血管新生制御剤およびその利用
【課題】血管新生の制御機構に関わる新規遺伝子を利用する、血管新生促進剤、血管新生の促進方法、血管新生抑制剤、血管新生の抑制方法、および、血管新生制御組成物のスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】血管新生促進剤は、配列番号１に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド等、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド等、配列番号３に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチドの阻害物質等または配列番号４に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドの阻害物質等を有効成分として含む。血管新生抑制剤は、配列番号１に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチドの阻害物質等、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドの阻害物質等、配列番号３に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド等または配列番号４に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド等を有効成分として含む。
【解決手段】血管新生促進剤は、配列番号１に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド等、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド等、配列番号３に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチドの阻害物質等または配列番号４に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドの阻害物質等を有効成分として含む。血管新生抑制剤は、配列番号１に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチドの阻害物質等、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドの阻害物質等、配列番号３に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド等または配列番号４に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド等を有効成分として含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生の制御機構を利用する、血管新生促進剤、血管新生の促進方法、血管新生抑制剤、血管新生の抑制方法、および、血管新生制御組成物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は、既存の血管から新たな血管が作られ血管網を構築する生理的現象である。しかし、生体にとっては、血管新生と関連して多くの疾患、例えば癌の増殖転移または糖尿病性網膜症等との関わり合いを持っている。その為、この血管新生を制御、調節することができれば、これらの疾患の予防、治療が可能となる。
【０００３】
そこで、近年、この血管新生の制御機構が遺伝子レベルから研究されており、現在までに血管新生に関連する遺伝子、特に、血管新生を抑制する遺伝子が多数発見されている。例えば、特許文献１には、血管内皮細胞増殖抑制活性、ｃ−ｆｏｓプロモーターからの転写抑制活性、Ｅ２Ｆプロモーターからの転写抑制活性、ＡＰ１プロモーターからの転写抑制活性、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）抑制活性、ＮＦκＢプロモーターからの転写抑制活性および／または血管新生抑制活性を有する新規のポリペプチド、およびそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドについて記載されている。
【０００４】
また、非特許文献１ないし非特許文献３においても、例えば、血管新生の応答を媒介し、促進するGalectin−３、血管新生を制御するmicroＲＮＡ−９２ａ、または、ＶＥＧＦに関与するＥＴＳ−１因子およびＭＭＰ−１因子等について記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００５／０９０５７４号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Anna I. Markowska, Fu-Tong Liu, and Noorjahan Panjwani、2010、Galectin-3 is an important mediator of VEGF- and bFGF-mediated angiogenic response、J. Exp. Med. Vol. 207 No. 9、1981-1993
【非特許文献２】Angelika Bonauer, Guillaume Carmona, Masayoshi Iwasaki, Marina Mione, Masamichi Koyanagi, Ariane Fischer, Jana Burchfield, Henrik Fox, Carmen Doebele, Kisho Ohtani, Emmanouil Chavakls, Michael Potente, Marc Tjwa, Carmen Urbich, Andreas M. Zeiher, and Stefanie Dimmeler、2009、MicroRNA-92a Controls Angiogenesis and Functional Recovery of Ischemic Tissues in Mice、SCIENCE VOL 324、1710-1713
【非特許文献３】SUN-HEE HEO, YOUNG-JIN CHOI, HYUN-MO RYOO, AND JE-YOEL CHO、2010、Expression Profiling of ETS and MMP Factors in VEGF-Activated Endothelial Cells: Role of MMP-10 in VEGF-Induced Angiogenesis、Journal of Cellular Physiology 224、734-742
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、前述したように、血管新生を抑制する遺伝子は多数発見されているが、血管新生を促進（血管再生）する遺伝子の発見は少なく、その制御機構の全容は明確には解明されていない。その為、血管新生と関連する、例えば、癌の増殖転移または糖尿病性網膜症等の疾患の予防薬または治療薬へと繋がる研究開発は、未だ困難であると言える。
【０００８】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、血管新生の制御機構に関わる新規遺伝子を利用する、血管新生促進剤、血管新生の促進方法、血管新生抑制剤、血管新生の抑制方法、および、血管新生制御組成物のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成する為、本発明者らは鋭意研究を行い、血管新生を促進する遺伝子としてＨｅｙ２（hairy/enhancer-of-split related with YRPW motif ２）遺伝子を、血管新生を抑制する遺伝子としてｊｄｐ２（jun dimerization protein ２）遺伝子を、ＤＮＡマイクロアレイ法により発見した（実施例１参照）。また、これらの両遺伝子の血管新生に係る機能解析を、ＲＮＡｉ法で管腔形成を観察することにより、確認した（実施例２参照）。
【００１０】
そこで、本発明の第１の態様に係る血管新生促進剤は、以下（ａ）ないし（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを有効成分として含むことを特徴とする。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列、または、配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含有し、かつ血管新生促進機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列、または、配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、かつ血管新生促進機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００１１】
または、以下（ｅ）ないし（ｇ）のいずれかのポリペプチドを有効成分として含むことを特徴とする。
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド。
（ｆ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含有し、かつ血管新生促進機能を有するポリペプチド。
（ｇ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入またはこれらの組み合わせにより配列に変異が生じているアミノ酸配列を含有し、かつ血管新生促進機能を有するポリペプチド。
【００１２】
または、以下（ｈ）ないし（ｋ）のいずれかのポリヌクレオチドの阻害物質を有効成分として含むことを特徴とする。
（ｈ）配列番号３に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
（ｉ）配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
（ｊ）配列番号３に記載の塩基配列、または、配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含有し、かつ血管新生抑制機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｋ）配列番号３に記載の塩基配列、または、配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、かつ血管新生抑制機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００１３】
好ましくは、前記ポリヌクレオチドの阻害物質は、遺伝子の発現を抑制する機能性核酸であることを特徴とする。
【００１４】
さらに好ましくは、前記機能性核酸は、ｓｉＲＮＡであることを特徴とする。
【００１５】
または、以下（ｌ）ないし（ｎ）のいずれかのポリペプチドの阻害物質を有効成分として含むことを特徴とする。
（ｌ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド。
（ｍ）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含有し、かつ血管新生抑制機能を有するポリペプチド。
（ｎ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入またはこれらの組み合わせにより配列に変異が生じているアミノ酸配列を含有し、かつ血管新生抑制機能を有するポリペプチド。
【００１６】
本発明の第２の態様に係る血管新生の促進方法は、第１の態様に係る血管新生促進剤を有効量投与または添加する工程を含むことを特徴とする。
【００１７】
本発明の第３の態様に係る血管新生抑制剤は、以下（ａ）ないし（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドの阻害物質を有効成分として含むことを特徴とする。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列、または、配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含有し、かつ血管新生促進機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列、または、配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、かつ血管新生促進機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００１８】
好ましくは、前記ポリヌクレオチドの阻害物質は、遺伝子の発現を抑制する機能性核酸であることを特徴とする。
【００１９】
さらに好ましくは、前記機能性核酸は、ｓｉＲＮＡであることを特徴とする。
【００２０】
または、以下（ｅ）ないし（ｇ）のいずれかのポリペプチドの阻害物質を有効成分として含むことを特徴とする。
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド。
（ｆ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含有し、かつ血管新生促進機能を有するポリペプチド。
（ｇ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入またはこれらの組み合わせにより配列に変異が生じているアミノ酸配列を含有し、かつ血管新生促進機能を有するポリペプチド。
【００２１】
または、以下（ｈ）ないし（ｋ）のいずれかのポリヌクレオチドを有効成分として含むことを特徴とする。
（ｈ）配列番号３に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
（ｉ）配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
（ｊ）配列番号３に記載の塩基配列、または、配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含有し、かつ血管新生抑制機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｋ）配列番号３に記載の塩基配列、または、配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、かつ血管新生抑制機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００２２】
または、以下（ｌ）ないし（ｎ）のいずれかのポリペプチドを有効成分として含むことを特徴とする。
（ｌ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド。
（ｍ）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含有し、かつ血管新生抑制機能を有するポリペプチド。
（ｎ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入またはこれらの組み合わせにより配列に変異が生じているアミノ酸配列を含有し、かつ血管新生抑制機能を有するポリペプチド。
【００２３】
本発明の第４の態様に係る血管新生の抑制方法は、第３の態様に係る血管新生抑制剤を有効量投与または添加する工程を含むことを特徴とする。
【００２４】
本発明の第５の態様に係る血管新生制御組成物のスクリーニング方法は、Ｈｅｙ２遺伝子または前記Ｈｅｙ２遺伝子の遺伝子産物の発現量を検出する工程を含むことを特徴とする。
【００２５】
または、ｊｄｐ２遺伝子または前記ｊｄｐ２遺伝子の遺伝子産物の発現量を検出する工程を含むことを特徴とする。
【００２６】
好ましくは、前記血管新生制御組成物は、癌、糖尿病、関節リウマチ、慢性炎症または動脈硬化の医薬組成物であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、血管新生の制御機構に関わる新規遺伝子を利用する、血管新生促進剤、血管新生の促進方法、血管新生抑制剤、血管新生の抑制方法、および、血管新生制御組成物のスクリーニング方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の実施例２に係るＨＵＶＥＣのNegative Control ｓｉＲＮＡの管腔形成の様子を示す図である。
【図２】本発明の実施例２に係るＨＵＶＥＣのＨｅｙ２−ｓｉＲＮＡの管腔形成の様子を示す図である。
【図３】本発明の実施例２に係るＨＵＶＥＣのｊｄｐ２−ｓｉＲＮＡの管腔形成の様子を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、本明細書において「有する」、「含む」または「含有する」といった表現は、「からなる」または「から構成される」という意も含むものとする。
【００３０】
（血管新生促進剤）
本発明の実施の形態１に係る血管新生促進剤は、Ｈｅｙ２を有効成分として含むものと、ｊｄｐ２阻害物質を有効成分として含むものとが挙げられる。
【００３１】
Ｈｅｙ２遺伝子またはｊｄｐ２遺伝子は、塩基配列およびコードするポリペプチドのアミノ酸配列の並びは公知であるが、機能は未知である。例えば、最も好ましいヒト（Homo sapiens）に係る遺伝子の塩基配列において、Ｈｅｙ２遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１に（National Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）のアクセッションＮｏ．ＡＢ０４４７５５）、当該Ｈｅｙ２遺伝子の塩基配列がコードするポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２に（ＮＣＢＩのアクセッションＮｏ．ＢＡＡ９６７８１）、ｊｄｐ２遺伝子の塩基配列を配列番号３に（ＮＣＢＩのアクセッションＮｏ．ＡＢ０７７８８０）、当該ｊｄｐ２遺伝子の塩基配列がコードするポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号４に示す（ＮＣＢＩのアクセッションＮｏ．ＢＡＢ８３８９６）。
【００３２】
本発明において、「Ｈｅｙ２」もしくは「ｊｄｐ２」とは、これら配列番号１もしくは配列番号３に示される塩基配列のポリヌクレオチド、または、配列番号２もしくは配列番号４に示されるアミノ酸配列のポリペプチドを示すが、これらに限定されるものではない。ポリヌクレオチドの場合、「Ｈｅｙ２」もしくは「ｊｄｐ２」は、例えば、配列番号１もしくは配列番号３に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチドと、配列番号１もしくは配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列を含有するポリヌクレオチドと、配列番号１もしくは配列番号３に記載の塩基配列、または、配列番号１もしくは配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含有し、かつ血管新生制御機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、配列番号１もしくは配列番号３に記載の塩基配列、または、配列番号１もしくは配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、かつ血管新生制御機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとを挙げることができる。
【００３３】
ここで、ストリンジェントな条件下とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高い核酸が形成される条件下、すなわち配列番号１または配列番号３に示す塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列の相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件下が挙げられる。
【００３４】
具体的には、ナトリウム塩濃度が１５〜７５０ｍＭ、好ましくは５０〜７５０ｍＭ、より好ましくは３００〜７５０ｍＭであり、温度が２５〜７０℃、好ましくは５０〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃であり、ホルムアミド濃度が０〜５０％、好ましくは２０〜５０％、より好ましくは３５〜４５％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件下では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、通常は、ナトリウム塩濃度が１５〜６００ｍＭ、好ましくは５０〜６００ｍＭ、より好ましくは３００〜６００ｍＭであり、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜７０℃、より好ましくは６０〜６５℃である。
【００３５】
ポリペプチドの場合、「Ｈｅｙ２」もしくは「ｊｄｐ２」は、例えば、配列番号２もしくは配列番号４に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドと、配列番号２もしくは配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含有し、かつ血管新生制御機能を有するポリペプチドと、配列番号２もしくは配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入またはこれらの組み合わせにより配列に変異が生じているアミノ酸配列を含有し、かつ血管新生制御機能を有するポリペプチドとを挙げることができる。
【００３６】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドのいずれの場合においても、「８０％以上の相同性」という用語を使用しているが、好ましくは８５％以上であり、より好ましくは９０％以上であり、さらに好ましくは９５％以上である。また、ポリペプチドの場合において、１または数個の「数個」とは、好ましくは２０個以下、より好ましくは１０個以下、さらに好ましくは５個以下、最も好ましくは３個以下を意味する。さらに、本発明において血管新生「制御」（機能）とは、血管新生を正に制御、すなわち「促進」する場合、および、血管新生を負に制御、すなわち「抑制」する場合のいずれも含む意味として用いている。
【００３７】
これらを考慮すると、本発明において、Ｈｅｙ２またはｊｄｐ２は、最も好ましくはヒト（Homo sapiens）に係るものであるが、好ましくは動物（脊椎動物および無脊椎動物を含む）に係るものも含む。例えば、動物としては、哺乳網、鳥網、爬虫網、両生網、魚網または昆虫網等が挙げられる。
【００３８】
前述した通り、本実施の形態１に係る血管新生促進剤にはＨｅｙ２を有効成分として含むものと、ｊｄｐ２阻害物質を有効成分として含むものとが挙げられる。具体的には、本実施の形態１に係る血管新生促進剤は、血管新生、つまり血管網の構築を促進し、調節する効果を奏する。
【００３９】
「ｊｄｐ２阻害物質」とは、ｊｄｐ２遺伝子の遺伝子産物の活性を阻害しうる物質（任意の識別可能な化学物質または分子等であり、例えば、低分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチドまたは核酸等を含む）を意味する。ここで、ｊｄｐ２阻害物質の例としては、ｊｄｐ２遺伝子の転写または翻訳に影響を及ぼす物質、または、ｊｄｐ２遺伝子の遺伝子産物の活性に影響を及ぼす物質等を挙げることができる。なお、ｊｄｐ２阻害物質には、プロモーターまたはエンハンサー阻害物質も含まれるものとする。
【００４０】
このようなｊｄｐ２阻害物質の例としては、核酸、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、これらを含むベクター、ポリペプチド、優性阻害体（dominant negative）、抗体（配列番号４に示される連続したアミノ酸配列を含むポリペプチド内のエピトープと特異的に結合する抗体等）、酵素、触媒型ＲＮＡ、リボザイム、アダプターまたは低分子量（例えば、２０００Ｄａ未満）の化学分子等を挙げることができる。なお、前述したように、ｊｄｐ２遺伝子の転写もしくは翻訳、または、ｊｄｐ２遺伝子の遺伝子産物の活性を阻害しうる物質である限り、これらの薬学的に許容される誘導体または薬学的に許容される塩類等の形態であっても、ｊｄｐ２阻害物質に含まれる。また、このようなｊｄｐ２阻害物質は、例えば、後述するスクリーニング方法によっても選別することが可能である。
【００４１】
本発明において、ｊｄｐ２阻害物質は、発現を抑制する「機能性核酸」であることが好ましい。本発明において「機能性核酸」とは、細胞内のＤＮＡまたはｍＲＮＡ等の内在性遺伝子の発現抑制を行う他、ＤＮＡまたはｍＲＮＡが有する転写または翻訳等のタンパク質を合成する一連の過程において作用し、本来有する機能を抑制できる核酸を意味する。
【００４２】
例えば、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイムまたはこれらを含む発現ベクター等を挙げることができる。当該機能性核酸は、遺伝子の発現を「抑制」するものである。本発明において、「抑制」とは、対照群と比較した場合において、本来のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現量の５０％以上を、好ましくは８０％以上を、より好ましくは９０％以上を抑制することを意味する。
【００４３】
これらの機能性核酸を含有させる発現ベクターは、当業者にとって公知のものであればどのようなものでも構わない。好ましくは、プラスミド、コスミドまたはウイルス発現系を含む。好ましいウイルス発現系の例としては、アデノウイルス、レトロウイルスまたはレンチウイルス等を挙げることができる。また、細胞または組織に発現ベクターを導入する方法についても、当業者にとって公知の方法であればどのようなものでも構わない。好ましい例としては、トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションまたは組み換えウイルスベクターによる感染等を挙げることができる。
【００４４】
本発明において機能性核酸は、「ｓｉＲＮＡ」の形態が好ましい。本発明の「ｓｉＲＮＡ」とは、前述のとおり遺伝子発現を抑制するｓｉＲＮＡを意味する。具体的には、対照群と比較して遺伝子発現を５０％以上抑制できるｓｉＲＮＡ、好ましくは対照群と比較して遺伝子発現を８０％以上抑制できるｓｉＲＮＡ、より好ましくは対照群と比較して遺伝子発現を９０％以上抑制できるｓｉＲＮＡを意味する。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）と呼ばれる配列特異的な遺伝子発現の抑制を誘導することが知られている。ｓｉＲＮＡは、一般に２本鎖のＲＮＡ部分と、センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端のオーバーハング部分から構成される。
【００４５】
ｓｉＲＮＡは、当業者にとって公知の方法によって設計することができる。例えば、選択したＤＮＡ配列（１９〜２１塩基が望ましい）をそのままＲＮＡ配列に変換したもの（センス鎖）と、そのアンチセンス鎖を２本鎖ＲＮＡ部分とし、オーバーハング部を付加する。オーバーハング部は、１または２塩基の任意の核酸（リボ核酸またはデオキシ核酸）であるが、ウリジン（Ｕ）もしくはチミジン（ｄＴ）が好ましい。本発明に係るＨｅｙ２またはｊｄｐ２のｓｉＲＮＡの場合は、好ましくは哺乳類の、より好ましくはヒト（Homo sapiens）の、最も好ましくはヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（human umbilical vein endothelial cells、ＨＵＶＥＣ）のＨｅｙ２またはｊｄｐ２のＤＮＡ配列（配列番号１または配列番号３）に基づいて設計され、Ｈｅｙ２またはｊｄｐ２の遺伝子発現を抑制できるｓｉＲＮＡであれば、特に限定しない。遺伝子発現の抑制は、Ｈｅｙ２またはｊｄｐ２に特異的であることが望ましい。特異的であるか否かは、一般公開されているＢＬＡＳＴ検索を実施することにより確認可能である。また、オーバーハング部分は必須ではない。
【００４６】
本実施の形態１に係る血管新生促進剤には、例えば、試薬、医薬品または食品（健康食品もしくはサプリメントを含む）等を挙げることができる。さらに具体的に述べると、これらの形態としては、例えば、液剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、粉剤、タブレットまたはカプセル剤等を挙げることができる。なお、これらの試薬、医薬品または食品等において、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または、これらの阻害物質の有効成分としての含有量および一日における投与量等は、適宜調節することが可能である。
【００４７】
このように、本実施の形態１に係る血管新生促進剤を利用することにより、血管新生を促進させることが可能になる。当該促進方法に関しては、以下の実施の形態２において詳細に述べる。
【００４８】
（血管新生の促進方法）
本発明の実施の形態２に係る血管新生の促進方法は、前述の実施の形態１に係る血管新生促進剤を有効量投与または添加する工程を含む。なお、血管新生促進剤における用語の詳細および好ましい形態等については、前述の実施の形態１と同様である。
【００４９】
本発明における「有効量投与または添加する」とは、血管新生制御機能の効能、対象とする物質、動物もしくは生物、または、これらの血管新生の程度等を考慮したうえで、適当な量を投与または添加等することを意味する。なお、適当な量の中に懸濁する場合も含む。例えば、血管新生促進剤の有効成分が、遺伝子の発現を抑制する機能性核酸である場合については、in vivo発現、特に、哺乳動物発現ベクターを投与する方法が好ましい。その他の投与または添加方法については、有効成分がポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたはこれらの阻害物質の場合で異なる部分もあるが、結果的に血管新生制御の対象において、血管新生の程度が異なっていればどのような方法でも構わない。なお、当業者であれば、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたはこれらの阻害物質を有効成分とした、例えば、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液または懸濁液剤等を、注射器等を用いて対象とする生物等に投与等することは容易に可能である。また、これらは経口投与または非経口投与のどちらでもよく、非経口投与の形態も特に限定されず、静脈投与、筋肉内投与、腹腔内投与または皮下投与等を挙げることができる。
【００５０】
このように、本実施の形態２に係る血管新生の促進方法によれば、病疾患等により血管新生が抑制された状態となっている場合に利用することができる。また、血管新生に関連する疾患、例えば、関節リウマチ、慢性炎症、動脈硬化、癌または糖尿病等のうち、血管新生が抑制された状態となってしまう疾患の予防薬または治療薬の研究開発等に繋げることも可能となる。
【００５１】
（血管新生抑制剤）
本発明の実施の形態３に係る血管新生抑制剤には、Ｈｅｙ２阻害物質を有効成分として含むものと、ｊｄｐ２を有効成分として含むものとが挙げられる。具体的には、本実施の形態３に係る血管新生抑制剤は、血管新生、つまり血管網の構築を抑制し、調節する効果を奏する。これは、前述した通り、Ｈｅｙ２が血管新生を促進する遺伝子として機能し、ｊｄｐ２が血管新生を抑制する遺伝子として機能するためである。なお、「Ｈｅｙ２」（配列番号１および配列番号２）、ならびに、「ｊｄｐ２」（配列番号３および配列番号４）の用語等の詳細については、実施の形態１において詳細に前述した通りである。
【００５２】
また、「Ｈｅｙ２阻害物質」とは、前述の「ｊｄｐ２阻害物質」と同様に、Ｈｅｙ２遺伝子の遺伝子産物の活性を阻害しうる物質（任意の識別可能な化学物質または分子等であり、例えば、低分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチドまたは核酸等を含む）を意味する。具体的には、Ｈｅｙ２遺伝子の転写または翻訳に影響を及ぼす物質、または、Ｈｅｙ２遺伝子の遺伝子産物の活性に影響を及ぼす物質等を挙げることができる。なお、プロモーターまたはエンハンサー阻害物質も含まれる。
【００５３】
その他、核酸、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、これらを含むベクター、ポリペプチド、優性阻害体（dominant negative）、抗体（配列番号２に示される連続したアミノ酸配列を含むポリペプチド内のエピトープと特異的に結合する抗体等）、酵素、触媒型ＲＮＡ、リボザイム、アダプターまたは低分子量（例えば、２０００Ｄａ未満）の化学分子等も、同様に挙げることができる。これらのうち、例えば、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイムまたはこれらを含む発現ベクター等の「機能性核酸」が好ましい。発現ベクターの詳細については、前述の実施の形態１と同様である。
【００５４】
Ｈｅｙ２阻害物質においても、当該機能性核酸は、Ｈｅｙ２遺伝子の発現を「抑制」するものである。「抑制」の意味については、前述の実施の形態１と同様である。なお、機能性核酸のうち最も好ましいものも、ｊｄｐ２阻害物質と同様で、「ｓｉＲＮＡ」である。ｓｉＲＮＡによる遺伝子発現の抑制の誘導、形態およびその他詳細についても前述の実施の形態１と同様である。
【００５５】
本実施の形態３に係る血管新生抑制剤の形態についても、前述の実施の形態１に係る血管新生促進剤と同様に、例えば、試薬、医薬品または食品（健康食品もしくはサプリメントを含む）等を挙げることができる。より具体的な形態としても同様に、例えば、液剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、粉剤、タブレットまたはカプセル剤等を挙げることができる。さらに、これらの試薬、医薬品または食品等において、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたはこれらの阻害物質の有効成分としての含有量および一日における投与量等が、適宜調節可能であることも同様である。
【００５６】
このように、本実施の形態３に係る血管新生抑制剤を利用することにより、血管新生を抑制させることが可能になる。当該抑制方法に関しては、以下の実施の形態４において詳細に述べる。
【００５７】
（血管新生の抑制方法）
本発明の実施の形態４に係る血管新生の抑制方法は、前述の実施の形態３に係る血管新生抑制剤を有効量投与または添加する工程を含む。なお、用語の詳細および好ましい形態等については、前述の実施の形態１ないし実施の形態３と同様である。
【００５８】
本実施の形態４に係る血管新生の抑制方法によれば、病疾患等により血管新生が促進された状態となっている場合に利用することができる。また、血管新生に関連する疾患、例えば、関節リウマチ、慢性炎症、動脈硬化、癌または糖尿病等のうち、血管新生が促進した状態となってしまう疾患の予防薬または治療薬の研究開発等に繋げることもできる。
【００５９】
（血管新生制御組成物のスクリーニング方法）
本発明の実施の形態５に係る血管新生制御組成物のスクリーニング方法では、Ｈｅｙ２遺伝子またはｊｄｐ２遺伝子およびこれらの遺伝子産物を指標とする。すなわち、Ｈｅｙ２遺伝子もしくは遺伝子産物の発現量、または、ｊｄｐ２遺伝子もしくは遺伝子産物の発現量の検出を行い、血管新生制御組成物（すなわち、血管新生促進組成物または血管新生抑制組成物）を選別する。
【００６０】
本実施の形態５に係る血管新生制御組成物の「組成物」とは、例えば、化合物、分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチドまたは核酸等でもよいし、試薬、医薬品または食品（健康食品・サプリメントを含む）等でも構わない。遺伝子または遺伝子産物の発現量の検出方法については、当業者であれば容易に測定・検出可能であり、例えば、ノザンブロッティング、定量リアルタイムＰＣＲ、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法または蛍光抗体法等を挙げることができる。
【００６１】
例えば、対象の物質を特定の組成物に対して接触（直接的接触または間接的接触のいずれでも構わない）・暴露させた場合に、当該物質のｊｄｐ２発現量が減少する当該特定の組成物は血管新生を促進（血管再生）させる組成物である。これは、ｊｄｐ２が血管新生を抑制する遺伝子産物となる為である。この場合、当該特定の組成物は、血管新生が抑制した状態となる疾患の予防薬または治療薬等に利用できる可能性が高い。一方、例えば、同様の接触等をさせた場合に、当該物質のＨｅｙ２発現量が減少する当該特定の組成物は血管新生を抑制させる組成物である。これは、Ｈｅｙ２が血管新生を促進する遺伝子産物となる為である。この場合、当該特定の組成物は、血管新生が促進した状態となる疾患の予防薬または治療薬等に利用できる可能性が高い。また、それぞれにおいて発現量が増加した場合には、それぞれにおける血管新生の促進または抑制が逆となる。なお、血管新生と関連する疾患には、例えば、関節リウマチ、慢性炎症、動脈硬化、癌または糖尿病等を挙げることができる。
【実施例】
【００６２】
以下、調製例および実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、調製例および実施例は本発明を限定するものではない。
【００６３】
（調製例）
まず、ＨＵＶＥＣの培養方法について説明する。初代培養ＨＵＶＥＣは、クラボウ（ＫＥ−４１０９Ｐ１０）より購入した。初代培養ＨＵＶＥＣは、到着後、直ちに３７℃の温浴中にて解凍し、血管内皮細胞専用培地HuMedia−ＥＧ２（クラボウ）で培養を開始した。培養は、ＣＯ２インキュベーター内、３７℃、湿度９５％にて行った。なお、以下に述べる全ての実験には、継代数５または６のＨＵＶＥＣを用いた。
【００６４】
（実施例１）
本実施例１では、ＤＮＡマイクロアレイ法での新規血管新生制御遺伝子（Ｈｅｙ２遺伝子およびｊｄｐ２遺伝子）の発見について詳細に述べる。
【００６５】
ＤＮＡマイクロアレイ解析用の、ＨＵＶＥＣの天然由来血管新生抑制物質への暴露について述べる。まず、ＣＯ２インキュベーター内において、継代数５のＨＵＶＥＣを、７５ｃｍ２のフラスコ中にほぼコンフルエントになるまで、HuMedia−ＥＧ２培地を用いた培養を行った。暴露実験開始１９時間前に、５％ＦＢＳ（Cell Culture Technology）を含むＲＭＰＩ１６４０培地（Gibco）に交換し、実験開始１時間前に、再度同培地１６ｍｌに交換した。
【００６６】
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解したカルノシン酸（Sigma-Aldrich）、レスベラトロール（Cayman Chemical Company）およびエピガロカテキンガレード（ナカライテスク）を、最終濃度５０μＭとなるように培地に添加し、６時間ＣＯ２インキュベーター内において培養した。６時間経過後、培地を取り除き、ＰＢＳを用いてＨＵＶＥＣを洗浄後、細胞解離バッファーを用いてＨＵＶＥＣを剥離し、同培地を用いて遠心管に回収した。遠心分離後（室温、９００ｇ×１０分間）、上清を捨て、ＰＢＳを用いてＨＵＶＥＣを懸濁した。懸濁したＨＵＶＥＣの一部を取り、細胞数計測に用いた。残りのＨＵＶＥＣ懸濁液は、再び遠心分離（室温、９００ｇ×１０分間）を行った後、上清を捨て、２ｍｌのＲＮＡlater（Ambion）を加えた。その後、４℃で２４時間保存し、−８０℃のディープフリーザーに入れ、１日置いた。その後、−８０℃で凍結させたＨＵＶＥＣを用い、ＤＮＡマイクロアレイ解析を実施した。
【００６７】
次いで、当該ＤＮＡマイクロアレイ解析での、天然物由来血管新生抑制物質暴露によって変動した、マーカー候補遺伝子の発現解析について述べる。ＤＮＡマイクロアレイ解析により、前述したような複数の天然物由来血管新生抑制物質暴露（カルノシン酸、レスベラトロールおよびエピガロカテキンガレード）によってその遺伝子発現が変動し、血管新生に重要であると示唆される遺伝子が２種類選択された。当該２種類の遺伝子は、Ｈｅｙ２遺伝子と、ｊｄｐ２遺伝子であった。
【００６８】
（実施例２）
本実施例２では、ＲＮＡｉ法でのＨｅｙ２遺伝子およびｊｄｐ２遺伝子の血管新生制御における機能解析について詳細に述べる。
【００６９】
当該機能解析として、ｓｉＲＮＡによるＨｅｙ２またはｊｄｐ２発現阻害が、ＨＵＶＥＣの血管新生に与える影響、すなわちＨＵＶＥＣの管腔形成に与える影響について実験を行った。まず、継代数６のＨＵＶＥＣが、２５ｃｍ２のフラスコにほぼコンフルエントになるまで、HuMedia−ＥＧ２培地を用い、ＣＯ２インキュベーター内で培養を行った。ＲＮＡｉの実験開始２４時間前に、１０％ＦＢＳ（Cell Culture Technologies）を含むＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ Reduced Serum Medium培地（Invitrogen）に交換し、ＲＮＡｉの実験開始１時間前に、再度同培地５ｍｌに交換した。
【００７０】
一方、両遺伝子に対するStealth ＲＮＡｉ（Invitrogen）溶液２０μＭから、６０ｐｍｏｌ（３μｌ）を取り、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ Reduced Serum Medium培地（Invitrogen）４９７μｌと混合した。また、１０μｌのLipofectamine ＲＮＡｉＭＡＸ（Invitrogen）とＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ Reduced Serum Medium培地（Invitrogen）４９０μｌとを混合し、さらに、前述したそれぞれの遺伝子に対するStealth ＲＮＡｉを含有する５００μｌの溶液と混合した（合計１ｍｌ）。その後、室温で２０分間置き、前述したＨＵＶＥＣの培地に加え、当該ＨＵＶＥＣを２４時間または４８時間、ＣＯ２インキュベーター内において培養した。
【００７１】
なお、前述のStealth ＲＮＡｉ（Invitrogen）は、Ｈｅｙ２遺伝子またはｊｄｐ２遺伝子のそれぞれに対し、各３種類ずつ合成して実験を行った。Ｈｅｙ２遺伝子に対しては、ＨＳＳ１１８８４１、ＨＳＳ１１８８４２およびＨＳＳ１７４５０を使用し、ｊｄｐ２遺伝子に対しては、ＨＳＳ１５１２３９、ＨＳＳ１５１２４０およびＨＳＳ１７４６６９を使用した。また、Negative Controlとして、３種類のStealth ＲＮＡｉ Negative Control Duplexes（Invitrogen）を使用した。具体的には、Low ＧＣ Duplex、Medium ＧＣ DuplexおよびHigh ＧＣ Duplexを使用した。
【００７２】
次に、９６well培養プレートに、保冷していたマトリゲル（ＢＤ Biosciences）を５０μｌ入れ、ＣＯ２インキュベーター内で１時間保温してゲル化させた。前述の方法により、Ｈｅｙ２遺伝子またはｊｄｐ２遺伝子のｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＨＵＶＥＣの培地を取り除き、ＰＢＳでＨＵＶＥＣを洗浄した後、細胞解離バッファーを用いてＨＵＶＥＣを剥離し、１０％ＦＢＳを含むＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ Reduced Serum Medium培地（Invitrogen）を用いて遠心管に回収した。その後、遠心分離を行い（室温、９００ｇ×１０分間）、上清を捨て、同培地を用いて細胞数１．０×１０５cells／ｍｌとなるようにＨＵＶＥＣを懸濁した。なお、細胞の一部はＲＮＡ回収用にＰＢＳ洗浄を行い、ＲＮＡlater１ｍｌを用いて保存した。その後、１．０×１０５cells／ｍｌのＨＵＶＥＣ懸濁液１００μｌを、ゲル化したマトリゲル上に加え、ＣＯ２インキュベーター内で１８時間培養を行った。培養後、各Stealth ＲＮＡｉにおけるＨＵＶＥＣの管腔形成の様子を、倒立顕微鏡下で、OLYMPUS ＤＳＥ３３０−Ａ撮影システムにより写真撮影した。
【００７３】
図１は、本発明の実施例２に係るＨＵＶＥＣのNegative Control ｓｉＲＮＡの管腔形成の様子を示す図である。図２は、本発明の実施例２に係るＨＵＶＥＣのＨｅｙ２−ｓｉＲＮＡの管腔形成の様子を示す図である。図３は、本発明の実施例２に係るＨＵＶＥＣのｊｄｐ２−ｓｉＲＮＡの管腔形成の様子を示す図である。図２におけるＨｅｙ２−ｓｉＲＮＡは、前述の３種類のStealth ＲＮＡｉがＨｅｙ２遺伝子に対する場合を示し、図３におけるｊｄｐ２−ｓｉＲＮＡは、前述の３種類のStealth ＲＮＡｉがｊｄｐ２遺伝子に対する場合を示す。
【００７４】
図１および図２に示すように、Ｈｅｙ２−ｓｉＲＮＡはＨＵＶＥＣの管腔形成を抑制している。すなわち、Negative Controlである図１のＨＵＶＥＣの管腔形成と比較すると、図２のＨｅｙ２−ｓｉＲＮＡのＨＵＶＥＣの管腔形成は抑制されており（血管新生は抑制されており）、これはＨｅｙ２が血管新生の促進に関与する遺伝子であることを意味する。また、図１および図３に示すように、ｊｄｐ２−ｓｉＲＮＡはＨＵＶＥＣの管腔形成を促進している。すなわち、Negative Controlである図１のＨＵＶＥＣの管腔形成と比較すると、図３のｊｄｐ２−ｓｉＲＮＡのＨＵＶＥＣの管腔形成は促進されており（血管新生は促進されており）、これはｊｄｐ２が血管新生の抑制に関与する遺伝子であることを意味する。
【００７５】
このように、Ｈｅｙ２の発現阻害物質は管腔形成に対して抑制的に作用することから、ｓｉＲＮＡもしくは阻害物質等による発現阻害または機能阻害は、血管新生抑制剤に応用可能である。このことから、Ｈｅｙ２が血管新生促進剤（血管再生剤）に応用可能であることも示唆される。一方、ｊｄｐ２の発現阻害物質は管腔形成に対して促進的に作用することから、ｓｉＲＮＡもしくは阻害物質等による発現阻害または機能阻害は、血管新生促進剤（血管再生剤）に応用可能である。このことから、ｊｄｐ２が血管新生抑制剤に応用可能であることも示唆される。
【００７６】
本発明は、上記発明の実施の形態および実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【００７７】
本明細書の中で明示した論文および公開特許公報等の内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明者らは鋭意研究を行い、血管新生を促進する遺伝子としてＨｅｙ２（hairy/enhancer-of-split related with YRPW motif ２）遺伝子を、血管新生を抑制する遺伝子としてｊｄｐ２（Jun dimerization protein ２）遺伝子を、ＤＮＡマイクロアレイ法により発見した（実施例１参照）。また、これらの両遺伝子の血管新生に係る機能解析を、ＲＮＡｉ法で管腔形成を観察することにより、確認した（実施例２参照）。
【００７９】
そこで、本発明によれば、血管新生の制御機構に関わる新規遺伝子を利用する、血管新生促進剤、血管新生の促進方法、血管新生抑制剤、血管新生の抑制方法、および、血管新生制御組成物のスクリーニング方法が提供され、その結果、血管新生と関連する、例えば癌の増殖転移または糖尿病性網膜症等の予防薬または治療薬の研究開発へと繋がる可能性が期待される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生の制御機構を利用する、血管新生促進剤、血管新生の促進方法、血管新生抑制剤、血管新生の抑制方法、および、血管新生制御組成物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は、既存の血管から新たな血管が作られ血管網を構築する生理的現象である。しかし、生体にとっては、血管新生と関連して多くの疾患、例えば癌の増殖転移または糖尿病性網膜症等との関わり合いを持っている。その為、この血管新生を制御、調節することができれば、これらの疾患の予防、治療が可能となる。
【０００３】
そこで、近年、この血管新生の制御機構が遺伝子レベルから研究されており、現在までに血管新生に関連する遺伝子、特に、血管新生を抑制する遺伝子が多数発見されている。例えば、特許文献１には、血管内皮細胞増殖抑制活性、ｃ−ｆｏｓプロモーターからの転写抑制活性、Ｅ２Ｆプロモーターからの転写抑制活性、ＡＰ１プロモーターからの転写抑制活性、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）抑制活性、ＮＦκＢプロモーターからの転写抑制活性および／または血管新生抑制活性を有する新規のポリペプチド、およびそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドについて記載されている。
【０００４】
また、非特許文献１ないし非特許文献３においても、例えば、血管新生の応答を媒介し、促進するGalectin−３、血管新生を制御するmicroＲＮＡ−９２ａ、または、ＶＥＧＦに関与するＥＴＳ−１因子およびＭＭＰ−１因子等について記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００５／０９０５７４号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Anna I. Markowska, Fu-Tong Liu, and Noorjahan Panjwani、2010、Galectin-3 is an important mediator of VEGF- and bFGF-mediated angiogenic response、J. Exp. Med. Vol. 207 No. 9、1981-1993
【非特許文献２】Angelika Bonauer, Guillaume Carmona, Masayoshi Iwasaki, Marina Mione, Masamichi Koyanagi, Ariane Fischer, Jana Burchfield, Henrik Fox, Carmen Doebele, Kisho Ohtani, Emmanouil Chavakls, Michael Potente, Marc Tjwa, Carmen Urbich, Andreas M. Zeiher, and Stefanie Dimmeler、2009、MicroRNA-92a Controls Angiogenesis and Functional Recovery of Ischemic Tissues in Mice、SCIENCE VOL 324、1710-1713
【非特許文献３】SUN-HEE HEO, YOUNG-JIN CHOI, HYUN-MO RYOO, AND JE-YOEL CHO、2010、Expression Profiling of ETS and MMP Factors in VEGF-Activated Endothelial Cells: Role of MMP-10 in VEGF-Induced Angiogenesis、Journal of Cellular Physiology 224、734-742
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、前述したように、血管新生を抑制する遺伝子は多数発見されているが、血管新生を促進（血管再生）する遺伝子の発見は少なく、その制御機構の全容は明確には解明されていない。その為、血管新生と関連する、例えば、癌の増殖転移または糖尿病性網膜症等の疾患の予防薬または治療薬へと繋がる研究開発は、未だ困難であると言える。
【０００８】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、血管新生の制御機構に関わる新規遺伝子を利用する、血管新生促進剤、血管新生の促進方法、血管新生抑制剤、血管新生の抑制方法、および、血管新生制御組成物のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成する為、本発明者らは鋭意研究を行い、血管新生を促進する遺伝子としてＨｅｙ２（hairy/enhancer-of-split related with YRPW motif ２）遺伝子を、血管新生を抑制する遺伝子としてｊｄｐ２（jun dimerization protein ２）遺伝子を、ＤＮＡマイクロアレイ法により発見した（実施例１参照）。また、これらの両遺伝子の血管新生に係る機能解析を、ＲＮＡｉ法で管腔形成を観察することにより、確認した（実施例２参照）。
【００１０】
そこで、本発明の第１の態様に係る血管新生促進剤は、以下（ａ）ないし（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを有効成分として含むことを特徴とする。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列、または、配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含有し、かつ血管新生促進機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列、または、配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、かつ血管新生促進機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００１１】
または、以下（ｅ）ないし（ｇ）のいずれかのポリペプチドを有効成分として含むことを特徴とする。
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド。
（ｆ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含有し、かつ血管新生促進機能を有するポリペプチド。
（ｇ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入またはこれらの組み合わせにより配列に変異が生じているアミノ酸配列を含有し、かつ血管新生促進機能を有するポリペプチド。
【００１２】
または、以下（ｈ）ないし（ｋ）のいずれかのポリヌクレオチドの阻害物質を有効成分として含むことを特徴とする。
（ｈ）配列番号３に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
（ｉ）配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
（ｊ）配列番号３に記載の塩基配列、または、配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含有し、かつ血管新生抑制機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｋ）配列番号３に記載の塩基配列、または、配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、かつ血管新生抑制機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００１３】
好ましくは、前記ポリヌクレオチドの阻害物質は、遺伝子の発現を抑制する機能性核酸であることを特徴とする。
【００１４】
さらに好ましくは、前記機能性核酸は、ｓｉＲＮＡであることを特徴とする。
【００１５】
または、以下（ｌ）ないし（ｎ）のいずれかのポリペプチドの阻害物質を有効成分として含むことを特徴とする。
（ｌ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド。
（ｍ）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含有し、かつ血管新生抑制機能を有するポリペプチド。
（ｎ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入またはこれらの組み合わせにより配列に変異が生じているアミノ酸配列を含有し、かつ血管新生抑制機能を有するポリペプチド。
【００１６】
本発明の第２の態様に係る血管新生の促進方法は、第１の態様に係る血管新生促進剤を有効量投与または添加する工程を含むことを特徴とする。
【００１７】
本発明の第３の態様に係る血管新生抑制剤は、以下（ａ）ないし（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドの阻害物質を有効成分として含むことを特徴とする。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列、または、配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含有し、かつ血管新生促進機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列、または、配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、かつ血管新生促進機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００１８】
好ましくは、前記ポリヌクレオチドの阻害物質は、遺伝子の発現を抑制する機能性核酸であることを特徴とする。
【００１９】
さらに好ましくは、前記機能性核酸は、ｓｉＲＮＡであることを特徴とする。
【００２０】
または、以下（ｅ）ないし（ｇ）のいずれかのポリペプチドの阻害物質を有効成分として含むことを特徴とする。
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド。
（ｆ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含有し、かつ血管新生促進機能を有するポリペプチド。
（ｇ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入またはこれらの組み合わせにより配列に変異が生じているアミノ酸配列を含有し、かつ血管新生促進機能を有するポリペプチド。
【００２１】
または、以下（ｈ）ないし（ｋ）のいずれかのポリヌクレオチドを有効成分として含むことを特徴とする。
（ｈ）配列番号３に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
（ｉ）配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
（ｊ）配列番号３に記載の塩基配列、または、配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含有し、かつ血管新生抑制機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｋ）配列番号３に記載の塩基配列、または、配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、かつ血管新生抑制機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００２２】
または、以下（ｌ）ないし（ｎ）のいずれかのポリペプチドを有効成分として含むことを特徴とする。
（ｌ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド。
（ｍ）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含有し、かつ血管新生抑制機能を有するポリペプチド。
（ｎ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入またはこれらの組み合わせにより配列に変異が生じているアミノ酸配列を含有し、かつ血管新生抑制機能を有するポリペプチド。
【００２３】
本発明の第４の態様に係る血管新生の抑制方法は、第３の態様に係る血管新生抑制剤を有効量投与または添加する工程を含むことを特徴とする。
【００２４】
本発明の第５の態様に係る血管新生制御組成物のスクリーニング方法は、Ｈｅｙ２遺伝子または前記Ｈｅｙ２遺伝子の遺伝子産物の発現量を検出する工程を含むことを特徴とする。
【００２５】
または、ｊｄｐ２遺伝子または前記ｊｄｐ２遺伝子の遺伝子産物の発現量を検出する工程を含むことを特徴とする。
【００２６】
好ましくは、前記血管新生制御組成物は、癌、糖尿病、関節リウマチ、慢性炎症または動脈硬化の医薬組成物であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、血管新生の制御機構に関わる新規遺伝子を利用する、血管新生促進剤、血管新生の促進方法、血管新生抑制剤、血管新生の抑制方法、および、血管新生制御組成物のスクリーニング方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の実施例２に係るＨＵＶＥＣのNegative Control ｓｉＲＮＡの管腔形成の様子を示す図である。
【図２】本発明の実施例２に係るＨＵＶＥＣのＨｅｙ２−ｓｉＲＮＡの管腔形成の様子を示す図である。
【図３】本発明の実施例２に係るＨＵＶＥＣのｊｄｐ２−ｓｉＲＮＡの管腔形成の様子を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、本明細書において「有する」、「含む」または「含有する」といった表現は、「からなる」または「から構成される」という意も含むものとする。
【００３０】
（血管新生促進剤）
本発明の実施の形態１に係る血管新生促進剤は、Ｈｅｙ２を有効成分として含むものと、ｊｄｐ２阻害物質を有効成分として含むものとが挙げられる。
【００３１】
Ｈｅｙ２遺伝子またはｊｄｐ２遺伝子は、塩基配列およびコードするポリペプチドのアミノ酸配列の並びは公知であるが、機能は未知である。例えば、最も好ましいヒト（Homo sapiens）に係る遺伝子の塩基配列において、Ｈｅｙ２遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１に（National Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）のアクセッションＮｏ．ＡＢ０４４７５５）、当該Ｈｅｙ２遺伝子の塩基配列がコードするポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２に（ＮＣＢＩのアクセッションＮｏ．ＢＡＡ９６７８１）、ｊｄｐ２遺伝子の塩基配列を配列番号３に（ＮＣＢＩのアクセッションＮｏ．ＡＢ０７７８８０）、当該ｊｄｐ２遺伝子の塩基配列がコードするポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号４に示す（ＮＣＢＩのアクセッションＮｏ．ＢＡＢ８３８９６）。
【００３２】
本発明において、「Ｈｅｙ２」もしくは「ｊｄｐ２」とは、これら配列番号１もしくは配列番号３に示される塩基配列のポリヌクレオチド、または、配列番号２もしくは配列番号４に示されるアミノ酸配列のポリペプチドを示すが、これらに限定されるものではない。ポリヌクレオチドの場合、「Ｈｅｙ２」もしくは「ｊｄｐ２」は、例えば、配列番号１もしくは配列番号３に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチドと、配列番号１もしくは配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列を含有するポリヌクレオチドと、配列番号１もしくは配列番号３に記載の塩基配列、または、配列番号１もしくは配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含有し、かつ血管新生制御機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、配列番号１もしくは配列番号３に記載の塩基配列、または、配列番号１もしくは配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、かつ血管新生制御機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとを挙げることができる。
【００３３】
ここで、ストリンジェントな条件下とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高い核酸が形成される条件下、すなわち配列番号１または配列番号３に示す塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列の相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件下が挙げられる。
【００３４】
具体的には、ナトリウム塩濃度が１５〜７５０ｍＭ、好ましくは５０〜７５０ｍＭ、より好ましくは３００〜７５０ｍＭであり、温度が２５〜７０℃、好ましくは５０〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃であり、ホルムアミド濃度が０〜５０％、好ましくは２０〜５０％、より好ましくは３５〜４５％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件下では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、通常は、ナトリウム塩濃度が１５〜６００ｍＭ、好ましくは５０〜６００ｍＭ、より好ましくは３００〜６００ｍＭであり、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜７０℃、より好ましくは６０〜６５℃である。
【００３５】
ポリペプチドの場合、「Ｈｅｙ２」もしくは「ｊｄｐ２」は、例えば、配列番号２もしくは配列番号４に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドと、配列番号２もしくは配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含有し、かつ血管新生制御機能を有するポリペプチドと、配列番号２もしくは配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入またはこれらの組み合わせにより配列に変異が生じているアミノ酸配列を含有し、かつ血管新生制御機能を有するポリペプチドとを挙げることができる。
【００３６】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドのいずれの場合においても、「８０％以上の相同性」という用語を使用しているが、好ましくは８５％以上であり、より好ましくは９０％以上であり、さらに好ましくは９５％以上である。また、ポリペプチドの場合において、１または数個の「数個」とは、好ましくは２０個以下、より好ましくは１０個以下、さらに好ましくは５個以下、最も好ましくは３個以下を意味する。さらに、本発明において血管新生「制御」（機能）とは、血管新生を正に制御、すなわち「促進」する場合、および、血管新生を負に制御、すなわち「抑制」する場合のいずれも含む意味として用いている。
【００３７】
これらを考慮すると、本発明において、Ｈｅｙ２またはｊｄｐ２は、最も好ましくはヒト（Homo sapiens）に係るものであるが、好ましくは動物（脊椎動物および無脊椎動物を含む）に係るものも含む。例えば、動物としては、哺乳網、鳥網、爬虫網、両生網、魚網または昆虫網等が挙げられる。
【００３８】
前述した通り、本実施の形態１に係る血管新生促進剤にはＨｅｙ２を有効成分として含むものと、ｊｄｐ２阻害物質を有効成分として含むものとが挙げられる。具体的には、本実施の形態１に係る血管新生促進剤は、血管新生、つまり血管網の構築を促進し、調節する効果を奏する。
【００３９】
「ｊｄｐ２阻害物質」とは、ｊｄｐ２遺伝子の遺伝子産物の活性を阻害しうる物質（任意の識別可能な化学物質または分子等であり、例えば、低分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチドまたは核酸等を含む）を意味する。ここで、ｊｄｐ２阻害物質の例としては、ｊｄｐ２遺伝子の転写または翻訳に影響を及ぼす物質、または、ｊｄｐ２遺伝子の遺伝子産物の活性に影響を及ぼす物質等を挙げることができる。なお、ｊｄｐ２阻害物質には、プロモーターまたはエンハンサー阻害物質も含まれるものとする。
【００４０】
このようなｊｄｐ２阻害物質の例としては、核酸、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、これらを含むベクター、ポリペプチド、優性阻害体（dominant negative）、抗体（配列番号４に示される連続したアミノ酸配列を含むポリペプチド内のエピトープと特異的に結合する抗体等）、酵素、触媒型ＲＮＡ、リボザイム、アダプターまたは低分子量（例えば、２０００Ｄａ未満）の化学分子等を挙げることができる。なお、前述したように、ｊｄｐ２遺伝子の転写もしくは翻訳、または、ｊｄｐ２遺伝子の遺伝子産物の活性を阻害しうる物質である限り、これらの薬学的に許容される誘導体または薬学的に許容される塩類等の形態であっても、ｊｄｐ２阻害物質に含まれる。また、このようなｊｄｐ２阻害物質は、例えば、後述するスクリーニング方法によっても選別することが可能である。
【００４１】
本発明において、ｊｄｐ２阻害物質は、発現を抑制する「機能性核酸」であることが好ましい。本発明において「機能性核酸」とは、細胞内のＤＮＡまたはｍＲＮＡ等の内在性遺伝子の発現抑制を行う他、ＤＮＡまたはｍＲＮＡが有する転写または翻訳等のタンパク質を合成する一連の過程において作用し、本来有する機能を抑制できる核酸を意味する。
【００４２】
例えば、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイムまたはこれらを含む発現ベクター等を挙げることができる。当該機能性核酸は、遺伝子の発現を「抑制」するものである。本発明において、「抑制」とは、対照群と比較した場合において、本来のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現量の５０％以上を、好ましくは８０％以上を、より好ましくは９０％以上を抑制することを意味する。
【００４３】
これらの機能性核酸を含有させる発現ベクターは、当業者にとって公知のものであればどのようなものでも構わない。好ましくは、プラスミド、コスミドまたはウイルス発現系を含む。好ましいウイルス発現系の例としては、アデノウイルス、レトロウイルスまたはレンチウイルス等を挙げることができる。また、細胞または組織に発現ベクターを導入する方法についても、当業者にとって公知の方法であればどのようなものでも構わない。好ましい例としては、トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションまたは組み換えウイルスベクターによる感染等を挙げることができる。
【００４４】
本発明において機能性核酸は、「ｓｉＲＮＡ」の形態が好ましい。本発明の「ｓｉＲＮＡ」とは、前述のとおり遺伝子発現を抑制するｓｉＲＮＡを意味する。具体的には、対照群と比較して遺伝子発現を５０％以上抑制できるｓｉＲＮＡ、好ましくは対照群と比較して遺伝子発現を８０％以上抑制できるｓｉＲＮＡ、より好ましくは対照群と比較して遺伝子発現を９０％以上抑制できるｓｉＲＮＡを意味する。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）と呼ばれる配列特異的な遺伝子発現の抑制を誘導することが知られている。ｓｉＲＮＡは、一般に２本鎖のＲＮＡ部分と、センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端のオーバーハング部分から構成される。
【００４５】
ｓｉＲＮＡは、当業者にとって公知の方法によって設計することができる。例えば、選択したＤＮＡ配列（１９〜２１塩基が望ましい）をそのままＲＮＡ配列に変換したもの（センス鎖）と、そのアンチセンス鎖を２本鎖ＲＮＡ部分とし、オーバーハング部を付加する。オーバーハング部は、１または２塩基の任意の核酸（リボ核酸またはデオキシ核酸）であるが、ウリジン（Ｕ）もしくはチミジン（ｄＴ）が好ましい。本発明に係るＨｅｙ２またはｊｄｐ２のｓｉＲＮＡの場合は、好ましくは哺乳類の、より好ましくはヒト（Homo sapiens）の、最も好ましくはヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（human umbilical vein endothelial cells、ＨＵＶＥＣ）のＨｅｙ２またはｊｄｐ２のＤＮＡ配列（配列番号１または配列番号３）に基づいて設計され、Ｈｅｙ２またはｊｄｐ２の遺伝子発現を抑制できるｓｉＲＮＡであれば、特に限定しない。遺伝子発現の抑制は、Ｈｅｙ２またはｊｄｐ２に特異的であることが望ましい。特異的であるか否かは、一般公開されているＢＬＡＳＴ検索を実施することにより確認可能である。また、オーバーハング部分は必須ではない。
【００４６】
本実施の形態１に係る血管新生促進剤には、例えば、試薬、医薬品または食品（健康食品もしくはサプリメントを含む）等を挙げることができる。さらに具体的に述べると、これらの形態としては、例えば、液剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、粉剤、タブレットまたはカプセル剤等を挙げることができる。なお、これらの試薬、医薬品または食品等において、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または、これらの阻害物質の有効成分としての含有量および一日における投与量等は、適宜調節することが可能である。
【００４７】
このように、本実施の形態１に係る血管新生促進剤を利用することにより、血管新生を促進させることが可能になる。当該促進方法に関しては、以下の実施の形態２において詳細に述べる。
【００４８】
（血管新生の促進方法）
本発明の実施の形態２に係る血管新生の促進方法は、前述の実施の形態１に係る血管新生促進剤を有効量投与または添加する工程を含む。なお、血管新生促進剤における用語の詳細および好ましい形態等については、前述の実施の形態１と同様である。
【００４９】
本発明における「有効量投与または添加する」とは、血管新生制御機能の効能、対象とする物質、動物もしくは生物、または、これらの血管新生の程度等を考慮したうえで、適当な量を投与または添加等することを意味する。なお、適当な量の中に懸濁する場合も含む。例えば、血管新生促進剤の有効成分が、遺伝子の発現を抑制する機能性核酸である場合については、in vivo発現、特に、哺乳動物発現ベクターを投与する方法が好ましい。その他の投与または添加方法については、有効成分がポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたはこれらの阻害物質の場合で異なる部分もあるが、結果的に血管新生制御の対象において、血管新生の程度が異なっていればどのような方法でも構わない。なお、当業者であれば、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたはこれらの阻害物質を有効成分とした、例えば、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液または懸濁液剤等を、注射器等を用いて対象とする生物等に投与等することは容易に可能である。また、これらは経口投与または非経口投与のどちらでもよく、非経口投与の形態も特に限定されず、静脈投与、筋肉内投与、腹腔内投与または皮下投与等を挙げることができる。
【００５０】
このように、本実施の形態２に係る血管新生の促進方法によれば、病疾患等により血管新生が抑制された状態となっている場合に利用することができる。また、血管新生に関連する疾患、例えば、関節リウマチ、慢性炎症、動脈硬化、癌または糖尿病等のうち、血管新生が抑制された状態となってしまう疾患の予防薬または治療薬の研究開発等に繋げることも可能となる。
【００５１】
（血管新生抑制剤）
本発明の実施の形態３に係る血管新生抑制剤には、Ｈｅｙ２阻害物質を有効成分として含むものと、ｊｄｐ２を有効成分として含むものとが挙げられる。具体的には、本実施の形態３に係る血管新生抑制剤は、血管新生、つまり血管網の構築を抑制し、調節する効果を奏する。これは、前述した通り、Ｈｅｙ２が血管新生を促進する遺伝子として機能し、ｊｄｐ２が血管新生を抑制する遺伝子として機能するためである。なお、「Ｈｅｙ２」（配列番号１および配列番号２）、ならびに、「ｊｄｐ２」（配列番号３および配列番号４）の用語等の詳細については、実施の形態１において詳細に前述した通りである。
【００５２】
また、「Ｈｅｙ２阻害物質」とは、前述の「ｊｄｐ２阻害物質」と同様に、Ｈｅｙ２遺伝子の遺伝子産物の活性を阻害しうる物質（任意の識別可能な化学物質または分子等であり、例えば、低分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチドまたは核酸等を含む）を意味する。具体的には、Ｈｅｙ２遺伝子の転写または翻訳に影響を及ぼす物質、または、Ｈｅｙ２遺伝子の遺伝子産物の活性に影響を及ぼす物質等を挙げることができる。なお、プロモーターまたはエンハンサー阻害物質も含まれる。
【００５３】
その他、核酸、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、これらを含むベクター、ポリペプチド、優性阻害体（dominant negative）、抗体（配列番号２に示される連続したアミノ酸配列を含むポリペプチド内のエピトープと特異的に結合する抗体等）、酵素、触媒型ＲＮＡ、リボザイム、アダプターまたは低分子量（例えば、２０００Ｄａ未満）の化学分子等も、同様に挙げることができる。これらのうち、例えば、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイムまたはこれらを含む発現ベクター等の「機能性核酸」が好ましい。発現ベクターの詳細については、前述の実施の形態１と同様である。
【００５４】
Ｈｅｙ２阻害物質においても、当該機能性核酸は、Ｈｅｙ２遺伝子の発現を「抑制」するものである。「抑制」の意味については、前述の実施の形態１と同様である。なお、機能性核酸のうち最も好ましいものも、ｊｄｐ２阻害物質と同様で、「ｓｉＲＮＡ」である。ｓｉＲＮＡによる遺伝子発現の抑制の誘導、形態およびその他詳細についても前述の実施の形態１と同様である。
【００５５】
本実施の形態３に係る血管新生抑制剤の形態についても、前述の実施の形態１に係る血管新生促進剤と同様に、例えば、試薬、医薬品または食品（健康食品もしくはサプリメントを含む）等を挙げることができる。より具体的な形態としても同様に、例えば、液剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、粉剤、タブレットまたはカプセル剤等を挙げることができる。さらに、これらの試薬、医薬品または食品等において、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたはこれらの阻害物質の有効成分としての含有量および一日における投与量等が、適宜調節可能であることも同様である。
【００５６】
このように、本実施の形態３に係る血管新生抑制剤を利用することにより、血管新生を抑制させることが可能になる。当該抑制方法に関しては、以下の実施の形態４において詳細に述べる。
【００５７】
（血管新生の抑制方法）
本発明の実施の形態４に係る血管新生の抑制方法は、前述の実施の形態３に係る血管新生抑制剤を有効量投与または添加する工程を含む。なお、用語の詳細および好ましい形態等については、前述の実施の形態１ないし実施の形態３と同様である。
【００５８】
本実施の形態４に係る血管新生の抑制方法によれば、病疾患等により血管新生が促進された状態となっている場合に利用することができる。また、血管新生に関連する疾患、例えば、関節リウマチ、慢性炎症、動脈硬化、癌または糖尿病等のうち、血管新生が促進した状態となってしまう疾患の予防薬または治療薬の研究開発等に繋げることもできる。
【００５９】
（血管新生制御組成物のスクリーニング方法）
本発明の実施の形態５に係る血管新生制御組成物のスクリーニング方法では、Ｈｅｙ２遺伝子またはｊｄｐ２遺伝子およびこれらの遺伝子産物を指標とする。すなわち、Ｈｅｙ２遺伝子もしくは遺伝子産物の発現量、または、ｊｄｐ２遺伝子もしくは遺伝子産物の発現量の検出を行い、血管新生制御組成物（すなわち、血管新生促進組成物または血管新生抑制組成物）を選別する。
【００６０】
本実施の形態５に係る血管新生制御組成物の「組成物」とは、例えば、化合物、分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチドまたは核酸等でもよいし、試薬、医薬品または食品（健康食品・サプリメントを含む）等でも構わない。遺伝子または遺伝子産物の発現量の検出方法については、当業者であれば容易に測定・検出可能であり、例えば、ノザンブロッティング、定量リアルタイムＰＣＲ、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法または蛍光抗体法等を挙げることができる。
【００６１】
例えば、対象の物質を特定の組成物に対して接触（直接的接触または間接的接触のいずれでも構わない）・暴露させた場合に、当該物質のｊｄｐ２発現量が減少する当該特定の組成物は血管新生を促進（血管再生）させる組成物である。これは、ｊｄｐ２が血管新生を抑制する遺伝子産物となる為である。この場合、当該特定の組成物は、血管新生が抑制した状態となる疾患の予防薬または治療薬等に利用できる可能性が高い。一方、例えば、同様の接触等をさせた場合に、当該物質のＨｅｙ２発現量が減少する当該特定の組成物は血管新生を抑制させる組成物である。これは、Ｈｅｙ２が血管新生を促進する遺伝子産物となる為である。この場合、当該特定の組成物は、血管新生が促進した状態となる疾患の予防薬または治療薬等に利用できる可能性が高い。また、それぞれにおいて発現量が増加した場合には、それぞれにおける血管新生の促進または抑制が逆となる。なお、血管新生と関連する疾患には、例えば、関節リウマチ、慢性炎症、動脈硬化、癌または糖尿病等を挙げることができる。
【実施例】
【００６２】
以下、調製例および実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、調製例および実施例は本発明を限定するものではない。
【００６３】
（調製例）
まず、ＨＵＶＥＣの培養方法について説明する。初代培養ＨＵＶＥＣは、クラボウ（ＫＥ−４１０９Ｐ１０）より購入した。初代培養ＨＵＶＥＣは、到着後、直ちに３７℃の温浴中にて解凍し、血管内皮細胞専用培地HuMedia−ＥＧ２（クラボウ）で培養を開始した。培養は、ＣＯ２インキュベーター内、３７℃、湿度９５％にて行った。なお、以下に述べる全ての実験には、継代数５または６のＨＵＶＥＣを用いた。
【００６４】
（実施例１）
本実施例１では、ＤＮＡマイクロアレイ法での新規血管新生制御遺伝子（Ｈｅｙ２遺伝子およびｊｄｐ２遺伝子）の発見について詳細に述べる。
【００６５】
ＤＮＡマイクロアレイ解析用の、ＨＵＶＥＣの天然由来血管新生抑制物質への暴露について述べる。まず、ＣＯ２インキュベーター内において、継代数５のＨＵＶＥＣを、７５ｃｍ２のフラスコ中にほぼコンフルエントになるまで、HuMedia−ＥＧ２培地を用いた培養を行った。暴露実験開始１９時間前に、５％ＦＢＳ（Cell Culture Technology）を含むＲＭＰＩ１６４０培地（Gibco）に交換し、実験開始１時間前に、再度同培地１６ｍｌに交換した。
【００６６】
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解したカルノシン酸（Sigma-Aldrich）、レスベラトロール（Cayman Chemical Company）およびエピガロカテキンガレード（ナカライテスク）を、最終濃度５０μＭとなるように培地に添加し、６時間ＣＯ２インキュベーター内において培養した。６時間経過後、培地を取り除き、ＰＢＳを用いてＨＵＶＥＣを洗浄後、細胞解離バッファーを用いてＨＵＶＥＣを剥離し、同培地を用いて遠心管に回収した。遠心分離後（室温、９００ｇ×１０分間）、上清を捨て、ＰＢＳを用いてＨＵＶＥＣを懸濁した。懸濁したＨＵＶＥＣの一部を取り、細胞数計測に用いた。残りのＨＵＶＥＣ懸濁液は、再び遠心分離（室温、９００ｇ×１０分間）を行った後、上清を捨て、２ｍｌのＲＮＡlater（Ambion）を加えた。その後、４℃で２４時間保存し、−８０℃のディープフリーザーに入れ、１日置いた。その後、−８０℃で凍結させたＨＵＶＥＣを用い、ＤＮＡマイクロアレイ解析を実施した。
【００６７】
次いで、当該ＤＮＡマイクロアレイ解析での、天然物由来血管新生抑制物質暴露によって変動した、マーカー候補遺伝子の発現解析について述べる。ＤＮＡマイクロアレイ解析により、前述したような複数の天然物由来血管新生抑制物質暴露（カルノシン酸、レスベラトロールおよびエピガロカテキンガレード）によってその遺伝子発現が変動し、血管新生に重要であると示唆される遺伝子が２種類選択された。当該２種類の遺伝子は、Ｈｅｙ２遺伝子と、ｊｄｐ２遺伝子であった。
【００６８】
（実施例２）
本実施例２では、ＲＮＡｉ法でのＨｅｙ２遺伝子およびｊｄｐ２遺伝子の血管新生制御における機能解析について詳細に述べる。
【００６９】
当該機能解析として、ｓｉＲＮＡによるＨｅｙ２またはｊｄｐ２発現阻害が、ＨＵＶＥＣの血管新生に与える影響、すなわちＨＵＶＥＣの管腔形成に与える影響について実験を行った。まず、継代数６のＨＵＶＥＣが、２５ｃｍ２のフラスコにほぼコンフルエントになるまで、HuMedia−ＥＧ２培地を用い、ＣＯ２インキュベーター内で培養を行った。ＲＮＡｉの実験開始２４時間前に、１０％ＦＢＳ（Cell Culture Technologies）を含むＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ Reduced Serum Medium培地（Invitrogen）に交換し、ＲＮＡｉの実験開始１時間前に、再度同培地５ｍｌに交換した。
【００７０】
一方、両遺伝子に対するStealth ＲＮＡｉ（Invitrogen）溶液２０μＭから、６０ｐｍｏｌ（３μｌ）を取り、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ Reduced Serum Medium培地（Invitrogen）４９７μｌと混合した。また、１０μｌのLipofectamine ＲＮＡｉＭＡＸ（Invitrogen）とＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ Reduced Serum Medium培地（Invitrogen）４９０μｌとを混合し、さらに、前述したそれぞれの遺伝子に対するStealth ＲＮＡｉを含有する５００μｌの溶液と混合した（合計１ｍｌ）。その後、室温で２０分間置き、前述したＨＵＶＥＣの培地に加え、当該ＨＵＶＥＣを２４時間または４８時間、ＣＯ２インキュベーター内において培養した。
【００７１】
なお、前述のStealth ＲＮＡｉ（Invitrogen）は、Ｈｅｙ２遺伝子またはｊｄｐ２遺伝子のそれぞれに対し、各３種類ずつ合成して実験を行った。Ｈｅｙ２遺伝子に対しては、ＨＳＳ１１８８４１、ＨＳＳ１１８８４２およびＨＳＳ１７４５０を使用し、ｊｄｐ２遺伝子に対しては、ＨＳＳ１５１２３９、ＨＳＳ１５１２４０およびＨＳＳ１７４６６９を使用した。また、Negative Controlとして、３種類のStealth ＲＮＡｉ Negative Control Duplexes（Invitrogen）を使用した。具体的には、Low ＧＣ Duplex、Medium ＧＣ DuplexおよびHigh ＧＣ Duplexを使用した。
【００７２】
次に、９６well培養プレートに、保冷していたマトリゲル（ＢＤ Biosciences）を５０μｌ入れ、ＣＯ２インキュベーター内で１時間保温してゲル化させた。前述の方法により、Ｈｅｙ２遺伝子またはｊｄｐ２遺伝子のｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＨＵＶＥＣの培地を取り除き、ＰＢＳでＨＵＶＥＣを洗浄した後、細胞解離バッファーを用いてＨＵＶＥＣを剥離し、１０％ＦＢＳを含むＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ Reduced Serum Medium培地（Invitrogen）を用いて遠心管に回収した。その後、遠心分離を行い（室温、９００ｇ×１０分間）、上清を捨て、同培地を用いて細胞数１．０×１０５cells／ｍｌとなるようにＨＵＶＥＣを懸濁した。なお、細胞の一部はＲＮＡ回収用にＰＢＳ洗浄を行い、ＲＮＡlater１ｍｌを用いて保存した。その後、１．０×１０５cells／ｍｌのＨＵＶＥＣ懸濁液１００μｌを、ゲル化したマトリゲル上に加え、ＣＯ２インキュベーター内で１８時間培養を行った。培養後、各Stealth ＲＮＡｉにおけるＨＵＶＥＣの管腔形成の様子を、倒立顕微鏡下で、OLYMPUS ＤＳＥ３３０−Ａ撮影システムにより写真撮影した。
【００７３】
図１は、本発明の実施例２に係るＨＵＶＥＣのNegative Control ｓｉＲＮＡの管腔形成の様子を示す図である。図２は、本発明の実施例２に係るＨＵＶＥＣのＨｅｙ２−ｓｉＲＮＡの管腔形成の様子を示す図である。図３は、本発明の実施例２に係るＨＵＶＥＣのｊｄｐ２−ｓｉＲＮＡの管腔形成の様子を示す図である。図２におけるＨｅｙ２−ｓｉＲＮＡは、前述の３種類のStealth ＲＮＡｉがＨｅｙ２遺伝子に対する場合を示し、図３におけるｊｄｐ２−ｓｉＲＮＡは、前述の３種類のStealth ＲＮＡｉがｊｄｐ２遺伝子に対する場合を示す。
【００７４】
図１および図２に示すように、Ｈｅｙ２−ｓｉＲＮＡはＨＵＶＥＣの管腔形成を抑制している。すなわち、Negative Controlである図１のＨＵＶＥＣの管腔形成と比較すると、図２のＨｅｙ２−ｓｉＲＮＡのＨＵＶＥＣの管腔形成は抑制されており（血管新生は抑制されており）、これはＨｅｙ２が血管新生の促進に関与する遺伝子であることを意味する。また、図１および図３に示すように、ｊｄｐ２−ｓｉＲＮＡはＨＵＶＥＣの管腔形成を促進している。すなわち、Negative Controlである図１のＨＵＶＥＣの管腔形成と比較すると、図３のｊｄｐ２−ｓｉＲＮＡのＨＵＶＥＣの管腔形成は促進されており（血管新生は促進されており）、これはｊｄｐ２が血管新生の抑制に関与する遺伝子であることを意味する。
【００７５】
このように、Ｈｅｙ２の発現阻害物質は管腔形成に対して抑制的に作用することから、ｓｉＲＮＡもしくは阻害物質等による発現阻害または機能阻害は、血管新生抑制剤に応用可能である。このことから、Ｈｅｙ２が血管新生促進剤（血管再生剤）に応用可能であることも示唆される。一方、ｊｄｐ２の発現阻害物質は管腔形成に対して促進的に作用することから、ｓｉＲＮＡもしくは阻害物質等による発現阻害または機能阻害は、血管新生促進剤（血管再生剤）に応用可能である。このことから、ｊｄｐ２が血管新生抑制剤に応用可能であることも示唆される。
【００７６】
本発明は、上記発明の実施の形態および実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【００７７】
本明細書の中で明示した論文および公開特許公報等の内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明者らは鋭意研究を行い、血管新生を促進する遺伝子としてＨｅｙ２（hairy/enhancer-of-split related with YRPW motif ２）遺伝子を、血管新生を抑制する遺伝子としてｊｄｐ２（Jun dimerization protein ２）遺伝子を、ＤＮＡマイクロアレイ法により発見した（実施例１参照）。また、これらの両遺伝子の血管新生に係る機能解析を、ＲＮＡｉ法で管腔形成を観察することにより、確認した（実施例２参照）。
【００７９】
そこで、本発明によれば、血管新生の制御機構に関わる新規遺伝子を利用する、血管新生促進剤、血管新生の促進方法、血管新生抑制剤、血管新生の抑制方法、および、血管新生制御組成物のスクリーニング方法が提供され、その結果、血管新生と関連する、例えば癌の増殖転移または糖尿病性網膜症等の予防薬または治療薬の研究開発へと繋がる可能性が期待される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下（ａ）ないし（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを有効成分として含むことを特徴とする、血管新生促進剤。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列、または、配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含有し、かつ血管新生促進機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列、または、配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、かつ血管新生促進機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
以下（ｅ）ないし（ｇ）のいずれかのポリペプチドを有効成分として含むことを特徴とする、血管新生促進剤。
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド。
（ｆ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含有し、かつ血管新生促進機能を有するポリペプチド。
（ｇ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入またはこれらの組み合わせにより配列に変異が生じているアミノ酸配列を含有し、かつ血管新生促進機能を有するポリペプチド。
【請求項３】
以下（ｈ）ないし（ｋ）のいずれかのポリヌクレオチドの阻害物質を有効成分として含むことを特徴とする、血管新生促進剤。
（ｈ）配列番号３に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
（ｉ）配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
（ｊ）配列番号３に記載の塩基配列、または、配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含有し、かつ血管新生抑制機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｋ）配列番号３に記載の塩基配列、または、配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、かつ血管新生抑制機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドの阻害物質は、遺伝子の発現を抑制する機能性核酸であることを特徴とする、請求項３に記載の血管新生促進剤。
【請求項５】
前記機能性核酸は、ｓｉＲＮＡであることを特徴とする、請求項４に記載の血管新生促進剤。
【請求項６】
以下（ｌ）ないし（ｎ）のいずれかのポリペプチドの阻害物質を有効成分として含むことを特徴とする、血管新生促進剤。
（ｌ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド。
（ｍ）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含有し、かつ血管新生抑制機能を有するポリペプチド。
（ｎ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入またはこれらの組み合わせにより配列に変異が生じているアミノ酸配列を含有し、かつ血管新生抑制機能を有するポリペプチド。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載の血管新生促進剤を有効量投与または添加する工程を含むことを特徴とする、血管新生の促進方法。
【請求項８】
以下（ａ）ないし（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドの阻害物質を有効成分として含むことを特徴とする、血管新生抑制剤。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列、または、配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含有し、かつ血管新生促進機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列、または、配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、かつ血管新生促進機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドの阻害物質は、遺伝子の発現を抑制する機能性核酸であることを特徴とする、請求項８に記載の血管新生抑制剤。
【請求項１０】
前記機能性核酸は、ｓｉＲＮＡであることを特徴とする、請求項９に記載の血管新生抑制剤。
【請求項１１】
以下（ｅ）ないし（ｇ）のいずれかのポリペプチドの阻害物質を有効成分として含むことを特徴とする、血管新生抑制剤。
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド。
（ｆ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含有し、かつ血管新生促進機能を有するポリペプチド。
（ｇ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入またはこれらの組み合わせにより配列に変異が生じているアミノ酸配列を含有し、かつ血管新生促進機能を有するポリペプチド。
【請求項１２】
以下（ｈ）ないし（ｋ）のいずれかのポリヌクレオチドを有効成分として含むことを特徴とする、血管新生抑制剤。
（ｈ）配列番号３に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
（ｉ）配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
（ｊ）配列番号３に記載の塩基配列、または、配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含有し、かつ血管新生抑制機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｋ）配列番号３に記載の塩基配列、または、配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、かつ血管新生抑制機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１３】
以下（ｌ）ないし（ｎ）のいずれかのポリペプチドを有効成分として含むことを特徴とする、血管新生抑制剤。
（ｌ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド。
（ｍ）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含有し、かつ血管新生抑制機能を有するポリペプチド。
（ｎ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入またはこれらの組み合わせにより配列に変異が生じているアミノ酸配列を含有し、かつ血管新生抑制機能を有するポリペプチド。
【請求項１４】
請求項８ないし１３のいずれか１項に記載の血管新生抑制剤を有効量投与または添加する工程を含むことを特徴とする、血管新生の抑制方法。
【請求項１５】
Ｈｅｙ２遺伝子または前記Ｈｅｙ２遺伝子の遺伝子産物の発現量を検出する工程を含むことを特徴とする、血管新生制御組成物のスクリーニング方法。
【請求項１６】
ｊｄｐ２遺伝子または前記ｊｄｐ２遺伝子の遺伝子産物の発現量を検出する工程を含むことを特徴とする、血管新生制御組成物のスクリーニング方法。
【請求項１７】
前記血管新生制御組成物は、癌、糖尿病、関節リウマチ、慢性炎症または動脈硬化の医薬組成物であることを特徴とする、請求項１５または１６に記載の血管新生制御組成物のスクリーニング方法。
【請求項１】
以下（ａ）ないし（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを有効成分として含むことを特徴とする、血管新生促進剤。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列、または、配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含有し、かつ血管新生促進機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列、または、配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、かつ血管新生促進機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
以下（ｅ）ないし（ｇ）のいずれかのポリペプチドを有効成分として含むことを特徴とする、血管新生促進剤。
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド。
（ｆ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含有し、かつ血管新生促進機能を有するポリペプチド。
（ｇ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入またはこれらの組み合わせにより配列に変異が生じているアミノ酸配列を含有し、かつ血管新生促進機能を有するポリペプチド。
【請求項３】
以下（ｈ）ないし（ｋ）のいずれかのポリヌクレオチドの阻害物質を有効成分として含むことを特徴とする、血管新生促進剤。
（ｈ）配列番号３に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
（ｉ）配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
（ｊ）配列番号３に記載の塩基配列、または、配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含有し、かつ血管新生抑制機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｋ）配列番号３に記載の塩基配列、または、配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、かつ血管新生抑制機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドの阻害物質は、遺伝子の発現を抑制する機能性核酸であることを特徴とする、請求項３に記載の血管新生促進剤。
【請求項５】
前記機能性核酸は、ｓｉＲＮＡであることを特徴とする、請求項４に記載の血管新生促進剤。
【請求項６】
以下（ｌ）ないし（ｎ）のいずれかのポリペプチドの阻害物質を有効成分として含むことを特徴とする、血管新生促進剤。
（ｌ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド。
（ｍ）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含有し、かつ血管新生抑制機能を有するポリペプチド。
（ｎ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入またはこれらの組み合わせにより配列に変異が生じているアミノ酸配列を含有し、かつ血管新生抑制機能を有するポリペプチド。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載の血管新生促進剤を有効量投与または添加する工程を含むことを特徴とする、血管新生の促進方法。
【請求項８】
以下（ａ）ないし（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドの阻害物質を有効成分として含むことを特徴とする、血管新生抑制剤。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列、または、配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含有し、かつ血管新生促進機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列、または、配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、かつ血管新生促進機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドの阻害物質は、遺伝子の発現を抑制する機能性核酸であることを特徴とする、請求項８に記載の血管新生抑制剤。
【請求項１０】
前記機能性核酸は、ｓｉＲＮＡであることを特徴とする、請求項９に記載の血管新生抑制剤。
【請求項１１】
以下（ｅ）ないし（ｇ）のいずれかのポリペプチドの阻害物質を有効成分として含むことを特徴とする、血管新生抑制剤。
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド。
（ｆ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含有し、かつ血管新生促進機能を有するポリペプチド。
（ｇ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入またはこれらの組み合わせにより配列に変異が生じているアミノ酸配列を含有し、かつ血管新生促進機能を有するポリペプチド。
【請求項１２】
以下（ｈ）ないし（ｋ）のいずれかのポリヌクレオチドを有効成分として含むことを特徴とする、血管新生抑制剤。
（ｈ）配列番号３に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
（ｉ）配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
（ｊ）配列番号３に記載の塩基配列、または、配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列を含有し、かつ血管新生抑制機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｋ）配列番号３に記載の塩基配列、または、配列番号３に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、かつ血管新生抑制機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１３】
以下（ｌ）ないし（ｎ）のいずれかのポリペプチドを有効成分として含むことを特徴とする、血管新生抑制剤。
（ｌ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド。
（ｍ）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含有し、かつ血管新生抑制機能を有するポリペプチド。
（ｎ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入またはこれらの組み合わせにより配列に変異が生じているアミノ酸配列を含有し、かつ血管新生抑制機能を有するポリペプチド。
【請求項１４】
請求項８ないし１３のいずれか１項に記載の血管新生抑制剤を有効量投与または添加する工程を含むことを特徴とする、血管新生の抑制方法。
【請求項１５】
Ｈｅｙ２遺伝子または前記Ｈｅｙ２遺伝子の遺伝子産物の発現量を検出する工程を含むことを特徴とする、血管新生制御組成物のスクリーニング方法。
【請求項１６】
ｊｄｐ２遺伝子または前記ｊｄｐ２遺伝子の遺伝子産物の発現量を検出する工程を含むことを特徴とする、血管新生制御組成物のスクリーニング方法。
【請求項１７】
前記血管新生制御組成物は、癌、糖尿病、関節リウマチ、慢性炎症または動脈硬化の医薬組成物であることを特徴とする、請求項１５または１６に記載の血管新生制御組成物のスクリーニング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１３−１６７５（Ｐ２０１３−１６７５Ａ）
【公開日】平成２５年１月７日（２０１３．１．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１３３８９５（Ｐ２０１１−１３３８９５）
【出願日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【出願人】（０００１７３５６６）一般財団法人 化学物質評価研究機構 (14)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年１月７日（２０１３．１．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【出願人】（０００１７３５６６）一般財団法人 化学物質評価研究機構 (14)
【Ｆターム（参考）】
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