血液試料から赤血球を分離する方法およびその使用
血液試料から赤血球を分離する方法、およびその使用が、ａ）血液試料中のフィブリンに結合することができる受容体と血液試料を接触させるステップと、ｂ）その後、血液試料からフィブリン結合受容体を分離するステップとを含む。方法を用いることにより、赤血球により引き起こされる、血液試料の流れの抑制が取り除かれ、赤血球により生成されるバックグラウンド妨害が低減されることができた。方法および方法の装置が検出結果に悪影響を及ぼさない。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は全血試料から赤血球を分離する方法および装置に関する。より詳細には、本発明は、全血試料からフィブリンを分離することにより赤血球を分離し、それにより検出に対する赤血球の妨害効果を低減する方法および装置を使う検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液試料に対して最新の臨床診断決定が日常的に行われている。不都合なことに、赤血球が多くの診断決定を妨げる。したがって、テストまたは分析が血液試料に対して行われることができる前に、赤血球がまず全血試料から除去されなければならない。一方、クロマトグラフィ分析装置では、具体的にはクロマトグラフィ免疫学的分析装置では、赤血球はこれらの装置で発生する反応のために必要な流体の流れを遅らせる可能性がある。これらの理由および別の理由から、全血試料からまず分離されなければならない血漿または血清に対して多くの分析方法論が実行される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第５９３９３３１号明細書
【特許文献２】米国特許第６６７３６２９号明細書
【特許文献３】米国特許第４５９４３２７号明細書
【特許文献４】米国特許第４６７８７５７号明細書
【特許文献５】米国特許第５５５８８３４号明細書
【特許文献６】米国特許第６８１８１８０号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２００６／００２９９２３号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第２００４／０２０２７８３号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
全血試料から赤血球を分離するための多くの知られている技法が存在する。従来型の方法が遠心分離機である。米国特許第５９３９３３１号明細書、第６６７３６２９号明細書、第４５９４３２７号明細書、第４６７８７５７号明細書、第５５５８８３４号明細書、および第６８１８１８０号明細書、ならびに米国特許出願公開第２００６／００２９９２３号明細書、および第２００４／０２０２７８３号明細書に開示されている方法もある。一般に、これらの方法は血漿から赤血球を分離するために物理的および化学的な処理を主に用い、これらの方法の大部分は費用がかかり複雑であり、赤血球の不完全な分離をもたらすことがある。さらに、既存の技法は、非常に長い間置かれたために凝固が発生した全血試料に適さない。具体的には、凝固した血液試料はクロマトグラフィ免疫学的分析装置で非特異的結合または高いバックグラウンドをもたらすことがあり、分析の感度を損なう結果となる。さらに、既存の技法はクロマトグラフィ支持体を遮り、支持体上での血漿または血清の流れを抑制することがあり、分析を無効にする。このことは具体的には非常に短期間で検出結果を与えることを求められる装置にとって致命的となり得る。したがって、試薬だけでなく、全血試料から赤血球を分離するための試薬を含むが、装置および方法が検出システムに悪影響を及ぼさない装置および方法を有する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記に言及される問題を解決するために、本発明は全血試料から赤血球を分離するための試薬、および試薬の適用を提供する。試薬を使用することにより、赤血球は全血試料から効果的に分離されることができる。
【０００６】
本発明の一様態は全血試料から赤血球を分離する方法に関する。具体的には、方法は、血液試料中のフィブリンに結合することができる受容体と全血試料を接触させるステップと、その後、血液試料からフィブリン結合受容体を除去するステップとを含む。方法はまた、赤血球に結合することができる受容体を含むことがある。方法は、フィブリン結合受容体だけ、またはフィブリン結合受容体と赤血球結合受容体の両方を備えた支持体を提供するステップと、その支持体を通って流れる血液試料を有するステップとをさらに含む。支持体はクロマトグラフィ支持体であることが好ましい。
【０００７】
本発明の別の様態は、血液試料中のフィブリンに結合することができる受容体を備えた支持体を含む、全血試料から赤血球を分離する装置に関する。支持体はまた、血液試料中の赤血球に結合することができる受容体を備えることがある。支持体はクロマトグラフィ支持体であることが好ましい。
【０００８】
本発明の別の様態は、試料受入領域、および試料受入領域の下流に配置される検出領域を有する支持体を含み、検出領域の上流の支持体が血液試料中のフィブリンに結合することができる受容体を備える、全血試料中のアナライトを検出するための検出装置に関する。試料受入領域はフィブリン結合受容体が固定化される領域でもよい。試料受入領域はまた、赤血球に結合することができる受容体を備えることがある。さらに、検出領域の上流の支持体は、血液試料の流れにより運び去られることができる標識物質をさらに含むことがあるが、検出領域は特異的結合分子を備えることがある。支持体はクロマトグラフィ支持体であることが好ましい。
【０００９】
本発明の別の様態は、全血試料中のアナライトを検出する方法に関し、方法は、フィブリンに結合することができる受容体を備える試料受入領域を含むクロマトグラフィ支持体を提供するステップと、試料受入領域を通る血液試料の流れを可能にするステップと、血液試料中のアナライトの含有量を測定するステップとを含む。支持体は赤血球に結合することができる受容体をさらに含むことがあり、アナライトを検出するために支持体の下流領域内に検出領域を含むことがある。
【００１０】
上記実施形態のすべてにおいて、フィブリンに結合することができる受容体が抗フィブリン抗体を含むが、赤血球に結合することができる受容体が抗赤血球抗体を含み、前記抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および抗体断片を含む。
【００１１】
本明細書において開示される本発明は多くの有利な点を提供する。本発明は、試料がどれだけ新鮮であっても、または既に凝固が発生しても、全血試料から赤血球を効果的に除去し、それにより血液試料の使用可能な寿命を延長する。さらに、血液試料から赤血球を分離するためまたは血液試料中のアナライトを検出するためにフィブリンに結合することができる受容体を用いる装置はまた、延長された使用可能な寿命を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の具体的な実施形態を描く。検出装置１０は、上で試料を受け入れ通過させるためのフィルタリング層１１と、反応層１２とを含む。反応層は還元反応のための基質、およびハンドル１３を備える。フィルタリング層はポリクローナル抗フィブリン抗体、およびポリクローナル抗赤血球抗体を備える。試料受入層１１上に全血試料０１を適用した後、層１１上に付着した抗フィブリン抗体および抗赤血球抗体は調和したやり方で赤血球を阻止するように働き、赤血球をフィルタリング層上に保持し、血漿が反応層１２まで通過することができるようにする。アナライトたとえば血糖が試料中に提示された場合、反応層１２の底面で色の変化が直接観察されることができる。
【図２】本発明の好ましい具体的な実施形態を描く。検出装置３０では、試料受入領域３５がガラス繊維からできている。検出領域３６がニトロセルロース膜からできており、試料受入領域の下流に位置する。標識保持領域３４が試料受入パッド３５と検出領域３６の間に位置する。検出領域は、アナライトに結合することができる特異的分子を備えるテストライン３３、および検出を確認するための対照として使用されるコントロールライン３２とを含む。試料受入領域内のガラス繊維はポリクローナル抗フィブリン抗体およびポリクローナル抗赤血球抗体を使って処理される。試料受入領域３５、標識保持領域３４、および検出領域３６はどれも、流体試料がさらなる反応のために試料受入領域３５から検出領域３６に流れるように、互いに接続される。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下は本発明に関係する構造の詳細な説明、および説明で使用される技術的語句の定義である。
【００１４】
検出
本明細書において使用されるように、「検出」は物質または材料、たとえば化学物質、有機化合物、無機化合物、代謝産物、薬物または薬物代謝産物、有機組織または有機組織の代謝産物、核酸、タンパク質、あるいは重合体だがそれらに限定されない存在のテストまたは分析を意味する。さらに、検出はまた物質または材料の含有量のテストまたは分析を意味する。さらに、本明細書において使用される分析は免疫分析、化学分析、酵素分析などを含む。
【００１５】
フィブリンおよびフィブリン結合受容体
フィブリノゲンは最も早くに発見された凝固因子である。フィブリノゲンは引き延ばされた楕円の形状を有し、ジスルフィド結合を介して互いに連結される２組の３つのポリペプチド（すなわち、１対のα鎖、１対のβ鎖、および１対のγ鎖）により形成される二量体であり、分子量３４０、０００ダルトンを有する。フィブリノゲンは肝臓内で合成され、その後血漿に入り、溶解した形態で存在する。１００ｍｌのヒト血漿当たり約０．３ｇのフィブリノゲンがある。しかしながら、フィブリンは非常に溶解しないタンパク質多量体であり、細い針の形状を有する結晶である。フィブリノゲンからフィブリンへの転換は血液凝固過程における基本的変化であり、血液凝固過程は３段階を経なければならない。すなわち、（１）フィブリノゲンの加水分解：フィブリノゲン分子の２つのα鎖および２つのβ鎖のそれぞれがトロンビンの影響下でペプチド結合を切断され、２対の小さなポリペプチドの解放（すなわち、総分子量約９０００ダルトンを有するフィブリノペプチドＡおよびフィブリノペプチドＢ）、およびフィブリン単量体の形成をもたらす。したがって、フィブリン単量体の分子量はフィブリノゲン分子の分子量よりも小さい。（２）フィブリン単量体の凝集：Ｃａ２＋の存在下で、多数のフィブリン単量体が凝集し、重合して、溶解性フィブリン重合体を形成する。（３）凝血塊の形成：トロンビン、第ＩＩＩａ因子、およびＣａ２＋の存在下で、フィブリン単量体のα鎖が互いに架橋結合して絡み合う繊維網を形成し、それによりフィブリン単量体を不溶性フィブリン重合体に変え、繊維網の中に赤血球を捕捉し、元のゾルのような血液をゲルのような血液凝固に転換する。
【００１６】
意外にも、フィブリンに結合することができる受容体を使って全血試料からフィブリンを除去することによって、血液試料中の赤血球を効果的に分離することができることがわかった。具体的には、フィブリン結合受容体が赤血球に結合することができる受容体と協調して使用されるとき、赤血球の分離はより効果的で完全になる。さらに、赤血球を除去するそのような技法は、血液試料がどれだけ新鮮であっても、または凝固がどれだけ起こっていてもうまく働く。
【００１７】
分離方法
一方、本発明は全血試料から赤血球を分離する方法に関する。具体的には、方法は血液中のフィブリンに結合することができる受容体と全血試料を接触させるステップと、その後血液試料からフィブリン結合受容体を除去するステップとを含む。具体的な実施形態では、抗フィブリン抗体が血液試料中のフィブリン単量体または重合体に結合するまたはそれらを捕獲するための受容体として使用され、この場合、抗フィブリン抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または抗体断片とすることができる。受容体はまた、フィブリンに結合することができる自然に合成されたまたは人工的に合成された別の受容体とすることができる。前記結合は「特異的」または「非特異的」とすることができ、受容体が血液試料中のフィブリンに結合するまたはそれを捕獲することができる限り、受容体はフィブリンに結合することができると考えられる。比較的簡単な一例は、全血試料を抗フィブリン抗体に接触させ、次に血液試料中の抗フィブリン抗体を分離することにより血液試料中の赤血球を分離するステップを含む。より好ましい実施形態は、まず抗赤血球抗体と全血試料を接触させるステップと、次に抗フィブリン抗体と血液試料を接触させるステップと、次に血液試料中の抗フィブリン抗体を分離することにより試料中の赤血球を分離するステップとを含む。さらに別の実施形態は、抗フィブリン抗体および抗赤血球抗体と全血試料を同時に接触させ、次に試料中の抗フィブリン抗体および抗赤血球抗体を同時に分離することにより赤血球を分離するステップを含む。本明細書において使用される「分離する」という語句は、抗フィブリン抗体が物理的または化学的なやり方を用いて血液試料から直接または間接的に分離されるまたは除去されることを意味する。たとえば、フィブリン結合受容体に対する抗体がフィブリン結合受容体を分離するための手段として直接使用されることができる、または別の方法が使用されることができる。
【００１８】
支持体および前記支持体を含む分離装置
別の実施形態では、方法はフィブリンに結合することができる受容体を備える支持体を提供するステップと、支持体通って全血試料を通過させるステップとを含む。さらに、本発明はまた、フィブリンに結合することができる受容体を備える支持体を含む、全血試料から赤血球を分離する装置に関する。支持体は、「クロマトグラフィ支持体」または非吸収性材料とも呼ばれる吸水材料から構成されるまたはそれからなることがある。
【００１９】
非吸収性材料は、プラスチック、ガラス、セラミック、および別の金属材料を含むがそれらに限定されない。たとえば、フィブリンに結合することができる受容体、たとえば抗体がまずプラスチック表面上に固定されることができ、プラスチック表面上の受容体と全血試料を接触させ、次に、血液試料中のフィブリンが、プラスチック表面上に固定された受容体により捕獲され、したがって、血液試料から分離され、その結果、赤血球も血液試料から分離される。好ましい実施形態では、そのような非吸収性材料が提供され、赤血球に対する抗体およびフィブリンに対する抗体が両方とも材料に固定され、次に、全血試料が非吸収性材料の表面を通過することができるようにされる。
【００２０】
一方、支持体は「クロマトグラフィ支持体」でもよく、この場合、「クロマトグラフィ支持体」は、任意の適切な多孔質材料および吸収材料、または毛管材料を指す。これらの材料は、本質的に流体が毛管現象により流れることができる吸収性とすべきである。これらの材料はたとえばろ紙、ガラスセルロース、ポリエステル膜、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、酢酸セルロース、天然材料（たとえば綿）織物、および合成材料（ナイロン）織物、多孔質ゲルなどとすることができる。流体の流れを支える支持体を使用する好ましい実施形態では、フィブリン結合受容体は、流体の流れのために血液試料により運び去られることができないように支持体上に処理される。全血試料が支持体に適用されるとき、血液試料中のフィブリン分子が受容体に結合され、支持体上に集められ、したがって、血液試料の連続する流れのために血液試料から分離される。さらに別の好ましい実施形態では、支持体はまた赤血球に結合することができる１つまたはいくつかの受容体を備えることがある。これらの受容体は全血試料中の赤血球を集めることができる。赤血球結合受容体がフィブリン結合受容体の上流に配置されることがある、またはフィブリン結合受容体の位置と同じ位置に、または別の位置に配置されることができる。前記支持体上に前記受容体を処理する方法は当分野の知られている事柄である。さらに、流体試料がこれらの材料の間を通ることができるように、多数の層が流体の流れの中で互いに接触する限り、支持体は単一材料、または２つ以上の材料から作られる（たとえば、異なる部分、領域、または層が異なる材料から作られる）ことができることが当業者により理解されよう。流体試料を受け取った後、これらの支持体は異なったやり方で、たとえば図１に示されるように垂直に、図２に示されるように水平に、または任意の別のやり方で、試料が支持体を通過することができるようにすることができる。
【００２１】
全血試料中のフィブリンを分離することによって試料中の赤血球を分離するまたは除去することができる理由は以下のような場合がある。フィブリン結合受容体、たとえば抗フィブリン抗体はフィブリン分子に結合することによりフィブリン分子を集め、それによりフィブリン分子が互いに架橋結合し、試料中の赤血球を捕獲することができる繊維網を形成することがある。したがって、試料中のフィブリン結合受容体が分離された場合、試料中の赤血球は間接的に分離される。別の好ましい実施形態では、赤血球に結合することができる受容体、たとえば赤血球表面抗原に対する抗体も存在する場合、そのような赤血球結合受容体は個々の赤血球を集めて「赤血球凝集」を形成することができ、フィブリン結合受容体およびフィブリン分子により形成された前記繊維網が、存在すれば、赤血球が血液試料の流れにより容易に運び去られることができないように、これらの「赤血球凝集」を容易に捕獲することができる。その結果、血液試料中の赤血球はより容易に分離されることができる。具体的な好ましい実施形態では、フィブリンに結合することができる受容体は、クロマトグラフィ支持体上に処理され固定されるポリクローナル抗体である。さらに、前記クロマトグラフィ支持体はまた、赤血球表面抗原に対するポリクローナル抗体を備え、そのポリクローナル抗体が固定されている。全血試料がクロマトグラフィ支持体に適用されるとき、支持体上に備えられた抗赤血球抗体が試料中の赤血球に結合する、またはそれを捕獲して、「赤血球凝集」を形成し、支持体上に備えられた抗フィブリン抗体は試料中のフィブリンに結合する、またはそれを捕獲して、フィブリン分子網を形成する。これらのフィブリン分子網は個々の赤血球の容積よりも大きな容積を有する「赤血球凝集」を容易に捕捉することができ、したがって、赤血球がより効果的に連続して流れるのを遅らせ、血液試料から赤血球をより効果的に分離する。支持体上に備えられたフィブリン結合受容体を分離することにより赤血球を分離する方法は、支持体上に受容体を直接固定することにより、またはフィブリンを分離する別の間接的手段により達成されることができる。たとえば、抗フィブリン抗体に対する抗体（抗フィブリン抗体に対する第２の抗体と呼ばれる）が支持体上に固定され、まず全血試料と抗フィブリン抗体を混合し反応させ、次に、混合溶液を抗フィブリン抗体に対する第２の抗体を備える支持体に適用する。前記第２の抗体は前記抗フィブリン抗体を捕獲し、それによりフィブリンを間接的に捕獲する。同様に、抗赤血球抗体に対する抗体（抗赤血球抗体に対する第２の抗体と呼ばれる）が、血液試料中の赤血球を間接的に捕獲するために支持体に固定される。好ましい実施形態では、抗フィブリン抗体および抗赤血球抗体は支持体上に直接処理される。
【００２２】
検出装置
本発明の別の様態は、全血試料中のアナライトを検出するための検出装置に関する。装置は、試料受入領域と、試料受入領域の下流に配置される検出領域とを含む支持体を含み、検出領域の上流の支持体は血液試料中のフィブリンと結合することができる受容体を備える。好ましくは、支持体はクロマトグラフィ支持体であり、試料受入領域は血液試料中のフィブリンに結合することができる受容体を備える。本発明の目的は、水平の流れシステム、垂直の流れシステム、およびテストバーを含むがそれらに限定されない任意の検出システム、好ましくはクロマトグラフィ免疫学的分析システムを使用して達成されることができる。一部の知られている検出システムの説明が以下に示される。
【００２３】
一般に、クロマトグラフィ試薬テストストリップ上には、少なくとも１つの試料受入領域および１つの検出領域があり、検出領域は、アナライトが試料中に存在するか、または試料中のアナライトの含有量が決定されることができる、ある種の特異的結合分子または化学物質を含む。特異的結合分子は抗体または抗体断片とすることができる。結合分子はアナライトに直接または間接的に結合することができる、またはアナライトが関与する部分に結合することができる。その部分はアナライト自体の免疫学的エピトープ、またはアナライトに結合した試薬（たとえば、試薬が標識保持領域を通過したときにアナライトに結合した試薬）の免疫学的エピトープとすることができる。検出されるべき流体試料が試料受入領域に適用されると、流体試料は毛管現象によりクロマトグラフィ支持体に沿って移動し、したがって検出領域内で発生する結合反応（たとえば免疫学的反応）により、あらかじめクロマトグラフィ支持体上に処理され配置された標識物質（標識された、標識を使って共役した）の蓄積が可能となり、流体試料と一緒に運び去られ、流れることができる。蓄積動作は、試料中のアナライトの存在または含有量に直接比例する（たとえば二抗体サンドイッチ）または反比例し（競合的方法）、標識物質の存在または含有量を測定することにより、試料中のアナライトの存在または含有量が間接的に決定されることができる。当然、検出領域内で行われる反応はまた、純粋な化学的性質を有する物質間の呈色反応、たとえば酸化−還元反応などとすることができ、次に、試料中のアナライトの存在または含有量が、検出領域内で示される色の強度を測定することにより決定されることができる。この原理を適用する知られている検出装置が血糖試薬テストストリップなど、たとえば米国特許第６、８１８、１８０号明細書に記載されているものを含む。具体的な実施形態では、試料受入領域は標識物質が配置される場所と同じ位置に配置されるが、標識物質の上流に配置されることが好ましい（毛管現象により引き起こされる試料の移動の方向が「下流」と呼ばれ、反対方向が「上流」と呼ばれる）。流体試料（対象となるアナライトを含むと思われる）を試料受入領域と接触させると、毛管現象により、流体試料はクロマトグラフィ支持体に沿ってアナライトと一緒に下流に流れる。前記アナライトは一般に、特定のやり方で検出領域上に処理され固定される検出分子に結合することができる化合物である。たとえば、アナライトが抗原であり、標識物質が抗原に対する抗体であり、検出領域上に固定された検出分子が抗原に対する別の抗体である。上記原理を適用することにより血液試料中のアナライトの存在を検出するための装置および方法は、既に先行技術であり、本発明の中心ではない。しかしながら本発明は血清および血漿を含む任意の血液試料で使用されることが意図されるが、赤血球を含む血液試料、たとえば全血試料で使用されることが好ましい。
【００２４】
本明細書において使用される標識物質は、標識を使って提供されるまたは共役される物質、たとえば抗体または抗原である。「標識」は検出可能な信号を提供する任意の適切な標識とすることができる。たとえば、標識はゾル粒子、蛍光分子、化学発光分子、金属または合金（たとえばコロイド金）、あるいは嚢、具体的には可視色素を含むリポソームとすることができる。また、有用なのが、疎水性有機染料または色素が水に溶解しない、または非常に限定された程度しか溶解しない疎水性ゾルである。標識はまた重合体粒子、たとえば着色ポリスチレン粒子（たとえば球形の）、または着色粒子（たとえばデキストランビーズ）とすることができる。別の有用な具体的な標識はフェリチン、フィコエリトリンまたは別のフィコビリタンパク質、沈降したまたは溶解しない金属または合金、真菌の、藻類のまたは細菌の色素または誘導体たとえば細菌のクロロフィル、あるいは別の植物性材料を含む。ある実施形態では、検出領域の上流に配置される標識物質が、対象となるアナライトに（直接または間接的に）結合することができ、それにより、対象となるアナライトが支持体を通って流れるとき、検出できる標識を使って対象となるアナライトを標識する。
【００２５】
様々な実施形態では、アナライトに結合した試薬は、抗体、抗体の断片または一部、アナライト結合領域に付けられた抗体と異なる種から得られた抗体（または抗体の断片）、あるいは特異的結合対の別の要素、たとえばそれ自体アナライトに結合した部分に結合されることができるアビジン、ストレプトアビジン、またはビオチンとすることができる。本明細書において使用される「抗体」は、自然のものにせよ、あるいは部分的にまたは全体的に合成して生成されるにせよ、免疫グロブリンを指す。用語はまた、特異的結合能力を保持する抗体の誘導体を含む。用語はまた、免疫グロブリン結合ドメインと類似している、または大部分は類似している結合ドメインを有する任意のタンパク質を包含する。これらのタンパク質は天然源から得られる、あるいは部分的にまたは全体的に合成で生成されることがある。抗体がモノクローナルでもポリクローナルでもよい。抗体は、ヒトクラス、すなわちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、およびＩｇＥのどれでも含む任意の免疫グロブリンクラスのメンバでもよい。「抗体断片」は、任意の誘導体、または完全長よりも短い抗体の一部である。抗体断片は完全長抗体の特異的結合能力の少なくともかなりの部分を保持することができる。抗体断片の例が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、およびＦｄ断片を含むがそれらに限定されない。
【００２６】
抗体断片は任意の手段で生成されることがある。たとえば、抗体断片は酵素によりまたは化学的に完全な抗体の断片化により生成されることがある、または抗体断片は部分的抗体配列をコード化する遺伝子から組換えで生成されることがある。あるいは、抗体断片は全体的にまたは部分的に合成により生成されることがある。抗体断片は任意選択で一本鎖抗体断片でもよい。あるいは、断片はたとえばジスルフィド結合により一緒に連結される多数鎖を含むことがある。断片はまた任意選択で多分子性複合体でもよい。機能的抗体断片が典型的には少なくとも約５０のアミノ酸を含み、より典型的には少なくとも約２００のアミノ酸を含む。
【００２７】
血液試料中の対象となるアナライトを検出する前に、検出が所望の感度で働くべき場合、試料中の赤血球が除去されることが好ましい。したがって、本発明によれば、血液試料中のフィブリンに結合することができる受容体がクロマトグラフィ支持体上に、好ましくは支持体の試料受入領域内で処理される。フィブリン結合受容体がクロマトグラフィ支持体の試料受入領域内に処理されることが好ましい理由は、血液試料が試料受入領域の上に適用されると、そのような構成が、赤血球が血液試料から効果的に除去されることができるようにすることである。そのような構成が支持体に沿って血漿または血清の連続する流れに対する赤血球の妨害を除去する、または少なくとも最小まで低減し、それにより流れが影響されないようにするためである。一方、そのような構成はバックグラウンド妨害を低減する。たとえば、図２は本発明の好ましい具体的な実施形態を説明する。検出装置３０では、試料受入領域３５がガラス繊維でできている。検出領域３６はニトロセルロース膜からできており、試料受入領域の下流に配置される。標識保持領域３４は試料受入領域３５と検出領域３６の間に配置される。検出領域は、特異的結合分子を備えるテストライン３３と、検出を確認するための対照として使用されるコントロールライン３２とを含む。試料受入領域内のガラス繊維は、ポリクローナル抗フィブリン抗体およびポリクローナル抗赤血球抗体を使って処理される。試料受入領域３５、標識保持領域３４、および検出領域３６はどれも、流体がさらなる反応のために試料受入領域３５から検出領域３６に流れるように接続される。
【００２８】
図１は本発明の別の好ましい具体的な実施形態を描く。検出装置１０は、試料受入および試料が通過するためのフィルタリング層１１と、反応層１２とを含む。反応層は還元反応のための基質、およびハンドル１３を備える。フィルタリング層はポリクローナル抗フィブリン抗体およびポリクローナル抗赤血球抗体を備える。全血試料０１を試料受入層１１の上に適用した後、フィルタリング層１１に付着した抗フィブリン抗体および抗赤血球抗体は調和したやり方で働いて、試料中の赤血球を捕獲し、それにより赤血球をフィルタリング層上に保持し、血漿が反応層１２まで通過することができるようにする。アナライトたとえば血糖が試料中に提示された場合、反応層１２の底面で色の変化が直接観測されることができる。全血試料から赤血球を除去することに関する、本発明に記載される方法の適用は、上記の具体的な実施形態に限定されるべきではない。方法は任意の別の検出システムで使用されることができる。たとえば、方法は米国特許第６８１８１８０号明細書の図１に記載される検出装置で使用されることができる。具体的には、方法は穴２１を通して適用される全血試料を分離するために、多孔質膜１の表面層５に適用されることができる。本発明の方法または装置は赤血球を分離するための先行技術の任意の他の方法、構造、および試薬と組み合わせて使用されることができることが当業者に理解されよう。たとえば、方法は米国特許第６８１８１８０号明細書に記載される構造および試薬と組み合わせられることができる。
【００２９】
検出方法
本発明の別の様態は全血試料中のアナライトを検出する方法に関する。方法は前記クロマトグラフィ支持体装置に適用されることが好ましい。具体的には、方法は、血液試料中のフィブリンに結合することができる受容体を備える試料受入領域を含むクロマトグラフィ支持体を提供するステップと、試料受入領域を通って血液試料を通過させるステップと、次にアナライトが血液試料中に存在するかどうかを検出するステップとを含む。試料受入領域は赤血球に結合することができる受容体を備えることが好ましい。試料受入領域の下流は特異的結合分子が固定される検出領域を含み、試料受入領域を通過した試料が検出領域を通過することができるようにすることが好ましい。
【００３０】
以下の実施例は本発明をさらに例示するが、いずれの場合も本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【００３１】
実施例１：ＣＴＩ（心臓トロポニンＩ）検出における抗フィブリン抗体による血液試料からの赤血球分離の適用
本実験で使用されたポリクローナル抗フィブリン抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ１１１３５７９６Ｊ１６２）は、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓａｎｂｏｙｕａｎｚｈｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．社（Ｄｏｎｇｂｅｉｗａｎｇ Ｓｏｕｔｈ Ｒｄ．、Ｎｏ．２６、Ｈａｉｄｉａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ、Ｂｅｉｊｉｎｇ）から得られた。モノクローナル抗赤血球抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＥ０６０８２２−１−０４１９）およびポリクローナル抗赤血球抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｑ０５９２０−１１１３）が、Ｃｅｎｃｌｏｎｎ Ｃｏｍｐａｎｙ社（Ｇｕｄａｎｇ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｐａｒｋ、Ｎｏ．１９８、Ｔｉａｎｍｕｓｈａｎ Ｒｄ、Ｈａｎｇｚｈｏｕ、Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ）から得られた。別に言及のある部分を除いて、本実験で使用されたＣＴＩ検出試薬テストストリップは、先行技術で知られている方法により準備された。試薬テストストリップの準備および組立てが図２を参照して本明細書においてさらに説明される。
【００３２】
１．試料受入パッド３５の構成および準備
試料受入パッド３５はガラス繊維からできている。そのようなガラス繊維パッドはまずトリス緩衝液（Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）を使って処理された。その後、ガラス繊維パッドは以下の説明に従って異なる処理を受けた。
【００３３】
１）ポリクローナル抗フィブリン抗体だけを使って処理されたガラス繊維パッド（総計１００のガラス繊維パッド、各処理で２０）：１００のガラス繊維パッドは５グループに均等に分割された。異なる希釈率、すなわち１：５０、１：１００、１：２００、１：３００、および１：４００で準備されたポリクローナル抗フィブリン抗体が５グループのガラス繊維パッドのそれぞれを処理するために使用され、それにより別々に希釈された抗フィブリン抗体をそれぞれ付着させた５グループのガラス繊維パッドを得た。すなわち、処理Ａ（１：５０）、処理Ｂ（１：１００）、処理Ｃ（１：２００）、処理Ｄ（１：３００）、および処理Ｅ（１：４００）であった。
【００３４】
２）抗赤血球ポリクローナル抗体とポリクローナル抗フィブリン抗体の両方を使って処理されたガラス繊維パッド（総計５０のガラス繊維パッド、各グループに１０）：処理Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥのそれぞれが均等に２つのサブグループにさらに分割された。したがって各サブグループは１０のガラス繊維パッドを含んでいた。各処理（すなわち、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥ）においてこれらの２つのサブグループの１つがポリクローナル抗赤血球抗体（１：１０に希釈）を使ってさらに処理され、それにより２種類の抗体をそれぞれ付着した５つの新しいグループのガラス繊維パッド（各グループに１０のガラス繊維パッド）を得た。５つの新しいグループは、処理Ｇ＝１：５０（抗フィブリン）＋１：１０（抗ＲＢＣ）、処理Ｈ＝１：１００（抗フィブリン）＋１：１０（抗ＲＢＣ）、処理Ｉ＝１：２００（抗フィブリン）＋１：１０（抗ＲＢＣ）、処理Ｊ＝１：３００（抗フィブリン）＋１：１０（抗ＲＢＣ）、処理Ｋ＝１：４００（抗フィブリン）＋１：１０（抗ＲＢＣ）と命名された。
【００３５】
３）ポリクローナル抗赤血球抗体（１：１０に希釈）だけを使って処理されたガラス繊維パッド：１０の処理されていないガラス繊維パッド（トリス緩衝液だけを使った）からなる別のグループが選択され、ポリクローナル抗赤血球抗体（１：１０に希釈）を使って処理され、それにより処理Ｆ（１０のガラス繊維パッド）と命名された新しいグループを得た。
【００３６】
次に、処理されたガラス繊維パッドすべてが乾燥器で３７℃で乾燥させられ、さらに使用するために保存された。
【００３７】
２．標識保持パッド３４の準備
ウサギのモノクローナル抗ヒトＣＴＩ抗体、およびマウスのポリクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体が、平均粒子径約２０〜４０ｎｍを有する一般的なコロイド金溶液により共役され、次に装置によりポリエステル膜の上に一様に噴霧された。膜は乾燥器内で３７℃でさらに乾燥させられ、さらに使用するために保存された。
【００３８】
３．ニトロセルロース膜３６の準備
マイクロプロセッサ制御の微量注入器を使用することにより、第１のポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（１．３ｍｇ／ｍｌ）が、コントロールライン（Ｃライン）３２（テスト確認のため）としてニトロセルロース膜の上に分注および配置され、次にマウス抗ヒトＣＴＩモノクローナル抗体（４．０ｍｇ／ｍｌ）が、テストライン（Ｔライン）３３（アナライト結合のため）としてニトロセルロース膜の上に分注および配置された。両方の抗体が１．１μｌ／ｃｍの速度で分注された。完了と同時に、付着した抗体が膜上に固定されるように、被覆されたニトロセルロース膜が直ちに４５℃で（２時間）乾燥させられた。
【００３９】
４．試薬テストストリップの組立て
ＣＴＩ検出試薬テストストリップが図２に示されるような概略図に従って組み立てられた。試料受入パッド３５（前述の処理されたガラス繊維パッドの１つ）が標識保持パッド３４を重ねて配置され、次に標識保持パッド３４が、標識保持パッド３４のもう一方の末端（試料受入パッドから離れた末端）にニトロセルロース膜３６を重ね、その後、ニトロセルロース膜３６が、テストストリップの遠位の末端に配置された吸収ろ紙３１により重ねられ、それにより図２に示されるような試薬テストストリップを形成した。
【００４０】
５．血液試料の準備
２０の全血試料（８日以上の間収集され、２〜８℃で保存された）がさらに使用するために準備された。
【００４１】
６．テスト手順
１００μｌの全血試料が試薬テストストリップの試料受入パッドの上に滴下され、Ｃラインが試薬テストストリップ上に出現する時間が記録された。Ｃラインが出現する時間は、血液試料液体の流速を示した。Ｃラインは試料導入の５分以内に出現しなければならず、試料は、試料導入の１０分以内に吸収ろ紙３１に到達するためにニトロセルロース膜３６を通って進まなければならなかった。それ以外の場合は、試薬テストストリップは不適当であると考えられた。
【００４２】
処理ＦおよびＪがそれぞれ試薬テストストリップの感度および特異性を決定するために使用された。標本中のＣＴＩ濃度が０．５ｎｇ／ｍｌになるように操作されることができるように、陽性標本がＣＴＩ陰性（実験で確認された）全血試料から準備され、陽性標本のテスト結果が記録された。特異性を決定するために、２０の標準ＣＴＩ陰性（実験で確認された）全血試料がテストにおける陰性標本として使用された。赤いバックグラウンドを示したこれらのストリップはまた不適当であると考えられた。
【００４３】
７．結果
【表１】
注：Ｃラインが出現する時間が５分を超えたため、または試料が１０分以内にニトロセルロース膜を通って進まなかったために、テストされた試薬テストストリップが不適当であると考えられた場合、結果に下線を引いた。
【００４４】
【表２】
【００４５】
【表３】
注：感度を検証するためにＣＴＩ陽性標本が使用された。「＋」は陽性のテスト結果が得られたことを示す。
【００４６】
【表４】
注：特異性をテストするためにＣＴＩ陰性全血試料が使用された。「−」は陰性の結果が得られたことを示す。
【００４７】
８．結論
上記結果は、抗フィブリン抗体が血液試料から赤血球を分離することができ、それにより、凝固した血液試料がクロマトグラフィ支持体を遮る確率を著しく低減し、血液分離の効率を非常に高めることを示唆する。一方、抗フィブリン抗体は検出自体に不利な影響を全く及ぼさないことは明らかである。さらに、抗フィブリン抗体が抗赤血球抗体と組み合わせて使用される場合、血液分離に対する抗フィブリン抗体の有利な効果はより明白となる。
【００４８】
実施例２．ＰＳＡ（前立腺特異抗原）検出における抗フィブリン抗体による血液試料からの赤血球分離の適用
この実験で使用された抗体は実験１で使用されたのと同じであった。実験１と比較して、実施例２で使用された試薬テストストリップの構成は、目的のアナライトが異なり、したがって、ストリップの試料受入パッドの処理が異なることを除いて、実験１で使用されたストリップの構成と似ていた。本実験で使用された試薬テストストリップの準備および組立ては、本明細書においてこの場合も図２を参照して説明される。
【００４９】
１．試料受入パッド３５の構成および準備
試料受入パッド３５はガラス繊維からできていた。そのようなガラス繊維パッドはまずトリス緩衝液で処理された。その後、ガラス繊維パッドは以下の異なる処理を受けた。
【００５０】
１）処理１（ポリクローナル抗フィブリン抗体とポリクローナル抗赤血球抗体の両方で処理されたガラス繊維パッド）：ガラス繊維パッドが、希釈されたポリクローナル抗フィブリン抗体（１：３００に希釈）、および希釈されたポリクローナル抗赤血球抗体（１：１０に希釈）で処理された。
【００５１】
２）処理２（ポリクローナル抗赤血球抗体で処理されたガラス繊維パッド）：ガラス繊維パッドが、希釈されたポリクローナル抗赤血球抗体（１：１０に希釈）で処理された。
【００５２】
３）対照処理ＣＫ（モノクローナル抗赤血球抗体で処理されたガラス繊維パッド）：ガラス繊維パッドが、希釈されたモノクローナル抗赤血球抗体（１：７５に希釈）で処理された。
【００５３】
次に、処理されたガラス繊維パッドはどれも乾燥器内で３７℃で乾燥させられ、さらに使用するために保存された。
【００５４】
２．標識保持パッド３４の準備
ウサギのモノクローナル抗ヒトＰＳＡ抗体、およびマウスのポリクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体が平均粒子径約２０〜４０ｎｍを有する一般的なコロイド金溶液により共役され、次に装置によりポリエステル膜の上に一様に噴霧された。膜は乾燥器内で３７℃でさらに乾燥させられ、さらに使用するために保存された。
【００５５】
３．ニトロセルロース膜３６の準備
マイクロプロセッサ制御の微量注入器を使用することにより、第１のポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ（１．３ｍｇ／ｍｌ）抗体が、コントロールライン（Ｃライン）３２（テスト確認のため）としてニトロセルロース膜の上に分注および配置され、次にモノクローナルマウス抗ヒトＰＳＡ抗体（４．０ｍｇ／ｍｌ）が、テストライン（Ｔライン）３３（アナライト結合のため）としてニトロセルロース膜の上に分注および配置された。両方の抗体が１．１μｌ／ｃｍの速度で分注された。完了と同時に、付着した抗体が膜上に固定されるように、被覆されたニトロセルロース膜が直ちに４５℃（２時間）で乾燥させられた。
【００５６】
４．試薬テストストリップの組立て
ＰＳＡ検出試薬テストストリップが図２に示されるような概略図に従って組み立てられた。試料受入パッド３５が標識保持パッド３４を重ねるように配置され、次に、標識保持パッド３４が、標識保持パッド３４のもう一方の末端（試料受入パッドから離れた末端）にニトロセルロース膜３６を重ね、最後にニトロセルロース膜３６が、テストストリップの遠位の末端に配置された吸収ろ紙３１により重ねられ、それにより図２に示されるような試薬テストストリップを形成した。
【００５７】
５．血液試料の準備
２０の全血試料（８日以上の間収集され、２〜８℃で保存された）がさらに使用するために準備された。
【００５８】
６．テスト手順
４０μｌの全血試料が、血液試料の移動を容易にするために使用された４０μｌの全血リン酸緩衝食塩水と一緒に試料受入パッド上に滴下された。Ｃラインが出現する時間が記録された。Ｃラインが出現する時間は血液試料液体の流速を示した。Ｃラインは試料導入の３分以内に出現しなければならず、試料は、試料導入の５分以内に吸収ろ紙３１に到達するためにニトロセルロース膜３６を通って進まなければならなかった。それ以外の場合は、試薬テストストリップは不適当であると考えられた。
【００５９】
生成物の感度および特異性を決定するために、それぞれ対照処理ＣＫおよび処理１が使用された。標本内のＰＳＡ濃度がそれぞれ２ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、および２０ｎｇ／ｍｌとなるように操作されることができるように、ＰＳＡ陰性（実験で確認された）全血試料から陽性標本が準備され、陽性標本のテスト結果が記録された。特異性を決定するために、２０の標準ＰＳＡ陰性（実験で確認された）全血試料がテストにおける陰性標本として使用された。
【００６０】
７．結果
【表５】
注：「−」は血液試料が３分以内にＣラインを通過することができなかったことを示す。「＊」は血液試料が５分以内にニトロセルロース膜を通って進むことができなかったことを示す。
【００６１】
【表６】
注：「−」は血液試料が３分以内にＣラインを通過することができなかったことを示す。
【００６２】
【表７】
注：ＰＳＡ陽性全血試料が使用された。「Ｇ＋数字」はＴライン／テストラインの色強度を示す（より大きな数字がより強い色を示す）。
【００６３】
【表８】
注：２種類の標本がこの実施例において使用された。標準ＰＳＡ陰性（実験で確認された）全血試料がテストされ、結果の１００％が、ＣＫグループでもＴ１グループでも陰性であった（テストラインの色強度はＧ１であった）。臨床的に収集された全血試料（実験でＰＳＡ陰性試料と確認されず、ＰＳＡを含む可能性があった）も使用され、すべての結果が、ＣＫグループでもＴ１グループでもすべて陰性（テストラインの色強度はＧ１であった）であることも明らかになった。
【００６４】
８．結論
上記の結果は、抗フィブリン抗体が血液試料から赤血球を分離することができ、それにより、凝固した血液試料がクロマトグラフィ支持体を遮る確率を著しく低減し、血液分離の効率を非常に高めることを示唆する。一方、抗フィブリン抗体は検出自体に不利な影響を全く及ぼさないことは明らかである。さらに、抗フィブリン抗体が抗赤血球抗体と組み合わせて使用される場合、血液分離に対する抗フィブリン抗体の有利な影響はより明白となる。
【００６５】
実施例３：加速安定度テスト
実験１による処理ＦおよびＪはまた、生成物の最大有効時間を決定する加速安定度テストを行うために使用された。
【００６６】
１．方法
処理ＦおよびＪによる生成物が温度５５℃で曝された。次に、この高温処理を受けた生成物が以下の表３−１に列挙されるデータスケジュールに従って感度および特異性のテストを行うために使用された。行われたテストのそれぞれについて各処理（処理Ｆおよび処理Ｊ）からそれぞれ１０の試料が使用された。各テストについて、１００μｌの全血試料が試料受入パッドの上に滴下され、その後Ｃラインが出現する時間が記録された。
【００６７】
【表９】
【００６８】
０日での結果：
【表１０】
注：実施例３では以後、「＋」は結果が陽性であったことを示す。「−」は結果が陰性であったことを示す。「＋」の前の数値は、結果として生じたテストラインの色強度を示す（すなわち、「３＋」の３は、結果として生じたテストラインの色強度がＧ３であったことを示す）。
【００６９】
【表１１】
【００７０】
【表１２】
【００７１】
【表１３】
【００７２】
【表１４】
【００７３】
【表１５】
【００７４】
【表１６】
【００７５】
【表１７】
２．結論
上記の結果から、試料受入パッドが抗フィブリン抗体を備えるとき、生成物の有効寿命が２年にもなり得ることは明白である。一方、血液試料がＣラインに到達する時間は低減される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は全血試料から赤血球を分離する方法および装置に関する。より詳細には、本発明は、全血試料からフィブリンを分離することにより赤血球を分離し、それにより検出に対する赤血球の妨害効果を低減する方法および装置を使う検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液試料に対して最新の臨床診断決定が日常的に行われている。不都合なことに、赤血球が多くの診断決定を妨げる。したがって、テストまたは分析が血液試料に対して行われることができる前に、赤血球がまず全血試料から除去されなければならない。一方、クロマトグラフィ分析装置では、具体的にはクロマトグラフィ免疫学的分析装置では、赤血球はこれらの装置で発生する反応のために必要な流体の流れを遅らせる可能性がある。これらの理由および別の理由から、全血試料からまず分離されなければならない血漿または血清に対して多くの分析方法論が実行される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第５９３９３３１号明細書
【特許文献２】米国特許第６６７３６２９号明細書
【特許文献３】米国特許第４５９４３２７号明細書
【特許文献４】米国特許第４６７８７５７号明細書
【特許文献５】米国特許第５５５８８３４号明細書
【特許文献６】米国特許第６８１８１８０号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２００６／００２９９２３号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第２００４／０２０２７８３号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
全血試料から赤血球を分離するための多くの知られている技法が存在する。従来型の方法が遠心分離機である。米国特許第５９３９３３１号明細書、第６６７３６２９号明細書、第４５９４３２７号明細書、第４６７８７５７号明細書、第５５５８８３４号明細書、および第６８１８１８０号明細書、ならびに米国特許出願公開第２００６／００２９９２３号明細書、および第２００４／０２０２７８３号明細書に開示されている方法もある。一般に、これらの方法は血漿から赤血球を分離するために物理的および化学的な処理を主に用い、これらの方法の大部分は費用がかかり複雑であり、赤血球の不完全な分離をもたらすことがある。さらに、既存の技法は、非常に長い間置かれたために凝固が発生した全血試料に適さない。具体的には、凝固した血液試料はクロマトグラフィ免疫学的分析装置で非特異的結合または高いバックグラウンドをもたらすことがあり、分析の感度を損なう結果となる。さらに、既存の技法はクロマトグラフィ支持体を遮り、支持体上での血漿または血清の流れを抑制することがあり、分析を無効にする。このことは具体的には非常に短期間で検出結果を与えることを求められる装置にとって致命的となり得る。したがって、試薬だけでなく、全血試料から赤血球を分離するための試薬を含むが、装置および方法が検出システムに悪影響を及ぼさない装置および方法を有する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記に言及される問題を解決するために、本発明は全血試料から赤血球を分離するための試薬、および試薬の適用を提供する。試薬を使用することにより、赤血球は全血試料から効果的に分離されることができる。
【０００６】
本発明の一様態は全血試料から赤血球を分離する方法に関する。具体的には、方法は、血液試料中のフィブリンに結合することができる受容体と全血試料を接触させるステップと、その後、血液試料からフィブリン結合受容体を除去するステップとを含む。方法はまた、赤血球に結合することができる受容体を含むことがある。方法は、フィブリン結合受容体だけ、またはフィブリン結合受容体と赤血球結合受容体の両方を備えた支持体を提供するステップと、その支持体を通って流れる血液試料を有するステップとをさらに含む。支持体はクロマトグラフィ支持体であることが好ましい。
【０００７】
本発明の別の様態は、血液試料中のフィブリンに結合することができる受容体を備えた支持体を含む、全血試料から赤血球を分離する装置に関する。支持体はまた、血液試料中の赤血球に結合することができる受容体を備えることがある。支持体はクロマトグラフィ支持体であることが好ましい。
【０００８】
本発明の別の様態は、試料受入領域、および試料受入領域の下流に配置される検出領域を有する支持体を含み、検出領域の上流の支持体が血液試料中のフィブリンに結合することができる受容体を備える、全血試料中のアナライトを検出するための検出装置に関する。試料受入領域はフィブリン結合受容体が固定化される領域でもよい。試料受入領域はまた、赤血球に結合することができる受容体を備えることがある。さらに、検出領域の上流の支持体は、血液試料の流れにより運び去られることができる標識物質をさらに含むことがあるが、検出領域は特異的結合分子を備えることがある。支持体はクロマトグラフィ支持体であることが好ましい。
【０００９】
本発明の別の様態は、全血試料中のアナライトを検出する方法に関し、方法は、フィブリンに結合することができる受容体を備える試料受入領域を含むクロマトグラフィ支持体を提供するステップと、試料受入領域を通る血液試料の流れを可能にするステップと、血液試料中のアナライトの含有量を測定するステップとを含む。支持体は赤血球に結合することができる受容体をさらに含むことがあり、アナライトを検出するために支持体の下流領域内に検出領域を含むことがある。
【００１０】
上記実施形態のすべてにおいて、フィブリンに結合することができる受容体が抗フィブリン抗体を含むが、赤血球に結合することができる受容体が抗赤血球抗体を含み、前記抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および抗体断片を含む。
【００１１】
本明細書において開示される本発明は多くの有利な点を提供する。本発明は、試料がどれだけ新鮮であっても、または既に凝固が発生しても、全血試料から赤血球を効果的に除去し、それにより血液試料の使用可能な寿命を延長する。さらに、血液試料から赤血球を分離するためまたは血液試料中のアナライトを検出するためにフィブリンに結合することができる受容体を用いる装置はまた、延長された使用可能な寿命を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の具体的な実施形態を描く。検出装置１０は、上で試料を受け入れ通過させるためのフィルタリング層１１と、反応層１２とを含む。反応層は還元反応のための基質、およびハンドル１３を備える。フィルタリング層はポリクローナル抗フィブリン抗体、およびポリクローナル抗赤血球抗体を備える。試料受入層１１上に全血試料０１を適用した後、層１１上に付着した抗フィブリン抗体および抗赤血球抗体は調和したやり方で赤血球を阻止するように働き、赤血球をフィルタリング層上に保持し、血漿が反応層１２まで通過することができるようにする。アナライトたとえば血糖が試料中に提示された場合、反応層１２の底面で色の変化が直接観察されることができる。
【図２】本発明の好ましい具体的な実施形態を描く。検出装置３０では、試料受入領域３５がガラス繊維からできている。検出領域３６がニトロセルロース膜からできており、試料受入領域の下流に位置する。標識保持領域３４が試料受入パッド３５と検出領域３６の間に位置する。検出領域は、アナライトに結合することができる特異的分子を備えるテストライン３３、および検出を確認するための対照として使用されるコントロールライン３２とを含む。試料受入領域内のガラス繊維はポリクローナル抗フィブリン抗体およびポリクローナル抗赤血球抗体を使って処理される。試料受入領域３５、標識保持領域３４、および検出領域３６はどれも、流体試料がさらなる反応のために試料受入領域３５から検出領域３６に流れるように、互いに接続される。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下は本発明に関係する構造の詳細な説明、および説明で使用される技術的語句の定義である。
【００１４】
検出
本明細書において使用されるように、「検出」は物質または材料、たとえば化学物質、有機化合物、無機化合物、代謝産物、薬物または薬物代謝産物、有機組織または有機組織の代謝産物、核酸、タンパク質、あるいは重合体だがそれらに限定されない存在のテストまたは分析を意味する。さらに、検出はまた物質または材料の含有量のテストまたは分析を意味する。さらに、本明細書において使用される分析は免疫分析、化学分析、酵素分析などを含む。
【００１５】
フィブリンおよびフィブリン結合受容体
フィブリノゲンは最も早くに発見された凝固因子である。フィブリノゲンは引き延ばされた楕円の形状を有し、ジスルフィド結合を介して互いに連結される２組の３つのポリペプチド（すなわち、１対のα鎖、１対のβ鎖、および１対のγ鎖）により形成される二量体であり、分子量３４０、０００ダルトンを有する。フィブリノゲンは肝臓内で合成され、その後血漿に入り、溶解した形態で存在する。１００ｍｌのヒト血漿当たり約０．３ｇのフィブリノゲンがある。しかしながら、フィブリンは非常に溶解しないタンパク質多量体であり、細い針の形状を有する結晶である。フィブリノゲンからフィブリンへの転換は血液凝固過程における基本的変化であり、血液凝固過程は３段階を経なければならない。すなわち、（１）フィブリノゲンの加水分解：フィブリノゲン分子の２つのα鎖および２つのβ鎖のそれぞれがトロンビンの影響下でペプチド結合を切断され、２対の小さなポリペプチドの解放（すなわち、総分子量約９０００ダルトンを有するフィブリノペプチドＡおよびフィブリノペプチドＢ）、およびフィブリン単量体の形成をもたらす。したがって、フィブリン単量体の分子量はフィブリノゲン分子の分子量よりも小さい。（２）フィブリン単量体の凝集：Ｃａ２＋の存在下で、多数のフィブリン単量体が凝集し、重合して、溶解性フィブリン重合体を形成する。（３）凝血塊の形成：トロンビン、第ＩＩＩａ因子、およびＣａ２＋の存在下で、フィブリン単量体のα鎖が互いに架橋結合して絡み合う繊維網を形成し、それによりフィブリン単量体を不溶性フィブリン重合体に変え、繊維網の中に赤血球を捕捉し、元のゾルのような血液をゲルのような血液凝固に転換する。
【００１６】
意外にも、フィブリンに結合することができる受容体を使って全血試料からフィブリンを除去することによって、血液試料中の赤血球を効果的に分離することができることがわかった。具体的には、フィブリン結合受容体が赤血球に結合することができる受容体と協調して使用されるとき、赤血球の分離はより効果的で完全になる。さらに、赤血球を除去するそのような技法は、血液試料がどれだけ新鮮であっても、または凝固がどれだけ起こっていてもうまく働く。
【００１７】
分離方法
一方、本発明は全血試料から赤血球を分離する方法に関する。具体的には、方法は血液中のフィブリンに結合することができる受容体と全血試料を接触させるステップと、その後血液試料からフィブリン結合受容体を除去するステップとを含む。具体的な実施形態では、抗フィブリン抗体が血液試料中のフィブリン単量体または重合体に結合するまたはそれらを捕獲するための受容体として使用され、この場合、抗フィブリン抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または抗体断片とすることができる。受容体はまた、フィブリンに結合することができる自然に合成されたまたは人工的に合成された別の受容体とすることができる。前記結合は「特異的」または「非特異的」とすることができ、受容体が血液試料中のフィブリンに結合するまたはそれを捕獲することができる限り、受容体はフィブリンに結合することができると考えられる。比較的簡単な一例は、全血試料を抗フィブリン抗体に接触させ、次に血液試料中の抗フィブリン抗体を分離することにより血液試料中の赤血球を分離するステップを含む。より好ましい実施形態は、まず抗赤血球抗体と全血試料を接触させるステップと、次に抗フィブリン抗体と血液試料を接触させるステップと、次に血液試料中の抗フィブリン抗体を分離することにより試料中の赤血球を分離するステップとを含む。さらに別の実施形態は、抗フィブリン抗体および抗赤血球抗体と全血試料を同時に接触させ、次に試料中の抗フィブリン抗体および抗赤血球抗体を同時に分離することにより赤血球を分離するステップを含む。本明細書において使用される「分離する」という語句は、抗フィブリン抗体が物理的または化学的なやり方を用いて血液試料から直接または間接的に分離されるまたは除去されることを意味する。たとえば、フィブリン結合受容体に対する抗体がフィブリン結合受容体を分離するための手段として直接使用されることができる、または別の方法が使用されることができる。
【００１８】
支持体および前記支持体を含む分離装置
別の実施形態では、方法はフィブリンに結合することができる受容体を備える支持体を提供するステップと、支持体通って全血試料を通過させるステップとを含む。さらに、本発明はまた、フィブリンに結合することができる受容体を備える支持体を含む、全血試料から赤血球を分離する装置に関する。支持体は、「クロマトグラフィ支持体」または非吸収性材料とも呼ばれる吸水材料から構成されるまたはそれからなることがある。
【００１９】
非吸収性材料は、プラスチック、ガラス、セラミック、および別の金属材料を含むがそれらに限定されない。たとえば、フィブリンに結合することができる受容体、たとえば抗体がまずプラスチック表面上に固定されることができ、プラスチック表面上の受容体と全血試料を接触させ、次に、血液試料中のフィブリンが、プラスチック表面上に固定された受容体により捕獲され、したがって、血液試料から分離され、その結果、赤血球も血液試料から分離される。好ましい実施形態では、そのような非吸収性材料が提供され、赤血球に対する抗体およびフィブリンに対する抗体が両方とも材料に固定され、次に、全血試料が非吸収性材料の表面を通過することができるようにされる。
【００２０】
一方、支持体は「クロマトグラフィ支持体」でもよく、この場合、「クロマトグラフィ支持体」は、任意の適切な多孔質材料および吸収材料、または毛管材料を指す。これらの材料は、本質的に流体が毛管現象により流れることができる吸収性とすべきである。これらの材料はたとえばろ紙、ガラスセルロース、ポリエステル膜、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、酢酸セルロース、天然材料（たとえば綿）織物、および合成材料（ナイロン）織物、多孔質ゲルなどとすることができる。流体の流れを支える支持体を使用する好ましい実施形態では、フィブリン結合受容体は、流体の流れのために血液試料により運び去られることができないように支持体上に処理される。全血試料が支持体に適用されるとき、血液試料中のフィブリン分子が受容体に結合され、支持体上に集められ、したがって、血液試料の連続する流れのために血液試料から分離される。さらに別の好ましい実施形態では、支持体はまた赤血球に結合することができる１つまたはいくつかの受容体を備えることがある。これらの受容体は全血試料中の赤血球を集めることができる。赤血球結合受容体がフィブリン結合受容体の上流に配置されることがある、またはフィブリン結合受容体の位置と同じ位置に、または別の位置に配置されることができる。前記支持体上に前記受容体を処理する方法は当分野の知られている事柄である。さらに、流体試料がこれらの材料の間を通ることができるように、多数の層が流体の流れの中で互いに接触する限り、支持体は単一材料、または２つ以上の材料から作られる（たとえば、異なる部分、領域、または層が異なる材料から作られる）ことができることが当業者により理解されよう。流体試料を受け取った後、これらの支持体は異なったやり方で、たとえば図１に示されるように垂直に、図２に示されるように水平に、または任意の別のやり方で、試料が支持体を通過することができるようにすることができる。
【００２１】
全血試料中のフィブリンを分離することによって試料中の赤血球を分離するまたは除去することができる理由は以下のような場合がある。フィブリン結合受容体、たとえば抗フィブリン抗体はフィブリン分子に結合することによりフィブリン分子を集め、それによりフィブリン分子が互いに架橋結合し、試料中の赤血球を捕獲することができる繊維網を形成することがある。したがって、試料中のフィブリン結合受容体が分離された場合、試料中の赤血球は間接的に分離される。別の好ましい実施形態では、赤血球に結合することができる受容体、たとえば赤血球表面抗原に対する抗体も存在する場合、そのような赤血球結合受容体は個々の赤血球を集めて「赤血球凝集」を形成することができ、フィブリン結合受容体およびフィブリン分子により形成された前記繊維網が、存在すれば、赤血球が血液試料の流れにより容易に運び去られることができないように、これらの「赤血球凝集」を容易に捕獲することができる。その結果、血液試料中の赤血球はより容易に分離されることができる。具体的な好ましい実施形態では、フィブリンに結合することができる受容体は、クロマトグラフィ支持体上に処理され固定されるポリクローナル抗体である。さらに、前記クロマトグラフィ支持体はまた、赤血球表面抗原に対するポリクローナル抗体を備え、そのポリクローナル抗体が固定されている。全血試料がクロマトグラフィ支持体に適用されるとき、支持体上に備えられた抗赤血球抗体が試料中の赤血球に結合する、またはそれを捕獲して、「赤血球凝集」を形成し、支持体上に備えられた抗フィブリン抗体は試料中のフィブリンに結合する、またはそれを捕獲して、フィブリン分子網を形成する。これらのフィブリン分子網は個々の赤血球の容積よりも大きな容積を有する「赤血球凝集」を容易に捕捉することができ、したがって、赤血球がより効果的に連続して流れるのを遅らせ、血液試料から赤血球をより効果的に分離する。支持体上に備えられたフィブリン結合受容体を分離することにより赤血球を分離する方法は、支持体上に受容体を直接固定することにより、またはフィブリンを分離する別の間接的手段により達成されることができる。たとえば、抗フィブリン抗体に対する抗体（抗フィブリン抗体に対する第２の抗体と呼ばれる）が支持体上に固定され、まず全血試料と抗フィブリン抗体を混合し反応させ、次に、混合溶液を抗フィブリン抗体に対する第２の抗体を備える支持体に適用する。前記第２の抗体は前記抗フィブリン抗体を捕獲し、それによりフィブリンを間接的に捕獲する。同様に、抗赤血球抗体に対する抗体（抗赤血球抗体に対する第２の抗体と呼ばれる）が、血液試料中の赤血球を間接的に捕獲するために支持体に固定される。好ましい実施形態では、抗フィブリン抗体および抗赤血球抗体は支持体上に直接処理される。
【００２２】
検出装置
本発明の別の様態は、全血試料中のアナライトを検出するための検出装置に関する。装置は、試料受入領域と、試料受入領域の下流に配置される検出領域とを含む支持体を含み、検出領域の上流の支持体は血液試料中のフィブリンと結合することができる受容体を備える。好ましくは、支持体はクロマトグラフィ支持体であり、試料受入領域は血液試料中のフィブリンに結合することができる受容体を備える。本発明の目的は、水平の流れシステム、垂直の流れシステム、およびテストバーを含むがそれらに限定されない任意の検出システム、好ましくはクロマトグラフィ免疫学的分析システムを使用して達成されることができる。一部の知られている検出システムの説明が以下に示される。
【００２３】
一般に、クロマトグラフィ試薬テストストリップ上には、少なくとも１つの試料受入領域および１つの検出領域があり、検出領域は、アナライトが試料中に存在するか、または試料中のアナライトの含有量が決定されることができる、ある種の特異的結合分子または化学物質を含む。特異的結合分子は抗体または抗体断片とすることができる。結合分子はアナライトに直接または間接的に結合することができる、またはアナライトが関与する部分に結合することができる。その部分はアナライト自体の免疫学的エピトープ、またはアナライトに結合した試薬（たとえば、試薬が標識保持領域を通過したときにアナライトに結合した試薬）の免疫学的エピトープとすることができる。検出されるべき流体試料が試料受入領域に適用されると、流体試料は毛管現象によりクロマトグラフィ支持体に沿って移動し、したがって検出領域内で発生する結合反応（たとえば免疫学的反応）により、あらかじめクロマトグラフィ支持体上に処理され配置された標識物質（標識された、標識を使って共役した）の蓄積が可能となり、流体試料と一緒に運び去られ、流れることができる。蓄積動作は、試料中のアナライトの存在または含有量に直接比例する（たとえば二抗体サンドイッチ）または反比例し（競合的方法）、標識物質の存在または含有量を測定することにより、試料中のアナライトの存在または含有量が間接的に決定されることができる。当然、検出領域内で行われる反応はまた、純粋な化学的性質を有する物質間の呈色反応、たとえば酸化−還元反応などとすることができ、次に、試料中のアナライトの存在または含有量が、検出領域内で示される色の強度を測定することにより決定されることができる。この原理を適用する知られている検出装置が血糖試薬テストストリップなど、たとえば米国特許第６、８１８、１８０号明細書に記載されているものを含む。具体的な実施形態では、試料受入領域は標識物質が配置される場所と同じ位置に配置されるが、標識物質の上流に配置されることが好ましい（毛管現象により引き起こされる試料の移動の方向が「下流」と呼ばれ、反対方向が「上流」と呼ばれる）。流体試料（対象となるアナライトを含むと思われる）を試料受入領域と接触させると、毛管現象により、流体試料はクロマトグラフィ支持体に沿ってアナライトと一緒に下流に流れる。前記アナライトは一般に、特定のやり方で検出領域上に処理され固定される検出分子に結合することができる化合物である。たとえば、アナライトが抗原であり、標識物質が抗原に対する抗体であり、検出領域上に固定された検出分子が抗原に対する別の抗体である。上記原理を適用することにより血液試料中のアナライトの存在を検出するための装置および方法は、既に先行技術であり、本発明の中心ではない。しかしながら本発明は血清および血漿を含む任意の血液試料で使用されることが意図されるが、赤血球を含む血液試料、たとえば全血試料で使用されることが好ましい。
【００２４】
本明細書において使用される標識物質は、標識を使って提供されるまたは共役される物質、たとえば抗体または抗原である。「標識」は検出可能な信号を提供する任意の適切な標識とすることができる。たとえば、標識はゾル粒子、蛍光分子、化学発光分子、金属または合金（たとえばコロイド金）、あるいは嚢、具体的には可視色素を含むリポソームとすることができる。また、有用なのが、疎水性有機染料または色素が水に溶解しない、または非常に限定された程度しか溶解しない疎水性ゾルである。標識はまた重合体粒子、たとえば着色ポリスチレン粒子（たとえば球形の）、または着色粒子（たとえばデキストランビーズ）とすることができる。別の有用な具体的な標識はフェリチン、フィコエリトリンまたは別のフィコビリタンパク質、沈降したまたは溶解しない金属または合金、真菌の、藻類のまたは細菌の色素または誘導体たとえば細菌のクロロフィル、あるいは別の植物性材料を含む。ある実施形態では、検出領域の上流に配置される標識物質が、対象となるアナライトに（直接または間接的に）結合することができ、それにより、対象となるアナライトが支持体を通って流れるとき、検出できる標識を使って対象となるアナライトを標識する。
【００２５】
様々な実施形態では、アナライトに結合した試薬は、抗体、抗体の断片または一部、アナライト結合領域に付けられた抗体と異なる種から得られた抗体（または抗体の断片）、あるいは特異的結合対の別の要素、たとえばそれ自体アナライトに結合した部分に結合されることができるアビジン、ストレプトアビジン、またはビオチンとすることができる。本明細書において使用される「抗体」は、自然のものにせよ、あるいは部分的にまたは全体的に合成して生成されるにせよ、免疫グロブリンを指す。用語はまた、特異的結合能力を保持する抗体の誘導体を含む。用語はまた、免疫グロブリン結合ドメインと類似している、または大部分は類似している結合ドメインを有する任意のタンパク質を包含する。これらのタンパク質は天然源から得られる、あるいは部分的にまたは全体的に合成で生成されることがある。抗体がモノクローナルでもポリクローナルでもよい。抗体は、ヒトクラス、すなわちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、およびＩｇＥのどれでも含む任意の免疫グロブリンクラスのメンバでもよい。「抗体断片」は、任意の誘導体、または完全長よりも短い抗体の一部である。抗体断片は完全長抗体の特異的結合能力の少なくともかなりの部分を保持することができる。抗体断片の例が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、およびＦｄ断片を含むがそれらに限定されない。
【００２６】
抗体断片は任意の手段で生成されることがある。たとえば、抗体断片は酵素によりまたは化学的に完全な抗体の断片化により生成されることがある、または抗体断片は部分的抗体配列をコード化する遺伝子から組換えで生成されることがある。あるいは、抗体断片は全体的にまたは部分的に合成により生成されることがある。抗体断片は任意選択で一本鎖抗体断片でもよい。あるいは、断片はたとえばジスルフィド結合により一緒に連結される多数鎖を含むことがある。断片はまた任意選択で多分子性複合体でもよい。機能的抗体断片が典型的には少なくとも約５０のアミノ酸を含み、より典型的には少なくとも約２００のアミノ酸を含む。
【００２７】
血液試料中の対象となるアナライトを検出する前に、検出が所望の感度で働くべき場合、試料中の赤血球が除去されることが好ましい。したがって、本発明によれば、血液試料中のフィブリンに結合することができる受容体がクロマトグラフィ支持体上に、好ましくは支持体の試料受入領域内で処理される。フィブリン結合受容体がクロマトグラフィ支持体の試料受入領域内に処理されることが好ましい理由は、血液試料が試料受入領域の上に適用されると、そのような構成が、赤血球が血液試料から効果的に除去されることができるようにすることである。そのような構成が支持体に沿って血漿または血清の連続する流れに対する赤血球の妨害を除去する、または少なくとも最小まで低減し、それにより流れが影響されないようにするためである。一方、そのような構成はバックグラウンド妨害を低減する。たとえば、図２は本発明の好ましい具体的な実施形態を説明する。検出装置３０では、試料受入領域３５がガラス繊維でできている。検出領域３６はニトロセルロース膜からできており、試料受入領域の下流に配置される。標識保持領域３４は試料受入領域３５と検出領域３６の間に配置される。検出領域は、特異的結合分子を備えるテストライン３３と、検出を確認するための対照として使用されるコントロールライン３２とを含む。試料受入領域内のガラス繊維は、ポリクローナル抗フィブリン抗体およびポリクローナル抗赤血球抗体を使って処理される。試料受入領域３５、標識保持領域３４、および検出領域３６はどれも、流体がさらなる反応のために試料受入領域３５から検出領域３６に流れるように接続される。
【００２８】
図１は本発明の別の好ましい具体的な実施形態を描く。検出装置１０は、試料受入および試料が通過するためのフィルタリング層１１と、反応層１２とを含む。反応層は還元反応のための基質、およびハンドル１３を備える。フィルタリング層はポリクローナル抗フィブリン抗体およびポリクローナル抗赤血球抗体を備える。全血試料０１を試料受入層１１の上に適用した後、フィルタリング層１１に付着した抗フィブリン抗体および抗赤血球抗体は調和したやり方で働いて、試料中の赤血球を捕獲し、それにより赤血球をフィルタリング層上に保持し、血漿が反応層１２まで通過することができるようにする。アナライトたとえば血糖が試料中に提示された場合、反応層１２の底面で色の変化が直接観測されることができる。全血試料から赤血球を除去することに関する、本発明に記載される方法の適用は、上記の具体的な実施形態に限定されるべきではない。方法は任意の別の検出システムで使用されることができる。たとえば、方法は米国特許第６８１８１８０号明細書の図１に記載される検出装置で使用されることができる。具体的には、方法は穴２１を通して適用される全血試料を分離するために、多孔質膜１の表面層５に適用されることができる。本発明の方法または装置は赤血球を分離するための先行技術の任意の他の方法、構造、および試薬と組み合わせて使用されることができることが当業者に理解されよう。たとえば、方法は米国特許第６８１８１８０号明細書に記載される構造および試薬と組み合わせられることができる。
【００２９】
検出方法
本発明の別の様態は全血試料中のアナライトを検出する方法に関する。方法は前記クロマトグラフィ支持体装置に適用されることが好ましい。具体的には、方法は、血液試料中のフィブリンに結合することができる受容体を備える試料受入領域を含むクロマトグラフィ支持体を提供するステップと、試料受入領域を通って血液試料を通過させるステップと、次にアナライトが血液試料中に存在するかどうかを検出するステップとを含む。試料受入領域は赤血球に結合することができる受容体を備えることが好ましい。試料受入領域の下流は特異的結合分子が固定される検出領域を含み、試料受入領域を通過した試料が検出領域を通過することができるようにすることが好ましい。
【００３０】
以下の実施例は本発明をさらに例示するが、いずれの場合も本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【００３１】
実施例１：ＣＴＩ（心臓トロポニンＩ）検出における抗フィブリン抗体による血液試料からの赤血球分離の適用
本実験で使用されたポリクローナル抗フィブリン抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ１１１３５７９６Ｊ１６２）は、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓａｎｂｏｙｕａｎｚｈｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．社（Ｄｏｎｇｂｅｉｗａｎｇ Ｓｏｕｔｈ Ｒｄ．、Ｎｏ．２６、Ｈａｉｄｉａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ、Ｂｅｉｊｉｎｇ）から得られた。モノクローナル抗赤血球抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＥ０６０８２２−１−０４１９）およびポリクローナル抗赤血球抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｑ０５９２０−１１１３）が、Ｃｅｎｃｌｏｎｎ Ｃｏｍｐａｎｙ社（Ｇｕｄａｎｇ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｐａｒｋ、Ｎｏ．１９８、Ｔｉａｎｍｕｓｈａｎ Ｒｄ、Ｈａｎｇｚｈｏｕ、Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ）から得られた。別に言及のある部分を除いて、本実験で使用されたＣＴＩ検出試薬テストストリップは、先行技術で知られている方法により準備された。試薬テストストリップの準備および組立てが図２を参照して本明細書においてさらに説明される。
【００３２】
１．試料受入パッド３５の構成および準備
試料受入パッド３５はガラス繊維からできている。そのようなガラス繊維パッドはまずトリス緩衝液（Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）を使って処理された。その後、ガラス繊維パッドは以下の説明に従って異なる処理を受けた。
【００３３】
１）ポリクローナル抗フィブリン抗体だけを使って処理されたガラス繊維パッド（総計１００のガラス繊維パッド、各処理で２０）：１００のガラス繊維パッドは５グループに均等に分割された。異なる希釈率、すなわち１：５０、１：１００、１：２００、１：３００、および１：４００で準備されたポリクローナル抗フィブリン抗体が５グループのガラス繊維パッドのそれぞれを処理するために使用され、それにより別々に希釈された抗フィブリン抗体をそれぞれ付着させた５グループのガラス繊維パッドを得た。すなわち、処理Ａ（１：５０）、処理Ｂ（１：１００）、処理Ｃ（１：２００）、処理Ｄ（１：３００）、および処理Ｅ（１：４００）であった。
【００３４】
２）抗赤血球ポリクローナル抗体とポリクローナル抗フィブリン抗体の両方を使って処理されたガラス繊維パッド（総計５０のガラス繊維パッド、各グループに１０）：処理Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥのそれぞれが均等に２つのサブグループにさらに分割された。したがって各サブグループは１０のガラス繊維パッドを含んでいた。各処理（すなわち、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥ）においてこれらの２つのサブグループの１つがポリクローナル抗赤血球抗体（１：１０に希釈）を使ってさらに処理され、それにより２種類の抗体をそれぞれ付着した５つの新しいグループのガラス繊維パッド（各グループに１０のガラス繊維パッド）を得た。５つの新しいグループは、処理Ｇ＝１：５０（抗フィブリン）＋１：１０（抗ＲＢＣ）、処理Ｈ＝１：１００（抗フィブリン）＋１：１０（抗ＲＢＣ）、処理Ｉ＝１：２００（抗フィブリン）＋１：１０（抗ＲＢＣ）、処理Ｊ＝１：３００（抗フィブリン）＋１：１０（抗ＲＢＣ）、処理Ｋ＝１：４００（抗フィブリン）＋１：１０（抗ＲＢＣ）と命名された。
【００３５】
３）ポリクローナル抗赤血球抗体（１：１０に希釈）だけを使って処理されたガラス繊維パッド：１０の処理されていないガラス繊維パッド（トリス緩衝液だけを使った）からなる別のグループが選択され、ポリクローナル抗赤血球抗体（１：１０に希釈）を使って処理され、それにより処理Ｆ（１０のガラス繊維パッド）と命名された新しいグループを得た。
【００３６】
次に、処理されたガラス繊維パッドすべてが乾燥器で３７℃で乾燥させられ、さらに使用するために保存された。
【００３７】
２．標識保持パッド３４の準備
ウサギのモノクローナル抗ヒトＣＴＩ抗体、およびマウスのポリクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体が、平均粒子径約２０〜４０ｎｍを有する一般的なコロイド金溶液により共役され、次に装置によりポリエステル膜の上に一様に噴霧された。膜は乾燥器内で３７℃でさらに乾燥させられ、さらに使用するために保存された。
【００３８】
３．ニトロセルロース膜３６の準備
マイクロプロセッサ制御の微量注入器を使用することにより、第１のポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（１．３ｍｇ／ｍｌ）が、コントロールライン（Ｃライン）３２（テスト確認のため）としてニトロセルロース膜の上に分注および配置され、次にマウス抗ヒトＣＴＩモノクローナル抗体（４．０ｍｇ／ｍｌ）が、テストライン（Ｔライン）３３（アナライト結合のため）としてニトロセルロース膜の上に分注および配置された。両方の抗体が１．１μｌ／ｃｍの速度で分注された。完了と同時に、付着した抗体が膜上に固定されるように、被覆されたニトロセルロース膜が直ちに４５℃で（２時間）乾燥させられた。
【００３９】
４．試薬テストストリップの組立て
ＣＴＩ検出試薬テストストリップが図２に示されるような概略図に従って組み立てられた。試料受入パッド３５（前述の処理されたガラス繊維パッドの１つ）が標識保持パッド３４を重ねて配置され、次に標識保持パッド３４が、標識保持パッド３４のもう一方の末端（試料受入パッドから離れた末端）にニトロセルロース膜３６を重ね、その後、ニトロセルロース膜３６が、テストストリップの遠位の末端に配置された吸収ろ紙３１により重ねられ、それにより図２に示されるような試薬テストストリップを形成した。
【００４０】
５．血液試料の準備
２０の全血試料（８日以上の間収集され、２〜８℃で保存された）がさらに使用するために準備された。
【００４１】
６．テスト手順
１００μｌの全血試料が試薬テストストリップの試料受入パッドの上に滴下され、Ｃラインが試薬テストストリップ上に出現する時間が記録された。Ｃラインが出現する時間は、血液試料液体の流速を示した。Ｃラインは試料導入の５分以内に出現しなければならず、試料は、試料導入の１０分以内に吸収ろ紙３１に到達するためにニトロセルロース膜３６を通って進まなければならなかった。それ以外の場合は、試薬テストストリップは不適当であると考えられた。
【００４２】
処理ＦおよびＪがそれぞれ試薬テストストリップの感度および特異性を決定するために使用された。標本中のＣＴＩ濃度が０．５ｎｇ／ｍｌになるように操作されることができるように、陽性標本がＣＴＩ陰性（実験で確認された）全血試料から準備され、陽性標本のテスト結果が記録された。特異性を決定するために、２０の標準ＣＴＩ陰性（実験で確認された）全血試料がテストにおける陰性標本として使用された。赤いバックグラウンドを示したこれらのストリップはまた不適当であると考えられた。
【００４３】
７．結果
【表１】
注：Ｃラインが出現する時間が５分を超えたため、または試料が１０分以内にニトロセルロース膜を通って進まなかったために、テストされた試薬テストストリップが不適当であると考えられた場合、結果に下線を引いた。
【００４４】
【表２】
【００４５】
【表３】
注：感度を検証するためにＣＴＩ陽性標本が使用された。「＋」は陽性のテスト結果が得られたことを示す。
【００４６】
【表４】
注：特異性をテストするためにＣＴＩ陰性全血試料が使用された。「−」は陰性の結果が得られたことを示す。
【００４７】
８．結論
上記結果は、抗フィブリン抗体が血液試料から赤血球を分離することができ、それにより、凝固した血液試料がクロマトグラフィ支持体を遮る確率を著しく低減し、血液分離の効率を非常に高めることを示唆する。一方、抗フィブリン抗体は検出自体に不利な影響を全く及ぼさないことは明らかである。さらに、抗フィブリン抗体が抗赤血球抗体と組み合わせて使用される場合、血液分離に対する抗フィブリン抗体の有利な効果はより明白となる。
【００４８】
実施例２．ＰＳＡ（前立腺特異抗原）検出における抗フィブリン抗体による血液試料からの赤血球分離の適用
この実験で使用された抗体は実験１で使用されたのと同じであった。実験１と比較して、実施例２で使用された試薬テストストリップの構成は、目的のアナライトが異なり、したがって、ストリップの試料受入パッドの処理が異なることを除いて、実験１で使用されたストリップの構成と似ていた。本実験で使用された試薬テストストリップの準備および組立ては、本明細書においてこの場合も図２を参照して説明される。
【００４９】
１．試料受入パッド３５の構成および準備
試料受入パッド３５はガラス繊維からできていた。そのようなガラス繊維パッドはまずトリス緩衝液で処理された。その後、ガラス繊維パッドは以下の異なる処理を受けた。
【００５０】
１）処理１（ポリクローナル抗フィブリン抗体とポリクローナル抗赤血球抗体の両方で処理されたガラス繊維パッド）：ガラス繊維パッドが、希釈されたポリクローナル抗フィブリン抗体（１：３００に希釈）、および希釈されたポリクローナル抗赤血球抗体（１：１０に希釈）で処理された。
【００５１】
２）処理２（ポリクローナル抗赤血球抗体で処理されたガラス繊維パッド）：ガラス繊維パッドが、希釈されたポリクローナル抗赤血球抗体（１：１０に希釈）で処理された。
【００５２】
３）対照処理ＣＫ（モノクローナル抗赤血球抗体で処理されたガラス繊維パッド）：ガラス繊維パッドが、希釈されたモノクローナル抗赤血球抗体（１：７５に希釈）で処理された。
【００５３】
次に、処理されたガラス繊維パッドはどれも乾燥器内で３７℃で乾燥させられ、さらに使用するために保存された。
【００５４】
２．標識保持パッド３４の準備
ウサギのモノクローナル抗ヒトＰＳＡ抗体、およびマウスのポリクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体が平均粒子径約２０〜４０ｎｍを有する一般的なコロイド金溶液により共役され、次に装置によりポリエステル膜の上に一様に噴霧された。膜は乾燥器内で３７℃でさらに乾燥させられ、さらに使用するために保存された。
【００５５】
３．ニトロセルロース膜３６の準備
マイクロプロセッサ制御の微量注入器を使用することにより、第１のポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ（１．３ｍｇ／ｍｌ）抗体が、コントロールライン（Ｃライン）３２（テスト確認のため）としてニトロセルロース膜の上に分注および配置され、次にモノクローナルマウス抗ヒトＰＳＡ抗体（４．０ｍｇ／ｍｌ）が、テストライン（Ｔライン）３３（アナライト結合のため）としてニトロセルロース膜の上に分注および配置された。両方の抗体が１．１μｌ／ｃｍの速度で分注された。完了と同時に、付着した抗体が膜上に固定されるように、被覆されたニトロセルロース膜が直ちに４５℃（２時間）で乾燥させられた。
【００５６】
４．試薬テストストリップの組立て
ＰＳＡ検出試薬テストストリップが図２に示されるような概略図に従って組み立てられた。試料受入パッド３５が標識保持パッド３４を重ねるように配置され、次に、標識保持パッド３４が、標識保持パッド３４のもう一方の末端（試料受入パッドから離れた末端）にニトロセルロース膜３６を重ね、最後にニトロセルロース膜３６が、テストストリップの遠位の末端に配置された吸収ろ紙３１により重ねられ、それにより図２に示されるような試薬テストストリップを形成した。
【００５７】
５．血液試料の準備
２０の全血試料（８日以上の間収集され、２〜８℃で保存された）がさらに使用するために準備された。
【００５８】
６．テスト手順
４０μｌの全血試料が、血液試料の移動を容易にするために使用された４０μｌの全血リン酸緩衝食塩水と一緒に試料受入パッド上に滴下された。Ｃラインが出現する時間が記録された。Ｃラインが出現する時間は血液試料液体の流速を示した。Ｃラインは試料導入の３分以内に出現しなければならず、試料は、試料導入の５分以内に吸収ろ紙３１に到達するためにニトロセルロース膜３６を通って進まなければならなかった。それ以外の場合は、試薬テストストリップは不適当であると考えられた。
【００５９】
生成物の感度および特異性を決定するために、それぞれ対照処理ＣＫおよび処理１が使用された。標本内のＰＳＡ濃度がそれぞれ２ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、および２０ｎｇ／ｍｌとなるように操作されることができるように、ＰＳＡ陰性（実験で確認された）全血試料から陽性標本が準備され、陽性標本のテスト結果が記録された。特異性を決定するために、２０の標準ＰＳＡ陰性（実験で確認された）全血試料がテストにおける陰性標本として使用された。
【００６０】
７．結果
【表５】
注：「−」は血液試料が３分以内にＣラインを通過することができなかったことを示す。「＊」は血液試料が５分以内にニトロセルロース膜を通って進むことができなかったことを示す。
【００６１】
【表６】
注：「−」は血液試料が３分以内にＣラインを通過することができなかったことを示す。
【００６２】
【表７】
注：ＰＳＡ陽性全血試料が使用された。「Ｇ＋数字」はＴライン／テストラインの色強度を示す（より大きな数字がより強い色を示す）。
【００６３】
【表８】
注：２種類の標本がこの実施例において使用された。標準ＰＳＡ陰性（実験で確認された）全血試料がテストされ、結果の１００％が、ＣＫグループでもＴ１グループでも陰性であった（テストラインの色強度はＧ１であった）。臨床的に収集された全血試料（実験でＰＳＡ陰性試料と確認されず、ＰＳＡを含む可能性があった）も使用され、すべての結果が、ＣＫグループでもＴ１グループでもすべて陰性（テストラインの色強度はＧ１であった）であることも明らかになった。
【００６４】
８．結論
上記の結果は、抗フィブリン抗体が血液試料から赤血球を分離することができ、それにより、凝固した血液試料がクロマトグラフィ支持体を遮る確率を著しく低減し、血液分離の効率を非常に高めることを示唆する。一方、抗フィブリン抗体は検出自体に不利な影響を全く及ぼさないことは明らかである。さらに、抗フィブリン抗体が抗赤血球抗体と組み合わせて使用される場合、血液分離に対する抗フィブリン抗体の有利な影響はより明白となる。
【００６５】
実施例３：加速安定度テスト
実験１による処理ＦおよびＪはまた、生成物の最大有効時間を決定する加速安定度テストを行うために使用された。
【００６６】
１．方法
処理ＦおよびＪによる生成物が温度５５℃で曝された。次に、この高温処理を受けた生成物が以下の表３−１に列挙されるデータスケジュールに従って感度および特異性のテストを行うために使用された。行われたテストのそれぞれについて各処理（処理Ｆおよび処理Ｊ）からそれぞれ１０の試料が使用された。各テストについて、１００μｌの全血試料が試料受入パッドの上に滴下され、その後Ｃラインが出現する時間が記録された。
【００６７】
【表９】
【００６８】
０日での結果：
【表１０】
注：実施例３では以後、「＋」は結果が陽性であったことを示す。「−」は結果が陰性であったことを示す。「＋」の前の数値は、結果として生じたテストラインの色強度を示す（すなわち、「３＋」の３は、結果として生じたテストラインの色強度がＧ３であったことを示す）。
【００６９】
【表１１】
【００７０】
【表１２】
【００７１】
【表１３】
【００７２】
【表１４】
【００７３】
【表１５】
【００７４】
【表１６】
【００７５】
【表１７】
２．結論
上記の結果から、試料受入パッドが抗フィブリン抗体を備えるとき、生成物の有効寿命が２年にもなり得ることは明白である。一方、血液試料がＣラインに到達する時間は低減される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液試料から赤血球を分離する方法であって、
ａ）血液試料中のフィブリンに結合することができる受容体と血液試料を接触させるステップと、
ｂ）その後、血液試料から前記フィブリン結合受容体を分離するステップとを含む、方法。
【請求項２】
血液試料中の赤血球に結合することができる受容体と血液試料を接触させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記フィブリン結合受容体および前記赤血球結合受容体が、支持体を通って流れる流体を支える支持体上に固定される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記受容体が、ａ）モノクローナル抗体、もしくはｂ）ポリクローナル抗体、もしくはｃ）ａ）またはｂ）の断片を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
血液試料から赤血球を分離する方法であって、血液試料中のフィブリンに結合することができる受容体を備えるクロマトグラフィ支持体を提供するステップと、クロマトグラフィ支持体を通る血液試料の流れを可能にするステップとを含む、方法。
【請求項６】
前記クロマトグラフィ支持体が、血液試料中の赤血球に結合することができる受容体をさらに備える、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記受容体が、ａ）モノクローナル抗体、もしくはｂ）ポリクローナル抗体、もしくはｃ）ａ）またはｂ）の断片を含む、請求項５から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
血液試料から赤血球を分離する装置であって、血液試料中のフィブリンに結合することができる受容体を備える支持体を含む装置。
【請求項９】
前記支持体が、血液試料中の赤血球に結合することができる受容体をさらに備える、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
前記支持体がクロマトグラフィ支持体である、請求項８から９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１１】
前記受容体が、ａ）モノクローナル抗体、もしくはｂ）ポリクローナル抗体、もしくはｃ）ａ）またはｂ）の断片を含む、請求項８から９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１２】
血液試料中のアナライトを検出するための検出装置であって、試料受入領域を有する支持体と、前記試料受入領域の下流に配置される検出領域とを含み、前記検出領域の上流の支持体が血液試料中のフィブリンに結合することができる受容体を備える検出装置。
【請求項１３】
前記支持体がクロマトグラフィ支持体である、請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
前記フィブリン結合受容体が試料受入領域内に配置される、請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
前記試料受入領域が、血液試料中の赤血球に結合することができる受容体をさらに備える、請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
前記受容体が、ａ）モノクローナル抗体、もしくはｂ）ポリクローナル抗体、もしくはｃ）ａ）またはｂ）の断片を含む、請求項１２から１５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１７】
前記試料受入領域の下流の支持体が、血液試料と一緒に運び去られ、流れることができる標識物質をさらに含む、請求項１４に記載の装置。
【請求項１８】
前記検出領域が特異的結合分子を備える、請求項１４に記載の装置。
【請求項１９】
血液試料中のアナライトを検出する方法であって、クロマトグラフィ支持体を提供するステップと、クロマトグラフィ支持体を通る血液試料の流れを可能にするステップと、血液試料中のアナライトの含有量を測定するステップとを含み、前記クロマトグラフィ支持体が、血液試料中のフィブリンに結合することができる受容体を備える方法。
【請求項２０】
前記支持体が、血液試料中の赤血球に結合することができる受容体をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記受容体が、ａ）モノクローナル抗体、もしくはｂ）ポリクローナル抗体、もしくはｃ）ａ）またはｂ）の断片を含む、請求項１９から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
血液試料中の前記アナライトを検出するための前記クロマトグラフィ支持体の下流領域に検出領域をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項１】
血液試料から赤血球を分離する方法であって、
ａ）血液試料中のフィブリンに結合することができる受容体と血液試料を接触させるステップと、
ｂ）その後、血液試料から前記フィブリン結合受容体を分離するステップとを含む、方法。
【請求項２】
血液試料中の赤血球に結合することができる受容体と血液試料を接触させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記フィブリン結合受容体および前記赤血球結合受容体が、支持体を通って流れる流体を支える支持体上に固定される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記受容体が、ａ）モノクローナル抗体、もしくはｂ）ポリクローナル抗体、もしくはｃ）ａ）またはｂ）の断片を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
血液試料から赤血球を分離する方法であって、血液試料中のフィブリンに結合することができる受容体を備えるクロマトグラフィ支持体を提供するステップと、クロマトグラフィ支持体を通る血液試料の流れを可能にするステップとを含む、方法。
【請求項６】
前記クロマトグラフィ支持体が、血液試料中の赤血球に結合することができる受容体をさらに備える、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記受容体が、ａ）モノクローナル抗体、もしくはｂ）ポリクローナル抗体、もしくはｃ）ａ）またはｂ）の断片を含む、請求項５から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
血液試料から赤血球を分離する装置であって、血液試料中のフィブリンに結合することができる受容体を備える支持体を含む装置。
【請求項９】
前記支持体が、血液試料中の赤血球に結合することができる受容体をさらに備える、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
前記支持体がクロマトグラフィ支持体である、請求項８から９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１１】
前記受容体が、ａ）モノクローナル抗体、もしくはｂ）ポリクローナル抗体、もしくはｃ）ａ）またはｂ）の断片を含む、請求項８から９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１２】
血液試料中のアナライトを検出するための検出装置であって、試料受入領域を有する支持体と、前記試料受入領域の下流に配置される検出領域とを含み、前記検出領域の上流の支持体が血液試料中のフィブリンに結合することができる受容体を備える検出装置。
【請求項１３】
前記支持体がクロマトグラフィ支持体である、請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
前記フィブリン結合受容体が試料受入領域内に配置される、請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
前記試料受入領域が、血液試料中の赤血球に結合することができる受容体をさらに備える、請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
前記受容体が、ａ）モノクローナル抗体、もしくはｂ）ポリクローナル抗体、もしくはｃ）ａ）またはｂ）の断片を含む、請求項１２から１５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１７】
前記試料受入領域の下流の支持体が、血液試料と一緒に運び去られ、流れることができる標識物質をさらに含む、請求項１４に記載の装置。
【請求項１８】
前記検出領域が特異的結合分子を備える、請求項１４に記載の装置。
【請求項１９】
血液試料中のアナライトを検出する方法であって、クロマトグラフィ支持体を提供するステップと、クロマトグラフィ支持体を通る血液試料の流れを可能にするステップと、血液試料中のアナライトの含有量を測定するステップとを含み、前記クロマトグラフィ支持体が、血液試料中のフィブリンに結合することができる受容体を備える方法。
【請求項２０】
前記支持体が、血液試料中の赤血球に結合することができる受容体をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記受容体が、ａ）モノクローナル抗体、もしくはｂ）ポリクローナル抗体、もしくはｃ）ａ）またはｂ）の断片を含む、請求項１９から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
血液試料中の前記アナライトを検出するための前記クロマトグラフィ支持体の下流領域に検出領域をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１２−５０５３８２（Ｐ２０１２−５０５３８２Ａ）
【公表日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３０３５２（Ｐ２０１１−５３０３５２）
【出願日】平成２１年１０月１３日（２００９．１０．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００９／００１１３７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４３１１３
【国際公開日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【出願人】（３０２０４４５９１）アレル・スウイツツアーランド・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング (38)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月１３日（２００９．１０．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００９／００１１３７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４３１１３
【国際公開日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【出願人】（３０２０４４５９１）アレル・スウイツツアーランド・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング (38)
【Ｆターム（参考）】
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