血管内皮細胞遊走用足場
【課題】従来よりも効果的に血管内皮細胞の遊走を促進することが可能な血管内皮細胞遊走用足場、及び再生医療用血管の製造方法の提供。
【解決手段】コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換えゼラチンを含む血管内皮細胞遊走用足場、及び生体から単離した血管内皮細胞を、前記血管内皮細胞遊走用足場に接触させること、前記血管内皮細胞遊走用足場と接触している前記血管内皮細胞を、血管新生に必要な時間にわたって培養することを含む再生医療用の血管の製造方法。
【解決手段】コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換えゼラチンを含む血管内皮細胞遊走用足場、及び生体から単離した血管内皮細胞を、前記血管内皮細胞遊走用足場に接触させること、前記血管内皮細胞遊走用足場と接触している前記血管内皮細胞を、血管新生に必要な時間にわたって培養することを含む再生医療用の血管の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管内皮細胞遊走用足場に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、機能障害や機能不全に陥った生体組織・臓器の再生を計る再生医療の実用化が進められている。再生医療は、生体が持っている自然治癒能力だけでは回復できなくなった生体組織において、細胞、足場及び成長因子の三因子を使って元の組織と同じような形態や機能を再び作り出す新たな医療技術である。
再生医療という組織再生の成否において、最も重要な要因となるのが血管導入、障害部位への血管誘導の成否であることがよく知られている。組織再生には栄養分の送達が重要であり、生体内で栄養を送達する手段である血管が新生されるかどうかが重要と考えられている。
【０００３】
血管の新生を誘導するために、血管新生を誘導する増殖因子（以下、「血管新生因子」という。）を投与することが提案されており、その有効成分としては血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）などが挙げられている（例えば、非特許文献１参照）。これらの血管誘導因子群は血管内皮細胞を直接的に誘引する作用を示す液性因子（成長因子）である。
【０００４】
一方で、液性因子（成長因子）だけでは所望の血管を十分に誘導、血管新生させることは難しいことが知られている。より効果的に血管を新生するために、誘引した血管内皮細胞の足場について検討されている。
生体内では、通常、細胞外マトリックス（「ＥＣＭ」）と呼ばれる細胞を取り囲む構造的に安定な物質が存在し、足場を提供している。主要な細胞外マトリックスとして知られているＩ型コラーゲン、フィブロネクチンは、組織修復、胚発生、血液凝固、及び血管内皮細胞の接着に関与する。血管新生においてもこれらＥＣＭが足場として用いられている（例えば、非特許文献２、参照）。
【０００５】
特にフィブロネクチンについては、現状得られる素材の中では良好なＥＣＭであるという認識から、血管内皮細胞の接着・遊走に有効な配列に向けた多くの研究がなされている。このような研究の中から、例えば、ＲＧＤ（アルギニン-グリシン-アスパラギン酸）配列とＩＧＤ（イソロイシン-グリシン-アスパラギン酸）配列が血管内皮細胞の遊走に寄与するといった報告がなされている（例えば、非特許文献３及び４、特許文献１）。
また、特許文献２には、血管再生に応用可能な化合物として、所定のピリミジン化合物等の幹細胞及び／又は内皮前駆細胞の分化促進剤が開示されており、この化合物を血管内皮細胞に暴露することにより血管内皮細胞の遊走が促進されると記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００５−５１８４０９号公報
【特許文献２】特開２００６−８３０９５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】J.Mol.Cell Cardiol. 33(3): 379-393 (2001)
【非特許文献２】Microvascular Research Volume 66, Issue 2, September 2003, Pages 102-112)
【非特許文献３】American Journal of Pathology vol.156, No.5 pp1673-1682
【非特許文献４】American journal of Pathology, vol155, No.3, pp887-895
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、上記先行技術に開示されているこれらの低分子ペプチドや低分子化合物は、遊走を促進するものの、血管内皮細胞の足場とはならない。
また、ある素材の血管新生の評価としては、血管内皮細胞が接着しやすいこと、血管内皮細胞の遊走が促進すること、血管内皮細胞による管腔形成が生じやすいこと、という評価基準があり、このうち、血管を組織へ導引する足場材という観点では、特に（１）血管内皮細胞が良好に接着し、かつ（２）血管内皮細胞の遊走を促進させる足場材であることが強く求められている。上記ＥＣＭをこの基準に照らしてみると、血管新生の足場材として用いられるＩ型コラーゲン、フィブロネクチンでは（１）の細胞接着性は良好であるものの、（２）の遊走能が不十分であることが知られている。また、ＲＧＤやＩＧＤのような個々のペプチドとして血管内皮細胞の遊走に寄与する配列が見出されたとしても、血管内皮細胞を効果的に遊走するには充分とは言えず、実際の足場材として用いることは容易ではない。このように、確実に血管を組織に導引するために高い遊走能を示す足場用材料が依然として求められている。
【０００９】
本発明は、従来よりも効果的に血管内皮細胞の遊走を促進可能な血管内皮細胞遊走用足場を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は以下のとおりである。
［１］ コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換えゼラチンを含む血管内皮細胞遊走用足場。
［２］ 前記遺伝子組換えゼラチンの架橋物である［１］に記載の血管内皮細胞遊走用足場。
［３］ 前記遺伝子組み換えゼラチンが、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ（Ｘ及びＹは任意のアミノ酸を表す）で示される配列の繰り返し単位と、細胞接着シグナルと、を有する［１］又は［２］に記載の血管内皮細胞遊走用足場。
［４］ 前記遺伝子組み換えゼラチンが、以下（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかである［１］〜［３］のいずれかに記載の血管内皮細胞遊走用足場：
（Ａ） 配列番号１で示されるポリペプチド、
（Ｂ） 前記（Ａ）のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有すると共に、血管内皮細胞遊走能を有するポリペプチド、
（Ｃ） 前記（Ａ）のアミノ酸配列に対して１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、血管内皮細胞遊走能を有するポリペプチド。
［５］ 前記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの遺伝子組み換えゼラチンを、足場表面に対して、１００μｇ／ｃｍ２以上の割合で含む［４］記載の血管内皮細胞遊走用足場。
［６］ 三次元の多孔質体である［１］〜［５］のいずれかに記載の血管内皮細胞遊走用足場
［７］ 更に、血管新生因子を含む［６］に記載の血管内皮細胞遊走用足場。
［８］ 前記血管新生因子が、塩基性線維芽細胞増殖因子である［７］に記載の血管内皮細胞遊走用足場。
［９］ 生体から単離した血管内皮細胞を、［１］〜［８］のいずれかに記載の血管内皮細胞遊走用足場に接触させること、前記血管内皮細胞遊走用足場と接触している前記血管内皮細胞を、血管新生に必要な時間にわたって培養することを含む再生医療用の血管の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、従来よりも効果的に血管内皮細胞の遊走を促進可能な血管内皮細胞遊走用足場を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の実施例１にかかる各種足場の細胞遊走速度を説明するグラフである。
【図２】本発明の実施例１にかかる細胞遊走評価の結果を示すグラフである。
【図３】（Ａ）本発明の実施例３にかかるＣＢＥ３スポンジ及びｂＦＧＦを含有する足場を生体内に移植したときの染色像、（Ｂ）は（Ａ）の枠内の拡大図である。
【図４】（Ａ）本発明の実施例３にかかるＣＢＥ３スポンジのみを含む足場を生体内に移植したときの染色像、（Ｂ）は（Ａ）の枠内の拡大図である。
【図５】（Ａ）本発明の実施例３にかかる動物ゼラチン及びｂＦＧＦを含有する足場を生体内に移植したときの染色像、（Ｂ）は（Ａ）の枠内の拡大図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の血管内皮細胞用遊走用足場は、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換えゼラチンを含む血管内皮細胞遊走用足場である。
本発明によれば、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換えゼラチンを含む血管内皮細胞遊走用足場とすることにより、血管内皮細胞を従来よりも効果的に遊走させることができる。
即ち、本発明の血管内皮細胞遊走用足場に含まれる前記遺伝子組換えゼラチンには、血管内皮細胞の遊走を著しく促進する作用が見出された。この結果、本発明の血管内皮細胞遊走用足場を用いることにより、所定の部位に確実に血管内皮細胞を遊走し、血管を新生することが可能となった。
【００１４】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
また、本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
また、本発明において、組成物中の各成分の量について言及する場合、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
以下、本発明について説明する。
【００１５】
本発明に係る組換えゼラチンは、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組換えゼラチンである。
前記遺伝子組換えゼラチンは、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組換えゼラチンを用いることができ、例えば、ＥＰ１０１４１７６Ａ２、ＵＳ６９９２１７２、ＷＯ２００４／８５４７３及びＷＯ２００８／１０３０４１等に開示されているものを用いることができる。また、前記遺伝子組換えゼラチンは、２ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下の分子量であることが好ましく、５ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下であることがより好ましく、１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下であることがより好ましい。
【００１６】
前記遺伝子組換えゼラチンは、前記コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列として、好ましくは、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有する。この配列の繰り返しはコラーゲンに特徴的な配列を意味する。複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙは、それぞれ同一であってもよく、異なってもよい。Ｇｌｙ−Ｘ−ＹにおいてＧｌｙはグリシン残基、Ｘ及びＹは、グリシン以外の任意のアミノ酸残基を表す（なお、本発明においてゼラチンを構成するアミノ酸残基又は具体的なアミノ酸の残基を、特に断らない限り、単に「アミノ酸」又はその具体的なアミノ酸残基に相当するアミノ酸名により表記する）。Ｘ及びＹとしては、イミノ酸、即ちプロリン又はオキシプロリンが多く含まれることが好ましい。このようなイミノ酸の含有率は、前記遺伝子組換えゼラチン全体の１０％〜４５％を占めることが好ましい。前記遺伝子組換えゼラチン中のＧｌｙ−Ｘ−Ｙの含有率としては、全体の８０％以上であることが好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、９９％以上であることが最も好ましい。
【００１７】
前記遺伝子組換えゼラチンは、生体親和性の点で好ましくは、細胞接着シグナルを含むものであり、一分子中に２つ以上有することがより好ましい。このような細胞接着シグナルとしては、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、及びＨＡＶ配列の各配列を挙げることができ、好ましくは、ＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列及びＨＡＶ配列を挙げることができ、ＲＧＤ配列であることが特に好ましい。ＲＧＤ配列のうち、ＥＲＧＤ配列であることが更に好ましい。
【００１８】
前記遺伝子組換えゼラチンにおけるＲＧＤ配列の配置としては、ＲＧＤ間のアミノ酸残基数が０〜１００であることが好ましく、２５〜６０であることが更に好ましい。また、ＲＧＤ配列は、このようなアミノ酸残基数の範囲内で不均一に配置されていることが好ましい。
また、前記遺伝子組換えゼラチンにおけるアミノ酸の総数に対するＲＧＤ配列の割合は、少なくとも０．４％であることが好ましく、遺伝子組換えゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合、３５０アミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤ配列を含むことが好ましい。
【００１９】
前記遺伝子組換えゼラチンは、２５０のアミノ酸あたり少なくとも２つのＲＧＤ配列を含むことが好ましく、少なくとも３つＲＧＤ配列を含むことがより好ましく、少なくとも４つのＲＧＤ配列を含むことが更に好ましい。ただし、前記遺伝子組換えゼラチンの配列は、以下の態様であることが好ましい：（１）セリン及びスレオニンを含まない、（２）セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン、及びシステインを含まない、（３）Asp-Arg-Gly-Aspで示されるアミノ酸配列を含まない。前記遺伝子組換えゼラチンは、この好ましい配列の態様（１）〜（３）を単独で備えたものであってよく、２つ以上の態様を組み合わせて備えたものものであってもよい。
また、前記遺伝子組換えゼラチンは部分的に加水分解されていてもよい。
【００２０】
前記遺伝子組換えゼラチンは、Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ］ｍ−Ｂの繰り返し構造を有することが好ましい。ｍは、２〜１０を表し、３〜５を表すことが好ましい。Ａ及びＢは、任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を表す。ｎは３〜１００を表し、１５〜７０を表すことが好ましく、５０〜６０を表すことがより好ましい。
好ましくは、遺伝子組み換えゼラチンは、式：Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）６３］３−Ｇｌｙ（式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、３個の（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）６３はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）で示される。
【００２１】
前記遺伝子組換えゼラチンの繰り返し単位には、天然に存在するコラーゲンの配列単位を複数結合することが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとしては、好ましくはＩ型、II型、III型、IV型及びＶ型が挙げられる。より好ましくは、Ｉ型、II型又はIII型とすることができる。コラーゲンの由来としては、好ましくは、ヒト、ウマ、ブタ、マウス、ラットを挙げることができ、ヒトであることがより好ましい。
前記遺伝子組換えゼラチンの等電点は、好ましくは５〜１０であり、より好ましくは６〜１０であり、更に好ましくは７〜９．５とすることができる。
【００２２】
前記遺伝子組換えゼラチンの好ましい態様としては以下のものを挙げることができる：（１）脱アミン化されていない、（２）プロコラーゲンを有さない、（３）テロペプタイドを有さない、（４）天然コラーゲンをコードする核酸により調製された実質的に純粋なコラーゲン用材料である。前記遺伝子組換えゼラチンは、この好ましい態様（１）〜（４）を単独で備えたものであってよく、２つ以上の態様を組み合わせて備えたものものであってもよい。
【００２３】
前記遺伝子組換えゼラチンは、遊走能の高さから、好ましくは、以下（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかとすることができる。
（Ａ） 下記配列番号１で示されるポリペプチド、
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G（配列番号１）
（Ｂ） 前記（Ａ）のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有すると共に、血管内皮細胞遊走能を有するポリペプチド、
（Ｃ） 前記（Ａ）のアミノ酸配列に対して１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、血管内皮細胞遊走能を有するポリペプチド。
【００２４】
前記（Ｂ）において、相同性としては、遺伝子組換えゼラチンの遊走促進能の観点から、より好ましくは９０％以上とすることができ、更に好ましくは９５％以上とすることができる。
前記（Ｃ）において欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸数としては、１個又は数個であればよく、遺伝子組換えゼラチンの総アミノ酸数によって異なるが、例えば、２〜１５個、好ましくは２〜５個とすることができる。
【００２５】
前記遺伝子組み換えゼラチンは、当業者に公知の遺伝子組み換え技術によって製造することができ、例えばＥＰ１０１４１７６Ａ２、ＵＳ６９９２１７２、ＷＯ２００４／８５４７３、ＷＯ２００８／１０３０４１等に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、所定の遺伝子組み換えゼラチンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、遺伝子組み換えゼラチンが産生されるので、培養物から産生された遺伝子組み換えゼラチンを回収することにより、本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンを調製することができる。
【００２６】
ここで、血管内皮細胞遊走能は、所定の血管内皮細胞株を用いた既知の細胞遊走試験により評価することができる。本発明に適用可能な細胞遊走試験としては、例えば、後述するセルカルチャーインサートを用いた遊走試験が挙げられる。
【００２７】
上述したような本発明に適用可能な遺伝子組換えゼラチンとしては、特表２０１０−５１９２９３、特表２０１０−５１９２５２、特表２０１０−５１８８３３、特表２０１０−５１９２５１、ＷＯ２０１０／１２８６７２及びＷＯ２０１０／１４７１０９等に開示されている遺伝子組換えゼラチンを特に好ましく用いることができる。
【００２８】
前記血管内皮細胞遊走用足場（以下、本明細書において、単に「足場」ということがある）は、前記遺伝子組換えゼラチンを含むものである。
足場表面における前記遺伝子組換えゼラチンの割合としては、当該足場表面に血管内皮細胞をより効率的に遊走させるために、３０μｇ／ｃｍ２以上であることが好ましく、１００μｇ／ｃｍ２以上であることが好ましい。好ましい遺伝子組換えゼラチンとして前述した（Ａ）〜（Ｃ）の遺伝子組換えゼラチンとした場合も同様である。一方、遺伝子組換えゼラチンを効率よく活用するとの観点から、３０００μｇ／ｃｍ２以下の割合とすることができる。
【００２９】
前記足場の形状については、特に制限はなく、血管内皮細胞の遊走が所望される領域の状態、大きさ、遊走させるべき部位等によって適宜選択することができ、例えば、シート状、矩形状、及び円盤状等とすることができる。特定の形状の足場とするために、支持体を用いてもよい。また、特定の形状に拘泥されず、血管内皮細胞を遊走すべき領域の表面に、所定の厚みで塗布すること等によって、簡便に足場を形成してもよい。
【００３０】
所望される大きさや形状の血管を形成しやすい等の観点から、前記足場の形状は所定の厚みを有する矩形状又は円盤状であることが好ましい。前記足場の厚みとしては、特に制限されないが、例えば、０．１ｍｍ〜５０ｃｍとすることができ、０．５ｍｍ〜１０ｃｍとすることが好ましく、１ｍｍ〜１ｃｍとすることがより好ましい。
前記足場の幅及び長さについては適宜設定が可能であり、適切な大きさの血管を形成するなどの観点から、特に制限されないが、例えば、円盤状では、直径１０ｃｍとしてもよく、直径８ｍｍであることが好ましい。
【００３１】
前記足場は、血管内皮細胞の遊走能及び血管新生形成能の観点から、三次元の多孔質体であることが好ましく、三次元のスポンジ（状）であることがより好ましい。三次元の多孔質体とすることにより、足場の表面だけでなく足場内部にも細胞の遊走がより促進されて、足場内部により多くの血管内皮細胞を案内することができ、足場内部での細胞密度を高くすることができる。これにより、足場内部に遊走した血管内皮細胞による血管新生を一層促進させることができる。
【００３２】
三次元多孔質体としての足場は、前記遺伝子組換えゼラチンによる血管内皮細胞の遊走能を損なわなければ、他の材料を含有してもよいが、主として前記遺伝子組換えゼラチンを含有することにより、形態が維持されていることが好ましい。
ここで「主として」とは、単数又は複数の材料で構成された前記三次元多孔質体の全質量に対して最大の質量比を占めることを意味する。前記足場における前記遺伝子組換えゼラチンの質量比は、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％、即ち遺伝子組換えゼラチンのみによって形状を維持することができる。
なお、「遺伝子組換えゼラチンのみによって形状を維持」とは、前記足場を構成する遺伝子組換えゼラチンの他に、形状の維持に関与しない他の成分、例えば、各種増殖因子などの液性因子を前記足場に含めてもよいことを意味する。
【００３３】
前記三次元多孔質体としての足場は、前記遺伝子組換えゼラチン以外にも、形状の維持に寄与しうる他の骨格材料（支持体）を含むことができる。このような骨格材料としては、例えばシリコーンを挙げることができる。
【００３４】
前記足場は、架橋されているものでもよいし、架橋されていないものでもよい。構造物の安定性の点から、前記足場は、遺伝子組換えゼラチンの架橋物であることが好ましい。前記遺伝子組換えゼラチンの架橋物とすることにより、遺伝子組換えゼラチンのみで三次元多孔質体の形状を適切に維持することができ、足場に占める遺伝子組換えゼラチンの割合を高くして、血管内皮細胞に対する遊走能を一層高くすることができる。
【００３５】
架橋方法としては、熱架橋、化学架橋、アルデヒド類（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど）による架橋、縮合剤（カルボジイミド、シアナミドなど）による架橋、酵素架橋、光架橋、ＵＶ架橋、疎水性相互作用、水素結合、イオン性相互作用など公知の方法を用いることができる。
【００３６】
化学架橋剤としては、例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、シアナミド等を挙げることができる。光架橋としては、光反応性基を導入した高分子への光照射、あるいは光増感剤の存在化での光照射によるものが挙げられる。光反応性基としては、例えば、シンナミル基、クマリン基、ジチオカルバミル基、キサンテン色素、及びカンファキノンが挙げられる。
【００３７】
酵素による架橋を行う場合、酵素としては、高分子材料間の架橋作用を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはトランスグルタミナーゼ及びラッカーゼ等を挙げることができ、最も好ましくはトランスグルタミナーゼを用いて架橋を行うことができる。トランスグルタミナーゼで酵素架橋するタンパク質の具体例としては、前記遺伝子組換えゼラチンと、リジン残基及びグルタミン残基を有するその他のタンパク質を挙げることができる。
トランスグルタミナーゼは、哺乳類由来のものであっても、微生物由来のものであってもよく、具体的には、味の素（株）製アクティバシリーズ、試薬として発売されている哺乳類由来のトランスグルタミナーゼ、例えば、オリエンタル酵母工業（株）製、Upstate USA Inc.製、Biodesign International製などのモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ、ヤギ由来トランスグルタミナーゼ、ウサギ由来トランスグルタミナーゼなど、ヒト由来の血液凝固因子（Factor XIIIa、Haematologic Technologies， Inc.社）などが挙げられる。
【００３８】
架橋の方法としては、化学架橋剤を用いた架橋法又は熱架橋法であることが好ましい。化学架橋剤を用いた架橋法の場合には、グルタルアルデヒドを化学架橋剤として用いた架橋であることがより好ましい。
【００３９】
遺伝子組み換えゼラチンの架橋方法としては、例えば、遺伝子組み換えゼラチンの溶液と架橋剤を混合する工程と、混合することにより得られた均一溶液において前記遺伝子組換えゼラチンと架橋剤とを反応させる工程の２つの工程を有する方法が挙げられる。
【００４０】
前記遺伝子組み換えゼラチンの溶液と架橋剤とを混合する際に温度は、溶液を混合できる限り特に限定されないが、好ましくは、０℃〜１００℃であり、より好ましくは０℃〜４０℃であり、更に好ましくは０℃〜３０℃であり、更に好ましくは３℃〜２５℃であり、更に好ましくは３℃〜１５℃であり、更に好ましくは３℃〜１０℃であり、特に好ましくは３℃〜７℃である。
前記遺伝子組み換えゼラチンの溶液と架橋剤の反応過程では、温度を上昇させることができる。前記混合することにより得られた均一溶液における反応温度としては、架橋が進行する限りは特に限定はないが、高分子材料の変性や分解を考慮すると実質的には−１００℃〜２００℃であり、より好ましくは０℃〜６０℃であり、より好ましくは０℃〜４０℃であり、より好ましくは３℃〜２５℃であり、より好ましくは３℃から１５℃であり、さらに好ましくは３℃〜１０℃であり、特に好ましくは３℃〜７℃である。
【００４１】
また、架橋剤を使用しなくても、高分子材料の架橋を行うことができる。当該架橋剤を使用しない架橋法としては、特に限定されるものではないが、具体的には熱架橋法が挙げられる。
【００４２】
架橋剤を使用しない架橋法を実施する際の反応温度は、架橋物が得られる限り特に限定されないが、好ましくは、−１００℃〜５００℃であり、より好ましくは０℃〜３００℃であり、更に好ましくは５０℃〜３００℃であり、更に好ましくは１００℃〜２５０℃であり、更に好ましくは１２０℃〜２００℃である。
【００４３】
また、前記足場が三次元多孔質体の場合、足場の平均気孔サイズとしては、細胞が足場内部に遊走可能な大きさであれば特に制限されないが、好ましくは１０μｍ〜４００μｍであり、さらに好ましくは５０μｍ〜３００μｍであり、より好ましくは７０μｍ〜２００μｍである。
また、足場の気孔率は、細胞が足場内部に所定の密度で存在可能であれば特に制限されないが、好ましくは８１％以上９９．９９％以下であり、さらに好ましくは９５．０１％以上９９．９％以下である。なお、足場の気孔率は、嵩密度（ρ）と真密度（ρc）より、気孔率（Ｐ＝（１−ρ／ρｃ）×１００（％））として求めることができる。
なお、本発明において、「三次元多孔質体」とは、複数の気孔を有する三次元構造を有する足場を意味する。
【００４４】
このような多孔質体を形成する方法については、特に制限はなく、公知の方法を適用することが可能である。より簡便に所望の形態の足場を作成できる観点から、所定量の架橋剤を使用することが好ましい。例えば、グルタルアルデヒドを用いた場合には、前記遺伝子組換えゼラチンの濃度を変えることにより、多孔質体の気孔率を調整することができ、例えば、前記遺伝子組換えゼラチンの濃度を低くすれば、多孔質体の気孔率を上げることができる。
【００４５】
前記足場には、前記遺伝子組換えゼラチンに加えて、成長因子などの各種の液性因子、好ましくは血管新生因子を含んでもよい。これにより、遺伝子組換えゼラチンによって遊走が促進された血管内皮細胞に対して、選択された液性因子による相乗効果が期待可能となる。
前記足場において前記遺伝子組換えゼラチンと併用可能な液性因子としては、特に制限はなく、血管新生因子、神経成長因子（ＮＧＦ）やアディポカイン、インターフェロン等を挙げることができる。なかでも、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）などの血管新生因子であることが、血管内皮細胞の遊走促進および血管新生の点で好ましく、中でも、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）が好ましい。
【００４６】
前記足場は、遺伝子組換えゼラチンと、血管新生因子のひとつである塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）とを含むことが、血管内皮細胞の遊走促進及び血管新生効果の観点から特に好ましい。
前記ｂＦＧＦの形態は特に限定されず、天然由来のｂＦＧＦでもよいし、遺伝子組み換えｂＦＧＦでもよい。遺伝子組み換えｂＦＧＦとしては、例えばトラフェルミン(フィブラスト)（科研製薬株式会社）として市販されているものを使用してもよい。
【００４７】
前記足場がｂＦＧＦを含む場合、前記足場は、より効率的な血管新生の観点から、ｂＦＧＦの含有量が、０．０１〜１０μｇ/ｍｍ３であることが好ましく、０．１〜５μｇ/ｍｍ３であることがより好ましく、０．３〜１μｇ/ｍｍ３であることが更に好ましい。
【００４８】
前記遺伝子組換えゼラチンと、ｂＦＧＦとを含む三次元多孔質体は、血管新生用足場としても好ましく用いることができる。前記血管新生用足場は、前述した遺伝子組換えゼラチンと、ｂＦＧＦとを含み、且つ、三次元多孔質体とすることにより、血管内皮細胞に対する遊走促進能をより高くすることができ、足場内部で確実に血管内皮細胞による血管を新生することができる。
本血管新生用足場に適用される遺伝子組換えゼラチン及びｂＦＧＦについては、血管内皮細胞用遊走用足場について既述した事項をそのまま適用可能である。また、本血管新生用足場における三次元であること及び多孔質であることに関する事項は、血管内皮細胞用遊走用足場について既述した事項をそのまま適用可能である。
【００４９】
前記血管内皮細胞遊走用足場及び血管新生用足場はいずれも、上述のとおり、血管内皮細胞の遊走の促進作用が高いため、血管内皮細胞の遊走により症状が軽減する各種の疾患に対して有効である。このような疾患としては、例えば、虚血性疾患、糖尿病性皮膚潰瘍、難聴、心疾患、急性冠症候群、急性心筋梗塞、不安定狭心症等を挙げることができる。また、前記足場は、細胞・組織再生療法、細胞移植治療などの各治療に好ましく用いられる。
【００５０】
また本発明は、上記の各種疾患に対する治療方法も包含する。血管内皮細胞の遊走により症状が軽減可能な疾患の治療方法は、前記内皮細胞遊走用足場を、血管内皮細胞の遊走の標的となる部位に配置することを含む。
また本発明は、血管新生方法も包含する。当該血管新生方法は、前記血管内皮細胞遊走用足場又は血管新生用足場を、血管新生を必要とする部位に配置することを含む。
これらの治療方法及び血管新生方法において、前記足場を目的部位に配置する方法には特に制限はなく、前記血管内皮細胞遊走用足場及び血管新生用足場の治療効果又は血管新生効果を妨げない公知の方法により行うことができる。
【００５１】
また、前述した三次元多孔質体である前記足場は、血管新生用として好ましく適用可能である。このため、再生医療用の血管を製造する際に適用可能である。
本発明は、例えば、再生医療用の血管を作製する方法を包含する。当該再生医療用の血管製造方法は、生体から単離した血管内皮細胞を前記足場に接触させること、前記血管内皮細胞遊走用足場と接触している血管内皮細胞を、血管新生に必要な時間にわたって培養することを含む。
これにより、生体由来材料に基づく血管を生体外で作製することが可能となる。また、得られた再生医療用の血管は、当該血管を必要とする対象に移植することが可能である。特に、前記血管を作製する際に使用する血管内皮細胞を、当該血管を必要とする対象から採取した場合には、同一対象の血管内皮細胞による血管を作製するため、作製された血管を当該対象へ移植（即ち、自家移植）しても拒絶反応が起きる可能性が著しく低くなり、特に好ましい。
【００５２】
前記方法において、前記足場と血管内皮細胞との接触の維持は、できるだけ無菌状態で行うものとすることが好ましい。また、前記培養は、通常の培養条件をそのまま適用すればよい。
培養期間としては、所望される血管の大きさや長さ、使用される血管内皮細胞の細胞数又は状態等によって適宜調整すればよい。
培養に使用可能な培地としては、血管内皮細胞の培養に通常用いられる培地を使用することができ、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）や、ＲＰＭＩ１６４０などを挙げることができる。これらの培養液に対しては、通常、血清、各種ビタミン、各種抗生物質等、通常の細胞培養に適用可能な各種添加剤を添加してもよい。移植後の拒絶反応の発生を低減させるなどの観点から、他の動物由来成分を含まない培地を用いることが好ましい。
【００５３】
本方法により得られた再生医療用の血管は、管腔を有し、移植片として生体へ適用した場合に、例えば血流等の体液を通過させるために使用可能である。ただし、本発明により得られた血管は、血管壁としての機能を有するものであれば、管腔の有無に制限されず、所望される医療用移植片の条件に応じて使用可能である。
【実施例】
【００５４】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。
【００５５】
［実施例１］
in vitro血管内皮細胞遊走能評価
リコンビナントペプチドＣＢＥ３がヒト血管内皮細胞の遊走を促進する能力を、本評価試験を行うことで評価した。遊走は血管新生に特徴的な過程であり、細胞遊走の促進は血管新生を促進する。本試験では、足場として基材を用いた場合と、培地に基材を添加した場合の２種の遊走試験を行った。
（１）基材
本発明に係る遺伝子組み換えゼラチンとして、以下記載のＣＢＥ３を用意した（ＷＯ２００８−１０３０４１に記載）。
ＣＢＥ３
分子量：５１．６ｋＤ
構造： ＧＡＰ［（ＧＸＹ）６３］３Ｇ
アミノ酸数：５７１個
ＲＧＤ配列：１２個
イミノ酸含量：３３％
ほぼ１００％のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造である。
ＣＢＥ３のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインは含まれていない。
ＣＢＥ３はＥＲＧＤ配列を有している。
等電点：９．３４
アミノ酸配列（配列番号１）
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
【００５６】
（２）遊走評価１ −試料フィルター−
被検物質は、ＣＢＥ３と、その比較対象となる他の基材としてウシ真皮由来アテロコラーゲン（高研 コラーゲン酸性溶液I−ＰＣ ５ｍｇ／ｍＬ）、ヒトフィブロネクチン（ＢＤ フィブロネクチン（ヒト））、ブタゼラチン（ニッピ ハイグレードゼラチン ＡＰＡＴ）を使用した。各被検物質は注射用水（大塚蒸留水 大塚製薬）を用いて溶解した。
細胞遊走を評価するため、セルカルチャーインサート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ フルオロブロック個別型セルカルチャーインサート、８μｍフィルターメンブレン付き２４ウェルプレート）を使用した。操作はすべて無菌状態で行った。プレートにインサートをセットし、被検物質の溶液をフィルターメンブレンに滴下し、１６時間風乾したものを評価に使用した。
被検物質の溶液は、ＣＢＥ３とブタゼラチンについては５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、５０００μｇ／ｍｌ、５００００μｇ／ｍｌの濃度のものを、コラーゲンは５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、５０００μｇ／ｍｌの濃度のものを、フィブロネクチンは５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌの濃度のものを使用した。各溶液は、それぞれ５０μＬでフィルターメンブレンに滴下した。なお、各試料とも、５００００μｇ／ｍｌは８３３３μｇ／ｃｍ２、５０００μｇ／ｍｌは８３３μｇ／ｃｍ２、５００μｇ／ｍｌは８３．３μｇ／ｃｍ２、５０μｇ／ｍｌは、８．３３μｇ／ｃｍ２、５μｇ／ｍｌは０．８３μｇ／ｃｍ２の被覆量に相当する。
【００５７】
細胞はＧＦＰ発現ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＡＧＰ社 ＧＦＰ−ＨＵＶＥＣ）を使用した。培養は、増殖用に５v/v％血清培地ＥＢＭ−２ＭＶ（Ｌｏｎｚａ社）を、評価試験用に無血清培地ＥＢＭ−２（Ｌｏｎｚａ社）を用いた。本培地を２４ウェルプレートのウェル下部に８００μＬ加え、そこに、フィルターメンブレンの上部に細胞を播種したセルカルチャーインサートをセットした。細胞は、２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度でフィルターメンブレン上に２００μＬ加えた。セルカルチャーインサートをセットしたプレートは、３７℃、５v/v％ＣＯ２の条件にて６時間培養した。
【００５８】
細胞の遊走能はフィルターメンブレンの上部から下部へ移動した細胞数を測定することで評価した。下方励起下方測光型蛍光プレートリーダー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ−２１０３ Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ， ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）でそれぞれのウェルの蛍光強度を測定することで、メンブレン下部の細胞のみの蛍光強度を測定した。結果を表１に示す。この表から、８３３３μｇ／ｃｍ２のＣＢＥ３を被覆した場合に、最も高い遊走能促進効果が得られた。コラーゲンおよびフィブロネクチンでは、８．３３μｇ／ｃｍ２を被覆した場合に高い遊走能促進効果が見られた。
【００５９】
【表１】
【００６０】
フィルター上に被覆した基材の残存量を定量するために、アミノ酸量の定量を行った。オルトフタルアルデヒド（ＯＰＡ）とアミノ酸を反応させ、蛍光強度を測定し、アミノ酸量として算出した。
上記と同様の方法で基材を被覆したフィルターメンブレンを、検量線作成用とした。また、同一のフィルターメンブレンを、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）（Ｇｉｂｃｏ）で３７℃で６時間擬似培養し、培養後のフィルターメンブレンを定量用に用いた。擬似培養は、２４ウェルプレートのウェルに８００μＬのＰＢＳを加え、セルカルチャーインサートをセットし、インサート上部に２００μＬのＰＢＳを加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件にて培養した。
【００６１】
フィルターメンブレン上の基材をアミノ酸に分解する反応には、以下の方法を用いた。
遊走能評価試験で用いたものと同じセルカルチャーインサートプレートに、０．４Ｍのホウ酸（試薬特級、和光純薬）バッファー（ｐＨ１０）を３７６μＬと、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（容量分析用、和光純薬）を３７６μＬ加えた。その後、セルカルチャーインサートをプレートにセットした。滅菌済みアルミプレートシール（アズワン）をウェル上に貼り、プレートのふたをかぶせ、８０℃、湿度９０％で１６時間反応させた。反応後に常温まで戻し、シールをはがしてセルカルチャーインサート上にある反応液をウェルに移し、セルカルチャーインサートを取り除いた。反応液を移したウェルに、更に、０．４Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ１０）を４４１μＬ加えた。
【００６２】
アミノ酸量の定量にはオルトフタルアルデヒド（ＯＰＡ）（和光純薬）とＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）（和光純薬）を用いた。２ｍｇ／ｍｌのＮＡＣ（１６０ｍｇ／ｍｌ ＯＰＡ含有）２９４μＬを加え、プレートシェーカーでウェルの溶液を攪拌し、３７℃で１５分反応させた。ＯＰＡ溶液はＮＡＣ溶液の体積の１％含まれるように調製した。ＯＰＡはメタノール（和光純薬）に、ＮＡＣは上記のホウ酸バッファーに溶かした。その後、すぐにプレートリーダー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ−２１０３ Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ， ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で蛍光強度を測定した。
【００６３】
結果を表２に示す。コラーゲンおよびフィブロネクチンでは、被覆した量が６時間培養後もフィルターメンブレン上にほぼ残っているが、ＣＢＥ３およびブタゼラチンでは、培養後はフィルターメンブレン上に被覆した量が残っていない結果となった。ＣＢＥ３では、８３３３μｇ／ｃｍ２を被覆した場合は２％、８３３μｇ／ｃｍ２を被覆した場合は３．６％、８３．３μｇ／ｃｍ２を被覆した場合は１０％のみ、フィルターメンブレン上に残存していた。だたし、同一の基材に関しては、被覆量に応じた残存量となっており、基材の培地への溶解速度は、被覆量によって異なることはなく均一であった。
【００６４】
【表２】
【００６５】
ここで、フィルターにおける基材の残存量と蛍光強度による遊走促進能（傾き）の関係を図１に示した。なお、図１において黒三角はＣＢＥ３、黒菱形はコラーゲン、黒四角はフィブロネクチン、×はブタゼラチンをそれぞれ用いた場合の結果を表す。
図１に示されるように、各試料において最も高い促進速度については、ＣＢＥ３は１７８８７／ｈ、コラーゲンは１２２１４／ｈ、フィブロネクチン９２２４／ｈであった。８３３３μｇ／ｃｍ２のＣＢＥ３の際は８．３３μｇ／ｃｍ２コラーゲンの１．５倍、８３３μｇ／ｃｍ２フィブロネクチンの１．９倍であった。また、ＣＢＥ３では、残存量に依存して遊走促進能が上昇しているが、コラーゲン、フィブロネクチン、ブタゼラチンでは、残存量に依存しないことが確認できる。このことから、基材の残存量を増やしても、ＣＢＥ３以外の基材の遊走促進能は大きくならないため、ＣＢＥ３が最も高い遊走促進能を有していることが窺える。
【００６６】
（２）遊走評価２ −試料液−
被検物質は、ＣＢＥ３と、その比較対象となる他の基材としてウシ真皮由来アテロコラーゲン（高研 コラーゲン酸性溶液Ｉ−ＰＣ ５ｍｇ／ｍＬ）、ヒトフィブロネクチン（ＢＤ フィブロネクチン（ヒト））、ブタゼラチン（ニッピ ハイグレードゼラチン ＡＰＡＴ）を使用した。また、ＲＧＤ配列の遊走促進効果について検証するため、サイクリックＲＧＤ（以下ｃＲＧＤと記載）（Ｃｙｃｌｏ−ＲＧＤｆＫ ＡＮＡＳＰＥＣ）も、被検物質として用いた。各被検物質は注射用水（大塚蒸留水 大塚製薬）を用いて溶解した。
細胞遊走を評価するため、セルカルチャーインサート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ フルオロブロック個別型セルカルチャーインサート、８μｍフィルターメンブレン付き２４ウェルプレート）を使用した。操作はすべて無菌状態で行った。
【００６７】
細胞はＧＦＰ発現ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＡＧＰ社 ＧＦＰ−ＨＵＶＥＣ）を使用した。培養は、増殖用に５v/v％血清培地ＥＢＭ−２ＭＶ（Ｌｏｎｚａ社）を、評価試験用に無血清培地ＥＢＭ−２（Ｌｏｎｚａ社）を用いた。被検物質の溶液は、ＣＢＥ３とブタゼラチンについては５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、５０００μｇ／ｍｌ、５００００μｇ／ｍｌの濃度のものを、コラーゲンは５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、５０００μｇ／ｍｌの濃度のものを、フィブロネクチンは５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌの濃度のものを、ｃＲＧＤは０．７μｇ／ｍｌ、７μｇ／ｍｌ、７０μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、７０００μｇ／ｍｌの濃度のものを用意し、被検物質溶液の量が１０分の１の液量になるように無血清培地ＥＢＭ−２と懸濁した。ｃＲＧＤについては、上記の量とすることにより、等量の溶液中に含まれるＲＧＤ配列の数がＣＢＥ３と同数になっており、ＣＢＥ３が５μｇ／ｍｌの場合は、ｃＲＧＤは０．７μｇ／ｍｌに、ＣＢＥ３が５００００μｇ／ｍｌの場合は、ｃＲＧＤは７０００μｇ／ｍｌにそれぞれ対応している。
【００６８】
なお、各試料とも、５００００μｇ／ｍｌは５０００μｇ、５０００μｇ／ｍｌは５００μｇ、５００μｇ／ｍｌは５０μｇ、５０μｇ／ｍｌは５μｇ、５μｇ／ｍｌは０．５μｇの含有量にそれぞれ相当する。ｃＲＧＤは７０００μｇ／ｍｌは７００μｇ、７００μｇ／ｍｌは７０μｇ、７０μｇ／ｍｌは７μｇ、７μｇ／ｍｌは０．７μｇ、０．７μｇ／ｍｌは０．０７μｇの含有量にそれぞれ相当する。
【００６９】
この混合溶液を２４ウェルプレートのウェル下部に８００μＬ加え、そこに、フィルターメンブレンの上部に細胞を播種したセルカルチャーインサートをセットした。細胞は、それぞれ上記の基材混合溶液に懸濁し、２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で２００μＬ、フィルターメンブレン上に加えた。セルカルチャーインサートをセットしたプレートは、３７℃、５v/v％ＣＯ２の条件にて６時間培養した。
【００７０】
細胞の遊走能はフィルターメンブレンの上部から下部へ移動した細胞数を測定することで評価した。下方励起下方測光型蛍光プレートリーダー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ−２１０３ Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ， ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）でそれぞれのウェルの蛍光強度を測定することで、メンブレン下部の細胞のみの蛍光強度を測定した。結果を図２に示す。
５０００μｇのＣＢＥ３を使用した場合に、最も高い遊走能促進効果を示した。コラーゲンでは５００μｇ、フィブロネクチンでは５０μｇの含有量の場合に、高い遊走能促進効果が見られた。５０００μｇのＣＢＥ３の際は、５００μｇのコラーゲンの１．６倍、５０μｇのフィブロネクチンの１．７倍であった。また、５０００μｇのＣＢＥ３と等量のＲＧＤ配列を含む７００μｇのｃＲＧＤの場合には、５０００μｇのＣＢＥ３ほどの遊走促進効果は得られなかった。遊走促進効果は、ｃＲＧＤの含有量に依存しないことも窺える。このことから、ＣＢＥ３による遊走促進効果は、ＲＧＤ配列の効果では説明ができない要因によることが示された。
【００７１】
上記遊走評価（１）及び（２）により、ＣＢＥ３を用いた場合、ＧＦＰ−ＨＵＶＥＣ細胞株の遊走が最も促進されることが分かった。また、ＣＢＥ３によるＧＦＰ−ＨＵＶＥＣ細胞株の遊走は、使用濃度に依存して促進されることが分かった。
【００７２】
［実施例２］
in vivo血管形成能評価
ＣＢＥ３が生体内で血管を形成する足場と成り得るかを調べるために、本試験を行った。ＣＢＥ３スポンジをマウス皮下に移植し、ＣＢＥ３スポンジ中での血管形成を評価した。
ＣＢＥ３スポンジは以下の方法で作製した。
以下の組成で試料溶液を調製し、グルタルアルデヒドを添加後、４℃にてホモジナイザー（ＡＭ−１１、ＮＩＨＯＮＳＥＩＫＩ製）で１７，０００ｒｐｍで４分間攪拌し、そのまま−８０℃で３時間急冷した。
試料溶液
組成：５％スポンジ１０ｍＬ分（ＣＢＥ３：５００ｍｇ、超純水：９４２４μＬ、
１Ｎ ＨＣｌ：７６μＬ、３％グルタルアルデヒド：５００μＬ）
【００７３】
その後、４℃で１６時間静置して得られた物を、十分量の３７℃の０．２Ｍグリシン溶液中で４時間、振盪した。その後、１０Ｌの超純水での洗浄を８回（計４時間）繰り返してから、−８０℃で２時間凍結させた。その後、凍結乾燥機にて４日間凍結乾燥を行い、ＣＢＥ３スポンジを得た。
平均気孔サイズは、内部断面構造を走査型電子顕微鏡で観察することで求めたところ、１００μｍであった。
気孔率は、嵩密度（ρ）と真密度（ρc）より、気孔率（Ｐ＝（１−ρ／ρｃ）×１００（％））を求めた。嵩密度（ρ）を乾燥重量と体積から算出し、真密度（ρc）をハバード型の比重瓶法により求めたところ、気孔率Ｐは９５％以上であった。
また、ＣＢＥ３スポンジに対する比較例として、動物ゼラチンスポンジ（アステラス製薬（製）、スポンゼル）を用いた。
【００７４】
スポンジの成形は以下のように行った。各スポンジを、直径８ｍｍ、厚さ３ｍｍの円盤状にくり貫き、セラムチューブ（住友ベークライト）に１個ずつ入れ、袋（ｅｌｋ ｂａｇ コスモ・バイオ）にシールし、ｅｏｇｅｌｋ ＳＡ−Ｎ１６０（エルクコーポレーション）でＥＯＧ滅菌を行った。
【００７５】
移植するスポンジは、ｂＦＧＦ（フィブラストスプレー 科研製薬）又は生理食塩水（大塚製薬）を浸潤させたものを使用した。ｂＦＧＦはＰＢＳ（ｐＨ７．２ ＧＩＢＣＯ）で１ｍｇ／ｍｌの濃度に調製した。２４ウェルプレート（ノントリートメントタイプ、ＢＤ）上にスポンジを置き、ｂＦＧＦ又は生理食塩水８０μＬを滴下し、プレートにふたをして蒸発しないようラップで包み、４℃で１８時間インキュベートした。
【００７６】
移植用マウスには、ｄｄＹ（ＳＬＣ）のオス５週齢を用いた。
移植方法は以下の手順で行った。まず、マウスをイソフルラン吸引麻酔下で、背部の首の位置に、はさみで約２ｃｍの切れ込みを入れた。その切れ込みから、はさみを入れ、尾部から約２ｃｍ〜３ｃｍの位置まで、筋肉に付着している皮膚をはがした。インキュベートしたスポンジをピンセットでつまみ、ピンセットを首の切れ込み部から皮膚を這うようにして、尾部から約２ｃｍ〜３ｃｍの位置にスポンジを置いた。首の切れ込み部はサージカルホッチキス（夏目製作所）で止め、傷口をイソジン（明治製菓）で拭いた。移植後のマウスは、２週間飼育した。
【００７７】
評価対象となるスポンジを、移植後２週間のマウスから取り出した。剖検方法は以下の方法で行った。まず、首の傷口の下の部分からはさみで尾部まで皮膚をはがした。皮膚にスポンジが付着している部分を１．５ｃｍ平方の正方形にメスで切り、４％パラホルムアルデヒド（和光純薬）に浸し、スポンジの真ん中半分の断面をパラフィン切片にした。背部を横に切断する方向に切断した。切片の染色はＨＥ染色を行った。結果を図３から図５に示す。各図において（Ａ）におけるバーは２．０ｍｍを示し、（Ｂ）におけるバーは２００μｍを示す。また各図（Ａ）における左上方に皮膚が認められ、右下方に各スポンジが認められる。図３に示されるように、ｂＦＧＦ存在下でＣＢＥ３スポンジ中に、管腔の中に赤血球、および管腔の周囲に血管壁細胞が見られることから血管が形成されたことが確認できた（図３（Ｂ）、円内参照）。一方、ｂＦＧＦ非存在下でのＣＢＥ３スポンジ（図４参照）、ｂＦＧＦ存在下の動物ゼラチンスポンジ（図５参照）では、スポンジ内に血管形成は見られなかった。
【００７８】
評価は以下の方法で行った。
まず、ＨＥ染色切片のスポンジ側部の上方部分、中央部分、下方部分の３箇所をそれぞれランダムに選び、顕微鏡（オリンパスＩＸ７１ＩＸ８１）で画像を撮影した。その画像中における、血管数および血管部分の面積を定量した。血管数は画像中の血管の数をカウントし、血管の面積はＩｍａｇｅＪを用いて算出した。結果を表３に示す。血管数は括弧内に示した。
【００７９】
それぞれのスポンジにおいて、３箇所で血管の有無に関しては一致した結果となり、ｂＦＧＦ存在下でＣＢＥ３スポンジ中に血管形成が確認でき、ｂＦＧＦ存在下の動物ゼラチンスポンジ、ｂＦＧＦ非存在下でのＣＢＥ３スポンジでは、スポンジ内に血管形成は見られなかった。平均すると、ｂＦＧＦ存在下のＣＢＥ３スポンジでは、血管０本で面積も０μｍ２、ｂＦＧＦ存在下の動物ゼラチンスポンジでは、血管０本で面積も０μｍ２、ｂＦＧＦ存在下のＣＢＥ３スポンジでは、血管は４．２本で面積は２０７９μｍ２であった。ｂＦＧＦ存在下のＣＢＥ３スポンジ中では、有意に血管が形成されていることが窺える。
【００８０】
【表３】
【００８１】
このように本発明の実施例にかかる遺伝子組換えゼラチンを含む足場では、血管内皮細胞の遊走を促進することができ、また、ｂＦＧＦを含む三次元多孔質体の足場とした場合には、足場内部に血管新生を促進することができる。
従って、本発明によれば、血管内皮細胞を従来よりも効果的に遊走可能な血管内皮細胞遊走用足場を提供することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管内皮細胞遊走用足場に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、機能障害や機能不全に陥った生体組織・臓器の再生を計る再生医療の実用化が進められている。再生医療は、生体が持っている自然治癒能力だけでは回復できなくなった生体組織において、細胞、足場及び成長因子の三因子を使って元の組織と同じような形態や機能を再び作り出す新たな医療技術である。
再生医療という組織再生の成否において、最も重要な要因となるのが血管導入、障害部位への血管誘導の成否であることがよく知られている。組織再生には栄養分の送達が重要であり、生体内で栄養を送達する手段である血管が新生されるかどうかが重要と考えられている。
【０００３】
血管の新生を誘導するために、血管新生を誘導する増殖因子（以下、「血管新生因子」という。）を投与することが提案されており、その有効成分としては血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）などが挙げられている（例えば、非特許文献１参照）。これらの血管誘導因子群は血管内皮細胞を直接的に誘引する作用を示す液性因子（成長因子）である。
【０００４】
一方で、液性因子（成長因子）だけでは所望の血管を十分に誘導、血管新生させることは難しいことが知られている。より効果的に血管を新生するために、誘引した血管内皮細胞の足場について検討されている。
生体内では、通常、細胞外マトリックス（「ＥＣＭ」）と呼ばれる細胞を取り囲む構造的に安定な物質が存在し、足場を提供している。主要な細胞外マトリックスとして知られているＩ型コラーゲン、フィブロネクチンは、組織修復、胚発生、血液凝固、及び血管内皮細胞の接着に関与する。血管新生においてもこれらＥＣＭが足場として用いられている（例えば、非特許文献２、参照）。
【０００５】
特にフィブロネクチンについては、現状得られる素材の中では良好なＥＣＭであるという認識から、血管内皮細胞の接着・遊走に有効な配列に向けた多くの研究がなされている。このような研究の中から、例えば、ＲＧＤ（アルギニン-グリシン-アスパラギン酸）配列とＩＧＤ（イソロイシン-グリシン-アスパラギン酸）配列が血管内皮細胞の遊走に寄与するといった報告がなされている（例えば、非特許文献３及び４、特許文献１）。
また、特許文献２には、血管再生に応用可能な化合物として、所定のピリミジン化合物等の幹細胞及び／又は内皮前駆細胞の分化促進剤が開示されており、この化合物を血管内皮細胞に暴露することにより血管内皮細胞の遊走が促進されると記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００５−５１８４０９号公報
【特許文献２】特開２００６−８３０９５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】J.Mol.Cell Cardiol. 33(3): 379-393 (2001)
【非特許文献２】Microvascular Research Volume 66, Issue 2, September 2003, Pages 102-112)
【非特許文献３】American Journal of Pathology vol.156, No.5 pp1673-1682
【非特許文献４】American journal of Pathology, vol155, No.3, pp887-895
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、上記先行技術に開示されているこれらの低分子ペプチドや低分子化合物は、遊走を促進するものの、血管内皮細胞の足場とはならない。
また、ある素材の血管新生の評価としては、血管内皮細胞が接着しやすいこと、血管内皮細胞の遊走が促進すること、血管内皮細胞による管腔形成が生じやすいこと、という評価基準があり、このうち、血管を組織へ導引する足場材という観点では、特に（１）血管内皮細胞が良好に接着し、かつ（２）血管内皮細胞の遊走を促進させる足場材であることが強く求められている。上記ＥＣＭをこの基準に照らしてみると、血管新生の足場材として用いられるＩ型コラーゲン、フィブロネクチンでは（１）の細胞接着性は良好であるものの、（２）の遊走能が不十分であることが知られている。また、ＲＧＤやＩＧＤのような個々のペプチドとして血管内皮細胞の遊走に寄与する配列が見出されたとしても、血管内皮細胞を効果的に遊走するには充分とは言えず、実際の足場材として用いることは容易ではない。このように、確実に血管を組織に導引するために高い遊走能を示す足場用材料が依然として求められている。
【０００９】
本発明は、従来よりも効果的に血管内皮細胞の遊走を促進可能な血管内皮細胞遊走用足場を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は以下のとおりである。
［１］ コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換えゼラチンを含む血管内皮細胞遊走用足場。
［２］ 前記遺伝子組換えゼラチンの架橋物である［１］に記載の血管内皮細胞遊走用足場。
［３］ 前記遺伝子組み換えゼラチンが、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ（Ｘ及びＹは任意のアミノ酸を表す）で示される配列の繰り返し単位と、細胞接着シグナルと、を有する［１］又は［２］に記載の血管内皮細胞遊走用足場。
［４］ 前記遺伝子組み換えゼラチンが、以下（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかである［１］〜［３］のいずれかに記載の血管内皮細胞遊走用足場：
（Ａ） 配列番号１で示されるポリペプチド、
（Ｂ） 前記（Ａ）のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有すると共に、血管内皮細胞遊走能を有するポリペプチド、
（Ｃ） 前記（Ａ）のアミノ酸配列に対して１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、血管内皮細胞遊走能を有するポリペプチド。
［５］ 前記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの遺伝子組み換えゼラチンを、足場表面に対して、１００μｇ／ｃｍ２以上の割合で含む［４］記載の血管内皮細胞遊走用足場。
［６］ 三次元の多孔質体である［１］〜［５］のいずれかに記載の血管内皮細胞遊走用足場
［７］ 更に、血管新生因子を含む［６］に記載の血管内皮細胞遊走用足場。
［８］ 前記血管新生因子が、塩基性線維芽細胞増殖因子である［７］に記載の血管内皮細胞遊走用足場。
［９］ 生体から単離した血管内皮細胞を、［１］〜［８］のいずれかに記載の血管内皮細胞遊走用足場に接触させること、前記血管内皮細胞遊走用足場と接触している前記血管内皮細胞を、血管新生に必要な時間にわたって培養することを含む再生医療用の血管の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、従来よりも効果的に血管内皮細胞の遊走を促進可能な血管内皮細胞遊走用足場を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の実施例１にかかる各種足場の細胞遊走速度を説明するグラフである。
【図２】本発明の実施例１にかかる細胞遊走評価の結果を示すグラフである。
【図３】（Ａ）本発明の実施例３にかかるＣＢＥ３スポンジ及びｂＦＧＦを含有する足場を生体内に移植したときの染色像、（Ｂ）は（Ａ）の枠内の拡大図である。
【図４】（Ａ）本発明の実施例３にかかるＣＢＥ３スポンジのみを含む足場を生体内に移植したときの染色像、（Ｂ）は（Ａ）の枠内の拡大図である。
【図５】（Ａ）本発明の実施例３にかかる動物ゼラチン及びｂＦＧＦを含有する足場を生体内に移植したときの染色像、（Ｂ）は（Ａ）の枠内の拡大図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の血管内皮細胞用遊走用足場は、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換えゼラチンを含む血管内皮細胞遊走用足場である。
本発明によれば、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換えゼラチンを含む血管内皮細胞遊走用足場とすることにより、血管内皮細胞を従来よりも効果的に遊走させることができる。
即ち、本発明の血管内皮細胞遊走用足場に含まれる前記遺伝子組換えゼラチンには、血管内皮細胞の遊走を著しく促進する作用が見出された。この結果、本発明の血管内皮細胞遊走用足場を用いることにより、所定の部位に確実に血管内皮細胞を遊走し、血管を新生することが可能となった。
【００１４】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
また、本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
また、本発明において、組成物中の各成分の量について言及する場合、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
以下、本発明について説明する。
【００１５】
本発明に係る組換えゼラチンは、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組換えゼラチンである。
前記遺伝子組換えゼラチンは、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組換えゼラチンを用いることができ、例えば、ＥＰ１０１４１７６Ａ２、ＵＳ６９９２１７２、ＷＯ２００４／８５４７３及びＷＯ２００８／１０３０４１等に開示されているものを用いることができる。また、前記遺伝子組換えゼラチンは、２ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下の分子量であることが好ましく、５ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下であることがより好ましく、１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下であることがより好ましい。
【００１６】
前記遺伝子組換えゼラチンは、前記コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列として、好ましくは、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有する。この配列の繰り返しはコラーゲンに特徴的な配列を意味する。複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙは、それぞれ同一であってもよく、異なってもよい。Ｇｌｙ−Ｘ−ＹにおいてＧｌｙはグリシン残基、Ｘ及びＹは、グリシン以外の任意のアミノ酸残基を表す（なお、本発明においてゼラチンを構成するアミノ酸残基又は具体的なアミノ酸の残基を、特に断らない限り、単に「アミノ酸」又はその具体的なアミノ酸残基に相当するアミノ酸名により表記する）。Ｘ及びＹとしては、イミノ酸、即ちプロリン又はオキシプロリンが多く含まれることが好ましい。このようなイミノ酸の含有率は、前記遺伝子組換えゼラチン全体の１０％〜４５％を占めることが好ましい。前記遺伝子組換えゼラチン中のＧｌｙ−Ｘ−Ｙの含有率としては、全体の８０％以上であることが好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、９９％以上であることが最も好ましい。
【００１７】
前記遺伝子組換えゼラチンは、生体親和性の点で好ましくは、細胞接着シグナルを含むものであり、一分子中に２つ以上有することがより好ましい。このような細胞接着シグナルとしては、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、及びＨＡＶ配列の各配列を挙げることができ、好ましくは、ＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列及びＨＡＶ配列を挙げることができ、ＲＧＤ配列であることが特に好ましい。ＲＧＤ配列のうち、ＥＲＧＤ配列であることが更に好ましい。
【００１８】
前記遺伝子組換えゼラチンにおけるＲＧＤ配列の配置としては、ＲＧＤ間のアミノ酸残基数が０〜１００であることが好ましく、２５〜６０であることが更に好ましい。また、ＲＧＤ配列は、このようなアミノ酸残基数の範囲内で不均一に配置されていることが好ましい。
また、前記遺伝子組換えゼラチンにおけるアミノ酸の総数に対するＲＧＤ配列の割合は、少なくとも０．４％であることが好ましく、遺伝子組換えゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合、３５０アミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤ配列を含むことが好ましい。
【００１９】
前記遺伝子組換えゼラチンは、２５０のアミノ酸あたり少なくとも２つのＲＧＤ配列を含むことが好ましく、少なくとも３つＲＧＤ配列を含むことがより好ましく、少なくとも４つのＲＧＤ配列を含むことが更に好ましい。ただし、前記遺伝子組換えゼラチンの配列は、以下の態様であることが好ましい：（１）セリン及びスレオニンを含まない、（２）セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン、及びシステインを含まない、（３）Asp-Arg-Gly-Aspで示されるアミノ酸配列を含まない。前記遺伝子組換えゼラチンは、この好ましい配列の態様（１）〜（３）を単独で備えたものであってよく、２つ以上の態様を組み合わせて備えたものものであってもよい。
また、前記遺伝子組換えゼラチンは部分的に加水分解されていてもよい。
【００２０】
前記遺伝子組換えゼラチンは、Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ］ｍ−Ｂの繰り返し構造を有することが好ましい。ｍは、２〜１０を表し、３〜５を表すことが好ましい。Ａ及びＢは、任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を表す。ｎは３〜１００を表し、１５〜７０を表すことが好ましく、５０〜６０を表すことがより好ましい。
好ましくは、遺伝子組み換えゼラチンは、式：Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）６３］３−Ｇｌｙ（式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、３個の（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）６３はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）で示される。
【００２１】
前記遺伝子組換えゼラチンの繰り返し単位には、天然に存在するコラーゲンの配列単位を複数結合することが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとしては、好ましくはＩ型、II型、III型、IV型及びＶ型が挙げられる。より好ましくは、Ｉ型、II型又はIII型とすることができる。コラーゲンの由来としては、好ましくは、ヒト、ウマ、ブタ、マウス、ラットを挙げることができ、ヒトであることがより好ましい。
前記遺伝子組換えゼラチンの等電点は、好ましくは５〜１０であり、より好ましくは６〜１０であり、更に好ましくは７〜９．５とすることができる。
【００２２】
前記遺伝子組換えゼラチンの好ましい態様としては以下のものを挙げることができる：（１）脱アミン化されていない、（２）プロコラーゲンを有さない、（３）テロペプタイドを有さない、（４）天然コラーゲンをコードする核酸により調製された実質的に純粋なコラーゲン用材料である。前記遺伝子組換えゼラチンは、この好ましい態様（１）〜（４）を単独で備えたものであってよく、２つ以上の態様を組み合わせて備えたものものであってもよい。
【００２３】
前記遺伝子組換えゼラチンは、遊走能の高さから、好ましくは、以下（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかとすることができる。
（Ａ） 下記配列番号１で示されるポリペプチド、
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G（配列番号１）
（Ｂ） 前記（Ａ）のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有すると共に、血管内皮細胞遊走能を有するポリペプチド、
（Ｃ） 前記（Ａ）のアミノ酸配列に対して１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、血管内皮細胞遊走能を有するポリペプチド。
【００２４】
前記（Ｂ）において、相同性としては、遺伝子組換えゼラチンの遊走促進能の観点から、より好ましくは９０％以上とすることができ、更に好ましくは９５％以上とすることができる。
前記（Ｃ）において欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸数としては、１個又は数個であればよく、遺伝子組換えゼラチンの総アミノ酸数によって異なるが、例えば、２〜１５個、好ましくは２〜５個とすることができる。
【００２５】
前記遺伝子組み換えゼラチンは、当業者に公知の遺伝子組み換え技術によって製造することができ、例えばＥＰ１０１４１７６Ａ２、ＵＳ６９９２１７２、ＷＯ２００４／８５４７３、ＷＯ２００８／１０３０４１等に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、所定の遺伝子組み換えゼラチンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、遺伝子組み換えゼラチンが産生されるので、培養物から産生された遺伝子組み換えゼラチンを回収することにより、本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンを調製することができる。
【００２６】
ここで、血管内皮細胞遊走能は、所定の血管内皮細胞株を用いた既知の細胞遊走試験により評価することができる。本発明に適用可能な細胞遊走試験としては、例えば、後述するセルカルチャーインサートを用いた遊走試験が挙げられる。
【００２７】
上述したような本発明に適用可能な遺伝子組換えゼラチンとしては、特表２０１０−５１９２９３、特表２０１０−５１９２５２、特表２０１０−５１８８３３、特表２０１０−５１９２５１、ＷＯ２０１０／１２８６７２及びＷＯ２０１０／１４７１０９等に開示されている遺伝子組換えゼラチンを特に好ましく用いることができる。
【００２８】
前記血管内皮細胞遊走用足場（以下、本明細書において、単に「足場」ということがある）は、前記遺伝子組換えゼラチンを含むものである。
足場表面における前記遺伝子組換えゼラチンの割合としては、当該足場表面に血管内皮細胞をより効率的に遊走させるために、３０μｇ／ｃｍ２以上であることが好ましく、１００μｇ／ｃｍ２以上であることが好ましい。好ましい遺伝子組換えゼラチンとして前述した（Ａ）〜（Ｃ）の遺伝子組換えゼラチンとした場合も同様である。一方、遺伝子組換えゼラチンを効率よく活用するとの観点から、３０００μｇ／ｃｍ２以下の割合とすることができる。
【００２９】
前記足場の形状については、特に制限はなく、血管内皮細胞の遊走が所望される領域の状態、大きさ、遊走させるべき部位等によって適宜選択することができ、例えば、シート状、矩形状、及び円盤状等とすることができる。特定の形状の足場とするために、支持体を用いてもよい。また、特定の形状に拘泥されず、血管内皮細胞を遊走すべき領域の表面に、所定の厚みで塗布すること等によって、簡便に足場を形成してもよい。
【００３０】
所望される大きさや形状の血管を形成しやすい等の観点から、前記足場の形状は所定の厚みを有する矩形状又は円盤状であることが好ましい。前記足場の厚みとしては、特に制限されないが、例えば、０．１ｍｍ〜５０ｃｍとすることができ、０．５ｍｍ〜１０ｃｍとすることが好ましく、１ｍｍ〜１ｃｍとすることがより好ましい。
前記足場の幅及び長さについては適宜設定が可能であり、適切な大きさの血管を形成するなどの観点から、特に制限されないが、例えば、円盤状では、直径１０ｃｍとしてもよく、直径８ｍｍであることが好ましい。
【００３１】
前記足場は、血管内皮細胞の遊走能及び血管新生形成能の観点から、三次元の多孔質体であることが好ましく、三次元のスポンジ（状）であることがより好ましい。三次元の多孔質体とすることにより、足場の表面だけでなく足場内部にも細胞の遊走がより促進されて、足場内部により多くの血管内皮細胞を案内することができ、足場内部での細胞密度を高くすることができる。これにより、足場内部に遊走した血管内皮細胞による血管新生を一層促進させることができる。
【００３２】
三次元多孔質体としての足場は、前記遺伝子組換えゼラチンによる血管内皮細胞の遊走能を損なわなければ、他の材料を含有してもよいが、主として前記遺伝子組換えゼラチンを含有することにより、形態が維持されていることが好ましい。
ここで「主として」とは、単数又は複数の材料で構成された前記三次元多孔質体の全質量に対して最大の質量比を占めることを意味する。前記足場における前記遺伝子組換えゼラチンの質量比は、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％、即ち遺伝子組換えゼラチンのみによって形状を維持することができる。
なお、「遺伝子組換えゼラチンのみによって形状を維持」とは、前記足場を構成する遺伝子組換えゼラチンの他に、形状の維持に関与しない他の成分、例えば、各種増殖因子などの液性因子を前記足場に含めてもよいことを意味する。
【００３３】
前記三次元多孔質体としての足場は、前記遺伝子組換えゼラチン以外にも、形状の維持に寄与しうる他の骨格材料（支持体）を含むことができる。このような骨格材料としては、例えばシリコーンを挙げることができる。
【００３４】
前記足場は、架橋されているものでもよいし、架橋されていないものでもよい。構造物の安定性の点から、前記足場は、遺伝子組換えゼラチンの架橋物であることが好ましい。前記遺伝子組換えゼラチンの架橋物とすることにより、遺伝子組換えゼラチンのみで三次元多孔質体の形状を適切に維持することができ、足場に占める遺伝子組換えゼラチンの割合を高くして、血管内皮細胞に対する遊走能を一層高くすることができる。
【００３５】
架橋方法としては、熱架橋、化学架橋、アルデヒド類（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど）による架橋、縮合剤（カルボジイミド、シアナミドなど）による架橋、酵素架橋、光架橋、ＵＶ架橋、疎水性相互作用、水素結合、イオン性相互作用など公知の方法を用いることができる。
【００３６】
化学架橋剤としては、例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、シアナミド等を挙げることができる。光架橋としては、光反応性基を導入した高分子への光照射、あるいは光増感剤の存在化での光照射によるものが挙げられる。光反応性基としては、例えば、シンナミル基、クマリン基、ジチオカルバミル基、キサンテン色素、及びカンファキノンが挙げられる。
【００３７】
酵素による架橋を行う場合、酵素としては、高分子材料間の架橋作用を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはトランスグルタミナーゼ及びラッカーゼ等を挙げることができ、最も好ましくはトランスグルタミナーゼを用いて架橋を行うことができる。トランスグルタミナーゼで酵素架橋するタンパク質の具体例としては、前記遺伝子組換えゼラチンと、リジン残基及びグルタミン残基を有するその他のタンパク質を挙げることができる。
トランスグルタミナーゼは、哺乳類由来のものであっても、微生物由来のものであってもよく、具体的には、味の素（株）製アクティバシリーズ、試薬として発売されている哺乳類由来のトランスグルタミナーゼ、例えば、オリエンタル酵母工業（株）製、Upstate USA Inc.製、Biodesign International製などのモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ、ヤギ由来トランスグルタミナーゼ、ウサギ由来トランスグルタミナーゼなど、ヒト由来の血液凝固因子（Factor XIIIa、Haematologic Technologies， Inc.社）などが挙げられる。
【００３８】
架橋の方法としては、化学架橋剤を用いた架橋法又は熱架橋法であることが好ましい。化学架橋剤を用いた架橋法の場合には、グルタルアルデヒドを化学架橋剤として用いた架橋であることがより好ましい。
【００３９】
遺伝子組み換えゼラチンの架橋方法としては、例えば、遺伝子組み換えゼラチンの溶液と架橋剤を混合する工程と、混合することにより得られた均一溶液において前記遺伝子組換えゼラチンと架橋剤とを反応させる工程の２つの工程を有する方法が挙げられる。
【００４０】
前記遺伝子組み換えゼラチンの溶液と架橋剤とを混合する際に温度は、溶液を混合できる限り特に限定されないが、好ましくは、０℃〜１００℃であり、より好ましくは０℃〜４０℃であり、更に好ましくは０℃〜３０℃であり、更に好ましくは３℃〜２５℃であり、更に好ましくは３℃〜１５℃であり、更に好ましくは３℃〜１０℃であり、特に好ましくは３℃〜７℃である。
前記遺伝子組み換えゼラチンの溶液と架橋剤の反応過程では、温度を上昇させることができる。前記混合することにより得られた均一溶液における反応温度としては、架橋が進行する限りは特に限定はないが、高分子材料の変性や分解を考慮すると実質的には−１００℃〜２００℃であり、より好ましくは０℃〜６０℃であり、より好ましくは０℃〜４０℃であり、より好ましくは３℃〜２５℃であり、より好ましくは３℃から１５℃であり、さらに好ましくは３℃〜１０℃であり、特に好ましくは３℃〜７℃である。
【００４１】
また、架橋剤を使用しなくても、高分子材料の架橋を行うことができる。当該架橋剤を使用しない架橋法としては、特に限定されるものではないが、具体的には熱架橋法が挙げられる。
【００４２】
架橋剤を使用しない架橋法を実施する際の反応温度は、架橋物が得られる限り特に限定されないが、好ましくは、−１００℃〜５００℃であり、より好ましくは０℃〜３００℃であり、更に好ましくは５０℃〜３００℃であり、更に好ましくは１００℃〜２５０℃であり、更に好ましくは１２０℃〜２００℃である。
【００４３】
また、前記足場が三次元多孔質体の場合、足場の平均気孔サイズとしては、細胞が足場内部に遊走可能な大きさであれば特に制限されないが、好ましくは１０μｍ〜４００μｍであり、さらに好ましくは５０μｍ〜３００μｍであり、より好ましくは７０μｍ〜２００μｍである。
また、足場の気孔率は、細胞が足場内部に所定の密度で存在可能であれば特に制限されないが、好ましくは８１％以上９９．９９％以下であり、さらに好ましくは９５．０１％以上９９．９％以下である。なお、足場の気孔率は、嵩密度（ρ）と真密度（ρc）より、気孔率（Ｐ＝（１−ρ／ρｃ）×１００（％））として求めることができる。
なお、本発明において、「三次元多孔質体」とは、複数の気孔を有する三次元構造を有する足場を意味する。
【００４４】
このような多孔質体を形成する方法については、特に制限はなく、公知の方法を適用することが可能である。より簡便に所望の形態の足場を作成できる観点から、所定量の架橋剤を使用することが好ましい。例えば、グルタルアルデヒドを用いた場合には、前記遺伝子組換えゼラチンの濃度を変えることにより、多孔質体の気孔率を調整することができ、例えば、前記遺伝子組換えゼラチンの濃度を低くすれば、多孔質体の気孔率を上げることができる。
【００４５】
前記足場には、前記遺伝子組換えゼラチンに加えて、成長因子などの各種の液性因子、好ましくは血管新生因子を含んでもよい。これにより、遺伝子組換えゼラチンによって遊走が促進された血管内皮細胞に対して、選択された液性因子による相乗効果が期待可能となる。
前記足場において前記遺伝子組換えゼラチンと併用可能な液性因子としては、特に制限はなく、血管新生因子、神経成長因子（ＮＧＦ）やアディポカイン、インターフェロン等を挙げることができる。なかでも、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）などの血管新生因子であることが、血管内皮細胞の遊走促進および血管新生の点で好ましく、中でも、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）が好ましい。
【００４６】
前記足場は、遺伝子組換えゼラチンと、血管新生因子のひとつである塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）とを含むことが、血管内皮細胞の遊走促進及び血管新生効果の観点から特に好ましい。
前記ｂＦＧＦの形態は特に限定されず、天然由来のｂＦＧＦでもよいし、遺伝子組み換えｂＦＧＦでもよい。遺伝子組み換えｂＦＧＦとしては、例えばトラフェルミン(フィブラスト)（科研製薬株式会社）として市販されているものを使用してもよい。
【００４７】
前記足場がｂＦＧＦを含む場合、前記足場は、より効率的な血管新生の観点から、ｂＦＧＦの含有量が、０．０１〜１０μｇ/ｍｍ３であることが好ましく、０．１〜５μｇ/ｍｍ３であることがより好ましく、０．３〜１μｇ/ｍｍ３であることが更に好ましい。
【００４８】
前記遺伝子組換えゼラチンと、ｂＦＧＦとを含む三次元多孔質体は、血管新生用足場としても好ましく用いることができる。前記血管新生用足場は、前述した遺伝子組換えゼラチンと、ｂＦＧＦとを含み、且つ、三次元多孔質体とすることにより、血管内皮細胞に対する遊走促進能をより高くすることができ、足場内部で確実に血管内皮細胞による血管を新生することができる。
本血管新生用足場に適用される遺伝子組換えゼラチン及びｂＦＧＦについては、血管内皮細胞用遊走用足場について既述した事項をそのまま適用可能である。また、本血管新生用足場における三次元であること及び多孔質であることに関する事項は、血管内皮細胞用遊走用足場について既述した事項をそのまま適用可能である。
【００４９】
前記血管内皮細胞遊走用足場及び血管新生用足場はいずれも、上述のとおり、血管内皮細胞の遊走の促進作用が高いため、血管内皮細胞の遊走により症状が軽減する各種の疾患に対して有効である。このような疾患としては、例えば、虚血性疾患、糖尿病性皮膚潰瘍、難聴、心疾患、急性冠症候群、急性心筋梗塞、不安定狭心症等を挙げることができる。また、前記足場は、細胞・組織再生療法、細胞移植治療などの各治療に好ましく用いられる。
【００５０】
また本発明は、上記の各種疾患に対する治療方法も包含する。血管内皮細胞の遊走により症状が軽減可能な疾患の治療方法は、前記内皮細胞遊走用足場を、血管内皮細胞の遊走の標的となる部位に配置することを含む。
また本発明は、血管新生方法も包含する。当該血管新生方法は、前記血管内皮細胞遊走用足場又は血管新生用足場を、血管新生を必要とする部位に配置することを含む。
これらの治療方法及び血管新生方法において、前記足場を目的部位に配置する方法には特に制限はなく、前記血管内皮細胞遊走用足場及び血管新生用足場の治療効果又は血管新生効果を妨げない公知の方法により行うことができる。
【００５１】
また、前述した三次元多孔質体である前記足場は、血管新生用として好ましく適用可能である。このため、再生医療用の血管を製造する際に適用可能である。
本発明は、例えば、再生医療用の血管を作製する方法を包含する。当該再生医療用の血管製造方法は、生体から単離した血管内皮細胞を前記足場に接触させること、前記血管内皮細胞遊走用足場と接触している血管内皮細胞を、血管新生に必要な時間にわたって培養することを含む。
これにより、生体由来材料に基づく血管を生体外で作製することが可能となる。また、得られた再生医療用の血管は、当該血管を必要とする対象に移植することが可能である。特に、前記血管を作製する際に使用する血管内皮細胞を、当該血管を必要とする対象から採取した場合には、同一対象の血管内皮細胞による血管を作製するため、作製された血管を当該対象へ移植（即ち、自家移植）しても拒絶反応が起きる可能性が著しく低くなり、特に好ましい。
【００５２】
前記方法において、前記足場と血管内皮細胞との接触の維持は、できるだけ無菌状態で行うものとすることが好ましい。また、前記培養は、通常の培養条件をそのまま適用すればよい。
培養期間としては、所望される血管の大きさや長さ、使用される血管内皮細胞の細胞数又は状態等によって適宜調整すればよい。
培養に使用可能な培地としては、血管内皮細胞の培養に通常用いられる培地を使用することができ、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）や、ＲＰＭＩ１６４０などを挙げることができる。これらの培養液に対しては、通常、血清、各種ビタミン、各種抗生物質等、通常の細胞培養に適用可能な各種添加剤を添加してもよい。移植後の拒絶反応の発生を低減させるなどの観点から、他の動物由来成分を含まない培地を用いることが好ましい。
【００５３】
本方法により得られた再生医療用の血管は、管腔を有し、移植片として生体へ適用した場合に、例えば血流等の体液を通過させるために使用可能である。ただし、本発明により得られた血管は、血管壁としての機能を有するものであれば、管腔の有無に制限されず、所望される医療用移植片の条件に応じて使用可能である。
【実施例】
【００５４】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。
【００５５】
［実施例１］
in vitro血管内皮細胞遊走能評価
リコンビナントペプチドＣＢＥ３がヒト血管内皮細胞の遊走を促進する能力を、本評価試験を行うことで評価した。遊走は血管新生に特徴的な過程であり、細胞遊走の促進は血管新生を促進する。本試験では、足場として基材を用いた場合と、培地に基材を添加した場合の２種の遊走試験を行った。
（１）基材
本発明に係る遺伝子組み換えゼラチンとして、以下記載のＣＢＥ３を用意した（ＷＯ２００８−１０３０４１に記載）。
ＣＢＥ３
分子量：５１．６ｋＤ
構造： ＧＡＰ［（ＧＸＹ）６３］３Ｇ
アミノ酸数：５７１個
ＲＧＤ配列：１２個
イミノ酸含量：３３％
ほぼ１００％のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造である。
ＣＢＥ３のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインは含まれていない。
ＣＢＥ３はＥＲＧＤ配列を有している。
等電点：９．３４
アミノ酸配列（配列番号１）
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
【００５６】
（２）遊走評価１ −試料フィルター−
被検物質は、ＣＢＥ３と、その比較対象となる他の基材としてウシ真皮由来アテロコラーゲン（高研 コラーゲン酸性溶液I−ＰＣ ５ｍｇ／ｍＬ）、ヒトフィブロネクチン（ＢＤ フィブロネクチン（ヒト））、ブタゼラチン（ニッピ ハイグレードゼラチン ＡＰＡＴ）を使用した。各被検物質は注射用水（大塚蒸留水 大塚製薬）を用いて溶解した。
細胞遊走を評価するため、セルカルチャーインサート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ フルオロブロック個別型セルカルチャーインサート、８μｍフィルターメンブレン付き２４ウェルプレート）を使用した。操作はすべて無菌状態で行った。プレートにインサートをセットし、被検物質の溶液をフィルターメンブレンに滴下し、１６時間風乾したものを評価に使用した。
被検物質の溶液は、ＣＢＥ３とブタゼラチンについては５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、５０００μｇ／ｍｌ、５００００μｇ／ｍｌの濃度のものを、コラーゲンは５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、５０００μｇ／ｍｌの濃度のものを、フィブロネクチンは５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌの濃度のものを使用した。各溶液は、それぞれ５０μＬでフィルターメンブレンに滴下した。なお、各試料とも、５００００μｇ／ｍｌは８３３３μｇ／ｃｍ２、５０００μｇ／ｍｌは８３３μｇ／ｃｍ２、５００μｇ／ｍｌは８３．３μｇ／ｃｍ２、５０μｇ／ｍｌは、８．３３μｇ／ｃｍ２、５μｇ／ｍｌは０．８３μｇ／ｃｍ２の被覆量に相当する。
【００５７】
細胞はＧＦＰ発現ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＡＧＰ社 ＧＦＰ−ＨＵＶＥＣ）を使用した。培養は、増殖用に５v/v％血清培地ＥＢＭ−２ＭＶ（Ｌｏｎｚａ社）を、評価試験用に無血清培地ＥＢＭ−２（Ｌｏｎｚａ社）を用いた。本培地を２４ウェルプレートのウェル下部に８００μＬ加え、そこに、フィルターメンブレンの上部に細胞を播種したセルカルチャーインサートをセットした。細胞は、２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度でフィルターメンブレン上に２００μＬ加えた。セルカルチャーインサートをセットしたプレートは、３７℃、５v/v％ＣＯ２の条件にて６時間培養した。
【００５８】
細胞の遊走能はフィルターメンブレンの上部から下部へ移動した細胞数を測定することで評価した。下方励起下方測光型蛍光プレートリーダー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ−２１０３ Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ， ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）でそれぞれのウェルの蛍光強度を測定することで、メンブレン下部の細胞のみの蛍光強度を測定した。結果を表１に示す。この表から、８３３３μｇ／ｃｍ２のＣＢＥ３を被覆した場合に、最も高い遊走能促進効果が得られた。コラーゲンおよびフィブロネクチンでは、８．３３μｇ／ｃｍ２を被覆した場合に高い遊走能促進効果が見られた。
【００５９】
【表１】
【００６０】
フィルター上に被覆した基材の残存量を定量するために、アミノ酸量の定量を行った。オルトフタルアルデヒド（ＯＰＡ）とアミノ酸を反応させ、蛍光強度を測定し、アミノ酸量として算出した。
上記と同様の方法で基材を被覆したフィルターメンブレンを、検量線作成用とした。また、同一のフィルターメンブレンを、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）（Ｇｉｂｃｏ）で３７℃で６時間擬似培養し、培養後のフィルターメンブレンを定量用に用いた。擬似培養は、２４ウェルプレートのウェルに８００μＬのＰＢＳを加え、セルカルチャーインサートをセットし、インサート上部に２００μＬのＰＢＳを加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件にて培養した。
【００６１】
フィルターメンブレン上の基材をアミノ酸に分解する反応には、以下の方法を用いた。
遊走能評価試験で用いたものと同じセルカルチャーインサートプレートに、０．４Ｍのホウ酸（試薬特級、和光純薬）バッファー（ｐＨ１０）を３７６μＬと、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（容量分析用、和光純薬）を３７６μＬ加えた。その後、セルカルチャーインサートをプレートにセットした。滅菌済みアルミプレートシール（アズワン）をウェル上に貼り、プレートのふたをかぶせ、８０℃、湿度９０％で１６時間反応させた。反応後に常温まで戻し、シールをはがしてセルカルチャーインサート上にある反応液をウェルに移し、セルカルチャーインサートを取り除いた。反応液を移したウェルに、更に、０．４Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ１０）を４４１μＬ加えた。
【００６２】
アミノ酸量の定量にはオルトフタルアルデヒド（ＯＰＡ）（和光純薬）とＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）（和光純薬）を用いた。２ｍｇ／ｍｌのＮＡＣ（１６０ｍｇ／ｍｌ ＯＰＡ含有）２９４μＬを加え、プレートシェーカーでウェルの溶液を攪拌し、３７℃で１５分反応させた。ＯＰＡ溶液はＮＡＣ溶液の体積の１％含まれるように調製した。ＯＰＡはメタノール（和光純薬）に、ＮＡＣは上記のホウ酸バッファーに溶かした。その後、すぐにプレートリーダー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ−２１０３ Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ， ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で蛍光強度を測定した。
【００６３】
結果を表２に示す。コラーゲンおよびフィブロネクチンでは、被覆した量が６時間培養後もフィルターメンブレン上にほぼ残っているが、ＣＢＥ３およびブタゼラチンでは、培養後はフィルターメンブレン上に被覆した量が残っていない結果となった。ＣＢＥ３では、８３３３μｇ／ｃｍ２を被覆した場合は２％、８３３μｇ／ｃｍ２を被覆した場合は３．６％、８３．３μｇ／ｃｍ２を被覆した場合は１０％のみ、フィルターメンブレン上に残存していた。だたし、同一の基材に関しては、被覆量に応じた残存量となっており、基材の培地への溶解速度は、被覆量によって異なることはなく均一であった。
【００６４】
【表２】
【００６５】
ここで、フィルターにおける基材の残存量と蛍光強度による遊走促進能（傾き）の関係を図１に示した。なお、図１において黒三角はＣＢＥ３、黒菱形はコラーゲン、黒四角はフィブロネクチン、×はブタゼラチンをそれぞれ用いた場合の結果を表す。
図１に示されるように、各試料において最も高い促進速度については、ＣＢＥ３は１７８８７／ｈ、コラーゲンは１２２１４／ｈ、フィブロネクチン９２２４／ｈであった。８３３３μｇ／ｃｍ２のＣＢＥ３の際は８．３３μｇ／ｃｍ２コラーゲンの１．５倍、８３３μｇ／ｃｍ２フィブロネクチンの１．９倍であった。また、ＣＢＥ３では、残存量に依存して遊走促進能が上昇しているが、コラーゲン、フィブロネクチン、ブタゼラチンでは、残存量に依存しないことが確認できる。このことから、基材の残存量を増やしても、ＣＢＥ３以外の基材の遊走促進能は大きくならないため、ＣＢＥ３が最も高い遊走促進能を有していることが窺える。
【００６６】
（２）遊走評価２ −試料液−
被検物質は、ＣＢＥ３と、その比較対象となる他の基材としてウシ真皮由来アテロコラーゲン（高研 コラーゲン酸性溶液Ｉ−ＰＣ ５ｍｇ／ｍＬ）、ヒトフィブロネクチン（ＢＤ フィブロネクチン（ヒト））、ブタゼラチン（ニッピ ハイグレードゼラチン ＡＰＡＴ）を使用した。また、ＲＧＤ配列の遊走促進効果について検証するため、サイクリックＲＧＤ（以下ｃＲＧＤと記載）（Ｃｙｃｌｏ−ＲＧＤｆＫ ＡＮＡＳＰＥＣ）も、被検物質として用いた。各被検物質は注射用水（大塚蒸留水 大塚製薬）を用いて溶解した。
細胞遊走を評価するため、セルカルチャーインサート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ フルオロブロック個別型セルカルチャーインサート、８μｍフィルターメンブレン付き２４ウェルプレート）を使用した。操作はすべて無菌状態で行った。
【００６７】
細胞はＧＦＰ発現ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＡＧＰ社 ＧＦＰ−ＨＵＶＥＣ）を使用した。培養は、増殖用に５v/v％血清培地ＥＢＭ−２ＭＶ（Ｌｏｎｚａ社）を、評価試験用に無血清培地ＥＢＭ−２（Ｌｏｎｚａ社）を用いた。被検物質の溶液は、ＣＢＥ３とブタゼラチンについては５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、５０００μｇ／ｍｌ、５００００μｇ／ｍｌの濃度のものを、コラーゲンは５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、５０００μｇ／ｍｌの濃度のものを、フィブロネクチンは５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌの濃度のものを、ｃＲＧＤは０．７μｇ／ｍｌ、７μｇ／ｍｌ、７０μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、７０００μｇ／ｍｌの濃度のものを用意し、被検物質溶液の量が１０分の１の液量になるように無血清培地ＥＢＭ−２と懸濁した。ｃＲＧＤについては、上記の量とすることにより、等量の溶液中に含まれるＲＧＤ配列の数がＣＢＥ３と同数になっており、ＣＢＥ３が５μｇ／ｍｌの場合は、ｃＲＧＤは０．７μｇ／ｍｌに、ＣＢＥ３が５００００μｇ／ｍｌの場合は、ｃＲＧＤは７０００μｇ／ｍｌにそれぞれ対応している。
【００６８】
なお、各試料とも、５００００μｇ／ｍｌは５０００μｇ、５０００μｇ／ｍｌは５００μｇ、５００μｇ／ｍｌは５０μｇ、５０μｇ／ｍｌは５μｇ、５μｇ／ｍｌは０．５μｇの含有量にそれぞれ相当する。ｃＲＧＤは７０００μｇ／ｍｌは７００μｇ、７００μｇ／ｍｌは７０μｇ、７０μｇ／ｍｌは７μｇ、７μｇ／ｍｌは０．７μｇ、０．７μｇ／ｍｌは０．０７μｇの含有量にそれぞれ相当する。
【００６９】
この混合溶液を２４ウェルプレートのウェル下部に８００μＬ加え、そこに、フィルターメンブレンの上部に細胞を播種したセルカルチャーインサートをセットした。細胞は、それぞれ上記の基材混合溶液に懸濁し、２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で２００μＬ、フィルターメンブレン上に加えた。セルカルチャーインサートをセットしたプレートは、３７℃、５v/v％ＣＯ２の条件にて６時間培養した。
【００７０】
細胞の遊走能はフィルターメンブレンの上部から下部へ移動した細胞数を測定することで評価した。下方励起下方測光型蛍光プレートリーダー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ−２１０３ Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ， ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）でそれぞれのウェルの蛍光強度を測定することで、メンブレン下部の細胞のみの蛍光強度を測定した。結果を図２に示す。
５０００μｇのＣＢＥ３を使用した場合に、最も高い遊走能促進効果を示した。コラーゲンでは５００μｇ、フィブロネクチンでは５０μｇの含有量の場合に、高い遊走能促進効果が見られた。５０００μｇのＣＢＥ３の際は、５００μｇのコラーゲンの１．６倍、５０μｇのフィブロネクチンの１．７倍であった。また、５０００μｇのＣＢＥ３と等量のＲＧＤ配列を含む７００μｇのｃＲＧＤの場合には、５０００μｇのＣＢＥ３ほどの遊走促進効果は得られなかった。遊走促進効果は、ｃＲＧＤの含有量に依存しないことも窺える。このことから、ＣＢＥ３による遊走促進効果は、ＲＧＤ配列の効果では説明ができない要因によることが示された。
【００７１】
上記遊走評価（１）及び（２）により、ＣＢＥ３を用いた場合、ＧＦＰ−ＨＵＶＥＣ細胞株の遊走が最も促進されることが分かった。また、ＣＢＥ３によるＧＦＰ−ＨＵＶＥＣ細胞株の遊走は、使用濃度に依存して促進されることが分かった。
【００７２】
［実施例２］
in vivo血管形成能評価
ＣＢＥ３が生体内で血管を形成する足場と成り得るかを調べるために、本試験を行った。ＣＢＥ３スポンジをマウス皮下に移植し、ＣＢＥ３スポンジ中での血管形成を評価した。
ＣＢＥ３スポンジは以下の方法で作製した。
以下の組成で試料溶液を調製し、グルタルアルデヒドを添加後、４℃にてホモジナイザー（ＡＭ−１１、ＮＩＨＯＮＳＥＩＫＩ製）で１７，０００ｒｐｍで４分間攪拌し、そのまま−８０℃で３時間急冷した。
試料溶液
組成：５％スポンジ１０ｍＬ分（ＣＢＥ３：５００ｍｇ、超純水：９４２４μＬ、
１Ｎ ＨＣｌ：７６μＬ、３％グルタルアルデヒド：５００μＬ）
【００７３】
その後、４℃で１６時間静置して得られた物を、十分量の３７℃の０．２Ｍグリシン溶液中で４時間、振盪した。その後、１０Ｌの超純水での洗浄を８回（計４時間）繰り返してから、−８０℃で２時間凍結させた。その後、凍結乾燥機にて４日間凍結乾燥を行い、ＣＢＥ３スポンジを得た。
平均気孔サイズは、内部断面構造を走査型電子顕微鏡で観察することで求めたところ、１００μｍであった。
気孔率は、嵩密度（ρ）と真密度（ρc）より、気孔率（Ｐ＝（１−ρ／ρｃ）×１００（％））を求めた。嵩密度（ρ）を乾燥重量と体積から算出し、真密度（ρc）をハバード型の比重瓶法により求めたところ、気孔率Ｐは９５％以上であった。
また、ＣＢＥ３スポンジに対する比較例として、動物ゼラチンスポンジ（アステラス製薬（製）、スポンゼル）を用いた。
【００７４】
スポンジの成形は以下のように行った。各スポンジを、直径８ｍｍ、厚さ３ｍｍの円盤状にくり貫き、セラムチューブ（住友ベークライト）に１個ずつ入れ、袋（ｅｌｋ ｂａｇ コスモ・バイオ）にシールし、ｅｏｇｅｌｋ ＳＡ−Ｎ１６０（エルクコーポレーション）でＥＯＧ滅菌を行った。
【００７５】
移植するスポンジは、ｂＦＧＦ（フィブラストスプレー 科研製薬）又は生理食塩水（大塚製薬）を浸潤させたものを使用した。ｂＦＧＦはＰＢＳ（ｐＨ７．２ ＧＩＢＣＯ）で１ｍｇ／ｍｌの濃度に調製した。２４ウェルプレート（ノントリートメントタイプ、ＢＤ）上にスポンジを置き、ｂＦＧＦ又は生理食塩水８０μＬを滴下し、プレートにふたをして蒸発しないようラップで包み、４℃で１８時間インキュベートした。
【００７６】
移植用マウスには、ｄｄＹ（ＳＬＣ）のオス５週齢を用いた。
移植方法は以下の手順で行った。まず、マウスをイソフルラン吸引麻酔下で、背部の首の位置に、はさみで約２ｃｍの切れ込みを入れた。その切れ込みから、はさみを入れ、尾部から約２ｃｍ〜３ｃｍの位置まで、筋肉に付着している皮膚をはがした。インキュベートしたスポンジをピンセットでつまみ、ピンセットを首の切れ込み部から皮膚を這うようにして、尾部から約２ｃｍ〜３ｃｍの位置にスポンジを置いた。首の切れ込み部はサージカルホッチキス（夏目製作所）で止め、傷口をイソジン（明治製菓）で拭いた。移植後のマウスは、２週間飼育した。
【００７７】
評価対象となるスポンジを、移植後２週間のマウスから取り出した。剖検方法は以下の方法で行った。まず、首の傷口の下の部分からはさみで尾部まで皮膚をはがした。皮膚にスポンジが付着している部分を１．５ｃｍ平方の正方形にメスで切り、４％パラホルムアルデヒド（和光純薬）に浸し、スポンジの真ん中半分の断面をパラフィン切片にした。背部を横に切断する方向に切断した。切片の染色はＨＥ染色を行った。結果を図３から図５に示す。各図において（Ａ）におけるバーは２．０ｍｍを示し、（Ｂ）におけるバーは２００μｍを示す。また各図（Ａ）における左上方に皮膚が認められ、右下方に各スポンジが認められる。図３に示されるように、ｂＦＧＦ存在下でＣＢＥ３スポンジ中に、管腔の中に赤血球、および管腔の周囲に血管壁細胞が見られることから血管が形成されたことが確認できた（図３（Ｂ）、円内参照）。一方、ｂＦＧＦ非存在下でのＣＢＥ３スポンジ（図４参照）、ｂＦＧＦ存在下の動物ゼラチンスポンジ（図５参照）では、スポンジ内に血管形成は見られなかった。
【００７８】
評価は以下の方法で行った。
まず、ＨＥ染色切片のスポンジ側部の上方部分、中央部分、下方部分の３箇所をそれぞれランダムに選び、顕微鏡（オリンパスＩＸ７１ＩＸ８１）で画像を撮影した。その画像中における、血管数および血管部分の面積を定量した。血管数は画像中の血管の数をカウントし、血管の面積はＩｍａｇｅＪを用いて算出した。結果を表３に示す。血管数は括弧内に示した。
【００７９】
それぞれのスポンジにおいて、３箇所で血管の有無に関しては一致した結果となり、ｂＦＧＦ存在下でＣＢＥ３スポンジ中に血管形成が確認でき、ｂＦＧＦ存在下の動物ゼラチンスポンジ、ｂＦＧＦ非存在下でのＣＢＥ３スポンジでは、スポンジ内に血管形成は見られなかった。平均すると、ｂＦＧＦ存在下のＣＢＥ３スポンジでは、血管０本で面積も０μｍ２、ｂＦＧＦ存在下の動物ゼラチンスポンジでは、血管０本で面積も０μｍ２、ｂＦＧＦ存在下のＣＢＥ３スポンジでは、血管は４．２本で面積は２０７９μｍ２であった。ｂＦＧＦ存在下のＣＢＥ３スポンジ中では、有意に血管が形成されていることが窺える。
【００８０】
【表３】
【００８１】
このように本発明の実施例にかかる遺伝子組換えゼラチンを含む足場では、血管内皮細胞の遊走を促進することができ、また、ｂＦＧＦを含む三次元多孔質体の足場とした場合には、足場内部に血管新生を促進することができる。
従って、本発明によれば、血管内皮細胞を従来よりも効果的に遊走可能な血管内皮細胞遊走用足場を提供することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換えゼラチンを含む血管内皮細胞遊走用足場。
【請求項２】
前記遺伝子組換えゼラチンの架橋物である請求項１記載の血管内皮細胞遊走用足場。
【請求項３】
前記遺伝子組み換えゼラチンが、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ（Ｘ及びＹは任意のアミノ酸を表す）で示される配列の繰り返し単位と、細胞接着シグナルと、を有する請求項１又は請求項２記載の血管内皮細胞遊走用足場。
【請求項４】
前記遺伝子組み換えゼラチンが、以下（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかである請求項１〜請求項３のいずれか一項記載の血管内皮細胞遊走用足場。
（Ａ） 配列番号１で示されるポリペプチド、
（Ｂ） 前記（Ａ）のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有すると共に、血管内皮細胞遊走能を有するポリペプチド、
（Ｃ） 前記（Ａ）のアミノ酸配列に対して１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、血管内皮細胞遊走能を有するポリペプチド。
【請求項５】
前記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの遺伝子組み換えゼラチンを、足場表面に対して、１００μｇ／ｃｍ２以上の割合で含む請求項４に記載の内皮細胞遊走用足場。
【請求項６】
三次元の多孔質体である請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の血管内皮細胞遊走用足場。
【請求項７】
更に、血管新生因子を含む請求項６記載の血管内皮細胞遊走用足場。
【請求項８】
前記血管新生因子が塩基性線維芽細胞増殖因子である請求項７記載の血管内皮細胞遊走用足場。
【請求項９】
生体から単離した血管内皮細胞を、請求項１〜請求項８のいずれか一項記載の血管内皮細胞遊走用足場に接触させること、
前記血管内皮細胞遊走用足場と接触している前記血管内皮細胞を、血管新生に必要な時間にわたって培養すること
を含む再生医療用の血管の製造方法。
【請求項１】
コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換えゼラチンを含む血管内皮細胞遊走用足場。
【請求項２】
前記遺伝子組換えゼラチンの架橋物である請求項１記載の血管内皮細胞遊走用足場。
【請求項３】
前記遺伝子組み換えゼラチンが、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ（Ｘ及びＹは任意のアミノ酸を表す）で示される配列の繰り返し単位と、細胞接着シグナルと、を有する請求項１又は請求項２記載の血管内皮細胞遊走用足場。
【請求項４】
前記遺伝子組み換えゼラチンが、以下（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかである請求項１〜請求項３のいずれか一項記載の血管内皮細胞遊走用足場。
（Ａ） 配列番号１で示されるポリペプチド、
（Ｂ） 前記（Ａ）のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有すると共に、血管内皮細胞遊走能を有するポリペプチド、
（Ｃ） 前記（Ａ）のアミノ酸配列に対して１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、血管内皮細胞遊走能を有するポリペプチド。
【請求項５】
前記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの遺伝子組み換えゼラチンを、足場表面に対して、１００μｇ／ｃｍ２以上の割合で含む請求項４に記載の内皮細胞遊走用足場。
【請求項６】
三次元の多孔質体である請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の血管内皮細胞遊走用足場。
【請求項７】
更に、血管新生因子を含む請求項６記載の血管内皮細胞遊走用足場。
【請求項８】
前記血管新生因子が塩基性線維芽細胞増殖因子である請求項７記載の血管内皮細胞遊走用足場。
【請求項９】
生体から単離した血管内皮細胞を、請求項１〜請求項８のいずれか一項記載の血管内皮細胞遊走用足場に接触させること、
前記血管内皮細胞遊走用足場と接触している前記血管内皮細胞を、血管新生に必要な時間にわたって培養すること
を含む再生医療用の血管の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１３−７４９３６（Ｐ２０１３−７４９３６Ａ）
【公開日】平成２５年４月２５日（２０１３．４．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２１５５４９（Ｐ２０１１−２１５５４９）
【出願日】平成２３年９月２９日（２０１１．９．２９）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年４月２５日（２０１３．４．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年９月２９日（２０１１．９．２９）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
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