）ついでアプロチニンの添加：
結果：ＦVIIａ １８mIU／ml
この場合、プロテアーゼにはＦVIIａを活性化する時間を与えた。アプロチニンはプロテアーゼをそがいするために単に添加し、１０分間のインキュベーション後に行われた。得られたＦVIIａをＦVIIａ−ｒＴＦアッセイで定量した。すなわち、ＦVIIａの基底値（アッセイ１）を差し引くと、選択された条件下でのプロテアーゼの活性によってＦVIIａ ８mIU／mlが形成された。
【００５１】
４．プロテアーゼ＋アプロチニン、ついでＦVIIの添加：
結果：ＦVIIａ １１mIU／ml
このアッセイでは、プロテアーゼをＦVIIと接触させる前にアプロチニンで阻害した。以後のＦVIIとのインキュベーションでもまた続くＦVIIａの定量でも、有意なＦVIIａ含量の上昇は生じなかった（アッセイにおける変動の範囲、すなわち、アッセイ１における１１と１０mIU／mlは有意とはみなされない）。
【００５２】
５．プロテアーゼ：
結果：ＦVIIａ ０mIU／ml
このアッセイでは、選択された濃度においてプロテアーゼはそれ自体ＦVIIａ−ｒＴＦテストシステムに何ら影響を与えないことが証明された。
要約すれば、以上から
−記述したプロテアーゼはＦVIIを活性化する；
−プロテアーゼによるＦVIIの活性化は「直接」、すなわち、ｒＴＦの存在とは独立に起こる；
−ＦVIIの活性化はアプロチニンによって阻害される；アプロチニンそれ自体はテストシステムに何ら有意な影響は与えない；
と結論される。
【００５３】
実施例２
この実施例はプロテアーゼの濃度およびプロテアーゼがＦVIIとインキュベートされた時間とは独立の反応において、ＦVIIがいかにして活性化されるかを説明する。テストシステムおよび試薬は実施例１の記載に相当するように選択された。最初のシリーズの実験では、最初に導入されたＦVIIは様々な希釈度（１：５、１：１０および１：２０）のプロテアーゼ含有溶液とプレインキュベートし（室温５分）、ついでアプロチニン（プロテアーゼを阻害する）で処理し、続いて、そのＦVIIａ含量をＦVIIａ−ｒＴＦアッセイにおいて試験した。この場合も、プロテアーゼをＦVIIと接触させる前にアプロチニンによって阻害したアッセイを平行して行い、対照とした。
【００５４】
結果は活性化係数として与える。すなわち、上述の対照アッセイで測定された値のｘ倍に相当する。
アッセイ：プロテアーゼ＋ＦVII、インキュベーション、＋アプロチニン
対照：プロテアーゼ＋アプロチニン、インキュベーション＋ＦVII
【表１】
これから、ＦVIIはプロテアーゼにより、プロテアーゼの濃度に依存する様式で活性化されると結論される。
【００５５】
共反応物質の濃度を一定に保持した場合、ＦVIIはインキュベーションの長さとは独立の様式で、プロテアーゼによって活性化されることも同様に証明された。ＦVII ０.２IU／mlおよび１：１０−希釈プロテアーゼ溶液を含有する溶液の等容量を一緒にインキュベートした場合には、相当時間のインキュベーション後にアプロチニンを添加して(活性化を停止させるため)、以下のＦVIIａ含量が得られた。
【表２】
これから、ＦVIIは、プロテアーゼによって時間依存性の様式で活性化されると結論される。
【００５６】
実施例３
この実施例を用い、ＦVIIのプロテアーゼによる活性化はカルシウムイオンおよびヘパリンの存在によって増大することを証明することとする。
２５μlのプロテアーゼ含有溶液を、５０μlの
−緩衝液（対照）
−１５ｍＭ ＣaＣl2
−ヘパリン ５０ＵＳＰ単位／ml
−Pathromtin（脂質混合物、アリコートを製造業者の指示書に従って溶解）
と室温で５分間混合し、ついで１５０μlのｔｒｉｓ／ＮａＣｌ緩衝液（pH８.２）および２５μlの色素原基質Ｓ２２８８（３mM）で処理し、ついで４０５nmにおける吸光度の経時的変化を測定した（３７℃）。緩衝液対照に対する活性化係数（ｘ倍）は下表に示す。
【表３】
この実施例で用いた条件下には、プロテアーゼ活性の著しい上昇をカルシウムイオンおよび／またはヘパリンの存在下に観察することができる。
【００５７】
実施例４
いずれの場合も、プロテアーゼ１０、１または０.１μg／mlを含有する溶液を、２５μlのＦVII（２IU／ml）と混合したのち、２５μlのＣaＣl2（２５mM）および２５μlのPathromtin(R)(Dade Behring GmbH）を加えた。３７℃において０、３、１０および２０分間インキュベートしたのち、４００μlのアプロチニン（５００KIU／mg）を添加して反応を停止させた。アプロチニンを最初に添加したサンプルを対照として用いた。
【００５８】
各サンプルをｔｒｉｓ緩衝液／ＢＳＡに希釈した。各場合、この溶液５０μlを因子試薬［主としてＦIXａ、ＦXおよびトロンビンインヒビターからなり、Cosmatic(R)ＦVIIIテスト、Chromogenix AB に従って改変］５０μlと混合し、３７℃において１０分間インキュベートした。５０μlの基質（たとえばＳ２７６５、Ｎ−ａ−Ｃbo−Ｄ−Ａrg−Ｇly−Ａrg−pＮＡ）を加えてたのち、既定時間のインキュベーション後に５０μlの酢酸（５０％）を添加して反応を停止させ、ついでＯＤ405nmを測定した。ＦVIIIの標準曲線を用いてサンプル中の濃度を決定した。
【００５９】
結果：
最初のアッセイでは、プロテアーゼをＦVIII（２IU／ml）とインキュベートする時間を一定（１０分）に保持したが、プロテアーゼの濃度は変動させた（０.１、１および１０μg／ml）。反応を停止させ、活性なＦVIIIの残留濃度を測定した。プロテアーゼ濃度が上昇すると、それに対応してＦVIIIは不活性化された（図１）。
サンプルのプロテアーゼ含量は適当な標準曲線を用いて定量化できる。
第二のアッセイではプロテアーゼの濃度を一定に保持して（１０μg／ml）、ＦVIII（２IU／ml）とインキュベーション時間を変動させた。活性なＦVIIIの残留濃度の著しい低下がインキュベーション時間の延長とともに認められた（図２）。
【００６０】
実施例５
第V因子の活性に対する「ＦVIIアクティベーター」の影響を検討した。
２５μlのプロテアーゼ含有溶液（０〜１００μg／ml）を５０μlのＦV（５IU／ml）および２５μlのＣaＣl2 とインキュベートし（０〜２０分）、ついで１００KIU／mlのアプロチニンを含む緩衝液４００μlを加えた。
いずれの場合も、各１００μlのインキュベーションアッセイをついで１００μlのＦV欠乏血漿と３７℃で１分間インキュベートし、次に２００μlのThromborelＳ(R)を加えて混合し、Schnitger & Gross 血液凝固計で血液凝固時間を測定した。ＦVの残留活性を決定した。
結果：
【表４】
この実施例では、ＦVがプロテアーゼによって経時的に不活性化されたことが証明される。
【００６１】
実施例６
「ＦVIIアクティベーター」のいわゆる包括的試験における血液凝固時間に対する影響を、Schnitger & Gross 血液凝固計を用いて検討した。掲げた差の値は、すべてこの量で短縮された血液凝固時間に相当する。
【００６２】
ＮＡＰＴＴ（非活性化部分トロンボプラスチン時間）
プロテアーゼ含有溶液を緩衝液で１００、３０、１０および３μg／mlに希釈した。これらの溶液それぞれ１００μlを、１００μlの加クエン酸血漿（標準血漿プールまたは個々のドナーから）および１００μlのPathromtin(R)と３７℃で２分間インキュベートし、ついで１００μlの２５ｍＭ ＣaＣl2を加え、ついで血液凝固時間を測定した。これらの測定値とプロテアーゼに代えて緩衝液を用いて得られた相当する血液凝固時間の間の差を求めた。
【表５】
ＦVIIアクティベーターの添加はＮＡＰＴＴの濃度依存性の短縮を生じた。
【００６３】
血漿カルシウム再沈殿時間
プロテアーゼ含有溶液を緩衝液で１００、３０、１０および３μg／mlに希釈した。これらの溶液それぞれ１００μｌを、１００μlの加クエン酸血漿（標準血漿プールまたは個々のドナーから）と３７℃で１分間インキュベートし、ついで１００μlの２５ｍＭ ＣａＣｌ2を加え、ついで血液凝固時間を測定した。これらの測定値とプロテアーゼに代えて緩衝液を用いて得られた相当する血液凝固時間の間の差を求めた。
【表６】
【００６４】
ＰＴ（プロトロンビン時間）
プロテアーゼ含有溶液を緩衝液で１００、３０、１０および３μg／mlに希釈した。これらの溶液それぞれ１００μlを、１００μlの加クエン酸血漿（標準血漿プールまたは個々のドナーから）と３７℃で１分間インキュベートし、ついで２００μlのThromborelＳ(R)（Dade Behring GmbH）を加え、ついで血液凝固時間を測定した。
これらの測定値とプロテアーゼに代えて緩衝液を用いて得られた相当する血液凝固時間の間の差を求めた。
【表７】
【００６５】
実施例７
「ＦVIIアクティベーター」のプラスミノーゲンアクティベーター活性化作用を一本鎖ウロキナーゼ（scuＰＡ）および一本鎖ｔＰＡ（sctＰＡ）を使用して検討した。
アッセイ：
０.１ml ＰＡ溶液（20μg／mlのscuPAまたは100μg／mlのsctPA）
＋０.１ml 試験緩衝液または
試験緩衝液中１００Ｕ／mlのヘパリンまたは
試験緩衝液中２０ｍＭ ＣaＣl2
＋０.５ml 試験緩衝液
＋０.１ml プロテアーゼ／サンプル（濃度上昇；２〜10μg／mlのscuPAまた
は50〜200μg／mlのsctPA）
３７℃でインキュベーション
＋０.１ml 試験緩衝液中１００KIU／mlのアプロチニン
３７℃で２分間インキュベーション
＋０.１ml 基質Ｓ−２４４４（３mM）
対照としては、最初のインキュベーションの前に、プラスミノーゲンアクティベーター（ＰＡ）に代えてアプロチニンを最初に導入し、以下、各場合を通して同様に実施する。一方、ＰＡは、以後アプロチニンの代わりに添加するまで加えなかった。
測定値の差（Δ）ΔＯＤ405nmを光学的に測定した。得られた対照値をサンプル／プロテアーゼ値から差し引き、この方法で、ＰＡＡ活性によって生じたＰＡ活性を測定した（ｍＩＵ／分）。
【００６６】
結果：
scuＰＡの活性化（20μg／mlのscuPA、２〜10μg／mlの「ＦVIIアクティベーター」）
【表８】
表は、scuＰＡが「ＦVIIアクティベーター」の濃度およびインキュベーションの長さに依存する様式で活性化される事実を例示する。同時に、ヘパリンおよびカルシウムの両者がプロテアーゼによってもたらされたＰＡの活性化に刺激作用を示した。
【００６７】
scuＰＡの活性化（100μg／mlのsctPA、50〜200μg／mlの「ＦVIIアクティベーター」
）
活性化ｔＰＡの代謝回転速度はｔＰＡプロ酵素に比較して係数３〜４まで上昇するにすぎない（ｕＰＡの場合は係数１０００〜１５００上昇する）ので、分析可能な測定シグナルを得るために、２種の共反応物質の高い濃度を選択しなければならなかった。
【表９】
表は sctＰＡもプロテアーゼの濃度およびインキュベーション時間に依存する様式で活性化されたことを証明する。ヘパリンおよびカルシウムイオンの両者が「ＦVIIアクティベーター」のＰＡの活性化能力に対して刺激作用を示した。
【００６８】
実施例８
２種のＦVIII含有溶液、一方はフォン・ヴィルブラント因子を本質的に含まず、他方はｖＷＦを含有する溶液を上述のプロテアーゼとカルシウムの存在下にインキュベートした。予め定められた時間後に、色素原試験によって残留ＦVIII活性を測定し、プロテアーゼを含まない対照アッセイと関連させた。
【００６９】
このためには、０.１IU／mlのＦVIIIを含有する溶液２５μlを同容量のプロテアーゼ溶液（μg／ml）で処理し、全体を２５μlのＣaＣl2（２５mM）と混合した。０、５、１０および２０分間３７℃でインキュベートしたのち、プロテアーゼの蛋白分解活性を停止させるために各場合、２００KIU／mlのアプロチニンを含有する溶液４００μlで処理した。
予備実験では、アプロチニンのこの濃度はいかに記述するＦVIII活性試験（アッセイ１＋３）に有意な干渉作用をもたないことが示された。アッセイ２においては、プロテアーゼをＦVIIIと接触させる前にアプロチニンとインキュベートし、ついで上述のように操作した。
【００７０】
いずれの場合も、５０μlの停止したサンプル（またはさらに希釈後）をついで主としてＦIX、ＦXおよびトロンビンインヒビターからなる、いわゆる因子試薬で処理し、３７℃において１０分間インキュベートした。活性化ＦXによって切断される色素原基質５０μlの添加に続いて５分間インキュベートしたのち５０μlの酢酸（５０％）を添加して反応を停止させ、ついでΔＯＤ405nmを測定した。ＦVIII活性（mIU）は、ＦVIII濃縮物から調製し、テストに包含された希釈系列を用いて構築した標準曲線を利用して確認した。
【００７１】
ＦVIII活性はプロテアーゼを添加しなかった対照に対する百分率で示す。
結果：
【表１０】
ＣaＣl2（この場合は６.２５ｍＭ）の存在下には、ＦVIIIはプロテアーゼにより、インキュベーションの長さに依存した様式で不活性化された。ｖＷＦは、プロテアーゼによる不活性化からＦVIIIを保護しなかった。ＦVIIIと接触させる前にアプロチニンでプロテアーゼを阻害すると、前者の不活性化は防止された。
【００７２】
実施例９
このシリーズの実験では、実施例１／アッセイ１を実施したが、この場合は、プロテアーゼとＦVIIIの混合物中のカルシウム濃度を変動させた。このためには、ＣaＣl2をカルシウム保存溶液から図３に示す最終濃度まで添加した。
結果：
アッセイ中のカルシウム濃度を１ｍＭ未満に低下させると、これらの条件下に約５０％のＦVIIIが残留する。０.５ｍＭ未満のカルシウムでは残留百分率は６０％以上である（図１）。
【００７３】
実施例１０
「ＦVIIアクティベーター」のいわゆる包括的試験における血液凝固時間に対する影響を血栓弾性記録法によって検討した。
関連血餅の剪断弾性または強度の変化を、Hilgard TEGメーター（Helligeより）を用いて連続的に記録した。いわゆるｒおよびｋ値、それぞれ血液の停止の開始からおよび血液凝固反応の開始からの時間であり、加クエン酸血漿の場合にはＴＥＧ曲線までの再カルシウム沈殿の時間は１mmまで広がり、ｒ値の終点から曲線までの時間は２０mmに広がった（血餅形成時間）。
【００７４】
このためには、５例のドナーからの血液または血漿の１５０μlのアリコートを各場合、測定キューベット中３７℃で２分間インキュベートし、ついで５０μlのサンプル（プロテアーゼ）を加え混合した。１００μlの２５ｍＭ ＣaＣl2を加え、反応を開始させた。アッセイ中「ＦVIIアクティベーター」の終濃度は１５μg／mlであった。ｒ時間の短縮をサンプルに代えて緩衝液を含有するアッセイに関して測定した。
結果：
【表１１】
【００７５】
この実施例は、ほとんどすべての場合、プロテアーゼの添加は血液凝固時間の著しい短縮を起こすことを明らかにするものである。ここに示した例では「ＦVIIアクティベーター」のフィブリン溶解作用はバックグランド中に隠れてしまっていた。この理由は「正常対象」では血漿中のプラスミノーゲンアクティベーターの濃度がナノグラムの領域にあり、インビトロでの血液凝固試験には全く影響しないからである。
【００７６】
実施例１１
プロテアーゼのＦVIII副経路活性は以下の実験的アッセイによって証明された。すなわち、測定技術として血栓弾性記録法を用いた。ｒ時間を評価した（実施例１０参照）。全血サンプルを、天然のＦVIIIインヒビターの存在を刺激するために、そのＦVIII活性阻害作用が分かっているモノクローナル抗体（ＦVIIIに対する抗体）とインキュベートした。サンプルを全血サンプル対照（Ｍａｂに代えて緩衝液）と比較した。プロテアーゼのＦＥＩＢ活性を、Ｍａｂによって阻害された全血サンプルにプロテアーゼ（終濃度１７μg／ml）を加えて試験した。さらにサンプルにプロテアーゼを加え、プロテアーゼ自体のｒ時間に対する影響を測定した。
【００７７】
結果：
【表１２】
抗−ＦVIII ｍＡｂによって引き起こされるｒ時間の延長はこの場合もプロテアーゼの存在により正常化され、これはプロテアーゼのＦＥＩＢ活性を例示するものである。既に上に証明したように、プロテアーゼそれ自体は血液凝固時間を短縮した。
【００７８】
実施例１２
５０μg／mlのＦVII活性化プロテアーゼを含有する溶液に、以下の物質を相当する終濃度になるように加えた。
２５ｍＭ クエン酸ナトリウム
２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ
１００ｍＭ アルギニン
０.７５ｇ／ml スクロース
この溶液を部分に分割し、各場合、アリコートを５.０〜８.６の様々なｐＨ値に調製し、ついで６０℃に１０時間加熱した。
加熱したプロテアーゼ溶液の活性は色素原試験により測定し色素原基質Ｓ２２８８（Ｈ−Ｄ−Ｉle−Ｐro−Ａrg−pＨＡ×２ＨＣl、Chromogenix AB，Sweden）の経時的なアミド分解を記録した。この活性は加熱しないで平行して測定されたアリコートの百分率として表示した。
【００７９】
結果：
【表１３】
この一連の実験は、特に酸性のｐＨ範囲における安定化はプロテアーゼの不活性化を著しく低下させた。ｐＨ５.５におけるわずかな「ブレークスルー」はこの範囲にプロテアーゼの等電点があるという事実によって説明できる。クエン酸ナトリウムは好ましいｐＨ範囲で起こる＞５０％の活性の喪失を防止する。
【００８０】
実施例１３
ｐＨ６.１におけるアッセイ（実施例１）はプロテアーゼの最良の安定化を示した。したがって、様々な活性を実施例１に記載のようにｐＨ６.０で試験して評価した。
以下の終濃度をセットし、プロテアーゼの濃度は５０μg／mlとした。
５０ｍＭ クエン酸ナトリウム／５０ｍＭ ＮaＣl、ｐＨ６.０
０.７５ｇ／mlのスクロース
１００ｍＭのグリシン
１００ｍＭのアルギニン
【００８１】
結果：
【表１４】
スクロースおよび各場合１種のアミノ酸の添加によってプロテアーゼの著しい安定化が証明された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）アプロチニンの存在によって阻害され、
ｂ）カルシウムイオンおよび／またはヘパリンもしくはヘパリン硫酸によりその活性は上昇し、
ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、それに続く非還元状態での染色により分子量５０〜７５ｋＤａの範囲の１個もしくは２個以上のバンドを示し、還元状態では分子量４０〜５５ｋＤａに１個のバンドおよび分子量１０〜３５ｋＤａの範囲に１個または２個以上のバンドを示し、そして
ｄ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて還元状態で分子量４０〜５５ｋＤａの範囲に得られるバンドはアミノ酸配列：ＬＬＥＳＬＤＰを有し、分子量１０〜３５ｋＤａの範囲に得られるバンドはアミノ酸配列：ＩＹＧＧＦＫＳＴＡＧＫを有するプロテアーゼ、および／または
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて還元状態で得られるバンドは６０〜６５ｋＤａの範囲の分子量を有し、アミノ酸配列：ＬＬＥＳＬＤＰおよびＩＹＧＧＦＫＳＴＡＧＫを含有する前記プロテアーゼのプロ酵素の定性的および定量的検出のための試験システムにおいて、そのプロテアーゼ活性は、
ａ）血液凝固第VIII／VIIIａ因子もしくは第V／Vａ因子を不活性化するその活性または
ｂ）包括的血液凝固試験における血液凝固時間を低下させるその活性または
ｃ）プラスミノーゲンアクティベーターを活性化するその活性または
ｄ）ＦVIIを活性化するその活性
によって測定する試験システム。
【請求項２】
請求項１に記載の試験システムにおいて、血液凝固時間を低下させる活性は、
ａ）非活性化部分トロンボプラスチン時間（ＮＡＰＴＴ）または
ｂ）プロトロンビン時間（ＰＴ）または
ｃ）血漿カルシウム再沈着時間または
ｄ）活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）
によって測定する試験システム。
【請求項３】
請求項１および２に記載の試験システムにおいて、プラスミノーゲンアクティベーターを活性化および／または増強する活性は、
ａ）一本鎖ウロキナーゼＰＡ（scuＰＡ、一本鎖ウロキナーゼプラスミノーゲンアクティベーター）または
ｂ）一本鎖 ｔＰＡ（sctＰＡ、一本鎖組織プラスミノーゲンアクティベーター）の活性化により測定する試験システム。
【請求項４】
請求項１〜３に記載の試験システムにおいてカルシウムイオン０.００１ｍＭ以上の量を含む試験システム。
【請求項５】
ａ）アプロチニンの存在によって阻害され、
ｂ）カルシウムイオンおよび／またはヘパリンもしくはヘパリン硫酸によりその活性は上昇し、
ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、それに続く非還元状態での染色により分子量５０〜７５ｋＤａの範囲の１個もしくは２個以上のバンドを示し、還元状態では分子量４０〜５５ｋＤａに１個のバンドおよび分子量１０〜３５ｋＤａの範囲の１個または２個以上のバンドを示し、そして
ｄ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて還元状態で分子量４０〜５５ｋＤａの範囲に得られるバンドはアミノ酸配列：ＬＬＥＳＬＤＰを有し、分子量１０〜３５ｋＤａの範囲に得られるバンドはアミノ酸配列：ＩＹＧＧＦＫＳＴＡＧＫを有するプロテアーゼ、および／または
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて還元状態で得られるバンドは６０〜６５ｋＤａの範囲の分子量を有し、アミノ酸配列：ＬＬＥＳＬＤＰおよびＩＹＧＧＦＫＳＴＡＧＫを含有する前記プロテアーゼのプロ酵素と適当なプロ酵素アクティベーターの混合物をプロトロンビン時間置換組織因子／トロンボプラスチンの試験に使用するアッセイシステム。
【請求項６】
ａ）アプロチニンの存在によって阻害され、
ｂ）カルシウムイオンおよび／またはヘパリンもしくはヘパリン硫酸によりその活性は上昇し、
ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、それに続く非還元状態での染色により分子量５０〜７５ｋＤａの範囲の１個もしくは２個以上のバンドを示し、還元状態では分子量４０〜５５ｋＤａに１個のバンドおよび分子量１０〜３５ｋＤａの範囲の１個または２個以上のバンドを示し、そして
ｄ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて還元状態で分子量４０〜５５ｋＤａの範囲に得られるバンドはアミノ酸配列：ＬＬＥＳＬＤＰを有し、分子量１０〜３５ｋＤａの範囲に得られるバンドはアミノ酸配列：ＩＹＧＧＦＫＳＴＡＧＫを有するプロテアーゼ、および／または
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて還元状態で得られるバンドは６０〜６５ｋＤａの範囲の分子量を有し、アミノ酸配列：ＬＬＥＳＬＤＰおよびＩＹＧＧＦＫＳＴＡＧＫを含有する前記プロテアーゼのプロ酵素と適当なプロ酵素アクティベーターの混合物を、プラスミノーゲンアクティベーターの機能性の試験ならびに一本鎖プラスミノーゲンアクティベーター型の定量に使用するアッセイシステム。
【請求項７】
請求項１〜６に記載の試験システムにおいて、プラスミノーゲンアクティベーターを増強する活性は、
ａ）色素原試験を用いて測定するかまたは
ｂ）プラスミノーゲンの存在下におけるカップリング反応でプラスミン自体の形成もしくはプラスミンによってもたらされるフィブリン凝血の溶解で測定する試験システム。
【請求項１】
ａ）アプロチニンの存在によって阻害され、
ｂ）カルシウムイオンおよび／またはヘパリンもしくはヘパリン硫酸によりその活性は上昇し、
ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、それに続く非還元状態での染色により分子量５０〜７５ｋＤａの範囲の１個もしくは２個以上のバンドを示し、還元状態では分子量４０〜５５ｋＤａに１個のバンドおよび分子量１０〜３５ｋＤａの範囲に１個または２個以上のバンドを示し、そして
ｄ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて還元状態で分子量４０〜５５ｋＤａの範囲に得られるバンドはアミノ酸配列：ＬＬＥＳＬＤＰを有し、分子量１０〜３５ｋＤａの範囲に得られるバンドはアミノ酸配列：ＩＹＧＧＦＫＳＴＡＧＫを有するプロテアーゼ、および／または
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて還元状態で得られるバンドは６０〜６５ｋＤａの範囲の分子量を有し、アミノ酸配列：ＬＬＥＳＬＤＰおよびＩＹＧＧＦＫＳＴＡＧＫを含有する前記プロテアーゼのプロ酵素の定性的および定量的検出のための試験システムにおいて、そのプロテアーゼ活性は、
ａ）血液凝固第VIII／VIIIａ因子もしくは第V／Vａ因子を不活性化するその活性または
ｂ）包括的血液凝固試験における血液凝固時間を低下させるその活性または
ｃ）プラスミノーゲンアクティベーターを活性化するその活性または
ｄ）ＦVIIを活性化するその活性
によって測定する試験システム。
【請求項２】
請求項１に記載の試験システムにおいて、血液凝固時間を低下させる活性は、
ａ）非活性化部分トロンボプラスチン時間（ＮＡＰＴＴ）または
ｂ）プロトロンビン時間（ＰＴ）または
ｃ）血漿カルシウム再沈着時間または
ｄ）活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）
によって測定する試験システム。
【請求項３】
請求項１および２に記載の試験システムにおいて、プラスミノーゲンアクティベーターを活性化および／または増強する活性は、
ａ）一本鎖ウロキナーゼＰＡ（scuＰＡ、一本鎖ウロキナーゼプラスミノーゲンアクティベーター）または
ｂ）一本鎖 ｔＰＡ（sctＰＡ、一本鎖組織プラスミノーゲンアクティベーター）の活性化により測定する試験システム。
【請求項４】
請求項１〜３に記載の試験システムにおいてカルシウムイオン０.００１ｍＭ以上の量を含む試験システム。
【請求項５】
ａ）アプロチニンの存在によって阻害され、
ｂ）カルシウムイオンおよび／またはヘパリンもしくはヘパリン硫酸によりその活性は上昇し、
ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、それに続く非還元状態での染色により分子量５０〜７５ｋＤａの範囲の１個もしくは２個以上のバンドを示し、還元状態では分子量４０〜５５ｋＤａに１個のバンドおよび分子量１０〜３５ｋＤａの範囲の１個または２個以上のバンドを示し、そして
ｄ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて還元状態で分子量４０〜５５ｋＤａの範囲に得られるバンドはアミノ酸配列：ＬＬＥＳＬＤＰを有し、分子量１０〜３５ｋＤａの範囲に得られるバンドはアミノ酸配列：ＩＹＧＧＦＫＳＴＡＧＫを有するプロテアーゼ、および／または
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて還元状態で得られるバンドは６０〜６５ｋＤａの範囲の分子量を有し、アミノ酸配列：ＬＬＥＳＬＤＰおよびＩＹＧＧＦＫＳＴＡＧＫを含有する前記プロテアーゼのプロ酵素と適当なプロ酵素アクティベーターの混合物をプロトロンビン時間置換組織因子／トロンボプラスチンの試験に使用するアッセイシステム。
【請求項６】
ａ）アプロチニンの存在によって阻害され、
ｂ）カルシウムイオンおよび／またはヘパリンもしくはヘパリン硫酸によりその活性は上昇し、
ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、それに続く非還元状態での染色により分子量５０〜７５ｋＤａの範囲の１個もしくは２個以上のバンドを示し、還元状態では分子量４０〜５５ｋＤａに１個のバンドおよび分子量１０〜３５ｋＤａの範囲の１個または２個以上のバンドを示し、そして
ｄ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて還元状態で分子量４０〜５５ｋＤａの範囲に得られるバンドはアミノ酸配列：ＬＬＥＳＬＤＰを有し、分子量１０〜３５ｋＤａの範囲に得られるバンドはアミノ酸配列：ＩＹＧＧＦＫＳＴＡＧＫを有するプロテアーゼ、および／または
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて還元状態で得られるバンドは６０〜６５ｋＤａの範囲の分子量を有し、アミノ酸配列：ＬＬＥＳＬＤＰおよびＩＹＧＧＦＫＳＴＡＧＫを含有する前記プロテアーゼのプロ酵素と適当なプロ酵素アクティベーターの混合物を、プラスミノーゲンアクティベーターの機能性の試験ならびに一本鎖プラスミノーゲンアクティベーター型の定量に使用するアッセイシステム。
【請求項７】
請求項１〜６に記載の試験システムにおいて、プラスミノーゲンアクティベーターを増強する活性は、
ａ）色素原試験を用いて測定するかまたは
ｂ）プラスミノーゲンの存在下におけるカップリング反応でプラスミン自体の形成もしくはプラスミンによってもたらされるフィブリン凝血の溶解で測定する試験システム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００９−１３１２７３（Ｐ２００９−１３１２７３Ａ）
【公開日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５７２３２（Ｐ２００９−５７２３２）
【出願日】平成２１年３月１１日（２００９．３．１１）
【分割の表示】特願平１１−１１６４１１の分割
【原出願日】平成１１年４月２３日（１９９９．４．２３）
【出願人】（５９７０７０２６４）ツェー・エス・エル・ベーリング・ゲー・エム・ベー・ハー (32)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月１１日（２００９．３．１１）
【分割の表示】特願平１１−１１６４１１の分割
【原出願日】平成１１年４月２３日（１９９９．４．２３）
【出願人】（５９７０７０２６４）ツェー・エス・エル・ベーリング・ゲー・エム・ベー・ハー (32)
【Ｆターム（参考）】
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