表面プラズモン励起増強蛍光分光法を利用して蛍光量を測定する定量分析方法ならびにそれに用いられる定量分析用キットおよびアナライト解離抑制剤
【課題】表面プラズモン励起増強蛍光分光法を利用して蛍光量を測定する定量分析方法において、リガンド−アナライト間の解離を抑制することができ、得られるシグナルの変動が抑制された高感度且つ高精度な検出を行うことができる定量分析方法、ならびにそれに用いられる定量分析用キット及びアナライト解離抑制剤を提供すること。
【解決手段】本発明の定量分析方法は、特定のセンサチップと、ナノ構造粒子、および特定の第３リガンドを有し、特定の第２リガンドと、該第３リガンドが該ナノ構造粒子上に固定されてなるナノ構造体とを用いた、表面プラズモン励起増強蛍光分光法によるアナライトの定量分析方法であって、所定の工程を実施することを特徴とする。
【解決手段】本発明の定量分析方法は、特定のセンサチップと、ナノ構造粒子、および特定の第３リガンドを有し、特定の第２リガンドと、該第３リガンドが該ナノ構造粒子上に固定されてなるナノ構造体とを用いた、表面プラズモン励起増強蛍光分光法によるアナライトの定量分析方法であって、所定の工程を実施することを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン共鳴現象を応用した表面プラズモン励起増強蛍光分光法を用いて蛍光を測定する分析方法ならびにそれに用いられる定量分析用キットおよびアナライト解離抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、ナノメートルレベルの微細金属近傍において電子と光が共鳴する現象（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）現象や局在プラズモン共鳴（ＬＰＲ； Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ））を応用し、例えば生体内の極微少なアナライト（測定対象物）の検出が行われている。例えば、ＳＰＲ現象を応用した特定のアナライトの検出に用いられる測定としてＳＰＲ測定がある。ＳＰＲ測定は、プリズムなどの誘電体部材上に形成された金などの金属薄膜上においてＳＰＲ現象を誘起することで、金属薄膜上の極小さな屈折率変化を測定することを原理としている。例えば、アナライトに特異的に結合するリガンドを金属薄膜上に固定し、該金属薄膜上に特定のアナライトを含んだ試料を供給することで、特定のアナライトのリガンドへの結合によって屈折率変化が誘起され、特定のアナライトの定量分析が可能となる。
【０００３】
このようなＳＰＲ現象を応用した他の測定として、近年、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）を利用した測定方法（ＳＰＦＳ測定）が開発されている。このＳＰＦＳ測定は、励起光と金属薄膜中の電子振動がカップリングすることで形成される増強電場を励起エネルギーとして、リガンドに特異的に結合したアナライトを標識する蛍光色素が発する蛍光を測定する方法である。金属薄膜の極表面に形成される増強電場を利用した蛍光色素の蛍光発光を測定するため、例えば、リガンド−アナライト間の結合等によって増強電場中に配置された蛍光色素からの蛍光シグナルを極めて効率的に測定することが可能で、高いシグナル（Ｓ）と低いノイズ（Ｎ）に裏付けられた高感度かつ高精度な分析（高いＳ／Ｎ比）により、ＳＰＲ測定による屈折率変化の測定よりもさらに高精度に特定のアナライトの定量分を行うことができる。
【０００４】
このようなＳＰＦＳを利用して蛍光量を測定する特定のアナライトの定量分析において、本出願人は、さらに高いＳ／Ｎ比を得るための改良を施した、技術を既に出願している（例えば、特許文献１）。この特許文献１には、金属薄膜上にアナライトと特異的に結合するリガンド（以下、第１リガンドともいう）を備えたセンサに、特定のアナライトを含む溶液を供給して第１リガンドにアナライトを補足させ、アナライトを標識するための蛍光色素を有し且つアナライトと特異的に結合するリガンド（以下、第２リガンドともいう）を含む溶液を供給して第１リガンドと結合されたアナライトに、該アナライトを標識するための蛍光色素を有する第２リガンドを結合させ、その後、金属コロイド粒子を分散させたコロイド液を供給しつつ蛍光色素の蛍光量を測定することで、通常の表面プラズモン共鳴による電場増強効果に、該金属コロイド粒子からの局在プラズモン共鳴による電場増強効果を組み合わせて、通常の表面プラズモン共鳴による蛍光量の測定よりも、さらに蛍光増幅を図り、より高いＳ／Ｎ比を得る高感度かつ高精度にアナライトの定量分析を行う方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−１４５２７２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１に記載の定量分析方法は、ＳＰＦＳを利用して蛍光量を測定するアナライトの定量分析において、より高いＳ／Ｎ比を得るための一つの手法である。しかしながら、特許文献１には、第１リガンドとアナライトとの結合や該アナライトと第２リガンドとの結合といった、リガンド−アナライト間の結合そのものに関する課題については何ら言及されていない。上記記載の技術のようにリガンド−アナライト間の結合により金属薄膜の極表面に局在化された蛍光色素に基づくアナライトの定量分析においては、リガンド−アナライト間の結合が解離すること（以下、リガンド−アナライト間の解離ともいう）によって一旦は局在化された蛍光色素が分散してしまうといった問題がある。特に、ＳＰＦＳを利用して蛍光量を測定する定量分析においては、蛍光色素の存在が必須であり、蛍光性を有しないアナライトを分析するにあたっては、金属膜上に設けられ、アナライトと特異的に結合する第１リガンド以外に、該第１リガンドに捕捉されたアナライトを第１リガンドとサンドイッチするような形態でアナライトと特異的に結合する、蛍光色素を有する第２リガンドが多用される。そのため、１つのアナライトに対して、少なくとも二個以上のリガンド（第１リガンド及び第２リガンド）が必要なＳＰＦＳ測定では、ＳＰＲ測定よりもリガンド−アナライト間の解離が生じてしまう危険性が高いと言える。
【０００７】
このことは特に、精度が要求されるＳＰＦＳ測定にとって、本来のシグナル（Ｓ）を失うことによるＳ／Ｎ比の低下や変動を生じさせる致命的な問題である。このような問題がＳＰＦＳを利用して蛍光量を測定する定量分析の汎用を困難にさせている要因の一つとなっていることがわかった。
【０００８】
本発明は、上記の点に鑑みてなされたものであり、表面プラズモン励起増強蛍光分光法を利用して蛍光量を測定する定量分析方法において、リガンド−アナライト間の解離を抑制することができ、得られるシグナル（以下、アッセイ発光シグナルともいう）の変動が抑制された高感度且つ高精度な検出を行うことができる定量分析方法、ならびにそれに用いられる定量分析用キット及びアナライト解離抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係るアナライトの定量分析方法は、透明支持体、該透明支持体上に形成された金属膜、および該金属膜上に固定され、かつアナライトに特異的に結合する第１リガンドを備えたセンサチップと、表面プラズモンにより励起されて蛍光する蛍光色素を有し、かつ前記アナライトに特異的に結合する第２リガンドと、ナノ構造粒子、および第２リガンドに特異的に結合する第３リガンドを有し、該第３リガンドが該ナノ構造粒子上に固定されてなるナノ構造体とを用いた、表面プラズモン励起増強蛍光分光法によるアナライトの定量分析方法であって、下記工程（ａ）〜（ｃ）を実施して、下記工程（ｄ）を実施することを特徴とする。
【００１０】
工程（ａ）：前記センサチップ上の第１リガンドと前記アナライトとを接触させて、該第１リガンドにアナライトを結合させる工程
工程（ｂ）：前記第２リガンドと前記アナライトとを接触させて、該第２リガンドにアナライトを結合させる工程
（ｃ）：前記第２リガンドに前記ナノ構造体を接触させて、該第２リガンドにナノ構造体を結合させる工程
（ｄ）：前記センサチップの透明支持体を介して前記金属膜に励起光を照射して表面プラズモンを生じさせ、該表面プラズモンにより蛍光色素を励起させて蛍光を生じさせ、該蛍光の蛍光量を測定する工程
【００１１】
本発明の定量分析方法において、前記ナノ構造体の体積平均粒径は、１ｎｍ以上、５０ｎｍ以下であることが好ましい。
本発明の定量分析方法において、前記ナノ構造体は、前記ナノ構造粒子上に複数の前記第３リガンドが固定されてなることが好ましい。
【００１２】
本発明の定量分析方法において、前記ナノ構造体は、前記ナノ構造粒子上に、前記第２リガンドおよび第１リガンドに特異的に結合する第３リガンド（Ａ）が、および／または、第３リガンドと、第１リガンドに特異的に結合する第３´リガンドとが固定されてなり、前記工程（ａ）〜（ｂ）を任意の順でまたは同時に実施して、工程（ｃ）〜（ｄ）を順次実施し、工程（ｃ）において、前記ナノ構造体を前記第２リガンドに接触させるとともに、前記第１リガンドにも接触させて、前記ナノ構造体に前記第２リガンドおよび前記第１リガンドを結合させる工程を実施することが好ましい。
【００１３】
本発明の定量分析方法において、前記ナノ構造体は、金属で構成されたナノ構造粒子を含むことが好ましい。
本発明の定量分析方法において、前記工程（ａ）、前記工程（ｂ）及び前記工程（ｃ）を順次実施することが好ましい。
【００１４】
本発明の定量分析方法において、前記センサチップが、金属膜上に、さらにカルボキシメチルデキストラン層を備え、前記第１リガンドが該カルボキシメチルデキストラン層に固定化されてなることが好ましい。
【００１５】
本発明に係る表面プラズモン励起増強蛍光分光法によるアナライトの定量分析に用いるためのキットは、透明支持体、該透明支持体上に形成された金属膜、および該金属膜上に固定され、かつアナライトに特異的に結合する第１リガンドを備えたセンサチップと、表面プラズモンにより励起されて蛍光する蛍光色素を有し、かつ前記アナライトに特異的に結合する第２リガンドと、ナノ構造粒子、および第２リガンドに特異的に結合する第３リガンドを有し、該第３リガンドが該ナノ構造粒子上に固定されてなるナノ構造体とを含むことを特徴とする。
【００１６】
本発明に係るアナライト解離抑制剤は、透明支持体、該透明支持体上に形成された金属膜、および該金属膜上に固定され、かつアナライトに特異的に結合する第１リガンドを備えたセンサチップと、表面プラズモンにより励起されて蛍光する蛍光色素を有し、かつ前記アナライトに特異的に結合する第２リガンドと、ナノ構造粒子、および第２リガンドに特異的に結合する第３リガンドを有し、該第３リガンドが該ナノ構造粒子上に固定されてなるナノ構造体とを用いた、表面プラズモン励起増強蛍光分光法によるアナライトの定量分析方法において、第１リガンドおよび第２リガンドとアナライトとの解離を抑制するために使用され、ナノ構造粒子、および第２リガンドに特異的に結合する第３リガンドを有し、該第３リガンドが該ナノ構造粒子上に固定されてなるナノ構造体を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１７】
本発明に係る、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）を利用して蛍光量を測定する定量分析方法は、特定のナノ構造体を用いることで、測定対象物（アナライト）と第１リガンド（アナライトに対して特異的な結合性を有する分子）間の解離や、アナライトと蛍光色素を有する第２リガンド（アナライトに対して特異的な結合性を有する分子）間の解離を抑制することができ、本来の測定されるべきシグナルの変動を抑制することができる。そのため、本発明は、従来よりも高感度且つ高精度な検出を行うことができる定量分析方法、ならびに該定量分析方法に用いられ、高感度且つ高精度な検出を可能にする定量分析用キットおよびアナライト解離抑制剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ナノ構造体を示した図面である。図１（ａ）は、ナノ構造粒子１粒子あたりに一つの第３リガンドを備えるナノ構造体の形態を示す図面である。図１（ｂ）は、ナノ構造粒子１粒子あたりに二つの第３リガンドを備えるナノ構造体の形態を示す図面である。図１（ｃ）は、ナノ構造粒子１粒子あたりに四つの第３リガンドを備えるナノ構造体の形態を示す図面である。
【図２】図２は、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）を利用する蛍光定量分析において、ナノ構造体を用いた際のＳＰＦＳセンサチップ表面の好ましい一態様を模式的に示した概念図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）を利用して蛍光量を測定する定量分析方法において、少なくとも第２リガンドに対して結合性を有する第３リガンドとナノ構造粒子を有するナノ構造体を、該第２リガンドに接触させる工程を有することを特徴とし、好ましくはＳＰＦＳセンサチップ表面にあらかじめ固定化されている第１リガンドに対しても結合性を有する第３リガンドとナノ構造粒子を有するナノ構造体を、該第１リガンドにも接触させる工程を有することである。このような工程を有することにより、リガンド−アナライト間の解離を抑制することができる。
【００２０】
なお、リガンド−アナライト間の解離抑制とは、第１リガンドとアナライト間の解離抑制、あるいは第２リガンドとアナライト間の解離抑制を指し、ナノ構造体は、少なくともどちらか一方の解離を抑制するものである。
【００２１】
また、第３リガンドを有するナノ構造体の好ましい形態としては、一つのナノ構造粒子に対し、二つ以上の（複数の）第３リガンドを有する形態である。このように、一つのナノ構造粒子中の二つ以上の（複数の）第３リガンドを各々、上記工程（Ｃ）において、第２リガンドに、好ましくは第２リガンドや第１リガンドに結合させる際に、ナノ構造粒子１粒子中１つの第３リガンドを有する形態に比較して、第３リガンドが上記リガンドに強固に結合するので、効果的に解離を抑制することができる。
【００２２】
すなわち、一つのナノ構造粒子に対し二つ以上の第３リガンドが固定されていると、それぞれの第３リガンドが各々異なる第２リガンドに結合することができる。さらには、後述するように、前記ナノ構造体は、前記ナノ構造粒子上に、前記第２リガンドおよび第１リガンドに特異的に結合する第３リガンド（Ａ）が、および／または、第３リガンドと、第１リガンドに特異的に結合する第３´リガンドとが固定されてなる場合、第３リガンド（Ａ）が第２リガンドだけでなく第１リガンドにも結合したり、第３リガンドおよび第３´リガンドがそれぞれ第２リガンドおよび第１リガンドに結合したりすることが可能となる。
【００２３】
このような場合、ナノ構造体により第２リガンド−第２リガンド間や第２リガンド−第１リガンド間を架橋する形態となり、リガンド−アナライト間の解離を効果的に抑制することができる。
【００２４】
なお、ナノ構造体が、一つのナノ構造粒子に対し、一つの第３リガンドを有する形態である場合、第２リガンドに対する結合部位が異なるリガンドを有する２種類以上のナノ構造体を使用することが好ましい。このようなナノ構造体を用いると、アナライトに結合した第２リガンドに、各異なる部位で複数のナノ構造体が結合して、アナライトが解離し難い構造を採ることができる。
【００２５】
以下、本発明のＳＰＦＳを利用して蛍光量を測定する定量分析方法及び蛍光定量分析用キットについて具体的に説明する。
なお、本発明では、蛍光分析の対象となる物質（主に生体関連物質）を「アナライト」と称し、アナライトと特異的に結合する物質を「第１リガンド及び第２リガンド」と称する。第１リガンドは、アナライトに対して特異的な結合性を有し、ＳＰＦＳセンサチップ表面にあらかじめ固定化されている分子である。第２リガンドは、アナライトに対して特異的な結合性を有し、蛍光性を有する分子である。
【００２６】
そして、ナノ構造体の構成物であり、少なくとも第２リガンドに対して特異的な結合性を有するリガンドを「第３リガンド」と称し、「第３リガンド」の中でも、第１リガンドに対しても特異的な結合性を有するリガンドを「第３リガンド（Ａ）」と称する。
【００２７】
〈ナノ構造体〉
本発明に係るナノ構造体は、図１（ａ）〜（ｃ）に示すように、ナノ構造粒子１、および第２リガンドに特異的に結合する第３リガンド２を有し、該第３リガンド２が該ナノ構造粒子上に固定されてなり、第１リガンドとアナライト間の解離、または第２リガンドとアナライト間の解離を抑制する目的で用いられる。
【００２８】
ナノ構造体として、図１（ａ）は、ナノ構造粒子１に第３リガンド２が一つ固定されてなる態様（ナノ構造体Ａ）、図１（ｂ）は、ナノ構造粒子１に第３リガンド２が二つ固定されてなる態様（ナノ構造体Ｂ）、図１（ｃ）は、ナノ構造粒子１に第３リガンド２が四つ固定されてなる態様（ナノ構造体Ｃ）を示す。このように、本発明に係るナノ構造体は、一つのナノ構造粒子に対し、１つ以上の第３リガンドが結合しているものであり、好ましい態様としては２つ以上（複数）の第３リガンドが結合しているものである。ナノ構造粒子に結合する第３リガンドの数を２つ以上にするには、例えば、ナノ構造体を作製する際に、単純にナノ構造粒子の数に対し第３リガンドの数を増やして結合させることで可能である。具体的には、ナノ構造粒子に第３リガンドを１つ結合させる場合に比べて、第３リガンドの濃度を高くすることで２つ以上結合させることができる。
【００２９】
ナノ構造粒子と第３リガンドとの結合（第３リガンドの固定化）は、物理吸着によるものや化学吸着によるものに限定されない。化学吸着としては、本来の（修飾されていない）第３リガンドがナノ構造粒子と直接反応して結合する場合に限らず、いわゆるリンカー分子、スペーサー分子のように、本来は結合し得ない２つの物質を連結する機能を果たす所定の分子を介してそれらが結合する場合や、ナノ構造粒子（コア）の表面に特定の被覆層（シェル）が形成されていて、第３リガンドがその被覆層と結合する（第３リガンドが被覆層を介してナノ構造粒子に結合する）場合などがあげられる。また、これらの結合が直接的であるか間接的であるかも問わない。後述する蛍光色素と第２リガンドとの結合についても同様である。
【００３０】
第３リガンドは、公知の方法に従ってナノ構造粒子上（ナノ構造粒子の表面またはナノ構造粒子の表面に形成された被覆層）に結合し得る（固定され得る）。例えば、ナノ構造粒子上（ナノ構造粒子の表面またはナノ構造粒子の表面に形成された被覆層）に結合する官能基（チオール基、シラノール基等）を一端に有し、もう一端に第３リガンドと結合しうる官能基（アミノ基、カルボキシル基、水酸基等）を有する分子（ＳＡＭ、シランカップリング剤など）を用いて、第３リガンドをナノ構造粒子上（ナノ構造粒子の表面またはナノ構造粒子の表面に形成された被覆層）に結合させることができる。このような官能基を有する分子であるＳＡＭ試薬としては、例えば１０−カルボキシ−１−デカンチオール、７−カルボキシ−１−ヘプタンチオール、５−カルボキシ−１−ペンタンチオール、チオセミカルバジド、チオ尿素、チオアセトアミド、チオカルバジド（チオカルボヒドラジド）、１１−アミノ−１−ウンデカンチオール、８−アミノ−１−オクタンチオール、６−アミノ−１−ヘキサンチオールが挙げられる。また、シランカップリング剤としては、たとえば（Ｍｅ）2ＳｉＣｌ−（ＣＨ2）m−ＣＯ−ＮＨＳ、２−（３，４−エポキシシクロヘキシル）エチルトリメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−２−（アミノエチル）−３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−２−（アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−２−（アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシランが挙げられる。第３リガンドをナノ構造粒子上に固定するにあたっては、上記のような分子を先に第３リガンドと反応させて第３リガンド誘導体を調製し、得られた第３リガンド誘導体をナノ構造粒子の表面または上記被覆層と反応させてもよいし、また先にナノ構造粒子の表面または上記被覆層と反応させて、そのような分子で表面が修飾されたナノ構造粒子に第３リガンドを反応させてもよい。反応条件を調整することにより、ナノ構造粒子に結合する第３リガンドの数（密度）を増減させることも可能である。
【００３１】
〈第３リガンド〉
第３リガンドは、後述する第２リガンドに反応性を有するものであり、好ましくは第１リガンドにも反応性を有する（第２リガンドおよび第１リガンドに特異的に結合する機能を有する）リガンド（第３リガンド（Ａ））である。また、ナノ構造体は、前記ナノ構造粒子上に、第３リガンドとして、第３リガンド（Ａ）が固定されてなることや、前記ナノ構造粒子上に、第３リガンドと、第１リガンドに特異的に結合する第３´リガンドとが固定されてなることが好ましい。本発明の定量分析方法において、このようなナノ構造体を用いる場合、前記工程（ａ）〜（ｂ）を任意の順でまたは同時に実施して、工程（ｃ）〜（ｄ）を順次実施し、工程（ｃ）において、前記ナノ構造体を前記第２リガンドに接触させるとともに、前記第１リガンドにも接触させて、ナノ構造体に前記第２リガンドおよび第１のリガンドを結合させる工程を実施する。
【００３２】
なお、第３リガンドは、少なくとも第２リガンドに反応し得る分子または分子断片であるが、このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、上記「タンパク質」としては、例えば、抗体などが挙げられ、具体的には、抗αフェトプロテイン〔ＡＦＰ〕モノクローナル抗体（（株）日本医学臨床検査研究所などから入手可能）、抗ガン胎児性抗原〔ＣＥＡ〕モノクローナル抗体、抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体、抗ＰＳＡモノクローナル抗体及び抗ｃＴｎｌモノクローナル抗体などが挙げられる。
【００３３】
なお、本明細書において、「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、遺伝子組換えにより得られる抗体、および抗体断片を包含する。抗体断片は、例えば、抗体（Ｆａｂ領域およびＦｃ領域を含む全体）ではなく、Ｆａｂ、Ｆａｂ‘、Ｆ（ａｂ’）2などの抗原認識部位を有する抗体断片などである。
【００３４】
〈ナノ構造粒子〉
本発明に係るナノ構造体の一部を構成するナノ構造粒子は、たとえば、その体積平均粒径が１ｎｍ以上、１００ｎｍ以下の範囲にあるものを指し、その形状及び材質は特に限定されない。好ましくは体積平均粒径が１以上、５０ｎｍ以下の範囲にあるものであり、上記ナノ構造粒子の大きさの平均が、そのような範囲にあるナノ構造粒子の集団を利用することが好適である。なお、ナノ構造粒子が被覆層を有する場合には、被覆層を含めた大きさが上記の範囲であることを意味する。また、本発明におけるナノ構造粒子は、微細粒子の集合体であってもよい。ＳＰＦＳ法を用いた蛍光量測定では、蛍光色素を励起するため表面プラズモンを用いるが、この表面プラズモンは、後述する金属膜の厚さ、励起波長、誘電体屈折率等の条件によっては、金属膜上２００以上、３００ｎｍ以下の範囲と限られた領域にしか生じないため、ナノ構造粒子の体積平均粒径が１００ｎｍを超えてしまうと、蛍光色素からの発光を該ナノ構造粒子が遮光してしまう可能性が高くなり蛍光色素からの蛍光量を測定できず、アナライトの高感度検出には不向きである。上述のナノ構造粒子の体積平均粒径は、例えば、ナノトラック粒度分布測定装置 ＵＰＡ−ＥＸ１５０（日機装製、動的光散乱法／レーザードップラー法）で測定されたものである。具体的な測定方法としては、ナノ構造粒子が分散された分散液を測定濃度範囲に調整して測定する。その際、あらかじめ分散液の分散溶媒のみでバッククラウンド測定をしておく。この測定法により、本発明で用いられるナノ構造粒子の体積平均粒径範囲を測定することが可能である。
【００３５】
形状については、任意の形状のものでよく、例えば、球状、楕円状または円柱状などの形状を有するものも挙げられるが、好ましい形状としては球状である。このように本発明のナノ構造粒子は様々な形状を有するものであり、様々な形状のなか体積平均粒径が１ｎｍ以上、１００ｎｍ以下の範囲にあるものとは、そのナノ構造粒子が取り得る最大の大きさ（長さ）が１ｎｍ以上、１００ｎｍ以下の範囲にあるものを指し、例えばナノ構造粒子が長方体に近いような形状の場合、対角線の長さが１ｎｍ以上、１００ｎｍ以下の範囲にあるものである。上記の体積平均粒径の測定方法は、既存の測定装置等で測定できる。例えば、電子顕微鏡による目視の測定や、粒度分布測定装置により体積粒度分布から体積平均粒子径の測定が挙げられる。ナノ構造粒子に前述の第３リガンドが結合している場合は、第３リガンドを処理してからナノ構造粒子を測定する。処理方法としては、ナノ構造粒子の構造が壊れたり、その特性を失ったりしなければ特に限定はなく、例えば、第３リガンドを酸やアルカリで処理したり、熱をかけて処理したり、あるいは紫外線を照射して処理したりすることができる。
【００３６】
材質については、有機物質、無機物質あるいはこれらのハイブリット物質等に限定されないが、好ましくは無機物質であり、無機物質の中でも金属が好ましく用いられる。金属の種類としては、特に限定されるものではないが、金、銀、銅、アルミニウム、白金、亜鉛、またはこれら２種以上の合金が好ましい。また、半導体素材であるＣｄＳｅやＣｄＴｅといったナノメートル−スケールの結晶から成る物質を用いることもできる。これらの半導体素材は光学特性を改良するため半導体シェル（ＺｎＳ） がコーティングされていても良い。
【００３７】
さらに、酵素などのタンパク質を用いることもできる。このタンパク質には、アミノ酸 だけからなる単純タンパク質や、核酸 ・リン酸 ・脂質 ・糖・金属 などを含む複合タンパク質 等に限定されない。また、分子の形状も、繊維状タンパク質 や、球状タンパク質 等に限定されるものではない。
【００３８】
具体的なナノ構造粒子として好ましく用いられるのは、金属粒子である。金属粒子の場合には、さらに局在プラズモンを誘起させることが可能である。このような金属粒子と第３リガンドを有するナノ構造体を、励起された表面プラズモンの電場増強効果が生じる金属膜から２００ｎｍ程度の範囲に配置することで、局在プラズモンを誘起させると共にアナライトとリガンドとの解離を抑制することができる。この局在プラズモンは、表面プラズモンによる電場増強効果と合わさることにより、電場増強効果は非常に高くなり、その電場増強効果は、金属粒子が存在しない場合と比べて７０倍程度に上る。金属粒子を構成する金属種には、特に制限はないものの、試料等に対する化学的安定性が高く、可視光によりプラズモン共鳴が効率的に発生することから、金、銀、白金等の金属、あるいはこれらの合金が好ましく、その中で、金が特に好ましい。また、この金属粒子を構成する金属は、後述する金属膜を構成する金属と同じでもよく、あるいは異なっていてもよい。
【００３９】
このような金属粒子は、様々な粒径を有する金属粒子のコロイド溶液の形態で市販品として入手可能である。あるいは、このような金属粒子を、従来公知の方法、例えば、ＨＡｕＣｌ4、Ｈ2ＰｔＣｌ4、硝酸銀などの金属化合物の溶液を還元することによって得ることもできる。
【００４０】
また、この「コロイド液」中での金属粒子の分散性を向上させ、また、非特異吸着を防止するため、金属粒子の表面にＰＥＧ（ポリエチレングリコール）修飾等の表面処理を施すことが望ましい。ＰＥＧ修飾金属コロイド粒子は、例えば、特開２００１−２０００５０号公報および特開２００５−３２８８０９号公報等に記載されているように、メルカプト基またはポリアミンを有するＰＥＧを金属微粒子と混合することによる調製することができる。あるいは、ＨＡｕＣｌ4、Ｈ2ＰｔＣｌ4、硝酸銀などの金属化合物の溶液を還元する際に、このような官能基を有するＰＥＧを共存させることにより調製してもよい。
【００４１】
また、ナノ構造粒子は、誘電体からなる層で被覆されていてもよい。そのような誘電体層を構成する誘電体としては、たとえばＳｉＯ2やデキストランまたはその誘導体（カルボキシメチルデキストラン等）が好適であり、その他の公知の誘電体を用いることもできる。
【００４２】
表面に誘電体からなる層が形成されたナノ構造粒子は公知の方法に従って調製することができる。たとえば、ナノ構造粒子または被覆層に結合する官能基（チオール基、シラノール基等）を一端に有し、もう一端にデキストラン等の還元性末端のアルデヒド基等と結合しうる官能基（アミノ基等）を有する分子（いわゆるシランカップリング剤）を用いることにより、デキストラン等でナノ構造粒子表面を修飾することができる。また、ＳｉＯ2からなる層を有するナノ構造粒子は、ナノ構造粒子を酸性ケイ酸液に添加するなどの方法により調製することができる。
【００４３】
〈ＳＰＦＳを利用するセンサチップ〉
本発明に用いられる、ＳＰＦＳを利用する蛍光定量分析において、ナノ構造体を用いた際のＳＰＦＳセンサチップ（以下、単にセンサチップともいう）の好ましい一態様を模式的に示した概念図を図２に示す。図２に示すように、本発明に用いられるセンサチップＤは、透明支持体３上に少なくとも金属膜４、アラライト８と特異的に結合する第１リガンド７を備えている。
【００４４】
そして、適宜必要に応じて、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）５、固相化層６をセンサチップＤに備えても良い。
なお、図２に示す固相化層６を形成するカルボキシメチルデキストランは３次元構造を備えるものであるが、デキストラン１本１本がそれぞれ垂直に近い状態で透明支持体３上に固定化されていてもよく、デキストラン等の１本が複数箇所で透明支持体３上に固定化されていてもよく、本発明はいずれの態様にも限定されるものではない。
【００４５】
〈透明支持体〉
後述する金属膜への励起光の照射をこの透明支持体を通じて行うため支持体は透明なものを用いる。
【００４６】
透明支持体は、本発明の目的が達せられる限り、材質に特に制限はない。例えば、この透明支持体はガラス製であってもよく、また、ポリカーボネート〔ＰＣ〕、シクロオレフィンポリマー〔ＣＯＰ〕などのプラスチック製であってもよい。
【００４７】
また、透明支持体は、ｄ線（５８８ｎｍ）における屈折率〔ｎd〕が好ましくは１．４０以上、２．２０以下であり、厚さが好ましくは０．０１ｍｍ以上、１０ｍｍ以下、より好ましくは０．５ｍｍ以上、５ｍｍ以下である。大きさ（縦×横）は特に限定されない。透明支持体はプリズム形状であっても良い。
【００４８】
なお、ガラス製の透明支持体は、市販品として、ショット日本（株）製の「ＢＫ７」（屈折率〔ｎd〕１．５２）および「ＬａＳＦＮ９」（屈折率〔ｎd〕１．８５）、（株）住田光学ガラス製の「Ｋ−ＰＳＦｎ３」（屈折率〔ｎd〕１．８４）、「Ｋ−ＬａＳＦｎ１７」（屈折率〔ｎd〕１．８８）および「Ｋ−ＬａＳＦｎ２２」（屈折率〔ｎd〕１．９０）、ならびに（株）オハラ製の「Ｓ−ＬＡＬ１０」（屈折率〔ｎd〕１．７２）などが、光学的特性と洗浄性との観点から好ましい。
【００４９】
透明支持体の表面に金属膜を形成する前に、透明支持体の表面を酸および／またはプラズマにより洗浄することが好ましい。
酸による洗浄処理としては、０．００１ｍｏｌ／リットル以上、１ｍｏｌ／リットル以下の塩酸中に、１時間以上、３時間以下浸漬することが好ましい。
【００５０】
プラズマによる洗浄処理としては、例えば、プラズマドライクリーナー（ヤマト科学（株）製の「ＰＤＣ２００」）中に、０．１分間以上、３０分間以下の範囲で浸漬させる方法が挙げられる。
【００５１】
〈金属膜〉
センサチップは、上述した透明支持体上に金属膜を備える。金属膜は、光源からの照射光（励起光）により表面プラズモンを発生させる役割を有する。この金属膜は、光源から照射された励起光により表面プラズモンを誘起させ、さらには該表面プラズモンにより後述する蛍光色素を効率的に励起させる役割を有する。
【００５２】
上記透明支持体の表面に形成される金属膜の金属としては、金、銀、アルミニウム、銅および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなることが好ましく、金からなることがより好ましい。また、金属膜は、これらの金属の幾つかの合金からなる形態であってもよく、また金属膜を複数積層したものであってもよい。このような金属種は、酸化に対して安定であり、かつプラズモン共鳴による電場増強が大きくなることから好適である。
【００５３】
なお、透明支持体としてガラス製の支持体を用いる場合には、ガラスと上記金属膜とをより強固に接着するために、あらかじめクロム、ニッケルクロム合金またはチタンの薄膜を透明支持体上に形成することが好ましい。
【００５４】
透明支持体上に金属膜を形成する方法としては、例えば、スパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法等）、電解メッキ法、無電解メッキ法などが挙げられる。膜形成条件の調整が容易なことから、スパッタリング法または蒸着法により金属膜を形成することが好ましい。また、あらかじめクロム、ニッケルクロム合金またはチタンの薄膜を透明支持体上に形成する場合も同様である。
【００５５】
金属膜の厚さとしては、金の場合５ｎｍ以上、５００ｎｍ以下、銀の場合５ｎｍ以上、５００ｎｍ以下、アルミニウムの場合５ｎｍ以上、５００ｎｍ以下、銅の場合５ｎｍ以上、５００ｎｍ以下、白金の場合５ｎｍ以上、５００ｎｍ以下、およびそれらの合金の場合５ｎｍ以上、５００ｎｍ以下が好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１ｎｍ以上、２０ｎｍ以下が好ましい。
【００５６】
電場増強効果の観点から、金：２０ｎｍ以上、７０ｎｍ以下、銀：２０ｎｍ以上、７０ｎｍ以下、アルミニウム：１０ｎｍ以上、５０ｎｍ以下、銅：２０ｎｍ以上、７０ｎｍ以下、白金：２０ｎｍ以上、７０ｎｍ以下およびそれらの合金：１０ｎｍ以上、７０ｎｍ以下がより好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１ｎｍ以上、３ｎｍ以下がより好ましい。金属膜の厚さが上記範囲内であると、表面プラズモンが発生し易いので好適である。また、金属膜の面積（縦×横）は特に限定されない。
【００５７】
〈自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）〉
ＳＡＭ〔Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；自己組織化単分子膜〕は、後述する固相化層を固相化する足場として、また蛍光測定の際に蛍光分子の金属消光を防止する目的で、上記金属膜の、上記支持体とは接していないもう一方の表面に形成される。
【００５８】
ＳＡＭを形成する単分子としては、通常、炭素原子数４以上、２０以下程度のカルボキシアルカンチオール（例えば、（株）同仁化学研究所、シグマ アルドリッチ ジャパン（株）などから入手可能）、特に好ましくは１０−カルボキシ−１−デカンチオールが用いられる。炭素原子数４以上、２０以下のカルボキシアルカンチオールは、それを用いて形成されたＳＡＭの光学的な影響が少ない、すなわち透明性が高く、屈折率が低く、膜厚が薄いなどの性質を有していることから好適である。
【００５９】
このようなＳＡＭの形成方法としては、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。具体例として、金属膜が形成された支持体を、１０−カルボキシ−１−デカンチオール（（株）同仁化学研究所製）を含むエタノール溶液に浸漬する方法などが挙げられる。この場合、１０−カルボキシ−１−デカンチオールが有するチオール基が、金属膜の金属と結合して固定化され、金属膜の表面上で自己組織化することにより、ＳＡＭが形成される。
【００６０】
また、ＳＡＭを形成する前に「誘電体からなるスペーサ層」を形成してもよく、この場合、ＳＡＭを形成する単分子としては、加水分解でシラノール基〔Ｓｉ−ＯＨ〕を与えるエトキシ基（またはメトキシ基）を有し、一端にアミノ基やグリシジル基、カルボキシル基などの反応基を有するシランカップリング剤であれば特に限定されず、従来公知のシランカップリング剤を用いることができる。
【００６１】
このような「誘電体からなるスペーサ層」に用いられる誘電体としては、光学的に透明な各種無機物、天然または合成ポリマーなどを用いることができる。その中で、化学的安定性、製造安定性および光学的透明性に優れていることから、二酸化ケイ素〔ＳｉＯ2〕、二酸化チタン〔ＴｉＯ2〕または酸化アルミニウム〔Ａｌ2Ｏ3〕を含む誘電体を用いることが好ましい。
【００６２】
誘電体からなるスペーサ層の厚さは、通常１０ｎｍ以上、１ｍｍ以下であり、共鳴角安定性の観点からは、好ましくは３０ｎｍ以下、より好ましくは１０以上、２０ｎｍ以下である。一方、電場増強の観点から、好ましくは２００ｎｍ以上、１ｍｍ以下であり、さらに電場増強の効果の安定性から、４００ｎｍ以上、１，６００ｎｍ以下がより好ましい。
【００６３】
誘電体からなるスペーサ層の形成方法としては、例えば、スパッタリング法、電子線蒸着法、熱蒸着法、ポリシラザン等の材料を用いた化学反応による形成方法、またはスピンコータによる塗布などが挙げられる。
【００６４】
〈固相化層〉
固相化層は、上記ＳＡＭの、上記金属膜とは接していないもう一方の表面に形成され、２次元構造、好ましくは３次元構造を有するものである。
【００６５】
この「３次元構造」とは、後述する第１リガンドの固定化を、「センサチップ」表面（およびその近傍）の２次元に限定することなく、該基板表面から遊離した３次元空間にまで広げられる固相化層の構造をいう。
【００６６】
このような固相化層は、グルコース，カルボキシメチル化グルコース，ならびにビニルエステル類，アクリル酸エステル類，メタクリル酸エステル類，オレフィン類，スチレン類，クロトン酸エステル類，イタコン酸ジエステル類，マレイン酸ジエステル類，フマル酸ジエステル類，アリル化合物類，ビニルエーテル類およびビニルケトン類それぞれに包含される単量体からなる群より選択される少なくとも１種の単量体から構成される高分子を含むことが好ましく、デキストランおよびデキストラン誘導体などの親水性高分子ならびにビニルエステル類，アクリル酸エステル類，メタクリル酸エステル類，オレフィン類，スチレン類，クロトン酸エステル類，イタコン酸ジエステル類，マレイン酸ジエステル類，フマル酸ジエステル類，アリル化合物類，ビニルエーテル類およびビニルケトン類それぞれに包含される疎水性単量体から構成される疎水性高分子を含むことがより好ましく、カルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕などのデキストランが生体親和性、非特異的な吸着反応の抑制性、高い親水性の観点から特に好適である。
【００６７】
ＣＭＤの分子量は、１ｋＤａ以上５，０００ｋＤａ以下が好ましく、４ｋＤａ以上１，０００ｋＤａがより好ましい。
固相化層（例えば、デキストランまたはデキストラン誘導体からなるもの）は、その密度として２ｎｇ／ｍｍ2未満を有することが好ましい。固相化層の密度は、用いる高分子の種類に応じて適宜調整することができる。上記高分子が上記ＳＡＭに、このような密度の範囲内で固相化されていると、ＳＰＦＳ用センサチップをアッセイ法に用いた場合に、アッセイのシグナルが安定化し、かつ増加するため好適である。なお、Ｂｉａｃｏｒｅライフサイエンス社製「Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５」の密度は２ｎｇ／ｍｍ2であった。この密度は、このＣＭ５基板および金膜のみの基板を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅライフサイエンス社製のＳＰＲ測定機器により得られた測定シグナルにおいて、平均２０００ＲＵを測定した結果、２ｎｇ／ｍｍ2と見積もられたものである。
【００６８】
固相化層の平均膜厚は、３ｎｍ以上８０ｎｍ以下であることが好ましい。この膜厚は原子間力顕微鏡〔ＡＦＭ〕などを用いて測定することができる。固相化層の平均膜厚がこのような範囲内であると、ＳＰＦＳ用センサチップをアッセイ法に用いた場合に、アッセイのシグナルが安定化し、かつ増加するため好適である。
【００６９】
固相化層の形成方法は、分子量１ｋＤａ以上５，０００ｋＤａ以下の上記高分子を０．０１ｍｇ／ｍＬ以上１００ｍｇ／ｍＬ以下、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕を０．０１ｍＭ以上３００ｍＭ以下及び水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕を０．０１ｍＭ以上５００ｍＭ以下含む、ｐＨ４．０以上ｐＨ６．５以下のＭＥＳ緩衝生理食塩水（イオン強度：０．１ｍＭ以上３００ｍＭ以下）に、金属膜を有する透明支持体を０．２時間以上３．０時間以下浸漬して形成される。
【００７０】
固相化層に含まれる高分子としては、好ましくはカルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕が用いられる。このような場合、カルボキシメチルデキストランは分子量１ｋＤａ以上５，０００ｋＤａ以下であり、上述したようなカルボキシメチルデキストランを０．０１ｍｇ／ｍＬ以上１００ｍｇ／ｍＬ以下、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕を０．０１ｍＭ以上３００ｍＭ以下及び水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕を０．０１ｍＭ以上５００ｍＭ以下含むＭＥＳ緩衝生理食塩水〔ＭＥＳ〕に、金属膜を有する透明支持体を０．２時間以上３．０時間以下浸漬し、カルボキシメチルデキストランを固定化することができる。
【００７１】
このようにして得られた固相化層の密度は、反応点数（ＳＡＭの官能基数）、反応溶液のイオン強度およびｐＨ、ならびにカルボキシメチルデキストラン分子のカルボキシル基数に対するＷＳＣ濃度によって調整することができる。また固相化層の平均膜厚は、カルボキシメチルデキストランの分子量および反応時間によって適宜調整することができる。
【００７２】
〈第１リガンド及び第２リガンド〉
第１リガンドは、検体中の特定のアナライトに特異的に結合して、アナライトを固定（捕捉）する目的で用いられるものを指し、上記固化層または金属膜に固定化される。固相化層が２次元構造の場合、第１リガンドは固層化層の外面に固定化され、固相化層が３次元構造の場合、第１リガンドは固相化層の層中および／または外面に固定化される。固相化層が３次元構造の場合、一般には第１リガンドの多くは固相化層の３次元構造の中に分散して固定化されることが好ましい。リガンドの種類としては、上述した第３リガンドと異なることが望ましい。
【００７３】
第２リガンドは、特定のアナライトに特異的に結合するものを指し、蛍光色素を有する（蛍光色素で標識化された）リガンドである。この第２リガンドは、特定のアナライトに蛍光色素による標識化を行う目的で用いられ、リガンドの種類としては、上述した第１リガンドと同じでもよいし、異なっていてもよいが、上述した第３リガンドとは異なることが望ましい。
【００７４】
ただし、第１リガンドとして用いる１次抗体がポリクローナル抗体である場合、第２リガンドとして用いる、２次抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよいが、該１次抗体がモノクローナル抗体である場合、２次抗体は、該１次抗体が認識しないエピトープを認識するモノクローナル抗体であるか、またはポリクローナル抗体であることが望ましい。
【００７５】
第２リガンドは、蛍光色素と反応させられ、蛍光色素を有するコンジュゲート（蛍光色素を有する第２リガンド）として作製される。蛍光色素を有する第２リガンドの作製方法としては、第２リガンドとして２次抗体を用いる場合、例えば、まず蛍光色素にカルボキシル基を付与し、該カルボキシル基を、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩〔ＥＤＣ〕など）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕とにより活性エステル化し、次いで活性エステル化したカルボキシル基と２次抗体が有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法；イソチオシアネートおよびアミノ基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；スルホニルハライドおよびアミノ基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；ヨードアセトアミドおよびチオール基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；ビオチン化された蛍光色素とストレプトアビジン化された２次抗体（あるいは、ストレプトアビジン化された蛍光色素とビオチン化された２次抗体）とを反応させ固定化する方法などが挙げられる。
【００７６】
なお、上記第１リガンドを固定化させた後に、後述する検体等がセンサチップに非特異的に吸着することを防止するため、センサチップの表面を牛血清アルブミン〔ＢＳＡ〕等のブロッキング剤により処理することが好ましい。
【００７７】
上記固相化層に固定化された第１リガンドの密度は、１フェムトｍｏｌ／ｃｍ2以上１ナノｍｏｌ／ｃｍ2以下が好ましく、１０フェムトｍｏｌ／ｃｍ2以上１００ピコｍｏｌ／ｃｍ2以下がより好ましい。第１リガンドの密度が上記範囲内であると、アッセイ蛍光シグナルの信号強度が大きくなるため好適である。
【００７８】
〈アッセイ（アナライトの定量分析方法）〉
本発明のアナライトの定量分析方法は、上述したセンサチップ（透明支持体、該透明支持体上に形成された金属膜、および該金属膜上に固定され、かつアナライトに特異的に結合する第１リガンドを備えたセンサチップ）と、上記第２リガンドの他に、上記ナノ構造体とを用いた、表面プラズモン励起増強蛍光分光法によるアナライトの定量分析方法である。ここで、本発明に係る孔ライトの定量分析方法は、下記工程（ａ）〜（ｃ）を実施した後に、下記工程（ｄ）を実施することを特徴とし、必要により下記の洗浄工程（１）〜（３）を実施してもよい。
【００７９】
工程（ａ）：前記センサチップ上の第１リガンドと前記アナライトとを接触させて、該第１リガンドにアナライトを結合させる工程
工程（ｂ）：前記第２リガンドと前記アナライトとを接触させて、該第２リガンドにアナライトを結合させる工程
（ｃ）：前記第２リガンドに前記ナノ構造体を接触させて、該第２リガンドにナノ構造体を結合させる工程
（ｄ）：前記センサチップの透明支持体を介して前記金属膜に励起光を照射して表面プラズモンを生じさせ、該表面プラズモンにより蛍光色素を励起させて蛍光を生じさせ、該蛍光の蛍光量を測定する工程
洗浄工程（１）：上記工程（ａ）を実施した後、センサチップ内を、洗浄液を用いて洗浄する工程
洗浄工程（２）：上記工程（ｂ）を実施した後、センサチップ内を、洗浄液を用いて洗浄する工程
洗浄工程（３）：上記工程（ｃ）を実施した後、センサチップ内を、洗浄液を用いて洗浄する工程
【００８０】
また、さらに工程（ｄ）の後、該工程（ｄ）で得られた測定結果から、アナライト量を算出する以下の工程（工程（ｅ））を含んでも良い。
工程（ｅ）：上記工程（ｄ）で得られた測定結果から、アナライト溶液中に含有されるアナライト量を算出する工程である。
【００８１】
［工程（ａ）］
工程（ａ）は、前記センサチップ上の第１リガンドと前記アナライトとを接触させて、該第１リガンドにアナライトを結合させる工程である。
【００８２】
（アナライト）
本発明において「アナライト」とは、金属膜上の第１リガンドに特異的に認識され（または、第１のリガンドを特異的に認識し）結合し得る分子または分子断片を意味する。このような「分子」または「分子断片」として、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチドを含む）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）、癌胎児性抗原等の腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモンなどであってもよく、特に限定されるものではない。
このアナライトは、アナライトを含む溶液の形で接触させることが好ましい。
【００８３】
（アナライト溶液）
アナライト溶液とは、測定対象となる種々のアナライトを含む溶液をいう。
アナライト溶液としては、アナライトを含む溶液であれば何れでもよいが、例えば、検体が挙げられる。検体としては、例えば、血液（血清・血漿）、尿、鼻孔液、唾液、便、体腔液（髄液、腹水、胸水等）などが挙げられ、所望の溶媒、緩衝液等に適宜希釈して用いてもよい。これら検体のうち、血液、尿、鼻孔液および唾液が好ましい。これらは１種単独で用いてもよく、また、２種以上を併用してもよい。
【００８４】
（アナライトの接触）
センサチップには流路が形成されていることが好ましく、流路中の少なくとも一部が透明支持体上に金属膜、金属膜上に第１リガンドを備えた構成とされ、アナライト溶液を前記流路中に送液して第１リガンドがアナライト溶液で浸漬されることにより、アナライトを第１リガンドに接触させる態様であることが好ましい。
【００８５】
「流路」の形状は、角筒（管）状であっても丸筒（管）状であってもよく、アナライトと第１リガンド等を結合させ、蛍光測定する反応部・測定部は角筒状であることが好ましく、それ以外の薬液等の送液のみに利用される流路部分は丸筒状であることが好ましい。
【００８６】
センサチップの外壁をなす部材、例えば流路基板と流路天板とで構成される場合等、それら部材の反応部・測定部に対応する部分（透明支持体）または流路天板の材料としては、メチルメタクリレート、スチレン等を原料として含有するホモポリマーまたは共重合体；ポリエチレン等のポリオレフィンなどからなり、流路部分はシリコーンゴム、テフロン（登録商標）、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリマーを用いることが好ましい。
【００８７】
反応部・測定部においては、アナライトとの接触効率を高め、拡散距離を短くする観点から、流路の断面として、縦と横がそれぞれ１００ｎｍ以上、１ｍｍ以下程度であることが好ましい。
【００８８】
センサチップに流路を形成する方法としては、小規模ロット（実験室レベル）では、まず、センサチップの金属膜が形成されている表面側に、流路高さ０．５ｍｍを有するポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕製シートを該センサチップの金属膜が形成されている部位を囲むようにして圧着し、次に、該ポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕製シートとセンサチップとをビス等の閉め具により固定する方法が好ましい。
【００８９】
工業的に製造される大規模ロット（工場レベル）では、センサチップに流路を形成する方法としては、センサチップに流路基板と流路天板に相当するプラスチックの一体成形品を形成する方法、または別途作製した金属膜が形成された支持体に流路基板を形成し、金属膜表面に（好ましくは誘電体からなるスペーサ層）ＳＡＭ、固定化層および第１リガンドの固定化を行った後に、流路天板に相当するプラスチックの一体成形品により、流路基板を形成されたセンサチップに蓋をする方法がある。
【００９０】
流路に送液するアナライト溶液において、アナライトを希釈するために用いる溶媒としては、例えば、リン酸緩衝生理食塩水〔ＰＢＳ〕、トリス緩衝生理食塩水〔ＴＢＳ〕、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水〔ＨＢＳ〕などが挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００９１】
第１リガンドに多くのアナライトを補足させるために、送液されたアナライト溶液を流路中に循環させることが好ましいが、その際のアナライト溶液の温度および時間としては、検体の種類などにより異なり、特に限定されるものではないが、通常２０℃以上、４０℃以下で１分間以上、６０分間以下、好ましくは３７℃で５分間以上、１５分間以下である。
【００９２】
アナライト溶液を流路に送液する場合、該アナライト溶液中に含有されるアナライトの初期濃度（送液前の濃度）は、１００μｇ／ｍｌ以上、０．００１ｐｇ／ｍｌ以下であってもよい。
【００９３】
流路に送液するアナライト溶液の総量は、通常０．００１ｍｌ以上、２０ｍｌ以下、好ましくは０．１ｍｌ以上、１ｍｌ以下である。
また、流路に送液するアナライト溶液の流速は、通常１μＬ／ｍｉｎ以上、５，００００μＬ／ｍｉｎ以下、好ましくは５，０００μＬ／ｍｉｎ以上、１，００００μｌ／ｍｉｎ以下である。
【００９４】
［洗浄工程］
洗浄工程としては、上記工程（ａ）を実施した後にセンサチップ内を洗浄液で洗浄する洗浄工程（１）、上記工程（ｂ）を実施した後にセンサチップ内を洗浄液で洗浄する洗浄工程（２）と、上記工程（ｃ）を実施した後にセンサチップ内を洗浄液で洗浄する工程（３）が挙げられる。
【００９５】
これら洗浄工程（１）〜（３）の何れかに使用される洗浄液は、例えば、工程（ａ）〜（ｃ）の何れかの反応で用いられた溶媒または緩衝液と同一種類の溶媒または緩衝液に、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ１００などの界面活性剤を好ましくは０．００００１質量％以上、１質量％以下含有するように溶解させたもの、または塩化ナトリウムや塩化カリウムなどの塩を１０ｍＭ以上、５００ｍＭ以下含有させたものであることが望ましい。あるいは、低ｐＨの緩衝液、例えば、１０ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ ＨＣｌで、ｐＨが１．５以上、４．０以下のものを洗浄液として用いてもよい。
【００９６】
洗浄工程における洗浄液の温度および流速は、上記工程（ａ）におけるアナライト溶液の送液時の温度および流速と同じであることが好ましい。
洗浄工程（洗浄液による洗浄時間）は、通常０．５分間以上、１８０分間以下、好ましくは５分間以上、６０分間以下である。
【００９７】
［工程（ｂ）］
工程（ｂ）は、前記第２リガンドと前記アナライトとを接触させて、該第２リガンドにアナライトを結合させる工程である。工程（ｂ）は、好ましくは上記工程（ａ）の後、さらに好ましくは上記洗浄工程（１）を経た後に実施される。
【００９８】
（蛍光色素）
「蛍光色素（蛍光分子ともいう）」は、所定の励起光を照射することによって、または電界効果を利用して励起することによって蛍光を発光する（表面プラズモンにより励起されて蛍光する）物質の総称であり、該「蛍光」は、燐光など各種の発光も含む。
【００９９】
本発明で用いられる蛍光色素は、金属膜による吸光に起因して完全に消光しない限りにおいて、その種類に特に制限はなく、公知の蛍光色素のいずれであってもよい。一般に、単色比色計〔ｍｏｎｏｃｈｒｏｍｏｍｅｔｅｒ〕よりむしろフィルタを備えた蛍光計の使用をも可能にし、かつ検出の効率を高める大きなストークス・シフトを有する蛍光色素が好ましい。
【０１００】
このような蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、クマリン・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ローダミン・ファミリーの蛍光色素（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス（株）製）、シアニン・ファミリーの蛍光色素、インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素、オキサジン・ファミリーの蛍光色素、チアジン・ファミリーの蛍光色素、スクアライン・ファミリーの蛍光色素、キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素、ピレン・ファミリーの蛍光色素、トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン（株）製）などが挙げられ、さらに米国特許番号第６，４０６，２９７号、同第６，２２１，６０４号、同第５，９９４，０６３号、同第５，８０８，０４４号、同第５，８８０，２８７号、同第５，５５６，９５９号および同第５，１３５，７１７号に記載の蛍光色素を用いることもできる。
【０１０１】
これらファミリーに含まれる代表的な蛍光色素の吸収波長（ｎｍ）および発光波長（ｎｍ）を表１に示す。
【０１０２】
【表１】
また、蛍光色素は、上記有機蛍光色素に限られない。例えば、Ｅｕ、Ｔｂ等の希土類錯体系の蛍光色素も用いることができる。希土類錯体は、一般的に励起波長（３１０以上、３４０ｎｍ以下程度）と発光波長（Ｅｕ錯体で６１５ｎｍ付近、Ｔｂ錯体で５４５ｎｍ付近）との波長差が大きく、蛍光寿命が数百マイクロ秒以上と長い特徴がある。市販されている希土類錯体系の蛍光色素の一例としては、ＡＴＢＴＡ−Ｅｕ3+が挙げられる。
【０１０３】
本発明においては、後述する蛍光量の測定を行う際に、金属膜に含まれる金属による吸光の少ない波長領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが望ましい。例えば、金属膜として金膜を用いる場合には、金膜による吸光による影響を最小限に抑えるため、最大蛍光波長が６００ｎｍ以上である蛍光色素を使用することが望ましい。したがって、この場合には、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７等近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが特に望ましい。このような近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることは、血液中の血球成分由来の鉄による吸光の影響を最小限に抑えることができる点で、検体として血液を用いる場合においても有用である。一方、金属膜として銀を用いる場合には、最大蛍光波長が４００ｎｍ以上である蛍光色素を使用することが望ましい。
【０１０４】
これら蛍光色素は１種単独でも、２種以上併用してもよい。
蛍光色素を有する第２リガンドを含む溶液をセンサチップに送液して反応させる際、送液される該溶液の濃度は、０．００１μｇ／ｍｌ以上、１０，０００μｇ／ｍｌ以下が好ましく、１μｇ／ｍｌ以上、１，０００μｇ／ｍｌ以下がより好ましい。
【０１０５】
この溶液を送液する際の溶液の温度、流速および工程（ｂ）の時間（送液時間）は、それぞれ上記工程（ａ）の場合と同様である。
【０１０６】
［工程（ｃ）］
工程（ｃ）は、第２リガンドに上記ナノ構造体を接触させて、該第２リガンドにナノ構造体を結合させる工程である。
【０１０７】
接触させる方法としては特に限定されず、例えば、上記工程（ｂ）を実施した後、センサチップにナノ構造体を含む溶液（ナノ構造体溶液）を送液して、上記第２リガンドにナノ構造体を接触させる方法、上記工程（ｂ）を実施した後、センサチップに、ナノ構造粒子含む溶液及び第３リガンドを含む溶液を別々に送液する方法が挙げられる。好ましくは上記工程（ｂ）を経たセンサチップにナノ構造体を含む溶液（ナノ構造体溶液）を送液して、上記第２リガンドにナノ構造体を接触させて、該第２リガンドにナノ構造体を結合させることである。
【０１０８】
このナノ構造体溶液の作製方法としては、例えば、ナノ構造粒子を含む溶液と第３リガンドを含む溶液とを混合してナノ構造粒子と第３リガンドを結合させて作製すること、あるいは、ナノ構造粒子単体（ナノ構造粒子と第３リガンドが初めから結合した単体）を溶液に入れ作製することが挙げられる。ナノ構造体を、ナノ構造粒子を含む溶液と第３リガンドを含む溶液とを混合して作製する場合、各溶液の濃度にもよるが、通常、ナノ構造粒子を含む溶液と第３リガンドを含む溶液とを、ナノ構造粒子の個数：第３リガンドの個数が１：１の割合になるように混合させると、１つのナノ構造粒子に対して、平均１つの第３リガンドが結合したナノ構造体を作製することができる。そして、ナノ構造粒子を含む溶液と第３リガンドを含む溶液とを、例えば、ナノ構造粒子の個数：第３リガンドの個数が１：２以上の割合になるように混合することで、１つのナノ構造粒子に対して、平均２つ以上（複数）の第３リガンドを結合させることができる。該ナノ構造粒子を含む溶液中のナノ構造粒子の濃度は、ナノ構造体粒子の粒径等により適宜異なるが、０．０１μｇ／ｍｌ以上、１０，０００μｇ／ｍｌ以下が好ましく、１μｇ／ｍｌ以上、１００μｇ／ｍｌ以下がより好ましい。
【０１０９】
なお、工程（ｂ）を実施した後のセンサチップに対して、上記洗浄工程（２）を行う方が好ましい。ナノ構造体を含む溶液に用いられる溶媒としては例えば、リン酸緩衝生理食塩水〔ＰＢＳ〕、トリス緩衝生理食塩水〔ＴＢＳ〕、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水〔ＨＢＳ〕などが挙げられるが、特に限定されるものではない。
【０１１０】
第２リガンドに多くの第３リガンドを結合させるために、好ましくは第２リガンド及び第１リガンドに多くの第３リガンドを結合させるために、送液されたナノ構造体溶液を流路中に循環させることが好ましい。その際のナノ構造体溶液の温度および循環させる時間としては、ナノ構造体の第３リガンドやナノ構造粒子等により異なり、特に限定されるものではないが、例えば、２０℃以上、４０℃以下で１分間以上、６０分間以下、好ましくは３０℃以上、３８℃以下で５分間以上、１５分間以下が挙げられる。
【０１１１】
流路に送液するナノ構造体溶液の総量は、通常０．００１ｍｌ以上、２０ｍｌ以下、好ましくは０．１ｍｌ以上、１ｍｌ以下である。
また、流路に送液するナノ構造体溶液の流速は、通常１μＬ／ｍｉｎ以上、５，００００μＬ／ｍｉｎ以下、好ましくは５，０００μｌ／ｍｉｎ以上、１，００００μｌ／ｍｉｎ以下である。
【０１１２】
上記第２リガンドとナノ構造体との接触は、詳細には、第２リガンドとナノ構造体の第３リガンド部の接触を指し、例えば、上述の工程（ｂ）で用いる「蛍光色素を有する第２リガンドを含む溶液」にナノ構造体を含有させて該溶液中で行っても良い。また、工程（ａ）で用いる「アナライト溶液」にナノ構造体を含有させて該溶液中で行っても良い。
【０１１３】
上述のように、上記第２リガンドとナノ構造体との接触方法は如何なる方法に限定されず、上記第２リガンドとナノ構造体とが接触すれば如何なる方法でも良い。
上記第２リガンドにナノ構造体を接触させた際に、ナノ構造体の第３リガンド部は第２リガンドと反応性を有するため、上記第２リガンドとナノ構造体の第３リガンド部は反応し結合する。このように、第２リガンドと第３リガンドを接触させ結合させることで、アナライト−第１リガンド間、及び／またはアナライト−第２リガンド間の解離を抑制することができる。
【０１１４】
［工程（ｄ）］
工程（ｄ）は、上記工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を実施した後、センサチップに、上記透明支持体の、上記金属膜を形成していないもう一方の表面から（透明支持体を介して）、励起光を照射し金属膜表面に表面プラズモンを生じさせ、該表面プラズモンにより蛍光色素を励起させて発光を生じさせ、該蛍光の蛍光量を測定する工程である。この工程において、表面プラズモンを生じさせる方法は特に限定されるものではないが、例えば、プリズムを経由してレーザ光（励起光）を照射して表面プラズモンを生じさせる方法等がある。この工程（ｄ）は、上記洗浄工程（３）を経た後のセンサチップに対して行うことが好ましい。
【０１１５】
（光学系）
蛍光を測定する際に照射される光源は、金属膜に表面プラズモンを生じさせることができるものであれば、特に制限がないものの、波長分布の単一性および光エネルギーの強さの点で、レーザ光（励起光）を光源として用いることが好ましい。レーザ光（励起光）は、光学フィルタを通して、プリズムに入射する直前のエネルギーおよびフォトン量を調節することが望ましい。
【０１１６】
レーザ光（励起光）の照射により、全反射減衰条件〔ＡＴＲ〕において、金属膜の表面に表面プラズモンが発生する。表面プラズモンの電場増強効果により、照射したフォトン量の数十倍以上、数百倍以下に増えたフォトンにより蛍光色素を励起する。なお、該電場増強効果によるフォトン増加量は、支持体の屈折率、金属膜の金属種およびその膜厚に依存するが、通常、金では約１０倍以上、２０倍以下の増加量となる。
【０１１７】
蛍光色素は、光吸収により分子内の電子が励起され、短時間のうちに第一電子励起状態に移動し、この状態（準位）から基底状態に戻る際、そのエネルギー差に相当する波長の蛍光を発する。
【０１１８】
励起光として使用される「レーザ光」としては、例えば、波長２００ｎｍ以上、９００ｎｍ以下、０．００１ｍＷ以上、１，０００ｍＷ以下のＬＤ；波長２３０ｎｍ以上、８００ｎｍ以下（金属部材に用いる金属種によって共鳴波長が決まる。）、０．０１ｍＷ以上、１００ｍＷ以下の半導体レーザなどが挙げられる。
【０１１９】
「プリズム」は、必要に応じて用いられる光学フィルタ、偏光フィルタ及びカットフィルタ等の各種フィルタを介したレーザ光が、金属膜に効率よく入射されることを目的としており、屈折率が透明支持体と同じであることが好ましい。本発明は、全反射条件を設定できる各種プリズムを適宜選択することができることから、角度、形状に特に制限はなく、例えば、６０度分散プリズムなどであってもよい。このようなプリズムの市販品としては、上述した「ガラス製の透明支持体」の市販品と同様のものが挙げられる。本発明の透明支持体がこのプリズムであっても良い。
【０１２０】
「光学フィルタ」としては、例えば、減光〔ＮＤ〕フィルタ、ダイアフラムレンズなどが挙げられる。「減光〔ＮＤ〕フィルタ」（または、中性濃度フィルタ）は、入射レーザ光量を調節することを目的とするものである。特に、ダイナミックレンジの狭い検出器を使用するときには精度の高い測定を実施する上で用いることが好ましい。
【０１２１】
「偏光フィルタ」は、レーザ光を、表面プラズモンを効率よく発生させるＰ偏光とするために用いられるものである。
「カットフィルタ」は、外光（装置外の照明光）、励起光（励起光の透過成分）、迷光（各所での励起光の散乱成分）、プラズモンの散乱光（励起光を起源とし、センサチップ表面上の構造体または付着物などの影響で発生する散乱光）などの光学ノイズ、および蛍光色素の自家蛍光を除去するフィルタであって、例えば、干渉フィルタ、色フィルタなどが挙げられる。
【０１２２】
「集光レンズ」は、蛍光量を測定する検出器に、蛍光シグナルを効率よく集光することを目的とするものであり、任意の集光レンズでよい。簡易な集光レンズとして、顕微鏡などで使用されている、市販の対物レンズ（例えば、（株）ニコン製またはオリンパス（株）製等）を転用してもよい。対物レンズの倍率としては、１０倍以上、１００倍以下が好ましい。
【０１２３】
「検出器」としては、超高感度の観点からは光電子増倍管（浜松ホトニクス（株）製のフォトマルチプライヤー）が好ましい。また、これらに比べると感度は下がるが、画像として見ることができ、かつノイズ光の除去が容易なことから、多点計測が可能なＣＣＤイメージセンサも好適である。
【０１２４】
［工程（ｅ）］
工程（ｅ）は、上記工程（ｄ）で得られた測定結果から、アナライト量（たとえば、アナライト溶液中に含まれるアナライト量）を算出（定量）する工程である。
【０１２５】
より具体的には、工程（ｅ）は、既知濃度のアナライト（たとえば、標的抗原または標的抗体）を用いて、本願発明の定量分析法を実施することで検量線を作成し、作成された検量線に基づいて、工程（ｄ）で得られた測定シグナルから、被測定アナライト溶液中のアナライト（たとえば、標的抗原）量を算出する工程である。
【０１２６】
［Ｓ／Ｎ比の算出］
さらに、工程（ｅ）においては、予め上記工程（ｂ）の前に測定した“ブランク発光シグナル”、上記工程（ｄ）で得られた“アッセイ発光シグナル（単にシグナルともいう）”、および何も修飾していない金属基板を流路に固定し、超純水を流しながら測定して得られた“初期ノイズシグナル”を用いて、下記式（１ａ）で表されるＳ／Ｎ比を算出することができる：
Ｓ／Ｎ＝｜Ｉａ／Ｉｏ｜／Ｉｎ （１ａ）
（上記式（１ａ）において、Ｉａはアッセイ発光シグナル、Ｉｏはブランク発光シグナル、Ｉｎは初期ノイズシグナルである）。
ただし、Ｓ／Ｎを算出するにあたっては、実用上、上記式（１ａ）に代えて、アナライト溶液中に含まれるアナライトの濃度が０の場合における“アッセイノイズシグナル（単にノイズともいう）”を基準として、下記式（１ｂ）にしたがって算出してもよい：
Ｓ／Ｎ＝｜Ｉａ｜／｜Ｉａｎ｜ （１ｂ）
（上記式（１ｂ）において、Ｉａｎはアッセイノイズシグナル、Ｉａは上記式（１ａ）の場合と同様にアッセイ発光シグナルである）。
【０１２７】
〔キット〕
本発明に係る定量分析用キットは、上記センサチップと、上記ナノ構造体と、上記第２リガンドとを含み、表面プラズモン励起増強蛍光分光法によるアナライトの定量分析に用いられることを特徴とする。ここで、本発明の定量分析方法を実施するにあたり、上記のセンサチップ等の他に、アナライト溶液を除き必要とされるすべてのものを含むことが好ましい。
【０１２８】
たとえば、本発明の定量分析用キットに含まれるものとしては、少なくともセンサチップ（透明支持体上に少なくとも金属膜を有する）、第１リガンドを含む溶液、第２リガンドを含む溶液、およびナノ構造体を含むアナライト解離抑制剤（溶液）である。
【０１２９】
これら蛍光量測定用キットと、例えば、アラナイト溶液としてアナライトを含む血液または血清と、特定の腫瘍マーカーに対する抗体とを用いることによって、特定の腫瘍マーカーの含有量を、高感度かつ高精度で検出することができる。この結果から、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌（上皮内癌）の存在も高精度で予測することができる。
【０１３０】
さらに、キット要素として、検量線作成用の標準物質、説明書、多数アナライトの同時処理ができるマイクロタイタープレートなどの必要な器材一式などを含んでもよい。
以上の説明において、本発明の定量分析方法では、工程（ｄ）が工程（ａ）〜（ｃ）の後に実施する限り、工程（ａ）〜工程（ｃ）の各工程は、任意の順番で実施してもよく、工程（ａ）〜工程（ｃ）のうち、２種類の工程または３種類の工程を同時に実施してもよい。
【０１３１】
本発明の定量分析方法を実施するに当たり、工程（ａ）〜（ｂ）を任意の順でまたは同時に実施し、工程（ｃ）〜（ｄ）を順次実施することが好ましく、工程（ａ）〜工程（ｄ）の順番で順次行う方が、各工程を、センサチップを処理対象にして、センサチップに対して順次処理を行うことができ好ましい。
【実施例】
【０１３２】
次に、本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【０１３３】
（蛍光色素を有する第２リガンド溶液の準備）
第２リガンドとして、抗ｃＴｎｌ ＩｇＧ２ａモノクローナル抗体（４Ｃ２；２．５ｍｇ／ｍｌ、Ｈｙｔｅｓｔ社製）の溶液とＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）標識キットを用い、キット使用方法の手順に従い、室温（２５℃）で６０分間、攪拌混合することで反応させ、蛍光色素標識された抗体を準備した。
【０１３４】
最後に、未反応抗体および未反応酵素を、分子量カットフィルタ（日本ミリポア（株）製）を用いて精製することで、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体溶液を得た。得られた標識２次抗体（蛍光色素を有する第２リガンド）溶液はタンパク定量後、４℃で保存した。
【０１３５】
（ナノ構造体溶液の準備）
第３リガンドとして、第２リガンドに結合性を有する抗ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａポリクロ―ナル抗体（１００μｇ／ｍｌ、（株）ミクリ免疫研究所）１００μｌと、体積平均粒径８ｎｍの金コロイド（ＷＲＧＭ３；金コロイド液：ＯＤ５２５＝１２ （株）ワインレッドケミカル）溶液１００μｌとを混合し抗体を結合させるｐＨのｂｕｆｆｅｒなどで希釈しｐＨを調節した後、１５分間静置した。その後、混合液（１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液と１％ＰＥＧ溶液を９：１の割合で混合した溶液）１ｍｌを第３リガンド及び金コロイド含有溶液１００μｌに加え、市販の遠心分離機を用いて５０００ｒｐｍで５分間、遠心分離を行なって上清を取り除いた。さらに、上記混合液２ｍｌを加えて、市販の超音波分散器で約３０秒間分散した。再度、遠心分離機を用いて５０００ｒｐｍで５分間、遠心分離を行って上清を取り除き、ナノ構造体を含む溶液（ナノ構造体溶液）を得た。得られたナノ構造体溶液は４℃で保存した。なお、得られたナノ構造体は、１粒子当たり、平均すると、複数個の第３リガンドが固定されるように調製した。
【０１３６】
［実施例１］
（センサチップ（Ａ）の製造）
屈折率〔ｎd〕１．７２、厚さ１ｍｍのガラス製の透明支持体（（株）オハラ製の「Ｓ−ＬＡＬ １０」）をプラズマ洗浄し、該支持体の片面にクロム薄膜をスパッタリング法により形成した後、その表面にさらに金属膜として金薄膜をスパッタリング法により該透明支持体に形成した。クロム薄膜の厚さは１ｎｍ以上、３ｎｍ以下、金薄膜の厚さは４２ｎｍ以上、４７ｎｍ以下であった。この半値幅（β）は７．６°であった。
【０１３７】
こうして金属膜が形成された透明支持体を、１ｍＭに調製した１０−カルボキシ−１−デカンチオールのエタノール溶液１０ｍｌに２４時間浸漬し、金薄膜の片面にＳＡＭを形成した。この透明支持体を、該エタノール溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールでそれぞれ洗浄した後、エアガンを用いて乾燥させた。
【０１３８】
続いて、分子量５０万のカルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕を１ｍｇ／ｍｌと、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕を０．５ｍＭと、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕を１ｍＭとを含むｐＨ７．４のＭＥＳ緩衝生理食塩水〔ＭＥＳ〕（イオン強度：１０ｍＭ）にＳＡＭを形成した透明支持体を１時間浸漬し、ＳＡＭ上に固相化層としてＣＭＤを固定化し、１モル／リットルのＮａＯＨ水溶液に３０分間浸漬することで未反応のコハク酸エステルを加水分解させた。ＣＭＤ層の平均膜厚は７０ｎｍであり、密度は１．９ｎｇ／ｍｍ2であった。
【０１３９】
続いて、ＮＨＳを５０ｍＭ（モル）と、ＷＳＣを１００ｍＭとを含むＭＥＳに１時間浸漬させた後に、抗ｃＴｎｌ ＩｇＧ１モノクローナル抗体（ＭＦ４；２．５μｇ／ｍｌ、Ｈｙｔｅｓｔ社製）（第１リガンド）溶液に３０分間浸漬することで、ＣＭＤに１次抗体（第１リガンド）を固定化した。
【０１４０】
さらに、１質量％の牛血清アルブミン〔ＢＳＡ〕および１Ｍのアミノエタノールを含むＰＢＳにて３０分間循環送液することで、非特異的吸着防止処理を行なった。
非特異吸着防止処理を行なった第１リガンドが固定化された透明支持体上に、流路高さ０．５ｍｍを有し、かつ適当な形状および大きさを有する穴のあいたポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕製シートを設け、さらに、このＰＤＭＳ製シートの周囲にシリコーンゴム製スペーサを配置した（このシリコーンゴム製スペーサは流路に送液する溶液に触れない状態にある）。該ＰＤＭＳ製シートおよび該シリコーンゴム製スペーサの上に、送液導入用の穴および送液排出用の穴を予めそれぞれ形成してあるＰＭＭＡ基板を、ＰＤＭＳ製シートで囲まれた領域の内側にこれらの穴が位置するように配置した（このとき、抗体を固定化した表面が流路の内側となるように、ＰＭＭＡ基板が配置されている）。これらを流路の外側から圧着し、ビスを用いて、ＰＭＭＡ基板と流路シート（すなわち、前記ＰＤＭＳ製シート）、該流路シートと支持体を固定し、センサチップ（Ａ）を製造した。
【０１４１】
（アッセイの実施）
上述のように製造したセンサチップ（Ａ）を用いて、以下の工程によりアッセイを実施した。
【０１４２】
工程（ａ）として、上述のようにして得られたセンサチップ（Ａ）の流路に、標的抗原（アナライト）としてｃＴｎｌを０．１ｎｇ／ｍｌ含む０．１ｍｌＰＢＳ溶液（アナライト溶液）を２５分間循環させた。
【０１４３】
洗浄工程（１）として、工程（ａ）の後、センサチップ（Ａ）の流路に、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５質量％含むトリス緩衝生理食塩水〔ＴＢＳ〕を送液させ１０分間循環させることによって洗浄した。
【０１４４】
工程（ｂ）として、洗浄工程（１）の後、センサチップ（Ａ）の流路に、上記で準備した蛍光色素を有する第２リガンド溶液（２μｇ／ｍｌとなるように調製したＰＢＳ溶液）０．１ｍｌを送液させ５分間循環させた。
【０１４５】
洗浄工程（２）として、工程（ｂ）の後、センサチップ（Ａ）の流路に、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５質量％含むＴＢＳを送液させ１０分間循環させることによって洗浄した。
工程（ｃ）として、洗浄工程（２）の後、センサチップ（Ａ）の流路に、上記で準備したナノ構造体溶液（２μｇ／ｍｌとなるように調製したＰＢＳ溶液）０．１ｍｌを送液させ５分間循環させた。
【０１４６】
工程（ｄ）として、工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を経たセンサチップ（Ａ）の、金属膜を形成していないもう一方の表面から、プリズム（シグマ光機（株）製）を経由してレーザ光（６４０ｎｍ、４０μＷ）を金属膜に照射し表面プラズモンを生じ、この表面プラズモンにより励起された蛍光色素から発光された蛍光量を光電子増倍管〔ＰＭＴ〕で検出した光量（シグナル値）を計測し「アッセイ発光シグナル」とした。
【０１４７】
一方、前記工程（ａ）〜（ｄ）において、上記工程（ａ）でｃＴｎｌを全く含まない（０ｎｇ／ｍｌ）０．１ｍｌＰＢＳ溶液をフローさせた以外は上記と同じ手順で蛍光量を測定し、その測定値を「アッセイノイズシグナル」とした。
【０１４８】
［実施例２］
上記実施例１において、ナノ構造体溶液を準備する際に、第３リガンドの濃度を１００μｇ／ｍｌから、７０μｇ／ｍｌに変更した以外は同様にして蛍光量を測定した。
【０１４９】
［実施例３］
上記実施例１において、ナノ構造体溶液を準備する際に、第３リガンドとして、第２リガンドと結合性を有する抗ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａポリクロ―ナル抗体（１００μｇ／ｍｌ、（株）ミクリ免疫研究所）１００μｌから、第１リガンド及び第２リガンドと共に結合性を有する抗ｍｏｕｓｅ ＩｇＧポリクロ―ナル抗体（５０μｇ／ｍｌ、（株）ミクリ免疫研究所）１００μｌに変更し、該第３リガンドを第２リガンド及び第１リガンドの両方に接触させた以外は同様にして蛍光量を測定した。
【０１５０】
［実施例４］
上記実施例１において、ナノ構造体溶液を準備する際に、第３リガンドの濃度を１００μｇ／ｍｌから、１μｇ／ｍｌに変更した以外は同様にして蛍光量を測定した。
【０１５１】
［実施例５］
上記実施例３において、ナノ構造体溶液を準備する際に、第３リガンドの濃度を２０μｇ／ｍｌから、１．２５μｇ／ｍｌに変更した以外は同様にして蛍光量を測定した。
【０１５２】
［実施例６］
上記実施例１において、ナノ構造体溶液を準備する際に、第３リガンドの濃度を１００μｇ／ｍｌから、０．８５μｇ／ｍｌに変更した以外は同様にして蛍光量を測定した。
【０１５３】
［実施例７］
上記実施例１において、ナノ構造体溶液を準備する際に、第３リガンドの濃度を１００μｇ／ｍｌから、１０μｇ／ｍｌに変更し、体積平均粒径８ｎｍの金コロイド（ＷＲＧＭ３；金コロイド液：ＯＤ５２５＝１２ （株）ワインレッドケミカル）溶液１００μｌから、体積平均粒径２０ｎｍの金コロイド（ＷＲＧＭ２；金コロイド液：ＯＤ５２５＝１２ （株）ワインレッドケミカル）溶液１００μｌに変更した以外は同様にして蛍光量を測定した。
【０１５４】
［実施例８］
上記実施例１において、ナノ構造体溶液を準備する際に、第３リガンドの濃度を１００μｇ／ｍｌから、３０μｇ／ｍｌに変更し、体積平均粒径８ｎｍの金コロイド（ＷＲＧＭ３；金コロイド液：ＯＤ５２５＝１２ （株）ワインレッドケミカル）溶液１００μｌから、体積平均粒径４０ｎｍの金コロイド（ＷＲＧＨ１；金コロイド液：ＯＤ５２５＝１２ （株）ワインレッドケミカル）溶液１００μｌに変更した以外は同様にして蛍光量を測定した。
【０１５５】
［実施例９］
上記実施例１において、ナノ構造体溶液を準備する際に、第３リガンドの濃度を１００μｇ／ｍｌから、１０μｇ／ｍｌに変更し、体積平均粒径８ｎｍの金コロイド（ＷＲＧＭ３；金コロイド液：ＯＤ５２５＝１２ （株）ワインレッドケミカル）溶液１００μｌから、体積平均粒径６０ｎｍの金コロイド（ＷＲＧＨ１；金コロイド液：ＯＤ５２５＝１２ （株）ワインレッドケミカル）溶液１００μｌに変更した以外は同様にして蛍光量を測定した。
【０１５６】
［実施例１０］
上記実施例１において、ナノ構造体溶液を準備する際に、金コロイド溶液１００μｌの代わりに、体積平均粒径は２０ｎｍのセレン化カドミウムである「Ｑｄｏｔ（登録商標） ５２５ ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｓ」（インビトロジェン株式会社製）を含む溶液（１μＭ）１００μｌを用いた以外は同様にして蛍光量を測定した。
【０１５７】
［実施例１１］
上記実施例１において、ナノ構造体溶液を準備する際に、第３リガンドとして、第２リガンドと結合性を有する抗ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａポリクロ―ナル抗体（１００μｇ／ｍｌ、（株）ミクリ免疫研究所）１００μｌから、第１リガンド及び第２リガンドと共に結合性を有する抗ｍｏｕｓｅ ＩｇＧポリクロ―ナル抗体（１００μｇ／ｍｌ、（株）ミクリ免疫研究所）１００μｌに変更し、金コロイド溶液の代わりに体積平均粒径２０ｎｍのタンパク質を含む溶液（１００μｇ／ｍｌ）１００μｌを用いた以外は同様にして蛍光量を測定した。
【０１５８】
［実施例１２］
上記実施例１において、ナノ構造体溶液を準備する際に、第３リガンドの濃度を１００μｇ／ｍｌから、１２０μｇ／ｍｌに変更し、体積平均粒径８ｎｍの金コロイド（ＷＲＧＭ３；金コロイド液：ＯＤ５２５＝１２ （株）ワインレッドケミカル）溶液１００μｌから、体積平均粒径６０ｎｍのタンパク質を含む溶液（１００μｇ／ｍｌ）１００μｌに変更した以外は同様にして蛍光量を測定した。
【０１５９】
［比較例１］
上記実施例１において、工程（ｃ）を除いた以外は同様の工程で蛍光量を測定した。すなわち、ナノ構造体溶液は使用していない（送液を行っていない）。
【０１６０】
［比較例２］
上記実施例１において、ナノ構造対溶液の代わりに、ナノ構造粒子を用いることなく第３リガンドのみ分散させた第３リガンド溶液を以下のようにして準備し、該第３リガンド溶液を使用した以外は同様にして蛍光量を測定した。
【０１６１】
（第３リガンド溶液の準備）
第３リガンドとして、第２リガンドと反応性を有する抗ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａポリクロ―ナル抗体（１００μｇ／ｍｌ、（株）ミクリ免疫研究所）溶液を準備した。
【０１６２】
［ナノ構造粒子体積平均粒径の測定方法］
ナノ構造粒子の体積平均粒径は、ナノ構造体溶液を作製する前のナノ構造粒子溶液をクロロホルム／ヘキサン混合溶媒（体積比：４／６）で１０倍に希釈し、動的光散乱式ナノトラック粒度分析計（ＵＰＡ−ＥＸ１５０、日機装株式会社）を用いて算出した。
【０１６３】
［アッセイ発光シグナルの評価］
実施例１〜９及び比較例１〜２で実施したそれぞれの蛍光量測定のアッセイ蛍光シグナルに注目し、比較例１のアッセイ発光シグナルを基準として、以下の通り評価した。結果を表１に示した。なお、アッセイノイズシグナルについては、実施例１〜９及び比較例１〜２においてそれぞれ測定したものの、いずれのアッセイノイズシグナルの値にも大差はなかった。また、アッセイ発光シグナルは、工程（ｄ）で得たもので評価したが、工程（ｃ）以降であれば、どのような時に測定したとしても同様の結果が得られる。
【０１６４】
Ａ：比較例１のアッセイ発光シグナルに比較し１．５倍を超える値である場合
Ｂ：比較例１のアッセイ発光シグナルに比較し１．３５倍以上、１．５倍未満である値である場合
Ｃ：比較例１のアッセイ発光シグナルに比較し１．２倍以上、１．３５倍未満である値である場合
Ｄ：比較例１のアッセイ発光シグナルに比較し１．０５倍以上、１．２倍未満である値である場合
Ｅ：比較例１のアッセイ発光シグナルに比較し１．０倍以上、１．０５倍未満である値である場合
【０１６５】
［Ｓ／Ｎ比のバラつきの評価］
実施例１〜９及び比較例１〜２で実施したそれぞれの蛍光量測定を全く同じ条件にて各々５回ずつ行い、上記アッセイ発光シグナルの評価と同じように、各々５回のアッセイ発光シグナルから該アッセイ発光シグナルの平均及び該アッセイ発光シグナルの標準偏差を求め、変動係数（ＣＶ値（％））にて以下の通り評価した。結果を表１に示した。なお、ＣＶ値（％）は、下記式に基づいて算出した。
ＣＶ値（％）＝（アッセイ発光シグナルにおける標準偏差／アッセイ発光シグナルの平均）×１００
Ａ：ＣＶ値（％）が０以上、８未満である場合
Ｂ：ＣＶ値（％）が８以上、１３未満である場合
Ｃ：ＣＶ値（％）が１３以上、１８未満である場合
Ｄ：ＣＶ値（％）が１８以上である場合
【０１６６】
【表２】
表２から、ナノ構造体を、蛍光色素を有する第２リガンドに接触させた実施例１〜１１は、比較例１〜２に比較しアッセイ発光シグナルが高く、蛍光測定時のアッセイ発光シグナルのバラつきが小さいことがわかる。これは、蛍光色素を有する第２リガンドにナノ構造体を接触させたことにより、第１リガンド−アナライト間、あるいは第２リガンド−アナライト間の解離が抑制されたためである。
【０１６７】
実施例３及び５では、「アッセイ発光シグナル」及び「バラつき」の評価が最も良かった。この理由として、「アッセイ発光シグナル」に関しては、ナノ構造粒子の材質が「金」であり、体積平均粒径が「１ｎｍ以上、５０ｎｍ以下の範囲」であり、第３リガンドの濃度が「１μｇ／ｍｌ以上、１００μｇ／ｍｌ以下の範囲」であり、接触が「第１リガンド及び第２リガンド」であるという本発明の最も好ましい形態を満たしているからである。そして、「バラつき」に関しては、第３リガンドの濃度が「１μｇ／ｍｌ以上、１００μｇ／ｍｌ以下の範囲」である、及び接触が「第１リガンド及び第２リガンド」であるという好ましい形態を満たしているからである。
【０１６８】
また、この表２から、リガンド−アナライト間の解離は、第３リガンドの濃度が大きいこと、第１リガンド及び第２リガンドと共に結合性を有する第３リガンドを用いることによりさらに抑制されていることがわかる（バラつきの評価より）。これは、第３リガンドの濃度が大きい方が、一つのナノ構造粒子に結合する第３リガンド数が単純に多くなるため、及び第３リガンドは第２リガンドのみに結合するより第１及び第２リガンドに結合する方がより強固に結合されるため解離がより抑制されるためである。
【０１６９】
一方、比較例１〜２は、ナノ構造体を用いていないので、リガンド−アナライト間の解離が抑制されず、解離が起こってしまった結果、各蛍光量測定で得られるアッセイ発光シグナルが実施例１〜１１に比較し低く、かつ蛍光測定時のアッセイ発光シグナルのバラつきが大きいので安定したアナライトの定量分析ができなかった。これは、比較例ではナノ構造体を用いていないために、各蛍光量測定において第１リガンド−アナライト間、あるいは第２リガンド−アナライト間で解離が起こってしまい、各蛍光量測定が同じ条件で行っているにも関わらず、測定したアッセイ発光シグナルにバラつきが生じてしまった結果である。
【符号の説明】
【０１７０】
Ａ 一つの第３リガンドを有するナノ構造体
Ｂ 二つの第３リガンドを有するナノ構造体
Ｃ 四つの第３リガンドを有するナノ構造体
Ｄ センサチップ
１ ナノ構造粒子
２ 第３リガンド
３ 透明支持体
４ 金属膜
５ 自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）
６ カルボキシメチルデキストラン
７ 第１リガンド
８ アナライト
９ 第２リガンド
１０ 蛍光色素
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン共鳴現象を応用した表面プラズモン励起増強蛍光分光法を用いて蛍光を測定する分析方法ならびにそれに用いられる定量分析用キットおよびアナライト解離抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、ナノメートルレベルの微細金属近傍において電子と光が共鳴する現象（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）現象や局在プラズモン共鳴（ＬＰＲ； Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ））を応用し、例えば生体内の極微少なアナライト（測定対象物）の検出が行われている。例えば、ＳＰＲ現象を応用した特定のアナライトの検出に用いられる測定としてＳＰＲ測定がある。ＳＰＲ測定は、プリズムなどの誘電体部材上に形成された金などの金属薄膜上においてＳＰＲ現象を誘起することで、金属薄膜上の極小さな屈折率変化を測定することを原理としている。例えば、アナライトに特異的に結合するリガンドを金属薄膜上に固定し、該金属薄膜上に特定のアナライトを含んだ試料を供給することで、特定のアナライトのリガンドへの結合によって屈折率変化が誘起され、特定のアナライトの定量分析が可能となる。
【０００３】
このようなＳＰＲ現象を応用した他の測定として、近年、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）を利用した測定方法（ＳＰＦＳ測定）が開発されている。このＳＰＦＳ測定は、励起光と金属薄膜中の電子振動がカップリングすることで形成される増強電場を励起エネルギーとして、リガンドに特異的に結合したアナライトを標識する蛍光色素が発する蛍光を測定する方法である。金属薄膜の極表面に形成される増強電場を利用した蛍光色素の蛍光発光を測定するため、例えば、リガンド−アナライト間の結合等によって増強電場中に配置された蛍光色素からの蛍光シグナルを極めて効率的に測定することが可能で、高いシグナル（Ｓ）と低いノイズ（Ｎ）に裏付けられた高感度かつ高精度な分析（高いＳ／Ｎ比）により、ＳＰＲ測定による屈折率変化の測定よりもさらに高精度に特定のアナライトの定量分を行うことができる。
【０００４】
このようなＳＰＦＳを利用して蛍光量を測定する特定のアナライトの定量分析において、本出願人は、さらに高いＳ／Ｎ比を得るための改良を施した、技術を既に出願している（例えば、特許文献１）。この特許文献１には、金属薄膜上にアナライトと特異的に結合するリガンド（以下、第１リガンドともいう）を備えたセンサに、特定のアナライトを含む溶液を供給して第１リガンドにアナライトを補足させ、アナライトを標識するための蛍光色素を有し且つアナライトと特異的に結合するリガンド（以下、第２リガンドともいう）を含む溶液を供給して第１リガンドと結合されたアナライトに、該アナライトを標識するための蛍光色素を有する第２リガンドを結合させ、その後、金属コロイド粒子を分散させたコロイド液を供給しつつ蛍光色素の蛍光量を測定することで、通常の表面プラズモン共鳴による電場増強効果に、該金属コロイド粒子からの局在プラズモン共鳴による電場増強効果を組み合わせて、通常の表面プラズモン共鳴による蛍光量の測定よりも、さらに蛍光増幅を図り、より高いＳ／Ｎ比を得る高感度かつ高精度にアナライトの定量分析を行う方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−１４５２７２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１に記載の定量分析方法は、ＳＰＦＳを利用して蛍光量を測定するアナライトの定量分析において、より高いＳ／Ｎ比を得るための一つの手法である。しかしながら、特許文献１には、第１リガンドとアナライトとの結合や該アナライトと第２リガンドとの結合といった、リガンド−アナライト間の結合そのものに関する課題については何ら言及されていない。上記記載の技術のようにリガンド−アナライト間の結合により金属薄膜の極表面に局在化された蛍光色素に基づくアナライトの定量分析においては、リガンド−アナライト間の結合が解離すること（以下、リガンド−アナライト間の解離ともいう）によって一旦は局在化された蛍光色素が分散してしまうといった問題がある。特に、ＳＰＦＳを利用して蛍光量を測定する定量分析においては、蛍光色素の存在が必須であり、蛍光性を有しないアナライトを分析するにあたっては、金属膜上に設けられ、アナライトと特異的に結合する第１リガンド以外に、該第１リガンドに捕捉されたアナライトを第１リガンドとサンドイッチするような形態でアナライトと特異的に結合する、蛍光色素を有する第２リガンドが多用される。そのため、１つのアナライトに対して、少なくとも二個以上のリガンド（第１リガンド及び第２リガンド）が必要なＳＰＦＳ測定では、ＳＰＲ測定よりもリガンド−アナライト間の解離が生じてしまう危険性が高いと言える。
【０００７】
このことは特に、精度が要求されるＳＰＦＳ測定にとって、本来のシグナル（Ｓ）を失うことによるＳ／Ｎ比の低下や変動を生じさせる致命的な問題である。このような問題がＳＰＦＳを利用して蛍光量を測定する定量分析の汎用を困難にさせている要因の一つとなっていることがわかった。
【０００８】
本発明は、上記の点に鑑みてなされたものであり、表面プラズモン励起増強蛍光分光法を利用して蛍光量を測定する定量分析方法において、リガンド−アナライト間の解離を抑制することができ、得られるシグナル（以下、アッセイ発光シグナルともいう）の変動が抑制された高感度且つ高精度な検出を行うことができる定量分析方法、ならびにそれに用いられる定量分析用キット及びアナライト解離抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係るアナライトの定量分析方法は、透明支持体、該透明支持体上に形成された金属膜、および該金属膜上に固定され、かつアナライトに特異的に結合する第１リガンドを備えたセンサチップと、表面プラズモンにより励起されて蛍光する蛍光色素を有し、かつ前記アナライトに特異的に結合する第２リガンドと、ナノ構造粒子、および第２リガンドに特異的に結合する第３リガンドを有し、該第３リガンドが該ナノ構造粒子上に固定されてなるナノ構造体とを用いた、表面プラズモン励起増強蛍光分光法によるアナライトの定量分析方法であって、下記工程（ａ）〜（ｃ）を実施して、下記工程（ｄ）を実施することを特徴とする。
【００１０】
工程（ａ）：前記センサチップ上の第１リガンドと前記アナライトとを接触させて、該第１リガンドにアナライトを結合させる工程
工程（ｂ）：前記第２リガンドと前記アナライトとを接触させて、該第２リガンドにアナライトを結合させる工程
（ｃ）：前記第２リガンドに前記ナノ構造体を接触させて、該第２リガンドにナノ構造体を結合させる工程
（ｄ）：前記センサチップの透明支持体を介して前記金属膜に励起光を照射して表面プラズモンを生じさせ、該表面プラズモンにより蛍光色素を励起させて蛍光を生じさせ、該蛍光の蛍光量を測定する工程
【００１１】
本発明の定量分析方法において、前記ナノ構造体の体積平均粒径は、１ｎｍ以上、５０ｎｍ以下であることが好ましい。
本発明の定量分析方法において、前記ナノ構造体は、前記ナノ構造粒子上に複数の前記第３リガンドが固定されてなることが好ましい。
【００１２】
本発明の定量分析方法において、前記ナノ構造体は、前記ナノ構造粒子上に、前記第２リガンドおよび第１リガンドに特異的に結合する第３リガンド（Ａ）が、および／または、第３リガンドと、第１リガンドに特異的に結合する第３´リガンドとが固定されてなり、前記工程（ａ）〜（ｂ）を任意の順でまたは同時に実施して、工程（ｃ）〜（ｄ）を順次実施し、工程（ｃ）において、前記ナノ構造体を前記第２リガンドに接触させるとともに、前記第１リガンドにも接触させて、前記ナノ構造体に前記第２リガンドおよび前記第１リガンドを結合させる工程を実施することが好ましい。
【００１３】
本発明の定量分析方法において、前記ナノ構造体は、金属で構成されたナノ構造粒子を含むことが好ましい。
本発明の定量分析方法において、前記工程（ａ）、前記工程（ｂ）及び前記工程（ｃ）を順次実施することが好ましい。
【００１４】
本発明の定量分析方法において、前記センサチップが、金属膜上に、さらにカルボキシメチルデキストラン層を備え、前記第１リガンドが該カルボキシメチルデキストラン層に固定化されてなることが好ましい。
【００１５】
本発明に係る表面プラズモン励起増強蛍光分光法によるアナライトの定量分析に用いるためのキットは、透明支持体、該透明支持体上に形成された金属膜、および該金属膜上に固定され、かつアナライトに特異的に結合する第１リガンドを備えたセンサチップと、表面プラズモンにより励起されて蛍光する蛍光色素を有し、かつ前記アナライトに特異的に結合する第２リガンドと、ナノ構造粒子、および第２リガンドに特異的に結合する第３リガンドを有し、該第３リガンドが該ナノ構造粒子上に固定されてなるナノ構造体とを含むことを特徴とする。
【００１６】
本発明に係るアナライト解離抑制剤は、透明支持体、該透明支持体上に形成された金属膜、および該金属膜上に固定され、かつアナライトに特異的に結合する第１リガンドを備えたセンサチップと、表面プラズモンにより励起されて蛍光する蛍光色素を有し、かつ前記アナライトに特異的に結合する第２リガンドと、ナノ構造粒子、および第２リガンドに特異的に結合する第３リガンドを有し、該第３リガンドが該ナノ構造粒子上に固定されてなるナノ構造体とを用いた、表面プラズモン励起増強蛍光分光法によるアナライトの定量分析方法において、第１リガンドおよび第２リガンドとアナライトとの解離を抑制するために使用され、ナノ構造粒子、および第２リガンドに特異的に結合する第３リガンドを有し、該第３リガンドが該ナノ構造粒子上に固定されてなるナノ構造体を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１７】
本発明に係る、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）を利用して蛍光量を測定する定量分析方法は、特定のナノ構造体を用いることで、測定対象物（アナライト）と第１リガンド（アナライトに対して特異的な結合性を有する分子）間の解離や、アナライトと蛍光色素を有する第２リガンド（アナライトに対して特異的な結合性を有する分子）間の解離を抑制することができ、本来の測定されるべきシグナルの変動を抑制することができる。そのため、本発明は、従来よりも高感度且つ高精度な検出を行うことができる定量分析方法、ならびに該定量分析方法に用いられ、高感度且つ高精度な検出を可能にする定量分析用キットおよびアナライト解離抑制剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ナノ構造体を示した図面である。図１（ａ）は、ナノ構造粒子１粒子あたりに一つの第３リガンドを備えるナノ構造体の形態を示す図面である。図１（ｂ）は、ナノ構造粒子１粒子あたりに二つの第３リガンドを備えるナノ構造体の形態を示す図面である。図１（ｃ）は、ナノ構造粒子１粒子あたりに四つの第３リガンドを備えるナノ構造体の形態を示す図面である。
【図２】図２は、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）を利用する蛍光定量分析において、ナノ構造体を用いた際のＳＰＦＳセンサチップ表面の好ましい一態様を模式的に示した概念図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）を利用して蛍光量を測定する定量分析方法において、少なくとも第２リガンドに対して結合性を有する第３リガンドとナノ構造粒子を有するナノ構造体を、該第２リガンドに接触させる工程を有することを特徴とし、好ましくはＳＰＦＳセンサチップ表面にあらかじめ固定化されている第１リガンドに対しても結合性を有する第３リガンドとナノ構造粒子を有するナノ構造体を、該第１リガンドにも接触させる工程を有することである。このような工程を有することにより、リガンド−アナライト間の解離を抑制することができる。
【００２０】
なお、リガンド−アナライト間の解離抑制とは、第１リガンドとアナライト間の解離抑制、あるいは第２リガンドとアナライト間の解離抑制を指し、ナノ構造体は、少なくともどちらか一方の解離を抑制するものである。
【００２１】
また、第３リガンドを有するナノ構造体の好ましい形態としては、一つのナノ構造粒子に対し、二つ以上の（複数の）第３リガンドを有する形態である。このように、一つのナノ構造粒子中の二つ以上の（複数の）第３リガンドを各々、上記工程（Ｃ）において、第２リガンドに、好ましくは第２リガンドや第１リガンドに結合させる際に、ナノ構造粒子１粒子中１つの第３リガンドを有する形態に比較して、第３リガンドが上記リガンドに強固に結合するので、効果的に解離を抑制することができる。
【００２２】
すなわち、一つのナノ構造粒子に対し二つ以上の第３リガンドが固定されていると、それぞれの第３リガンドが各々異なる第２リガンドに結合することができる。さらには、後述するように、前記ナノ構造体は、前記ナノ構造粒子上に、前記第２リガンドおよび第１リガンドに特異的に結合する第３リガンド（Ａ）が、および／または、第３リガンドと、第１リガンドに特異的に結合する第３´リガンドとが固定されてなる場合、第３リガンド（Ａ）が第２リガンドだけでなく第１リガンドにも結合したり、第３リガンドおよび第３´リガンドがそれぞれ第２リガンドおよび第１リガンドに結合したりすることが可能となる。
【００２３】
このような場合、ナノ構造体により第２リガンド−第２リガンド間や第２リガンド−第１リガンド間を架橋する形態となり、リガンド−アナライト間の解離を効果的に抑制することができる。
【００２４】
なお、ナノ構造体が、一つのナノ構造粒子に対し、一つの第３リガンドを有する形態である場合、第２リガンドに対する結合部位が異なるリガンドを有する２種類以上のナノ構造体を使用することが好ましい。このようなナノ構造体を用いると、アナライトに結合した第２リガンドに、各異なる部位で複数のナノ構造体が結合して、アナライトが解離し難い構造を採ることができる。
【００２５】
以下、本発明のＳＰＦＳを利用して蛍光量を測定する定量分析方法及び蛍光定量分析用キットについて具体的に説明する。
なお、本発明では、蛍光分析の対象となる物質（主に生体関連物質）を「アナライト」と称し、アナライトと特異的に結合する物質を「第１リガンド及び第２リガンド」と称する。第１リガンドは、アナライトに対して特異的な結合性を有し、ＳＰＦＳセンサチップ表面にあらかじめ固定化されている分子である。第２リガンドは、アナライトに対して特異的な結合性を有し、蛍光性を有する分子である。
【００２６】
そして、ナノ構造体の構成物であり、少なくとも第２リガンドに対して特異的な結合性を有するリガンドを「第３リガンド」と称し、「第３リガンド」の中でも、第１リガンドに対しても特異的な結合性を有するリガンドを「第３リガンド（Ａ）」と称する。
【００２７】
〈ナノ構造体〉
本発明に係るナノ構造体は、図１（ａ）〜（ｃ）に示すように、ナノ構造粒子１、および第２リガンドに特異的に結合する第３リガンド２を有し、該第３リガンド２が該ナノ構造粒子上に固定されてなり、第１リガンドとアナライト間の解離、または第２リガンドとアナライト間の解離を抑制する目的で用いられる。
【００２８】
ナノ構造体として、図１（ａ）は、ナノ構造粒子１に第３リガンド２が一つ固定されてなる態様（ナノ構造体Ａ）、図１（ｂ）は、ナノ構造粒子１に第３リガンド２が二つ固定されてなる態様（ナノ構造体Ｂ）、図１（ｃ）は、ナノ構造粒子１に第３リガンド２が四つ固定されてなる態様（ナノ構造体Ｃ）を示す。このように、本発明に係るナノ構造体は、一つのナノ構造粒子に対し、１つ以上の第３リガンドが結合しているものであり、好ましい態様としては２つ以上（複数）の第３リガンドが結合しているものである。ナノ構造粒子に結合する第３リガンドの数を２つ以上にするには、例えば、ナノ構造体を作製する際に、単純にナノ構造粒子の数に対し第３リガンドの数を増やして結合させることで可能である。具体的には、ナノ構造粒子に第３リガンドを１つ結合させる場合に比べて、第３リガンドの濃度を高くすることで２つ以上結合させることができる。
【００２９】
ナノ構造粒子と第３リガンドとの結合（第３リガンドの固定化）は、物理吸着によるものや化学吸着によるものに限定されない。化学吸着としては、本来の（修飾されていない）第３リガンドがナノ構造粒子と直接反応して結合する場合に限らず、いわゆるリンカー分子、スペーサー分子のように、本来は結合し得ない２つの物質を連結する機能を果たす所定の分子を介してそれらが結合する場合や、ナノ構造粒子（コア）の表面に特定の被覆層（シェル）が形成されていて、第３リガンドがその被覆層と結合する（第３リガンドが被覆層を介してナノ構造粒子に結合する）場合などがあげられる。また、これらの結合が直接的であるか間接的であるかも問わない。後述する蛍光色素と第２リガンドとの結合についても同様である。
【００３０】
第３リガンドは、公知の方法に従ってナノ構造粒子上（ナノ構造粒子の表面またはナノ構造粒子の表面に形成された被覆層）に結合し得る（固定され得る）。例えば、ナノ構造粒子上（ナノ構造粒子の表面またはナノ構造粒子の表面に形成された被覆層）に結合する官能基（チオール基、シラノール基等）を一端に有し、もう一端に第３リガンドと結合しうる官能基（アミノ基、カルボキシル基、水酸基等）を有する分子（ＳＡＭ、シランカップリング剤など）を用いて、第３リガンドをナノ構造粒子上（ナノ構造粒子の表面またはナノ構造粒子の表面に形成された被覆層）に結合させることができる。このような官能基を有する分子であるＳＡＭ試薬としては、例えば１０−カルボキシ−１−デカンチオール、７−カルボキシ−１−ヘプタンチオール、５−カルボキシ−１−ペンタンチオール、チオセミカルバジド、チオ尿素、チオアセトアミド、チオカルバジド（チオカルボヒドラジド）、１１−アミノ−１−ウンデカンチオール、８−アミノ−１−オクタンチオール、６−アミノ−１−ヘキサンチオールが挙げられる。また、シランカップリング剤としては、たとえば（Ｍｅ）2ＳｉＣｌ−（ＣＨ2）m−ＣＯ−ＮＨＳ、２−（３，４−エポキシシクロヘキシル）エチルトリメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−２−（アミノエチル）−３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−２−（アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−２−（アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシランが挙げられる。第３リガンドをナノ構造粒子上に固定するにあたっては、上記のような分子を先に第３リガンドと反応させて第３リガンド誘導体を調製し、得られた第３リガンド誘導体をナノ構造粒子の表面または上記被覆層と反応させてもよいし、また先にナノ構造粒子の表面または上記被覆層と反応させて、そのような分子で表面が修飾されたナノ構造粒子に第３リガンドを反応させてもよい。反応条件を調整することにより、ナノ構造粒子に結合する第３リガンドの数（密度）を増減させることも可能である。
【００３１】
〈第３リガンド〉
第３リガンドは、後述する第２リガンドに反応性を有するものであり、好ましくは第１リガンドにも反応性を有する（第２リガンドおよび第１リガンドに特異的に結合する機能を有する）リガンド（第３リガンド（Ａ））である。また、ナノ構造体は、前記ナノ構造粒子上に、第３リガンドとして、第３リガンド（Ａ）が固定されてなることや、前記ナノ構造粒子上に、第３リガンドと、第１リガンドに特異的に結合する第３´リガンドとが固定されてなることが好ましい。本発明の定量分析方法において、このようなナノ構造体を用いる場合、前記工程（ａ）〜（ｂ）を任意の順でまたは同時に実施して、工程（ｃ）〜（ｄ）を順次実施し、工程（ｃ）において、前記ナノ構造体を前記第２リガンドに接触させるとともに、前記第１リガンドにも接触させて、ナノ構造体に前記第２リガンドおよび第１のリガンドを結合させる工程を実施する。
【００３２】
なお、第３リガンドは、少なくとも第２リガンドに反応し得る分子または分子断片であるが、このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、上記「タンパク質」としては、例えば、抗体などが挙げられ、具体的には、抗αフェトプロテイン〔ＡＦＰ〕モノクローナル抗体（（株）日本医学臨床検査研究所などから入手可能）、抗ガン胎児性抗原〔ＣＥＡ〕モノクローナル抗体、抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体、抗ＰＳＡモノクローナル抗体及び抗ｃＴｎｌモノクローナル抗体などが挙げられる。
【００３３】
なお、本明細書において、「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、遺伝子組換えにより得られる抗体、および抗体断片を包含する。抗体断片は、例えば、抗体（Ｆａｂ領域およびＦｃ領域を含む全体）ではなく、Ｆａｂ、Ｆａｂ‘、Ｆ（ａｂ’）2などの抗原認識部位を有する抗体断片などである。
【００３４】
〈ナノ構造粒子〉
本発明に係るナノ構造体の一部を構成するナノ構造粒子は、たとえば、その体積平均粒径が１ｎｍ以上、１００ｎｍ以下の範囲にあるものを指し、その形状及び材質は特に限定されない。好ましくは体積平均粒径が１以上、５０ｎｍ以下の範囲にあるものであり、上記ナノ構造粒子の大きさの平均が、そのような範囲にあるナノ構造粒子の集団を利用することが好適である。なお、ナノ構造粒子が被覆層を有する場合には、被覆層を含めた大きさが上記の範囲であることを意味する。また、本発明におけるナノ構造粒子は、微細粒子の集合体であってもよい。ＳＰＦＳ法を用いた蛍光量測定では、蛍光色素を励起するため表面プラズモンを用いるが、この表面プラズモンは、後述する金属膜の厚さ、励起波長、誘電体屈折率等の条件によっては、金属膜上２００以上、３００ｎｍ以下の範囲と限られた領域にしか生じないため、ナノ構造粒子の体積平均粒径が１００ｎｍを超えてしまうと、蛍光色素からの発光を該ナノ構造粒子が遮光してしまう可能性が高くなり蛍光色素からの蛍光量を測定できず、アナライトの高感度検出には不向きである。上述のナノ構造粒子の体積平均粒径は、例えば、ナノトラック粒度分布測定装置 ＵＰＡ−ＥＸ１５０（日機装製、動的光散乱法／レーザードップラー法）で測定されたものである。具体的な測定方法としては、ナノ構造粒子が分散された分散液を測定濃度範囲に調整して測定する。その際、あらかじめ分散液の分散溶媒のみでバッククラウンド測定をしておく。この測定法により、本発明で用いられるナノ構造粒子の体積平均粒径範囲を測定することが可能である。
【００３５】
形状については、任意の形状のものでよく、例えば、球状、楕円状または円柱状などの形状を有するものも挙げられるが、好ましい形状としては球状である。このように本発明のナノ構造粒子は様々な形状を有するものであり、様々な形状のなか体積平均粒径が１ｎｍ以上、１００ｎｍ以下の範囲にあるものとは、そのナノ構造粒子が取り得る最大の大きさ（長さ）が１ｎｍ以上、１００ｎｍ以下の範囲にあるものを指し、例えばナノ構造粒子が長方体に近いような形状の場合、対角線の長さが１ｎｍ以上、１００ｎｍ以下の範囲にあるものである。上記の体積平均粒径の測定方法は、既存の測定装置等で測定できる。例えば、電子顕微鏡による目視の測定や、粒度分布測定装置により体積粒度分布から体積平均粒子径の測定が挙げられる。ナノ構造粒子に前述の第３リガンドが結合している場合は、第３リガンドを処理してからナノ構造粒子を測定する。処理方法としては、ナノ構造粒子の構造が壊れたり、その特性を失ったりしなければ特に限定はなく、例えば、第３リガンドを酸やアルカリで処理したり、熱をかけて処理したり、あるいは紫外線を照射して処理したりすることができる。
【００３６】
材質については、有機物質、無機物質あるいはこれらのハイブリット物質等に限定されないが、好ましくは無機物質であり、無機物質の中でも金属が好ましく用いられる。金属の種類としては、特に限定されるものではないが、金、銀、銅、アルミニウム、白金、亜鉛、またはこれら２種以上の合金が好ましい。また、半導体素材であるＣｄＳｅやＣｄＴｅといったナノメートル−スケールの結晶から成る物質を用いることもできる。これらの半導体素材は光学特性を改良するため半導体シェル（ＺｎＳ） がコーティングされていても良い。
【００３７】
さらに、酵素などのタンパク質を用いることもできる。このタンパク質には、アミノ酸 だけからなる単純タンパク質や、核酸 ・リン酸 ・脂質 ・糖・金属 などを含む複合タンパク質 等に限定されない。また、分子の形状も、繊維状タンパク質 や、球状タンパク質 等に限定されるものではない。
【００３８】
具体的なナノ構造粒子として好ましく用いられるのは、金属粒子である。金属粒子の場合には、さらに局在プラズモンを誘起させることが可能である。このような金属粒子と第３リガンドを有するナノ構造体を、励起された表面プラズモンの電場増強効果が生じる金属膜から２００ｎｍ程度の範囲に配置することで、局在プラズモンを誘起させると共にアナライトとリガンドとの解離を抑制することができる。この局在プラズモンは、表面プラズモンによる電場増強効果と合わさることにより、電場増強効果は非常に高くなり、その電場増強効果は、金属粒子が存在しない場合と比べて７０倍程度に上る。金属粒子を構成する金属種には、特に制限はないものの、試料等に対する化学的安定性が高く、可視光によりプラズモン共鳴が効率的に発生することから、金、銀、白金等の金属、あるいはこれらの合金が好ましく、その中で、金が特に好ましい。また、この金属粒子を構成する金属は、後述する金属膜を構成する金属と同じでもよく、あるいは異なっていてもよい。
【００３９】
このような金属粒子は、様々な粒径を有する金属粒子のコロイド溶液の形態で市販品として入手可能である。あるいは、このような金属粒子を、従来公知の方法、例えば、ＨＡｕＣｌ4、Ｈ2ＰｔＣｌ4、硝酸銀などの金属化合物の溶液を還元することによって得ることもできる。
【００４０】
また、この「コロイド液」中での金属粒子の分散性を向上させ、また、非特異吸着を防止するため、金属粒子の表面にＰＥＧ（ポリエチレングリコール）修飾等の表面処理を施すことが望ましい。ＰＥＧ修飾金属コロイド粒子は、例えば、特開２００１−２０００５０号公報および特開２００５−３２８８０９号公報等に記載されているように、メルカプト基またはポリアミンを有するＰＥＧを金属微粒子と混合することによる調製することができる。あるいは、ＨＡｕＣｌ4、Ｈ2ＰｔＣｌ4、硝酸銀などの金属化合物の溶液を還元する際に、このような官能基を有するＰＥＧを共存させることにより調製してもよい。
【００４１】
また、ナノ構造粒子は、誘電体からなる層で被覆されていてもよい。そのような誘電体層を構成する誘電体としては、たとえばＳｉＯ2やデキストランまたはその誘導体（カルボキシメチルデキストラン等）が好適であり、その他の公知の誘電体を用いることもできる。
【００４２】
表面に誘電体からなる層が形成されたナノ構造粒子は公知の方法に従って調製することができる。たとえば、ナノ構造粒子または被覆層に結合する官能基（チオール基、シラノール基等）を一端に有し、もう一端にデキストラン等の還元性末端のアルデヒド基等と結合しうる官能基（アミノ基等）を有する分子（いわゆるシランカップリング剤）を用いることにより、デキストラン等でナノ構造粒子表面を修飾することができる。また、ＳｉＯ2からなる層を有するナノ構造粒子は、ナノ構造粒子を酸性ケイ酸液に添加するなどの方法により調製することができる。
【００４３】
〈ＳＰＦＳを利用するセンサチップ〉
本発明に用いられる、ＳＰＦＳを利用する蛍光定量分析において、ナノ構造体を用いた際のＳＰＦＳセンサチップ（以下、単にセンサチップともいう）の好ましい一態様を模式的に示した概念図を図２に示す。図２に示すように、本発明に用いられるセンサチップＤは、透明支持体３上に少なくとも金属膜４、アラライト８と特異的に結合する第１リガンド７を備えている。
【００４４】
そして、適宜必要に応じて、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）５、固相化層６をセンサチップＤに備えても良い。
なお、図２に示す固相化層６を形成するカルボキシメチルデキストランは３次元構造を備えるものであるが、デキストラン１本１本がそれぞれ垂直に近い状態で透明支持体３上に固定化されていてもよく、デキストラン等の１本が複数箇所で透明支持体３上に固定化されていてもよく、本発明はいずれの態様にも限定されるものではない。
【００４５】
〈透明支持体〉
後述する金属膜への励起光の照射をこの透明支持体を通じて行うため支持体は透明なものを用いる。
【００４６】
透明支持体は、本発明の目的が達せられる限り、材質に特に制限はない。例えば、この透明支持体はガラス製であってもよく、また、ポリカーボネート〔ＰＣ〕、シクロオレフィンポリマー〔ＣＯＰ〕などのプラスチック製であってもよい。
【００４７】
また、透明支持体は、ｄ線（５８８ｎｍ）における屈折率〔ｎd〕が好ましくは１．４０以上、２．２０以下であり、厚さが好ましくは０．０１ｍｍ以上、１０ｍｍ以下、より好ましくは０．５ｍｍ以上、５ｍｍ以下である。大きさ（縦×横）は特に限定されない。透明支持体はプリズム形状であっても良い。
【００４８】
なお、ガラス製の透明支持体は、市販品として、ショット日本（株）製の「ＢＫ７」（屈折率〔ｎd〕１．５２）および「ＬａＳＦＮ９」（屈折率〔ｎd〕１．８５）、（株）住田光学ガラス製の「Ｋ−ＰＳＦｎ３」（屈折率〔ｎd〕１．８４）、「Ｋ−ＬａＳＦｎ１７」（屈折率〔ｎd〕１．８８）および「Ｋ−ＬａＳＦｎ２２」（屈折率〔ｎd〕１．９０）、ならびに（株）オハラ製の「Ｓ−ＬＡＬ１０」（屈折率〔ｎd〕１．７２）などが、光学的特性と洗浄性との観点から好ましい。
【００４９】
透明支持体の表面に金属膜を形成する前に、透明支持体の表面を酸および／またはプラズマにより洗浄することが好ましい。
酸による洗浄処理としては、０．００１ｍｏｌ／リットル以上、１ｍｏｌ／リットル以下の塩酸中に、１時間以上、３時間以下浸漬することが好ましい。
【００５０】
プラズマによる洗浄処理としては、例えば、プラズマドライクリーナー（ヤマト科学（株）製の「ＰＤＣ２００」）中に、０．１分間以上、３０分間以下の範囲で浸漬させる方法が挙げられる。
【００５１】
〈金属膜〉
センサチップは、上述した透明支持体上に金属膜を備える。金属膜は、光源からの照射光（励起光）により表面プラズモンを発生させる役割を有する。この金属膜は、光源から照射された励起光により表面プラズモンを誘起させ、さらには該表面プラズモンにより後述する蛍光色素を効率的に励起させる役割を有する。
【００５２】
上記透明支持体の表面に形成される金属膜の金属としては、金、銀、アルミニウム、銅および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなることが好ましく、金からなることがより好ましい。また、金属膜は、これらの金属の幾つかの合金からなる形態であってもよく、また金属膜を複数積層したものであってもよい。このような金属種は、酸化に対して安定であり、かつプラズモン共鳴による電場増強が大きくなることから好適である。
【００５３】
なお、透明支持体としてガラス製の支持体を用いる場合には、ガラスと上記金属膜とをより強固に接着するために、あらかじめクロム、ニッケルクロム合金またはチタンの薄膜を透明支持体上に形成することが好ましい。
【００５４】
透明支持体上に金属膜を形成する方法としては、例えば、スパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法等）、電解メッキ法、無電解メッキ法などが挙げられる。膜形成条件の調整が容易なことから、スパッタリング法または蒸着法により金属膜を形成することが好ましい。また、あらかじめクロム、ニッケルクロム合金またはチタンの薄膜を透明支持体上に形成する場合も同様である。
【００５５】
金属膜の厚さとしては、金の場合５ｎｍ以上、５００ｎｍ以下、銀の場合５ｎｍ以上、５００ｎｍ以下、アルミニウムの場合５ｎｍ以上、５００ｎｍ以下、銅の場合５ｎｍ以上、５００ｎｍ以下、白金の場合５ｎｍ以上、５００ｎｍ以下、およびそれらの合金の場合５ｎｍ以上、５００ｎｍ以下が好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１ｎｍ以上、２０ｎｍ以下が好ましい。
【００５６】
電場増強効果の観点から、金：２０ｎｍ以上、７０ｎｍ以下、銀：２０ｎｍ以上、７０ｎｍ以下、アルミニウム：１０ｎｍ以上、５０ｎｍ以下、銅：２０ｎｍ以上、７０ｎｍ以下、白金：２０ｎｍ以上、７０ｎｍ以下およびそれらの合金：１０ｎｍ以上、７０ｎｍ以下がより好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１ｎｍ以上、３ｎｍ以下がより好ましい。金属膜の厚さが上記範囲内であると、表面プラズモンが発生し易いので好適である。また、金属膜の面積（縦×横）は特に限定されない。
【００５７】
〈自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）〉
ＳＡＭ〔Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；自己組織化単分子膜〕は、後述する固相化層を固相化する足場として、また蛍光測定の際に蛍光分子の金属消光を防止する目的で、上記金属膜の、上記支持体とは接していないもう一方の表面に形成される。
【００５８】
ＳＡＭを形成する単分子としては、通常、炭素原子数４以上、２０以下程度のカルボキシアルカンチオール（例えば、（株）同仁化学研究所、シグマ アルドリッチ ジャパン（株）などから入手可能）、特に好ましくは１０−カルボキシ−１−デカンチオールが用いられる。炭素原子数４以上、２０以下のカルボキシアルカンチオールは、それを用いて形成されたＳＡＭの光学的な影響が少ない、すなわち透明性が高く、屈折率が低く、膜厚が薄いなどの性質を有していることから好適である。
【００５９】
このようなＳＡＭの形成方法としては、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。具体例として、金属膜が形成された支持体を、１０−カルボキシ−１−デカンチオール（（株）同仁化学研究所製）を含むエタノール溶液に浸漬する方法などが挙げられる。この場合、１０−カルボキシ−１−デカンチオールが有するチオール基が、金属膜の金属と結合して固定化され、金属膜の表面上で自己組織化することにより、ＳＡＭが形成される。
【００６０】
また、ＳＡＭを形成する前に「誘電体からなるスペーサ層」を形成してもよく、この場合、ＳＡＭを形成する単分子としては、加水分解でシラノール基〔Ｓｉ−ＯＨ〕を与えるエトキシ基（またはメトキシ基）を有し、一端にアミノ基やグリシジル基、カルボキシル基などの反応基を有するシランカップリング剤であれば特に限定されず、従来公知のシランカップリング剤を用いることができる。
【００６１】
このような「誘電体からなるスペーサ層」に用いられる誘電体としては、光学的に透明な各種無機物、天然または合成ポリマーなどを用いることができる。その中で、化学的安定性、製造安定性および光学的透明性に優れていることから、二酸化ケイ素〔ＳｉＯ2〕、二酸化チタン〔ＴｉＯ2〕または酸化アルミニウム〔Ａｌ2Ｏ3〕を含む誘電体を用いることが好ましい。
【００６２】
誘電体からなるスペーサ層の厚さは、通常１０ｎｍ以上、１ｍｍ以下であり、共鳴角安定性の観点からは、好ましくは３０ｎｍ以下、より好ましくは１０以上、２０ｎｍ以下である。一方、電場増強の観点から、好ましくは２００ｎｍ以上、１ｍｍ以下であり、さらに電場増強の効果の安定性から、４００ｎｍ以上、１，６００ｎｍ以下がより好ましい。
【００６３】
誘電体からなるスペーサ層の形成方法としては、例えば、スパッタリング法、電子線蒸着法、熱蒸着法、ポリシラザン等の材料を用いた化学反応による形成方法、またはスピンコータによる塗布などが挙げられる。
【００６４】
〈固相化層〉
固相化層は、上記ＳＡＭの、上記金属膜とは接していないもう一方の表面に形成され、２次元構造、好ましくは３次元構造を有するものである。
【００６５】
この「３次元構造」とは、後述する第１リガンドの固定化を、「センサチップ」表面（およびその近傍）の２次元に限定することなく、該基板表面から遊離した３次元空間にまで広げられる固相化層の構造をいう。
【００６６】
このような固相化層は、グルコース，カルボキシメチル化グルコース，ならびにビニルエステル類，アクリル酸エステル類，メタクリル酸エステル類，オレフィン類，スチレン類，クロトン酸エステル類，イタコン酸ジエステル類，マレイン酸ジエステル類，フマル酸ジエステル類，アリル化合物類，ビニルエーテル類およびビニルケトン類それぞれに包含される単量体からなる群より選択される少なくとも１種の単量体から構成される高分子を含むことが好ましく、デキストランおよびデキストラン誘導体などの親水性高分子ならびにビニルエステル類，アクリル酸エステル類，メタクリル酸エステル類，オレフィン類，スチレン類，クロトン酸エステル類，イタコン酸ジエステル類，マレイン酸ジエステル類，フマル酸ジエステル類，アリル化合物類，ビニルエーテル類およびビニルケトン類それぞれに包含される疎水性単量体から構成される疎水性高分子を含むことがより好ましく、カルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕などのデキストランが生体親和性、非特異的な吸着反応の抑制性、高い親水性の観点から特に好適である。
【００６７】
ＣＭＤの分子量は、１ｋＤａ以上５，０００ｋＤａ以下が好ましく、４ｋＤａ以上１，０００ｋＤａがより好ましい。
固相化層（例えば、デキストランまたはデキストラン誘導体からなるもの）は、その密度として２ｎｇ／ｍｍ2未満を有することが好ましい。固相化層の密度は、用いる高分子の種類に応じて適宜調整することができる。上記高分子が上記ＳＡＭに、このような密度の範囲内で固相化されていると、ＳＰＦＳ用センサチップをアッセイ法に用いた場合に、アッセイのシグナルが安定化し、かつ増加するため好適である。なお、Ｂｉａｃｏｒｅライフサイエンス社製「Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５」の密度は２ｎｇ／ｍｍ2であった。この密度は、このＣＭ５基板および金膜のみの基板を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅライフサイエンス社製のＳＰＲ測定機器により得られた測定シグナルにおいて、平均２０００ＲＵを測定した結果、２ｎｇ／ｍｍ2と見積もられたものである。
【００６８】
固相化層の平均膜厚は、３ｎｍ以上８０ｎｍ以下であることが好ましい。この膜厚は原子間力顕微鏡〔ＡＦＭ〕などを用いて測定することができる。固相化層の平均膜厚がこのような範囲内であると、ＳＰＦＳ用センサチップをアッセイ法に用いた場合に、アッセイのシグナルが安定化し、かつ増加するため好適である。
【００６９】
固相化層の形成方法は、分子量１ｋＤａ以上５，０００ｋＤａ以下の上記高分子を０．０１ｍｇ／ｍＬ以上１００ｍｇ／ｍＬ以下、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕を０．０１ｍＭ以上３００ｍＭ以下及び水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕を０．０１ｍＭ以上５００ｍＭ以下含む、ｐＨ４．０以上ｐＨ６．５以下のＭＥＳ緩衝生理食塩水（イオン強度：０．１ｍＭ以上３００ｍＭ以下）に、金属膜を有する透明支持体を０．２時間以上３．０時間以下浸漬して形成される。
【００７０】
固相化層に含まれる高分子としては、好ましくはカルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕が用いられる。このような場合、カルボキシメチルデキストランは分子量１ｋＤａ以上５，０００ｋＤａ以下であり、上述したようなカルボキシメチルデキストランを０．０１ｍｇ／ｍＬ以上１００ｍｇ／ｍＬ以下、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕を０．０１ｍＭ以上３００ｍＭ以下及び水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕を０．０１ｍＭ以上５００ｍＭ以下含むＭＥＳ緩衝生理食塩水〔ＭＥＳ〕に、金属膜を有する透明支持体を０．２時間以上３．０時間以下浸漬し、カルボキシメチルデキストランを固定化することができる。
【００７１】
このようにして得られた固相化層の密度は、反応点数（ＳＡＭの官能基数）、反応溶液のイオン強度およびｐＨ、ならびにカルボキシメチルデキストラン分子のカルボキシル基数に対するＷＳＣ濃度によって調整することができる。また固相化層の平均膜厚は、カルボキシメチルデキストランの分子量および反応時間によって適宜調整することができる。
【００７２】
〈第１リガンド及び第２リガンド〉
第１リガンドは、検体中の特定のアナライトに特異的に結合して、アナライトを固定（捕捉）する目的で用いられるものを指し、上記固化層または金属膜に固定化される。固相化層が２次元構造の場合、第１リガンドは固層化層の外面に固定化され、固相化層が３次元構造の場合、第１リガンドは固相化層の層中および／または外面に固定化される。固相化層が３次元構造の場合、一般には第１リガンドの多くは固相化層の３次元構造の中に分散して固定化されることが好ましい。リガンドの種類としては、上述した第３リガンドと異なることが望ましい。
【００７３】
第２リガンドは、特定のアナライトに特異的に結合するものを指し、蛍光色素を有する（蛍光色素で標識化された）リガンドである。この第２リガンドは、特定のアナライトに蛍光色素による標識化を行う目的で用いられ、リガンドの種類としては、上述した第１リガンドと同じでもよいし、異なっていてもよいが、上述した第３リガンドとは異なることが望ましい。
【００７４】
ただし、第１リガンドとして用いる１次抗体がポリクローナル抗体である場合、第２リガンドとして用いる、２次抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよいが、該１次抗体がモノクローナル抗体である場合、２次抗体は、該１次抗体が認識しないエピトープを認識するモノクローナル抗体であるか、またはポリクローナル抗体であることが望ましい。
【００７５】
第２リガンドは、蛍光色素と反応させられ、蛍光色素を有するコンジュゲート（蛍光色素を有する第２リガンド）として作製される。蛍光色素を有する第２リガンドの作製方法としては、第２リガンドとして２次抗体を用いる場合、例えば、まず蛍光色素にカルボキシル基を付与し、該カルボキシル基を、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩〔ＥＤＣ〕など）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕とにより活性エステル化し、次いで活性エステル化したカルボキシル基と２次抗体が有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法；イソチオシアネートおよびアミノ基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；スルホニルハライドおよびアミノ基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；ヨードアセトアミドおよびチオール基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；ビオチン化された蛍光色素とストレプトアビジン化された２次抗体（あるいは、ストレプトアビジン化された蛍光色素とビオチン化された２次抗体）とを反応させ固定化する方法などが挙げられる。
【００７６】
なお、上記第１リガンドを固定化させた後に、後述する検体等がセンサチップに非特異的に吸着することを防止するため、センサチップの表面を牛血清アルブミン〔ＢＳＡ〕等のブロッキング剤により処理することが好ましい。
【００７７】
上記固相化層に固定化された第１リガンドの密度は、１フェムトｍｏｌ／ｃｍ2以上１ナノｍｏｌ／ｃｍ2以下が好ましく、１０フェムトｍｏｌ／ｃｍ2以上１００ピコｍｏｌ／ｃｍ2以下がより好ましい。第１リガンドの密度が上記範囲内であると、アッセイ蛍光シグナルの信号強度が大きくなるため好適である。
【００７８】
〈アッセイ（アナライトの定量分析方法）〉
本発明のアナライトの定量分析方法は、上述したセンサチップ（透明支持体、該透明支持体上に形成された金属膜、および該金属膜上に固定され、かつアナライトに特異的に結合する第１リガンドを備えたセンサチップ）と、上記第２リガンドの他に、上記ナノ構造体とを用いた、表面プラズモン励起増強蛍光分光法によるアナライトの定量分析方法である。ここで、本発明に係る孔ライトの定量分析方法は、下記工程（ａ）〜（ｃ）を実施した後に、下記工程（ｄ）を実施することを特徴とし、必要により下記の洗浄工程（１）〜（３）を実施してもよい。
【００７９】
工程（ａ）：前記センサチップ上の第１リガンドと前記アナライトとを接触させて、該第１リガンドにアナライトを結合させる工程
工程（ｂ）：前記第２リガンドと前記アナライトとを接触させて、該第２リガンドにアナライトを結合させる工程
（ｃ）：前記第２リガンドに前記ナノ構造体を接触させて、該第２リガンドにナノ構造体を結合させる工程
（ｄ）：前記センサチップの透明支持体を介して前記金属膜に励起光を照射して表面プラズモンを生じさせ、該表面プラズモンにより蛍光色素を励起させて蛍光を生じさせ、該蛍光の蛍光量を測定する工程
洗浄工程（１）：上記工程（ａ）を実施した後、センサチップ内を、洗浄液を用いて洗浄する工程
洗浄工程（２）：上記工程（ｂ）を実施した後、センサチップ内を、洗浄液を用いて洗浄する工程
洗浄工程（３）：上記工程（ｃ）を実施した後、センサチップ内を、洗浄液を用いて洗浄する工程
【００８０】
また、さらに工程（ｄ）の後、該工程（ｄ）で得られた測定結果から、アナライト量を算出する以下の工程（工程（ｅ））を含んでも良い。
工程（ｅ）：上記工程（ｄ）で得られた測定結果から、アナライト溶液中に含有されるアナライト量を算出する工程である。
【００８１】
［工程（ａ）］
工程（ａ）は、前記センサチップ上の第１リガンドと前記アナライトとを接触させて、該第１リガンドにアナライトを結合させる工程である。
【００８２】
（アナライト）
本発明において「アナライト」とは、金属膜上の第１リガンドに特異的に認識され（または、第１のリガンドを特異的に認識し）結合し得る分子または分子断片を意味する。このような「分子」または「分子断片」として、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチドを含む）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）、癌胎児性抗原等の腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモンなどであってもよく、特に限定されるものではない。
このアナライトは、アナライトを含む溶液の形で接触させることが好ましい。
【００８３】
（アナライト溶液）
アナライト溶液とは、測定対象となる種々のアナライトを含む溶液をいう。
アナライト溶液としては、アナライトを含む溶液であれば何れでもよいが、例えば、検体が挙げられる。検体としては、例えば、血液（血清・血漿）、尿、鼻孔液、唾液、便、体腔液（髄液、腹水、胸水等）などが挙げられ、所望の溶媒、緩衝液等に適宜希釈して用いてもよい。これら検体のうち、血液、尿、鼻孔液および唾液が好ましい。これらは１種単独で用いてもよく、また、２種以上を併用してもよい。
【００８４】
（アナライトの接触）
センサチップには流路が形成されていることが好ましく、流路中の少なくとも一部が透明支持体上に金属膜、金属膜上に第１リガンドを備えた構成とされ、アナライト溶液を前記流路中に送液して第１リガンドがアナライト溶液で浸漬されることにより、アナライトを第１リガンドに接触させる態様であることが好ましい。
【００８５】
「流路」の形状は、角筒（管）状であっても丸筒（管）状であってもよく、アナライトと第１リガンド等を結合させ、蛍光測定する反応部・測定部は角筒状であることが好ましく、それ以外の薬液等の送液のみに利用される流路部分は丸筒状であることが好ましい。
【００８６】
センサチップの外壁をなす部材、例えば流路基板と流路天板とで構成される場合等、それら部材の反応部・測定部に対応する部分（透明支持体）または流路天板の材料としては、メチルメタクリレート、スチレン等を原料として含有するホモポリマーまたは共重合体；ポリエチレン等のポリオレフィンなどからなり、流路部分はシリコーンゴム、テフロン（登録商標）、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリマーを用いることが好ましい。
【００８７】
反応部・測定部においては、アナライトとの接触効率を高め、拡散距離を短くする観点から、流路の断面として、縦と横がそれぞれ１００ｎｍ以上、１ｍｍ以下程度であることが好ましい。
【００８８】
センサチップに流路を形成する方法としては、小規模ロット（実験室レベル）では、まず、センサチップの金属膜が形成されている表面側に、流路高さ０．５ｍｍを有するポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕製シートを該センサチップの金属膜が形成されている部位を囲むようにして圧着し、次に、該ポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕製シートとセンサチップとをビス等の閉め具により固定する方法が好ましい。
【００８９】
工業的に製造される大規模ロット（工場レベル）では、センサチップに流路を形成する方法としては、センサチップに流路基板と流路天板に相当するプラスチックの一体成形品を形成する方法、または別途作製した金属膜が形成された支持体に流路基板を形成し、金属膜表面に（好ましくは誘電体からなるスペーサ層）ＳＡＭ、固定化層および第１リガンドの固定化を行った後に、流路天板に相当するプラスチックの一体成形品により、流路基板を形成されたセンサチップに蓋をする方法がある。
【００９０】
流路に送液するアナライト溶液において、アナライトを希釈するために用いる溶媒としては、例えば、リン酸緩衝生理食塩水〔ＰＢＳ〕、トリス緩衝生理食塩水〔ＴＢＳ〕、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水〔ＨＢＳ〕などが挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００９１】
第１リガンドに多くのアナライトを補足させるために、送液されたアナライト溶液を流路中に循環させることが好ましいが、その際のアナライト溶液の温度および時間としては、検体の種類などにより異なり、特に限定されるものではないが、通常２０℃以上、４０℃以下で１分間以上、６０分間以下、好ましくは３７℃で５分間以上、１５分間以下である。
【００９２】
アナライト溶液を流路に送液する場合、該アナライト溶液中に含有されるアナライトの初期濃度（送液前の濃度）は、１００μｇ／ｍｌ以上、０．００１ｐｇ／ｍｌ以下であってもよい。
【００９３】
流路に送液するアナライト溶液の総量は、通常０．００１ｍｌ以上、２０ｍｌ以下、好ましくは０．１ｍｌ以上、１ｍｌ以下である。
また、流路に送液するアナライト溶液の流速は、通常１μＬ／ｍｉｎ以上、５，００００μＬ／ｍｉｎ以下、好ましくは５，０００μＬ／ｍｉｎ以上、１，００００μｌ／ｍｉｎ以下である。
【００９４】
［洗浄工程］
洗浄工程としては、上記工程（ａ）を実施した後にセンサチップ内を洗浄液で洗浄する洗浄工程（１）、上記工程（ｂ）を実施した後にセンサチップ内を洗浄液で洗浄する洗浄工程（２）と、上記工程（ｃ）を実施した後にセンサチップ内を洗浄液で洗浄する工程（３）が挙げられる。
【００９５】
これら洗浄工程（１）〜（３）の何れかに使用される洗浄液は、例えば、工程（ａ）〜（ｃ）の何れかの反応で用いられた溶媒または緩衝液と同一種類の溶媒または緩衝液に、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ１００などの界面活性剤を好ましくは０．００００１質量％以上、１質量％以下含有するように溶解させたもの、または塩化ナトリウムや塩化カリウムなどの塩を１０ｍＭ以上、５００ｍＭ以下含有させたものであることが望ましい。あるいは、低ｐＨの緩衝液、例えば、１０ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ ＨＣｌで、ｐＨが１．５以上、４．０以下のものを洗浄液として用いてもよい。
【００９６】
洗浄工程における洗浄液の温度および流速は、上記工程（ａ）におけるアナライト溶液の送液時の温度および流速と同じであることが好ましい。
洗浄工程（洗浄液による洗浄時間）は、通常０．５分間以上、１８０分間以下、好ましくは５分間以上、６０分間以下である。
【００９７】
［工程（ｂ）］
工程（ｂ）は、前記第２リガンドと前記アナライトとを接触させて、該第２リガンドにアナライトを結合させる工程である。工程（ｂ）は、好ましくは上記工程（ａ）の後、さらに好ましくは上記洗浄工程（１）を経た後に実施される。
【００９８】
（蛍光色素）
「蛍光色素（蛍光分子ともいう）」は、所定の励起光を照射することによって、または電界効果を利用して励起することによって蛍光を発光する（表面プラズモンにより励起されて蛍光する）物質の総称であり、該「蛍光」は、燐光など各種の発光も含む。
【００９９】
本発明で用いられる蛍光色素は、金属膜による吸光に起因して完全に消光しない限りにおいて、その種類に特に制限はなく、公知の蛍光色素のいずれであってもよい。一般に、単色比色計〔ｍｏｎｏｃｈｒｏｍｏｍｅｔｅｒ〕よりむしろフィルタを備えた蛍光計の使用をも可能にし、かつ検出の効率を高める大きなストークス・シフトを有する蛍光色素が好ましい。
【０１００】
このような蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、クマリン・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ローダミン・ファミリーの蛍光色素（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス（株）製）、シアニン・ファミリーの蛍光色素、インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素、オキサジン・ファミリーの蛍光色素、チアジン・ファミリーの蛍光色素、スクアライン・ファミリーの蛍光色素、キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素、ピレン・ファミリーの蛍光色素、トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン（株）製）などが挙げられ、さらに米国特許番号第６，４０６，２９７号、同第６，２２１，６０４号、同第５，９９４，０６３号、同第５，８０８，０４４号、同第５，８８０，２８７号、同第５，５５６，９５９号および同第５，１３５，７１７号に記載の蛍光色素を用いることもできる。
【０１０１】
これらファミリーに含まれる代表的な蛍光色素の吸収波長（ｎｍ）および発光波長（ｎｍ）を表１に示す。
【０１０２】
【表１】
また、蛍光色素は、上記有機蛍光色素に限られない。例えば、Ｅｕ、Ｔｂ等の希土類錯体系の蛍光色素も用いることができる。希土類錯体は、一般的に励起波長（３１０以上、３４０ｎｍ以下程度）と発光波長（Ｅｕ錯体で６１５ｎｍ付近、Ｔｂ錯体で５４５ｎｍ付近）との波長差が大きく、蛍光寿命が数百マイクロ秒以上と長い特徴がある。市販されている希土類錯体系の蛍光色素の一例としては、ＡＴＢＴＡ−Ｅｕ3+が挙げられる。
【０１０３】
本発明においては、後述する蛍光量の測定を行う際に、金属膜に含まれる金属による吸光の少ない波長領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが望ましい。例えば、金属膜として金膜を用いる場合には、金膜による吸光による影響を最小限に抑えるため、最大蛍光波長が６００ｎｍ以上である蛍光色素を使用することが望ましい。したがって、この場合には、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７等近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが特に望ましい。このような近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることは、血液中の血球成分由来の鉄による吸光の影響を最小限に抑えることができる点で、検体として血液を用いる場合においても有用である。一方、金属膜として銀を用いる場合には、最大蛍光波長が４００ｎｍ以上である蛍光色素を使用することが望ましい。
【０１０４】
これら蛍光色素は１種単独でも、２種以上併用してもよい。
蛍光色素を有する第２リガンドを含む溶液をセンサチップに送液して反応させる際、送液される該溶液の濃度は、０．００１μｇ／ｍｌ以上、１０，０００μｇ／ｍｌ以下が好ましく、１μｇ／ｍｌ以上、１，０００μｇ／ｍｌ以下がより好ましい。
【０１０５】
この溶液を送液する際の溶液の温度、流速および工程（ｂ）の時間（送液時間）は、それぞれ上記工程（ａ）の場合と同様である。
【０１０６】
［工程（ｃ）］
工程（ｃ）は、第２リガンドに上記ナノ構造体を接触させて、該第２リガンドにナノ構造体を結合させる工程である。
【０１０７】
接触させる方法としては特に限定されず、例えば、上記工程（ｂ）を実施した後、センサチップにナノ構造体を含む溶液（ナノ構造体溶液）を送液して、上記第２リガンドにナノ構造体を接触させる方法、上記工程（ｂ）を実施した後、センサチップに、ナノ構造粒子含む溶液及び第３リガンドを含む溶液を別々に送液する方法が挙げられる。好ましくは上記工程（ｂ）を経たセンサチップにナノ構造体を含む溶液（ナノ構造体溶液）を送液して、上記第２リガンドにナノ構造体を接触させて、該第２リガンドにナノ構造体を結合させることである。
【０１０８】
このナノ構造体溶液の作製方法としては、例えば、ナノ構造粒子を含む溶液と第３リガンドを含む溶液とを混合してナノ構造粒子と第３リガンドを結合させて作製すること、あるいは、ナノ構造粒子単体（ナノ構造粒子と第３リガンドが初めから結合した単体）を溶液に入れ作製することが挙げられる。ナノ構造体を、ナノ構造粒子を含む溶液と第３リガンドを含む溶液とを混合して作製する場合、各溶液の濃度にもよるが、通常、ナノ構造粒子を含む溶液と第３リガンドを含む溶液とを、ナノ構造粒子の個数：第３リガンドの個数が１：１の割合になるように混合させると、１つのナノ構造粒子に対して、平均１つの第３リガンドが結合したナノ構造体を作製することができる。そして、ナノ構造粒子を含む溶液と第３リガンドを含む溶液とを、例えば、ナノ構造粒子の個数：第３リガンドの個数が１：２以上の割合になるように混合することで、１つのナノ構造粒子に対して、平均２つ以上（複数）の第３リガンドを結合させることができる。該ナノ構造粒子を含む溶液中のナノ構造粒子の濃度は、ナノ構造体粒子の粒径等により適宜異なるが、０．０１μｇ／ｍｌ以上、１０，０００μｇ／ｍｌ以下が好ましく、１μｇ／ｍｌ以上、１００μｇ／ｍｌ以下がより好ましい。
【０１０９】
なお、工程（ｂ）を実施した後のセンサチップに対して、上記洗浄工程（２）を行う方が好ましい。ナノ構造体を含む溶液に用いられる溶媒としては例えば、リン酸緩衝生理食塩水〔ＰＢＳ〕、トリス緩衝生理食塩水〔ＴＢＳ〕、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水〔ＨＢＳ〕などが挙げられるが、特に限定されるものではない。
【０１１０】
第２リガンドに多くの第３リガンドを結合させるために、好ましくは第２リガンド及び第１リガンドに多くの第３リガンドを結合させるために、送液されたナノ構造体溶液を流路中に循環させることが好ましい。その際のナノ構造体溶液の温度および循環させる時間としては、ナノ構造体の第３リガンドやナノ構造粒子等により異なり、特に限定されるものではないが、例えば、２０℃以上、４０℃以下で１分間以上、６０分間以下、好ましくは３０℃以上、３８℃以下で５分間以上、１５分間以下が挙げられる。
【０１１１】
流路に送液するナノ構造体溶液の総量は、通常０．００１ｍｌ以上、２０ｍｌ以下、好ましくは０．１ｍｌ以上、１ｍｌ以下である。
また、流路に送液するナノ構造体溶液の流速は、通常１μＬ／ｍｉｎ以上、５，００００μＬ／ｍｉｎ以下、好ましくは５，０００μｌ／ｍｉｎ以上、１，００００μｌ／ｍｉｎ以下である。
【０１１２】
上記第２リガンドとナノ構造体との接触は、詳細には、第２リガンドとナノ構造体の第３リガンド部の接触を指し、例えば、上述の工程（ｂ）で用いる「蛍光色素を有する第２リガンドを含む溶液」にナノ構造体を含有させて該溶液中で行っても良い。また、工程（ａ）で用いる「アナライト溶液」にナノ構造体を含有させて該溶液中で行っても良い。
【０１１３】
上述のように、上記第２リガンドとナノ構造体との接触方法は如何なる方法に限定されず、上記第２リガンドとナノ構造体とが接触すれば如何なる方法でも良い。
上記第２リガンドにナノ構造体を接触させた際に、ナノ構造体の第３リガンド部は第２リガンドと反応性を有するため、上記第２リガンドとナノ構造体の第３リガンド部は反応し結合する。このように、第２リガンドと第３リガンドを接触させ結合させることで、アナライト−第１リガンド間、及び／またはアナライト−第２リガンド間の解離を抑制することができる。
【０１１４】
［工程（ｄ）］
工程（ｄ）は、上記工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を実施した後、センサチップに、上記透明支持体の、上記金属膜を形成していないもう一方の表面から（透明支持体を介して）、励起光を照射し金属膜表面に表面プラズモンを生じさせ、該表面プラズモンにより蛍光色素を励起させて発光を生じさせ、該蛍光の蛍光量を測定する工程である。この工程において、表面プラズモンを生じさせる方法は特に限定されるものではないが、例えば、プリズムを経由してレーザ光（励起光）を照射して表面プラズモンを生じさせる方法等がある。この工程（ｄ）は、上記洗浄工程（３）を経た後のセンサチップに対して行うことが好ましい。
【０１１５】
（光学系）
蛍光を測定する際に照射される光源は、金属膜に表面プラズモンを生じさせることができるものであれば、特に制限がないものの、波長分布の単一性および光エネルギーの強さの点で、レーザ光（励起光）を光源として用いることが好ましい。レーザ光（励起光）は、光学フィルタを通して、プリズムに入射する直前のエネルギーおよびフォトン量を調節することが望ましい。
【０１１６】
レーザ光（励起光）の照射により、全反射減衰条件〔ＡＴＲ〕において、金属膜の表面に表面プラズモンが発生する。表面プラズモンの電場増強効果により、照射したフォトン量の数十倍以上、数百倍以下に増えたフォトンにより蛍光色素を励起する。なお、該電場増強効果によるフォトン増加量は、支持体の屈折率、金属膜の金属種およびその膜厚に依存するが、通常、金では約１０倍以上、２０倍以下の増加量となる。
【０１１７】
蛍光色素は、光吸収により分子内の電子が励起され、短時間のうちに第一電子励起状態に移動し、この状態（準位）から基底状態に戻る際、そのエネルギー差に相当する波長の蛍光を発する。
【０１１８】
励起光として使用される「レーザ光」としては、例えば、波長２００ｎｍ以上、９００ｎｍ以下、０．００１ｍＷ以上、１，０００ｍＷ以下のＬＤ；波長２３０ｎｍ以上、８００ｎｍ以下（金属部材に用いる金属種によって共鳴波長が決まる。）、０．０１ｍＷ以上、１００ｍＷ以下の半導体レーザなどが挙げられる。
【０１１９】
「プリズム」は、必要に応じて用いられる光学フィルタ、偏光フィルタ及びカットフィルタ等の各種フィルタを介したレーザ光が、金属膜に効率よく入射されることを目的としており、屈折率が透明支持体と同じであることが好ましい。本発明は、全反射条件を設定できる各種プリズムを適宜選択することができることから、角度、形状に特に制限はなく、例えば、６０度分散プリズムなどであってもよい。このようなプリズムの市販品としては、上述した「ガラス製の透明支持体」の市販品と同様のものが挙げられる。本発明の透明支持体がこのプリズムであっても良い。
【０１２０】
「光学フィルタ」としては、例えば、減光〔ＮＤ〕フィルタ、ダイアフラムレンズなどが挙げられる。「減光〔ＮＤ〕フィルタ」（または、中性濃度フィルタ）は、入射レーザ光量を調節することを目的とするものである。特に、ダイナミックレンジの狭い検出器を使用するときには精度の高い測定を実施する上で用いることが好ましい。
【０１２１】
「偏光フィルタ」は、レーザ光を、表面プラズモンを効率よく発生させるＰ偏光とするために用いられるものである。
「カットフィルタ」は、外光（装置外の照明光）、励起光（励起光の透過成分）、迷光（各所での励起光の散乱成分）、プラズモンの散乱光（励起光を起源とし、センサチップ表面上の構造体または付着物などの影響で発生する散乱光）などの光学ノイズ、および蛍光色素の自家蛍光を除去するフィルタであって、例えば、干渉フィルタ、色フィルタなどが挙げられる。
【０１２２】
「集光レンズ」は、蛍光量を測定する検出器に、蛍光シグナルを効率よく集光することを目的とするものであり、任意の集光レンズでよい。簡易な集光レンズとして、顕微鏡などで使用されている、市販の対物レンズ（例えば、（株）ニコン製またはオリンパス（株）製等）を転用してもよい。対物レンズの倍率としては、１０倍以上、１００倍以下が好ましい。
【０１２３】
「検出器」としては、超高感度の観点からは光電子増倍管（浜松ホトニクス（株）製のフォトマルチプライヤー）が好ましい。また、これらに比べると感度は下がるが、画像として見ることができ、かつノイズ光の除去が容易なことから、多点計測が可能なＣＣＤイメージセンサも好適である。
【０１２４】
［工程（ｅ）］
工程（ｅ）は、上記工程（ｄ）で得られた測定結果から、アナライト量（たとえば、アナライト溶液中に含まれるアナライト量）を算出（定量）する工程である。
【０１２５】
より具体的には、工程（ｅ）は、既知濃度のアナライト（たとえば、標的抗原または標的抗体）を用いて、本願発明の定量分析法を実施することで検量線を作成し、作成された検量線に基づいて、工程（ｄ）で得られた測定シグナルから、被測定アナライト溶液中のアナライト（たとえば、標的抗原）量を算出する工程である。
【０１２６】
［Ｓ／Ｎ比の算出］
さらに、工程（ｅ）においては、予め上記工程（ｂ）の前に測定した“ブランク発光シグナル”、上記工程（ｄ）で得られた“アッセイ発光シグナル（単にシグナルともいう）”、および何も修飾していない金属基板を流路に固定し、超純水を流しながら測定して得られた“初期ノイズシグナル”を用いて、下記式（１ａ）で表されるＳ／Ｎ比を算出することができる：
Ｓ／Ｎ＝｜Ｉａ／Ｉｏ｜／Ｉｎ （１ａ）
（上記式（１ａ）において、Ｉａはアッセイ発光シグナル、Ｉｏはブランク発光シグナル、Ｉｎは初期ノイズシグナルである）。
ただし、Ｓ／Ｎを算出するにあたっては、実用上、上記式（１ａ）に代えて、アナライト溶液中に含まれるアナライトの濃度が０の場合における“アッセイノイズシグナル（単にノイズともいう）”を基準として、下記式（１ｂ）にしたがって算出してもよい：
Ｓ／Ｎ＝｜Ｉａ｜／｜Ｉａｎ｜ （１ｂ）
（上記式（１ｂ）において、Ｉａｎはアッセイノイズシグナル、Ｉａは上記式（１ａ）の場合と同様にアッセイ発光シグナルである）。
【０１２７】
〔キット〕
本発明に係る定量分析用キットは、上記センサチップと、上記ナノ構造体と、上記第２リガンドとを含み、表面プラズモン励起増強蛍光分光法によるアナライトの定量分析に用いられることを特徴とする。ここで、本発明の定量分析方法を実施するにあたり、上記のセンサチップ等の他に、アナライト溶液を除き必要とされるすべてのものを含むことが好ましい。
【０１２８】
たとえば、本発明の定量分析用キットに含まれるものとしては、少なくともセンサチップ（透明支持体上に少なくとも金属膜を有する）、第１リガンドを含む溶液、第２リガンドを含む溶液、およびナノ構造体を含むアナライト解離抑制剤（溶液）である。
【０１２９】
これら蛍光量測定用キットと、例えば、アラナイト溶液としてアナライトを含む血液または血清と、特定の腫瘍マーカーに対する抗体とを用いることによって、特定の腫瘍マーカーの含有量を、高感度かつ高精度で検出することができる。この結果から、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌（上皮内癌）の存在も高精度で予測することができる。
【０１３０】
さらに、キット要素として、検量線作成用の標準物質、説明書、多数アナライトの同時処理ができるマイクロタイタープレートなどの必要な器材一式などを含んでもよい。
以上の説明において、本発明の定量分析方法では、工程（ｄ）が工程（ａ）〜（ｃ）の後に実施する限り、工程（ａ）〜工程（ｃ）の各工程は、任意の順番で実施してもよく、工程（ａ）〜工程（ｃ）のうち、２種類の工程または３種類の工程を同時に実施してもよい。
【０１３１】
本発明の定量分析方法を実施するに当たり、工程（ａ）〜（ｂ）を任意の順でまたは同時に実施し、工程（ｃ）〜（ｄ）を順次実施することが好ましく、工程（ａ）〜工程（ｄ）の順番で順次行う方が、各工程を、センサチップを処理対象にして、センサチップに対して順次処理を行うことができ好ましい。
【実施例】
【０１３２】
次に、本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【０１３３】
（蛍光色素を有する第２リガンド溶液の準備）
第２リガンドとして、抗ｃＴｎｌ ＩｇＧ２ａモノクローナル抗体（４Ｃ２；２．５ｍｇ／ｍｌ、Ｈｙｔｅｓｔ社製）の溶液とＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）標識キットを用い、キット使用方法の手順に従い、室温（２５℃）で６０分間、攪拌混合することで反応させ、蛍光色素標識された抗体を準備した。
【０１３４】
最後に、未反応抗体および未反応酵素を、分子量カットフィルタ（日本ミリポア（株）製）を用いて精製することで、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体溶液を得た。得られた標識２次抗体（蛍光色素を有する第２リガンド）溶液はタンパク定量後、４℃で保存した。
【０１３５】
（ナノ構造体溶液の準備）
第３リガンドとして、第２リガンドに結合性を有する抗ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａポリクロ―ナル抗体（１００μｇ／ｍｌ、（株）ミクリ免疫研究所）１００μｌと、体積平均粒径８ｎｍの金コロイド（ＷＲＧＭ３；金コロイド液：ＯＤ５２５＝１２ （株）ワインレッドケミカル）溶液１００μｌとを混合し抗体を結合させるｐＨのｂｕｆｆｅｒなどで希釈しｐＨを調節した後、１５分間静置した。その後、混合液（１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液と１％ＰＥＧ溶液を９：１の割合で混合した溶液）１ｍｌを第３リガンド及び金コロイド含有溶液１００μｌに加え、市販の遠心分離機を用いて５０００ｒｐｍで５分間、遠心分離を行なって上清を取り除いた。さらに、上記混合液２ｍｌを加えて、市販の超音波分散器で約３０秒間分散した。再度、遠心分離機を用いて５０００ｒｐｍで５分間、遠心分離を行って上清を取り除き、ナノ構造体を含む溶液（ナノ構造体溶液）を得た。得られたナノ構造体溶液は４℃で保存した。なお、得られたナノ構造体は、１粒子当たり、平均すると、複数個の第３リガンドが固定されるように調製した。
【０１３６】
［実施例１］
（センサチップ（Ａ）の製造）
屈折率〔ｎd〕１．７２、厚さ１ｍｍのガラス製の透明支持体（（株）オハラ製の「Ｓ−ＬＡＬ １０」）をプラズマ洗浄し、該支持体の片面にクロム薄膜をスパッタリング法により形成した後、その表面にさらに金属膜として金薄膜をスパッタリング法により該透明支持体に形成した。クロム薄膜の厚さは１ｎｍ以上、３ｎｍ以下、金薄膜の厚さは４２ｎｍ以上、４７ｎｍ以下であった。この半値幅（β）は７．６°であった。
【０１３７】
こうして金属膜が形成された透明支持体を、１ｍＭに調製した１０−カルボキシ−１−デカンチオールのエタノール溶液１０ｍｌに２４時間浸漬し、金薄膜の片面にＳＡＭを形成した。この透明支持体を、該エタノール溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールでそれぞれ洗浄した後、エアガンを用いて乾燥させた。
【０１３８】
続いて、分子量５０万のカルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕を１ｍｇ／ｍｌと、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕を０．５ｍＭと、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕を１ｍＭとを含むｐＨ７．４のＭＥＳ緩衝生理食塩水〔ＭＥＳ〕（イオン強度：１０ｍＭ）にＳＡＭを形成した透明支持体を１時間浸漬し、ＳＡＭ上に固相化層としてＣＭＤを固定化し、１モル／リットルのＮａＯＨ水溶液に３０分間浸漬することで未反応のコハク酸エステルを加水分解させた。ＣＭＤ層の平均膜厚は７０ｎｍであり、密度は１．９ｎｇ／ｍｍ2であった。
【０１３９】
続いて、ＮＨＳを５０ｍＭ（モル）と、ＷＳＣを１００ｍＭとを含むＭＥＳに１時間浸漬させた後に、抗ｃＴｎｌ ＩｇＧ１モノクローナル抗体（ＭＦ４；２．５μｇ／ｍｌ、Ｈｙｔｅｓｔ社製）（第１リガンド）溶液に３０分間浸漬することで、ＣＭＤに１次抗体（第１リガンド）を固定化した。
【０１４０】
さらに、１質量％の牛血清アルブミン〔ＢＳＡ〕および１Ｍのアミノエタノールを含むＰＢＳにて３０分間循環送液することで、非特異的吸着防止処理を行なった。
非特異吸着防止処理を行なった第１リガンドが固定化された透明支持体上に、流路高さ０．５ｍｍを有し、かつ適当な形状および大きさを有する穴のあいたポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕製シートを設け、さらに、このＰＤＭＳ製シートの周囲にシリコーンゴム製スペーサを配置した（このシリコーンゴム製スペーサは流路に送液する溶液に触れない状態にある）。該ＰＤＭＳ製シートおよび該シリコーンゴム製スペーサの上に、送液導入用の穴および送液排出用の穴を予めそれぞれ形成してあるＰＭＭＡ基板を、ＰＤＭＳ製シートで囲まれた領域の内側にこれらの穴が位置するように配置した（このとき、抗体を固定化した表面が流路の内側となるように、ＰＭＭＡ基板が配置されている）。これらを流路の外側から圧着し、ビスを用いて、ＰＭＭＡ基板と流路シート（すなわち、前記ＰＤＭＳ製シート）、該流路シートと支持体を固定し、センサチップ（Ａ）を製造した。
【０１４１】
（アッセイの実施）
上述のように製造したセンサチップ（Ａ）を用いて、以下の工程によりアッセイを実施した。
【０１４２】
工程（ａ）として、上述のようにして得られたセンサチップ（Ａ）の流路に、標的抗原（アナライト）としてｃＴｎｌを０．１ｎｇ／ｍｌ含む０．１ｍｌＰＢＳ溶液（アナライト溶液）を２５分間循環させた。
【０１４３】
洗浄工程（１）として、工程（ａ）の後、センサチップ（Ａ）の流路に、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５質量％含むトリス緩衝生理食塩水〔ＴＢＳ〕を送液させ１０分間循環させることによって洗浄した。
【０１４４】
工程（ｂ）として、洗浄工程（１）の後、センサチップ（Ａ）の流路に、上記で準備した蛍光色素を有する第２リガンド溶液（２μｇ／ｍｌとなるように調製したＰＢＳ溶液）０．１ｍｌを送液させ５分間循環させた。
【０１４５】
洗浄工程（２）として、工程（ｂ）の後、センサチップ（Ａ）の流路に、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５質量％含むＴＢＳを送液させ１０分間循環させることによって洗浄した。
工程（ｃ）として、洗浄工程（２）の後、センサチップ（Ａ）の流路に、上記で準備したナノ構造体溶液（２μｇ／ｍｌとなるように調製したＰＢＳ溶液）０．１ｍｌを送液させ５分間循環させた。
【０１４６】
工程（ｄ）として、工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を経たセンサチップ（Ａ）の、金属膜を形成していないもう一方の表面から、プリズム（シグマ光機（株）製）を経由してレーザ光（６４０ｎｍ、４０μＷ）を金属膜に照射し表面プラズモンを生じ、この表面プラズモンにより励起された蛍光色素から発光された蛍光量を光電子増倍管〔ＰＭＴ〕で検出した光量（シグナル値）を計測し「アッセイ発光シグナル」とした。
【０１４７】
一方、前記工程（ａ）〜（ｄ）において、上記工程（ａ）でｃＴｎｌを全く含まない（０ｎｇ／ｍｌ）０．１ｍｌＰＢＳ溶液をフローさせた以外は上記と同じ手順で蛍光量を測定し、その測定値を「アッセイノイズシグナル」とした。
【０１４８】
［実施例２］
上記実施例１において、ナノ構造体溶液を準備する際に、第３リガンドの濃度を１００μｇ／ｍｌから、７０μｇ／ｍｌに変更した以外は同様にして蛍光量を測定した。
【０１４９】
［実施例３］
上記実施例１において、ナノ構造体溶液を準備する際に、第３リガンドとして、第２リガンドと結合性を有する抗ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａポリクロ―ナル抗体（１００μｇ／ｍｌ、（株）ミクリ免疫研究所）１００μｌから、第１リガンド及び第２リガンドと共に結合性を有する抗ｍｏｕｓｅ ＩｇＧポリクロ―ナル抗体（５０μｇ／ｍｌ、（株）ミクリ免疫研究所）１００μｌに変更し、該第３リガンドを第２リガンド及び第１リガンドの両方に接触させた以外は同様にして蛍光量を測定した。
【０１５０】
［実施例４］
上記実施例１において、ナノ構造体溶液を準備する際に、第３リガンドの濃度を１００μｇ／ｍｌから、１μｇ／ｍｌに変更した以外は同様にして蛍光量を測定した。
【０１５１】
［実施例５］
上記実施例３において、ナノ構造体溶液を準備する際に、第３リガンドの濃度を２０μｇ／ｍｌから、１．２５μｇ／ｍｌに変更した以外は同様にして蛍光量を測定した。
【０１５２】
［実施例６］
上記実施例１において、ナノ構造体溶液を準備する際に、第３リガンドの濃度を１００μｇ／ｍｌから、０．８５μｇ／ｍｌに変更した以外は同様にして蛍光量を測定した。
【０１５３】
［実施例７］
上記実施例１において、ナノ構造体溶液を準備する際に、第３リガンドの濃度を１００μｇ／ｍｌから、１０μｇ／ｍｌに変更し、体積平均粒径８ｎｍの金コロイド（ＷＲＧＭ３；金コロイド液：ＯＤ５２５＝１２ （株）ワインレッドケミカル）溶液１００μｌから、体積平均粒径２０ｎｍの金コロイド（ＷＲＧＭ２；金コロイド液：ＯＤ５２５＝１２ （株）ワインレッドケミカル）溶液１００μｌに変更した以外は同様にして蛍光量を測定した。
【０１５４】
［実施例８］
上記実施例１において、ナノ構造体溶液を準備する際に、第３リガンドの濃度を１００μｇ／ｍｌから、３０μｇ／ｍｌに変更し、体積平均粒径８ｎｍの金コロイド（ＷＲＧＭ３；金コロイド液：ＯＤ５２５＝１２ （株）ワインレッドケミカル）溶液１００μｌから、体積平均粒径４０ｎｍの金コロイド（ＷＲＧＨ１；金コロイド液：ＯＤ５２５＝１２ （株）ワインレッドケミカル）溶液１００μｌに変更した以外は同様にして蛍光量を測定した。
【０１５５】
［実施例９］
上記実施例１において、ナノ構造体溶液を準備する際に、第３リガンドの濃度を１００μｇ／ｍｌから、１０μｇ／ｍｌに変更し、体積平均粒径８ｎｍの金コロイド（ＷＲＧＭ３；金コロイド液：ＯＤ５２５＝１２ （株）ワインレッドケミカル）溶液１００μｌから、体積平均粒径６０ｎｍの金コロイド（ＷＲＧＨ１；金コロイド液：ＯＤ５２５＝１２ （株）ワインレッドケミカル）溶液１００μｌに変更した以外は同様にして蛍光量を測定した。
【０１５６】
［実施例１０］
上記実施例１において、ナノ構造体溶液を準備する際に、金コロイド溶液１００μｌの代わりに、体積平均粒径は２０ｎｍのセレン化カドミウムである「Ｑｄｏｔ（登録商標） ５２５ ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｓ」（インビトロジェン株式会社製）を含む溶液（１μＭ）１００μｌを用いた以外は同様にして蛍光量を測定した。
【０１５７】
［実施例１１］
上記実施例１において、ナノ構造体溶液を準備する際に、第３リガンドとして、第２リガンドと結合性を有する抗ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａポリクロ―ナル抗体（１００μｇ／ｍｌ、（株）ミクリ免疫研究所）１００μｌから、第１リガンド及び第２リガンドと共に結合性を有する抗ｍｏｕｓｅ ＩｇＧポリクロ―ナル抗体（１００μｇ／ｍｌ、（株）ミクリ免疫研究所）１００μｌに変更し、金コロイド溶液の代わりに体積平均粒径２０ｎｍのタンパク質を含む溶液（１００μｇ／ｍｌ）１００μｌを用いた以外は同様にして蛍光量を測定した。
【０１５８】
［実施例１２］
上記実施例１において、ナノ構造体溶液を準備する際に、第３リガンドの濃度を１００μｇ／ｍｌから、１２０μｇ／ｍｌに変更し、体積平均粒径８ｎｍの金コロイド（ＷＲＧＭ３；金コロイド液：ＯＤ５２５＝１２ （株）ワインレッドケミカル）溶液１００μｌから、体積平均粒径６０ｎｍのタンパク質を含む溶液（１００μｇ／ｍｌ）１００μｌに変更した以外は同様にして蛍光量を測定した。
【０１５９】
［比較例１］
上記実施例１において、工程（ｃ）を除いた以外は同様の工程で蛍光量を測定した。すなわち、ナノ構造体溶液は使用していない（送液を行っていない）。
【０１６０】
［比較例２］
上記実施例１において、ナノ構造対溶液の代わりに、ナノ構造粒子を用いることなく第３リガンドのみ分散させた第３リガンド溶液を以下のようにして準備し、該第３リガンド溶液を使用した以外は同様にして蛍光量を測定した。
【０１６１】
（第３リガンド溶液の準備）
第３リガンドとして、第２リガンドと反応性を有する抗ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａポリクロ―ナル抗体（１００μｇ／ｍｌ、（株）ミクリ免疫研究所）溶液を準備した。
【０１６２】
［ナノ構造粒子体積平均粒径の測定方法］
ナノ構造粒子の体積平均粒径は、ナノ構造体溶液を作製する前のナノ構造粒子溶液をクロロホルム／ヘキサン混合溶媒（体積比：４／６）で１０倍に希釈し、動的光散乱式ナノトラック粒度分析計（ＵＰＡ−ＥＸ１５０、日機装株式会社）を用いて算出した。
【０１６３】
［アッセイ発光シグナルの評価］
実施例１〜９及び比較例１〜２で実施したそれぞれの蛍光量測定のアッセイ蛍光シグナルに注目し、比較例１のアッセイ発光シグナルを基準として、以下の通り評価した。結果を表１に示した。なお、アッセイノイズシグナルについては、実施例１〜９及び比較例１〜２においてそれぞれ測定したものの、いずれのアッセイノイズシグナルの値にも大差はなかった。また、アッセイ発光シグナルは、工程（ｄ）で得たもので評価したが、工程（ｃ）以降であれば、どのような時に測定したとしても同様の結果が得られる。
【０１６４】
Ａ：比較例１のアッセイ発光シグナルに比較し１．５倍を超える値である場合
Ｂ：比較例１のアッセイ発光シグナルに比較し１．３５倍以上、１．５倍未満である値である場合
Ｃ：比較例１のアッセイ発光シグナルに比較し１．２倍以上、１．３５倍未満である値である場合
Ｄ：比較例１のアッセイ発光シグナルに比較し１．０５倍以上、１．２倍未満である値である場合
Ｅ：比較例１のアッセイ発光シグナルに比較し１．０倍以上、１．０５倍未満である値である場合
【０１６５】
［Ｓ／Ｎ比のバラつきの評価］
実施例１〜９及び比較例１〜２で実施したそれぞれの蛍光量測定を全く同じ条件にて各々５回ずつ行い、上記アッセイ発光シグナルの評価と同じように、各々５回のアッセイ発光シグナルから該アッセイ発光シグナルの平均及び該アッセイ発光シグナルの標準偏差を求め、変動係数（ＣＶ値（％））にて以下の通り評価した。結果を表１に示した。なお、ＣＶ値（％）は、下記式に基づいて算出した。
ＣＶ値（％）＝（アッセイ発光シグナルにおける標準偏差／アッセイ発光シグナルの平均）×１００
Ａ：ＣＶ値（％）が０以上、８未満である場合
Ｂ：ＣＶ値（％）が８以上、１３未満である場合
Ｃ：ＣＶ値（％）が１３以上、１８未満である場合
Ｄ：ＣＶ値（％）が１８以上である場合
【０１６６】
【表２】
表２から、ナノ構造体を、蛍光色素を有する第２リガンドに接触させた実施例１〜１１は、比較例１〜２に比較しアッセイ発光シグナルが高く、蛍光測定時のアッセイ発光シグナルのバラつきが小さいことがわかる。これは、蛍光色素を有する第２リガンドにナノ構造体を接触させたことにより、第１リガンド−アナライト間、あるいは第２リガンド−アナライト間の解離が抑制されたためである。
【０１６７】
実施例３及び５では、「アッセイ発光シグナル」及び「バラつき」の評価が最も良かった。この理由として、「アッセイ発光シグナル」に関しては、ナノ構造粒子の材質が「金」であり、体積平均粒径が「１ｎｍ以上、５０ｎｍ以下の範囲」であり、第３リガンドの濃度が「１μｇ／ｍｌ以上、１００μｇ／ｍｌ以下の範囲」であり、接触が「第１リガンド及び第２リガンド」であるという本発明の最も好ましい形態を満たしているからである。そして、「バラつき」に関しては、第３リガンドの濃度が「１μｇ／ｍｌ以上、１００μｇ／ｍｌ以下の範囲」である、及び接触が「第１リガンド及び第２リガンド」であるという好ましい形態を満たしているからである。
【０１６８】
また、この表２から、リガンド−アナライト間の解離は、第３リガンドの濃度が大きいこと、第１リガンド及び第２リガンドと共に結合性を有する第３リガンドを用いることによりさらに抑制されていることがわかる（バラつきの評価より）。これは、第３リガンドの濃度が大きい方が、一つのナノ構造粒子に結合する第３リガンド数が単純に多くなるため、及び第３リガンドは第２リガンドのみに結合するより第１及び第２リガンドに結合する方がより強固に結合されるため解離がより抑制されるためである。
【０１６９】
一方、比較例１〜２は、ナノ構造体を用いていないので、リガンド−アナライト間の解離が抑制されず、解離が起こってしまった結果、各蛍光量測定で得られるアッセイ発光シグナルが実施例１〜１１に比較し低く、かつ蛍光測定時のアッセイ発光シグナルのバラつきが大きいので安定したアナライトの定量分析ができなかった。これは、比較例ではナノ構造体を用いていないために、各蛍光量測定において第１リガンド−アナライト間、あるいは第２リガンド−アナライト間で解離が起こってしまい、各蛍光量測定が同じ条件で行っているにも関わらず、測定したアッセイ発光シグナルにバラつきが生じてしまった結果である。
【符号の説明】
【０１７０】
Ａ 一つの第３リガンドを有するナノ構造体
Ｂ 二つの第３リガンドを有するナノ構造体
Ｃ 四つの第３リガンドを有するナノ構造体
Ｄ センサチップ
１ ナノ構造粒子
２ 第３リガンド
３ 透明支持体
４ 金属膜
５ 自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）
６ カルボキシメチルデキストラン
７ 第１リガンド
８ アナライト
９ 第２リガンド
１０ 蛍光色素
【特許請求の範囲】
【請求項１】
透明支持体、該透明支持体上に形成された金属膜、および該金属膜上に固定され、かつアナライトと特異的に結合する第１リガンドを備えたセンサチップと、
表面プラズモンにより励起されて蛍光する蛍光色素を有し、かつ前記アナライトに特異的に結合する第２リガンドと
ナノ構造粒子、および第２リガンドに特異的に結合する第３リガンドを有し、該第３リガンドが該ナノ構造粒子上に固定されてなるナノ構造体とを用いた、表面プラズモン励起増強蛍光分光法によるアナライトの定量分析方法であって、
下記工程（ａ）〜（ｃ）を実施して、下記工程（ｄ）を実施することを特徴とする定量分析方法。
工程（ａ）：前記センサチップ上の第１リガンドと前記アナライトとを接触させて、該第１リガンドと該アナライトを結合させる工程
工程（ｂ）：前記第２リガンドと前記アナライトとを接触させて、該第２リガンドと該アナライトを結合させる工程
（ｃ）：前記第２リガンドと前記ナノ構造体とを接触させて、該第２リガンドとナノ構造体を結合させる工程
（ｄ）：前記センサチップの透明支持体を介して前記金属膜に励起光を照射して表面プラズモンを生じさせ、該表面プラズモンにより蛍光色素を励起させて蛍光を生じさせ、該蛍光の蛍光量を測定する工程
【請求項２】
前記ナノ構造体の体積平均粒径は、１ｎｍ以上、５０ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載の定量分析方法。
【請求項３】
前記ナノ構造体は、前記ナノ構造粒子上に複数の前記第３リガンドが固定されてなることを特徴とする請求項１または２に記載の定量分析方法。
【請求項４】
前記第３リガンドは、前記第２リガンドおよび前記第１リガンドに特異的に結合する第３リガンド（Ａ）であり、
前記工程（ａ）〜（ｂ）を任意の順でまたは同時に実施して、工程（ｃ）〜（ｄ）を順次実施し、
工程（ｃ）において、前記ナノ構造体と前記第２リガンドとを接触させるとともに、前記ナノ構造体と前記第１リガンドとを接触させて、前記ナノ構造体に前記第２リガンドおよび前記第１リガンドを結合させる工程を実施することを特徴とする請求項１〜３の何れか一項に記載の定量分析方法。
【請求項５】
前記ナノ構造体は、金属で構成されたナノ構造粒子を含むことを特徴とする請求項１〜４の何れか一項に記載の定量分析方法。
【請求項６】
前記工程（ａ）、前記工程（ｂ）及び前記工程（ｃ）を順次実施することを特徴とする請求項１〜５の何れか一項に記載の定量分析方法。
【請求項７】
前記センサチップが、金属膜上に、さらにカルボキシメチルデキストラン層を備え、前記第１リガンドが該カルボキシメチルデキストラン層に固定化されてなることを特徴とする請求項１〜６の何れか一項に記載の定量分析方法。
【請求項８】
透明支持体、該透明支持体上に形成された金属膜、および該金属膜上に固定され、かつアナライトに特異的に結合する第１リガンドを備えたセンサチップと、
表面プラズモンにより励起されて蛍光する蛍光色素を有し、かつ前記アナライトに特異的に結合する第２リガンドと
ナノ構造粒子、および第２リガンドに特異的に結合する第３リガンドを有し、該第３リガンドが該ナノ構造粒子上に固定されてなるナノ構造体と、
を含み、
表面プラズモン励起増強蛍光分光法によるアナライトの定量分析に用いるためのキット。
【請求項９】
透明支持体、該透明支持体上に形成された金属膜、および該金属膜上に固定され、かつアナライトに特異的に結合する第１リガンドを備えたセンサチップと、
表面プラズモンにより励起されて蛍光する蛍光色素を有し、かつ前記アナライトに特異的に結合する第２リガンドと
ナノ構造粒子、および第２リガンドに特異的に結合する第３リガンドを有し、該第３リガンドが該ナノ構造粒子上に固定されてなるナノ構造体とを用いた、表面プラズモン励起増強蛍光分光法によるアナライトの定量分析方法において、第１リガンドおよび第２リガンドとアナライトとの解離を抑制するために使用されるアナライト解離抑制剤であって、
ナノ構造粒子、および第２リガンドに特異的に結合する第３リガンドを有し、該第３リガンドが該ナノ構造粒子上に固定されてなるナノ構造体を含むことを特徴とするアナライト解離抑制剤。
【請求項１】
透明支持体、該透明支持体上に形成された金属膜、および該金属膜上に固定され、かつアナライトと特異的に結合する第１リガンドを備えたセンサチップと、
表面プラズモンにより励起されて蛍光する蛍光色素を有し、かつ前記アナライトに特異的に結合する第２リガンドと
ナノ構造粒子、および第２リガンドに特異的に結合する第３リガンドを有し、該第３リガンドが該ナノ構造粒子上に固定されてなるナノ構造体とを用いた、表面プラズモン励起増強蛍光分光法によるアナライトの定量分析方法であって、
下記工程（ａ）〜（ｃ）を実施して、下記工程（ｄ）を実施することを特徴とする定量分析方法。
工程（ａ）：前記センサチップ上の第１リガンドと前記アナライトとを接触させて、該第１リガンドと該アナライトを結合させる工程
工程（ｂ）：前記第２リガンドと前記アナライトとを接触させて、該第２リガンドと該アナライトを結合させる工程
（ｃ）：前記第２リガンドと前記ナノ構造体とを接触させて、該第２リガンドとナノ構造体を結合させる工程
（ｄ）：前記センサチップの透明支持体を介して前記金属膜に励起光を照射して表面プラズモンを生じさせ、該表面プラズモンにより蛍光色素を励起させて蛍光を生じさせ、該蛍光の蛍光量を測定する工程
【請求項２】
前記ナノ構造体の体積平均粒径は、１ｎｍ以上、５０ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載の定量分析方法。
【請求項３】
前記ナノ構造体は、前記ナノ構造粒子上に複数の前記第３リガンドが固定されてなることを特徴とする請求項１または２に記載の定量分析方法。
【請求項４】
前記第３リガンドは、前記第２リガンドおよび前記第１リガンドに特異的に結合する第３リガンド（Ａ）であり、
前記工程（ａ）〜（ｂ）を任意の順でまたは同時に実施して、工程（ｃ）〜（ｄ）を順次実施し、
工程（ｃ）において、前記ナノ構造体と前記第２リガンドとを接触させるとともに、前記ナノ構造体と前記第１リガンドとを接触させて、前記ナノ構造体に前記第２リガンドおよび前記第１リガンドを結合させる工程を実施することを特徴とする請求項１〜３の何れか一項に記載の定量分析方法。
【請求項５】
前記ナノ構造体は、金属で構成されたナノ構造粒子を含むことを特徴とする請求項１〜４の何れか一項に記載の定量分析方法。
【請求項６】
前記工程（ａ）、前記工程（ｂ）及び前記工程（ｃ）を順次実施することを特徴とする請求項１〜５の何れか一項に記載の定量分析方法。
【請求項７】
前記センサチップが、金属膜上に、さらにカルボキシメチルデキストラン層を備え、前記第１リガンドが該カルボキシメチルデキストラン層に固定化されてなることを特徴とする請求項１〜６の何れか一項に記載の定量分析方法。
【請求項８】
透明支持体、該透明支持体上に形成された金属膜、および該金属膜上に固定され、かつアナライトに特異的に結合する第１リガンドを備えたセンサチップと、
表面プラズモンにより励起されて蛍光する蛍光色素を有し、かつ前記アナライトに特異的に結合する第２リガンドと
ナノ構造粒子、および第２リガンドに特異的に結合する第３リガンドを有し、該第３リガンドが該ナノ構造粒子上に固定されてなるナノ構造体と、
を含み、
表面プラズモン励起増強蛍光分光法によるアナライトの定量分析に用いるためのキット。
【請求項９】
透明支持体、該透明支持体上に形成された金属膜、および該金属膜上に固定され、かつアナライトに特異的に結合する第１リガンドを備えたセンサチップと、
表面プラズモンにより励起されて蛍光する蛍光色素を有し、かつ前記アナライトに特異的に結合する第２リガンドと
ナノ構造粒子、および第２リガンドに特異的に結合する第３リガンドを有し、該第３リガンドが該ナノ構造粒子上に固定されてなるナノ構造体とを用いた、表面プラズモン励起増強蛍光分光法によるアナライトの定量分析方法において、第１リガンドおよび第２リガンドとアナライトとの解離を抑制するために使用されるアナライト解離抑制剤であって、
ナノ構造粒子、および第２リガンドに特異的に結合する第３リガンドを有し、該第３リガンドが該ナノ構造粒子上に固定されてなるナノ構造体を含むことを特徴とするアナライト解離抑制剤。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１３−５３９０２（Ｐ２０１３−５３９０２Ａ）
【公開日】平成２５年３月２１日（２０１３．３．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１９１５７１（Ｐ２０１１−１９１５７１）
【出願日】平成２３年９月２日（２０１１．９．２）
【出願人】（０００００１２７０）コニカミノルタホールディングス株式会社 (4,463)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年３月２１日（２０１３．３．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年９月２日（２０１１．９．２）
【出願人】（０００００１２７０）コニカミノルタホールディングス株式会社 (4,463)
【Ｆターム（参考）】
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