血球細胞の初期化法
【課題】体細胞から効率的に多能性幹細胞を製造する方法の提供。
【解決手段】体細胞から多能性幹細胞を製造する方法であって、（ａ）体細胞を、ＩＬ−６シグナル伝達因子刺激因子および少なくとも１種のサイトカインを含む細胞培養培地中で培養する工程、および（ｂ）体細胞を脱分化させる工程を含んでなり、工程（ａ）の後に工程（ｂ）が行われるか、または工程（ａ）と工程（ｂ）が同時に行われる方法。
【解決手段】体細胞から多能性幹細胞を製造する方法であって、（ａ）体細胞を、ＩＬ−６シグナル伝達因子刺激因子および少なくとも１種のサイトカインを含む細胞培養培地中で培養する工程、および（ｂ）体細胞を脱分化させる工程を含んでなり、工程（ａ）の後に工程（ｂ）が行われるか、または工程（ａ）と工程（ｂ）が同時に行われる方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、分化した体細胞、特に血球系細胞を初期化または脱分化することにより多能性幹細胞を製造するための方法およびキットに関する。
【０００２】
背景技術
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、生体中の組織・臓器を構成するほぼ全ての種類の細胞に分化できる多能性を有したまま、長期間にわたる細胞増殖を無制限に維持できる細胞株である。この性質により、ＥＳ細胞は、パーキンソン病、Ｉ型糖尿病、脊髄損傷、心不全など、多くの疾患に対する移植療法のための細胞資源として、組織工学による人工組織・臓器作製のための多種類細胞材料の供給源として、さらには、基礎研究や創薬研究に用いられるヒト細胞の供給源としての利用が期待されている。しかしながら、ＥＳ細胞はヒトやマウスの初期胚を破壊して樹立された細胞株であることから、倫理的見地よりＥＳ細胞の利用に対する反対意見も多い。また、細胞移植療法については、他人の細胞を移植することになることから、臓器移植と同様に拒絶反応を惹起する危険性を伴っている。これらの問題を回避する方法として、患者自身の分化体細胞を初期化した、ＥＳ細胞に近い多能性と増殖能を有した誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の利用が期待されている。
【０００３】
分化体細胞の初期化法として、例えば、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ細胞）にレトロウィルスベクターでＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−ｍｙｃの４遺伝子を同時感染させることによりｉＰＳ細胞を誘導する技術が報告されている（非特許文献１：K. Takahashi, S. Yamanaka, Cell, 126, pp.663-676, 2006；非特許文献２：K. Okita, T. Ichisaka, S. Yamanaka, Nature, 448, pp. 313-317, 2007；非特許文献３：M. Wernig et al., Nature, 448, pp.318-324, 2007）。マウス肝細胞および胃上皮細胞から同様の方法でｉＰＳ細胞を誘導する技術も報告されている（非特許文献４：T. Aoi et al., Science Express on 14 Feb. 2008）。これらの報告における初期化因子のスクリーニング方法については国際公開第２００５／０８０５９８号パンフレット（特許文献１）に提案されており、また、当該初期化因子については、他のＥＳ細胞特異的遺伝子（初期化因子の候補遺伝子）と共に国際公開第２００７／０６９６６６号パンフレット（特許文献２）に提案されている。これらの報告および提案においては、ヒト細胞について一部記載があるものの、この段階ではヒトＥＳ細胞と同等の性質を持ったヒトｉＰＳ細胞としての樹立は不完全なものである。また、肝細胞や胃上皮細胞からの誘導はヒトに適用する場合には侵襲性が多く、採取する患者の負担が大きくなることが予想される。
【０００４】
ヒトｉＰＳ細胞を樹立する方法としては、成人皮膚由来線維芽細胞 (ＨＤＦ細胞)にレトロウィルスを用いてＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−ｍｙｃの４因子を導入する方法が報告されている（非特許文献５：K. Takahashi, S. Yamanaka, Cell, 131, pp.861-872, 2007）。この方法においては、レトロウィルスを高効率に感染させるために、マウスエコトロピックウィルス受容体であるｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ ｆａｍｉｌｙ ７(Ｓｌｃ７ａ１) をレンチウィルスにより発現させた細胞を用いている。その結果、レトロウィルスの感染後２５日目頃よりヒトＥＳ細胞様のコロニーを認め、３０日目以降にコロニーのピックアップを実施している。この方法では、新たにマウスエコトロピックウィルス受容体をレンチウィルスにより導入しているため、異種動物由来の遺伝子の発現および染色体へのＤＮＡ断片挿入機会の増加による、宿主細胞の癌化リスクの増大といった課題を抱えている。さらに、誘導日数が１ヶ月におよぶため、培養コストについても課題を抱えている。また、この報告では、ｉＰＳ細胞の誘導に新生児包皮由来線維芽細胞 （ＢＪ１細胞）も用いられており、その場合のヒトＥＳ細胞様コロニーの出現頻度はＨＤＦを用いた場合よりも高いが、誘導日数については短縮されていない。
【０００５】
他のグループでは、アデノウィルスによりマウスエコトロピックウィルス受容体であるｍＣＡＴ１遺伝子を発現させたヒト新生児包皮由来線維芽細胞を用いて、同様の４因子をレトロウィルスにより導入し、ｉＰＳ細胞を誘導した報告もある（非特許文献６：H.Masaki et al., Stem Cell Research, 1, pp.105-115, 2007）。この報告では、レトロウィルスの感染後１７日目にｉＰＳ様のコロニーの出現が認められている。この方法では、アデノウィルスでウィルス受容体を発現させていることにより、染色体ＤＮＡへの異種遺伝子の挿入リスクは低減されているが、異種遺伝子が細胞内に導入されることに伴うリスクは以前として残る。同様の４因子をレトロウィルスによりヒト胎児肺線維芽細胞 (ＭＲＣ５細胞)へ導入してｉＰＳ細胞を誘導した報告もある（非特許文献７：I. H. Park et al., Nature, 451, pp.141-146, 2008）。しかしながら、この報告では、ＢＪ１細胞、成体間葉系幹細胞（ＭＳＣ細胞）、およびＨＤＦ細胞からの４因子によるｉＰＳ細胞誘導は成功していない。また、初期化因子としてＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮＡＮＯＧ、およびＬｉｎ２８の４因子を用いて、レンチウィルスで細胞に発現させることにより、ｆｅｔａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌｓ(ＩＭＲ９０ ｃｅｌｌｓ)やｎｅｗｂｏｒｎ ｆｏｒｅｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔからＥＳ細胞様コロニーを取得している報告もある（非特許文献８：J. Yu et al., Science, 318, pp.1917-1920, 2007）。胎児や新生児の細胞を用いた場合、成人の表皮線維芽細胞を用いた場合に比べて、より短期間でｉＰＳ細胞が誘導できているが、治療や研究に用いる細胞源としては倫理的な課題が残る。この報告ではさらに、ヒトＥＳ細胞から分化誘導した血球細胞等を用いてｉＰＳ細胞が誘導可能であることが報告されている。しかし、ＥＳ細胞から分化誘導した細胞は正常な分化過程を経ておらず、成体由来の血球細胞と同一の細胞とはいえない。今のところ、成体から採取した血球細胞からのｉＰＳ細胞の誘導についての報告はない。
【０００６】
Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−ｍｙｃの４因子に加え、Ｎａｎｏｇを共発現させることによりｉＰＳ細胞の誘導を効率化した報告もある(非特許文献９：W. E. Lowry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105, pp.2883-2888, 2008) 。Ｎａｎｏｇの存在下でリプログラミング（初期化）効率が上がることは従来から報告されている(非特許文献１０：J. Silva et al., Nature, 441, pp.997-1001, 2006) 。レトロウィルスを用いてＨＤＦ細胞に遺伝子導入を行い、ウィルス感染終了後２１日目でＥＳ細胞様コロニーが出現する。Ｎａｎｏｇを用いることによりｉＰＳ細胞の誘導効率が上がっているが、因子の種類を増やすことは、染色体に挿入される遺伝子の種類も増やすこととなり、初期化因子の種類を増やさない方法での効率改善が望まれる。
【０００７】
また、マウスにおいては終末分化した成熟Ｂ細胞からｉＰＳ細胞を誘導した報告もある（非特許文献１１：J. Hanna et al., Cell, 133, pp.250-264, 2008）。この報告においては、ドキシサイクリン依存的に４つの核初期化因子、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−ｍｙｃを発現するユニットをレンチウィルスベクターにより導入することによって、まずｉＰＳ細胞を誘導している。さらに、誘導されたｉＰＳ細胞を用いてトランスジェニックマウスを作製している。成熟Ｂ細胞からのｉＰＳ細胞誘導には、こうして得られたトランスジェニックマウスより調製したＢ細胞を用いており、同様の方法をヒトに適用することは不可能である。ヒトの終末分化した血液細胞からｉＰＳ細胞を誘導するためには本法を適用することはできず、ヒト初代細胞に適用できる初期化方法が望まれる。
【０００８】
一方で、ＥＳ細胞のような多能性幹細胞の利用により治療効果が期待される医療領域では、ＥＳ細胞から分化誘導した細胞による治療法の検討と並行して、生体内に存在する体性幹細胞の利用が検討されてきた。そのような取組みの中、細胞移植療法への利用を目的として生体外で体性幹細胞を増幅する技術の報告がある。中でも造血幹細胞については、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔリガンド（ＦＬ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）と可溶化型ＩＬ−６受容体のα鎖（ＩＬ−６Ｒ）との融合タンパク質などのサイトカインを用いて、臍帯血由来の造血幹細胞や骨髄由来の造血幹細胞を増幅した報告がある（非特許文献１２：T. Ueda et al., J. of Clinical Investigation, 105, pp-1013-1021, 2000；非特許文献１３：L. Gammaitoni et al., Experimental Hematology, 31, pp. 261-270, 2003）。さらに、ストローマ細胞を用いて増幅率を向上させる技術もある（特許文献３：国際公開第２００３／０１４３３６号パンフレット）。いずれも血球系の幹細胞または前駆細胞を増幅する技術であり、増幅の際に他の細胞系譜への分化能を付与することはできず、体細胞の初期化作用や脱分化作用はない。また、造血幹細胞の増幅には限界があり、ＥＳ細胞のように多能性を維持したまま無制限に増殖させることはできない。
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００５／０８０５９８号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００７／０６９６６６号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００３／０１４３３６号パンフレット
【非特許文献１】K. Takahashi, S. Yamanaka, Cell, 126, pp.663-676, 2006
【非特許文献２】K. Okita, T. Ichisaka, S. Yamanaka, Nature, 448, pp. 313-317, 2007
【非特許文献３】M. Wernig et al., Nature, 448, pp.318-324, 2007
【非特許文献４】T. Aoi et al., Science Express on 14 Feb. 2008
【非特許文献５】K. Takahashi, S. Yamanaka, Cell, 131, pp.861-872, 2007
【非特許文献６】H.Masaki et al., Stem Cell Research, 1, pp.105-115, 2007
【非特許文献７】I. H. Park et al., Nature, 451, pp.141-146, 2008
【非特許文献８】J. Yu et al., Science, 318, pp.1917-1920, 2007
【非特許文献９】W. E. Lowry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105, pp.2883-2888, 2008
【非特許文献１０】J. Silva et al., Nature, 441, pp.997-1001, 2006
【非特許文献１１】J. Hanna et al., Cell, 133, pp.250-264, 2008
【非特許文献１２】T. Ueda et al., J. of Clinical Investigation, 105, pp-1013-1021, 2000
【非特許文献１３】L. Gammaitoni et al., Experimental Hematology, 31, pp. 261-270, 2003
【発明の概要】
【００１０】
本発明者らは、ＩＬ−６シグナル伝達因子（ＩＬ６ＳＴ）刺激因子とサイトカインカクテルとの存在下での培養と、細胞の脱分化とを組み合わせることにより、体細胞から多能性幹細胞を効率的に樹立できることを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
【００１１】
従って、本発明の目的は、体細胞から効率的に多能性幹細胞を製造する方法を提供することにある。
【００１２】
そして、本発明による多能性幹細胞の製造法は、体細胞から多能性幹細胞を製造する方法であって、（ａ）体細胞を、ＩＬ−６シグナル伝達因子刺激因子および少なくとも１種のサイトカインを含む細胞培養培地中で培養する工程、および（ｂ）体細胞を脱分化させる工程を含んでなり、工程（ａ）の後に工程（ｂ）が行われるか、または工程（ａ）と工程（ｂ）が同時に行われる方法である。
【００１３】
本発明によれば、人体より軽微な負担で採取できる体細胞、例えば末梢血液細胞などから、従来法よりも短期間で高効率に多能性幹細胞を樹立することができる。多能性幹細胞の樹立に要する期間は、例えば、従来法の約１／２にまで短縮することが可能である。よって、製造された多能性幹細胞を、脊髄損傷などの緊急性の高い疾患の治療に利用することができ、また、多能性幹細胞の製造にかかる費用も低減することが可能となる。
【発明の具体的説明】
【００１４】
本発明において製造される「多能性幹細胞」とは、種々の分化系譜に分化可能な細胞を意味し、必ずしもＥＳ細胞と同等のすべての細胞系譜に分化可能な細胞に限られるものではなく、例えば、内胚葉系幹細胞、中胚葉系幹細胞、または外胚葉系幹細胞としてもよい。例えば、心不全の治療に使用する多能性幹細胞を製造するためには、心筋細胞に分化可能な細胞を製造できればよい。あるいは、Ｉ型糖尿病の治療に使用する多能性幹細胞を製造するためには、β細胞に分化可能な細胞を製造できればよい。使用目的に応じたレポーター遺伝子や特異的表面抗原に対する抗体を用いることで、目的の細胞を効率よく分離することが可能である。
【００１５】
本発明の好ましい実施態様によれば、「多能性幹細胞」は、ＥＳ細胞と同等のすべての細胞系譜に分化可能な細胞とされる。このような細胞は、ヒトにおいては、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１などのマーカー分子を発現する細胞である。マウスにおいては、ＳＳＥＡ−１などのマーカー分子を発現する細胞である。ヒトおよびマウスのそれらの細胞は、ＳＣＩＤマウスやヌードマウスなどの免疫不全マウスの皮下に移植することにより、奇形腫を形成することが知られている。多能性幹細胞から形成された奇形腫には、内胚葉系、中胚葉系、外胚葉系、それぞれの系譜の分化細胞が含まれる。よって、ＥＳ細胞と同等のすべての細胞系譜に分化可能な多能性幹細胞は、このような奇形腫の形成により特徴づけられる。
【００１６】
本発明による多能性幹細胞の製造法は、ＩＬ−６シグナル伝達因子（ＩＬ６ＳＴ）刺激因子および少なくとも１種のサイトカインを含む細胞培養培地中で培養する工程（以下「工程（ａ）」という）を含んでなる。
【００１７】
本発明において「ＩＬ６シグナル伝達因子（ＩＬ６ＳＴ）」とは、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒを意味し、ｇｐ１３０とも呼ばれている。ＩＬ６ＳＴはシグナル領域、細胞外領域、膜貫通領域、および細胞内領域から構成される全長９１８アミノ酸残基のタンパク質を意味する。ＩＬ６ＳＴについては、シグナルペプチドであるＮ末端から２２番目のグリシン残基までが欠失してもＩＬ６ＳＴを介したシグナル伝達は維持されることが知られている。ＩＬ−６と結合したＩＬ−６Ｒは２分子のＩＬ６ＳＴと結合し、ＩＬ６ＳＴはホモ二量体を形成する。ホモ二量体を形成したＩＬ６ＳＴは、細胞内領域のチロシン残基がリン酸化され、シグナル伝達が活性化されることが知られている。ＩＬ６ＳＴは、ＩＬ−１１Ｒとも結合し、シグナルを伝達することが知られている。また、ＩＬ６ＳＴは白血球遊走阻止因子レセプター（ＬＩＦＲ）、オンコスタチンＭレセプター（ＯＳＭＲ）、毛様体神経栄養因子レセプター（ＣＮＴＦＲ）、カルジオトロピンレセプター（ＣＴ−１Ｒ）などとも結合し、ヘテロ二量体を形成することにより活性化されることが知られている。
【００１８】
本発明において「ＩＬ６ＳＴ刺激因子」とは、ヒトＩＬ６ＳＴを介してシグナルを伝達する分子を意味し、より具体的には、ＩＬ６ＳＴと会合することによりＩＬ６ＳＴの活性化を引き起こす分子をいう。ＩＬ６ＳＴ刺激因子としては、ＩＬ−６またはその変異体とＩＬ−６受容体（以下「ＩＬ−６Ｒ」という）またはその変異体との融合タンパク質、ＩＬ−６Ｒ（好ましくは、可溶性ＩＬ−６Ｒ（ｓＩＬ−６Ｒ））またはその変異体とＩＬ−６またはその変異体との組み合わせ（特表平１０−５０９０４０号）、ＩＬ−６とＩＬ−６受容体のα鎖との複合体、ＩＬ６ＳＴに対してアゴニストとして作用するＩＬ６ＳＴに対する抗体（Z. J. Gu et al., Leukemia, 14, pp.188-197, 2000）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ、およびカルジオトロピンが挙げられる。
【００１９】
本発明において「ＩＬ−６」とは、ＩＬ−６として一般的に知られる、４つのへリックスから構成される全長２１２アミノ酸残基のタンパク質を意味する。また、本発明において「ＩＬ−６の変異体」とは、置換、欠失、挿入、および付加から選択される１以上の改変を有し、かつＩＬ６ＳＴ刺激活性を有するＩＬ−６の変異体を意味する。ＩＬ−６については、シグナルペプチドであるＮ末端から２８番目のアラニン残基までが欠失してもＩＬ６ＳＴ刺激活性を維持することが知られている（ＷＯ００/０１７３１）。また、ＩＬ−６の３７番目のリジン残基のＣ末端側がプロテアーゼの消化作用を受けること、および２８番目のアラニン残基から３７番目のリジン残基までの１０アミノ酸残基が欠失してもＩＬ−６活性に支障がないことが知られている（ＷＯ００／０１７３１）。従って、本発明においては、Ｎ末端が欠失し、かつＩＬ６ＳＴ刺激活性を有する改変ＩＬ−６をＩＬ−６変異体として用いてもよい。このようなＩＬ−６変異体としては、２８番目までのＮ末端配列が欠失したＩＬ−６、３７番目までのＮ末端配列が欠失したＩＬ−６が挙げられる。
【００２０】
本発明において、「ＩＬ−６Ｒ」とは、ＩＬ−６受容体として一般的に知られる、シグナル領域、細胞外領域、膜貫通領域、および細胞内領域から構成される全長４６８アミノ酸残基のタンパク質を意味する。また、本発明において「ＩＬ−６Ｒの変異体」とは、置換、欠失、挿入、および付加から選択される１以上の改変を有し、かつＩＬ６ＳＴ刺激活性を有するＩＬ−６Ｒの変異体を意味する。ＩＬ−６Ｒについては、細胞外領域中に存在するサイトカインレセプター領域（１１２番目のバリン残基付近から３２３番目のアラニン残基付近までの領域）がＩＬ−６との結合に必要十分であることが知られている。従って、本発明においては、ＩＬ−６Ｒの１１２番目のバリン残基付近から３３３番目のアラニン残基付近までの領域を含んでなる改変ＩＬ−６ＲをＩＬ−６Ｒ変異体として用いてもよい。
【００２１】
本発明の好ましい実施態様によれば、ＩＬ６ＳＴ刺激因子は、ＩＬ−６またはその変異体とＩＬ−６Ｒまたはその変異体とが直接またはリンカーを介して連結された融合タンパク質とされる。このような融合タンパク質は、当技術分野において公知の方法、例えば、ＷＯ００／０１７３１、ＷＯ９９／０２５５２、特表２０００−５０６０１４号、またはFischer et al., Nature Biotech., 15, pp.142-145, 1997に記載の方法に従って製造することができる。
【００２２】
本発明の特に好ましい実施態様によれば、前記融合タンパク質は、ＩＬ−６Ｒの１１２番目のバリン残基から３３３番目のアラニン残基までの断片のＣ末端と、ＩＬ−６の３８番目のアスパラギン酸残基から２１２番目のメチオニン残基までの断片のＮ末端とが直接連結されたタンパク質（以下「ＦＰ６」という）とされる。この場合、この融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を宿主において発現可能なように連結したベクターを適当な宿主に導入し、形質転換された宿主を培養し、培養物からＦＰ６を採取することにより融合タンパク質ＦＰ６を製造することができる（ＷＯ００／０１７３１参照）。
【００２３】
ＩＬ６ＳＴ刺激因子の細胞培養培地への添加量は特に制限されないが、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌとされる。
【００２４】
本発明による多能性幹細胞の製造法において、ＩＬ−６ＳＴ刺激因子の使用は一つの主要な特徴である。特定の理論に拘束されるわけではないが、ＩＬ６ＳＴの活性化は、例えば、ＪＡＫキナーゼの活性化、ＳＴＡＴ３のリン酸化、リン酸化によりホモ二量体を形成したＳＴＡＴ３によるＪｕｎＢ、ＪＡＢなどの遺伝子の転写促進を順次引き起こし、結果として細胞増殖、細胞分化調節等を生じることが考えられる。よって、本発明においては、ＩＬ６ＳＴ刺激因子に替えて、活性化型ＪＡＫキナーゼ、リン酸化型ＳＴＡＴ３、ホモ二量体を形成させる変異を導入したＳＴＡＴ３Ｃ（J.F.Bromberg et. al., Cell, 98, pp-295-303, 1999）、エストロゲン類縁体により誘導性にホモ二量体を形成させるＳＴＡＴ３ＥＲ（T.Matsuda et al., EMBO Journal, 18, pp-4261-4269, 1999）、ＪＡＫキナーゼの阻害因子であるＳＯＣＳ分子の阻害剤などを、遺伝子またはタンパク質の形で細胞内に導入することも考えられる。
【００２５】
工程（ａ）において使用される「サイトカイン類」としては、トロンボポエチン（ＴＰＯ）およびその変異体ならびにそれらの誘導体、ｃ−ｍｐｌリガンド（ＴＰＯを除く）およびその誘導体、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージ・コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）のような増殖因子；抗ヒトＣＤ４０抗体、抗ヒトＣＤ３抗体、抗ヒトＣＤ２８抗体のような増殖刺激活性を有する抗体；リポ多糖（ＬＰＳ）のような増殖刺激因子；およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００２６】
本発明において「トロンボポエチン」（ＴＰＯ）とは、全長３３２アミノ酸残基のアミノ酸配列からなる、血小板産生を特異的に刺激または増大させる活性を有するタンパク質をいう（ＷＯ９５／２１９１９）。また、本発明において「ＴＰＯの変異体」とは、置換、欠失、挿入、および付加から選択される１以上の改変を有し、かつ血小板産生を特異的に刺激または増大させるＴＰＯの変異体を意味する。ＴＰＯの変異体としては、例えば、ＷＯ９５／１８８５８、特開平８−２７７２９６号公報、特開平８−２２８７８１号公報、およびＷＯ９５／２１９１９等に記載されているものが挙げられ、好ましくは、アミノ酸残基１番目から１６３番目までのアミノ酸配列からなるＴＰＯの変異体（断片）が挙げられる。
【００２７】
本発明において「ＴＰＯおよびその変異体の誘導体」とは、水溶性ポリマーを連結してなるＴＰＯおよびその変異体を意味する。水溶性ポリマーとしては、ポリエチレングリコール、好ましくは平均分子量が約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａであるポリエチレングリコールが挙げられる。ＴＰＯおよびその変異体のポリエチレングリコール化（ＰＥＧ化）は周知の方法に従って実施することができる（例えば、Focus on Growth Factors, 3, pp. 4-10, 1992参照）。水溶性ポリマー対「ＴＰＯおよびその変異体」タンパク質のモル比は１：１〜１００：１とすることができ、ポリＰＥＧ化の場合には１：１〜２０：１、モノＰＥＧ化の場合には１：１〜５：１とすることができる。
【００２８】
本発明において「ｃ−ｍｐｌリガンド」とは、ｍｐｌレセプターに結合可能なペプチド性リガンド、タンパク質性リガンド、および非ペプチド性リガンドを意味する。タンパク質性ｃ−ｍｐｌリガンド（ＴＰＯを除く）としては、巨核球の刺激剤としてのアゴニスト抗体（ＷＯ９９／０３４９５およびＷＯ９９／１０４９４）や造血レセプターアゴニストなどの他のタンパク質（ ＷＯ９６／２３８８８ 、ＷＯ９７／１２９７８、ＷＯ９７／１２９８５、ＷＯ９８／１７８１０、ＷＯ９６／３４０１６およびＷＯ００／２４７７０）が挙げられる。ペプチド性ｃ−ｍｐｌリガンドとしては、ＷＯ９６／４０１８９、ＷＯ９６／４０７５０、ＷＯ９８／２５９６５、特開平１０−７２４９２号、ＷＯ９９／４２１２７、およびＷＯ００／２４７７０に記載されているものが挙げられる。非ペプチド性ｃ−ｍｐｌリガンドとしては、ベンゾジアゼピン誘導体（特開平１１−１４７７号および特開平１１−１５２２７６号）や他の低分子リガンド（ＷＯ９９／１１２６２、ＷＯ９９／２２７３３、ＷＯ９９／２２７３４、ＷＯ００／３５４４６およびＷＯ００／２８９８７）が挙げられる。
【００２９】
本発明において「ｃ−ｍｐｌリガンドの誘導体」とは、水溶性ポリマーを連結してなるｃ−ｍｐｌリガンドおよびその変異体を意味する。水溶性ポリマーとしては、ポリエチレングリコール、好ましくは平均分子量が約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａであるポリエチレングリコールが挙げられる。ｃ−ｍｐｌリガンドのポリエチレングリコール化（ＰＥＧ化）は周知の方法に従って実施することができる（例えば、Focus on Growth Factors, 3, pp. 4-10, 1992参照）。水溶性ポリマー対ｃ−ｍｐｌリガンドタンパク質のモル比は１：１〜１００：１とすることができ、ポリＰＥＧ化の場合には１：１〜２０：１、モノＰＥＧ化の場合には１：１〜５：１とすることができる。
【００３０】
本発明において「幹細胞因子」（ＳＣＦ：stem cell factorまたはsteel factor）とは、造血および生殖発生に重要な機能を果たす、全長２７３アミノ酸残基のアミノ酸配列からなるタンパク質をいう。また、本発明において「ＳＣＦの変異体」とは、置換、欠失、挿入および付加から選択される１以上の改変を有し、かつＳＣＦのレセプターであるｃ−ｋｉｔ分子を特異的に刺激して活性化させるＳＣＦの変異体を意味する。ＳＣＦについては、シグナルペプチドであるＮ末端から２５番目のスレオニン残基までが欠失しても活性を保持していることが知られている。ＳＣＦは、Ｎ末端から１８９番目のアラニン残基と１９０番目のアラニン残基との間で、あるいは１９０番目のアラニン残基と１９１番目のセリン残基との間でタンパク質分解酵素により消化されることにより可溶化型ＳＣＦとして存在することが知られている。また、複数のオルタナティブフォームが存在することが知られており、Ｎ末端から１７５番目のセリン残基から２０２番目のイソロイシン残基までを欠失した膜結合型のＳＣＦが存在することが知られている。本発明においては、これらの変異体のいずれもが「ＳＣＦの変異体」として使用可能である。
【００３１】
本発明において「ＩＬ−３」は、造血幹・前駆細胞に作用し、コロニー形成を支持する活性を持つタンパク質である。また、ＩＬ−３は、肥満細胞、好酸球、好塩基球、好中球、単球などの分化した細胞の増殖因子として重要な機能を有する。ＩＬ−３は、全長１５２アミノ酸残基のアミノ酸配列からなる。また、本発明において「ＩＬ−３の変異体」とは、置換、欠失、挿入および付加から選択される１以上の改変を有し、かつＩＬ−３受容体を特異的に刺激して活性化させるＩＬ−３の変異体を意味する。ＩＬ−３については、シグナルペプチドであるＮ末端から１９番目のグルタミン残基までが欠失しても活性を保持していることが知られている。本発明においては、このような変異体を「ＩＬ−３の変異体」として使用することができる。
【００３２】
本発明において「Ｆｌｔ−３リガンド」（ＦＬ）は、造血幹・前駆細胞の増殖因子として重要な機能を持つタンパク質である。ＦＬは全長２３５アミノ酸残基のアミノ酸配列からなる膜結合蛋白質である。また、本発明において「ＦＬの変異体」とは、置換、欠失、挿入および付加から選択される１以上の改変を有し、かつＦｌｔ−３チロシンキナーゼ受容体を特異的に刺激して活性化させるＦＬの変異体を意味し、好ましくはアミノ酸残基１番目から１８５番目のプロリン残基までのアミノ酸配列からなるＦＬの変異体（断片）が挙げられる。ＦＬについては、シグナルペプチドであるＮ末端から２６番目のグリシン残基までが欠失しても活性を保持していることが知られている。本発明においては、これらの変異体のいずれもが「ＦＬの変異体」として使用可能である。
【００３３】
本発明の好ましい実施態様によれば、サイトカインは、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）およびその変異体ならびにそれらの誘導体、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）およびその変異体、ならびにこれらの２以上の組合わせから選択され、より好ましくは、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−３およびＦｌｔ−３リガンド、ならびにこれらの２以上の組合せから選択される。本発明の特に好ましい実施態様によれば、サイトカインは、ＳＣＦ、ＴＰＯおよびＩＬ−３の組合せ、またはＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−３およびＦｌｔ−３リガンドの組合せとされる。
【００３４】
工程（ａ）において用いられる細胞培養培地は、例えば、下記の群：顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）のような増殖因子；抗ヒトＣＤ４０抗体、抗ヒトＣＤ３抗体、抗ヒトＣＤ２８抗体のような増殖刺激活性を有する抗体；リポ多糖（ＬＰＳ）のような増殖刺激因子からなる群から選ばれる１種以上の増殖刺激因子をさらに含むものとしてもよい。これらの因子によるＩＬ６ＳＴの発現亢進により、多能性幹細胞の誘導がより効率化する場合もある。
【００３５】
これらサイトカインの細胞培養培地への添加量は特に制限されないが、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌとされる。
【００３６】
培養に用いる基礎培地としては、血球細胞などの体細胞および多能性細胞の増殖および生存が害されない限り特に制限されないが、例えば、Ｄ−ＭＥＭ培地、Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＭＥＭ−α培地、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＳｔｅｍＰｒｏ培地（以上、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｍＴｅＳＲ 1培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＨＥＳｃＧＲＯ培地（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、Ｎ２Ｂ２７培地、が好適に用いられる。培養温度は、通常２５〜３９℃、好ましくは３３〜３９℃である。また、培地に添加する物質としては、ウシ胎児血清、ヒト血清、ノックアウト血清リプレースメント（ＫｎｏｃｋＯｕｔＳｅｒｕｍＲｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、インシュリン、トランスフェリン、ラクトフェリン、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、モノチオグリセロール、２−メルカプトエタノール、ウシ血清アルブミン、ピルビン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、各種ビタミン、各種アミノ酸が挙げられる。ＣＯ２は、通常４〜１５％であり、５〜１０％が好ましい。Ｏ２は通常５〜２５％である。また、培養にはトロンボポエチン（ＴＰＯ）およびその変異体およびそれらの誘導体、ｃ−ｍｐｌリガンド（ＴＰＯを除く）およびその誘導体、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージ・コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）のような増殖因子；抗ヒトＣＤ４０抗体、抗ヒトＣＤ３抗体、抗ヒトＣＤ２８抗体のような増殖刺激活性を有する抗体；リポ多糖（ＬＰＳ）のような増殖刺激因子などのサイトカイン類の他に、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、骨形成因子（ＢＭＰ）ファミリー、ヘッジホッグ因子（Ｈｈ）ファミリー、ｂＦＧＦなどに代表される増殖因子、ＭＩＰ−１α、ＳＤＦ−１などのＣＣケモカインあるいはＣＸＣケモカイン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）のような造血ホルモン、Ｗｎｔファミリー遺伝子産物、Ｎｏｔｃｈリガンドファミリー遺伝子産物、塩化リチウム、ピペコリン酸、γ―アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）などの化合物を１０ｎｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌの範囲で添加することもできる。
【００３７】
本発明における培養では、培養用のシャーレ、フラスコ、培養バックを用いた培養が可能であるが、培地組成、ｐＨなどを機械的に制御し、高密度で培養が可能なバイオリアクターによって、その培養を改善することもできる。
【００３８】
培養に用いるフィーダー細胞としては、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）、ＳＮＬ細胞（A.P.McMahon and A.Bradley, Cell, 62, pp-1073-1085, 1990）、ＳＴＯ細胞などを用いることができる。フィーダー細胞の増殖を抑える方法としては、マイトマイシンＣ処理や放射線照射などの方法を用いることができる。また、フィーダー細胞に替えて、ＢＤマトリゲル（ＢＤバイオサイエンス社）などのマトリゲル、あるいはコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンなどの細胞外マトリックス蛋白質、あるいはゼラチンなどにより培養基材をコーティングする方法を用いることもできる。
【００３９】
本発明による多能性幹細胞の製造法は、体細胞を脱分化させる工程（以下「工程（ｂ）」という）をさらに含んでなる。この工程（ｂ）は、工程（ａ）の後に行ってもよいし、または工程（ａ）と同時に行ってもよい。
【００４０】
工程（ａ）と工程（ｂ）が同時に行われる実施態様では、上述のＩＬ６ＳＴ刺激因子およびサイトカインを含む上記細胞培養培地中で体細胞の脱分化が行われる。すなわち、工程（ａ）と工程（ｂ）が同時に開始される。この実施態様では、脱分化の過程で培地を他の培地、例えばＥＳ細胞培養用の培地に変更することもできる。すなわち、この実施態様では、工程（ａ）のみを先に終了させ、工程（ｂ）のみを継続してもよい。
【００４１】
工程（ａ）の後に工程（ｂ）が行われる実施態様では、上述のＩＬ６ＳＴ刺激因子およびサイトカインを含む上記細胞培養培地中での体細胞の培養が行われ、その後、体細胞の脱分化が行われる。ここで、体細胞の脱分化は工程（ａ）で用いられる培地と同じ培地を用いて行うことができる。すなわち、この実施態様では、工程（ａ）は工程（ｂ）よりも先に開始されるが、工程（ｂ）を開始するときに、工程（ａ）は必ずしも終了していなくてもよい。さらに、この実施態様では、脱分化の過程で培地を他の培地、例えばＥＳ細胞培養用の培地に変更することもできる。すなわち、この実施態様では、工程（ａ）のみを先に終了させ、工程（ｂ）のみを継続してもよい。
【００４２】
本発明において「脱分化」とは、分化した組織や器官の細胞が、より未分化性の高い状態に戻ることを意味し、言い換えれば、分化とは逆のプロセスをいう。工程（ｂ）における体細胞の脱分化は、当技術分野において公知の方法により行うことができる。
【００４３】
本発明の好ましい実施態様によれば、工程（ｂ）における体細胞の脱分化は、該体細胞の核初期化処理によって行われる。ここで、「核初期化」とは、体細胞の核が受精卵の状態に戻ることをいう。このような核初期化処理は、当技術分野において公知の方法、例えば、ＷＯ２００７／０６９６６６に記載の方法に従って行うことができる。
【００４４】
核初期化処理に用いられる核初期化因子としては、Ｏｃｔファミリー遺伝子（例えばＯｃｔ３／４遺伝子）、Ｋｌｆファミリー遺伝子（例えばＫｌｆ４遺伝子）、Ｓｏｘファミリー遺伝子（例えばＳｏｘ２遺伝子）およびＭｙｃファミリー遺伝子（例えばｃ−Ｍｙｃ遺伝子）の各遺伝子産物が知られている（ＷＯ２００７／０６９６６６）。従って、核初期化処理は、体細胞をこれらの遺伝子産物に接触させることによって行うことができる。あるいは、核初期化処理は、体細胞において、これらの遺伝子を活性化または発現させることによって行うこともできる。本発明の好ましい実施態様によれば、体細胞の核初期化処理は、Ｏｃｔファミリー遺伝子（例えばＯｃｔ３／４遺伝子）、Ｋｌｆファミリー遺伝子（例えばＫｌｆ４遺伝子）、Ｓｏｘファミリー遺伝子（例えばＳｏｘ２遺伝子）およびＭｙｃファミリー遺伝子（例えばｃ−Ｍｙｃ遺伝子）を、発現可能な形で体細胞に導入することを含む。
【００４５】
核初期化処理に用いられる培地は、例えば、下記の群：顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）のような増殖因子；抗ヒトＣＤ４０抗体、抗ヒトＣＤ３抗体、抗ヒトＣＤ２８抗体のような増殖刺激活性を有する抗体；リポ多糖（ＬＰＳ）のような増殖刺激因子からなる群から選ばれる１種以上の増殖刺激因子を含むものとしてもよい。これらの因子による核初期化遺伝子ファミリーの発現亢進により、多能性幹細胞の誘導がより効率化する場合もある。
【００４６】
核初期化処理に用いられる核初期化因子としては、上記の遺伝子に替えて、サイトカイン類、ケモカイン類、増殖因子類、低分子化合物、マイクロＲＮＡなどのリボ核酸等を用いてもよい。このような核初期化因子としては、例えば、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、骨形成因子（ＢＭＰ）ファミリー、ヘッジホッグ因子（Ｈｈ）ファミリー、ｂＦＧＦなどに代表される増殖因子、ＭＩＰ−１α、ＳＤＦ−１などのＣＣケモカインあるいはＣＸＣケモカイン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）のような造血ホルモン、Ｗｎｔファミリー遺伝子産物、Ｎｏｔｃｈリガンドファミリー遺伝子産物、塩化リチウム、ピペコリン酸、γ―アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）などの化合物、核初期化因子の発現を亢進させる低分子化合物、核初期化因子の転写調節に関わる因子のｓｉＲＮＡ等のマイクロＲＮＡ分子などが挙げられる。
【００４７】
核初期化処理に用いられる核初期化因子の細胞導入法は特に制限されるものではなく、例えば、レトロウィルスベクター、レンチウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、アデノウィルスベクター、単純ヘルペスウィルスベクター、ネコ内在ウィルスベクター、動物細胞用ベクター等を用いる方法が挙げられ、好ましくはレトロウィルスベクターまたはレンチウィルスベクターを用いる方法、より好ましくはレトロウィルスベクターを用いる方法が挙げられる。また、核初期化因子を細胞に注入する方法を用いてもよく、あるいは膜透過性の修飾を施すことにより各因子を細胞に添加する方法を用いてもよい。
【００４８】
核初期化処理に用いられる遺伝子の細胞導入法は特に制限されるものではなく、動物細胞への遺伝子導入に用いられる一般的な方法、例えば、モロニーマウス白血病ウィルス等のレトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウィルスベクター、レンチウィルスベクター等のウィルス由来の動物細胞用ベクターを用いる方法、リン酸カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ＨＶＪリポソーム法等を用いることができる。本発明の好ましい実施態様によれば、核初期化処理に用いられる遺伝子の細胞導入法は、ウィルス由来の動物細胞用ベクター、より好ましくはレトロウィルスベクターを用いる方法とされる。
【００４９】
本発明による多能性幹細胞の製造法において、出発材料として用いられる体細胞は特に制限されるものではなく、いかなる体細胞であってもよい。また、体細胞としては、採取された後に一旦凍結保存された細胞を用いてもよい。
【００５０】
本発明の好ましい実施態様によれば、前記体細胞は血球細胞とされる。本発明において「血球細胞」とは、生体内の血流中に存在しうる血液細胞と同等の細胞群を意味し、必ずしも末梢血液細胞に限られるものではなく、例えば骨髄中や臍帯血中に存在するものであってもよい。より具体的には、「血球細胞」とは、ＣＤ４５、ＣＤ１１aなどの血液細胞のマーカー分子を発現する細胞をいう。また、本明細書において、骨髄中に存在することが確認されている血球細胞を用いることにより、他の組織細胞からよりも効率的に多能性幹細胞を樹立できることが見出されている。よって、本発明の好ましい実施態様によれば、前記血球細胞は骨髄由来単核球細胞とされる。さらに、本発明の他の好ましい実施態様によれば、前記血球細胞は分化血液細胞とされる。このような血球細胞は、採取された後に一旦凍結保存された細胞であってもよい。
【００５１】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、前記体細胞（特に血球細胞）は、ＩＬ６ＳＴ刺激因子と上記サイトカインとの存在下での培養により、水疱性口内炎ウィルスのＧタンパク質を被覆タンパク質として持つレトロウィルスにより容易に感染する細胞とされる。このような細胞は、レトロウィルスベクターによって遺伝子を導入する上で有利である。
【００５２】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、前記体細胞（特に血球細胞）は、ＩＬ６ＳＴを高発現する細胞とされる。具体的には、ＩＬ６ＳＴはいずれの血球細胞においても発現しているが、中でも発現の高いＴ細胞、単球（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、ＤＣ細胞、ＣＤ３４陽性細胞などを用いることが考えられる。また、血球細胞以外でもＩＬ６ＳＴを高発現する体細胞を用いることで、効率よく多能性幹細胞を製造することができる。具体的には、肝臓、腎臓、骨格筋、肺、すい臓、心臓、小腸、脊髄、唾液腺などの細胞も利用することが可能である。
【００５３】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、前記体細胞（特に血球細胞）は、工程（ａ）または（ｂ）で用いられるサイトカインに対するレセプターを発現する細胞とされる。具体的には、ｃ−ｋｉｔ（ＳＣＦレセプター）、ｃ−ｍｐｌ（ＴＰＯレセプター）、およびＦｌｔ３を発現する細胞として、ＣＤ３４陽性細胞などを用いることが考えられる。また、ＩＬ−３Ｒα（ＩＬ−３レセプター）などを発現する細胞として、単球（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ）などを用いることが考えられる。血球細胞以外でも、ｃ−ｋｉｔを発現する細胞などが挙げられる。
【００５４】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、前記体細胞（特に血球細胞）は、核初期化因子の少なくとも１種を発現する細胞とされる。例えば、核初期化因子の１つであるＫｌｆ４を発現する細胞としては、血球細胞の中では、単球（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、ＤＣ細胞、ＣＤ３４陽性細胞などが挙げられ、その他の組織では、肺、骨格筋、小腸などが挙げられる。Ｋｌｆ４以外についても、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｏｃｔ３／４ファミリー遺伝子、Ｍｙｃファミリー遺伝子、またはＳｏｘファミリー遺伝子を発現する体細胞を用いることができる。また、Ｏｃｔ３／４ファミリー遺伝子やＮａｎｏｇ遺伝子などの初期化遺伝子については、それらの偽遺伝子を発現する細胞を体細胞として利用することもできる。
【００５５】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、前記体細胞（特に血球細胞）は、ＩＬ６ＳＴ刺激因子と上記のサイトカインとの存在下において核初期化因子の発現が上昇する細胞とされる。例えば、各サイトカインのレセプターであるｃ−ｋｉｔ（ＳＣＦレセプター）、ｃ−ｍｐｌ（ＴＰＯレセプター）、Ｆｌｔ３、ＩＬ−３Ｒα（ＩＬ−３レセプター）などを発現する細胞を用いることが考えられる。血球細胞の中では、ＣＤ３４陽性細胞、ＤＣ細胞などが挙げられる。また、上記サイトカインによるこれらのレセプターへの刺激により、核初期化因子であるＯｃｔ３／４ファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｍｙｃファミリー遺伝子、および／またはＳｏｘファミリー遺伝子の発現が上昇する細胞を用いることにより、これらすべての初期化因子を用いずとも、多能性幹細胞の製造が可能となる。
【００５６】
本発明の好ましい実施態様によれば、前記体細胞（特に血球細胞）はヒト細胞とされる。この実施態様では、本発明に用いられるＩＬ６ＳＴ刺激因子、サイトカイン、核初期化因子またはその遺伝子は、全てヒト由来のものとすることが好ましい。これにより、ヒトの多能性幹細胞を効率よく製造することが可能となる。
【００５７】
本発明に従って製造された細胞における脱分化または初期化の確認は、当技術分野において公知の方法によって行うことができる。このような方法としては、例えば、細胞表面に発現した未分化マーカーに対する抗体を用いて、蛍光励起細胞分離装置（ＦＡＣＳ）を利用して解析する方法が挙げられる。具体的には、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１などの未分化マーカーに対する抗体を利用することができる。また、ＮａｎｏｇやＯｃｔ３／４遺伝子といった未分化マーカーのレポーター遺伝子を細胞に導入して利用することもできる。
【００５８】
本発明の工程（ａ）において用いられる、ＩＬ６ＳＴ刺激因子および少なくとも１種のサイトカインを含む細胞培養培地は、製造された多能性幹細胞の性質を維持するために利用することもできる。すなわち、ＩＬ６ＳＴ刺激因子と上記のサイトカイン類は、核初期化プロセスの促進のみならず、核初期化後の初期化状態の維持に利用することもできる。
【００５９】
本発明による多能性幹細胞の製造法に用いられる試薬類をまとめて、キットとすることもできる。従って、本発明の他の態様によれば、体細胞から多能性幹細胞を製造するためのキットが提供され、該キットは、（ａ）ＩＬ−６シグナル伝達因子刺激因子および少なくとも１種のサイトカインを含む、体細胞を培養するための細胞培養培地、および（ｂ）体細胞を脱分化させるための試薬を含んでなる。
【００６０】
好適なＩＬ−６シグナル伝達因子刺激因子および好適なサイトカインについては上述したとおりである。また、体細胞を脱分化させるための試薬についても上述したとおりであるが、好ましくは、Ｏｃｔファミリー遺伝子、ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子、およびＭｙｃファミリー遺伝子を、発現可能な形で体細胞に導入するためのベクターを含む。本発明によるキットはさらに、多能性幹細胞の製造法に用いられる具体的方法に応じて、試薬類、反応容器、説明書等を含んでいてもよい。
【００６１】
本発明に従って製造された多能性幹細胞は、各種分化細胞に誘導することが可能であるため、細胞再生医療に利用することができる。すなわち、この多能性幹細胞は、患者本人の体細胞を用いた自家の細胞移植および細胞バンク等より入手した細胞を利用する同種の細胞移植の両者の移植系への利用が可能である。既に存在する血球細胞の大型細胞バンクからも多能性幹細胞の細胞バンクを構築することができる。
【００６２】
また、本発明によれば、各種疾病の患者からの血球細胞検体より、疾病情報に対応した多能性幹細胞バンクを構築することが可能である。さらに、健常人由来の血球細胞を初期化した多能性幹細胞を用いて各種分化細胞を誘導することにより、あるいは難治性疾患の患者より入手した血球細胞を用いて疾患のターゲット細胞を誘導することにより、創薬スクリーニングのツールとしての各種ヒトモデル細胞系の構築も可能である。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６４】
例１：ヒト骨髄由来単核球細胞からの多能性細胞の誘導（１）
Ａ．ヒト骨髄由来単核球細胞の培養
凍結保存されたヒト骨髄由来単核球細胞（ｈＢＭＭＮＣｓ）２．５×１０６細胞（Ａｌｌｃｅｌｌｓ社）を１００ｍｍペトリディッシュ２枚に播種し、３７℃、５％ ＣＯ２下、１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地で培養を開始した。一方のディッシュには、ヒトＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ）、およびヒトＩＬ−３（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加し、他方のディッシュにはＳＣＦ、ＴＰＯおよびＩＬ−３に加えてＦＰ６（２０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。ここで、ＳＣＦ、ＴＰＯおよびＩＬ−３からなるサイトカインカクテルを「ＳＴ３」と呼び、ＳＴ３にＦＰ６を加えたカクテルを「ＳＴ３ＦＰ６」と呼ぶ（以下同様）。培養開始２４時間後に、それぞれのディッシュにそれぞれのサイトカインカクテルを同濃度で再び添加した。培養開始４８時間後にそれぞれの細胞を回収し、１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地５００μｌで懸濁した。ＳＴ３存在下で培養した細胞懸濁液にはＳＴ３を各３００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加し、ＳＴ３ＦＰ６存在下で培養した細胞懸濁液には、ＳＴ３（各３００ｎｇ／ｍｌ）に加えてＦＰ６を６０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した。調製したｈＢＭＭＮＣｓを次のウィルス感染実験に用いた。
【００６５】
Ｂ．核初期化遺伝子を含む組換えレトロウィルスベクターの作製
コラーゲンタイプＩコート１００ｍｍディッシュ１２枚に、それぞれ４×１０６個のＧ３Ｔ−ｈｉ細胞（タカラバイオ社）を播種し、３７℃、５％ ＣＯ２下、１０％ ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地で培養した。培養２４時間後に、核初期化遺伝子１種類についてディッシュ３枚を用いてウィルスベクターの遺伝子導入を行った。各ディッシュにつき、ｐＧＰ ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社）６μｇ、ｐＶＳＶ−Ｇ ｖｅｃｔｏｒ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）６μｇ、およびレトロウィルスベクターｐＭＸｓ（T. Kitamura et al., Experimental Hematology, 31, pp.1007-1014, 2003；東京大学北村俊雄教授より供与）に核初期化遺伝子を挿入したプラスミド１２μｇを、遺伝子導入試薬ＦｕＧｅｎｅ６（ロシュダイグノスティック社）を用いて共導入した。用いた核初期化遺伝子は、ヒトＯｃｔ３／４、ヒトＳｏｘ２、ヒトＫｌｆ４、およびヒトｃ−ｍｙｃの４種類であった。核初期化遺伝子発現レトロウィルスベクター：ｐＭＸｓｈＯｃｔ３／４、ｐＭＸｓｈＳｏｘ２、ｐＭＸｓｈＫｌｆ４、およびｐＭＸｓｈｃ−ｍｙｃの構築は、山中らの方法に従って行った（K. Takahashi, S. Yamanaka, Cell, 131, pp.861-872, 2007）。遺伝子導入の約４８時間後に、核初期化遺伝子の種類ごとに培養液を回収し、培養液を０．４５μｍフィルターでろ過後、５８００×ｇ、４℃で４時間遠心し、培養上清を捨てることでウィルス沈殿を取得した。ウィルス沈殿は全て１つにまとめ、２ｍｌの１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地で懸濁した。最終的に液量は２．４ｍｌほどになった。
【００６６】
Ｃ．ヒト骨髄由来単核球細胞のウィルス感染処理
予め５０μｇ／ｍｌのレトロネクチン（タカラバイオ社）でコートされた１２ウェルプレートへ、懸濁したウィルス沈殿を１ウェルにつき１．２ｍｌずつ添加し、１０８０×ｇ、２０℃で２時間遠心した。遠心後のプレートに前記のｈＢＭＭＮＣｓの細胞懸濁液５００μｌを各ウェルに添加し、３７℃、５％ ＣＯ２にて培養を開始した。培養開始約２４時間後に、それぞれにサイトカインを再び添加した。
【００６７】
ウィルス感染開始から約４８時間後にトリプシンＥＤＴＡ液（ＧＩＢＣＯ社）で各ウェルの細胞を回収し、予め５×１０５個／ディッシュのマウス胚性線維芽細胞をフィーダー細胞としたゼラチンコート１００ｍｍディッシュに１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地を用いて細胞を播き直した。それぞれのディッシュにはサイトカインを再び添加した。さらに、約２４時間後および約７２時間後に、サイトカイン入りの１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地で培地交換を実施した。その後、ウィルス感染開始から６日後からは、ＳＴ３またはＳＴ３ＦＰ６を含まないヒトＥＳ細胞培養用の培地に交換した。用いた培地の組成は、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地（ＳＩＧＭＡ社）５００ｍｌ、非必須アミノ酸液（ＳＩＧＭＡ社）５ｍｌ、２００ｍＭ Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ社）６．２５ｍｌ、ＫＮＯＣＫＯＵＴTM Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ(ＫＳＲ)（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ社）１２５ｍｌ、２−メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ社）５μｌ、５Ｎ ＮａＯＨ ６３８μｌ、Ｈｕｍａｎ ｂＦＧＦ（ＵＢＩ社）終濃度５ｎｇ／ｍｌであった。
【００６８】
その後、毎日培地交換を実施した。ウィルス感染開始から１０日後には、両方のディッシュでいくつかのコロニーを確認した（図１Ｂ）。この時点でＳＴ３ＦＰ６存在下で培養したｈＢＭＭＮＣｓの場合、比較的大きな扁平コロニーを含んでいたのに対し、ＳＴ３存在下で培養したｈＢＭＭＮＣｓの場合は出現したコロニーはまだ小さく、マウスＥＳ細胞に似た形態のコロニーであった。１５日後には各２４個のコロニーをピックアップし、残りの細胞を予めフィーダー細胞を播いたゼラチンコート１００ｍｍディッシュに再播種した。２０日後に再びコロニーをピックアップし、残りの細胞の半分を播種し、さらに残りの半分の細胞について、ＦＡＣＳによりヒトＥＳ細胞マーカーＳＳＥＡ−４の発現確認を行った（図１Ａ）。ＦＡＣＳによる解析では、回収した細胞をｓｔａｉｎｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ（ＳＭ）（５％ ＦＢＳ、０．０５％ ＮａＮ３、および０．５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）３〜５ｍｌで洗浄後、フィコエリスリン結合抗ＳＳＥＡ４抗体（ＢＤバイオサイエンス社）５μｌを添加し、氷中で１５分静置した。ＳＭ６ｍｌで洗浄後、死細胞を検出するための試薬ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）１μｇ／ｍｌを含むＳＭ液１ｍｌで再懸濁し、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤバイオサイエンス社）またはＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＳＯＲＰ（ＢＤバイオサイエンス社）を用いて測定を行った。その結果、ＳＴ３ＦＰ６存在下で培養したｈＢＭＭＮＣｓを用いた場合、レトロウィルス感染２０日後の時点で、幹細胞マーカーであるＳＳＥＡ−４を発現する細胞が約４０％に達し、ＦＰ６を添加しなかった場合の約１５％に比して２．５倍以上に達していることが示された。また、ヒトＥＳ細胞においてはアルカリフォスファターゼが発現していることが知られている。そこで、２７日後の時点で、常法に従ってアルカリフォスファターゼ活性染色を行った（図１Ｃ）。その結果、この時点でのコロニーのほとんどがアルカリフォスファターゼ陽性であることを確認した。以上より、ＳＴ３ＦＰ６存在下で培養したｈＢＭＭＮＣｓを用いた場合、多能性幹細胞の出現時期、細胞数において、ＳＴ３存在下で培養したｈＢＭＭＮＣｓを用いた場合を顕著に上回っていることが明らかとなった。
【００６９】
例２：ヒト骨髄由来単核球細胞からの多能性細胞の誘導（２）
Ａ．ヒト骨髄由来単核球細胞の培養
凍結保存されたヒト骨髄由来単核球細胞（ｈＢＭＭＮＣｓ）２．５×１０6細胞（Ａｌｌｃｅｌｌｓ社）を１００ｍｍペトリディッシュ１枚に播種し、３７℃、５％ ＣＯ２下、１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地で培養を開始した。培地には、ヒトＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＩＬ−３（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＦｌｔ３リガンド（１００ｎｇ／ｍｌ）、およびＦＰ６（２０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。ここで、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−３、Ｆｌｔ３リガンド、およびＦＰ６からなるサイトカインカクテルを「ＳＴ３ＦＬＦＰ６」と呼ぶ（以下同様）。培養開始２４時間後に、ＳＴ３ＦＬＦＰ６を同濃度で再び添加した。培養開始４８時間後に細胞を回収し、総細胞数５×１０５個の細胞を１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地５００μｌで懸濁した。細胞懸濁液には、ＳＴ３ＦＬ（各３００ｎｇ／ｍｌ）に加え、ＦＰ６を６０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した。調製したｈＢＭＭＮＣｓを次のウィルス感染実験に用いた。
【００７０】
Ｂ．核初期化遺伝子を含む組換えレトロウィルスベクターの作製
コラーゲンタイプＩコート１００ｍｍディッシュ１６枚に、それぞれ２．５×１０６個のＧ３Ｔ−ｈｉ細胞（タカラバイオ社）を播種し、３７℃、５％ ＣＯ２下、１０％ ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地で培養した。培養２４時間後に、核初期化遺伝子１種類についてディッシュ４枚を用いてウィルスベクターの遺伝子導入を行った。各ディッシュにつき、ｐＧＰ ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社）６μｇ、ｐＶＳＶ−Ｇ ｖｅｃｔｏｒ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）６μｇ、およびレトロウィルスベクターｐＭＸｓに核初期化遺伝子を挿入したプラスミド１２μｇを、遺伝子導入試薬ＦｕＧｅｎｅ６（ロシュダイグノスティック社）を用いて共導入した。用いた核初期化遺伝子は、ヒトＯｃｔ３／４、ヒトＳｏｘ２、ヒトＫｌｆ４、ヒトｃ−ｍｙｃの４種類であった。遺伝子導入の約４８時間後に、核初期化遺伝子の種類ごとに培養液を回収し、培養液を０．７５μｍフィルターでろ過後、５０００×ｇ、４℃で４時間遠心し、培養上清を捨てることでウィルス沈殿を取得した。ウィルス沈殿は全て１つにまとめ、５００μｌの１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地を加えて再懸濁したところ、最終的に液量は１ｍｌほどになった。
【００７１】
Ｃ．ヒト骨髄由来単核球細胞のウィルス感染処理
予め５０μｇ／ｍｌのレトロネクチン（タカラバイオ社）でコートされた１２ウェルプレート中の１つのウェルに、懸濁したウィルス沈殿を添加し、１０８０×ｇ、２０℃で２時間遠心した。遠心後のプレートに前記のｈＢＭＭＮＣｓの細胞懸濁液５００μｌを添加し、３７℃、５％ ＣＯ２にて培養を開始した。培養開始約２４時間後に、ＳＴ３ＦＬＦＰ６入りの培地で培地交換を実施した。
【００７２】
ウィルス感染開始から約４８時間後にトリプシンＥＤＴＡ液（ＧＩＢＣＯ社）で細胞を回収し、予め５×１０５個／ディッシュのマウス胚性線維芽細胞をフィーダー細胞としたゼラチンコート１００ｍｍディッシュに、１０％ＦＢＳおよびＳＴ３ＦＬＦＰ６を補充したＤＭＥＭ培地を用いて細胞を播き直した。さらに、約４８時間後に１０％ＦＢＳおよびＳＴ３ＦＬＦＰ６を補充したＤＭＥＭ培地で培地交換を実施した。その後、ウィルス感染開始から６日後からは、ＳＴ３ＦＬＦＰ６を含まないヒトＥＳ細胞培養用の培地（例１Ｃに記載）に交換した。
【００７３】
その後、毎日培地交換を実施した。ウィルス感染開始から１１日後には、両方のディッシュでいくつかのコロニーを確認した。１８日後には各２４個のコロニーをピックアップし、残りの細胞を予めフィーダー細胞を播いたゼラチンコート１００ｍｍディッシュに再播種した。２２日後の細胞を回収し、例１の方法に倣い、ＦＡＣＳによりヒトＥＳ細胞マーカーであるＳＳＥＡ−４の発現を解析した。その結果を図２に示す。
【００７４】
例３：レトロウィルス感染性ヒト骨髄由来単核球細胞の解析
Ａ．ヒト骨髄由来単核球細胞のレトロウィルス感染性の分析
凍結保存されたｈＢＭＭＮＣｓ（Ａｌｌｃｅｌｌｓ社）を用いて、レトロウィルスの感染効率についての検討を行った。例１の方法に倣い、核初期化因子発現ｐＭＸｓベクターの代わりに、緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰを発現するｐＭＸｓＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（ｐＭＸｓＩＧ）ベクター（T. Kitamura et al., Experimental Hematology, 31, pp.1007-1014, 2003；東京大学北村俊雄教授より供与）を用いて実施した。
【００７５】
ｈＢＭＭＮＣｓの培養条件は以下の３種類で実施した：(i)サイトカインを添加せずに、解凍後の細胞を用いてレトロウィルス感染を行った；(ii)例１と同様に、１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地にヒトＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ）、およびヒトＩＬ−３（１００ｎｇ／ｍｌ）を加えて（ＳＴ３）、前培養およびレトロウィルス感染を実施した；(iii)例１と同様に、１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地にヒトＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＩＬ−３（１００ｎｇ／ｍｌ）、およびＦＰ６（２０ｎｇ／ｍｌ）を加えて（ＳＴ３ＦＰ６）、前培養およびレトロウィルス感染を実施した。
【００７６】
レトロウィルスの調製および感染方法は例１と同様に実施した。感染２日後に細胞を回収し、細胞をＳＭ液で洗浄後、ＰＩ（１μｇ／ｍｌ）を含むＳＭ液１ｍｌで再懸濁し、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤバイオサイエンス社）を用いてＦＡＣＳ解析を行った（図３）。その結果、サイトカインを添加した培養を行わない(i)の場合、レトロウィルスに感染する細胞は全く検出できなかったのに対して、ＳＴ３を添加（(ii)）することにより、生細胞中約４％の細胞がレトロウィルスに感染するようになり、さらにＦＰ６を加えてＳＴ３ＦＰ６を添加（(iii)）することにより、レトロウィルスに感染する細胞は約８％に増加した。一方で、本例にて使用したレトロウィルスをコントロール細胞のＮＩＨ３Ｔ３細胞に感染させたところ、９９％の効率で感染が可能であったことから、レトロウィルスそのものの感染能力は十分であった。
【００７７】
Ｂ．感染細胞の表面抗原マーカーの分析
次に、例１および例２と同様にＳＴ３、ＳＴ３ＦＰ６またはＳＴ３ＦＬＦＰ６存在下で培養したｈＢＭＭＮＣｓに対して、ｐＭＸｓＩＧベクターより作製したレトロウィルスを感染させた場合の、ＥＧＦＰ陽性の感染細胞について、各種表面抗原マーカーに対する抗体を用いて免疫染色を行い、ＦＡＣＳを用いて解析を行った。
【００７８】
回収した細胞をＳＭ液３〜５ ｍｌで洗浄後、各種抗体５μｌを添加し、氷中で１５分静置した。ＳＭ６ｍｌで洗浄後、ＰＩ（１μｇ／ｍｌ）を含むＳＭ液１ｍｌで再懸濁し、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤバイオサイエンス社）にて測定を行った。用いた抗体は、アロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ４５抗体、アロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ３４抗体、フィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ３８抗体、アロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ１１ｂ抗体（以上、ＢＤバイオサイエンス社）、フィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ３抗体、フィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ１１７抗体、およびフィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ１９抗体（以上、ＩＭＭＵＮＯＴＥＣＨ社）であった。ＣＤ４５抗原は、すべてのヒト白血球、すなわちリンパ球、好酸球、単球、好塩基球、および好中球の表面に発現する。ＣＤ３４抗原は、最も未分化な造血幹細胞と造血前駆細胞に発現する。ＣＤ３８抗原は活性化したＴおよびＢリンパ球、ＮＫ細胞、単球、形質細胞および胸腺髄質細胞に発現する。ＣＤ１１ｂ抗原は、骨髄単球系細胞にみられ、ＮＫ細胞、顆粒球、単球／マクロファージに強く発現する。ＣＤ３抗原は、成熟Ｔ細胞および胸腺細胞に発現する。ＣＤ１１７抗原はごく少数の正常骨髄細胞にしか発現していないが、肥満細胞にも発現する。ＣＤ１９抗原は初期Ｂ細胞を含むすべての正常Ｂ細胞に発現するが、形質細胞に成熟すると消失する。
【００７９】
解析の結果、レトロウィルス感染細胞のほぼ全てにおいて白血球のマーカーであるＣＤ４５は陽性であり、ＳＴ３ではほぼすべてがＣＤ３４陽性細胞であり、ＳＴ３ＦＰ６またはＳＴ３ＦＬＦＰ６では約６０％がＣＤ３４陽性細胞であった。一方で、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３、ＣＤ１９といったマーカーはいずれも陰性であった（図４）。
【００８０】
例４：レトロウィルス感染性ヒト末梢血由来単核球細胞の解析
凍結保存されたヒト末梢血由来単核球細胞（ｈＰＢＭＮＣｓ）（Ａｌｌｃｅｌｌｓ社）に対して、例３と同様にｐＭＸｓＩＧベクターを用いてレトロウィルスの感染実験を行った。サイトカインカクテルを用いてｈＰＢＭＮＣｓを培養した場合の感染効率とＥＧＦＰ陽性の感染細胞について、各種表面抗原マーカーに対する抗体を用いて免疫染色を行い、ＦＡＣＳを用いて感染細胞の同定を行った。
【００８１】
ｈＰＢＭＮＣｓの培養には、１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地にヒトＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＩＬ−３（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＦＰ６（２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ３リガンド（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加して培養したＧＭ培養系と、ヒトＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＩＬ−３（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＦＰ６（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）、抗ヒトＣＤ４０抗体 ＃３４１（キリンファーマ社）（１００ｎｇ／ｍｌ）、抗ヒトＣＤ３抗体（ＯＫＴ３ ヤンセンファーマ）（１μｇ／ｍｌ）、抗ヒトＣＤ２８抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（１μｇ／ｍｌ）を添加して前培養したＴＢ培養系の２通りの培養系を用いて、レトロウィルス感染を実施した。レトロウィルスの調製および感染方法は例１と同様に実施した。感染２日後に細胞を回収し、回収した細胞をＳＭ液３〜５ｍｌで洗浄後、各種抗体５μｌを添加し、氷中で１５分静置した。ＳＭ６ｍｌで洗浄後、ＰＩ（１μｇ／ｍｌ）を含むＳＭ液１ｍｌで再懸濁し、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤバイオサイエンス社）にて測定を行った。
【００８２】
用いた抗体は、アロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ４５抗体、アロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ３４抗体、フィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ３８抗体、アロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ１１ｂ抗体、フィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ１３抗体（以上、ＢＤバイオサイエンス社）、フィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ３抗体、フィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ１１７抗体、およびフィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ１９抗体（以上、ＩＭＭＵＮＯＴＥＣＨ社）であった。ＣＤ１３抗原は、正常末梢血の好中球、好酸球、好塩基球および単球など、ほとんどの骨髄系細胞に発現する。
【００８３】
解析の結果、レトロウィルス感染細胞のほぼ全てにおいて白血球のマーカーであるＣＤ４５は陽性であり、ＧＭ培養系では骨髄細胞を用いた場合と同様に、約半数がＣＤ３４陽性であった。ＴＢ培養系においてはＴ細胞のマーカーであるＣＤ３抗原陽性であった（図５）。本系を用いることにより、末梢血中に存在するＴ細胞などから多能性細胞を誘導できる可能性が考えられる。
【００８４】
例５：ヒト誘導多能性細胞クローンの表面抗原解析
例１および例２の結果クローニングした細胞株について、コロニー形態の観察およびＦＡＣＳによりヒトＥＳ細胞マーカーＳＳＥＡ−４の発現確認を行った。ＦＡＣＳ解析の方法は例１と同様に行った。
【００８５】
ＳＴ３の培養条件を用いて取得したクローン＃１６および＃３０、ＳＴ３ＦＰの培養条件を用いて取得したクローン＃２２および＃３３、ＳＴ３ＦＬＦＰの培養条件を用いて取得したクローン＃１および＃４について解析した結果を図６に示す。いずれのクローンも幹細胞マーカーであるＳＳＥＡ−４を有意に発現していることを確認した。
【００８６】
例６：ヒト誘導多能性細胞クローンのＲＴ−ＰＣＲ解析
例５で解析したクローンを含め、例１および例２の結果取得した多能性幹細胞クローンについて、幹細胞特異的遺伝子のｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲ法を用いて解析した。
【００８７】
各クローン細胞をマウス胚性線維芽細胞のフィーダー細胞上に播種し、ヒトＥＳ細胞用培地にて培養した細胞よりＲＮＡを回収した。用いた培地の組成は、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地（ＳＩＧＭＡ社）５００ｍｌ、非必須アミノ酸液（ＳＩＧＭＡ社）５ｍｌ、２００ｍＭ Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ社）６．２５ｍｌ、ＫＮＯＣＫＯＵＴTM Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ(ＫＳＲ)（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ社）１２５ｍｌ、２−メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ社）５μｌ、５Ｎ ＮａＯＨ ６３８μｌ、Ｈｕｍａｎ ｂＦＧＦ（ＵＢＩ社）終濃度５ｎｇ／ｍｌであった。回収した細胞はＰＢＳ緩衝液で洗浄後、細胞沈殿を液体窒素中にて凍結した。コントロール細胞として、凍結融解後のＢＭＭＮＣｓをフィーダー細胞上で数時間培養した細胞およびフィーダー細胞（ＭＥＦ細胞）を用意した。凍結後の細胞サンプルより、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、添付プロトコルに従って全ＲＮＡを調製した。調製したＲＮＡを用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により添付のプロトコルに従ってｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを鋳型として、ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）を用いて、９６℃−２０秒、５５℃−３０秒、および７２℃−３０秒からなる工程を１サイクルとして３５サイクルのＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応に用いたプライマーは山中らと同様のものを用いており（K. Takahashi, S. Yamanaka, Cell, 131, pp.861-872, 2007）、各プライマーの塩基配列を表１に示す。各ＰＣＲ反応は各遺伝子についてフォワード（Ｆｗ）プライマーとリバース（Ｒｖ）プライマーとの組合せを用いて実施した。ＲＴ反応およびＰＣＲ反応のコントロールとして、ハウスキーピング遺伝子であるｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−3−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子を用いた。ＰＣＲ反応物をエチジウムブロマイド入りのアガロースゲルにて電気泳動し、ＵＶトランスイルミネーターにより観察した結果を図７に示す。解析の結果、いずれのクローンも幹細胞マーカー遺伝子を発現していることを確認した。
【００８８】
【表１】
【００８９】
例７：マウス骨髄由来単核球細胞からの多能性細胞の誘導（１）
Ａ．マウス骨髄由来単核球細胞の取得
未分化な多能性幹細胞において緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰを発現することが知られているＯｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス（１０〜２０週齢）（K. Ohbo et al., Dev. Biol., 258, pp.209-225, 2003; 横浜市立大学 大保和之准教授より供与）の大腿骨内の骨髄を採取し、ＰＢＳに懸濁した。定法に従い（高津聖志、免疫研究の基礎技術、羊土社1995）、骨髄から比重遠心法により単核球細胞画分を濃縮し、これをマウス骨髄単核球細胞（ｍＢＭＭＮＣｓ）として用いた。
【００９０】
Ｂ．核初期化遺伝子を含む組換えレトロウィルスベクターの作製
コラーゲンタイプＩコート６０ｍｍディッシュ１０枚にそれぞれ１×１０６個、および６ウェルプレートの各ウェルに１×１０５個のレトロウィルス用のパッケージング用細胞：ＰＬＡＴ−Ｅ細胞（S.Morita et al., Gene Therapy, 7, pp.1063-1066, 2000；東京大学北村俊雄教授より供与）を播種し、３７℃、５％ ＣＯ２下、１０％ ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地で培養した。培養２４時間後に、マウス核初期化遺伝子１種類について６０ｍｍディッシュ２枚を用いてウィルスベクターの遺伝子導入を行った。各ディッシュにつき、レトロウィルスベクターｐＭＸｓに核初期化遺伝子を挿入したプラスミド３μｇを遺伝子導入試薬ＦｕＧｅｎｅ６（ロシュダイグノスティック社）を用いて導入した。用いた核初期化遺伝子は、マウスＯｃｔ３／４、マウスＳｏｘ２、マウスＫｌｆ４、およびマウスｃ−ｍｙｃの４種類であった。核初期化遺伝子発現レトロウィルスベクター、ｐＭＸｓｍＯｃｔ３／４、ｐＭＸｓｍＳｏｘ２、ｐＭＸｓｍＫｌｆ４、およびｐＭＸｓｍｃ−ｍｙｃの構築は、山中らの方法に従って行った（K. Takahashi, S. Yamanaka, Cell, 126, pp.663-676, 2006）。その他に、６０ｍｍディッシュ１枚と６ウェルプレートの３ウェル分において、上記４種類の遺伝子各３μｇのＤＮＡを併せて導入した。また、コントロールとして緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰを発現するｐＭＸｓＩＧベクター３μｇを６０ｍｍディッシュ１枚に導入した。遺伝子導入の約４８時間後に、各核初期化遺伝子について６０ｍｍディッシュ１枚ずつを集めて０．２２μｍフィルターでろ過後、５８００×ｇ、４℃で４時間遠心し、培養上清を捨てた後に３ｍｌのマウスＥＳ細胞用培地で再懸濁した濃縮ウィルスサンプル(i)を取得した。マウスＥＳ細胞用培地としては、２０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地に１／１００容の２-メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ社）、１／１０００容のＥＳＧＲＯ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社）を添加したものを用いた。また、各核初期化遺伝子について６０ｍｍディッシュ１枚ずつを集めて０．２２μｍフィルターでろ過しただけのものを４ウィルスサンプル(ii)とした。４種類の遺伝子を同時に導入した６０ｍｍディッシュ１枚と６ウェルプレートの３ウェル分の培養上清に
ついては、０．２２μｍフィルターでろ過し、４遺伝子サンプル(iii)とした。コントロールのｐＭＸｓＩＧベクターを導入した培養上清については、０．２２μｍフィルターでろ過したものをコントロールサンプル(iv)とした。
【００９１】
Ｃ．マウス骨髄由来単核球細胞のウィルス感染処理
予め３３μｇ／ｍｌのレトロネクチン（タカラバイオ社）でコートされた１２ウェルプレートの２ウェルずつに上記(i)〜(iv)のサンプルを添加し、１０８０×ｇ、２５℃で２時間遠心した。遠心後のプレートからウィルスサンプルを除去し、新たなマウスＥＳ細胞用培地を１ｍｌずつ添加した。さらに、(i)〜(iv)の各サンプルの一方のウェルには、マウスＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ）、およびマウスＩＬ−３（１００ｎｇ／ｍｌ）（ＳＴ３）を添加した。その後、各ウェルに前記のＯｃｔ４−ＥＧＦＰマウスより調製したｍＢＭＭＮＣｓを１×１０５個／ウェルになるよう添加し、３７℃、５％ ＣＯ２にて培養を開始した。
【００９２】
また、ウィルス感染前日に、Ｏｃｔ４ＥＧＦＰマウス由来胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を１２ウェルプレートに２×１０４個／ウェルで播種して培養していた各ウェルについても、上記(i)〜(iv)のサンプルを１ウェルずつに添加し、１０８０×ｇ、３２℃で４０分間遠心した後、３７℃、５％ ＣＯ２にて培養を開始した。
【００９３】
ウィルス感染２日後のコントロールサンプルにおけるＥＧＦＰ発現細胞の割合は、ＭＥＦ細胞では３４％、サイトカインなしのｍＢＭＭＮＣｓでは５５％、ＳＴ３存在下のｍＢＭＭＮＣｓでは６０％であった。
【００９４】
４ウィルスサンプル（(ii)）を感染させたｍＢＭＭＮＣｓについては、サイトカインの添加、非添加に関わらず、ウィルス感染開始から５日後にはＯｃｔ４−ＥＧＦＰレポーター遺伝子によるＥＧＦＰ遺伝子の発現が認められた（図８Ａ・Ｂ）。一方で、ＭＥＦについてはこの時点ではＥＧＦＰ遺伝子発現細胞の存在は認められなかった（図８Ｃ）。ウィルス感染７日後に、ｍＢＭＭＮＣｓ由来各サンプルについて、Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰレポーター遺伝子の発現と血球細胞マーカーであるＣＤ４５抗原の発現のＦＡＣＳ解析を実施した。この解析のために、回収した細胞をＳＭ液３〜５ ｍｌで洗浄後、アロフィコシアニン結合抗マウスＣＤ４５抗体（ＢＤバイオサイエンス社）５μｌを添加し、氷中で１５分静置した。ＳＭ６ｍｌで洗浄後、ＰＩ（１μｇ／ｍｌ）を含むＳＭ液１ｍｌで再懸濁し、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤバイオサイエンス社）にて測定を行った。その結果を図９および表２に示す。ＦＡＣＳ解析前の細胞の様子を図１０に示す。感染前のｍＢＭＭＮＣｓはそのほぼ全てがＣＤ４５抗原陽性であるのに対し、この時点でのＯｃｔ４−ＥＧＦＰ陽性細胞の多くは既にＣＤ４５抗原陰性であった。また同時に、ＦＡＣＳ ｓｏｒｔｉｎｇによりＥＧＦＰ陽性細胞の分取を行い、それらの細胞からクローニングを実施し、マウス骨髄由来誘導多能性幹細胞（ｍＢＭｉＰＳ）クローン＃７および＃１３を取得した。取得した各クローンについてもＦＡＣＳ解析を実施した（図１１）。
【００９５】
【表２】
【００９６】
ＦＡＣＳによる解析では、回収した細胞をＳＭ液３〜５ ｍｌで洗浄後、各種抗体５μｌを添加し、氷中で１５分静置した。ＳＭ６ｍｌで洗浄後、ＰＩ（１μｇ／ｍｌ）を含むＳＭ液１ｍｌで再懸濁し、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤバイオサイエンス社）またはＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＳＯＲＰ（ＢＤバイオサイエンス社）を用いて測定を行った。抗体としては、アロフィコシアニン結合抗マウスＣＤ４５抗体（ＢＤバイオサイエンス社）、およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７結合抗マウスＳＳＥＡ−１抗体を用いた。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７結合抗マウスＳＳＥＡ−１抗体は、抗マウスＳＳＥＡ−１抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社）１００μｇをＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて標識することにより調製した。
【００９７】
例８：マウス骨髄由来単核球細胞からの多能性細胞の誘導（２）
Ａ．核初期化遺伝子を含む組換えレトロウィルスベクターの作製
コラーゲンタイプＩコート６０ｍｍディッシュ１２枚にそれぞれ７×１０５個のＰＬＡＴ−Ｅ細胞を播種し、３７℃、５％ ＣＯ２下、１０％ ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地で培養した。培養２４時間後に、各種遺伝子導入を行った。１２枚のうち４枚については、マウス核初期化遺伝子１種類について６０ｍｍディッシュ１枚を用いてウィルスベクターの遺伝子導入を行った。各ディッシュにつき、レトロウィルスベクターｐＭＹｓ（T. Kitamura et al., Experimental Hematology, 31, pp.1007-1014, 2003；東京大学北村俊雄教授より供与）に核初期化遺伝子を挿入したプラスミド４μｇを遺伝子導入試薬ＦｕＧｅｎｅ６（ロシュダイグノスティック社）を用いて導入した。用いた核初期化遺伝子は、ヒトＯｃｔ３／４、ヒトＳｏｘ２、ヒトＫｌｆ４、およびヒトｃ−ｍｙｃの４種類であった。６０ｍｍディッシュ４枚について、上記４種類の遺伝子各４μｇのＤＮＡを併せて導入した。また、コントロールとして緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰを発現するｐＭＹｓＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（ｐＭＹｓＩＧ）ベクター１６μｇを６０ｍｍディッシュ４枚に導入した。
【００９８】
遺伝子導入の約４８時間後に、各核初期化遺伝子を個別に導入した６０ｍｍディッシュ計４枚を集めて４ウィルスサンプルとし、４種同時に導入した計４枚を集めて４遺伝子サンプルとし、ｐＭＹｓＩＧベクターを導入した計４枚を集めてコントロールサンプルとした。いずれのサンプルについても、０．２２μｍフィルターでろ過後、５８００×ｇ、４℃で４時間遠心し、培養上清を捨てた後に２．５ｍｌのマウスＥＳ細胞用培地で再懸濁し、再び０．２２μｍフィルターでろ過を行った。
【００９９】
Ｂ．細胞のウィルス感染処理
レトロネクチン（タカラバイオ社）でコートされた１２ウェルプレートの２ウェルずつに４ウィルスサンプル、４遺伝子サンプル、およびコントロールサンプルをそれぞれ添加し、１０８０×ｇ、２５℃で２時間遠心した。遠心後のプレートからウィルスサンプルを除去し、各サンプルのウェルに対して、マウスＥＳ細胞用培地で懸濁したＯｃｔ４−ＥＧＦＰマウスＢＭＭＮＣｓまたはＯｃｔ４−ＥＧＦＰマウスＭＥＦ細胞を１×１０５個／ウェルになるよう添加し、３７℃、５％ ＣＯ２にて培養を開始した。
【０１００】
また、ウィルス感染前日に、Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰマウスＭＥＦ細胞をゼラチンコート１２ウェルプレートに２×１０４個／ウェルで播種して培養していた各ウェルについても、上記３種のサンプルを１ウェルずつに添加し、１０８０×ｇ、２５℃で４０分間遠心した後、３７℃、５％ ＣＯ２にて培養を開始した。
【０１０１】
ウィルス感染開始２日後のコントロールサンプルにおけるＥＧＦＰ発現細胞の割合は、レトロネクチンコートプレートで感染させたＭＥＦ細胞では９５％、ゼラチンコートプレートで予め培養していたＭＥＦ細胞では６５％、レトロネクチンコートプレートで感染させたｍＢＭＭＮＣｓでは２６％であった（図１２）。その後、ウィルス感染開始から７日目にＦＡＣＳ ｓｏｒｔｉｎｇを行い（図１３）、１２日目に出現コロニー数を計測した。その結果を表３にまとめた。
【０１０２】
【表３】
【０１０３】
例９：マウス骨髄由来多能性細胞の多分化能解析
ｍＢＭｉＰＳクローン＃７および＃１３について分化多能性を評価するため、ヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃＡＪｃｌ−ｎｕ）の皮下への移植を行った。未分化ＥＳ細胞は生体内に移植されると奇形腫を形成することが知られている。コントロール細胞としてマウスＥＳ細胞Ｅ１４株を使用した。ヌードマウス１匹あたり各細胞１×１０６個を１００μｌ血清非含有ＤＭＥＭ培地で懸濁して皮下投与した。その結果、マウスＥＳ細胞を移植した場合と同様の大きさの奇形腫瘍がｍＢＭｉＰＳ細胞を移植した全例でも形成された。移植後２週間後および４週間後の腫瘍を摘出し、ホルマリン固定により組織標本を作製した。組織学的な解析の結果、いずれのクローン由来の奇形腫においても、神経組織、軟骨組織、筋組織、脂肪組織、食道粘膜様組織、気管上皮などが認められたことから、ｍＢＭＭＮＣｓより誘導された各クローンが多能性を有することが証明された（図１４）。
【０１０４】
さらにｍＢＭｉＰＳクローン＃７細胞をＢａｌｂ／ｃマウスの受精卵から作製した胚盤胞に注入後、偽妊娠マウスに移植することによりキメラ個体を作出することを試みた。その結果、Ｂａｌｂ／ｃマウスの産仔は白色の毛色を示すはずのところ、ｍＢＭｉＰＳ細胞に由来する黒色の毛色を有するキメラマウスが誕生した（図１５および表４）。毛色は全身の細胞の一部を反映するものであり、他の組織・臓器においてもｍＢＭｉＰＳ細胞に由来する細胞が個体を構成しているものと考えられた。
【０１０５】
【表４】
【０１０６】
例１０：マウス骨髄由来多能性細胞の発現プロファイル解析
ｍＢＭｉＰＳクローン＃７および＃１３について、各５×１０５個の細胞からＲＮＡｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｐｌｕｓ ｋｉｔ (ＱＩＡＧＥＮ社)を用いてＲＮＡを調製し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｒｒａｙ （Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いて発現プロファイル解析を実施した。コントロールとしてマウスＥＳ細胞Ｅ１４株およびマウスＢＭＭＮＣ細胞を使用した。その結果、図１６に示すような各遺伝子の発現パターンを示し、ｍＢＭｉＰＳクローン＃７および＃１３がＥＳ細胞と酷似した細胞であることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】ヒト骨髄由来単核球細胞（ｈＢＭＭＮＣｓ）から誘導された多能性幹細胞の未分化マーカーの発現量を評価したＦＡＣＳ解析の結果、誘導された多能性幹細胞が形成するコロニーの形態および誘導された多能性幹細胞のアルカリフォスファターゼの活性染色の結果を示した。[Ａ]は ｈＢＭＭＮＣｓに対して核初期化因子を発現するレトロウィルスを感染させた後２０日目の未分化細胞マーカーＳＳＥＡ−４の発現を示した。図の水平軸がＳＳＥＡ−４の発現量を示し、垂直軸が示すＰＩの染色強度が低いものが生細胞を示した。図中の等高線は解析した細胞の存在頻度を示した。「ＳＴ３ＦＰ６」はレトロウィルス感染前２日間および核初期化プロセスにおいて、サイトカインカクテルとしてＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−３、ＦＰ６をｈＢＭＭＮＣｓと共存させていることを示し、「ＳＴ３」はレトロウィルス感染前２日間および核初期化プロセスにおいて、サイトカインカクテルとしてＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−３をｈＢＭＭＮＣｓと共存させていることを示した。[Ｂ]は核初期化プロセスにおいて形成された細胞コロニーの形態を示した。「Ｄａｙ１０」、「Ｄａｙ２０」はレトロウィルス感染開始からの日数を示した。[Ｃ]はｈＢＭＭＮＣｓから誘導された多能性幹細胞のレトロウィルス感染開始から２７日目のアルカリフォスファターゼ染色を示した。
【図２】ヒト骨髄由来単核球細胞（ｈＢＭＭＮＣｓ）から誘導された多能性幹細胞の未分化マーカーの発現量を評価したＦＡＣＳ解析の結果および誘導された多能性幹細胞が形成するコロニーの形態を示した。レトロウィルス感染前２日間および核初期化プロセスにおいて、サイトカインカクテルとしてＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−３、ＦＰ６、ＦｌｔリガンドをｈＢＭＭＮＣｓと共存させた場合を示した。[Ａ]は ｈＢＭＭＮＣｓに対して核初期化因子を発現するレトロウィルスを感染させた後２２日目の未分化細胞マーカーＳＳＥＡ−４の発現を示した。図の水平軸がＳＳＥＡ−４の発現量を示し、垂直軸が細胞数を示した。 [Ｂ]は核初期化プロセスにおいて形成された細胞コロニーの形態を示した。
【図３】ｐＭＸｓＩＧベクターを用いて調製されたレトロウィルスのヒト骨髄由来単核球細胞（ｈＢＭＭＮＣｓ）に対する感染効率を評価するためのＦＡＣＳ解析結果を示した。「ＰＩ」はヨウ化プロピジウムによる染色強度を示し、図中の等高線は解析した細胞の存在頻度を示した。各図の水平軸は感染したレトロウィルスゲノムから発現する緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰの発現強度を示した。「サイトカイン培養なし」はレトロウィルス感染前後でサイトカイン類を共存させない場合を示した。「ＳＴ３添加培養」はレトロウィルス感染２日前より、ＦＡＣＳ解析を行ったレトロウィルス感染２日後までの間、ｈＢＭＭＮＣｓとＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−３のサイトカインを共存させた場合を示した。「ＳＴ３ＦＰ６添加培養」はレトロウィルス感染２日前より、ＦＡＣＳ解析を行ったレトロウィルス感染２日後までの間、ｈＢＭＭＮＣｓとＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−３、ＦＰ６のサイトカインを共存させた場合を示した。
【図４】ｐＭＸｓＩＧベクターを用いて調製されたレトロウィルスが感染したヒト骨髄由来単核球細胞（ｈＢＭＭＮＣｓ）の細胞系譜を同定評価するためのＦＡＣＳ解析結果を示した。レトロウィルス感染２日前よりＦＡＣＳ解析を行ったレトロウィルス感染２日後までの間、ｈＢＭＭＮＣｓを、ＳＣＦ、ＴＰＯ、およびＩＬ−３サイトカインと共存させた場合をＳＴ３として示し、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−３、およびＦＰ６サイトカインと共存させた場合をＳＴ３ＦＰ６として示し、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−３、ＦＰ６、およびＦｌｔ３リガンドと共存させた場合をＳＴ３ＦＬＦＰ６として示した。各図の水平軸は感染したレトロウィルスゲノムから発現する緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰの発現強度を示し、図中の等高線は解析した細胞の存在頻度を示した。「ＣＤ４５ＡＰＣ」はアロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ４５抗体による染色強度を示した。「ＣＤ３４ＡＰＣ」はアロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ３４抗体による染色強度を示した。「ＣＤ３８ＰＥ」はフィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ３８抗体による染色強度を示した。「ＣＤ１１７ＰＥ」はフィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ１１７抗体による染色強度を示した。「ＣＤ１１ｂＡＰＣ」はアロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ１１ｂ抗体による染色強度を示した。「ＣＤ３ＰＥ」はフィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ３抗体による染色強度を示した。「ＣＤ１９ＰＥ」はフィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ１９抗体による染色強度を示した。
【図５】ｐＭＸｓＩＧベクターを用いて調製されたレトロウィルスが感染したヒト末梢血由来単核球細胞（ｈＰＢＭＮＣｓ）の細胞系譜を同定評価するためのＦＡＣＳ解析結果を示した。レトロウィルス感染２日前よりＦＡＣＳ解析を行ったレトロウィルス感染２日後までの間、ｈＰＢＭＮＣｓをヒトＳＣＦ、ヒトＴＰＯ、ヒトＩＬ−３、ＦＰ６、Ｆｌｔ３リガンド、ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦと共存させた場合をＧＭ培養として示し、ヒトＳＣＦ、ヒトＴＰＯ、ヒトＩＬ−３、ＦＰ６、ＬＰＳ、抗ヒトＣＤ４０抗体、抗ヒトＣＤ３抗体、抗ヒトＣＤ２８抗体の因子と共存させた場合をＴＢ培養として示した。各図の水平軸は感染したレトロウィルスゲノムから発現する緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰの発現強度を示し、図中の等高線は解析した細胞の存在頻度を示した。「ＣＤ４５ＡＰＣ」はアロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ４５抗体による染色強度を示した。「ＣＤ３４ＡＰＣ」はアロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ３４抗体による染色強度を示した。「ＣＤ３８ＰＥ」はフィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ３８抗体による染色強度を示した。「ＣＤ１１７ＰＥ」はフィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ１１７抗体による染色強度を示した。「ＣＤ１１ｂＡＰＣ」はアロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ１１ｂ抗体による染色強度を示した。「ＣＤ３ＰＥ」はフィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ３抗体による染色強度を示した。「ＣＤ１９ＰＥ」はフィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ１９抗体による染色強度を示した。「ＣＤ１３ＰＥ」はフィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ１３抗体による染色強度を示した。
【図６】クローニングしたヒト誘導多能性細胞株について、コロニー形態およびＦＡＣＳによるヒトＥＳ細胞マーカーＳＳＥＡ−４の発現解析結果を示した。図の水平軸がＳＳＥＡ−４の発現量を示し、垂直軸が細胞数を示した。
【図７】クローニングしたヒト誘導多能性細胞株についてのＲＴ−ＰＣＲ解析結果を示した。図の水平方向に各細胞株を配置し、ＳＴ３、ＳＴ３ＦＰ６、ＳＴ３ＦＬＦＰ６は各細胞の誘導条件を示し、その下の数字が各クローン番号を示した。図の垂直方向には多能性幹細胞マーカーとして知られる遺伝子を配置し、コントロール遺伝子としてハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの結果を示した。図の黒色のバンドが各遺伝子についての発現を示している。
【図８】Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス骨髄由来単核球細胞（ｍＢＭＭＮＣｓ）あるいはＯｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来の胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）から誘導された多能性幹細胞が形成するコロニーの形態および未分化性のマーカーであるＯｃｔ４−ＥＧＦＰレポーター遺伝子からのＥＧＦＰタンパク質の発現を示した。[Ａ]はＯｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来のｍＢＭＭＮＣｓに対して核初期化因子を発現するレトロウィルスを感染させた後５日目の細胞の形態および未分化性マーカーＯｃｔ４−ＥＧＦＰの発現を示した。「４遺伝子サンプル」はレトロウィルスを調製する際に、４つの核初期化遺伝子を同時にパッケージング細胞へ導入してレトロウィルスを作製した場合を示した。「４ウィルスサンプル」はレトロウィルスを調製する際に、４つの核初期化遺伝子をそれぞれ個別にパッケージング細胞へ導入してレトロウィルスを作製した後に、レトロウィルスを混合し細胞に感染させた場合を示した。[Ｂ]はＯｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来のｍＢＭＭＮＣｓにレトロウィルスを感染させる際に、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−３のサイトカインを共存させた場合の、レトロウィルス感染後５日目の細胞の形態および未分化性マーカーＯｃｔ４−ＥＧＦＰの発現を示した。 [Ｃ]はＯｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来のＭＥＦに対して核初期化因子を発現するレトロウィルスを感染させた後５日目の細胞の形態および未分化性マーカーＯｃｔ４−ＥＧＦＰの発現を示した。
【図９】Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウスの骨髄由来単核球細胞（ｍＢＭＭＮＣｓ）から誘導された多能性幹細胞について、未分化性のマーカーであるＯｃｔ４−ＥＧＦＰレポーター遺伝子からのＥＧＦＰタンパク質の発現と血球細胞のマーカーであるＣＤ４５抗原の発現をＦＡＣＳにて解析した結果を示した。Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来のｍＢＭＭＮＣｓに対して核初期化因子を発現するレトロウィルスを感染させた後７日目の解析を示した。「４遺伝子」はレトロウィルスを調製する際に、４つの核初期化遺伝子を同時にパッケージング細胞へ導入してレトロウィルスを作製した場合を示した。「４ウィルス」はレトロウィルスを調製する際に、４つの核初期化遺伝子をそれぞれ個別にパッケージング細胞へ導入してレトロウィルスを作製した後に、レトロウィルスを混合し細胞に感染させた場合を示した。「濃縮ウィルス」は「４ウィルス」と同様に調製したレトロウィルスを濃縮して感染に用いた場合を示した。各図の水平軸は感染したレトロウィルスゲノムから発現する緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰの発現強度を示した。「ＣＤ４５ＡＰＣ」はアロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ４５抗体による染色強度を示し、図中の等高線は解析した細胞の存在頻度を示した。
【図１０】Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス骨髄由来単核球細胞（ｍＢＭＭＮＣｓ）あるいはＯｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来の胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）から誘導された多能性幹細胞が形成するコロニーの形態および未分化性のマーカーであるＯｃｔ４−ＥＧＦＰレポーター遺伝子からのＥＧＦＰタンパク質の発現を示した。Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来のｍＢＭＭＮＣｓあるいはＭＥＦに対して核初期化因子を発現するレトロウィルスを感染させた後７日目の様子を示した。「ｍＢＭＭＮＣｓ」はＯｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来のｍＢＭＭＮＣｓから誘導された細胞を示した。「ＭＥＦ」はＯｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来のＭＥＦから誘導された細胞を示した。
【図１１】Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウスの骨髄由来単核球細胞（ｍＢＭＭＮＣｓ）から誘導された多能性幹細胞クローンについて、未分化性のマーカーであるＯｃｔ４−ＥＧＦＰレポーター遺伝子からのＥＧＦＰタンパク質の発現とマウス未分化細胞のマーカーであるＳＳＥＡ−１抗原の発現をＦＡＣＳにて解析した結果および多能性幹細胞クローンが形成するコロニーの形態とコロニーにおける未分化性のマーカーであるＯｃｔ４−ＥＧＦＰレポーター遺伝子からのＥＧＦＰタンパク質の発現を示した。[Ａ]はＯｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来のｍＢＭｉＰＳ細胞クローン＃７およびクローン＃１３について未分化性マーカーＯｃｔ４−ＥＧＦＰの発現およびマウス未分化細胞のマーカーであるＳＳＥＡ−１抗原の発現をＦＡＣＳにて解析した結果を示した。「ＩｇＧ ＡＰＣ」はアロフィコシアニン結合コントロールＩｇＧによる染色強度を示した。「ＳＳＥＡ−１ Ａｌｅｘａ６４７」はＡｌｅｘａ６４７結合抗マウスＳＳＥＡ−１抗体による染色強度を示した。各図の水平軸は未分化性マーカーＯｃｔ４−ＥＧＦＰの発現強度を示し、図中の等高線は解析した細胞の存在頻度を示した。[Ｂ]はＯｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来のｍＢＭｉＰＳ細胞クローン＃７およびクローン＃１３についてマウス未分化細胞のマーカーであるＳＳＥＡ−１抗原の発現をＦＡＣＳにて解析した結果を示した。水平軸はマウス未分化細胞のマーカーであるＳＳＥＡ−１抗原の発現強度を示し、垂直軸は細胞数を示した。図の実線がＡｌｅｘａ６４７結合抗マウスＳＳＥＡ−１抗体で染色した場合をしめし、破線はアロフィコシアニン結合コントロールＩｇＧで染色した場合を示した。[Ｃ]はＯｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来のｍＢＭｉＰＳ細胞クローン＃７およびクローン＃１３が形成するコロニーの形態および未分化性のマーカーであるＯｃｔ４−ＥＧＦＰレポーター遺伝子からのＥＧＦＰタンパク質の発現を示した。
【図１２】ｐＭＹｓＩＧベクターを用いて調製されたレトロウィルスのＯｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス骨髄由来単核球細胞（ｍＢＭＭＮＣｓ）あるいはＯｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来の胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）に対する感染効率を評価するためのＦＡＣＳ解析結果を示した。図の水平軸は感染したレトロウィルスゲノムから発現する緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰの発現強度を示し、垂直軸は細胞数を示した。レトロウィルス感染後２日目の解析結果を示した。「ＢＭＭＮＣｓ」はＯｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来ｍＢＭＭＮＣｓを用いた場合を示し、「ゼラチン上に予め培養ＭＥＦ」はウィルス感染前日からゼラチンコートプレート上で培養していたＯｃｔ４−ＥＧＦＰマウスＭＥＦを用いた場合を示し、「レトロネクチン上ＭＥＦ」はＢＭＭＮＣｓと同様にレトロネクチンコートプレートで感染させたＭＥＦを用いた場合を示した。
【図１３】Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウスの骨髄由来単核球細胞（ｍＢＭＭＮＣｓ）あるいはＭＥＦからｐＭＹｓ核初期化遺伝子ベクターを用いて調製されたレトロウィルスを用いて誘導された多能性幹細胞について、未分化性のマーカーであるＯｃｔ４−ＥＧＦＰレポーター遺伝子からのＥＧＦＰタンパク質の発現とマウス未分化細胞のマーカーであるＳＳＥＡ−１抗原の発現をＦＡＣＳにて解析した結果および多能性幹細胞クローンが形成するコロニーの形態とコロニーにおける未分化性のマーカーであるＯｃｔ４−ＥＧＦＰレポーター遺伝子からのＥＧＦＰタンパク質の発現を示した。[Ａ]はレトロウィルス感染７日後のＯｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来ｍＢＭＭＮＣｓおよびＭＥＦの未分化性マーカーＯｃｔ４−ＥＧＦＰの発現およびマウス未分化細胞のマーカーであるＳＳＥＡ−１抗原の発現をＦＡＣＳにて解析した結果を示した。「ＳＳＥＡ−１ Ａｌｅｘａ６４７」はＡｌｅｘａ６４７結合抗マウスＳＳＥＡ−１抗体による染色強度を示した。各図の水平軸は未分化性マーカーＯｃｔ４−ＥＧＦＰの発現強度を示し、図中の等高線は解析した細胞の存在頻度を示した。[Ｂ]はレトロウィルス感染７日後にＯｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来のｍＢＭＭＮＣｓおよびＭＥＦが形成するコロニーの形態および未分化性のマーカーであるＯｃｔ４−ＥＧＦＰレポーター遺伝子からのＥＧＦＰタンパク質の発現を示した。[Ｃ]はレトロウィルス感染１２日後にＯｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来のｍＢＭＭＮＣｓおよびＭＥＦが形成するコロニーの形態および未分化性のマーカーであるＯｃｔ４−ＥＧＦＰレポーター遺伝子からのＥＧＦＰタンパク質の発現を示した。「ＢＭＭＮＣｓ」はＯｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来ｍＢＭＭＮＣｓを用いた場合を示し、「ゼラチン上に予め培養ＭＥＦ」はウィルス感染前日からゼラチンコートプレート上で培養していたＯｃｔ４−ＥＧＦＰマウスＭＥＦを用いた場合を示し、「レトロネクチン上ＭＥＦ」はＢＭＭＮＣｓと同様にレトロネクチンコートプレートで感染させたＭＥＦを用いた場合を示した。
【図１４】ヌードマウスの皮下に移植されたマウス骨髄由来ｉＰＳ＃７細胞より形成された奇形腫を示す。[Ａ]は皮下に移植されたマウス骨髄由来ｉＰＳ＃７細胞あるいはＥＳ細胞より奇形腫が形成されたヌードマウスを示す。[Ｂ]は形成された奇形腫より作製した病理標本を示し、標本中には、未分化神経組織、中枢神経、大脳皮質様組織、毛根組織、筋組織、軟骨組織、白色脂肪組織、気管粘液上皮細胞及び繊毛を有する気管上皮細胞、食道粘膜様組織、膵臓腺房細胞、唾液腺の漿液細胞および粘液細胞などが観察される。
【図１５】マウス骨髄由来ｉＰＳ＃７細胞をＢａｌｂ／ｃマウスの受精卵から作製した胚盤胞に注入後、偽妊娠マウスに移植することにより作出されたキメラ個体を示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスは本来白色の毛色を示し、骨髄由来ｉＰＳ細胞は黒色の毛色を有するＣ５７ＢＬ／６マウスに由来している。黒色の毛色を有する細胞は骨髄由来ｉＰＳ細胞由来の細胞であることを示している。
【図１６】マウス骨髄由来のｉＰＳ細胞クローンとマウスＥＳ細胞およびマウス骨髄由来単核球細胞について、各細胞で発現している遺伝子の発現強度の比較を示した図である。「ｉＰＳ＃７」はマウスｉＰＳ細胞クローンを示し、「ＢＭＭＮＣ」はマウス骨髄由来単核球細胞を示す。各図の水平軸、垂直軸は各細胞で発現する遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの量を示し、図中の各点は一種類の遺伝子に対応している。比較する細胞間で発現する遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの量が同一である場合には、図中の各点は図の対角線上に位置することになる。
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、分化した体細胞、特に血球系細胞を初期化または脱分化することにより多能性幹細胞を製造するための方法およびキットに関する。
【０００２】
背景技術
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、生体中の組織・臓器を構成するほぼ全ての種類の細胞に分化できる多能性を有したまま、長期間にわたる細胞増殖を無制限に維持できる細胞株である。この性質により、ＥＳ細胞は、パーキンソン病、Ｉ型糖尿病、脊髄損傷、心不全など、多くの疾患に対する移植療法のための細胞資源として、組織工学による人工組織・臓器作製のための多種類細胞材料の供給源として、さらには、基礎研究や創薬研究に用いられるヒト細胞の供給源としての利用が期待されている。しかしながら、ＥＳ細胞はヒトやマウスの初期胚を破壊して樹立された細胞株であることから、倫理的見地よりＥＳ細胞の利用に対する反対意見も多い。また、細胞移植療法については、他人の細胞を移植することになることから、臓器移植と同様に拒絶反応を惹起する危険性を伴っている。これらの問題を回避する方法として、患者自身の分化体細胞を初期化した、ＥＳ細胞に近い多能性と増殖能を有した誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の利用が期待されている。
【０００３】
分化体細胞の初期化法として、例えば、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ細胞）にレトロウィルスベクターでＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−ｍｙｃの４遺伝子を同時感染させることによりｉＰＳ細胞を誘導する技術が報告されている（非特許文献１：K. Takahashi, S. Yamanaka, Cell, 126, pp.663-676, 2006；非特許文献２：K. Okita, T. Ichisaka, S. Yamanaka, Nature, 448, pp. 313-317, 2007；非特許文献３：M. Wernig et al., Nature, 448, pp.318-324, 2007）。マウス肝細胞および胃上皮細胞から同様の方法でｉＰＳ細胞を誘導する技術も報告されている（非特許文献４：T. Aoi et al., Science Express on 14 Feb. 2008）。これらの報告における初期化因子のスクリーニング方法については国際公開第２００５／０８０５９８号パンフレット（特許文献１）に提案されており、また、当該初期化因子については、他のＥＳ細胞特異的遺伝子（初期化因子の候補遺伝子）と共に国際公開第２００７／０６９６６６号パンフレット（特許文献２）に提案されている。これらの報告および提案においては、ヒト細胞について一部記載があるものの、この段階ではヒトＥＳ細胞と同等の性質を持ったヒトｉＰＳ細胞としての樹立は不完全なものである。また、肝細胞や胃上皮細胞からの誘導はヒトに適用する場合には侵襲性が多く、採取する患者の負担が大きくなることが予想される。
【０００４】
ヒトｉＰＳ細胞を樹立する方法としては、成人皮膚由来線維芽細胞 (ＨＤＦ細胞)にレトロウィルスを用いてＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−ｍｙｃの４因子を導入する方法が報告されている（非特許文献５：K. Takahashi, S. Yamanaka, Cell, 131, pp.861-872, 2007）。この方法においては、レトロウィルスを高効率に感染させるために、マウスエコトロピックウィルス受容体であるｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ ｆａｍｉｌｙ ７(Ｓｌｃ７ａ１) をレンチウィルスにより発現させた細胞を用いている。その結果、レトロウィルスの感染後２５日目頃よりヒトＥＳ細胞様のコロニーを認め、３０日目以降にコロニーのピックアップを実施している。この方法では、新たにマウスエコトロピックウィルス受容体をレンチウィルスにより導入しているため、異種動物由来の遺伝子の発現および染色体へのＤＮＡ断片挿入機会の増加による、宿主細胞の癌化リスクの増大といった課題を抱えている。さらに、誘導日数が１ヶ月におよぶため、培養コストについても課題を抱えている。また、この報告では、ｉＰＳ細胞の誘導に新生児包皮由来線維芽細胞 （ＢＪ１細胞）も用いられており、その場合のヒトＥＳ細胞様コロニーの出現頻度はＨＤＦを用いた場合よりも高いが、誘導日数については短縮されていない。
【０００５】
他のグループでは、アデノウィルスによりマウスエコトロピックウィルス受容体であるｍＣＡＴ１遺伝子を発現させたヒト新生児包皮由来線維芽細胞を用いて、同様の４因子をレトロウィルスにより導入し、ｉＰＳ細胞を誘導した報告もある（非特許文献６：H.Masaki et al., Stem Cell Research, 1, pp.105-115, 2007）。この報告では、レトロウィルスの感染後１７日目にｉＰＳ様のコロニーの出現が認められている。この方法では、アデノウィルスでウィルス受容体を発現させていることにより、染色体ＤＮＡへの異種遺伝子の挿入リスクは低減されているが、異種遺伝子が細胞内に導入されることに伴うリスクは以前として残る。同様の４因子をレトロウィルスによりヒト胎児肺線維芽細胞 (ＭＲＣ５細胞)へ導入してｉＰＳ細胞を誘導した報告もある（非特許文献７：I. H. Park et al., Nature, 451, pp.141-146, 2008）。しかしながら、この報告では、ＢＪ１細胞、成体間葉系幹細胞（ＭＳＣ細胞）、およびＨＤＦ細胞からの４因子によるｉＰＳ細胞誘導は成功していない。また、初期化因子としてＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮＡＮＯＧ、およびＬｉｎ２８の４因子を用いて、レンチウィルスで細胞に発現させることにより、ｆｅｔａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌｓ(ＩＭＲ９０ ｃｅｌｌｓ)やｎｅｗｂｏｒｎ ｆｏｒｅｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔからＥＳ細胞様コロニーを取得している報告もある（非特許文献８：J. Yu et al., Science, 318, pp.1917-1920, 2007）。胎児や新生児の細胞を用いた場合、成人の表皮線維芽細胞を用いた場合に比べて、より短期間でｉＰＳ細胞が誘導できているが、治療や研究に用いる細胞源としては倫理的な課題が残る。この報告ではさらに、ヒトＥＳ細胞から分化誘導した血球細胞等を用いてｉＰＳ細胞が誘導可能であることが報告されている。しかし、ＥＳ細胞から分化誘導した細胞は正常な分化過程を経ておらず、成体由来の血球細胞と同一の細胞とはいえない。今のところ、成体から採取した血球細胞からのｉＰＳ細胞の誘導についての報告はない。
【０００６】
Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−ｍｙｃの４因子に加え、Ｎａｎｏｇを共発現させることによりｉＰＳ細胞の誘導を効率化した報告もある(非特許文献９：W. E. Lowry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105, pp.2883-2888, 2008) 。Ｎａｎｏｇの存在下でリプログラミング（初期化）効率が上がることは従来から報告されている(非特許文献１０：J. Silva et al., Nature, 441, pp.997-1001, 2006) 。レトロウィルスを用いてＨＤＦ細胞に遺伝子導入を行い、ウィルス感染終了後２１日目でＥＳ細胞様コロニーが出現する。Ｎａｎｏｇを用いることによりｉＰＳ細胞の誘導効率が上がっているが、因子の種類を増やすことは、染色体に挿入される遺伝子の種類も増やすこととなり、初期化因子の種類を増やさない方法での効率改善が望まれる。
【０００７】
また、マウスにおいては終末分化した成熟Ｂ細胞からｉＰＳ細胞を誘導した報告もある（非特許文献１１：J. Hanna et al., Cell, 133, pp.250-264, 2008）。この報告においては、ドキシサイクリン依存的に４つの核初期化因子、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−ｍｙｃを発現するユニットをレンチウィルスベクターにより導入することによって、まずｉＰＳ細胞を誘導している。さらに、誘導されたｉＰＳ細胞を用いてトランスジェニックマウスを作製している。成熟Ｂ細胞からのｉＰＳ細胞誘導には、こうして得られたトランスジェニックマウスより調製したＢ細胞を用いており、同様の方法をヒトに適用することは不可能である。ヒトの終末分化した血液細胞からｉＰＳ細胞を誘導するためには本法を適用することはできず、ヒト初代細胞に適用できる初期化方法が望まれる。
【０００８】
一方で、ＥＳ細胞のような多能性幹細胞の利用により治療効果が期待される医療領域では、ＥＳ細胞から分化誘導した細胞による治療法の検討と並行して、生体内に存在する体性幹細胞の利用が検討されてきた。そのような取組みの中、細胞移植療法への利用を目的として生体外で体性幹細胞を増幅する技術の報告がある。中でも造血幹細胞については、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔリガンド（ＦＬ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）と可溶化型ＩＬ−６受容体のα鎖（ＩＬ−６Ｒ）との融合タンパク質などのサイトカインを用いて、臍帯血由来の造血幹細胞や骨髄由来の造血幹細胞を増幅した報告がある（非特許文献１２：T. Ueda et al., J. of Clinical Investigation, 105, pp-1013-1021, 2000；非特許文献１３：L. Gammaitoni et al., Experimental Hematology, 31, pp. 261-270, 2003）。さらに、ストローマ細胞を用いて増幅率を向上させる技術もある（特許文献３：国際公開第２００３／０１４３３６号パンフレット）。いずれも血球系の幹細胞または前駆細胞を増幅する技術であり、増幅の際に他の細胞系譜への分化能を付与することはできず、体細胞の初期化作用や脱分化作用はない。また、造血幹細胞の増幅には限界があり、ＥＳ細胞のように多能性を維持したまま無制限に増殖させることはできない。
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００５／０８０５９８号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００７／０６９６６６号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００３／０１４３３６号パンフレット
【非特許文献１】K. Takahashi, S. Yamanaka, Cell, 126, pp.663-676, 2006
【非特許文献２】K. Okita, T. Ichisaka, S. Yamanaka, Nature, 448, pp. 313-317, 2007
【非特許文献３】M. Wernig et al., Nature, 448, pp.318-324, 2007
【非特許文献４】T. Aoi et al., Science Express on 14 Feb. 2008
【非特許文献５】K. Takahashi, S. Yamanaka, Cell, 131, pp.861-872, 2007
【非特許文献６】H.Masaki et al., Stem Cell Research, 1, pp.105-115, 2007
【非特許文献７】I. H. Park et al., Nature, 451, pp.141-146, 2008
【非特許文献８】J. Yu et al., Science, 318, pp.1917-1920, 2007
【非特許文献９】W. E. Lowry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105, pp.2883-2888, 2008
【非特許文献１０】J. Silva et al., Nature, 441, pp.997-1001, 2006
【非特許文献１１】J. Hanna et al., Cell, 133, pp.250-264, 2008
【非特許文献１２】T. Ueda et al., J. of Clinical Investigation, 105, pp-1013-1021, 2000
【非特許文献１３】L. Gammaitoni et al., Experimental Hematology, 31, pp. 261-270, 2003
【発明の概要】
【００１０】
本発明者らは、ＩＬ−６シグナル伝達因子（ＩＬ６ＳＴ）刺激因子とサイトカインカクテルとの存在下での培養と、細胞の脱分化とを組み合わせることにより、体細胞から多能性幹細胞を効率的に樹立できることを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
【００１１】
従って、本発明の目的は、体細胞から効率的に多能性幹細胞を製造する方法を提供することにある。
【００１２】
そして、本発明による多能性幹細胞の製造法は、体細胞から多能性幹細胞を製造する方法であって、（ａ）体細胞を、ＩＬ−６シグナル伝達因子刺激因子および少なくとも１種のサイトカインを含む細胞培養培地中で培養する工程、および（ｂ）体細胞を脱分化させる工程を含んでなり、工程（ａ）の後に工程（ｂ）が行われるか、または工程（ａ）と工程（ｂ）が同時に行われる方法である。
【００１３】
本発明によれば、人体より軽微な負担で採取できる体細胞、例えば末梢血液細胞などから、従来法よりも短期間で高効率に多能性幹細胞を樹立することができる。多能性幹細胞の樹立に要する期間は、例えば、従来法の約１／２にまで短縮することが可能である。よって、製造された多能性幹細胞を、脊髄損傷などの緊急性の高い疾患の治療に利用することができ、また、多能性幹細胞の製造にかかる費用も低減することが可能となる。
【発明の具体的説明】
【００１４】
本発明において製造される「多能性幹細胞」とは、種々の分化系譜に分化可能な細胞を意味し、必ずしもＥＳ細胞と同等のすべての細胞系譜に分化可能な細胞に限られるものではなく、例えば、内胚葉系幹細胞、中胚葉系幹細胞、または外胚葉系幹細胞としてもよい。例えば、心不全の治療に使用する多能性幹細胞を製造するためには、心筋細胞に分化可能な細胞を製造できればよい。あるいは、Ｉ型糖尿病の治療に使用する多能性幹細胞を製造するためには、β細胞に分化可能な細胞を製造できればよい。使用目的に応じたレポーター遺伝子や特異的表面抗原に対する抗体を用いることで、目的の細胞を効率よく分離することが可能である。
【００１５】
本発明の好ましい実施態様によれば、「多能性幹細胞」は、ＥＳ細胞と同等のすべての細胞系譜に分化可能な細胞とされる。このような細胞は、ヒトにおいては、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１などのマーカー分子を発現する細胞である。マウスにおいては、ＳＳＥＡ−１などのマーカー分子を発現する細胞である。ヒトおよびマウスのそれらの細胞は、ＳＣＩＤマウスやヌードマウスなどの免疫不全マウスの皮下に移植することにより、奇形腫を形成することが知られている。多能性幹細胞から形成された奇形腫には、内胚葉系、中胚葉系、外胚葉系、それぞれの系譜の分化細胞が含まれる。よって、ＥＳ細胞と同等のすべての細胞系譜に分化可能な多能性幹細胞は、このような奇形腫の形成により特徴づけられる。
【００１６】
本発明による多能性幹細胞の製造法は、ＩＬ−６シグナル伝達因子（ＩＬ６ＳＴ）刺激因子および少なくとも１種のサイトカインを含む細胞培養培地中で培養する工程（以下「工程（ａ）」という）を含んでなる。
【００１７】
本発明において「ＩＬ６シグナル伝達因子（ＩＬ６ＳＴ）」とは、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒを意味し、ｇｐ１３０とも呼ばれている。ＩＬ６ＳＴはシグナル領域、細胞外領域、膜貫通領域、および細胞内領域から構成される全長９１８アミノ酸残基のタンパク質を意味する。ＩＬ６ＳＴについては、シグナルペプチドであるＮ末端から２２番目のグリシン残基までが欠失してもＩＬ６ＳＴを介したシグナル伝達は維持されることが知られている。ＩＬ−６と結合したＩＬ−６Ｒは２分子のＩＬ６ＳＴと結合し、ＩＬ６ＳＴはホモ二量体を形成する。ホモ二量体を形成したＩＬ６ＳＴは、細胞内領域のチロシン残基がリン酸化され、シグナル伝達が活性化されることが知られている。ＩＬ６ＳＴは、ＩＬ−１１Ｒとも結合し、シグナルを伝達することが知られている。また、ＩＬ６ＳＴは白血球遊走阻止因子レセプター（ＬＩＦＲ）、オンコスタチンＭレセプター（ＯＳＭＲ）、毛様体神経栄養因子レセプター（ＣＮＴＦＲ）、カルジオトロピンレセプター（ＣＴ−１Ｒ）などとも結合し、ヘテロ二量体を形成することにより活性化されることが知られている。
【００１８】
本発明において「ＩＬ６ＳＴ刺激因子」とは、ヒトＩＬ６ＳＴを介してシグナルを伝達する分子を意味し、より具体的には、ＩＬ６ＳＴと会合することによりＩＬ６ＳＴの活性化を引き起こす分子をいう。ＩＬ６ＳＴ刺激因子としては、ＩＬ−６またはその変異体とＩＬ−６受容体（以下「ＩＬ−６Ｒ」という）またはその変異体との融合タンパク質、ＩＬ−６Ｒ（好ましくは、可溶性ＩＬ−６Ｒ（ｓＩＬ−６Ｒ））またはその変異体とＩＬ−６またはその変異体との組み合わせ（特表平１０−５０９０４０号）、ＩＬ−６とＩＬ−６受容体のα鎖との複合体、ＩＬ６ＳＴに対してアゴニストとして作用するＩＬ６ＳＴに対する抗体（Z. J. Gu et al., Leukemia, 14, pp.188-197, 2000）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ、およびカルジオトロピンが挙げられる。
【００１９】
本発明において「ＩＬ−６」とは、ＩＬ−６として一般的に知られる、４つのへリックスから構成される全長２１２アミノ酸残基のタンパク質を意味する。また、本発明において「ＩＬ−６の変異体」とは、置換、欠失、挿入、および付加から選択される１以上の改変を有し、かつＩＬ６ＳＴ刺激活性を有するＩＬ−６の変異体を意味する。ＩＬ−６については、シグナルペプチドであるＮ末端から２８番目のアラニン残基までが欠失してもＩＬ６ＳＴ刺激活性を維持することが知られている（ＷＯ００/０１７３１）。また、ＩＬ−６の３７番目のリジン残基のＣ末端側がプロテアーゼの消化作用を受けること、および２８番目のアラニン残基から３７番目のリジン残基までの１０アミノ酸残基が欠失してもＩＬ−６活性に支障がないことが知られている（ＷＯ００／０１７３１）。従って、本発明においては、Ｎ末端が欠失し、かつＩＬ６ＳＴ刺激活性を有する改変ＩＬ−６をＩＬ−６変異体として用いてもよい。このようなＩＬ−６変異体としては、２８番目までのＮ末端配列が欠失したＩＬ−６、３７番目までのＮ末端配列が欠失したＩＬ−６が挙げられる。
【００２０】
本発明において、「ＩＬ−６Ｒ」とは、ＩＬ−６受容体として一般的に知られる、シグナル領域、細胞外領域、膜貫通領域、および細胞内領域から構成される全長４６８アミノ酸残基のタンパク質を意味する。また、本発明において「ＩＬ−６Ｒの変異体」とは、置換、欠失、挿入、および付加から選択される１以上の改変を有し、かつＩＬ６ＳＴ刺激活性を有するＩＬ−６Ｒの変異体を意味する。ＩＬ−６Ｒについては、細胞外領域中に存在するサイトカインレセプター領域（１１２番目のバリン残基付近から３２３番目のアラニン残基付近までの領域）がＩＬ−６との結合に必要十分であることが知られている。従って、本発明においては、ＩＬ−６Ｒの１１２番目のバリン残基付近から３３３番目のアラニン残基付近までの領域を含んでなる改変ＩＬ−６ＲをＩＬ−６Ｒ変異体として用いてもよい。
【００２１】
本発明の好ましい実施態様によれば、ＩＬ６ＳＴ刺激因子は、ＩＬ−６またはその変異体とＩＬ−６Ｒまたはその変異体とが直接またはリンカーを介して連結された融合タンパク質とされる。このような融合タンパク質は、当技術分野において公知の方法、例えば、ＷＯ００／０１７３１、ＷＯ９９／０２５５２、特表２０００−５０６０１４号、またはFischer et al., Nature Biotech., 15, pp.142-145, 1997に記載の方法に従って製造することができる。
【００２２】
本発明の特に好ましい実施態様によれば、前記融合タンパク質は、ＩＬ−６Ｒの１１２番目のバリン残基から３３３番目のアラニン残基までの断片のＣ末端と、ＩＬ−６の３８番目のアスパラギン酸残基から２１２番目のメチオニン残基までの断片のＮ末端とが直接連結されたタンパク質（以下「ＦＰ６」という）とされる。この場合、この融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を宿主において発現可能なように連結したベクターを適当な宿主に導入し、形質転換された宿主を培養し、培養物からＦＰ６を採取することにより融合タンパク質ＦＰ６を製造することができる（ＷＯ００／０１７３１参照）。
【００２３】
ＩＬ６ＳＴ刺激因子の細胞培養培地への添加量は特に制限されないが、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌとされる。
【００２４】
本発明による多能性幹細胞の製造法において、ＩＬ−６ＳＴ刺激因子の使用は一つの主要な特徴である。特定の理論に拘束されるわけではないが、ＩＬ６ＳＴの活性化は、例えば、ＪＡＫキナーゼの活性化、ＳＴＡＴ３のリン酸化、リン酸化によりホモ二量体を形成したＳＴＡＴ３によるＪｕｎＢ、ＪＡＢなどの遺伝子の転写促進を順次引き起こし、結果として細胞増殖、細胞分化調節等を生じることが考えられる。よって、本発明においては、ＩＬ６ＳＴ刺激因子に替えて、活性化型ＪＡＫキナーゼ、リン酸化型ＳＴＡＴ３、ホモ二量体を形成させる変異を導入したＳＴＡＴ３Ｃ（J.F.Bromberg et. al., Cell, 98, pp-295-303, 1999）、エストロゲン類縁体により誘導性にホモ二量体を形成させるＳＴＡＴ３ＥＲ（T.Matsuda et al., EMBO Journal, 18, pp-4261-4269, 1999）、ＪＡＫキナーゼの阻害因子であるＳＯＣＳ分子の阻害剤などを、遺伝子またはタンパク質の形で細胞内に導入することも考えられる。
【００２５】
工程（ａ）において使用される「サイトカイン類」としては、トロンボポエチン（ＴＰＯ）およびその変異体ならびにそれらの誘導体、ｃ−ｍｐｌリガンド（ＴＰＯを除く）およびその誘導体、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージ・コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）のような増殖因子；抗ヒトＣＤ４０抗体、抗ヒトＣＤ３抗体、抗ヒトＣＤ２８抗体のような増殖刺激活性を有する抗体；リポ多糖（ＬＰＳ）のような増殖刺激因子；およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００２６】
本発明において「トロンボポエチン」（ＴＰＯ）とは、全長３３２アミノ酸残基のアミノ酸配列からなる、血小板産生を特異的に刺激または増大させる活性を有するタンパク質をいう（ＷＯ９５／２１９１９）。また、本発明において「ＴＰＯの変異体」とは、置換、欠失、挿入、および付加から選択される１以上の改変を有し、かつ血小板産生を特異的に刺激または増大させるＴＰＯの変異体を意味する。ＴＰＯの変異体としては、例えば、ＷＯ９５／１８８５８、特開平８−２７７２９６号公報、特開平８−２２８７８１号公報、およびＷＯ９５／２１９１９等に記載されているものが挙げられ、好ましくは、アミノ酸残基１番目から１６３番目までのアミノ酸配列からなるＴＰＯの変異体（断片）が挙げられる。
【００２７】
本発明において「ＴＰＯおよびその変異体の誘導体」とは、水溶性ポリマーを連結してなるＴＰＯおよびその変異体を意味する。水溶性ポリマーとしては、ポリエチレングリコール、好ましくは平均分子量が約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａであるポリエチレングリコールが挙げられる。ＴＰＯおよびその変異体のポリエチレングリコール化（ＰＥＧ化）は周知の方法に従って実施することができる（例えば、Focus on Growth Factors, 3, pp. 4-10, 1992参照）。水溶性ポリマー対「ＴＰＯおよびその変異体」タンパク質のモル比は１：１〜１００：１とすることができ、ポリＰＥＧ化の場合には１：１〜２０：１、モノＰＥＧ化の場合には１：１〜５：１とすることができる。
【００２８】
本発明において「ｃ−ｍｐｌリガンド」とは、ｍｐｌレセプターに結合可能なペプチド性リガンド、タンパク質性リガンド、および非ペプチド性リガンドを意味する。タンパク質性ｃ−ｍｐｌリガンド（ＴＰＯを除く）としては、巨核球の刺激剤としてのアゴニスト抗体（ＷＯ９９／０３４９５およびＷＯ９９／１０４９４）や造血レセプターアゴニストなどの他のタンパク質（ ＷＯ９６／２３８８８ 、ＷＯ９７／１２９７８、ＷＯ９７／１２９８５、ＷＯ９８／１７８１０、ＷＯ９６／３４０１６およびＷＯ００／２４７７０）が挙げられる。ペプチド性ｃ−ｍｐｌリガンドとしては、ＷＯ９６／４０１８９、ＷＯ９６／４０７５０、ＷＯ９８／２５９６５、特開平１０−７２４９２号、ＷＯ９９／４２１２７、およびＷＯ００／２４７７０に記載されているものが挙げられる。非ペプチド性ｃ−ｍｐｌリガンドとしては、ベンゾジアゼピン誘導体（特開平１１−１４７７号および特開平１１−１５２２７６号）や他の低分子リガンド（ＷＯ９９／１１２６２、ＷＯ９９／２２７３３、ＷＯ９９／２２７３４、ＷＯ００／３５４４６およびＷＯ００／２８９８７）が挙げられる。
【００２９】
本発明において「ｃ−ｍｐｌリガンドの誘導体」とは、水溶性ポリマーを連結してなるｃ−ｍｐｌリガンドおよびその変異体を意味する。水溶性ポリマーとしては、ポリエチレングリコール、好ましくは平均分子量が約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａであるポリエチレングリコールが挙げられる。ｃ−ｍｐｌリガンドのポリエチレングリコール化（ＰＥＧ化）は周知の方法に従って実施することができる（例えば、Focus on Growth Factors, 3, pp. 4-10, 1992参照）。水溶性ポリマー対ｃ−ｍｐｌリガンドタンパク質のモル比は１：１〜１００：１とすることができ、ポリＰＥＧ化の場合には１：１〜２０：１、モノＰＥＧ化の場合には１：１〜５：１とすることができる。
【００３０】
本発明において「幹細胞因子」（ＳＣＦ：stem cell factorまたはsteel factor）とは、造血および生殖発生に重要な機能を果たす、全長２７３アミノ酸残基のアミノ酸配列からなるタンパク質をいう。また、本発明において「ＳＣＦの変異体」とは、置換、欠失、挿入および付加から選択される１以上の改変を有し、かつＳＣＦのレセプターであるｃ−ｋｉｔ分子を特異的に刺激して活性化させるＳＣＦの変異体を意味する。ＳＣＦについては、シグナルペプチドであるＮ末端から２５番目のスレオニン残基までが欠失しても活性を保持していることが知られている。ＳＣＦは、Ｎ末端から１８９番目のアラニン残基と１９０番目のアラニン残基との間で、あるいは１９０番目のアラニン残基と１９１番目のセリン残基との間でタンパク質分解酵素により消化されることにより可溶化型ＳＣＦとして存在することが知られている。また、複数のオルタナティブフォームが存在することが知られており、Ｎ末端から１７５番目のセリン残基から２０２番目のイソロイシン残基までを欠失した膜結合型のＳＣＦが存在することが知られている。本発明においては、これらの変異体のいずれもが「ＳＣＦの変異体」として使用可能である。
【００３１】
本発明において「ＩＬ−３」は、造血幹・前駆細胞に作用し、コロニー形成を支持する活性を持つタンパク質である。また、ＩＬ−３は、肥満細胞、好酸球、好塩基球、好中球、単球などの分化した細胞の増殖因子として重要な機能を有する。ＩＬ−３は、全長１５２アミノ酸残基のアミノ酸配列からなる。また、本発明において「ＩＬ−３の変異体」とは、置換、欠失、挿入および付加から選択される１以上の改変を有し、かつＩＬ−３受容体を特異的に刺激して活性化させるＩＬ−３の変異体を意味する。ＩＬ−３については、シグナルペプチドであるＮ末端から１９番目のグルタミン残基までが欠失しても活性を保持していることが知られている。本発明においては、このような変異体を「ＩＬ−３の変異体」として使用することができる。
【００３２】
本発明において「Ｆｌｔ−３リガンド」（ＦＬ）は、造血幹・前駆細胞の増殖因子として重要な機能を持つタンパク質である。ＦＬは全長２３５アミノ酸残基のアミノ酸配列からなる膜結合蛋白質である。また、本発明において「ＦＬの変異体」とは、置換、欠失、挿入および付加から選択される１以上の改変を有し、かつＦｌｔ−３チロシンキナーゼ受容体を特異的に刺激して活性化させるＦＬの変異体を意味し、好ましくはアミノ酸残基１番目から１８５番目のプロリン残基までのアミノ酸配列からなるＦＬの変異体（断片）が挙げられる。ＦＬについては、シグナルペプチドであるＮ末端から２６番目のグリシン残基までが欠失しても活性を保持していることが知られている。本発明においては、これらの変異体のいずれもが「ＦＬの変異体」として使用可能である。
【００３３】
本発明の好ましい実施態様によれば、サイトカインは、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）およびその変異体ならびにそれらの誘導体、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）およびその変異体、ならびにこれらの２以上の組合わせから選択され、より好ましくは、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−３およびＦｌｔ−３リガンド、ならびにこれらの２以上の組合せから選択される。本発明の特に好ましい実施態様によれば、サイトカインは、ＳＣＦ、ＴＰＯおよびＩＬ−３の組合せ、またはＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−３およびＦｌｔ−３リガンドの組合せとされる。
【００３４】
工程（ａ）において用いられる細胞培養培地は、例えば、下記の群：顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）のような増殖因子；抗ヒトＣＤ４０抗体、抗ヒトＣＤ３抗体、抗ヒトＣＤ２８抗体のような増殖刺激活性を有する抗体；リポ多糖（ＬＰＳ）のような増殖刺激因子からなる群から選ばれる１種以上の増殖刺激因子をさらに含むものとしてもよい。これらの因子によるＩＬ６ＳＴの発現亢進により、多能性幹細胞の誘導がより効率化する場合もある。
【００３５】
これらサイトカインの細胞培養培地への添加量は特に制限されないが、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌとされる。
【００３６】
培養に用いる基礎培地としては、血球細胞などの体細胞および多能性細胞の増殖および生存が害されない限り特に制限されないが、例えば、Ｄ−ＭＥＭ培地、Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＭＥＭ−α培地、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＳｔｅｍＰｒｏ培地（以上、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｍＴｅＳＲ 1培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＨＥＳｃＧＲＯ培地（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、Ｎ２Ｂ２７培地、が好適に用いられる。培養温度は、通常２５〜３９℃、好ましくは３３〜３９℃である。また、培地に添加する物質としては、ウシ胎児血清、ヒト血清、ノックアウト血清リプレースメント（ＫｎｏｃｋＯｕｔＳｅｒｕｍＲｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、インシュリン、トランスフェリン、ラクトフェリン、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、モノチオグリセロール、２−メルカプトエタノール、ウシ血清アルブミン、ピルビン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、各種ビタミン、各種アミノ酸が挙げられる。ＣＯ２は、通常４〜１５％であり、５〜１０％が好ましい。Ｏ２は通常５〜２５％である。また、培養にはトロンボポエチン（ＴＰＯ）およびその変異体およびそれらの誘導体、ｃ−ｍｐｌリガンド（ＴＰＯを除く）およびその誘導体、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージ・コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）のような増殖因子；抗ヒトＣＤ４０抗体、抗ヒトＣＤ３抗体、抗ヒトＣＤ２８抗体のような増殖刺激活性を有する抗体；リポ多糖（ＬＰＳ）のような増殖刺激因子などのサイトカイン類の他に、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、骨形成因子（ＢＭＰ）ファミリー、ヘッジホッグ因子（Ｈｈ）ファミリー、ｂＦＧＦなどに代表される増殖因子、ＭＩＰ−１α、ＳＤＦ−１などのＣＣケモカインあるいはＣＸＣケモカイン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）のような造血ホルモン、Ｗｎｔファミリー遺伝子産物、Ｎｏｔｃｈリガンドファミリー遺伝子産物、塩化リチウム、ピペコリン酸、γ―アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）などの化合物を１０ｎｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌの範囲で添加することもできる。
【００３７】
本発明における培養では、培養用のシャーレ、フラスコ、培養バックを用いた培養が可能であるが、培地組成、ｐＨなどを機械的に制御し、高密度で培養が可能なバイオリアクターによって、その培養を改善することもできる。
【００３８】
培養に用いるフィーダー細胞としては、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）、ＳＮＬ細胞（A.P.McMahon and A.Bradley, Cell, 62, pp-1073-1085, 1990）、ＳＴＯ細胞などを用いることができる。フィーダー細胞の増殖を抑える方法としては、マイトマイシンＣ処理や放射線照射などの方法を用いることができる。また、フィーダー細胞に替えて、ＢＤマトリゲル（ＢＤバイオサイエンス社）などのマトリゲル、あるいはコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンなどの細胞外マトリックス蛋白質、あるいはゼラチンなどにより培養基材をコーティングする方法を用いることもできる。
【００３９】
本発明による多能性幹細胞の製造法は、体細胞を脱分化させる工程（以下「工程（ｂ）」という）をさらに含んでなる。この工程（ｂ）は、工程（ａ）の後に行ってもよいし、または工程（ａ）と同時に行ってもよい。
【００４０】
工程（ａ）と工程（ｂ）が同時に行われる実施態様では、上述のＩＬ６ＳＴ刺激因子およびサイトカインを含む上記細胞培養培地中で体細胞の脱分化が行われる。すなわち、工程（ａ）と工程（ｂ）が同時に開始される。この実施態様では、脱分化の過程で培地を他の培地、例えばＥＳ細胞培養用の培地に変更することもできる。すなわち、この実施態様では、工程（ａ）のみを先に終了させ、工程（ｂ）のみを継続してもよい。
【００４１】
工程（ａ）の後に工程（ｂ）が行われる実施態様では、上述のＩＬ６ＳＴ刺激因子およびサイトカインを含む上記細胞培養培地中での体細胞の培養が行われ、その後、体細胞の脱分化が行われる。ここで、体細胞の脱分化は工程（ａ）で用いられる培地と同じ培地を用いて行うことができる。すなわち、この実施態様では、工程（ａ）は工程（ｂ）よりも先に開始されるが、工程（ｂ）を開始するときに、工程（ａ）は必ずしも終了していなくてもよい。さらに、この実施態様では、脱分化の過程で培地を他の培地、例えばＥＳ細胞培養用の培地に変更することもできる。すなわち、この実施態様では、工程（ａ）のみを先に終了させ、工程（ｂ）のみを継続してもよい。
【００４２】
本発明において「脱分化」とは、分化した組織や器官の細胞が、より未分化性の高い状態に戻ることを意味し、言い換えれば、分化とは逆のプロセスをいう。工程（ｂ）における体細胞の脱分化は、当技術分野において公知の方法により行うことができる。
【００４３】
本発明の好ましい実施態様によれば、工程（ｂ）における体細胞の脱分化は、該体細胞の核初期化処理によって行われる。ここで、「核初期化」とは、体細胞の核が受精卵の状態に戻ることをいう。このような核初期化処理は、当技術分野において公知の方法、例えば、ＷＯ２００７／０６９６６６に記載の方法に従って行うことができる。
【００４４】
核初期化処理に用いられる核初期化因子としては、Ｏｃｔファミリー遺伝子（例えばＯｃｔ３／４遺伝子）、Ｋｌｆファミリー遺伝子（例えばＫｌｆ４遺伝子）、Ｓｏｘファミリー遺伝子（例えばＳｏｘ２遺伝子）およびＭｙｃファミリー遺伝子（例えばｃ−Ｍｙｃ遺伝子）の各遺伝子産物が知られている（ＷＯ２００７／０６９６６６）。従って、核初期化処理は、体細胞をこれらの遺伝子産物に接触させることによって行うことができる。あるいは、核初期化処理は、体細胞において、これらの遺伝子を活性化または発現させることによって行うこともできる。本発明の好ましい実施態様によれば、体細胞の核初期化処理は、Ｏｃｔファミリー遺伝子（例えばＯｃｔ３／４遺伝子）、Ｋｌｆファミリー遺伝子（例えばＫｌｆ４遺伝子）、Ｓｏｘファミリー遺伝子（例えばＳｏｘ２遺伝子）およびＭｙｃファミリー遺伝子（例えばｃ−Ｍｙｃ遺伝子）を、発現可能な形で体細胞に導入することを含む。
【００４５】
核初期化処理に用いられる培地は、例えば、下記の群：顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）のような増殖因子；抗ヒトＣＤ４０抗体、抗ヒトＣＤ３抗体、抗ヒトＣＤ２８抗体のような増殖刺激活性を有する抗体；リポ多糖（ＬＰＳ）のような増殖刺激因子からなる群から選ばれる１種以上の増殖刺激因子を含むものとしてもよい。これらの因子による核初期化遺伝子ファミリーの発現亢進により、多能性幹細胞の誘導がより効率化する場合もある。
【００４６】
核初期化処理に用いられる核初期化因子としては、上記の遺伝子に替えて、サイトカイン類、ケモカイン類、増殖因子類、低分子化合物、マイクロＲＮＡなどのリボ核酸等を用いてもよい。このような核初期化因子としては、例えば、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、骨形成因子（ＢＭＰ）ファミリー、ヘッジホッグ因子（Ｈｈ）ファミリー、ｂＦＧＦなどに代表される増殖因子、ＭＩＰ−１α、ＳＤＦ−１などのＣＣケモカインあるいはＣＸＣケモカイン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）のような造血ホルモン、Ｗｎｔファミリー遺伝子産物、Ｎｏｔｃｈリガンドファミリー遺伝子産物、塩化リチウム、ピペコリン酸、γ―アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）などの化合物、核初期化因子の発現を亢進させる低分子化合物、核初期化因子の転写調節に関わる因子のｓｉＲＮＡ等のマイクロＲＮＡ分子などが挙げられる。
【００４７】
核初期化処理に用いられる核初期化因子の細胞導入法は特に制限されるものではなく、例えば、レトロウィルスベクター、レンチウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、アデノウィルスベクター、単純ヘルペスウィルスベクター、ネコ内在ウィルスベクター、動物細胞用ベクター等を用いる方法が挙げられ、好ましくはレトロウィルスベクターまたはレンチウィルスベクターを用いる方法、より好ましくはレトロウィルスベクターを用いる方法が挙げられる。また、核初期化因子を細胞に注入する方法を用いてもよく、あるいは膜透過性の修飾を施すことにより各因子を細胞に添加する方法を用いてもよい。
【００４８】
核初期化処理に用いられる遺伝子の細胞導入法は特に制限されるものではなく、動物細胞への遺伝子導入に用いられる一般的な方法、例えば、モロニーマウス白血病ウィルス等のレトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウィルスベクター、レンチウィルスベクター等のウィルス由来の動物細胞用ベクターを用いる方法、リン酸カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ＨＶＪリポソーム法等を用いることができる。本発明の好ましい実施態様によれば、核初期化処理に用いられる遺伝子の細胞導入法は、ウィルス由来の動物細胞用ベクター、より好ましくはレトロウィルスベクターを用いる方法とされる。
【００４９】
本発明による多能性幹細胞の製造法において、出発材料として用いられる体細胞は特に制限されるものではなく、いかなる体細胞であってもよい。また、体細胞としては、採取された後に一旦凍結保存された細胞を用いてもよい。
【００５０】
本発明の好ましい実施態様によれば、前記体細胞は血球細胞とされる。本発明において「血球細胞」とは、生体内の血流中に存在しうる血液細胞と同等の細胞群を意味し、必ずしも末梢血液細胞に限られるものではなく、例えば骨髄中や臍帯血中に存在するものであってもよい。より具体的には、「血球細胞」とは、ＣＤ４５、ＣＤ１１aなどの血液細胞のマーカー分子を発現する細胞をいう。また、本明細書において、骨髄中に存在することが確認されている血球細胞を用いることにより、他の組織細胞からよりも効率的に多能性幹細胞を樹立できることが見出されている。よって、本発明の好ましい実施態様によれば、前記血球細胞は骨髄由来単核球細胞とされる。さらに、本発明の他の好ましい実施態様によれば、前記血球細胞は分化血液細胞とされる。このような血球細胞は、採取された後に一旦凍結保存された細胞であってもよい。
【００５１】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、前記体細胞（特に血球細胞）は、ＩＬ６ＳＴ刺激因子と上記サイトカインとの存在下での培養により、水疱性口内炎ウィルスのＧタンパク質を被覆タンパク質として持つレトロウィルスにより容易に感染する細胞とされる。このような細胞は、レトロウィルスベクターによって遺伝子を導入する上で有利である。
【００５２】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、前記体細胞（特に血球細胞）は、ＩＬ６ＳＴを高発現する細胞とされる。具体的には、ＩＬ６ＳＴはいずれの血球細胞においても発現しているが、中でも発現の高いＴ細胞、単球（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、ＤＣ細胞、ＣＤ３４陽性細胞などを用いることが考えられる。また、血球細胞以外でもＩＬ６ＳＴを高発現する体細胞を用いることで、効率よく多能性幹細胞を製造することができる。具体的には、肝臓、腎臓、骨格筋、肺、すい臓、心臓、小腸、脊髄、唾液腺などの細胞も利用することが可能である。
【００５３】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、前記体細胞（特に血球細胞）は、工程（ａ）または（ｂ）で用いられるサイトカインに対するレセプターを発現する細胞とされる。具体的には、ｃ−ｋｉｔ（ＳＣＦレセプター）、ｃ−ｍｐｌ（ＴＰＯレセプター）、およびＦｌｔ３を発現する細胞として、ＣＤ３４陽性細胞などを用いることが考えられる。また、ＩＬ−３Ｒα（ＩＬ−３レセプター）などを発現する細胞として、単球（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ）などを用いることが考えられる。血球細胞以外でも、ｃ−ｋｉｔを発現する細胞などが挙げられる。
【００５４】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、前記体細胞（特に血球細胞）は、核初期化因子の少なくとも１種を発現する細胞とされる。例えば、核初期化因子の１つであるＫｌｆ４を発現する細胞としては、血球細胞の中では、単球（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、ＤＣ細胞、ＣＤ３４陽性細胞などが挙げられ、その他の組織では、肺、骨格筋、小腸などが挙げられる。Ｋｌｆ４以外についても、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｏｃｔ３／４ファミリー遺伝子、Ｍｙｃファミリー遺伝子、またはＳｏｘファミリー遺伝子を発現する体細胞を用いることができる。また、Ｏｃｔ３／４ファミリー遺伝子やＮａｎｏｇ遺伝子などの初期化遺伝子については、それらの偽遺伝子を発現する細胞を体細胞として利用することもできる。
【００５５】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、前記体細胞（特に血球細胞）は、ＩＬ６ＳＴ刺激因子と上記のサイトカインとの存在下において核初期化因子の発現が上昇する細胞とされる。例えば、各サイトカインのレセプターであるｃ−ｋｉｔ（ＳＣＦレセプター）、ｃ−ｍｐｌ（ＴＰＯレセプター）、Ｆｌｔ３、ＩＬ−３Ｒα（ＩＬ−３レセプター）などを発現する細胞を用いることが考えられる。血球細胞の中では、ＣＤ３４陽性細胞、ＤＣ細胞などが挙げられる。また、上記サイトカインによるこれらのレセプターへの刺激により、核初期化因子であるＯｃｔ３／４ファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｍｙｃファミリー遺伝子、および／またはＳｏｘファミリー遺伝子の発現が上昇する細胞を用いることにより、これらすべての初期化因子を用いずとも、多能性幹細胞の製造が可能となる。
【００５６】
本発明の好ましい実施態様によれば、前記体細胞（特に血球細胞）はヒト細胞とされる。この実施態様では、本発明に用いられるＩＬ６ＳＴ刺激因子、サイトカイン、核初期化因子またはその遺伝子は、全てヒト由来のものとすることが好ましい。これにより、ヒトの多能性幹細胞を効率よく製造することが可能となる。
【００５７】
本発明に従って製造された細胞における脱分化または初期化の確認は、当技術分野において公知の方法によって行うことができる。このような方法としては、例えば、細胞表面に発現した未分化マーカーに対する抗体を用いて、蛍光励起細胞分離装置（ＦＡＣＳ）を利用して解析する方法が挙げられる。具体的には、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１などの未分化マーカーに対する抗体を利用することができる。また、ＮａｎｏｇやＯｃｔ３／４遺伝子といった未分化マーカーのレポーター遺伝子を細胞に導入して利用することもできる。
【００５８】
本発明の工程（ａ）において用いられる、ＩＬ６ＳＴ刺激因子および少なくとも１種のサイトカインを含む細胞培養培地は、製造された多能性幹細胞の性質を維持するために利用することもできる。すなわち、ＩＬ６ＳＴ刺激因子と上記のサイトカイン類は、核初期化プロセスの促進のみならず、核初期化後の初期化状態の維持に利用することもできる。
【００５９】
本発明による多能性幹細胞の製造法に用いられる試薬類をまとめて、キットとすることもできる。従って、本発明の他の態様によれば、体細胞から多能性幹細胞を製造するためのキットが提供され、該キットは、（ａ）ＩＬ−６シグナル伝達因子刺激因子および少なくとも１種のサイトカインを含む、体細胞を培養するための細胞培養培地、および（ｂ）体細胞を脱分化させるための試薬を含んでなる。
【００６０】
好適なＩＬ−６シグナル伝達因子刺激因子および好適なサイトカインについては上述したとおりである。また、体細胞を脱分化させるための試薬についても上述したとおりであるが、好ましくは、Ｏｃｔファミリー遺伝子、ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子、およびＭｙｃファミリー遺伝子を、発現可能な形で体細胞に導入するためのベクターを含む。本発明によるキットはさらに、多能性幹細胞の製造法に用いられる具体的方法に応じて、試薬類、反応容器、説明書等を含んでいてもよい。
【００６１】
本発明に従って製造された多能性幹細胞は、各種分化細胞に誘導することが可能であるため、細胞再生医療に利用することができる。すなわち、この多能性幹細胞は、患者本人の体細胞を用いた自家の細胞移植および細胞バンク等より入手した細胞を利用する同種の細胞移植の両者の移植系への利用が可能である。既に存在する血球細胞の大型細胞バンクからも多能性幹細胞の細胞バンクを構築することができる。
【００６２】
また、本発明によれば、各種疾病の患者からの血球細胞検体より、疾病情報に対応した多能性幹細胞バンクを構築することが可能である。さらに、健常人由来の血球細胞を初期化した多能性幹細胞を用いて各種分化細胞を誘導することにより、あるいは難治性疾患の患者より入手した血球細胞を用いて疾患のターゲット細胞を誘導することにより、創薬スクリーニングのツールとしての各種ヒトモデル細胞系の構築も可能である。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６４】
例１：ヒト骨髄由来単核球細胞からの多能性細胞の誘導（１）
Ａ．ヒト骨髄由来単核球細胞の培養
凍結保存されたヒト骨髄由来単核球細胞（ｈＢＭＭＮＣｓ）２．５×１０６細胞（Ａｌｌｃｅｌｌｓ社）を１００ｍｍペトリディッシュ２枚に播種し、３７℃、５％ ＣＯ２下、１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地で培養を開始した。一方のディッシュには、ヒトＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ）、およびヒトＩＬ−３（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加し、他方のディッシュにはＳＣＦ、ＴＰＯおよびＩＬ−３に加えてＦＰ６（２０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。ここで、ＳＣＦ、ＴＰＯおよびＩＬ−３からなるサイトカインカクテルを「ＳＴ３」と呼び、ＳＴ３にＦＰ６を加えたカクテルを「ＳＴ３ＦＰ６」と呼ぶ（以下同様）。培養開始２４時間後に、それぞれのディッシュにそれぞれのサイトカインカクテルを同濃度で再び添加した。培養開始４８時間後にそれぞれの細胞を回収し、１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地５００μｌで懸濁した。ＳＴ３存在下で培養した細胞懸濁液にはＳＴ３を各３００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加し、ＳＴ３ＦＰ６存在下で培養した細胞懸濁液には、ＳＴ３（各３００ｎｇ／ｍｌ）に加えてＦＰ６を６０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した。調製したｈＢＭＭＮＣｓを次のウィルス感染実験に用いた。
【００６５】
Ｂ．核初期化遺伝子を含む組換えレトロウィルスベクターの作製
コラーゲンタイプＩコート１００ｍｍディッシュ１２枚に、それぞれ４×１０６個のＧ３Ｔ−ｈｉ細胞（タカラバイオ社）を播種し、３７℃、５％ ＣＯ２下、１０％ ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地で培養した。培養２４時間後に、核初期化遺伝子１種類についてディッシュ３枚を用いてウィルスベクターの遺伝子導入を行った。各ディッシュにつき、ｐＧＰ ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社）６μｇ、ｐＶＳＶ−Ｇ ｖｅｃｔｏｒ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）６μｇ、およびレトロウィルスベクターｐＭＸｓ（T. Kitamura et al., Experimental Hematology, 31, pp.1007-1014, 2003；東京大学北村俊雄教授より供与）に核初期化遺伝子を挿入したプラスミド１２μｇを、遺伝子導入試薬ＦｕＧｅｎｅ６（ロシュダイグノスティック社）を用いて共導入した。用いた核初期化遺伝子は、ヒトＯｃｔ３／４、ヒトＳｏｘ２、ヒトＫｌｆ４、およびヒトｃ−ｍｙｃの４種類であった。核初期化遺伝子発現レトロウィルスベクター：ｐＭＸｓｈＯｃｔ３／４、ｐＭＸｓｈＳｏｘ２、ｐＭＸｓｈＫｌｆ４、およびｐＭＸｓｈｃ−ｍｙｃの構築は、山中らの方法に従って行った（K. Takahashi, S. Yamanaka, Cell, 131, pp.861-872, 2007）。遺伝子導入の約４８時間後に、核初期化遺伝子の種類ごとに培養液を回収し、培養液を０．４５μｍフィルターでろ過後、５８００×ｇ、４℃で４時間遠心し、培養上清を捨てることでウィルス沈殿を取得した。ウィルス沈殿は全て１つにまとめ、２ｍｌの１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地で懸濁した。最終的に液量は２．４ｍｌほどになった。
【００６６】
Ｃ．ヒト骨髄由来単核球細胞のウィルス感染処理
予め５０μｇ／ｍｌのレトロネクチン（タカラバイオ社）でコートされた１２ウェルプレートへ、懸濁したウィルス沈殿を１ウェルにつき１．２ｍｌずつ添加し、１０８０×ｇ、２０℃で２時間遠心した。遠心後のプレートに前記のｈＢＭＭＮＣｓの細胞懸濁液５００μｌを各ウェルに添加し、３７℃、５％ ＣＯ２にて培養を開始した。培養開始約２４時間後に、それぞれにサイトカインを再び添加した。
【００６７】
ウィルス感染開始から約４８時間後にトリプシンＥＤＴＡ液（ＧＩＢＣＯ社）で各ウェルの細胞を回収し、予め５×１０５個／ディッシュのマウス胚性線維芽細胞をフィーダー細胞としたゼラチンコート１００ｍｍディッシュに１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地を用いて細胞を播き直した。それぞれのディッシュにはサイトカインを再び添加した。さらに、約２４時間後および約７２時間後に、サイトカイン入りの１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地で培地交換を実施した。その後、ウィルス感染開始から６日後からは、ＳＴ３またはＳＴ３ＦＰ６を含まないヒトＥＳ細胞培養用の培地に交換した。用いた培地の組成は、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地（ＳＩＧＭＡ社）５００ｍｌ、非必須アミノ酸液（ＳＩＧＭＡ社）５ｍｌ、２００ｍＭ Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ社）６．２５ｍｌ、ＫＮＯＣＫＯＵＴTM Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ(ＫＳＲ)（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ社）１２５ｍｌ、２−メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ社）５μｌ、５Ｎ ＮａＯＨ ６３８μｌ、Ｈｕｍａｎ ｂＦＧＦ（ＵＢＩ社）終濃度５ｎｇ／ｍｌであった。
【００６８】
その後、毎日培地交換を実施した。ウィルス感染開始から１０日後には、両方のディッシュでいくつかのコロニーを確認した（図１Ｂ）。この時点でＳＴ３ＦＰ６存在下で培養したｈＢＭＭＮＣｓの場合、比較的大きな扁平コロニーを含んでいたのに対し、ＳＴ３存在下で培養したｈＢＭＭＮＣｓの場合は出現したコロニーはまだ小さく、マウスＥＳ細胞に似た形態のコロニーであった。１５日後には各２４個のコロニーをピックアップし、残りの細胞を予めフィーダー細胞を播いたゼラチンコート１００ｍｍディッシュに再播種した。２０日後に再びコロニーをピックアップし、残りの細胞の半分を播種し、さらに残りの半分の細胞について、ＦＡＣＳによりヒトＥＳ細胞マーカーＳＳＥＡ−４の発現確認を行った（図１Ａ）。ＦＡＣＳによる解析では、回収した細胞をｓｔａｉｎｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ（ＳＭ）（５％ ＦＢＳ、０．０５％ ＮａＮ３、および０．５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）３〜５ｍｌで洗浄後、フィコエリスリン結合抗ＳＳＥＡ４抗体（ＢＤバイオサイエンス社）５μｌを添加し、氷中で１５分静置した。ＳＭ６ｍｌで洗浄後、死細胞を検出するための試薬ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）１μｇ／ｍｌを含むＳＭ液１ｍｌで再懸濁し、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤバイオサイエンス社）またはＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＳＯＲＰ（ＢＤバイオサイエンス社）を用いて測定を行った。その結果、ＳＴ３ＦＰ６存在下で培養したｈＢＭＭＮＣｓを用いた場合、レトロウィルス感染２０日後の時点で、幹細胞マーカーであるＳＳＥＡ−４を発現する細胞が約４０％に達し、ＦＰ６を添加しなかった場合の約１５％に比して２．５倍以上に達していることが示された。また、ヒトＥＳ細胞においてはアルカリフォスファターゼが発現していることが知られている。そこで、２７日後の時点で、常法に従ってアルカリフォスファターゼ活性染色を行った（図１Ｃ）。その結果、この時点でのコロニーのほとんどがアルカリフォスファターゼ陽性であることを確認した。以上より、ＳＴ３ＦＰ６存在下で培養したｈＢＭＭＮＣｓを用いた場合、多能性幹細胞の出現時期、細胞数において、ＳＴ３存在下で培養したｈＢＭＭＮＣｓを用いた場合を顕著に上回っていることが明らかとなった。
【００６９】
例２：ヒト骨髄由来単核球細胞からの多能性細胞の誘導（２）
Ａ．ヒト骨髄由来単核球細胞の培養
凍結保存されたヒト骨髄由来単核球細胞（ｈＢＭＭＮＣｓ）２．５×１０6細胞（Ａｌｌｃｅｌｌｓ社）を１００ｍｍペトリディッシュ１枚に播種し、３７℃、５％ ＣＯ２下、１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地で培養を開始した。培地には、ヒトＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＩＬ−３（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＦｌｔ３リガンド（１００ｎｇ／ｍｌ）、およびＦＰ６（２０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。ここで、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−３、Ｆｌｔ３リガンド、およびＦＰ６からなるサイトカインカクテルを「ＳＴ３ＦＬＦＰ６」と呼ぶ（以下同様）。培養開始２４時間後に、ＳＴ３ＦＬＦＰ６を同濃度で再び添加した。培養開始４８時間後に細胞を回収し、総細胞数５×１０５個の細胞を１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地５００μｌで懸濁した。細胞懸濁液には、ＳＴ３ＦＬ（各３００ｎｇ／ｍｌ）に加え、ＦＰ６を６０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した。調製したｈＢＭＭＮＣｓを次のウィルス感染実験に用いた。
【００７０】
Ｂ．核初期化遺伝子を含む組換えレトロウィルスベクターの作製
コラーゲンタイプＩコート１００ｍｍディッシュ１６枚に、それぞれ２．５×１０６個のＧ３Ｔ−ｈｉ細胞（タカラバイオ社）を播種し、３７℃、５％ ＣＯ２下、１０％ ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地で培養した。培養２４時間後に、核初期化遺伝子１種類についてディッシュ４枚を用いてウィルスベクターの遺伝子導入を行った。各ディッシュにつき、ｐＧＰ ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社）６μｇ、ｐＶＳＶ−Ｇ ｖｅｃｔｏｒ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）６μｇ、およびレトロウィルスベクターｐＭＸｓに核初期化遺伝子を挿入したプラスミド１２μｇを、遺伝子導入試薬ＦｕＧｅｎｅ６（ロシュダイグノスティック社）を用いて共導入した。用いた核初期化遺伝子は、ヒトＯｃｔ３／４、ヒトＳｏｘ２、ヒトＫｌｆ４、ヒトｃ−ｍｙｃの４種類であった。遺伝子導入の約４８時間後に、核初期化遺伝子の種類ごとに培養液を回収し、培養液を０．７５μｍフィルターでろ過後、５０００×ｇ、４℃で４時間遠心し、培養上清を捨てることでウィルス沈殿を取得した。ウィルス沈殿は全て１つにまとめ、５００μｌの１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地を加えて再懸濁したところ、最終的に液量は１ｍｌほどになった。
【００７１】
Ｃ．ヒト骨髄由来単核球細胞のウィルス感染処理
予め５０μｇ／ｍｌのレトロネクチン（タカラバイオ社）でコートされた１２ウェルプレート中の１つのウェルに、懸濁したウィルス沈殿を添加し、１０８０×ｇ、２０℃で２時間遠心した。遠心後のプレートに前記のｈＢＭＭＮＣｓの細胞懸濁液５００μｌを添加し、３７℃、５％ ＣＯ２にて培養を開始した。培養開始約２４時間後に、ＳＴ３ＦＬＦＰ６入りの培地で培地交換を実施した。
【００７２】
ウィルス感染開始から約４８時間後にトリプシンＥＤＴＡ液（ＧＩＢＣＯ社）で細胞を回収し、予め５×１０５個／ディッシュのマウス胚性線維芽細胞をフィーダー細胞としたゼラチンコート１００ｍｍディッシュに、１０％ＦＢＳおよびＳＴ３ＦＬＦＰ６を補充したＤＭＥＭ培地を用いて細胞を播き直した。さらに、約４８時間後に１０％ＦＢＳおよびＳＴ３ＦＬＦＰ６を補充したＤＭＥＭ培地で培地交換を実施した。その後、ウィルス感染開始から６日後からは、ＳＴ３ＦＬＦＰ６を含まないヒトＥＳ細胞培養用の培地（例１Ｃに記載）に交換した。
【００７３】
その後、毎日培地交換を実施した。ウィルス感染開始から１１日後には、両方のディッシュでいくつかのコロニーを確認した。１８日後には各２４個のコロニーをピックアップし、残りの細胞を予めフィーダー細胞を播いたゼラチンコート１００ｍｍディッシュに再播種した。２２日後の細胞を回収し、例１の方法に倣い、ＦＡＣＳによりヒトＥＳ細胞マーカーであるＳＳＥＡ−４の発現を解析した。その結果を図２に示す。
【００７４】
例３：レトロウィルス感染性ヒト骨髄由来単核球細胞の解析
Ａ．ヒト骨髄由来単核球細胞のレトロウィルス感染性の分析
凍結保存されたｈＢＭＭＮＣｓ（Ａｌｌｃｅｌｌｓ社）を用いて、レトロウィルスの感染効率についての検討を行った。例１の方法に倣い、核初期化因子発現ｐＭＸｓベクターの代わりに、緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰを発現するｐＭＸｓＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（ｐＭＸｓＩＧ）ベクター（T. Kitamura et al., Experimental Hematology, 31, pp.1007-1014, 2003；東京大学北村俊雄教授より供与）を用いて実施した。
【００７５】
ｈＢＭＭＮＣｓの培養条件は以下の３種類で実施した：(i)サイトカインを添加せずに、解凍後の細胞を用いてレトロウィルス感染を行った；(ii)例１と同様に、１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地にヒトＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ）、およびヒトＩＬ−３（１００ｎｇ／ｍｌ）を加えて（ＳＴ３）、前培養およびレトロウィルス感染を実施した；(iii)例１と同様に、１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地にヒトＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＩＬ−３（１００ｎｇ／ｍｌ）、およびＦＰ６（２０ｎｇ／ｍｌ）を加えて（ＳＴ３ＦＰ６）、前培養およびレトロウィルス感染を実施した。
【００７６】
レトロウィルスの調製および感染方法は例１と同様に実施した。感染２日後に細胞を回収し、細胞をＳＭ液で洗浄後、ＰＩ（１μｇ／ｍｌ）を含むＳＭ液１ｍｌで再懸濁し、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤバイオサイエンス社）を用いてＦＡＣＳ解析を行った（図３）。その結果、サイトカインを添加した培養を行わない(i)の場合、レトロウィルスに感染する細胞は全く検出できなかったのに対して、ＳＴ３を添加（(ii)）することにより、生細胞中約４％の細胞がレトロウィルスに感染するようになり、さらにＦＰ６を加えてＳＴ３ＦＰ６を添加（(iii)）することにより、レトロウィルスに感染する細胞は約８％に増加した。一方で、本例にて使用したレトロウィルスをコントロール細胞のＮＩＨ３Ｔ３細胞に感染させたところ、９９％の効率で感染が可能であったことから、レトロウィルスそのものの感染能力は十分であった。
【００７７】
Ｂ．感染細胞の表面抗原マーカーの分析
次に、例１および例２と同様にＳＴ３、ＳＴ３ＦＰ６またはＳＴ３ＦＬＦＰ６存在下で培養したｈＢＭＭＮＣｓに対して、ｐＭＸｓＩＧベクターより作製したレトロウィルスを感染させた場合の、ＥＧＦＰ陽性の感染細胞について、各種表面抗原マーカーに対する抗体を用いて免疫染色を行い、ＦＡＣＳを用いて解析を行った。
【００７８】
回収した細胞をＳＭ液３〜５ ｍｌで洗浄後、各種抗体５μｌを添加し、氷中で１５分静置した。ＳＭ６ｍｌで洗浄後、ＰＩ（１μｇ／ｍｌ）を含むＳＭ液１ｍｌで再懸濁し、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤバイオサイエンス社）にて測定を行った。用いた抗体は、アロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ４５抗体、アロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ３４抗体、フィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ３８抗体、アロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ１１ｂ抗体（以上、ＢＤバイオサイエンス社）、フィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ３抗体、フィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ１１７抗体、およびフィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ１９抗体（以上、ＩＭＭＵＮＯＴＥＣＨ社）であった。ＣＤ４５抗原は、すべてのヒト白血球、すなわちリンパ球、好酸球、単球、好塩基球、および好中球の表面に発現する。ＣＤ３４抗原は、最も未分化な造血幹細胞と造血前駆細胞に発現する。ＣＤ３８抗原は活性化したＴおよびＢリンパ球、ＮＫ細胞、単球、形質細胞および胸腺髄質細胞に発現する。ＣＤ１１ｂ抗原は、骨髄単球系細胞にみられ、ＮＫ細胞、顆粒球、単球／マクロファージに強く発現する。ＣＤ３抗原は、成熟Ｔ細胞および胸腺細胞に発現する。ＣＤ１１７抗原はごく少数の正常骨髄細胞にしか発現していないが、肥満細胞にも発現する。ＣＤ１９抗原は初期Ｂ細胞を含むすべての正常Ｂ細胞に発現するが、形質細胞に成熟すると消失する。
【００７９】
解析の結果、レトロウィルス感染細胞のほぼ全てにおいて白血球のマーカーであるＣＤ４５は陽性であり、ＳＴ３ではほぼすべてがＣＤ３４陽性細胞であり、ＳＴ３ＦＰ６またはＳＴ３ＦＬＦＰ６では約６０％がＣＤ３４陽性細胞であった。一方で、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３、ＣＤ１９といったマーカーはいずれも陰性であった（図４）。
【００８０】
例４：レトロウィルス感染性ヒト末梢血由来単核球細胞の解析
凍結保存されたヒト末梢血由来単核球細胞（ｈＰＢＭＮＣｓ）（Ａｌｌｃｅｌｌｓ社）に対して、例３と同様にｐＭＸｓＩＧベクターを用いてレトロウィルスの感染実験を行った。サイトカインカクテルを用いてｈＰＢＭＮＣｓを培養した場合の感染効率とＥＧＦＰ陽性の感染細胞について、各種表面抗原マーカーに対する抗体を用いて免疫染色を行い、ＦＡＣＳを用いて感染細胞の同定を行った。
【００８１】
ｈＰＢＭＮＣｓの培養には、１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地にヒトＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＩＬ−３（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＦＰ６（２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ３リガンド（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加して培養したＧＭ培養系と、ヒトＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＩＬ−３（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＦＰ６（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）、抗ヒトＣＤ４０抗体 ＃３４１（キリンファーマ社）（１００ｎｇ／ｍｌ）、抗ヒトＣＤ３抗体（ＯＫＴ３ ヤンセンファーマ）（１μｇ／ｍｌ）、抗ヒトＣＤ２８抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（１μｇ／ｍｌ）を添加して前培養したＴＢ培養系の２通りの培養系を用いて、レトロウィルス感染を実施した。レトロウィルスの調製および感染方法は例１と同様に実施した。感染２日後に細胞を回収し、回収した細胞をＳＭ液３〜５ｍｌで洗浄後、各種抗体５μｌを添加し、氷中で１５分静置した。ＳＭ６ｍｌで洗浄後、ＰＩ（１μｇ／ｍｌ）を含むＳＭ液１ｍｌで再懸濁し、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤバイオサイエンス社）にて測定を行った。
【００８２】
用いた抗体は、アロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ４５抗体、アロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ３４抗体、フィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ３８抗体、アロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ１１ｂ抗体、フィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ１３抗体（以上、ＢＤバイオサイエンス社）、フィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ３抗体、フィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ１１７抗体、およびフィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ１９抗体（以上、ＩＭＭＵＮＯＴＥＣＨ社）であった。ＣＤ１３抗原は、正常末梢血の好中球、好酸球、好塩基球および単球など、ほとんどの骨髄系細胞に発現する。
【００８３】
解析の結果、レトロウィルス感染細胞のほぼ全てにおいて白血球のマーカーであるＣＤ４５は陽性であり、ＧＭ培養系では骨髄細胞を用いた場合と同様に、約半数がＣＤ３４陽性であった。ＴＢ培養系においてはＴ細胞のマーカーであるＣＤ３抗原陽性であった（図５）。本系を用いることにより、末梢血中に存在するＴ細胞などから多能性細胞を誘導できる可能性が考えられる。
【００８４】
例５：ヒト誘導多能性細胞クローンの表面抗原解析
例１および例２の結果クローニングした細胞株について、コロニー形態の観察およびＦＡＣＳによりヒトＥＳ細胞マーカーＳＳＥＡ−４の発現確認を行った。ＦＡＣＳ解析の方法は例１と同様に行った。
【００８５】
ＳＴ３の培養条件を用いて取得したクローン＃１６および＃３０、ＳＴ３ＦＰの培養条件を用いて取得したクローン＃２２および＃３３、ＳＴ３ＦＬＦＰの培養条件を用いて取得したクローン＃１および＃４について解析した結果を図６に示す。いずれのクローンも幹細胞マーカーであるＳＳＥＡ−４を有意に発現していることを確認した。
【００８６】
例６：ヒト誘導多能性細胞クローンのＲＴ−ＰＣＲ解析
例５で解析したクローンを含め、例１および例２の結果取得した多能性幹細胞クローンについて、幹細胞特異的遺伝子のｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲ法を用いて解析した。
【００８７】
各クローン細胞をマウス胚性線維芽細胞のフィーダー細胞上に播種し、ヒトＥＳ細胞用培地にて培養した細胞よりＲＮＡを回収した。用いた培地の組成は、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地（ＳＩＧＭＡ社）５００ｍｌ、非必須アミノ酸液（ＳＩＧＭＡ社）５ｍｌ、２００ｍＭ Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ社）６．２５ｍｌ、ＫＮＯＣＫＯＵＴTM Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ(ＫＳＲ)（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ社）１２５ｍｌ、２−メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ社）５μｌ、５Ｎ ＮａＯＨ ６３８μｌ、Ｈｕｍａｎ ｂＦＧＦ（ＵＢＩ社）終濃度５ｎｇ／ｍｌであった。回収した細胞はＰＢＳ緩衝液で洗浄後、細胞沈殿を液体窒素中にて凍結した。コントロール細胞として、凍結融解後のＢＭＭＮＣｓをフィーダー細胞上で数時間培養した細胞およびフィーダー細胞（ＭＥＦ細胞）を用意した。凍結後の細胞サンプルより、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、添付プロトコルに従って全ＲＮＡを調製した。調製したＲＮＡを用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により添付のプロトコルに従ってｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを鋳型として、ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）を用いて、９６℃−２０秒、５５℃−３０秒、および７２℃−３０秒からなる工程を１サイクルとして３５サイクルのＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応に用いたプライマーは山中らと同様のものを用いており（K. Takahashi, S. Yamanaka, Cell, 131, pp.861-872, 2007）、各プライマーの塩基配列を表１に示す。各ＰＣＲ反応は各遺伝子についてフォワード（Ｆｗ）プライマーとリバース（Ｒｖ）プライマーとの組合せを用いて実施した。ＲＴ反応およびＰＣＲ反応のコントロールとして、ハウスキーピング遺伝子であるｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−3−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子を用いた。ＰＣＲ反応物をエチジウムブロマイド入りのアガロースゲルにて電気泳動し、ＵＶトランスイルミネーターにより観察した結果を図７に示す。解析の結果、いずれのクローンも幹細胞マーカー遺伝子を発現していることを確認した。
【００８８】
【表１】
【００８９】
例７：マウス骨髄由来単核球細胞からの多能性細胞の誘導（１）
Ａ．マウス骨髄由来単核球細胞の取得
未分化な多能性幹細胞において緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰを発現することが知られているＯｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス（１０〜２０週齢）（K. Ohbo et al., Dev. Biol., 258, pp.209-225, 2003; 横浜市立大学 大保和之准教授より供与）の大腿骨内の骨髄を採取し、ＰＢＳに懸濁した。定法に従い（高津聖志、免疫研究の基礎技術、羊土社1995）、骨髄から比重遠心法により単核球細胞画分を濃縮し、これをマウス骨髄単核球細胞（ｍＢＭＭＮＣｓ）として用いた。
【００９０】
Ｂ．核初期化遺伝子を含む組換えレトロウィルスベクターの作製
コラーゲンタイプＩコート６０ｍｍディッシュ１０枚にそれぞれ１×１０６個、および６ウェルプレートの各ウェルに１×１０５個のレトロウィルス用のパッケージング用細胞：ＰＬＡＴ−Ｅ細胞（S.Morita et al., Gene Therapy, 7, pp.1063-1066, 2000；東京大学北村俊雄教授より供与）を播種し、３７℃、５％ ＣＯ２下、１０％ ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地で培養した。培養２４時間後に、マウス核初期化遺伝子１種類について６０ｍｍディッシュ２枚を用いてウィルスベクターの遺伝子導入を行った。各ディッシュにつき、レトロウィルスベクターｐＭＸｓに核初期化遺伝子を挿入したプラスミド３μｇを遺伝子導入試薬ＦｕＧｅｎｅ６（ロシュダイグノスティック社）を用いて導入した。用いた核初期化遺伝子は、マウスＯｃｔ３／４、マウスＳｏｘ２、マウスＫｌｆ４、およびマウスｃ−ｍｙｃの４種類であった。核初期化遺伝子発現レトロウィルスベクター、ｐＭＸｓｍＯｃｔ３／４、ｐＭＸｓｍＳｏｘ２、ｐＭＸｓｍＫｌｆ４、およびｐＭＸｓｍｃ−ｍｙｃの構築は、山中らの方法に従って行った（K. Takahashi, S. Yamanaka, Cell, 126, pp.663-676, 2006）。その他に、６０ｍｍディッシュ１枚と６ウェルプレートの３ウェル分において、上記４種類の遺伝子各３μｇのＤＮＡを併せて導入した。また、コントロールとして緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰを発現するｐＭＸｓＩＧベクター３μｇを６０ｍｍディッシュ１枚に導入した。遺伝子導入の約４８時間後に、各核初期化遺伝子について６０ｍｍディッシュ１枚ずつを集めて０．２２μｍフィルターでろ過後、５８００×ｇ、４℃で４時間遠心し、培養上清を捨てた後に３ｍｌのマウスＥＳ細胞用培地で再懸濁した濃縮ウィルスサンプル(i)を取得した。マウスＥＳ細胞用培地としては、２０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地に１／１００容の２-メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ社）、１／１０００容のＥＳＧＲＯ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社）を添加したものを用いた。また、各核初期化遺伝子について６０ｍｍディッシュ１枚ずつを集めて０．２２μｍフィルターでろ過しただけのものを４ウィルスサンプル(ii)とした。４種類の遺伝子を同時に導入した６０ｍｍディッシュ１枚と６ウェルプレートの３ウェル分の培養上清に
ついては、０．２２μｍフィルターでろ過し、４遺伝子サンプル(iii)とした。コントロールのｐＭＸｓＩＧベクターを導入した培養上清については、０．２２μｍフィルターでろ過したものをコントロールサンプル(iv)とした。
【００９１】
Ｃ．マウス骨髄由来単核球細胞のウィルス感染処理
予め３３μｇ／ｍｌのレトロネクチン（タカラバイオ社）でコートされた１２ウェルプレートの２ウェルずつに上記(i)〜(iv)のサンプルを添加し、１０８０×ｇ、２５℃で２時間遠心した。遠心後のプレートからウィルスサンプルを除去し、新たなマウスＥＳ細胞用培地を１ｍｌずつ添加した。さらに、(i)〜(iv)の各サンプルの一方のウェルには、マウスＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ）、およびマウスＩＬ−３（１００ｎｇ／ｍｌ）（ＳＴ３）を添加した。その後、各ウェルに前記のＯｃｔ４−ＥＧＦＰマウスより調製したｍＢＭＭＮＣｓを１×１０５個／ウェルになるよう添加し、３７℃、５％ ＣＯ２にて培養を開始した。
【００９２】
また、ウィルス感染前日に、Ｏｃｔ４ＥＧＦＰマウス由来胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を１２ウェルプレートに２×１０４個／ウェルで播種して培養していた各ウェルについても、上記(i)〜(iv)のサンプルを１ウェルずつに添加し、１０８０×ｇ、３２℃で４０分間遠心した後、３７℃、５％ ＣＯ２にて培養を開始した。
【００９３】
ウィルス感染２日後のコントロールサンプルにおけるＥＧＦＰ発現細胞の割合は、ＭＥＦ細胞では３４％、サイトカインなしのｍＢＭＭＮＣｓでは５５％、ＳＴ３存在下のｍＢＭＭＮＣｓでは６０％であった。
【００９４】
４ウィルスサンプル（(ii)）を感染させたｍＢＭＭＮＣｓについては、サイトカインの添加、非添加に関わらず、ウィルス感染開始から５日後にはＯｃｔ４−ＥＧＦＰレポーター遺伝子によるＥＧＦＰ遺伝子の発現が認められた（図８Ａ・Ｂ）。一方で、ＭＥＦについてはこの時点ではＥＧＦＰ遺伝子発現細胞の存在は認められなかった（図８Ｃ）。ウィルス感染７日後に、ｍＢＭＭＮＣｓ由来各サンプルについて、Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰレポーター遺伝子の発現と血球細胞マーカーであるＣＤ４５抗原の発現のＦＡＣＳ解析を実施した。この解析のために、回収した細胞をＳＭ液３〜５ ｍｌで洗浄後、アロフィコシアニン結合抗マウスＣＤ４５抗体（ＢＤバイオサイエンス社）５μｌを添加し、氷中で１５分静置した。ＳＭ６ｍｌで洗浄後、ＰＩ（１μｇ／ｍｌ）を含むＳＭ液１ｍｌで再懸濁し、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤバイオサイエンス社）にて測定を行った。その結果を図９および表２に示す。ＦＡＣＳ解析前の細胞の様子を図１０に示す。感染前のｍＢＭＭＮＣｓはそのほぼ全てがＣＤ４５抗原陽性であるのに対し、この時点でのＯｃｔ４−ＥＧＦＰ陽性細胞の多くは既にＣＤ４５抗原陰性であった。また同時に、ＦＡＣＳ ｓｏｒｔｉｎｇによりＥＧＦＰ陽性細胞の分取を行い、それらの細胞からクローニングを実施し、マウス骨髄由来誘導多能性幹細胞（ｍＢＭｉＰＳ）クローン＃７および＃１３を取得した。取得した各クローンについてもＦＡＣＳ解析を実施した（図１１）。
【００９５】
【表２】
【００９６】
ＦＡＣＳによる解析では、回収した細胞をＳＭ液３〜５ ｍｌで洗浄後、各種抗体５μｌを添加し、氷中で１５分静置した。ＳＭ６ｍｌで洗浄後、ＰＩ（１μｇ／ｍｌ）を含むＳＭ液１ｍｌで再懸濁し、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤバイオサイエンス社）またはＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＳＯＲＰ（ＢＤバイオサイエンス社）を用いて測定を行った。抗体としては、アロフィコシアニン結合抗マウスＣＤ４５抗体（ＢＤバイオサイエンス社）、およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７結合抗マウスＳＳＥＡ−１抗体を用いた。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７結合抗マウスＳＳＥＡ−１抗体は、抗マウスＳＳＥＡ−１抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社）１００μｇをＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて標識することにより調製した。
【００９７】
例８：マウス骨髄由来単核球細胞からの多能性細胞の誘導（２）
Ａ．核初期化遺伝子を含む組換えレトロウィルスベクターの作製
コラーゲンタイプＩコート６０ｍｍディッシュ１２枚にそれぞれ７×１０５個のＰＬＡＴ−Ｅ細胞を播種し、３７℃、５％ ＣＯ２下、１０％ ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地で培養した。培養２４時間後に、各種遺伝子導入を行った。１２枚のうち４枚については、マウス核初期化遺伝子１種類について６０ｍｍディッシュ１枚を用いてウィルスベクターの遺伝子導入を行った。各ディッシュにつき、レトロウィルスベクターｐＭＹｓ（T. Kitamura et al., Experimental Hematology, 31, pp.1007-1014, 2003；東京大学北村俊雄教授より供与）に核初期化遺伝子を挿入したプラスミド４μｇを遺伝子導入試薬ＦｕＧｅｎｅ６（ロシュダイグノスティック社）を用いて導入した。用いた核初期化遺伝子は、ヒトＯｃｔ３／４、ヒトＳｏｘ２、ヒトＫｌｆ４、およびヒトｃ−ｍｙｃの４種類であった。６０ｍｍディッシュ４枚について、上記４種類の遺伝子各４μｇのＤＮＡを併せて導入した。また、コントロールとして緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰを発現するｐＭＹｓＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（ｐＭＹｓＩＧ）ベクター１６μｇを６０ｍｍディッシュ４枚に導入した。
【００９８】
遺伝子導入の約４８時間後に、各核初期化遺伝子を個別に導入した６０ｍｍディッシュ計４枚を集めて４ウィルスサンプルとし、４種同時に導入した計４枚を集めて４遺伝子サンプルとし、ｐＭＹｓＩＧベクターを導入した計４枚を集めてコントロールサンプルとした。いずれのサンプルについても、０．２２μｍフィルターでろ過後、５８００×ｇ、４℃で４時間遠心し、培養上清を捨てた後に２．５ｍｌのマウスＥＳ細胞用培地で再懸濁し、再び０．２２μｍフィルターでろ過を行った。
【００９９】
Ｂ．細胞のウィルス感染処理
レトロネクチン（タカラバイオ社）でコートされた１２ウェルプレートの２ウェルずつに４ウィルスサンプル、４遺伝子サンプル、およびコントロールサンプルをそれぞれ添加し、１０８０×ｇ、２５℃で２時間遠心した。遠心後のプレートからウィルスサンプルを除去し、各サンプルのウェルに対して、マウスＥＳ細胞用培地で懸濁したＯｃｔ４−ＥＧＦＰマウスＢＭＭＮＣｓまたはＯｃｔ４−ＥＧＦＰマウスＭＥＦ細胞を１×１０５個／ウェルになるよう添加し、３７℃、５％ ＣＯ２にて培養を開始した。
【０１００】
また、ウィルス感染前日に、Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰマウスＭＥＦ細胞をゼラチンコート１２ウェルプレートに２×１０４個／ウェルで播種して培養していた各ウェルについても、上記３種のサンプルを１ウェルずつに添加し、１０８０×ｇ、２５℃で４０分間遠心した後、３７℃、５％ ＣＯ２にて培養を開始した。
【０１０１】
ウィルス感染開始２日後のコントロールサンプルにおけるＥＧＦＰ発現細胞の割合は、レトロネクチンコートプレートで感染させたＭＥＦ細胞では９５％、ゼラチンコートプレートで予め培養していたＭＥＦ細胞では６５％、レトロネクチンコートプレートで感染させたｍＢＭＭＮＣｓでは２６％であった（図１２）。その後、ウィルス感染開始から７日目にＦＡＣＳ ｓｏｒｔｉｎｇを行い（図１３）、１２日目に出現コロニー数を計測した。その結果を表３にまとめた。
【０１０２】
【表３】
【０１０３】
例９：マウス骨髄由来多能性細胞の多分化能解析
ｍＢＭｉＰＳクローン＃７および＃１３について分化多能性を評価するため、ヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃＡＪｃｌ−ｎｕ）の皮下への移植を行った。未分化ＥＳ細胞は生体内に移植されると奇形腫を形成することが知られている。コントロール細胞としてマウスＥＳ細胞Ｅ１４株を使用した。ヌードマウス１匹あたり各細胞１×１０６個を１００μｌ血清非含有ＤＭＥＭ培地で懸濁して皮下投与した。その結果、マウスＥＳ細胞を移植した場合と同様の大きさの奇形腫瘍がｍＢＭｉＰＳ細胞を移植した全例でも形成された。移植後２週間後および４週間後の腫瘍を摘出し、ホルマリン固定により組織標本を作製した。組織学的な解析の結果、いずれのクローン由来の奇形腫においても、神経組織、軟骨組織、筋組織、脂肪組織、食道粘膜様組織、気管上皮などが認められたことから、ｍＢＭＭＮＣｓより誘導された各クローンが多能性を有することが証明された（図１４）。
【０１０４】
さらにｍＢＭｉＰＳクローン＃７細胞をＢａｌｂ／ｃマウスの受精卵から作製した胚盤胞に注入後、偽妊娠マウスに移植することによりキメラ個体を作出することを試みた。その結果、Ｂａｌｂ／ｃマウスの産仔は白色の毛色を示すはずのところ、ｍＢＭｉＰＳ細胞に由来する黒色の毛色を有するキメラマウスが誕生した（図１５および表４）。毛色は全身の細胞の一部を反映するものであり、他の組織・臓器においてもｍＢＭｉＰＳ細胞に由来する細胞が個体を構成しているものと考えられた。
【０１０５】
【表４】
【０１０６】
例１０：マウス骨髄由来多能性細胞の発現プロファイル解析
ｍＢＭｉＰＳクローン＃７および＃１３について、各５×１０５個の細胞からＲＮＡｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｐｌｕｓ ｋｉｔ (ＱＩＡＧＥＮ社)を用いてＲＮＡを調製し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｒｒａｙ （Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いて発現プロファイル解析を実施した。コントロールとしてマウスＥＳ細胞Ｅ１４株およびマウスＢＭＭＮＣ細胞を使用した。その結果、図１６に示すような各遺伝子の発現パターンを示し、ｍＢＭｉＰＳクローン＃７および＃１３がＥＳ細胞と酷似した細胞であることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】ヒト骨髄由来単核球細胞（ｈＢＭＭＮＣｓ）から誘導された多能性幹細胞の未分化マーカーの発現量を評価したＦＡＣＳ解析の結果、誘導された多能性幹細胞が形成するコロニーの形態および誘導された多能性幹細胞のアルカリフォスファターゼの活性染色の結果を示した。[Ａ]は ｈＢＭＭＮＣｓに対して核初期化因子を発現するレトロウィルスを感染させた後２０日目の未分化細胞マーカーＳＳＥＡ−４の発現を示した。図の水平軸がＳＳＥＡ−４の発現量を示し、垂直軸が示すＰＩの染色強度が低いものが生細胞を示した。図中の等高線は解析した細胞の存在頻度を示した。「ＳＴ３ＦＰ６」はレトロウィルス感染前２日間および核初期化プロセスにおいて、サイトカインカクテルとしてＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−３、ＦＰ６をｈＢＭＭＮＣｓと共存させていることを示し、「ＳＴ３」はレトロウィルス感染前２日間および核初期化プロセスにおいて、サイトカインカクテルとしてＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−３をｈＢＭＭＮＣｓと共存させていることを示した。[Ｂ]は核初期化プロセスにおいて形成された細胞コロニーの形態を示した。「Ｄａｙ１０」、「Ｄａｙ２０」はレトロウィルス感染開始からの日数を示した。[Ｃ]はｈＢＭＭＮＣｓから誘導された多能性幹細胞のレトロウィルス感染開始から２７日目のアルカリフォスファターゼ染色を示した。
【図２】ヒト骨髄由来単核球細胞（ｈＢＭＭＮＣｓ）から誘導された多能性幹細胞の未分化マーカーの発現量を評価したＦＡＣＳ解析の結果および誘導された多能性幹細胞が形成するコロニーの形態を示した。レトロウィルス感染前２日間および核初期化プロセスにおいて、サイトカインカクテルとしてＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−３、ＦＰ６、ＦｌｔリガンドをｈＢＭＭＮＣｓと共存させた場合を示した。[Ａ]は ｈＢＭＭＮＣｓに対して核初期化因子を発現するレトロウィルスを感染させた後２２日目の未分化細胞マーカーＳＳＥＡ−４の発現を示した。図の水平軸がＳＳＥＡ−４の発現量を示し、垂直軸が細胞数を示した。 [Ｂ]は核初期化プロセスにおいて形成された細胞コロニーの形態を示した。
【図３】ｐＭＸｓＩＧベクターを用いて調製されたレトロウィルスのヒト骨髄由来単核球細胞（ｈＢＭＭＮＣｓ）に対する感染効率を評価するためのＦＡＣＳ解析結果を示した。「ＰＩ」はヨウ化プロピジウムによる染色強度を示し、図中の等高線は解析した細胞の存在頻度を示した。各図の水平軸は感染したレトロウィルスゲノムから発現する緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰの発現強度を示した。「サイトカイン培養なし」はレトロウィルス感染前後でサイトカイン類を共存させない場合を示した。「ＳＴ３添加培養」はレトロウィルス感染２日前より、ＦＡＣＳ解析を行ったレトロウィルス感染２日後までの間、ｈＢＭＭＮＣｓとＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−３のサイトカインを共存させた場合を示した。「ＳＴ３ＦＰ６添加培養」はレトロウィルス感染２日前より、ＦＡＣＳ解析を行ったレトロウィルス感染２日後までの間、ｈＢＭＭＮＣｓとＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−３、ＦＰ６のサイトカインを共存させた場合を示した。
【図４】ｐＭＸｓＩＧベクターを用いて調製されたレトロウィルスが感染したヒト骨髄由来単核球細胞（ｈＢＭＭＮＣｓ）の細胞系譜を同定評価するためのＦＡＣＳ解析結果を示した。レトロウィルス感染２日前よりＦＡＣＳ解析を行ったレトロウィルス感染２日後までの間、ｈＢＭＭＮＣｓを、ＳＣＦ、ＴＰＯ、およびＩＬ−３サイトカインと共存させた場合をＳＴ３として示し、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−３、およびＦＰ６サイトカインと共存させた場合をＳＴ３ＦＰ６として示し、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−３、ＦＰ６、およびＦｌｔ３リガンドと共存させた場合をＳＴ３ＦＬＦＰ６として示した。各図の水平軸は感染したレトロウィルスゲノムから発現する緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰの発現強度を示し、図中の等高線は解析した細胞の存在頻度を示した。「ＣＤ４５ＡＰＣ」はアロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ４５抗体による染色強度を示した。「ＣＤ３４ＡＰＣ」はアロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ３４抗体による染色強度を示した。「ＣＤ３８ＰＥ」はフィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ３８抗体による染色強度を示した。「ＣＤ１１７ＰＥ」はフィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ１１７抗体による染色強度を示した。「ＣＤ１１ｂＡＰＣ」はアロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ１１ｂ抗体による染色強度を示した。「ＣＤ３ＰＥ」はフィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ３抗体による染色強度を示した。「ＣＤ１９ＰＥ」はフィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ１９抗体による染色強度を示した。
【図５】ｐＭＸｓＩＧベクターを用いて調製されたレトロウィルスが感染したヒト末梢血由来単核球細胞（ｈＰＢＭＮＣｓ）の細胞系譜を同定評価するためのＦＡＣＳ解析結果を示した。レトロウィルス感染２日前よりＦＡＣＳ解析を行ったレトロウィルス感染２日後までの間、ｈＰＢＭＮＣｓをヒトＳＣＦ、ヒトＴＰＯ、ヒトＩＬ−３、ＦＰ６、Ｆｌｔ３リガンド、ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＭ−ＣＳＦと共存させた場合をＧＭ培養として示し、ヒトＳＣＦ、ヒトＴＰＯ、ヒトＩＬ−３、ＦＰ６、ＬＰＳ、抗ヒトＣＤ４０抗体、抗ヒトＣＤ３抗体、抗ヒトＣＤ２８抗体の因子と共存させた場合をＴＢ培養として示した。各図の水平軸は感染したレトロウィルスゲノムから発現する緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰの発現強度を示し、図中の等高線は解析した細胞の存在頻度を示した。「ＣＤ４５ＡＰＣ」はアロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ４５抗体による染色強度を示した。「ＣＤ３４ＡＰＣ」はアロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ３４抗体による染色強度を示した。「ＣＤ３８ＰＥ」はフィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ３８抗体による染色強度を示した。「ＣＤ１１７ＰＥ」はフィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ１１７抗体による染色強度を示した。「ＣＤ１１ｂＡＰＣ」はアロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ１１ｂ抗体による染色強度を示した。「ＣＤ３ＰＥ」はフィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ３抗体による染色強度を示した。「ＣＤ１９ＰＥ」はフィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ１９抗体による染色強度を示した。「ＣＤ１３ＰＥ」はフィコエリスリン結合抗ヒトＣＤ１３抗体による染色強度を示した。
【図６】クローニングしたヒト誘導多能性細胞株について、コロニー形態およびＦＡＣＳによるヒトＥＳ細胞マーカーＳＳＥＡ−４の発現解析結果を示した。図の水平軸がＳＳＥＡ−４の発現量を示し、垂直軸が細胞数を示した。
【図７】クローニングしたヒト誘導多能性細胞株についてのＲＴ−ＰＣＲ解析結果を示した。図の水平方向に各細胞株を配置し、ＳＴ３、ＳＴ３ＦＰ６、ＳＴ３ＦＬＦＰ６は各細胞の誘導条件を示し、その下の数字が各クローン番号を示した。図の垂直方向には多能性幹細胞マーカーとして知られる遺伝子を配置し、コントロール遺伝子としてハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの結果を示した。図の黒色のバンドが各遺伝子についての発現を示している。
【図８】Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス骨髄由来単核球細胞（ｍＢＭＭＮＣｓ）あるいはＯｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来の胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）から誘導された多能性幹細胞が形成するコロニーの形態および未分化性のマーカーであるＯｃｔ４−ＥＧＦＰレポーター遺伝子からのＥＧＦＰタンパク質の発現を示した。[Ａ]はＯｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来のｍＢＭＭＮＣｓに対して核初期化因子を発現するレトロウィルスを感染させた後５日目の細胞の形態および未分化性マーカーＯｃｔ４−ＥＧＦＰの発現を示した。「４遺伝子サンプル」はレトロウィルスを調製する際に、４つの核初期化遺伝子を同時にパッケージング細胞へ導入してレトロウィルスを作製した場合を示した。「４ウィルスサンプル」はレトロウィルスを調製する際に、４つの核初期化遺伝子をそれぞれ個別にパッケージング細胞へ導入してレトロウィルスを作製した後に、レトロウィルスを混合し細胞に感染させた場合を示した。[Ｂ]はＯｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来のｍＢＭＭＮＣｓにレトロウィルスを感染させる際に、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−３のサイトカインを共存させた場合の、レトロウィルス感染後５日目の細胞の形態および未分化性マーカーＯｃｔ４−ＥＧＦＰの発現を示した。 [Ｃ]はＯｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来のＭＥＦに対して核初期化因子を発現するレトロウィルスを感染させた後５日目の細胞の形態および未分化性マーカーＯｃｔ４−ＥＧＦＰの発現を示した。
【図９】Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウスの骨髄由来単核球細胞（ｍＢＭＭＮＣｓ）から誘導された多能性幹細胞について、未分化性のマーカーであるＯｃｔ４−ＥＧＦＰレポーター遺伝子からのＥＧＦＰタンパク質の発現と血球細胞のマーカーであるＣＤ４５抗原の発現をＦＡＣＳにて解析した結果を示した。Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来のｍＢＭＭＮＣｓに対して核初期化因子を発現するレトロウィルスを感染させた後７日目の解析を示した。「４遺伝子」はレトロウィルスを調製する際に、４つの核初期化遺伝子を同時にパッケージング細胞へ導入してレトロウィルスを作製した場合を示した。「４ウィルス」はレトロウィルスを調製する際に、４つの核初期化遺伝子をそれぞれ個別にパッケージング細胞へ導入してレトロウィルスを作製した後に、レトロウィルスを混合し細胞に感染させた場合を示した。「濃縮ウィルス」は「４ウィルス」と同様に調製したレトロウィルスを濃縮して感染に用いた場合を示した。各図の水平軸は感染したレトロウィルスゲノムから発現する緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰの発現強度を示した。「ＣＤ４５ＡＰＣ」はアロフィコシアニン結合抗ヒトＣＤ４５抗体による染色強度を示し、図中の等高線は解析した細胞の存在頻度を示した。
【図１０】Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス骨髄由来単核球細胞（ｍＢＭＭＮＣｓ）あるいはＯｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来の胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）から誘導された多能性幹細胞が形成するコロニーの形態および未分化性のマーカーであるＯｃｔ４−ＥＧＦＰレポーター遺伝子からのＥＧＦＰタンパク質の発現を示した。Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来のｍＢＭＭＮＣｓあるいはＭＥＦに対して核初期化因子を発現するレトロウィルスを感染させた後７日目の様子を示した。「ｍＢＭＭＮＣｓ」はＯｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来のｍＢＭＭＮＣｓから誘導された細胞を示した。「ＭＥＦ」はＯｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来のＭＥＦから誘導された細胞を示した。
【図１１】Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウスの骨髄由来単核球細胞（ｍＢＭＭＮＣｓ）から誘導された多能性幹細胞クローンについて、未分化性のマーカーであるＯｃｔ４−ＥＧＦＰレポーター遺伝子からのＥＧＦＰタンパク質の発現とマウス未分化細胞のマーカーであるＳＳＥＡ−１抗原の発現をＦＡＣＳにて解析した結果および多能性幹細胞クローンが形成するコロニーの形態とコロニーにおける未分化性のマーカーであるＯｃｔ４−ＥＧＦＰレポーター遺伝子からのＥＧＦＰタンパク質の発現を示した。[Ａ]はＯｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来のｍＢＭｉＰＳ細胞クローン＃７およびクローン＃１３について未分化性マーカーＯｃｔ４−ＥＧＦＰの発現およびマウス未分化細胞のマーカーであるＳＳＥＡ−１抗原の発現をＦＡＣＳにて解析した結果を示した。「ＩｇＧ ＡＰＣ」はアロフィコシアニン結合コントロールＩｇＧによる染色強度を示した。「ＳＳＥＡ−１ Ａｌｅｘａ６４７」はＡｌｅｘａ６４７結合抗マウスＳＳＥＡ−１抗体による染色強度を示した。各図の水平軸は未分化性マーカーＯｃｔ４−ＥＧＦＰの発現強度を示し、図中の等高線は解析した細胞の存在頻度を示した。[Ｂ]はＯｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来のｍＢＭｉＰＳ細胞クローン＃７およびクローン＃１３についてマウス未分化細胞のマーカーであるＳＳＥＡ−１抗原の発現をＦＡＣＳにて解析した結果を示した。水平軸はマウス未分化細胞のマーカーであるＳＳＥＡ−１抗原の発現強度を示し、垂直軸は細胞数を示した。図の実線がＡｌｅｘａ６４７結合抗マウスＳＳＥＡ−１抗体で染色した場合をしめし、破線はアロフィコシアニン結合コントロールＩｇＧで染色した場合を示した。[Ｃ]はＯｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来のｍＢＭｉＰＳ細胞クローン＃７およびクローン＃１３が形成するコロニーの形態および未分化性のマーカーであるＯｃｔ４−ＥＧＦＰレポーター遺伝子からのＥＧＦＰタンパク質の発現を示した。
【図１２】ｐＭＹｓＩＧベクターを用いて調製されたレトロウィルスのＯｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス骨髄由来単核球細胞（ｍＢＭＭＮＣｓ）あるいはＯｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来の胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）に対する感染効率を評価するためのＦＡＣＳ解析結果を示した。図の水平軸は感染したレトロウィルスゲノムから発現する緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰの発現強度を示し、垂直軸は細胞数を示した。レトロウィルス感染後２日目の解析結果を示した。「ＢＭＭＮＣｓ」はＯｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来ｍＢＭＭＮＣｓを用いた場合を示し、「ゼラチン上に予め培養ＭＥＦ」はウィルス感染前日からゼラチンコートプレート上で培養していたＯｃｔ４−ＥＧＦＰマウスＭＥＦを用いた場合を示し、「レトロネクチン上ＭＥＦ」はＢＭＭＮＣｓと同様にレトロネクチンコートプレートで感染させたＭＥＦを用いた場合を示した。
【図１３】Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウスの骨髄由来単核球細胞（ｍＢＭＭＮＣｓ）あるいはＭＥＦからｐＭＹｓ核初期化遺伝子ベクターを用いて調製されたレトロウィルスを用いて誘導された多能性幹細胞について、未分化性のマーカーであるＯｃｔ４−ＥＧＦＰレポーター遺伝子からのＥＧＦＰタンパク質の発現とマウス未分化細胞のマーカーであるＳＳＥＡ−１抗原の発現をＦＡＣＳにて解析した結果および多能性幹細胞クローンが形成するコロニーの形態とコロニーにおける未分化性のマーカーであるＯｃｔ４−ＥＧＦＰレポーター遺伝子からのＥＧＦＰタンパク質の発現を示した。[Ａ]はレトロウィルス感染７日後のＯｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来ｍＢＭＭＮＣｓおよびＭＥＦの未分化性マーカーＯｃｔ４−ＥＧＦＰの発現およびマウス未分化細胞のマーカーであるＳＳＥＡ−１抗原の発現をＦＡＣＳにて解析した結果を示した。「ＳＳＥＡ−１ Ａｌｅｘａ６４７」はＡｌｅｘａ６４７結合抗マウスＳＳＥＡ−１抗体による染色強度を示した。各図の水平軸は未分化性マーカーＯｃｔ４−ＥＧＦＰの発現強度を示し、図中の等高線は解析した細胞の存在頻度を示した。[Ｂ]はレトロウィルス感染７日後にＯｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来のｍＢＭＭＮＣｓおよびＭＥＦが形成するコロニーの形態および未分化性のマーカーであるＯｃｔ４−ＥＧＦＰレポーター遺伝子からのＥＧＦＰタンパク質の発現を示した。[Ｃ]はレトロウィルス感染１２日後にＯｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来のｍＢＭＭＮＣｓおよびＭＥＦが形成するコロニーの形態および未分化性のマーカーであるＯｃｔ４−ＥＧＦＰレポーター遺伝子からのＥＧＦＰタンパク質の発現を示した。「ＢＭＭＮＣｓ」はＯｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウス由来ｍＢＭＭＮＣｓを用いた場合を示し、「ゼラチン上に予め培養ＭＥＦ」はウィルス感染前日からゼラチンコートプレート上で培養していたＯｃｔ４−ＥＧＦＰマウスＭＥＦを用いた場合を示し、「レトロネクチン上ＭＥＦ」はＢＭＭＮＣｓと同様にレトロネクチンコートプレートで感染させたＭＥＦを用いた場合を示した。
【図１４】ヌードマウスの皮下に移植されたマウス骨髄由来ｉＰＳ＃７細胞より形成された奇形腫を示す。[Ａ]は皮下に移植されたマウス骨髄由来ｉＰＳ＃７細胞あるいはＥＳ細胞より奇形腫が形成されたヌードマウスを示す。[Ｂ]は形成された奇形腫より作製した病理標本を示し、標本中には、未分化神経組織、中枢神経、大脳皮質様組織、毛根組織、筋組織、軟骨組織、白色脂肪組織、気管粘液上皮細胞及び繊毛を有する気管上皮細胞、食道粘膜様組織、膵臓腺房細胞、唾液腺の漿液細胞および粘液細胞などが観察される。
【図１５】マウス骨髄由来ｉＰＳ＃７細胞をＢａｌｂ／ｃマウスの受精卵から作製した胚盤胞に注入後、偽妊娠マウスに移植することにより作出されたキメラ個体を示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスは本来白色の毛色を示し、骨髄由来ｉＰＳ細胞は黒色の毛色を有するＣ５７ＢＬ／６マウスに由来している。黒色の毛色を有する細胞は骨髄由来ｉＰＳ細胞由来の細胞であることを示している。
【図１６】マウス骨髄由来のｉＰＳ細胞クローンとマウスＥＳ細胞およびマウス骨髄由来単核球細胞について、各細胞で発現している遺伝子の発現強度の比較を示した図である。「ｉＰＳ＃７」はマウスｉＰＳ細胞クローンを示し、「ＢＭＭＮＣ」はマウス骨髄由来単核球細胞を示す。各図の水平軸、垂直軸は各細胞で発現する遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの量を示し、図中の各点は一種類の遺伝子に対応している。比較する細胞間で発現する遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの量が同一である場合には、図中の各点は図の対角線上に位置することになる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
体細胞から多能性幹細胞を製造する方法であって、
（ａ）体細胞を、ＩＬ−６シグナル伝達因子刺激因子および少なくとも１種のサイトカインを含む細胞培養培地中で培養する工程、および
（ｂ）体細胞を脱分化させる工程
を含んでなり、工程（ａ）の後に工程（ｂ）が行われるか、または工程（ａ）と工程（ｂ）が同時に行われる、方法。
【請求項２】
前記ＩＬ−６シグナル伝達因子刺激因子が、ＩＬ−６もしくはその変異体とＩＬ−６受容体もしくはその変異体とが連結された融合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サイトカインが、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−３およびＦｌｔ−３リガンド、ならびにこれらの２以上の組合せからなる群から選択されるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）における体細胞の脱分化が、該体細胞の核初期化処理によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
体細胞の核初期化処理が、Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子、およびＭｙｃファミリー遺伝子を、発現可能な形で体細胞に導入することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
体細胞が骨髄由来単核球細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
体細胞が分化血液細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
体細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
体細胞から多能性幹細胞を製造するためのキットであって、
（ａ）ＩＬ−６シグナル伝達因子刺激因子および少なくとも１種のサイトカインを含む、体細胞を培養するための細胞培養培地、および
（ｂ）体細胞を脱分化させるための試薬
を含んでなる、キット。
【請求項１０】
前記ＩＬ−６シグナル伝達因子刺激因子が、ＩＬ−６もしくはその変異体とＩＬ−６受容体もしくはその変異体とが融合された融合タンパク質である、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記サイトカインが、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−３およびＦｌｔ−３リガンド、ならびにこれらの２以上の組合せからなる群から選択されるものである、請求項９に記載のキット。
【請求項１２】
体細胞を脱分化させるための試薬が、Ｏｃｔファミリー遺伝子、ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子、およびＭｙｃファミリー遺伝子を、発現可能な形で体細胞に導入するためのベクターを含むものである、請求項９に記載のキット。
【請求項１３】
体細胞が骨髄由来単核球細胞である、請求項９に記載のキット。
【請求項１４】
体細胞が分化血液細胞である、請求項９に記載のキット。
【請求項１５】
体細胞がヒト細胞である、請求項９に記載のキット。
【請求項１】
体細胞から多能性幹細胞を製造する方法であって、
（ａ）体細胞を、ＩＬ−６シグナル伝達因子刺激因子および少なくとも１種のサイトカインを含む細胞培養培地中で培養する工程、および
（ｂ）体細胞を脱分化させる工程
を含んでなり、工程（ａ）の後に工程（ｂ）が行われるか、または工程（ａ）と工程（ｂ）が同時に行われる、方法。
【請求項２】
前記ＩＬ−６シグナル伝達因子刺激因子が、ＩＬ−６もしくはその変異体とＩＬ−６受容体もしくはその変異体とが連結された融合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サイトカインが、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−３およびＦｌｔ−３リガンド、ならびにこれらの２以上の組合せからなる群から選択されるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）における体細胞の脱分化が、該体細胞の核初期化処理によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
体細胞の核初期化処理が、Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子、およびＭｙｃファミリー遺伝子を、発現可能な形で体細胞に導入することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
体細胞が骨髄由来単核球細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
体細胞が分化血液細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
体細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
体細胞から多能性幹細胞を製造するためのキットであって、
（ａ）ＩＬ−６シグナル伝達因子刺激因子および少なくとも１種のサイトカインを含む、体細胞を培養するための細胞培養培地、および
（ｂ）体細胞を脱分化させるための試薬
を含んでなる、キット。
【請求項１０】
前記ＩＬ−６シグナル伝達因子刺激因子が、ＩＬ−６もしくはその変異体とＩＬ−６受容体もしくはその変異体とが融合された融合タンパク質である、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記サイトカインが、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−３およびＦｌｔ−３リガンド、ならびにこれらの２以上の組合せからなる群から選択されるものである、請求項９に記載のキット。
【請求項１２】
体細胞を脱分化させるための試薬が、Ｏｃｔファミリー遺伝子、ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子、およびＭｙｃファミリー遺伝子を、発現可能な形で体細胞に導入するためのベクターを含むものである、請求項９に記載のキット。
【請求項１３】
体細胞が骨髄由来単核球細胞である、請求項９に記載のキット。
【請求項１４】
体細胞が分化血液細胞である、請求項９に記載のキット。
【請求項１５】
体細胞がヒト細胞である、請求項９に記載のキット。
【図３】
【図４】
【図５】
【図９】
【図１２】
【図１６】
【図１】
【図２】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１０】
【図１１】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図４】
【図５】
【図９】
【図１２】
【図１６】
【図１】
【図２】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１０】
【図１１】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２０１１−１６０６６１（Ｐ２０１１−１６０６６１Ａ）
【公開日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１４５０２２（Ｐ２００８−１４５０２２）
【出願日】平成２０年６月２日（２００８．６．２）
【出願人】（０００００１０２９）協和発酵キリン株式会社 (276)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月２日（２００８．６．２）
【出願人】（０００００１０２９）協和発酵キリン株式会社 (276)
【Ｆターム（参考）】
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