血清調製方法及び血清調製装置
【課題】使用する血液の鮮度に拘らず高い培養効率を奏することが可能な血清を、一度に大量に得ることができる血清調製方法及び血清調製装置を提供する。
【解決手段】少なくとも血小板を含有する血液から血清を調製する血清調製方法において、血液中の血小板の細胞膜を破壊する処理を行う血小板処理工程を設けた。血小板処理工程の後には、血液中の易熱性タンパク質を析出させる析出工程と、この析出工程により析出した易熱性タンパク質を除去する除去工程とを設けることが好ましい。
【解決手段】少なくとも血小板を含有する血液から血清を調製する血清調製方法において、血液中の血小板の細胞膜を破壊する処理を行う血小板処理工程を設けた。血小板処理工程の後には、血液中の易熱性タンパク質を析出させる析出工程と、この析出工程により析出した易熱性タンパク質を除去する除去工程とを設けることが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、採取された血液から血清を調製する血清調製方法及び血清調製装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、再生医療分野においては、対象者から採取した幹細胞を体外で、増殖又は分化させ、対象者に移植して対象者の組織の再生を促進させるという研究が行われている。
幹細胞の体外培養増殖では、培地に血清を添加すると、培養効率を向上させることが分かっている。
【０００３】
血清を調製する方法としては、例えばガラス粉末からなる血液凝固促進個体が収容された採血管を用いるという方法が特許文献１に開示されている。また、採取した血液を、例えばガラスビーズからなる血液凝固促進個体と接触させることにより、血小板を活性化させ、細胞増殖因子を放出させた後に血清を分離する方法が特許文献２に開示されている。
【特許文献１】特開２０００−０００２２８号公報
【特許文献２】特許第３７８８４７９号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、特許文献１に開示されている方法は、血液の検査を目的とするため、容量の小さな採血管から血清を調製することを前提としている。特許文献１に開示の方法を用いて血清を調製する場合、幹細胞の培養に必要な量を確保するためには、何度も調製操作を行わなければならず、実用に適さない。
【０００５】
また、細胞培養の培養効率は、血清中に含まれる細胞増殖因子の量に依存する。仮に一度に多量の血清を得ることができたとしても、細胞増殖因子の量が少なければ、培養効率を向上させることは困難である。
細胞増殖因子は血小板に含有されており、そこから放出される細胞増殖因子の量は、血小板の活性状態に依存し、血小板の活性状態は血小板の鮮度に依存する。特許文献２に開示されている方法は、血液をガラスビーズと接触させることで血小板を自発的に活性化させる方法であるため、使用する血液が古ければ、血液中の血小板の量から推測される量の細胞増殖因子を得ることは困難であり、高い培養効率を奏することが可能な血清を一度に大量に得ることができない。
【０００６】
また、特許文献２の方法は、血液をガラスビーズと接触させることにより、血小板を活性化させると同時にガラスビーズに血液凝固因子を付着させ、除去していく。そのため、献血で採取された血液のように、抗凝固処理された血液では、血液凝固因子をガラスビーズに付着させて除去することはできないため、このような血液に対して適用することは比較的難しい。
【０００７】
本発明は以上のような課題に鑑みてなされたものであり、使用する血液の鮮度に拘らず高い培養効率を奏することが可能な血清を、一度に大量に得ることができる血清調製方法及び血清調製装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、古い血液であっても、血小板の細胞膜を破壊することにより、血小板の量から推測される量の細胞増殖因子を得ることが可能であること、即ち血小板が含有しているほぼ全ての細胞増殖因子を得ることが可能であること、また、抗凝固処理が施された血液であっても、所定の処理を行うことにより使用することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。具体的には以下の発明である。
【０００９】
（１）少なくとも血小板を含有する血液から血清を調製する血清調製方法であって、前記血液中の血小板の細胞膜を破壊する処理を行う血小板処理工程を有する血清調製方法。
【００１０】
（２）前記血小板処理工程は、前記血液に、熱処理、超音波処理、遠心分離処理、加圧・減圧処理又はガラスビーズによる混和・撹拌処理の少なくともいずれかの処理を行う工程である（１）記載の血清調製方法。
【００１１】
（３）前記血液として、抗凝固処理が施された血液を用いる（１）又は（２）記載の血清調製方法。
【００１２】
（４）前記血小板処理工程を経た血液中の易熱性タンパク質を析出させる析出工程を更に有する（１）〜（３）のいずれかに記載の血清調製方法。
【００１３】
（５）前記析出工程により析出した前記易熱性タンパク質を除去する除去工程を更に有する（４）記載の血清調製方法。
【００１４】
（６） （１）〜（５）のいずれかに記載の血清調製方法により調製された血清。
【００１５】
（７）少なくとも血小板を含有する血液から血清を調製する血清調製装置であって、前記血液を貯留する血液貯留部と、該血液貯留部に無菌的かつ気密に連結され、前記血液貯留部に貯留された血液より分離された血清を収容する成分収容部と、を備える血清調製装置。
【００１６】
（８）前記血液貯留部は、全血を貯留する全血貯留部と、該全血貯留部に無菌的かつ気密に連結され、前記全血貯留部に貯留された全血より分離された多血小板血漿を貯留する血漿貯留部と、を備える（７）記載の血清調製装置。
【００１７】
（９）前記血液貯留部は、多血小板血漿を貯留する血漿貯留部である（７）記載の血清調製装置。
【００１８】
（１０）前記血液貯留部と前記成分収容部とは、これらを分離及び接続可能な接続部により接続される（７）〜（９）のいずれかに記載の血清調製装置。
【００１９】
ここで、本発明における「血液」とは、少なくとも血小板を含み、血球（赤血球、白血球）と液体成分である血漿（血清）からなる全血、及びこれらの少なくとも１種を含んだ液体（例えば成分献血で採取された血液）をいう。
また、「血清」とは、採取した血液を放置すると流動性が低下し、その後に赤い凝固塊（血餅）から分離される淡黄色の液体、又は細胞増殖因子を多く含む淡黄色の血液の液性成分をいう。
また、「多血小板血漿」とは、通常の全血中の血小板濃度よりも、より多くの血小板を含む血液の液性成分をいう。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、使用する血液の鮮度に拘らず、高い培養効率を奏することが可能な血清を、一度に大量に得ることが可能な血清調製方法及び血清調製装置を提供することが可能となる。
また、本発明によれば、例えば成分献血で採取された血液のように、抗凝固処理が施された血液であっても血清を調製することが可能となるため、体調上の問題から全血を採取することが困難な患者であっても、身体に負担をかけることなく血清を製造することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明するが、本発明は、以下の実施形態に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。なお、説明が重複する箇所については、適宜説明を省略するが、発明の趣旨を限定するものではない。
【００２２】
＜第１実施形態＞
［血清調製方法］
本発明は、少なくとも血小板を含有する血液から血清を調製する血清調製方法であって、前記血液中の血小板の細胞膜を破壊する血小板処理工程を有する血清調製方法である。
【００２３】
血小板が自発的に放出することができる、細胞増殖因子の量は、血小板の鮮度に依存する。血液中の血小板には「活性が高く、若い血小板」と「活性が低く、老いた血小板」が混在し、「若い血小板」は自発的に放出することができる細胞増殖因子の量も多い。採血から時間が経つほど「老いた血小板」の量も多くなるため、古い血液を用いて血清を製造すれば、細胞増殖因子の量が少ない血清となってしまう。しかしながら、本実施形態に係る発明によれば、血小板の細胞膜を破壊する「血小板処理工程」を設けることにより、使用する血液（血小板）の鮮度に関わらず、血小板の量から想定されるほぼ全ての細胞増殖因子を得ることができる。これによって培養効率の高い血清を得ることができる。
【００２４】
「血小板処理工程」としては、血液に熱処理、超音波処理、遠心分離処理、加圧・減圧処理等、物理的な負荷をかける処理を施すことが挙げられる。中でも、効率よく細胞膜を破壊することができることから、熱処理や超音波処理を行うことが好ましい。熱処理としては具体的には、凍結融解処理が挙げられる。
凍結融解処理は、凍結と融解の工程を少なくとも１回以上行う処理である。凍結工程における凍結温度は、−１９６℃〜−１℃、好ましくは−８０℃〜−５℃であり、凍結状態保持時間は、容量によって異なるが１秒以上であることが好ましい。また、融解工程における融解温度は、０℃〜５６℃、好ましくは４℃〜３７℃であり、融解状態の保持時間は容量によって異なるが１秒以上であることが好ましい。
【００２５】
また、超音波処理は、その対象物に対する超音波を音圧計にて測定したとき、５ｍＶ以上の音圧が得られるという条件で５分間〜６０分間、好ましくは１０分間〜３０分間超音波処理を行う。本発明において、超音波は、通常の超音波発生装置を用いて発生させる。
遠心分離処理は、血液を血液バッグ等の容器に収容し、この血液が収容された容器を、１００００〜１０００００Ｇ、５〜６００分の条件で遠心分離を行う。なお、血小板処理工程として、遠心分離処理を採用する場合には、血液として多血小板血漿を用いることが好ましい。
【００２６】
また、加圧・減圧処理は、血液に３〜２７５ＭＰａの比較的高い圧力を加え、その後減圧する操作を少なくとも１回行う。これにより、効率よく血小板の細胞膜を破壊できる。
物理的な負荷をかける処理としては、例えば、血液中にガラスビーズを混和させ、このガラスビーズが混和された血液を、遠心分離機等により撹拌する混和・撹拌処理が挙げられる。
【００２７】
これらの血液処理工程は、採取された血液が貯留されている血液バッグ等の容器に、そのまま施すことが好ましい。これによって採血又は処理された血液が外気に触れて汚染されてしまうのを防止することが可能となる。また、容器を移し変える必要がないため、工程を簡略化することが可能となる。
【００２８】
本実施形態において、「血液」は少なくとも血小板を含有していれば、全血であっても、多血小板血漿のように、一部の血液成分であってもよく、特に限定されるものではない。当該血液は、例えば採血管により採取された数ｍｌ程度の血液であってもよいが、一度に多量の血清を製造する場合には、所謂血液バッグにより採血された数百ｍｌ〜数千ｍｌの血液を用いることが好ましい。
また、献血で採血された血液のように、抗凝固処理が施されたものであってもよい。ここで、「抗凝固処理」とは、採取した血液にＣＰＤ液（Ｃｉｔｒａｔｅ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）やＡＣＤ−Ａ液（Ａｃｉｄ−Ｃｉｔｒａｔｅ−Ｄｅｘｔｒｏｓｅ−Ａ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）等の抗凝固剤を添加することをいう。抗凝固剤は予め採血された血液を貯留する血液バッグに添加されていることが好ましい。この抗凝固剤は、「血小板処理工程」を経た後の血液に、塩化カルシウム等に由来するカルシウムイオンを添加して中和することにより除去してもよい。
【００２９】
本実施形態では、採取された血液に、抗凝固剤が添加されているため、このままではフィブリノゲン等の易熱性タンパク質を含有する血液成分ができあがってしまうことになる。血清が易熱性タンパク質を含有したままであると、フィブリンの析出が起こり、細胞培養をすることが困難になってしまう。そのため、上記血小板処理工程を経た血液は、「析出工程」により易熱性タンパク質を析出させ、その後の「除去工程」により当該易熱性タンパク質を除去することが好ましい。
これによって抗凝固剤が添加された血液を用いた場合であっても、上記のような薬剤を添加することなく、易熱性タンパク質を除去することが可能となる。易熱性タンパク質としては、フィブリノゲン、補体成分が挙げられる。
なお、上述の血液処理工程と同様の理由から、当該「析出工程」も、採取された血液が貯留されている血液バッグや採血管等の容器にそのまま施すことが好ましい。
【００３０】
「析出工程」としては、加温処理が挙げられる。加温条件は、用いる血液の鮮度や量によって異なるが、通常４５℃〜６５℃であることが好ましく、５０℃〜６０℃であることがより好ましく、５５℃〜６０℃であることが最も好ましい。また加温時間としては、１０分から６０分であることが好ましく、２０分から５０分であることがより好ましく、３０分から４０分であることが最も好ましい。これによって易熱性タンパク質を容易に析出させることが可能となる。また、補体を失活させることが可能であるため、調製された血清を改めて非働化する必要がなく、工程を簡略化することができる。このような理由から、加温処理は、所謂非働化と同様の条件（５６℃で３０分間加温）で行ってもよい。
【００３１】
「除去工程」としては、遠心分離、ろ過等の処理を行うことが挙げられる。遠心分離の条件は、調製した血清の量及び分離する成分の種類によって設定されるものであるが、例えば４４００（Ｇ）×６分、２２（℃）に設定されることが好ましい。また、ろ過は、例えばオープニング径２００μｍのフィルターによってろ過することが好ましい。
【００３２】
＜第２実施形態＞
本実施形態では、抗凝固剤を添加しない状態で血清を調製する点が第１実施形態と異なる。
本実施形態では、血小板処理工程を経た血液は、血小板のみならず、赤血球や白血球の細胞膜も破壊された所謂溶血状態になる。そのため、赤血球中のヘモグロビンや白血球中のＤＮＡ及びＲＮＡを取り除くために、血小板処理工程と析出工程の間に、赤血球と白血球に由来する成分を除去する処理を行う。具体的には、吸着カラムやフィルター等を用いて除去する。なお、ヘモグロビンを取り除く場合には吸着カラムを用いることが好ましく、ＤＮＡ及びＲＮＡを取り除く場合にはフィルターを用いることが好ましい。
【００３３】
＜第３実施形態＞
［血清調製装置］
次に、上述した本発明の血清を調製する血清調製装置について説明する。
本発明の血清調製装置は、少なくとも血小板を含有する血液から血清を調製する血清調製装置であって、前記血液を貯留する血液貯留部と、この血液貯留部に無菌的かつ気密に連結され、前記血液貯留部に貯留された血液より分離された血清を収容する成分収容部と、を備える血清調製装置である。以下、本実施形態に係る血清調製装置について、詳細に説明する。
【００３４】
図１は、本実施形態に係る血清調製装置１を示す図である。この血清調製装置１は、血液貯留部１０、成分収容部２０を主な要素として構成されている。血液貯留部１０は対象者の全血を貯留する全血貯留部１１、及び全血から分離された多血小板血漿を貯留する血漿貯留部１２から構成されている。このうち、全血貯留部１１は、可撓性を有する樹脂材料、例えば、軟質ポリ塩化ビニルからなる２枚のシートが外縁部１１０ａで融着されることで袋状に形成された本体部１１０から構成されている。血漿貯留部１２も全血貯留部１１と同様に、軟質ポリ塩化ビニルからなる。
なお、全血貯留部１１は、内部に抗凝固剤が充填されている、所謂血液バッグや分離バッグであってもよい。血液貯留部１０の内部は前もって滅菌処理が施されている。本実施形態においては、予め抗凝固剤が添加されたものを用いている。
【００３５】
成分収容部２０は、６つの袋体２１〜２６から構成されており、各々が全血貯留部１１と同様に、軟質ポリ塩化ビニルからなる。これらは血液貯留部１０と同様に、前もって滅菌処理が施されている。
【００３６】
図１に示すように、全血貯留部１１の本体部１１０における上縁端には、その接続口に２本のチューブ４１，４２が気密接続されている。そのうちのチューブ４１は血液を導入するための導入路の役割を担っているため他端には、採血針３０あるいは採血針と接続可能な接続部が接続されている。もう一方のチューブ４２は、チューブ４３〜４７、５１〜５７及び分岐体６１〜６６を介して各袋体２１〜２６に接続されている。これらは血液を導出するための導出路の役割を担っている。これらのチューブ４１〜４７、５１〜５７については、柔軟性を有した樹脂材料、例えば、軟質ポリ塩化ビニルから構成されている。ここで、成分収容部２０の袋体２１〜２６と各チューブ５１〜５７についても、気密接続されている。
【００３７】
全血貯留部１１と血漿貯留部１２、及び血漿貯留部１２と各袋体２１〜２６は、各チューブ４２〜４７、５１〜５７を介して、内部の空間が外部環境と隔絶された状態、即ち、気密状態で接続されている。また、各チューブ４２〜４７、５１〜５７と各分岐体６１〜６６とについても、内部における血液成分が流通する領域が外部環境と隔絶された状態に接続されている。接続方法としては、溶剤接着、熱溶着あるいは超音波溶着等が挙げられる。
【００３８】
図１には図示していないが、本発明の第１実施形態に係る血清調製装置１では、各チューブ４２〜４７、５１〜５７の所要の箇所をクランプで挟むことで血液及び抽出された血清を導出する際に、その流路を切り替えることができる構成となっている。
【００３９】
＜血清調製操作について＞
上記構成を有する血清調製装置１を用いた血清調製操作について、図１及び図２〜３を用いて説明する。なお、特に断りがない限り、符号は図１に記載の符号である。
【００４０】
図２に示すように、上記血清調製装置１を用いた血液分離操作は、大別して１０の工程（Ｓ１〜Ｓ１０）から構成されている。
【００４１】
まず、操作の第１段階としては、採血針３０を対象者（患者）に刺し、血液を採取する。この際、採血針３０から採取された血液は、チューブ４１を介して、下方に位置する全血貯留部１１に貯留される（以下、貯留工程Ｓ１とする）。ここで、全血貯留部１１に採取された血液が、血漿貯留部１２の方に流れ込まないように、チューブ４２における全血貯留部１１との境界近傍には、破断可能な隔壁（図示せず）が備えられている。あるいはチューブ４２は、クランプ等を用いて全血貯留部１１の根元側で経路が閉鎖されている。貯留工程Ｓ１は、採血時における患者の体調等を考慮して、所要量を採取して終了する。ここでいう所要量とは、患者の体格や体調に問題がない場合には２００〜６００（ｍｌ）程度である。
【００４２】
なお、採血に際しては、献血の際に広く使われている採血機等を用いることもできる。
【００４３】
次いで、対象者から採血針３０を抜針し、採血針３０と全血貯留部１１とを連結しているチューブ４１の一部を溶断し、同時にその溶断端を溶着する（以下、第１溶断工程Ｓ２とする）。なお、チューブ４１の溶断には、溶断機（所謂シーラー）を用いて溶断してもよい。
【００４４】
次いで、全血貯留部１１中の全血から血漿（以下、本実施形態では多血小板血漿とする）を分離する（以下、第１分離工程Ｓ３とする）。分離方法としては、遠心分離、ろ過、又はそれらの組み合わせ、等が挙げられる。本実施形態では、遠心分離を行う。遠心分離の条件は、貯留された血液の量及び分離する成分の種類によって設定されるものであるが、例えば１１００（Ｇ）×６（ｍｉｎ．）、２４（℃）に設定されることが好ましい。なお、遠心分離を行う際は、血清調製装置１を折りたたんで遠心分離機にかけることが好ましい。
【００４５】
次いで、分離された多血小板血漿を、血漿貯留部１２に移す（以下、第１移送工程Ｓ４とする）。本工程は、図３を用いて説明する。
【００４６】
図３に示すように、分離された多血小板血漿７１を、血漿貯留部１２に移送しようとする場合には、クランプ９０を用いてチューブ４３の経路を閉鎖しておき、この状態で全血貯留部１１の外側に設置した加圧機８０をもって、全血貯留部１１を加圧（Ｆ１）する。上述のように、全血貯留部１１に気密接続されたチューブ４１は、貯留工程Ｓ１が終了した時点で、その途中４１ａが溶断され、かつ同時にその端部及び近傍４１ｂが溶着されている。
【００４７】
よって、加圧Ｆ１を受けることによって、分離によって抽出された上清部分である多血小板血漿７１の一部は、チューブ４２、分岐体６１及びチューブ５１を介して血漿貯留部１２に移送される。
なお、チューブ４３の経路閉鎖は、柔軟性を有するチューブ４３を、クランプ９０の円板９１とベース９２との間で挟むことにより行われる。
【００４８】
多血小板血漿７１を移送した後に全血貯留部１１に残った赤血球等の血液成分は、生理食塩水等で希釈してドナーに返却することができる。また、残った血液成分に赤血球保存液を加え、一定期間保存後に、例えば細胞移植時にドナーに返却することができる。
【００４９】
図２に戻って、血漿貯留部１２に多血小板血漿７１が充填された後、チューブ４２を溶断及び溶着する（以下、第２溶断工程Ｓ５とする）。この溶断及び溶着は、第１溶断工程Ｓ２と同様の方法を用いて行われる。
【００５０】
次いで、血漿貯留部１２移送された多血小板血漿中の血小板の細胞膜を物理的に破壊する（以下、血小板処理工程Ｓ６とする）。血小板処理工程Ｓ６としては、遠心分離処理、超音波処理、熱処理、加圧・減圧処理、ガラスビーズによる混和・撹拌処理等が挙げられる。本実施形態では、血小板処理工程は、熱処理としての凍結融解処理により血小板の処理を行う。凍結融解処理は、血清調製装置１全体を−８０℃で６０分間凍結させ、その後３７℃まで昇温させ２０分間保持することを３回繰り返して行う。
血小板処理工程Ｓ６により、血小板の細胞膜が破壊され、血小板の中の細胞増殖因子が放出される。これによって、血小板又は血液の鮮度に拘らず、血小板が含有している全ての細胞増殖因子を得ることができる。
【００５１】
次いで、血小板処理工程Ｓ６を経た血液中の易熱性タンパク質を析出させる（以下、析出工程Ｓ７とする）。析出処理は、上記血小板処理工程Ｓ６を経た血漿貯留部１２を、加温処理することにより行われる。本実施形態において、加温処理は、５６℃で３０分間行われる。析出工程Ｓ７によって易熱性タンパク質だけではなく、補体も失活化させることが可能となる。補体を失活化させることにより、培養細胞への影響を軽減することが可能となる。
なお、析出工程Ｓ７における加温処理は血清調製装置１全体を加温してもよい。
【００５２】
次いで、析出工程Ｓ７により析出した易熱性タンパク質を除去する（以下、除去工程Ｓ８とする）。除去方法としては、ろ過、遠心分離又はこれらを組み合わせて行う方法等が挙げられる。本実施形態では、４４００（Ｇ）×６分間遠心分離を行う。遠心分離を行う際は、血清調製装置１全体を遠心分離機にかけることが好ましい。ろ過を行う場合には、図１中のチューブ４３の一部に、フィルターを予め組み込んでおけば、後述する第２移送工程を行いつつ、析出した易熱性タンパク質を除去することが可能となる。
【００５３】
次いで、上記除去工程Ｓ８により分離された血清を、成分収容部２０のそれぞれの袋体２１〜２６に移送する（第２移送工程Ｓ９）。移送方法は第１移送工程Ｓ４と同様に、血漿貯留部１２の外側に圧力をかけて、調製した血清を押し出す方法が好ましい。血清はそれぞれの袋体２１〜２６に、収容することができる。なお、調製した血清の量が少ない場合には、チューブ４４〜４７のいずれかをクランプ等で閉じて使用する袋体２１〜２６の数を調製してもよい。
【００５４】
成分収容部２０に血清を移送した後、チューブ５２〜５７を溶断及び溶着する（以下、第３溶断工程Ｓ１０とする）。この溶断及び溶着は、第１溶断工程Ｓ２と同様の方法を用いて行われる。
【００５５】
本実施形態によれば、採取された血液から血清を外気に触れさせることなく、無菌的に製造することが可能となる。これによって、採血から血清調製までの一連の工程を外気に触れることなく行うことが可能であるため、微生物による汚染のリスクを低減させることができる。
【００５６】
なお、本実施形態では、血小板処理工程Ｓ６における熱処理として、凍結融解処理の例を示した。しかしながら、本発明における熱処理は、凍結融解処理に制限されない。例えば、熱処理として加温処理を行っても、本発明の効果を達成することができる。血小板処理工程Ｓ６の加温処理は、例えば、血清調製装置１全体を５６℃で６０分間加温処理することにより行われる。これにより、血小板の細胞膜が破壊され、血小板の中の細胞増殖因子を得ることができる。また、血小板処理工程Ｓ６において、５６℃で６０分間の加温処理することにより、上記析出工程Ｓ７の工程を同時に行うことができる。これにより、血清調製工程の一連の工程の短縮化を図れる効果がある。
【００５７】
なお、本発明に係る血清調製装置は、ヒトの血液だけではなく、げっ歯類、家畜類、霊長類等の哺乳類の血液にも使用することが可能であるため、非ヒト用血液成分分離装置として使用することも可能である。
【００５８】
＜第４実施形態＞
図４及び図５は、本発明の第４実施形態に係る血清調製装置１Ａを示した図である。本実施形態においては、血液貯留部１０Ａが、全血貯留部と血漿貯留部とで構成されておらず、一つの袋体で構成されており、血液貯留部１０Ａが多血小板血漿を貯留する血漿貯留部１２Ａのみから構成されている点が、第３実施形態と異なる。
図４において、血漿貯留部１２Ａには、例えば成分献血で採取された多血小板血漿が貯留されることになる。この場合、チューブ４２Ａと血漿貯留部１２Ａは、始めは接続されていない。使用する際には、チューブ４２Ａを接続部７０に差込み、血漿貯留部１２Ａ側のチューブ４２Ａ’と連結する。なお、採血時に使用されていたチューブ４１Ａは、予め溶断されていることが好ましい。接続部７０としては、例えば挿入具の挿脱にともなって弁体のスリット状開口部が開閉する機能を有する気密性の高い混注ポート（日本国特許第３３８９９８３号等参照）を備えた構成が挙げられる。
なお、本実施形態において、図６に示すように、血漿貯留部１２Ａとチューブ４２Ａとが、接続部７０を介さず、予め一体的に接続されてなる構成であってもよい。
このような構成にすることによって、献血のように外部で採取された血液を使用することが可能となる。また、成分献血で採取された血液を使用することができるため、体調上の問題から全血を採取することができない患者でも血清を容易に調製することができる。なお、本実施形態におけるその他の構成は、第３実施形態に係る血清調製装置と同様であるためその他の部分についての説明は省略する。
【００５９】
＜第５実施形態＞
図７及び図８は、本発明の第５実施形態に係る血清調製装置１Ｂを示した図である。
本実施形態においては、血液貯留部１０Ｂが血漿貯留部１２Ｂのみから構成されており、この血漿貯留部１２Ｂに超音波を発生させる超音波発振子１３を収容可能な超音波発振子収容部１４が設けられている点が、第１実施形態と異なる。
【００６０】
超音波発振子収容部１４は、一端が閉鎖され他端が開放された筒状部材１５が、血漿貯留部１２Ｂの上縁部から、袋状に形成された本体部１２０Ｂの内部側に突出するように配置されて形成されている。筒状部材１５は、閉鎖された一端側が本体部１２０Ｂの内部側に突出するように配置される。
超音波発振子１３は、棒状であり、筒状部材１５の開放された一端側から中空部内に挿入される。即ち、本実施形態では、筒状部材１５の中空部が超音波発振子収容部１４を構成する。
【００６１】
筒状部材１５の中空部の形状は、超音波発振子１３の外形と略同一である。これにより、超音波発振子１３を超音波発振子収容部１４に収容した場合に、超音波発振子１３が筒状部材１５に密着する。
超音波発振子１３は、接続線を介して超音波発生装置本体１６に接続されており、この超音波発生装置本体１６に設けられたスイッチを作動させることにより、超音波を発振する。
【００６２】
以上のような構成とすることで、超音波発振子１３より発生する超音波を、本体部１２０Ｂの内部に収容された全血に直接負荷できる。これにより、効率的な血清調製操作が可能となる。その結果、血清調製操作にかかるエネルギー負荷を軽減でき、また、血清調製にかかる時間の短縮が可能となる。
また、超音波発振子収容部１４を、血漿貯留部１２Ｂの内部空間と外部空間とが隔絶された状態で接続できる。これにより、血漿貯留部１２Ｂの内部空間の無菌性を確保しつつ、血小板処理工程を行うことが可能となる。
【００６３】
更に、超音波発振子収容部１４を、血清調製装置１Ｂの血液貯留部１０Ｂとしての血漿貯留部１２Ｂに設ける構成としたことにより、血小板処理工程としての超音波処理に用いる超音波発振子１３を血清調製装置１Ｂに容易に着脱でき、血清調製操作が容易となる。また、小型の超音波発生装置を使用でき、血清調製装置１Ｂの省スペース化を図ることができる。
【実施例】
【００６４】
〔実施例１〜４、比較例１、参考例１及び２〕
血小板処理工程における、血小板の細胞膜を破壊する方法の検討を行った。
まず、全血から多血小板血漿を分離する。始めにヒト血液１０ｍｌに、ＣＰＤ液を１．４ｍｌ添加し、２０℃のもと３５００ｒｐｍで８分間遠心分離（遠心分離機：株式会社久保田製作所製）を行った。次いで、分離された血漿層とバフィーコート層を分離し、２０℃のもと８００ｒｐｍで８分間遠心分離を行い、上澄みを多血小板血漿として分離した。これを試験用の検体とした。
【００６５】
上記多血小板血漿をそれぞれ１ｍｌずつ容器に分与し、以下の処理を行った。なお、比較例１に記載の処理方法は、特許文献２（特許第３７８８４７９号）に記載の方法である。
（実施例１）−８０℃で１０分間凍結させ、その後３７℃で融解させる処理を３回実施
（実施例２）超音波処理を１５分間実施
（実施例３）超音波処理を３０分間実施
（実施例４）直径１ｍｍのガラスビーズを多数加えた容器の中で１０分間激しく撹拌する処理を実施
（比較例１）直径４ｍｍのガラスビーズ５個と２７．８ｗ／ｖ％の塩化カルシウムを１０μｌ添加し、３７℃で３０分間加温処理を実施
（参考例１）１４０００Ｇで１０分間遠心分離を１回実施
（参考例２）１４０００Ｇで１０分間遠心分離を３回実施
【００６６】
上記処理後、３５００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた上澄み（血清）について細胞増殖因子の定量を行った。その結果を表１に示す。
【表１】
【００６７】
実施例１の凍結融解処理を施したものや実施例４のガラスビーズを添加して撹拌する処理を施したものでは、従来の方法（比較例１）とほぼ同等の量の細胞増殖因子を得ることができた。一方、実施例２，３の超音波処理を施したものでは、ヒトの血清が有する細胞増殖因子の上限値に近い量の細胞増殖因子を得ることができた。
【００６８】
次いで、実施例２，３において、超音波の処理時間と血小板残存率（％）の関係を検討した。図９は、超音波処理時間と血小板数の関係（ｎ＝５）を示した図である。これより１５分間の超音波処理で殆どの血小板の細胞膜が破壊されることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】本発明の第３実施形態に係る血清調製装置を示した図である。
【図２】本発明の第３実施形態に係る血清調製装置による血液採取から血清保存に至るまでの手順を示す図である。
【図３】本発明の第３実施形態に係る血清調製装置の全血貯留部１１内で調製された多血小板血漿７１を血漿貯留部１２に導出する方法を示す断面図である。
【図４】本発明の第４実施形態に係る血清調製装置において、血漿貯留部が分離された状態を示した図である。
【図５】本発明の第４実施形態に係る血清調製装置において、血漿貯留部が接続された状態を示した図である。
【図６】本発明の第４実施形態に係る血清調製装置の変形例を示した図である。
【図７】本発明の第５実施形態に係る血清調製装置を示した図である。
【図８】図７の部分拡大図である。
【図９】実施例２及び３において、超音波処理時間と血小板残存率（％）の関係を示した図である。
【符号の説明】
【００７０】
１、１Ａ 血清調製装置
１０、１０Ａ 血液貯留部
１１ 全血貯留部
１１０ 本体部
１１０ａ 外縁部
１２ 血漿貯留部
２０ 成分収容部
２１〜２６ 袋体
３０ 採血針
４１〜４７，５１〜５７ チューブ
６１〜６６ 分岐体
７０ 接続部
７１ 多血小板血漿
８０ 加圧機
９０ クランプ
９１ 円板
９２ ベース
【技術分野】
【０００１】
本発明は、採取された血液から血清を調製する血清調製方法及び血清調製装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、再生医療分野においては、対象者から採取した幹細胞を体外で、増殖又は分化させ、対象者に移植して対象者の組織の再生を促進させるという研究が行われている。
幹細胞の体外培養増殖では、培地に血清を添加すると、培養効率を向上させることが分かっている。
【０００３】
血清を調製する方法としては、例えばガラス粉末からなる血液凝固促進個体が収容された採血管を用いるという方法が特許文献１に開示されている。また、採取した血液を、例えばガラスビーズからなる血液凝固促進個体と接触させることにより、血小板を活性化させ、細胞増殖因子を放出させた後に血清を分離する方法が特許文献２に開示されている。
【特許文献１】特開２０００−０００２２８号公報
【特許文献２】特許第３７８８４７９号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、特許文献１に開示されている方法は、血液の検査を目的とするため、容量の小さな採血管から血清を調製することを前提としている。特許文献１に開示の方法を用いて血清を調製する場合、幹細胞の培養に必要な量を確保するためには、何度も調製操作を行わなければならず、実用に適さない。
【０００５】
また、細胞培養の培養効率は、血清中に含まれる細胞増殖因子の量に依存する。仮に一度に多量の血清を得ることができたとしても、細胞増殖因子の量が少なければ、培養効率を向上させることは困難である。
細胞増殖因子は血小板に含有されており、そこから放出される細胞増殖因子の量は、血小板の活性状態に依存し、血小板の活性状態は血小板の鮮度に依存する。特許文献２に開示されている方法は、血液をガラスビーズと接触させることで血小板を自発的に活性化させる方法であるため、使用する血液が古ければ、血液中の血小板の量から推測される量の細胞増殖因子を得ることは困難であり、高い培養効率を奏することが可能な血清を一度に大量に得ることができない。
【０００６】
また、特許文献２の方法は、血液をガラスビーズと接触させることにより、血小板を活性化させると同時にガラスビーズに血液凝固因子を付着させ、除去していく。そのため、献血で採取された血液のように、抗凝固処理された血液では、血液凝固因子をガラスビーズに付着させて除去することはできないため、このような血液に対して適用することは比較的難しい。
【０００７】
本発明は以上のような課題に鑑みてなされたものであり、使用する血液の鮮度に拘らず高い培養効率を奏することが可能な血清を、一度に大量に得ることができる血清調製方法及び血清調製装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、古い血液であっても、血小板の細胞膜を破壊することにより、血小板の量から推測される量の細胞増殖因子を得ることが可能であること、即ち血小板が含有しているほぼ全ての細胞増殖因子を得ることが可能であること、また、抗凝固処理が施された血液であっても、所定の処理を行うことにより使用することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。具体的には以下の発明である。
【０００９】
（１）少なくとも血小板を含有する血液から血清を調製する血清調製方法であって、前記血液中の血小板の細胞膜を破壊する処理を行う血小板処理工程を有する血清調製方法。
【００１０】
（２）前記血小板処理工程は、前記血液に、熱処理、超音波処理、遠心分離処理、加圧・減圧処理又はガラスビーズによる混和・撹拌処理の少なくともいずれかの処理を行う工程である（１）記載の血清調製方法。
【００１１】
（３）前記血液として、抗凝固処理が施された血液を用いる（１）又は（２）記載の血清調製方法。
【００１２】
（４）前記血小板処理工程を経た血液中の易熱性タンパク質を析出させる析出工程を更に有する（１）〜（３）のいずれかに記載の血清調製方法。
【００１３】
（５）前記析出工程により析出した前記易熱性タンパク質を除去する除去工程を更に有する（４）記載の血清調製方法。
【００１４】
（６） （１）〜（５）のいずれかに記載の血清調製方法により調製された血清。
【００１５】
（７）少なくとも血小板を含有する血液から血清を調製する血清調製装置であって、前記血液を貯留する血液貯留部と、該血液貯留部に無菌的かつ気密に連結され、前記血液貯留部に貯留された血液より分離された血清を収容する成分収容部と、を備える血清調製装置。
【００１６】
（８）前記血液貯留部は、全血を貯留する全血貯留部と、該全血貯留部に無菌的かつ気密に連結され、前記全血貯留部に貯留された全血より分離された多血小板血漿を貯留する血漿貯留部と、を備える（７）記載の血清調製装置。
【００１７】
（９）前記血液貯留部は、多血小板血漿を貯留する血漿貯留部である（７）記載の血清調製装置。
【００１８】
（１０）前記血液貯留部と前記成分収容部とは、これらを分離及び接続可能な接続部により接続される（７）〜（９）のいずれかに記載の血清調製装置。
【００１９】
ここで、本発明における「血液」とは、少なくとも血小板を含み、血球（赤血球、白血球）と液体成分である血漿（血清）からなる全血、及びこれらの少なくとも１種を含んだ液体（例えば成分献血で採取された血液）をいう。
また、「血清」とは、採取した血液を放置すると流動性が低下し、その後に赤い凝固塊（血餅）から分離される淡黄色の液体、又は細胞増殖因子を多く含む淡黄色の血液の液性成分をいう。
また、「多血小板血漿」とは、通常の全血中の血小板濃度よりも、より多くの血小板を含む血液の液性成分をいう。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、使用する血液の鮮度に拘らず、高い培養効率を奏することが可能な血清を、一度に大量に得ることが可能な血清調製方法及び血清調製装置を提供することが可能となる。
また、本発明によれば、例えば成分献血で採取された血液のように、抗凝固処理が施された血液であっても血清を調製することが可能となるため、体調上の問題から全血を採取することが困難な患者であっても、身体に負担をかけることなく血清を製造することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明するが、本発明は、以下の実施形態に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。なお、説明が重複する箇所については、適宜説明を省略するが、発明の趣旨を限定するものではない。
【００２２】
＜第１実施形態＞
［血清調製方法］
本発明は、少なくとも血小板を含有する血液から血清を調製する血清調製方法であって、前記血液中の血小板の細胞膜を破壊する血小板処理工程を有する血清調製方法である。
【００２３】
血小板が自発的に放出することができる、細胞増殖因子の量は、血小板の鮮度に依存する。血液中の血小板には「活性が高く、若い血小板」と「活性が低く、老いた血小板」が混在し、「若い血小板」は自発的に放出することができる細胞増殖因子の量も多い。採血から時間が経つほど「老いた血小板」の量も多くなるため、古い血液を用いて血清を製造すれば、細胞増殖因子の量が少ない血清となってしまう。しかしながら、本実施形態に係る発明によれば、血小板の細胞膜を破壊する「血小板処理工程」を設けることにより、使用する血液（血小板）の鮮度に関わらず、血小板の量から想定されるほぼ全ての細胞増殖因子を得ることができる。これによって培養効率の高い血清を得ることができる。
【００２４】
「血小板処理工程」としては、血液に熱処理、超音波処理、遠心分離処理、加圧・減圧処理等、物理的な負荷をかける処理を施すことが挙げられる。中でも、効率よく細胞膜を破壊することができることから、熱処理や超音波処理を行うことが好ましい。熱処理としては具体的には、凍結融解処理が挙げられる。
凍結融解処理は、凍結と融解の工程を少なくとも１回以上行う処理である。凍結工程における凍結温度は、−１９６℃〜−１℃、好ましくは−８０℃〜−５℃であり、凍結状態保持時間は、容量によって異なるが１秒以上であることが好ましい。また、融解工程における融解温度は、０℃〜５６℃、好ましくは４℃〜３７℃であり、融解状態の保持時間は容量によって異なるが１秒以上であることが好ましい。
【００２５】
また、超音波処理は、その対象物に対する超音波を音圧計にて測定したとき、５ｍＶ以上の音圧が得られるという条件で５分間〜６０分間、好ましくは１０分間〜３０分間超音波処理を行う。本発明において、超音波は、通常の超音波発生装置を用いて発生させる。
遠心分離処理は、血液を血液バッグ等の容器に収容し、この血液が収容された容器を、１００００〜１０００００Ｇ、５〜６００分の条件で遠心分離を行う。なお、血小板処理工程として、遠心分離処理を採用する場合には、血液として多血小板血漿を用いることが好ましい。
【００２６】
また、加圧・減圧処理は、血液に３〜２７５ＭＰａの比較的高い圧力を加え、その後減圧する操作を少なくとも１回行う。これにより、効率よく血小板の細胞膜を破壊できる。
物理的な負荷をかける処理としては、例えば、血液中にガラスビーズを混和させ、このガラスビーズが混和された血液を、遠心分離機等により撹拌する混和・撹拌処理が挙げられる。
【００２７】
これらの血液処理工程は、採取された血液が貯留されている血液バッグ等の容器に、そのまま施すことが好ましい。これによって採血又は処理された血液が外気に触れて汚染されてしまうのを防止することが可能となる。また、容器を移し変える必要がないため、工程を簡略化することが可能となる。
【００２８】
本実施形態において、「血液」は少なくとも血小板を含有していれば、全血であっても、多血小板血漿のように、一部の血液成分であってもよく、特に限定されるものではない。当該血液は、例えば採血管により採取された数ｍｌ程度の血液であってもよいが、一度に多量の血清を製造する場合には、所謂血液バッグにより採血された数百ｍｌ〜数千ｍｌの血液を用いることが好ましい。
また、献血で採血された血液のように、抗凝固処理が施されたものであってもよい。ここで、「抗凝固処理」とは、採取した血液にＣＰＤ液（Ｃｉｔｒａｔｅ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）やＡＣＤ−Ａ液（Ａｃｉｄ−Ｃｉｔｒａｔｅ−Ｄｅｘｔｒｏｓｅ−Ａ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）等の抗凝固剤を添加することをいう。抗凝固剤は予め採血された血液を貯留する血液バッグに添加されていることが好ましい。この抗凝固剤は、「血小板処理工程」を経た後の血液に、塩化カルシウム等に由来するカルシウムイオンを添加して中和することにより除去してもよい。
【００２９】
本実施形態では、採取された血液に、抗凝固剤が添加されているため、このままではフィブリノゲン等の易熱性タンパク質を含有する血液成分ができあがってしまうことになる。血清が易熱性タンパク質を含有したままであると、フィブリンの析出が起こり、細胞培養をすることが困難になってしまう。そのため、上記血小板処理工程を経た血液は、「析出工程」により易熱性タンパク質を析出させ、その後の「除去工程」により当該易熱性タンパク質を除去することが好ましい。
これによって抗凝固剤が添加された血液を用いた場合であっても、上記のような薬剤を添加することなく、易熱性タンパク質を除去することが可能となる。易熱性タンパク質としては、フィブリノゲン、補体成分が挙げられる。
なお、上述の血液処理工程と同様の理由から、当該「析出工程」も、採取された血液が貯留されている血液バッグや採血管等の容器にそのまま施すことが好ましい。
【００３０】
「析出工程」としては、加温処理が挙げられる。加温条件は、用いる血液の鮮度や量によって異なるが、通常４５℃〜６５℃であることが好ましく、５０℃〜６０℃であることがより好ましく、５５℃〜６０℃であることが最も好ましい。また加温時間としては、１０分から６０分であることが好ましく、２０分から５０分であることがより好ましく、３０分から４０分であることが最も好ましい。これによって易熱性タンパク質を容易に析出させることが可能となる。また、補体を失活させることが可能であるため、調製された血清を改めて非働化する必要がなく、工程を簡略化することができる。このような理由から、加温処理は、所謂非働化と同様の条件（５６℃で３０分間加温）で行ってもよい。
【００３１】
「除去工程」としては、遠心分離、ろ過等の処理を行うことが挙げられる。遠心分離の条件は、調製した血清の量及び分離する成分の種類によって設定されるものであるが、例えば４４００（Ｇ）×６分、２２（℃）に設定されることが好ましい。また、ろ過は、例えばオープニング径２００μｍのフィルターによってろ過することが好ましい。
【００３２】
＜第２実施形態＞
本実施形態では、抗凝固剤を添加しない状態で血清を調製する点が第１実施形態と異なる。
本実施形態では、血小板処理工程を経た血液は、血小板のみならず、赤血球や白血球の細胞膜も破壊された所謂溶血状態になる。そのため、赤血球中のヘモグロビンや白血球中のＤＮＡ及びＲＮＡを取り除くために、血小板処理工程と析出工程の間に、赤血球と白血球に由来する成分を除去する処理を行う。具体的には、吸着カラムやフィルター等を用いて除去する。なお、ヘモグロビンを取り除く場合には吸着カラムを用いることが好ましく、ＤＮＡ及びＲＮＡを取り除く場合にはフィルターを用いることが好ましい。
【００３３】
＜第３実施形態＞
［血清調製装置］
次に、上述した本発明の血清を調製する血清調製装置について説明する。
本発明の血清調製装置は、少なくとも血小板を含有する血液から血清を調製する血清調製装置であって、前記血液を貯留する血液貯留部と、この血液貯留部に無菌的かつ気密に連結され、前記血液貯留部に貯留された血液より分離された血清を収容する成分収容部と、を備える血清調製装置である。以下、本実施形態に係る血清調製装置について、詳細に説明する。
【００３４】
図１は、本実施形態に係る血清調製装置１を示す図である。この血清調製装置１は、血液貯留部１０、成分収容部２０を主な要素として構成されている。血液貯留部１０は対象者の全血を貯留する全血貯留部１１、及び全血から分離された多血小板血漿を貯留する血漿貯留部１２から構成されている。このうち、全血貯留部１１は、可撓性を有する樹脂材料、例えば、軟質ポリ塩化ビニルからなる２枚のシートが外縁部１１０ａで融着されることで袋状に形成された本体部１１０から構成されている。血漿貯留部１２も全血貯留部１１と同様に、軟質ポリ塩化ビニルからなる。
なお、全血貯留部１１は、内部に抗凝固剤が充填されている、所謂血液バッグや分離バッグであってもよい。血液貯留部１０の内部は前もって滅菌処理が施されている。本実施形態においては、予め抗凝固剤が添加されたものを用いている。
【００３５】
成分収容部２０は、６つの袋体２１〜２６から構成されており、各々が全血貯留部１１と同様に、軟質ポリ塩化ビニルからなる。これらは血液貯留部１０と同様に、前もって滅菌処理が施されている。
【００３６】
図１に示すように、全血貯留部１１の本体部１１０における上縁端には、その接続口に２本のチューブ４１，４２が気密接続されている。そのうちのチューブ４１は血液を導入するための導入路の役割を担っているため他端には、採血針３０あるいは採血針と接続可能な接続部が接続されている。もう一方のチューブ４２は、チューブ４３〜４７、５１〜５７及び分岐体６１〜６６を介して各袋体２１〜２６に接続されている。これらは血液を導出するための導出路の役割を担っている。これらのチューブ４１〜４７、５１〜５７については、柔軟性を有した樹脂材料、例えば、軟質ポリ塩化ビニルから構成されている。ここで、成分収容部２０の袋体２１〜２６と各チューブ５１〜５７についても、気密接続されている。
【００３７】
全血貯留部１１と血漿貯留部１２、及び血漿貯留部１２と各袋体２１〜２６は、各チューブ４２〜４７、５１〜５７を介して、内部の空間が外部環境と隔絶された状態、即ち、気密状態で接続されている。また、各チューブ４２〜４７、５１〜５７と各分岐体６１〜６６とについても、内部における血液成分が流通する領域が外部環境と隔絶された状態に接続されている。接続方法としては、溶剤接着、熱溶着あるいは超音波溶着等が挙げられる。
【００３８】
図１には図示していないが、本発明の第１実施形態に係る血清調製装置１では、各チューブ４２〜４７、５１〜５７の所要の箇所をクランプで挟むことで血液及び抽出された血清を導出する際に、その流路を切り替えることができる構成となっている。
【００３９】
＜血清調製操作について＞
上記構成を有する血清調製装置１を用いた血清調製操作について、図１及び図２〜３を用いて説明する。なお、特に断りがない限り、符号は図１に記載の符号である。
【００４０】
図２に示すように、上記血清調製装置１を用いた血液分離操作は、大別して１０の工程（Ｓ１〜Ｓ１０）から構成されている。
【００４１】
まず、操作の第１段階としては、採血針３０を対象者（患者）に刺し、血液を採取する。この際、採血針３０から採取された血液は、チューブ４１を介して、下方に位置する全血貯留部１１に貯留される（以下、貯留工程Ｓ１とする）。ここで、全血貯留部１１に採取された血液が、血漿貯留部１２の方に流れ込まないように、チューブ４２における全血貯留部１１との境界近傍には、破断可能な隔壁（図示せず）が備えられている。あるいはチューブ４２は、クランプ等を用いて全血貯留部１１の根元側で経路が閉鎖されている。貯留工程Ｓ１は、採血時における患者の体調等を考慮して、所要量を採取して終了する。ここでいう所要量とは、患者の体格や体調に問題がない場合には２００〜６００（ｍｌ）程度である。
【００４２】
なお、採血に際しては、献血の際に広く使われている採血機等を用いることもできる。
【００４３】
次いで、対象者から採血針３０を抜針し、採血針３０と全血貯留部１１とを連結しているチューブ４１の一部を溶断し、同時にその溶断端を溶着する（以下、第１溶断工程Ｓ２とする）。なお、チューブ４１の溶断には、溶断機（所謂シーラー）を用いて溶断してもよい。
【００４４】
次いで、全血貯留部１１中の全血から血漿（以下、本実施形態では多血小板血漿とする）を分離する（以下、第１分離工程Ｓ３とする）。分離方法としては、遠心分離、ろ過、又はそれらの組み合わせ、等が挙げられる。本実施形態では、遠心分離を行う。遠心分離の条件は、貯留された血液の量及び分離する成分の種類によって設定されるものであるが、例えば１１００（Ｇ）×６（ｍｉｎ．）、２４（℃）に設定されることが好ましい。なお、遠心分離を行う際は、血清調製装置１を折りたたんで遠心分離機にかけることが好ましい。
【００４５】
次いで、分離された多血小板血漿を、血漿貯留部１２に移す（以下、第１移送工程Ｓ４とする）。本工程は、図３を用いて説明する。
【００４６】
図３に示すように、分離された多血小板血漿７１を、血漿貯留部１２に移送しようとする場合には、クランプ９０を用いてチューブ４３の経路を閉鎖しておき、この状態で全血貯留部１１の外側に設置した加圧機８０をもって、全血貯留部１１を加圧（Ｆ１）する。上述のように、全血貯留部１１に気密接続されたチューブ４１は、貯留工程Ｓ１が終了した時点で、その途中４１ａが溶断され、かつ同時にその端部及び近傍４１ｂが溶着されている。
【００４７】
よって、加圧Ｆ１を受けることによって、分離によって抽出された上清部分である多血小板血漿７１の一部は、チューブ４２、分岐体６１及びチューブ５１を介して血漿貯留部１２に移送される。
なお、チューブ４３の経路閉鎖は、柔軟性を有するチューブ４３を、クランプ９０の円板９１とベース９２との間で挟むことにより行われる。
【００４８】
多血小板血漿７１を移送した後に全血貯留部１１に残った赤血球等の血液成分は、生理食塩水等で希釈してドナーに返却することができる。また、残った血液成分に赤血球保存液を加え、一定期間保存後に、例えば細胞移植時にドナーに返却することができる。
【００４９】
図２に戻って、血漿貯留部１２に多血小板血漿７１が充填された後、チューブ４２を溶断及び溶着する（以下、第２溶断工程Ｓ５とする）。この溶断及び溶着は、第１溶断工程Ｓ２と同様の方法を用いて行われる。
【００５０】
次いで、血漿貯留部１２移送された多血小板血漿中の血小板の細胞膜を物理的に破壊する（以下、血小板処理工程Ｓ６とする）。血小板処理工程Ｓ６としては、遠心分離処理、超音波処理、熱処理、加圧・減圧処理、ガラスビーズによる混和・撹拌処理等が挙げられる。本実施形態では、血小板処理工程は、熱処理としての凍結融解処理により血小板の処理を行う。凍結融解処理は、血清調製装置１全体を−８０℃で６０分間凍結させ、その後３７℃まで昇温させ２０分間保持することを３回繰り返して行う。
血小板処理工程Ｓ６により、血小板の細胞膜が破壊され、血小板の中の細胞増殖因子が放出される。これによって、血小板又は血液の鮮度に拘らず、血小板が含有している全ての細胞増殖因子を得ることができる。
【００５１】
次いで、血小板処理工程Ｓ６を経た血液中の易熱性タンパク質を析出させる（以下、析出工程Ｓ７とする）。析出処理は、上記血小板処理工程Ｓ６を経た血漿貯留部１２を、加温処理することにより行われる。本実施形態において、加温処理は、５６℃で３０分間行われる。析出工程Ｓ７によって易熱性タンパク質だけではなく、補体も失活化させることが可能となる。補体を失活化させることにより、培養細胞への影響を軽減することが可能となる。
なお、析出工程Ｓ７における加温処理は血清調製装置１全体を加温してもよい。
【００５２】
次いで、析出工程Ｓ７により析出した易熱性タンパク質を除去する（以下、除去工程Ｓ８とする）。除去方法としては、ろ過、遠心分離又はこれらを組み合わせて行う方法等が挙げられる。本実施形態では、４４００（Ｇ）×６分間遠心分離を行う。遠心分離を行う際は、血清調製装置１全体を遠心分離機にかけることが好ましい。ろ過を行う場合には、図１中のチューブ４３の一部に、フィルターを予め組み込んでおけば、後述する第２移送工程を行いつつ、析出した易熱性タンパク質を除去することが可能となる。
【００５３】
次いで、上記除去工程Ｓ８により分離された血清を、成分収容部２０のそれぞれの袋体２１〜２６に移送する（第２移送工程Ｓ９）。移送方法は第１移送工程Ｓ４と同様に、血漿貯留部１２の外側に圧力をかけて、調製した血清を押し出す方法が好ましい。血清はそれぞれの袋体２１〜２６に、収容することができる。なお、調製した血清の量が少ない場合には、チューブ４４〜４７のいずれかをクランプ等で閉じて使用する袋体２１〜２６の数を調製してもよい。
【００５４】
成分収容部２０に血清を移送した後、チューブ５２〜５７を溶断及び溶着する（以下、第３溶断工程Ｓ１０とする）。この溶断及び溶着は、第１溶断工程Ｓ２と同様の方法を用いて行われる。
【００５５】
本実施形態によれば、採取された血液から血清を外気に触れさせることなく、無菌的に製造することが可能となる。これによって、採血から血清調製までの一連の工程を外気に触れることなく行うことが可能であるため、微生物による汚染のリスクを低減させることができる。
【００５６】
なお、本実施形態では、血小板処理工程Ｓ６における熱処理として、凍結融解処理の例を示した。しかしながら、本発明における熱処理は、凍結融解処理に制限されない。例えば、熱処理として加温処理を行っても、本発明の効果を達成することができる。血小板処理工程Ｓ６の加温処理は、例えば、血清調製装置１全体を５６℃で６０分間加温処理することにより行われる。これにより、血小板の細胞膜が破壊され、血小板の中の細胞増殖因子を得ることができる。また、血小板処理工程Ｓ６において、５６℃で６０分間の加温処理することにより、上記析出工程Ｓ７の工程を同時に行うことができる。これにより、血清調製工程の一連の工程の短縮化を図れる効果がある。
【００５７】
なお、本発明に係る血清調製装置は、ヒトの血液だけではなく、げっ歯類、家畜類、霊長類等の哺乳類の血液にも使用することが可能であるため、非ヒト用血液成分分離装置として使用することも可能である。
【００５８】
＜第４実施形態＞
図４及び図５は、本発明の第４実施形態に係る血清調製装置１Ａを示した図である。本実施形態においては、血液貯留部１０Ａが、全血貯留部と血漿貯留部とで構成されておらず、一つの袋体で構成されており、血液貯留部１０Ａが多血小板血漿を貯留する血漿貯留部１２Ａのみから構成されている点が、第３実施形態と異なる。
図４において、血漿貯留部１２Ａには、例えば成分献血で採取された多血小板血漿が貯留されることになる。この場合、チューブ４２Ａと血漿貯留部１２Ａは、始めは接続されていない。使用する際には、チューブ４２Ａを接続部７０に差込み、血漿貯留部１２Ａ側のチューブ４２Ａ’と連結する。なお、採血時に使用されていたチューブ４１Ａは、予め溶断されていることが好ましい。接続部７０としては、例えば挿入具の挿脱にともなって弁体のスリット状開口部が開閉する機能を有する気密性の高い混注ポート（日本国特許第３３８９９８３号等参照）を備えた構成が挙げられる。
なお、本実施形態において、図６に示すように、血漿貯留部１２Ａとチューブ４２Ａとが、接続部７０を介さず、予め一体的に接続されてなる構成であってもよい。
このような構成にすることによって、献血のように外部で採取された血液を使用することが可能となる。また、成分献血で採取された血液を使用することができるため、体調上の問題から全血を採取することができない患者でも血清を容易に調製することができる。なお、本実施形態におけるその他の構成は、第３実施形態に係る血清調製装置と同様であるためその他の部分についての説明は省略する。
【００５９】
＜第５実施形態＞
図７及び図８は、本発明の第５実施形態に係る血清調製装置１Ｂを示した図である。
本実施形態においては、血液貯留部１０Ｂが血漿貯留部１２Ｂのみから構成されており、この血漿貯留部１２Ｂに超音波を発生させる超音波発振子１３を収容可能な超音波発振子収容部１４が設けられている点が、第１実施形態と異なる。
【００６０】
超音波発振子収容部１４は、一端が閉鎖され他端が開放された筒状部材１５が、血漿貯留部１２Ｂの上縁部から、袋状に形成された本体部１２０Ｂの内部側に突出するように配置されて形成されている。筒状部材１５は、閉鎖された一端側が本体部１２０Ｂの内部側に突出するように配置される。
超音波発振子１３は、棒状であり、筒状部材１５の開放された一端側から中空部内に挿入される。即ち、本実施形態では、筒状部材１５の中空部が超音波発振子収容部１４を構成する。
【００６１】
筒状部材１５の中空部の形状は、超音波発振子１３の外形と略同一である。これにより、超音波発振子１３を超音波発振子収容部１４に収容した場合に、超音波発振子１３が筒状部材１５に密着する。
超音波発振子１３は、接続線を介して超音波発生装置本体１６に接続されており、この超音波発生装置本体１６に設けられたスイッチを作動させることにより、超音波を発振する。
【００６２】
以上のような構成とすることで、超音波発振子１３より発生する超音波を、本体部１２０Ｂの内部に収容された全血に直接負荷できる。これにより、効率的な血清調製操作が可能となる。その結果、血清調製操作にかかるエネルギー負荷を軽減でき、また、血清調製にかかる時間の短縮が可能となる。
また、超音波発振子収容部１４を、血漿貯留部１２Ｂの内部空間と外部空間とが隔絶された状態で接続できる。これにより、血漿貯留部１２Ｂの内部空間の無菌性を確保しつつ、血小板処理工程を行うことが可能となる。
【００６３】
更に、超音波発振子収容部１４を、血清調製装置１Ｂの血液貯留部１０Ｂとしての血漿貯留部１２Ｂに設ける構成としたことにより、血小板処理工程としての超音波処理に用いる超音波発振子１３を血清調製装置１Ｂに容易に着脱でき、血清調製操作が容易となる。また、小型の超音波発生装置を使用でき、血清調製装置１Ｂの省スペース化を図ることができる。
【実施例】
【００６４】
〔実施例１〜４、比較例１、参考例１及び２〕
血小板処理工程における、血小板の細胞膜を破壊する方法の検討を行った。
まず、全血から多血小板血漿を分離する。始めにヒト血液１０ｍｌに、ＣＰＤ液を１．４ｍｌ添加し、２０℃のもと３５００ｒｐｍで８分間遠心分離（遠心分離機：株式会社久保田製作所製）を行った。次いで、分離された血漿層とバフィーコート層を分離し、２０℃のもと８００ｒｐｍで８分間遠心分離を行い、上澄みを多血小板血漿として分離した。これを試験用の検体とした。
【００６５】
上記多血小板血漿をそれぞれ１ｍｌずつ容器に分与し、以下の処理を行った。なお、比較例１に記載の処理方法は、特許文献２（特許第３７８８４７９号）に記載の方法である。
（実施例１）−８０℃で１０分間凍結させ、その後３７℃で融解させる処理を３回実施
（実施例２）超音波処理を１５分間実施
（実施例３）超音波処理を３０分間実施
（実施例４）直径１ｍｍのガラスビーズを多数加えた容器の中で１０分間激しく撹拌する処理を実施
（比較例１）直径４ｍｍのガラスビーズ５個と２７．８ｗ／ｖ％の塩化カルシウムを１０μｌ添加し、３７℃で３０分間加温処理を実施
（参考例１）１４０００Ｇで１０分間遠心分離を１回実施
（参考例２）１４０００Ｇで１０分間遠心分離を３回実施
【００６６】
上記処理後、３５００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた上澄み（血清）について細胞増殖因子の定量を行った。その結果を表１に示す。
【表１】
【００６７】
実施例１の凍結融解処理を施したものや実施例４のガラスビーズを添加して撹拌する処理を施したものでは、従来の方法（比較例１）とほぼ同等の量の細胞増殖因子を得ることができた。一方、実施例２，３の超音波処理を施したものでは、ヒトの血清が有する細胞増殖因子の上限値に近い量の細胞増殖因子を得ることができた。
【００６８】
次いで、実施例２，３において、超音波の処理時間と血小板残存率（％）の関係を検討した。図９は、超音波処理時間と血小板数の関係（ｎ＝５）を示した図である。これより１５分間の超音波処理で殆どの血小板の細胞膜が破壊されることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】本発明の第３実施形態に係る血清調製装置を示した図である。
【図２】本発明の第３実施形態に係る血清調製装置による血液採取から血清保存に至るまでの手順を示す図である。
【図３】本発明の第３実施形態に係る血清調製装置の全血貯留部１１内で調製された多血小板血漿７１を血漿貯留部１２に導出する方法を示す断面図である。
【図４】本発明の第４実施形態に係る血清調製装置において、血漿貯留部が分離された状態を示した図である。
【図５】本発明の第４実施形態に係る血清調製装置において、血漿貯留部が接続された状態を示した図である。
【図６】本発明の第４実施形態に係る血清調製装置の変形例を示した図である。
【図７】本発明の第５実施形態に係る血清調製装置を示した図である。
【図８】図７の部分拡大図である。
【図９】実施例２及び３において、超音波処理時間と血小板残存率（％）の関係を示した図である。
【符号の説明】
【００７０】
１、１Ａ 血清調製装置
１０、１０Ａ 血液貯留部
１１ 全血貯留部
１１０ 本体部
１１０ａ 外縁部
１２ 血漿貯留部
２０ 成分収容部
２１〜２６ 袋体
３０ 採血針
４１〜４７，５１〜５７ チューブ
６１〜６６ 分岐体
７０ 接続部
７１ 多血小板血漿
８０ 加圧機
９０ クランプ
９１ 円板
９２ ベース
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも血小板を含有する血液から血清を調製する血清調製方法であって、
前記血液中の血小板の細胞膜を破壊する処理を行う血小板処理工程を有する血清調製方法。
【請求項２】
前記血小板処理工程は、前記血液に、熱処理、超音波処理、遠心分離処理、加圧・減圧処理又はガラスビーズによる混和・撹拌処理の少なくともいずれかの処理を行う工程である請求項１記載の血清調製方法。
【請求項３】
前記血液として、抗凝固処理が施された血液を用いる請求項１又は２記載の血清調製方法。
【請求項４】
前記血小板処理工程を経た血液中の易熱性タンパク質を析出させる析出工程を更に有する請求項１〜３のいずれかに記載の血清調製方法。
【請求項５】
前記析出工程により析出した前記易熱性タンパク質を除去する除去工程を更に有する請求項４記載の血清調製方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の血清調製方法により調製された血清。
【請求項７】
少なくとも血小板を含有する血液から血清を調製する血清調製装置であって、
前記血液を貯留する血液貯留部と、
該血液貯留部に無菌的かつ気密に連結され、前記血液貯留部に貯留された血液より分離された血清を収容する成分収容部と、を備える血清調製装置。
【請求項８】
前記血液貯留部は、全血を貯留する全血貯留部と、該全血貯留部に無菌的かつ気密に連結され、前記全血貯留部に貯留された全血より分離された多血小板血漿を貯留する血漿貯留部と、を備える請求項７記載の血清調製装置。
【請求項９】
前記血液貯留部は、多血小板血漿を貯留する血漿貯留部である請求項７記載の血清調製装置。
【請求項１０】
前記血液貯留部と前記成分収容部とは、これらを分離及び接続可能な接続部により接続される請求項７〜９のいずれかに記載の血清調製装置。
【請求項１】
少なくとも血小板を含有する血液から血清を調製する血清調製方法であって、
前記血液中の血小板の細胞膜を破壊する処理を行う血小板処理工程を有する血清調製方法。
【請求項２】
前記血小板処理工程は、前記血液に、熱処理、超音波処理、遠心分離処理、加圧・減圧処理又はガラスビーズによる混和・撹拌処理の少なくともいずれかの処理を行う工程である請求項１記載の血清調製方法。
【請求項３】
前記血液として、抗凝固処理が施された血液を用いる請求項１又は２記載の血清調製方法。
【請求項４】
前記血小板処理工程を経た血液中の易熱性タンパク質を析出させる析出工程を更に有する請求項１〜３のいずれかに記載の血清調製方法。
【請求項５】
前記析出工程により析出した前記易熱性タンパク質を除去する除去工程を更に有する請求項４記載の血清調製方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の血清調製方法により調製された血清。
【請求項７】
少なくとも血小板を含有する血液から血清を調製する血清調製装置であって、
前記血液を貯留する血液貯留部と、
該血液貯留部に無菌的かつ気密に連結され、前記血液貯留部に貯留された血液より分離された血清を収容する成分収容部と、を備える血清調製装置。
【請求項８】
前記血液貯留部は、全血を貯留する全血貯留部と、該全血貯留部に無菌的かつ気密に連結され、前記全血貯留部に貯留された全血より分離された多血小板血漿を貯留する血漿貯留部と、を備える請求項７記載の血清調製装置。
【請求項９】
前記血液貯留部は、多血小板血漿を貯留する血漿貯留部である請求項７記載の血清調製装置。
【請求項１０】
前記血液貯留部と前記成分収容部とは、これらを分離及び接続可能な接続部により接続される請求項７〜９のいずれかに記載の血清調製装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００８−２４６２００（Ｐ２００８−２４６２００Ａ）
【公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５５５４（Ｐ２００８−５５５５４）
【出願日】平成２０年３月５日（２００８．３．５）
【出願人】（０００１５３０３０）株式会社ジェイ・エム・エス (452)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月５日（２００８．３．５）
【出願人】（０００１５３０３０）株式会社ジェイ・エム・エス (452)
【Ｆターム（参考）】
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