血液由来単核細胞群からの接着性細胞の選択的培養方法
【課題】 培養基材表面と血液由来の単核細胞群中の接着性細胞との間の接着力を制御し、高い培養（増殖）性と、培養後の低温処理による高い剥離性を有する血液由来単核細胞群からの接着性細胞の選択的培養方法、及び培養された接着性細胞を提供する。
【解決手段】 メトキシエチルアクリレート（ａ）の重合体（Ａ）と、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料（Ｃ）とを含有する細胞培養基材の上に、血液由来単核細胞群を播種し、成長因子を使用せずに血液由来単核細胞群中の接着性細胞のみを選択的に細胞培養基材上で接着増殖させ、培地交換により、培養基材表面に接着していない細胞を除き、次いで細胞培養基材の表面に接着し増殖された接着性細胞を基材から剥離することを特徴とする血液由来単核細胞群からの接着性細胞の選択的培養方法。
【解決手段】 メトキシエチルアクリレート（ａ）の重合体（Ａ）と、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料（Ｃ）とを含有する細胞培養基材の上に、血液由来単核細胞群を播種し、成長因子を使用せずに血液由来単核細胞群中の接着性細胞のみを選択的に細胞培養基材上で接着増殖させ、培地交換により、培養基材表面に接着していない細胞を除き、次いで細胞培養基材の表面に接着し増殖された接着性細胞を基材から剥離することを特徴とする血液由来単核細胞群からの接着性細胞の選択的培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メトキシエチルアクリレート（ａ）の重合体（Ａ）と無機材料（Ｃ）とを含有する細胞培養基材上での、血液由来単核細胞群からの接着性細胞の選択的培養方法、及びそれによって得られる培養接着細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、動物組織や血液由来の単核細胞等の細胞培養基材としては、主にプラスチック（例えばポリスチレン）製容器が使用されてきた。これら容器は、細胞培養を有効に行うために、その表面にプラズマ処理や、シリコンや細胞接着因子等のコーティングなどの表面処理が施されている。これら細胞培養容器の培養性が細胞の種類により異なる。例えば血液由来単核細胞の場合、細胞の増殖が非常に遅い。一方、一般に用いられる増殖できる細胞例えば線維芽細胞などについては、培養（増殖）した細胞が容器表面に接着しており、細胞を単離・回収するためには、トリプシ等のタンパク質加水分解酵素や化学薬品、物理的操作を用いて、容器表面から剥離する必要があった。このような酵素や化学薬品、物理的操作により細胞を剥離する操作は、細胞と基材の結合部分が切断されるだけではなく、細胞同士の結合も切断されるため、細胞を増殖している形状のままで取り出すことができなかったり、細胞の基底タンパクがダメージを受けたりして、予期せぬ細胞の性質変化を引き起こす可能性があった。
【０００３】
近年、細胞培養容器の表面にポリＮ−イソプロピルアクリルアミドのような下限臨界溶解温度（LCST）を有するポリマーを極薄く被覆した基材を使用して、細胞培養温度ではポリマーが疎水性状態を示し細胞がポリマーに接着し、培養後にポリマーを低温処理して親水性状態にすることにより、細胞とポリマーとの接着性を低下させ、細胞を加水分解酵素や化学薬品を使用せずに基材から細胞をシート状に剥離する技術が報告されている（例えば特許文献１及び２、非特許文献１参照）。
【０００４】
しかし、このような培養基材も、細胞の増殖が遅く、培養に適さない細胞種が存在し、更に、この培養基材が放射線（例えばγ線）滅菌処理を行うと、ポリマー同士が架橋し、LCSTを有するポリマーの温度応答性が大きく低下してしまい、本来の細胞の剥離しやすさが無くなる問題があった。
【０００５】
一方、（メタ）アクリル酸エステル系モノマー（ａ）を含むモノマーの重合体（Ｐ）と、水膨潤性粘土鉱物（Ｂ）とが三次元網目を形成してなる有機無機複合体粒子（Ｘ）の分散液を乾燥してなる有機無機複合体（Ｘ）の乾燥皮膜を表面に有する細胞培養基材が開示されている（例えば特許文献３参照）。
【０００６】
しかし、上記従来文献においては、血液由来単核細胞群からの接着性細胞の選択的培養方法及び剥離方法に関する具体的手段は開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特公平６−１０４０６１
【特許文献２】特開平５−１９２１３８
【特許文献３】特許第４４３０１２４
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】大和雅之、岡野光夫「ナノバイオテクノロジーの最前線」第６章、Ｐ．３４０−Ｐ．３４７、シーエムシー出版（２００３年出版）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明が解決しようとする課題は、培養基材表面と血液由来の単核細胞群中の接着性細胞との間の接着力を制御し、高い培養（増殖）性と、培養後の低温処理による高い剥離性を有する血液由来単核細胞群からの接着性細胞の選択的培養方法、及び培養された接着性細胞を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、メトキシエチルアクリレート（ａ）の重合体（Ａ）と、無機材料（Ｃ）とを含有する細胞培養基材、及びメトキシエチルアクリレート（ａ）の重合体（Ａ）と、Ｎ-イソプロピルアクリルアミドの重合体（Ｂ）と、無機材料（Ｃ）とを含有する細胞培養基材の上では、血液由来単核細胞群中の接着性細胞が優れた増殖性を有し、また、上記培養基材を用いた場合、基材表面と細胞間の接着力を低く維持しながら、血液由来単核細胞群中の接着性細胞を選択的に培養することができ、更に、培養後低温処理により、培養基材の表面に接着し増殖された接着性細胞を基材表面から容易に剥離できる、血液由来単核細胞群からの接着性細胞の選択的培養方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち、本発明は、メトキシエチルアクリレート（ａ）の重合体（Ａ）と、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料（Ｃ）とを含有する細胞培養基材の上に、血液由来単核細胞群を播種し、成長因子を使用せずに血液由来単核細胞群中の接着性細胞のみを選択的に細胞培養基材上で接着増殖させ、培地交換により、培養基材表面に接着していない細胞を除き、次いで細胞培養基材の表面に接着し増殖された接着性細胞を基材から剥離することを特徴とする血液由来単核細胞群からの接着性細胞の選択的培養方法を提供する。
【００１２】
また、本発明は、前記細胞培養基材が、更に、Ｎ-イソプロピルアクリルアミドの重合体（Ｂ）を含有する血液由来単核細胞群からの接着性細胞の選択的培養方法を提供する。
【００１３】
また、本発明は、前記培養方法で製造された血液由来単核細胞からの接着性細胞を提供する。
【００１４】
本発明の細胞培養基材の最大の特徴は、上記無機材料（Ｃ）の構成部分が血液由来単核細胞群中の接着性細胞の増殖を担い、メトキシエチルアクリレート（ａ）の重合体（Ａ）が細胞に対して低接着性を付与し、更に、重合体（A）及びＮ-イソプロピルアクリルアミドの重合体（Ｂ）は温度変化による細胞の剥離を担うことにある。それぞれの部分を接着性細胞の増殖、剥離の状況に応じてそれぞれ単独に調節できることにある。例えば、培養時（３７℃）、接着性細胞が培養表面と弱い接着性を維持しながら、高い増殖能で増殖し、培養終了後、温度を３０℃以下に下げることにより（例えば室温）、重合体（B）の部分がより高い親水性を示し、培養表面と細胞間の接着力が更に弱くなり、培養された接着性細胞が容易に剥離することができる。また、メトキシエチルアクリレート（ａ）の重合体（Ａ）と細胞との間の接着性が十分に弱い場合、重合体（A）単独でも、培地の低温処理で、両者間の接着性が更に弱くなり、培養細胞を容易に剥離・回収することができる。ここでいう接着性細胞とは、樹状細胞やマクロファージ細胞、間葉系幹細胞のような細胞のことをいい、また、ここで言う血液とは、ヒトまたはその他の動物の臍帯血液または末梢血液のことをいう。
【００１５】
培養後、薬剤（タンパク質分解酵素）を使用することなく、低温処理のみで、培養細胞を容易に基材表面から剥離し、細胞にダメージを与えずに、高い収率で細胞を回収することができることにある。
【００１６】
重合体（Ａ）は主にイオン結合や水素結合などにより無機材料（Ｃ）と相互作用し結合している。この結合力は強く、容易にポリマーと無機材料（Ｃ）を引き離すことはできない。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の血液由来単核細胞群からの接着性細胞の選択的培養方法は、細胞と培養表面の間に弱い接着力を維持しながら、高い増殖能を有し、培養した細胞を、薬剤（トリプシン等）を使用することなく、培養細胞を容易に培養基材表面から剥離、回収できる特徴を有する。
また、本培養方法に用いられる培養基材は、γ線や電子線などの放射線滅菌が可能である特徴を有する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
メトキシエチルアクリレートモノマー（ａ）の使用により、血液由来単核細胞群中の接着性細胞の初期接着性を低く維持でき、細胞増殖性と剥離性が良好な細胞培養基材が得られる。また、モノマー（ａ）は、これらの細胞培養基材をポリスチレンなどのプラスチック製基材等の支持体の表面に積層させる場合は、両者間の接着性が強く、製造が簡便にできる特徴も持っている。
【００１９】
また、培養性や剥離性、及びその他の物性を調整するため、必要に応じてその他の共重合モノマーとして、例えば、スルホン基やカルボキシル基のようなアニオン基を有するアクリル系モノマー、４級アンモニウム基のようなカチオン基を有するアクリル系モノマー、４級アンモニウム基と燐酸基とを持つ両性イオン基を有するアクリル系モノマー、カルボキシル基とアミノ基とをもつアミノ酸残基を有するアクリル系モノマー、糖残基を有するアクリル系モノマー、また、水酸基を有するアクリル系モノマー、更にポリエチレングリコールのような親水性鎖とノニルフェニル基のような疎水基を合わせ持つ両親媒性アクリル系モノマー、Ｎ−置換（メタ）アクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ−ジ置換（メタ）アクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドなどを併用することができる。
【００２０】
本発明に用いる無機材料（Ｃ）は、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料である。水膨潤性粘土鉱物としては、層状に剥離可能な水膨潤性粘土鉱物が挙げられ、好ましくは水または水と有機溶剤との混合溶液中で膨潤し均一に分散可能な粘土鉱物、特に好ましくは水中で分子状（単一層）またはそれに近いレベルで均一分散可能な無機粘土鉱物が用いられる。具体的にはナトリウムを層間イオンとして含む水膨潤性ヘクトライト、水膨潤性モンモリライト、水膨潤性サポナイト、水膨潤性合成雲母、等が挙げられる。これらの粘土鉱物を混合して用いても良い。
【００２１】
本発明に用いるシリカ（ＳｉＯ２）としては、コロイダルシリカが挙げられ、好ましくは水溶液中で均一に分散可能で、粒径が１０ｎｍ〜５００ｎｍのコロイダルシリカ、特に好ましくは粒径が１０〜５０ｎｍのコロイダルシリカが用いられる。
【００２２】
本発明の細胞培養基材において、メトキシエチルアクリレート（ａ）の重合体（Ａ）とＮ-イソプロピルアクリルアミドの重合体（Ｂ）との質量比（（Ｂ）／（Ａ））が、０．０１〜１．５であることが好ましく、０．０３〜０．７がより好ましく、０．１〜０．３が特に好ましい。質量比（（Ｂ）／（Ａ））がこの範囲であると、接着性細胞に対し良好な培養性と高い剥離性を兼ね備えることができ、好ましい。
【００２３】
また、本発明の細胞培養基材において、重合体（Ａ）と無機材料（Ｃ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））が、０．０３〜０．８であることが好ましく、０．０５〜０．３がより好ましく、０．０７〜０．１が特に好ましい。質量比（（Ｃ）／（Ａ））がこの範囲であると、接着性細胞に対し良好な培養性と高い剥離性を兼ね備えることができ、好ましい。
【００２４】
更に、本発明の細胞培養基材で培養した接着性細胞を、培地温度を３０℃以下に下げ、静置して、細胞を自然に剥離させることもできるし、または培地温度を３０℃以下に下げた後、以下に列挙した方法と併用して、細胞を容易に剥離させることもできる。
（１）培養容器内の培地を軽く揺らして細胞を剥離させる方法。
（２）ピペットで培地を吸ったり出したりするピペッティング操作で剥離させる方法。
（３）ガラス棒、ピペットの先や、ゴムヘラ等を培養細胞と培養基材間に差し込んで、細胞を持ち上げるように剥離させる方法、
（４）ストロー状の器材で吸引しながら剥離させる方法等がある。
【００２５】
本発明の培養方法で製造された接着性細胞は、トリプシンなどのタンパク質分解酵素を使用しないため、細胞の基底タンパクがダメージを受けず、生体内の細胞形態により近い状態にあり、細胞活性も高く、移植後の定着性や治癒性が高いと考えられる。
【００２６】
本発明の培養基材の製造方法は、メトキシエチルアクリレート（ａ）重合体（Ａ）とＮ-イソプロピルアクリルアミドの重合体（Ｂ）が、無機材料（Ｃ）と相互作用し、有機無機複合体を形成できるものであれば、特に限定されない。例えば、メトキシエチルアクリレート（ａ）と前記無機材料（Ｃ）および重合開始剤（Ｄ）とを混合した水媒体（Ｅ）を支持体に塗布して、前記メトキシエチルアクリレート（ａ）を重合させることにより、重合体（Ａ）と前記無機材料（Ｃ）との複合体（Ｘ）の薄層を形成する製造方法が挙げられる。
【００２７】
前記製造方法に用いる水媒体（Ｅ）は、モノマー（ａ）や無機材料（Ｃ）などを含むことができ、重合によって、物性のよい有機無機複合体が得られれば良く、特に限定されない。例えば水、または水と混和性を有する溶剤及び／またはその他の化合物を含む水溶液であってよく、その中には更に、必要に応じて防腐剤や抗菌剤、抗生物質、着色料、香料、酵素、たんぱく質、コラーゲン、糖類、アミノ酸類、ペプチド類、ＤＮＡ類、塩類、水溶性有機溶剤類、界面活性剤、高分子化合物、レベリング剤などを含むことができる。
【００２８】
本発明に用いられる重合開始剤（Ｄ）としては、公知のラジカル重合開始剤を適時選択して用いることができる。好ましくは水溶性または水分散性を有し、系全体に均一に含まれるものが好ましく用いられる。具体的には、重合開始剤として、水溶性の過酸化物、例えばペルオキソ二硫酸カリウムやペルオキソ二硫酸アンモニウム、水溶性のアゾ化合物、例えばＶＡ−０４４、Ｖ−５０、Ｖ−５０１（いずれも和光純薬工業株式会社製）の他、Ｆｅ２＋と過酸化水素との混合物などが例示される。
【００２９】
触媒としては、３級アミン化合物であるＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンなどは好ましく用いられる。但し、触媒は必ずしも用いなくてもよい。重合温度は、重合触媒や開始剤の種類に合わせて例えば０℃〜１００℃が用いられる。重合時間も数十秒〜数十時間の間で行うことが出来る。
【００３０】
一方、光重合開始剤は、酸素阻害の影響を受けにくく、重合速度が速いため、重合開始剤（Ｄ）として好適に用いられる。具体的には、ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルトリクロロアセトフェノンなどのアセトフェノン類、４，４’−ビスジメチルアミノベンゾフェノンなどのベンゾフェノン類、２−メチルチオキサントンなどのケトン類、ベンゾインメチルエーテルなどのベンゾインエーテル類、ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトンなどのα−ヒドロキシケトン類、メチルベンゾイルホルメートなどのフェニルグリオキシレート類、メタロセン類などが挙げられる。
【００３１】
本工程に用いられる光としては、電子線、γ線、Ｘ線、紫外線、可視光などを用いることができるが、中でも装置や取り扱いの簡便さやモノマー（ｂ）の重合と同時に架橋を起こさせない観点から紫外線を用いることが好ましい。照射する紫外線の強度は１０〜５００ｍＷ／ｃｍ２が好ましく、照射時間は一般に０．１秒〜２００秒程度である。通常の加熱によるラジカル重合においては、酸素が重合の阻害因子として働くが、本発明では、必ずしも酸素を遮断した雰囲気で溶液の調製および紫外線照射による重合を行う必要がなく、空気雰囲気でこれらを行うことが可能である。但し、紫外線照射を不活性ガス雰囲気下で行うことによって、更に重合速度を速めることが可能で、望ましい場合がある。
【００３２】
また、本発明の培養基材の第二の製造例としては、水媒体（Ｅ）中の前記無機材料（Ｃ）の濃度が下記式（１）又は式（２）で表される範囲となるように、前記モノマー（ａ）と前記無機材料（Ｃ）と重合開始剤（Ｄ）とを水媒体（Ｅ）に混合した後、前記モノマー（ａ）を重合させることにより重合体（Ａ）と前記無機材料（Ｃ）との複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）を製造する第１工程、
前記分散液（Ｌ）を基材に塗布し、その後乾燥することにより前記複合体（Ｘ）の薄層を形成する第２工程を順次行なうことを特徴とする細胞培養基材の製造方法が挙げられる。
式（１） Ｒａ＜０．１９のとき
無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＜１２．４Ｒａ＋０．０５
式（２） Ｒａ≧０．１９のとき
無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＜０．８７Ｒａ＋２．１７
（式中、無機材料（Ｃ）の濃度（質量％）は、無機材料（Ｃ）の質量を水媒体（Ｅ）と無機材料（Ｃ）の合計質量で除して１００を掛けた数値、Ｒａは無機材料（Ｃ）と重合体（Ａ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））である。）
【００３３】
無機材料（Ｃ）の水媒体に対する濃度（質量％）は式（１）又は式（２）で表される範囲内であると、良好な複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）が得られ、支持体への塗布が容易で、平滑で均一な薄い塗膜が得られ、好ましい。
【００３４】
本発明の製造方法で製造される分散液（Ｌ）は、そのまま使用してもよいし、水洗などによる精製工程を経てから使用してもよい。また該分散液（Ｌ）に更にレベリング剤や界面活性剤、ペプチド、たんぱく質、コラーゲン、アミノ酸類、高分子化合物などを添加して使用してもよい。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲がこれらの実施例にのみ限定されるものではない。
【００３６】
（実施例１） 重合体（A）と無機材料（C）からなる培養機材（重合体（B）を含まない）例。
［メトキシエチルアクリレート（ａ）、無機材料（Ｃ）、水媒体（Ｅ）を含む反応溶液の調製］
メトキシエチルアクリレート（ａ）３．２ｇ、無機材料（Ｃ）として水膨潤性粘土鉱物Laponite XLG（Rockwood Additives Ltd.社製）０．２ｇ、水媒体（Ｅ）として水１００ｇ、を均一に混合して反応溶液（１）を調製した。
【００３７】
［重合開始剤（Ｄ）を溶媒（Ｆ）に溶解させた溶液の調整］
溶媒（Ｆ）として、メタノール９．８ｇ、重合開始剤（Ｄ）として１−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン「イルガキュアー１８４」（チバガイギー社製）０．２ｇを、均一に混合して溶液（２）を調製した。
【００３８】
［複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）の調製（第１工程）］
上記反応溶液（１）全量に、溶液（２）を２５０μｌ入れ、均一に分散させた後、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１８０秒照射し乳白色の複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ１）を作製した。
【００３９】
この反応系のＲａ＝０．０６、無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＝０．２０（％）＜１２．４Ｒａ＋０．０５＝０．７９
【００４０】
［培養基材（複合体（Ｘ）の薄層）の調製（第２工程）］
直径３５ｍｍのポリスチレン製シャーレ（CORNINGセルカルチャデイッシュ４３０１６５）に、上記複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ１）を入れ、スピンコーターを用いて該分散液をシャーレの表面に薄く塗布した後、８０℃の熱風乾燥器中で１０分間乾燥させ、次いで、滅菌水によりシャーレを洗浄した後、滅菌袋中でシャーレを４０℃、５時間乾燥させて、細胞培養基材１を得た。
【００４１】
［血液由来単核細胞の培養・回収］
上記得られた細胞培養基材１を照射線量１０ｋＧｙの電子線で滅菌した（日本照射サービス株式会社）後、培地としてリンパ球増殖基本培地（LGM-3）を適量入れ、ヒト末梢血液由来の単核細胞（TakaraCC-2072、タカラバイオ株式会社）を２．０×１０６個／Dish播種して、５％二酸化炭素中、３７℃で４日間培養を行った。次いで、ディッシュ中の培地及び浮遊している単核細胞を除いて、予め冷蔵庫で冷やした冷培地を入れ、１０分間静置した後、ピペットで培地を吸ったり出したりするピペッティング操作を１０回程行ったところ、培養基材の表面に接着、増殖されたほぼすべての接着性細胞が培養基材１の表面から剥離されたことが観察された。自然剥離された接着性細胞の数、及び培養基材表面から剥離せず残留した細胞の数をそれぞれ数えて、下記式（３）より、細胞の回収率を求めた。自然剥離された細胞数は６.４×１０４個で、剥離せず基材に残留した細胞数は１．１×１０４個、回収率は８５％であった。
上記培養基材１で培養された接着性細胞の総数（７．５×１０４個）が、未コート培養シャーレ（CORNINGセルカルチャデイッシュ４３０１６５）を用いた場合（２．３×１０４個）の３.３倍であった。
（３）
【００４２】
この実施例より、重合体（Ａ）と無機材料（C）からなる培養基材（重合体（B）を含まない）が、通常のティッシュカルチャデイッシュに比べ、細胞培養性が高く、また、培養基材表面と細胞間の接着性が低く、低温処理のみで細胞が容易に剥離できることが理解できる。
【００４３】
（実施例２） 重合体（A）、（B）と無機材料（C）からなる培養基材例。
［Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの重合体（B）の水溶液の調製］
Ｎ―イソプロピルアクリルアミド（株式会社興人製）１．７ｇ、水１０ｇ、溶液（２）１４０μｌ、を混合した後、該溶液を入れるガラス容器の周りを冷却しながら（約２０℃）、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１８０秒照射し、Ｎ-イソプロピルアクリルアミドを重合させた後、更に水を５ｇ添加し、重合体（Ｂ）の水溶液（ＰＮＩＰＡ２）を調製した。DIGITAL VISCOMATE粘度計（MODEL VM-100A、山一電機株式会社製）を用いてこの溶液の粘度を測定して、粘度は５１１ｍＰａ・ｓであった。測定時の溶液温度は２０℃であった。
【００４４】
また、Ｓｈｏｄｅｘ ＧＰＣ Ｓｙｓｔｅｍ−２１装置（昭和電工株式会社製）で測定した結果、このポリＮ―イソプロピルアクリルアミドの重量平均分子量Ｍｗは３．４０×１０６であった。測定時の溶媒として１０ｍｍｏｌ／ＬのＬｉＢｒを含有するＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液を使用した。分子量の計算に使用したポリスチレン標準物質としては、ＳＴＡＮＤＡＲＤ ＳＨ−７５とＳＭ−１０５キット（昭和電工株式会社製）を使用した。
【００４５】
［メトキシエチルアクリレート（ａ）、無機材料（Ｃ）、水媒体（Ｅ）を含む反応溶液の調製］
メトキシエチルアクリレート（ａ）３．２ｇ、無機材料（Ｃ）として水膨潤性粘土鉱物Laponite XLG（Rockwood Additives Ltd.社製）０．２ｇ、水媒体（Ｅ）として水１００ｇ、を均一に混合して反応溶液（２）を調製した。
【００４６】
［複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）の調製（第１工程）］
上記反応溶液（２）全量に、前記溶液（２）を２５０μｌ入れ、均一に分散させた後、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１８０秒照射し乳白色の複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ２）を作製した。
【００４７】
この反応系のＲａ＝０．０６、無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＝０．２０（％）＜１２．４Ｒａ＋０．０５＝０．７９
【００４８】
［培養基材（複合体（Ｘ）の薄層）の調製（第２工程）］
上記分散液（Ｌ２）全量に、Ｎ-イソプロピルアクリルアミドの重合体（Ｂ）の水溶液（ＰＮＩＰＡ２）を７ｇ添加し、均一に混合した後、直径３５ｍｍのポリスチレン製シャーレ（CORNINGセルカルチャデイッシュ４３０１６）に入れ、スピンコーターを用いて該分散液をシャーレの表面に薄く塗布した後、８０℃の熱風乾燥器中で１０分間乾燥させ、次いで、滅菌水によりシャーレを洗浄した後、滅菌袋中でシャーレを４０℃、５時間乾燥させて、細胞培養基材２を得た。
【００４９】
［血液由来単核細胞の培養・回収］
上記得られた細胞培養基材２を照射線量１０ｋＧｙの電子線で滅菌した（日本照射サービス株式会社）後、実施例１と同様にして、ヒト末梢血液由来の単核細胞群の培養を行い、低温処理による接着性細胞の回収を行った。自然剥離された接着性細胞の数は６．７×１０４個で、剥離せず基材に残留した細胞数は３×１０３個、回収率は９６％であった。
上記培養基材２で培養された接着性細胞の総数（７×１０４個）が、未コート培養シャーレ（CORNINGセルカルチャデイッシュ４３０１６５）を用いた場合（２．３×１０４個）の３倍であった。
【００５０】
この実施例より、重合体（Ａ）と無機材料（C）に温度応答性を有する重合体（B）を配合させた培養基材が、通常のティッシュカルチャデイッシュに比べ、細胞培養性が高く、低温処理のみで細胞が容易に剥離できることが理解できる。
【００５１】
（実施例３）
［メトキシエチルアクリレート（ａ）、無機材料（Ｃ）、水媒体（Ｅ）を含む反応溶液の調製］
メトキシエチルアクリレート（ａ）３．２ｇ、無機材料（C）としてコロイダルシリカ２０質量％水溶液（商品名スノーテックス２０、日産化学工業株式会社製）１ｇ（ＳｉＯ２＝０．２ｇ）、水媒体（E）として水１００ｇ、を均一に混合して反応溶液（３）を調製した。
【００５２】
［複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）の調製（第１工程）］
上記反応溶液（３）全量に、前記溶液（２）を２５０μｌ入れ、均一に分散させた後、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１８０秒照射し乳白色の複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ３）を作製した。
【００５３】
この反応系のＲａ＝０．０６、無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＝０．２０（％）＜１２．４Ｒａ＋０．０５＝０．７９
【００５４】
［培養基材（複合体（Ｘ）の薄層）の調製（第２工程）］
上記分散液（Ｌ３）全量に、Ｎ-イソプロピルアクリルアミドの重合体（Ｂ）の水溶液（ＰＮＩＰＡ２）を１ｇ添加し、均一に混合した後、直径３５ｍｍのポリスチレン製シャーレ（CORNINGセルカルチャデイッシュ４３０１６５）に入れ、スピンコーターを用いて該分散液をシャーレの表面に薄く塗布した後、８０℃の熱風乾燥器中で１０分間乾燥させ、次いで、滅菌水によりシャーレを洗浄した後、滅菌袋中でシャーレを４０℃、５時間乾燥させて、細胞培養基材３を得た。
【００５５】
［血液由来単核細胞の培養・回収］
上記得られた細胞培養基材３を照射線量１０ｋＧｙの電子線で滅菌した（日本照射サービス株式会社）後、実施例１と同様にして、ヒト末梢血液由来の単核細胞群の培養を行い、低温処理による接着性細胞の回収を行った。自然剥離された接着性細胞の数は４．４×１０４個で、剥離せず基材に残留した細胞数は１．１×１０４個、回収率は８０％であった。
上記培養基材３で培養された接着性細胞の総数（５．５×１０４個）が、未コート培養シャーレ（CORNINGセルカルチャデイッシュ４３０１６５）を用いた場合（２．３×１０４個）の２．４倍であった。
【００５６】
この実施例より、無機材料（C）としてシリカを用いた場合の培養基材３が良好な培養性と自然剥離による高い回収率を有することが理解できる。
【００５７】
（比較例１）
直径３５ｍｍのポリスチレン製シャーレ（CORNINGセルカルチャデイッシュ４３０１６５）をそのまま用いて、実施例１と同様にして、ヒト末梢血液由来の単核細胞群の培養を行った後、低温処理による接着細胞の回収を行ったところ、細胞は殆ど剥離しなかった。更にD-PBSと0.25% Trypsin−EDTAで処理し、細胞を回収し、細胞の数は２．３×１０４個であった。自然剥離による細胞の回収率は１０％以下であった。
【００５８】
この比較例より、通常のポリスチレン製セルカルチャデイッシュでは、ヒト末梢血液由来の単核細胞に対する培養（増殖）性が低く、培養された細胞もディッシュ表面に強く接着し、薬剤（トリプシン）を使用しない場合、容易に剥離することができないことが理解できる。
【００５９】
（比較例２）
フィブロネクチン（３５４００８、日本ベクトン・ディッキンソン株式会）の水溶液を５μｇ／ｃｍ２になるようにポリスチレン製シャーレ（CORNINGセルカルチャデイッシュ４３０１６５）にコートしたものを用いて、実施例１と同様にして、ヒト末梢血液由来の単核細胞群の培養を行った後、低温処理による接着性細胞の回収を行ったところ、細胞は殆ど剥離しなかった。更にD-PBSと0.25% Trypsin−EDTAで処理し、細胞を回収し、細胞の数は１．１×１０４個であった。自然剥離による細胞の回収率は１０％以下であった。
【００６０】
この比較例より、通常細胞の接着、伸展、及び増殖を促進するフィブロネクチンをコートした培養シャーレでは、ヒト末梢血液由来の単核細胞群中の接着性細胞に対する培養（増殖）性が低く、培養された接着性細胞もディッシュ表面に強く接着し、薬剤（トリプシン）を使用しない場合、容易に剥離することができないことが理解できる。
【００６１】
（比較例３） 重合体（Ａ）のみの（無機材料（C）を含まない）基材の例
［メトキシエチルアクリレート（ａ）、水媒体（Ｅ）を含む反応溶液の調製］
メトキシエチルアクリレート（ａ）３．２ｇ、水媒体（Ｅ）として水１００ｇ、を均一に混合して反応溶液（３’）を調製した。
【００６２】
実施例１と同様にして基材（３’）を製造した。実施例１と同様にして、ヒト末梢血液由来の単核細胞群を播種し、４日間培養したが、基材（３’）の表面に接着する細胞は殆ど見当たらなかった。
【００６３】
この比較例より、無機材料（C）を含まない、重合体（Ａ）のみの基材では、細胞との接着性が低過ぎて、細胞が増殖できないことが理解できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メトキシエチルアクリレート（ａ）の重合体（Ａ）と無機材料（Ｃ）とを含有する細胞培養基材上での、血液由来単核細胞群からの接着性細胞の選択的培養方法、及びそれによって得られる培養接着細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、動物組織や血液由来の単核細胞等の細胞培養基材としては、主にプラスチック（例えばポリスチレン）製容器が使用されてきた。これら容器は、細胞培養を有効に行うために、その表面にプラズマ処理や、シリコンや細胞接着因子等のコーティングなどの表面処理が施されている。これら細胞培養容器の培養性が細胞の種類により異なる。例えば血液由来単核細胞の場合、細胞の増殖が非常に遅い。一方、一般に用いられる増殖できる細胞例えば線維芽細胞などについては、培養（増殖）した細胞が容器表面に接着しており、細胞を単離・回収するためには、トリプシ等のタンパク質加水分解酵素や化学薬品、物理的操作を用いて、容器表面から剥離する必要があった。このような酵素や化学薬品、物理的操作により細胞を剥離する操作は、細胞と基材の結合部分が切断されるだけではなく、細胞同士の結合も切断されるため、細胞を増殖している形状のままで取り出すことができなかったり、細胞の基底タンパクがダメージを受けたりして、予期せぬ細胞の性質変化を引き起こす可能性があった。
【０００３】
近年、細胞培養容器の表面にポリＮ−イソプロピルアクリルアミドのような下限臨界溶解温度（LCST）を有するポリマーを極薄く被覆した基材を使用して、細胞培養温度ではポリマーが疎水性状態を示し細胞がポリマーに接着し、培養後にポリマーを低温処理して親水性状態にすることにより、細胞とポリマーとの接着性を低下させ、細胞を加水分解酵素や化学薬品を使用せずに基材から細胞をシート状に剥離する技術が報告されている（例えば特許文献１及び２、非特許文献１参照）。
【０００４】
しかし、このような培養基材も、細胞の増殖が遅く、培養に適さない細胞種が存在し、更に、この培養基材が放射線（例えばγ線）滅菌処理を行うと、ポリマー同士が架橋し、LCSTを有するポリマーの温度応答性が大きく低下してしまい、本来の細胞の剥離しやすさが無くなる問題があった。
【０００５】
一方、（メタ）アクリル酸エステル系モノマー（ａ）を含むモノマーの重合体（Ｐ）と、水膨潤性粘土鉱物（Ｂ）とが三次元網目を形成してなる有機無機複合体粒子（Ｘ）の分散液を乾燥してなる有機無機複合体（Ｘ）の乾燥皮膜を表面に有する細胞培養基材が開示されている（例えば特許文献３参照）。
【０００６】
しかし、上記従来文献においては、血液由来単核細胞群からの接着性細胞の選択的培養方法及び剥離方法に関する具体的手段は開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特公平６−１０４０６１
【特許文献２】特開平５−１９２１３８
【特許文献３】特許第４４３０１２４
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】大和雅之、岡野光夫「ナノバイオテクノロジーの最前線」第６章、Ｐ．３４０−Ｐ．３４７、シーエムシー出版（２００３年出版）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明が解決しようとする課題は、培養基材表面と血液由来の単核細胞群中の接着性細胞との間の接着力を制御し、高い培養（増殖）性と、培養後の低温処理による高い剥離性を有する血液由来単核細胞群からの接着性細胞の選択的培養方法、及び培養された接着性細胞を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、メトキシエチルアクリレート（ａ）の重合体（Ａ）と、無機材料（Ｃ）とを含有する細胞培養基材、及びメトキシエチルアクリレート（ａ）の重合体（Ａ）と、Ｎ-イソプロピルアクリルアミドの重合体（Ｂ）と、無機材料（Ｃ）とを含有する細胞培養基材の上では、血液由来単核細胞群中の接着性細胞が優れた増殖性を有し、また、上記培養基材を用いた場合、基材表面と細胞間の接着力を低く維持しながら、血液由来単核細胞群中の接着性細胞を選択的に培養することができ、更に、培養後低温処理により、培養基材の表面に接着し増殖された接着性細胞を基材表面から容易に剥離できる、血液由来単核細胞群からの接着性細胞の選択的培養方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち、本発明は、メトキシエチルアクリレート（ａ）の重合体（Ａ）と、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料（Ｃ）とを含有する細胞培養基材の上に、血液由来単核細胞群を播種し、成長因子を使用せずに血液由来単核細胞群中の接着性細胞のみを選択的に細胞培養基材上で接着増殖させ、培地交換により、培養基材表面に接着していない細胞を除き、次いで細胞培養基材の表面に接着し増殖された接着性細胞を基材から剥離することを特徴とする血液由来単核細胞群からの接着性細胞の選択的培養方法を提供する。
【００１２】
また、本発明は、前記細胞培養基材が、更に、Ｎ-イソプロピルアクリルアミドの重合体（Ｂ）を含有する血液由来単核細胞群からの接着性細胞の選択的培養方法を提供する。
【００１３】
また、本発明は、前記培養方法で製造された血液由来単核細胞からの接着性細胞を提供する。
【００１４】
本発明の細胞培養基材の最大の特徴は、上記無機材料（Ｃ）の構成部分が血液由来単核細胞群中の接着性細胞の増殖を担い、メトキシエチルアクリレート（ａ）の重合体（Ａ）が細胞に対して低接着性を付与し、更に、重合体（A）及びＮ-イソプロピルアクリルアミドの重合体（Ｂ）は温度変化による細胞の剥離を担うことにある。それぞれの部分を接着性細胞の増殖、剥離の状況に応じてそれぞれ単独に調節できることにある。例えば、培養時（３７℃）、接着性細胞が培養表面と弱い接着性を維持しながら、高い増殖能で増殖し、培養終了後、温度を３０℃以下に下げることにより（例えば室温）、重合体（B）の部分がより高い親水性を示し、培養表面と細胞間の接着力が更に弱くなり、培養された接着性細胞が容易に剥離することができる。また、メトキシエチルアクリレート（ａ）の重合体（Ａ）と細胞との間の接着性が十分に弱い場合、重合体（A）単独でも、培地の低温処理で、両者間の接着性が更に弱くなり、培養細胞を容易に剥離・回収することができる。ここでいう接着性細胞とは、樹状細胞やマクロファージ細胞、間葉系幹細胞のような細胞のことをいい、また、ここで言う血液とは、ヒトまたはその他の動物の臍帯血液または末梢血液のことをいう。
【００１５】
培養後、薬剤（タンパク質分解酵素）を使用することなく、低温処理のみで、培養細胞を容易に基材表面から剥離し、細胞にダメージを与えずに、高い収率で細胞を回収することができることにある。
【００１６】
重合体（Ａ）は主にイオン結合や水素結合などにより無機材料（Ｃ）と相互作用し結合している。この結合力は強く、容易にポリマーと無機材料（Ｃ）を引き離すことはできない。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の血液由来単核細胞群からの接着性細胞の選択的培養方法は、細胞と培養表面の間に弱い接着力を維持しながら、高い増殖能を有し、培養した細胞を、薬剤（トリプシン等）を使用することなく、培養細胞を容易に培養基材表面から剥離、回収できる特徴を有する。
また、本培養方法に用いられる培養基材は、γ線や電子線などの放射線滅菌が可能である特徴を有する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
メトキシエチルアクリレートモノマー（ａ）の使用により、血液由来単核細胞群中の接着性細胞の初期接着性を低く維持でき、細胞増殖性と剥離性が良好な細胞培養基材が得られる。また、モノマー（ａ）は、これらの細胞培養基材をポリスチレンなどのプラスチック製基材等の支持体の表面に積層させる場合は、両者間の接着性が強く、製造が簡便にできる特徴も持っている。
【００１９】
また、培養性や剥離性、及びその他の物性を調整するため、必要に応じてその他の共重合モノマーとして、例えば、スルホン基やカルボキシル基のようなアニオン基を有するアクリル系モノマー、４級アンモニウム基のようなカチオン基を有するアクリル系モノマー、４級アンモニウム基と燐酸基とを持つ両性イオン基を有するアクリル系モノマー、カルボキシル基とアミノ基とをもつアミノ酸残基を有するアクリル系モノマー、糖残基を有するアクリル系モノマー、また、水酸基を有するアクリル系モノマー、更にポリエチレングリコールのような親水性鎖とノニルフェニル基のような疎水基を合わせ持つ両親媒性アクリル系モノマー、Ｎ−置換（メタ）アクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ−ジ置換（メタ）アクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドなどを併用することができる。
【００２０】
本発明に用いる無機材料（Ｃ）は、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料である。水膨潤性粘土鉱物としては、層状に剥離可能な水膨潤性粘土鉱物が挙げられ、好ましくは水または水と有機溶剤との混合溶液中で膨潤し均一に分散可能な粘土鉱物、特に好ましくは水中で分子状（単一層）またはそれに近いレベルで均一分散可能な無機粘土鉱物が用いられる。具体的にはナトリウムを層間イオンとして含む水膨潤性ヘクトライト、水膨潤性モンモリライト、水膨潤性サポナイト、水膨潤性合成雲母、等が挙げられる。これらの粘土鉱物を混合して用いても良い。
【００２１】
本発明に用いるシリカ（ＳｉＯ２）としては、コロイダルシリカが挙げられ、好ましくは水溶液中で均一に分散可能で、粒径が１０ｎｍ〜５００ｎｍのコロイダルシリカ、特に好ましくは粒径が１０〜５０ｎｍのコロイダルシリカが用いられる。
【００２２】
本発明の細胞培養基材において、メトキシエチルアクリレート（ａ）の重合体（Ａ）とＮ-イソプロピルアクリルアミドの重合体（Ｂ）との質量比（（Ｂ）／（Ａ））が、０．０１〜１．５であることが好ましく、０．０３〜０．７がより好ましく、０．１〜０．３が特に好ましい。質量比（（Ｂ）／（Ａ））がこの範囲であると、接着性細胞に対し良好な培養性と高い剥離性を兼ね備えることができ、好ましい。
【００２３】
また、本発明の細胞培養基材において、重合体（Ａ）と無機材料（Ｃ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））が、０．０３〜０．８であることが好ましく、０．０５〜０．３がより好ましく、０．０７〜０．１が特に好ましい。質量比（（Ｃ）／（Ａ））がこの範囲であると、接着性細胞に対し良好な培養性と高い剥離性を兼ね備えることができ、好ましい。
【００２４】
更に、本発明の細胞培養基材で培養した接着性細胞を、培地温度を３０℃以下に下げ、静置して、細胞を自然に剥離させることもできるし、または培地温度を３０℃以下に下げた後、以下に列挙した方法と併用して、細胞を容易に剥離させることもできる。
（１）培養容器内の培地を軽く揺らして細胞を剥離させる方法。
（２）ピペットで培地を吸ったり出したりするピペッティング操作で剥離させる方法。
（３）ガラス棒、ピペットの先や、ゴムヘラ等を培養細胞と培養基材間に差し込んで、細胞を持ち上げるように剥離させる方法、
（４）ストロー状の器材で吸引しながら剥離させる方法等がある。
【００２５】
本発明の培養方法で製造された接着性細胞は、トリプシンなどのタンパク質分解酵素を使用しないため、細胞の基底タンパクがダメージを受けず、生体内の細胞形態により近い状態にあり、細胞活性も高く、移植後の定着性や治癒性が高いと考えられる。
【００２６】
本発明の培養基材の製造方法は、メトキシエチルアクリレート（ａ）重合体（Ａ）とＮ-イソプロピルアクリルアミドの重合体（Ｂ）が、無機材料（Ｃ）と相互作用し、有機無機複合体を形成できるものであれば、特に限定されない。例えば、メトキシエチルアクリレート（ａ）と前記無機材料（Ｃ）および重合開始剤（Ｄ）とを混合した水媒体（Ｅ）を支持体に塗布して、前記メトキシエチルアクリレート（ａ）を重合させることにより、重合体（Ａ）と前記無機材料（Ｃ）との複合体（Ｘ）の薄層を形成する製造方法が挙げられる。
【００２７】
前記製造方法に用いる水媒体（Ｅ）は、モノマー（ａ）や無機材料（Ｃ）などを含むことができ、重合によって、物性のよい有機無機複合体が得られれば良く、特に限定されない。例えば水、または水と混和性を有する溶剤及び／またはその他の化合物を含む水溶液であってよく、その中には更に、必要に応じて防腐剤や抗菌剤、抗生物質、着色料、香料、酵素、たんぱく質、コラーゲン、糖類、アミノ酸類、ペプチド類、ＤＮＡ類、塩類、水溶性有機溶剤類、界面活性剤、高分子化合物、レベリング剤などを含むことができる。
【００２８】
本発明に用いられる重合開始剤（Ｄ）としては、公知のラジカル重合開始剤を適時選択して用いることができる。好ましくは水溶性または水分散性を有し、系全体に均一に含まれるものが好ましく用いられる。具体的には、重合開始剤として、水溶性の過酸化物、例えばペルオキソ二硫酸カリウムやペルオキソ二硫酸アンモニウム、水溶性のアゾ化合物、例えばＶＡ−０４４、Ｖ−５０、Ｖ−５０１（いずれも和光純薬工業株式会社製）の他、Ｆｅ２＋と過酸化水素との混合物などが例示される。
【００２９】
触媒としては、３級アミン化合物であるＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンなどは好ましく用いられる。但し、触媒は必ずしも用いなくてもよい。重合温度は、重合触媒や開始剤の種類に合わせて例えば０℃〜１００℃が用いられる。重合時間も数十秒〜数十時間の間で行うことが出来る。
【００３０】
一方、光重合開始剤は、酸素阻害の影響を受けにくく、重合速度が速いため、重合開始剤（Ｄ）として好適に用いられる。具体的には、ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルトリクロロアセトフェノンなどのアセトフェノン類、４，４’−ビスジメチルアミノベンゾフェノンなどのベンゾフェノン類、２−メチルチオキサントンなどのケトン類、ベンゾインメチルエーテルなどのベンゾインエーテル類、ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトンなどのα−ヒドロキシケトン類、メチルベンゾイルホルメートなどのフェニルグリオキシレート類、メタロセン類などが挙げられる。
【００３１】
本工程に用いられる光としては、電子線、γ線、Ｘ線、紫外線、可視光などを用いることができるが、中でも装置や取り扱いの簡便さやモノマー（ｂ）の重合と同時に架橋を起こさせない観点から紫外線を用いることが好ましい。照射する紫外線の強度は１０〜５００ｍＷ／ｃｍ２が好ましく、照射時間は一般に０．１秒〜２００秒程度である。通常の加熱によるラジカル重合においては、酸素が重合の阻害因子として働くが、本発明では、必ずしも酸素を遮断した雰囲気で溶液の調製および紫外線照射による重合を行う必要がなく、空気雰囲気でこれらを行うことが可能である。但し、紫外線照射を不活性ガス雰囲気下で行うことによって、更に重合速度を速めることが可能で、望ましい場合がある。
【００３２】
また、本発明の培養基材の第二の製造例としては、水媒体（Ｅ）中の前記無機材料（Ｃ）の濃度が下記式（１）又は式（２）で表される範囲となるように、前記モノマー（ａ）と前記無機材料（Ｃ）と重合開始剤（Ｄ）とを水媒体（Ｅ）に混合した後、前記モノマー（ａ）を重合させることにより重合体（Ａ）と前記無機材料（Ｃ）との複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）を製造する第１工程、
前記分散液（Ｌ）を基材に塗布し、その後乾燥することにより前記複合体（Ｘ）の薄層を形成する第２工程を順次行なうことを特徴とする細胞培養基材の製造方法が挙げられる。
式（１） Ｒａ＜０．１９のとき
無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＜１２．４Ｒａ＋０．０５
式（２） Ｒａ≧０．１９のとき
無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＜０．８７Ｒａ＋２．１７
（式中、無機材料（Ｃ）の濃度（質量％）は、無機材料（Ｃ）の質量を水媒体（Ｅ）と無機材料（Ｃ）の合計質量で除して１００を掛けた数値、Ｒａは無機材料（Ｃ）と重合体（Ａ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））である。）
【００３３】
無機材料（Ｃ）の水媒体に対する濃度（質量％）は式（１）又は式（２）で表される範囲内であると、良好な複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）が得られ、支持体への塗布が容易で、平滑で均一な薄い塗膜が得られ、好ましい。
【００３４】
本発明の製造方法で製造される分散液（Ｌ）は、そのまま使用してもよいし、水洗などによる精製工程を経てから使用してもよい。また該分散液（Ｌ）に更にレベリング剤や界面活性剤、ペプチド、たんぱく質、コラーゲン、アミノ酸類、高分子化合物などを添加して使用してもよい。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲がこれらの実施例にのみ限定されるものではない。
【００３６】
（実施例１） 重合体（A）と無機材料（C）からなる培養機材（重合体（B）を含まない）例。
［メトキシエチルアクリレート（ａ）、無機材料（Ｃ）、水媒体（Ｅ）を含む反応溶液の調製］
メトキシエチルアクリレート（ａ）３．２ｇ、無機材料（Ｃ）として水膨潤性粘土鉱物Laponite XLG（Rockwood Additives Ltd.社製）０．２ｇ、水媒体（Ｅ）として水１００ｇ、を均一に混合して反応溶液（１）を調製した。
【００３７】
［重合開始剤（Ｄ）を溶媒（Ｆ）に溶解させた溶液の調整］
溶媒（Ｆ）として、メタノール９．８ｇ、重合開始剤（Ｄ）として１−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン「イルガキュアー１８４」（チバガイギー社製）０．２ｇを、均一に混合して溶液（２）を調製した。
【００３８】
［複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）の調製（第１工程）］
上記反応溶液（１）全量に、溶液（２）を２５０μｌ入れ、均一に分散させた後、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１８０秒照射し乳白色の複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ１）を作製した。
【００３９】
この反応系のＲａ＝０．０６、無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＝０．２０（％）＜１２．４Ｒａ＋０．０５＝０．７９
【００４０】
［培養基材（複合体（Ｘ）の薄層）の調製（第２工程）］
直径３５ｍｍのポリスチレン製シャーレ（CORNINGセルカルチャデイッシュ４３０１６５）に、上記複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ１）を入れ、スピンコーターを用いて該分散液をシャーレの表面に薄く塗布した後、８０℃の熱風乾燥器中で１０分間乾燥させ、次いで、滅菌水によりシャーレを洗浄した後、滅菌袋中でシャーレを４０℃、５時間乾燥させて、細胞培養基材１を得た。
【００４１】
［血液由来単核細胞の培養・回収］
上記得られた細胞培養基材１を照射線量１０ｋＧｙの電子線で滅菌した（日本照射サービス株式会社）後、培地としてリンパ球増殖基本培地（LGM-3）を適量入れ、ヒト末梢血液由来の単核細胞（TakaraCC-2072、タカラバイオ株式会社）を２．０×１０６個／Dish播種して、５％二酸化炭素中、３７℃で４日間培養を行った。次いで、ディッシュ中の培地及び浮遊している単核細胞を除いて、予め冷蔵庫で冷やした冷培地を入れ、１０分間静置した後、ピペットで培地を吸ったり出したりするピペッティング操作を１０回程行ったところ、培養基材の表面に接着、増殖されたほぼすべての接着性細胞が培養基材１の表面から剥離されたことが観察された。自然剥離された接着性細胞の数、及び培養基材表面から剥離せず残留した細胞の数をそれぞれ数えて、下記式（３）より、細胞の回収率を求めた。自然剥離された細胞数は６.４×１０４個で、剥離せず基材に残留した細胞数は１．１×１０４個、回収率は８５％であった。
上記培養基材１で培養された接着性細胞の総数（７．５×１０４個）が、未コート培養シャーレ（CORNINGセルカルチャデイッシュ４３０１６５）を用いた場合（２．３×１０４個）の３.３倍であった。
（３）
【００４２】
この実施例より、重合体（Ａ）と無機材料（C）からなる培養基材（重合体（B）を含まない）が、通常のティッシュカルチャデイッシュに比べ、細胞培養性が高く、また、培養基材表面と細胞間の接着性が低く、低温処理のみで細胞が容易に剥離できることが理解できる。
【００４３】
（実施例２） 重合体（A）、（B）と無機材料（C）からなる培養基材例。
［Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの重合体（B）の水溶液の調製］
Ｎ―イソプロピルアクリルアミド（株式会社興人製）１．７ｇ、水１０ｇ、溶液（２）１４０μｌ、を混合した後、該溶液を入れるガラス容器の周りを冷却しながら（約２０℃）、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１８０秒照射し、Ｎ-イソプロピルアクリルアミドを重合させた後、更に水を５ｇ添加し、重合体（Ｂ）の水溶液（ＰＮＩＰＡ２）を調製した。DIGITAL VISCOMATE粘度計（MODEL VM-100A、山一電機株式会社製）を用いてこの溶液の粘度を測定して、粘度は５１１ｍＰａ・ｓであった。測定時の溶液温度は２０℃であった。
【００４４】
また、Ｓｈｏｄｅｘ ＧＰＣ Ｓｙｓｔｅｍ−２１装置（昭和電工株式会社製）で測定した結果、このポリＮ―イソプロピルアクリルアミドの重量平均分子量Ｍｗは３．４０×１０６であった。測定時の溶媒として１０ｍｍｏｌ／ＬのＬｉＢｒを含有するＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液を使用した。分子量の計算に使用したポリスチレン標準物質としては、ＳＴＡＮＤＡＲＤ ＳＨ−７５とＳＭ−１０５キット（昭和電工株式会社製）を使用した。
【００４５】
［メトキシエチルアクリレート（ａ）、無機材料（Ｃ）、水媒体（Ｅ）を含む反応溶液の調製］
メトキシエチルアクリレート（ａ）３．２ｇ、無機材料（Ｃ）として水膨潤性粘土鉱物Laponite XLG（Rockwood Additives Ltd.社製）０．２ｇ、水媒体（Ｅ）として水１００ｇ、を均一に混合して反応溶液（２）を調製した。
【００４６】
［複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）の調製（第１工程）］
上記反応溶液（２）全量に、前記溶液（２）を２５０μｌ入れ、均一に分散させた後、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１８０秒照射し乳白色の複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ２）を作製した。
【００４７】
この反応系のＲａ＝０．０６、無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＝０．２０（％）＜１２．４Ｒａ＋０．０５＝０．７９
【００４８】
［培養基材（複合体（Ｘ）の薄層）の調製（第２工程）］
上記分散液（Ｌ２）全量に、Ｎ-イソプロピルアクリルアミドの重合体（Ｂ）の水溶液（ＰＮＩＰＡ２）を７ｇ添加し、均一に混合した後、直径３５ｍｍのポリスチレン製シャーレ（CORNINGセルカルチャデイッシュ４３０１６）に入れ、スピンコーターを用いて該分散液をシャーレの表面に薄く塗布した後、８０℃の熱風乾燥器中で１０分間乾燥させ、次いで、滅菌水によりシャーレを洗浄した後、滅菌袋中でシャーレを４０℃、５時間乾燥させて、細胞培養基材２を得た。
【００４９】
［血液由来単核細胞の培養・回収］
上記得られた細胞培養基材２を照射線量１０ｋＧｙの電子線で滅菌した（日本照射サービス株式会社）後、実施例１と同様にして、ヒト末梢血液由来の単核細胞群の培養を行い、低温処理による接着性細胞の回収を行った。自然剥離された接着性細胞の数は６．７×１０４個で、剥離せず基材に残留した細胞数は３×１０３個、回収率は９６％であった。
上記培養基材２で培養された接着性細胞の総数（７×１０４個）が、未コート培養シャーレ（CORNINGセルカルチャデイッシュ４３０１６５）を用いた場合（２．３×１０４個）の３倍であった。
【００５０】
この実施例より、重合体（Ａ）と無機材料（C）に温度応答性を有する重合体（B）を配合させた培養基材が、通常のティッシュカルチャデイッシュに比べ、細胞培養性が高く、低温処理のみで細胞が容易に剥離できることが理解できる。
【００５１】
（実施例３）
［メトキシエチルアクリレート（ａ）、無機材料（Ｃ）、水媒体（Ｅ）を含む反応溶液の調製］
メトキシエチルアクリレート（ａ）３．２ｇ、無機材料（C）としてコロイダルシリカ２０質量％水溶液（商品名スノーテックス２０、日産化学工業株式会社製）１ｇ（ＳｉＯ２＝０．２ｇ）、水媒体（E）として水１００ｇ、を均一に混合して反応溶液（３）を調製した。
【００５２】
［複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）の調製（第１工程）］
上記反応溶液（３）全量に、前記溶液（２）を２５０μｌ入れ、均一に分散させた後、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１８０秒照射し乳白色の複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ３）を作製した。
【００５３】
この反応系のＲａ＝０．０６、無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＝０．２０（％）＜１２．４Ｒａ＋０．０５＝０．７９
【００５４】
［培養基材（複合体（Ｘ）の薄層）の調製（第２工程）］
上記分散液（Ｌ３）全量に、Ｎ-イソプロピルアクリルアミドの重合体（Ｂ）の水溶液（ＰＮＩＰＡ２）を１ｇ添加し、均一に混合した後、直径３５ｍｍのポリスチレン製シャーレ（CORNINGセルカルチャデイッシュ４３０１６５）に入れ、スピンコーターを用いて該分散液をシャーレの表面に薄く塗布した後、８０℃の熱風乾燥器中で１０分間乾燥させ、次いで、滅菌水によりシャーレを洗浄した後、滅菌袋中でシャーレを４０℃、５時間乾燥させて、細胞培養基材３を得た。
【００５５】
［血液由来単核細胞の培養・回収］
上記得られた細胞培養基材３を照射線量１０ｋＧｙの電子線で滅菌した（日本照射サービス株式会社）後、実施例１と同様にして、ヒト末梢血液由来の単核細胞群の培養を行い、低温処理による接着性細胞の回収を行った。自然剥離された接着性細胞の数は４．４×１０４個で、剥離せず基材に残留した細胞数は１．１×１０４個、回収率は８０％であった。
上記培養基材３で培養された接着性細胞の総数（５．５×１０４個）が、未コート培養シャーレ（CORNINGセルカルチャデイッシュ４３０１６５）を用いた場合（２．３×１０４個）の２．４倍であった。
【００５６】
この実施例より、無機材料（C）としてシリカを用いた場合の培養基材３が良好な培養性と自然剥離による高い回収率を有することが理解できる。
【００５７】
（比較例１）
直径３５ｍｍのポリスチレン製シャーレ（CORNINGセルカルチャデイッシュ４３０１６５）をそのまま用いて、実施例１と同様にして、ヒト末梢血液由来の単核細胞群の培養を行った後、低温処理による接着細胞の回収を行ったところ、細胞は殆ど剥離しなかった。更にD-PBSと0.25% Trypsin−EDTAで処理し、細胞を回収し、細胞の数は２．３×１０４個であった。自然剥離による細胞の回収率は１０％以下であった。
【００５８】
この比較例より、通常のポリスチレン製セルカルチャデイッシュでは、ヒト末梢血液由来の単核細胞に対する培養（増殖）性が低く、培養された細胞もディッシュ表面に強く接着し、薬剤（トリプシン）を使用しない場合、容易に剥離することができないことが理解できる。
【００５９】
（比較例２）
フィブロネクチン（３５４００８、日本ベクトン・ディッキンソン株式会）の水溶液を５μｇ／ｃｍ２になるようにポリスチレン製シャーレ（CORNINGセルカルチャデイッシュ４３０１６５）にコートしたものを用いて、実施例１と同様にして、ヒト末梢血液由来の単核細胞群の培養を行った後、低温処理による接着性細胞の回収を行ったところ、細胞は殆ど剥離しなかった。更にD-PBSと0.25% Trypsin−EDTAで処理し、細胞を回収し、細胞の数は１．１×１０４個であった。自然剥離による細胞の回収率は１０％以下であった。
【００６０】
この比較例より、通常細胞の接着、伸展、及び増殖を促進するフィブロネクチンをコートした培養シャーレでは、ヒト末梢血液由来の単核細胞群中の接着性細胞に対する培養（増殖）性が低く、培養された接着性細胞もディッシュ表面に強く接着し、薬剤（トリプシン）を使用しない場合、容易に剥離することができないことが理解できる。
【００６１】
（比較例３） 重合体（Ａ）のみの（無機材料（C）を含まない）基材の例
［メトキシエチルアクリレート（ａ）、水媒体（Ｅ）を含む反応溶液の調製］
メトキシエチルアクリレート（ａ）３．２ｇ、水媒体（Ｅ）として水１００ｇ、を均一に混合して反応溶液（３’）を調製した。
【００６２】
実施例１と同様にして基材（３’）を製造した。実施例１と同様にして、ヒト末梢血液由来の単核細胞群を播種し、４日間培養したが、基材（３’）の表面に接着する細胞は殆ど見当たらなかった。
【００６３】
この比較例より、無機材料（C）を含まない、重合体（Ａ）のみの基材では、細胞との接着性が低過ぎて、細胞が増殖できないことが理解できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メトキシエチルアクリレート（ａ）の重合体（Ａ）と、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料（Ｃ）とを含有する細胞培養基材の上に、血液由来単核細胞群を播種し、成長因子を使用せずに血液由来単核細胞群中の接着性細胞のみを選択的に細胞培養基材上で接着増殖させ、培地交換により、培養基材表面に接着していない細胞を除き、次いで細胞培養基材の表面に接着し増殖された接着性細胞を基材から剥離することを特徴とする血液由来単核細胞群からの接着性細胞の選択的培養方法。
【請求項２】
前記細胞培養基材が、更に、Ｎ-イソプロピルアクリルアミドの重合体（Ｂ）を含有する請求項１記載の血液由来単核細胞群からの接着性細胞の選択的培養方法。
【請求項３】
前記重合体（Ａ）と重合体（Ｂ）との質量比（（Ｂ）／（Ａ））が、０．０１〜１．５の範囲にある請求項２記載の血液由来単核細胞群からの接着性細胞の選択的培養方法。
【請求項４】
前記重合体（Ａ）と、前記無機材料（Ｃ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））が、０．０３〜０．８の範囲にある請求項１〜３のいずれか一つに記載の血液由来単核細胞群からの接着性細胞の選択的培養方法。
【請求項５】
タンパク質分解酵素を使用せずに培養細胞を基材から剥離する請求項１〜４のいずれか一つに記載の血液由来単核細胞群からの接着性細胞の選択的培養方法。
【請求項６】
２５℃以下の低温処理及び／または物理的な外部刺激により該基材から培養細胞を剥離する請求項１〜５のいずれかに記載の血液由来単核細胞群からの接着性細胞の選択的培養方法。
【請求項７】
前記血液が、臍帯血、末梢血である請求項１〜６のいずれか一つに記載の血液由来単核細胞群からの接着性細胞の選択的培養方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の培養方法で製造された血液由来単核細胞群からの接着性細胞。
【請求項１】
メトキシエチルアクリレート（ａ）の重合体（Ａ）と、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料（Ｃ）とを含有する細胞培養基材の上に、血液由来単核細胞群を播種し、成長因子を使用せずに血液由来単核細胞群中の接着性細胞のみを選択的に細胞培養基材上で接着増殖させ、培地交換により、培養基材表面に接着していない細胞を除き、次いで細胞培養基材の表面に接着し増殖された接着性細胞を基材から剥離することを特徴とする血液由来単核細胞群からの接着性細胞の選択的培養方法。
【請求項２】
前記細胞培養基材が、更に、Ｎ-イソプロピルアクリルアミドの重合体（Ｂ）を含有する請求項１記載の血液由来単核細胞群からの接着性細胞の選択的培養方法。
【請求項３】
前記重合体（Ａ）と重合体（Ｂ）との質量比（（Ｂ）／（Ａ））が、０．０１〜１．５の範囲にある請求項２記載の血液由来単核細胞群からの接着性細胞の選択的培養方法。
【請求項４】
前記重合体（Ａ）と、前記無機材料（Ｃ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））が、０．０３〜０．８の範囲にある請求項１〜３のいずれか一つに記載の血液由来単核細胞群からの接着性細胞の選択的培養方法。
【請求項５】
タンパク質分解酵素を使用せずに培養細胞を基材から剥離する請求項１〜４のいずれか一つに記載の血液由来単核細胞群からの接着性細胞の選択的培養方法。
【請求項６】
２５℃以下の低温処理及び／または物理的な外部刺激により該基材から培養細胞を剥離する請求項１〜５のいずれかに記載の血液由来単核細胞群からの接着性細胞の選択的培養方法。
【請求項７】
前記血液が、臍帯血、末梢血である請求項１〜６のいずれか一つに記載の血液由来単核細胞群からの接着性細胞の選択的培養方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の培養方法で製造された血液由来単核細胞群からの接着性細胞。
【公開番号】特開２０１３−５５９０７（Ｐ２０１３−５５９０７Ａ）
【公開日】平成２５年３月２８日（２０１３．３．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１９６０１０（Ｐ２０１１−１９６０１０）
【出願日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【出願人】（０００１７３７５１）一般財団法人川村理化学研究所 (206)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年３月２８日（２０１３．３．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【出願人】（０００１７３７５１）一般財団法人川村理化学研究所 (206)
【Ｆターム（参考）】
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