説明

表面処理材及び表面処理方法

【課題】 簡単な操作でタンパク質の非特異的な結合や細胞の付着を効果的に防止することができ、バイオマテリアルやバイオチップとして利用し得る表面処理材を提供し、さらには表面処理方法を提供する。
【解決手段】 本発明の表面処理材では、末端に親水性の官能基を有する樹状高分子が基材表面に結合されている。樹状高分子は第3世代以上の樹状高分子である。あるいは、樹状高分子の直径が3nm以上である。本発明の表面処理材は、タンパク質付着防止機能や 細胞付着防止機能を有し、バイオチップ用として好適である。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、樹状高分子(いわゆるデンドリマー)を用いた表面処理材及び表面処理方法に関するものであり、簡単な操作で細胞やタンパク質の付着防止機能を付与し得る新規な表面処理材及び表面処理方法に関する。
【背景技術】
【0002】
金属やプラスチック、ガラス等の表面は、通常、非特異的タンパク質結合を起こし易く、細胞が付着し易いという性質を有している。このような性質は、望ましくない生体反応を引き起こし、バイオマテリアルやバイオチップの性能低下の原因となる。
【0003】
前述のような非特異的なタンパク質の結合や細胞の付着を防ぐ手法としては、ポリエチレングリコール等の親水性ポリマー層を形成する方法(非特許文献1を参照)や、デキストリン等のヒドロゲルで修飾する方法(非特許文献2を参照)等が一般的である。これら方法により表面処理を行えば、基材表面に生体忌避活性を付与することが可能である。
【0004】
しかしながら、これら方法では100nm以上の比較的厚いポリマー層の形成が必要になる等の問題がある。例えばバイオセンシング等においては、ポリマー層の厚さが厚いと電極からの距離が遠くなるため、光学的手法でも電気化学的な手法でも、感度の低下が見られる。また、気体や物質を透過させる材料に生体忌避活性を付与することが難しいという問題もある。いずれの問題も、親水性ポリマーやヒドロゲルを例えば数十nm以下の超薄膜にした状態では、十分にタンパク質の付着を防ぐことができないために起こる。
【0005】
一方、デンドリマーと称される規則正しく分岐した構造を有する樹状高分子に関する研究が各方面で進められており、例えばデンドリマーを用いた細胞固定化方法等が提案されている(例えば、特許文献1等を参照)。特許文献1には、末端に細胞のトランスポートチャンネルを標的とした物質を有するデンドリマー高分子化合物で培養面を修飾し、細胞を播種することを特徴とする細胞固定化方法が開示されている。
【0006】
また、特許文献2には、デンドリマーを結合させた基材が開示されている。基材に結合されたデンドリマー(樹枝状材料)は、例えばイオン交換サイトまたは親和性補足サイトとして機能する反応性末端基を有し、したがって混合物からの1種以上の化合物の分離または精製に用いることが可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】特開2005−192406号公報
【特許文献2】特表2008−514418号公報
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Annu. Rev. Master. Sci. 1996, 26, 365-394
【非特許文献2】Langmuir, 2001, 17, 4386-4391
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
しかしながら、従来技術として挙げた特許文献1や特許文献2に記載される発明は、いずれも生体忌避活性を付与することを目的とするものではなく、例えば特許文献1記載の発明では、逆に強固な細胞固定を目的としており、そのための工夫に重きが置かれている。特許文献2記載の発明は、特定の官能基を利用して基材にデンドリマーを共有結合させる点に特徴を有し、非特異的なタンパク質の結合や細胞の付着を防ぐことに関しては、何ら言及していない。
【0010】
本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、簡単な操作でタンパク質の非特異的な結合や細胞の付着を効果的に防止することができ、バイオマテリアルやバイオチップとして利用し得る新規な表面処理材を提供することを目的とし、さらには表面処理方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者らは、デンドリマーに関する研究を進める中で、ある程度のサイズを有するデンドリマーが生体忌避活性の付与に極めて有効であり、またデンドリマーを基材表面に付着させるだけで、簡単に生体忌避活性を付与することができることを見出すに至った。このような知見は、これまで全く知られておらず、予想外の結果である。
【0012】
本発明は、前述の知見に基づいて完成されたものである。すなわち、本発明の表面処理材は、末端に親水性の官能基を有する樹状高分子が基材表面に結合されており、前記樹状高分子が第3世代以上の樹状高分子であることを特徴とする。あるいは、末端に親水性の官能基を有する樹状高分子が基材表面に結合されており、前記樹状高分子の直径が3nm以上であることを特徴とする。
【0013】
また、本発明の表面処理方法は、末端に親水性の官能基を有する第3世代以上の樹状高分子を基材表面に結合させることを特徴とする。あるいは、末端に親水性の官能基を有する直径3nm以上の樹状高分子を基材表面に結合させることを特徴とする。
【0014】
樹状高分子(デンドリマー)を用いて表面処理を行うことにより非特異的なタンパク質の結合や細胞の付着が防止される理由について、その詳細は不明であるが、ある程度の大きさのデンドリマーが付着することにより表面改質がなされ、生体忌避活性が付与されるものと推測している。デンドリマーは、そのサイズが小さく、これを付着してもその厚みは僅かであり、ポリマー層を形成する場合に比べて、その影響は極めて小さい。
【発明の効果】
【0015】
本発明によれば、簡単な操作でタンパク質の非特異的な結合や細胞の付着等を効果的に防止し得る表面処理材、表面処理方法を提供することが可能である。また、本発明の表面処理材では、表面処理層が超薄膜であっても優れた生体忌避活性を有することから、バイオマテリアルやバイオチップ等として利用可能である。例えば、本発明では、付着される樹状高分子(デンドリマー)のサイズが小さく、ポリマー層を形成する場合に比べて表面処理層の厚さを極めて小さくすることができるので、バイオセンシングにおいて電極からの距離を極めて小さくすることができ、感度の低下を最小限に抑えることが可能である。さらに、気体や物質を透過させる材料に対しても、容易に生体忌避活性を付与することができるという利点もある。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】本発明を適用した表面処理材の一例を示す模式図である。
【図2】第1世代から第3世代のデンドリマーを示す模式図であり、(a)は第1世代のデンドリマー、(b)は第2世代のデンドリマー、(c)は第3世代のデンドリマーをそれぞれ示す。
【図3】デンドリマーで修飾した金基板の反射赤外スペクトルである。
【図4】デンドリマーで修飾した金基板のXPS(X線光電子分光)スペクトルである。
【図5】デンドリマーの世代数とタンパク質の吸着量の関係を示す図であり、(a)リゾチームに関する測定結果、(b)はウシ血清アルブミンの測定結果、(c)はフィブリノーゲンの測定結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0017】
以下、本発明を適用した表面処理材及び表面処理方法について、図面を参照しながら詳細に説明する。
【0018】
本発明の表面処理材1は、図1に模式的に示すように、処理対象となる任意の部材(例えば基板2)の表面に、末端に親水性の官能基を有する樹状高分子(デンドリマー)3を付着させたものであり、単純な構成でありながら、タンパク質の非特異的な結合や細胞の付着を効果的に防止する機能を有する。デンドリマー3を基板2の表面に付着させることで、元の表面状態に比べて官能基が密な状態で存在することになるので、厚さの厚いポリマー層と同じように高い生体忌避活性を発揮するものと考えられる。
【0019】
ここで、表面に付着させるデンドリマーを構成するデンドロンの構造は、如何なるものであってもよく、特に限定されるものではない。ただし、前記デンドリマーは、末端に親水性の官能基を有することが必要である。官能基としては、親水性の官能基であれば任意であるが、例えばアミノ基、カルボキシル基、水酸基、リン酸基、糖鎖、アミノ酸基等を挙げることができる。前記デンドリマーは、末端にこれらの官能基の少なくとも1種が結合されていればよい。したがって、例えばポリアミドアミン、ポリフェニルアミン等のデンドリマーを前記デンドリマーとして例示することができる。
【0020】
なお、例えば付着阻害の対象となるタンパク質は,その種類によって,表面の電荷が多種多様である。このため対象となるタンパク質の表面の電荷に合わせて前記官能基を選択することによって、表面処理材の表面の電荷が選択され、任意のタンパク質の表面電荷に応じて最適化した付着阻害機能を有するデバイスを作製することも可能である。
【0021】
前述のデンドリマーは、化学構造、分子量だけでなく、分子形状や分子サイズが制御された規則的な精密高分子であり、例えば世代数を制御することで、直径が数ナノメートルから数十ナノメートルの精密なナノ構造を任意に構築することができる。
【0022】
本発明者らが研究を重ねたところ、良好な生体忌避活性を付与するためには、表面に付着させるデンドリマーのサイズを適正に選定することが重要であり、使用するデンドリマーは、世代数で言えば第3世代以上、直径で言えば3nm以上であることが好ましい。
【0023】
図2は、デンドリマーの世代数と末端数の関係を示すものであり、(a)に示す第1世代のデンドリマーでは末端数8、(b)に示す第2世代のデンドリマーでは末端数16、(c)に示す第3世代のデンドリマーでは末端数32になる。本発明の表面処理材においては、デンドリマーの世代数を増やすことによりタンパク質の非特異的な結合が減少するという現象が見られ、特に第3世代以上にまで増やすと、急激にタンパク質の結合を減少させることができる。世代数の上限は特に制約されないが、あまり世代数が大きくなるとサイズが大きくなりすぎ、表面のギャップが大きくなるという不都合が生ずるおそれがある(例えばバイオセンサーにおいては、被検物とセンサー間の距離が大きくなり、ポリマー層で付着阻害を行う場合と同様、感度が大きく低下するおそれがある)ので、第10世代以下とすることが好ましい。
【0024】
同様に、デンドリマーの直径も生体忌避活性の付与効果に影響を与え、良好な生体忌避活性を付与するためには、表面に付着させるデンドリマーの直径を3nm以上とすることが好ましい。表面に付着させるデンドリマーの直径を3nm以上とすることで、タンパク質の非特異的な結合や細胞の付着を大幅に減らすことが可能である。なお、前記デンドリマーの直径に関しても、特に上限は制約されないが、表面のギャップの大きさや入手の容易さ等を考慮すると、直径10nm以下とすることが好ましい。
【0025】
前述のデンドリマーは、基板の表面に結合して超薄膜を形成するが、デンドリマーの基板表面への結合方式については、水溶液での洗浄に耐えられる結合であれば如何なる結合であってもよく、例えば非特異結合であってもよいし、共有結合であってもよい。いずれにしても基板2の表面に何らかの形で結合していればよい。
【0026】
デンドリマーを用いた表面処理方法では、例えばデンドリマー水溶液を加温して放置するだけで厚さ数nm〜数十nm程度の薄膜を形成して、物理吸着させることができる。すなわち、極めて簡単な操作で表面処理を行うことが可能である。
【0027】
また、デンドリマーの末端の官能基は、基板1の材質等に応じて自由に変えることもでき、ガラス、半導体、金属等からなる基板1では、シランカップリング剤で処理した表面に対して、化学結合させることも可能である。例えば、ガラスアミノプロピルシランとグルタルアルデヒド、ポリアリルアミンデンドリマーやポリアミドアミンデンドリマーを縮合反応させることで、デンドリマーを固定化することができる。
【0028】
ポリスチレンやポリメタクリレート等のプラスチック基材の表面では、プラス間放電処理、電子線処理等を施すことによって表面に水酸基を導入することができ、同様にシランカップリング剤等で化学結合させることが可能である。
【0029】
勿論、デンドリマーを化学結合させるための手段は、これらに限定されるものではなく、あらゆる化学結合の形成を適用することが可能である。また、いずれの結合手段を採用した場合にも、デンドリマーでの処理によって、タンパク質の非特異的な吸着等を防ぐことができる。
【0030】
以上のように、本発明の表面処理材、表面処理方法では、厚さ数nm〜数十nm程度のデンドリマーの層を表面に結合させるだけで、タンパク質や細胞が付着しない表面を形成することが可能である。従来、例えばタンパク質の非特異吸着については、疎水性、親水性の観点と、タンパク質の電荷の影響が大きいとされている。これに対して、本発明者らが、デンドリマーの末端の官能基による電荷と、被検物のタンパク質の電荷とによって、吸着し易いと考えられる組み合わせと、吸着し難いと考えられる組み合わせについて実験を行った結果、官能基の電荷とタンパク質の電荷の組み合わせによらず、デンドリマーの構造のみで吸着が阻害されるとの結果が得られた。これは、前記従来の考えからすれば、想定外の結果と言うことができる。
【0031】
また、例えば電気化学反応や表面プラズモン共鳴等においては、基材から距離が離れると、感度が指数関数に沿って大幅に低下することが知られている。本発明の表面処理材、表面処理方法では、前記の通り表面に形成されるデンドリマーの層を超薄膜とすることができるので、バイオセンシングにおける感度の点でも有利であり、ポリエチレングリコールやデキストリンを生体物質付着の抑制材料として用いた場合に比べて、感度を大幅に向上することが可能である。勿論、非特異吸着が防がれることから、何らかの表面処理を施さない表面よりもバイオセンシング感度は向上する。
【0032】
さらに、本発明の表面処理材、表面処理方法では、表面処理材料としてデンドリマーを用いているので、ナノサイズの生体適合分子であること、世代数の増加により分子サイズの変更が可能であること、末端リガンドの密度の制御が可能であること、末端リガンドの種類を変えることで多様な性質を表面に付与することができること、等の利点を有する。
【0033】
このように様々な利点を有する本発明の表面処理材、表面処理方法は、バイオマテリアルやバイオチップ等、様々な分野に応用することが可能である。例えば、DNAチップ等、電気化学測定法を用いるセンサでは、被検物と電極間の距離が短いほど高感度となる。また、特異的な結合認識を示す表面が必要であり、非特異的吸着はノイズの原因となる。本発明の表面処理材は、超薄膜で非特異的吸着を防止することができ、このような要求に対して、極めて有用性が高い。
【0034】
また、人工血管や尿路カテーテル、ステント等においては、タンパク質の付着を阻害することで、血栓の予防や閉塞による交換頻度を減らすことが可能であるが、このような医療分野においても、本発明の表面処理材、表面処理方法は有用である。さらに、コンタクトレンズでは、タンパク質の吸着がレンズの汚れの原因となるが、本発明の表面処理材、表面処理方法を適用することで、汚れ難いコンタクトを実現することができる。
【実施例】
【0035】
以下、本発明の具体的な実施例について、実験結果に基づいて詳細に説明する。
【0036】
デンドリマーで表面修飾した金基板の作製
ポリアミドアミンデンドリマー(PAMAM−NHデンドリマー)の第1世代(G1)〜第4世代(G49)を用意し、超純水(MilliQ水)に溶解して0.1mM水溶液を調製した。なお、ポリアミドアミンデンドリマーとしては、市販のもの(シグマアルドリッチ社製)を使用した。
【0037】
一方、ガラス基板上に金を蒸着した金基板(アルテック社製、またはGEヘルスケア社製)を用意し、これを超純水及びアセトンで超音波洗浄した後、UVオゾン洗浄装置(バイオフォースナノサイエンス社製)を用いてUVオゾン洗浄を行った。この清浄な金基板を先に調製したポリアミドアミンデンドリマー0.1mM水溶液に12時間浸漬した。その後、金基板を前記水溶液から取り出し、超純水とエタノールで洗浄し、窒素雰囲気中で乾燥させた。
【0038】
デンドリマーによる修飾の確認
作製した金基板のデンドリマーによる修飾を確認するために、接触角を測定し、さらに反射赤外スペクトル(FTIR−RAS)及びX線光電子分光分析を行った。接触角の測定結果を表1に、反射赤外スペクトルを図3に、X線光電子分光スペクトル(XPS)を図4にそれぞれ示す。
【0039】
【表1】

【0040】
接触角の測定結果(表1)を見ると、デンドリマーで修飾した金基板の接触角は、未修飾の金基板の接触角よりも小さくなっており、デンドリマーで修飾した金基板において、デンドリマーによる表面の親水化を示している。反射赤外スペクトルではアミドI(1650cm−1付近)とアミドII(1540cm−1付近)のピークより、デンドリマーの薄膜の形成を確認した。また、X線光電子分光解析においても、アミド基の存在が示唆されたことから、デンドリマーの薄膜の形成が確認された。
【0041】
タンパク質の非特的結合の阻害効果
デンドリマーで修飾した金基板のタンパク質との結合を測定した。測定には、GEヘルスケア社製、商品名Biacore3000を用いた。また、測定は、HBS−Nバッファー(0.01M HEPES,pH7.4,0.15M NaCl)によって行い、25℃で20μl/min、1分間、各種タンパク質[リゾチーム(シグマアルドリッチ社製)、ウシ血清アルブミン、フィブリノーゲン]をインジェクトして行った。結果を表2及び図5に示す。なお、表2における数値の単位は、レスポンスユニット(RU)である。
【0042】
【表2】

【0043】
デンドリマーを結合させた金基板の界面(表面)でのタンパク質の結合量は、表2に示す通り、デンドリマーのサイズ(世代数)が大きくなるほど顕著であり、図5に示す通り、いずれのタンパク質においても、第3世代(G3)以降になると、タンパク質の結合が顕著に減少することがわかった。
【0044】
また、デンドリマーの直径については、ポリアミドアミン型デンドリマーについて、直径の計算値が表3のように計算されており、第三世代から概ね直径が3nm程度になっている。したがって、前記結果は、第三世代よりも高い世代の、すなわち直径3nm以上のデンドリマーの薄膜について、タンパク質の付着の防止が明確に示されたものと言える。
【0045】
【表3】

【符号の説明】
【0046】
1 表面処理材、2 基板、3 デンドリマー


【特許請求の範囲】
【請求項1】
末端に親水性の官能基を有する樹状高分子が基材表面に結合されており、前記樹状高分子が第3世代以上の樹状高分子であることを特徴とする表面処理材。
【請求項2】
末端に親水性の官能基を有する樹状高分子が基材表面に結合されており、前記樹状高分子の直径が3nm以上であることを特徴とする表面処理材。
【請求項3】
前記親水性の官能基が、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、リン酸基、糖鎖、アミノ酸基から選ばれる少なくとも1種であることを特徴とする請求項1または2記載の表面処理材。
【請求項4】
タンパク質付着防止機能を有することを特徴とする請求項1から3のいずれか1項記載の表面処理材。
【請求項5】
細胞付着防止機能を有することを特徴とする請求項1から3のいずれか1項記載の表面処理材。
【請求項6】
バイオチップ用であることを特徴とする請求項1から3のいずれか1項記載の表面処理材。
【請求項7】
末端に親水性の官能基を有する第3世代以上の樹状高分子を基材表面に結合させることを特徴とする表面処理方法。
【請求項8】
末端に親水性の官能基を有する直径3nm以上の樹状高分子を基材表面に結合させることを特徴とする表面処理方法。

【図1】
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【図2】
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【図3】
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【図4】
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【図5】
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【公開番号】特開2011−50469(P2011−50469A)
【公開日】平成23年3月17日(2011.3.17)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2009−200368(P2009−200368)
【出願日】平成21年8月31日(2009.8.31)
【出願人】(304024430)国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 (169)
【Fターム(参考)】