表面プラズモン励起蛍光計測装置及び表面プラズモン励起蛍光計測方法
【課題】導電体膜の膜厚の影響が減少し計測の精度が向上する表面プラズモン励起蛍光計測装置及び表面プラズモン励起蛍光計測方法を提供する。
【解決手段】金膜の第１の主面に試料が供給される。金膜の第１の主面に抗体固層膜が定着する。金膜の第２の主面とプリズムの密着面とが密着する。抗体固層膜に被計測物が捕捉され、捕捉された被計測物が蛍光標識される。励起光がプリズムに照射され、蛍光標識された被計測物から放射される表面プラズモン励起蛍光の光量が測定される。膜厚測定光がプリズムに照射され、金膜を透過する透過光の光量が測定される。表面プラズモン励起蛍光の光量の測定値は透過光の光量の測定値により補正される。密着面への励起光の入射角θ１は共鳴角θｒに設定される。密着面への膜厚測定光の入射角θ２は臨界角θｃより小さい角に設定される。
【解決手段】金膜の第１の主面に試料が供給される。金膜の第１の主面に抗体固層膜が定着する。金膜の第２の主面とプリズムの密着面とが密着する。抗体固層膜に被計測物が捕捉され、捕捉された被計測物が蛍光標識される。励起光がプリズムに照射され、蛍光標識された被計測物から放射される表面プラズモン励起蛍光の光量が測定される。膜厚測定光がプリズムに照射され、金膜を透過する透過光の光量が測定される。表面プラズモン励起蛍光の光量の測定値は透過光の光量の測定値により補正される。密着面への励起光の入射角θ１は共鳴角θｒに設定される。密着面への膜厚測定光の入射角θ２は臨界角θｃより小さい角に設定される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン励起蛍光分光法による計測を行う表面プラズモン励起蛍光計測装置及び表面プラズモン励起蛍光計測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
誘電体媒体の中を進む励起光が導電体膜と誘電体媒体との界面に全反射された場合は、界面からエバネッセント波がもれだし、導電体膜の中のプラズモンとエバネッセント波とが干渉する。界面への励起光の入射角が共鳴角に設定されプラズモンとエバネッセント波とが共鳴する場合にエバネッセント波の電場は著しく増強される。表面プラズモン励起蛍光分光法（ＳＰＦＳ）による計測においては、この増強された電場が用いられる。
【０００３】
ＳＰＦＳによる計測においては、導電体膜の表面に被計測物が捕捉され、捕捉された被計測物が蛍光標識される。増強された電場は蛍光標識された被計測物に作用し、蛍光標識された被計測物からは表面プラズモン励起蛍光が放射される。さらに、表面プラズモン励起蛍光の光量が測定され、被計測物の有無、被計測物の捕捉量等が特定される。
【０００４】
エバネッセント波の電場増強度は、導電体膜の膜厚に依存する。このため、導電体膜の膜厚にばらつきがある場合は、エバネッセント波の電場増強度にばらつきが生じ、表面プラズモン励起蛍光の光量にばらつきが生じ、計測の精度が低下する。
【０００５】
特許文献１においては、表面プラズモン励起蛍光の光量が測定されるときに、散乱光の光量が測定される。また、散乱光の光量から電場増強度が求められ、電場増強度により表面プラズモン励起蛍光の光量が補正される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−２１６５３２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、散乱光の光量は導電体膜の表面の状態により変化する。例えば、散乱光の光量は導電体膜の表面の粗さ、うねり等により変化する。このため、特許文献１の補正が行われても計測の精度は不十分である。
【０００８】
本発明は、この問題を解決するためになされる。本発明の目的は、導電体膜の膜厚の影響が減少し計測の精度が向上する表面プラズモン励起蛍光計測装置及び表面プラズモン励起蛍光計測方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１から第６までの局面は、表面プラズモン計測装置に向けられる。
【００１０】
本発明の第１の局面においては、導電体膜、誘電体媒体、照射機構、測定機構及び補正部が設けられる。
【００１１】
導電体膜の第１の主面には試料が供給される。導電体膜の第２の主面と誘電体媒体の密着面とは密着する。
【００１２】
照射機構は、誘電体媒体に光を照射し、第１の光路と第２の光路との間で光の光路を切り替える。第１の光路においては、誘電体媒体の内部において臨界角以上の入射角で密着面に光が入射する。第２の光路においては、誘電体媒体の内部において臨界角より小さい入射角で密着面に光が入射する。
【００１３】
測定機構は、表面プラズモン励起蛍光及び透過光の光量を測定する。表面プラズモン励起蛍光は、第１の光路を経由する光が誘電体媒体に照射されている間に試料に含まれる被計測物から放射される。透過光は、第２の光路を経由する光が誘電体媒体に照射されている間に導電体膜を透過する。
【００１４】
補正部は、表面プラズモン励起蛍光の光量の測定値を透過光の光量の測定値により補正する。
【００１５】
本発明の第２の局面は本発明の第１の局面にさらなる事項を付加する。本発明の第２の局面においては、光源、光学系及び駆動機構が照射機構に設けられる。光学系は、光源に放射された光の光路を誘電体媒体へ導く。駆動機構は、光学系を駆動し、光の光路を第１の光路と第２の光路との間で切り替える。
【００１６】
本発明の第３の局面は、本発明の第１又は第２の局面にさらなる事項を付加する。本発明の第３の局面においては、第２の光路が第２の主面と垂直をなす。
【００１７】
本発明の第４の局面は、本発明の第１から第３までのいずれかの局面にさらなる事項を付加する。本発明の第４の局面においては、光量センサが測定機構に設けられる。光量センサは、表面プラズモン励起蛍光の光路上であって透過光の光路上にある。
【００１８】
本発明の第５の局面は、本発明の第１から第４までのいずれの局面にさらなる事項を付加する。本発明の第５の局面においては、透過率導出部、電場増強度特定部及び規格化部が補正部に設けられる。透過率導出部は、測定機構から透過光の光量の測定値を取得し、透過光の光量の測定値から導電体膜の透過率の指標を導出する。電場増強度特定部は、導電体膜の透過率の指標から電場増強度を特定する。規格化部は、測定機構から表面プラズモン励起蛍光の光量の測定値を取得し、電場増強度により表面プラズモン励起蛍光の光量の測定値を規格化する。
【００１９】
本発明の第６の局面は、本発明の第５の局面にさらなる事項を付加する。本発明の第６の局面においては、膜厚導出部及び電場増強度導出部が電場増強度特定部に設けられる。膜厚導出部は、導電体膜の透過率の指標から導電体膜の膜厚を導出する。電場増強度導出部は、導電体膜の膜厚から電場増強度を導出する。
【００２０】
本発明の第７の局面は、表面プラズモン励起蛍光計測方法に向けられる。
【００２１】
本発明の第７の局面においては、導電体膜及び誘電体媒体が準備される。導電体膜の第２の主面と誘電体媒体の密着面とは密着する。導電体膜及び誘電体媒体が準備された後に、誘電体媒体の内部において臨界角より小さい入射角で密着面に光を入射させながら導電体膜を透過する透過光の光量が測定される。透過光の光量が測定された前若しくは後又は透過光の光量が測定されるのと同時に第１の主面に試料が供給される。試料が供給された後に、誘電体媒体の内部において臨界角以上の入射角で密着面に光を入射させながら試料に含まれる被計測物から放射される表面プラズモン励起蛍光の光量が測定される。表面プラズモン励起蛍光の光量の測定値は、透過光の光量の測定値により補正される。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の第１及び第７の局面によれば、導電体膜の膜厚の影響が減少し、計測の精度が向上する。
【００２３】
本発明の第２の局面によれば、第１の光路を経由する光及び第２の光路を経由する光が同一の光源から放射され、光源の数が減少し、表面プラズモン励起蛍光計測装置が簡略化される。
【００２４】
本発明の第３の局面によれば、透過光の光量が測定される場合に導電体膜と誘電体媒体との界面における光の反射の影響が減少し、計測の精度が向上する。
【００２５】
本発明の第４の局面によれば、表面プラズモン励起蛍光の光量及び透過光の光量が同一の光量センサにより測定され、光量センサの数が減少し、表面プラズモン励起蛍光計測装置が簡略化される。
【００２６】
本発明の第５の局面によれば、電場増強度の変化の影響が解消され、計測の精度が向上する。
【００２７】
これらの及びこれら以外の本発明の目的、特徴、局面及び利点は、添付図面とともに考慮されたときに下記の本発明の詳細な説明によってより明白となる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】表面プラズモン励起蛍光計測装置の模式図である。
【図２】センサチップの分解図である。
【図３】試料液が流路へ注入された状態の模式図である。
【図４】蛍光標識液が流路へ注入された状態の模式図である。
【図５】励起光の光路の模式図である。
【図６】膜厚測定光の光路の模式図である。
【図７】コントローラのブロック図である。
【図８】透過率と膜厚との関係を示すグラフである。
【図９】膜厚と電場増強度との関係を示すグラフである。
【図１０】表面プラズモン励起蛍光計測装置の動作を示すフローチャートである。
【図１１】ＳＰＲ曲線及び入射角と電場増強度との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
（表面プラズモン励起蛍光計測装置の概略）
図１の模式図は、表面プラズモン励起蛍光計測装置の望ましい実施形態を示す。
【００３０】
図１に示すように、表面プラズモン励起蛍光計測装置１０００は、センサチップ１００２、照射機構１００４、測定機構１００６、供給機構１００８及びコントローラ１０１０を備える。センサチップ１００２は、金膜１０１２、プリズム１０１４、抗体固層膜１０１６及び流路形成体１０１８を備える。照射機構１００４は、光源１０２０、光学系１０２２及び駆動機構１０２４を備える。測定機構１００６は、電荷結合素子（ＣＣＤ）センサ１０２６、ローパスフィルタ１０２８、減光（ＮＤ）フィルタ１０３０、フィルタ入れ替え機構１０３２及びフォトダイオード１０３４を備える。光学系１０２２は、直線偏光板１０３６、光路切り替えミラー１０３８及び膜厚測定光導入ミラー１０４０を備える。
【００３１】
表面プラズモン励起蛍光計測装置１０００は、表面プラズモン励起蛍光分光法（ＳＰＦＳ）による計測を行う。抗体固層膜１０１６には被計測物が捕捉される。捕捉された被計測物は蛍光標識される。
【００３２】
また、励起光１０４２がプリズム１０１４に導かれ、蛍光標識された被計測物から放射される表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量が測定される。
【００３３】
さらに、膜厚測定光１０５０がプリズム１０１４に導かれ、金膜１０１２を透過する透過光１０４６の光量が測定される。表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量の測定値は透過光１０４６の光量の測定値により補正される。
【００３４】
透過光１０４６の光量は金膜１０１２の膜厚に依存する。このため、この補正により、表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量の測定値に与える金膜１０１２の膜厚の影響が減少し、計測の精度が向上する。透過光１０４６の光量は、散乱光の光量と比較した場合、金膜１０１２の表面の粗さ、うねり等の影響を受けにくい。
【００３５】
表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量が測定される場合は、プリズム１０１４に励起光１０４２が照射される。励起光１０４２は、プリズム１０１４の内部において密着面１０４８に全反射される。密着面１０４８への励起光１０４２の入射角θ１は共鳴角θｒに設定される。励起光１０４２がプリズム１０１４に照射されている間は、密着面１０４８から金膜１０１２へエバネッセント波がもれだし、エバネッセント波と金膜１０１２の中のプラズモンとが共鳴し、エバネッセント波の電場が増強される。この増強された電場が蛍光標識された被計測物に作用し、蛍光標識された被計測物から表面プラズモン励起蛍光１０４４が放射される。表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量はＣＣＤセンサ１０２６により測定される。
【００３６】
透過光１０４６の光量が測定される場合は、プリズム１０１４に膜厚測定光１０５０が照射される。密着面１０４８への膜厚測定光１０５０の入射角θ２は臨界角θｃより小さい角に設定される。膜厚測定光１０５０がプリズム１０１４に照射されている間には、膜厚測定光１０５０が金膜１０１２を透過し、透過光１０４６の光量がＣＣＤセンサ１０２６により測定される。
【００３７】
｛センサチップ｝
図２の模式図は、センサチップの分解図である。
【００３８】
図１及び図２に示すように、センサチップ１００２においては、金膜１０１２の第１の主面１０５２に抗体固層膜１０１６が定着し、金膜１０１２の第１の主面１０５２に流路形成体１０１８が接合され、金膜１０１２の第２の主面１０５３とプリズム１０１４の密着面１０４８とが密着する。流路形成体１０１８には流路１０５４が形成される。抗体固層膜１０１６は流路１０５４の内部にある。
【００３９】
センサチップ１００２は、望ましくは、各片の長さが数ｍｍから数ｃｍまでの範囲内にある構造物であるが、「チップ」の範疇に含まれないより小型の構造物又はより大型の構造物に置き換えられてもよい。
【００４０】
｛金膜｝
金膜１０１２は、薄膜である。金膜１０１２の膜厚は、望ましくは、３０〜７０ｎｍである。ただし、金膜１０１２の膜厚がこの範囲外であってもよい。
【００４１】
金膜１０１２は、スパッタリング、蒸着、メッキ等により形成される。ただし、金膜１０１２が他の方法により形成されてもよい。
【００４２】
金膜１０１２が表面プラズモン共鳴を発生させる他の種類の導電体からなる膜に置き換えられてもよい。例えば、金膜１０１２が銀、銅、アルミニウム等の金属又はこれらの金属を含む合金からなる膜に置き換えられてもよい。
【００４３】
｛プリズム｝
プリズム１０１４は、台形柱体である。望ましくは、プリズム１０１４は、等脚台形柱体である。プリズム１０１４の一方の傾斜側面は励起光１０４２の入射面１０６６になる。プリズム１０１４の幅狭の平行側面は膜厚測定光１０５０の入射面１０６８になる。プリズム１０１４の幅広の平行側面は励起光１０４２の反射面１０７０及び膜厚測定光１０５０の出射面１０７２になる。プリズム１０１４の他方の傾斜面は励起光１０４２の出射面１０７４になる。密着面１０４８はプリズム１０１４の幅広の平行側面の全部又は一部を占める。プリズム１０１４の形状は、臨界角θｃ以上の入射角θ１で励起光１０４２を密着面１０４８へ入射させることができ、臨界角θｃより小さい入射角θ２で膜厚測定光１０５０を密着面１０４８へ入射させることができるように決められる。
【００４４】
臨界角θｃ以上の入射角θ１で励起光１０４２を密着面１０４８へ入射させることができ、臨界角θｃより小さい入射角θ２で膜厚測定光１０５０を密着面１０４８へ入射させることができる限り、プリズム１０１４が台形柱体以外でもよく、プリズム１０１４が「プリズム」の範疇に含まれない形状物に置き換えられてもよい。
【００４５】
プリズム１０１４は、励起光１０４２及び透過光１０４６に対して透明な材質からなる誘電体媒体である。プリズム１０１４は、ガラス、樹脂等からなる。望ましくは、プリズム１０１４は、屈折率が１．４〜１．６であって複屈折が小さい樹脂からなる。
【００４６】
プリズム１０１４が樹脂からなる場合は、望ましくは、プリズム１０１４は射出成形により作製される。
【００４７】
｛流路形成体｝
流路形成体１０１８には、流路１０５４が形成される。流路１０５４の途中には反応室１０７６がある。反応室１０７６は、接合面１０７８に露出する。流路形成体１０１８が金膜１０１２に接合される場合には、反応室１０７６の平面位置と抗体固層膜１０１６の平面位置とが一致させられる。抗体固層膜１０１６は、反応室１０７６に露出する。流路１０５４は、流路形成体１０１８の非接合面１０８０に露出し、非接合面１０８０には注入口１０８２が形成される。流路形成体１０１８と金膜１０１２とは、接着、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ圧着等により接合される。ただし、流路形成体１０１８と金膜１０１２とが他の方法により接合されてもよい。
【００４８】
流路形成体１０１８は、表面プラズモン励起蛍光１０４４及び膜厚測定光１０５０に対して透明な材質からなる。流路形成体１０１８は、例えば、樹脂等からなる。
【００４９】
流路形成体１０１８は、試料液又は蛍光標識液の飛散を防止し、抗体固層膜１０１６に接触する試料液又は蛍光標識液の量を一定にすることに寄与する。しかし、流路形成体１０１８が省略され、抗体固層膜１０１６の上に試料液又は蛍光標識液が直接的に滴下されてもよい。
【００５０】
｛供給機構｝
供給機構１００８は、試料液及び蛍光標識液を流路１０５４へ注入する。試料液又は蛍光標識液が流路１０５４へ注入された場合は、それぞれ、試料液又は蛍光標識液で反応室１０７６が満たされ、第１の主面１０５２上の抗体固層膜１０１６に試料液又は蛍光標識液が供給され、試料液又は蛍光標識液が抗体固層膜１０１６に接触する。
【００５１】
｛流路への試料液及び蛍光標識液の注入｝
図３の模式図は、試料液が流路へ注入された状態を示す。図４の模式図は、蛍光標識液が流路へ注入された状態を示す。
【００５２】
図３に示すように、試料液１０５６が流路１０５４へ注入された場合は、試料液１０５６に含まれる抗原１０５８と抗体固層膜１０１６に含まれる抗体１０６４とが生化学反応又は免疫反応により結合し、抗原１０５８が抗体固層膜１０１６に捕捉される。また、抗原１０５８が抗体固層膜１０１６に捕捉された状態において蛍光標識液１０６０が流路１０５４へ注入された場合は、図４に示すように、抗体固層膜１０１６に捕捉された抗原１０５８と蛍光標識液１０６０に含まれる蛍光標識抗体１０６２とが生化学反応又は免疫反応により結合し、抗体固層膜１０１６に捕捉された抗原１０５８が蛍光標識抗体１０６２に蛍光標識される。免疫反応は、抗原抗体反応とも呼ばれる。
【００５３】
｛試料液及び蛍光標識液｝
試料液１０５６は、典型的には、血液等の人間からの採取物であるが、人間以外の生物からの採取物であってもよく、非生物からの採取物であってもよい。希釈、血球分離、試薬の混合等の他の前処理が採取物に対して行われてもよい。
【００５４】
蛍光標識液１０６０は、被計測物の抗原１０５８と結合する蛍光標識抗体１０６２を含む。蛍光標識抗体１０６２は、蛍光を放射する蛍光標識となる化学構造部分を含む。
【００５５】
試料液１０５６及び蛍光標識液１０６０に代えて、それぞれ、気体又は流動性を有する固体からなる試料及び蛍光標識抗体含有物が流路１０５４へ注入されてもよい。
【００５６】
｛抗体固層膜｝
抗体固層膜１０１６は、非流動体からなる。したがって、試料液１０５６又は蛍光標識液１０６０が抗体固層膜１０１６に接触しても、抗体固層膜１０１６は移動しない。
【００５７】
抗体１０６４は、均一に分布する。被計測物に応じて被計測物を捕捉する捕捉体は変更され、被計測物の補足体は抗体固層膜１０１６に限られない。
【００５８】
抗体固層膜１０１６は、例えば、ラバー製のアプリケーターによりパターニングされる。抗体固層膜１０１６の直径は、典型的には２ｍｍであり、抗体固層膜１０１６の層厚は、典型的には１００ｎｍ以下である。
【００５９】
｛光源｝
図１に示すように、光源１０２０は、光を放射する。望ましくは、光源１０２０はレーザーダイオードであり、光源１０２０から放射される光は、平行光線であり、直線偏光であり、単色光である。
【００６０】
光源１０２０がレーザーダイオード以外であってもよい。例えば、光源１０２０が発光ダイオード、水銀灯、レーザーダイオード以外のレーザー等であってもよい。光源１０２０から放射される光が平行光線でない場合は、レンズ、鏡、スリット等により光が平行光線へ変換される。光源１０２０から放射される光が直線偏光でない場合は、偏光子等により光が直線偏光に変換される。光源１０２０から放射される光が単色光でない場合は、回折格子等により光が単色光に変換される。
【００６１】
｛直線偏光板｝
直線偏光板１０３６は、励起光１０４２の光路上にあり、励起光１０４２を直線偏光に変換する。励起光１０４２の偏光方向は、密着面１０４８に対して励起光１０４２がｐ偏光になるように選択される。これにより、エバネッセント波のもれだしが増加し、表面プラズモン励起蛍光１０４４が増加し、計測の感度が向上する。
【００６２】
｛光学系｝
図５の模式図は、励起光の光路を示す。図６の模式図は、膜厚測定光の光路を示す。
【００６３】
図５に示すように、光源１０２０から放射された光が励起光１０４２として利用される場合は、光源１０２０から放射された光が光路切り替えミラー１０３８により反射される。光路切り替えミラー１０３８により反射された光はプリズム１０１４に照射される。プリズム１０１４に照射された光は、励起光１０４２の入射面１０６６へ入射し、密着面１０４８に反射され、励起光１０４２の出射面１０７４から出射する。密着面１０４８への励起光１０４２の入射角θ１は、全反射条件θｃ≦θ１を満たす。したがって、励起光１０４２が密着面１０４８へ入射した場合は、励起光１０４２が密着面１０４８に全反射され、図４に示すように、金膜１０１２にエバネッセント波１０８２がもれだし、エバネッセント波１０８２が増強される。
【００６４】
図６に示すように、光源１０２０から放射された光が膜厚測定光１０５０として利用される場合は、光源１０２０から放射された光が光路切り替えミラー１０３８により反射される。光路切り替えミラー１０３８により反射された光は膜厚測定光導入ミラー１０４０にさらに反射される。膜厚測定光導入ミラー１０４０により反射された光は、プリズム１０１４に照射される。プリズム１０１４に照射された光は、膜厚測定光１０５０の入射面１０６８へ入射し、密着面１０４８から出射し、金膜１０１２の第２の主面１０５３へ入射し、金膜１０１２を透過し、金膜１０１２の第１の主面１０５２から出射する。密着面１０４８への膜厚測定光１０５０の入射角θ２は、全反射条件θｃ≦θ２を満たさず（θ２＜θｃ）、望ましくは０°である。密着面１０４８への膜厚測定光１０５０の入射角θ２が０°である場合は、膜厚測定光１０５０の光路が第２の主面１０５３と垂直をなし、膜厚測定光１０５０が金膜１０１２に垂直に入射し、金膜１０１２とプリズム１０１４との界面における膜厚測定光１０５０の反射の影響が抑制され、計測の精度が向上する。
【００６５】
光源１０２０から放射された光の光路を励起光１０４２の光路と膜厚測定光１０５０の光路との間で切り替えるため、図１に示すように、光路切り替えミラー１０３８の位置及び姿勢が駆動機構１０２４により調整される。駆動機構１０２４は、密着面１０４８への励起光１０４４の入射角θ１を調整するためにも用いられる。駆動機構１０２４は、モータ、圧電アクチュエータ等の駆動力源を備える。駆動機構１０２４は、光路切り替えミラー１０３６を回転させ、光路切り替えミラー１０３６の姿勢を調整する。駆動機構１０２４は、光路切り替えミラー１０３６をリニアステージの上で移動させ、光路切り替えミラー１０３６の位置を調整する。
【００６６】
他の種類の光学系により光源１０２０から放射された光の光路が励起光１０４２の光路と膜厚測定光１０５０の光路との間で切り替えられてもよい。例えば、光路切り替えミラー１０３８及び膜厚測定光導入ミラー１０４０の両方又は片方がプリズム等の他の種類の屈曲光学素子に置き換えられてもよい。光路切り替えミラー１０３８及び膜厚測定光導入ミラー１０４０以外の光学素子が設けられてもよい。光路切り替えミラー１０３８の位置及び姿勢を調整する駆動機構に代えて、又は、光路切り替えミラー１０３８の位置及び姿勢を調整する駆動機構に加えて、光路切り替えミラー１０３８以外の光学素子の位置及び姿勢を調整する駆動機構、光源１０２０の位置及び姿勢を調整する機構が設けられてもよい。
【００６７】
望ましくは、同一の光源１０２０から放射された光の光路が励起光１０４２の光路と膜厚測定光１０５０の光路とに光学系１０２２により切り替えられる。これにより、励起光１０４２及び膜厚測定光１０５０が同一の光源１０２０から放射され、光源１０２０の数が減少し、表面プラズモン励起蛍光計測装置１０００が簡略化される。ただし、光源の数が増加するが、励起光１０４２を放射する光源と膜厚放射光１０５０を放射する光源とが別個であってもよい。励起光１０４２の波長及び膜厚測定光１０５０の波長は、望ましくは同じであるが、異なってもよい。
【００６８】
｛ＣＣＤセンサ｝
ＣＣＤセンサ１０２６は、表面プラズモン励起蛍光１０４４の光路上であって透過光１０４６の光路上にあり、表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量及び透過光１０４６の光量の両方を測定する。これにより、表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量及び透過光１０４６の光量が同一のＣＣＤセンサ１０２６により測定され、ＣＣＤセンサの数が減少し、表面プラズモン励起蛍光計測装置１０００が簡略化される。このためには、表面プラズモン励起蛍光１０４４の光路及び透過光１０４６の光路の少なくとも一部が一致する必要がある。ただし、ＣＣＤセンサの数が増加するが、表面プラズモン励起蛍光１０４４の光路及び透過光１０４６の光路が完全に分離されてもよく、表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量を測定するＣＣＤセンサと透過光１０４６の光量を測定するＣＣＤセンサとが別個であってもよい。ＣＣＤセンサ１０２６が光電子増倍管（ＰＭＴ）等の他の形式の光量センサに置き換えられてもよい。
【００６９】
反射光１０８４の光量が極小になる入射角θ１ではなく散乱光の光量が極大になる入射角θ１から共鳴角θｒが決定される場合は、望ましくは、ＣＣＤセンサ１０２６は、散乱光の光路上にあり、散乱光の光量も測定する。ただし、ＣＣＤセンサ１０２６とは別個のＣＣＤセンサが散乱光の光量を測定してもよい。
【００７０】
｛ローパスフィルタ、減光フィルタ及びフィルタ入れ替え機構｝
フィルタ入れ替え機構１０３２は、光路に挿入されるフィルタをローパスフィルタ１０２８と減光フィルタ１０３０との間で切り替える。図５に示すように、表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量が測定される場合は、ローパスフィルタ１０２８が表面プラズモン励起蛍光１０４４の光路に挿入される。図６に示すように、透過光１０４６の光量が測定される場合は、減光フィルタ１０３０が透過光１０４６の光路に挿入される。
【００７１】
ローパスフィルタ１０２８は、カットオフ波長より長い波長の光を透過し、カットオフ波長より短い波長の光を減衰させる。カットオフ波長は、励起光１０４２の波長から表面プラズモン励起蛍光１０４４の波長までの範囲内で選択される。例えば、励起光１０４２の波長が約６４０ｎｍであって表面プラズモン励起蛍光１０４４の波長が６７０ｎｍである場合は、６５０ｎｍがカットオフ波長として選択される。ローパスフィルタ１０２８が表面プラズモン励起蛍光１０４４の光路に挿入された場合は、励起光１０４２はローパスフィルタ１０２８により減衰し、励起光１０４２のごく一部がＣＣＤセンサ１０２６に到達するが、表面プラズモン励起蛍光１０４４はローパスフィルタ１０２８を透過し、表面プラズモン励起蛍光１０４４の大部分がＣＣＤセンサ１０２６に到達する。これにより、相対的に光量が小さい表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量が測定される場合に相対的に光量が大きい散乱光の影響が抑制され、計測の精度が向上する。
【００７２】
減光フィルタ１０３０は、光を減衰させる。減光フィルタ１０３０が透過光１０４６の光路に挿入された場合は、透過光１０４６は減光フィルタ１０３０により減衰し、透過光１０４６の一部がＣＣＤセンサ１０２６に到達する。これにより、相対的に光量が大きい透過光１０４６の光量と相対的に光量が小さい表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量とが同一のＣＣＤセンサ１０２６により容易に測定される。
【００７３】
表面プラズモン励起蛍光１０４４の光路及び透過光１０４６の光路が分離される場合は、フィルタ入れ替え機構１０３２が省略される場合もある。表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量を測定する光量センサと透過光１０４６の光量を測定する光量センサとが別個であり、透過光１０４６の光量を測定する光量センサの感度が低い場合は、減光フィルタ１０３０が省略されてもよい。
【００７４】
｛フォトダイオード｝
図１に示すように、フォトダイオード１０３４は、励起光１０４２の出射面１０７４から出射した励起光１０４２、すなわち、反射光１０８４の光路上にあり、反射光１０８４の光量を測定する。フォトダイオード１０３４がフォトトランジスタ、フォトレジスタ等の他の形式の光量センサにより測定されてもよい。散乱光の光量が極大になる入射角θ１から共鳴角θｒが決定される場合は、フォトダイオード１０３４が省略されてもよい。
【００７５】
｛コントローラ｝
図７のブロック図は、コントローラを示す。
【００７６】
図７に示すように、コントローラ１０１０は、運転制御部１１００及び補正部１１０２を備える。補正部１１０２は、透過率導出部１１０４、電場増強度特定部１１０６、規格化部１１０８及び記憶部１１１０を備える。電場増強度特定部１１０６は、膜厚導出部１１１２及び電場増強度導出部１１１４を備える。
【００７７】
運転制御部１１００は、表面プラズモン励起蛍光計測装置１０００のハードウエアの構成物を制御し、表面プラズモン励起蛍光計測装置１０００の運転を担う。補正部１１０２は、演算を行い、透過光１０４６の光量の測定値による表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量の測定値の補正を担う。
【００７８】
透過率導出部１１０４は、ＣＣＤセンサ１０２６から透過光１０４６の光量の測定値を取得し、透過光１０４６の光量の測定値から金膜１０１２の透過率の指標を導出する。透過率の指標は、透過率そのものであってもよいし、透過率と一対一に対応する値であってもよい。例えば、金膜１０１２の第２の主面１０５３へ入射する膜厚測定光１０５０の光量が一定であって金膜１０１２の第１の主面１０５２からＣＣＤセンサ１０２６までの区間における膜厚測定光１０５０の減衰が一定であるとみなせる場合は、透過光１０４６の光量の測定値そのものが透過率の指標となりうる。透過率の指標は、減光フィルタ１０３０の減衰率及び膜厚測定光１０５０の光量で透過光１０４６の光量の測定値を除することにより導出される。
【００７９】
電場増強度特定部１１０６は、金膜１０１２の透過率の指標から電場増強度を特定する。
【００８０】
膜厚導出部１１１２は、金膜１０１２の透過率の指標から金膜１０１２の膜厚を導出する。金膜１０１２の膜厚が導出される場合には、記憶部１１１０に記憶された金膜１０１２の透過率の指標と金膜１０１２の膜厚との関係１１１６が参照され、透過率導出部１１０４により特定された金膜１０１２の透過率の指標に対応する金膜１０１２の膜厚が特定される。
【００８１】
図８のグラフは、膜厚測定光１０５０の波長が６３５ｎｍであり、金膜１０１２の光学定数がn=0.22273及びk=3.4533であるとした場合に理論的に得られる金膜１０１２の透過率と金膜１０１２の膜厚と関係を示す。
【００８２】
電場増強度導出部１１１４は、金膜１０１２の膜厚から電場増強度を導出する。電場増強度が導出される場合は、記憶部１１１０に記憶された金膜１０１２の膜厚と電場増強度との関係１１１８が参照され、膜厚導出部１１１２により導出された金膜１０１２の膜厚に対応する電場増強度が特定される。
【００８３】
電場増強度は、入射角θ１にも依存し、電場増強度が最大になる入射角θ１は金膜１０１２の膜厚によって変化する。このため、望ましくは、金膜１０１２の膜厚ごとに電場増強度が最大になる入射角θ１が特定され、電場増強度が最大となる入射角θ１で密着面１０４８に励起光１０４２が入射した場合の金膜１０１２の膜厚と電場増強度との関係が用いられる。
【００８４】
図９のグラフは、金膜１０１２の膜厚と電場増強度との関係の一例を示す。図９は、プリズム１０１４の２種類の樹脂材料である「Ｅ４８Ｒ」及び「ＢＫ７」について理論的に得られる金膜１０１２の膜厚と電場増強度との関係を示す。
【００８５】
関係１１１６及び１１１８は、典型的には、数値テーブルである。ただし、関係１１１６及び１１１８が演算式として与えられてもよい関係１１１６及び係１１１８は、理論的に求められるが、実測されてもよい。
【００８６】
関係１１１６及び１１１８が結合され、金膜１０１２の透過率の指標と電場増強度との関係が記憶部１１１０に記憶されてもよい。この場合は、電場増強度特定部１１０６において、金膜１０１２の膜厚を経由せずに金膜１０１２の透過率の指標から電場増強度が直接的に導出される。
【００８７】
規格化部１１０８は、ＣＣＤセンサ１０２６から表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量の測定値を取得し、電場増強度特定部１１０６により特定された電場増強度により表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量の測定値を規格化する。規格化は、表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量の測定値を電場増強度で除することにより行われる。
【００８８】
コントローラ１０１０は、ソフトウエアを実行する組み込みコンピュータである。１個の組み込みコンピュータが図７に示すブロックの機能を担ってもよいし、２個以上の組み込みコンピュータが分担して図７に示すブロックの機能を担ってもよい。ソフトウエアを伴わないハードウエアが図７に示すブロックの全部又は一部の機能を担ってもよい。ハードウエアは、例えば、オペアンプ、コンパレータ等の電子回路である。図７に示すブロックによる処理の全部又は一部が、人間の手作業により実行されてもよく、表面プラズモン励起蛍光計測装置１０００の外部において実行されてもよい。
【００８９】
（表面プラズモン励起蛍光計測装置の動作）
図１０のフローチャートは、表面プラズモン励起蛍光計測装置の動作を示す。
【００９０】
図１０に示すように、センサチップ１００２が準備され、表面プラズモン励起蛍光計測装置１０００にセンサチップ１００２が取り付けられる（ステップＳ１０１）。
【００９１】
センサチップ１００２が取り付けられた後に、透過光１０４６の光量が測定される（ステップＳ１０２）。透過光１０４６の光量が測定される場合は、駆動機構１０２４及びＣＣＤセンサ１０２６が運転制御部１１００により制御される。光路切り替えミラー１０３８の位置及び姿勢が駆動機構１０２４により調整され、光源１０２０から放射された光の光路が膜厚測定光１０５０の光路に設定される。同時に、透過光１０４６の光量がＣＣＤセンサ１０２６により測定される。透過光１０４６の光量の測定値は、コントローラ１０１０へ転送される。
【００９２】
透過光１０４６の光量が測定された後に、入射角θが測定角θｍに設定される（ステップＳ１０３）。入射角θが測定角θｍに設定される場合は、駆動機構１０２４及びフォトダイオード１０３４が運転制御部１１００により制御される。光路切り替えミラー１０３８の位置及び姿勢が駆動機構１０２４により調整され、光源１０２０から放射された光の光路が励起光１０４２の光路に設定される。また、入射角θ１が予想される共鳴角θｒの近傍において走査される。入射角θ１の走査と並行して、反射光１０８４の光量がフォトダイオード１０３４により測定される。反射光１０８４の光量の測定値は、コントローラ１０１０へ転送される。入射角θ１と反射光１０８４の光量との関係を示す表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）曲線から反射光１０８４の光量が極小になる入射角θ１である共鳴角θｒが特定され、共鳴角θｒから測定角θｍが決定される。共鳴角θｒと電場増強度が極大になる入射角θ１とはわずかに異なるので、望ましくは、微小角が共鳴角θｒに可算又は減算され測定角θｍが決定される。図１１のグラフは、ＳＰＲ曲線及び入射角と電場増強度との関係を示す。
【００９３】
入射角θ１が測定角θｍに設定された後に、試料液１０５６及び蛍光標識液１０６０が流路１０５４へ順次に注入される（ステップＳ１０４）。試料液１０５６及び蛍光標識液１０６０が流路１０５４に順次に注入される場合は、供給機構１００８が運転制御部１１００により制御される。これにより、試料液１０５６及び蛍光標識液１０６０が抗体固層膜１０１６に順次に供給され、蛍光標識された抗原１０５８が抗体固層膜１０１６に捕捉された状態になる。膜厚測定光１０５０の光路が流路１０５４を通過する場合は、望ましくは、透過光１０４６の光量が測定された後に試料液１０５６及び蛍光標識液１０６０が流路１０５４に注入される。しかし、膜厚測定光１０５０の光路が流路１０５４を通過しない場合は、透過光１０４６の光量が測定された前及び後のいずれに試料液１０５６及び蛍光標識液１０６０が流路１０５４に注入されてもよく、透過光１０４６の光量が測定されるのと同時に試料液１０５６及び蛍光標識液１０６０が流路１０５４に注入されてもよい。
【００９４】
試料液１０５６及び蛍光標識液１０６０が流路１０５４に注入された後に、表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量が測定される（ステップＳ１０５）。表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量が測定される場合は、ＣＣＤセンサ１０２６が運転制御部１１００により制御される。表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量はＣＣＤセンサ１０２６により測定される。表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量の測定値は、コントローラ１０１０へ転送される。
【００９５】
表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量を測定する光量センサと透過光１０４６の光量を測定する光量センサとが別個であり、励起光１０４２を放射する光源１０２０と膜厚測定光１０５０を放射する光源１０２０とが別個であり、膜厚測定光１０５０が流路１０５４を通過しない場合は、表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量の測定と同時に透過光１０４６の光量が測定されてもよい。
【００９６】
表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量が測定された後に、補正部１１０２において表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量の測定値が透過光１０４６の光量の測定値により補正される（ステップＳ１０６）。
【００９７】
この発明は詳細に説明されたが、上記の説明は、すべての局面において例示であり、この発明は上記の説明に限定されない。例示されない無数の変形例が、この発明の範囲から外れることなく想定されうる。
【符号の説明】
【００９８】
１０００ 表面プラズモン励起蛍光計測装置
１００４ 照射機構
１００６ 測定機構
１０１２ 金膜
１０２０ 光源
１０２２ 光学系
１０２４ 駆動機構
１０４２ 励起光
１０４４ 表面プラズモン励起蛍光
１０４６ 透過光
１０５０ 膜厚測定光
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン励起蛍光分光法による計測を行う表面プラズモン励起蛍光計測装置及び表面プラズモン励起蛍光計測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
誘電体媒体の中を進む励起光が導電体膜と誘電体媒体との界面に全反射された場合は、界面からエバネッセント波がもれだし、導電体膜の中のプラズモンとエバネッセント波とが干渉する。界面への励起光の入射角が共鳴角に設定されプラズモンとエバネッセント波とが共鳴する場合にエバネッセント波の電場は著しく増強される。表面プラズモン励起蛍光分光法（ＳＰＦＳ）による計測においては、この増強された電場が用いられる。
【０００３】
ＳＰＦＳによる計測においては、導電体膜の表面に被計測物が捕捉され、捕捉された被計測物が蛍光標識される。増強された電場は蛍光標識された被計測物に作用し、蛍光標識された被計測物からは表面プラズモン励起蛍光が放射される。さらに、表面プラズモン励起蛍光の光量が測定され、被計測物の有無、被計測物の捕捉量等が特定される。
【０００４】
エバネッセント波の電場増強度は、導電体膜の膜厚に依存する。このため、導電体膜の膜厚にばらつきがある場合は、エバネッセント波の電場増強度にばらつきが生じ、表面プラズモン励起蛍光の光量にばらつきが生じ、計測の精度が低下する。
【０００５】
特許文献１においては、表面プラズモン励起蛍光の光量が測定されるときに、散乱光の光量が測定される。また、散乱光の光量から電場増強度が求められ、電場増強度により表面プラズモン励起蛍光の光量が補正される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−２１６５３２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、散乱光の光量は導電体膜の表面の状態により変化する。例えば、散乱光の光量は導電体膜の表面の粗さ、うねり等により変化する。このため、特許文献１の補正が行われても計測の精度は不十分である。
【０００８】
本発明は、この問題を解決するためになされる。本発明の目的は、導電体膜の膜厚の影響が減少し計測の精度が向上する表面プラズモン励起蛍光計測装置及び表面プラズモン励起蛍光計測方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１から第６までの局面は、表面プラズモン計測装置に向けられる。
【００１０】
本発明の第１の局面においては、導電体膜、誘電体媒体、照射機構、測定機構及び補正部が設けられる。
【００１１】
導電体膜の第１の主面には試料が供給される。導電体膜の第２の主面と誘電体媒体の密着面とは密着する。
【００１２】
照射機構は、誘電体媒体に光を照射し、第１の光路と第２の光路との間で光の光路を切り替える。第１の光路においては、誘電体媒体の内部において臨界角以上の入射角で密着面に光が入射する。第２の光路においては、誘電体媒体の内部において臨界角より小さい入射角で密着面に光が入射する。
【００１３】
測定機構は、表面プラズモン励起蛍光及び透過光の光量を測定する。表面プラズモン励起蛍光は、第１の光路を経由する光が誘電体媒体に照射されている間に試料に含まれる被計測物から放射される。透過光は、第２の光路を経由する光が誘電体媒体に照射されている間に導電体膜を透過する。
【００１４】
補正部は、表面プラズモン励起蛍光の光量の測定値を透過光の光量の測定値により補正する。
【００１５】
本発明の第２の局面は本発明の第１の局面にさらなる事項を付加する。本発明の第２の局面においては、光源、光学系及び駆動機構が照射機構に設けられる。光学系は、光源に放射された光の光路を誘電体媒体へ導く。駆動機構は、光学系を駆動し、光の光路を第１の光路と第２の光路との間で切り替える。
【００１６】
本発明の第３の局面は、本発明の第１又は第２の局面にさらなる事項を付加する。本発明の第３の局面においては、第２の光路が第２の主面と垂直をなす。
【００１７】
本発明の第４の局面は、本発明の第１から第３までのいずれかの局面にさらなる事項を付加する。本発明の第４の局面においては、光量センサが測定機構に設けられる。光量センサは、表面プラズモン励起蛍光の光路上であって透過光の光路上にある。
【００１８】
本発明の第５の局面は、本発明の第１から第４までのいずれの局面にさらなる事項を付加する。本発明の第５の局面においては、透過率導出部、電場増強度特定部及び規格化部が補正部に設けられる。透過率導出部は、測定機構から透過光の光量の測定値を取得し、透過光の光量の測定値から導電体膜の透過率の指標を導出する。電場増強度特定部は、導電体膜の透過率の指標から電場増強度を特定する。規格化部は、測定機構から表面プラズモン励起蛍光の光量の測定値を取得し、電場増強度により表面プラズモン励起蛍光の光量の測定値を規格化する。
【００１９】
本発明の第６の局面は、本発明の第５の局面にさらなる事項を付加する。本発明の第６の局面においては、膜厚導出部及び電場増強度導出部が電場増強度特定部に設けられる。膜厚導出部は、導電体膜の透過率の指標から導電体膜の膜厚を導出する。電場増強度導出部は、導電体膜の膜厚から電場増強度を導出する。
【００２０】
本発明の第７の局面は、表面プラズモン励起蛍光計測方法に向けられる。
【００２１】
本発明の第７の局面においては、導電体膜及び誘電体媒体が準備される。導電体膜の第２の主面と誘電体媒体の密着面とは密着する。導電体膜及び誘電体媒体が準備された後に、誘電体媒体の内部において臨界角より小さい入射角で密着面に光を入射させながら導電体膜を透過する透過光の光量が測定される。透過光の光量が測定された前若しくは後又は透過光の光量が測定されるのと同時に第１の主面に試料が供給される。試料が供給された後に、誘電体媒体の内部において臨界角以上の入射角で密着面に光を入射させながら試料に含まれる被計測物から放射される表面プラズモン励起蛍光の光量が測定される。表面プラズモン励起蛍光の光量の測定値は、透過光の光量の測定値により補正される。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の第１及び第７の局面によれば、導電体膜の膜厚の影響が減少し、計測の精度が向上する。
【００２３】
本発明の第２の局面によれば、第１の光路を経由する光及び第２の光路を経由する光が同一の光源から放射され、光源の数が減少し、表面プラズモン励起蛍光計測装置が簡略化される。
【００２４】
本発明の第３の局面によれば、透過光の光量が測定される場合に導電体膜と誘電体媒体との界面における光の反射の影響が減少し、計測の精度が向上する。
【００２５】
本発明の第４の局面によれば、表面プラズモン励起蛍光の光量及び透過光の光量が同一の光量センサにより測定され、光量センサの数が減少し、表面プラズモン励起蛍光計測装置が簡略化される。
【００２６】
本発明の第５の局面によれば、電場増強度の変化の影響が解消され、計測の精度が向上する。
【００２７】
これらの及びこれら以外の本発明の目的、特徴、局面及び利点は、添付図面とともに考慮されたときに下記の本発明の詳細な説明によってより明白となる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】表面プラズモン励起蛍光計測装置の模式図である。
【図２】センサチップの分解図である。
【図３】試料液が流路へ注入された状態の模式図である。
【図４】蛍光標識液が流路へ注入された状態の模式図である。
【図５】励起光の光路の模式図である。
【図６】膜厚測定光の光路の模式図である。
【図７】コントローラのブロック図である。
【図８】透過率と膜厚との関係を示すグラフである。
【図９】膜厚と電場増強度との関係を示すグラフである。
【図１０】表面プラズモン励起蛍光計測装置の動作を示すフローチャートである。
【図１１】ＳＰＲ曲線及び入射角と電場増強度との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
（表面プラズモン励起蛍光計測装置の概略）
図１の模式図は、表面プラズモン励起蛍光計測装置の望ましい実施形態を示す。
【００３０】
図１に示すように、表面プラズモン励起蛍光計測装置１０００は、センサチップ１００２、照射機構１００４、測定機構１００６、供給機構１００８及びコントローラ１０１０を備える。センサチップ１００２は、金膜１０１２、プリズム１０１４、抗体固層膜１０１６及び流路形成体１０１８を備える。照射機構１００４は、光源１０２０、光学系１０２２及び駆動機構１０２４を備える。測定機構１００６は、電荷結合素子（ＣＣＤ）センサ１０２６、ローパスフィルタ１０２８、減光（ＮＤ）フィルタ１０３０、フィルタ入れ替え機構１０３２及びフォトダイオード１０３４を備える。光学系１０２２は、直線偏光板１０３６、光路切り替えミラー１０３８及び膜厚測定光導入ミラー１０４０を備える。
【００３１】
表面プラズモン励起蛍光計測装置１０００は、表面プラズモン励起蛍光分光法（ＳＰＦＳ）による計測を行う。抗体固層膜１０１６には被計測物が捕捉される。捕捉された被計測物は蛍光標識される。
【００３２】
また、励起光１０４２がプリズム１０１４に導かれ、蛍光標識された被計測物から放射される表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量が測定される。
【００３３】
さらに、膜厚測定光１０５０がプリズム１０１４に導かれ、金膜１０１２を透過する透過光１０４６の光量が測定される。表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量の測定値は透過光１０４６の光量の測定値により補正される。
【００３４】
透過光１０４６の光量は金膜１０１２の膜厚に依存する。このため、この補正により、表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量の測定値に与える金膜１０１２の膜厚の影響が減少し、計測の精度が向上する。透過光１０４６の光量は、散乱光の光量と比較した場合、金膜１０１２の表面の粗さ、うねり等の影響を受けにくい。
【００３５】
表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量が測定される場合は、プリズム１０１４に励起光１０４２が照射される。励起光１０４２は、プリズム１０１４の内部において密着面１０４８に全反射される。密着面１０４８への励起光１０４２の入射角θ１は共鳴角θｒに設定される。励起光１０４２がプリズム１０１４に照射されている間は、密着面１０４８から金膜１０１２へエバネッセント波がもれだし、エバネッセント波と金膜１０１２の中のプラズモンとが共鳴し、エバネッセント波の電場が増強される。この増強された電場が蛍光標識された被計測物に作用し、蛍光標識された被計測物から表面プラズモン励起蛍光１０４４が放射される。表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量はＣＣＤセンサ１０２６により測定される。
【００３６】
透過光１０４６の光量が測定される場合は、プリズム１０１４に膜厚測定光１０５０が照射される。密着面１０４８への膜厚測定光１０５０の入射角θ２は臨界角θｃより小さい角に設定される。膜厚測定光１０５０がプリズム１０１４に照射されている間には、膜厚測定光１０５０が金膜１０１２を透過し、透過光１０４６の光量がＣＣＤセンサ１０２６により測定される。
【００３７】
｛センサチップ｝
図２の模式図は、センサチップの分解図である。
【００３８】
図１及び図２に示すように、センサチップ１００２においては、金膜１０１２の第１の主面１０５２に抗体固層膜１０１６が定着し、金膜１０１２の第１の主面１０５２に流路形成体１０１８が接合され、金膜１０１２の第２の主面１０５３とプリズム１０１４の密着面１０４８とが密着する。流路形成体１０１８には流路１０５４が形成される。抗体固層膜１０１６は流路１０５４の内部にある。
【００３９】
センサチップ１００２は、望ましくは、各片の長さが数ｍｍから数ｃｍまでの範囲内にある構造物であるが、「チップ」の範疇に含まれないより小型の構造物又はより大型の構造物に置き換えられてもよい。
【００４０】
｛金膜｝
金膜１０１２は、薄膜である。金膜１０１２の膜厚は、望ましくは、３０〜７０ｎｍである。ただし、金膜１０１２の膜厚がこの範囲外であってもよい。
【００４１】
金膜１０１２は、スパッタリング、蒸着、メッキ等により形成される。ただし、金膜１０１２が他の方法により形成されてもよい。
【００４２】
金膜１０１２が表面プラズモン共鳴を発生させる他の種類の導電体からなる膜に置き換えられてもよい。例えば、金膜１０１２が銀、銅、アルミニウム等の金属又はこれらの金属を含む合金からなる膜に置き換えられてもよい。
【００４３】
｛プリズム｝
プリズム１０１４は、台形柱体である。望ましくは、プリズム１０１４は、等脚台形柱体である。プリズム１０１４の一方の傾斜側面は励起光１０４２の入射面１０６６になる。プリズム１０１４の幅狭の平行側面は膜厚測定光１０５０の入射面１０６８になる。プリズム１０１４の幅広の平行側面は励起光１０４２の反射面１０７０及び膜厚測定光１０５０の出射面１０７２になる。プリズム１０１４の他方の傾斜面は励起光１０４２の出射面１０７４になる。密着面１０４８はプリズム１０１４の幅広の平行側面の全部又は一部を占める。プリズム１０１４の形状は、臨界角θｃ以上の入射角θ１で励起光１０４２を密着面１０４８へ入射させることができ、臨界角θｃより小さい入射角θ２で膜厚測定光１０５０を密着面１０４８へ入射させることができるように決められる。
【００４４】
臨界角θｃ以上の入射角θ１で励起光１０４２を密着面１０４８へ入射させることができ、臨界角θｃより小さい入射角θ２で膜厚測定光１０５０を密着面１０４８へ入射させることができる限り、プリズム１０１４が台形柱体以外でもよく、プリズム１０１４が「プリズム」の範疇に含まれない形状物に置き換えられてもよい。
【００４５】
プリズム１０１４は、励起光１０４２及び透過光１０４６に対して透明な材質からなる誘電体媒体である。プリズム１０１４は、ガラス、樹脂等からなる。望ましくは、プリズム１０１４は、屈折率が１．４〜１．６であって複屈折が小さい樹脂からなる。
【００４６】
プリズム１０１４が樹脂からなる場合は、望ましくは、プリズム１０１４は射出成形により作製される。
【００４７】
｛流路形成体｝
流路形成体１０１８には、流路１０５４が形成される。流路１０５４の途中には反応室１０７６がある。反応室１０７６は、接合面１０７８に露出する。流路形成体１０１８が金膜１０１２に接合される場合には、反応室１０７６の平面位置と抗体固層膜１０１６の平面位置とが一致させられる。抗体固層膜１０１６は、反応室１０７６に露出する。流路１０５４は、流路形成体１０１８の非接合面１０８０に露出し、非接合面１０８０には注入口１０８２が形成される。流路形成体１０１８と金膜１０１２とは、接着、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ圧着等により接合される。ただし、流路形成体１０１８と金膜１０１２とが他の方法により接合されてもよい。
【００４８】
流路形成体１０１８は、表面プラズモン励起蛍光１０４４及び膜厚測定光１０５０に対して透明な材質からなる。流路形成体１０１８は、例えば、樹脂等からなる。
【００４９】
流路形成体１０１８は、試料液又は蛍光標識液の飛散を防止し、抗体固層膜１０１６に接触する試料液又は蛍光標識液の量を一定にすることに寄与する。しかし、流路形成体１０１８が省略され、抗体固層膜１０１６の上に試料液又は蛍光標識液が直接的に滴下されてもよい。
【００５０】
｛供給機構｝
供給機構１００８は、試料液及び蛍光標識液を流路１０５４へ注入する。試料液又は蛍光標識液が流路１０５４へ注入された場合は、それぞれ、試料液又は蛍光標識液で反応室１０７６が満たされ、第１の主面１０５２上の抗体固層膜１０１６に試料液又は蛍光標識液が供給され、試料液又は蛍光標識液が抗体固層膜１０１６に接触する。
【００５１】
｛流路への試料液及び蛍光標識液の注入｝
図３の模式図は、試料液が流路へ注入された状態を示す。図４の模式図は、蛍光標識液が流路へ注入された状態を示す。
【００５２】
図３に示すように、試料液１０５６が流路１０５４へ注入された場合は、試料液１０５６に含まれる抗原１０５８と抗体固層膜１０１６に含まれる抗体１０６４とが生化学反応又は免疫反応により結合し、抗原１０５８が抗体固層膜１０１６に捕捉される。また、抗原１０５８が抗体固層膜１０１６に捕捉された状態において蛍光標識液１０６０が流路１０５４へ注入された場合は、図４に示すように、抗体固層膜１０１６に捕捉された抗原１０５８と蛍光標識液１０６０に含まれる蛍光標識抗体１０６２とが生化学反応又は免疫反応により結合し、抗体固層膜１０１６に捕捉された抗原１０５８が蛍光標識抗体１０６２に蛍光標識される。免疫反応は、抗原抗体反応とも呼ばれる。
【００５３】
｛試料液及び蛍光標識液｝
試料液１０５６は、典型的には、血液等の人間からの採取物であるが、人間以外の生物からの採取物であってもよく、非生物からの採取物であってもよい。希釈、血球分離、試薬の混合等の他の前処理が採取物に対して行われてもよい。
【００５４】
蛍光標識液１０６０は、被計測物の抗原１０５８と結合する蛍光標識抗体１０６２を含む。蛍光標識抗体１０６２は、蛍光を放射する蛍光標識となる化学構造部分を含む。
【００５５】
試料液１０５６及び蛍光標識液１０６０に代えて、それぞれ、気体又は流動性を有する固体からなる試料及び蛍光標識抗体含有物が流路１０５４へ注入されてもよい。
【００５６】
｛抗体固層膜｝
抗体固層膜１０１６は、非流動体からなる。したがって、試料液１０５６又は蛍光標識液１０６０が抗体固層膜１０１６に接触しても、抗体固層膜１０１６は移動しない。
【００５７】
抗体１０６４は、均一に分布する。被計測物に応じて被計測物を捕捉する捕捉体は変更され、被計測物の補足体は抗体固層膜１０１６に限られない。
【００５８】
抗体固層膜１０１６は、例えば、ラバー製のアプリケーターによりパターニングされる。抗体固層膜１０１６の直径は、典型的には２ｍｍであり、抗体固層膜１０１６の層厚は、典型的には１００ｎｍ以下である。
【００５９】
｛光源｝
図１に示すように、光源１０２０は、光を放射する。望ましくは、光源１０２０はレーザーダイオードであり、光源１０２０から放射される光は、平行光線であり、直線偏光であり、単色光である。
【００６０】
光源１０２０がレーザーダイオード以外であってもよい。例えば、光源１０２０が発光ダイオード、水銀灯、レーザーダイオード以外のレーザー等であってもよい。光源１０２０から放射される光が平行光線でない場合は、レンズ、鏡、スリット等により光が平行光線へ変換される。光源１０２０から放射される光が直線偏光でない場合は、偏光子等により光が直線偏光に変換される。光源１０２０から放射される光が単色光でない場合は、回折格子等により光が単色光に変換される。
【００６１】
｛直線偏光板｝
直線偏光板１０３６は、励起光１０４２の光路上にあり、励起光１０４２を直線偏光に変換する。励起光１０４２の偏光方向は、密着面１０４８に対して励起光１０４２がｐ偏光になるように選択される。これにより、エバネッセント波のもれだしが増加し、表面プラズモン励起蛍光１０４４が増加し、計測の感度が向上する。
【００６２】
｛光学系｝
図５の模式図は、励起光の光路を示す。図６の模式図は、膜厚測定光の光路を示す。
【００６３】
図５に示すように、光源１０２０から放射された光が励起光１０４２として利用される場合は、光源１０２０から放射された光が光路切り替えミラー１０３８により反射される。光路切り替えミラー１０３８により反射された光はプリズム１０１４に照射される。プリズム１０１４に照射された光は、励起光１０４２の入射面１０６６へ入射し、密着面１０４８に反射され、励起光１０４２の出射面１０７４から出射する。密着面１０４８への励起光１０４２の入射角θ１は、全反射条件θｃ≦θ１を満たす。したがって、励起光１０４２が密着面１０４８へ入射した場合は、励起光１０４２が密着面１０４８に全反射され、図４に示すように、金膜１０１２にエバネッセント波１０８２がもれだし、エバネッセント波１０８２が増強される。
【００６４】
図６に示すように、光源１０２０から放射された光が膜厚測定光１０５０として利用される場合は、光源１０２０から放射された光が光路切り替えミラー１０３８により反射される。光路切り替えミラー１０３８により反射された光は膜厚測定光導入ミラー１０４０にさらに反射される。膜厚測定光導入ミラー１０４０により反射された光は、プリズム１０１４に照射される。プリズム１０１４に照射された光は、膜厚測定光１０５０の入射面１０６８へ入射し、密着面１０４８から出射し、金膜１０１２の第２の主面１０５３へ入射し、金膜１０１２を透過し、金膜１０１２の第１の主面１０５２から出射する。密着面１０４８への膜厚測定光１０５０の入射角θ２は、全反射条件θｃ≦θ２を満たさず（θ２＜θｃ）、望ましくは０°である。密着面１０４８への膜厚測定光１０５０の入射角θ２が０°である場合は、膜厚測定光１０５０の光路が第２の主面１０５３と垂直をなし、膜厚測定光１０５０が金膜１０１２に垂直に入射し、金膜１０１２とプリズム１０１４との界面における膜厚測定光１０５０の反射の影響が抑制され、計測の精度が向上する。
【００６５】
光源１０２０から放射された光の光路を励起光１０４２の光路と膜厚測定光１０５０の光路との間で切り替えるため、図１に示すように、光路切り替えミラー１０３８の位置及び姿勢が駆動機構１０２４により調整される。駆動機構１０２４は、密着面１０４８への励起光１０４４の入射角θ１を調整するためにも用いられる。駆動機構１０２４は、モータ、圧電アクチュエータ等の駆動力源を備える。駆動機構１０２４は、光路切り替えミラー１０３６を回転させ、光路切り替えミラー１０３６の姿勢を調整する。駆動機構１０２４は、光路切り替えミラー１０３６をリニアステージの上で移動させ、光路切り替えミラー１０３６の位置を調整する。
【００６６】
他の種類の光学系により光源１０２０から放射された光の光路が励起光１０４２の光路と膜厚測定光１０５０の光路との間で切り替えられてもよい。例えば、光路切り替えミラー１０３８及び膜厚測定光導入ミラー１０４０の両方又は片方がプリズム等の他の種類の屈曲光学素子に置き換えられてもよい。光路切り替えミラー１０３８及び膜厚測定光導入ミラー１０４０以外の光学素子が設けられてもよい。光路切り替えミラー１０３８の位置及び姿勢を調整する駆動機構に代えて、又は、光路切り替えミラー１０３８の位置及び姿勢を調整する駆動機構に加えて、光路切り替えミラー１０３８以外の光学素子の位置及び姿勢を調整する駆動機構、光源１０２０の位置及び姿勢を調整する機構が設けられてもよい。
【００６７】
望ましくは、同一の光源１０２０から放射された光の光路が励起光１０４２の光路と膜厚測定光１０５０の光路とに光学系１０２２により切り替えられる。これにより、励起光１０４２及び膜厚測定光１０５０が同一の光源１０２０から放射され、光源１０２０の数が減少し、表面プラズモン励起蛍光計測装置１０００が簡略化される。ただし、光源の数が増加するが、励起光１０４２を放射する光源と膜厚放射光１０５０を放射する光源とが別個であってもよい。励起光１０４２の波長及び膜厚測定光１０５０の波長は、望ましくは同じであるが、異なってもよい。
【００６８】
｛ＣＣＤセンサ｝
ＣＣＤセンサ１０２６は、表面プラズモン励起蛍光１０４４の光路上であって透過光１０４６の光路上にあり、表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量及び透過光１０４６の光量の両方を測定する。これにより、表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量及び透過光１０４６の光量が同一のＣＣＤセンサ１０２６により測定され、ＣＣＤセンサの数が減少し、表面プラズモン励起蛍光計測装置１０００が簡略化される。このためには、表面プラズモン励起蛍光１０４４の光路及び透過光１０４６の光路の少なくとも一部が一致する必要がある。ただし、ＣＣＤセンサの数が増加するが、表面プラズモン励起蛍光１０４４の光路及び透過光１０４６の光路が完全に分離されてもよく、表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量を測定するＣＣＤセンサと透過光１０４６の光量を測定するＣＣＤセンサとが別個であってもよい。ＣＣＤセンサ１０２６が光電子増倍管（ＰＭＴ）等の他の形式の光量センサに置き換えられてもよい。
【００６９】
反射光１０８４の光量が極小になる入射角θ１ではなく散乱光の光量が極大になる入射角θ１から共鳴角θｒが決定される場合は、望ましくは、ＣＣＤセンサ１０２６は、散乱光の光路上にあり、散乱光の光量も測定する。ただし、ＣＣＤセンサ１０２６とは別個のＣＣＤセンサが散乱光の光量を測定してもよい。
【００７０】
｛ローパスフィルタ、減光フィルタ及びフィルタ入れ替え機構｝
フィルタ入れ替え機構１０３２は、光路に挿入されるフィルタをローパスフィルタ１０２８と減光フィルタ１０３０との間で切り替える。図５に示すように、表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量が測定される場合は、ローパスフィルタ１０２８が表面プラズモン励起蛍光１０４４の光路に挿入される。図６に示すように、透過光１０４６の光量が測定される場合は、減光フィルタ１０３０が透過光１０４６の光路に挿入される。
【００７１】
ローパスフィルタ１０２８は、カットオフ波長より長い波長の光を透過し、カットオフ波長より短い波長の光を減衰させる。カットオフ波長は、励起光１０４２の波長から表面プラズモン励起蛍光１０４４の波長までの範囲内で選択される。例えば、励起光１０４２の波長が約６４０ｎｍであって表面プラズモン励起蛍光１０４４の波長が６７０ｎｍである場合は、６５０ｎｍがカットオフ波長として選択される。ローパスフィルタ１０２８が表面プラズモン励起蛍光１０４４の光路に挿入された場合は、励起光１０４２はローパスフィルタ１０２８により減衰し、励起光１０４２のごく一部がＣＣＤセンサ１０２６に到達するが、表面プラズモン励起蛍光１０４４はローパスフィルタ１０２８を透過し、表面プラズモン励起蛍光１０４４の大部分がＣＣＤセンサ１０２６に到達する。これにより、相対的に光量が小さい表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量が測定される場合に相対的に光量が大きい散乱光の影響が抑制され、計測の精度が向上する。
【００７２】
減光フィルタ１０３０は、光を減衰させる。減光フィルタ１０３０が透過光１０４６の光路に挿入された場合は、透過光１０４６は減光フィルタ１０３０により減衰し、透過光１０４６の一部がＣＣＤセンサ１０２６に到達する。これにより、相対的に光量が大きい透過光１０４６の光量と相対的に光量が小さい表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量とが同一のＣＣＤセンサ１０２６により容易に測定される。
【００７３】
表面プラズモン励起蛍光１０４４の光路及び透過光１０４６の光路が分離される場合は、フィルタ入れ替え機構１０３２が省略される場合もある。表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量を測定する光量センサと透過光１０４６の光量を測定する光量センサとが別個であり、透過光１０４６の光量を測定する光量センサの感度が低い場合は、減光フィルタ１０３０が省略されてもよい。
【００７４】
｛フォトダイオード｝
図１に示すように、フォトダイオード１０３４は、励起光１０４２の出射面１０７４から出射した励起光１０４２、すなわち、反射光１０８４の光路上にあり、反射光１０８４の光量を測定する。フォトダイオード１０３４がフォトトランジスタ、フォトレジスタ等の他の形式の光量センサにより測定されてもよい。散乱光の光量が極大になる入射角θ１から共鳴角θｒが決定される場合は、フォトダイオード１０３４が省略されてもよい。
【００７５】
｛コントローラ｝
図７のブロック図は、コントローラを示す。
【００７６】
図７に示すように、コントローラ１０１０は、運転制御部１１００及び補正部１１０２を備える。補正部１１０２は、透過率導出部１１０４、電場増強度特定部１１０６、規格化部１１０８及び記憶部１１１０を備える。電場増強度特定部１１０６は、膜厚導出部１１１２及び電場増強度導出部１１１４を備える。
【００７７】
運転制御部１１００は、表面プラズモン励起蛍光計測装置１０００のハードウエアの構成物を制御し、表面プラズモン励起蛍光計測装置１０００の運転を担う。補正部１１０２は、演算を行い、透過光１０４６の光量の測定値による表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量の測定値の補正を担う。
【００７８】
透過率導出部１１０４は、ＣＣＤセンサ１０２６から透過光１０４６の光量の測定値を取得し、透過光１０４６の光量の測定値から金膜１０１２の透過率の指標を導出する。透過率の指標は、透過率そのものであってもよいし、透過率と一対一に対応する値であってもよい。例えば、金膜１０１２の第２の主面１０５３へ入射する膜厚測定光１０５０の光量が一定であって金膜１０１２の第１の主面１０５２からＣＣＤセンサ１０２６までの区間における膜厚測定光１０５０の減衰が一定であるとみなせる場合は、透過光１０４６の光量の測定値そのものが透過率の指標となりうる。透過率の指標は、減光フィルタ１０３０の減衰率及び膜厚測定光１０５０の光量で透過光１０４６の光量の測定値を除することにより導出される。
【００７９】
電場増強度特定部１１０６は、金膜１０１２の透過率の指標から電場増強度を特定する。
【００８０】
膜厚導出部１１１２は、金膜１０１２の透過率の指標から金膜１０１２の膜厚を導出する。金膜１０１２の膜厚が導出される場合には、記憶部１１１０に記憶された金膜１０１２の透過率の指標と金膜１０１２の膜厚との関係１１１６が参照され、透過率導出部１１０４により特定された金膜１０１２の透過率の指標に対応する金膜１０１２の膜厚が特定される。
【００８１】
図８のグラフは、膜厚測定光１０５０の波長が６３５ｎｍであり、金膜１０１２の光学定数がn=0.22273及びk=3.4533であるとした場合に理論的に得られる金膜１０１２の透過率と金膜１０１２の膜厚と関係を示す。
【００８２】
電場増強度導出部１１１４は、金膜１０１２の膜厚から電場増強度を導出する。電場増強度が導出される場合は、記憶部１１１０に記憶された金膜１０１２の膜厚と電場増強度との関係１１１８が参照され、膜厚導出部１１１２により導出された金膜１０１２の膜厚に対応する電場増強度が特定される。
【００８３】
電場増強度は、入射角θ１にも依存し、電場増強度が最大になる入射角θ１は金膜１０１２の膜厚によって変化する。このため、望ましくは、金膜１０１２の膜厚ごとに電場増強度が最大になる入射角θ１が特定され、電場増強度が最大となる入射角θ１で密着面１０４８に励起光１０４２が入射した場合の金膜１０１２の膜厚と電場増強度との関係が用いられる。
【００８４】
図９のグラフは、金膜１０１２の膜厚と電場増強度との関係の一例を示す。図９は、プリズム１０１４の２種類の樹脂材料である「Ｅ４８Ｒ」及び「ＢＫ７」について理論的に得られる金膜１０１２の膜厚と電場増強度との関係を示す。
【００８５】
関係１１１６及び１１１８は、典型的には、数値テーブルである。ただし、関係１１１６及び１１１８が演算式として与えられてもよい関係１１１６及び係１１１８は、理論的に求められるが、実測されてもよい。
【００８６】
関係１１１６及び１１１８が結合され、金膜１０１２の透過率の指標と電場増強度との関係が記憶部１１１０に記憶されてもよい。この場合は、電場増強度特定部１１０６において、金膜１０１２の膜厚を経由せずに金膜１０１２の透過率の指標から電場増強度が直接的に導出される。
【００８７】
規格化部１１０８は、ＣＣＤセンサ１０２６から表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量の測定値を取得し、電場増強度特定部１１０６により特定された電場増強度により表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量の測定値を規格化する。規格化は、表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量の測定値を電場増強度で除することにより行われる。
【００８８】
コントローラ１０１０は、ソフトウエアを実行する組み込みコンピュータである。１個の組み込みコンピュータが図７に示すブロックの機能を担ってもよいし、２個以上の組み込みコンピュータが分担して図７に示すブロックの機能を担ってもよい。ソフトウエアを伴わないハードウエアが図７に示すブロックの全部又は一部の機能を担ってもよい。ハードウエアは、例えば、オペアンプ、コンパレータ等の電子回路である。図７に示すブロックによる処理の全部又は一部が、人間の手作業により実行されてもよく、表面プラズモン励起蛍光計測装置１０００の外部において実行されてもよい。
【００８９】
（表面プラズモン励起蛍光計測装置の動作）
図１０のフローチャートは、表面プラズモン励起蛍光計測装置の動作を示す。
【００９０】
図１０に示すように、センサチップ１００２が準備され、表面プラズモン励起蛍光計測装置１０００にセンサチップ１００２が取り付けられる（ステップＳ１０１）。
【００９１】
センサチップ１００２が取り付けられた後に、透過光１０４６の光量が測定される（ステップＳ１０２）。透過光１０４６の光量が測定される場合は、駆動機構１０２４及びＣＣＤセンサ１０２６が運転制御部１１００により制御される。光路切り替えミラー１０３８の位置及び姿勢が駆動機構１０２４により調整され、光源１０２０から放射された光の光路が膜厚測定光１０５０の光路に設定される。同時に、透過光１０４６の光量がＣＣＤセンサ１０２６により測定される。透過光１０４６の光量の測定値は、コントローラ１０１０へ転送される。
【００９２】
透過光１０４６の光量が測定された後に、入射角θが測定角θｍに設定される（ステップＳ１０３）。入射角θが測定角θｍに設定される場合は、駆動機構１０２４及びフォトダイオード１０３４が運転制御部１１００により制御される。光路切り替えミラー１０３８の位置及び姿勢が駆動機構１０２４により調整され、光源１０２０から放射された光の光路が励起光１０４２の光路に設定される。また、入射角θ１が予想される共鳴角θｒの近傍において走査される。入射角θ１の走査と並行して、反射光１０８４の光量がフォトダイオード１０３４により測定される。反射光１０８４の光量の測定値は、コントローラ１０１０へ転送される。入射角θ１と反射光１０８４の光量との関係を示す表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）曲線から反射光１０８４の光量が極小になる入射角θ１である共鳴角θｒが特定され、共鳴角θｒから測定角θｍが決定される。共鳴角θｒと電場増強度が極大になる入射角θ１とはわずかに異なるので、望ましくは、微小角が共鳴角θｒに可算又は減算され測定角θｍが決定される。図１１のグラフは、ＳＰＲ曲線及び入射角と電場増強度との関係を示す。
【００９３】
入射角θ１が測定角θｍに設定された後に、試料液１０５６及び蛍光標識液１０６０が流路１０５４へ順次に注入される（ステップＳ１０４）。試料液１０５６及び蛍光標識液１０６０が流路１０５４に順次に注入される場合は、供給機構１００８が運転制御部１１００により制御される。これにより、試料液１０５６及び蛍光標識液１０６０が抗体固層膜１０１６に順次に供給され、蛍光標識された抗原１０５８が抗体固層膜１０１６に捕捉された状態になる。膜厚測定光１０５０の光路が流路１０５４を通過する場合は、望ましくは、透過光１０４６の光量が測定された後に試料液１０５６及び蛍光標識液１０６０が流路１０５４に注入される。しかし、膜厚測定光１０５０の光路が流路１０５４を通過しない場合は、透過光１０４６の光量が測定された前及び後のいずれに試料液１０５６及び蛍光標識液１０６０が流路１０５４に注入されてもよく、透過光１０４６の光量が測定されるのと同時に試料液１０５６及び蛍光標識液１０６０が流路１０５４に注入されてもよい。
【００９４】
試料液１０５６及び蛍光標識液１０６０が流路１０５４に注入された後に、表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量が測定される（ステップＳ１０５）。表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量が測定される場合は、ＣＣＤセンサ１０２６が運転制御部１１００により制御される。表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量はＣＣＤセンサ１０２６により測定される。表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量の測定値は、コントローラ１０１０へ転送される。
【００９５】
表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量を測定する光量センサと透過光１０４６の光量を測定する光量センサとが別個であり、励起光１０４２を放射する光源１０２０と膜厚測定光１０５０を放射する光源１０２０とが別個であり、膜厚測定光１０５０が流路１０５４を通過しない場合は、表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量の測定と同時に透過光１０４６の光量が測定されてもよい。
【００９６】
表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量が測定された後に、補正部１１０２において表面プラズモン励起蛍光１０４４の光量の測定値が透過光１０４６の光量の測定値により補正される（ステップＳ１０６）。
【００９７】
この発明は詳細に説明されたが、上記の説明は、すべての局面において例示であり、この発明は上記の説明に限定されない。例示されない無数の変形例が、この発明の範囲から外れることなく想定されうる。
【符号の説明】
【００９８】
１０００ 表面プラズモン励起蛍光計測装置
１００４ 照射機構
１００６ 測定機構
１０１２ 金膜
１０２０ 光源
１０２２ 光学系
１０２４ 駆動機構
１０４２ 励起光
１０４４ 表面プラズモン励起蛍光
１０４６ 透過光
１０５０ 膜厚測定光
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面プラズモン励起蛍光計測装置であって、
第１の主面及び第２の主面を有し、前記第１の主面上に試料が供給される導電体膜と、
前記第２の主面と密着する密着面を有する誘電体媒体と、
前記誘電体媒体に光を照射し、前記誘電体媒体の内部において臨界角以上の入射角で前記密着面に前記光が入射する第１の光路と前記誘電体媒体の内部において前記臨界角より小さい入射角で前記密着面に前記光が入射する第２の光路との間で前記光の光路を切り替える照射機構と、
前記第１の光路を経由する前記光が前記誘電体媒体に照射されている間に前記試料に含まれる被計測物から放射される表面プラズモン励起蛍光及び前記第２の光路を経由する前記光が前記誘電体媒体に照射されている間に前記導電体膜を透過する透過光の光量を測定する測定機構と、
前記測定機構により測定された表面プラズモン励起蛍光の光量の測定値を前記測定機構により測定された透過光の光量の測定値により補正する補正部と、
を備える表面プラズモン励起蛍光計測装置。
【請求項２】
請求項１の表面プラズモン励起蛍光計測装置において、
前記照射機構は、
前記光を放射する光源と、
前記光源から放射された前記光を前記誘電体媒体へ導く光学系と、
前記光学系を駆動し、前記光の光路を前記第１の光路と前記第２の光路との間で切り替える駆動機構と、
を備える表面プラズモン励起蛍光計測装置。
【請求項３】
請求項１又は請求項２の表面プラズモン励起蛍光計測装置において、
前記第２の光路は前記第２の主面と垂直をなす
表面プラズモン励起蛍光計測装置。
【請求項４】
請求項１から請求項３までのいずれかの表面プラズモン励起蛍光計測装置において、
前記測定機構は、
前記表面プラズモン励起蛍光の光路上であって前記透過光の光路上にある光量センサ
を備える表面プラズモン励起蛍光測定装置。
【請求項５】
請求項１から請求項４までのいずれかの表面プラズモン励起蛍光計測装置において、
前記補正部は、
前記測定機構から前記透過光の光量の測定値を取得し、前記透過光の光量の測定値から前記導電体膜の透過率の指標を導出する透過率導出部と、
前記導電体膜の透過率の指標から電場増強度を特定する電場増強度特定部と、
前記測定機構から前記表面プラズモン励起蛍光の光量の測定値を取得し、前記電場増強度により前記表面プラズモン励起蛍光の光量の測定値を規格化する規格化部と、
を備える表面プラズモン励起蛍光計測装置。
【請求項６】
請求項５の表面プラズモン励起蛍光計測装置において、
前記電場増強度特定部は、
前記導電体膜の透過率の指標から前記導電体膜の膜厚を導出する膜厚導出部と、
前記導電体膜の膜厚から前記電場増強度を導出する電場増強度導出部と、
を備える表面プラズモン励起蛍光計測装置。
【請求項７】
表面プラズモン励起蛍光計測方法であって、
(a) 第１の主面及び第２の主面を有する導電体膜並びに前記第２の主面と密着する密着面を有する誘電体媒体を準備する工程と、
(b) 前記工程(a)の後に前記誘電体媒体の内部において臨界角より小さい入射角で前記密着面に光を入射させながら前記第導電体膜を透過する透過光の光量を測定する工程と、
(c) 前記工程(b)の前若しくは後又は前記工程(b)と同時に前記第１の主面に試料を供給する工程と、
(d) 前記工程(c)の後に前記誘電体媒体の内部において前記臨界角以上の入射角で前記密着面に光を入射させながら前記試料に含まれる被計測物から放射される表面プラズモン励起蛍光の光量を測定する工程と、
(e) 前記工程(d)において測定された前記表面プラズモン励起蛍光の光量の測定値を前記工程(b)において測定された前記透過光の光量の測定値により補正する工程と、
を備える表面プラズモン励起蛍光計測方法。
【請求項１】
表面プラズモン励起蛍光計測装置であって、
第１の主面及び第２の主面を有し、前記第１の主面上に試料が供給される導電体膜と、
前記第２の主面と密着する密着面を有する誘電体媒体と、
前記誘電体媒体に光を照射し、前記誘電体媒体の内部において臨界角以上の入射角で前記密着面に前記光が入射する第１の光路と前記誘電体媒体の内部において前記臨界角より小さい入射角で前記密着面に前記光が入射する第２の光路との間で前記光の光路を切り替える照射機構と、
前記第１の光路を経由する前記光が前記誘電体媒体に照射されている間に前記試料に含まれる被計測物から放射される表面プラズモン励起蛍光及び前記第２の光路を経由する前記光が前記誘電体媒体に照射されている間に前記導電体膜を透過する透過光の光量を測定する測定機構と、
前記測定機構により測定された表面プラズモン励起蛍光の光量の測定値を前記測定機構により測定された透過光の光量の測定値により補正する補正部と、
を備える表面プラズモン励起蛍光計測装置。
【請求項２】
請求項１の表面プラズモン励起蛍光計測装置において、
前記照射機構は、
前記光を放射する光源と、
前記光源から放射された前記光を前記誘電体媒体へ導く光学系と、
前記光学系を駆動し、前記光の光路を前記第１の光路と前記第２の光路との間で切り替える駆動機構と、
を備える表面プラズモン励起蛍光計測装置。
【請求項３】
請求項１又は請求項２の表面プラズモン励起蛍光計測装置において、
前記第２の光路は前記第２の主面と垂直をなす
表面プラズモン励起蛍光計測装置。
【請求項４】
請求項１から請求項３までのいずれかの表面プラズモン励起蛍光計測装置において、
前記測定機構は、
前記表面プラズモン励起蛍光の光路上であって前記透過光の光路上にある光量センサ
を備える表面プラズモン励起蛍光測定装置。
【請求項５】
請求項１から請求項４までのいずれかの表面プラズモン励起蛍光計測装置において、
前記補正部は、
前記測定機構から前記透過光の光量の測定値を取得し、前記透過光の光量の測定値から前記導電体膜の透過率の指標を導出する透過率導出部と、
前記導電体膜の透過率の指標から電場増強度を特定する電場増強度特定部と、
前記測定機構から前記表面プラズモン励起蛍光の光量の測定値を取得し、前記電場増強度により前記表面プラズモン励起蛍光の光量の測定値を規格化する規格化部と、
を備える表面プラズモン励起蛍光計測装置。
【請求項６】
請求項５の表面プラズモン励起蛍光計測装置において、
前記電場増強度特定部は、
前記導電体膜の透過率の指標から前記導電体膜の膜厚を導出する膜厚導出部と、
前記導電体膜の膜厚から前記電場増強度を導出する電場増強度導出部と、
を備える表面プラズモン励起蛍光計測装置。
【請求項７】
表面プラズモン励起蛍光計測方法であって、
(a) 第１の主面及び第２の主面を有する導電体膜並びに前記第２の主面と密着する密着面を有する誘電体媒体を準備する工程と、
(b) 前記工程(a)の後に前記誘電体媒体の内部において臨界角より小さい入射角で前記密着面に光を入射させながら前記第導電体膜を透過する透過光の光量を測定する工程と、
(c) 前記工程(b)の前若しくは後又は前記工程(b)と同時に前記第１の主面に試料を供給する工程と、
(d) 前記工程(c)の後に前記誘電体媒体の内部において前記臨界角以上の入射角で前記密着面に光を入射させながら前記試料に含まれる被計測物から放射される表面プラズモン励起蛍光の光量を測定する工程と、
(e) 前記工程(d)において測定された前記表面プラズモン励起蛍光の光量の測定値を前記工程(b)において測定された前記透過光の光量の測定値により補正する工程と、
を備える表面プラズモン励起蛍光計測方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１２−２２０２９４（Ｐ２０１２−２２０２９４Ａ）
【公開日】平成２４年１１月１２日（２０１２．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−８５０８３（Ｐ２０１１−８５０８３）
【出願日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【出願人】（０００００１２７０）コニカミノルタホールディングス株式会社 (4,463)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月１２日（２０１２．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【出願人】（０００００１２７０）コニカミノルタホールディングス株式会社 (4,463)
【Ｆターム（参考）】
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