血球溶解後のサイズ分離により血液から希少な目的細胞を回収する方法
【課題】本発明は、血液に含まれる希少な目的細胞を観察しやすくするために、血液に含まれる赤血球の数を減らすが、白血球および目的細胞の数は減らさずに目的細胞を回収する方法，該方法に用いるキットおよびシステムを提供することを目的とする。
【解決手段】(a) 赤血球の溶解剤を血液に添加することによって、溶血させる工程；および(b) 血液に含有される血球成分または該血球成分が崩壊したものを、その大きさに依存した分離手段を用いて分離する工程を含むことを特徴とする、血液から目的細胞を回収する方法。
【解決手段】(a) 赤血球の溶解剤を血液に添加することによって、溶血させる工程；および(b) 血液に含有される血球成分または該血球成分が崩壊したものを、その大きさに依存した分離手段を用いて分離する工程を含むことを特徴とする、血液から目的細胞を回収する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液から目的細胞を回収する方法，該方法に用いるキットおよびシステムに関する。さらに詳細には、赤血球を溶解し、濾過（サイズ分離）によって白血球および希少な目的細胞を回収する方法，該方法に用いるキットおよびシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍（がん）の診断の一つとして、または腫瘍が局在性か転移性かを識別するための方法として、血液検査が挙げられる。血中遊離癌細胞〔ＣＴＣ〕などの腫瘍細胞は、顕微鏡下での観察、すなわち検鏡によって形態から鑑別されるが、病期（ステージ）に関わらず、がん患者から採取した血液10ｍＬ当りに含まれる腫瘍細胞は10個程度と極めて少ない。
【０００３】
血液などの細胞懸濁液を、フィルタを用いて濾過する方法は多数の文献に記載されており、例えば特許文献１には、ＣＴＣ検査の前処理として、約5μｍ〜約12μｍの孔径を有するパリレン基板を含むメンブレンフィルタを用いて血液を濾過する方法が開示されている。しかしながら、例えば直径が約11μｍのＣＴＣが存在している場合、このＣＴＣを濾過で失う虞がある。また、濾過した際の目詰まりを防止するため、血液を希釈し、かつ遅い速度(流速)での濾過を必要とするため、検査に必要な10ｍＬ程度の血液を濾過する場合、多大な時間を要することがある。
【０００４】
他方、特許文献２には、ＣＴＣ検査の前処理として、赤血球の溶解剤を用いて赤血球を溶解させる旨記載されている。しかしながら、赤血球を溶解すると、赤血球に由来する細胞の断片が生じて、観察の妨げになる場合がある。さらに、溶解後に細胞を洗浄することによって目的細胞をロス（損失）する虞がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００８−５３８５０９号公報
【特許文献２】特表２００９−５２５４６８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、血液に含まれる希少な目的細胞を観察しやすくするために、血液に含まれる赤血球の数を減らすが、白血球および目的細胞の数は極力減らさずに目的細胞を回収する方法，該方法に用いるキットおよびシステムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究した結果、血液中の赤血球を溶解した後に濾過することによって、フィルタが目詰まりすることも、血液を希釈することもなく、目的細胞をロスする虞のある洗浄操作を必須とせず、赤血球数／白血球数の比率を高くても１〜１０程度にできることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明の、血液から目的細胞を回収する方法は、
(a) 赤血球の溶解剤を血液に添加することによって、溶血させる工程；および
(b) 血液に含有される血球成分または該血球成分が崩壊したものを、その大きさに依存した分離手段を用いて分離する工程；を含むことを特徴とする。
【０００９】
上記工程(a)の後に上記工程(b)を実施しても、上記工程(b)の後に上記工程(a)を実施しても、上記工程(a)と上記工程(b)とを同時に実施してもよい。
上記工程(b)の分離を、濾紙状フィルタを用いて行ってもよく、該濾紙状フィルタの孔径は、０．４μｍ以上５μｍ以下であることが好ましい。
【００１０】
また、上記工程(b)の分離を、流路状フィルタを用いて行ってもよく、該流路状フィルタは、図１に示すように、分岐(10)に血液を供給する流入チャネル(9)と、血液に含有される血球成分または該血球成分が崩壊したものを有する流体を分岐(10)から離して導出する第一排出チャネル(11)と、目的細胞を有する流体を分岐(10)から離して導出する第二排出チャネル(12)とを含む、流動チャネル(3)を備え、目的細胞が第二排出チャネル(12)の中で第一排出チャネル(11)の中よりもはるかに速く流れ、かつ、第一排出チャネル(11)の内径が０．４μｍ以上５μｍ以下であることが好ましい。
【００１１】
上記溶解剤は、塩化アンモニウムであっても、アミンであっても、界面活性剤であってもよく、該界面活性剤は、ノニオン（非イオン）性界面活性剤であることが好ましい。
上記目的細胞は、血中遊離癌細胞〔ＣＴＣ〕であることが好ましい。
【００１２】
上記方法によって得られた細胞を観察し、目的細胞を検査する工程をさらに含むことが好ましい。
本発明の白血球観察用キットは、上記濾紙状フィルタまたは上記流路状フィルタと、上記の赤血球の溶解剤とを含み、本発明の方法に用いられることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明の、観察の前処理用システムは、上記濾紙状フィルタまたは上記流路状フィルタを用いた分離手段と、上記の赤血球の溶解剤の添加手段とを含み、本発明の方法に用いられることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、血液に含まれる赤血球の数を減らしながらも、白血球および目的細胞の数は極力減らさずに、血液に含まれる希少な目的細胞を観察しやすくすることが可能な目的細胞の回収を行うことができる。
【００１５】
特に、赤血球を溶解する溶血工程と、血球成分または該血球成分が崩壊したものを大きさで分離するサイズ分離工程とを、同時またはその順に実施する場合には、赤血球を溶解し、洗浄を行わずに、濾過（サイズ分離）によって白血球および希少な目的細胞と、赤血球の断片および溶け残った赤血球とを分離することができる。濾過に濾紙状フィルタを用いる（赤血球をフィルタ濾液中に除去、白血球をフィルタ上に回収できる）場合であっても、この代替として流路状フィルタを用いる（濾過分級を行い、白血球をトラップまたは懸濁液として回収できる)場合であってもよい。
【００１６】
赤血球の溶解後に濾過を行うと、血液を希釈する必要がなく（目的細胞の濃度が下がることがない。）、かつ速く濾過できることから、大量の血液を短時間に処理することができる。
【００１７】
洗浄工程をサイズ分離工程に置き換えることにより、白血球の損失（ロス）を軽減し、不要な残存物を濾過で除去することができる。
また、サイズ分離工程後に溶血工程を実施する場合には、分離の際のサイズをやや大き目に設定でき、それにより分離の際に生じる目的細胞へのダメージを低減できると共に、その後の溶血工程における赤血球の溶解反応の阻害因子（例えば、血漿中に含まれる崩壊した赤血球などの不要細胞）を除去できる点においてさらに有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、特許第４００５０２２号公報に記載の図１であり、流路状フィルタを最も単純化した態様のマイクロ流路デバイスの概略図を示す。血液を分岐(10)に導入すると、白血球は第二排出チャネル(12)に、血球成分または該血球成分が崩壊したものは第一排出チャネル(11)に分離される。
【図２】図２は、実施例４，５および比較例４で用いた、流路状フィルタの一態様であるマイクロ流路デバイスの概略図を示す。図中の数字の単位はμｍである。分岐流路としてoutlet2〜4に繋がるものを各10本、outlet5に繋がるものを100本設けた。inlet1からＰＢＳで10倍に希釈した血液を、inlet2からＰＢＳをそれぞれ連続的に導入すると、outlet5からは平均直径7μｍ未満の赤血球および血小板が、outlet4からは7〜10μｍの白血球が、outlet3からは10〜17μｍの白血球が、outlet2からは17〜30μｍの白血球が、outlet1からは30μｍ以上の白血球が主に含まれる液をそれぞれ流出するように設計されている。
【図３】図３は、図１，２に示したマイクロ流路デバイスにおける、水力学的濾過法の基本的な原理を説明するための模式図を示す。
【図４】図４は、実施例３の工程(b)において、濾紙状フィルタをクランプ[2]とサポートスクリーン[3]との間に挟んだ状態で濾過する際に用いる各部品の構成を模式的に示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
次に、本発明の、血液から目的細胞を回収する方法，該方法に用いるキットおよびシステムについて詳細に説明する。
＜血液から目的細胞を回収する方法＞
本発明の工程(a)において、赤血球の溶解剤を血液に添加し溶血させると、溶解後の赤血球の（溶け残り）断片や小さくなった赤血球（赤血球デブリ）、溶けなかった赤血球が残存する場合がある。従来、これらの不要な残存物を洗浄（洗浄液を添加し遠心分離した後、不要な残存物を上清として廃棄して、白血球を沈殿として再懸濁して回収する。）によって除去していた。しかしながら、洗浄による除去において、廃棄した上清に白血球が含まれたり（ロス）、下層に赤血球が沈んで残存したり（混入）していた。
【００２０】
本発明の、血液から目的細胞を回収する方法は、上記の洗浄するという工程（操作）が不要であって、下記工程(a)および(b)を含むことを特徴とし、好ましくはさらに下記工程(c)を含み、白血球の損失（ロス）を低減する方法である。
【００２１】
(a) 赤血球の溶解剤を血液に添加することによって、溶血させる工程。
(b) 血液に含有される血球成分または該血球成分が崩壊したものを、その大きさに依存した分離手段を用いて分離する工程。
【００２２】
(c) 工程(a)および(b)（すなわち、本発明の、血液から目的細胞を回収する方法）を実施したことによって得られた細胞集団を観察し、目的細胞を検査する工程。
ここで、「検査」とは、単に目的細胞の有無を調べること、細胞種を同定することなどを含むものである。
【００２３】
本発明は、目的細胞を検査するための前処理とも位置付けられる。まず、前処理後の懸濁液に含まれるすべての細胞を観察する必要があるため、赤血球の数を減らし、白血球の数を維持すること（すなわち赤血球数／白血球数の比率を下げること）が望ましい。
【００２４】
本発明において、工程(a)の後に工程(b)を実施しても、工程(b)の後に工程(a)を実施しても、工程(a)と工程(b)とを同時に実施してもよい。いずれの場合であっても工程(c)は最後に実施する。すなわち、本発明の、血液から目的細胞を回収する方法は、下記の第一の態様，第二の態様および第三の態様が含まれる。
【００２５】
［第一の態様］
第一の態様としては、工程(a)の後に工程(b)を実施し、最後に工程(c)を実施する態様である。
【００２６】
第一の態様を具体的に説明すると、まず、血液に、赤血球の溶解剤を添加し、溶血させる。次に、赤血球の溶解剤で崩壊しなかった白血球や血中遊離癌細胞〔ＣＴＣ〕および赤血球（赤血球はすべて崩壊し、存在しない場合もある。）等の血球成分と、赤血球の溶解剤で崩壊した血球成分（赤血球が崩壊したものであるが、赤血球以外の血球成分が崩壊したものも含まれる場合がある。）とをその大きさに依存して、例えば濾紙状フィルタ等を用いて分離するか、または、例えば流路状フィルタ等を用いて分離する。最後に、このようにして得られた細胞集団を、例えば顕微鏡等で観察し、例えばＣＴＣ等の目的細胞を検査する態様である。
【００２７】
［第二の態様］
第二の態様としては、工程(b)の後に工程(a)を実施し、最後に工程(c)を実施する態様である。
【００２８】
第二の態様を具体的に説明すると、まず、血液そのまま、または、適切な緩衝液で希釈した血液を、白血球やＣＴＣと赤血球との大きさに依存して、例えば濾紙状フィルタ等を用いて分離するか、あるいは、例えば流路状フィルタ等を用いて分離する。次に、濾紙状フィルタ上の白血球やＣＴＣ、あるいは、流路状フィルタで分離された白血球やＣＴＣを含有する血液に、赤血球の溶解剤を添加し、溶血させる（おもに、残留した赤血球のみを崩壊させる）。最後に、このようにして得られた細胞集団を、例えば顕微鏡等で観察し、例えばＣＴＣ等の目的細胞を検査する態様である。
【００２９】
［第三の態様］
第三の態様としては、工程(a)と工程(b)とを同時に実施し、最後に工程(c)を実施する態様である。
【００３０】
第三の態様を具体的に説明すると、まず、血液（適切な緩衝液で希釈した血液でもよい。）と赤血球の溶解剤とをそれぞれ濾紙状フィルタ上に滴下する。該血液に含まれる、該フィルタの孔径より小さいもの（例えば、血小板など）が濾過されつつ、該フィルタ上で赤血球が溶解すると同時に赤血球デブリが濾過される。あるいは、図１に示すように、マイクロ流路デバイスのinlet1および2から、それぞれ血液（適切な緩衝液で希釈した血液でもよい。）および赤血球の溶解剤を連続的に導入し、溶解と分離とを同時に行う。次に、このようにして得られた細胞集団を、例えば顕微鏡等で観察し、例えばＣＴＣ等の目的細胞を検査する態様である。
【００３１】
［フィルタ］
上記工程(b)の分離を、濾紙状フィルタを用いて行ってもよく、流路状フィルタを用いて行ってもよい。
【００３２】
濾紙状フィルタの孔径は、０．４μｍ以上５μｍ以下であることが好ましい。このような濾紙状フィルタとしては、例えば、ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）製の「ニュークリポアメンブレン（商標）」シリーズの（ＰＣ ＭＢ 25ｍｍ 3.0μｍ）や（ＰＣ ＭＢ 25ｍｍ 5.0μｍ）等が好適である。
【００３３】
流路状フィルタは、図１に示すように、分岐(10)に血液を供給する流入チャネル(9)と、血液に含有される血球成分または該血球成分が崩壊したものを有する流体を分岐(10)から離して導出する第一排出チャネル(11)と、目的細胞を有する流体を分岐(10)から離して導出する第二排出チャネル(12)とを含む、流動チャネル(3)を備え、目的細胞が第二排出チャネル(12)の中で第一排出チャネル(11)の中よりもはるかに速く流れ、かつ、第一排出チャネル(11)の内径は０．４μｍ以上５μｍ以下であることが好ましい。本発明で用いる流路上フィルタとして、図２に示すようなマイクロ流路デバイスを用いることがより好ましく、例えば、「ミューセルソーター（商標）」（（株）アドバンス製）などが好適である。
【００３４】
これらフィルタの孔径または内径が上記範囲内であると、赤血球の溶解剤によって崩壊した血球成分（おもに赤血球デブリ）のみを濾過し、崩壊しなかった血球成分は濾過しないため好適である。
【００３５】
このマイクロ流路デバイスにおける水力学的濾過法の基本的な原理は、例えば、松田ら「水理学的濾過法を用いた血液細胞の分級」（電学論Ｅ，128巻10号，2008年）に記載されており、そこからの引用である図２を用いて簡単に説明する。図２(a) において、途中に分岐点を有する流路に、下方のinlet（入口）から連続的に粒子懸濁液が導入されている（図中の斜線は、分岐流路に導入される流体部分を示す）。このとき、粒子ａのように分岐流路への流量等によって定まる境界線Ａよりも分岐流路側（図中右側）にその中心がある粒子は、分岐流路に導入されるが、粒子ｂや粒子ｃのようにその中心が境界線Ａよりも左側にある場合は、分岐流路には導入されない。このような原理に基づいて作製した流路を図２(b) に示す。ここでは、outlet（出口）を多数、inlet（入口）を２つ設け、inletの一方（図下部左側）から、粒子を含まない液体（組成は粒子懸濁液の連続相と同様）を導入し、分岐流路を有する壁（図中右側）の近傍を粒子が流れるようにする。さらに、図中領域ｄに、一定の大きさ以上の粒子が導入されないように調整された分岐流路を複数設けると、一定の大きさ以上の粒子は徐々に右側の流路壁に引き寄せられ、最終的には壁側に整列するようになる。そして、下流（図中領域ｅ）において、小さな粒子から順に排出されるように分岐流路を少しずつ太くまたは短くすることで、粒子は大きさにより分離され、同時に濃縮することが可能となる。
【００３６】
［赤血球の溶解剤］
本発明で用いる赤血球の溶解剤としては、公知の各種の溶解剤を用いることができるが、塩化アンモニウムであっても、アミンであっても、界面活性剤であってもよく、または、塩化アンモニウムもしくはアミンと界面活性剤とを併用してもよい。
【００３７】
赤血球の溶解剤が塩化アンモニウムである場合、生成したアンモニウムイオンが、赤血球の膜表面に浸透圧の差を引き起こし、赤血球の細胞外の水が半透膜である細胞膜を通過して赤血球内に流れ込み、赤血球を破裂（崩壊）させるものであり、例えば、日本ベクトン・ディッキンソン（株）製の「PharmLyse（商標）」（塩化アンモニウムをベースとした10倍濃縮の緩衝液）などの市販品を用いることができる。「PharmLyse」の製造会社によると、「PharmLyse」を10倍に希釈して、赤血球が懸濁した溶液に添加（例えば、10倍希釈した「PharmLyse」1ｍＬを、全血100μＬに添加等）し、穏やかに撹拌した後、室温（20〜25℃）で15分間、暗所で反応させることが推奨されている。
【００３８】
赤血球の溶解剤がアミンである場合、赤血球を崩壊させる作用機序は塩化アンモニウムの場合と類似しているが、アンモニウムイオンを生成することがないことからｐＨ変化を引き起こさず、塩化アンモニウムを用いた場合と比べ緩やかに溶血する。アミンの市販品としては、例えば、ベックマンコールター（株）製の「VersaLyse（商標）」（活性を有する主成分は環状アミンであり、環状アミンが赤血球に存在する炭酸脱水酵素に接触すると、赤血球に対して高い溶解性を示す化合物に変換される。）などが挙げられる。「VersaLyse」の製造会社によると、白血球5×105個/100μＬ（赤血球6×108個/100μＬ）に対して「VersaLyse」1ｍＬを添加し、室温（18〜25℃）で少なくとも10分間、暗所で反応させることが推奨されている。
【００３９】
赤血球の溶解剤が界面活性剤である場合、ノニオン（非イオン）性界面活性剤であることが好ましい。ノニオン性界面活性剤としては、例えば、ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）製の「Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（商標）」や「ＴＷＥＥＮ ２０（商標）」等の一般的な市販試薬が挙げられる。
【００４０】
用いる赤血球の溶解剤の種類（赤血球の溶解の度合いの強さ）、濃度および反応時間を適宜調整することによって、所望の態様で赤血球を溶解することができる。例えば、同程度の溶解の度合いの強さを有する溶解剤を用いるにしても、比較的薄い濃度で反応時間を長くする場合と、比較的濃い濃度で反応時間を短くする場合のいずれかで、分離の際に用いるフィルタに依存することなく、回収後の赤血球数／白血球数の比率を下げる（具体的には１〜10程度の比率とする）ことができる。例えば、流路型フィルタで分離する等のような濾過に時間を要する場合、赤血球を赤血球の溶解剤と接触させた状態で流下させることで、分離されるまでの間に溶解処理が行われるようにすることができる。血液に赤血球の溶解剤を添加したものを流路に導入してもよいし、赤血球の溶解剤を別の流路から導入して赤血球と接触させてもよい。
【００４１】
［目的細胞］
目的細胞としては、血液に含まれる希少な細胞であることが好ましく、血中遊離癌細胞〔ＣＴＣ〕であることが特に好ましい。
【００４２】
血液中の、白血球数に対する赤血球の比率、すなわち(赤血球の数)／(白血球の数)は、103オーダー（約1000〜2000）である。より具体的なデータを下表に示す。
【００４３】
【表１】
ＣＴＣの直径は、例えばClin Cancer Res. 2004 Dec 15;10(24):8152-62などＣＴＣに関する多くの報告において記載されており、平均として約20μmである。
【００４４】
従って、ＣＴＣは血液中に含まれる白血球の多くと同程度の直径であるため、白血球の多くをその数を極力減らさずに回収することにより、目的細胞としたＣＴＣがロス（損失）してしまうことを防止することができる。
【００４５】
＜白血球観察用キット＞
本発明の白血球観察用キットは、上記濾紙状フィルタまたは上記流路状フィルタと、上記の赤血球の溶解剤とを含み、本発明の、血液から目的細胞を回収する方法に用いられることを特徴とする。
【００４６】
例えば、本発明の白血球観察用キットと被験者から採取した血液とを用いることによって、ＣＴＣを高精度で検出することができる。この結果から、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌（上皮内癌）の存在も高精度で予測することができる。
【００４７】
このようなキットとしては、具体的に、フィルタや溶解剤の他に、血液を希釈する適切な緩衝液や本発明の方法を実施するために必要とされる各種器材または資材や装置を含めることもできる。
【００４８】
＜観察の前処理用システム＞
また、本発明の、観察の前処理用システムは、上記濾紙状フィルタまたは上記流路状フィルタを用いた分離手段と、上記の赤血球の溶解剤の添加手段とを含み、本発明の方法に用いられることを特徴とする。
【実施例】
【００４９】
次に、本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
［実施例１］
まず工程(a)として、市販の血液（コージンバイオ（株）製の「正常ヒト全血液・B型」）100μＬが入ったチューブに、溶解剤として蒸留水で10倍希釈した「PharmLyse（商標）」（日本ベクトン・ディッキンソン（株）製）1ｍＬを加えた。そして、穏やかに撹拌した後、暗所にて15分間、室温で静置した。
【００５０】
次に工程(b)として、孔径0.4μｍの濾紙状フィルタ（ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）製の「ニュークリポアメンブレン（ＰＣ ＭＢ 25ｍｍ 0.4μｍ）（商標）」）を用いて全量を濾過した。
【００５１】
濾紙状フィルタを顕微鏡で観察し、白血球数および赤血球数を計測し、処理前の細胞数に対する処理後の細胞数の割合を回収率として、白血球および赤血球の回収率を算出した。目的細胞(ＣＴＣ、実施例および比較例では白血球)の回収率が高く、不要な細胞(主に赤血球)の回収率が低いことが望ましい。不要な細胞については、回収率の低さが、除去した細胞の割合の高さを示している。その結果を表２に示す。
【００５２】
なお、市販の血液は、採血してから2〜4週間程度の時間が経過したものであるから、赤血球・白血球の数は、表１に記載の数より若干少なくなっているものと考えられる。
［実施例２］
実施例１において、工程(b)で用いた濾紙状フィルタの孔径を2μｍに変更した（すなわち、濾紙状フィルタとして、ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）製の「ニュークリポアメンブレン（ＰＣ ＭＢ 25ｍｍ 2μｍ）」を用いた）以外は実施例１と同様にして該濾紙状フィルタを顕微鏡で観察し、白血球数および赤血球数を計測し、白血球および赤血球の回収率を算出した。その結果を表２に示す。
【００５３】
［実施例３］
まず工程(b)として、市販の血液（コージンバイオ（株）製の「正常ヒト全血液・B型」）100μＬを、孔径2μｍの濾紙状フィルタである「ニュークリポアメンブレン（ＰＣ ＭＢ 25ｍｍ 2μｍ）」を、図４に示すように、アドバンテック東洋（株）製の「サポートスクリーン19310004」([3])の上に載せ、「クランプ19311003」([2])により挟んで固定した状態で濾過した。
【００５４】
次に工程(a)として、その濾紙状フィルタに、蒸留水で10倍希釈した「PharmLyse」を1ｍＬ滴下し、該PharmLyseがその濾紙状フィルタ表面全体に行き渡るように、該フィルタを穏やかに「ポリマックス1040 5度（商標）」（Heidolph（株）製）を用いて振盪させた。その後、暗所にて15分間、室温で静置した。
【００５５】
濾紙状フィルタを顕微鏡で観察し、白血球数および赤血球数を計測し、白血球および赤血球の回収率を算出した。その結果を表２に示す。
［実施例４］
まず工程(a)として、市販の血液20μＬが入ったチューブに、蒸留水で10倍希釈した「PharmLyse（商標）」（日本ベクトン・ディッキンソン（株）製）200μＬを加えた。そして、穏やかに撹拌した後、暗所にて15分間、室温で静置した。
【００５６】
次に工程(b)として、工程(ａ)で得られた細胞懸濁液をさらにＰＢＳで5倍希釈して、「ミューセルソーター」（（株）アドバンス製）を用いて分離した。この「ミューセルソーター（表中では「μセルソーター」と簡略表記する。）」は、図１に示すマイクロ流路デバイスと基本構造は同じである。inletに検体を導入してから、outletで細胞を回収するまでの時間（すなわち反応時間）は、45分間であった。
【００５７】
Outlet1〜4（図１に示す。）から回収した液をそれぞれ顕微鏡で観察し、白血球数および赤血球数を計測し、白血球および赤血球の回収率を算出した。その結果を表２に示す。
［実施例５］
工程(b)として、市販の血液20μＬをＰＢＳで50倍希釈（全量：1ｍＬ）して「ミューセルソーター」のinletに導入すると同時に、工程(a)として、蒸留水で10倍希釈した「PharmLyse」1ｍＬを、もう一方のinletから流路に流し、「ミューセルソーター」で分離した。inletに検体を導入してから、outletで細胞を回収するまでの時間（すなわち反応時間）は、50分間であった。
【００５８】
Outlet1〜4（図１に示す。）から回収した液をそれぞれ顕微鏡で観察し、白血球数および赤血球数を計測し、白血球の回収率および赤血球の除去率を算出した。その結果を表２に示す。
【００５９】
［実施例６］
実施例１において、工程(a)で用いた溶解剤を「VersaLyse（商標）」（ベックマンコールター（株）製）に変更し、暗所での反応時間を15分間から10分間に短縮し、工程(b)で用いた濾紙状フィルタの孔径を2μｍに変更した以外は実施例１と同様にして該濾紙状フィルタを顕微鏡で観察し、白血球数および赤血球数を計測し、白血球および赤血球の回収率を算出した。その結果を表２に示す。
【００６０】
［実施例７］
実施例１において、工程(a)で用いた溶解剤を、０．０５％「Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（商標）」（ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）製）および０．０００１％「ＴＷＥＥＮ ２０（商標）」（ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）製）に変更し、反応時間を15分間から30秒間に短縮し、工程(b)で用いた濾紙状フィルタの孔径を2μｍに変更した以外は実施例１と同様にして該濾紙状フィルタを顕微鏡で観察し、白血球数および赤血球数を計測し、白血球および赤血球の回収率を算出した。その結果を表２に示す。
【００６１】
なお、以上の実施例１〜７においては、いずれも希釈や洗浄を行っていないが、本発明に係る工程(a)および工程(b)に加えて、さらに希釈や洗浄を行っても本発明の効果が得られることは勿論である。例えば、白血球の沈殿または懸濁液に洗浄液としてＰＢＳを加え、遠心分離後の上清に白血球が含まれない程度に、充分な遠心分離を行い、遠心分離後の上清を廃棄することで洗浄工程を行うことができる。また、例えば、工程(a)の後に、洗浄による遠心分離後の上清を廃棄せず、この上清と白血球の沈殿あるいは白血球の沈殿を再懸濁したものとのそれぞれに対して、工程(b)の分離を別々に行って、それらを回収するようにすることもできる。
【００６２】
［比較例１］
実施例１において、工程(b)の代わりに洗浄工程を実施した。すなわち、
まず工程(a)として、市販の血液100μＬが入ったチューブに、蒸留水で10倍希釈した「PharmLyse」1ｍＬを加えた。そして、穏やかに撹拌した後、暗所にて15分間、室温で静置した。
【００６３】
次に洗浄工程として、そのチューブを室温で5分間遠心分離（200×g）し上清を捨て、ＰＢＳを2ｍＬ加えた。そして、室温で5分間遠心分離（200×g）し上清を捨てた。
最後にＰＢＳを1ｍＬ加えて懸濁した。適切な濃度に希釈して血球計算盤で観察し、白血球数および赤血球数を計測し、白血球および赤血球の回収率を算出した。その結果を表２に示す。
【００６４】
［比較例２］
比較例１において、「PharmLyse」の代わりにベックマンコールター（株）製の「VersaLyse」を用いて、暗所での反応時間を15分間から10分間に短縮した以外は比較例１と同様にして、適切な濃度に希釈した細胞を血球計算盤で観察し、白血球数および赤血球数を計測し、白血球および赤血球の回収率を算出した。その結果を表２に示す。
【００６５】
［比較例３］
実施例３において、工程(a)を実施しなかった。ただし、市販の血液を適切な濃度となるようにＰＢＳで希釈し、フィルタの孔径を8μｍに変更した。すなわち、
工程(b)として、市販の血液を適切な濃度に希釈した後、孔径8μmの濾紙状フィルタ（ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）製の「ニュークリポアメンブレン（ＰＣ ＭＢ 25ｍｍ 8.0μｍ）」）により濾過した。
【００６６】
その濾紙状フィルタを顕微鏡で観察し、白血球数および赤血球数を計測し、白血球の回収率および赤血球の除去率を算出した。その結果を表２に示す。
［比較例４］
実施例４において、工程(a)を実施しなかった。すなわち、
工程(b)として、市販の血液20μＬをＰＢＳで50倍希釈して「ミューセルソーター」のinletに導入し分離した。inletに検体を導入してから、outletで細胞を回収するまでの時間（すなわち反応時間）は、60分であった。
【００６７】
Outlet1〜4（図１に示す。）から回収した液をそれぞれ顕微鏡で観察し、白血球数および赤血球数を計測し、白血球および赤血球の回収率を算出した。その結果を表２に示す。
【００６８】
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明の、血液から目的細胞を回収する方法を用いて、被験者から採血した血液（10ｍＬ）から回収した細胞を観察した場合、赤血球数／白血球数の比率を１〜10程度にできることから、例えばＣＴＣなどの数が少ない細胞を効率良く検査することができる。
【符号の説明】
【００７０】
１・・・マイクロ流路デバイス
３・・・流動チャネル
８・・・入口
９・・・流入チャネル
１０・・・分岐
１１・・・第一排出チャネル
１２・・・第二排出チャネル
１４・・・出口
１５・・・出口
１６・・・穿孔
ａ・・・境界線Ａよりも分岐流路側（図中右側）に中心がある、小さい粒子
ｂ・・・境界線Ａよりも左側に中心がある、大きい粒子
ｃ・・・境界線Ａよりも左側に中心がある、小さい粒子
ｄ・・・一定の大きさ以上の粒子が導入されないように調整された分岐流路を複数設けた領域
ｅ・・・上流から下流にかけて小さな粒子から順に排出されるように分岐流路を少しずつ太くまたは短くして複数設けた領域
[1]・・・ファンネル
[2]・・・クランプ
[3]・・・サポートスクリーン
[4]・・・ＰＴＦＥ製ガスケット
[5]・・・リングプレート
[6]・・・ベース
[7]・・・ゴム栓
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液から目的細胞を回収する方法，該方法に用いるキットおよびシステムに関する。さらに詳細には、赤血球を溶解し、濾過（サイズ分離）によって白血球および希少な目的細胞を回収する方法，該方法に用いるキットおよびシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍（がん）の診断の一つとして、または腫瘍が局在性か転移性かを識別するための方法として、血液検査が挙げられる。血中遊離癌細胞〔ＣＴＣ〕などの腫瘍細胞は、顕微鏡下での観察、すなわち検鏡によって形態から鑑別されるが、病期（ステージ）に関わらず、がん患者から採取した血液10ｍＬ当りに含まれる腫瘍細胞は10個程度と極めて少ない。
【０００３】
血液などの細胞懸濁液を、フィルタを用いて濾過する方法は多数の文献に記載されており、例えば特許文献１には、ＣＴＣ検査の前処理として、約5μｍ〜約12μｍの孔径を有するパリレン基板を含むメンブレンフィルタを用いて血液を濾過する方法が開示されている。しかしながら、例えば直径が約11μｍのＣＴＣが存在している場合、このＣＴＣを濾過で失う虞がある。また、濾過した際の目詰まりを防止するため、血液を希釈し、かつ遅い速度(流速)での濾過を必要とするため、検査に必要な10ｍＬ程度の血液を濾過する場合、多大な時間を要することがある。
【０００４】
他方、特許文献２には、ＣＴＣ検査の前処理として、赤血球の溶解剤を用いて赤血球を溶解させる旨記載されている。しかしながら、赤血球を溶解すると、赤血球に由来する細胞の断片が生じて、観察の妨げになる場合がある。さらに、溶解後に細胞を洗浄することによって目的細胞をロス（損失）する虞がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００８−５３８５０９号公報
【特許文献２】特表２００９−５２５４６８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、血液に含まれる希少な目的細胞を観察しやすくするために、血液に含まれる赤血球の数を減らすが、白血球および目的細胞の数は極力減らさずに目的細胞を回収する方法，該方法に用いるキットおよびシステムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究した結果、血液中の赤血球を溶解した後に濾過することによって、フィルタが目詰まりすることも、血液を希釈することもなく、目的細胞をロスする虞のある洗浄操作を必須とせず、赤血球数／白血球数の比率を高くても１〜１０程度にできることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明の、血液から目的細胞を回収する方法は、
(a) 赤血球の溶解剤を血液に添加することによって、溶血させる工程；および
(b) 血液に含有される血球成分または該血球成分が崩壊したものを、その大きさに依存した分離手段を用いて分離する工程；を含むことを特徴とする。
【０００９】
上記工程(a)の後に上記工程(b)を実施しても、上記工程(b)の後に上記工程(a)を実施しても、上記工程(a)と上記工程(b)とを同時に実施してもよい。
上記工程(b)の分離を、濾紙状フィルタを用いて行ってもよく、該濾紙状フィルタの孔径は、０．４μｍ以上５μｍ以下であることが好ましい。
【００１０】
また、上記工程(b)の分離を、流路状フィルタを用いて行ってもよく、該流路状フィルタは、図１に示すように、分岐(10)に血液を供給する流入チャネル(9)と、血液に含有される血球成分または該血球成分が崩壊したものを有する流体を分岐(10)から離して導出する第一排出チャネル(11)と、目的細胞を有する流体を分岐(10)から離して導出する第二排出チャネル(12)とを含む、流動チャネル(3)を備え、目的細胞が第二排出チャネル(12)の中で第一排出チャネル(11)の中よりもはるかに速く流れ、かつ、第一排出チャネル(11)の内径が０．４μｍ以上５μｍ以下であることが好ましい。
【００１１】
上記溶解剤は、塩化アンモニウムであっても、アミンであっても、界面活性剤であってもよく、該界面活性剤は、ノニオン（非イオン）性界面活性剤であることが好ましい。
上記目的細胞は、血中遊離癌細胞〔ＣＴＣ〕であることが好ましい。
【００１２】
上記方法によって得られた細胞を観察し、目的細胞を検査する工程をさらに含むことが好ましい。
本発明の白血球観察用キットは、上記濾紙状フィルタまたは上記流路状フィルタと、上記の赤血球の溶解剤とを含み、本発明の方法に用いられることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明の、観察の前処理用システムは、上記濾紙状フィルタまたは上記流路状フィルタを用いた分離手段と、上記の赤血球の溶解剤の添加手段とを含み、本発明の方法に用いられることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、血液に含まれる赤血球の数を減らしながらも、白血球および目的細胞の数は極力減らさずに、血液に含まれる希少な目的細胞を観察しやすくすることが可能な目的細胞の回収を行うことができる。
【００１５】
特に、赤血球を溶解する溶血工程と、血球成分または該血球成分が崩壊したものを大きさで分離するサイズ分離工程とを、同時またはその順に実施する場合には、赤血球を溶解し、洗浄を行わずに、濾過（サイズ分離）によって白血球および希少な目的細胞と、赤血球の断片および溶け残った赤血球とを分離することができる。濾過に濾紙状フィルタを用いる（赤血球をフィルタ濾液中に除去、白血球をフィルタ上に回収できる）場合であっても、この代替として流路状フィルタを用いる（濾過分級を行い、白血球をトラップまたは懸濁液として回収できる)場合であってもよい。
【００１６】
赤血球の溶解後に濾過を行うと、血液を希釈する必要がなく（目的細胞の濃度が下がることがない。）、かつ速く濾過できることから、大量の血液を短時間に処理することができる。
【００１７】
洗浄工程をサイズ分離工程に置き換えることにより、白血球の損失（ロス）を軽減し、不要な残存物を濾過で除去することができる。
また、サイズ分離工程後に溶血工程を実施する場合には、分離の際のサイズをやや大き目に設定でき、それにより分離の際に生じる目的細胞へのダメージを低減できると共に、その後の溶血工程における赤血球の溶解反応の阻害因子（例えば、血漿中に含まれる崩壊した赤血球などの不要細胞）を除去できる点においてさらに有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、特許第４００５０２２号公報に記載の図１であり、流路状フィルタを最も単純化した態様のマイクロ流路デバイスの概略図を示す。血液を分岐(10)に導入すると、白血球は第二排出チャネル(12)に、血球成分または該血球成分が崩壊したものは第一排出チャネル(11)に分離される。
【図２】図２は、実施例４，５および比較例４で用いた、流路状フィルタの一態様であるマイクロ流路デバイスの概略図を示す。図中の数字の単位はμｍである。分岐流路としてoutlet2〜4に繋がるものを各10本、outlet5に繋がるものを100本設けた。inlet1からＰＢＳで10倍に希釈した血液を、inlet2からＰＢＳをそれぞれ連続的に導入すると、outlet5からは平均直径7μｍ未満の赤血球および血小板が、outlet4からは7〜10μｍの白血球が、outlet3からは10〜17μｍの白血球が、outlet2からは17〜30μｍの白血球が、outlet1からは30μｍ以上の白血球が主に含まれる液をそれぞれ流出するように設計されている。
【図３】図３は、図１，２に示したマイクロ流路デバイスにおける、水力学的濾過法の基本的な原理を説明するための模式図を示す。
【図４】図４は、実施例３の工程(b)において、濾紙状フィルタをクランプ[2]とサポートスクリーン[3]との間に挟んだ状態で濾過する際に用いる各部品の構成を模式的に示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
次に、本発明の、血液から目的細胞を回収する方法，該方法に用いるキットおよびシステムについて詳細に説明する。
＜血液から目的細胞を回収する方法＞
本発明の工程(a)において、赤血球の溶解剤を血液に添加し溶血させると、溶解後の赤血球の（溶け残り）断片や小さくなった赤血球（赤血球デブリ）、溶けなかった赤血球が残存する場合がある。従来、これらの不要な残存物を洗浄（洗浄液を添加し遠心分離した後、不要な残存物を上清として廃棄して、白血球を沈殿として再懸濁して回収する。）によって除去していた。しかしながら、洗浄による除去において、廃棄した上清に白血球が含まれたり（ロス）、下層に赤血球が沈んで残存したり（混入）していた。
【００２０】
本発明の、血液から目的細胞を回収する方法は、上記の洗浄するという工程（操作）が不要であって、下記工程(a)および(b)を含むことを特徴とし、好ましくはさらに下記工程(c)を含み、白血球の損失（ロス）を低減する方法である。
【００２１】
(a) 赤血球の溶解剤を血液に添加することによって、溶血させる工程。
(b) 血液に含有される血球成分または該血球成分が崩壊したものを、その大きさに依存した分離手段を用いて分離する工程。
【００２２】
(c) 工程(a)および(b)（すなわち、本発明の、血液から目的細胞を回収する方法）を実施したことによって得られた細胞集団を観察し、目的細胞を検査する工程。
ここで、「検査」とは、単に目的細胞の有無を調べること、細胞種を同定することなどを含むものである。
【００２３】
本発明は、目的細胞を検査するための前処理とも位置付けられる。まず、前処理後の懸濁液に含まれるすべての細胞を観察する必要があるため、赤血球の数を減らし、白血球の数を維持すること（すなわち赤血球数／白血球数の比率を下げること）が望ましい。
【００２４】
本発明において、工程(a)の後に工程(b)を実施しても、工程(b)の後に工程(a)を実施しても、工程(a)と工程(b)とを同時に実施してもよい。いずれの場合であっても工程(c)は最後に実施する。すなわち、本発明の、血液から目的細胞を回収する方法は、下記の第一の態様，第二の態様および第三の態様が含まれる。
【００２５】
［第一の態様］
第一の態様としては、工程(a)の後に工程(b)を実施し、最後に工程(c)を実施する態様である。
【００２６】
第一の態様を具体的に説明すると、まず、血液に、赤血球の溶解剤を添加し、溶血させる。次に、赤血球の溶解剤で崩壊しなかった白血球や血中遊離癌細胞〔ＣＴＣ〕および赤血球（赤血球はすべて崩壊し、存在しない場合もある。）等の血球成分と、赤血球の溶解剤で崩壊した血球成分（赤血球が崩壊したものであるが、赤血球以外の血球成分が崩壊したものも含まれる場合がある。）とをその大きさに依存して、例えば濾紙状フィルタ等を用いて分離するか、または、例えば流路状フィルタ等を用いて分離する。最後に、このようにして得られた細胞集団を、例えば顕微鏡等で観察し、例えばＣＴＣ等の目的細胞を検査する態様である。
【００２７】
［第二の態様］
第二の態様としては、工程(b)の後に工程(a)を実施し、最後に工程(c)を実施する態様である。
【００２８】
第二の態様を具体的に説明すると、まず、血液そのまま、または、適切な緩衝液で希釈した血液を、白血球やＣＴＣと赤血球との大きさに依存して、例えば濾紙状フィルタ等を用いて分離するか、あるいは、例えば流路状フィルタ等を用いて分離する。次に、濾紙状フィルタ上の白血球やＣＴＣ、あるいは、流路状フィルタで分離された白血球やＣＴＣを含有する血液に、赤血球の溶解剤を添加し、溶血させる（おもに、残留した赤血球のみを崩壊させる）。最後に、このようにして得られた細胞集団を、例えば顕微鏡等で観察し、例えばＣＴＣ等の目的細胞を検査する態様である。
【００２９】
［第三の態様］
第三の態様としては、工程(a)と工程(b)とを同時に実施し、最後に工程(c)を実施する態様である。
【００３０】
第三の態様を具体的に説明すると、まず、血液（適切な緩衝液で希釈した血液でもよい。）と赤血球の溶解剤とをそれぞれ濾紙状フィルタ上に滴下する。該血液に含まれる、該フィルタの孔径より小さいもの（例えば、血小板など）が濾過されつつ、該フィルタ上で赤血球が溶解すると同時に赤血球デブリが濾過される。あるいは、図１に示すように、マイクロ流路デバイスのinlet1および2から、それぞれ血液（適切な緩衝液で希釈した血液でもよい。）および赤血球の溶解剤を連続的に導入し、溶解と分離とを同時に行う。次に、このようにして得られた細胞集団を、例えば顕微鏡等で観察し、例えばＣＴＣ等の目的細胞を検査する態様である。
【００３１】
［フィルタ］
上記工程(b)の分離を、濾紙状フィルタを用いて行ってもよく、流路状フィルタを用いて行ってもよい。
【００３２】
濾紙状フィルタの孔径は、０．４μｍ以上５μｍ以下であることが好ましい。このような濾紙状フィルタとしては、例えば、ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）製の「ニュークリポアメンブレン（商標）」シリーズの（ＰＣ ＭＢ 25ｍｍ 3.0μｍ）や（ＰＣ ＭＢ 25ｍｍ 5.0μｍ）等が好適である。
【００３３】
流路状フィルタは、図１に示すように、分岐(10)に血液を供給する流入チャネル(9)と、血液に含有される血球成分または該血球成分が崩壊したものを有する流体を分岐(10)から離して導出する第一排出チャネル(11)と、目的細胞を有する流体を分岐(10)から離して導出する第二排出チャネル(12)とを含む、流動チャネル(3)を備え、目的細胞が第二排出チャネル(12)の中で第一排出チャネル(11)の中よりもはるかに速く流れ、かつ、第一排出チャネル(11)の内径は０．４μｍ以上５μｍ以下であることが好ましい。本発明で用いる流路上フィルタとして、図２に示すようなマイクロ流路デバイスを用いることがより好ましく、例えば、「ミューセルソーター（商標）」（（株）アドバンス製）などが好適である。
【００３４】
これらフィルタの孔径または内径が上記範囲内であると、赤血球の溶解剤によって崩壊した血球成分（おもに赤血球デブリ）のみを濾過し、崩壊しなかった血球成分は濾過しないため好適である。
【００３５】
このマイクロ流路デバイスにおける水力学的濾過法の基本的な原理は、例えば、松田ら「水理学的濾過法を用いた血液細胞の分級」（電学論Ｅ，128巻10号，2008年）に記載されており、そこからの引用である図２を用いて簡単に説明する。図２(a) において、途中に分岐点を有する流路に、下方のinlet（入口）から連続的に粒子懸濁液が導入されている（図中の斜線は、分岐流路に導入される流体部分を示す）。このとき、粒子ａのように分岐流路への流量等によって定まる境界線Ａよりも分岐流路側（図中右側）にその中心がある粒子は、分岐流路に導入されるが、粒子ｂや粒子ｃのようにその中心が境界線Ａよりも左側にある場合は、分岐流路には導入されない。このような原理に基づいて作製した流路を図２(b) に示す。ここでは、outlet（出口）を多数、inlet（入口）を２つ設け、inletの一方（図下部左側）から、粒子を含まない液体（組成は粒子懸濁液の連続相と同様）を導入し、分岐流路を有する壁（図中右側）の近傍を粒子が流れるようにする。さらに、図中領域ｄに、一定の大きさ以上の粒子が導入されないように調整された分岐流路を複数設けると、一定の大きさ以上の粒子は徐々に右側の流路壁に引き寄せられ、最終的には壁側に整列するようになる。そして、下流（図中領域ｅ）において、小さな粒子から順に排出されるように分岐流路を少しずつ太くまたは短くすることで、粒子は大きさにより分離され、同時に濃縮することが可能となる。
【００３６】
［赤血球の溶解剤］
本発明で用いる赤血球の溶解剤としては、公知の各種の溶解剤を用いることができるが、塩化アンモニウムであっても、アミンであっても、界面活性剤であってもよく、または、塩化アンモニウムもしくはアミンと界面活性剤とを併用してもよい。
【００３７】
赤血球の溶解剤が塩化アンモニウムである場合、生成したアンモニウムイオンが、赤血球の膜表面に浸透圧の差を引き起こし、赤血球の細胞外の水が半透膜である細胞膜を通過して赤血球内に流れ込み、赤血球を破裂（崩壊）させるものであり、例えば、日本ベクトン・ディッキンソン（株）製の「PharmLyse（商標）」（塩化アンモニウムをベースとした10倍濃縮の緩衝液）などの市販品を用いることができる。「PharmLyse」の製造会社によると、「PharmLyse」を10倍に希釈して、赤血球が懸濁した溶液に添加（例えば、10倍希釈した「PharmLyse」1ｍＬを、全血100μＬに添加等）し、穏やかに撹拌した後、室温（20〜25℃）で15分間、暗所で反応させることが推奨されている。
【００３８】
赤血球の溶解剤がアミンである場合、赤血球を崩壊させる作用機序は塩化アンモニウムの場合と類似しているが、アンモニウムイオンを生成することがないことからｐＨ変化を引き起こさず、塩化アンモニウムを用いた場合と比べ緩やかに溶血する。アミンの市販品としては、例えば、ベックマンコールター（株）製の「VersaLyse（商標）」（活性を有する主成分は環状アミンであり、環状アミンが赤血球に存在する炭酸脱水酵素に接触すると、赤血球に対して高い溶解性を示す化合物に変換される。）などが挙げられる。「VersaLyse」の製造会社によると、白血球5×105個/100μＬ（赤血球6×108個/100μＬ）に対して「VersaLyse」1ｍＬを添加し、室温（18〜25℃）で少なくとも10分間、暗所で反応させることが推奨されている。
【００３９】
赤血球の溶解剤が界面活性剤である場合、ノニオン（非イオン）性界面活性剤であることが好ましい。ノニオン性界面活性剤としては、例えば、ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）製の「Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（商標）」や「ＴＷＥＥＮ ２０（商標）」等の一般的な市販試薬が挙げられる。
【００４０】
用いる赤血球の溶解剤の種類（赤血球の溶解の度合いの強さ）、濃度および反応時間を適宜調整することによって、所望の態様で赤血球を溶解することができる。例えば、同程度の溶解の度合いの強さを有する溶解剤を用いるにしても、比較的薄い濃度で反応時間を長くする場合と、比較的濃い濃度で反応時間を短くする場合のいずれかで、分離の際に用いるフィルタに依存することなく、回収後の赤血球数／白血球数の比率を下げる（具体的には１〜10程度の比率とする）ことができる。例えば、流路型フィルタで分離する等のような濾過に時間を要する場合、赤血球を赤血球の溶解剤と接触させた状態で流下させることで、分離されるまでの間に溶解処理が行われるようにすることができる。血液に赤血球の溶解剤を添加したものを流路に導入してもよいし、赤血球の溶解剤を別の流路から導入して赤血球と接触させてもよい。
【００４１】
［目的細胞］
目的細胞としては、血液に含まれる希少な細胞であることが好ましく、血中遊離癌細胞〔ＣＴＣ〕であることが特に好ましい。
【００４２】
血液中の、白血球数に対する赤血球の比率、すなわち(赤血球の数)／(白血球の数)は、103オーダー（約1000〜2000）である。より具体的なデータを下表に示す。
【００４３】
【表１】
ＣＴＣの直径は、例えばClin Cancer Res. 2004 Dec 15;10(24):8152-62などＣＴＣに関する多くの報告において記載されており、平均として約20μmである。
【００４４】
従って、ＣＴＣは血液中に含まれる白血球の多くと同程度の直径であるため、白血球の多くをその数を極力減らさずに回収することにより、目的細胞としたＣＴＣがロス（損失）してしまうことを防止することができる。
【００４５】
＜白血球観察用キット＞
本発明の白血球観察用キットは、上記濾紙状フィルタまたは上記流路状フィルタと、上記の赤血球の溶解剤とを含み、本発明の、血液から目的細胞を回収する方法に用いられることを特徴とする。
【００４６】
例えば、本発明の白血球観察用キットと被験者から採取した血液とを用いることによって、ＣＴＣを高精度で検出することができる。この結果から、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌（上皮内癌）の存在も高精度で予測することができる。
【００４７】
このようなキットとしては、具体的に、フィルタや溶解剤の他に、血液を希釈する適切な緩衝液や本発明の方法を実施するために必要とされる各種器材または資材や装置を含めることもできる。
【００４８】
＜観察の前処理用システム＞
また、本発明の、観察の前処理用システムは、上記濾紙状フィルタまたは上記流路状フィルタを用いた分離手段と、上記の赤血球の溶解剤の添加手段とを含み、本発明の方法に用いられることを特徴とする。
【実施例】
【００４９】
次に、本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
［実施例１］
まず工程(a)として、市販の血液（コージンバイオ（株）製の「正常ヒト全血液・B型」）100μＬが入ったチューブに、溶解剤として蒸留水で10倍希釈した「PharmLyse（商標）」（日本ベクトン・ディッキンソン（株）製）1ｍＬを加えた。そして、穏やかに撹拌した後、暗所にて15分間、室温で静置した。
【００５０】
次に工程(b)として、孔径0.4μｍの濾紙状フィルタ（ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）製の「ニュークリポアメンブレン（ＰＣ ＭＢ 25ｍｍ 0.4μｍ）（商標）」）を用いて全量を濾過した。
【００５１】
濾紙状フィルタを顕微鏡で観察し、白血球数および赤血球数を計測し、処理前の細胞数に対する処理後の細胞数の割合を回収率として、白血球および赤血球の回収率を算出した。目的細胞(ＣＴＣ、実施例および比較例では白血球)の回収率が高く、不要な細胞(主に赤血球)の回収率が低いことが望ましい。不要な細胞については、回収率の低さが、除去した細胞の割合の高さを示している。その結果を表２に示す。
【００５２】
なお、市販の血液は、採血してから2〜4週間程度の時間が経過したものであるから、赤血球・白血球の数は、表１に記載の数より若干少なくなっているものと考えられる。
［実施例２］
実施例１において、工程(b)で用いた濾紙状フィルタの孔径を2μｍに変更した（すなわち、濾紙状フィルタとして、ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）製の「ニュークリポアメンブレン（ＰＣ ＭＢ 25ｍｍ 2μｍ）」を用いた）以外は実施例１と同様にして該濾紙状フィルタを顕微鏡で観察し、白血球数および赤血球数を計測し、白血球および赤血球の回収率を算出した。その結果を表２に示す。
【００５３】
［実施例３］
まず工程(b)として、市販の血液（コージンバイオ（株）製の「正常ヒト全血液・B型」）100μＬを、孔径2μｍの濾紙状フィルタである「ニュークリポアメンブレン（ＰＣ ＭＢ 25ｍｍ 2μｍ）」を、図４に示すように、アドバンテック東洋（株）製の「サポートスクリーン19310004」([3])の上に載せ、「クランプ19311003」([2])により挟んで固定した状態で濾過した。
【００５４】
次に工程(a)として、その濾紙状フィルタに、蒸留水で10倍希釈した「PharmLyse」を1ｍＬ滴下し、該PharmLyseがその濾紙状フィルタ表面全体に行き渡るように、該フィルタを穏やかに「ポリマックス1040 5度（商標）」（Heidolph（株）製）を用いて振盪させた。その後、暗所にて15分間、室温で静置した。
【００５５】
濾紙状フィルタを顕微鏡で観察し、白血球数および赤血球数を計測し、白血球および赤血球の回収率を算出した。その結果を表２に示す。
［実施例４］
まず工程(a)として、市販の血液20μＬが入ったチューブに、蒸留水で10倍希釈した「PharmLyse（商標）」（日本ベクトン・ディッキンソン（株）製）200μＬを加えた。そして、穏やかに撹拌した後、暗所にて15分間、室温で静置した。
【００５６】
次に工程(b)として、工程(ａ)で得られた細胞懸濁液をさらにＰＢＳで5倍希釈して、「ミューセルソーター」（（株）アドバンス製）を用いて分離した。この「ミューセルソーター（表中では「μセルソーター」と簡略表記する。）」は、図１に示すマイクロ流路デバイスと基本構造は同じである。inletに検体を導入してから、outletで細胞を回収するまでの時間（すなわち反応時間）は、45分間であった。
【００５７】
Outlet1〜4（図１に示す。）から回収した液をそれぞれ顕微鏡で観察し、白血球数および赤血球数を計測し、白血球および赤血球の回収率を算出した。その結果を表２に示す。
［実施例５］
工程(b)として、市販の血液20μＬをＰＢＳで50倍希釈（全量：1ｍＬ）して「ミューセルソーター」のinletに導入すると同時に、工程(a)として、蒸留水で10倍希釈した「PharmLyse」1ｍＬを、もう一方のinletから流路に流し、「ミューセルソーター」で分離した。inletに検体を導入してから、outletで細胞を回収するまでの時間（すなわち反応時間）は、50分間であった。
【００５８】
Outlet1〜4（図１に示す。）から回収した液をそれぞれ顕微鏡で観察し、白血球数および赤血球数を計測し、白血球の回収率および赤血球の除去率を算出した。その結果を表２に示す。
【００５９】
［実施例６］
実施例１において、工程(a)で用いた溶解剤を「VersaLyse（商標）」（ベックマンコールター（株）製）に変更し、暗所での反応時間を15分間から10分間に短縮し、工程(b)で用いた濾紙状フィルタの孔径を2μｍに変更した以外は実施例１と同様にして該濾紙状フィルタを顕微鏡で観察し、白血球数および赤血球数を計測し、白血球および赤血球の回収率を算出した。その結果を表２に示す。
【００６０】
［実施例７］
実施例１において、工程(a)で用いた溶解剤を、０．０５％「Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（商標）」（ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）製）および０．０００１％「ＴＷＥＥＮ ２０（商標）」（ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）製）に変更し、反応時間を15分間から30秒間に短縮し、工程(b)で用いた濾紙状フィルタの孔径を2μｍに変更した以外は実施例１と同様にして該濾紙状フィルタを顕微鏡で観察し、白血球数および赤血球数を計測し、白血球および赤血球の回収率を算出した。その結果を表２に示す。
【００６１】
なお、以上の実施例１〜７においては、いずれも希釈や洗浄を行っていないが、本発明に係る工程(a)および工程(b)に加えて、さらに希釈や洗浄を行っても本発明の効果が得られることは勿論である。例えば、白血球の沈殿または懸濁液に洗浄液としてＰＢＳを加え、遠心分離後の上清に白血球が含まれない程度に、充分な遠心分離を行い、遠心分離後の上清を廃棄することで洗浄工程を行うことができる。また、例えば、工程(a)の後に、洗浄による遠心分離後の上清を廃棄せず、この上清と白血球の沈殿あるいは白血球の沈殿を再懸濁したものとのそれぞれに対して、工程(b)の分離を別々に行って、それらを回収するようにすることもできる。
【００６２】
［比較例１］
実施例１において、工程(b)の代わりに洗浄工程を実施した。すなわち、
まず工程(a)として、市販の血液100μＬが入ったチューブに、蒸留水で10倍希釈した「PharmLyse」1ｍＬを加えた。そして、穏やかに撹拌した後、暗所にて15分間、室温で静置した。
【００６３】
次に洗浄工程として、そのチューブを室温で5分間遠心分離（200×g）し上清を捨て、ＰＢＳを2ｍＬ加えた。そして、室温で5分間遠心分離（200×g）し上清を捨てた。
最後にＰＢＳを1ｍＬ加えて懸濁した。適切な濃度に希釈して血球計算盤で観察し、白血球数および赤血球数を計測し、白血球および赤血球の回収率を算出した。その結果を表２に示す。
【００６４】
［比較例２］
比較例１において、「PharmLyse」の代わりにベックマンコールター（株）製の「VersaLyse」を用いて、暗所での反応時間を15分間から10分間に短縮した以外は比較例１と同様にして、適切な濃度に希釈した細胞を血球計算盤で観察し、白血球数および赤血球数を計測し、白血球および赤血球の回収率を算出した。その結果を表２に示す。
【００６５】
［比較例３］
実施例３において、工程(a)を実施しなかった。ただし、市販の血液を適切な濃度となるようにＰＢＳで希釈し、フィルタの孔径を8μｍに変更した。すなわち、
工程(b)として、市販の血液を適切な濃度に希釈した後、孔径8μmの濾紙状フィルタ（ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）製の「ニュークリポアメンブレン（ＰＣ ＭＢ 25ｍｍ 8.0μｍ）」）により濾過した。
【００６６】
その濾紙状フィルタを顕微鏡で観察し、白血球数および赤血球数を計測し、白血球の回収率および赤血球の除去率を算出した。その結果を表２に示す。
［比較例４］
実施例４において、工程(a)を実施しなかった。すなわち、
工程(b)として、市販の血液20μＬをＰＢＳで50倍希釈して「ミューセルソーター」のinletに導入し分離した。inletに検体を導入してから、outletで細胞を回収するまでの時間（すなわち反応時間）は、60分であった。
【００６７】
Outlet1〜4（図１に示す。）から回収した液をそれぞれ顕微鏡で観察し、白血球数および赤血球数を計測し、白血球および赤血球の回収率を算出した。その結果を表２に示す。
【００６８】
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明の、血液から目的細胞を回収する方法を用いて、被験者から採血した血液（10ｍＬ）から回収した細胞を観察した場合、赤血球数／白血球数の比率を１〜10程度にできることから、例えばＣＴＣなどの数が少ない細胞を効率良く検査することができる。
【符号の説明】
【００７０】
１・・・マイクロ流路デバイス
３・・・流動チャネル
８・・・入口
９・・・流入チャネル
１０・・・分岐
１１・・・第一排出チャネル
１２・・・第二排出チャネル
１４・・・出口
１５・・・出口
１６・・・穿孔
ａ・・・境界線Ａよりも分岐流路側（図中右側）に中心がある、小さい粒子
ｂ・・・境界線Ａよりも左側に中心がある、大きい粒子
ｃ・・・境界線Ａよりも左側に中心がある、小さい粒子
ｄ・・・一定の大きさ以上の粒子が導入されないように調整された分岐流路を複数設けた領域
ｅ・・・上流から下流にかけて小さな粒子から順に排出されるように分岐流路を少しずつ太くまたは短くして複数設けた領域
[1]・・・ファンネル
[2]・・・クランプ
[3]・・・サポートスクリーン
[4]・・・ＰＴＦＥ製ガスケット
[5]・・・リングプレート
[6]・・・ベース
[7]・・・ゴム栓
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) 赤血球の溶解剤を血液に添加することによって、溶血させる工程；および
(b) 血液に含有される血球成分または該血球成分が崩壊したものを、その大きさに依存した分離手段を用いて分離する工程
を含むことを特徴とする、血液から目的細胞を回収する方法。
【請求項２】
上記工程(a)の後に上記工程(b)を実施する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記工程(b)の後に上記工程(a)を実施する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記工程(a)と上記工程(b)とを同時に実施する請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記工程(b)の分離を、濾紙状フィルタを用いて行う請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
上記濾紙状フィルタの孔径が、０．４μｍ以上５μｍ以下である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上記工程(b)の分離を、流路状フィルタを用いて行う請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
上記流路状フィルタが、分岐(10)に血液を供給する流入チャネル(9)と、血液に含有される血球成分または該血球成分が崩壊したものを有する流体を分岐(10)から離して導出する第一排出チャネル(11)と、目的細胞を有する流体を分岐(10)から離して導出する第二排出チャネル(12)とを含む、流動チャネル(3)を備え、目的細胞が第二排出チャネル(12)の中で第一排出チャネル(11)の中よりもはるかに速く流れ、かつ、第一排出チャネル(11)の内径が、０.４μｍ以上５μｍ以下である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
上記溶解剤が、塩化アンモニウムである請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
上記溶解剤が、アミンである請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
上記溶解剤が、界面活性剤である請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
上記界面活性剤が、ノニオン（非イオン）性界面活性剤である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
上記目的細胞が、血中遊離癌細胞〔ＣＴＣ〕である請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法によって得られた細胞を観察し、目的細胞を検査する工程をさらに含む方法。
【請求項１５】
上記濾紙状フィルタまたは上記流路状フィルタと、上記の赤血球の溶解剤とを含み、
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法に用いられることを特徴とする白血球観察用キット。
【請求項１６】
上記濾紙状フィルタまたは上記流路状フィルタを用いた分離手段と、上記の赤血球の溶解剤の添加手段とを含み、
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法に用いられることを特徴とする、観察の前処理用システム。
【請求項１】
(a) 赤血球の溶解剤を血液に添加することによって、溶血させる工程；および
(b) 血液に含有される血球成分または該血球成分が崩壊したものを、その大きさに依存した分離手段を用いて分離する工程
を含むことを特徴とする、血液から目的細胞を回収する方法。
【請求項２】
上記工程(a)の後に上記工程(b)を実施する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記工程(b)の後に上記工程(a)を実施する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記工程(a)と上記工程(b)とを同時に実施する請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記工程(b)の分離を、濾紙状フィルタを用いて行う請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
上記濾紙状フィルタの孔径が、０．４μｍ以上５μｍ以下である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上記工程(b)の分離を、流路状フィルタを用いて行う請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
上記流路状フィルタが、分岐(10)に血液を供給する流入チャネル(9)と、血液に含有される血球成分または該血球成分が崩壊したものを有する流体を分岐(10)から離して導出する第一排出チャネル(11)と、目的細胞を有する流体を分岐(10)から離して導出する第二排出チャネル(12)とを含む、流動チャネル(3)を備え、目的細胞が第二排出チャネル(12)の中で第一排出チャネル(11)の中よりもはるかに速く流れ、かつ、第一排出チャネル(11)の内径が、０.４μｍ以上５μｍ以下である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
上記溶解剤が、塩化アンモニウムである請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
上記溶解剤が、アミンである請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
上記溶解剤が、界面活性剤である請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
上記界面活性剤が、ノニオン（非イオン）性界面活性剤である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
上記目的細胞が、血中遊離癌細胞〔ＣＴＣ〕である請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法によって得られた細胞を観察し、目的細胞を検査する工程をさらに含む方法。
【請求項１５】
上記濾紙状フィルタまたは上記流路状フィルタと、上記の赤血球の溶解剤とを含み、
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法に用いられることを特徴とする白血球観察用キット。
【請求項１６】
上記濾紙状フィルタまたは上記流路状フィルタを用いた分離手段と、上記の赤血球の溶解剤の添加手段とを含み、
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法に用いられることを特徴とする、観察の前処理用システム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１３−１７４２９（Ｐ２０１３−１７４２９Ａ）
【公開日】平成２５年１月３１日（２０１３．１．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１５３６９４（Ｐ２０１１−１５３６９４）
【出願日】平成２３年７月１２日（２０１１．７．１２）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２２年度独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構「血中分子・遺伝子診断自動化システムの研究開発（血中がん遺伝子診断の検体処理自動化システム）」共同研究 産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許願
【出願人】（０００００１２７０）コニカミノルタホールディングス株式会社 (4,463)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年１月３１日（２０１３．１．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年７月１２日（２０１１．７．１２）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２２年度独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構「血中分子・遺伝子診断自動化システムの研究開発（血中がん遺伝子診断の検体処理自動化システム）」共同研究 産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許願
【出願人】（０００００１２７０）コニカミノルタホールディングス株式会社 (4,463)
【Ｆターム（参考）】
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