血管新生阻害剤および癌転移抑制剤
【課題】血管新生阻害作用および癌転移抑作用を有する化合物を提供する。
【解決手段】 本発明は、式（Ｉ）
【化１】
（式中、Ｘが−ＣＨ２−で、かつＲ１が炭素数１または２のアルキル基、ホルミル基、アセチル基、水素原子又はハロゲン原子を表すか、あるいは、Ｘが−（ＣＨ２）２−で、かつＲ１が炭素数１〜３のアルキル基、ホルミル基、アセチル基、水素原子又はハロゲン原子を表す）で表される化合物を有効成分とする血管新生阻害剤に関する。
【解決手段】 本発明は、式（Ｉ）
【化１】
（式中、Ｘが−ＣＨ２−で、かつＲ１が炭素数１または２のアルキル基、ホルミル基、アセチル基、水素原子又はハロゲン原子を表すか、あるいは、Ｘが−（ＣＨ２）２−で、かつＲ１が炭素数１〜３のアルキル基、ホルミル基、アセチル基、水素原子又はハロゲン原子を表す）で表される化合物を有効成分とする血管新生阻害剤に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生阻害剤および癌転移抑制剤、またはその作用に基づく疾病治療並びに予防用の組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は死亡原因の第一位であり死亡者数の約３割を占めている（平成１８年人口動態統計：厚生労働省）疾患である。癌は、癌細胞が増殖し人間個体を死に至らしめる疾患であり、癌治療には大きく分けて化学療法、手術療法、放射線療法等があるが、いずれの治療においても癌の転移は大きな課題となっている。癌細胞は正常細胞と異なり、細胞分裂時に抑制がかからず無限増殖し、また、他の組織へ侵入して増殖を続けるという性質がある。現在、癌治療は、癌細胞をできるだけ選択的に排除する方法が実施されているが、他の組織への転移の有無は時間が経過しないと不明であるため、癌転移を抑制する方法の開発が望まれている。細胞増殖が制御できなくなった細胞を腫瘍細胞、その塊を腫瘍というが、この段階では良性の腫瘍である。それに加えて腫瘍細胞が周囲に浸潤する能力を獲得したときに悪性腫瘍、すなわち癌と呼ぶ（非特許文献１）。癌細胞が血液やリンパ管に入り、体内の他の場所に転移すると治療が困難になる場合が多い。
【０００３】
癌の転移を抑制する薬剤はこれまでいくつかの報告があるが、いまだ十分なものはなく、安全で効果ある薬剤が望まれている。癌細胞の増殖には、癌組織内における血管新生による栄養供給が必要であり、新しく形成された血管は、癌細胞への栄養補給だけではなく、形成された血管を通じて癌の転移を引き起こすことが知られている。従って、癌組織での血管新生阻害は、癌細胞の増殖を抑制して癌を縮小させるだけではなく、癌転移抑制に有効と考えられている。これまでに知られている血管新生阻害のターゲットとしては、血管内皮細胞増殖抑制因子阻害、タンパク質分解酵素阻害、ＴＮＦαなどの炎症性サイトカイン阻害などがある。また一方で、癌転移の際は癌細胞がタンパク質分解酵素により基底膜を破って周囲の組織内に浸潤していくことから、この癌浸潤を抑制することも癌転移抑制に有効な一つの方法と考えられている。
【０００４】
熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）やその転写誘導因子である熱ショック因子（ＨＳＦ）の抗癌作用に関する関係は、これまでにＨＳＰ９０阻害剤による癌増殖抑制効果や（非特許文献２）、ＨＳＰ９０阻害剤を熱ショック反応抑制剤と併用することによりＨＳＰ９０阻害剤の作用が強まることが報告されているが（非特許文献３）、血管新生阻害や癌転移抑制効果に関する記述は全くない。Ｎ−ホルミル−３,４−メチレンジオキシベンジリデン−γ−ブチロラクタム（ＫＮＫ４３７）は熱ショック因子活性化阻害剤として見出された化合物であり、これまでに、ストレス性疾患治療剤（特許文献１）、癌温熱療法時の癌細胞温熱耐性獲得阻害剤（特許文献２）、神経細胞伸張促進剤としての報告（非特許文献４）があるが、血管新生阻害作用や癌浸潤抑制作用、癌転移抑制作用に関する報告はない。
【０００５】
また、従来の抗癌剤は、一般に癌細胞だけではなく正常細胞にまで影響を及ぼす副作用が問題となっており、副作用のより少ない抗癌剤が望まれている。血管新生阻害剤は、副作用の少ない抗癌剤として期待されているが、血管新生は癌組織だけでなく正常組織でもおこるため、より癌組織特異的あるいは疾患特異的な血管新生阻害剤が望まれている。また、血管新生阻害剤や癌転移抑制剤は、各種癌治療や他の薬剤と併用できるものが望まれているが、未だ満足できる薬剤はない。さらに、血管新生に関連する疾患としては、網膜に血管新生が起こる糖尿病性網膜症、網膜の黄斑部に血管新生が起こる加齢黄斑変性症、角質での毛細血管増加が起こる乾癬、マクロファージなどの炎症細胞が血管新生を促進させる関節炎などがあり、いずれも血管新生阻害剤による治療効果が期待されている。
【特許文献１】米国特許第６２８１２２９号明細書
【特許文献２】米国特許第６９０３１１６号明細書
【非特許文献１】The Cell 細胞の分子生物学、第４版、1313-1326、2004
【非特許文献２】J.Bioxci.32,517-530,2007
【非特許文献３】Cancer Res.,66,1783-1791,2006
【非特許文献４】Neuroscience Letters,410,212-217,2006
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、血管新生阻害作用および癌転移抑制作用を有する化合物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ＫＮＫ４３７等の下記式（Ｉ）で表される化合物に血管新生阻害作用および癌転移抑制作用があることを見いだし、それを基に本発明を完成するに至った。これまで、ＫＮＫ４３７に上記のような効果があることは全く知られていなかった。すなわち、本発明が提供するのは以下の通りである。
【０００８】
[１]
式（Ｉ）、
【化１】
（式中、Ｘは−ＣＨ２−、Ｒ１は炭素数１または２のアルキル基、ホルミル基、アセチル基、水素原子、ハロゲン原子、あるいは、Ｘは−（ＣＨ２）２−、Ｒ１は炭素数１〜３のアルキル基、ホルミル基、アセチル基、水素原子、ハロゲン原子を表す）で表される化合物をまたはその医薬として許容しうる塩を有効成分とする血管新生阻害剤。
【０００９】
[２]
Ｘが−ＣＨ２−、Ｒ１がホルミル基である[１]記載の血管新生阻害剤。
【００１０】
[３]
Ｘが−ＣＨ２−、Ｒ１が水素原子である[１]記載の血管新生阻害剤。
【００１１】
[４]
Ｘが−ＣＨ２−、Ｒ１がアセチル基である[１]記載の血管新生阻害剤。
【００１２】
[５]
Ｘが−（ＣＨ２）２−、Ｒ１が水素原子である[１]記載の血管新生阻害剤。
【００１３】
[６]
Ｘが−（ＣＨ２）２−、Ｒ１がホルミル基である[１]記載の血管新生阻害剤。
【００１４】
[７]
式（Ｉ）で表される化合物がＥ体である[１]〜[６]いずれか記載の血管新生阻害剤。
【００１５】
[８]
式（Ｉ）で表される化合物がＲ体である[１]〜[６]いずれか記載の血管新生阻害剤。
【００１６】
[９]
[１]〜[８]いずれか記載の血管新生阻害剤を含有する、癌あるいは糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症、乾癬、関節炎の治療または予防薬。
【００１７】
[１０]
[１]〜[８]いずれか記載の化合物を含有する組成物を用いた、血管新生阻害を目的とした治療または予防方法。
【００１８】
[１１]
[１]〜[８] いずれか１項記載の式（Ｉ）で表される化合物を有効成分とする癌転移抑制剤。
【００１９】
[１２]
[１]〜[８]いずれか記載の血管新生阻害剤または[１１]記載の癌転移抑制剤を含有する癌の治療または転移抑制薬。
【００２０】
[１３]
[１]〜[８]いずれか記載の化合物を含有する組成物を用いた、癌転移治療または癌転移予防方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、副作用が少ない、血管新生阻害剤および癌転移抑制剤を得ることが期待できる。これらは、癌等の疾病治療並びに予防に有効であり、医薬品や医薬部外品として用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下に、本発明の実施の形態を詳しく説明する。
本発明は、下記式（Ｉ）で表される化合物（化合物（Ｉ））を含有する血管新生阻害剤および癌転移抑制剤に関する。
式（Ｉ）
【化２】
上記式（Ｉ）のＲ１における炭素数１または２のアルキル基としては、メチル基、エチル基が挙げられ、る。Ｒ１におけるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子等が挙げられる。また、式（Ｉ）のＲ１における炭素数１〜３のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基等が挙げられる。
【００２３】
好適な実施態様としては、Ｘが−ＣＨ２−で、Ｒ１がホルミル基である化合物、Ｘが−ＣＨ２−で、Ｒ１が水素原子である化合物、Ｘが−ＣＨ２−で、Ｒ１がアセチル基である化合物、また別の好適な実施態様としては、Ｘが−（ＣＨ２）２−で、Ｒ１が水素原子である化合物、Ｘが−（ＣＨ２）２−で、Ｒ１がホルミル基である化合物が挙げられる。
【００２４】
また、上記（Ｉ）で表される化合物はＥ体であってもよいし、Ｚ体であってもよい。
【００２５】
より好ましい実施態様としては、式（Ｉ）のＸが−ＣＨ２−でＲ１がホルミル基か、Ｘが−（ＣＨ２）２−でＲ１が水素原子か、あるいはＸが−（ＣＨ２）２−で、Ｒ１がホルミル基であり、かつ、Ｅ体又はＺ体の化合物である。
【００２６】
上記化合物（Ｉ）の一例として、Ｎ−ホルミル−３,４−メチレンジオキシベンジリデン−γ−ブチロラクタム（ＫＮＫ４３７）が挙げられる。
【００２７】
式（Ｉ）で表される化合物の製造方法は、特に限定されないが、例えば、ＫＮＫ４３７を具体例に挙げると、以下の方法で得ることができる。まず、Ｎ−アセチル−２−ピロリドン（７０．０ｇ，０．５５ｍｏｌ）とピペロナール（８２．０ｇ，０．５５ｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（５００ｍｌ）溶液を、水素化ナトリウム（６０％鉱物油懸濁物、６３．０ｇ，１．５７ｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１０００ｍｌ）懸濁液に、アルゴン雰囲気下、氷冷しながら滴下した後、反応液を室温にて一晩撹拌する。得られた反応液を希硫酸で中和、クロロホルムで抽出、飽和食塩水で洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥したのち、濾過、減圧にて溶媒留去する。得られた反応物を２−プロパノールで再結晶することにより、Ｎ−ホルミル−３，４−メチレンジオキシベンジリデン−γ−ブチロラクタム（ＫＮＫ４３７）（７９．０ｇ，収率６５％）を得ることができる。
【００２８】
本発明でいう血管新生とは、既存の血管から新たな血管が分岐し、毛細血管となる現象である。血管新生は、癌あるいは糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症、乾癬、関節炎等の疾患に関与することが知られており、血管新生阻害剤はこれらの疾患治療に適応可能である。
【００２９】
癌の浸潤とは、癌細胞が周囲の組織、血液やリンパ管に入りこむことであり、また、癌転移とは癌が浸潤し、体の他の場所で腫瘍を形成することである。癌転移は多段階からなり、原発腫瘍から癌細胞が離脱し、癌細胞が血管やリンパ管へ侵入し、さらに離れた組織に癌細胞が定着し増殖することで起こる。癌浸潤のメカニズムは未だ完全には解明されていないが、細胞と細胞の接着が破壊されることに一つの原因があると推測されている。癌細胞は周囲の組織に広がっていき、元の腫瘍から癌細胞が離脱することで癌の転移が始まる。そのため、癌浸潤を抑制することは、血管を含めた周囲の組織への癌侵入や血管やリンパ球で運ばれた部位に癌細胞が定着することを抑制し、癌転移を抑制することができる。また、癌組織が大きくなるためには血液の供給が必要なため、癌組織は血管を新たに形成する血管新生が原発腫瘍および転移腫瘍に必須である。新しく形成された血管により癌細胞は増殖を続け、また同時にその血管は癌転移に必要な、癌細胞運搬路となっている。そのため、癌組織の血管新生を阻害した場合、栄養と酸素の不足により癌細胞の成育が阻害され、さらに癌転移が抑制される可能性がある。
【００３０】
本発明の血管新生阻害剤および癌転移抑制剤は、血管新生阻害および癌細胞の転移を抑制する効果を有するので、癌あるいは糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症、乾癬、関節炎等の疾患治療や予防薬の製造に用いることが出来る。
【００３１】
血管新生は、血管新生促進因子といわれる成長因子やサイトカインが血管に働き、さらにマトリックスメタロプロテナーゼ２（コラーゲン分解酵素）により血管基底膜のコラーゲンが溶解されることで、内皮細胞が血管新生部位に移動していき、その後、新しい血管が出来る。
【００３２】
癌細胞の転移（浸潤）を調べる方法の一つとして、例えば、Boyden Chamberと呼ばれる上下２層からなる培養器具を用いることができる。具体的には、上層の約８μｍの穴をもつ膜上に癌細胞株を播種し、培地を加えた下層への癌細胞移動を調べる方法である。
【００３３】
血管新生阻害作用を測定するための一つの方法として、正常ヒトさい帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）と皮膚繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）との共培養系モデルがある。この共培養系モデルを用いると、例えば、内皮細胞および内皮細胞間の接合部に高発現している抗ＣＤ３１抗体で管腔染色することにより、血管腔を観察することが出来る。この系を用いることにより、管腔形成阻害物質の評価を行うことが可能である。
【００３４】
血管新生のメカニズムは、遺伝子発現を解析することによりさらに詳細に調べることが出来る。例えばリアルタイムＰＣＲ技術を利用して血管新生に関連する遺伝子群の発現を解析することができ、正常ヒトさい帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いてその遺伝子発現を解析することも一つの方法である。リアルタイムＰＣＲ技術を利用し、血管新生阻害作用を持つ薬剤をＨＵＶＥＣ細胞培養時に添加して、血管新生に関連する遺伝子発現の変化を解析することは、そのメカニズム解明にも有用である。
【００３５】
血管新生に関与する遺伝子群としては、例えば血管新生を誘導する腫瘍増殖因子（ＴＧＦ−α）、細胞走化性を誘導するケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１、コラーゲンなどの細胞外構造を分解するマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）ファミリー、低血清下で増殖が抑制されている線維芽細胞の増殖を促進するマトリックスメタロプロテアーゼインヒビター３、などがある。ＨＵＶＥＣ細胞を用いた血管新生阻害効果試験において、薬剤処理等によるこれら遺伝子の発現低下は、血管新生阻害効果の作用メカニズムを示唆している。
【００３６】
また、癌転移抑制メカニズムは、癌転移に関連する遺伝子発現を解析することによりさらに詳細に調べることが出来る。例えばリアルタイムＰＣＲ技術を利用して癌転移に関連する遺伝子群の発現を解析することができ、癌細胞株を用いてその遺伝子発現を解析することも一つの方法である。用いる癌細胞は腺癌細胞や上皮癌細胞等、特に限定する必要はない。リアルタイムＰＣＲ技術を利用し、癌転移抑制作用を持つ薬剤を癌細胞培養時に添加して、癌転移に関連する遺伝子発現の変化を解析することは、そのメカニズム解明に有用である。
【００３７】
癌転移に関連する遺伝子群としては、コラーゲンなどの細胞外構造を分解するマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）ファミリー、癌浸潤のステップとしてＭＭＰの活性を調節するＭＭＰインヒビター、基底膜コラーゲンタイプＩＶのα鎖（ＣＯＬ４Ａ２）、などがある。癌細胞株を用いた癌転移抑制試験において、薬剤処理等によるこれら遺伝子の発現低下は、癌転移抑制効果のメカニズムを示唆している。
【００３８】
血管新生阻害効果および癌転移抑制効果を調べる別の方法として、マウスに癌を移植し、その癌組織への血管新生作用および癌浸潤作用を観察評価する方法がある。
癌細胞を移植したマウス（担癌マウス）を数週間飼育することで、癌細胞は増殖し腫瘍を形成する。薬剤を投与したマウスと薬剤を投与しないマウスの癌細胞を摘出し、組織染色後に血管腔を観察することにより血管新生を評価することができる。また、同じ担癌マウス試験により、腫瘍観察および腫瘍摘出後の重量測定で癌浸潤を評価することができる。用いる癌細胞は特に限定されないが、Ｃ３Ｈマウス頬部腫瘍由来癌細胞株（ＳＱ−１９７９）細胞などがある。
【００３９】
本発明の化合物は単独で使用できるが、他の薬剤を用いる化学療法、手術療法、放射線療法、温熱療法あるいは他の血管新生抑制療法と組み合わせて使用することもできる。
【００４０】
本発明化合物の投与方法としては経口、経腸または他の非経口的投与方法のいずれをも選ぶことができる。具体的な製剤形態としては特に限定されず、投与目的や投与経路等に応じて、たとえば錠剤、散剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤等の経口剤、又は坐剤、軟膏剤、注射剤、局所投与のクリーム若しくは点眼薬などの非経口剤をあげることができる。配合量に関しては特に規定するものではないが、所望の効果を奏する範囲内で適宜選択することができる。
【００４１】
本発明による製剤の担体としては経口、経腸、その他非経口的に投与するために適した有機または無機の固体または液体の任意成分を含有することができる。任意成分としては、一般に製剤に使用される結合剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤等の添加物を含有させることができる。結合剤の好適な例としてはデンプン、トレハロース、デキストリン、アラビアゴム末などが挙げられる。賦形剤の好適な例としては、しょ糖、乳糖、ブドウ糖、コーンスターチ、マンニト−ル、結晶セルロース、ゼラチン、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、植物性および動物性脂肪ならびに油、ペクチンなどが挙げられる。滑沢剤の好適な例としてはステアリン酸、タルク、ロウ、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。崩壊剤の好適な例としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチなどが挙げられる。安定剤の好適な例としては油脂、プロピレングリコールなどが挙げられる。乳化剤の好適な例としては、アニオン界面活性剤、非イオン性界面活性剤、ポリビニルアルコールなどが挙げられる。緩衝剤の好適な例としてはリン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液が挙げられる。
【００４２】
本発明の血管新生阻害剤および癌転移抑制剤を医薬部外品として製剤化して用いる場合は、必要に応じて他の添加剤などを添加して、例えば、軟膏、リニメント剤、エアゾール剤、クリーム、石鹸、洗顔料、全身洗浄料、化粧水、ローション、入浴剤などに使用することができ、局所的に用いることができる。
【００４３】
本発明の化合物は、製剤中に０．００１〜１００重量％含ませることができる。含有量は、好ましくは０．０１〜１００重量％、より好ましくは０．１〜９０重量％である。
これら製剤の投与量としては、当該抽出物換算で成人一人一日当たり、好ましくは０．００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．０１〜２００ｍｇ／ｋｇ体重を１回ないし数回に分けて投与する。
【００４４】
また本発明の血管新生阻害剤および癌転移抑制剤はその他の医薬を含むことができる。この場合、本発明化合物（Ｉ）は必ずしもその製剤中の主成分でなくてもよい。
以下に実施例を記載して、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、これらの実施例によって、本発明の範囲は限定的に解釈されるものではない。
【実施例】
【００４５】
以下に実施例を記載して、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、これらの実施例によって、本発明の範囲は限定的に解釈されるものではない。
【００４６】
（実施例１）ＫＮＫ４３７の濃度依存的血管新生阻害作用
血管新生キット（倉敷紡績株式会社、製品番号；ＫＺ−１１００）を使用し、製品説明書奨の方法に従って実験した。当該キットは正常ヒトさい帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）と皮膚繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）の共培養系モデルであり、２４穴プレートで管腔形成初期段階の増殖状態で提供される。血管新生専用培地に血管新生促進剤であるＶＥＧＦ−Ａ（キット付属）を添加したものを培地交換に用い、ＫＮＫ４３７を終濃度が、０（コントロール）、０．０１、０．１、１．０、１０、２０μＭになるよう各ウエルに添加した。炭酸ガスインキュベーターで３日間培養後、さらに４、７、９日目に各ＫＮＫ４３７濃度に設定した培地で培地交換した。１１日目にＰＢＳで洗浄後、１ｍｌ／ｗｅｌｌの７０％エタノールを加え、室温３０分静置により細胞固定した。さらに抗ＣＤ３１抗体を用いた管腔染色キット（倉敷紡績株式会社、製品番号；ＫＺ−１２２５）で各ウエルを染色し、形成された管腔を観察した。
その結果、ＫＮＫ４３７は濃度依存的に血管新生阻害作用を示した。
【００４７】
（実施例２）ＫＮＫ４３７の血管新生関連遺伝子発現低下作用
血管新生関連遺伝子発現の解析は、SABiosciences社のAngiogenesis ＲＴ２ ProfilerTM ＰＣＲ Arraysシステム（ＰＡＨＳ−０２４Ａ）を使用し、製品説明書の方法に従って実験した。ＫＮＫ４３７は、終濃度１０μＭで正常ヒトさい帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）へ添加し、炭酸ガスインキュベーターで３日間培養後、ＲＮＡを抽出した。さらにｃＤＮＡを調製後、ＲＴ２マスターミックスと混合し、ＰＣＲアレイプレート（９６穴）に添加した。ＰＣＲ装置（BIO-RAD社）でリアルタイムＰＣＲを実行後、Threshold Cycle (Ct)法によりデータ解析した。ＫＮＫ４３７投与後の発現量変化は、（ＫＮＫ４３７添加群の発現量）／（ＫＮＫ４３７非添加群の発現量）の比で表し、発現量が減少したものはマイナスの記号で表した。
【００４８】
【表１】
【００４９】
ＫＮＫ４３７投与群では、ＭＭＰファミリー等の血管新生関連の遺伝子発現が顕著に低下した。
【００５０】
（実施例３）ＫＮＫ４３７の癌転移関連遺伝子群発現低下作用
癌転移関連伝子発現の解析は、SABiosciences社のTumor Metastasis ＲＴ２ ProfilerTM ＰＣＲ Arraysシステム（ＰＡＨＳ−０２８Ａ）を使用し、製品説明書の方法に従って実験した。ヒト顎下腺由来腺癌細胞株（ＨＳＧ）、ヒト口腔扁平上皮癌細胞株（ＨＳＣ２、ＳＡＳ）を使用し、ＫＮＫ４３７はＨＳＧ細胞で終濃度１０μＭ、その他の細胞で終濃度４０μＭとなるよう培地へ添加し、炭酸ガスインキュベーターで３日間培養後、ＲＮＡを抽出した。さらにｃＤＮＡを調製後、ＲＴ２マスターミックスと混合し、ＰＣＲアレイプレート（９６穴）に添加した。ＰＣＲ装置（BIO-RAD社）でリアルタイムＰＣＲを実行後、Threshold Cycle (Ct)法によりデータ解析した。ＫＮＫ４３７投与後の発現量変化は、（ＫＮＫ４３７添加群の発現量）／（ＫＮＫ４３７非添加群の発現量）の比で表し、発現量が減少したものはマイナスの記号で表した。
【００５１】
【表２】
【００５２】
ＫＮＫ４３７投与群では、特にＭＭＰファミリー遺伝子群の遺伝子発現が顕著に低下した。
【００５３】
（実施例４）ＫＮＫ４３７の癌細胞株の癌転移抑制効果（浸潤抑制）
上下２層からなる２４ウェルタイプのBoyden Chamberを用い、８μｍの穴の開いたメンブレンを透過した細胞数を観察し、ＫＮＫ４３７の細胞浸潤阻害効果を調べた。Cell Invasion Assay Kit (CHEMICON International, Inc. No. ECM550)を使用し、製品説明書の方法に従って実験した。上層チャンバーには、浸潤型癌細胞株であるヒト顎下腺由来腺癌細胞株（ＨＳＧ）、ヒト口腔扁平上皮癌細胞株（ＨＳＣ２、ＳＡＳ、ＨＳＣ３、ＫＢ）をそれぞれ１．０ｘ１０６個／ｍｌ濃度で播種した。ＫＮＫ４３７はＨＳＧ細胞で終濃度１０μＭ、その他の細胞で終濃度４０μＭとなるよう下層チャンバーに添加し、炭酸ガスインキュベーターで３日間培養後、メンブレンを透過して移動した細胞を染色し、浸潤抑制効果についてＫＮＫ４３７未添加のコントロール群と比較し評価した。
【００５４】
【表３】
【００５５】
浸潤型癌細胞株のＨＳＧ、ＨＳＣ２、ＳＡＳ、ＨＳＣ３、ＫＢ、において、ＫＮＫ４３７投与群はＫＮＫ４３７非投与コントロール群と比較し浸潤抑制効果を示し、癌転移抑制効果が認められた。
【００５６】
（実施例５）ＫＮＫ４３７の坦癌マウスにおける癌転移抑制（血管新生阻害）効果
Ｃ３Ｈマウス頬部腫瘍由来癌細胞株ＳＱ−１９７９を、Ｃ３Ｈマウス（５週齢、雄）の背部皮下に接種し１週間後に腫瘍の形成を確認した。癌細胞移植後１週間目からＫＮＫ４３７をオリーブオイルに懸濁し、１００ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。ＫＮＫ４３７非投与群にはオリーブオイルのみ投与した。３週間隔日投与を行った後、腫瘍を摘出して組織染色により血管腔の形成を顕微鏡観察した。結果を図１に示す。
【００５７】
図１の結果からわかるように、ＫＮＫ４３７投与群では、血管腔の形成が抑制された。
【００５８】
（実施例６）ＫＮＫ４３７の坦癌マウスにおける癌転移抑制（癌浸潤抑制）効果
Ｃ３Ｈマウス頬部腫瘍由来癌細胞株ＳＱ−１９７９を、Ｃ３Ｈマウス（５週齢、雄）の背部皮下に接種し１週間後に腫瘍の形成を確認した。癌細胞移植後１週間目からＫＮＫ４３７をオリーブオイルに懸濁し、１００ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。コントロール群はＫＮＫ４３７を投与せずオリーブオイルのみ投与した。３週間隔日投与を行った後、移植した背部を開き腫瘍の浸潤程度を目視で観察した。結果を図２に示す。
【００５９】
図２の結果からわかるように、ＫＮＫ４３７はマウス癌細胞株の浸潤を抑制した。ＫＮＫ４３７投与群で顕著に腫瘍の大きさが小さかった。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明によれば、副作用が少ない、血管新生阻害剤および癌転移抑制剤を得ることができ、これらは、癌等の疾病治療並びに予防に有効であり、医薬品や医薬部外品として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】マウス背部皮下に接種したＣ３Ｈマウス頬部腫瘍由来癌細胞株（ＳＱ−１９７９）を用いたＫＮＫ４３７の血管腔形成抑制効果を示す。
【図２】マウス背部皮下に接種したＣ３Ｈマウス頬部腫瘍由来癌細胞株（ＳＱ−１９７９）を用いたＫＮＫ４３７の癌浸潤抑制効果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生阻害剤および癌転移抑制剤、またはその作用に基づく疾病治療並びに予防用の組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は死亡原因の第一位であり死亡者数の約３割を占めている（平成１８年人口動態統計：厚生労働省）疾患である。癌は、癌細胞が増殖し人間個体を死に至らしめる疾患であり、癌治療には大きく分けて化学療法、手術療法、放射線療法等があるが、いずれの治療においても癌の転移は大きな課題となっている。癌細胞は正常細胞と異なり、細胞分裂時に抑制がかからず無限増殖し、また、他の組織へ侵入して増殖を続けるという性質がある。現在、癌治療は、癌細胞をできるだけ選択的に排除する方法が実施されているが、他の組織への転移の有無は時間が経過しないと不明であるため、癌転移を抑制する方法の開発が望まれている。細胞増殖が制御できなくなった細胞を腫瘍細胞、その塊を腫瘍というが、この段階では良性の腫瘍である。それに加えて腫瘍細胞が周囲に浸潤する能力を獲得したときに悪性腫瘍、すなわち癌と呼ぶ（非特許文献１）。癌細胞が血液やリンパ管に入り、体内の他の場所に転移すると治療が困難になる場合が多い。
【０００３】
癌の転移を抑制する薬剤はこれまでいくつかの報告があるが、いまだ十分なものはなく、安全で効果ある薬剤が望まれている。癌細胞の増殖には、癌組織内における血管新生による栄養供給が必要であり、新しく形成された血管は、癌細胞への栄養補給だけではなく、形成された血管を通じて癌の転移を引き起こすことが知られている。従って、癌組織での血管新生阻害は、癌細胞の増殖を抑制して癌を縮小させるだけではなく、癌転移抑制に有効と考えられている。これまでに知られている血管新生阻害のターゲットとしては、血管内皮細胞増殖抑制因子阻害、タンパク質分解酵素阻害、ＴＮＦαなどの炎症性サイトカイン阻害などがある。また一方で、癌転移の際は癌細胞がタンパク質分解酵素により基底膜を破って周囲の組織内に浸潤していくことから、この癌浸潤を抑制することも癌転移抑制に有効な一つの方法と考えられている。
【０００４】
熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）やその転写誘導因子である熱ショック因子（ＨＳＦ）の抗癌作用に関する関係は、これまでにＨＳＰ９０阻害剤による癌増殖抑制効果や（非特許文献２）、ＨＳＰ９０阻害剤を熱ショック反応抑制剤と併用することによりＨＳＰ９０阻害剤の作用が強まることが報告されているが（非特許文献３）、血管新生阻害や癌転移抑制効果に関する記述は全くない。Ｎ−ホルミル−３,４−メチレンジオキシベンジリデン−γ−ブチロラクタム（ＫＮＫ４３７）は熱ショック因子活性化阻害剤として見出された化合物であり、これまでに、ストレス性疾患治療剤（特許文献１）、癌温熱療法時の癌細胞温熱耐性獲得阻害剤（特許文献２）、神経細胞伸張促進剤としての報告（非特許文献４）があるが、血管新生阻害作用や癌浸潤抑制作用、癌転移抑制作用に関する報告はない。
【０００５】
また、従来の抗癌剤は、一般に癌細胞だけではなく正常細胞にまで影響を及ぼす副作用が問題となっており、副作用のより少ない抗癌剤が望まれている。血管新生阻害剤は、副作用の少ない抗癌剤として期待されているが、血管新生は癌組織だけでなく正常組織でもおこるため、より癌組織特異的あるいは疾患特異的な血管新生阻害剤が望まれている。また、血管新生阻害剤や癌転移抑制剤は、各種癌治療や他の薬剤と併用できるものが望まれているが、未だ満足できる薬剤はない。さらに、血管新生に関連する疾患としては、網膜に血管新生が起こる糖尿病性網膜症、網膜の黄斑部に血管新生が起こる加齢黄斑変性症、角質での毛細血管増加が起こる乾癬、マクロファージなどの炎症細胞が血管新生を促進させる関節炎などがあり、いずれも血管新生阻害剤による治療効果が期待されている。
【特許文献１】米国特許第６２８１２２９号明細書
【特許文献２】米国特許第６９０３１１６号明細書
【非特許文献１】The Cell 細胞の分子生物学、第４版、1313-1326、2004
【非特許文献２】J.Bioxci.32,517-530,2007
【非特許文献３】Cancer Res.,66,1783-1791,2006
【非特許文献４】Neuroscience Letters,410,212-217,2006
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、血管新生阻害作用および癌転移抑制作用を有する化合物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ＫＮＫ４３７等の下記式（Ｉ）で表される化合物に血管新生阻害作用および癌転移抑制作用があることを見いだし、それを基に本発明を完成するに至った。これまで、ＫＮＫ４３７に上記のような効果があることは全く知られていなかった。すなわち、本発明が提供するのは以下の通りである。
【０００８】
[１]
式（Ｉ）、
【化１】
（式中、Ｘは−ＣＨ２−、Ｒ１は炭素数１または２のアルキル基、ホルミル基、アセチル基、水素原子、ハロゲン原子、あるいは、Ｘは−（ＣＨ２）２−、Ｒ１は炭素数１〜３のアルキル基、ホルミル基、アセチル基、水素原子、ハロゲン原子を表す）で表される化合物をまたはその医薬として許容しうる塩を有効成分とする血管新生阻害剤。
【０００９】
[２]
Ｘが−ＣＨ２−、Ｒ１がホルミル基である[１]記載の血管新生阻害剤。
【００１０】
[３]
Ｘが−ＣＨ２−、Ｒ１が水素原子である[１]記載の血管新生阻害剤。
【００１１】
[４]
Ｘが−ＣＨ２−、Ｒ１がアセチル基である[１]記載の血管新生阻害剤。
【００１２】
[５]
Ｘが−（ＣＨ２）２−、Ｒ１が水素原子である[１]記載の血管新生阻害剤。
【００１３】
[６]
Ｘが−（ＣＨ２）２−、Ｒ１がホルミル基である[１]記載の血管新生阻害剤。
【００１４】
[７]
式（Ｉ）で表される化合物がＥ体である[１]〜[６]いずれか記載の血管新生阻害剤。
【００１５】
[８]
式（Ｉ）で表される化合物がＲ体である[１]〜[６]いずれか記載の血管新生阻害剤。
【００１６】
[９]
[１]〜[８]いずれか記載の血管新生阻害剤を含有する、癌あるいは糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症、乾癬、関節炎の治療または予防薬。
【００１７】
[１０]
[１]〜[８]いずれか記載の化合物を含有する組成物を用いた、血管新生阻害を目的とした治療または予防方法。
【００１８】
[１１]
[１]〜[８] いずれか１項記載の式（Ｉ）で表される化合物を有効成分とする癌転移抑制剤。
【００１９】
[１２]
[１]〜[８]いずれか記載の血管新生阻害剤または[１１]記載の癌転移抑制剤を含有する癌の治療または転移抑制薬。
【００２０】
[１３]
[１]〜[８]いずれか記載の化合物を含有する組成物を用いた、癌転移治療または癌転移予防方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、副作用が少ない、血管新生阻害剤および癌転移抑制剤を得ることが期待できる。これらは、癌等の疾病治療並びに予防に有効であり、医薬品や医薬部外品として用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下に、本発明の実施の形態を詳しく説明する。
本発明は、下記式（Ｉ）で表される化合物（化合物（Ｉ））を含有する血管新生阻害剤および癌転移抑制剤に関する。
式（Ｉ）
【化２】
上記式（Ｉ）のＲ１における炭素数１または２のアルキル基としては、メチル基、エチル基が挙げられ、る。Ｒ１におけるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子等が挙げられる。また、式（Ｉ）のＲ１における炭素数１〜３のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基等が挙げられる。
【００２３】
好適な実施態様としては、Ｘが−ＣＨ２−で、Ｒ１がホルミル基である化合物、Ｘが−ＣＨ２−で、Ｒ１が水素原子である化合物、Ｘが−ＣＨ２−で、Ｒ１がアセチル基である化合物、また別の好適な実施態様としては、Ｘが−（ＣＨ２）２−で、Ｒ１が水素原子である化合物、Ｘが−（ＣＨ２）２−で、Ｒ１がホルミル基である化合物が挙げられる。
【００２４】
また、上記（Ｉ）で表される化合物はＥ体であってもよいし、Ｚ体であってもよい。
【００２５】
より好ましい実施態様としては、式（Ｉ）のＸが−ＣＨ２−でＲ１がホルミル基か、Ｘが−（ＣＨ２）２−でＲ１が水素原子か、あるいはＸが−（ＣＨ２）２−で、Ｒ１がホルミル基であり、かつ、Ｅ体又はＺ体の化合物である。
【００２６】
上記化合物（Ｉ）の一例として、Ｎ−ホルミル−３,４−メチレンジオキシベンジリデン−γ−ブチロラクタム（ＫＮＫ４３７）が挙げられる。
【００２７】
式（Ｉ）で表される化合物の製造方法は、特に限定されないが、例えば、ＫＮＫ４３７を具体例に挙げると、以下の方法で得ることができる。まず、Ｎ−アセチル−２−ピロリドン（７０．０ｇ，０．５５ｍｏｌ）とピペロナール（８２．０ｇ，０．５５ｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（５００ｍｌ）溶液を、水素化ナトリウム（６０％鉱物油懸濁物、６３．０ｇ，１．５７ｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１０００ｍｌ）懸濁液に、アルゴン雰囲気下、氷冷しながら滴下した後、反応液を室温にて一晩撹拌する。得られた反応液を希硫酸で中和、クロロホルムで抽出、飽和食塩水で洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥したのち、濾過、減圧にて溶媒留去する。得られた反応物を２−プロパノールで再結晶することにより、Ｎ−ホルミル−３，４−メチレンジオキシベンジリデン−γ−ブチロラクタム（ＫＮＫ４３７）（７９．０ｇ，収率６５％）を得ることができる。
【００２８】
本発明でいう血管新生とは、既存の血管から新たな血管が分岐し、毛細血管となる現象である。血管新生は、癌あるいは糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症、乾癬、関節炎等の疾患に関与することが知られており、血管新生阻害剤はこれらの疾患治療に適応可能である。
【００２９】
癌の浸潤とは、癌細胞が周囲の組織、血液やリンパ管に入りこむことであり、また、癌転移とは癌が浸潤し、体の他の場所で腫瘍を形成することである。癌転移は多段階からなり、原発腫瘍から癌細胞が離脱し、癌細胞が血管やリンパ管へ侵入し、さらに離れた組織に癌細胞が定着し増殖することで起こる。癌浸潤のメカニズムは未だ完全には解明されていないが、細胞と細胞の接着が破壊されることに一つの原因があると推測されている。癌細胞は周囲の組織に広がっていき、元の腫瘍から癌細胞が離脱することで癌の転移が始まる。そのため、癌浸潤を抑制することは、血管を含めた周囲の組織への癌侵入や血管やリンパ球で運ばれた部位に癌細胞が定着することを抑制し、癌転移を抑制することができる。また、癌組織が大きくなるためには血液の供給が必要なため、癌組織は血管を新たに形成する血管新生が原発腫瘍および転移腫瘍に必須である。新しく形成された血管により癌細胞は増殖を続け、また同時にその血管は癌転移に必要な、癌細胞運搬路となっている。そのため、癌組織の血管新生を阻害した場合、栄養と酸素の不足により癌細胞の成育が阻害され、さらに癌転移が抑制される可能性がある。
【００３０】
本発明の血管新生阻害剤および癌転移抑制剤は、血管新生阻害および癌細胞の転移を抑制する効果を有するので、癌あるいは糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症、乾癬、関節炎等の疾患治療や予防薬の製造に用いることが出来る。
【００３１】
血管新生は、血管新生促進因子といわれる成長因子やサイトカインが血管に働き、さらにマトリックスメタロプロテナーゼ２（コラーゲン分解酵素）により血管基底膜のコラーゲンが溶解されることで、内皮細胞が血管新生部位に移動していき、その後、新しい血管が出来る。
【００３２】
癌細胞の転移（浸潤）を調べる方法の一つとして、例えば、Boyden Chamberと呼ばれる上下２層からなる培養器具を用いることができる。具体的には、上層の約８μｍの穴をもつ膜上に癌細胞株を播種し、培地を加えた下層への癌細胞移動を調べる方法である。
【００３３】
血管新生阻害作用を測定するための一つの方法として、正常ヒトさい帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）と皮膚繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）との共培養系モデルがある。この共培養系モデルを用いると、例えば、内皮細胞および内皮細胞間の接合部に高発現している抗ＣＤ３１抗体で管腔染色することにより、血管腔を観察することが出来る。この系を用いることにより、管腔形成阻害物質の評価を行うことが可能である。
【００３４】
血管新生のメカニズムは、遺伝子発現を解析することによりさらに詳細に調べることが出来る。例えばリアルタイムＰＣＲ技術を利用して血管新生に関連する遺伝子群の発現を解析することができ、正常ヒトさい帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いてその遺伝子発現を解析することも一つの方法である。リアルタイムＰＣＲ技術を利用し、血管新生阻害作用を持つ薬剤をＨＵＶＥＣ細胞培養時に添加して、血管新生に関連する遺伝子発現の変化を解析することは、そのメカニズム解明にも有用である。
【００３５】
血管新生に関与する遺伝子群としては、例えば血管新生を誘導する腫瘍増殖因子（ＴＧＦ−α）、細胞走化性を誘導するケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１、コラーゲンなどの細胞外構造を分解するマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）ファミリー、低血清下で増殖が抑制されている線維芽細胞の増殖を促進するマトリックスメタロプロテアーゼインヒビター３、などがある。ＨＵＶＥＣ細胞を用いた血管新生阻害効果試験において、薬剤処理等によるこれら遺伝子の発現低下は、血管新生阻害効果の作用メカニズムを示唆している。
【００３６】
また、癌転移抑制メカニズムは、癌転移に関連する遺伝子発現を解析することによりさらに詳細に調べることが出来る。例えばリアルタイムＰＣＲ技術を利用して癌転移に関連する遺伝子群の発現を解析することができ、癌細胞株を用いてその遺伝子発現を解析することも一つの方法である。用いる癌細胞は腺癌細胞や上皮癌細胞等、特に限定する必要はない。リアルタイムＰＣＲ技術を利用し、癌転移抑制作用を持つ薬剤を癌細胞培養時に添加して、癌転移に関連する遺伝子発現の変化を解析することは、そのメカニズム解明に有用である。
【００３７】
癌転移に関連する遺伝子群としては、コラーゲンなどの細胞外構造を分解するマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）ファミリー、癌浸潤のステップとしてＭＭＰの活性を調節するＭＭＰインヒビター、基底膜コラーゲンタイプＩＶのα鎖（ＣＯＬ４Ａ２）、などがある。癌細胞株を用いた癌転移抑制試験において、薬剤処理等によるこれら遺伝子の発現低下は、癌転移抑制効果のメカニズムを示唆している。
【００３８】
血管新生阻害効果および癌転移抑制効果を調べる別の方法として、マウスに癌を移植し、その癌組織への血管新生作用および癌浸潤作用を観察評価する方法がある。
癌細胞を移植したマウス（担癌マウス）を数週間飼育することで、癌細胞は増殖し腫瘍を形成する。薬剤を投与したマウスと薬剤を投与しないマウスの癌細胞を摘出し、組織染色後に血管腔を観察することにより血管新生を評価することができる。また、同じ担癌マウス試験により、腫瘍観察および腫瘍摘出後の重量測定で癌浸潤を評価することができる。用いる癌細胞は特に限定されないが、Ｃ３Ｈマウス頬部腫瘍由来癌細胞株（ＳＱ−１９７９）細胞などがある。
【００３９】
本発明の化合物は単独で使用できるが、他の薬剤を用いる化学療法、手術療法、放射線療法、温熱療法あるいは他の血管新生抑制療法と組み合わせて使用することもできる。
【００４０】
本発明化合物の投与方法としては経口、経腸または他の非経口的投与方法のいずれをも選ぶことができる。具体的な製剤形態としては特に限定されず、投与目的や投与経路等に応じて、たとえば錠剤、散剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤等の経口剤、又は坐剤、軟膏剤、注射剤、局所投与のクリーム若しくは点眼薬などの非経口剤をあげることができる。配合量に関しては特に規定するものではないが、所望の効果を奏する範囲内で適宜選択することができる。
【００４１】
本発明による製剤の担体としては経口、経腸、その他非経口的に投与するために適した有機または無機の固体または液体の任意成分を含有することができる。任意成分としては、一般に製剤に使用される結合剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤等の添加物を含有させることができる。結合剤の好適な例としてはデンプン、トレハロース、デキストリン、アラビアゴム末などが挙げられる。賦形剤の好適な例としては、しょ糖、乳糖、ブドウ糖、コーンスターチ、マンニト−ル、結晶セルロース、ゼラチン、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、植物性および動物性脂肪ならびに油、ペクチンなどが挙げられる。滑沢剤の好適な例としてはステアリン酸、タルク、ロウ、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。崩壊剤の好適な例としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチなどが挙げられる。安定剤の好適な例としては油脂、プロピレングリコールなどが挙げられる。乳化剤の好適な例としては、アニオン界面活性剤、非イオン性界面活性剤、ポリビニルアルコールなどが挙げられる。緩衝剤の好適な例としてはリン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液が挙げられる。
【００４２】
本発明の血管新生阻害剤および癌転移抑制剤を医薬部外品として製剤化して用いる場合は、必要に応じて他の添加剤などを添加して、例えば、軟膏、リニメント剤、エアゾール剤、クリーム、石鹸、洗顔料、全身洗浄料、化粧水、ローション、入浴剤などに使用することができ、局所的に用いることができる。
【００４３】
本発明の化合物は、製剤中に０．００１〜１００重量％含ませることができる。含有量は、好ましくは０．０１〜１００重量％、より好ましくは０．１〜９０重量％である。
これら製剤の投与量としては、当該抽出物換算で成人一人一日当たり、好ましくは０．００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．０１〜２００ｍｇ／ｋｇ体重を１回ないし数回に分けて投与する。
【００４４】
また本発明の血管新生阻害剤および癌転移抑制剤はその他の医薬を含むことができる。この場合、本発明化合物（Ｉ）は必ずしもその製剤中の主成分でなくてもよい。
以下に実施例を記載して、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、これらの実施例によって、本発明の範囲は限定的に解釈されるものではない。
【実施例】
【００４５】
以下に実施例を記載して、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、これらの実施例によって、本発明の範囲は限定的に解釈されるものではない。
【００４６】
（実施例１）ＫＮＫ４３７の濃度依存的血管新生阻害作用
血管新生キット（倉敷紡績株式会社、製品番号；ＫＺ−１１００）を使用し、製品説明書奨の方法に従って実験した。当該キットは正常ヒトさい帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）と皮膚繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）の共培養系モデルであり、２４穴プレートで管腔形成初期段階の増殖状態で提供される。血管新生専用培地に血管新生促進剤であるＶＥＧＦ−Ａ（キット付属）を添加したものを培地交換に用い、ＫＮＫ４３７を終濃度が、０（コントロール）、０．０１、０．１、１．０、１０、２０μＭになるよう各ウエルに添加した。炭酸ガスインキュベーターで３日間培養後、さらに４、７、９日目に各ＫＮＫ４３７濃度に設定した培地で培地交換した。１１日目にＰＢＳで洗浄後、１ｍｌ／ｗｅｌｌの７０％エタノールを加え、室温３０分静置により細胞固定した。さらに抗ＣＤ３１抗体を用いた管腔染色キット（倉敷紡績株式会社、製品番号；ＫＺ−１２２５）で各ウエルを染色し、形成された管腔を観察した。
その結果、ＫＮＫ４３７は濃度依存的に血管新生阻害作用を示した。
【００４７】
（実施例２）ＫＮＫ４３７の血管新生関連遺伝子発現低下作用
血管新生関連遺伝子発現の解析は、SABiosciences社のAngiogenesis ＲＴ２ ProfilerTM ＰＣＲ Arraysシステム（ＰＡＨＳ−０２４Ａ）を使用し、製品説明書の方法に従って実験した。ＫＮＫ４３７は、終濃度１０μＭで正常ヒトさい帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）へ添加し、炭酸ガスインキュベーターで３日間培養後、ＲＮＡを抽出した。さらにｃＤＮＡを調製後、ＲＴ２マスターミックスと混合し、ＰＣＲアレイプレート（９６穴）に添加した。ＰＣＲ装置（BIO-RAD社）でリアルタイムＰＣＲを実行後、Threshold Cycle (Ct)法によりデータ解析した。ＫＮＫ４３７投与後の発現量変化は、（ＫＮＫ４３７添加群の発現量）／（ＫＮＫ４３７非添加群の発現量）の比で表し、発現量が減少したものはマイナスの記号で表した。
【００４８】
【表１】
【００４９】
ＫＮＫ４３７投与群では、ＭＭＰファミリー等の血管新生関連の遺伝子発現が顕著に低下した。
【００５０】
（実施例３）ＫＮＫ４３７の癌転移関連遺伝子群発現低下作用
癌転移関連伝子発現の解析は、SABiosciences社のTumor Metastasis ＲＴ２ ProfilerTM ＰＣＲ Arraysシステム（ＰＡＨＳ−０２８Ａ）を使用し、製品説明書の方法に従って実験した。ヒト顎下腺由来腺癌細胞株（ＨＳＧ）、ヒト口腔扁平上皮癌細胞株（ＨＳＣ２、ＳＡＳ）を使用し、ＫＮＫ４３７はＨＳＧ細胞で終濃度１０μＭ、その他の細胞で終濃度４０μＭとなるよう培地へ添加し、炭酸ガスインキュベーターで３日間培養後、ＲＮＡを抽出した。さらにｃＤＮＡを調製後、ＲＴ２マスターミックスと混合し、ＰＣＲアレイプレート（９６穴）に添加した。ＰＣＲ装置（BIO-RAD社）でリアルタイムＰＣＲを実行後、Threshold Cycle (Ct)法によりデータ解析した。ＫＮＫ４３７投与後の発現量変化は、（ＫＮＫ４３７添加群の発現量）／（ＫＮＫ４３７非添加群の発現量）の比で表し、発現量が減少したものはマイナスの記号で表した。
【００５１】
【表２】
【００５２】
ＫＮＫ４３７投与群では、特にＭＭＰファミリー遺伝子群の遺伝子発現が顕著に低下した。
【００５３】
（実施例４）ＫＮＫ４３７の癌細胞株の癌転移抑制効果（浸潤抑制）
上下２層からなる２４ウェルタイプのBoyden Chamberを用い、８μｍの穴の開いたメンブレンを透過した細胞数を観察し、ＫＮＫ４３７の細胞浸潤阻害効果を調べた。Cell Invasion Assay Kit (CHEMICON International, Inc. No. ECM550)を使用し、製品説明書の方法に従って実験した。上層チャンバーには、浸潤型癌細胞株であるヒト顎下腺由来腺癌細胞株（ＨＳＧ）、ヒト口腔扁平上皮癌細胞株（ＨＳＣ２、ＳＡＳ、ＨＳＣ３、ＫＢ）をそれぞれ１．０ｘ１０６個／ｍｌ濃度で播種した。ＫＮＫ４３７はＨＳＧ細胞で終濃度１０μＭ、その他の細胞で終濃度４０μＭとなるよう下層チャンバーに添加し、炭酸ガスインキュベーターで３日間培養後、メンブレンを透過して移動した細胞を染色し、浸潤抑制効果についてＫＮＫ４３７未添加のコントロール群と比較し評価した。
【００５４】
【表３】
【００５５】
浸潤型癌細胞株のＨＳＧ、ＨＳＣ２、ＳＡＳ、ＨＳＣ３、ＫＢ、において、ＫＮＫ４３７投与群はＫＮＫ４３７非投与コントロール群と比較し浸潤抑制効果を示し、癌転移抑制効果が認められた。
【００５６】
（実施例５）ＫＮＫ４３７の坦癌マウスにおける癌転移抑制（血管新生阻害）効果
Ｃ３Ｈマウス頬部腫瘍由来癌細胞株ＳＱ−１９７９を、Ｃ３Ｈマウス（５週齢、雄）の背部皮下に接種し１週間後に腫瘍の形成を確認した。癌細胞移植後１週間目からＫＮＫ４３７をオリーブオイルに懸濁し、１００ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。ＫＮＫ４３７非投与群にはオリーブオイルのみ投与した。３週間隔日投与を行った後、腫瘍を摘出して組織染色により血管腔の形成を顕微鏡観察した。結果を図１に示す。
【００５７】
図１の結果からわかるように、ＫＮＫ４３７投与群では、血管腔の形成が抑制された。
【００５８】
（実施例６）ＫＮＫ４３７の坦癌マウスにおける癌転移抑制（癌浸潤抑制）効果
Ｃ３Ｈマウス頬部腫瘍由来癌細胞株ＳＱ−１９７９を、Ｃ３Ｈマウス（５週齢、雄）の背部皮下に接種し１週間後に腫瘍の形成を確認した。癌細胞移植後１週間目からＫＮＫ４３７をオリーブオイルに懸濁し、１００ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。コントロール群はＫＮＫ４３７を投与せずオリーブオイルのみ投与した。３週間隔日投与を行った後、移植した背部を開き腫瘍の浸潤程度を目視で観察した。結果を図２に示す。
【００５９】
図２の結果からわかるように、ＫＮＫ４３７はマウス癌細胞株の浸潤を抑制した。ＫＮＫ４３７投与群で顕著に腫瘍の大きさが小さかった。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明によれば、副作用が少ない、血管新生阻害剤および癌転移抑制剤を得ることができ、これらは、癌等の疾病治療並びに予防に有効であり、医薬品や医薬部外品として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】マウス背部皮下に接種したＣ３Ｈマウス頬部腫瘍由来癌細胞株（ＳＱ−１９７９）を用いたＫＮＫ４３７の血管腔形成抑制効果を示す。
【図２】マウス背部皮下に接種したＣ３Ｈマウス頬部腫瘍由来癌細胞株（ＳＱ−１９７９）を用いたＫＮＫ４３７の癌浸潤抑制効果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
（式中、Ｘが−ＣＨ２−で、かつＲ１が炭素数１または２のアルキル基、ホルミル基、アセチル基、水素原子又はハロゲン原子を表すか、あるいは、Ｘが−（ＣＨ２）２−で、かつＲ１が炭素数１〜３のアルキル基、ホルミル基、アセチル基、水素原子又はハロゲン原子を表す）で表される化合物を有効成分とする血管新生阻害剤。
【請求項２】
Ｘが−ＣＨ２−、Ｒ１がホルミル基である請求項１記載の血管新生阻害剤。
【請求項３】
Ｘが−ＣＨ２−、Ｒ１が水素原子である請求項１記載の血管新生阻害剤。
【請求項４】
Ｘが−ＣＨ２−、Ｒ１がアセチル基である請求項１記載の血管新生阻害剤。
【請求項５】
Ｘが−（ＣＨ２）２−、Ｒ１が水素原子である請求項１記載の血管新生阻害剤。
【請求項６】
Ｘが−（ＣＨ２）２−、Ｒ１がホルミル基である請求項１記載の血管新生阻害剤。
【請求項７】
式（Ｉ）で表される化合物がＥ体である請求項１〜６いずれか記載の血管新生阻害剤。
【請求項８】
式（Ｉ）で表される化合物がＺ体である請求項１〜６いずれか記載の血管新生阻害剤。
【請求項９】
請求項１〜８いずれか記載の血管新生阻害剤を含有する、癌あるいは糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症、乾癬、関節炎の治療または予防薬。
【請求項１０】
請求項１〜８いずれか記載の化合物を含有する組成物を用いた、血管新生阻害を目的とした治療または予防方法。
【請求項１１】
請求項１〜８いずれか１項記載の式（Ｉ）で表される化合物を有効成分とする癌転移抑制剤。
【請求項１２】
請求項１〜８いずれか記載の血管新生阻害剤または請求項１１記載の癌転移抑制剤を含有する癌の治療または転移抑制薬。
【請求項１３】
請求項１〜８いずれか記載の化合物を含有する組成物を用いた、癌転移治療または癌転移予防方法。
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
（式中、Ｘが−ＣＨ２−で、かつＲ１が炭素数１または２のアルキル基、ホルミル基、アセチル基、水素原子又はハロゲン原子を表すか、あるいは、Ｘが−（ＣＨ２）２−で、かつＲ１が炭素数１〜３のアルキル基、ホルミル基、アセチル基、水素原子又はハロゲン原子を表す）で表される化合物を有効成分とする血管新生阻害剤。
【請求項２】
Ｘが−ＣＨ２−、Ｒ１がホルミル基である請求項１記載の血管新生阻害剤。
【請求項３】
Ｘが−ＣＨ２−、Ｒ１が水素原子である請求項１記載の血管新生阻害剤。
【請求項４】
Ｘが−ＣＨ２−、Ｒ１がアセチル基である請求項１記載の血管新生阻害剤。
【請求項５】
Ｘが−（ＣＨ２）２−、Ｒ１が水素原子である請求項１記載の血管新生阻害剤。
【請求項６】
Ｘが−（ＣＨ２）２−、Ｒ１がホルミル基である請求項１記載の血管新生阻害剤。
【請求項７】
式（Ｉ）で表される化合物がＥ体である請求項１〜６いずれか記載の血管新生阻害剤。
【請求項８】
式（Ｉ）で表される化合物がＺ体である請求項１〜６いずれか記載の血管新生阻害剤。
【請求項９】
請求項１〜８いずれか記載の血管新生阻害剤を含有する、癌あるいは糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症、乾癬、関節炎の治療または予防薬。
【請求項１０】
請求項１〜８いずれか記載の化合物を含有する組成物を用いた、血管新生阻害を目的とした治療または予防方法。
【請求項１１】
請求項１〜８いずれか１項記載の式（Ｉ）で表される化合物を有効成分とする癌転移抑制剤。
【請求項１２】
請求項１〜８いずれか記載の血管新生阻害剤または請求項１１記載の癌転移抑制剤を含有する癌の治療または転移抑制薬。
【請求項１３】
請求項１〜８いずれか記載の化合物を含有する組成物を用いた、癌転移治療または癌転移予防方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１０−９５４６２（Ｐ２０１０−９５４６２Ａ）
【公開日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２６６６１２（Ｐ２００８−２６６６１２）
【出願日】平成２０年１０月１５日（２００８．１０．１５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年４月１６日 ＮＰＯ法人日本歯科放射線学会発行の「第４９回学術大会 プログラム・講演抄録集」に発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年５月１６日〜１８日 ＮＰＯ法人日本歯科放射線学会主催の「第４９回学術大会」において発表
【出願人】（５０４１４７２４３）国立大学法人 岡山大学 (444)
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月１５日（２００８．１０．１５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年４月１６日 ＮＰＯ法人日本歯科放射線学会発行の「第４９回学術大会 プログラム・講演抄録集」に発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年５月１６日〜１８日 ＮＰＯ法人日本歯科放射線学会主催の「第４９回学術大会」において発表
【出願人】（５０４１４７２４３）国立大学法人 岡山大学 (444)
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
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