被検物質の電気化学的検出方法
【課題】高い検出感度で被検物質を検出することができる被検物質の電気化学的検出方法を提供する。
【解決手段】作用電極上に捕捉された被検物質Ｓを検出する際に、標識物質９３と被検物質Ｓを捕捉する第１結合物質９２とがポリペプチドからなる支持体９１に少なくとも保持された標識結合物質９０を被検物質に接触させる。そして、作用電極上に存在する標識物質を電気化学的に検出する。
【解決手段】作用電極上に捕捉された被検物質Ｓを検出する際に、標識物質９３と被検物質Ｓを捕捉する第１結合物質９２とがポリペプチドからなる支持体９１に少なくとも保持された標識結合物質９０を被検物質に接触させる。そして、作用電極上に存在する標識物質を電気化学的に検出する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検物質の電気化学的検出方法に関する。より詳しくは、核酸、タンパク質等の被検物質の検出や定量等や、これらを利用する疾病の臨床検査、診断等に有用な、被検物質の電気化学的検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
疾病の臨床検査や診断は、生体試料中に含まれる前記疾病に関連する遺伝子やタンパク質等を、遺伝子検出法や免疫学的検出法等の検出法によって検出することにより行なわれている。かかる臨床検査や診断を行なうための方法として、光化学的に活性な標識物質を光励起させることにより生じる光電流を、核酸、タンパク質等の被検物質の検出に利用する光化学的検出方法が提案されている。ここで、臨床検査や診断では、検体に含まれる微量な被検物質を検出する必要があるため、被検物質の検出感度の向上が求められている。
【０００３】
例えば、特許文献１の段落番号［００６９］〜［００７８］には、被検物質であるタンパク質を特異的に認識する捕捉物質である抗体が表面に固定化された電極と、電気化学的に活性な標識物質により結合物質である抗体が標識された標識抗体とを用いる光電流による被検物質の特異的検出法が開示されている。前記特許文献１に記載の方法では、まず、被検物質と電極上の抗体とを接触させ、前記抗体によって被検物質を電極上に捕捉する。その後、電極上に捕捉された被検物質と、標識抗体とを接触させて複合体を形成させる。そして、標識抗体中の標識物質に基づく光電流を測定することにより、被検物質が検出される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０２４４４６号、段落番号［００６９］〜［００７８］
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１に記載のように、支持体を介さないで、標識物質で直接的に結合物質を標識した場合、結合物質に結合させることができる標識物質の数に限度がある。そのため、特許文献１に記載の方法では、１つの被検物質あたりの標識物質の数を限度以上に増やすことができず、高感度化するのは困難である。
【０００６】
本発明は、前述の事情に鑑みてなされたものであり、高い検出感度で被検物質を検出することができる被検物質の電気化学的検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、被検物質を電気化学的に検出する方法において、被検物質の検出に用いられる標識物質を、ポリペプチドからなる支持体を介して前記結合物質に結合させることで、検出感度を著しく向上させることができ、上記の課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、
〔１〕 被検物質を電気化学的に検出する方法であって、
（１） 被検物質を含む試料を、この被検物質を捕捉する捕捉物質が固定された作用電極に接触させ、前記捕捉物質によって被検物質を作用電極上に捕捉する工程、
（２） 前記工程（１）で作用電極上に捕捉された被検物質と、標識物質と前記被検物質を捕捉する結合物質とがポリペプチドからなる支持体に少なくとも保持された標識結合物質とを含む複合体を形成させる工程、及び
（３） 前記工程（２）で得られた作用電極上に存在する標識物質を電気化学的に検出する工程、
を含む被検物質の電気化学的検出方法、
〔２〕 前記工程（２）において、前記標識結合物質を、前記工程（１）で作用電極上捕捉された被検物質に接触させ、前記複合体を形成させる前記〔１〕に記載の方法、
〔３〕 前記工程（２）において、前記被検物質を捕捉する結合物質がポリペプチドからなる支持体に少なくとも保持され、かつ標識物質を結合する結合体を、前記工程（１）で作用電極上に捕捉された被検物質に接触させ、その後、被検物質に結合した前記結合体に、標識物質を結合させて、前記被検物質と、標識物質と前記被検物質を捕捉する結合物質とがポリペプチドからなる支持体に少なくとも保持された標識結合物質とを含む複合体を形成させる前記〔１〕に記載の方法、
〔４〕 前記ポリペプチドがアルブミン又はフェリチンである前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法、
〔５〕 前記標識結合物質中のポリペプチドからなる支持体と標識物質とがリンカーを介して連結されている前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法、並びに
〔６〕 前記標識物質が、光化学的又は電気化学的に活性な物質である前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の被検物質の電気化学的検出方法によれば、高い検出感度で、被検物質を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いる検出装置を示す斜視図である。
【図２】図１に示される検出装置の構成を示すブロック図である。
【図３】本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いる検出チップを示す斜視図である。
【図４】（Ａ）は図３に示される検出チップのＡＡ線での断面図である。（Ｂ）は図３に示される検出チップの上基板を下面側から見た斜視図である。（Ｃ）は図３に示される検出チップの下基板を上面側から見た斜視図である。
【図５】本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いる検出チップ中の電極を含む部分の一例を模式的に表した断面説明図である。
【図６】本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法の処理手順を示す工程説明図である。
【図７】従来の被検物質の電気化学的検出方法における検出工程を示す概略説明図である。
【図８】本発明の他の実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法の処理手順を示す工程説明図である。
【図９】本発明のさらに他の実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法の処理手順を示す工程説明図である。
【図１０】試験例１に用いられたＤＮＡを示す概略説明図である。
【図１１】試験例１における被検物質の電気化学的検出方法（実施例１）の操作手順を示す概略説明図である。
【図１２】試験例１における被検物質の電気化学的検出方法（比較例１）の操作手順を示す概略説明図である。
【図１３】試験例１において、検出方法の種類と光電流との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図１４】試験例２に用いられたＤＮＡを示す概略説明図である。
【図１５】試験例２における被検物質の電気化学的検出方法（実施例２）の操作手順を示す概略説明図である。
【図１６】試験例２における被検物質の電気化学的検出方法（比較例２）の操作手順を示す概略説明図である。
【図１７】試験例２において、検出方法の種類と光電流との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図１８】試験例３に用いられたＤＮＡを示す概略説明図である。
【図１９】試験例３における被検物質の電気化学的検出方法（実施例３）の操作手順を示す概略説明図である。
【図２０】試験例３における被検物質の電気化学的検出方法（比較例３）の操作手順を示す概略説明図である。
【図２１】試験例３において、検出方法の種類と光電流との関係を調べた結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［検出装置の構成］
本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いる検出装置の一例を添付図面により説明する。
図１は、本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いる検出装置を示す斜視図である。この検出装置１は、光化学的に活性な物質を標識物質として用いる検出方法に用いる検出装置である。
【００１２】
検出装置１は、検出チップ２０が挿入されるチップ受入部１１と、検出結果を表示するディスプレイ１２とを備えている。
【００１３】
図２は、図１に示される検出装置の構成を示すブロック図である。検出装置１は、光源１３と、電流計１４と、電源１５と、Ａ／Ｄ変換部１６と、制御部１７と、ディスプレイ１２とを備えている。
光源１３は、検出チップ２０の作用電極上に存在させた標識物質に光を照射して当該標識物質を励起させる。光源１３は、励起光を発生する光源であればよい。かかる光源としては、例えば、蛍光灯、ブラックライト、殺菌ランプ、白熱電球、低圧水銀ランプ、高圧水銀ランプ、キセノンランプ、水銀−キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、ＬＥＤ（白色ＬＥＤ、青色ＬＥＤ、緑色ＬＥＤ、赤色ＬＥＤ等）、レーザー（炭酸ガスレーザー、色素レーザー、半導体レーザー）、太陽光等が挙げられる。前記光源のなかでは、蛍光灯、白熱電球、キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、ＬＥＤ、レーザー又は太陽光が好ましい。前記光源のなかでは、レーザーがより好ましい。前記光源は、必要に応じて、分光器やバンドパスフィルタにより、特定波長領域の光のみが放出されるものであってもよい。
電流計１４は、励起された標識物質から放出される電子に起因して検出チップ２０内を流れる電流を測定する。
電源１５は、検出チップ２０に設けられた電極に対して所定の電位を印加する。
Ａ／Ｄ変換部１６は、電流計１４によって測定された光電流値をデジタル変換する。
制御部１７は、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ等から構成されている。この制御部１７は、ディスプレイ１２、光源１３、電流計１４及び電源１５の動作を制御する。また、制御部１７は、Ａ／Ｄ変換部１６でデジタル変換された光電流値から、予め作成された光電流値と標識物質の量との関係を示す検量線に基づき、標識物質の量を概算し、被検物質の量を算出する。
ディスプレイ１２は、制御部１７で概算された被検物質の量等の情報を表示する。
【００１４】
なお、前記標識物質を後述の酸化還元電流・電気化学発光検出法にしたがって検出する場合、検出装置は、光源１３を備えていなくてもよい（図示せず）。
前記標識物質を電気化学発光により検出する場合、検出装置は、標識物質から生じる光などを検出するためのセンサをさらに備えていればよい。
【００１５】
［検出チップの構成］
つぎに、本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いる検出チップ２０の構成を説明する。
【００１６】
図３は、本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いる検出チップを示す斜視図である。図４（Ａ）は図３に示される検出チップのＡＡ線での断面図、図４（Ｂ）は図３に示される検出チップの上基板を下面側から見た斜視図、図４（Ｃ）は図３に示される検出チップの下基板を上面側から見た斜視図である。
【００１７】
検出チップ２０は、上基板３０と、上基板３０の下方に設けられた下基板４０と、上基板３０と下基板４０とに挟まれた間隔保持部材５０とを備えている。検出チップ２０では、上基板３０と下基板４０とは、一側部において重複して配置されている。そして、上基板３０と下基板４０とが重複する部分には、間隔保持部材５０が介在している。
【００１８】
上基板３０は、図４（Ｂ）に示されるように、基板本体３０ａと、作用電極６１とを備えている。この基板本体３０ａには、被検物質を含む試料等を内部に注入するための試料注入口３０ｂが設けられている。また、基板本体３０ａの表面には、作用電極６１と、この作用電極６１に接続されている電極リード７１とが形成されている。上基板３０においては、作用電極６１は、基板本体３０ａの一側部〔図４（Ｂ）の左側〕に配置されている。電極リード７１は、作用電極６１から基板本体３０ａの他側部〔図４（Ｂ）の右側〕に向けて延びている。試料注入口３０ｂは、基板本体３０ａにおいて、間隔保持部材５０が介装される部分よりも内側に設けられている。
【００１９】
基板本体３０ａは、矩形状に形成されている。なお、かかる基板本体３０ａの形状は、特に限定されるものではなく、多角形形状、円盤状等であってもよい。基板の作製及び取り扱いの簡便性の観点から、好ましくは矩形状である。
【００２０】
基板本体３０ａを構成する材料としては、特に限定されないが、例えば、ガラス、ポリエチレンテレフタレート、ポリイミド樹脂等のプラスチック類、金属等の無機材料等が挙げられる。これらのなかでは、光の透過性、十分な耐熱性、耐久性、平滑性等を確保し、かつ材料に要するコストを低減させる観点から、好ましくはガラスである。基板本体３０ａの厚さは、十分な耐久性を確保する観点から、好ましくは０．０１〜１ｍｍ、より好ましくは０．１〜０．７ｍｍ、さらに好ましくは約０．５ｍｍである。また、基板本体３０ａの大きさは、特に限定されないが、多種類の被検物質の検出（多項目）を前提とした場合には項目数によるが、通常、２０ｍｍ×２０ｍｍ程度の大きさである。
【００２１】
下基板４０は、図４（Ｃ）に示されるように、基板本体４０ａと、対極６６と、参照電極６９とを備えている。基板本体４０ａは、上基板３０の基板本体３０ａと略同寸法の矩形状に形成されている。基板本体４０ａ及び基板本体３０ａは、必ずしも、同寸法である必要はない。
【００２２】
基板本体４０ａを構成する材料としては、特に限定されないが、例えば、ガラス、ポリエチレンテレフタレート、ポリイミド樹脂等のプラスチック類、金属等の無機材料等が挙げられる。これらのなかでは、十分な光の透過性、耐熱性、耐久性、平滑性等を確保し、かつ材料に要するコストを低減させる観点から、好ましくはガラスである。基板本体４０ａの厚さ及び大きさは、前記上基板３０の基板本体３０ａを構成する材料、基板本体３０ａの厚さ及び大きさと同様である。
【００２３】
基板本体４０ａの表面には、対極６６と、この対極６６に接続された電極リード７２と、参照電極６９と、この参照電極６９に接続された電極リード７３とが形成されている。下基板４０においては、対極６６は、基板本体４０ａの一側部〔図４（Ｃ）の右側〕に配置されている。対極６６の電極リード７２と参照電極６９の電極リード７３とは、それぞれ、基板本体４０ａの一側部〔図４（Ｃ）の右側〕から他側部〔図４（Ｃ）の左側〕へ向けて延びている。対極６６及び参照電極６９の各電極リード７２，７３は、基板本体４０ａの他側部〔図４（Ｃ）の左側〕において互いに並列するように配置されている。また、電極リード７２，７３は、上基板３０と下基板４０とが重複する部分からはみ出して外部に露出している〔図３及び図４（Ａ）参照〕。なお、基板本体３０ａ及び基板本体４０ａは、当該基板本体を透過させるようにして光を照射する場合には、透過性を有する材料から構成された基板本体であることが望ましい。この場合、基板本体３０ａ及び基板本体４０ａのうち、光を照射する側の基板本体が、透過性を有する材料から構成されていればよい。
【００２４】
つぎに、作用電極６１、対極６６及び参照電極６９について、詳細に説明する。
図５は、本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いる検出チップ中の電極を含む部分の一例を模式的に表した断面説明図である。作用電極６１は、ほぼ四角形状に形成されている。作用電極６１は、図５に示されるように、基板本体３０ａ上に形成された作用電極６１と、この作用電極６１上に固定化された捕捉物質８１とから構成されている。作用電極６１には、電極リード７１が接続されている。
【００２５】
後述の光電気化学検出法に用いる検出チップにおいては、作用電極６１は、励起光が照射されることにより被検物質から生じた電子を受容する半導体からなる。この半導体は、導電体及び電子受容体として機能する。前記半導体は、光励起により被検物質から生じた電子の注入が可能なエネルギー準位をとり得る物質であればよい。ここで、「光励起により被検物質から生じた電子の注入が可能なエネルギー準位」とは、伝導帯（コンダクションバンド）を意味する。すなわち、半導体は、後述の標識物質の最低非占有分子軌道（ＬＵＭＯ）のエネルギー準位よりも低いエネルギー順位を有すればよい。かかる半導体としては、特に限定されないが、例えば、シリコン、ゲルマニウム等の単体半導体；チタン、スズ、亜鉛、鉄、タングステン、ジルコニウム、ハフニウム、ストロンチウム、インジウム、セリウム、イットリウム、ランタン、バナジウム、ニオブ、タンタル等の酸化物を含む酸化物半導体；チタン酸ストロンチウム、チタン酸カルシウム、チタン酸ナトリウム、チタン酸バナジウム、ニオブ酸カリウム等のペロブスカイト型半導体；カドニウム、亜鉛、鉛、銀、アンチモン、ビスマス等の硫化物を含む硫化物半導体；ガリウム、チタン等の窒化物を含む半導体；カドミウム、鉛のセレン化物からなる半導体（例えば、カドミウムセレナイド等）；カドミウムのテルル化物を含む半導体；亜鉛、ガリウム、インジウム、カドミウム等のリン化合物からなる半導体；ガリウム砒素、銅−インジウム−セレン化物、銅−インジウム−硫化物等の化合物を含む半導体；カーボン等の化合物半導体又は有機物半導体等が挙げられる。なお、前記半導体は、真性半導体及び不純物半導体のいずれであってもよい。これらのなかでは、酸化物半導体が好ましい。前記酸化物半導体のうち、真性半導体のなかでは、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化スズ、酸化ニオブ、酸化インジウム、酸化タングステン、酸化タンタル及びチタン酸ストロンチウムが好ましい。また、前記酸化物半導体のうち、不純物半導体のなかでは、スズをドーパントとして含む酸化インジウム（ＩＴＯ）及びフッ素をドーパントとして含む酸化スズ（ＦＴＯ）が好ましい。作用電極の厚さは、通常、０．１〜１μｍ、好ましくは０．１〜２００ｎｍ、より好ましくは０．１〜１０ｎｍである。
【００２６】
さらに、本発明においては、後述の光電気化学検出法に用いる検出チップにおける作用電極６１は、半導体層と導電層とから構成されていてもよい。この場合、作用電極６１の電極リード７１は、導電層に接続される。
前記半導体層を構成する半導体は、前記と同様である。この場合の半導体層の厚さは、好ましくは０．１〜１００ｎｍ、さらに好ましくは０．１〜１０ｎｍである。
前記導電層は、導電性材料からなる。前記導電性材料としては、例えば、金、銀、銅、カーボン、白金、パラジウム、クロム、アルミニウム、ニッケル等の金属又はこれらの少なくとも１つを含む合金；酸化インジウム、スズをドーパントとして含む酸化インジウム（ＩＴＯ）等の酸化インジウム系材料；酸化スズ、アンチモンをドーパントとして含む酸化スズ（ＡＴＯ）、フッ素をドーパントとして含む酸化スズ（ＦＴＯ）等の酸化スズ系材料；チタン、酸化チタン、窒化チタン等のチタン系材料；グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カーボンペースト、カーボンファイバー等の炭素系材料等が挙げられる。導電層の厚さは、好ましくは１〜１０００ｎｍ、さらに好ましくは１〜２００ｎｍ、さらに好ましくは１〜１００ｎｍである。導電性が確保でき、かつ電極から生じる光電流（バックグランド電流）が最小となる膜厚が望ましい。なお、導電性材料は、ガラス、プラスチック等の非導電性物質からなる非導電性基材の表面に導電性を有する材料からなる導電材層が設けられた複合基材であってもよい。かかる導電材層の形状は、薄膜状及びスポット状のいずれであってもよい。導電材層を構成する材料としては、例えば、スズをドーパントとして含む酸化インジウム（ＩＴＯ）、アンチモンをドーパントとして含む酸化スズ（ＡＴＯ）、フッ素をドーパントとして含む酸化スズ（ＦＴＯ）等が挙げられる。導電層は、例えば、当該導電層を構成する材料の種類に応じた膜形成方法により形成させることができる。
【００２７】
一方、後述の酸化還元電流・電気化学発光検出方法に用いる検出チップにおいては、作用電極６１は、導電性材料からなる。
前記導電性材料は、前記光電気化学検出法に用いる検出チップにおける作用電極６１の導電層に用いられる導電性材料と同様である。
さらに、導電性材料は、ガラス、プラスチックなどの非導電性物質からなる非導電性基材の表面に導電性を有する材料からなる導電材層が設けられた複合基材であってもよい。かかる導電材層の形状は、薄膜状およびスポット状のいずれであってもよい。
この場合、作用電極６１の厚さは、好ましくは１〜１０００ｎｍ、さらに好ましくは１０〜２００ｎｍである。
【００２８】
作用電極６１の表面には、捕捉物質８１が固定化されている〔図５参照〕。かかる捕捉物質８１は、被検物質を捕捉する物質である。これにより、被検物質を作用電極６１の近傍に存在させることができるようになっている。捕捉物質８１は、被検物質の種類に応じて、適宜選択することができる。前記捕捉物質８１としては、例えば、核酸、タンパク質、ペプチド、糖鎖、抗体、特異的な認識能を持つナノ構造体等が挙げられる。
【００２９】
対極６６は、図５に示されるように、基板本体４０ａ上に形成されている。この対極６６は、導電性材料からなる薄膜からなる。前記導電性材料としては、例えば、金、銀、銅、カーボン、白金、パラジウム、クロム、アルミニウム、ニッケル等の金属又はこれらの少なくとも１つを含む合金、ＩＴＯ、酸化インジウム等の導電性セラミックス、ＡＴＯ、ＦＴＯ等の金属酸化物、チタン、酸化チタン、窒化チタン等のチタン化合物等が挙げられる。前記薄膜の厚さは、好ましくは１〜１０００ｎｍ、より好ましくは１０〜２００ｎｍである。
【００３０】
参照電極６９は、図５に示されるように、基板本体４０ａ上に形成されている。この参照電極６９は、導電性材料からなる薄膜からなる。前記導電性材料としては、例えば、金、銀、銅、カーボン、白金、パラジウム、クロム、アルミニウム、ニッケル等の金属又はこれらの少なくとも１つを含む合金、ＩＴＯ、酸化インジウム等の導電性セラミックス、ＡＴＯ、ＦＴＯ等の金属酸化物、チタン、酸化チタン、窒化チタン等のチタン化合物等が挙げられる。前記薄膜の厚さは、好ましくは１〜１０００ｎｍ、より好ましくは１０〜２００ｎｍである。なお、本実施の形態では、参照電極６９を設けているが、本発明においては、参照電極６９を設けなくてもよい。対極６６に用いる電極の種類、膜厚にもよるが、電圧降下の影響が僅かな小さな電流（例えば、１μＡ以下）を測定する場合は、対極６６が参照電極６９を兼ねていてもよい。一方、大きな電流を測定する場合、電圧降下の影響を抑制し、作用電極６１に印加する電圧を安定化させる観点から、参照電極６９を設けることが好ましい。
【００３１】
つぎに、間隔保持部材５０について、説明する。間隔保持部材５０は、矩形の環状体形状に形成され、絶縁体であるシリコーンゴムからなっている。この間隔保持部材５０は、作用電極６１、対極６６及び参照電極６９を取り囲むように配置されている〔図４（Ａ）、図５参照〕。上基板３０と下基板４０との間には間隔保持部材５０の厚さに相当する間隔が形成されている。これにより、各電極６１，６６，６９の間には試料や電解液を収容するための空間２０ａが形成されている〔図４（Ａ）及び図５参照〕。間隔保持部材５０の厚さは、通常、０．２〜３００μｍである。本発明においては、間隔保持部材５０を構成する材料として、シリコーンゴムの代わりに、例えば、ポリエステルフィルム等のプラスチック製両面テープ等を用いることもできる。
【００３２】
また、本発明においては、作用電極６１、対極６６及び参照電極６９は、各電極が他の電極と接触しないように間隔保持部材５０の枠内に配置されていればよい。したがって、作用電極６１、対極６６及び参照電極６９は、同一の基板本体上に形成されていてもよい。さらに、本発明においては、対極６６及び参照電極６９は、基板本体上に形成された薄膜状の電極でなくてもよい。この場合、対極６６及び参照電極６９の少なくともいずれかが間隔保持部材５０の部材本体に設けられていてもよい。そして、上基板３０及び下基板４０のいずれかに、間隔保持部材５０の部材本体に設けた電極以外の電極が設けられていればよい。
【００３３】
［被検物質の電気化学的検出方法］
本発明の被検物質の電気化学的検出方法は、被検物質を電気化学的に検出する方法であって、
（１） 被検物質を含む試料を、この被検物質を捕捉する捕捉物質が固定された作用電極に接触させ、前記被検物質を作用電極上の捕捉物質で捕捉する工程、
（２） 前記工程（１）で得られた作用電極上の捕捉物質により捕捉された被検物質と、ポリペプチドからなる支持体を介して標識物質と前記被検物質を捕捉する結合物質とを少なくとも保持する標識結合物質とを含む複合体を形成させる工程、及び
（３） 前記工程（２）で得られた作用電極上に存在する標識物質を電気化学的に検出する工程、
を含むことを特徴とする。
【００３４】
本発明の被検物質の電気化学的検出方法では、標識物質の支持体として、ポリペプチドが用いられている点に１つの大きな特徴がある。
【００３５】
本発明の被検物質の電気化学的検出方法では、例えば、ナノサイズで比重が小さいポリペプチドからなるポリペプチド支持体を介して被検物質Ｓと結合する結合物質と多数の標識物質が結合した標識結合物質が用いられている。このようにポリペプチド支持体を用いた場合、従来のようにポリペプチド支持体を介さないで標識物質が結合物質に直接結合させる場合とは異なり、結合物質の結合活性を維持したまま、多数の標識物質を結合することができる。したがって、本発明の被検物質の電気化学的検出方法によれば、検出感度を著しく向上させることが可能である。また、ポリペプチドは、その種類毎に決まった構造及び配列を有しており、しかも、標識物質が結合可能な結合部位（アミノ基やスルフヒドリル基等のアミノ酸の側鎖）の数が決まっている。したがって、本発明の被検物質の電気化学的検出方法によれば、金属ナノ粒子等のポリペプチド以外の支持体を用いる場合よりも、高い再現性での被検物質の検出や定量が可能になる。さらに、ポリペプチドは、インビトロで合成することができ、遺伝子操作により、所望の場所に標識物質が結合可能なアミノ酸残基（アミノ基やチオール基等を有するアミノ酸残基）を導入することができ、標識結合物質中における標識物質数を制御性よく増加させることも可能である。
【００３６】
本発明の方法では、前記標識物質として、光化学的又は電気化学的に活性な物質が用いられる。光化学的に活性な物質は、当該物質が光により励起されることにより放出される電子を用いて検出される。一方、電気化学的に活性な物質は、当該物質に基づく酸化還元電流及び／又は電気化学発光を用いて検出される。したがって、本発明の方法は、標識物質の検出技術の種類によって、光電気化学検出方法（図６及び図８参照）及び酸化還元電流・電気化学発光検出方法（図９参照）に大別することができる。
【００３７】
１．光電気化学検出方法
まず、光電気化学検出方法について説明する。光電気化学検出方法には、上述した図１に示される検出装置及び図３に示される検出チップを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
以下、図１に示される検出装置及び図３に示される検出チップを用いる場合を例としてあげて説明する。
【００３８】
図６は、本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法の処理手順を示す工程説明図である。
光電気化学検出方法では、ユーザーは、被検物質Ｓを含む試料を、検出チップ２０の試料注入口３０ｂより注入する〔図６（Ａ）試料供給工程を参照〕。これにより、試料中の被検物質が検出チップ２０を構成する上基板３０の作用電極６１上の捕捉物質８１によって捕捉される〔図６（Ｂ）被検物質捕捉工程を参照〕。このとき、前記試料中の被検物質Ｓ以外の物質（夾雑物質Ｆ）は、捕捉物質８１に捕捉されない。
捕捉物質８１は、被検物質Ｓの種類に応じて適宜選択することができる。例えば、被検物質Ｓが核酸である場合、捕捉物質８１として、かかる核酸にハイブリダイズする核酸プローブ、前記核酸に対する抗体、前記核酸と結合するタンパク質等を用いることができる。また、被検物質Ｓがタンパク質又はペプチドである場合、捕捉物質８１として、かかるタンパク質又はペプチドに対する抗体等を用いることができる。
【００３９】
捕捉物質８１による被検物質の捕捉は、例えば、捕捉物質８１と被検物質とが結合する条件下で行なうことができる。捕捉物質８１と被検物質とが結合する条件は、被検物質の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、被検物質が核酸であり、捕捉物質８１が前記核酸にハイブリダイズする核酸プローブである場合、被検物質の捕捉は、ハイブリダイゼーション用緩衝液存在下に行なうことができる。また。被検物質が核酸、タンパク質又はペプチドであり、捕捉物質８１が前記核酸に対する抗体、前記タンパク質に対する抗体又は前記ペプチドに対する抗体である場合、被検物質の捕捉は、リン酸緩衝生理的食塩水、ヘペス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、ピペス（ＰＩＰＥＳ）緩衝液、トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液等の抗原抗体反応を行なうに適した溶液中で行なうことができる。さらに、被検物質がリガンドであり、捕捉物質８１が前記リガンドに対するレセプターである場合や、被検物質がレセプターであり、捕捉物質８１が前記レセプターに対するリガンドである場合、被検物質の捕捉は、リガンドとレセプターとの結合に適した溶液中で行なうことができる。
【００４０】
つぎに、ユーザーは、試料注入口３０ｂから当該検出チップ２０内に標識結合物質９０を注入して、標識結合物質９０を作用電極６１上に捕捉された被検物質Ｓに結合させる〔図６（Ｃ）標識工程を参照〕。標識工程では、作用電極６１上に、捕捉物質８１と被検物質Ｓと標識結合物質９０とを含む複合体が形成される。
【００４１】
標識結合物質９０は、ポリペプチド支持体９１と、被検物質Ｓに結合する第１結合物質９２と、標識物質９３と、第１リンカー９４とから構成されている。標識結合物質９０では、被検物質Ｓに結合する第１結合物質９２と、第１リンカー９４とがポリペプチド支持体９１の表面に直接固定化されている。また、第１リンカー９４を介して標識物質９３が支持体９１上に固定化されている。
【００４２】
ポリペプチド支持体９１は、ポリペプチドからなる。ポリペプチド支持体９１の直径は、被検物質、標識物質等の種類に応じて適宜設定することができるが、通常、３ｎｍ〜１００ｎｍである。
【００４３】
前記ポリペプチドは、天然由来の精製ポリペプチド、インビトロで合成したリコンビナントポリペプチド、遺伝子改変した人工ポリペプチド及び化学合成ペプチドのいずれであってもよい。
【００４４】
また、前記ポリペプチドの分子量は、好ましくは１０００Ｄａ〜１００００００Ｄａ、より好ましくは１００００Ｄａ〜７０００００Ｄａ、さらに好ましくは５００００Ｄａ〜５０００００Ｄａである。
【００４５】
さらに、前記ポリペプチドの形状は、ポリペプチドが取りうる形状であればよい。前記形状としては、例えば、球状、直鎖状、紐状等が挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００４６】
前記ポリペプチドには、標識物質を結合させやすいアミノ酸残基が含まれていればよい。かかるアミノ酸残基としては、例えば、一級アミノ基を側鎖に有するアミノ酸残基（例えば、リジン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基等）、スルフヒドリル基を有するアミノ酸残基（システイン残基）等が挙げられる。なかでも、リジン残基を多く含むポリペプチド、すなわち、強い塩基性のタンパク質等は、多数の標識物質を結合させる目的では有効である。かかるポリペプチドの具体例としては、アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン等）、ポリリジン、ヒストンＨ１、ミエリンベーシックプロテイン（ＭＢＰ）、卵白リゾチーム等が挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００４７】
ポリペプチド支持体９１を構成するポリペプチドは、サブユニットが複数個会合した多量体からなるポリペプチドであってもよい。この場合、前記多量体は、各サブユニットが互いに同一であるホモ多量体であってもよく、各サブユニットが互いに異なるヘテロ多量体であってもよい。また、前記多量体は、各サブユニットが、互いに相同的である多量体であってもよい。このような多量体からなるポリペプチドとしては、例えば、フェリチン、ストレプトアビジン、リステリアＤｐｓ等のホモ多量体構造を有するポリペプチド；ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）、ロタウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、ロスリバーウイルス、ポリオウイルス等のウイルス粒子の外殻を利用したポリペプチド等が挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００４８】
前記ポリペプチドのなかでは、安価に大量調製が容易なことから、好ましくはフェリチン及びアルブミンである。前記フェリチンは、標識物質が結合可能な結合部位がフェリチン分子の外側に位置するように改変されていることが好ましい。このような改変が施されたフェリチンとしては、例えば、馬フェリチン分子の外側に位置する８６番目のセリン残基が、マレイミド修飾された標識物質が結合可能なシステイン残基（マレイミド基との反応性が高いシステイン残基）に改変された変異型フェリチンなどが挙げられる。
【００４９】
第１結合物質９２は、被検物質Ｓにおいて、捕捉物質８１とは異なる位置や場所に結合する物質であればよい。かかる第１結合物質９２は、被検物質Ｓの種類に応じて適宜選択される。例えば、被検物質Ｓが核酸である場合、第１結合物質９２として、かかる核酸にハイブリダイズする核酸プローブ、前記核酸に対する抗体、前記核酸と結合するタンパク質等を用いることができる。また、被検物質Ｓがタンパク質又はペプチドである場合、第１結合物質９２として、かかるタンパク質又はペプチドに対する抗体等を用いることができる。
【００５０】
標識物質９３は、光を照射することにより励起状態となり電子を放出する物質である。標識物質９３として、金属錯体、有機蛍光体、量子ドット及び無機蛍光体からなる群より選択された少なくとも１つを用いることができる。
前記標識物質の具体例としては、金属フタロシアン、ルテニウム錯体、オスミウム錯体、鉄錯体、亜鉛錯体、９−フェニルキサンテン系色素、シアニン系色素、メタロシアニン色素、キサンテン系色素、トリフェニルメタン系色素、アクリジン系色素、オキサジン系色素、クマリン系色素、メロシアニン系色素、ロダシアニン系色素、ポリメチン系色素、ポルフィリン系色素、フタロシアニン系色素、ローダミン系色素、キサンテン系色素、クロロフィル系色素、エオシン系色素、マーキュロクロム系色素、インジゴ系色素、ＢＯＤＩＰＹ系色素、ＣＡＬＦｌｕｏｒ系色素、オレゴングリーン系色素、ロードル（Ｒｈｏｄｏｌ）グリーン、テキサスレッド、カスケードブルー、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）、セレン化カドミウム、テルル化カドミウム、Ｌｎ2Ｏ3：Ｒｅ、Ｌｎ2Ｏ2Ｓ：Ｒｅ、ＺｎＯ、ＣａＷＯ4、ＭＯ・ｘＡｌ2Ｏ3：Ｅｕ、Ｚｎ2ＳｉＯ4：Ｍｎ、ＬａＰＯ4：Ｃｅ、Ｔｂ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５及びＣｙ９（いずれも、アマシャムバイオサイエンス社製）；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７９０（いずれも、モレキュラープローブ社製）；ＤＹ−６１０、ＤＹ−６１５、ＤＹ−６３０、ＤＹ−６３１、ＤＹ−６３３、ＤＹ−６３５、ＤＹ−６３６、ＥＶＯｂｌｕｅ１０、ＥＶＯｂｌｕｅ３０、ＤＹ−６４７、ＤＹ−６５０、ＤＹ−６５１、ＤＹ―８００、ＤＹＱ−６６０及びＤＹＱ−６６１（いずれも、Ｄｙｏｍｉｃｓ社製）；Ａｔｔｏ４２５、Ａｔｔｏ４６５、Ａｔｔｏ４８８、Ａｔｔｏ４９５、Ａｔｔｏ５２０、Ａｔｔｏ５３２、Ａｔｔｏ５５０、Ａｔｔｏ５６５、Ａｔｔｏ５９０、Ａｔｔｏ５９４、Ａｔｔｏ６１０、Ａｔｔｏ６１１Ｘ、Ａｔｔｏ６２０、Ａｔｔｏ６３３、Ａｔｔｏ６３５、Ａｔｔｏ６３７、Ａｔｔｏ６４７、Ａｔｔｏ６５５、Ａｔｔｏ６８０、Ａｔｔｏ７００、Ａｔｔｏ７２５及びＡｔｔｏ７４０（いずれも、Ａｔｔｏ−ＴＥＣ ＧｍｂＨ社製）；ＶｉｖｏＴａｇＳ６８０、ＶｉｖｏＴａｇ６８０及びＶｉｖｏＴａｇＳ７５０（いずれも、ＶｉｓＥｎＭｅｄｉｃａｌ社製）等が挙げられる。なお、前記ＬｎはＬａ、Ｇｄ、Ｌｕ又はＹを示し、Ｒｅはランタニド族元素を示し、Ｍはアルカリ土類金属元素を示し、ｘは０．５〜１．５の数を示す。標識物質の他の例については、例えば、特許第４０８６０９０号公報、特開平７−８３９２７号公報等を参照することができる。
【００５１】
第１リンカー９４としては、例えば、炭素鎖、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖、核酸等が挙げられる。リンカーの長さは、標識物質及び官能基の種類等によって好適な範囲が異なるので、標識物質及び官能基の種類等に応じて適宜設定することが好ましい。
【００５２】
なお、標識結合物質９０は、標識物質９３をポリペプチド支持体９１に直接結合させることができるのであれば、第１リンカー９４を有していなくてもよい。
【００５３】
標識結合物質９０におけるポリペプチド支持体９１への標識物質９３の結合方法としては、例えば、標識物質９３をポリペプチド支持体９１に共有結合により結合させる方法、標識物質９３をポリペプチド支持体９１に非共有結合により結合させる方法が挙げられる。
【００５４】
標識物質９３をポリペプチド支持体９１に共有結合により結合させる方法は、標識物質９３をポリペプチドに共有結合させることができる方法であればよく、特に限定されるものではない。
【００５５】
ポリペプチド支持体９１において、標識物質９３を共有結合させる部位は、特に限定されないが、ポリペプチド支持体９１と標識物質９３との結合が容易であることから、ポリペプチド中のアミノ基（ＮＨ２）及びスルフヒドリル（ＳＨ）基が好ましい。ポリペプチド中のアミノ基（ＮＨ２基）に結合させることができる反応基としては、例えば、サクシンイミド基（ＮＨＳ）、イソチオシアノ基（ＩＴＣ）、クロロスルホニル基、クロロアシル基、オキシエチレン基、クロロアルキル基、アルデヒド基、カルボキシル基等が挙げられる。これらのなかでは、ポリペプチドのアミノ基を介して目的とする標識物質を共有結合的に付加させる場合には、水系での反応が必須で、反応溶液のｐＨが中性〜弱アルカリ性領域にあること、氷冷下から３７℃程度の反応温度で短時間に反応が進むこと等のように反応化合物を使用できる条件が限られていることから、好ましくはＮＨＳ及びＩＴＣである。したがって、標識物質９３として、ＮＨＳ及び／又はＩＴＣを有する標識物質を用いることができる。
【００５６】
ポリペプチド中のスルフヒドリル（ＳＨ）基に結合させることができる反応基としては、例えば、マレイミド基、ブロモアセトアミド基等があげられる。スルホヒドリル（ＳＨ）基は、通常、ポリペプチド中ではジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合を形成している。そのため、スルフヒドリル（ＳＨ）基を、標識物質を結合させる部位として用いる場合、ポリペプチド中のジスルフィド構造を還元し、スルホヒドリル（ＳＨ）基として用いることになる。ジスルフィド結合の還元には、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）、メルカプトエチルアミン（ＭＥＡ）等を用いることができる。したがって、標識物質が、アミノ基やチオール基に対する反応性の高い官能基（例えば、サクシンイミド基、マレイミド基等）を有している場合には、ポリペプチドと標識物質とを混合するだけで、ポリペプチドのアミノ基やチオール基に標識物質を直接結合させることができる。このような標識物質としては、例えば、サクシンイミドエステル修飾されたＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０やＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７９０（インビトロジェン社製）等が挙げられる。
【００５７】
標識物質９３が、アミノ基、チオール基、アルデヒド基、カルボキシル基等を有している場合は、例えば、化学クロスリンカーを介して標識物質９３とポリペプチド支持体９１とを結合させること、標識物質９３とポリペプチド支持体９１と間にジチオール結合を形成させること、一般的な化学反応を行なうこと等により、標識物質９３とポリペプチド支持体９１とを容易に結合させることができる。
【００５８】
前記クロスリンカーは、一般的に直鎖状の構造を有しており、両末端にアミノ基やチオール基と反応するサクシンイミド基、マレイミド基等を有するスペーサーからなる。かかるクロスリンカーを第１リンカー９４として用いることにより、ポリペプチド支持体９１と標識物質９３とを連結させることが可能である。例えば、標識物質９３がチオール基を有する場合、この標識物質９３をポリペプチドのアミノ基に結合させる際に、一方の末端にサクシンイミド基を有し、かつ他方の末端にマレイミド基を有するクロスリンカーを用いることができる。この場合、まず、ポリペプチド中のアミノ基とクロスリンカー中のサクシンイミド基とを反応させ、クロスリンカーのマレイミド基をポリペプチドの表面に露出させる。そして、前記マレイミド基と標識物質中のチオール基とを反応させることにより結合させることができる。ここで、クロスリンカーのスペーサーの長さは、特に限定されるものではない。スペーサーとしては、例えば、ＰＥＧ鎖、核酸等が挙げられる。前記クロスリンカーの具体例としては、Ｎ−［α−マレイミドアセトアセトキシ］スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、Ｎ−［β−マレイミドプロピルオキシ］スクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）、（マレイミドブチリルオキシ−スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、スクシンイミジル トランス−４−（Ｎ−マレイミジルメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−［ε−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート（ＳＭＰＢ）、スクシンイミジル−６−［（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート］（ＳＭＰＨ）、スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシ−［６−アミドカプロエート］（ＬＣ−ＳＭＣＣ）、ＮＨＳ−ＰＥＧｎ−Ｍａｌｅｉｍｉｄ等が挙げられる。前記クロスリンカーは、両末端の官能基がアミノ基との反応性を有するグルタルアルデヒド、アミン反応性のＮＨＳエステル基と光反応性のジアジリン基の２つの官能基を末端に有するクロスリンカー等であってもよい。
【００５９】
また、標識物質９３がチオール基を有している場合、標識物質９３のチオール基とポリペプチドのチオール基とを反応させることにより、ジチオール結合を形成することによっても結合可能である。標識物質９３がカルボキシル基を有する場合、ＮＨＳを用いて活性化して、ポリペプチドのアミノ基と結合させることができる。標識物質９３がアルデヒド基を有する場合、ポリペプチドのアミノ基とシッフ塩基を形成させた後、還元して安定な結合をつくることができる。
【００６０】
標識物質９３をポリペプチド支持体９１に非共有結合により結合させる方法としては、標識物質９３をポリペプチドに非共有結合により結合させる方法やポリペプチドに共有結合により結合させた物質を介して非共有結合により標識物質９３を結合させる方法等が考えられる。
【００６１】
標識物質９３をポリペプチドに非共有結合により結合させる方法としては、例えば、ストレプトアビジンと、ビオチン標識した標識物質との結合を利用する方法等が挙げられる。また、ポリペプチドに共有結合により結合させた物質を介して非共有結合により標識物質を結合させる方法としては、例えば、まず、前述のように、末端にアミノ基等を有するＤＮＡをポリペプチドに共有結合させ、つぎに、前記ＤＮＡに標識物質を結合させた相補的なＤＮＡをハイブリダイゼーションにより非共有結合的に結合させる方法等が挙げられる。
【００６２】
以上のように、ポリペプチド支持体９１を標識物質９３の支持体として用いた場合、無機材料からなる支持体を用いた場合に比べ、標識物質の和が正確に制御された標識物質結合物質を容易に作製することができる。
【００６３】
ポリペプチド支持体９１への第１結合物質９２の結合についても、標識物質９３をポリペプチド支持体９１に結合させるのと同様の方法により行なうことができる。
【００６４】
つぎに、検出工程が行なわれる〔図６（Ｄ）検出工程を参照〕。
【００６５】
かかる検出工程では、まず、ユーザーは、電解液を、検出チップ２０の試料注入口３０ｂより注入する。その後、ユーザーは、図１に示される検出装置１のチップ受入部１１に検出チップ２０を挿入する。そして、ユーザーは、検出装置１に測定開始を指示する。ここでは、検出装置１に挿入された検出チップ２０の電極リード７１，７２、７３は電流計１４や電源１５に接続される。そして、検出装置１の電源１５により、参照電極６９を基準として任意の電位が作用電極６１に印加される。電極に印加される電位は、被検物質に対する励起光が照射されていない場合の電流値（定常電流、暗電流）が小さく、被検物質から生じる光電流が最大となる電位が好ましい。電位は、対極に印加してもよく、作用電極に印加してもよい。
【００６６】
その後、検出装置１の光源１３により、作用電極６１上の標識物質９３に励起光が照射される。これにより、標識物質９３が励起し、電子を発生する。そして、発生した電子は、作用電極６１に移動する。その結果、作用電極６１と対極６６との間に電流が流れる。そして、検出装置１の電流計１４により、作用電極６１と対極６６との間に流れる電流が測定される。電流計１４で測定された電流値は、標識物質９３の個数と相関している。したがって、測定された電流値に基づき、被検物質Ｓを定量することができる。なお、励起光は、必要に応じて、分光器やバンドパスフィルタを用いて特定波長領域の光のみであってもよい。
【００６７】
その後、まず、Ａ／Ｄ変換部１６によってデジタル変換された電流値が制御部１７に入力される。つぎに、予め作成された電流値と被検物質量との関係を示す検量線に基づき、制御部１７により、デジタル変換後の電流値から、試料中の被検物質量が概算される。そして、概算された被検物質量の情報をディスプレイ１２に表示するための検出結果画面が、制御部１７によって作成される。その後、制御部１７によって作成された検出結果画面がディスプレイ１２に送信され、ディスプレイ１２に表示される。
【００６８】
前記電解液として、酸化された状態の標識物質９３に電子を供給しうる塩からなる電解質と、非プロトン性極性溶媒、プロトン性極性溶媒又は非プロトン性極性溶媒とプロトン性極性溶媒との混合物とを含む溶液を用いることができる。この電解液は、所望により、他の成分をさらに含んでいてもよい。また、電解液は、ゲル状であってもよく、固体であってもよい。
【００６９】
電解質としては、例えば、ヨウ化物、臭化物、金属錯体、チオ硫酸塩、亜硫酸塩、これらの混合物等が挙げられる。前記電解質の具体例としては、ヨウ化リチウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、ヨウ化セシウム、ヨウ化カルシウム等の金属ヨウ化物；テトラアルキルアンモニウムヨーダイド、ピリジニウムヨーダイド、イミダゾリウムヨーダイド等の４級アンモニウム化合物のヨウ素塩；臭化リチウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化セシウム、臭化カルシウム等の金属臭化物；テトラアルキルアンモニウムブロマイド、ピリジニウムブロマイド等の４級アンモニウム化合物の臭素塩；フェロシアン酸塩、フェリシニウムイオン等の金属錯体；チオ硫酸ナトリウム、チオ硫酸アンモニウム、チオ硫酸カリウム、チオ硫酸カルシウム等のチオ硫酸塩；亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、亜硫酸アンモニウム、亜硫酸鉄、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸カルシウム等の亜硫酸塩；及びこれらの混合物等が挙げられる。これらのなかでは、テトラプロピルアンモニウムヨーダイド及びヨウ化カルシウムが好ましい。
【００７０】
電解液の電解質濃度は、好ましくは０．００１〜１５Ｍである。
【００７１】
プロトン性極性溶媒として、水、水を主体に緩衝液成分を混合した極性溶媒等を用いることができる。
非プロトン性極性溶媒としては、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）等のニトリル類；プロピレンカーボネート、エチレンカーボネート等のカーボネート類、１，３−ジメチルイミダゾリノン、３−メチルオキサゾリノン、ジアルキルイミダゾリウム塩等の複素環化合物；ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、スルホラン等が挙げられる。非プロトン性極性溶媒のなかでは、アセトニトリルが好ましい。プロトン性極性溶媒及び非プロトン性極性溶媒は、単独で、又は両者を混合して用いることができる。プロトン性極性溶媒と非プロトン性極性溶媒との混合物は、水とアセトニトリルとの混合物が好ましい。
【００７２】
標識物質９３への光の照射には、標識物質９３を光励起することができる波長の光を照射できる光源を用いることができる。かかる光源は、標識物質９３の種類等に応じて、適宜選択することができる。前記光源としては、例えば、蛍光灯、ブラックライト、殺菌ランプ、白熱電球、低圧水銀ランプ、高圧水銀ランプ、キセノンランプ、水銀−キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、ＬＥＤ（白色ＬＥＤ、青色ＬＥＤ、緑色ＬＥＤ、赤色ＬＥＤ等）、レーザー（炭酸ガスレーザー、色素レーザー、半導体レーザー）、太陽光等が挙げられる。前記光源のなかでは、蛍光灯、白熱電球、キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、ＬＥＤ又は太陽光が好ましい。また、検出工程においては、必要に応じて、分光器やバンドパスフィルタを用いて特定波長領域の光のみを標識物質９３に照射してもよい。
【００７３】
標識物質９３に由来する光電流の測定には、例えば、電流計、ポテンショスタット、レコーダ、計算機等を備える測定装置を用いることができる。
かかる検出工程では、光電流を定量することにより、被検物質の量を調べることができる。
【００７４】
以上のように、本実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法では、標識物質の支持体として、ポリペプチド支持体９１が用いられている。したがって、本実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法によれば、１つの被検物質Ｓあたりの標識物質に基づく光電流を大きくすることができる。これに対して、従来の被検物質の電気化学的検出方法では、ポリペプチド支持体９１が用いられておらず、一般的に、図７に示されるように、被検物質Ｓの検出に際して、被検物質Ｓに結合する結合物質１０３に標識物質１０２が直接結合した標識結合物質等が用いられる。そのため、従来の被検物質の電気化学的検出方法では、１つの被検物質Ｓあたりの標識物質に基づく光電流は小さい。
【００７５】
なお、本実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法では、夾雑物質に基づくノイズの発生を抑制する観点から、ユーザーは、被検物質捕捉工程後、検出チップ２０の試料注入口３０ｂより夾雑物質を含む残部の液体を排出し、検出チップ２０内を洗浄してもよい。検出チップ２０内の洗浄には、例えば、緩衝液（特に界面活性剤を含んだ緩衝液）；精製水（特に界面活性剤を含んだ精製水）；エタノール等の有機溶媒等を用いることができる。
【００７６】
また、本実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法では、被検物質Ｓに結合していない遊離の標識結合物質９０を除去して、検出精度を向上させる観点から、標識工程の後、検出チップ２０内を洗浄し、遊離の標識結合物質９０を除去する工程をさらに行なってもよい。かかる洗浄には、例えば、エタノール、精製水等を用いることができる。
【００７７】
さらに、本発明においては、標識工程において、標識物質が予め結合されている標識結合物質を用いて被検物質Ｓを標識する代わりに、図８に示されるように、標識工程中において、標識結合物質が形成されるように操作を行なってもよい。図８は、本発明の他の実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法の処理手順を示す工程説明図である。図８に示される被検物質の電気化学的検出方法では、（Ａ）試料供給工程、（Ｂ）被検物質捕捉工程及び（Ｄ）検出工程は、前述した図６に示される方法の（Ａ）試料供給工程、（Ｂ）被検物質捕捉工程及び（Ｄ）検出工程と同様である。一方、図８に示される被検物質の電気化学的検出方法では、（Ｃ）標識工程において、まず、ポリペプチド支持体９１を介して第１結合物質９２及び第１リンカー９４を保持する結合体９０ａを被検物質Ｓに結合させる〔図８中、（Ｃ−１）〕。その後、結合体９０ａに、標識体９０ｂを結合させる〔図８中、（Ｃ−２）〕。この標識体９０ｂは、標識物質９３と、この標識物質９３を保持するための第２リンカー９６と、前記第２リンカー９６を結合する第２結合物質９５とからなる。標識体９０ｂにおいては、標識物質９３と第２リンカー９６とを含む複数個の複合体が第２結合物質９５上に結合している。
【００７８】
２．酸化還元電流・電気化学発光検出方法
つぎに、酸化還元電流・電気化学発光検出方法について説明する。図９は、本発明のさらに他の実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法の処理手順を示す工程説明図である。
【００７９】
かかる酸化還元電流・電気化学発光検出方法は、標識工程〔図９（Ｃ）参照〕において、標識物質１９３として、電圧を印加することにより酸化還元電流を生じる標識物質又は電圧を印加することにより発光する標識物質を用いる点及び検出工程〔図９（Ｄ）参照〕において、電圧を作用電極６１に印加して標識物質１９３から生じた光を検出する点が光電気化学検出方法と大きく異なっている。したがって、試料供給工程〔図９（Ａ）参照〕及び被検物質捕捉工程〔図９（Ｂ）参照〕は、光電気化学検出方法における試料供給工程及び被検物質捕捉工程と同様である。なお、本実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いられる検出装置１は、光源１３を備えず、標識物質から生じる光を検出するためのセンサをさらに備えている装置である。また、本実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いられる検出チップ２０は、作用電極６１が導電性材料からなるものである。
【００８０】
標識工程においては、ユーザーは、試料注入口３０ｂから当該検出チップ２０内に標識結合物質１９０を注入して、標識結合物質１９０を作用電極６１上に捕捉された被検物質Ｓに結合させる〔図９（Ｃ）標識工程を参照〕。標識工程では、作用電極６１上に、捕捉物質８１と被検物質Ｓと標識結合物質１９０とを含む複合体が形成される。
【００８１】
標識結合物質１９０は、ポリペプチド支持体９１と、被検物質Ｓに結合する第１結合物質９２と、標識物質１９３と、第１リンカー９４とから構成されている。標識結合物質１９０では、被検物質Ｓに結合する第１結合物質９２と、第１リンカー９４とがポリペプチド支持体９１の表面に直接固定化されている。また、第１リンカー９４を介して標識物質１９３がポリペプチド支持体９１上に固定化されている。
【００８２】
標識物質１９３は、電圧を印加することにより発光する標識物質である。
電圧を印加することにより発光する標識物質としては、例えば、ルミノール、ルシゲニン、ピレン、ジフェニルアントラセン、ルブレン等が挙げられる。
これらの標識物質の発光は、例えば、ホタルルシフェリン、デヒドロルシフェリンのようなルシフェリン誘導体、フェニルフェノール、クロロフェノールのようなフェノ−ル類若しくはナフトール類のようなエンハンサ−を用いることにより増強することが可能である。
なお、本実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法では、標識物質１９３として、電圧を印加することにより発光する標識物質の代わりに、電圧を印加することにより酸化還元電流を生じる標識物質を用いてもよい。
電圧を印加することにより酸化還元電流を生じる標識物質としては、例えば、電気的に可逆的な酸化還元反応を起こす金属を中心金属として含む金属錯体等が挙げられる。このような金属錯体としては、例えば、トリス（フェナントロリン）亜鉛錯体、トリス（フェナントロリン）ルテニュウム錯体、トリス（フェナントロリン）コバルト錯体、ジ（フェナントロリン）亜鉛錯体、ジ（フェナントロリン）ルテニュウム錯体、ジ（フェナントロリン）コバルト錯体、ビピリジンプラチナ錯体、ターピリジンプラチナ錯体、フェナントロリンプラチナ錯体、トリス（ビピリジル）亜鉛錯体、トリス（ビピリジル）ルテニュウム錯体、トリス（ビピリジル）コバルト錯体、ジ（ビピリジル）亜鉛錯体、ジ（ビピリジル）ルテニュウム錯体、ジ（ビピリジル）コバルト錯体等が挙げられる。
【００８３】
なお、ポリペプチド支持体９１、第１結合物質９２及び第１リンカー９４は、光電気化学検出方法におけるポリペプチド支持体９１、第１結合物質９２及び第１リンカー９４と同様である。
【００８４】
つぎに、検出工程が行なわれる〔図９（Ｄ）検出工程を参照〕。
【００８５】
かかる検出工程では、まず、ユーザーは、電解液を、検出チップ２０の試料注入口３０ｂより注入する。その後、ユーザーは、図１に示される検出装置１のチップ受入部１１に検出チップ２０を挿入する。そして、ユーザーは、検出装置１に測定開始を指示する。ここでは、検出装置１に挿入された検出チップ２０の電極リード７１，７２、７３は電流計１４や電源１５に接続される。そして、検出装置１の電源１５により、作用電極６１に電圧が印加される。これにより、標識物質１９３が励起され、光が生じる。標識物質１９３に基づく光の測定には、フォトンカウンタ等が用いられる。また、この場合、電極の代わりに、光ファイバーの先端に透明電極を形成することにより得られる光ファイバー電極を用いて間接的に検出することもできる（特許第２５７３４４３号公報を参照）。
【００８６】
その後、まず、Ａ／Ｄ変換部１６によってデジタル変換された光量の値が制御部１７に入力される。つぎに、予め作成された光量の値と被検物質量との関係を示す検量線に基づき、制御部１７により、デジタル変換後の電流値から、試料中の被検物質量が概算される。そして、概算された被検物質量の情報をディスプレイ１２に表示するための検出結果画面が、制御部１７によって作成される。その後、制御部１７によって作成された検出結果画面がディスプレイ１２に送信され、ディスプレイ１２に表示される。
【００８７】
なお、本実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法においても、夾雑物質に基づくノイズの発生を抑制する観点から、ユーザーは、被検物質捕捉工程後、検出チップ２０の試料注入口３０ｂより夾雑物質を含む残部の液体を排出し、検出チップ２０内を洗浄してもよい。検出チップ２０内の洗浄には、例えば、緩衝液（特に界面活性剤を含んだ緩衝液）；精製水（特に界面活性剤を含んだ精製水）；エタノール等の有機溶媒等を用いることができる。
【００８８】
また、本実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法では、被検物質Ｓに結合していない遊離の標識結合物質１９０を除去して、検出精度を向上させる観点から、標識工程の後、検出チップ２０内を洗浄し、遊離の標識結合物質１９０を除去する工程をさらに行なってもよい。かかる洗浄には、例えば、エタノール、精製水等を用いることができる。
【００８９】
さらに、本発明においては、標識工程において、標識物質１９３が予め結合されている標識結合物質１９０を用いて被検物質Ｓを標識する代わりに、図８に示されるように、標識工程中において、標識結合物質が形成されるように操作を行なってもよい。
【００９０】
また、図９（Ｄ）では、光を測定する場合を例として挙げて示しているが、標識物質１９３が電圧を印加することにより酸化還元電流を生じる標識物質である場合には、標識物質１９３が励起され、電子が発生する。そして、発生した電子は、作用電極６１に移動する。その結果、作用電極６１と対極６６との間に電流が流れる。そして、検出装置１の電流計１４により、作用電極６１と対極６６との間に流れる電流が測定される。電流計１４で測定された電流値は、標識物質の個数と相関している。したがって、測定された電流値に基づき、被検物質を定量することができる。
【実施例】
【００９１】
以下、実施例等により、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００９２】
（製造例１）
シランカップリング剤である３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）を、その濃度が１体積％となるようにトルエンに添加し、溶液Ａを得た。
【００９３】
（製造例２）
アセトニトリルとエチレンカーボネートとを体積比で２：３となるように混合し、非プロトン性極性溶媒を得た。前記非プロトン性極性溶媒に、電解質塩として、テトラプロピルアンモニウムヨーダイドをその濃度が０．６Ｍとなるように溶解させた。得られた溶液に、さらに電解質として、ヨウ素をその濃度が０．０６Ｍとなるように溶解させ、電解液を得た。
【００９４】
（製造例３）
スパッタリング法により、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）からなる基板本体上に、厚さ２００ｎｍの白金薄膜（導電層）からなる対極を形成し、対極基板を得た。前記対極部には電流計と接続するための対極リードを接続した。これにより、対極基板を得た。
【００９５】
（試験例１）
（１−１）ＤＮＡ結合フェリチンの作製
結合物質またはリンカーとして用いられるＤＮＡをポリペプチドからなる支持体であるフェリチンの外側に結合させるために馬フェリチンサブユニットを変異導入用キット〔ストラタジーン製、商品名：ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ〕を用いた遺伝子組み換え技術により外側に位置する８６番目のセリン残基をマレイミド基と反応性の高いシステイン残基に改変し、リコンビナントフェリチンサブユニットを得た。
【００９６】
つぎに、前記リコンビナントフェリチンサブユニットを自己会合させ、球殻状フェリチンを得た。得られた球殻状フェリチン〔図１１（Ｂ）中において、１１１参照〕と、マレイミド化ＤＮＡ〔（株）日本バイオサービス製、配列番号：１〕とを、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸含有２０ｍＭリン酸バッファー中、５０℃で結合させた。なお、前記マレイミド化ＤＮＡは、３’末端をマレイミド修飾された４１塩基のＤＮＡである。また、前記マレイミド化ＤＮＡは、標的となる被検物質ＳであるＣＫ１９ ＤＮＡ（配列番号：５）に相補的な配列〔図１０（Ａ）において、斜体字で示された配列〕と、後述の標識物質保持用ＤＮＡが結合する配列〔図１０（Ａ）において、太字で示された配列〕とを有している。
【００９７】
得られた産物をゲルろ過クロマトグラフィーに供し、ＤＮＡ結合フェリチンを精製した。ＤＮＡ結合フェリチン（結合体）〔図１１（Ｂ）において、１１０ａ〕は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、球殻状フェリチンに約１２個のＤＮＡが結合した構造を有していると推測された。なお、図１１においては、説明をわかりやすくするため、ＤＮＡ結合フェリチン１１０ａ（結合体）において、球殻状フェリチンに結合しているＤＮＡの一部を省略している。
【００９８】
（１−２）標識結合物質の作製
１×ＭＥＳハイブリダイゼーション溶液（アフィメトリックス社製）において、１００ｎＭ標識物質保持用ＤＮＡ〔北海道システムサイエンス（株）製、配列番号：２、図１０（Ｂ）、図１１（Ｃ）において、１１５参照〕と、１μＭ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ〔（株）日本バイオサービス製、配列番号：３、図１１（Ｃ）において、１１７参照〕とを４５℃で１時間インキュベーションし、標識体〔図１１（Ｃ）において、１１０ｂ参照〕を得た。
【００９９】
なお、標識物質保持用ＤＮＡ１１５は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ１１７にハイブリダイゼーションする配列〔図１０（Ｂ）において、下線が付された配列〕を６つ有している。また、標識物質保持用ＤＮＡ１１５は、３’末端に、ＤＮＡ結合フェリチン中のマレイミド化ＤＮＡにハイブリダイゼーションする配列〔図１０（Ｂ）において、斜体字で示された配列〕を１つ有している。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ１１７は、前記標識物質保持用ＤＮＡ１１５にハイブリダイゼーションする配列を有している〔図１０（Ｃ）参照〕。また、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ１１７に含まれるＤＮＡ（リンカー）〔図１１（Ｃ）において、１１６参照〕の両末端は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０（標識物質）〔図１１（Ｃ）において、１１３参照〕で標識されている。
【０１００】
（１−３）作用電極基板の作製
スパッタリング法により、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）からなる基板本体３０ａ上に、スズをドープした酸化インジウムの薄膜（厚さ２００ｎｍ）からなる作用電極を形成した。前記薄膜は、導電層と電子受容層とを兼ねている。つぎに、前記作用電極に、電流計と接続するための作用電極リードを接続した。
【０１０１】
つぎに、作用電極の表面を製造例１で得られた溶液Ａを接触させて作用電極の表面にアミノ基を付与した。
【０１０２】
１０μＭ ＣＫ１９ ＤＮＡ捕捉用ＤＮＡ（捕捉物質８１）〔配列番号：４、図１０（Ｄ）参照〕を含むＤＮＡ溶液と、クロスリンキング試薬〔ＧＥヘルスケア社製、商品名：ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ Ｄ〕とを体積比で１：９となるように混合した。得られた混合物を前記作用電極上に滴下した。その後、前記作用電極に紫外線（１６０ｍＪ）を照射してＣＫ１９ ＤＮＡ捕捉用ＤＮＡを作用電極上に固定した。これにより、作用電極基板を得た。
【０１０３】
（１−４）被検物質の捕捉
作用電極基板の作用電極の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。その後、この作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、ハイブリダイゼーションバッファー〔東洋紡績（株）製、商品名：Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｈｙｂ〕と被検物質Ｓとして１ｎＭ ＣＫ１９ ＤＮＡ〔（株）北海道システムサイエンス製、１５０塩基、配列番号：５〕とを入れた。前記作用電極基板を５８℃で２時間インキュベーションした。これにより、作用電極〔図１１（Ａ）において、６１参照〕上の捕捉物質〔図１１（Ａ）において、８１参照〕に、被検物質Ｓを捕捉させた〔図１１（Ａ）参照〕。
【０１０４】
作用電極６１を、０．１質量％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート（Ｔｗｅｅｎ−２０）含有６×ＳＳＰＥ〔１×ＳＳＰＥの組成：０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、０．１４９Ｍ塩化ナトリウム、０．００１Ｍ ＥＤＴＡ〕で洗浄した。その後、前記空間に、１×ＭＥＳハイブリダイゼーション溶液（アフィメトリックス社）と５０ｎＭ ＤＮＡ結合フェリチン（結合体）とを入れた。そして、前記作用電極基板（上基板３０）を４５℃で１時間インキュベーションした。これにより、作用電極６１上の捕捉物質８１に捕捉された被検物質ＳとＤＮＡ結合フェリチン１１０ａ（結合体）中に含まれるＤＮＡ（結合物質）〔図１１（Ｂ）において、１１２参照〕とをハイブリダイゼーションさせ、作用電極６１上に被検物質Ｓを捕捉した〔図１１（Ｂ）参照〕。ここで、被検物質Ｓは、ＤＮＡ結合フェリチン１１０ａ（結合体）中に含まれるＤＮＡ１１２（結合物質）の破線部分〔図１０（Ａ）において、斜体字で示された配列〕とハイブリダイゼーションする。
【０１０５】
つぎに、作用電極６１を０．１質量％Ｔｗｅｅｎ−２０含有６×ＳＳＰＥで洗浄した。その後、前記空間に、１×ＭＥＳハイブリダイゼーション溶液（アフィメトリックス社製）と、標識体１１０ｂとを入れた。そして、前記作用電極基板（上基板３０）を４５℃で１時間インキュベーションした。これにより、作用電極基板（上基板３０）の作用電極６１上に捕捉物質８１と被検物質ＳとＤＮＡ結合フェリチン１１０ａ（結合体）と標識体１１０ｂとを含む複合体が形成した〔図１１（Ｃ）参照〕（実施例１）。
【０１０６】
（２）対照実験
実施例１において、ＤＮＡ結合フェリチンの代わりに、１μＭ ＣＫ１９認識配列−標識保持用ＤＮＡ〔配列番号：６、図１０（Ｆ）、図１２中、１２０ａ参照〕を用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、作用電極基板（上基板３０）の作用電極６１上に捕捉物質８１と被検物質ＳとＣＫ１９認識配列−標識保持用ＤＮＡ１２０ａと標識体１１０ｂとを含む複合体が形成した〔図１２（Ｃ）参照〕（比較例１）。
【０１０７】
（３）光電流の測定
実施例１及び比較例１の各作用電極基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。そして、作用電極基板（上基板３０）とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例２で得られた電解液を充填した。そして、電解液が充填された空間を、作用電極基板の上方から、製造例３で得られた対極基板で密封した。これにより、作用電極及び対極を電解液に接触させた。つぎに、作用電極基板及び対極からなる検出チップを電気化学計測装置に設置し、作用電極リード及び対極リードを電流計に接続した。
【０１０８】
作用電極基板側から対極基板に向けて、光源（波長７８１ｎｍ、出力１３ｍＷのレーザー光源）から光を照射した。光照射により、標識物質が励起され、電子を生じる。そして、前記電子が作用電極に輸送されることにより、作用電極と対極との間に電流が流れる。そこで、この電流を測定した。試験例１において、検出方法の種類と光電流との関係を調べた結果を図１３に示す。
【０１０９】
図１３に示された結果から、標識物質を保持する支持体として、ポリペプチドからなる支持体であるフェリチンを用いた実施例１においては、検出された電流は約１３７ｎＡであることがわかる。これに対して、従来のように、標識物質を保持する支持体として、ポリペプチドからなる支持体を用いない比較例１では、約１７ｎＡであることがわかる。これらの結果から、標識物質を保持する支持体として、ポリペプチドからなる支持体を用いることにより、非常に大きな電流を検出することができることがわかる。
【０１１０】
（試験例２）
（１−１）ＤＮＡ結合ＢＳＡの作製
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（シグマ社製）をゲルろ過クロマトグラフィーで精製した。精製後のＢＳＡ〔図１５（Ｂ）において、１３１〕とクロスリンカー〔（株）同仁化学研究所製、商品名：ＧＭＢＳ〕とを反応させ、ＢＳＡの表面にマレイミド基を結合させた。得られたマレイミド修飾ＢＳＡ２．６ｎｍｏｌに対して、３’末端にチオール基を有するＣＫ１９認識用ＤＮＡ〔配列番号：７、２０塩基、図１４（Ａ）、図１５（Ｂ）において、１３２参照〕２．７ｎｍｏｌと、３’末端にチオール基を有する標識保持用ＤＮＡ結合ＤＮＡ〔配列番号：８、図１４（Ｂ）、図１５（Ｂ）において、１３４参照〕６．４ｎｍｏｌとを混合し、０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有リン酸バッファー（ｐＨ７）１００μＬ中、３７℃で２時間反応させた。得られた反応産物を、遠心式フィルター〔ミリポア社製、商品名：アミコンウルトラ−０．５ ３０Ｋカット〕で限外ろ過して未反応のＤＮＡを除去し、ＤＮＡ結合ＢＳＡ〔図１５（Ｂ）において、１３０ａ参照〕を得た。
【０１１１】
なお、ＣＫ１９認識用ＤＮＡは、被検物質ＳであるＣＫ１９ ＤＮＡ〔配列番号：５、図１４（Ｆ）〕に相補的な配列〔図１４（Ａ）において、太字で示された配列〕を有している。また、標識保持用ＤＮＡ結合ＤＮＡは、標識物質保持用ＤＮＡ〔配列番号：２、図１４（Ｃ）参照〕の結合部位〔図１４（Ｃ）において、斜体字で示された配列〕に相補的な配列〔図１４（Ｂ）において、太字で示された配列〕を有している。
【０１１２】
（１−２）標識体の作製
ハイブリダイゼーション溶液〔東洋紡績（株）製、商品名：ＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ〕中において、１００ｎＭ標識物質保持用ＤＮＡ（第２結合物質）〔北海道システムサイエンス（株）製、配列番号：２、図１４（Ｃ）、図１５（Ｃ）において、１３５参照〕と、１μＭ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ〔（株）日本バイオサービス製、配列番号：３、図１４（Ｄ）、図１５（Ｃ）において、１３７参照〕とを６０℃で１時間インキュベーションし、標識体〔図１５（Ｃ）において、１３０ｂ参照〕を得た。標識体１３０ｂは、標識物質１３３とＤＮＡ１３６とからなるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ１３７と、標識物質保持用ＤＮＡ１３５とからなる。
【０１１３】
（１−３）被検物質の捕捉
試験例１の（１−３）と同様にして得られた作用電極基板（上基板３０）の作用電極６１の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。なお、かかる作用電極基板（上基板３０）の作用電極６１上には、ＣＫ１９ ＤＮＡ捕捉用ＤＮＡ（捕捉物質８１）〔図１４（Ｅ）参照、配列番号：４〕が固定化されている。
【０１１４】
その後、この作用電極基板（上基板３０）とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、ハイブリダイゼーションバッファー〔東洋紡績（株）製、商品名：Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｈｙｂ〕と被検物質Ｓとして１ｎＭ ＣＫ１９ ＤＮＡ〔（株）北海道システムサイエンス製、配列番号：５、１５０塩基、図１４（Ｆ）参照〕とを入れた。前記作用電極基板（上基板３０）を６０℃で２時間インキュベーションした。これにより、作用電極６１上の捕捉物質８１に、被検物質Ｓを捕捉させた〔図１５（Ａ）参照〕。
【０１１５】
前記反応溶液の排出後、前記空間に、ハイブリダイゼーションバッファー〔東洋紡績（株）製、商品名：Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｈｙｂ〕と５０ｎＭ ＤＮＡ結合ＢＳＡ（結合体）〔図１５（Ｂ）において、１３０ａ参照〕とを入れた。そして、前記作用電極基板（上基板３０）を６０℃で１時間インキュベーションした。これにより、作用電極６１上の捕捉物質８１に捕捉された被検物質ＳとＤＮＡ結合ＢＳＡ１３０ａ（結合体）中に含まれるＣＫ１９認識用ＤＮＡ１３２（第１結合物質）とをハイブリダイゼーションさせ、作用電極６１上に被検物質Ｓを捕捉した〔図１５（Ｂ）参照〕。
【０１１６】
前記反応溶液の排出後、前記空間に、ハイブリダイゼーションバッファー〔東洋紡績（株）製、商品名：Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｈｙｂ〕と、標識体１３０ｂとを入れた。そして、前記作用電極基板（上基板３０）を６０℃、１時間インキュベーションし、標識体１３０ｂ中の標識物質保持用ＤＮＡ１３５（第２結合物質）と、捕捉物質８１及び被検物質Ｓを介して作用電極６１上に固定化されたＤＮＡ結合ＢＳＡ１３０ａ（結合体）中に含まれる標識保持用ＤＮＡ結合ＤＮＡ（第１リンカー）〔図１５（Ｂ）において１３４参照〕とをハイブリダイゼーションさせた。これにより、作用電極基板（上基板３０）の作用電極６１上に捕捉物質８１と被検物質ＳとＤＮＡ結合ＢＳＡ１３０ａ（結合体）と標識体１３０ｂとを含む複合体が形成した〔図１５（Ｃ）参照〕（実施例２）。なお、標識保持用ＤＮＡ結合ＤＮＡ１３４（第１リンカー）は、標識物質保持用ＤＮＡ１３５（第２結合物質）の３’末端側の領域〔図１４（Ｃ）において、斜体字で示された配列〕と結合する。
【０１１７】
（２）対照実験
実施例２において、ＤＮＡ結合ＢＳＡの代わりに、１μＭ ＣＫ１９認識配列−標識保持用ＤＮＡ〔配列番号：６、図１４（Ｇ）、図１６において、１４０ａ参照〕を用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、作用電極基板（上基板３０）の作用電極６１上に捕捉物質８１と被検物質ＳとＣＫ１９認識配列−標識保持用ＤＮＡ１４０ａと標識体１３０ｂとを含む複合体が形成した〔図１６（Ｃ）参照〕（比較例２）。
【０１１８】
（３）光電流の測定
実施例２及び比較例２の各作用電極基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。そして、作用電極基板（上基板３０）とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例２で得られた電解液を充填した。そして、電解液が充填された空間を、作用電極基板の上方から、製造例３で得られた対極基板で密封した。これにより、作用電極及び対極を電解液に接触させた。つぎに、作用電極基板及び対極からなる検出チップを電気化学計測装置に設置し、作用電極リード及び対極リードを電流計に接続した。
【０１１９】
作用電極基板側から対極基板に向けて、光源（波長７８１ｎｍ、出力１３ｍＷのレーザー光源）から光を照射した。光照射により、標識物質が励起され、電子を生じる。そして、前記電子が作用電極に輸送されることにより、作用電極と対極との間に電流が流れる。そこで、この電流を測定した。試験例２において、検出方法の種類と光電流との関係を調べた結果を図１７に示す。
【０１２０】
図１７に示された結果から、標識物質を保持する支持体として、ポリペプチドからなる支持体であるＢＳＡを用いた実施例１においては、検出された電流は約２１８．２ｎＡであることがわかる。これに対して、従来のように、標識物質を保持する支持体として、ポリペプチドからなる支持体を用いない比較例１では、約５．８ｎＡであることがわかる。これらの結果から、標識物質を保持する支持体として、ポリペプチドからなる支持体を用いることにより、非常に大きな電流を検出することができることがわかる。
【０１２１】
（試験例３）
（１−１）ＤＮＡ結合ＢＳＡの作製
ＢＳＡ（シグマ社製）をゲルろ過クロマトグラフィーで精製した。精製後のＢＳＡ〔図１９（Ｂ）において、１５１参照〕とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０誘導体（インビトロジェン社製、商品名：ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ，ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ）とを、０．１Ｍ 炭酸ナトリウム（ｐＨ８．５）中、室温で１時間反応させた。得られた反応産物を、脱塩カラム（ピアース社製、商品名：Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｍｉｃｒｏ ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ）で濾過して未反応のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０誘導体を除去し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＢＳＡを得た。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＢＳＡは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるバンドシフトと吸収スペクトルとから、ＢＳＡに約１０個のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０誘導体が結合した構造を有していると推測された。前記複合体とクロスリンカー〔（株）同仁化学研究所製、商品名：ＧＭＢＳ〕とを反応させ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＢＳＡの表面にマレイミド基を結合させた。
【０１２２】
得られた反応産物を脱塩カラムで精製して未反応のクロスリンカーを除去した。その後、得られたマレイミド修飾ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＢＳＡ１ｎｍｏｌと、３’末端にチオール基を有するＣＫ１９認識用ＤＮＡ〔配列番号：７、２０塩基、図１８（Ａ）参照〕２ｎｍｏｌとを混合し、０．１５Ｍ 塩化ナトリウム含有リン酸バッファー（ｐＨ７）５０μＬ中、３７℃で３時間反応させた。得られた反応産物を、遠心式フィルター〔ミリポア社製、商品名：アミコンウルトラ−０．５ ３０Ｋカット〕で限外ろ過して未反応のＤＮＡを除去し、ＤＮＡ結合ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＢＳＡを得た。
【０１２３】
（１−２）被検物質の捕捉
試験例１の（１−３）と同様にして得られた作用電極基板（上基板３０）の作用電極６１の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。なお、かかる作用電極基板（上基板３０）の作用電極６１上には、ＣＫ１９ ＤＮＡ捕捉用ＤＮＡ（捕捉物質８１）〔配列番号：４、図１８（Ｃ）〕が固定化されている。
【０１２４】
その後、この作用電極基板（上基板３０）とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、ハイブリダイゼーションバッファー〔東洋紡績（株）製、商品名：Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｈｙｂ〕と被検物質Ｓとして１ｎＭ ＣＫ１９ ＤＮＡ〔（株）北海道システムサイエンス製、１５０塩基、配列番号：５、図１８（Ｄ）参照〕とを入れた。前記作用電極基板（上基板３０）を６０℃で２時間インキュベーションした。これにより、作用電極６１上の捕捉物質８１に、被検物質Ｓを捕捉させた〔図１９（Ａ）参照〕。
【０１２５】
前記反応溶液の排出後、前記空間に、ハイブリダイゼーションバッファー〔東洋紡績（株）製、商品名：Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｈｙｂ〕と１００ｎＭ ＤＮＡ結合ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＢＳＡ（標識結合物質）〔図１９（Ｂ）において、１５０参照〕とを入れた。そして、前記作用電極基板（上基板３０）を６０℃、１時間インキュベーションした。これにより、作用電極６１上の捕捉物質８１に捕捉された被検物質ＳとＤＮＡ結合ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＢＳＡ１５０中に含まれるＤＮＡ１５２（結合物質）とをハイブリダイゼーションさせた〔図１９（Ｂ）参照〕。その後、作用電極６１を０．１質量％Ｔｗｅｅｎ−２０含有６×ＳＳＰＥで洗浄した（実施例３）。
【０１２６】
（２）対照実験
実施例３において、ＤＮＡ結合ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＢＳＡ１５０の代わりに、１００ｎＭ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＣＫ１９認識ＤＮＡ〔（株）日本バイオサービス製、配列番号：９、図１８（Ｂ）、図２０（Ｂ）において、１６０参照〕を用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、作用電極基板（上基板３０）の作用電極６１上に捕捉物質８１と被検物質ＳとＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＣＫ１９認識ＤＮＡ１６０とを含む複合体を形成した〔図２０（Ｂ）参照〕（比較例３）。なお、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＣＫ１９認識ＤＮＡ１６０は、ＣＫ１９認識ＤＮＡ〔図２０（Ｂ）において、１６２参照〕の両末端にＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０〔図２０（Ｂ）において、１６１参照〕を有している。
【０１２７】
（３）光電流の測定
実施例３及び比較例３の各作用電極基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。そして、作用電極基板（上基板３０）とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例２で得られた電解液を充填した。そして、電解液が充填された空間を、作用電極基板の上方から、製造例３で得られた対極基板で密封した。これにより、作用電極及び対極を電解液に接触させた。つぎに、作用電極基板及び対極からなる検出チップを電気化学計測装置に設置し、作用電極リード及び対極リードを電流計に接続した。
【０１２８】
作用電極基板側から対極基板に向けて、光源（波長７８１ｎｍ、出力１３ｍＷのレーザー光源）から光を照射した。光照射により、標識物質が励起され、電子を生じる。そして、前記電子が作用電極に輸送されることにより、作用電極と対極との間に電流が流れる。そこで、この電流を測定した。試験例３において、検出方法の種類と光電流との関係を調べた結果を図２１に示す。
【０１２９】
図２１に示された結果から、標識物質を保持する支持体として、ポリペプチドからなる支持体であるＢＳＡを用いた実施例３においては、検出された電流は約１０ｎＡであることがわかる。これに対して、従来のように、標識物質を保持する支持体として、ポリペプチドからなる支持体を用いない比較例３では、約２．０ｎＡであることがわかる。これらの結果から、標識物質を保持する支持体として、ポリペプチドからなる支持体を用いた被検物質の電気化学的検出方法によれば、ポリペプチドからなる支持体を用いない被検物質の電気化学的検出方法と比べて、約５倍の非常に大きな電流を検出することができることがわかる。
【０１３０】
なお、前述したように、ＤＮＡ結合ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＢＳＡ１５０において、ＢＳＡに付加されたＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０の数は、約１０個であるのに対して、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＣＫ１９認識ＤＮＡにおいて、ＤＮＡに付加されたＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０の数は２個である。したがって、検出される電流値は標識数に比例することから、ポリペプチドからなる支持体を用いた被検物質の電気化学的検出方法によれば、被検物質を定量することができることが示唆される。
【符号の説明】
【０１３１】
１ 検出装置
１１ チップ受入部
１２ ディスプレイ
１３ 光源
１４ 電流計
１５ 電源
１６ 変換部
１７ 制御部
２０ 検出チップ
３０ 上基板
３０ａ 基板本体
３０ｂ 試料注入口
４０ 下基板
４０ａ 基板本体
５０ 間隔保持部材
６１ 作用電極
６６ 対極
６９ 参照電極
７１ 電極リード
７２ 電極リード
７３ 電極リード
８１ 捕捉物質
９０ 標識結合物質
９０ａ 結合体
９０ｂ 標識体
９１ ポリペプチド支持体
９２ 第１結合物質
９３ 標識物質
９４ 第１リンカー
９５ 第２結合物質
９６ 第２リンカー
１０２ 標識物質
１０３ 結合物質
１１０ａ ＤＮＡ結合フェリチン
１１０ｂ 標識体
１１１ 球殻状フェリチン
１１２ ＤＮＡ
１１３ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０
１１５ 標識物質保持用ＤＮＡ
１１６ ＤＮＡ
１１７ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ
１２０ａ ＣＫ１９認識配列−標識保持用ＤＮＡ
１３０ａ ＤＮＡ結合ＢＳＡ
１３０ｂ 標識体
１３１ ＢＳＡ
１３２ ＣＫ１９認識用ＤＮＡ
１３３ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０
１３４ 標識保持用ＤＮＡ結合ＤＮＡ
１３５ 標識物質保持用ＤＮＡ
１３６ ＤＮＡ
１３７ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ
１４０ａ ＣＫ１９認識配列−標識保持用ＤＮＡ
１５０ ＤＮＡ結合ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＢＳＡ
１５２ ＤＮＡ
１５１ ＢＳＡ
１６０ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＣＫ１９認識ＤＮＡ
１６１ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０
１６２ ＣＫ１９認識ＤＮＡ
Ｓ 被検物質
【配列表フリーテキスト】
【０１３２】
配列番号：１は、マレイミド化ＤＮＡの配列である。
配列番号：２は、標識物質保持用ＤＮＡの配列である。
配列番号：３は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡの配列である。
配列番号：４は、ＣＫ１９ ＤＮＡ捕捉用ＤＮＡの配列である。
配列番号：５は、ＣＫ１９ ＤＮＡの配列である。
配列番号：６は、ＣＫ１９認識配列−標識保持用ＤＮＡの配列である。
配列番号：７は、ＣＫ１９認識用ＤＮＡの配列である。
配列番号：８は、標識保持用ＤＮＡ結合ＤＮＡの配列である。
配列番号：９は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＣＫ１９認識ＤＮＡの配列である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検物質の電気化学的検出方法に関する。より詳しくは、核酸、タンパク質等の被検物質の検出や定量等や、これらを利用する疾病の臨床検査、診断等に有用な、被検物質の電気化学的検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
疾病の臨床検査や診断は、生体試料中に含まれる前記疾病に関連する遺伝子やタンパク質等を、遺伝子検出法や免疫学的検出法等の検出法によって検出することにより行なわれている。かかる臨床検査や診断を行なうための方法として、光化学的に活性な標識物質を光励起させることにより生じる光電流を、核酸、タンパク質等の被検物質の検出に利用する光化学的検出方法が提案されている。ここで、臨床検査や診断では、検体に含まれる微量な被検物質を検出する必要があるため、被検物質の検出感度の向上が求められている。
【０００３】
例えば、特許文献１の段落番号［００６９］〜［００７８］には、被検物質であるタンパク質を特異的に認識する捕捉物質である抗体が表面に固定化された電極と、電気化学的に活性な標識物質により結合物質である抗体が標識された標識抗体とを用いる光電流による被検物質の特異的検出法が開示されている。前記特許文献１に記載の方法では、まず、被検物質と電極上の抗体とを接触させ、前記抗体によって被検物質を電極上に捕捉する。その後、電極上に捕捉された被検物質と、標識抗体とを接触させて複合体を形成させる。そして、標識抗体中の標識物質に基づく光電流を測定することにより、被検物質が検出される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０２４４４６号、段落番号［００６９］〜［００７８］
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１に記載のように、支持体を介さないで、標識物質で直接的に結合物質を標識した場合、結合物質に結合させることができる標識物質の数に限度がある。そのため、特許文献１に記載の方法では、１つの被検物質あたりの標識物質の数を限度以上に増やすことができず、高感度化するのは困難である。
【０００６】
本発明は、前述の事情に鑑みてなされたものであり、高い検出感度で被検物質を検出することができる被検物質の電気化学的検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、被検物質を電気化学的に検出する方法において、被検物質の検出に用いられる標識物質を、ポリペプチドからなる支持体を介して前記結合物質に結合させることで、検出感度を著しく向上させることができ、上記の課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、
〔１〕 被検物質を電気化学的に検出する方法であって、
（１） 被検物質を含む試料を、この被検物質を捕捉する捕捉物質が固定された作用電極に接触させ、前記捕捉物質によって被検物質を作用電極上に捕捉する工程、
（２） 前記工程（１）で作用電極上に捕捉された被検物質と、標識物質と前記被検物質を捕捉する結合物質とがポリペプチドからなる支持体に少なくとも保持された標識結合物質とを含む複合体を形成させる工程、及び
（３） 前記工程（２）で得られた作用電極上に存在する標識物質を電気化学的に検出する工程、
を含む被検物質の電気化学的検出方法、
〔２〕 前記工程（２）において、前記標識結合物質を、前記工程（１）で作用電極上捕捉された被検物質に接触させ、前記複合体を形成させる前記〔１〕に記載の方法、
〔３〕 前記工程（２）において、前記被検物質を捕捉する結合物質がポリペプチドからなる支持体に少なくとも保持され、かつ標識物質を結合する結合体を、前記工程（１）で作用電極上に捕捉された被検物質に接触させ、その後、被検物質に結合した前記結合体に、標識物質を結合させて、前記被検物質と、標識物質と前記被検物質を捕捉する結合物質とがポリペプチドからなる支持体に少なくとも保持された標識結合物質とを含む複合体を形成させる前記〔１〕に記載の方法、
〔４〕 前記ポリペプチドがアルブミン又はフェリチンである前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法、
〔５〕 前記標識結合物質中のポリペプチドからなる支持体と標識物質とがリンカーを介して連結されている前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法、並びに
〔６〕 前記標識物質が、光化学的又は電気化学的に活性な物質である前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の被検物質の電気化学的検出方法によれば、高い検出感度で、被検物質を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いる検出装置を示す斜視図である。
【図２】図１に示される検出装置の構成を示すブロック図である。
【図３】本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いる検出チップを示す斜視図である。
【図４】（Ａ）は図３に示される検出チップのＡＡ線での断面図である。（Ｂ）は図３に示される検出チップの上基板を下面側から見た斜視図である。（Ｃ）は図３に示される検出チップの下基板を上面側から見た斜視図である。
【図５】本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いる検出チップ中の電極を含む部分の一例を模式的に表した断面説明図である。
【図６】本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法の処理手順を示す工程説明図である。
【図７】従来の被検物質の電気化学的検出方法における検出工程を示す概略説明図である。
【図８】本発明の他の実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法の処理手順を示す工程説明図である。
【図９】本発明のさらに他の実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法の処理手順を示す工程説明図である。
【図１０】試験例１に用いられたＤＮＡを示す概略説明図である。
【図１１】試験例１における被検物質の電気化学的検出方法（実施例１）の操作手順を示す概略説明図である。
【図１２】試験例１における被検物質の電気化学的検出方法（比較例１）の操作手順を示す概略説明図である。
【図１３】試験例１において、検出方法の種類と光電流との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図１４】試験例２に用いられたＤＮＡを示す概略説明図である。
【図１５】試験例２における被検物質の電気化学的検出方法（実施例２）の操作手順を示す概略説明図である。
【図１６】試験例２における被検物質の電気化学的検出方法（比較例２）の操作手順を示す概略説明図である。
【図１７】試験例２において、検出方法の種類と光電流との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図１８】試験例３に用いられたＤＮＡを示す概略説明図である。
【図１９】試験例３における被検物質の電気化学的検出方法（実施例３）の操作手順を示す概略説明図である。
【図２０】試験例３における被検物質の電気化学的検出方法（比較例３）の操作手順を示す概略説明図である。
【図２１】試験例３において、検出方法の種類と光電流との関係を調べた結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［検出装置の構成］
本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いる検出装置の一例を添付図面により説明する。
図１は、本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いる検出装置を示す斜視図である。この検出装置１は、光化学的に活性な物質を標識物質として用いる検出方法に用いる検出装置である。
【００１２】
検出装置１は、検出チップ２０が挿入されるチップ受入部１１と、検出結果を表示するディスプレイ１２とを備えている。
【００１３】
図２は、図１に示される検出装置の構成を示すブロック図である。検出装置１は、光源１３と、電流計１４と、電源１５と、Ａ／Ｄ変換部１６と、制御部１７と、ディスプレイ１２とを備えている。
光源１３は、検出チップ２０の作用電極上に存在させた標識物質に光を照射して当該標識物質を励起させる。光源１３は、励起光を発生する光源であればよい。かかる光源としては、例えば、蛍光灯、ブラックライト、殺菌ランプ、白熱電球、低圧水銀ランプ、高圧水銀ランプ、キセノンランプ、水銀−キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、ＬＥＤ（白色ＬＥＤ、青色ＬＥＤ、緑色ＬＥＤ、赤色ＬＥＤ等）、レーザー（炭酸ガスレーザー、色素レーザー、半導体レーザー）、太陽光等が挙げられる。前記光源のなかでは、蛍光灯、白熱電球、キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、ＬＥＤ、レーザー又は太陽光が好ましい。前記光源のなかでは、レーザーがより好ましい。前記光源は、必要に応じて、分光器やバンドパスフィルタにより、特定波長領域の光のみが放出されるものであってもよい。
電流計１４は、励起された標識物質から放出される電子に起因して検出チップ２０内を流れる電流を測定する。
電源１５は、検出チップ２０に設けられた電極に対して所定の電位を印加する。
Ａ／Ｄ変換部１６は、電流計１４によって測定された光電流値をデジタル変換する。
制御部１７は、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ等から構成されている。この制御部１７は、ディスプレイ１２、光源１３、電流計１４及び電源１５の動作を制御する。また、制御部１７は、Ａ／Ｄ変換部１６でデジタル変換された光電流値から、予め作成された光電流値と標識物質の量との関係を示す検量線に基づき、標識物質の量を概算し、被検物質の量を算出する。
ディスプレイ１２は、制御部１７で概算された被検物質の量等の情報を表示する。
【００１４】
なお、前記標識物質を後述の酸化還元電流・電気化学発光検出法にしたがって検出する場合、検出装置は、光源１３を備えていなくてもよい（図示せず）。
前記標識物質を電気化学発光により検出する場合、検出装置は、標識物質から生じる光などを検出するためのセンサをさらに備えていればよい。
【００１５】
［検出チップの構成］
つぎに、本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いる検出チップ２０の構成を説明する。
【００１６】
図３は、本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いる検出チップを示す斜視図である。図４（Ａ）は図３に示される検出チップのＡＡ線での断面図、図４（Ｂ）は図３に示される検出チップの上基板を下面側から見た斜視図、図４（Ｃ）は図３に示される検出チップの下基板を上面側から見た斜視図である。
【００１７】
検出チップ２０は、上基板３０と、上基板３０の下方に設けられた下基板４０と、上基板３０と下基板４０とに挟まれた間隔保持部材５０とを備えている。検出チップ２０では、上基板３０と下基板４０とは、一側部において重複して配置されている。そして、上基板３０と下基板４０とが重複する部分には、間隔保持部材５０が介在している。
【００１８】
上基板３０は、図４（Ｂ）に示されるように、基板本体３０ａと、作用電極６１とを備えている。この基板本体３０ａには、被検物質を含む試料等を内部に注入するための試料注入口３０ｂが設けられている。また、基板本体３０ａの表面には、作用電極６１と、この作用電極６１に接続されている電極リード７１とが形成されている。上基板３０においては、作用電極６１は、基板本体３０ａの一側部〔図４（Ｂ）の左側〕に配置されている。電極リード７１は、作用電極６１から基板本体３０ａの他側部〔図４（Ｂ）の右側〕に向けて延びている。試料注入口３０ｂは、基板本体３０ａにおいて、間隔保持部材５０が介装される部分よりも内側に設けられている。
【００１９】
基板本体３０ａは、矩形状に形成されている。なお、かかる基板本体３０ａの形状は、特に限定されるものではなく、多角形形状、円盤状等であってもよい。基板の作製及び取り扱いの簡便性の観点から、好ましくは矩形状である。
【００２０】
基板本体３０ａを構成する材料としては、特に限定されないが、例えば、ガラス、ポリエチレンテレフタレート、ポリイミド樹脂等のプラスチック類、金属等の無機材料等が挙げられる。これらのなかでは、光の透過性、十分な耐熱性、耐久性、平滑性等を確保し、かつ材料に要するコストを低減させる観点から、好ましくはガラスである。基板本体３０ａの厚さは、十分な耐久性を確保する観点から、好ましくは０．０１〜１ｍｍ、より好ましくは０．１〜０．７ｍｍ、さらに好ましくは約０．５ｍｍである。また、基板本体３０ａの大きさは、特に限定されないが、多種類の被検物質の検出（多項目）を前提とした場合には項目数によるが、通常、２０ｍｍ×２０ｍｍ程度の大きさである。
【００２１】
下基板４０は、図４（Ｃ）に示されるように、基板本体４０ａと、対極６６と、参照電極６９とを備えている。基板本体４０ａは、上基板３０の基板本体３０ａと略同寸法の矩形状に形成されている。基板本体４０ａ及び基板本体３０ａは、必ずしも、同寸法である必要はない。
【００２２】
基板本体４０ａを構成する材料としては、特に限定されないが、例えば、ガラス、ポリエチレンテレフタレート、ポリイミド樹脂等のプラスチック類、金属等の無機材料等が挙げられる。これらのなかでは、十分な光の透過性、耐熱性、耐久性、平滑性等を確保し、かつ材料に要するコストを低減させる観点から、好ましくはガラスである。基板本体４０ａの厚さ及び大きさは、前記上基板３０の基板本体３０ａを構成する材料、基板本体３０ａの厚さ及び大きさと同様である。
【００２３】
基板本体４０ａの表面には、対極６６と、この対極６６に接続された電極リード７２と、参照電極６９と、この参照電極６９に接続された電極リード７３とが形成されている。下基板４０においては、対極６６は、基板本体４０ａの一側部〔図４（Ｃ）の右側〕に配置されている。対極６６の電極リード７２と参照電極６９の電極リード７３とは、それぞれ、基板本体４０ａの一側部〔図４（Ｃ）の右側〕から他側部〔図４（Ｃ）の左側〕へ向けて延びている。対極６６及び参照電極６９の各電極リード７２，７３は、基板本体４０ａの他側部〔図４（Ｃ）の左側〕において互いに並列するように配置されている。また、電極リード７２，７３は、上基板３０と下基板４０とが重複する部分からはみ出して外部に露出している〔図３及び図４（Ａ）参照〕。なお、基板本体３０ａ及び基板本体４０ａは、当該基板本体を透過させるようにして光を照射する場合には、透過性を有する材料から構成された基板本体であることが望ましい。この場合、基板本体３０ａ及び基板本体４０ａのうち、光を照射する側の基板本体が、透過性を有する材料から構成されていればよい。
【００２４】
つぎに、作用電極６１、対極６６及び参照電極６９について、詳細に説明する。
図５は、本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いる検出チップ中の電極を含む部分の一例を模式的に表した断面説明図である。作用電極６１は、ほぼ四角形状に形成されている。作用電極６１は、図５に示されるように、基板本体３０ａ上に形成された作用電極６１と、この作用電極６１上に固定化された捕捉物質８１とから構成されている。作用電極６１には、電極リード７１が接続されている。
【００２５】
後述の光電気化学検出法に用いる検出チップにおいては、作用電極６１は、励起光が照射されることにより被検物質から生じた電子を受容する半導体からなる。この半導体は、導電体及び電子受容体として機能する。前記半導体は、光励起により被検物質から生じた電子の注入が可能なエネルギー準位をとり得る物質であればよい。ここで、「光励起により被検物質から生じた電子の注入が可能なエネルギー準位」とは、伝導帯（コンダクションバンド）を意味する。すなわち、半導体は、後述の標識物質の最低非占有分子軌道（ＬＵＭＯ）のエネルギー準位よりも低いエネルギー順位を有すればよい。かかる半導体としては、特に限定されないが、例えば、シリコン、ゲルマニウム等の単体半導体；チタン、スズ、亜鉛、鉄、タングステン、ジルコニウム、ハフニウム、ストロンチウム、インジウム、セリウム、イットリウム、ランタン、バナジウム、ニオブ、タンタル等の酸化物を含む酸化物半導体；チタン酸ストロンチウム、チタン酸カルシウム、チタン酸ナトリウム、チタン酸バナジウム、ニオブ酸カリウム等のペロブスカイト型半導体；カドニウム、亜鉛、鉛、銀、アンチモン、ビスマス等の硫化物を含む硫化物半導体；ガリウム、チタン等の窒化物を含む半導体；カドミウム、鉛のセレン化物からなる半導体（例えば、カドミウムセレナイド等）；カドミウムのテルル化物を含む半導体；亜鉛、ガリウム、インジウム、カドミウム等のリン化合物からなる半導体；ガリウム砒素、銅−インジウム−セレン化物、銅−インジウム−硫化物等の化合物を含む半導体；カーボン等の化合物半導体又は有機物半導体等が挙げられる。なお、前記半導体は、真性半導体及び不純物半導体のいずれであってもよい。これらのなかでは、酸化物半導体が好ましい。前記酸化物半導体のうち、真性半導体のなかでは、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化スズ、酸化ニオブ、酸化インジウム、酸化タングステン、酸化タンタル及びチタン酸ストロンチウムが好ましい。また、前記酸化物半導体のうち、不純物半導体のなかでは、スズをドーパントとして含む酸化インジウム（ＩＴＯ）及びフッ素をドーパントとして含む酸化スズ（ＦＴＯ）が好ましい。作用電極の厚さは、通常、０．１〜１μｍ、好ましくは０．１〜２００ｎｍ、より好ましくは０．１〜１０ｎｍである。
【００２６】
さらに、本発明においては、後述の光電気化学検出法に用いる検出チップにおける作用電極６１は、半導体層と導電層とから構成されていてもよい。この場合、作用電極６１の電極リード７１は、導電層に接続される。
前記半導体層を構成する半導体は、前記と同様である。この場合の半導体層の厚さは、好ましくは０．１〜１００ｎｍ、さらに好ましくは０．１〜１０ｎｍである。
前記導電層は、導電性材料からなる。前記導電性材料としては、例えば、金、銀、銅、カーボン、白金、パラジウム、クロム、アルミニウム、ニッケル等の金属又はこれらの少なくとも１つを含む合金；酸化インジウム、スズをドーパントとして含む酸化インジウム（ＩＴＯ）等の酸化インジウム系材料；酸化スズ、アンチモンをドーパントとして含む酸化スズ（ＡＴＯ）、フッ素をドーパントとして含む酸化スズ（ＦＴＯ）等の酸化スズ系材料；チタン、酸化チタン、窒化チタン等のチタン系材料；グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カーボンペースト、カーボンファイバー等の炭素系材料等が挙げられる。導電層の厚さは、好ましくは１〜１０００ｎｍ、さらに好ましくは１〜２００ｎｍ、さらに好ましくは１〜１００ｎｍである。導電性が確保でき、かつ電極から生じる光電流（バックグランド電流）が最小となる膜厚が望ましい。なお、導電性材料は、ガラス、プラスチック等の非導電性物質からなる非導電性基材の表面に導電性を有する材料からなる導電材層が設けられた複合基材であってもよい。かかる導電材層の形状は、薄膜状及びスポット状のいずれであってもよい。導電材層を構成する材料としては、例えば、スズをドーパントとして含む酸化インジウム（ＩＴＯ）、アンチモンをドーパントとして含む酸化スズ（ＡＴＯ）、フッ素をドーパントとして含む酸化スズ（ＦＴＯ）等が挙げられる。導電層は、例えば、当該導電層を構成する材料の種類に応じた膜形成方法により形成させることができる。
【００２７】
一方、後述の酸化還元電流・電気化学発光検出方法に用いる検出チップにおいては、作用電極６１は、導電性材料からなる。
前記導電性材料は、前記光電気化学検出法に用いる検出チップにおける作用電極６１の導電層に用いられる導電性材料と同様である。
さらに、導電性材料は、ガラス、プラスチックなどの非導電性物質からなる非導電性基材の表面に導電性を有する材料からなる導電材層が設けられた複合基材であってもよい。かかる導電材層の形状は、薄膜状およびスポット状のいずれであってもよい。
この場合、作用電極６１の厚さは、好ましくは１〜１０００ｎｍ、さらに好ましくは１０〜２００ｎｍである。
【００２８】
作用電極６１の表面には、捕捉物質８１が固定化されている〔図５参照〕。かかる捕捉物質８１は、被検物質を捕捉する物質である。これにより、被検物質を作用電極６１の近傍に存在させることができるようになっている。捕捉物質８１は、被検物質の種類に応じて、適宜選択することができる。前記捕捉物質８１としては、例えば、核酸、タンパク質、ペプチド、糖鎖、抗体、特異的な認識能を持つナノ構造体等が挙げられる。
【００２９】
対極６６は、図５に示されるように、基板本体４０ａ上に形成されている。この対極６６は、導電性材料からなる薄膜からなる。前記導電性材料としては、例えば、金、銀、銅、カーボン、白金、パラジウム、クロム、アルミニウム、ニッケル等の金属又はこれらの少なくとも１つを含む合金、ＩＴＯ、酸化インジウム等の導電性セラミックス、ＡＴＯ、ＦＴＯ等の金属酸化物、チタン、酸化チタン、窒化チタン等のチタン化合物等が挙げられる。前記薄膜の厚さは、好ましくは１〜１０００ｎｍ、より好ましくは１０〜２００ｎｍである。
【００３０】
参照電極６９は、図５に示されるように、基板本体４０ａ上に形成されている。この参照電極６９は、導電性材料からなる薄膜からなる。前記導電性材料としては、例えば、金、銀、銅、カーボン、白金、パラジウム、クロム、アルミニウム、ニッケル等の金属又はこれらの少なくとも１つを含む合金、ＩＴＯ、酸化インジウム等の導電性セラミックス、ＡＴＯ、ＦＴＯ等の金属酸化物、チタン、酸化チタン、窒化チタン等のチタン化合物等が挙げられる。前記薄膜の厚さは、好ましくは１〜１０００ｎｍ、より好ましくは１０〜２００ｎｍである。なお、本実施の形態では、参照電極６９を設けているが、本発明においては、参照電極６９を設けなくてもよい。対極６６に用いる電極の種類、膜厚にもよるが、電圧降下の影響が僅かな小さな電流（例えば、１μＡ以下）を測定する場合は、対極６６が参照電極６９を兼ねていてもよい。一方、大きな電流を測定する場合、電圧降下の影響を抑制し、作用電極６１に印加する電圧を安定化させる観点から、参照電極６９を設けることが好ましい。
【００３１】
つぎに、間隔保持部材５０について、説明する。間隔保持部材５０は、矩形の環状体形状に形成され、絶縁体であるシリコーンゴムからなっている。この間隔保持部材５０は、作用電極６１、対極６６及び参照電極６９を取り囲むように配置されている〔図４（Ａ）、図５参照〕。上基板３０と下基板４０との間には間隔保持部材５０の厚さに相当する間隔が形成されている。これにより、各電極６１，６６，６９の間には試料や電解液を収容するための空間２０ａが形成されている〔図４（Ａ）及び図５参照〕。間隔保持部材５０の厚さは、通常、０．２〜３００μｍである。本発明においては、間隔保持部材５０を構成する材料として、シリコーンゴムの代わりに、例えば、ポリエステルフィルム等のプラスチック製両面テープ等を用いることもできる。
【００３２】
また、本発明においては、作用電極６１、対極６６及び参照電極６９は、各電極が他の電極と接触しないように間隔保持部材５０の枠内に配置されていればよい。したがって、作用電極６１、対極６６及び参照電極６９は、同一の基板本体上に形成されていてもよい。さらに、本発明においては、対極６６及び参照電極６９は、基板本体上に形成された薄膜状の電極でなくてもよい。この場合、対極６６及び参照電極６９の少なくともいずれかが間隔保持部材５０の部材本体に設けられていてもよい。そして、上基板３０及び下基板４０のいずれかに、間隔保持部材５０の部材本体に設けた電極以外の電極が設けられていればよい。
【００３３】
［被検物質の電気化学的検出方法］
本発明の被検物質の電気化学的検出方法は、被検物質を電気化学的に検出する方法であって、
（１） 被検物質を含む試料を、この被検物質を捕捉する捕捉物質が固定された作用電極に接触させ、前記被検物質を作用電極上の捕捉物質で捕捉する工程、
（２） 前記工程（１）で得られた作用電極上の捕捉物質により捕捉された被検物質と、ポリペプチドからなる支持体を介して標識物質と前記被検物質を捕捉する結合物質とを少なくとも保持する標識結合物質とを含む複合体を形成させる工程、及び
（３） 前記工程（２）で得られた作用電極上に存在する標識物質を電気化学的に検出する工程、
を含むことを特徴とする。
【００３４】
本発明の被検物質の電気化学的検出方法では、標識物質の支持体として、ポリペプチドが用いられている点に１つの大きな特徴がある。
【００３５】
本発明の被検物質の電気化学的検出方法では、例えば、ナノサイズで比重が小さいポリペプチドからなるポリペプチド支持体を介して被検物質Ｓと結合する結合物質と多数の標識物質が結合した標識結合物質が用いられている。このようにポリペプチド支持体を用いた場合、従来のようにポリペプチド支持体を介さないで標識物質が結合物質に直接結合させる場合とは異なり、結合物質の結合活性を維持したまま、多数の標識物質を結合することができる。したがって、本発明の被検物質の電気化学的検出方法によれば、検出感度を著しく向上させることが可能である。また、ポリペプチドは、その種類毎に決まった構造及び配列を有しており、しかも、標識物質が結合可能な結合部位（アミノ基やスルフヒドリル基等のアミノ酸の側鎖）の数が決まっている。したがって、本発明の被検物質の電気化学的検出方法によれば、金属ナノ粒子等のポリペプチド以外の支持体を用いる場合よりも、高い再現性での被検物質の検出や定量が可能になる。さらに、ポリペプチドは、インビトロで合成することができ、遺伝子操作により、所望の場所に標識物質が結合可能なアミノ酸残基（アミノ基やチオール基等を有するアミノ酸残基）を導入することができ、標識結合物質中における標識物質数を制御性よく増加させることも可能である。
【００３６】
本発明の方法では、前記標識物質として、光化学的又は電気化学的に活性な物質が用いられる。光化学的に活性な物質は、当該物質が光により励起されることにより放出される電子を用いて検出される。一方、電気化学的に活性な物質は、当該物質に基づく酸化還元電流及び／又は電気化学発光を用いて検出される。したがって、本発明の方法は、標識物質の検出技術の種類によって、光電気化学検出方法（図６及び図８参照）及び酸化還元電流・電気化学発光検出方法（図９参照）に大別することができる。
【００３７】
１．光電気化学検出方法
まず、光電気化学検出方法について説明する。光電気化学検出方法には、上述した図１に示される検出装置及び図３に示される検出チップを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
以下、図１に示される検出装置及び図３に示される検出チップを用いる場合を例としてあげて説明する。
【００３８】
図６は、本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法の処理手順を示す工程説明図である。
光電気化学検出方法では、ユーザーは、被検物質Ｓを含む試料を、検出チップ２０の試料注入口３０ｂより注入する〔図６（Ａ）試料供給工程を参照〕。これにより、試料中の被検物質が検出チップ２０を構成する上基板３０の作用電極６１上の捕捉物質８１によって捕捉される〔図６（Ｂ）被検物質捕捉工程を参照〕。このとき、前記試料中の被検物質Ｓ以外の物質（夾雑物質Ｆ）は、捕捉物質８１に捕捉されない。
捕捉物質８１は、被検物質Ｓの種類に応じて適宜選択することができる。例えば、被検物質Ｓが核酸である場合、捕捉物質８１として、かかる核酸にハイブリダイズする核酸プローブ、前記核酸に対する抗体、前記核酸と結合するタンパク質等を用いることができる。また、被検物質Ｓがタンパク質又はペプチドである場合、捕捉物質８１として、かかるタンパク質又はペプチドに対する抗体等を用いることができる。
【００３９】
捕捉物質８１による被検物質の捕捉は、例えば、捕捉物質８１と被検物質とが結合する条件下で行なうことができる。捕捉物質８１と被検物質とが結合する条件は、被検物質の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、被検物質が核酸であり、捕捉物質８１が前記核酸にハイブリダイズする核酸プローブである場合、被検物質の捕捉は、ハイブリダイゼーション用緩衝液存在下に行なうことができる。また。被検物質が核酸、タンパク質又はペプチドであり、捕捉物質８１が前記核酸に対する抗体、前記タンパク質に対する抗体又は前記ペプチドに対する抗体である場合、被検物質の捕捉は、リン酸緩衝生理的食塩水、ヘペス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、ピペス（ＰＩＰＥＳ）緩衝液、トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液等の抗原抗体反応を行なうに適した溶液中で行なうことができる。さらに、被検物質がリガンドであり、捕捉物質８１が前記リガンドに対するレセプターである場合や、被検物質がレセプターであり、捕捉物質８１が前記レセプターに対するリガンドである場合、被検物質の捕捉は、リガンドとレセプターとの結合に適した溶液中で行なうことができる。
【００４０】
つぎに、ユーザーは、試料注入口３０ｂから当該検出チップ２０内に標識結合物質９０を注入して、標識結合物質９０を作用電極６１上に捕捉された被検物質Ｓに結合させる〔図６（Ｃ）標識工程を参照〕。標識工程では、作用電極６１上に、捕捉物質８１と被検物質Ｓと標識結合物質９０とを含む複合体が形成される。
【００４１】
標識結合物質９０は、ポリペプチド支持体９１と、被検物質Ｓに結合する第１結合物質９２と、標識物質９３と、第１リンカー９４とから構成されている。標識結合物質９０では、被検物質Ｓに結合する第１結合物質９２と、第１リンカー９４とがポリペプチド支持体９１の表面に直接固定化されている。また、第１リンカー９４を介して標識物質９３が支持体９１上に固定化されている。
【００４２】
ポリペプチド支持体９１は、ポリペプチドからなる。ポリペプチド支持体９１の直径は、被検物質、標識物質等の種類に応じて適宜設定することができるが、通常、３ｎｍ〜１００ｎｍである。
【００４３】
前記ポリペプチドは、天然由来の精製ポリペプチド、インビトロで合成したリコンビナントポリペプチド、遺伝子改変した人工ポリペプチド及び化学合成ペプチドのいずれであってもよい。
【００４４】
また、前記ポリペプチドの分子量は、好ましくは１０００Ｄａ〜１００００００Ｄａ、より好ましくは１００００Ｄａ〜７０００００Ｄａ、さらに好ましくは５００００Ｄａ〜５０００００Ｄａである。
【００４５】
さらに、前記ポリペプチドの形状は、ポリペプチドが取りうる形状であればよい。前記形状としては、例えば、球状、直鎖状、紐状等が挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００４６】
前記ポリペプチドには、標識物質を結合させやすいアミノ酸残基が含まれていればよい。かかるアミノ酸残基としては、例えば、一級アミノ基を側鎖に有するアミノ酸残基（例えば、リジン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基等）、スルフヒドリル基を有するアミノ酸残基（システイン残基）等が挙げられる。なかでも、リジン残基を多く含むポリペプチド、すなわち、強い塩基性のタンパク質等は、多数の標識物質を結合させる目的では有効である。かかるポリペプチドの具体例としては、アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン等）、ポリリジン、ヒストンＨ１、ミエリンベーシックプロテイン（ＭＢＰ）、卵白リゾチーム等が挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００４７】
ポリペプチド支持体９１を構成するポリペプチドは、サブユニットが複数個会合した多量体からなるポリペプチドであってもよい。この場合、前記多量体は、各サブユニットが互いに同一であるホモ多量体であってもよく、各サブユニットが互いに異なるヘテロ多量体であってもよい。また、前記多量体は、各サブユニットが、互いに相同的である多量体であってもよい。このような多量体からなるポリペプチドとしては、例えば、フェリチン、ストレプトアビジン、リステリアＤｐｓ等のホモ多量体構造を有するポリペプチド；ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）、ロタウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、ロスリバーウイルス、ポリオウイルス等のウイルス粒子の外殻を利用したポリペプチド等が挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００４８】
前記ポリペプチドのなかでは、安価に大量調製が容易なことから、好ましくはフェリチン及びアルブミンである。前記フェリチンは、標識物質が結合可能な結合部位がフェリチン分子の外側に位置するように改変されていることが好ましい。このような改変が施されたフェリチンとしては、例えば、馬フェリチン分子の外側に位置する８６番目のセリン残基が、マレイミド修飾された標識物質が結合可能なシステイン残基（マレイミド基との反応性が高いシステイン残基）に改変された変異型フェリチンなどが挙げられる。
【００４９】
第１結合物質９２は、被検物質Ｓにおいて、捕捉物質８１とは異なる位置や場所に結合する物質であればよい。かかる第１結合物質９２は、被検物質Ｓの種類に応じて適宜選択される。例えば、被検物質Ｓが核酸である場合、第１結合物質９２として、かかる核酸にハイブリダイズする核酸プローブ、前記核酸に対する抗体、前記核酸と結合するタンパク質等を用いることができる。また、被検物質Ｓがタンパク質又はペプチドである場合、第１結合物質９２として、かかるタンパク質又はペプチドに対する抗体等を用いることができる。
【００５０】
標識物質９３は、光を照射することにより励起状態となり電子を放出する物質である。標識物質９３として、金属錯体、有機蛍光体、量子ドット及び無機蛍光体からなる群より選択された少なくとも１つを用いることができる。
前記標識物質の具体例としては、金属フタロシアン、ルテニウム錯体、オスミウム錯体、鉄錯体、亜鉛錯体、９−フェニルキサンテン系色素、シアニン系色素、メタロシアニン色素、キサンテン系色素、トリフェニルメタン系色素、アクリジン系色素、オキサジン系色素、クマリン系色素、メロシアニン系色素、ロダシアニン系色素、ポリメチン系色素、ポルフィリン系色素、フタロシアニン系色素、ローダミン系色素、キサンテン系色素、クロロフィル系色素、エオシン系色素、マーキュロクロム系色素、インジゴ系色素、ＢＯＤＩＰＹ系色素、ＣＡＬＦｌｕｏｒ系色素、オレゴングリーン系色素、ロードル（Ｒｈｏｄｏｌ）グリーン、テキサスレッド、カスケードブルー、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）、セレン化カドミウム、テルル化カドミウム、Ｌｎ2Ｏ3：Ｒｅ、Ｌｎ2Ｏ2Ｓ：Ｒｅ、ＺｎＯ、ＣａＷＯ4、ＭＯ・ｘＡｌ2Ｏ3：Ｅｕ、Ｚｎ2ＳｉＯ4：Ｍｎ、ＬａＰＯ4：Ｃｅ、Ｔｂ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５及びＣｙ９（いずれも、アマシャムバイオサイエンス社製）；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７９０（いずれも、モレキュラープローブ社製）；ＤＹ−６１０、ＤＹ−６１５、ＤＹ−６３０、ＤＹ−６３１、ＤＹ−６３３、ＤＹ−６３５、ＤＹ−６３６、ＥＶＯｂｌｕｅ１０、ＥＶＯｂｌｕｅ３０、ＤＹ−６４７、ＤＹ−６５０、ＤＹ−６５１、ＤＹ―８００、ＤＹＱ−６６０及びＤＹＱ−６６１（いずれも、Ｄｙｏｍｉｃｓ社製）；Ａｔｔｏ４２５、Ａｔｔｏ４６５、Ａｔｔｏ４８８、Ａｔｔｏ４９５、Ａｔｔｏ５２０、Ａｔｔｏ５３２、Ａｔｔｏ５５０、Ａｔｔｏ５６５、Ａｔｔｏ５９０、Ａｔｔｏ５９４、Ａｔｔｏ６１０、Ａｔｔｏ６１１Ｘ、Ａｔｔｏ６２０、Ａｔｔｏ６３３、Ａｔｔｏ６３５、Ａｔｔｏ６３７、Ａｔｔｏ６４７、Ａｔｔｏ６５５、Ａｔｔｏ６８０、Ａｔｔｏ７００、Ａｔｔｏ７２５及びＡｔｔｏ７４０（いずれも、Ａｔｔｏ−ＴＥＣ ＧｍｂＨ社製）；ＶｉｖｏＴａｇＳ６８０、ＶｉｖｏＴａｇ６８０及びＶｉｖｏＴａｇＳ７５０（いずれも、ＶｉｓＥｎＭｅｄｉｃａｌ社製）等が挙げられる。なお、前記ＬｎはＬａ、Ｇｄ、Ｌｕ又はＹを示し、Ｒｅはランタニド族元素を示し、Ｍはアルカリ土類金属元素を示し、ｘは０．５〜１．５の数を示す。標識物質の他の例については、例えば、特許第４０８６０９０号公報、特開平７−８３９２７号公報等を参照することができる。
【００５１】
第１リンカー９４としては、例えば、炭素鎖、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖、核酸等が挙げられる。リンカーの長さは、標識物質及び官能基の種類等によって好適な範囲が異なるので、標識物質及び官能基の種類等に応じて適宜設定することが好ましい。
【００５２】
なお、標識結合物質９０は、標識物質９３をポリペプチド支持体９１に直接結合させることができるのであれば、第１リンカー９４を有していなくてもよい。
【００５３】
標識結合物質９０におけるポリペプチド支持体９１への標識物質９３の結合方法としては、例えば、標識物質９３をポリペプチド支持体９１に共有結合により結合させる方法、標識物質９３をポリペプチド支持体９１に非共有結合により結合させる方法が挙げられる。
【００５４】
標識物質９３をポリペプチド支持体９１に共有結合により結合させる方法は、標識物質９３をポリペプチドに共有結合させることができる方法であればよく、特に限定されるものではない。
【００５５】
ポリペプチド支持体９１において、標識物質９３を共有結合させる部位は、特に限定されないが、ポリペプチド支持体９１と標識物質９３との結合が容易であることから、ポリペプチド中のアミノ基（ＮＨ２）及びスルフヒドリル（ＳＨ）基が好ましい。ポリペプチド中のアミノ基（ＮＨ２基）に結合させることができる反応基としては、例えば、サクシンイミド基（ＮＨＳ）、イソチオシアノ基（ＩＴＣ）、クロロスルホニル基、クロロアシル基、オキシエチレン基、クロロアルキル基、アルデヒド基、カルボキシル基等が挙げられる。これらのなかでは、ポリペプチドのアミノ基を介して目的とする標識物質を共有結合的に付加させる場合には、水系での反応が必須で、反応溶液のｐＨが中性〜弱アルカリ性領域にあること、氷冷下から３７℃程度の反応温度で短時間に反応が進むこと等のように反応化合物を使用できる条件が限られていることから、好ましくはＮＨＳ及びＩＴＣである。したがって、標識物質９３として、ＮＨＳ及び／又はＩＴＣを有する標識物質を用いることができる。
【００５６】
ポリペプチド中のスルフヒドリル（ＳＨ）基に結合させることができる反応基としては、例えば、マレイミド基、ブロモアセトアミド基等があげられる。スルホヒドリル（ＳＨ）基は、通常、ポリペプチド中ではジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合を形成している。そのため、スルフヒドリル（ＳＨ）基を、標識物質を結合させる部位として用いる場合、ポリペプチド中のジスルフィド構造を還元し、スルホヒドリル（ＳＨ）基として用いることになる。ジスルフィド結合の還元には、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）、メルカプトエチルアミン（ＭＥＡ）等を用いることができる。したがって、標識物質が、アミノ基やチオール基に対する反応性の高い官能基（例えば、サクシンイミド基、マレイミド基等）を有している場合には、ポリペプチドと標識物質とを混合するだけで、ポリペプチドのアミノ基やチオール基に標識物質を直接結合させることができる。このような標識物質としては、例えば、サクシンイミドエステル修飾されたＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０やＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７９０（インビトロジェン社製）等が挙げられる。
【００５７】
標識物質９３が、アミノ基、チオール基、アルデヒド基、カルボキシル基等を有している場合は、例えば、化学クロスリンカーを介して標識物質９３とポリペプチド支持体９１とを結合させること、標識物質９３とポリペプチド支持体９１と間にジチオール結合を形成させること、一般的な化学反応を行なうこと等により、標識物質９３とポリペプチド支持体９１とを容易に結合させることができる。
【００５８】
前記クロスリンカーは、一般的に直鎖状の構造を有しており、両末端にアミノ基やチオール基と反応するサクシンイミド基、マレイミド基等を有するスペーサーからなる。かかるクロスリンカーを第１リンカー９４として用いることにより、ポリペプチド支持体９１と標識物質９３とを連結させることが可能である。例えば、標識物質９３がチオール基を有する場合、この標識物質９３をポリペプチドのアミノ基に結合させる際に、一方の末端にサクシンイミド基を有し、かつ他方の末端にマレイミド基を有するクロスリンカーを用いることができる。この場合、まず、ポリペプチド中のアミノ基とクロスリンカー中のサクシンイミド基とを反応させ、クロスリンカーのマレイミド基をポリペプチドの表面に露出させる。そして、前記マレイミド基と標識物質中のチオール基とを反応させることにより結合させることができる。ここで、クロスリンカーのスペーサーの長さは、特に限定されるものではない。スペーサーとしては、例えば、ＰＥＧ鎖、核酸等が挙げられる。前記クロスリンカーの具体例としては、Ｎ−［α−マレイミドアセトアセトキシ］スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、Ｎ−［β−マレイミドプロピルオキシ］スクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）、（マレイミドブチリルオキシ−スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、スクシンイミジル トランス−４−（Ｎ−マレイミジルメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−［ε−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート（ＳＭＰＢ）、スクシンイミジル−６−［（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート］（ＳＭＰＨ）、スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシ−［６−アミドカプロエート］（ＬＣ−ＳＭＣＣ）、ＮＨＳ−ＰＥＧｎ−Ｍａｌｅｉｍｉｄ等が挙げられる。前記クロスリンカーは、両末端の官能基がアミノ基との反応性を有するグルタルアルデヒド、アミン反応性のＮＨＳエステル基と光反応性のジアジリン基の２つの官能基を末端に有するクロスリンカー等であってもよい。
【００５９】
また、標識物質９３がチオール基を有している場合、標識物質９３のチオール基とポリペプチドのチオール基とを反応させることにより、ジチオール結合を形成することによっても結合可能である。標識物質９３がカルボキシル基を有する場合、ＮＨＳを用いて活性化して、ポリペプチドのアミノ基と結合させることができる。標識物質９３がアルデヒド基を有する場合、ポリペプチドのアミノ基とシッフ塩基を形成させた後、還元して安定な結合をつくることができる。
【００６０】
標識物質９３をポリペプチド支持体９１に非共有結合により結合させる方法としては、標識物質９３をポリペプチドに非共有結合により結合させる方法やポリペプチドに共有結合により結合させた物質を介して非共有結合により標識物質９３を結合させる方法等が考えられる。
【００６１】
標識物質９３をポリペプチドに非共有結合により結合させる方法としては、例えば、ストレプトアビジンと、ビオチン標識した標識物質との結合を利用する方法等が挙げられる。また、ポリペプチドに共有結合により結合させた物質を介して非共有結合により標識物質を結合させる方法としては、例えば、まず、前述のように、末端にアミノ基等を有するＤＮＡをポリペプチドに共有結合させ、つぎに、前記ＤＮＡに標識物質を結合させた相補的なＤＮＡをハイブリダイゼーションにより非共有結合的に結合させる方法等が挙げられる。
【００６２】
以上のように、ポリペプチド支持体９１を標識物質９３の支持体として用いた場合、無機材料からなる支持体を用いた場合に比べ、標識物質の和が正確に制御された標識物質結合物質を容易に作製することができる。
【００６３】
ポリペプチド支持体９１への第１結合物質９２の結合についても、標識物質９３をポリペプチド支持体９１に結合させるのと同様の方法により行なうことができる。
【００６４】
つぎに、検出工程が行なわれる〔図６（Ｄ）検出工程を参照〕。
【００６５】
かかる検出工程では、まず、ユーザーは、電解液を、検出チップ２０の試料注入口３０ｂより注入する。その後、ユーザーは、図１に示される検出装置１のチップ受入部１１に検出チップ２０を挿入する。そして、ユーザーは、検出装置１に測定開始を指示する。ここでは、検出装置１に挿入された検出チップ２０の電極リード７１，７２、７３は電流計１４や電源１５に接続される。そして、検出装置１の電源１５により、参照電極６９を基準として任意の電位が作用電極６１に印加される。電極に印加される電位は、被検物質に対する励起光が照射されていない場合の電流値（定常電流、暗電流）が小さく、被検物質から生じる光電流が最大となる電位が好ましい。電位は、対極に印加してもよく、作用電極に印加してもよい。
【００６６】
その後、検出装置１の光源１３により、作用電極６１上の標識物質９３に励起光が照射される。これにより、標識物質９３が励起し、電子を発生する。そして、発生した電子は、作用電極６１に移動する。その結果、作用電極６１と対極６６との間に電流が流れる。そして、検出装置１の電流計１４により、作用電極６１と対極６６との間に流れる電流が測定される。電流計１４で測定された電流値は、標識物質９３の個数と相関している。したがって、測定された電流値に基づき、被検物質Ｓを定量することができる。なお、励起光は、必要に応じて、分光器やバンドパスフィルタを用いて特定波長領域の光のみであってもよい。
【００６７】
その後、まず、Ａ／Ｄ変換部１６によってデジタル変換された電流値が制御部１７に入力される。つぎに、予め作成された電流値と被検物質量との関係を示す検量線に基づき、制御部１７により、デジタル変換後の電流値から、試料中の被検物質量が概算される。そして、概算された被検物質量の情報をディスプレイ１２に表示するための検出結果画面が、制御部１７によって作成される。その後、制御部１７によって作成された検出結果画面がディスプレイ１２に送信され、ディスプレイ１２に表示される。
【００６８】
前記電解液として、酸化された状態の標識物質９３に電子を供給しうる塩からなる電解質と、非プロトン性極性溶媒、プロトン性極性溶媒又は非プロトン性極性溶媒とプロトン性極性溶媒との混合物とを含む溶液を用いることができる。この電解液は、所望により、他の成分をさらに含んでいてもよい。また、電解液は、ゲル状であってもよく、固体であってもよい。
【００６９】
電解質としては、例えば、ヨウ化物、臭化物、金属錯体、チオ硫酸塩、亜硫酸塩、これらの混合物等が挙げられる。前記電解質の具体例としては、ヨウ化リチウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、ヨウ化セシウム、ヨウ化カルシウム等の金属ヨウ化物；テトラアルキルアンモニウムヨーダイド、ピリジニウムヨーダイド、イミダゾリウムヨーダイド等の４級アンモニウム化合物のヨウ素塩；臭化リチウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化セシウム、臭化カルシウム等の金属臭化物；テトラアルキルアンモニウムブロマイド、ピリジニウムブロマイド等の４級アンモニウム化合物の臭素塩；フェロシアン酸塩、フェリシニウムイオン等の金属錯体；チオ硫酸ナトリウム、チオ硫酸アンモニウム、チオ硫酸カリウム、チオ硫酸カルシウム等のチオ硫酸塩；亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、亜硫酸アンモニウム、亜硫酸鉄、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸カルシウム等の亜硫酸塩；及びこれらの混合物等が挙げられる。これらのなかでは、テトラプロピルアンモニウムヨーダイド及びヨウ化カルシウムが好ましい。
【００７０】
電解液の電解質濃度は、好ましくは０．００１〜１５Ｍである。
【００７１】
プロトン性極性溶媒として、水、水を主体に緩衝液成分を混合した極性溶媒等を用いることができる。
非プロトン性極性溶媒としては、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）等のニトリル類；プロピレンカーボネート、エチレンカーボネート等のカーボネート類、１，３−ジメチルイミダゾリノン、３−メチルオキサゾリノン、ジアルキルイミダゾリウム塩等の複素環化合物；ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、スルホラン等が挙げられる。非プロトン性極性溶媒のなかでは、アセトニトリルが好ましい。プロトン性極性溶媒及び非プロトン性極性溶媒は、単独で、又は両者を混合して用いることができる。プロトン性極性溶媒と非プロトン性極性溶媒との混合物は、水とアセトニトリルとの混合物が好ましい。
【００７２】
標識物質９３への光の照射には、標識物質９３を光励起することができる波長の光を照射できる光源を用いることができる。かかる光源は、標識物質９３の種類等に応じて、適宜選択することができる。前記光源としては、例えば、蛍光灯、ブラックライト、殺菌ランプ、白熱電球、低圧水銀ランプ、高圧水銀ランプ、キセノンランプ、水銀−キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、ＬＥＤ（白色ＬＥＤ、青色ＬＥＤ、緑色ＬＥＤ、赤色ＬＥＤ等）、レーザー（炭酸ガスレーザー、色素レーザー、半導体レーザー）、太陽光等が挙げられる。前記光源のなかでは、蛍光灯、白熱電球、キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、ＬＥＤ又は太陽光が好ましい。また、検出工程においては、必要に応じて、分光器やバンドパスフィルタを用いて特定波長領域の光のみを標識物質９３に照射してもよい。
【００７３】
標識物質９３に由来する光電流の測定には、例えば、電流計、ポテンショスタット、レコーダ、計算機等を備える測定装置を用いることができる。
かかる検出工程では、光電流を定量することにより、被検物質の量を調べることができる。
【００７４】
以上のように、本実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法では、標識物質の支持体として、ポリペプチド支持体９１が用いられている。したがって、本実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法によれば、１つの被検物質Ｓあたりの標識物質に基づく光電流を大きくすることができる。これに対して、従来の被検物質の電気化学的検出方法では、ポリペプチド支持体９１が用いられておらず、一般的に、図７に示されるように、被検物質Ｓの検出に際して、被検物質Ｓに結合する結合物質１０３に標識物質１０２が直接結合した標識結合物質等が用いられる。そのため、従来の被検物質の電気化学的検出方法では、１つの被検物質Ｓあたりの標識物質に基づく光電流は小さい。
【００７５】
なお、本実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法では、夾雑物質に基づくノイズの発生を抑制する観点から、ユーザーは、被検物質捕捉工程後、検出チップ２０の試料注入口３０ｂより夾雑物質を含む残部の液体を排出し、検出チップ２０内を洗浄してもよい。検出チップ２０内の洗浄には、例えば、緩衝液（特に界面活性剤を含んだ緩衝液）；精製水（特に界面活性剤を含んだ精製水）；エタノール等の有機溶媒等を用いることができる。
【００７６】
また、本実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法では、被検物質Ｓに結合していない遊離の標識結合物質９０を除去して、検出精度を向上させる観点から、標識工程の後、検出チップ２０内を洗浄し、遊離の標識結合物質９０を除去する工程をさらに行なってもよい。かかる洗浄には、例えば、エタノール、精製水等を用いることができる。
【００７７】
さらに、本発明においては、標識工程において、標識物質が予め結合されている標識結合物質を用いて被検物質Ｓを標識する代わりに、図８に示されるように、標識工程中において、標識結合物質が形成されるように操作を行なってもよい。図８は、本発明の他の実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法の処理手順を示す工程説明図である。図８に示される被検物質の電気化学的検出方法では、（Ａ）試料供給工程、（Ｂ）被検物質捕捉工程及び（Ｄ）検出工程は、前述した図６に示される方法の（Ａ）試料供給工程、（Ｂ）被検物質捕捉工程及び（Ｄ）検出工程と同様である。一方、図８に示される被検物質の電気化学的検出方法では、（Ｃ）標識工程において、まず、ポリペプチド支持体９１を介して第１結合物質９２及び第１リンカー９４を保持する結合体９０ａを被検物質Ｓに結合させる〔図８中、（Ｃ−１）〕。その後、結合体９０ａに、標識体９０ｂを結合させる〔図８中、（Ｃ−２）〕。この標識体９０ｂは、標識物質９３と、この標識物質９３を保持するための第２リンカー９６と、前記第２リンカー９６を結合する第２結合物質９５とからなる。標識体９０ｂにおいては、標識物質９３と第２リンカー９６とを含む複数個の複合体が第２結合物質９５上に結合している。
【００７８】
２．酸化還元電流・電気化学発光検出方法
つぎに、酸化還元電流・電気化学発光検出方法について説明する。図９は、本発明のさらに他の実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法の処理手順を示す工程説明図である。
【００７９】
かかる酸化還元電流・電気化学発光検出方法は、標識工程〔図９（Ｃ）参照〕において、標識物質１９３として、電圧を印加することにより酸化還元電流を生じる標識物質又は電圧を印加することにより発光する標識物質を用いる点及び検出工程〔図９（Ｄ）参照〕において、電圧を作用電極６１に印加して標識物質１９３から生じた光を検出する点が光電気化学検出方法と大きく異なっている。したがって、試料供給工程〔図９（Ａ）参照〕及び被検物質捕捉工程〔図９（Ｂ）参照〕は、光電気化学検出方法における試料供給工程及び被検物質捕捉工程と同様である。なお、本実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いられる検出装置１は、光源１３を備えず、標識物質から生じる光を検出するためのセンサをさらに備えている装置である。また、本実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いられる検出チップ２０は、作用電極６１が導電性材料からなるものである。
【００８０】
標識工程においては、ユーザーは、試料注入口３０ｂから当該検出チップ２０内に標識結合物質１９０を注入して、標識結合物質１９０を作用電極６１上に捕捉された被検物質Ｓに結合させる〔図９（Ｃ）標識工程を参照〕。標識工程では、作用電極６１上に、捕捉物質８１と被検物質Ｓと標識結合物質１９０とを含む複合体が形成される。
【００８１】
標識結合物質１９０は、ポリペプチド支持体９１と、被検物質Ｓに結合する第１結合物質９２と、標識物質１９３と、第１リンカー９４とから構成されている。標識結合物質１９０では、被検物質Ｓに結合する第１結合物質９２と、第１リンカー９４とがポリペプチド支持体９１の表面に直接固定化されている。また、第１リンカー９４を介して標識物質１９３がポリペプチド支持体９１上に固定化されている。
【００８２】
標識物質１９３は、電圧を印加することにより発光する標識物質である。
電圧を印加することにより発光する標識物質としては、例えば、ルミノール、ルシゲニン、ピレン、ジフェニルアントラセン、ルブレン等が挙げられる。
これらの標識物質の発光は、例えば、ホタルルシフェリン、デヒドロルシフェリンのようなルシフェリン誘導体、フェニルフェノール、クロロフェノールのようなフェノ−ル類若しくはナフトール類のようなエンハンサ−を用いることにより増強することが可能である。
なお、本実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法では、標識物質１９３として、電圧を印加することにより発光する標識物質の代わりに、電圧を印加することにより酸化還元電流を生じる標識物質を用いてもよい。
電圧を印加することにより酸化還元電流を生じる標識物質としては、例えば、電気的に可逆的な酸化還元反応を起こす金属を中心金属として含む金属錯体等が挙げられる。このような金属錯体としては、例えば、トリス（フェナントロリン）亜鉛錯体、トリス（フェナントロリン）ルテニュウム錯体、トリス（フェナントロリン）コバルト錯体、ジ（フェナントロリン）亜鉛錯体、ジ（フェナントロリン）ルテニュウム錯体、ジ（フェナントロリン）コバルト錯体、ビピリジンプラチナ錯体、ターピリジンプラチナ錯体、フェナントロリンプラチナ錯体、トリス（ビピリジル）亜鉛錯体、トリス（ビピリジル）ルテニュウム錯体、トリス（ビピリジル）コバルト錯体、ジ（ビピリジル）亜鉛錯体、ジ（ビピリジル）ルテニュウム錯体、ジ（ビピリジル）コバルト錯体等が挙げられる。
【００８３】
なお、ポリペプチド支持体９１、第１結合物質９２及び第１リンカー９４は、光電気化学検出方法におけるポリペプチド支持体９１、第１結合物質９２及び第１リンカー９４と同様である。
【００８４】
つぎに、検出工程が行なわれる〔図９（Ｄ）検出工程を参照〕。
【００８５】
かかる検出工程では、まず、ユーザーは、電解液を、検出チップ２０の試料注入口３０ｂより注入する。その後、ユーザーは、図１に示される検出装置１のチップ受入部１１に検出チップ２０を挿入する。そして、ユーザーは、検出装置１に測定開始を指示する。ここでは、検出装置１に挿入された検出チップ２０の電極リード７１，７２、７３は電流計１４や電源１５に接続される。そして、検出装置１の電源１５により、作用電極６１に電圧が印加される。これにより、標識物質１９３が励起され、光が生じる。標識物質１９３に基づく光の測定には、フォトンカウンタ等が用いられる。また、この場合、電極の代わりに、光ファイバーの先端に透明電極を形成することにより得られる光ファイバー電極を用いて間接的に検出することもできる（特許第２５７３４４３号公報を参照）。
【００８６】
その後、まず、Ａ／Ｄ変換部１６によってデジタル変換された光量の値が制御部１７に入力される。つぎに、予め作成された光量の値と被検物質量との関係を示す検量線に基づき、制御部１７により、デジタル変換後の電流値から、試料中の被検物質量が概算される。そして、概算された被検物質量の情報をディスプレイ１２に表示するための検出結果画面が、制御部１７によって作成される。その後、制御部１７によって作成された検出結果画面がディスプレイ１２に送信され、ディスプレイ１２に表示される。
【００８７】
なお、本実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法においても、夾雑物質に基づくノイズの発生を抑制する観点から、ユーザーは、被検物質捕捉工程後、検出チップ２０の試料注入口３０ｂより夾雑物質を含む残部の液体を排出し、検出チップ２０内を洗浄してもよい。検出チップ２０内の洗浄には、例えば、緩衝液（特に界面活性剤を含んだ緩衝液）；精製水（特に界面活性剤を含んだ精製水）；エタノール等の有機溶媒等を用いることができる。
【００８８】
また、本実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法では、被検物質Ｓに結合していない遊離の標識結合物質１９０を除去して、検出精度を向上させる観点から、標識工程の後、検出チップ２０内を洗浄し、遊離の標識結合物質１９０を除去する工程をさらに行なってもよい。かかる洗浄には、例えば、エタノール、精製水等を用いることができる。
【００８９】
さらに、本発明においては、標識工程において、標識物質１９３が予め結合されている標識結合物質１９０を用いて被検物質Ｓを標識する代わりに、図８に示されるように、標識工程中において、標識結合物質が形成されるように操作を行なってもよい。
【００９０】
また、図９（Ｄ）では、光を測定する場合を例として挙げて示しているが、標識物質１９３が電圧を印加することにより酸化還元電流を生じる標識物質である場合には、標識物質１９３が励起され、電子が発生する。そして、発生した電子は、作用電極６１に移動する。その結果、作用電極６１と対極６６との間に電流が流れる。そして、検出装置１の電流計１４により、作用電極６１と対極６６との間に流れる電流が測定される。電流計１４で測定された電流値は、標識物質の個数と相関している。したがって、測定された電流値に基づき、被検物質を定量することができる。
【実施例】
【００９１】
以下、実施例等により、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００９２】
（製造例１）
シランカップリング剤である３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）を、その濃度が１体積％となるようにトルエンに添加し、溶液Ａを得た。
【００９３】
（製造例２）
アセトニトリルとエチレンカーボネートとを体積比で２：３となるように混合し、非プロトン性極性溶媒を得た。前記非プロトン性極性溶媒に、電解質塩として、テトラプロピルアンモニウムヨーダイドをその濃度が０．６Ｍとなるように溶解させた。得られた溶液に、さらに電解質として、ヨウ素をその濃度が０．０６Ｍとなるように溶解させ、電解液を得た。
【００９４】
（製造例３）
スパッタリング法により、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）からなる基板本体上に、厚さ２００ｎｍの白金薄膜（導電層）からなる対極を形成し、対極基板を得た。前記対極部には電流計と接続するための対極リードを接続した。これにより、対極基板を得た。
【００９５】
（試験例１）
（１−１）ＤＮＡ結合フェリチンの作製
結合物質またはリンカーとして用いられるＤＮＡをポリペプチドからなる支持体であるフェリチンの外側に結合させるために馬フェリチンサブユニットを変異導入用キット〔ストラタジーン製、商品名：ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ〕を用いた遺伝子組み換え技術により外側に位置する８６番目のセリン残基をマレイミド基と反応性の高いシステイン残基に改変し、リコンビナントフェリチンサブユニットを得た。
【００９６】
つぎに、前記リコンビナントフェリチンサブユニットを自己会合させ、球殻状フェリチンを得た。得られた球殻状フェリチン〔図１１（Ｂ）中において、１１１参照〕と、マレイミド化ＤＮＡ〔（株）日本バイオサービス製、配列番号：１〕とを、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸含有２０ｍＭリン酸バッファー中、５０℃で結合させた。なお、前記マレイミド化ＤＮＡは、３’末端をマレイミド修飾された４１塩基のＤＮＡである。また、前記マレイミド化ＤＮＡは、標的となる被検物質ＳであるＣＫ１９ ＤＮＡ（配列番号：５）に相補的な配列〔図１０（Ａ）において、斜体字で示された配列〕と、後述の標識物質保持用ＤＮＡが結合する配列〔図１０（Ａ）において、太字で示された配列〕とを有している。
【００９７】
得られた産物をゲルろ過クロマトグラフィーに供し、ＤＮＡ結合フェリチンを精製した。ＤＮＡ結合フェリチン（結合体）〔図１１（Ｂ）において、１１０ａ〕は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、球殻状フェリチンに約１２個のＤＮＡが結合した構造を有していると推測された。なお、図１１においては、説明をわかりやすくするため、ＤＮＡ結合フェリチン１１０ａ（結合体）において、球殻状フェリチンに結合しているＤＮＡの一部を省略している。
【００９８】
（１−２）標識結合物質の作製
１×ＭＥＳハイブリダイゼーション溶液（アフィメトリックス社製）において、１００ｎＭ標識物質保持用ＤＮＡ〔北海道システムサイエンス（株）製、配列番号：２、図１０（Ｂ）、図１１（Ｃ）において、１１５参照〕と、１μＭ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ〔（株）日本バイオサービス製、配列番号：３、図１１（Ｃ）において、１１７参照〕とを４５℃で１時間インキュベーションし、標識体〔図１１（Ｃ）において、１１０ｂ参照〕を得た。
【００９９】
なお、標識物質保持用ＤＮＡ１１５は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ１１７にハイブリダイゼーションする配列〔図１０（Ｂ）において、下線が付された配列〕を６つ有している。また、標識物質保持用ＤＮＡ１１５は、３’末端に、ＤＮＡ結合フェリチン中のマレイミド化ＤＮＡにハイブリダイゼーションする配列〔図１０（Ｂ）において、斜体字で示された配列〕を１つ有している。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ１１７は、前記標識物質保持用ＤＮＡ１１５にハイブリダイゼーションする配列を有している〔図１０（Ｃ）参照〕。また、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ１１７に含まれるＤＮＡ（リンカー）〔図１１（Ｃ）において、１１６参照〕の両末端は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０（標識物質）〔図１１（Ｃ）において、１１３参照〕で標識されている。
【０１００】
（１−３）作用電極基板の作製
スパッタリング法により、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）からなる基板本体３０ａ上に、スズをドープした酸化インジウムの薄膜（厚さ２００ｎｍ）からなる作用電極を形成した。前記薄膜は、導電層と電子受容層とを兼ねている。つぎに、前記作用電極に、電流計と接続するための作用電極リードを接続した。
【０１０１】
つぎに、作用電極の表面を製造例１で得られた溶液Ａを接触させて作用電極の表面にアミノ基を付与した。
【０１０２】
１０μＭ ＣＫ１９ ＤＮＡ捕捉用ＤＮＡ（捕捉物質８１）〔配列番号：４、図１０（Ｄ）参照〕を含むＤＮＡ溶液と、クロスリンキング試薬〔ＧＥヘルスケア社製、商品名：ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ Ｄ〕とを体積比で１：９となるように混合した。得られた混合物を前記作用電極上に滴下した。その後、前記作用電極に紫外線（１６０ｍＪ）を照射してＣＫ１９ ＤＮＡ捕捉用ＤＮＡを作用電極上に固定した。これにより、作用電極基板を得た。
【０１０３】
（１−４）被検物質の捕捉
作用電極基板の作用電極の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。その後、この作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、ハイブリダイゼーションバッファー〔東洋紡績（株）製、商品名：Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｈｙｂ〕と被検物質Ｓとして１ｎＭ ＣＫ１９ ＤＮＡ〔（株）北海道システムサイエンス製、１５０塩基、配列番号：５〕とを入れた。前記作用電極基板を５８℃で２時間インキュベーションした。これにより、作用電極〔図１１（Ａ）において、６１参照〕上の捕捉物質〔図１１（Ａ）において、８１参照〕に、被検物質Ｓを捕捉させた〔図１１（Ａ）参照〕。
【０１０４】
作用電極６１を、０．１質量％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート（Ｔｗｅｅｎ−２０）含有６×ＳＳＰＥ〔１×ＳＳＰＥの組成：０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、０．１４９Ｍ塩化ナトリウム、０．００１Ｍ ＥＤＴＡ〕で洗浄した。その後、前記空間に、１×ＭＥＳハイブリダイゼーション溶液（アフィメトリックス社）と５０ｎＭ ＤＮＡ結合フェリチン（結合体）とを入れた。そして、前記作用電極基板（上基板３０）を４５℃で１時間インキュベーションした。これにより、作用電極６１上の捕捉物質８１に捕捉された被検物質ＳとＤＮＡ結合フェリチン１１０ａ（結合体）中に含まれるＤＮＡ（結合物質）〔図１１（Ｂ）において、１１２参照〕とをハイブリダイゼーションさせ、作用電極６１上に被検物質Ｓを捕捉した〔図１１（Ｂ）参照〕。ここで、被検物質Ｓは、ＤＮＡ結合フェリチン１１０ａ（結合体）中に含まれるＤＮＡ１１２（結合物質）の破線部分〔図１０（Ａ）において、斜体字で示された配列〕とハイブリダイゼーションする。
【０１０５】
つぎに、作用電極６１を０．１質量％Ｔｗｅｅｎ−２０含有６×ＳＳＰＥで洗浄した。その後、前記空間に、１×ＭＥＳハイブリダイゼーション溶液（アフィメトリックス社製）と、標識体１１０ｂとを入れた。そして、前記作用電極基板（上基板３０）を４５℃で１時間インキュベーションした。これにより、作用電極基板（上基板３０）の作用電極６１上に捕捉物質８１と被検物質ＳとＤＮＡ結合フェリチン１１０ａ（結合体）と標識体１１０ｂとを含む複合体が形成した〔図１１（Ｃ）参照〕（実施例１）。
【０１０６】
（２）対照実験
実施例１において、ＤＮＡ結合フェリチンの代わりに、１μＭ ＣＫ１９認識配列−標識保持用ＤＮＡ〔配列番号：６、図１０（Ｆ）、図１２中、１２０ａ参照〕を用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、作用電極基板（上基板３０）の作用電極６１上に捕捉物質８１と被検物質ＳとＣＫ１９認識配列−標識保持用ＤＮＡ１２０ａと標識体１１０ｂとを含む複合体が形成した〔図１２（Ｃ）参照〕（比較例１）。
【０１０７】
（３）光電流の測定
実施例１及び比較例１の各作用電極基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。そして、作用電極基板（上基板３０）とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例２で得られた電解液を充填した。そして、電解液が充填された空間を、作用電極基板の上方から、製造例３で得られた対極基板で密封した。これにより、作用電極及び対極を電解液に接触させた。つぎに、作用電極基板及び対極からなる検出チップを電気化学計測装置に設置し、作用電極リード及び対極リードを電流計に接続した。
【０１０８】
作用電極基板側から対極基板に向けて、光源（波長７８１ｎｍ、出力１３ｍＷのレーザー光源）から光を照射した。光照射により、標識物質が励起され、電子を生じる。そして、前記電子が作用電極に輸送されることにより、作用電極と対極との間に電流が流れる。そこで、この電流を測定した。試験例１において、検出方法の種類と光電流との関係を調べた結果を図１３に示す。
【０１０９】
図１３に示された結果から、標識物質を保持する支持体として、ポリペプチドからなる支持体であるフェリチンを用いた実施例１においては、検出された電流は約１３７ｎＡであることがわかる。これに対して、従来のように、標識物質を保持する支持体として、ポリペプチドからなる支持体を用いない比較例１では、約１７ｎＡであることがわかる。これらの結果から、標識物質を保持する支持体として、ポリペプチドからなる支持体を用いることにより、非常に大きな電流を検出することができることがわかる。
【０１１０】
（試験例２）
（１−１）ＤＮＡ結合ＢＳＡの作製
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（シグマ社製）をゲルろ過クロマトグラフィーで精製した。精製後のＢＳＡ〔図１５（Ｂ）において、１３１〕とクロスリンカー〔（株）同仁化学研究所製、商品名：ＧＭＢＳ〕とを反応させ、ＢＳＡの表面にマレイミド基を結合させた。得られたマレイミド修飾ＢＳＡ２．６ｎｍｏｌに対して、３’末端にチオール基を有するＣＫ１９認識用ＤＮＡ〔配列番号：７、２０塩基、図１４（Ａ）、図１５（Ｂ）において、１３２参照〕２．７ｎｍｏｌと、３’末端にチオール基を有する標識保持用ＤＮＡ結合ＤＮＡ〔配列番号：８、図１４（Ｂ）、図１５（Ｂ）において、１３４参照〕６．４ｎｍｏｌとを混合し、０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有リン酸バッファー（ｐＨ７）１００μＬ中、３７℃で２時間反応させた。得られた反応産物を、遠心式フィルター〔ミリポア社製、商品名：アミコンウルトラ−０．５ ３０Ｋカット〕で限外ろ過して未反応のＤＮＡを除去し、ＤＮＡ結合ＢＳＡ〔図１５（Ｂ）において、１３０ａ参照〕を得た。
【０１１１】
なお、ＣＫ１９認識用ＤＮＡは、被検物質ＳであるＣＫ１９ ＤＮＡ〔配列番号：５、図１４（Ｆ）〕に相補的な配列〔図１４（Ａ）において、太字で示された配列〕を有している。また、標識保持用ＤＮＡ結合ＤＮＡは、標識物質保持用ＤＮＡ〔配列番号：２、図１４（Ｃ）参照〕の結合部位〔図１４（Ｃ）において、斜体字で示された配列〕に相補的な配列〔図１４（Ｂ）において、太字で示された配列〕を有している。
【０１１２】
（１−２）標識体の作製
ハイブリダイゼーション溶液〔東洋紡績（株）製、商品名：ＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ〕中において、１００ｎＭ標識物質保持用ＤＮＡ（第２結合物質）〔北海道システムサイエンス（株）製、配列番号：２、図１４（Ｃ）、図１５（Ｃ）において、１３５参照〕と、１μＭ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ〔（株）日本バイオサービス製、配列番号：３、図１４（Ｄ）、図１５（Ｃ）において、１３７参照〕とを６０℃で１時間インキュベーションし、標識体〔図１５（Ｃ）において、１３０ｂ参照〕を得た。標識体１３０ｂは、標識物質１３３とＤＮＡ１３６とからなるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ１３７と、標識物質保持用ＤＮＡ１３５とからなる。
【０１１３】
（１−３）被検物質の捕捉
試験例１の（１−３）と同様にして得られた作用電極基板（上基板３０）の作用電極６１の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。なお、かかる作用電極基板（上基板３０）の作用電極６１上には、ＣＫ１９ ＤＮＡ捕捉用ＤＮＡ（捕捉物質８１）〔図１４（Ｅ）参照、配列番号：４〕が固定化されている。
【０１１４】
その後、この作用電極基板（上基板３０）とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、ハイブリダイゼーションバッファー〔東洋紡績（株）製、商品名：Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｈｙｂ〕と被検物質Ｓとして１ｎＭ ＣＫ１９ ＤＮＡ〔（株）北海道システムサイエンス製、配列番号：５、１５０塩基、図１４（Ｆ）参照〕とを入れた。前記作用電極基板（上基板３０）を６０℃で２時間インキュベーションした。これにより、作用電極６１上の捕捉物質８１に、被検物質Ｓを捕捉させた〔図１５（Ａ）参照〕。
【０１１５】
前記反応溶液の排出後、前記空間に、ハイブリダイゼーションバッファー〔東洋紡績（株）製、商品名：Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｈｙｂ〕と５０ｎＭ ＤＮＡ結合ＢＳＡ（結合体）〔図１５（Ｂ）において、１３０ａ参照〕とを入れた。そして、前記作用電極基板（上基板３０）を６０℃で１時間インキュベーションした。これにより、作用電極６１上の捕捉物質８１に捕捉された被検物質ＳとＤＮＡ結合ＢＳＡ１３０ａ（結合体）中に含まれるＣＫ１９認識用ＤＮＡ１３２（第１結合物質）とをハイブリダイゼーションさせ、作用電極６１上に被検物質Ｓを捕捉した〔図１５（Ｂ）参照〕。
【０１１６】
前記反応溶液の排出後、前記空間に、ハイブリダイゼーションバッファー〔東洋紡績（株）製、商品名：Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｈｙｂ〕と、標識体１３０ｂとを入れた。そして、前記作用電極基板（上基板３０）を６０℃、１時間インキュベーションし、標識体１３０ｂ中の標識物質保持用ＤＮＡ１３５（第２結合物質）と、捕捉物質８１及び被検物質Ｓを介して作用電極６１上に固定化されたＤＮＡ結合ＢＳＡ１３０ａ（結合体）中に含まれる標識保持用ＤＮＡ結合ＤＮＡ（第１リンカー）〔図１５（Ｂ）において１３４参照〕とをハイブリダイゼーションさせた。これにより、作用電極基板（上基板３０）の作用電極６１上に捕捉物質８１と被検物質ＳとＤＮＡ結合ＢＳＡ１３０ａ（結合体）と標識体１３０ｂとを含む複合体が形成した〔図１５（Ｃ）参照〕（実施例２）。なお、標識保持用ＤＮＡ結合ＤＮＡ１３４（第１リンカー）は、標識物質保持用ＤＮＡ１３５（第２結合物質）の３’末端側の領域〔図１４（Ｃ）において、斜体字で示された配列〕と結合する。
【０１１７】
（２）対照実験
実施例２において、ＤＮＡ結合ＢＳＡの代わりに、１μＭ ＣＫ１９認識配列−標識保持用ＤＮＡ〔配列番号：６、図１４（Ｇ）、図１６において、１４０ａ参照〕を用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、作用電極基板（上基板３０）の作用電極６１上に捕捉物質８１と被検物質ＳとＣＫ１９認識配列−標識保持用ＤＮＡ１４０ａと標識体１３０ｂとを含む複合体が形成した〔図１６（Ｃ）参照〕（比較例２）。
【０１１８】
（３）光電流の測定
実施例２及び比較例２の各作用電極基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。そして、作用電極基板（上基板３０）とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例２で得られた電解液を充填した。そして、電解液が充填された空間を、作用電極基板の上方から、製造例３で得られた対極基板で密封した。これにより、作用電極及び対極を電解液に接触させた。つぎに、作用電極基板及び対極からなる検出チップを電気化学計測装置に設置し、作用電極リード及び対極リードを電流計に接続した。
【０１１９】
作用電極基板側から対極基板に向けて、光源（波長７８１ｎｍ、出力１３ｍＷのレーザー光源）から光を照射した。光照射により、標識物質が励起され、電子を生じる。そして、前記電子が作用電極に輸送されることにより、作用電極と対極との間に電流が流れる。そこで、この電流を測定した。試験例２において、検出方法の種類と光電流との関係を調べた結果を図１７に示す。
【０１２０】
図１７に示された結果から、標識物質を保持する支持体として、ポリペプチドからなる支持体であるＢＳＡを用いた実施例１においては、検出された電流は約２１８．２ｎＡであることがわかる。これに対して、従来のように、標識物質を保持する支持体として、ポリペプチドからなる支持体を用いない比較例１では、約５．８ｎＡであることがわかる。これらの結果から、標識物質を保持する支持体として、ポリペプチドからなる支持体を用いることにより、非常に大きな電流を検出することができることがわかる。
【０１２１】
（試験例３）
（１−１）ＤＮＡ結合ＢＳＡの作製
ＢＳＡ（シグマ社製）をゲルろ過クロマトグラフィーで精製した。精製後のＢＳＡ〔図１９（Ｂ）において、１５１参照〕とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０誘導体（インビトロジェン社製、商品名：ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ，ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ）とを、０．１Ｍ 炭酸ナトリウム（ｐＨ８．５）中、室温で１時間反応させた。得られた反応産物を、脱塩カラム（ピアース社製、商品名：Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｍｉｃｒｏ ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ）で濾過して未反応のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０誘導体を除去し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＢＳＡを得た。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＢＳＡは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるバンドシフトと吸収スペクトルとから、ＢＳＡに約１０個のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０誘導体が結合した構造を有していると推測された。前記複合体とクロスリンカー〔（株）同仁化学研究所製、商品名：ＧＭＢＳ〕とを反応させ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＢＳＡの表面にマレイミド基を結合させた。
【０１２２】
得られた反応産物を脱塩カラムで精製して未反応のクロスリンカーを除去した。その後、得られたマレイミド修飾ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＢＳＡ１ｎｍｏｌと、３’末端にチオール基を有するＣＫ１９認識用ＤＮＡ〔配列番号：７、２０塩基、図１８（Ａ）参照〕２ｎｍｏｌとを混合し、０．１５Ｍ 塩化ナトリウム含有リン酸バッファー（ｐＨ７）５０μＬ中、３７℃で３時間反応させた。得られた反応産物を、遠心式フィルター〔ミリポア社製、商品名：アミコンウルトラ−０．５ ３０Ｋカット〕で限外ろ過して未反応のＤＮＡを除去し、ＤＮＡ結合ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＢＳＡを得た。
【０１２３】
（１−２）被検物質の捕捉
試験例１の（１−３）と同様にして得られた作用電極基板（上基板３０）の作用電極６１の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。なお、かかる作用電極基板（上基板３０）の作用電極６１上には、ＣＫ１９ ＤＮＡ捕捉用ＤＮＡ（捕捉物質８１）〔配列番号：４、図１８（Ｃ）〕が固定化されている。
【０１２４】
その後、この作用電極基板（上基板３０）とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、ハイブリダイゼーションバッファー〔東洋紡績（株）製、商品名：Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｈｙｂ〕と被検物質Ｓとして１ｎＭ ＣＫ１９ ＤＮＡ〔（株）北海道システムサイエンス製、１５０塩基、配列番号：５、図１８（Ｄ）参照〕とを入れた。前記作用電極基板（上基板３０）を６０℃で２時間インキュベーションした。これにより、作用電極６１上の捕捉物質８１に、被検物質Ｓを捕捉させた〔図１９（Ａ）参照〕。
【０１２５】
前記反応溶液の排出後、前記空間に、ハイブリダイゼーションバッファー〔東洋紡績（株）製、商品名：Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｈｙｂ〕と１００ｎＭ ＤＮＡ結合ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＢＳＡ（標識結合物質）〔図１９（Ｂ）において、１５０参照〕とを入れた。そして、前記作用電極基板（上基板３０）を６０℃、１時間インキュベーションした。これにより、作用電極６１上の捕捉物質８１に捕捉された被検物質ＳとＤＮＡ結合ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＢＳＡ１５０中に含まれるＤＮＡ１５２（結合物質）とをハイブリダイゼーションさせた〔図１９（Ｂ）参照〕。その後、作用電極６１を０．１質量％Ｔｗｅｅｎ−２０含有６×ＳＳＰＥで洗浄した（実施例３）。
【０１２６】
（２）対照実験
実施例３において、ＤＮＡ結合ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＢＳＡ１５０の代わりに、１００ｎＭ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＣＫ１９認識ＤＮＡ〔（株）日本バイオサービス製、配列番号：９、図１８（Ｂ）、図２０（Ｂ）において、１６０参照〕を用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、作用電極基板（上基板３０）の作用電極６１上に捕捉物質８１と被検物質ＳとＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＣＫ１９認識ＤＮＡ１６０とを含む複合体を形成した〔図２０（Ｂ）参照〕（比較例３）。なお、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＣＫ１９認識ＤＮＡ１６０は、ＣＫ１９認識ＤＮＡ〔図２０（Ｂ）において、１６２参照〕の両末端にＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０〔図２０（Ｂ）において、１６１参照〕を有している。
【０１２７】
（３）光電流の測定
実施例３及び比較例３の各作用電極基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。そして、作用電極基板（上基板３０）とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例２で得られた電解液を充填した。そして、電解液が充填された空間を、作用電極基板の上方から、製造例３で得られた対極基板で密封した。これにより、作用電極及び対極を電解液に接触させた。つぎに、作用電極基板及び対極からなる検出チップを電気化学計測装置に設置し、作用電極リード及び対極リードを電流計に接続した。
【０１２８】
作用電極基板側から対極基板に向けて、光源（波長７８１ｎｍ、出力１３ｍＷのレーザー光源）から光を照射した。光照射により、標識物質が励起され、電子を生じる。そして、前記電子が作用電極に輸送されることにより、作用電極と対極との間に電流が流れる。そこで、この電流を測定した。試験例３において、検出方法の種類と光電流との関係を調べた結果を図２１に示す。
【０１２９】
図２１に示された結果から、標識物質を保持する支持体として、ポリペプチドからなる支持体であるＢＳＡを用いた実施例３においては、検出された電流は約１０ｎＡであることがわかる。これに対して、従来のように、標識物質を保持する支持体として、ポリペプチドからなる支持体を用いない比較例３では、約２．０ｎＡであることがわかる。これらの結果から、標識物質を保持する支持体として、ポリペプチドからなる支持体を用いた被検物質の電気化学的検出方法によれば、ポリペプチドからなる支持体を用いない被検物質の電気化学的検出方法と比べて、約５倍の非常に大きな電流を検出することができることがわかる。
【０１３０】
なお、前述したように、ＤＮＡ結合ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＢＳＡ１５０において、ＢＳＡに付加されたＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０の数は、約１０個であるのに対して、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＣＫ１９認識ＤＮＡにおいて、ＤＮＡに付加されたＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０の数は２個である。したがって、検出される電流値は標識数に比例することから、ポリペプチドからなる支持体を用いた被検物質の電気化学的検出方法によれば、被検物質を定量することができることが示唆される。
【符号の説明】
【０１３１】
１ 検出装置
１１ チップ受入部
１２ ディスプレイ
１３ 光源
１４ 電流計
１５ 電源
１６ 変換部
１７ 制御部
２０ 検出チップ
３０ 上基板
３０ａ 基板本体
３０ｂ 試料注入口
４０ 下基板
４０ａ 基板本体
５０ 間隔保持部材
６１ 作用電極
６６ 対極
６９ 参照電極
７１ 電極リード
７２ 電極リード
７３ 電極リード
８１ 捕捉物質
９０ 標識結合物質
９０ａ 結合体
９０ｂ 標識体
９１ ポリペプチド支持体
９２ 第１結合物質
９３ 標識物質
９４ 第１リンカー
９５ 第２結合物質
９６ 第２リンカー
１０２ 標識物質
１０３ 結合物質
１１０ａ ＤＮＡ結合フェリチン
１１０ｂ 標識体
１１１ 球殻状フェリチン
１１２ ＤＮＡ
１１３ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０
１１５ 標識物質保持用ＤＮＡ
１１６ ＤＮＡ
１１７ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ
１２０ａ ＣＫ１９認識配列−標識保持用ＤＮＡ
１３０ａ ＤＮＡ結合ＢＳＡ
１３０ｂ 標識体
１３１ ＢＳＡ
１３２ ＣＫ１９認識用ＤＮＡ
１３３ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０
１３４ 標識保持用ＤＮＡ結合ＤＮＡ
１３５ 標識物質保持用ＤＮＡ
１３６ ＤＮＡ
１３７ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡ
１４０ａ ＣＫ１９認識配列−標識保持用ＤＮＡ
１５０ ＤＮＡ結合ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＢＳＡ
１５２ ＤＮＡ
１５１ ＢＳＡ
１６０ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＣＫ１９認識ＤＮＡ
１６１ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０
１６２ ＣＫ１９認識ＤＮＡ
Ｓ 被検物質
【配列表フリーテキスト】
【０１３２】
配列番号：１は、マレイミド化ＤＮＡの配列である。
配列番号：２は、標識物質保持用ＤＮＡの配列である。
配列番号：３は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡの配列である。
配列番号：４は、ＣＫ１９ ＤＮＡ捕捉用ＤＮＡの配列である。
配列番号：５は、ＣＫ１９ ＤＮＡの配列である。
配列番号：６は、ＣＫ１９認識配列−標識保持用ＤＮＡの配列である。
配列番号：７は、ＣＫ１９認識用ＤＮＡの配列である。
配列番号：８は、標識保持用ＤＮＡ結合ＤＮＡの配列である。
配列番号：９は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＣＫ１９認識ＤＮＡの配列である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質を電気化学的に検出する方法であって、
（１） 被検物質を含む試料を、この被検物質を捕捉する捕捉物質が固定された作用電極に接触させ、前記捕捉物質によって被検物質を作用電極上に捕捉する工程、
（２） 前記工程（１）で作用電極上に捕捉された被検物質と、標識物質と前記被検物質を捕捉する結合物質とがポリペプチドからなる支持体に少なくとも保持された標識結合物質とを含む複合体を形成させる工程、及び
（３） 前記工程（２）で得られた作用電極上に存在する標識物質を電気化学的に検出する工程、
を含む被検物質の電気化学的検出方法。
【請求項２】
前記工程（２）において、前記標識結合物質を、前記工程（１）で作用電極上捕捉された被検物質に接触させ、前記複合体を形成させる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（２）において、前記被検物質を捕捉する結合物質がポリペプチドからなる支持体に少なくとも保持され、かつ標識物質を結合する結合体を、前記工程（１）で作用電極上に捕捉された被検物質に接触させ、その後、被検物質に結合した前記結合体に、標識物質を結合させて、前記被検物質と、標識物質と前記被検物質を捕捉する結合物質とがポリペプチドからなる支持体に少なくとも保持された標識結合物質とを含む複合体を形成させる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリペプチドがアルブミン又はフェリチンである請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記標識結合物質中のポリペプチドからなる支持体と標識物質とがリンカーを介して連結されている請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記標識物質が、光化学的又は電気化学的に活性な物質である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
被検物質を電気化学的に検出する方法であって、
（１） 被検物質を含む試料を、この被検物質を捕捉する捕捉物質が固定された作用電極に接触させ、前記捕捉物質によって被検物質を作用電極上に捕捉する工程、
（２） 前記工程（１）で作用電極上に捕捉された被検物質と、標識物質と前記被検物質を捕捉する結合物質とがポリペプチドからなる支持体に少なくとも保持された標識結合物質とを含む複合体を形成させる工程、及び
（３） 前記工程（２）で得られた作用電極上に存在する標識物質を電気化学的に検出する工程、
を含む被検物質の電気化学的検出方法。
【請求項２】
前記工程（２）において、前記標識結合物質を、前記工程（１）で作用電極上捕捉された被検物質に接触させ、前記複合体を形成させる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（２）において、前記被検物質を捕捉する結合物質がポリペプチドからなる支持体に少なくとも保持され、かつ標識物質を結合する結合体を、前記工程（１）で作用電極上に捕捉された被検物質に接触させ、その後、被検物質に結合した前記結合体に、標識物質を結合させて、前記被検物質と、標識物質と前記被検物質を捕捉する結合物質とがポリペプチドからなる支持体に少なくとも保持された標識結合物質とを含む複合体を形成させる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリペプチドがアルブミン又はフェリチンである請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記標識結合物質中のポリペプチドからなる支持体と標識物質とがリンカーを介して連結されている請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記標識物質が、光化学的又は電気化学的に活性な物質である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図１０】
【図１４】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図１０】
【図１４】
【図１８】
【公開番号】特開２０１２−２２５８８５（Ｐ２０１２−２２５８８５Ａ）
【公開日】平成２４年１１月１５日（２０１２．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−９６３４１（Ｐ２０１１−９６３４１）
【出願日】平成２３年４月２２日（２０１１．４．２２）
【出願人】（５０４１４３４４１）国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学 (226)
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【公開日】平成２４年１１月１５日（２０１２．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月２２日（２０１１．４．２２）
【出願人】（５０４１４３４４１）国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学 (226)
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
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