血液型抗原融合ポリペプチドおよびその使用方法
【課題】本発明は、抗体媒介性移植拒絶を処置または予防するための、組成物および方法を提供することを課題とする。
【解決手段】本発明は、血液型エピトープが、高密度で、かつムチン型タンパク質骨格の異なるコア糖鎖によって特異的に発現され得るという発見に一部基づく。ポリペプチドは、本明細書中でＡＢＯ融合ポリペプチドと称される。１つの局面において、本発明は、第１ポリペプチドを含む融合ポリペプチドを提供し、この第１ポリペプチドは、ムチンポリペプチドの少なくとも１領域を含み、第２ポリペプチドに作動可能に連結されるα１，２フコシルトランスフェラーゼによってグリコシル化される。第１ポリペプチドは、α１，３ Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼおよび／またはα１，３ ガラクトシルトランスフェラーゼによって連続的にグリコシル化される。ムチンポリペプチドは、例えば、ＰＳＧＬ−１である。
【解決手段】本発明は、血液型エピトープが、高密度で、かつムチン型タンパク質骨格の異なるコア糖鎖によって特異的に発現され得るという発見に一部基づく。ポリペプチドは、本明細書中でＡＢＯ融合ポリペプチドと称される。１つの局面において、本発明は、第１ポリペプチドを含む融合ポリペプチドを提供し、この第１ポリペプチドは、ムチンポリペプチドの少なくとも１領域を含み、第２ポリペプチドに作動可能に連結されるα１，２フコシルトランスフェラーゼによってグリコシル化される。第１ポリペプチドは、α１，３ Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼおよび／またはα１，３ ガラクトシルトランスフェラーゼによって連続的にグリコシル化される。ムチンポリペプチドは、例えば、ＰＳＧＬ−１である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、概して抗体媒介性移植拒絶を処置または予防するための組成物および方法に
関し、より具体的には、血液型（ｂｌｏｏｄ ｇｒｏｕｐ）決定基を含む融合ポリペプチ
ドを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
主要なヒトの血液型系（組織−血液型ＡＢＯ系）は、３つの糖質決定基（血液型Ａエピ
トープ、ＢエピトープおよびＨエピトープ）によって規定される。ＡＢＨ決定基を有する
グリカンは、糖タンパク質、糖脂質、または遊離のオリゴ糖において見出される。ＡＢＨ
抗原は、Ｎ連結グリカンまたはＯ連結グリカンにおいて見出され得る。Ｏ連結グリカンに
関してこれまで記載された最も共通なコア構造は、コア１（Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃ）、
コア２（Ｇａｌβ３（ＧｌｃＮＡｃβ６）ＧａｌＮＡｃ）、コア３（ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇ
ａｌＮＡｃ）およびコア４（ＧｌｃＮＡｃβ３（ＧｌｃＮＡｃβ６）ＧａｌＮＡｃ）であ
る。これらは、１型（Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ）構造、２型（Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ）
構造、および３型（Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃα）構造を保有することが示されている。１
型構造は主に、コア３構造およびコア４構造の伸長物として見出されるが、２型鎖（ポリ
ラクトサミン）は、コア２構造のＧｌｃＮＡｃβ１，６分枝の伸長物として発見された。
【０００３】
ＡＢＯ障壁を越える移植（Ｔｘ）は、通常、組織Ｔｘを避ける。なぜなら、実施する抗
体に起因する抗体媒介性拒絶（ＡＭＲ）の危険性がしばしば高いからである。これはまた
、骨髄移植において適用され得るが、血液型ＡＢＨの不一致はその結果に影響しないと長
い間考えられてきた。しかし、いくつかの場合、ＡＢＯ障害を越えて移植することが依然
として所望される。これは、ドナーの総数が増加しなくても、特定のレシピエントに対し
て利用可能なドナーのプールを広げるからである。
【０００４】
体外免疫吸収（ＥＩＡ）または血漿交換（ＰＰ）による抗Ａ型抗体または抗Ｂ型抗体の
除去は、ＡＢＯ不適合性組織Ｔｘ後の移植片の生存を改善することが証明された。ＡＢＯ
不適合性Ｔｘおよび異種Ｔｘの両方におけるＡＭＲの予防のために使用される別の方法は
、遊離オリゴ糖の注入であるが、遊離糖に対する抗体の低い親和性および循環における低
分子量のオリゴ糖の短い半減期（Ｙｅら、１９９４；Ｓｉｍｏｎら、１９９８）は、より
広い使用を抑制する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、血液型エピトープが、高密度で、かつムチン型タンパク質骨格の異なるコア
糖鎖によって特異的に発現され得るという発見に一部基づく。ポリペプチドは、本明細書
中でＡＢＯ融合ポリペプチドと称される。したがって、本発明は以下を提供する。
（１）
第２ポリペプチドに作動可能に連結される第１ポリペプチドを含む融合ポリペプチドであ
って、該第１ポリペプチドは：
（ａ）ムチンポリペプチドであり、そして
（ｂ）α１，２フコシルトランスフェラーゼによってグリコシル化され、
該第２ポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドの少なくとも１領域を含む、融合
ポリペプチド。
（２）
前記第１ポリペプチドが、α１，３ Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ
またはα１，３ ガラクトシルトランスフェラーゼによってさらにグリコシル化される、
請求項１に記載の融合ポリペプチド。
（３）
前記α１，２フコシルトランスフェラーゼが、血液型Ｈまたは分泌型α１，２フコシルト
ランスフェラーゼである、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
（４）
前記第１ポリペプチドが、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１の少なくとも１領域
を含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
（５）
前記第１ポリペプチドが、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１の細胞外部分を含む
、請求項４に記載の融合ポリペプチド。
（６）
前記第２ポリペプチドが、重鎖免疫グロブリンポリペプチドの領域を含む、請求項１に記
載の融合ポリペプチド。
（７）
前記第２ポリペプチドが、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域を含む、請求項６に記載の融合
ポリペプチド。
（８）
ダイマーである、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
（９）
請求項１に記載のペプチドをコードする、単離された核酸。
（１０）
請求項９に記載の核酸を含む、ベクター。
（１１）
請求項１１に記載のベクターを含む、細胞。
（１２）
請求項１に記載の融合ポリペプチドを含む、吸収体。
（１３）
抗体媒介性拒絶を処置または予防する必要のある被験体において、抗体媒介性拒絶を処置
または予防するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）融合ポリペプチド複合体を形成するために、該被験体に由来する生物学的サンプ
ルと、請求項１に記載の融合ポリペプチドとを接触させる工程；および
（ｂ）該生物学的サンプルから該複合体を除去することによって、該被験体における抗
体媒介性拒絶を処置または予防する工程
を包含する、方法。
（１４）
生物学的サンプルから抗体を除去する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）融合ポリペプチド複合体を形成するために、生物学的サンプルと、請求項１に記
載の融合ポリペプチドとを接触させる工程；
（ｂ）該生物学的サンプルから該複合体を除去することによって、該生物学的サンプル
から該抗体を除去する工程
を包含する、方法。
【０００６】
１つの局面において、本発明は、第１ポリペプチドを含む融合ポリペプチドを提供し、
この第１ポリペプチドは、ムチンポリペプチドの少なくとも１領域を含み、第２ポリペプ
チドに作動可能に連結されるα１，２フコシルトランスフェラーゼによってグリコシル化
される。第１ポリペプチドは、α１，３ Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラ
ーゼおよび／またはα１，３ ガラクトシルトランスフェラーゼによって連続的にグリコ
シル化される。ムチンポリペプチドは、例えば、ＰＳＧＬ−１である。好ましくは、この
ムチンポリペプチドは、ＰＳＧＬ−１の細胞外部分である。α１，２，フコシルトランス
フェラーゼは、例えば、血液型Ｈまたは分泌型α１，２，フクシルトランスフェラーゼ（
例えば、ＦＵＴ１またはＦＵＴ２）である。
【０００７】
好ましい実施形態において、第２ポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドの少な
くとも１領域を含む。例えば、第２ポリペプチドは、重鎖免疫グロブリンポリペプチドの
１領域を含む。あるいは、第２ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖のＦＣ領域を含む。
【０００８】
ＡＢＯ融合ポリペプチドは多量体（ｍｕｔｉｍｅｒ）である。好ましくは、ＡＢＯ融合
ポリペプチドはダイマーである。
【０００９】
本発明はまた、ＡＢＯ融合ポリペプチドをコードする核酸、ならびに本明細書中に記載
される核酸をコードするＡＢＯ融合ポリペプチドを含むベクター、および本明細書中に記
載されるベクターまたは核酸を含む細胞を含む。あるいは、ベクターは、α１，２，フコ
シルトランスフェラーゼおよび／またはα１，３ Ｎアセチルガラクトサミニルトランス
フェラーゼまたはα１，３ ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸をさらに
含む。
【００１０】
別の局面において、本発明は、被験体における抗体媒介性拒絶を処置する方法を提供す
る。この方法は、融合ポリペプチド−抗体複合体を形成させるために、生物学的サンプル
（例えば、患者に由来する全血または血漿）と、本発明のＡＢＯ融合ポリペプチドとを接
触させる工程を包含する。この複合体は、生物学的サンプルから除去され、そしてこの生
物学的サンプルは被験体に再融合される。
【００１１】
抗体融合ペプチド複合体を形成し、そして生物学的サンプルからこの複合体を除去する
ために、サンプルと本発明のＡＢＯ融合ペプチドとを接触させる工程によりこのサンプル
から抗体を除去する方法もまた、本発明に含まれる。
【００１２】
ＡＢＯ融合ポリペプチドを含む薬学的組成物もまた、本発明に含まれる。
【００１３】
別の記載がない限り、本明細書中で使用される全ての技術および専門用語は、本発明に
属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載され
るのと類似または等価な方法および材料は、本発明の実施または試験において使用され得
るが、適切な方法および材料は、以下に記載される。本明細書中に記載される全ての特許
刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参考として援用される。矛盾
する場合、明細書（定義を含む）が制御する。さらに、材料、方法および実施例は、例示
のみであり、制限を意図するものではない。本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、および特許請求の範囲から示され
る。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１Ａ〜Ｄは、Ｈ遺伝子もしくはＳｅ遺伝子単独でか、またはＡ遺伝子によりコードされたα１，３ＧａｌＮＡｃＴと組み合わせてトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞において産生されたキメラである、免疫精製したＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析の写真である。８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分離およびニトロセルロース膜へのブロッティングの後、抗マウスＩｇＧ抗体により（Ａ）、抗血液型Ａ抗体の後でヤギ抗マウスＩｇＭ抗体により（Ｂ）、抗１型Ｈ鎖特異的抗体の後でＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ３抗体により（Ｃ）、抗２型Ｈ鎖特異的抗体の後でヤギ抗マウスＩｇＭ−ＨＲＰ抗体により（Ｄ）、そして抗３型Ｈ鎖特異的抗体の後にＨＲＰ標識したヤギ抗マウスＩｇＭ抗体により（Ｅ）、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂキメラを、プローブした。パネルＡ〜Ｄにおいて、ＣＤＭ８（レーン１および５）、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ（レーン２および６）、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂおよびＨ遺伝子（レーン３）、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ、Ｈ遺伝子およびＡ遺伝子（レーン４）、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂおよびＳｅ遺伝子（レーン７）、またはＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ、ならびにＳｅ遺伝子およびＡ遺伝子（レーン８）をコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞由来のサンプルを分析した。Ｅにおいて、ＣＤＭ８およびＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂでトランスフェクトされた細胞由来の重複したサンプルは、省略した。Ｃにおいて、２５０ｎｇの１型Ｈ鎖−ＢＳＡを、ポジティブコントロールとして使用した。
【図２】図２Ａ〜Ｄは、Ｈ遺伝子もしくはＳｅ遺伝子単独でか、またはＡ遺伝子によりコードされたα１，３ＧａｌＮＡｃＴと組み合わせてトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞において産生された、ＰＮＧａｓｅＦ処理された、免疫精製したＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析の写真である。免疫精製したＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂのＰＮＧａｓｅＦ処理あり（＋）またはなし（−）の後、このＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂを、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、そしてニトロセルロース膜へブロッティングした。抗マウスＩｇＧ抗体により（Ａ）、抗血液型Ａ抗体の後でヤギ抗マウスＩｇＭ抗体により（Ｂ）、抗２型Ｈ鎖特異的抗体の後でヤギ抗マウスＩｇＭ−ＨＲＰ抗体により（Ｃ）、そして抗３型Ｈ鎖特異的抗体の後にＨＲＰ標識したヤギ抗マウスＩｇＭ抗体により（Ｄ）、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂキメラを、プローブした。パネルＡ〜Ｄにおいて、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂおよびＨ遺伝子（レーン１および２）、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ、ならびにＨ遺伝子およびＡ遺伝子（レーン３および４）、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂおよびＳｅ遺伝子（レーン５および６）、またはＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ、ならびにＳｅ遺伝子およびＡ遺伝子（レーン７および８）をコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞由来のサンプルを分析した。
【図３】図３Ａ〜Ｅは、Ｈ遺伝子もしくはＳｅ遺伝子単独でか、またはＡ遺伝子によりコードされたα１，３ＧａｌＮＡｃＴと組み合わせてトランスフェクトされたＣＯＳ−７ｍ６細胞において産生されたキメラである、免疫精製したＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析の写真である。８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分離およびニトロセルロース膜へのブロッティングの後、抗マウスＩｇＧ抗体により（Ａ）、抗血液型Ａ抗体の後でヤギ抗マウスＩｇＭ抗体により（Ｂ）、抗１型Ｈ鎖特異的抗体の後でＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ３抗体により（Ｃ）、抗２型Ｈ鎖特異的抗体の後でヤギ抗マウスＩｇＭ−ＨＲＰ抗体により（Ｄ）、そして抗３型Ｈ鎖特異的抗体の後にＨＲＰ標識したヤギ抗マウスＩｇＭ抗体により（Ｅ）、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂキメラを、プローブした。パネルＡ〜Ｄにおいて、ＣＤＭ８（レーン１および５）、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ（レーン２および６）、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂおよびＨ遺伝子（レーン３）、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ、Ｈ遺伝子およびＡ遺伝子（レーン４）、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂおよびＳｅ遺伝子（レーン７）、またはＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ、ならびにＳｅ遺伝子およびＡ遺伝子（レーン８）をコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞由来のサンプルを分析した。Ｅにおいて、ＣＤＭ８およびＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂでトランスフェクトされた細胞由来の重複したサンプルは、省略した。Ｃにおいて、２５０ｎｇの１型Ｈ鎖−ＢＳＡを、ポジティブコントロールとして使用した。
【図４】図４Ａ〜Ｅは、Ｈ遺伝子もしくはＳｅ遺伝子単独でか、またはＡ遺伝子によりコードされたα１，３ＧａｌＮＡｃＴと組み合わせてトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞において産生されたキメラである、免疫精製したＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析の写真である。８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分離およびニトロセルロース膜へのブロッティングの後、抗マウスＩｇＧ抗体により（Ａ）、抗血液型Ａ抗体の後でヤギ抗マウスＩｇＭ抗体により（Ｂ）、抗１型Ａ鎖特異的抗体の後でＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ３抗体により（Ｃ）、抗２型Ｈ鎖特異的抗体の後でヤギ抗マウスＩｇＭ−ＨＲＰ抗体により（Ｄ）、そして抗３型Ｈ鎖特異的抗体の後にＨＲＰ標識したヤギ抗マウスＩｇＭ抗体により（Ｅ）、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂキメラを、プローブした。ＣＤＭ８（レーン１）、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ（レーン２）、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂおよびＨ遺伝子（レーン３）、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ、Ｈ遺伝子およびＡ遺伝子（レーン４）、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂおよびＳｅ遺伝子（レーン５）、またはＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ、ならびにＳｅ遺伝子およびＡ遺伝子（レーン６）をコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞由来のサンプルを分析した。Ｃにおいて、２５０ｎｇの１型Ｈ鎖−ＢＳＡを、ポジティブコントロールとして使用した。
【図５】ＦＵＴ１またはＦＵＴ２をα１，３ＧａｌＮＡｃＴと同時発現するＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞および２９３Ｔ（２９３１）細胞において産生された組換えＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂに対する相対的血液型Ａ密度を示す、棒グラフである。密度は、血液型ＡとｍＩｇＧとの反応性についての容積の比として計算し、そしてこの値を、ＦＵＴ１およびα１，３ＧａｌＮＡｃＴを同時発現するＣＯＳ細胞において産生されるＡ置換ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂについて得られた値に対して正規化した。
【図６】異なる血液型Ａ置換吸収剤に対する、吸収後に血清中に残った抗血液型Ａの反応性を示す折れ線グラフである。Ａ−ＰＡＡ−ビオチンコーティングされたＥＬＩＳＡによって測定されるような、非吸収血液型Ｏ血清の割合での、残存する反応性を、使用した吸収剤の量に対してプロットした。傾向線を、対数回帰を使用して計算した。円は、ＦＵＴ２およびα１，３ＧａｌＮＡｃＴを有するＣＨＯ細胞において産生されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂを示し、そして四角は、Ａ−ＰＡＡ−ＭＰＧを介して連結されたＡトリサッカリドを示す。Ｂ−ＰＡＡ−ＭＰＧを介して連結されたＢトリサッカリドを使用して、全ての吸収において同じ量のＰＡＡ−ＭＰＧを得た。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、血液型エピトープが、高密度で特異的に、そしてムチン型タンパク質骨格上
の異なるコアサッカリド鎖で発現され得るという発見に一部基づく。より高い密度の血液
型エピトープは、遊離のサッカリドまたは固相に結合したＡＢ決定因子と比較して、抗血
液型抗体の結合の増加または除去（すなわち、吸収）を生じる。
【００１６】
本発明は、抗血液型抗体の吸収剤として有用な複数の血液型エピトープを含む、ムチン
−免疫グロブリン融合タンパク質（本明細書中で「ＡＢＯ融合タンパク質」という）を提
供する。ＡＢＯ融合ペプチドはまた、グリコシル化についての研究のためのモデルタンパ
ク質として有用である。例えば、このＡＢＯ融合タンパク質は、ＡＢＯ不適合性の臓器移
植または骨髄移植の前に、血液または血漿由来のレシピエント抗血液型ＡＢＯ抗体を排除
する際に、有用である。このＡＢＯ融合タンパク質は、レシピエントの血液または血漿由
来の抗血液型ＡＢＯ抗体の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、
または１００％を吸収する。
【００１７】
ＡＢＯ融合ペプチドは、野生型ＡＢ決定因子の遊離サッカリドと比較して、抗血液型抗
体を除去または結合する際に、炭水化物モル濃度基準で、より有効である。このＡＢＯ融
合ペプチドは、等量の野生型ＡＢ決定因子の遊離サッカリドと比較して、２倍、４倍、１
０倍、２０倍、５０倍、８０倍、１００倍またはそれ以上多い数の抗血液型抗体と結合す
る。
【００１８】
本発明のＡＢＯ融合タンパク質は、血液型決定因子に特異的なエピトープを保有する。
例えば、ＡＢＯ融合タンパク質は、Ａエピトープ、ＢエピトープまたはＨエピトープのい
ずれかを保有する。あるいは、このＡＢＯ融合物は、血液型抗原についての２つのエピト
ープを保有する。例えば、このＡＢＯ融合タンパク質は、ＡエピトープおよびＢエピトー
プの両方を保有する。いくつかの局面において、このＡＢＯ融合タンパク質は、３つ全て
のエピトープ（すなわち、Ａ、ＢおよびＨ）を保有する。
【００１９】
（融合ポリペプチド）
種々の局面において、本発明は、第二のポリペプチドと作動可能に連結した、糖タンパ
ク質（例えば、ムチンポリペプチド）の少なくとも一部を含む第一のポリペプチドを含む
融合タンパク質を提供する。本明細書中で使用される場合、「融合タンパク質」または「
キメラタンパク質」は、非ムチンポリペプチドと作動可能に連結したムチンポリペプチド
の少なくとも一部を含む。「ムチンポリペプチド」は、ムチンドメインを有するポリペプ
チドをいう。このムチンポリペプチドは、１個、２個、３個、５個、１０個、２０個また
はそれ以上のムチンドメインを有する。このムチンポリペプチドは、Ｏ−グリカンで置換
されたアミノ酸配列によって特徴付けられる任意の糖タンパク質である。例えば、ムチン
ポリペプチドは、２アミノ酸毎または３アミノ酸毎に、セリンまたはスレオニンであるア
ミノ酸を有する。このムチンポリペプチドは、分泌タンパク質である。あるいは、ムチン
ポリペプチドは、細胞表面タンパク質である。
【００２０】
ムチンドメインは、アミノ酸のスレオニン、セリンおよびプロリンに富んでおり、ここ
で、オリゴサッカリドは、ヒドロキシアミノ酸（Ｏ−グリカン）に、Ｎ−アセチルガラク
トサミンを介して連結される。ムチンドメインは、Ｏ−連結グリコシル化部位を含むか、
またはＯ−連結グリコシル化部位からなる。ムチンドメインは、１個、２個、３個、５個
、１０個、２０個、５０個、１００個またはそれ以上のＯ−連結グリコシル化部位を有す
る。あるいは、ムチンドメインは、Ｎ−連結グリコシル化部位を含むか、またはＯ−連結
グリコシル化部位からなる。ムチンポリペプチドは、その質量の５０％、６０％、８０％
、９０％、９５％または１００％がグリカンに帰する。ムチンポリペプチドは、ＭＵＣ遺
伝子（すなわち、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３など）によりコードされる任意のポリペ
プチドである。あるいは、ムチンポリペプチドは、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド
１（ＰＳＧＬ−１）、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ９６、ＧｌｙＣＡＭ−１、Ｍ
ＡｄＣＡＭまたは赤血球糖タンパク質である。好ましくは、このムチンは、ＰＳＧＬ−１
である。一方、「非ムチンポリペプチド」は、その質量の少なくとも４０％未満がグリカ
ンに帰するポリペプチドをいう。
【００２１】
本発明のＡＢＯ融合タンパク質において、このムチンポリペプチドは、ムチンタンパク
質の全てまたは一部に対応し得る。１実施形態において、ＡＢＯ融合タンパク質は、ムチ
ンタンパク質の少なくとも一部を含む。「少なくとも一部」は、このムチンポリペプチド
が、少なくとも１つのムチンドメイン（例えば、Ｏ−連結グリコシル化部位）を含むこと
を意味する。１実施形態において、このムチンタンパク質は、このポリペプチドの細胞外
部分を含む。例えば、このムチンポリペプチドは、ＰＳＧＬ−１の細胞外部分を含む。
【００２２】
第一のポリペプチドは、１以上の血液型トランスフェラーゼによってグリコシル化され
る。第一のポリペプチドは、２個、３個、５個またはそれ以上の血液型トランスフェラー
ゼによってグリコシル化される。グリコシル化は、連続的または継続的である。あるいは
、グリコシル化は、同時発生的またはランダム（すなわち、特定の順序はない）である。
例えば、第一のポリペプチドは、α１，２フコシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｈ遺伝
子またはＳｅ遺伝子によってコードされるα１，２フコシルトランスフェラーゼ）によっ
てグリコシル化される。例示的なα１，２フコシルトランスフェラーゼは、ＦＵＴ１（Ｇ
ｅｎＢａｎｋ登録番号Ｑ１０９８４；Ｏ１０９８３；Ｏ１０９８１；ＡＴ４５５０２８お
よびＮＭ００１４８）およびＦＵＴ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｐ１９５２６；ＢＡＡ１
１６３８；Ｄ８２９３３およびＡ５６０９８）である。あるいは、第一のポリペプチドは
、１，３Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼまたはα１，３アセチルガラ
クトサミニルトランスフェラーゼによってグリコシル化される。いくつかの局面において
、第一のポリペプチドは、α１，２フコシルトランスフェラーゼおよび１，３Ｎ−アセチ
ルガラクトサミニルトランスフェラーゼまたはα１，３アセチルガラクトサミニルトラン
スフェラーゼの両方によってグリコシル化される。
【００２３】
融合タンパク質において、用語「作動可能に連結される」は、第一および第二のポリペ
プチドが、第一のポリペプチドのＯ−連結グリコシル化を可能にする様式で、（最も代表
的にはペプチド結合のような共有結合を介して）化学的に連結されることを示すことが意
図される。融合ポリペプチドをコードする核酸をいうために使用される場合、用語、作動
可能に連結される、は、ムチンポリペプチドおよび非ムチンポリペプチドをコードする核
酸が、互いにインフレームで融合していることを意味する。この非ムチンポリペプチドは
、ムチンポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
【００２４】
さらなる実施形態において、このＡＢＯ融合タンパク質は、１以上のさらなる部分に連
結され得る。例えば、このＡＢＯ融合タンパク質は、ＡＢＯ融合タンパク質配列がＧＳＴ
（すなわち、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＮ末端に連結された、ＧＳＴ
融合タンパク質にさらに連結され得る。このような融合タンパク質は、ＡＢＯ融合タンパ
ク質の精製を容易にし得る。あるいは、ＡＢＯ融合タンパク質は、固体支持体にさらに連
結され得る。種々の固体支持体が当業者に公知である。このような組成物は、抗血液型抗
体の除去を容易にし得る。例えば、ＡＢＯ融合タンパク質は、例えば、金属化合物、シリ
カ、ラテックス、ポリマー物質から作製される粒子；マイクロタイタープレート；ニトロ
セルロースもしくはナイロンまたはこれらの組み合わせに連結され得る。固体支持体に連
結されたＡＢＯ融合タンパク質は、吸収剤として使用されて、生物学的サンプル（例えば
、血液または血漿）から、抗血液型抗体を除去する。
【００２５】
別の実施形態では、融合タンパク質は、異種シグナル配列（すなわち、ムチン核酸によ
ってコードされるポリペプチド中に存在しないポリペプチド配列）をそのＮ末端に含む。
例えば、ネイティブなムチンシグナル配列は除去され得、そして別のタンパク質由来のシ
グナル配列で置き換えられ得る。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）では、ポ
リペプチドの発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用を通して増大され得る
。
【００２６】
本発明のキメラタンパク質または融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術によっ
て産生され得る。例えば、種々のポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントは、
従来技術に従って、例えば、連結のための平滑末端化末端もしくは付着末端化末端、適切
な末端を提供する制限酵素消化、必要に応じて粘着末端のフィルイン、望ましくない連結
を回避するアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結を用いることによって、イン
フレームで一緒に連結される。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成機を
含む、従来技術によって合成され得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、
その後アニーリングおよび再増幅されてキメラ遺伝子配列を作製し得る、２つの連続した
遺伝子フラグメントの間での相補的突出部を生じる、アンカープライマーを用いて実施さ
れ得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ
ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９２
を参照のこと）。さらに、融合部分（例えば、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域）をコード
する多くの発現ベクターが市販されている。糖タンパク質Ｉｂαコード核酸は、その融合
部分が、免疫グロブリンタンパク質に対してインフレームで連結されるように、このよう
な発現ベクター中にクローニングされ得る。
【００２７】
ＡＢＯ融合ポリペプチドは、オリゴマー（例えば、ダイマー、トリマーまたはペンタマ
ー）として存在し得る。好ましくは、ＡＢＯ融合ポリペプチドは、ダイマーである。
【００２８】
第１ポリペプチド（および／または第１ポリペプチドをコードする核酸）は、当該分野
で公知であるムチンコード配列を用いて構築され得る。ムチンポリペプチドおよびムチン
ポリペプチドをコードする核酸についての適切な供給源としては、ＧｅｎＢａｎｋ登録番
号ＮＰ６６３６２５およびＮＭ１４５６５０、ＣＡＤ１０６２５およびＡＪ４１７８１５
、ＸＰ１４０６９４およびＸＭ１４０６９４、ＸＰ００６８６７およびＸＭ００６８６７
、ならびにＮＰ００３３１７７７およびＮＭ００９１５１がそれぞれ挙げられ、そしてそ
れらの全体が本明細書中に参考として援用される。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ムチンポリペプチド部分は、天然に存在するムチン配列（野
生型）中に（非変異配列と比較して）増大した糖質含量をもたらす変異を有する改変体ム
チンポリペプチドとして提供される。例えば、改変体ムチンポリペプチドは、野生型ムチ
ンと比較してさらなるＯ結合型グリコシル化部位を含んでいた。あるいは、改変体ムチン
ポリペプチドは、野生型ムチンポリペプチドと比較して増加した数のセリン残基、トレオ
ニン残基またはプロリン残基をもたらす、アミノ酸配列変異を含む。この増加した糖質含
量は、当業者に公知の方法によって、ムチンのタンパク質対糖質の比率を決定することに
よって評価され得る。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ムチンポリペプチド部分は、天然に存在するムチン配列（野
生型）中に、タンパク質分解に対して（非変異配列と比較して）より耐性のムチン配列を
もたらす変異を有する改変体ムチンポリペプチドとして提供される。
【００３１】
いくつかの実施形態では、第１ポリペプチドは、全長ＰＳＧＬ−１を含む。あるいは、
第１ポリペプチドは、全長未満のＰＳＧＬ−１ポリペプチド（例えば、ＰＳＧＬ−１の細
胞外部分）を含む。例えば、４００アミノ酸長未満（例えば、３００アミノ酸長以下、２
５０アミノ酸長以下、１５０アミノ酸長以下、１００アミノ酸長以下、５０アミノ酸長以
下または２５アミノ酸長以下）の第１ポリペプチド。例示的なＰＳＧＬ−１ポリペプチド
配列およびＰＳＧＬ−１核酸配列としては、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ００６８６７；
ＸＭ００６８６７；ＸＰ１４０６９４およびＸＭ１４０６９４が挙げられる。
【００３２】
第２ポリペプチドは好ましくは可溶性である。いくつかの実施形態では、第２ポリペプ
チドは、第２ムチンポリペプチドとのＡＢＯ融合ポリペプチドの会合を容易にする配列を
含む。好ましい実施形態では、第２ポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドの少な
くとも一領域を含む。「少なくとも一領域」は、免疫グロブリン分子の任意の部分（例え
ば、軽鎖、重鎖、ＦＣ領域、Ｆａｂ領域、Ｆｖ領域またはそれらの任意のフラグメント）
を含むことを意味する。免疫グロブリン融合ポリペプチドは、当該分野で公知であり、そ
して例えば、米国特許第５，５１６，９６４号；同第５，２２５，５３８号；同第５，４
２８，１３０号；同第５，５１４，５８２号；同第５，７１４，１４７号；および同第５
，４５５，１６５号に記載される。
【００３３】
いくつかの実施形態では、第２ポリペプチドは、全長免疫グロブリンポリペプチドを含
む。あるいは、第２ポリペプチドは、全長未満の免疫グロブリンポリペプチド（例えば、
重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆｖ、またはＦｃ）を含む。好ましくは、第２ポリペプ
チドは、免疫グロブリンポリペプチドの重鎖を含む。より好ましくは、第２ポリペプチド
は、免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域を含む。
【００３４】
本発明の別の局面では、第２ポリペプチドは、野生型免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の
エフェクター機能よりも劣ったエフェクター機能を有する。Ｆｃエフェクター機能として
は、例えば、Ｆｃレセプター結合、補体結合およびＴ細胞枯渇活性が挙げられる（例えば
、米国特許第６，１３６，３１０号を参照のこと）。Ｔ細胞枯渇活性、Ｆｃエフェクター
機能、および抗体安定性をアッセイする方法は、当該分野で公知である。１つの実施形態
では、第２ポリペプチドは、Ｆｃレセプターに対する親和性が低いかまたはない。代替的
な実施形態では、第２ポリペプチドは、補体タンパク質Ｃ１ｑに対する親和性が低いかま
たはない。
【００３５】
本発明の別の局面は、ムチンポリペプチド、またはその誘導体、フラグメント、アナロ
グもしくはホモログをコードする核酸を含む、ベクター（好ましくは、発現ベクター）に
関する。種々の局面では、このベクターは、免疫グロブリンポリペプチド、またはその誘
導体、フラグメント、アナログもしくはホモログをコードする核酸に作動可能に連結した
、ムチンポリペプチドをコードする核酸を含む。さらに、このベクターは、血液型トラン
スフェラーゼ（例えば、α１，２フコシルトランスフェラーゼ、α１，３Ｎアセチルガラ
クトサミニルトランスフェラーゼ（α１，３Ｎ ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎ
ｉｎｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、α１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ、またはこ
れらの任意の組み合わせ）をコードする核酸を含む。血液型トランスフェラーゼは、ＡＢ
Ｏ融合タンパク質のムチン部分のペプチド（ｐｅｐｔｏｄｅ）骨格に対する血液型決定因
子の付加を促進する。本明細書中で用いられる場合、用語「ベクター」とは、連結されて
いる別の核酸分子を輸送し得る核酸分子をいう。ベクターの1つの型は、「プラスミド」
であり、プラスミドとは、さらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状二本鎖ＤＮＡル
ープをいう。ベクターの別の型は、ウイルスベクターであり、ここで、さらなるＤＮＡセ
グメントがウイルスゲノムに連結され得る。特定のベクターは、これらが導入される宿主
細胞中で自律的複製をし得る（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピ
ソームの哺乳動物ベクターを有する）。他のベクター（例えば、非エピソームの哺乳動物
ベクター）は、宿主細胞へと導入される際に、宿主細胞のゲノムへと組み込まれ、それに
よって、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に
連結される遺伝子の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書中で、「発現ベ
クター」といわれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、頻繁に
、プラスミドの形態である。本明細書中で、「プラスミド」および「ベクター」は、交換
可能に用いられ得る。なぜならば、プラスミドは、最も一般的に用いられるベクターの形
態だからである。しかし、本発明は、等価な機能を果たす、ウイルスベクター（例えば、
複製欠損のレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような、発現
ベクターのこのような他の形態を含むことを意図する。
【００３６】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主における核酸の発現に適切な形態で、本発明の核
酸分子を含み、このことは、組換え発現ベクターが、発現に用いられる宿主細胞に基づい
て選択された（すなわち、発現される核酸配列に作動可能に連結された）、1つ以上の調
節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に連結した（さ
れる）」とは、目的のヌクレオチド配列が、このヌクレオチド配列の発現を可能にする様
式で（例えば、インビトロ転写／翻訳システムにおいて、またはベクターが宿主細胞に導
入される場合、宿主細胞において）、調節配列に連結されるという意味が意図される。
【００３７】
用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例
えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。このような調節配列は、例え
ば、Ｇｏｅｄｄｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨ
ＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載される。調節配列としては、宿主細胞の
多くの型においてヌクレオチド配列の構成的発現を指向する配列、および特定の宿主細胞
においてのみヌクレオチド配列の発現を指向する配列（例えば、組織特異的調節配列）が
挙げられる。発現ベクターの設計は、例えば、形質転換される宿主細胞の選択、所望され
るタンパク質の発現のレベルなどの因子に依存し得ることが当業者により理解される。本
発明の発現ベクターは、宿主細胞へと導入されて、それにより、本明細書中に記載される
ような核酸によりコードされる、融合タンパク質もしくは融合ペプチド（例えば、ＡＢＯ
融合ポリペプチド、ＡＢＯ融合ポリペプチドの変異形態など）を含む、タンパク質もしく
はペプチドを産生し得る。
【００３８】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞におけるＡＢＯ融合
ポリペプチドの発現のために設計され得る。例えば、ＡＢＯ融合ポリペプチドは、Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクタ
ーを用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現され得る。適切な宿主細胞は、
Ｇｏｅｄｄｌｅ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯ
ＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）にさらに考察される。あるいは、組換え発現ベク
ターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、インビト
ロで転写および翻訳され得る。
【００３９】
原核生物におけるタンパク質の発現は、最も頻繁に、融合タンパク質または非融合タン
パク質のいずれかの発現を指向する構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含む
ベクターを用いて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで実施される。融合ベクターは、
それらの中でコードされるタンパク質に、通常は、組換えタンパク質のアミノ末端に、多
数のアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、代表的には、以下の３つの目的を
果たす：（ｉ）組換えタンパク質の発現を増大させること；（ｉｉ）組換えタンパク質の
可溶性を増大させること；および（ｉｉｉ）アフィニティー精製におけるリガンドとして
作用することにより、組換えタンパク質の精製を補助すること。頻繁に、融合発現ベクタ
ーにおいて、タンパク質分解切断部位が、融合部分と組み換えタンパク質との接合部に導
入されて、融合タンパク質の精製、引き続く、この融合部分からの組換えタンパク質の分
離を可能にする。このような酵素、およびこれらの同族の認識配列としては、第Ｘａ因子
、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。代表的な融合発現ベクターとしては
、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎ
ｓｏｎ，１９８８．Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）、およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられ、これらは、標的組換えタンパク質
に対して、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結
合タンパク質、またはプロテインＡを融合する。
【００４０】
適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎ
ら（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３０５）およびｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅ
ｒら、ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ
ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ
，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。
【００４１】
Ｅ．ｃｏｌｉ中の組換えタンパク質発現を最小にする１つのストラテジーは、組み換え
タンパク質をタンパク質分解により切断する能力が損なわれた宿主細菌において、タンパ
ク質を発現することである。例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩ
ＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）１１９
−１２８を参照のこと。別のストラテジーは、各アミノ酸についての個々のコドンが、Ｅ
．ｃｏｌｉにおいて優先的に利用されるものであるように、発現ベクターへと挿入される
核酸の核酸配列を変化させることである（例えば、Ｗａｄａら、１９９２．Ｎｕｃｌ．Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８を参照のこと）。本発明の核酸配列のこの
ような変更は、標準的なＤＮＡ合成技術により実行され得る。
【００４２】
別の実施形態において、ＡＢＯ融合ポリペプチド発現ベクターは、酵母発現ベクターで
ある。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓａｅにおける発現のためのベク
ターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６
：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９８２．
Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、１９８７．Ｇｅ
ｎｅ ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）およびｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ
Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
【００４３】
あるいは、ＡＢＯ融合ポリペプチドは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して、昆
虫細胞において発現され得る。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）におけるタンパク質
の発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉ
ｔｈら、１９８３．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶ
Ｌシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ，１９８９．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７
０：３１−３９）が挙げられる。
【００４４】
さらに別の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺
乳動物細胞において発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅ
ｅｄ，１９８７．Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ
ら、１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞におい
て使用される場合、この発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイルス調節エレメント
により提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイ
ルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０由来である。原核生物細胞お
よび真核生物細胞の両方に適切な他の発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、
ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．第２
版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９の第１６章および１７章を参照のこと。
【００４５】
本発明の別の局面は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。用
語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」とは、本明細書中で交換可能に使用される。こ
のような用語は、特定の被験体細胞を言及するだけでなく、このような細胞の子孫または
潜在的な子孫も言及することが理解される。特定の改変は、変異の影響または環境的な影
響のいずれかに起因して、次世代で生じ得るので、このような子孫は、実際のところ、親
細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書中で使用されるような用語の範囲内になお
含まれる。
【００４６】
宿主細胞は、任意の原核動物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、糖タンパク
質Ｉｂα融合ポリペプチドは、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母細胞
または哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）も
しくはＣＯＳ細胞）において発現され得る。他の適切な宿主細胞が、当業者に公知である
。
【００４７】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換技術またはトランスフェクション技術によって、原
核生物細胞または真核生物細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「形
質転換」および「トランスフェクション」は、異種核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に
導入するための当該分野で認められた種々の技術をいうことが意図され、これらの技術と
しては、リン酸カルシウム共沈殿もしくは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラ
ン媒介性トランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションが挙げ
られる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするための適切な方法は、Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ Ｍ
ＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）、および他の研究用マニュアルに
見出され得る。
【００４８】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションについて、使用される発現ベクターおよび
トランスフェクション技術に依存して、わずかな細胞しか異種ＤＮＡをそのゲノムに組み
込み得ないことが知られている。これらの要素を同定および選択するために、選択マーカ
ー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子は、一般的に、目的の遺伝子と
共に宿主細胞に導入される。種々の選択マーカーとしては、薬物に対する耐性を与えるマ
ーカー（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキサート）が挙げられる。
選択マーカーをコードする核酸は、糖タンパク質Ｉｂα融合ポリペプチドをコードするベ
クターと同じベクターを用いて宿主細胞に導入され得るか、または別個のベクターを用い
て導入され得る。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によ
り同定され得る（例えば、選択マーカー遺伝子を組み込まれた細胞は生き残り、一方、他
の細胞は、死ぬ）。
【００４９】
培養物中の本発明の宿主細胞（例えば、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞）は
、ＡＢＯ融合ポリペプチドを産生（すなわち、発現）するために使用され得る。従って、
本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用して、ＡＢＯ融合ポリペプチドを産生するため
の方法を提供する。一実施形態において、この方法は、本発明の宿主細胞（この宿主細胞
に、ＡＢＯ融合ポリペプチドをコードする組換え発現ベクターが導入されている）を、適
切な培地中で、ＡＢＯ融合ポリペプチドが産生するように、培養する工程を包含する。別
の実施形態において、この方法はさらに、この培地または宿主細胞からＡＢＯポリペプチ
ドを単離する工程を包含する。
【００５０】
ＡＢＯ融合ポリペプチドは、従来の条件（例えば、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、
アフィニティクロマトグラフィー、電気泳動など）に従って、単離および精製され得る。
例えば、免疫グロブリン融合タンパク質は、この融合タンパク質のＦｃ部分に選択的に結
合する固定化されたプロテインＡまたはプロテインＧを含むカラムに溶液を通すことによ
り、精製され得る。例えば、Ｒｅｉｓ，Ｋ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３２：３０
９８−３１０２（１９８４）ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ８７／００３２９を参照のこと。こ
の融合ポリペプチドは、カオトロピック塩での処理によって、または酢酸水溶液（１Ｍ）
での溶出によって、溶出され得る。
【００５１】
あるいは、本発明に従うＡＢＯ融合ポリペプチドは、当該分野で公知の方法を使用して
、化学的に合成され得る。ポリペプチドの化学合成は、例えば、以下に記載される。種々
のタンパク質合成方法が、当該分野で公知であり、これにはペプチド合成機を使用する合
成が挙げられる。例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａ
ｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ，Ｂｏｄａｓｎｓｋｙ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９
８８；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：２４１−２４７（１９８６）；
Ｂａｒａｎｙら、Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３０：７０
５−７３９（１９８７）；Ｋｅｎｔ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：９５７−
９８９（１９８８）、およびＫａｉｓｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１８７−１９８
（１９８９）を参照のこと。このポリペプチドは、化学前駆体も他の化学物質も実質的に
含まなくなるように、標準的なペプチド精製技術を使用して精製される。用語「化学前駆
体も他の化学物質も実質的に含まない」は、ペプチドが、このペプチドの合成に関与する
化学前駆体または他の化学物質から分離されているペプチドの調製物を含む。一実施形態
において、用語「化学前駆体も他の化学物質も実質的に含まない」は、約３０％（乾燥重
量）未満の化学前駆体または非ペプチド化学物質、より好ましくは約２０％未満の化学前
駆体または非ペプチド化学物質、さらにより好ましくは約１０％未満の化学前駆体または
非ペプチド化学物質、最も好ましくは約５％未満の化学前駆体または非ペプチド化学物質
を有するペプチドの調製物を含む。
【００５２】
ポリペプチドの化学合成は、改変されたかまたは非天然のアミノ酸（Ｄ−アミノ酸が挙
げられる）および他の有機低分子の組み込みを容易にする。対応するＤ−アミノ酸アイソ
フォームでの、ペプチド中の１つ以上のＬ−アミノ酸の置換は、酵素的加水分解に対する
ペプチドの耐性を増加するため、および生物学的に活性なペプチドの１つ以上の特性（す
なわち、レセプター結合、機能的効力または作用の持続時間）を増強するために、使用さ
れ得る。例えば、Ｄｏｈｅｒｔｙら、１９９３．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：２５８５
−２５９４；Ｋｉｒｂｙら、１９９３．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：３８０２−３８０
８；Ｍｏｒｉｔａら、１９９４．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５３：８４−８８；Ｗａｎｇら
、１９９３．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．４２：３９２−３９９；
ＦａｕｃｈｅｒｅおよびＴｈｉｕｎｉｅａｕ，１９９２．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．２
３：１２７−１５９を参照のこと。
【００５３】
ペプチド配列への供給架橋の導入は、ポリペプチド骨格を立体配置的かつ組織分布的に
制約し得る。このストラテジーは、増加した効力、選択性および安定性を有する融合ポリ
ペプチドのペプチドアナログを開発するために使用され得る。環状ペプチドの構造エント
ロピーは、その直線状対応物の構造エントロピーより低いので、特定のコンフォメーショ
ンの採用は、非環式アナログのエントロピーの減少よりも小さい環状アナログのエントロ
ピーの減少を伴って生じ、それにより、結合の自由エネルギーをより有利にする。大環状
化は、しばしば、ペプチドのＮ末端とＣ末端との間、側鎖とＮ末端もしくはＣ末端との間
［例えば、ｐＨ８．５においてＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６を用いた場合］（Ｓａｍｓｏｎら、Ｅ
ｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３７：５１８２−５１８５（１９９６））、または２つの
アミノ酸側鎖の間のアミド結合の形成によって達成される。例えば、ＤｅＧｒａｄｏ，Ａ
ｄｖ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ，３９：５１−１２４（１９８８）を参照のこと。ジス
ルフィド結合もまた、直線状配列に組み込まれ、その可撓性を低下させる。例えば、Ｒｏ
ｓｅら、Ａｄｖ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ，３７：１−１０９（１９８５）；Ｍｏｓｂ
ｅｒｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，１０６：５０５−
５１２（１９８２）を参照のこと。さらに、ペニシラミン（Ｐｅｎ，３−メルカプト−（
Ｄ）バリン）でのシステイン残基の置換は、あるオピオイド−レセプター相互作用の選択
性を増加するために使用されている。ＬｉｐｋｏｗｓｋｉおよびＣａｒｒ，Ｐｅｐｔｉｄ
ｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ
，Ｇｕｔｔｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ２８７−３２０頁（１９９５）。
【００５４】
（抗体媒介性移植片拒絶の処置または予防の方法）
抗体媒介性移植片拒絶（ＡＭＲ）（例えば、臓器移植拒絶）を処置または予防する方法
もまた、本発明に含まれる。このような移植片としては、腎臓、肝臓、皮膚、膵臓、角膜
または心臓が挙げられるが、これらに限定されない。ＡＭＲとは、レシピエントによる任
意の抗体媒介性移植片拒絶を含むことを意味する。この方法は、被験体由来の生物学的サ
ンプルを本発明のＡＢＯ融合ペプチドと接触させる工程を包含する。この生物学的サンプ
ルは、例えば、血液（すなわち、全血または血漿）である。このサンプルは、抗体（例え
ば、抗血液型抗体）を含むことが知られているか、またはこのような抗体を含むと疑われ
ている。いくつかの局面において、この生物学的サンプルは、ＡＢＯ融合ポリペプチドと
このサンプルとを接触させる前に、被験体から取り出される。この生物学的サンプルは、
ＡＢＯ融合ペプチド−抗血液型抗体複合体の形成を可能にする条件下で、ＡＢＯ融合ペプ
チドと接触される。このＡＢＯ融合ペプチド複合体は、存在する場合、抗血液型抗体を排
除するためにこの生物学的サンプルから分離され、そしてこの生物学的サンプルは、被験
体に再注入される。ＡＭＲはまた、本発明のＡＢＯ融合ポリペプチドを被験体に投与する
ことによって、処置または予防される。
【００５５】
被験体は、例えば、任意の哺乳動物（例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、
ネコ、ウシ、ウマ、ブタ）であり得る。処置は、被験体がＡＢＯ不適合性移植片を受ける
前に、施される。あるいは、処置は、被験体がＡＢＯ不適合性移植片を受けた後に、施さ
れる。
【００５６】
生物学的サンプルは、当業者に公知の方法によって、ＡＢＯ融合タンパク質と接触され
る。例えば、血漿しゃ血または体外免疫吸収。
【００５７】
本質的に、抗体媒介性反応と病原学的に関連する任意の障害は、予防または処置を受け
やすいとみなされる。ＡＭＲは、臓器移植の生存率が、本発明の方法により処置されない
臓器移植の生存率よりも大きい場合、処置または予防される。移植の生存率とは、移植片
がレシピエントにより拒絶される前の時間を意味する。例えば、ＡＭＲは、移植片が、移
植後少なくとも１、２、４または８週間生存する場合、処置または予防される。好ましく
は、この移植片は、３、６、１３ヶ月生存する。より好ましくは、この移植片は、２、３
、５年またはそれ以上生存する。
【００５８】
（サンプルから抗血液型抗体を除去する方法）
サンプルから抗血液型抗体を除去または枯渇する方法もまた、本発明に含まれる。この
サンプルは、生物学的流体（例えば、血液または血漿）である。あるいは、このサンプル
は、生物学的組織（例えば、心臓組織、肝臓組織、皮膚または腎臓組織）である。この方
法は、サンプルと本発明のＡＢＯ融合ペプチドを接触させる工程を包含する。このサンプ
ルは、ＡＢＯ融合ペプチド−抗血液型抗体複合体の形成を可能にする条件下で、ＡＢＯ融
合ペプチドと接触される。このＡＢＯ融合ペプチド−抗体複合体は、存在する場合、抗血
液型抗体を除去または枯渇するために、この生物学的サンプルから分離される。
【００５９】
（ＡＢＯ融合ポリペプチドまたはこれらをコードする核酸を含む薬学的組成物）
本発明のＡＢＯ融合タンパク質、またはこれらの融合タンパク質をコードする核酸分子
（本明細書中において、「治療剤」または「活性化合物」とも呼ばれる）、ならびにこれ
らの誘導体、フラグメント、アナログおよびホモログは、投与のために適切な薬学的組成
物に混合され得る。このような組成物は、代表的に、核酸分子、タンパク質、または抗体
および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書中において使用される場合、「薬学
的に受容可能なキャリア」は、薬学的投与に適合性の、任意の全ての溶媒、分散媒体、コ
ーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張性剤および吸収遅延剤などを含むことが意図さ
れる。適切なキャリアは、当該分野における標準的な参考教科書である、Ｒｅｍｉｎｇｔ
ｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版（本明細書中にお
いて参考として援用される）に記載される。このようなキャリアまたは希釈剤の好ましい
例としては、限定しないが、水、生理食塩水、フィンガー溶液（ｆｉｎｇｅｒ’ｓ ｓｏ
ｌｕｔｉｏｎ）、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。リ
ポソームおよび非水性ビヒクル（例えば、不揮発性油）もまた使用され得る。薬学的に活
性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野において周知である。任
意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合性である場合を除いて、組成物における
それらの使用が企図される。補助的な活性化合物もまた、組成物に組み込まれ得る。
【００６０】
本明細書中に開示される活性剤はまた、リポソームとして処方され得る。リポソームは
、当該分野で公知の方法（例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）；および米国特許第４，４８５，
０４５号および同第４，５４４，５４５号に記載される）によって調製される。向上した
循環時間を有するリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示される。
【００６１】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導
体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いる、逆相
エバポレーション法によって作製され得る。リポソームは、所望の直径を有するリポソー
ムを生じるように、規定された孔サイズのフィルターを通して押し出される。
【００６２】
本発明の薬学的組成物は、その意図された投与の経路と適合性であるように処方される
。投与の経路の例としては、非経口的投与、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、
経口（例えば、吸入）投与、経皮（すなわち、局所的）投与、経粘膜投与、および直腸投
与が挙げられる。非経口適用、皮内適用、または皮下適用のために使用される溶液または
懸濁液は、以下の成分を含み得る：注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレ
ングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような滅菌希釈
剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸または重
亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のようなキレ
ート剤；アセテート、シトレートまたはホスフェートのような緩衝剤、および塩化ナトリ
ウムまたはデキストロースのような張度の調節のための薬剤。ｐＨは、酸または塩基（例
えば、塩酸または水酸化ナトリウム）を用いて調節され得る。非経口調製物は、ガラスま
たはプラスチックから作製されたアンプル、使い捨て可能シリンジまたは複数用量のバイ
アル中に含まれ得る。
【００６３】
注射可能用途に適切な薬学的組成物としては、滅菌水溶液（水溶性である場合）または
分散物および滅菌注射可能溶液または分散物の即席調製物のための滅菌粉末が挙げられる
。静脈内投与のために、適切なキャリアとしては、生理学的生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅ
ｍｏｐｈｏｒ ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩
衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、滅菌でなけれ
ばならず、そして容易に注射可能である程度まで流体であるべきである。組成物は、製造
および保存の条件下において安定でなければならず、そして微生物（例えば、細菌および
真菌）の混入作用に対して保存されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノ
ール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチ
レングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒体であり得
る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散の場
合、必要とされる粒子サイズの維持によって、そして界面活性剤の使用によって、維持さ
れ得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロ
ロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る
。多くの場合において、等張性剤（例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール
）、ソルビトール、塩化ナトリウム）を組成物中に含むことが好ましい。注射可能組成物
の長期の吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよび
ゼラチン）を組成物中に含むことによってもたらされ得る。
【００６４】
滅菌注射可能溶液は、活性化合物（例えば、ＡＢＯ融合タンパク質）を必要とされる量
で、適切な溶媒中に、上記成分の１つまたは組合せと混合し、必要に応じて、続いて、滅
菌濾過することによって、調製され得る。一般的に、分散物は、ベーシックな分散媒体お
よび必要とされる上記成分からの他の成分を含む、滅菌ビヒクルに、活性化合物を混合す
ることによって調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法
は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これは、先に滅菌濾過された溶液からの、活性成分
および任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる。
【００６５】
経口組成物は、一般的に、不活性な希釈剤または食用キャリアを含む。これらは、ゼラ
チンカプセルに含まれ得るかまたは錠剤に圧縮され得る。経口治療投与のために、活性化
合物は、賦形剤と混合され得、そして錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用され
得る。経口組成物はまた、マウスウオッシュとしての使用のために流体キャリアを使用し
て調製され得、ここで、流体キャリア中の化合物は、経口適用され、スウィッシュされ、
そして吐き出されるかまたは嚥下される。薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジ
ュバント物質は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤
などは、類似の性質の以下の成分、または化合物のいずれかを含み得る：結合剤（例えば
、微結晶セルロース、トラガカントガムまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンま
たはラクトース）、崩壊剤（例えば、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスタ
ーチ）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅ）；グリダン
ト（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロー
スまたはサッカリン）；または香料（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、または
オレンジ香料）。
【００６６】
吸入による投与のために、化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素のような気体
）を含む加圧容器または分散器、あるいは噴霧器からエアロゾル噴霧の形態で送達される
。
【００６７】
全身投与はまた、経粘膜的手段または経皮的手段によってであり得る。経粘膜的投与ま
たは経皮的投与のために、浸透される障壁に対して適切な浸透剤は、処方物で使用される
。このような浸透剤は、一般的に、当該分野で公知であり、そして例えば、経粘膜的投与
のため、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜的投与は
、経鼻スプレーまたは坐剤の使用によって達成され得る。経皮投与のために、活性化合物
は、当該分野において一般的に公知な、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）
、ゲル、またはクリームに処方される。
【００６８】
化合物はまた、坐剤の形態で（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従
来の坐剤ベースとともに）または直腸送達のための保持浣腸で、調製され得る。
【００６９】
１つの実施形態において、活性化合物は、身体からの迅速な排除に対して化合物を保護
するキャリア（例えば、徐放処方物（移植物およびマイクロカプセル化送達システムを含
む））を用いて調製される。生分解性、生体適合性ポリマー（例えば、エチレンビニルア
セテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポ
リ乳酸）が使用され得る。このような処方物の調製のための方法は、当業者に明らかであ
る。これらの材料はまた、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒ
ｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手され得る。リポソーム懸濁物（ウイ
ルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染した細胞に標的化されたリポソームを
含む）もまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば、米
国特許第４，５２２，８１１号に記載されるように、当業者に公知の方法に従って調製さ
れ得る。
【００７０】
いくつかの実施形態において、経口組成物または非経口組成物は、投与の容易さおよび
均一な投与のために投薬単位形態で処方される。本明細書中で使用される投薬単位形態は
、処置される被験体に対して単位投薬として適切な物理的に異なる単位をいい；それぞれ
の単位は、必要とされる薬学的キャリアとともに、所望の治療的効果を生成するように計
算された所定量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態のための詳細は、活性化合物
の独特の特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに個体の処置のためのこのよ
うな活性化合物を配合する当該分野に固有の制限によって示され、そして直接的に依存す
る。
【００７１】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入され得、そして遺伝子治療ベクターとして使用さ
れ得る。遺伝子治療ベクターは、被験体に、例えば、静脈内注射、局所投与（例えば、米
国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）によって、または定位的な注射（例えば、
Ｃｈｅｎら、１９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３０５
４−３０５７を参照のこと）によって被験体に送達され得る。遺伝子治療ベクターの薬学
的調製物は、受容可能な希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含み得るか、または遺伝子治療
ビヒクルが埋め込まれる徐放マトリクスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクタ
ーが、組換え細胞からインタクトに作製され得る場合（例えば、レトロウイルスベクター
）、薬学的調製物は、遺伝子送達システムを作製する１つ以上の細胞を含み得る。
【００７２】
持続放出調製物は、所望であれば、調製され得る。持続放出調製物の適切な例としては
、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスが挙げられ、このマトリクスは、
形付けられた物品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態である。持続放出
マトリクスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエ
チル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許
第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタメートのコポ
リマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（
例えば、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイ
プロリドから構成される注射可能なミクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒ
ドロキシ酪酸が挙げられる。エチレンビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸のよう
なポリマーが１００日にわたる間、分子の放出を可能にする一方で、特定のヒドロゲルが
より短い時間の間、タンパク質を放出する。
【００７３】
薬学的組成物は、投与のための説明書とともに、容器、パックまたは分散器中に含まれ
得る。
【００７４】
本発明はさらに、以下の非制限的な実施例で例示される。
【実施例】
【００７５】
（実施例１：一般的方法）
本明細書中に記載されるデータは、以下の試薬および方法を使用して作製された。
【００７６】
（細胞培養）
ＣＯＳ−７ ｍ６細胞（Ｓｅｅｄ，１９８７）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６
１）、およびＳＶ４０ラージＴ抗原を発現する２９３ヒト胚性腎臓細胞株（２９３Ｔ；Ｂ
．Ｓｅｅｄによって親切にも提供された）を、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ培地（
ＧｉｂｃｏＢｒｌ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｓｃｏｔｌ
ａｎｄ）（１０％ウシ胎仔血清（ＧｉｂｃｏＢｒｌ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ）、２５μｇ／ｍｌゲンタマイシンスルフェート（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍ
Ｏ）および２ｍＭグルタミン（ＧｉｂｃｏＢｒｌ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
）を補充した）において培養した。細胞を、２〜４日毎に継代させた。ＨＨ１４ハイブリ
ドーマ（ＡＴＣＣ ＨＢ−９２９９；米国特許第４，８５７，６３９号）を、ＲＰＭＩ
１６４０（ＧｉｂｃｏＢｒｌ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（１０％ウシ胎仔
血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／μｌストレプトマイシンおよび２ｍＭグ
ルタミンを補充した）において培養した。
【００７７】
（ＨＨ１４抗体の精製）
上清を、培養したＨＨ１４細胞から収集した。２リットルの上清を、ヤギ抗マウスＩｇ
Ｍ（Ｓｉｇｍａ）カラムで、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＬＰクロマトグラフ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈ
ｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いてアフィニティー精製した。結合したタンパク質を、０．
１ＭグリシンＣｌ（ｐＨ２．５）によって溶出させ、そして溶出物を、１Ｍ Ｔｒｉｓ−
Ｃｌ（ｐＨ７．５）を用いて直ちに中和した。溶出物を、１％リン酸緩衝化生理食塩水（
ＰＢＳ）に対して透析し、そして凍結乾燥した。凍結乾燥したタンパク質を、ＢＣＡアッ
セイによって測定した場合に３μｇ／μｌの最終濃度になるように、蒸留Ｈ２Ｏ中に溶解
させた。
【００７８】
（発現ベクターの構築）
ヒト血液型Ａ遺伝子を、ＭＫＮ−４５細胞株から単離された総ＲＮＡから作製されたｃ
ＤＮＡから、５’−ｃｇｃ ｇｇｇ ａａｇ ｃｔｔ ｇｃｃ ｇａｇ ａｃｃ ａｇａ
ｃｇｃ ｇｇａ−３’（配列番号１）を正方向プライマーとして、そして５’−ｃｇｃ
ｇｇｇ ｃｇｇ ｃｃｇ ｃｔｃ ａｃｇ ｇｇｔ ｔｃｃ ｇｇａ ｃｃｇ ｃ−３
’（配列番号２）を逆方向プライマーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によ
って増幅した。増幅されたｃＤＮＡ（Ａ遺伝子）を、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＮｏｔ Ｉ
を用いて、ＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，１９８７）のポリリンカー中にサブクローン化した。血
液型Ｈ遺伝子を、ヒト扁桃支質ライブラリーをテンプレートとして用いてＰＣＲ増幅して
２片とした。内部Ｓｓｅ Ｉ部位を、ヌクレオチド７７５（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３
５５３１）をＣへと変化させて、Ｐｓｔ Ｉ部位からＳｓｅ Ｉ部位を作製する内部重複
プライマーを用いたＰＣＲによって作製した。ＦＵＴ１のカルボキシ末端をコードするｃ
ＤＮＡを、５’−ｇｇｇ ｇａｃ ｔａｃ ｃｔｇ ｃａｇ ｇｔｔ ａｔｇ ｃｃｔ
ｃａｇ ｃｇｃ−３’（配列番号３）を正方向プライマーとして、そして５’−ｃｇｃ
ｇｇｇ ｇｃｇ ｇｃｃ ｇｃｔ ｔｃａ ａｇｇ ｃｔｔ ａｇｃ ｃａａ ｔｇｔ−
３’（配列番号４）を逆方向プライマーとして用いて増幅し、Ｓｓｅ ＩおよびＮｏｔ
Ｉによって切断し、そしてＰｓｔ ＩおよびＮｏｔ Ｉで消化したＣＤＭ８発現ベクター
中にサブクローン化した。ＦＵＴ１のアミノ末端をコードするｃＤＮＡを、５’−ｃｇｃ
ｇｇｇ ａａｇ ｃｔｔ ａｃｃ ａｔｇ ｔｇｇ ｃｔｃ ｃｇｇ ａｇｃ ｃａｔ
−３’（配列番号５）を正方向プライマーとし、そして５’−ｃｃａ ｇｃｇ ｃｔｇ
ａｇｇ ｃａｔ ａａｃ ｃｔｇ ｃａｇ ｇｔａ ｇｔｃ−３’（配列番号６）を逆方
向プライマーとして用いて増幅し、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＳｓｅ Ｉによって切断し、
そしてＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＳｓｅ Ｉ切断後の、カルボキシ末端を保有するＣＤＭ８
中にサブクローン化した。
【００７９】
Ｓｅ遺伝子を、血液型Ａ２Ｌｅ（ａ−ｂ＋）Ｓｅ個体によって提供された末梢血単核細
胞から単離された総ＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡから、５’−ｃｇｃ ｇｇｇ ａａ
ｇ ｃｔｔ ａｃｃ ａｔｇ ｃｔｇ ｇｔｃ ｇｔｔ ｃａｇ ａｔｇ−３’（配列番
号７）を正方向プライマーとして、そして５’−ｃｇｃ ｇｇｇ ｃｇｇ ｃｃｇ ｃｔ
ｔ ａｇｔ ｇｃｔ ｔｇａ ｇｔａ ａｇｇ ｇ−３’（配列番号８）を逆方向プライ
マーとして用いて同様にＰＣＲ増幅した。このＳｅ遺伝子ｃＤＮＡを、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
およびＮｏｔ Ｉを用いてＣＤＭ８中にサブクローン化した。グリコシルトランスフェラ
ーゼｃＤＮＡを配列決定し、そしてこれらがコードする酵素活性を、血液型ＨおよびＡ特
異的モノクローナル抗体を用いた、一過的にトランスフェクトされた細胞のフローサイト
メトリー分析によってチェックした。ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂキメラを、以前（Ｌｉ
ｕら，１９９７）に記載されたとおりに構築した。
【００８０】
（トランスフェクションおよび分泌されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂキメラの産生）
トランスフェクションカクテルを、５ｍｌポリスチレンチューブ中で３９μｌの２０％
グルコース、３９μｇのプラスミドＤＮＡ、１２７μｌのｄＨ２Ｏ、および１５．２μｌ
の０．１Ｍポリエチレンイミン（２５ｋＤａ；Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗ
Ｉ）を混合することによって調製した。全てのトランスフェクション混合物において、１
３μｇのＰＳＧＬ‐１／ｍＩｇＧ２ｂプラスミドを用いた。種々のグリコシルトランスフ
ェラーゼ（ｇｌｙｃｏｓｙｉｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）に対して、１３μｇのこのプラス
ミドを添加し、そして必要な場合、合計３９μｇのプラスミドＤＮＡに達するようにＣＤ
Ｍ８プラスミドを添加した。この混合物を室温で１０分間静置し、その後、１０ｍｌの培
養培地中に入れて、約７０％コンフルエンシーな細胞に添加した。７日後、細胞上清を収
集し、細片をスピンダウン（１４００×ｇ、１５分間）し、そしてＮａＮ３を、０．０２
％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるように添加した。
【００８１】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析のための、分泌されたＰＳＧＬ−１
／ｍＩｇＧ２ｂの精製）
ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ融合タンパク質を、４℃で一晩回転させることによって、
５０μｌヤギ抗ｍＩｇＧアガロースビーズ（１００：１のスラリー；Ｓｉｇｍａ）によっ
て、収集した上清から精製した。融合タンパク質を有するビーズをＰＢＳ中で３回洗浄し
、そしてその後の分析のために用いた。代表的には、サンプルを５０μｌの２×還元サン
プル緩衝液中に溶解し、そして１０：１のサンプルを各ウェルにローディングした。
【００８２】
（アフィニティー精製したＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂのＰＮＧａｓｅＦ処理）
ＰＮＧａｓｅＦキット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌ
ｉｓ，ＩＮ）を、Ｎ−グリカンの脱グリコシル化のために用いた。製造業者によって提供
されたプロトコルのわずかな改変版を用いた。１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ
中で、２０μｌの反応緩衝液を、アガロースビーズ上の精製したＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ
２ｂと混合し、そして３分間煮沸した。この混合物をスピンダウンし、そして１０μｌの
上清を新たなＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移した。１０μｌのＰＮＧａｓｅＦまたはネ
ガティブコントロールとして１０μｌの反応緩衝液を添加した。チューブを、１．５時間
にわたって３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、２０μｌの２×還元サ
ンプル緩衝液および１０μｌのＨ２Ｏを添加し、そしてサンプルを３分間煮沸した。
【００８３】
（上清中のＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ濃度の決定のためのＥＬＩＳＡ）
９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３５９０，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を
、５０μｌの５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中の０．５μｇ／ウェルのアフィニティ
ー精製したヤギ抗ｍＩｇＧ特異性抗体（Ｓｉｇｍａ）で、室温で２時間にわたってコーテ
ィングした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ−Ｔ）を含むＰＢＳ中の３％ウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）３００μｌを用いて４℃で一晩ブロッキングし、続いて洗浄した後、培
養培地中に連続希釈した、５０μｌのサンプル上清を添加した。洗浄後、これらのプレー
トを、ブロッキング緩衝液中に１０，０００：１希釈したヤギ抗ｍＩｇＭ−ＨＲＰ（Ｓｉ
ｇｍａ）５０μｌとともに２時間にわたってインキュベートした。発色溶液のために、１
錠の３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Ｓｉｇｍａ）を、３μｌの３０％（
ｗ／ｖ）Ｈ２Ｏ２を含む１１ｍｌの０．０５Ｍクエン酸／リン酸緩衝液中に溶解した。１
００μｌの発色溶液を添加した。反応を、２５μｌの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を用いて停止させ
た。これらのプレートを、自動化マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔ
ｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）において４５０ｎｍおよび５４０ｎｍで読み
取った。標準として、培養培地中の精製ｍＩｇＧ Ｆｅフラグメント（Ｓｉｇｍａ）の希
釈シリーズを三連で用いた。
【００８４】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、５％スタッキングゲルおよび８％分離ゲルを用いるＬａｅｍｍｌ
ｉ（１９７０）の方法によって行い、そして分離されたタンパク質を、以前（Ｌｉｕら，
１９９７）に記載されるとおりに、ＨｙｂｏｎｄＴＭ−Ｃエキストラメンブレン上に電気
泳動的にブロッティングした。３％ ＢＳＡを含む、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含
むＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ−Ｔ）中での一晩のブロッキング後、これらのメン
ブレンを、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。次いで、これらを、マウス抗ヒト血液型Ａ全種類
（ｍＩｇＭ，Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）または抗ヒトＨ型１（ｍＩｇＧ
３，Ｓｉｇｎｅｔ；Ｄｅｄｈａｍ，ＭＡ）、抗ヒトＨ型２（ｍＩｇＭ，Ｄａｋｏ）もしく
は抗ヒトＨ型３（ｍＩｇＭ，ハイブリドーマＨＨ１４，ＡＴＣＣ ＨＢ９２９９）ととも
に、１時間にわたって室温でインキュベートした。Ｈ型３抗体以外の全ての抗体を、ＴＢ
Ｓ−Ｔ中の３％ ＢＳＡ中に１：２００希釈した。Ｈ型３抗体を、ＴＢＳ−Ｔ中の３％
ＢＳＡにおいて１μｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した。これらのメンブレンを、ＴＢ
Ｓ−Ｔで３回洗浄し、その後、ＴＢＳ−Ｔ中の３％ ＢＳＡに２０００：１希釈した、西
洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化二次抗体である、ヤギ抗ｍＩｇＭ（Ｃａｐ
ｐｅｌ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）またはヤギ抗ｍＩｇＧ３（Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｏｘｆｏｒｄ
，Ｅｎｇｌａｎｄ）とともに１時間にわたって室温でインキュベートした。結合した二次
抗体を、製造業者の指示に従って、ＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた化学発光によって可視化
した。ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ自体の検出のために、ＨＲＰ標識ヤギ抗ｍＩｇＧ（Ｓ
ｉｇｍａ）を、二次抗体とのインキュベーションを行わないこと以外は上記のとおりに、
ＴＢＳ−Ｔ中の３％ ＢＳＡにおける１：１０，０００の希釈で用いた。
【００８５】
（ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂによる相対血液型Ａエピトープ密度の決定）
ウェスタンブロットを、上記の通りに行った。メンブレンを、−３５℃で作動するＣＣ
Ｄカメラを備えるＦｌｕｏｒ−Ｓ Ｍａｘ Ｍｕｉｔｌｍａｇｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）にお
いて可視化した。Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）の分析ウィン
ドウにおいて量ツールを用いて、血液型Ａ反応性についての量（量境界ｘピクセル領域内
のピクセルの強度の合計）を、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞および２９３Ｔ細胞中で作製した
ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂについてのｍＩｇＧ反応性量で除算した。異なる宿主細胞中
で作製したＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧｂ２ｂ間でＡエピトープ／マウスＩｇＧ比を比較する
ために、比を、Ｈ遺伝子およびＡ遺伝子でトランスフェクトされたＣＯＳ細胞中で作製さ
れたＡ置換ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂから得られた比に対して正規化した。
【００８６】
（血清の吸収）
ヤギ抗ｍＩｇＧアガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）の６００マイクロリットルのスラリー
を、１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ微量遠心管に移した。これらのビーズを、４００×
ｇでのすばやいスピンによってスピンダウンした。次いで、上清を除去し、そしてこれら
のビーズを１ｍｌ ＰＢＳで１回洗浄し、再度スピンダウンし、そしてＰＳＧＬ−１／ｍ
ＩｇＧ２ｂをコードするｃＤＮＡ（Ｓｅ遺伝子およびＡ遺伝子）でトランスフェクトされ
たＣＨＯ細胞由来の１８０ｍｌの上清に移した。アガロースビーズを含む上清を、４℃で
一晩、回転させながらインキュベートした。収集のために、これらのビーズを４００×ｇ
で１５分間、室温でスピンダウンし、そして１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ微量遠心管
に移した。ＰＢＳでの洗浄を３回行った。これらのビーズは、Ａムチンビーズと呼ばれる
。６００マイクロリットルの抗ｍＩｇＧアガロースビーズをまた、Ａムチン−ビーズの希
釈のために用いて吸収剤としてのＡムチン−ビーズの希釈系列を得たこと以外は、同じ様
式で調製した。これらのビーズは、ヤギ抗ｍＩｇＧビーズと呼ばれる。これらのビーズを
、４ｍｌのＥｌｌｅｒｍａｎチューブ中に、表Ｉに従ってアリコートに分けた。Ａ−ＰＡ
Ａ−ＭＰＧ（Ｓｙｎｔｅｓｏｍｅ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＢ−ＰＡＡ−
ＭＰＧ（Ｓｙｎｔｅｓｏｍｅ）を計量し、そしてＥｌｌｅｒｍａｎチューブ中に表Ｉに従
ってアリコートに分け、その後、ＰＢＳで１回洗浄した。
【００８７】
血液型Ｏ型の５人の患者由来のプールした血清を、Ｈｕｄｄｉｎｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌの血液銀行（倫理的許可、Ｄｎｒ．３９２／９９、承認日０８
／１５／２０００）から入手した。細胞破片を、Ｊｏｕａｎ Ａ−１４微量遠心機での１
４，０００ｒｐｍでの５分間の遠心分離によって血清から除去した。透明にされた血清を
別のチューブに移し、そして水浴中で５６℃で１時間インキュベートして、補体を不活化
した。血清を、使用するまでアリコートにして−２０℃で保存した。
【００８８】
【表１】
５００マイクロリットルの血清を、各チューブに添加し、そしてこれらのビーズと、ロ
ーリングテーブル上で４℃で４時間混同した。吸収後、これらのビーズをスピンダウンし
、そして吸収された血清を新たなＥｌｌｅｒｍａｎチューブに移した。吸収された血清を
、さらなる分析まで、−２０℃で保存した。
【００８９】
Ａムチン−ビーズ上でのＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂの量を決定するために、ヤギ抗ｍ
ＩｇＧ Ｆｃ ＥＬＩＳＡ（上記の手順を参照のこと）を、アガロースビーズとのインキ
ュベーション前の上清およびインキュベーション後の上清について行った。
【００９０】
（抗Ａ抗体の定量のためのＥＬＩＳＡ）
９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３５９０，Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、１ウ
ェルあたり５０μｌの５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中０．０５μｌのＡ−ＰＡＡ−
ビオチン（Ｓｙｎｔｅｓｏｍｅ）で２時間、室温でコーティングした。ＰＢＳ−Ｔ中の３
％ ＢＳＡ（３００μｌ）を用いた４℃での一晩のブロッキングおよびその後の洗浄後、
ＰＢＳ中に連続希釈した５０μｌの血清を添加し、そしてこのプレートを室温で２時間イ
ンキュベートした。洗浄後、ブロッキング緩衝液中に１０，０００：１希釈したマウス抗
ヒトＩｇＡ−ＨＲＰ、マウス抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰおよびマウス抗ヒトＩｇＭ−ＨＲＰ（
Ｊａｃｋｓｏｎ，ＰＡ）（５０μｌ）とともにインキュベーションを行った。このプレー
トの発色および読取りを上記の通りに行った。
【００９１】
（血清中における総タンパク質濃度の決定）
血清中における総タンパク質濃度を、抗Ａ抗体の吸収の前後に決定した。ＢＣＡタンパ
ク質アッセイ試薬のマイクロタイタープレートプロトコール（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆ
ｏｒｄ，ＩＬ）を製造業者の指針書に従って使用し、そしてこのサンプルを二連または三
連で実施した。
【００９２】
（実施例２：血液型ＨおよびＡを、種々の宿主細胞中で作製した組換えＰＳＧＬ−１／
ｍＩｇＧ２０において決定する）
２９３Ｔ細胞。免疫親和性により精製したＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ（Ｈ遺伝子、Ｓ
ｅ遺伝子、またはＡ遺伝子をコードするプラスミドを含むか、または含まないＰＳＧＬ−
１／ｍＩｇＧ２ｂ ｃＤＮＡで一過性でトランスフェクトした２９３Ｔ細胞により産生し
た）を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
）ならびに検出のために抗体に特異的な抗ｍＩｇＧ、抗血液型Ａ、Ｈ１型、Ｈ２型、およ
びＨ３型を使用するウエスタンブロットによって分析した（図１Ａ〜Ｅ）。この融合タン
パク質を、見掛け上の分子量約１００および１４０〜１６０ｋＤａ（Ａ）を用いる二連の
還元状態下で移動させた。このＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂは、高度にグリコシル化され
たムチン型タンパク質の挙動に関して、上記観察に従って銀でわずかに染色した（示さず
）（ＣａｒｒａｗａｙおよびＨｕｌｌ，１９９１；ＳｈｉｍｉｚｕおよびＳｈａｗ，１９
９３）。上に示されるように（Ｌｉｕら，１９９７）、この融合タンパク質は、ホモダイ
マーとして産生した（データは示さず）。６５ｋＤａおよび３５ｋＤａ付近の二本のバン
ドは、抗ｍＩｇＧ抗体で決定された。これらのバンドは、エンプティーベクターのみでト
ランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の上清には見られず、従って、融合タンパク質由来の
タンパク質フラグメントであるようであった（ＣａｒｒａｗａｙおよびＨｕｌｌ，１９９
１）。細胞フラクション中においてみられた、この４７ｋＤａおよび２０ｋＤａのバンド
は、サンプル緩衝液中で沸騰させることでアガロースビーズから脱離させた、ヤギ抗マウ
ス抗体の重鎖Ｉｇおよび軽鎖Ｉｇ由来である。
【００９３】
αｌ，３ＧａｌＮＡｃＴを有するＦＵＴ１およびＦＵＴ２の両方は、ＰＳＧＬ−１／ｍ
ＩｇＧ２ｂ（Ｂ）上の血液型Ａ鎖の生合成を支持する。ＦＵＴ２とαｌ，３ＧａｌＮＡｃ
Ｔとの組み合わせは、ＦＵＴ１とαｌ，３ＧａｌＮＡｃＴとの組み合わせよりも、ＰＳＧ
Ｌ−１／ｍＩｇＧ２ｂにおいてよりＡエピトープを産生するようであった（Ｂにおけるこ
れらのレーンを参照）。一方、ＦＵＴ１のみは、大量のＨ２型構造（Ｄ）の発現を支持し
たが、ＦＵＴ２は、ムチン／Ｉｇ（Ｄ）において、わずかなＨ２型エピトープを生じた。
ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂにおいて、検出可能なＨ１型構造は、存在しか生じなかった
。ＦＵＴ２により産生された、このＨエピトープは、ほとんど排他的に型３（すなわち、
Ｆｕｃα２Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃα−Ｒ）に基づく。なぜならば、Ｈ１型構造およびわ
ずかなＨ２型構造が、この酵素（Ｅ）によってＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂにおいて作製
されたからである。興味深いことに、Ａ遺伝子でのＨ遺伝子またはＳｅ遺伝子の両方の同
時トランスフェクションは、抗Ｈ３型抗体（Ｅ）と反応性のＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ
において大量のエピトープを生じる。血液型Ａ、Ｈ２型およびＨ３型エピトープは、主に
Ｏ連結された。なぜならば、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂのペプチドＮグリコシダーゼＦ
（ＰＮＧａｓｅＦ）処置は、これらのエピトープに対して特異的な抗体を使用する、抗体
染色を減少させたからである（図２Ｂ〜Ｄ）。効率的なＮ−グルカン脱グリコシル化は、
ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂの完全な移動シフトによって示された（図２Ａ〜Ｄ）。
【００９４】
ＣＯＳ細胞。ＣＯＳ細胞において作製されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂのウエスタン
ブロット分析は、図３Ａ〜Ｅにおいて示される。抗Ａ特異的抗体および抗Ｈ特異的抗体を
使用して染色するＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂのパターンは、２９３Ｔ細胞において作製
されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂに対して見出されたパターンに、弱いがいくらか類似
していた。α１，３ＧａｌＮａｃＴを一緒に含むＦＵＴ１およびＦＵＴ２の両方は、Ａエ
ピトープ発現を支持し、より多量のエピトープが、ＦＵＴ２およびα１，３ＧａｌＮＡｃ
Ｔ（Ｂ）によって産生された。ＦＵＴ１のみが、Ｈ２型構造（Ｄ）を作製し得、そしてＦ
ＵＴ１もＦＵＴ２も、ＣＯＳ細胞（Ｃ）において、Ｈ１型構造の発現を支持しなかった。
２９３Ｔ細胞において作製されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂに対して、非常に低レベル
のＨ３型エピトープが、ＦＵＴ１およびα１，３ＧａｌＮＡｃＴ、またはＦＵＴ２酵素の
み（Ｅ）を発現するＣＯＳ細胞において産生されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂにおいて
見られた。
【００９５】
しかし、ＦＵＴ２およびα１，３ＧａｌＮＡｃＴのジョイント発現（ｊｏｉｎｔ ｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎ）は、Ｈ３型抗体（Ｅ）との増加した反応性を生じた。さらに、弱いバ
ンドは、α１，２ＦＴのみが発現された場合、抗Ａ抗体で見出され、上記で報告したよう
に、ＣＯＳ細胞において、α１，３ＧａｌＮＡｃＴの弱い内因性の活性を示した（Ｃｌａ
ｒｋｅおよびＷａｔｋｉｎｓ，１９９９）。ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂのＰＮＧａｓｅ
Ｆ処理は、抗血液型Ａ、Ｈ２型またはＨ３型抗体の染色における任意の検出可能な減少を
示さず（データは示さず）、このことは、これらのエピトープが、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇ
Ｇ２ｂＯグリカン上で主に保持されることを示す。
【００９６】
（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）。図４Ａ〜Ｅは、ＣＨＯ細胞において
作製されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂの染色、ＦＵＴ１またはＦＵＴ２ ｃＤＮＡとα
１，３ＧａｌＮＡｃＴ（Ｂ）との同時発現後のＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ保持血液型Ａ
エピトープの染色を示す。Ｈ１型（Ｃ）構造もＨ２型（Ｄ）構造も、ＦＵＴ１またはＦＵ
Ｔ２のいずれかとの同時トランスフェクション後に、ＣＨＯ細胞において作製されたＰＳ
ＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂキメラ上で検出され得ず、このことは、Ｈ３型構造が、α１，３
ＧａｌＮＡｃＴに対して利用可能な唯一の前駆体であることを示した。抗Ｈ３型抗体を用
いた染色は、ＦＵＴ１およびＦＵＴ２（Ｂ）を用いて見出され、Ａエピトープが、ＣＨＯ
細胞におけるコア１構造に唯一基づくという理論を支持する。さらに、このことに対する
支持は、ＰＮＧａｓｅＦ処置後に得られ、このことは、抗体染色強度に影響を及ぼさず、
Ｏグリカン制限Ａエピトープ発現を示す（データは示さず）。ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２
ｂキメラ上におけるＡエピトープおよびＨ３型エピトープの数は、ＦＵＴ１と比較した場
合、ＦＵＴ２で明らかにより多く、このことは、このＳｅ遺伝子産物が、コア１（Ｇａｌ
β３ＧａｌＮＡｃα−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）構造のα１，２−フコシル化の点において、Ｈ遺
伝子産物よりも優れていることを示唆する。
【００９７】
（実施例３．異なる宿主細胞において産生されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂにおける
、血液型Ａエピトープの相対密度）
Ａ遺伝子をα１，２ＦＴのいずれかと発現する種々の宿主細胞において作製したＰＳＧ
Ｌ−１／ｍＩｇＧ２ｂキメラにおけるＡエピトープの相対数を半定量するために、抗Ａ抗
体および抗ｍＩｇＧ抗体を用いたウエスタンブロット、続いてＦｌｕｏｒ−Ｓ（登録商標
）Ｍａｘ ＭｕｌｔＩｍａｇｅｒでの化学ルミネセンス検出を使用した。各ＰＳＧＬ−１
／ｍＩｇＧ２ｂに対する、血液型ＡおよびｍＩｇＧの反応性の比を、図５に示す（３つの
代表的な実験のうちの１つを示した）。理解されるように、Ａエピトープの密度は、α１
，２ＦＴをコードするＳｅ遺伝子とともにＡ遺伝子を発現するＣＨＯ細胞において作製さ
れたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂにおいて最も高かった。このＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２
ｂは、ＦＵＴ２およびＡ遺伝子を用いてトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞において製
造されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂよりも約３倍多量のＡエピトープを保持する；ＰＳ
ＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂは、２番目に高いＡエピトープ密度を有する（図５）。各細胞レ
ーンにおいて、Ａ遺伝子をともに有するＦＵＴ１よりも、Ａ遺伝子をともに有するＦＵＴ
２は、より高いＡエピトープ密度を与えた。
【００９８】
（実施例４：血液型Ａエピトープを保持するＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂにおける抗Ａ
抗体の吸収）
血液型Ａエピトープを有するか、または有さない組換えＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂに
おける抗Ａ抗体吸収の効率を、マクロ孔質ガラスビーズに対するポリ［Ｎ−（２−ヒドロ
キシエチル）アクリルアミド］介して連結されたＡトリサッカライド（Ａ−ＰＡＡ−ＭＰ
Ｇ）上での吸収の効率と比較した。抗Ａ抗体の吸収前および吸収後のレベルを、酵素結合
イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）において評価し、このプレートを、ビオチンでも
また置換したポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アクリルアミド］に連結させたＡトリ
サッカライド（Ａ−ＰＡＡ−ビオチン）でコーティングした。この結果を、図６に示す。
２０ｐｍｏｌの組換えＡエピトープ置換ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂが、Ａ−ＰＡＡ−ビ
オチンＥＬＩＳＡにおいて検出される場合に、抗Ａ抗体の６０％を吸収するために必要と
され、一方、Ａ−ＰＡＡ−ＭＰＧのような１６４，０００ｐｍｏｌのＡ決定基は、同量の
抗Ａ抗体を吸収するために必要とされた。このＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂダイマーは、
１０６ヶ所の強力なＯ連結グリコシル化部位および８ヶ所の強力なＮ連結グリコシル化部
位を有し（Ｗｉｌｋｉｎｓら，１９９６；Ａｅｅｄら，１９９８，２００１）、この後者
の８ヶ所は、分枝構造を保持し得る。各ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂが、約１００のＡエ
ピトープを保持すると推定する場合、これらのほとんどは、推定を超えるようであり、Ｆ
ＵＴ２およびα１，３ＧａｌＮａｃＴを有するＣＨＯ細胞において作製されたムチンは、
Ａ−ＰＡＡＦ−ＭＡＰよりも、カルボキシレートモルを基準として約８０倍以上の効率を
有する。
【００９９】
（実施例５：抗体媒介性移植拒絶の処置または予防）
ＡＢＯ障壁を横切る組織移植を、ドナー組織血液型に対して予め形成されるか、または
誘導された抗体により媒介されたＡＭＲによって特徴付する（Ｐｏｒｔｅｒ，１９６３；
Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｕｒａｄａｚｐａｌら，１９９３；Ｆａｒｇｅｓら，１９９５；Ｔａｎ
ａｂｅら，１９９８；Ａｌｋｈｕｎａｉｚｉら，１９９９）。抗ＡＢＯ抗体を、ＥＩＡ設
定における吸収剤としてＡ決定基を保持するＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ融合タンパク質
を使用して、除去する。結果は、（１００のＡ決定基／ｍｏｌのＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ
２ｂに基づく）２ｎｍｏｌのＡ決定基に対応する、ＦＵＴ２およびα１，３ＧａｌＮＡｃ
Ｔを含むＣＨＯ−Ｋ１中で作製された約２０ｐｍｏｌの組換えＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２
ｂ（分子量３００ｋＤａとして計算された）（Ｗｉｌｋｉｎｓら，１９９６；Ａｅｅｄら
，１９９８，２００１）は、Ａ−ＰＡＡ−反応性抗体の６０％を吸収する。約１６４，０
００ｐｍｏｌのＡトリサッカリドに対応するＡ−ＰＡＡ−ＭＰＧ（２μｍｏｌ／μｇとし
て計算された）が、同量の抗Ａ抗体を吸収するために必要とされた。両方の化合物にして
非特異的なタンパク質吸収量もまた評価し、そしてこの非特異的な吸収が、ＰＡＡ−ＭＰ
Ｇベース化合物よりほぼ４倍高かった。ムチンベース吸収の比較的高度な吸収効率は、（
１）多価カルボキシレート置換、（２）カルボキシレートエピトープの密接した空間、お
よび（３）主要抗原決定基を保持するコアサッカライド鎖の構造多能性に依存し得る。さ
らに、例えば、最適化されたムチンタンデム反復によって構成された合成ムチン型タンパ
ク質を作製することによる、タンパク質骨格の変化は、吸収体を改善し得る（Ｓｉｌｖｅ
ｒｍａｎら，２００１）。また、ＧａｌＮＡｃ：ポリペプチドトランスフェラーゼの異な
る組み合わせを発現するように操作された細胞は、Ｏグリカン置換密度を最適化すること
によって吸収効率を改善し得る。
【０１００】
（略語）
ＡＭＲ（抗体媒介拒絶（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）
）；ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）；ＣＨＯ（チャイニーズハムスターの卵巣）；ＣＯＳ
；ＥＴＡ（体外免疫吸収）；ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント検定法）；ＦＴ（フ
ルコシルトランスフェラーゼ）；ＧａｌＮＡｃＴ（Ｎ−アセチルガラクトサミニルトラン
スフェラーゼ）；ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）；ｍＩｇＧ（マウスＩｇＧ）；
ｍＩｇＭ（マウスＩｇＭ）；ＭＰＧ（マクロ孔質ガラスビーズ）；ＰＡＡ（ポリ［Ｎ−（
２−Ｈドロキシエチル）アクリルアミド］）；ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）；ＰＢＳ
−Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ）；ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）；ＰＮ
ＧａｓｅＦ（ペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＦ）；ＰＰ（血漿瀉血）；ＰＳＧＬ−１（Ｐ
セレクチン糖タンパク質リガンド−１）；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動）；ＴＢＳ−Ｔ（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含む
Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水）；Ｔｘ（移植）。
【０１０１】
（参考文献）
【０１０２】
【表２−１】
【０１０３】
【表２−２】
【０１０４】
【表２−３】
【０１０５】
【表２−４】
【０１０６】
【表２−５】
【０１０７】
【表２−６】
【０１０８】
【表２−７】
【０１０９】
【表２−８】
（他の実施形態）
本発明は、その詳細な説明と組み合わせて議論されるが、上記の記載は、本発明を例示
するものであって、その範囲を限定するものではないことを意図し、この範囲は、添付の
特許請求の範囲によって規定される。他の局面、利点および改変は、以下の特許請求の範
囲内である。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、概して抗体媒介性移植拒絶を処置または予防するための組成物および方法に
関し、より具体的には、血液型（ｂｌｏｏｄ ｇｒｏｕｐ）決定基を含む融合ポリペプチ
ドを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
主要なヒトの血液型系（組織−血液型ＡＢＯ系）は、３つの糖質決定基（血液型Ａエピ
トープ、ＢエピトープおよびＨエピトープ）によって規定される。ＡＢＨ決定基を有する
グリカンは、糖タンパク質、糖脂質、または遊離のオリゴ糖において見出される。ＡＢＨ
抗原は、Ｎ連結グリカンまたはＯ連結グリカンにおいて見出され得る。Ｏ連結グリカンに
関してこれまで記載された最も共通なコア構造は、コア１（Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃ）、
コア２（Ｇａｌβ３（ＧｌｃＮＡｃβ６）ＧａｌＮＡｃ）、コア３（ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇ
ａｌＮＡｃ）およびコア４（ＧｌｃＮＡｃβ３（ＧｌｃＮＡｃβ６）ＧａｌＮＡｃ）であ
る。これらは、１型（Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ）構造、２型（Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ）
構造、および３型（Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃα）構造を保有することが示されている。１
型構造は主に、コア３構造およびコア４構造の伸長物として見出されるが、２型鎖（ポリ
ラクトサミン）は、コア２構造のＧｌｃＮＡｃβ１，６分枝の伸長物として発見された。
【０００３】
ＡＢＯ障壁を越える移植（Ｔｘ）は、通常、組織Ｔｘを避ける。なぜなら、実施する抗
体に起因する抗体媒介性拒絶（ＡＭＲ）の危険性がしばしば高いからである。これはまた
、骨髄移植において適用され得るが、血液型ＡＢＨの不一致はその結果に影響しないと長
い間考えられてきた。しかし、いくつかの場合、ＡＢＯ障害を越えて移植することが依然
として所望される。これは、ドナーの総数が増加しなくても、特定のレシピエントに対し
て利用可能なドナーのプールを広げるからである。
【０００４】
体外免疫吸収（ＥＩＡ）または血漿交換（ＰＰ）による抗Ａ型抗体または抗Ｂ型抗体の
除去は、ＡＢＯ不適合性組織Ｔｘ後の移植片の生存を改善することが証明された。ＡＢＯ
不適合性Ｔｘおよび異種Ｔｘの両方におけるＡＭＲの予防のために使用される別の方法は
、遊離オリゴ糖の注入であるが、遊離糖に対する抗体の低い親和性および循環における低
分子量のオリゴ糖の短い半減期（Ｙｅら、１９９４；Ｓｉｍｏｎら、１９９８）は、より
広い使用を抑制する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、血液型エピトープが、高密度で、かつムチン型タンパク質骨格の異なるコア
糖鎖によって特異的に発現され得るという発見に一部基づく。ポリペプチドは、本明細書
中でＡＢＯ融合ポリペプチドと称される。したがって、本発明は以下を提供する。
（１）
第２ポリペプチドに作動可能に連結される第１ポリペプチドを含む融合ポリペプチドであ
って、該第１ポリペプチドは：
（ａ）ムチンポリペプチドであり、そして
（ｂ）α１，２フコシルトランスフェラーゼによってグリコシル化され、
該第２ポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドの少なくとも１領域を含む、融合
ポリペプチド。
（２）
前記第１ポリペプチドが、α１，３ Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ
またはα１，３ ガラクトシルトランスフェラーゼによってさらにグリコシル化される、
請求項１に記載の融合ポリペプチド。
（３）
前記α１，２フコシルトランスフェラーゼが、血液型Ｈまたは分泌型α１，２フコシルト
ランスフェラーゼである、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
（４）
前記第１ポリペプチドが、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１の少なくとも１領域
を含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
（５）
前記第１ポリペプチドが、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１の細胞外部分を含む
、請求項４に記載の融合ポリペプチド。
（６）
前記第２ポリペプチドが、重鎖免疫グロブリンポリペプチドの領域を含む、請求項１に記
載の融合ポリペプチド。
（７）
前記第２ポリペプチドが、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域を含む、請求項６に記載の融合
ポリペプチド。
（８）
ダイマーである、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
（９）
請求項１に記載のペプチドをコードする、単離された核酸。
（１０）
請求項９に記載の核酸を含む、ベクター。
（１１）
請求項１１に記載のベクターを含む、細胞。
（１２）
請求項１に記載の融合ポリペプチドを含む、吸収体。
（１３）
抗体媒介性拒絶を処置または予防する必要のある被験体において、抗体媒介性拒絶を処置
または予防するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）融合ポリペプチド複合体を形成するために、該被験体に由来する生物学的サンプ
ルと、請求項１に記載の融合ポリペプチドとを接触させる工程；および
（ｂ）該生物学的サンプルから該複合体を除去することによって、該被験体における抗
体媒介性拒絶を処置または予防する工程
を包含する、方法。
（１４）
生物学的サンプルから抗体を除去する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）融合ポリペプチド複合体を形成するために、生物学的サンプルと、請求項１に記
載の融合ポリペプチドとを接触させる工程；
（ｂ）該生物学的サンプルから該複合体を除去することによって、該生物学的サンプル
から該抗体を除去する工程
を包含する、方法。
【０００６】
１つの局面において、本発明は、第１ポリペプチドを含む融合ポリペプチドを提供し、
この第１ポリペプチドは、ムチンポリペプチドの少なくとも１領域を含み、第２ポリペプ
チドに作動可能に連結されるα１，２フコシルトランスフェラーゼによってグリコシル化
される。第１ポリペプチドは、α１，３ Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラ
ーゼおよび／またはα１，３ ガラクトシルトランスフェラーゼによって連続的にグリコ
シル化される。ムチンポリペプチドは、例えば、ＰＳＧＬ−１である。好ましくは、この
ムチンポリペプチドは、ＰＳＧＬ−１の細胞外部分である。α１，２，フコシルトランス
フェラーゼは、例えば、血液型Ｈまたは分泌型α１，２，フクシルトランスフェラーゼ（
例えば、ＦＵＴ１またはＦＵＴ２）である。
【０００７】
好ましい実施形態において、第２ポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドの少な
くとも１領域を含む。例えば、第２ポリペプチドは、重鎖免疫グロブリンポリペプチドの
１領域を含む。あるいは、第２ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖のＦＣ領域を含む。
【０００８】
ＡＢＯ融合ポリペプチドは多量体（ｍｕｔｉｍｅｒ）である。好ましくは、ＡＢＯ融合
ポリペプチドはダイマーである。
【０００９】
本発明はまた、ＡＢＯ融合ポリペプチドをコードする核酸、ならびに本明細書中に記載
される核酸をコードするＡＢＯ融合ポリペプチドを含むベクター、および本明細書中に記
載されるベクターまたは核酸を含む細胞を含む。あるいは、ベクターは、α１，２，フコ
シルトランスフェラーゼおよび／またはα１，３ Ｎアセチルガラクトサミニルトランス
フェラーゼまたはα１，３ ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸をさらに
含む。
【００１０】
別の局面において、本発明は、被験体における抗体媒介性拒絶を処置する方法を提供す
る。この方法は、融合ポリペプチド−抗体複合体を形成させるために、生物学的サンプル
（例えば、患者に由来する全血または血漿）と、本発明のＡＢＯ融合ポリペプチドとを接
触させる工程を包含する。この複合体は、生物学的サンプルから除去され、そしてこの生
物学的サンプルは被験体に再融合される。
【００１１】
抗体融合ペプチド複合体を形成し、そして生物学的サンプルからこの複合体を除去する
ために、サンプルと本発明のＡＢＯ融合ペプチドとを接触させる工程によりこのサンプル
から抗体を除去する方法もまた、本発明に含まれる。
【００１２】
ＡＢＯ融合ポリペプチドを含む薬学的組成物もまた、本発明に含まれる。
【００１３】
別の記載がない限り、本明細書中で使用される全ての技術および専門用語は、本発明に
属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載され
るのと類似または等価な方法および材料は、本発明の実施または試験において使用され得
るが、適切な方法および材料は、以下に記載される。本明細書中に記載される全ての特許
刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参考として援用される。矛盾
する場合、明細書（定義を含む）が制御する。さらに、材料、方法および実施例は、例示
のみであり、制限を意図するものではない。本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、および特許請求の範囲から示され
る。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１Ａ〜Ｄは、Ｈ遺伝子もしくはＳｅ遺伝子単独でか、またはＡ遺伝子によりコードされたα１，３ＧａｌＮＡｃＴと組み合わせてトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞において産生されたキメラである、免疫精製したＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析の写真である。８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分離およびニトロセルロース膜へのブロッティングの後、抗マウスＩｇＧ抗体により（Ａ）、抗血液型Ａ抗体の後でヤギ抗マウスＩｇＭ抗体により（Ｂ）、抗１型Ｈ鎖特異的抗体の後でＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ３抗体により（Ｃ）、抗２型Ｈ鎖特異的抗体の後でヤギ抗マウスＩｇＭ−ＨＲＰ抗体により（Ｄ）、そして抗３型Ｈ鎖特異的抗体の後にＨＲＰ標識したヤギ抗マウスＩｇＭ抗体により（Ｅ）、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂキメラを、プローブした。パネルＡ〜Ｄにおいて、ＣＤＭ８（レーン１および５）、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ（レーン２および６）、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂおよびＨ遺伝子（レーン３）、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ、Ｈ遺伝子およびＡ遺伝子（レーン４）、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂおよびＳｅ遺伝子（レーン７）、またはＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ、ならびにＳｅ遺伝子およびＡ遺伝子（レーン８）をコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞由来のサンプルを分析した。Ｅにおいて、ＣＤＭ８およびＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂでトランスフェクトされた細胞由来の重複したサンプルは、省略した。Ｃにおいて、２５０ｎｇの１型Ｈ鎖−ＢＳＡを、ポジティブコントロールとして使用した。
【図２】図２Ａ〜Ｄは、Ｈ遺伝子もしくはＳｅ遺伝子単独でか、またはＡ遺伝子によりコードされたα１，３ＧａｌＮＡｃＴと組み合わせてトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞において産生された、ＰＮＧａｓｅＦ処理された、免疫精製したＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析の写真である。免疫精製したＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂのＰＮＧａｓｅＦ処理あり（＋）またはなし（−）の後、このＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂを、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、そしてニトロセルロース膜へブロッティングした。抗マウスＩｇＧ抗体により（Ａ）、抗血液型Ａ抗体の後でヤギ抗マウスＩｇＭ抗体により（Ｂ）、抗２型Ｈ鎖特異的抗体の後でヤギ抗マウスＩｇＭ−ＨＲＰ抗体により（Ｃ）、そして抗３型Ｈ鎖特異的抗体の後にＨＲＰ標識したヤギ抗マウスＩｇＭ抗体により（Ｄ）、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂキメラを、プローブした。パネルＡ〜Ｄにおいて、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂおよびＨ遺伝子（レーン１および２）、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ、ならびにＨ遺伝子およびＡ遺伝子（レーン３および４）、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂおよびＳｅ遺伝子（レーン５および６）、またはＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ、ならびにＳｅ遺伝子およびＡ遺伝子（レーン７および８）をコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞由来のサンプルを分析した。
【図３】図３Ａ〜Ｅは、Ｈ遺伝子もしくはＳｅ遺伝子単独でか、またはＡ遺伝子によりコードされたα１，３ＧａｌＮＡｃＴと組み合わせてトランスフェクトされたＣＯＳ−７ｍ６細胞において産生されたキメラである、免疫精製したＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析の写真である。８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分離およびニトロセルロース膜へのブロッティングの後、抗マウスＩｇＧ抗体により（Ａ）、抗血液型Ａ抗体の後でヤギ抗マウスＩｇＭ抗体により（Ｂ）、抗１型Ｈ鎖特異的抗体の後でＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ３抗体により（Ｃ）、抗２型Ｈ鎖特異的抗体の後でヤギ抗マウスＩｇＭ−ＨＲＰ抗体により（Ｄ）、そして抗３型Ｈ鎖特異的抗体の後にＨＲＰ標識したヤギ抗マウスＩｇＭ抗体により（Ｅ）、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂキメラを、プローブした。パネルＡ〜Ｄにおいて、ＣＤＭ８（レーン１および５）、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ（レーン２および６）、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂおよびＨ遺伝子（レーン３）、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ、Ｈ遺伝子およびＡ遺伝子（レーン４）、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂおよびＳｅ遺伝子（レーン７）、またはＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ、ならびにＳｅ遺伝子およびＡ遺伝子（レーン８）をコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞由来のサンプルを分析した。Ｅにおいて、ＣＤＭ８およびＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂでトランスフェクトされた細胞由来の重複したサンプルは、省略した。Ｃにおいて、２５０ｎｇの１型Ｈ鎖−ＢＳＡを、ポジティブコントロールとして使用した。
【図４】図４Ａ〜Ｅは、Ｈ遺伝子もしくはＳｅ遺伝子単独でか、またはＡ遺伝子によりコードされたα１，３ＧａｌＮＡｃＴと組み合わせてトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞において産生されたキメラである、免疫精製したＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析の写真である。８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分離およびニトロセルロース膜へのブロッティングの後、抗マウスＩｇＧ抗体により（Ａ）、抗血液型Ａ抗体の後でヤギ抗マウスＩｇＭ抗体により（Ｂ）、抗１型Ａ鎖特異的抗体の後でＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ３抗体により（Ｃ）、抗２型Ｈ鎖特異的抗体の後でヤギ抗マウスＩｇＭ−ＨＲＰ抗体により（Ｄ）、そして抗３型Ｈ鎖特異的抗体の後にＨＲＰ標識したヤギ抗マウスＩｇＭ抗体により（Ｅ）、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂキメラを、プローブした。ＣＤＭ８（レーン１）、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ（レーン２）、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂおよびＨ遺伝子（レーン３）、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ、Ｈ遺伝子およびＡ遺伝子（レーン４）、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂおよびＳｅ遺伝子（レーン５）、またはＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ、ならびにＳｅ遺伝子およびＡ遺伝子（レーン６）をコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞由来のサンプルを分析した。Ｃにおいて、２５０ｎｇの１型Ｈ鎖−ＢＳＡを、ポジティブコントロールとして使用した。
【図５】ＦＵＴ１またはＦＵＴ２をα１，３ＧａｌＮＡｃＴと同時発現するＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞および２９３Ｔ（２９３１）細胞において産生された組換えＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂに対する相対的血液型Ａ密度を示す、棒グラフである。密度は、血液型ＡとｍＩｇＧとの反応性についての容積の比として計算し、そしてこの値を、ＦＵＴ１およびα１，３ＧａｌＮＡｃＴを同時発現するＣＯＳ細胞において産生されるＡ置換ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂについて得られた値に対して正規化した。
【図６】異なる血液型Ａ置換吸収剤に対する、吸収後に血清中に残った抗血液型Ａの反応性を示す折れ線グラフである。Ａ−ＰＡＡ−ビオチンコーティングされたＥＬＩＳＡによって測定されるような、非吸収血液型Ｏ血清の割合での、残存する反応性を、使用した吸収剤の量に対してプロットした。傾向線を、対数回帰を使用して計算した。円は、ＦＵＴ２およびα１，３ＧａｌＮＡｃＴを有するＣＨＯ細胞において産生されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂを示し、そして四角は、Ａ−ＰＡＡ−ＭＰＧを介して連結されたＡトリサッカリドを示す。Ｂ−ＰＡＡ−ＭＰＧを介して連結されたＢトリサッカリドを使用して、全ての吸収において同じ量のＰＡＡ−ＭＰＧを得た。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、血液型エピトープが、高密度で特異的に、そしてムチン型タンパク質骨格上
の異なるコアサッカリド鎖で発現され得るという発見に一部基づく。より高い密度の血液
型エピトープは、遊離のサッカリドまたは固相に結合したＡＢ決定因子と比較して、抗血
液型抗体の結合の増加または除去（すなわち、吸収）を生じる。
【００１６】
本発明は、抗血液型抗体の吸収剤として有用な複数の血液型エピトープを含む、ムチン
−免疫グロブリン融合タンパク質（本明細書中で「ＡＢＯ融合タンパク質」という）を提
供する。ＡＢＯ融合ペプチドはまた、グリコシル化についての研究のためのモデルタンパ
ク質として有用である。例えば、このＡＢＯ融合タンパク質は、ＡＢＯ不適合性の臓器移
植または骨髄移植の前に、血液または血漿由来のレシピエント抗血液型ＡＢＯ抗体を排除
する際に、有用である。このＡＢＯ融合タンパク質は、レシピエントの血液または血漿由
来の抗血液型ＡＢＯ抗体の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、
または１００％を吸収する。
【００１７】
ＡＢＯ融合ペプチドは、野生型ＡＢ決定因子の遊離サッカリドと比較して、抗血液型抗
体を除去または結合する際に、炭水化物モル濃度基準で、より有効である。このＡＢＯ融
合ペプチドは、等量の野生型ＡＢ決定因子の遊離サッカリドと比較して、２倍、４倍、１
０倍、２０倍、５０倍、８０倍、１００倍またはそれ以上多い数の抗血液型抗体と結合す
る。
【００１８】
本発明のＡＢＯ融合タンパク質は、血液型決定因子に特異的なエピトープを保有する。
例えば、ＡＢＯ融合タンパク質は、Ａエピトープ、ＢエピトープまたはＨエピトープのい
ずれかを保有する。あるいは、このＡＢＯ融合物は、血液型抗原についての２つのエピト
ープを保有する。例えば、このＡＢＯ融合タンパク質は、ＡエピトープおよびＢエピトー
プの両方を保有する。いくつかの局面において、このＡＢＯ融合タンパク質は、３つ全て
のエピトープ（すなわち、Ａ、ＢおよびＨ）を保有する。
【００１９】
（融合ポリペプチド）
種々の局面において、本発明は、第二のポリペプチドと作動可能に連結した、糖タンパ
ク質（例えば、ムチンポリペプチド）の少なくとも一部を含む第一のポリペプチドを含む
融合タンパク質を提供する。本明細書中で使用される場合、「融合タンパク質」または「
キメラタンパク質」は、非ムチンポリペプチドと作動可能に連結したムチンポリペプチド
の少なくとも一部を含む。「ムチンポリペプチド」は、ムチンドメインを有するポリペプ
チドをいう。このムチンポリペプチドは、１個、２個、３個、５個、１０個、２０個また
はそれ以上のムチンドメインを有する。このムチンポリペプチドは、Ｏ−グリカンで置換
されたアミノ酸配列によって特徴付けられる任意の糖タンパク質である。例えば、ムチン
ポリペプチドは、２アミノ酸毎または３アミノ酸毎に、セリンまたはスレオニンであるア
ミノ酸を有する。このムチンポリペプチドは、分泌タンパク質である。あるいは、ムチン
ポリペプチドは、細胞表面タンパク質である。
【００２０】
ムチンドメインは、アミノ酸のスレオニン、セリンおよびプロリンに富んでおり、ここ
で、オリゴサッカリドは、ヒドロキシアミノ酸（Ｏ−グリカン）に、Ｎ−アセチルガラク
トサミンを介して連結される。ムチンドメインは、Ｏ−連結グリコシル化部位を含むか、
またはＯ−連結グリコシル化部位からなる。ムチンドメインは、１個、２個、３個、５個
、１０個、２０個、５０個、１００個またはそれ以上のＯ−連結グリコシル化部位を有す
る。あるいは、ムチンドメインは、Ｎ−連結グリコシル化部位を含むか、またはＯ−連結
グリコシル化部位からなる。ムチンポリペプチドは、その質量の５０％、６０％、８０％
、９０％、９５％または１００％がグリカンに帰する。ムチンポリペプチドは、ＭＵＣ遺
伝子（すなわち、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３など）によりコードされる任意のポリペ
プチドである。あるいは、ムチンポリペプチドは、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド
１（ＰＳＧＬ−１）、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ９６、ＧｌｙＣＡＭ−１、Ｍ
ＡｄＣＡＭまたは赤血球糖タンパク質である。好ましくは、このムチンは、ＰＳＧＬ−１
である。一方、「非ムチンポリペプチド」は、その質量の少なくとも４０％未満がグリカ
ンに帰するポリペプチドをいう。
【００２１】
本発明のＡＢＯ融合タンパク質において、このムチンポリペプチドは、ムチンタンパク
質の全てまたは一部に対応し得る。１実施形態において、ＡＢＯ融合タンパク質は、ムチ
ンタンパク質の少なくとも一部を含む。「少なくとも一部」は、このムチンポリペプチド
が、少なくとも１つのムチンドメイン（例えば、Ｏ−連結グリコシル化部位）を含むこと
を意味する。１実施形態において、このムチンタンパク質は、このポリペプチドの細胞外
部分を含む。例えば、このムチンポリペプチドは、ＰＳＧＬ−１の細胞外部分を含む。
【００２２】
第一のポリペプチドは、１以上の血液型トランスフェラーゼによってグリコシル化され
る。第一のポリペプチドは、２個、３個、５個またはそれ以上の血液型トランスフェラー
ゼによってグリコシル化される。グリコシル化は、連続的または継続的である。あるいは
、グリコシル化は、同時発生的またはランダム（すなわち、特定の順序はない）である。
例えば、第一のポリペプチドは、α１，２フコシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｈ遺伝
子またはＳｅ遺伝子によってコードされるα１，２フコシルトランスフェラーゼ）によっ
てグリコシル化される。例示的なα１，２フコシルトランスフェラーゼは、ＦＵＴ１（Ｇ
ｅｎＢａｎｋ登録番号Ｑ１０９８４；Ｏ１０９８３；Ｏ１０９８１；ＡＴ４５５０２８お
よびＮＭ００１４８）およびＦＵＴ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｐ１９５２６；ＢＡＡ１
１６３８；Ｄ８２９３３およびＡ５６０９８）である。あるいは、第一のポリペプチドは
、１，３Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼまたはα１，３アセチルガラ
クトサミニルトランスフェラーゼによってグリコシル化される。いくつかの局面において
、第一のポリペプチドは、α１，２フコシルトランスフェラーゼおよび１，３Ｎ−アセチ
ルガラクトサミニルトランスフェラーゼまたはα１，３アセチルガラクトサミニルトラン
スフェラーゼの両方によってグリコシル化される。
【００２３】
融合タンパク質において、用語「作動可能に連結される」は、第一および第二のポリペ
プチドが、第一のポリペプチドのＯ−連結グリコシル化を可能にする様式で、（最も代表
的にはペプチド結合のような共有結合を介して）化学的に連結されることを示すことが意
図される。融合ポリペプチドをコードする核酸をいうために使用される場合、用語、作動
可能に連結される、は、ムチンポリペプチドおよび非ムチンポリペプチドをコードする核
酸が、互いにインフレームで融合していることを意味する。この非ムチンポリペプチドは
、ムチンポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
【００２４】
さらなる実施形態において、このＡＢＯ融合タンパク質は、１以上のさらなる部分に連
結され得る。例えば、このＡＢＯ融合タンパク質は、ＡＢＯ融合タンパク質配列がＧＳＴ
（すなわち、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＮ末端に連結された、ＧＳＴ
融合タンパク質にさらに連結され得る。このような融合タンパク質は、ＡＢＯ融合タンパ
ク質の精製を容易にし得る。あるいは、ＡＢＯ融合タンパク質は、固体支持体にさらに連
結され得る。種々の固体支持体が当業者に公知である。このような組成物は、抗血液型抗
体の除去を容易にし得る。例えば、ＡＢＯ融合タンパク質は、例えば、金属化合物、シリ
カ、ラテックス、ポリマー物質から作製される粒子；マイクロタイタープレート；ニトロ
セルロースもしくはナイロンまたはこれらの組み合わせに連結され得る。固体支持体に連
結されたＡＢＯ融合タンパク質は、吸収剤として使用されて、生物学的サンプル（例えば
、血液または血漿）から、抗血液型抗体を除去する。
【００２５】
別の実施形態では、融合タンパク質は、異種シグナル配列（すなわち、ムチン核酸によ
ってコードされるポリペプチド中に存在しないポリペプチド配列）をそのＮ末端に含む。
例えば、ネイティブなムチンシグナル配列は除去され得、そして別のタンパク質由来のシ
グナル配列で置き換えられ得る。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）では、ポ
リペプチドの発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用を通して増大され得る
。
【００２６】
本発明のキメラタンパク質または融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術によっ
て産生され得る。例えば、種々のポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントは、
従来技術に従って、例えば、連結のための平滑末端化末端もしくは付着末端化末端、適切
な末端を提供する制限酵素消化、必要に応じて粘着末端のフィルイン、望ましくない連結
を回避するアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結を用いることによって、イン
フレームで一緒に連結される。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成機を
含む、従来技術によって合成され得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、
その後アニーリングおよび再増幅されてキメラ遺伝子配列を作製し得る、２つの連続した
遺伝子フラグメントの間での相補的突出部を生じる、アンカープライマーを用いて実施さ
れ得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ
ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９２
を参照のこと）。さらに、融合部分（例えば、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域）をコード
する多くの発現ベクターが市販されている。糖タンパク質Ｉｂαコード核酸は、その融合
部分が、免疫グロブリンタンパク質に対してインフレームで連結されるように、このよう
な発現ベクター中にクローニングされ得る。
【００２７】
ＡＢＯ融合ポリペプチドは、オリゴマー（例えば、ダイマー、トリマーまたはペンタマ
ー）として存在し得る。好ましくは、ＡＢＯ融合ポリペプチドは、ダイマーである。
【００２８】
第１ポリペプチド（および／または第１ポリペプチドをコードする核酸）は、当該分野
で公知であるムチンコード配列を用いて構築され得る。ムチンポリペプチドおよびムチン
ポリペプチドをコードする核酸についての適切な供給源としては、ＧｅｎＢａｎｋ登録番
号ＮＰ６６３６２５およびＮＭ１４５６５０、ＣＡＤ１０６２５およびＡＪ４１７８１５
、ＸＰ１４０６９４およびＸＭ１４０６９４、ＸＰ００６８６７およびＸＭ００６８６７
、ならびにＮＰ００３３１７７７およびＮＭ００９１５１がそれぞれ挙げられ、そしてそ
れらの全体が本明細書中に参考として援用される。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ムチンポリペプチド部分は、天然に存在するムチン配列（野
生型）中に（非変異配列と比較して）増大した糖質含量をもたらす変異を有する改変体ム
チンポリペプチドとして提供される。例えば、改変体ムチンポリペプチドは、野生型ムチ
ンと比較してさらなるＯ結合型グリコシル化部位を含んでいた。あるいは、改変体ムチン
ポリペプチドは、野生型ムチンポリペプチドと比較して増加した数のセリン残基、トレオ
ニン残基またはプロリン残基をもたらす、アミノ酸配列変異を含む。この増加した糖質含
量は、当業者に公知の方法によって、ムチンのタンパク質対糖質の比率を決定することに
よって評価され得る。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ムチンポリペプチド部分は、天然に存在するムチン配列（野
生型）中に、タンパク質分解に対して（非変異配列と比較して）より耐性のムチン配列を
もたらす変異を有する改変体ムチンポリペプチドとして提供される。
【００３１】
いくつかの実施形態では、第１ポリペプチドは、全長ＰＳＧＬ−１を含む。あるいは、
第１ポリペプチドは、全長未満のＰＳＧＬ−１ポリペプチド（例えば、ＰＳＧＬ−１の細
胞外部分）を含む。例えば、４００アミノ酸長未満（例えば、３００アミノ酸長以下、２
５０アミノ酸長以下、１５０アミノ酸長以下、１００アミノ酸長以下、５０アミノ酸長以
下または２５アミノ酸長以下）の第１ポリペプチド。例示的なＰＳＧＬ−１ポリペプチド
配列およびＰＳＧＬ−１核酸配列としては、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ００６８６７；
ＸＭ００６８６７；ＸＰ１４０６９４およびＸＭ１４０６９４が挙げられる。
【００３２】
第２ポリペプチドは好ましくは可溶性である。いくつかの実施形態では、第２ポリペプ
チドは、第２ムチンポリペプチドとのＡＢＯ融合ポリペプチドの会合を容易にする配列を
含む。好ましい実施形態では、第２ポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドの少な
くとも一領域を含む。「少なくとも一領域」は、免疫グロブリン分子の任意の部分（例え
ば、軽鎖、重鎖、ＦＣ領域、Ｆａｂ領域、Ｆｖ領域またはそれらの任意のフラグメント）
を含むことを意味する。免疫グロブリン融合ポリペプチドは、当該分野で公知であり、そ
して例えば、米国特許第５，５１６，９６４号；同第５，２２５，５３８号；同第５，４
２８，１３０号；同第５，５１４，５８２号；同第５，７１４，１４７号；および同第５
，４５５，１６５号に記載される。
【００３３】
いくつかの実施形態では、第２ポリペプチドは、全長免疫グロブリンポリペプチドを含
む。あるいは、第２ポリペプチドは、全長未満の免疫グロブリンポリペプチド（例えば、
重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆｖ、またはＦｃ）を含む。好ましくは、第２ポリペプ
チドは、免疫グロブリンポリペプチドの重鎖を含む。より好ましくは、第２ポリペプチド
は、免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域を含む。
【００３４】
本発明の別の局面では、第２ポリペプチドは、野生型免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の
エフェクター機能よりも劣ったエフェクター機能を有する。Ｆｃエフェクター機能として
は、例えば、Ｆｃレセプター結合、補体結合およびＴ細胞枯渇活性が挙げられる（例えば
、米国特許第６，１３６，３１０号を参照のこと）。Ｔ細胞枯渇活性、Ｆｃエフェクター
機能、および抗体安定性をアッセイする方法は、当該分野で公知である。１つの実施形態
では、第２ポリペプチドは、Ｆｃレセプターに対する親和性が低いかまたはない。代替的
な実施形態では、第２ポリペプチドは、補体タンパク質Ｃ１ｑに対する親和性が低いかま
たはない。
【００３５】
本発明の別の局面は、ムチンポリペプチド、またはその誘導体、フラグメント、アナロ
グもしくはホモログをコードする核酸を含む、ベクター（好ましくは、発現ベクター）に
関する。種々の局面では、このベクターは、免疫グロブリンポリペプチド、またはその誘
導体、フラグメント、アナログもしくはホモログをコードする核酸に作動可能に連結した
、ムチンポリペプチドをコードする核酸を含む。さらに、このベクターは、血液型トラン
スフェラーゼ（例えば、α１，２フコシルトランスフェラーゼ、α１，３Ｎアセチルガラ
クトサミニルトランスフェラーゼ（α１，３Ｎ ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎ
ｉｎｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、α１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ、またはこ
れらの任意の組み合わせ）をコードする核酸を含む。血液型トランスフェラーゼは、ＡＢ
Ｏ融合タンパク質のムチン部分のペプチド（ｐｅｐｔｏｄｅ）骨格に対する血液型決定因
子の付加を促進する。本明細書中で用いられる場合、用語「ベクター」とは、連結されて
いる別の核酸分子を輸送し得る核酸分子をいう。ベクターの1つの型は、「プラスミド」
であり、プラスミドとは、さらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状二本鎖ＤＮＡル
ープをいう。ベクターの別の型は、ウイルスベクターであり、ここで、さらなるＤＮＡセ
グメントがウイルスゲノムに連結され得る。特定のベクターは、これらが導入される宿主
細胞中で自律的複製をし得る（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピ
ソームの哺乳動物ベクターを有する）。他のベクター（例えば、非エピソームの哺乳動物
ベクター）は、宿主細胞へと導入される際に、宿主細胞のゲノムへと組み込まれ、それに
よって、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に
連結される遺伝子の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書中で、「発現ベ
クター」といわれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、頻繁に
、プラスミドの形態である。本明細書中で、「プラスミド」および「ベクター」は、交換
可能に用いられ得る。なぜならば、プラスミドは、最も一般的に用いられるベクターの形
態だからである。しかし、本発明は、等価な機能を果たす、ウイルスベクター（例えば、
複製欠損のレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような、発現
ベクターのこのような他の形態を含むことを意図する。
【００３６】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主における核酸の発現に適切な形態で、本発明の核
酸分子を含み、このことは、組換え発現ベクターが、発現に用いられる宿主細胞に基づい
て選択された（すなわち、発現される核酸配列に作動可能に連結された）、1つ以上の調
節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に連結した（さ
れる）」とは、目的のヌクレオチド配列が、このヌクレオチド配列の発現を可能にする様
式で（例えば、インビトロ転写／翻訳システムにおいて、またはベクターが宿主細胞に導
入される場合、宿主細胞において）、調節配列に連結されるという意味が意図される。
【００３７】
用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例
えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。このような調節配列は、例え
ば、Ｇｏｅｄｄｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨ
ＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載される。調節配列としては、宿主細胞の
多くの型においてヌクレオチド配列の構成的発現を指向する配列、および特定の宿主細胞
においてのみヌクレオチド配列の発現を指向する配列（例えば、組織特異的調節配列）が
挙げられる。発現ベクターの設計は、例えば、形質転換される宿主細胞の選択、所望され
るタンパク質の発現のレベルなどの因子に依存し得ることが当業者により理解される。本
発明の発現ベクターは、宿主細胞へと導入されて、それにより、本明細書中に記載される
ような核酸によりコードされる、融合タンパク質もしくは融合ペプチド（例えば、ＡＢＯ
融合ポリペプチド、ＡＢＯ融合ポリペプチドの変異形態など）を含む、タンパク質もしく
はペプチドを産生し得る。
【００３８】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞におけるＡＢＯ融合
ポリペプチドの発現のために設計され得る。例えば、ＡＢＯ融合ポリペプチドは、Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクタ
ーを用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現され得る。適切な宿主細胞は、
Ｇｏｅｄｄｌｅ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯ
ＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）にさらに考察される。あるいは、組換え発現ベク
ターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、インビト
ロで転写および翻訳され得る。
【００３９】
原核生物におけるタンパク質の発現は、最も頻繁に、融合タンパク質または非融合タン
パク質のいずれかの発現を指向する構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含む
ベクターを用いて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで実施される。融合ベクターは、
それらの中でコードされるタンパク質に、通常は、組換えタンパク質のアミノ末端に、多
数のアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、代表的には、以下の３つの目的を
果たす：（ｉ）組換えタンパク質の発現を増大させること；（ｉｉ）組換えタンパク質の
可溶性を増大させること；および（ｉｉｉ）アフィニティー精製におけるリガンドとして
作用することにより、組換えタンパク質の精製を補助すること。頻繁に、融合発現ベクタ
ーにおいて、タンパク質分解切断部位が、融合部分と組み換えタンパク質との接合部に導
入されて、融合タンパク質の精製、引き続く、この融合部分からの組換えタンパク質の分
離を可能にする。このような酵素、およびこれらの同族の認識配列としては、第Ｘａ因子
、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。代表的な融合発現ベクターとしては
、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎ
ｓｏｎ，１９８８．Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）、およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられ、これらは、標的組換えタンパク質
に対して、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結
合タンパク質、またはプロテインＡを融合する。
【００４０】
適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎ
ら（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３０５）およびｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅ
ｒら、ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ
ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ
，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。
【００４１】
Ｅ．ｃｏｌｉ中の組換えタンパク質発現を最小にする１つのストラテジーは、組み換え
タンパク質をタンパク質分解により切断する能力が損なわれた宿主細菌において、タンパ
ク質を発現することである。例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩ
ＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）１１９
−１２８を参照のこと。別のストラテジーは、各アミノ酸についての個々のコドンが、Ｅ
．ｃｏｌｉにおいて優先的に利用されるものであるように、発現ベクターへと挿入される
核酸の核酸配列を変化させることである（例えば、Ｗａｄａら、１９９２．Ｎｕｃｌ．Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８を参照のこと）。本発明の核酸配列のこの
ような変更は、標準的なＤＮＡ合成技術により実行され得る。
【００４２】
別の実施形態において、ＡＢＯ融合ポリペプチド発現ベクターは、酵母発現ベクターで
ある。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓａｅにおける発現のためのベク
ターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６
：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９８２．
Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、１９８７．Ｇｅ
ｎｅ ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）およびｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ
Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
【００４３】
あるいは、ＡＢＯ融合ポリペプチドは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して、昆
虫細胞において発現され得る。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）におけるタンパク質
の発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉ
ｔｈら、１９８３．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶ
Ｌシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ，１９８９．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７
０：３１−３９）が挙げられる。
【００４４】
さらに別の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺
乳動物細胞において発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅ
ｅｄ，１９８７．Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ
ら、１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞におい
て使用される場合、この発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイルス調節エレメント
により提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイ
ルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０由来である。原核生物細胞お
よび真核生物細胞の両方に適切な他の発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、
ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．第２
版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９の第１６章および１７章を参照のこと。
【００４５】
本発明の別の局面は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。用
語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」とは、本明細書中で交換可能に使用される。こ
のような用語は、特定の被験体細胞を言及するだけでなく、このような細胞の子孫または
潜在的な子孫も言及することが理解される。特定の改変は、変異の影響または環境的な影
響のいずれかに起因して、次世代で生じ得るので、このような子孫は、実際のところ、親
細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書中で使用されるような用語の範囲内になお
含まれる。
【００４６】
宿主細胞は、任意の原核動物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、糖タンパク
質Ｉｂα融合ポリペプチドは、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母細胞
または哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）も
しくはＣＯＳ細胞）において発現され得る。他の適切な宿主細胞が、当業者に公知である
。
【００４７】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換技術またはトランスフェクション技術によって、原
核生物細胞または真核生物細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「形
質転換」および「トランスフェクション」は、異種核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に
導入するための当該分野で認められた種々の技術をいうことが意図され、これらの技術と
しては、リン酸カルシウム共沈殿もしくは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラ
ン媒介性トランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションが挙げ
られる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするための適切な方法は、Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ Ｍ
ＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）、および他の研究用マニュアルに
見出され得る。
【００４８】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションについて、使用される発現ベクターおよび
トランスフェクション技術に依存して、わずかな細胞しか異種ＤＮＡをそのゲノムに組み
込み得ないことが知られている。これらの要素を同定および選択するために、選択マーカ
ー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子は、一般的に、目的の遺伝子と
共に宿主細胞に導入される。種々の選択マーカーとしては、薬物に対する耐性を与えるマ
ーカー（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキサート）が挙げられる。
選択マーカーをコードする核酸は、糖タンパク質Ｉｂα融合ポリペプチドをコードするベ
クターと同じベクターを用いて宿主細胞に導入され得るか、または別個のベクターを用い
て導入され得る。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によ
り同定され得る（例えば、選択マーカー遺伝子を組み込まれた細胞は生き残り、一方、他
の細胞は、死ぬ）。
【００４９】
培養物中の本発明の宿主細胞（例えば、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞）は
、ＡＢＯ融合ポリペプチドを産生（すなわち、発現）するために使用され得る。従って、
本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用して、ＡＢＯ融合ポリペプチドを産生するため
の方法を提供する。一実施形態において、この方法は、本発明の宿主細胞（この宿主細胞
に、ＡＢＯ融合ポリペプチドをコードする組換え発現ベクターが導入されている）を、適
切な培地中で、ＡＢＯ融合ポリペプチドが産生するように、培養する工程を包含する。別
の実施形態において、この方法はさらに、この培地または宿主細胞からＡＢＯポリペプチ
ドを単離する工程を包含する。
【００５０】
ＡＢＯ融合ポリペプチドは、従来の条件（例えば、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、
アフィニティクロマトグラフィー、電気泳動など）に従って、単離および精製され得る。
例えば、免疫グロブリン融合タンパク質は、この融合タンパク質のＦｃ部分に選択的に結
合する固定化されたプロテインＡまたはプロテインＧを含むカラムに溶液を通すことによ
り、精製され得る。例えば、Ｒｅｉｓ，Ｋ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３２：３０
９８−３１０２（１９８４）ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ８７／００３２９を参照のこと。こ
の融合ポリペプチドは、カオトロピック塩での処理によって、または酢酸水溶液（１Ｍ）
での溶出によって、溶出され得る。
【００５１】
あるいは、本発明に従うＡＢＯ融合ポリペプチドは、当該分野で公知の方法を使用して
、化学的に合成され得る。ポリペプチドの化学合成は、例えば、以下に記載される。種々
のタンパク質合成方法が、当該分野で公知であり、これにはペプチド合成機を使用する合
成が挙げられる。例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａ
ｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ，Ｂｏｄａｓｎｓｋｙ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９
８８；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：２４１−２４７（１９８６）；
Ｂａｒａｎｙら、Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３０：７０
５−７３９（１９８７）；Ｋｅｎｔ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：９５７−
９８９（１９８８）、およびＫａｉｓｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１８７−１９８
（１９８９）を参照のこと。このポリペプチドは、化学前駆体も他の化学物質も実質的に
含まなくなるように、標準的なペプチド精製技術を使用して精製される。用語「化学前駆
体も他の化学物質も実質的に含まない」は、ペプチドが、このペプチドの合成に関与する
化学前駆体または他の化学物質から分離されているペプチドの調製物を含む。一実施形態
において、用語「化学前駆体も他の化学物質も実質的に含まない」は、約３０％（乾燥重
量）未満の化学前駆体または非ペプチド化学物質、より好ましくは約２０％未満の化学前
駆体または非ペプチド化学物質、さらにより好ましくは約１０％未満の化学前駆体または
非ペプチド化学物質、最も好ましくは約５％未満の化学前駆体または非ペプチド化学物質
を有するペプチドの調製物を含む。
【００５２】
ポリペプチドの化学合成は、改変されたかまたは非天然のアミノ酸（Ｄ−アミノ酸が挙
げられる）および他の有機低分子の組み込みを容易にする。対応するＤ−アミノ酸アイソ
フォームでの、ペプチド中の１つ以上のＬ−アミノ酸の置換は、酵素的加水分解に対する
ペプチドの耐性を増加するため、および生物学的に活性なペプチドの１つ以上の特性（す
なわち、レセプター結合、機能的効力または作用の持続時間）を増強するために、使用さ
れ得る。例えば、Ｄｏｈｅｒｔｙら、１９９３．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：２５８５
−２５９４；Ｋｉｒｂｙら、１９９３．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：３８０２−３８０
８；Ｍｏｒｉｔａら、１９９４．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５３：８４−８８；Ｗａｎｇら
、１９９３．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．４２：３９２−３９９；
ＦａｕｃｈｅｒｅおよびＴｈｉｕｎｉｅａｕ，１９９２．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．２
３：１２７−１５９を参照のこと。
【００５３】
ペプチド配列への供給架橋の導入は、ポリペプチド骨格を立体配置的かつ組織分布的に
制約し得る。このストラテジーは、増加した効力、選択性および安定性を有する融合ポリ
ペプチドのペプチドアナログを開発するために使用され得る。環状ペプチドの構造エント
ロピーは、その直線状対応物の構造エントロピーより低いので、特定のコンフォメーショ
ンの採用は、非環式アナログのエントロピーの減少よりも小さい環状アナログのエントロ
ピーの減少を伴って生じ、それにより、結合の自由エネルギーをより有利にする。大環状
化は、しばしば、ペプチドのＮ末端とＣ末端との間、側鎖とＮ末端もしくはＣ末端との間
［例えば、ｐＨ８．５においてＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６を用いた場合］（Ｓａｍｓｏｎら、Ｅ
ｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３７：５１８２−５１８５（１９９６））、または２つの
アミノ酸側鎖の間のアミド結合の形成によって達成される。例えば、ＤｅＧｒａｄｏ，Ａ
ｄｖ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ，３９：５１−１２４（１９８８）を参照のこと。ジス
ルフィド結合もまた、直線状配列に組み込まれ、その可撓性を低下させる。例えば、Ｒｏ
ｓｅら、Ａｄｖ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ，３７：１−１０９（１９８５）；Ｍｏｓｂ
ｅｒｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，１０６：５０５−
５１２（１９８２）を参照のこと。さらに、ペニシラミン（Ｐｅｎ，３−メルカプト−（
Ｄ）バリン）でのシステイン残基の置換は、あるオピオイド−レセプター相互作用の選択
性を増加するために使用されている。ＬｉｐｋｏｗｓｋｉおよびＣａｒｒ，Ｐｅｐｔｉｄ
ｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ
，Ｇｕｔｔｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ２８７−３２０頁（１９９５）。
【００５４】
（抗体媒介性移植片拒絶の処置または予防の方法）
抗体媒介性移植片拒絶（ＡＭＲ）（例えば、臓器移植拒絶）を処置または予防する方法
もまた、本発明に含まれる。このような移植片としては、腎臓、肝臓、皮膚、膵臓、角膜
または心臓が挙げられるが、これらに限定されない。ＡＭＲとは、レシピエントによる任
意の抗体媒介性移植片拒絶を含むことを意味する。この方法は、被験体由来の生物学的サ
ンプルを本発明のＡＢＯ融合ペプチドと接触させる工程を包含する。この生物学的サンプ
ルは、例えば、血液（すなわち、全血または血漿）である。このサンプルは、抗体（例え
ば、抗血液型抗体）を含むことが知られているか、またはこのような抗体を含むと疑われ
ている。いくつかの局面において、この生物学的サンプルは、ＡＢＯ融合ポリペプチドと
このサンプルとを接触させる前に、被験体から取り出される。この生物学的サンプルは、
ＡＢＯ融合ペプチド−抗血液型抗体複合体の形成を可能にする条件下で、ＡＢＯ融合ペプ
チドと接触される。このＡＢＯ融合ペプチド複合体は、存在する場合、抗血液型抗体を排
除するためにこの生物学的サンプルから分離され、そしてこの生物学的サンプルは、被験
体に再注入される。ＡＭＲはまた、本発明のＡＢＯ融合ポリペプチドを被験体に投与する
ことによって、処置または予防される。
【００５５】
被験体は、例えば、任意の哺乳動物（例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、
ネコ、ウシ、ウマ、ブタ）であり得る。処置は、被験体がＡＢＯ不適合性移植片を受ける
前に、施される。あるいは、処置は、被験体がＡＢＯ不適合性移植片を受けた後に、施さ
れる。
【００５６】
生物学的サンプルは、当業者に公知の方法によって、ＡＢＯ融合タンパク質と接触され
る。例えば、血漿しゃ血または体外免疫吸収。
【００５７】
本質的に、抗体媒介性反応と病原学的に関連する任意の障害は、予防または処置を受け
やすいとみなされる。ＡＭＲは、臓器移植の生存率が、本発明の方法により処置されない
臓器移植の生存率よりも大きい場合、処置または予防される。移植の生存率とは、移植片
がレシピエントにより拒絶される前の時間を意味する。例えば、ＡＭＲは、移植片が、移
植後少なくとも１、２、４または８週間生存する場合、処置または予防される。好ましく
は、この移植片は、３、６、１３ヶ月生存する。より好ましくは、この移植片は、２、３
、５年またはそれ以上生存する。
【００５８】
（サンプルから抗血液型抗体を除去する方法）
サンプルから抗血液型抗体を除去または枯渇する方法もまた、本発明に含まれる。この
サンプルは、生物学的流体（例えば、血液または血漿）である。あるいは、このサンプル
は、生物学的組織（例えば、心臓組織、肝臓組織、皮膚または腎臓組織）である。この方
法は、サンプルと本発明のＡＢＯ融合ペプチドを接触させる工程を包含する。このサンプ
ルは、ＡＢＯ融合ペプチド−抗血液型抗体複合体の形成を可能にする条件下で、ＡＢＯ融
合ペプチドと接触される。このＡＢＯ融合ペプチド−抗体複合体は、存在する場合、抗血
液型抗体を除去または枯渇するために、この生物学的サンプルから分離される。
【００５９】
（ＡＢＯ融合ポリペプチドまたはこれらをコードする核酸を含む薬学的組成物）
本発明のＡＢＯ融合タンパク質、またはこれらの融合タンパク質をコードする核酸分子
（本明細書中において、「治療剤」または「活性化合物」とも呼ばれる）、ならびにこれ
らの誘導体、フラグメント、アナログおよびホモログは、投与のために適切な薬学的組成
物に混合され得る。このような組成物は、代表的に、核酸分子、タンパク質、または抗体
および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書中において使用される場合、「薬学
的に受容可能なキャリア」は、薬学的投与に適合性の、任意の全ての溶媒、分散媒体、コ
ーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張性剤および吸収遅延剤などを含むことが意図さ
れる。適切なキャリアは、当該分野における標準的な参考教科書である、Ｒｅｍｉｎｇｔ
ｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版（本明細書中にお
いて参考として援用される）に記載される。このようなキャリアまたは希釈剤の好ましい
例としては、限定しないが、水、生理食塩水、フィンガー溶液（ｆｉｎｇｅｒ’ｓ ｓｏ
ｌｕｔｉｏｎ）、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。リ
ポソームおよび非水性ビヒクル（例えば、不揮発性油）もまた使用され得る。薬学的に活
性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野において周知である。任
意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合性である場合を除いて、組成物における
それらの使用が企図される。補助的な活性化合物もまた、組成物に組み込まれ得る。
【００６０】
本明細書中に開示される活性剤はまた、リポソームとして処方され得る。リポソームは
、当該分野で公知の方法（例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）；および米国特許第４，４８５，
０４５号および同第４，５４４，５４５号に記載される）によって調製される。向上した
循環時間を有するリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示される。
【００６１】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導
体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いる、逆相
エバポレーション法によって作製され得る。リポソームは、所望の直径を有するリポソー
ムを生じるように、規定された孔サイズのフィルターを通して押し出される。
【００６２】
本発明の薬学的組成物は、その意図された投与の経路と適合性であるように処方される
。投与の経路の例としては、非経口的投与、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、
経口（例えば、吸入）投与、経皮（すなわち、局所的）投与、経粘膜投与、および直腸投
与が挙げられる。非経口適用、皮内適用、または皮下適用のために使用される溶液または
懸濁液は、以下の成分を含み得る：注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレ
ングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような滅菌希釈
剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸または重
亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のようなキレ
ート剤；アセテート、シトレートまたはホスフェートのような緩衝剤、および塩化ナトリ
ウムまたはデキストロースのような張度の調節のための薬剤。ｐＨは、酸または塩基（例
えば、塩酸または水酸化ナトリウム）を用いて調節され得る。非経口調製物は、ガラスま
たはプラスチックから作製されたアンプル、使い捨て可能シリンジまたは複数用量のバイ
アル中に含まれ得る。
【００６３】
注射可能用途に適切な薬学的組成物としては、滅菌水溶液（水溶性である場合）または
分散物および滅菌注射可能溶液または分散物の即席調製物のための滅菌粉末が挙げられる
。静脈内投与のために、適切なキャリアとしては、生理学的生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅ
ｍｏｐｈｏｒ ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩
衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、滅菌でなけれ
ばならず、そして容易に注射可能である程度まで流体であるべきである。組成物は、製造
および保存の条件下において安定でなければならず、そして微生物（例えば、細菌および
真菌）の混入作用に対して保存されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノ
ール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチ
レングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒体であり得
る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散の場
合、必要とされる粒子サイズの維持によって、そして界面活性剤の使用によって、維持さ
れ得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロ
ロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る
。多くの場合において、等張性剤（例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール
）、ソルビトール、塩化ナトリウム）を組成物中に含むことが好ましい。注射可能組成物
の長期の吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよび
ゼラチン）を組成物中に含むことによってもたらされ得る。
【００６４】
滅菌注射可能溶液は、活性化合物（例えば、ＡＢＯ融合タンパク質）を必要とされる量
で、適切な溶媒中に、上記成分の１つまたは組合せと混合し、必要に応じて、続いて、滅
菌濾過することによって、調製され得る。一般的に、分散物は、ベーシックな分散媒体お
よび必要とされる上記成分からの他の成分を含む、滅菌ビヒクルに、活性化合物を混合す
ることによって調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法
は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これは、先に滅菌濾過された溶液からの、活性成分
および任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる。
【００６５】
経口組成物は、一般的に、不活性な希釈剤または食用キャリアを含む。これらは、ゼラ
チンカプセルに含まれ得るかまたは錠剤に圧縮され得る。経口治療投与のために、活性化
合物は、賦形剤と混合され得、そして錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用され
得る。経口組成物はまた、マウスウオッシュとしての使用のために流体キャリアを使用し
て調製され得、ここで、流体キャリア中の化合物は、経口適用され、スウィッシュされ、
そして吐き出されるかまたは嚥下される。薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジ
ュバント物質は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤
などは、類似の性質の以下の成分、または化合物のいずれかを含み得る：結合剤（例えば
、微結晶セルロース、トラガカントガムまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンま
たはラクトース）、崩壊剤（例えば、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスタ
ーチ）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅ）；グリダン
ト（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロー
スまたはサッカリン）；または香料（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、または
オレンジ香料）。
【００６６】
吸入による投与のために、化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素のような気体
）を含む加圧容器または分散器、あるいは噴霧器からエアロゾル噴霧の形態で送達される
。
【００６７】
全身投与はまた、経粘膜的手段または経皮的手段によってであり得る。経粘膜的投与ま
たは経皮的投与のために、浸透される障壁に対して適切な浸透剤は、処方物で使用される
。このような浸透剤は、一般的に、当該分野で公知であり、そして例えば、経粘膜的投与
のため、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜的投与は
、経鼻スプレーまたは坐剤の使用によって達成され得る。経皮投与のために、活性化合物
は、当該分野において一般的に公知な、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）
、ゲル、またはクリームに処方される。
【００６８】
化合物はまた、坐剤の形態で（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従
来の坐剤ベースとともに）または直腸送達のための保持浣腸で、調製され得る。
【００６９】
１つの実施形態において、活性化合物は、身体からの迅速な排除に対して化合物を保護
するキャリア（例えば、徐放処方物（移植物およびマイクロカプセル化送達システムを含
む））を用いて調製される。生分解性、生体適合性ポリマー（例えば、エチレンビニルア
セテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポ
リ乳酸）が使用され得る。このような処方物の調製のための方法は、当業者に明らかであ
る。これらの材料はまた、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒ
ｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手され得る。リポソーム懸濁物（ウイ
ルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染した細胞に標的化されたリポソームを
含む）もまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば、米
国特許第４，５２２，８１１号に記載されるように、当業者に公知の方法に従って調製さ
れ得る。
【００７０】
いくつかの実施形態において、経口組成物または非経口組成物は、投与の容易さおよび
均一な投与のために投薬単位形態で処方される。本明細書中で使用される投薬単位形態は
、処置される被験体に対して単位投薬として適切な物理的に異なる単位をいい；それぞれ
の単位は、必要とされる薬学的キャリアとともに、所望の治療的効果を生成するように計
算された所定量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態のための詳細は、活性化合物
の独特の特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに個体の処置のためのこのよ
うな活性化合物を配合する当該分野に固有の制限によって示され、そして直接的に依存す
る。
【００７１】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入され得、そして遺伝子治療ベクターとして使用さ
れ得る。遺伝子治療ベクターは、被験体に、例えば、静脈内注射、局所投与（例えば、米
国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）によって、または定位的な注射（例えば、
Ｃｈｅｎら、１９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３０５
４−３０５７を参照のこと）によって被験体に送達され得る。遺伝子治療ベクターの薬学
的調製物は、受容可能な希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含み得るか、または遺伝子治療
ビヒクルが埋め込まれる徐放マトリクスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクタ
ーが、組換え細胞からインタクトに作製され得る場合（例えば、レトロウイルスベクター
）、薬学的調製物は、遺伝子送達システムを作製する１つ以上の細胞を含み得る。
【００７２】
持続放出調製物は、所望であれば、調製され得る。持続放出調製物の適切な例としては
、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスが挙げられ、このマトリクスは、
形付けられた物品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態である。持続放出
マトリクスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエ
チル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許
第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタメートのコポ
リマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（
例えば、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイ
プロリドから構成される注射可能なミクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒ
ドロキシ酪酸が挙げられる。エチレンビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸のよう
なポリマーが１００日にわたる間、分子の放出を可能にする一方で、特定のヒドロゲルが
より短い時間の間、タンパク質を放出する。
【００７３】
薬学的組成物は、投与のための説明書とともに、容器、パックまたは分散器中に含まれ
得る。
【００７４】
本発明はさらに、以下の非制限的な実施例で例示される。
【実施例】
【００７５】
（実施例１：一般的方法）
本明細書中に記載されるデータは、以下の試薬および方法を使用して作製された。
【００７６】
（細胞培養）
ＣＯＳ−７ ｍ６細胞（Ｓｅｅｄ，１９８７）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６
１）、およびＳＶ４０ラージＴ抗原を発現する２９３ヒト胚性腎臓細胞株（２９３Ｔ；Ｂ
．Ｓｅｅｄによって親切にも提供された）を、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ培地（
ＧｉｂｃｏＢｒｌ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｓｃｏｔｌ
ａｎｄ）（１０％ウシ胎仔血清（ＧｉｂｃｏＢｒｌ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ）、２５μｇ／ｍｌゲンタマイシンスルフェート（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍ
Ｏ）および２ｍＭグルタミン（ＧｉｂｃｏＢｒｌ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
）を補充した）において培養した。細胞を、２〜４日毎に継代させた。ＨＨ１４ハイブリ
ドーマ（ＡＴＣＣ ＨＢ−９２９９；米国特許第４，８５７，６３９号）を、ＲＰＭＩ
１６４０（ＧｉｂｃｏＢｒｌ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（１０％ウシ胎仔
血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／μｌストレプトマイシンおよび２ｍＭグ
ルタミンを補充した）において培養した。
【００７７】
（ＨＨ１４抗体の精製）
上清を、培養したＨＨ１４細胞から収集した。２リットルの上清を、ヤギ抗マウスＩｇ
Ｍ（Ｓｉｇｍａ）カラムで、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＬＰクロマトグラフ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈ
ｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いてアフィニティー精製した。結合したタンパク質を、０．
１ＭグリシンＣｌ（ｐＨ２．５）によって溶出させ、そして溶出物を、１Ｍ Ｔｒｉｓ−
Ｃｌ（ｐＨ７．５）を用いて直ちに中和した。溶出物を、１％リン酸緩衝化生理食塩水（
ＰＢＳ）に対して透析し、そして凍結乾燥した。凍結乾燥したタンパク質を、ＢＣＡアッ
セイによって測定した場合に３μｇ／μｌの最終濃度になるように、蒸留Ｈ２Ｏ中に溶解
させた。
【００７８】
（発現ベクターの構築）
ヒト血液型Ａ遺伝子を、ＭＫＮ−４５細胞株から単離された総ＲＮＡから作製されたｃ
ＤＮＡから、５’−ｃｇｃ ｇｇｇ ａａｇ ｃｔｔ ｇｃｃ ｇａｇ ａｃｃ ａｇａ
ｃｇｃ ｇｇａ−３’（配列番号１）を正方向プライマーとして、そして５’−ｃｇｃ
ｇｇｇ ｃｇｇ ｃｃｇ ｃｔｃ ａｃｇ ｇｇｔ ｔｃｃ ｇｇａ ｃｃｇ ｃ−３
’（配列番号２）を逆方向プライマーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によ
って増幅した。増幅されたｃＤＮＡ（Ａ遺伝子）を、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＮｏｔ Ｉ
を用いて、ＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，１９８７）のポリリンカー中にサブクローン化した。血
液型Ｈ遺伝子を、ヒト扁桃支質ライブラリーをテンプレートとして用いてＰＣＲ増幅して
２片とした。内部Ｓｓｅ Ｉ部位を、ヌクレオチド７７５（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３
５５３１）をＣへと変化させて、Ｐｓｔ Ｉ部位からＳｓｅ Ｉ部位を作製する内部重複
プライマーを用いたＰＣＲによって作製した。ＦＵＴ１のカルボキシ末端をコードするｃ
ＤＮＡを、５’−ｇｇｇ ｇａｃ ｔａｃ ｃｔｇ ｃａｇ ｇｔｔ ａｔｇ ｃｃｔ
ｃａｇ ｃｇｃ−３’（配列番号３）を正方向プライマーとして、そして５’−ｃｇｃ
ｇｇｇ ｇｃｇ ｇｃｃ ｇｃｔ ｔｃａ ａｇｇ ｃｔｔ ａｇｃ ｃａａ ｔｇｔ−
３’（配列番号４）を逆方向プライマーとして用いて増幅し、Ｓｓｅ ＩおよびＮｏｔ
Ｉによって切断し、そしてＰｓｔ ＩおよびＮｏｔ Ｉで消化したＣＤＭ８発現ベクター
中にサブクローン化した。ＦＵＴ１のアミノ末端をコードするｃＤＮＡを、５’−ｃｇｃ
ｇｇｇ ａａｇ ｃｔｔ ａｃｃ ａｔｇ ｔｇｇ ｃｔｃ ｃｇｇ ａｇｃ ｃａｔ
−３’（配列番号５）を正方向プライマーとし、そして５’−ｃｃａ ｇｃｇ ｃｔｇ
ａｇｇ ｃａｔ ａａｃ ｃｔｇ ｃａｇ ｇｔａ ｇｔｃ−３’（配列番号６）を逆方
向プライマーとして用いて増幅し、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＳｓｅ Ｉによって切断し、
そしてＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＳｓｅ Ｉ切断後の、カルボキシ末端を保有するＣＤＭ８
中にサブクローン化した。
【００７９】
Ｓｅ遺伝子を、血液型Ａ２Ｌｅ（ａ−ｂ＋）Ｓｅ個体によって提供された末梢血単核細
胞から単離された総ＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡから、５’−ｃｇｃ ｇｇｇ ａａ
ｇ ｃｔｔ ａｃｃ ａｔｇ ｃｔｇ ｇｔｃ ｇｔｔ ｃａｇ ａｔｇ−３’（配列番
号７）を正方向プライマーとして、そして５’−ｃｇｃ ｇｇｇ ｃｇｇ ｃｃｇ ｃｔ
ｔ ａｇｔ ｇｃｔ ｔｇａ ｇｔａ ａｇｇ ｇ−３’（配列番号８）を逆方向プライ
マーとして用いて同様にＰＣＲ増幅した。このＳｅ遺伝子ｃＤＮＡを、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
およびＮｏｔ Ｉを用いてＣＤＭ８中にサブクローン化した。グリコシルトランスフェラ
ーゼｃＤＮＡを配列決定し、そしてこれらがコードする酵素活性を、血液型ＨおよびＡ特
異的モノクローナル抗体を用いた、一過的にトランスフェクトされた細胞のフローサイト
メトリー分析によってチェックした。ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂキメラを、以前（Ｌｉ
ｕら，１９９７）に記載されたとおりに構築した。
【００８０】
（トランスフェクションおよび分泌されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂキメラの産生）
トランスフェクションカクテルを、５ｍｌポリスチレンチューブ中で３９μｌの２０％
グルコース、３９μｇのプラスミドＤＮＡ、１２７μｌのｄＨ２Ｏ、および１５．２μｌ
の０．１Ｍポリエチレンイミン（２５ｋＤａ；Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗ
Ｉ）を混合することによって調製した。全てのトランスフェクション混合物において、１
３μｇのＰＳＧＬ‐１／ｍＩｇＧ２ｂプラスミドを用いた。種々のグリコシルトランスフ
ェラーゼ（ｇｌｙｃｏｓｙｉｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）に対して、１３μｇのこのプラス
ミドを添加し、そして必要な場合、合計３９μｇのプラスミドＤＮＡに達するようにＣＤ
Ｍ８プラスミドを添加した。この混合物を室温で１０分間静置し、その後、１０ｍｌの培
養培地中に入れて、約７０％コンフルエンシーな細胞に添加した。７日後、細胞上清を収
集し、細片をスピンダウン（１４００×ｇ、１５分間）し、そしてＮａＮ３を、０．０２
％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるように添加した。
【００８１】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析のための、分泌されたＰＳＧＬ−１
／ｍＩｇＧ２ｂの精製）
ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ融合タンパク質を、４℃で一晩回転させることによって、
５０μｌヤギ抗ｍＩｇＧアガロースビーズ（１００：１のスラリー；Ｓｉｇｍａ）によっ
て、収集した上清から精製した。融合タンパク質を有するビーズをＰＢＳ中で３回洗浄し
、そしてその後の分析のために用いた。代表的には、サンプルを５０μｌの２×還元サン
プル緩衝液中に溶解し、そして１０：１のサンプルを各ウェルにローディングした。
【００８２】
（アフィニティー精製したＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂのＰＮＧａｓｅＦ処理）
ＰＮＧａｓｅＦキット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌ
ｉｓ，ＩＮ）を、Ｎ−グリカンの脱グリコシル化のために用いた。製造業者によって提供
されたプロトコルのわずかな改変版を用いた。１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ
中で、２０μｌの反応緩衝液を、アガロースビーズ上の精製したＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ
２ｂと混合し、そして３分間煮沸した。この混合物をスピンダウンし、そして１０μｌの
上清を新たなＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移した。１０μｌのＰＮＧａｓｅＦまたはネ
ガティブコントロールとして１０μｌの反応緩衝液を添加した。チューブを、１．５時間
にわたって３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、２０μｌの２×還元サ
ンプル緩衝液および１０μｌのＨ２Ｏを添加し、そしてサンプルを３分間煮沸した。
【００８３】
（上清中のＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ濃度の決定のためのＥＬＩＳＡ）
９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３５９０，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を
、５０μｌの５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中の０．５μｇ／ウェルのアフィニティ
ー精製したヤギ抗ｍＩｇＧ特異性抗体（Ｓｉｇｍａ）で、室温で２時間にわたってコーテ
ィングした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ−Ｔ）を含むＰＢＳ中の３％ウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）３００μｌを用いて４℃で一晩ブロッキングし、続いて洗浄した後、培
養培地中に連続希釈した、５０μｌのサンプル上清を添加した。洗浄後、これらのプレー
トを、ブロッキング緩衝液中に１０，０００：１希釈したヤギ抗ｍＩｇＭ−ＨＲＰ（Ｓｉ
ｇｍａ）５０μｌとともに２時間にわたってインキュベートした。発色溶液のために、１
錠の３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Ｓｉｇｍａ）を、３μｌの３０％（
ｗ／ｖ）Ｈ２Ｏ２を含む１１ｍｌの０．０５Ｍクエン酸／リン酸緩衝液中に溶解した。１
００μｌの発色溶液を添加した。反応を、２５μｌの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を用いて停止させ
た。これらのプレートを、自動化マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔ
ｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）において４５０ｎｍおよび５４０ｎｍで読み
取った。標準として、培養培地中の精製ｍＩｇＧ Ｆｅフラグメント（Ｓｉｇｍａ）の希
釈シリーズを三連で用いた。
【００８４】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、５％スタッキングゲルおよび８％分離ゲルを用いるＬａｅｍｍｌ
ｉ（１９７０）の方法によって行い、そして分離されたタンパク質を、以前（Ｌｉｕら，
１９９７）に記載されるとおりに、ＨｙｂｏｎｄＴＭ−Ｃエキストラメンブレン上に電気
泳動的にブロッティングした。３％ ＢＳＡを含む、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含
むＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ−Ｔ）中での一晩のブロッキング後、これらのメン
ブレンを、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。次いで、これらを、マウス抗ヒト血液型Ａ全種類
（ｍＩｇＭ，Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）または抗ヒトＨ型１（ｍＩｇＧ
３，Ｓｉｇｎｅｔ；Ｄｅｄｈａｍ，ＭＡ）、抗ヒトＨ型２（ｍＩｇＭ，Ｄａｋｏ）もしく
は抗ヒトＨ型３（ｍＩｇＭ，ハイブリドーマＨＨ１４，ＡＴＣＣ ＨＢ９２９９）ととも
に、１時間にわたって室温でインキュベートした。Ｈ型３抗体以外の全ての抗体を、ＴＢ
Ｓ−Ｔ中の３％ ＢＳＡ中に１：２００希釈した。Ｈ型３抗体を、ＴＢＳ−Ｔ中の３％
ＢＳＡにおいて１μｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した。これらのメンブレンを、ＴＢ
Ｓ−Ｔで３回洗浄し、その後、ＴＢＳ−Ｔ中の３％ ＢＳＡに２０００：１希釈した、西
洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化二次抗体である、ヤギ抗ｍＩｇＭ（Ｃａｐ
ｐｅｌ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）またはヤギ抗ｍＩｇＧ３（Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｏｘｆｏｒｄ
，Ｅｎｇｌａｎｄ）とともに１時間にわたって室温でインキュベートした。結合した二次
抗体を、製造業者の指示に従って、ＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた化学発光によって可視化
した。ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ自体の検出のために、ＨＲＰ標識ヤギ抗ｍＩｇＧ（Ｓ
ｉｇｍａ）を、二次抗体とのインキュベーションを行わないこと以外は上記のとおりに、
ＴＢＳ−Ｔ中の３％ ＢＳＡにおける１：１０，０００の希釈で用いた。
【００８５】
（ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂによる相対血液型Ａエピトープ密度の決定）
ウェスタンブロットを、上記の通りに行った。メンブレンを、−３５℃で作動するＣＣ
Ｄカメラを備えるＦｌｕｏｒ−Ｓ Ｍａｘ Ｍｕｉｔｌｍａｇｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）にお
いて可視化した。Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）の分析ウィン
ドウにおいて量ツールを用いて、血液型Ａ反応性についての量（量境界ｘピクセル領域内
のピクセルの強度の合計）を、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞および２９３Ｔ細胞中で作製した
ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂについてのｍＩｇＧ反応性量で除算した。異なる宿主細胞中
で作製したＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧｂ２ｂ間でＡエピトープ／マウスＩｇＧ比を比較する
ために、比を、Ｈ遺伝子およびＡ遺伝子でトランスフェクトされたＣＯＳ細胞中で作製さ
れたＡ置換ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂから得られた比に対して正規化した。
【００８６】
（血清の吸収）
ヤギ抗ｍＩｇＧアガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）の６００マイクロリットルのスラリー
を、１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ微量遠心管に移した。これらのビーズを、４００×
ｇでのすばやいスピンによってスピンダウンした。次いで、上清を除去し、そしてこれら
のビーズを１ｍｌ ＰＢＳで１回洗浄し、再度スピンダウンし、そしてＰＳＧＬ−１／ｍ
ＩｇＧ２ｂをコードするｃＤＮＡ（Ｓｅ遺伝子およびＡ遺伝子）でトランスフェクトされ
たＣＨＯ細胞由来の１８０ｍｌの上清に移した。アガロースビーズを含む上清を、４℃で
一晩、回転させながらインキュベートした。収集のために、これらのビーズを４００×ｇ
で１５分間、室温でスピンダウンし、そして１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ微量遠心管
に移した。ＰＢＳでの洗浄を３回行った。これらのビーズは、Ａムチンビーズと呼ばれる
。６００マイクロリットルの抗ｍＩｇＧアガロースビーズをまた、Ａムチン−ビーズの希
釈のために用いて吸収剤としてのＡムチン−ビーズの希釈系列を得たこと以外は、同じ様
式で調製した。これらのビーズは、ヤギ抗ｍＩｇＧビーズと呼ばれる。これらのビーズを
、４ｍｌのＥｌｌｅｒｍａｎチューブ中に、表Ｉに従ってアリコートに分けた。Ａ−ＰＡ
Ａ−ＭＰＧ（Ｓｙｎｔｅｓｏｍｅ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＢ−ＰＡＡ−
ＭＰＧ（Ｓｙｎｔｅｓｏｍｅ）を計量し、そしてＥｌｌｅｒｍａｎチューブ中に表Ｉに従
ってアリコートに分け、その後、ＰＢＳで１回洗浄した。
【００８７】
血液型Ｏ型の５人の患者由来のプールした血清を、Ｈｕｄｄｉｎｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌの血液銀行（倫理的許可、Ｄｎｒ．３９２／９９、承認日０８
／１５／２０００）から入手した。細胞破片を、Ｊｏｕａｎ Ａ−１４微量遠心機での１
４，０００ｒｐｍでの５分間の遠心分離によって血清から除去した。透明にされた血清を
別のチューブに移し、そして水浴中で５６℃で１時間インキュベートして、補体を不活化
した。血清を、使用するまでアリコートにして−２０℃で保存した。
【００８８】
【表１】
５００マイクロリットルの血清を、各チューブに添加し、そしてこれらのビーズと、ロ
ーリングテーブル上で４℃で４時間混同した。吸収後、これらのビーズをスピンダウンし
、そして吸収された血清を新たなＥｌｌｅｒｍａｎチューブに移した。吸収された血清を
、さらなる分析まで、−２０℃で保存した。
【００８９】
Ａムチン−ビーズ上でのＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂの量を決定するために、ヤギ抗ｍ
ＩｇＧ Ｆｃ ＥＬＩＳＡ（上記の手順を参照のこと）を、アガロースビーズとのインキ
ュベーション前の上清およびインキュベーション後の上清について行った。
【００９０】
（抗Ａ抗体の定量のためのＥＬＩＳＡ）
９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３５９０，Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、１ウ
ェルあたり５０μｌの５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中０．０５μｌのＡ−ＰＡＡ−
ビオチン（Ｓｙｎｔｅｓｏｍｅ）で２時間、室温でコーティングした。ＰＢＳ−Ｔ中の３
％ ＢＳＡ（３００μｌ）を用いた４℃での一晩のブロッキングおよびその後の洗浄後、
ＰＢＳ中に連続希釈した５０μｌの血清を添加し、そしてこのプレートを室温で２時間イ
ンキュベートした。洗浄後、ブロッキング緩衝液中に１０，０００：１希釈したマウス抗
ヒトＩｇＡ−ＨＲＰ、マウス抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰおよびマウス抗ヒトＩｇＭ−ＨＲＰ（
Ｊａｃｋｓｏｎ，ＰＡ）（５０μｌ）とともにインキュベーションを行った。このプレー
トの発色および読取りを上記の通りに行った。
【００９１】
（血清中における総タンパク質濃度の決定）
血清中における総タンパク質濃度を、抗Ａ抗体の吸収の前後に決定した。ＢＣＡタンパ
ク質アッセイ試薬のマイクロタイタープレートプロトコール（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆ
ｏｒｄ，ＩＬ）を製造業者の指針書に従って使用し、そしてこのサンプルを二連または三
連で実施した。
【００９２】
（実施例２：血液型ＨおよびＡを、種々の宿主細胞中で作製した組換えＰＳＧＬ−１／
ｍＩｇＧ２０において決定する）
２９３Ｔ細胞。免疫親和性により精製したＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ（Ｈ遺伝子、Ｓ
ｅ遺伝子、またはＡ遺伝子をコードするプラスミドを含むか、または含まないＰＳＧＬ−
１／ｍＩｇＧ２ｂ ｃＤＮＡで一過性でトランスフェクトした２９３Ｔ細胞により産生し
た）を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
）ならびに検出のために抗体に特異的な抗ｍＩｇＧ、抗血液型Ａ、Ｈ１型、Ｈ２型、およ
びＨ３型を使用するウエスタンブロットによって分析した（図１Ａ〜Ｅ）。この融合タン
パク質を、見掛け上の分子量約１００および１４０〜１６０ｋＤａ（Ａ）を用いる二連の
還元状態下で移動させた。このＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂは、高度にグリコシル化され
たムチン型タンパク質の挙動に関して、上記観察に従って銀でわずかに染色した（示さず
）（ＣａｒｒａｗａｙおよびＨｕｌｌ，１９９１；ＳｈｉｍｉｚｕおよびＳｈａｗ，１９
９３）。上に示されるように（Ｌｉｕら，１９９７）、この融合タンパク質は、ホモダイ
マーとして産生した（データは示さず）。６５ｋＤａおよび３５ｋＤａ付近の二本のバン
ドは、抗ｍＩｇＧ抗体で決定された。これらのバンドは、エンプティーベクターのみでト
ランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の上清には見られず、従って、融合タンパク質由来の
タンパク質フラグメントであるようであった（ＣａｒｒａｗａｙおよびＨｕｌｌ，１９９
１）。細胞フラクション中においてみられた、この４７ｋＤａおよび２０ｋＤａのバンド
は、サンプル緩衝液中で沸騰させることでアガロースビーズから脱離させた、ヤギ抗マウ
ス抗体の重鎖Ｉｇおよび軽鎖Ｉｇ由来である。
【００９３】
αｌ，３ＧａｌＮＡｃＴを有するＦＵＴ１およびＦＵＴ２の両方は、ＰＳＧＬ−１／ｍ
ＩｇＧ２ｂ（Ｂ）上の血液型Ａ鎖の生合成を支持する。ＦＵＴ２とαｌ，３ＧａｌＮＡｃ
Ｔとの組み合わせは、ＦＵＴ１とαｌ，３ＧａｌＮＡｃＴとの組み合わせよりも、ＰＳＧ
Ｌ−１／ｍＩｇＧ２ｂにおいてよりＡエピトープを産生するようであった（Ｂにおけるこ
れらのレーンを参照）。一方、ＦＵＴ１のみは、大量のＨ２型構造（Ｄ）の発現を支持し
たが、ＦＵＴ２は、ムチン／Ｉｇ（Ｄ）において、わずかなＨ２型エピトープを生じた。
ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂにおいて、検出可能なＨ１型構造は、存在しか生じなかった
。ＦＵＴ２により産生された、このＨエピトープは、ほとんど排他的に型３（すなわち、
Ｆｕｃα２Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃα−Ｒ）に基づく。なぜならば、Ｈ１型構造およびわ
ずかなＨ２型構造が、この酵素（Ｅ）によってＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂにおいて作製
されたからである。興味深いことに、Ａ遺伝子でのＨ遺伝子またはＳｅ遺伝子の両方の同
時トランスフェクションは、抗Ｈ３型抗体（Ｅ）と反応性のＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ
において大量のエピトープを生じる。血液型Ａ、Ｈ２型およびＨ３型エピトープは、主に
Ｏ連結された。なぜならば、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂのペプチドＮグリコシダーゼＦ
（ＰＮＧａｓｅＦ）処置は、これらのエピトープに対して特異的な抗体を使用する、抗体
染色を減少させたからである（図２Ｂ〜Ｄ）。効率的なＮ−グルカン脱グリコシル化は、
ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂの完全な移動シフトによって示された（図２Ａ〜Ｄ）。
【００９４】
ＣＯＳ細胞。ＣＯＳ細胞において作製されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂのウエスタン
ブロット分析は、図３Ａ〜Ｅにおいて示される。抗Ａ特異的抗体および抗Ｈ特異的抗体を
使用して染色するＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂのパターンは、２９３Ｔ細胞において作製
されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂに対して見出されたパターンに、弱いがいくらか類似
していた。α１，３ＧａｌＮａｃＴを一緒に含むＦＵＴ１およびＦＵＴ２の両方は、Ａエ
ピトープ発現を支持し、より多量のエピトープが、ＦＵＴ２およびα１，３ＧａｌＮＡｃ
Ｔ（Ｂ）によって産生された。ＦＵＴ１のみが、Ｈ２型構造（Ｄ）を作製し得、そしてＦ
ＵＴ１もＦＵＴ２も、ＣＯＳ細胞（Ｃ）において、Ｈ１型構造の発現を支持しなかった。
２９３Ｔ細胞において作製されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂに対して、非常に低レベル
のＨ３型エピトープが、ＦＵＴ１およびα１，３ＧａｌＮＡｃＴ、またはＦＵＴ２酵素の
み（Ｅ）を発現するＣＯＳ細胞において産生されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂにおいて
見られた。
【００９５】
しかし、ＦＵＴ２およびα１，３ＧａｌＮＡｃＴのジョイント発現（ｊｏｉｎｔ ｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎ）は、Ｈ３型抗体（Ｅ）との増加した反応性を生じた。さらに、弱いバ
ンドは、α１，２ＦＴのみが発現された場合、抗Ａ抗体で見出され、上記で報告したよう
に、ＣＯＳ細胞において、α１，３ＧａｌＮＡｃＴの弱い内因性の活性を示した（Ｃｌａ
ｒｋｅおよびＷａｔｋｉｎｓ，１９９９）。ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂのＰＮＧａｓｅ
Ｆ処理は、抗血液型Ａ、Ｈ２型またはＨ３型抗体の染色における任意の検出可能な減少を
示さず（データは示さず）、このことは、これらのエピトープが、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇ
Ｇ２ｂＯグリカン上で主に保持されることを示す。
【００９６】
（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）。図４Ａ〜Ｅは、ＣＨＯ細胞において
作製されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂの染色、ＦＵＴ１またはＦＵＴ２ ｃＤＮＡとα
１，３ＧａｌＮＡｃＴ（Ｂ）との同時発現後のＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ保持血液型Ａ
エピトープの染色を示す。Ｈ１型（Ｃ）構造もＨ２型（Ｄ）構造も、ＦＵＴ１またはＦＵ
Ｔ２のいずれかとの同時トランスフェクション後に、ＣＨＯ細胞において作製されたＰＳ
ＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂキメラ上で検出され得ず、このことは、Ｈ３型構造が、α１，３
ＧａｌＮＡｃＴに対して利用可能な唯一の前駆体であることを示した。抗Ｈ３型抗体を用
いた染色は、ＦＵＴ１およびＦＵＴ２（Ｂ）を用いて見出され、Ａエピトープが、ＣＨＯ
細胞におけるコア１構造に唯一基づくという理論を支持する。さらに、このことに対する
支持は、ＰＮＧａｓｅＦ処置後に得られ、このことは、抗体染色強度に影響を及ぼさず、
Ｏグリカン制限Ａエピトープ発現を示す（データは示さず）。ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２
ｂキメラ上におけるＡエピトープおよびＨ３型エピトープの数は、ＦＵＴ１と比較した場
合、ＦＵＴ２で明らかにより多く、このことは、このＳｅ遺伝子産物が、コア１（Ｇａｌ
β３ＧａｌＮＡｃα−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）構造のα１，２−フコシル化の点において、Ｈ遺
伝子産物よりも優れていることを示唆する。
【００９７】
（実施例３．異なる宿主細胞において産生されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂにおける
、血液型Ａエピトープの相対密度）
Ａ遺伝子をα１，２ＦＴのいずれかと発現する種々の宿主細胞において作製したＰＳＧ
Ｌ−１／ｍＩｇＧ２ｂキメラにおけるＡエピトープの相対数を半定量するために、抗Ａ抗
体および抗ｍＩｇＧ抗体を用いたウエスタンブロット、続いてＦｌｕｏｒ−Ｓ（登録商標
）Ｍａｘ ＭｕｌｔＩｍａｇｅｒでの化学ルミネセンス検出を使用した。各ＰＳＧＬ−１
／ｍＩｇＧ２ｂに対する、血液型ＡおよびｍＩｇＧの反応性の比を、図５に示す（３つの
代表的な実験のうちの１つを示した）。理解されるように、Ａエピトープの密度は、α１
，２ＦＴをコードするＳｅ遺伝子とともにＡ遺伝子を発現するＣＨＯ細胞において作製さ
れたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂにおいて最も高かった。このＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２
ｂは、ＦＵＴ２およびＡ遺伝子を用いてトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞において製
造されたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂよりも約３倍多量のＡエピトープを保持する；ＰＳ
ＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂは、２番目に高いＡエピトープ密度を有する（図５）。各細胞レ
ーンにおいて、Ａ遺伝子をともに有するＦＵＴ１よりも、Ａ遺伝子をともに有するＦＵＴ
２は、より高いＡエピトープ密度を与えた。
【００９８】
（実施例４：血液型Ａエピトープを保持するＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂにおける抗Ａ
抗体の吸収）
血液型Ａエピトープを有するか、または有さない組換えＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂに
おける抗Ａ抗体吸収の効率を、マクロ孔質ガラスビーズに対するポリ［Ｎ−（２−ヒドロ
キシエチル）アクリルアミド］介して連結されたＡトリサッカライド（Ａ−ＰＡＡ−ＭＰ
Ｇ）上での吸収の効率と比較した。抗Ａ抗体の吸収前および吸収後のレベルを、酵素結合
イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）において評価し、このプレートを、ビオチンでも
また置換したポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アクリルアミド］に連結させたＡトリ
サッカライド（Ａ−ＰＡＡ−ビオチン）でコーティングした。この結果を、図６に示す。
２０ｐｍｏｌの組換えＡエピトープ置換ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂが、Ａ−ＰＡＡ−ビ
オチンＥＬＩＳＡにおいて検出される場合に、抗Ａ抗体の６０％を吸収するために必要と
され、一方、Ａ−ＰＡＡ−ＭＰＧのような１６４，０００ｐｍｏｌのＡ決定基は、同量の
抗Ａ抗体を吸収するために必要とされた。このＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂダイマーは、
１０６ヶ所の強力なＯ連結グリコシル化部位および８ヶ所の強力なＮ連結グリコシル化部
位を有し（Ｗｉｌｋｉｎｓら，１９９６；Ａｅｅｄら，１９９８，２００１）、この後者
の８ヶ所は、分枝構造を保持し得る。各ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂが、約１００のＡエ
ピトープを保持すると推定する場合、これらのほとんどは、推定を超えるようであり、Ｆ
ＵＴ２およびα１，３ＧａｌＮａｃＴを有するＣＨＯ細胞において作製されたムチンは、
Ａ−ＰＡＡＦ−ＭＡＰよりも、カルボキシレートモルを基準として約８０倍以上の効率を
有する。
【００９９】
（実施例５：抗体媒介性移植拒絶の処置または予防）
ＡＢＯ障壁を横切る組織移植を、ドナー組織血液型に対して予め形成されるか、または
誘導された抗体により媒介されたＡＭＲによって特徴付する（Ｐｏｒｔｅｒ，１９６３；
Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｕｒａｄａｚｐａｌら，１９９３；Ｆａｒｇｅｓら，１９９５；Ｔａｎ
ａｂｅら，１９９８；Ａｌｋｈｕｎａｉｚｉら，１９９９）。抗ＡＢＯ抗体を、ＥＩＡ設
定における吸収剤としてＡ決定基を保持するＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ融合タンパク質
を使用して、除去する。結果は、（１００のＡ決定基／ｍｏｌのＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ
２ｂに基づく）２ｎｍｏｌのＡ決定基に対応する、ＦＵＴ２およびα１，３ＧａｌＮＡｃ
Ｔを含むＣＨＯ−Ｋ１中で作製された約２０ｐｍｏｌの組換えＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２
ｂ（分子量３００ｋＤａとして計算された）（Ｗｉｌｋｉｎｓら，１９９６；Ａｅｅｄら
，１９９８，２００１）は、Ａ−ＰＡＡ−反応性抗体の６０％を吸収する。約１６４，０
００ｐｍｏｌのＡトリサッカリドに対応するＡ−ＰＡＡ−ＭＰＧ（２μｍｏｌ／μｇとし
て計算された）が、同量の抗Ａ抗体を吸収するために必要とされた。両方の化合物にして
非特異的なタンパク質吸収量もまた評価し、そしてこの非特異的な吸収が、ＰＡＡ−ＭＰ
Ｇベース化合物よりほぼ４倍高かった。ムチンベース吸収の比較的高度な吸収効率は、（
１）多価カルボキシレート置換、（２）カルボキシレートエピトープの密接した空間、お
よび（３）主要抗原決定基を保持するコアサッカライド鎖の構造多能性に依存し得る。さ
らに、例えば、最適化されたムチンタンデム反復によって構成された合成ムチン型タンパ
ク質を作製することによる、タンパク質骨格の変化は、吸収体を改善し得る（Ｓｉｌｖｅ
ｒｍａｎら，２００１）。また、ＧａｌＮＡｃ：ポリペプチドトランスフェラーゼの異な
る組み合わせを発現するように操作された細胞は、Ｏグリカン置換密度を最適化すること
によって吸収効率を改善し得る。
【０１００】
（略語）
ＡＭＲ（抗体媒介拒絶（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）
）；ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）；ＣＨＯ（チャイニーズハムスターの卵巣）；ＣＯＳ
；ＥＴＡ（体外免疫吸収）；ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント検定法）；ＦＴ（フ
ルコシルトランスフェラーゼ）；ＧａｌＮＡｃＴ（Ｎ−アセチルガラクトサミニルトラン
スフェラーゼ）；ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）；ｍＩｇＧ（マウスＩｇＧ）；
ｍＩｇＭ（マウスＩｇＭ）；ＭＰＧ（マクロ孔質ガラスビーズ）；ＰＡＡ（ポリ［Ｎ−（
２−Ｈドロキシエチル）アクリルアミド］）；ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）；ＰＢＳ
−Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ）；ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）；ＰＮ
ＧａｓｅＦ（ペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＦ）；ＰＰ（血漿瀉血）；ＰＳＧＬ−１（Ｐ
セレクチン糖タンパク質リガンド−１）；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動）；ＴＢＳ−Ｔ（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含む
Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水）；Ｔｘ（移植）。
【０１０１】
（参考文献）
【０１０２】
【表２−１】
【０１０３】
【表２−２】
【０１０４】
【表２−３】
【０１０５】
【表２−４】
【０１０６】
【表２−５】
【０１０７】
【表２−６】
【０１０８】
【表２−７】
【０１０９】
【表２−８】
（他の実施形態）
本発明は、その詳細な説明と組み合わせて議論されるが、上記の記載は、本発明を例示
するものであって、その範囲を限定するものではないことを意図し、この範囲は、添付の
特許請求の範囲によって規定される。他の局面、利点および改変は、以下の特許請求の範
囲内である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００９−１３１２７９（Ｐ２００９−１３１２７９Ａ）
【公開日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−６２１０４（Ｐ２００９−６２１０４）
【出願日】平成２１年３月１３日（２００９．３．１３）
【分割の表示】特願２００３−５１５５６０（Ｐ２００３−５１５５６０）の分割
【原出願日】平成１４年７月１９日（２００２．７．１９）
【出願人】（５０２０７０５２１）アブソーバー アクチボラゲット (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月１３日（２００９．３．１３）
【分割の表示】特願２００３−５１５５６０（Ｐ２００３−５１５５６０）の分割
【原出願日】平成１４年７月１９日（２００２．７．１９）
【出願人】（５０２０７０５２１）アブソーバー アクチボラゲット (2)
【Ｆターム（参考）】
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