被検物質検出方法および被検物質検出装置
【課題】微小な流路を備えた検出チップを用いた被検物質検出方法において、前処理を必要とせず、容易かつ迅速に上記の流路の目詰まりや免疫反応の阻害を防止できるとともに、検査間で溶血率のばらつきのない検査を可能とする。
【解決手段】流路１１を有する流路基材１２、および、流路１１の所定領域に形成された検出部１５を備えた検出チップＣ１を用い、被検物質Ａを含有する可能性があり細胞性の非被検物質を含有する液体試料Ｓを流路１１に流入させ、検出部１５よりも上流側に設けられた超音波照射部２０によって、流路１１の長さ方向に垂直な方向から流路１１内の液体試料Ｓに対して、流路１１内に定在波Ｕを生じせしめるように超音波を照射する。
【解決手段】流路１１を有する流路基材１２、および、流路１１の所定領域に形成された検出部１５を備えた検出チップＣ１を用い、被検物質Ａを含有する可能性があり細胞性の非被検物質を含有する液体試料Ｓを流路１１に流入させ、検出部１５よりも上流側に設けられた超音波照射部２０によって、流路１１の長さ方向に垂直な方向から流路１１内の液体試料Ｓに対して、流路１１内に定在波Ｕを生じせしめるように超音波を照射する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微小な流路を備えた検出チップを用いた被検物質検出方法および被検物質検出装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、微細加工技術を応用して形成されたマイクロレベルの微小な流路を備えた検出チップを用い、免疫反応を利用した生化学検査（免疫検査）が盛んに研究されている。流路を微細化することで、生体から採取する試料の必要量を微量にすることができるとともに、検出チップを含む装置全体を小型化することができる。さらに、検出チップを含む装置全体を小型化することで、診療所や家庭などで診断を行うＰＯＣＴ（Point Of Care Testing：その場診断）を実現することが可能となる。免疫検査は、各種の診断や観察に広く利用され、臨床検査として重要な検査法となっており、現在では各種の免疫検査装置が開発され、多数の検査項目を同時に検査する等、高度の分析が可能となっている。
【０００３】
免疫検査では、通常、検査試料として血液が用いられる。血液は、血球成分（または細胞性成分ともいう。赤血球、白血球および血小板などを指す。）と血漿成分（または液性成分ともいう。血漿、または血漿から凝固因子を除去した血清を指す。）とから構成されるが、検査試料としては血漿成分が用いられることが多い。
【０００４】
血漿成分を検査試料とし、上記のような検出チップを用いて検査を行う場合には、通常、採血した血液を遠心分離して、血漿成分に比べて大きな比重を有する血球成分を除去（血球分離）する前処理が行われる。これは、人の血液中の血球成分を構成する赤血球（血球成分中の構成比：９６％）、白血球（３％）および血小板（１％）の大きさが、それぞれ約８μｍ、約６〜２２μｍおよび約１〜４μｍと上記流路に対し大きいため、上記のような検出チップを用いて血液診断を行う場合には、このような血球成分（特に赤血球）によって流路が目詰まりを起こしたり免疫反応が阻害されたりするといった問題が生じるためである。しかし、このような前処理を行う場合には、遠心分離装置を要する、血球成分と血漿成分の比重差がほとんどないため長時間の遠心分離作業を要する、および作業工程数が増える等の別の問題が生じる。
【０００５】
一方、上記のような前処理を必要とせず、血球分離を行う他の方法としては、血球分離膜を流路の上流側に設けて血液を点着するだけで血球成分を分離する方法（特許文献１）が挙げられる。しかしながら、このような血球分離膜を用いた方法でも、流路の目詰まりは解決できるものの、血球分離膜の目詰まりが起きる可能性は排除できず、必要な量の検査試料が流路を流下しないといった問題や、迅速な測定が阻害されるといった問題が生じる場合がある。ポンプ等によって正圧または負圧を印加することにより血球分離膜を用いても血球分離を迅速に行うことは可能であるが、結局余計な作業が増加することとなる。
【０００６】
そこで、上記のような前処理を必要とせず、容易かつ迅速に上記の流路の目詰まりや免疫反応の阻害という問題を解決することが可能な方法が提案されている。例えばこのような方法として、検査試料に界面活性剤を添加して血球成分の細胞膜を化学的に破壊することにより血液を溶血する方法（特許文献２）や、流路中の検査試料に超音波を照射して血球成分の細胞膜を物理的に破壊することにより血液を溶血する方法（特許文献３）が挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００２−５０８６９８号公報
【特許文献２】特開２００７−１６３１８２号公報
【特許文献３】特開２００９−２０７４５９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、特許文献２のように界面活性剤を用いた場合、この界面活性剤の添加により、検査試料全体としての流体力学物性（粘性および表面張力等）が変動してしまって、流路内での流速等の流動状態も変動してしまうため、拡散律速等を引き起こし免疫反応速度の制御が困難になるという問題が生じうる。
【０００９】
また、特許文献３のように単に超音波を照射しただけでは、超音波による音響放射圧分布が流路内の場所や時間によって不規則に変動し、音響場を通過した血球の溶血率（血球成分のうち細胞膜が破壊され溶血した血球成分の割合）が検査間で一定しないという問題がある。一方、溶血率を検査間で一定にするためには超音波を長時間照射する必要があるという問題もある。
【００１０】
本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、微小な流路を備えた検出チップを用いた被検物質検出方法において、前処理を必要とせず、容易かつ迅速に上記の流路の目詰まりや免疫反応の阻害を防止できるとともに、検査間で溶血率のばらつきのない検査を可能とする被検物質検出方法および被検物質検出装置を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために、本発明に係る被検物質検出方法は、流路と、流路に接続された、流路に液体試料を流入させるための流入口と、流路に接続された、流入口から流入した液体試料を流路に流入させるための空気口とを有する流路基材、および、流路の所定領域に形成された検出部を備えた検出チップを用い、
被検物質を含有する可能性があり細胞性の非被検物質を含有する液体試料を流路に流入させ、
検出部よりも上流側に設けられた超音波照射部によって、流路の長さ方向に垂直な方向から流路内の液体試料に対して、流路内に定在波を生じせしめるように超音波を照射し、
被検物質を、検出部に固定された、被検物質と特異的に結合する固定化結合物質で検出することを特徴とするものである。
【００１２】
本明細書において、「検出部」とは、被検物質を検出するための領域を意味する。例えば、被検物質（例えば抗原）と特異的に結合する固定化結合物質（例えば抗体）が流路壁面上に固定されているような場合には、この固定化結合物質が固定されている流路壁面上の領域が検出部となる。また、この検出部には、流路壁面上に表面プラズモンを発生させるための金属膜等が含まれていてもよい。
【００１３】
「流路の長さ方向に垂直な方向」とは、流路の高さ方向または流路の幅方向を意味する。
【００１４】
「固定化結合物質」とは、特異的に結合する対の物質の一方である被検物質に対する他方の物質であって、検出部に固定されたものを意味する。なお、「特異的に結合する対の物質」とは、抗原および抗体、もしくはタンパク質および補因子等のように、一方の物質と他方の物質とが特異的に認識し合って結合する関係にある対の物質を意味する。
【００１５】
さらに、本発明に係る被検物質検出方法において、超音波照射部によって、流路内に時間的および／または空間的に分離された２つ以上の定在波をそれぞれ生じせしめるように、異なる周波数の２つ以上の超音波を時間的および／または空間的に分離して照射することが好ましい。
【００１６】
本明細書において、「時間的および／または空間的に分離された２つ以上の定在波」とは、異なる時間帯および／または異なる場所に形成された、周波数の異なる２つ以上の定在波を意味する。なお、周波数を連続的に変調しながら定在波を形成した場合には、その瞬間々々の定在波それぞれが別個の定在波であるとする。
【００１７】
異なる周波数の２つ以上の超音波を「時間的および／または空間的に分離して照射する」とは、異なる時間帯および／または異なる場所で周波数の異なる超音波を照射することを意味する。なお、周波数を連続的に変調しながら超音波を照射した場合には、その瞬間々々の超音波それぞれが別個の超音波であるとする。
【００１８】
さらに、本発明に係る被検物質検出方法において、１つの超音波照射素子のみからなる上記超音波照射部を用い、超音波照射素子によって、周波数を時間的に変調しながら超音波を照射することにより、上記異なる周波数の２つ以上の超音波を時間的に分離して照射することができる。この場合、上記異なる周波数の２つ以上の超音波のうち１つの超音波に起因して生じせしめられた定在波の腹の位置が、他の超音波に起因して生じせしめられた定在波の節の位置となるように、周波数を変調することが好ましい。
【００１９】
本明細書において、「１つの超音波に起因して生じせしめられた定在波の腹の位置が、他の超音波に起因して生じせしめられた定在波の節の位置となる」とは、ある定在波の節と他の定在波の腹とが、同時に存在することはないが実質的に同一の場所に形成される状態を意味する。実質的に同一の場所に形成される状態とは、被検物質の液体試料中の拡散等を考慮し、ある定在波の節と他の定在波の節とが重ならないように、これらの定在波が形成される状態を意味する。少なくとも１対の定在波の１対の腹および節が実質的に同一の場所に形成されていればよい。
【００２０】
さらに、本発明に係る被検物質検出方法において、流路の長さ方向に沿って設けられた２つ以上の超音波照射素子からなる上記超音波照射部を用い、この２つ以上の超音波素子によって、それぞれ異なる周波数の超音波を照射することにより上記異なる周波数の２つ以上の超音波を空間的に分離して照射することができる。この場合、上記異なる周波数の２つ以上の超音波のうち１つの超音波に起因して生じせしめられた定在波の腹の位置が、他の超音波に起因して生じせしめられた定在波の節の位置に、流路の長さ方向に沿って対応するように、周波数を異ならせることが好ましい。また、上記異なる周波数の２つ以上の超音波のうち少なくとも１つの超音波の周波数を変調することが好ましい。
【００２１】
本明細書において、「１つの超音波に起因して生じせしめられた定在波の腹の位置が、他の超音波に起因して生じせしめられた定在波の節の位置に、流路の長さ方向に沿って対応する」とは、ある定在波の節の位置と他の定在波の腹の位置とが実質的に同一の流線上に存在する状態を意味する。実質的に同一の流線上に存在する状態とは、被検物質の液体試料中の拡散等を考慮し、ある定在波の節と他の定在波の節とが同一の流線上に存在しないように、これらの定在波が形成される状態を意味する。これは、例えば流路幅が一定で物質および分子等の液体試料中の拡散が無視できる範囲において言い換えれば、流路の長さ方向からこれらの定在波が生じている流路断面を眺めた場合に、１つの定在波の節と他の定在波の腹が重なるような状態ということもできる。少なくとも１対の定在波の１対の腹および節が重なっていればよい。
【００２２】
さらに、検出チップとして、定在波が生じうる領域の流路の壁面に音響整合層が設けられた検出チップを用いることが好ましい。
【００２３】
一方、本発明に係る被検物質検出装置は、
流路と、流路に接続された、流路に液体試料を流入させるための流入口と、流路に接続された、流入口から流入した液体試料を流路に流入させるための空気口とを有する流路基材、および、流路の所定領域に形成された検出部を備えた検出チップと、
検出部よりも上流側に設けられた、流路の長さ方向に垂直な方向から流路内の液体試料に対して超音波を照射する超音波照射部と、
流路内に定在波を生じせしめるように超音波照射部を制御する超音波制御部とを備えることを特徴とするものである。
【００２４】
さらに、本発明に係る被検物質検出装置において、超音波照射部が、１つの超音波照射素子のみからなるものであり、超音波制御部が、周波数を時間的に変調することにより、異なる周波数の２つ以上の超音波を時間的に分離して照射するように、超音波照射素子を制御するものであることが好ましく、或いは、超音波照射部が、流路の長さ方向に沿って設けられた２つ以上の超音波照射素子からなるものであり、超音波制御部が、それぞれ異なる周波数の超音波を照射することにより、異なる周波数の２つ以上の超音波を空間的に分離して照射するように、超音波照射素子を制御するものであることが好ましい。
【発明の効果】
【００２５】
本発明に係る被検物質検出方法は、微小な流路を備えた検出チップを用いた被検物質検出方法において、被検物質を含有する可能性があり細胞性の非被検物質を含有する液体試料を流路に供給し、検出部よりも上流側に設けられた超音波照射部によって、流路の長さ方向に垂直な方向から流路内の液体試料に対して、流路内に定在波を生じせしめるように超音波を照射するものである。したがって、超音波によって物理的に細胞性の非被検物質を破壊することができるため、前処理を必要とせず、容易かつ迅速に上記の流路の目詰まりや免疫反応の阻害を防止することができる。一方、流路内に定在波を生じせしめているから、腹および節の位置が固定され音響放射圧分布が一定となり、検査間で溶血率のばらつきのない検査が可能となる。この結果、前処理を必要とせず、容易かつ迅速に上記の流路の目詰まりや免疫反応の阻害を防止できるとともに、検査間で溶血率のばらつきのない検査が可能となる。
【００２６】
さらに、本発明に係る被検物質検出装置は、流路と、流路に接続された、流路に液体試料を流入させるための流入口と、流路に接続された、流入口から流入した液体試料を流路に流入させるための空気口とを有する流路基材、および、流路の所定領域に形成された検出部を備えた検出チップと、検出部よりも上流側に設けられた、流路の長さ方向に垂直な方向から流路内の液体試料に対して超音波を照射する超音波照射部と、流路内に定在波を生じせしめるように超音波照射部を制御する超音波制御部とを備え、超音波照射部によって、流路の長さ方向に垂直な方向から流路内の液体試料に対して、流路内に定在波を生じせしめるようにしている。この結果、上記被検物質検出方法と同様に、前処理を必要とせず、容易かつ迅速に上記の流路の目詰まりや免疫反応の阻害を防止できるとともに、検査間で溶血率のばらつきのない検査が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】本発明の第１の実施形態の被検物質検出方法に用いる検出装置を示す概略断面図である。
【図１Ｂ】本発明の第１の実施形態の被検物質検出方法に用いる検出チップを示す概略上面図である。
【図１Ｃ】本発明の第１の実施形態の被検物質検出方法に用いる検出チップを示す概略断面図である。
【図２】本発明の第１の実施形態の被検物質検出方法によってサンドイッチ法による免疫検査を行う工程を示す概略断面図である。
【図３】（ａ）（ｂ）第１の実施形態において、それぞれ異なる時間帯に異なる周波数の超音波によって定在波を生じせしめた様子を示す概略断面図である。
【図４】本発明の第２の実施形態の被検物質検出方法に用いる検出チップを示す概略断面図である。
【図５】第２の実施形態において、異なる場所で異なる周波数の超音波によって定在波を生じせしめた様子を示す概略断面図である。
【図６】本発明の第３の実施形態の被検物質検出方法に用いる検出チップを示す概略断面図である。
【図７】第３の実施形態において、異なる場所で異なる周波数の超音波によって定在波を生じせしめた様子を示す概略断面図である。
【図８】第３の実施形態において、異なる場所で同一の周波数の超音波によって定在波を生じせしめた様子を示す概略断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明の実施形態について図面を用いて説明するが、本発明はこれに限られるものではない。なお、視認しやすくするため、図面中の各構成要素の縮尺等は実際のものとは適宜異ならせてある。
【００２９】
「第１の実施形態の被検物質検出方法」
まず、被検物質検出方法の第１の実施形態について説明する。図１Ａは、本実施形態の被検物質検出方法に用いる検出装置を示す概略断面図である。また、図１Ｂおよび図１Ｃはそれぞれ、本実施形態の被検物質検出方法に用いる検出チップＣ１を示す概略上面図、本実施形態の被検物質検出方法に用いる検出チップＣ１を示す概略断面図である。なお、本実施形態においては、特異的に結合する対の物質の具体例として抗原および抗体を用いて、被検物質を抗原、この被検物質と特異的に結合する物質を抗体として、蛍光標識を用いたサンドイッチ法によって分析する場合を例として説明する。
【００３０】
本実施形態の被検物質検出方法は、図２に示すように、流路１１と、流路１１に接続された、流路１１に液体試料を流入させるための流入口１４ａと、流路１１に接続された、流入口１４ａから流入した液体試料を流路１１に流入させるための空気口１４ｂとを有する流路基材１２、流路１１の所定領域に形成された検出部１５、および、検出部１５よりも上流側に乾燥配置された蛍光標識抗体ＢＦを備えた検出チップＣ１を用い、抗原Ａを含有する可能性がある全血試料Ｓを流路１１に流入させ、蛍光標識抗体ＢＦが乾燥配置された領域よりも上流側に設けられた超音波照射部２０によって、流路１１の長さ方向に垂直な方向から流路１１内の全血試料Ｓに対して、流路１１内に周波数の異なる定在波Ｕを周期的に生じせしめるように、周波数を周期的に変調しながら超音波を照射し、この定在波Ｕの腹の音響放射圧で全血試料Ｓ中の血球成分の細胞膜を破壊することで、流路１１の目詰まりなく全血試料Ｓを流路１１に流下せしめ、全血試料Ｓを蛍光標識抗体ＢＦと接触せしめるとともに抗原Ａを蛍光標識抗体ＢＦによって標識し、この抗原Ａおよび蛍光標識抗体ＢＦの複合体を検出部１５上の固定化抗体Ｂ１に固定し、図１Ａに示すように、測定光Ｌｅを照射して検出部１５上の上記複合体中の蛍光標識Ｆからの蛍光信号Ｌｆを光検出器２３で検出して、全血試料Ｓ中の抗原Ａの有無および／または量を検出することを特徴とするものである。
【００３１】
また、本発明の被検物質検出装置は、図１Ａに示すように、上記検出チップＣ１と、検出部よりも上流側に設けられた、流路の長さ方向に垂直な方向から流路内の液体試料に対して超音波を照射する超音波照射部２０と、流路内に定在波を生じせしめるように超音波照射部を制御する超音波制御部２１と、光源２２と、光検出器２３とを備えるものである。
【００３２】
上記の被検物質検出方法および装置に用いられる検出チップＣ１は、主として流路１１を有する流路基材１２および流路１１内の検出部１５から構成される。
【００３３】
流路基材１２は、コ文字型の溝が形成された流路部材１３とこの溝に蓋をする蓋部材１４とからなるものであり、樹脂から形成されたものが好ましく、この場合は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンを含む非晶性ポリオレフィン（ＡＰＯ）、ポリスチレン、およびゼオネックス（登録商標）等の樹脂を用いることがより好ましい。
【００３４】
流路１１は、流路部材１３上に形成されたコ文字型の溝に蓋をするように、蓋部材１４が流路部材１３に装着されることにより形成される。本明細書において、流路１１の幅および高さ（いずれも試料の進行方向と垂直な方向の長さ）は、特に限定されないが、幅１０ｍｍ以下、厚み２ｍｍ以下である場合、特に幅３ｍｍ以下、厚み５００μｍ以下である場合に流路１１の目詰まりが顕著に表れるため、このような範囲にある幅および厚みを有する流路を用いた検査に対して本発明は特に効果的である。本実施形態においては、具体的には幅２ｍｍおよび厚み３１４μｍの流路１１である。さらに、流路１１の両端には流入用或いは廃液用の液溜め１１ａおよび１１ｂが形成されている。
【００３５】
また、流路１１の所定領域には、検出部となる金属膜が形成されている。これにより、金属膜に生じるプラズモンによる増強場Ｅｗを利用した高感度の分析方法と組み合わせることができる。例えば、金属膜が金属材料のベタ膜である場合には、表面プラズモン共鳴法、表面プラズモン増強蛍光法やＳＰＣＥ（surface plasmon-coupled emission）法と組み合わせることができ、金属膜が配列された金属微粒子からなる層である場合には、局在表面プラズモン共鳴法と組み合わせることができる。金属膜の材料としては、特に制限されるものではなく、例えばプラズモンを効率よく誘起する観点から、Ａｕ，Ａｇ，Ｃｕ，Ｐｔ，Ｎｉ，Ｔｉ等が挙げられ、電場増強効果の高いＡｕ，Ａｇ等が特に好ましい。金属膜の厚みは、金属膜の材料と、測定光Ｌｅの波長により表面プラズモンが強く励起されるように適宜定めることが望ましい。例えば、測定光Ｌｅとして７８０ｎｍに中心波長を有するレーザ光を用い、金属膜として金（Ａｕ）膜を用いる場合、金属膜の厚みは５０ｎｍ±５ｎｍが好適である。
【００３６】
さらに、流路１１には超音波を効率よく反射させるための反射板１７が設けられている。反射板１７は、超音波をより効率的に反射させる（つまり、定在波Ｕをより効率的に生じせしめる）ため、後述する超音波照射部２０に対向するように設けられている層である。反射板１７は、超音波の反射率を上げるため、反射板１７および液体試料Ｓの音響インピーダンスの差が大きくなるような材料を用いることが好ましい。その材料としては、ガラス等の誘電材料、アルミニウム等の金属材料を挙げることができる。反射板１７は、図１Ｃに示すように流路１１の内壁（図では蓋部材１４）の一部となるように埋め込まれるように形成されてもよいし、流路１１の内壁面上に形成されてもよい。また、反射板１７は、液体試料と音響インピーダンスが異なっているという点では流路基材１２そのものでもよい、つまり流路基材１２が反射板としての機能を兼ねてもよい。しかしながら、音響インピーダンスの大小に基づく材料選択という観点から、流路基材１２とは異なる材料で反射板１７を別途設けることが好ましい。
【００３７】
蓋部材１４は、流路部材１３に装着することにより流路１１の上面を形成するためのものである。また、蓋部材１４は、流入用の液溜め１１ａに接続する試料等を流入するための流入口１４ａ、および廃液用の液溜め１１ｂに接続する空気等を抜くための空気口１４ｂを有している。蓋部材１４は、上記金属膜１６が形成されたあとに、超音波融着等により流路部材１３に装着される。
【００３８】
本実施形態における液体試料Ｓは、人から採決したままの全血試料であり、細胞性の非被検物質は全血中の血球成分となる。しかしながら、これに限られず希釈剤等によって希釈された血液でもよい。また、血液の他にも、液体試料として、例えば尿を採用することもできる。つまり、尿中の８−ＯＨｄＧ（酸化ストレスマーカー）を検出するときに、尿中に混じった赤血球などの細胞成分を除去する場合に本発明が適用できる。
【００３９】
また、流路１１の上流側には、蛍光標識抗体ＢＦが乾燥配置されている。蛍光標識抗体ＢＦは、抗体Ｂ２が修飾された蛍光標識Ｆである。本実施形態の場合には、具体的には、この蛍光標識抗体ＢＦは、抗原Ａ（被検物質）と特異的に結合する修飾化抗体Ｂ２（修飾化結合物質）と、この修飾化抗体Ｂ２（修飾化結合物質）が修飾された蛍光標識Ｆ（標識物質）とからなる。これにより、抗体Ｂ２が抗原Ａと特異的に結合することにより抗原Ａおよび蛍光標識抗体ＢＦの複合体が形成される。このように蛍光標識抗体ＢＦを流路１１内に乾燥配置することにより、別途抗原Ａを標識する作業を行う必要がない。蛍光標識Ｆ（標識物質）は特に制限されず蛍光色素、量子ドット等を用いることができる。特に蛍光標識Ｆ（標識物質）としては、蛍光検出の感度を稼ぐために、例えばポリスチレン粒子の内部に複数の蛍光色素、量子ドット等が包含された蛍光粒子（標識粒子）を用いることが好ましい。標識粒子の大きさは、後述する定在波の捕捉力が物質の体積に比例することや拡散速度の観点から、０．０５μｍ〜１０ｍｍ程度が好ましく、０．１μｍ〜１ｍｍがさらに好ましい。また、本実施形態では、試料を流路１１に供給したあとに流路１１内で標識を行っているが、抗原Ａを標識するタイミングは、特に制限されず、流路１１に供給する前に抗原Ａと標識とを反応させてもよい。
【００４０】
検出部１５は、抗原Ａを検出するための固定化抗体Ｂ１が固定されている金属膜１６を含む領域である。検出部１５は、１つであっても複数であっても構わない。異なる種類の固定化抗体Ｂ１が固定された検出部１５が複数ある場合には、複数の抗原を検出することができるため、いわゆる多項目アレイ分析測定が可能となる。固定化抗体Ｂ１は、抗原Ａに対して特異的に結合する抗体である。このような抗体は、特に制限されるものではなく、検出条件（特に抗原Ａ）に応じて適宜選択することができる。例えば、抗原ＡがｈＣＧ抗原（分子量３８０００ Ｄａ）の場合、この抗原Ａと特異的に結合するモノクロナール抗体等を用いることができる。固定化方法としては、金属膜１６に対して物理的に吸着させる方法、金属膜１６に表面修飾を施すことによってカルボキシル基、アミノ基、チオール基、などの官能基を導入し、そこに静電的にまたは化学結合を介して固定化する方法などが挙げられる。
【００４１】
超音波照射部２０は、検出部１５よりも上流側に設けられ、流路１１の長さ方向に垂直な方向（本実施形態では図１Ａ中の紙面内下方）から流路１１内の全血試料に対して、流路１１内に定在波を生じせしめるように、超音波を照射するものである。これにより、図１中の流路１１の上下の壁面間で定在波Ｕが生じる。超音波照射部２０は、例えば超音波振動子である。超音波振動子は、圧電セラミクス、またはフッ化ポリビニルピロリドンのような高分子フィルムのような圧電素子であり、例えばＰＺＴ−Ｐｂ（Ｚｒ・Ｔｉ）Ｏ３ 系 ・ソフト材Ｃ−８２（商品名、株式会社富士セラミックス）を用いることが好ましい。超音波照射部２０は、本実施形態では１つの超音波照射素子（例えば超音波振動子）によって構成されているが、後述するように２以上の超音波照射素子によって構成されてもよい。つまり、本実施形態では、１つの超音波照射素子を用いかつ周波数を変調することにより、時間的に分離された異なる周波数の超音波を照射している。超音波照射部２０は、流路１１内の液体試料Ｓに直接接するように流路１１の壁面を構成していても良いが、装置を繰り返し使う場合を考慮すると、超音波照射部２０は流路基材１２を介して流路１１に超音波を照射することが好ましい。超音波の周波数は、超音波を照射する方向に沿った流路１１の長さに応じて適宜設定できるが、１００ｋＨｚ〜１００ＭＨｚが好ましく、特に３ＭＨｚ程度が好ましい。超音波の周波数は、経時的に一定でもよいが、効率的に血球成分（細胞性の非被検物質）を破壊するために、経時的および／または周期的に変調すること、例えば連続的に掃引したり断続的に変化させたりすることが好ましい。
【００４２】
超音波制御部２１は、流路１１内に定在波Ｕが生じるように、超音波照射部２０を制御するものである。超音波制御部２１は、電源、超音波用の発振回路、変調回路および出力回路等を有する個別のユニットとすることもできる。また、超音波制御部２１は、必要に応じて超音波の波形を自由に加工し得る回路等、付加的な回路を設けることもできる。例えば、超音波制御部２１は、マルチファンクションジェネレータＷＦ１９７４（株式会社エヌエフ回路設計ブロック製）を用いることができる。駆動電圧の波形は正弦波、方形波、三角波、ランプ波など任意の波形を用いることができる。
【００４３】
光源２２は、例えばレーザ光源等でもよく、特に制限はないが、検出条件に応じて適宜選択することができる。また、光源２２は、前述のように、検出チップＣ１の流路基材１２と金属膜１６との界面で、測定光Ｌｅが全反射すると共に金属膜１６で表面プラズモン共鳴する共鳴角で入射するように配置されている。なお、測定光Ｌｅは、一般的には表面プラズモンを誘起するようにＰ偏向で界面に対して入射させることが好ましい。
【００４４】
光検出器２３は、蛍光標識Ｆからの蛍光Ｌｆを検出するものである。光検出器２３としては、ＣＣＤ、ＰＤ（フォトダイオード）、フォトマルチプライア、ｃ−ＭＯＳ等を適宜用いることができる。特に検出感度の観点から、冷却ＣＣＤを用いることが好ましい。
【００４５】
以下、上記検出チップＣ１を用いた本実施形態の被検物質検出方法によって、被検物質である抗原Ａを含む全血試料Ｓについて、サンドイッチ法によるアッセイを行う手順について図２を参照して詳細に説明する。
Ｓｔｅｐ１：まず、上記検査チップＣ１の流入口１４ａから検査対象である試料Ｓを流入する。
Ｓｔｅｐ２：試料Ｓを流入した後、超音波照射部２０によって流路１１の厚み方向に、周波数を周期的に変調しながら超音波を照射して、流路１１内に定在波Ｕを生じせしめる。
Ｓｔｅｐ３：試料Ｓが毛細管現象で流路１１に染み出す。この際、試料Ｓは定在波Ｕが生じている領域（定在波領域）を通過するが、この定在波Ｕの音響放射圧の力学的作用によって血球成分が破壊される一方で、抗原Ａは、血球成分に比して小さいので音響放射圧の影響をそれほど受けず、定在波領域をそのまま通過する。反応を早め、検出時間を短縮するために、空気口１４ｂにポンプを接続し、試料Ｓをポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。
Ｓｔｅｐ４：定在波領域を通過した試料Ｓと蛍光標識抗体ＢＦ（修飾化抗体Ｂ２が付与された蛍光粒子Ｆ）とが混ぜ合わされ、試料Ｓ中の抗原Ａが蛍光標識抗体ＢＦと結合しながら、流路１１をさらに流下していく。
Ｓｔｅｐ５：試料Ｓは流路１１に沿って空気口１４ｂ側へと徐々に流れ、蛍光標識抗体ＢＦと結合した抗原Ａが、検出部１５上に固定されている固定化抗体Ｂ１と結合し、抗原Ａが固定化抗体Ｂ１と蛍光標識抗体ＢＦで挟み込まれたいわゆるサンドイッチ構造が形成される。
Ｓｔｅｐ６：検出部１５に固定されなかった蛍光標識抗体ＢＦの一部が検出部１５上に残っている場合があっても、後続の試料Ｓが洗浄の役割を担い、流路１１中に浮遊或いは検出部１５上に非特異吸着している蛍光標識抗体ＢＦを洗い流す。検出部１５上を通過した試料Ｓは廃液溜め１１ｂに溜められる。
【００４６】
これらの工程の後、検出部１５に測定光Ｌｅを照射し、蛍光標識Ｆからの蛍光信号Ｌｆを検出することで、抗原Ａを検出することができる。
【００４７】
以下、本実施形態において、本発明の効果について詳細に説明する。
前述したように、微小な流路１１を備えた検出チップＣ１を用いて、被検物質および細胞性の非被検物質を含有する液体試料Ｓ（例えば全血）の検査を行う被検物質検出方法において、前処理を必要とせず、容易かつ迅速に上記の流路１１の目詰まりや免疫反応の阻害を防止できるとともに、検査間で溶血率のばらつきのない検査を可能とするために、本発明では超音波照射部２０によって流路１１内に定在波を生じせしめることを特徴とする。
【００４８】
例えば、流路１１の厚みが約３１４μｍである上記検出チップＣ１の流路１１に、超音波照射部２０によって２．５ＭＨｚと５．０ＭＨｚの周波数の超音波を周期的に照射した場合を考える。流路１１内は全血試料Ｓにより満たされているため、流路１１内の音速は１５７０ｍ／ｓである。この場合、それぞれ図３ａおよび図３ｂのような定在波Ｕ１およびＵ２が生じる。２．５ＭＨｚの周波数の超音波に起因して生じせしめられた定在波Ｕ１は、図３ａに示すように流路壁面上に腹および流路１１内に節を１つ有するものとなり、５．０ＭＨｚの周波数の超音波に起因して生じせしめられた定在波Ｕ２は、図３ｂに示すように流路壁面上に腹および流路１１内に節を２つ有するものとなる。つまり、定在波Ｕ１の腹から腹までの距離は３１４μｍであり、定在波Ｕ２の腹から腹までの距離は１５７μｍとなる。全血試料Ｓを流路１１の上流から流下させると血球成分はこの定在波領域を通過することになるが、定在波Ｕの場合には音響放射圧分布が空間的に固定されるため、腹の位置か節の位置かで破壊されやすさの違いはあるが、安定した溶血率を得ることができる。さらに、上記のように周波数を変調して腹の位置と節の位置を周期的に切り替えることにより、ある定在波の節の位置に濃縮させた血球成分を他の定在波の腹の音響放射圧で破壊でき効率的に溶血を行うことができる。これは、定在波の節近傍に位置する物質に節方向に働く捕捉力が働くためである。
【００４９】
この捕捉力は、直近の節の方向に働く力であり、その大きさＦ０は、下記式（１）に示すように物質Ｍの体積Ｖおよび音波周波数ｆ等に比例する。
式（１）：
【数１】
ここで、Ｆ０は捕捉力の大きさ、ｚは定在波Ｕ端部からの距離、ρ０は媒質の密度、ｃ０は媒質における音速、Ｖは物質Ｍの体積、Ｐ０は音圧、ｆは音波周波数、λは音波の波長を表す。或いは、捕捉力の大きさは、音響放射圧ポテンシャルの勾配に比例するともいえる。したがって、定在波Ｕの腹の位置に近い物質Ｍほど捕捉力Ｆ０は大きくなり、節の位置ではほとんど働かない。ここで、音響放射圧ポテンシャルとは、定在波音響場中の力学的なポテンシャルを意味する。
【００５０】
溶血されなかった血球成分は、免疫反応の阻害、或いは光学的測定における信号光の散乱および検出部への吸収等によって信号ノイズに大きな影響を与えて、検査の信頼性を低下させる。しかしながら、本実施形態のように、例えば周期的に周波数を切り替えながら定在波を生じせしめ、異なる周波数の定在波の節および腹を利用することにより、分布が一定かつ進行波の音響放射圧よりも高い音響放射圧（定在波の腹の振幅は進行波の２倍となる。）によって、従来の進行波を照射する場合よりも、検査間で溶血率が均一となりかつ高い溶血率を実現することが可能となる。
【００５１】
以上のように、本発明に係る被検物質検出方法は、微小な流路を備えた検出チップＣ１を用いた被検物質検出方法において、被検物質を含有する可能性があり細胞性の非被検物質を含有する液体試料を流路に供給し、検出部よりも上流側に設けられた超音波照射部によって、流路の長さ方向に垂直な方向から流路内の液体試料に対して、流路内に定在波を生じせしめるように超音波を照射するものである。したがって、超音波によって物理的に細胞性の非被検物質を破壊することができるため、前処理を必要とせず、容易かつ迅速に流路の目詰まりや免疫反応の阻害を防止することができる。一方、流路内に定在波を生じせしめているから、腹および節の位置が空間的に固定され音響放射圧分布が一定となり、検査間で溶血率のばらつきのない検査が可能となる。この結果、前処理を必要とせず、容易かつ迅速に上記の流路の目詰まりや免疫反応の阻害を防止できるとともに、検査間で溶血率のばらつきのない検査が可能となる。
【００５２】
さらに、本発明に係る被検物質検出方法は、通常の進行波よりも高い音響放射圧を有する定在波を利用しているため、細胞性の非被検物質の破壊を進行波によって実施するよりも容易に実施することが可能となる。
【００５３】
さらに、本実施形態では周期的に周波数を切り替えながら定在波を生じせしめるというように、超音波照射部によって、流路内に時間的に分離された２つ以上の定在波をそれぞれ生じせしめるように、異なる周波数の２つ以上の超音波を時間的に分離して照射しているから、ある定在波の節の位置に濃縮させた血球成分を他の定在波の腹の音響放射圧で破壊でき効率的に細胞性の非被検物質の破壊を実施することが可能となる。
（第１の実施形態の設計変更）
上記実施形態においては、抗原の標識として蛍光標識を用いたが、標識としてはその他の光応答性標識（例えば、燐光、散乱光などの標識）を用いてもよい。また、放射性同位体を用いた放射免疫測定(ＲＩＡ)、酵素を用いた酵素免疫測定(ＥＩＡ)、化学発光酵素免疫測定(ＣＬＥＩＡ)などの種々の免疫測定法と組み合わせても良い。
【００５４】
また、上記ではサンドイッチ法について説明したが、競合法を用いても構わない。この場合、蛍光標識抗体として、抗原（被検物質）と競合して固定化抗体（固定化結合物質）に特異的に結合する修飾化抗体（修飾化結合物質）と、この修飾化抗体（修飾化結合物質）が修飾された蛍光粒子とからなるものを用いることになる。
【００５５】
なお、本発明では、基本的には流路の設計厚みに基づいて超音波の周波数が決定されるが、実際には流路の厚みの設計からのずれや、超音波照射部と流路基材との接着のずれに起因して、共振周波数ずれが生じるので、超音波照射部へ印加する電圧の周波数を掃引して、最も効率的に血球を濃縮、溶血できるように調整する必要がある。
【００５６】
「第２の実施形態の被検物質検出方法」
次に、被検物質検出方法の第２の実施形態について説明する。図４は、本実施形態の被検物質検出方法に用いる検出チップＣ２を示す概略断面図である。なお、本実施形態においても、特異的に結合する対の物質の具体例として抗原および抗体を用いて、被検物質を抗原、この被検物質と特異的に結合する物質を抗体として、蛍光標識を用いたサンドイッチ法によって分析する場合を例として説明する。
【００５７】
本実施形態の被検物質検出方法は、超音波照射部として、２つの超音波照射素子２０ａおよび２０ｂを流路１１に沿って設け、これらから異なる周波数の超音波を照射して流路１１内に定在波Ｕ１およびＵ２を生じせしめる点で第１の実施形態と異なる。したがって、その他の同様の要素についての詳細な説明は特に必要のない限り省略する。
【００５８】
本実施形態の被検物質検出方法は、流路１１と、流路１１に接続された、流路１１に液体試料を流入させるための流入口１４ａと、流路１１に接続された、流入口１４ａから流入した液体試料を流路１１に流入させるための空気口１４ｂとを有する流路基材１２、流路１１の所定領域に形成された検出部１５、および検出部１５よりも上流側に乾燥配置された蛍光標識抗体ＢＦを備えた検出チップＣ２を用い、抗原Ａを含有する可能性がある全血試料Ｓを流路１１に流入させ、蛍光標識抗体ＢＦが乾燥配置された領域よりも上流側に設けられた超音波照射部を構成する２つの超音波照射素子２０ａおよび２０ｂによって、流路１１の長さ方向に垂直な方向から流路１１内の全血試料Ｓに対して、流路１１内に異なる周波数の定在波Ｕ３およびＵ４をそれぞれ生じせしめるように、異なる周波数の超音波をそれぞれ照射し、これらの定在波Ｕ３およびＵ４の腹の音響放射圧で全血試料Ｓ中の血球成分の細胞膜を破壊することで、流路１１の目詰まりなく全血試料Ｓを流路１１に流下せしめ、全血試料Ｓを蛍光標識抗体ＢＦと接触せしめるとともに抗原Ａを蛍光標識抗体ＢＦによって標識し、この抗原Ａおよび蛍光標識抗体ＢＦの複合体を検出部１５上の固定化抗体Ｂ１に固定し、測定光Ｌｅを照射して検出部１５上の上記複合体中の蛍光標識Ｆからの蛍光信号Ｌｆを光検出器２３で検出して、全血試料Ｓ中の抗原Ａの有無および／または量を検出することを特徴とするものである。
【００５９】
本実施形態の超音波照射部は、流路１１の長さ方向に沿って設けられた２つの超音波照射素子２０ａおよび２０ｂから構成される。つまり、本実施形態では、別個の超音波照射素子を用いることにより、空間的に分離された異なる周波数の超音波を照射している。本実施形態においては、周波数を変調しなくてもそれぞれの超音波照射素子から異なる周波数の超音波を生じせしめることはできるが、より効率よく溶血を行う観点から周波数を変調してもよい。
【００６０】
図５は、上記検出チップＣ２と上記超音波照射部を用いて定在波を生じせしめた様子を示す概略図である。図５に示すように、異なる周波数の超音波に起因して生じる定在波を、一方の定在波Ｕ４の腹の位置が、他の定在波Ｕ３の節の位置に流路１１の長さ方向に沿って対応させることにより、上流側の定在波Ｕ３の節に濃縮させた血球成分を下流側の定在波Ｕ４の腹の音響放射圧で破壊でき効率的に細胞性の非被検物質の破壊を実施することが可能となる。このような場合には、下流側の超音波照射素子に関して、溶血率を上げるために、例えばバイポーラ電源ＨＳＡ４１０１（株式会社エヌエフ回路設計ブロック製）を用いて、電圧を増幅してから印加してもよい。
【００６１】
本実施形態において、全血試料を流路１１の上流から流下させると血球成分はそれぞれの定在波領域を通過することになるが、第１の実施形態と同様に、定在波の場合には音響放射圧分布が空間的に固定されるため、安定した溶血率を得ることができる。さらに、上記のように２つの超音波照射素子２０ａおよび２０ｂを設け、腹の位置と節の位置を流路１１の長さ方向に沿って対応させることにより、上流側の定在波Ｕ３の節の位置に濃縮させた血球成分を下流側の定在波Ｕ４の腹の音響放射圧で破壊でき効率的に溶血を行うことができる。
【００６２】
以上のように、本発明に係る被検物質検出方法は、第１の実施形態と同様に、微小な流路を備えた検出チップを用いた被検物質検出方法において、被検物質を含有する可能性があり細胞性の非被検物質を含有する液体試料を流路に供給し、検出部よりも上流側に設けられた超音波照射部によって、流路の長さ方向に垂直な方向から流路内の液体試料に対して、流路内に定在波を生じせしめるように超音波を照射するものである。したがって、第１の実施形態と同様の効果を奏する。
【００６３】
さらに、本発明に係る被検物質検出方法は、第１の実施形態と同様に、通常の進行波よりも高い音響放射圧を有する定在波を利用しているため、したがって、第１の実施形態と同様の効果を奏する。
【００６４】
さらに、本実施形態では２以上の超音波照射素子を用いて定在波を生じせしめるというように、超音波照射部によって、流路内に時間的および／または空間的に分離された２つ以上の定在波をそれぞれ生じせしめるように、異なる周波数の２つ以上の超音波を時間的および／または空間的に分離して照射しているから、ある定在波の節の位置に濃縮させた血球成分を他の定在波の腹の音響放射圧で破壊でき効率的に細胞性の非被検物質の破壊を実施することが可能となる。
【００６５】
「第３の実施形態の被検物質検出方法」
次に、被検物質検出方法の第３の実施形態について説明する。図６は、本実施形態の被検物質検出方法に用いる検出チップＣ３を示す概略断面図である。なお、本実施形態においても、特異的に結合する対の物質の具体例として抗原および抗体を用いて、被検物質を抗原、この被検物質と特異的に結合する物質を抗体として、蛍光標識を用いたサンドイッチ法によって分析する場合を例として説明する。
【００６６】
本実施形態の被検物質検出方法は、超音波照射素子２０ａに対向するように流路の反対側に第１の音響整合層１８ａおよび第１の反射板１７ａが配置され、さらに超音波照射素子２０ｂに接するように流路部材１３に第２の音響整合層１８ｂが配置されかつこの第２の音響整合層１８ｂに対向するように流路の反対側の蓋部材１４に第２の反射板１７ｂが配置された点で第２の実施形態と異なる。したがって、その他の同様の要素についての詳細な説明は特に必要のない限り省略する。
【００６７】
本実施形態の被検物質検出方法は、流路１１と、流路１１に接続された、流路１１に液体試料を流入させるための流入口１４ａと、流路１１に接続された、流入口１４ａから流入した液体試料を流路１１に流入させるための空気口１４ｂとを有する流路基材１２、流路１１の所定領域に形成された検出部１５、検出部１５よりも上流側に乾燥配置された蛍光標識抗体ＢＦ、反射板１７ａおよび１７ｂ、並びに音響整合層１８ａおよび１８ｂを備えた検出チップＣ３を用い、抗原Ａを含有する可能性がある全血試料Ｓを流路１１に流入させ、蛍光標識抗体ＢＦが乾燥配置された領域よりも上流側に設けられた超音波照射部を構成する２つの超音波照射素子２０ａおよび２０ｂによって、流路１１の長さ方向に垂直な方向から流路１１内の全血試料Ｓに対して、流路１１内に異なる周波数の定在波Ｕ５およびＵ６をそれぞれ生じせしめるように、異なる周波数の超音波をそれぞれ照射し、これらの定在波Ｕ５およびＵ６の腹の音響放射圧で全血試料Ｓ中の血球成分の細胞膜を破壊することで、流路１１の目詰まりなく全血試料Ｓを流路１１に流下せしめ、全血試料Ｓを蛍光標識抗体ＢＦと接触せしめるとともに抗原Ａを蛍光標識抗体ＢＦによって標識し、この抗原Ａおよび蛍光標識抗体ＢＦの複合体を検出部１５上の固定化抗体Ｂ１に固定し、測定光Ｌｅを照射して検出部１５上の上記複合体中の蛍光標識Ｆからの蛍光信号Ｌｆを光検出器２３で検出して、全血試料Ｓ中の抗原Ａの有無および／または量を検出することを特徴とするものである。
【００６８】
本実施形態の超音波照射部は、第２の実施形態と同様に、流路１１の長さ方向に沿って設けられた２つの超音波照射素子２０ａおよび２０ｂから構成される。つまり、本実施形態では、別個の超音波照射素子を用いることにより、空間的に分離された異なる周波数の超音波を照射している。
【００６９】
本実施形態の検出チップＣ３は、超音波照射素子２０ａと接触する流路基材１２の部分に対向するように流路を挟んだ反対側の流路基材１２の部分に、第１の音響整合層１８ａおよび第１の反射板１７ａを備え、さらに、超音波照射素子２０ｂと接触する流路基材１２の部分に埋め込まれた第２の音響整合層１８ｂ、およびこの第２の音響整合層１８ｂに対向するように流路を挟んだ反対側に設けられた第２の反射板１７ｂを備えている。より具体的には、第１の音響整合層１８ａは、超音波照射素子２０ａが接触する流路部材１３の部分に対向するように流路を挟んだ反対側の蓋部材１４の部分に埋め込まれるように形成されており、第１の反射板１７ａは、この第１の音響整合層１８ａの流路と反対側の面に接するように形成されている。また、第２の音響整合層１８ｂは、超音波照射素子２０ｂが接触する流路部材１３の部分に埋め込まれるように形成されており、第２の反射板１７ｂは、この第２の音響整合層１８ｂに対向するように流路を挟んだ反対側の蓋部材１４の部分に埋め込まれるように形成されている。反射板１７ａおよび１７ｂについての詳細は第１の実施形態と同様である。
【００７０】
音響整合層１８ａおよび１８ｂは、流路１１に供給された液体試料Ｓとの音響インピーダンス（Ｚ：Ｚ＝ｃ（物質中の音速）×ρ（物質の密度））の整合を取る役割（音響整合機能）を担うための層であるため、供給される液体試料Ｓと同等の音響インピーダンスを有する材料からなる層である。音響整合層１８ａおよび１８ｂの材料としては特に限定されないが、一般的に生体物質の分析を行う場合の液体試料Ｓは水（Ｚ＝１．４８×１０６ Ｎ・ｓ・ｍ−３（室温））を溶媒とするため、ポリマー等の誘電体材料が挙げられ、軟質のポリエチレン（Ｚ＝１．７５×１０６ Ｎ・ｓ・ｍ−３（室温））やゴム材料が好ましく、ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）等のシリコーンゴム、天然ゴム（Ｚ＝１．５０×１０６ Ｎ・ｓ・ｍ−３（室温））、スチレン−ブタジエン−ゴム（Ｚ＝１．７６×１０６ Ｎ・ｓ・ｍ−３（室温））がより好ましく、特に形状の加工性や厚みの制御性の容易さの観点からＰＤＭＳ（Ｚ＝１．０６×１０６ Ｎ・ｓ・ｍ−３（室温））が好ましい。音響整合層を設けた場合、周波数を調整することにより、定在波の節が音響整合層と流路（もしくは液体試料）との界面（整合界面）に位置することが可能となる。音響整合層１８ａおよび１８ｂは、図６に示すように流路基材１２の内壁の一部となるように埋め込まれるように形成されてもよいし、流路基材１２の内壁面上に形成されてもよい。
【００７１】
本実施形態では上記のような音響整合層１８ａおよび１８ｂを設けているから、図７に示すように、定在波の節が整合界面上に位置することができる。したがって、上流側の超音波照射素子２０ａで形成した定在波Ｕ５の整合界面上の節と、下流側の超音波照射素子２０ｂで形成した定在波Ｕ６の整合界面上の腹が、流路の長さ方向に沿って対応するため、上流側の定在波Ｕ５の節の位置に濃縮させた血球成分を下流側の定在波Ｕ６の腹の音響放射圧で破壊でき効率的に溶血を行うことができる。
【００７２】
また、本実施形態では、下流側の超音波照射素子２０ｂで形成した定在波領域の流路壁面上であって流路長さ方向に沿って検出部１５に対応する位置（検出部１５と同一の流線上の壁面）に第２の音響整合層１８ｂを設けているから、検出部１５近傍へ続く流線上に、前述の捕捉力によって抗原を捕捉した蛍光標識抗体ＢＦを濃縮させることができるため、感度の高い検出を行うことができる。
【００７３】
以上のように、本発明に係る被検物質検出方法は、第１の実施形態と同様に、微小な流路を備えた検出チップを用いた被検物質検出方法において、被検物質を含有する可能性があり細胞性の非被検物質を含有する液体試料を流路に供給し、検出部よりも上流側に設けられた超音波照射部によって、流路の長さ方向に垂直な方向から流路内の液体試料に対して、流路内に定在波を生じせしめるように超音波を照射するものである。したがって、第１の実施形態と同様の効果を奏する。
【００７４】
さらに、本発明に係る被検物質検出方法は、第１の実施形態と同様に、通常の進行波よりも高い音響放射圧を有する定在波を利用しているため、したがって、第１の実施形態と同様の効果を奏する。
【００７５】
さらに、本実施形態では、２以上の超音波照射素子を用いて定在波を生じせしめるというように、超音波照射部によって、流路内に時間的および／または空間的に分離された２つ以上の定在波をそれぞれ生じせしめるように、異なる周波数の２つ以上の超音波を時間的および／または空間的に分離して照射しているから、第２の実施形態と同様の効果を奏する。
【００７６】
さらに、本実施形態では、流路長さ方向に沿って検出部に対応するように、定在波が生じうる領域の流路の壁面に音響整合層を設けているから、検出部近傍へ続く流線上に被検物質を濃縮させることができるため、感度の高い検出を行うことができる。
【００７７】
＜第３の実施形態の設計変更＞
上記の第３の実施形態では、異なる周波数の２つ以上の超音波を時間的および／または空間的に分離して照射するように、２つの超音波照射素子を駆動させた場合について説明したが、必ずしもこの実施形態に限られず、本実施形態の検査チップの構成では、常に同一の周波数を照射するようにしてもよい。例えば、音響整合層１８ａおよび１８ｂの厚みが等しい場合には、定在波Ｕ５およびＵ６は、図８に示すように上下反転した形状となり、同一の周波数を照射しても、１つの超音波に起因して生じせしめられた定在波の腹の位置が、他の超音波に起因して生じせしめられた定在波の節の位置に、流路の長さ方向に沿って対応するためである。
【符号の説明】
【００７８】
１ 検出装置
１１ 流路
１２ 流路基材
１３ 流路部材
１４ 蓋部材
１４ａ 流入口
１４ｂ 空気口
１５ 検出部
１６ 金属膜
１７、１７ａ、１７ｂ 反射板
１８ａ、１８ｂ 音響整合層
２０ 超音波照射部
２１ 超音波制御部
２２ 光源
２３ 光検出器
Ａ 被検物質
Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３ 検査チップ
Ｌｅ 測定光
Ｌｆ 蛍光信号
Ｓ 液体試料
Ｕ、Ｕ１〜６ 定在波
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微小な流路を備えた検出チップを用いた被検物質検出方法および被検物質検出装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、微細加工技術を応用して形成されたマイクロレベルの微小な流路を備えた検出チップを用い、免疫反応を利用した生化学検査（免疫検査）が盛んに研究されている。流路を微細化することで、生体から採取する試料の必要量を微量にすることができるとともに、検出チップを含む装置全体を小型化することができる。さらに、検出チップを含む装置全体を小型化することで、診療所や家庭などで診断を行うＰＯＣＴ（Point Of Care Testing：その場診断）を実現することが可能となる。免疫検査は、各種の診断や観察に広く利用され、臨床検査として重要な検査法となっており、現在では各種の免疫検査装置が開発され、多数の検査項目を同時に検査する等、高度の分析が可能となっている。
【０００３】
免疫検査では、通常、検査試料として血液が用いられる。血液は、血球成分（または細胞性成分ともいう。赤血球、白血球および血小板などを指す。）と血漿成分（または液性成分ともいう。血漿、または血漿から凝固因子を除去した血清を指す。）とから構成されるが、検査試料としては血漿成分が用いられることが多い。
【０００４】
血漿成分を検査試料とし、上記のような検出チップを用いて検査を行う場合には、通常、採血した血液を遠心分離して、血漿成分に比べて大きな比重を有する血球成分を除去（血球分離）する前処理が行われる。これは、人の血液中の血球成分を構成する赤血球（血球成分中の構成比：９６％）、白血球（３％）および血小板（１％）の大きさが、それぞれ約８μｍ、約６〜２２μｍおよび約１〜４μｍと上記流路に対し大きいため、上記のような検出チップを用いて血液診断を行う場合には、このような血球成分（特に赤血球）によって流路が目詰まりを起こしたり免疫反応が阻害されたりするといった問題が生じるためである。しかし、このような前処理を行う場合には、遠心分離装置を要する、血球成分と血漿成分の比重差がほとんどないため長時間の遠心分離作業を要する、および作業工程数が増える等の別の問題が生じる。
【０００５】
一方、上記のような前処理を必要とせず、血球分離を行う他の方法としては、血球分離膜を流路の上流側に設けて血液を点着するだけで血球成分を分離する方法（特許文献１）が挙げられる。しかしながら、このような血球分離膜を用いた方法でも、流路の目詰まりは解決できるものの、血球分離膜の目詰まりが起きる可能性は排除できず、必要な量の検査試料が流路を流下しないといった問題や、迅速な測定が阻害されるといった問題が生じる場合がある。ポンプ等によって正圧または負圧を印加することにより血球分離膜を用いても血球分離を迅速に行うことは可能であるが、結局余計な作業が増加することとなる。
【０００６】
そこで、上記のような前処理を必要とせず、容易かつ迅速に上記の流路の目詰まりや免疫反応の阻害という問題を解決することが可能な方法が提案されている。例えばこのような方法として、検査試料に界面活性剤を添加して血球成分の細胞膜を化学的に破壊することにより血液を溶血する方法（特許文献２）や、流路中の検査試料に超音波を照射して血球成分の細胞膜を物理的に破壊することにより血液を溶血する方法（特許文献３）が挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００２−５０８６９８号公報
【特許文献２】特開２００７−１６３１８２号公報
【特許文献３】特開２００９−２０７４５９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、特許文献２のように界面活性剤を用いた場合、この界面活性剤の添加により、検査試料全体としての流体力学物性（粘性および表面張力等）が変動してしまって、流路内での流速等の流動状態も変動してしまうため、拡散律速等を引き起こし免疫反応速度の制御が困難になるという問題が生じうる。
【０００９】
また、特許文献３のように単に超音波を照射しただけでは、超音波による音響放射圧分布が流路内の場所や時間によって不規則に変動し、音響場を通過した血球の溶血率（血球成分のうち細胞膜が破壊され溶血した血球成分の割合）が検査間で一定しないという問題がある。一方、溶血率を検査間で一定にするためには超音波を長時間照射する必要があるという問題もある。
【００１０】
本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、微小な流路を備えた検出チップを用いた被検物質検出方法において、前処理を必要とせず、容易かつ迅速に上記の流路の目詰まりや免疫反応の阻害を防止できるとともに、検査間で溶血率のばらつきのない検査を可能とする被検物質検出方法および被検物質検出装置を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために、本発明に係る被検物質検出方法は、流路と、流路に接続された、流路に液体試料を流入させるための流入口と、流路に接続された、流入口から流入した液体試料を流路に流入させるための空気口とを有する流路基材、および、流路の所定領域に形成された検出部を備えた検出チップを用い、
被検物質を含有する可能性があり細胞性の非被検物質を含有する液体試料を流路に流入させ、
検出部よりも上流側に設けられた超音波照射部によって、流路の長さ方向に垂直な方向から流路内の液体試料に対して、流路内に定在波を生じせしめるように超音波を照射し、
被検物質を、検出部に固定された、被検物質と特異的に結合する固定化結合物質で検出することを特徴とするものである。
【００１２】
本明細書において、「検出部」とは、被検物質を検出するための領域を意味する。例えば、被検物質（例えば抗原）と特異的に結合する固定化結合物質（例えば抗体）が流路壁面上に固定されているような場合には、この固定化結合物質が固定されている流路壁面上の領域が検出部となる。また、この検出部には、流路壁面上に表面プラズモンを発生させるための金属膜等が含まれていてもよい。
【００１３】
「流路の長さ方向に垂直な方向」とは、流路の高さ方向または流路の幅方向を意味する。
【００１４】
「固定化結合物質」とは、特異的に結合する対の物質の一方である被検物質に対する他方の物質であって、検出部に固定されたものを意味する。なお、「特異的に結合する対の物質」とは、抗原および抗体、もしくはタンパク質および補因子等のように、一方の物質と他方の物質とが特異的に認識し合って結合する関係にある対の物質を意味する。
【００１５】
さらに、本発明に係る被検物質検出方法において、超音波照射部によって、流路内に時間的および／または空間的に分離された２つ以上の定在波をそれぞれ生じせしめるように、異なる周波数の２つ以上の超音波を時間的および／または空間的に分離して照射することが好ましい。
【００１６】
本明細書において、「時間的および／または空間的に分離された２つ以上の定在波」とは、異なる時間帯および／または異なる場所に形成された、周波数の異なる２つ以上の定在波を意味する。なお、周波数を連続的に変調しながら定在波を形成した場合には、その瞬間々々の定在波それぞれが別個の定在波であるとする。
【００１７】
異なる周波数の２つ以上の超音波を「時間的および／または空間的に分離して照射する」とは、異なる時間帯および／または異なる場所で周波数の異なる超音波を照射することを意味する。なお、周波数を連続的に変調しながら超音波を照射した場合には、その瞬間々々の超音波それぞれが別個の超音波であるとする。
【００１８】
さらに、本発明に係る被検物質検出方法において、１つの超音波照射素子のみからなる上記超音波照射部を用い、超音波照射素子によって、周波数を時間的に変調しながら超音波を照射することにより、上記異なる周波数の２つ以上の超音波を時間的に分離して照射することができる。この場合、上記異なる周波数の２つ以上の超音波のうち１つの超音波に起因して生じせしめられた定在波の腹の位置が、他の超音波に起因して生じせしめられた定在波の節の位置となるように、周波数を変調することが好ましい。
【００１９】
本明細書において、「１つの超音波に起因して生じせしめられた定在波の腹の位置が、他の超音波に起因して生じせしめられた定在波の節の位置となる」とは、ある定在波の節と他の定在波の腹とが、同時に存在することはないが実質的に同一の場所に形成される状態を意味する。実質的に同一の場所に形成される状態とは、被検物質の液体試料中の拡散等を考慮し、ある定在波の節と他の定在波の節とが重ならないように、これらの定在波が形成される状態を意味する。少なくとも１対の定在波の１対の腹および節が実質的に同一の場所に形成されていればよい。
【００２０】
さらに、本発明に係る被検物質検出方法において、流路の長さ方向に沿って設けられた２つ以上の超音波照射素子からなる上記超音波照射部を用い、この２つ以上の超音波素子によって、それぞれ異なる周波数の超音波を照射することにより上記異なる周波数の２つ以上の超音波を空間的に分離して照射することができる。この場合、上記異なる周波数の２つ以上の超音波のうち１つの超音波に起因して生じせしめられた定在波の腹の位置が、他の超音波に起因して生じせしめられた定在波の節の位置に、流路の長さ方向に沿って対応するように、周波数を異ならせることが好ましい。また、上記異なる周波数の２つ以上の超音波のうち少なくとも１つの超音波の周波数を変調することが好ましい。
【００２１】
本明細書において、「１つの超音波に起因して生じせしめられた定在波の腹の位置が、他の超音波に起因して生じせしめられた定在波の節の位置に、流路の長さ方向に沿って対応する」とは、ある定在波の節の位置と他の定在波の腹の位置とが実質的に同一の流線上に存在する状態を意味する。実質的に同一の流線上に存在する状態とは、被検物質の液体試料中の拡散等を考慮し、ある定在波の節と他の定在波の節とが同一の流線上に存在しないように、これらの定在波が形成される状態を意味する。これは、例えば流路幅が一定で物質および分子等の液体試料中の拡散が無視できる範囲において言い換えれば、流路の長さ方向からこれらの定在波が生じている流路断面を眺めた場合に、１つの定在波の節と他の定在波の腹が重なるような状態ということもできる。少なくとも１対の定在波の１対の腹および節が重なっていればよい。
【００２２】
さらに、検出チップとして、定在波が生じうる領域の流路の壁面に音響整合層が設けられた検出チップを用いることが好ましい。
【００２３】
一方、本発明に係る被検物質検出装置は、
流路と、流路に接続された、流路に液体試料を流入させるための流入口と、流路に接続された、流入口から流入した液体試料を流路に流入させるための空気口とを有する流路基材、および、流路の所定領域に形成された検出部を備えた検出チップと、
検出部よりも上流側に設けられた、流路の長さ方向に垂直な方向から流路内の液体試料に対して超音波を照射する超音波照射部と、
流路内に定在波を生じせしめるように超音波照射部を制御する超音波制御部とを備えることを特徴とするものである。
【００２４】
さらに、本発明に係る被検物質検出装置において、超音波照射部が、１つの超音波照射素子のみからなるものであり、超音波制御部が、周波数を時間的に変調することにより、異なる周波数の２つ以上の超音波を時間的に分離して照射するように、超音波照射素子を制御するものであることが好ましく、或いは、超音波照射部が、流路の長さ方向に沿って設けられた２つ以上の超音波照射素子からなるものであり、超音波制御部が、それぞれ異なる周波数の超音波を照射することにより、異なる周波数の２つ以上の超音波を空間的に分離して照射するように、超音波照射素子を制御するものであることが好ましい。
【発明の効果】
【００２５】
本発明に係る被検物質検出方法は、微小な流路を備えた検出チップを用いた被検物質検出方法において、被検物質を含有する可能性があり細胞性の非被検物質を含有する液体試料を流路に供給し、検出部よりも上流側に設けられた超音波照射部によって、流路の長さ方向に垂直な方向から流路内の液体試料に対して、流路内に定在波を生じせしめるように超音波を照射するものである。したがって、超音波によって物理的に細胞性の非被検物質を破壊することができるため、前処理を必要とせず、容易かつ迅速に上記の流路の目詰まりや免疫反応の阻害を防止することができる。一方、流路内に定在波を生じせしめているから、腹および節の位置が固定され音響放射圧分布が一定となり、検査間で溶血率のばらつきのない検査が可能となる。この結果、前処理を必要とせず、容易かつ迅速に上記の流路の目詰まりや免疫反応の阻害を防止できるとともに、検査間で溶血率のばらつきのない検査が可能となる。
【００２６】
さらに、本発明に係る被検物質検出装置は、流路と、流路に接続された、流路に液体試料を流入させるための流入口と、流路に接続された、流入口から流入した液体試料を流路に流入させるための空気口とを有する流路基材、および、流路の所定領域に形成された検出部を備えた検出チップと、検出部よりも上流側に設けられた、流路の長さ方向に垂直な方向から流路内の液体試料に対して超音波を照射する超音波照射部と、流路内に定在波を生じせしめるように超音波照射部を制御する超音波制御部とを備え、超音波照射部によって、流路の長さ方向に垂直な方向から流路内の液体試料に対して、流路内に定在波を生じせしめるようにしている。この結果、上記被検物質検出方法と同様に、前処理を必要とせず、容易かつ迅速に上記の流路の目詰まりや免疫反応の阻害を防止できるとともに、検査間で溶血率のばらつきのない検査が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】本発明の第１の実施形態の被検物質検出方法に用いる検出装置を示す概略断面図である。
【図１Ｂ】本発明の第１の実施形態の被検物質検出方法に用いる検出チップを示す概略上面図である。
【図１Ｃ】本発明の第１の実施形態の被検物質検出方法に用いる検出チップを示す概略断面図である。
【図２】本発明の第１の実施形態の被検物質検出方法によってサンドイッチ法による免疫検査を行う工程を示す概略断面図である。
【図３】（ａ）（ｂ）第１の実施形態において、それぞれ異なる時間帯に異なる周波数の超音波によって定在波を生じせしめた様子を示す概略断面図である。
【図４】本発明の第２の実施形態の被検物質検出方法に用いる検出チップを示す概略断面図である。
【図５】第２の実施形態において、異なる場所で異なる周波数の超音波によって定在波を生じせしめた様子を示す概略断面図である。
【図６】本発明の第３の実施形態の被検物質検出方法に用いる検出チップを示す概略断面図である。
【図７】第３の実施形態において、異なる場所で異なる周波数の超音波によって定在波を生じせしめた様子を示す概略断面図である。
【図８】第３の実施形態において、異なる場所で同一の周波数の超音波によって定在波を生じせしめた様子を示す概略断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明の実施形態について図面を用いて説明するが、本発明はこれに限られるものではない。なお、視認しやすくするため、図面中の各構成要素の縮尺等は実際のものとは適宜異ならせてある。
【００２９】
「第１の実施形態の被検物質検出方法」
まず、被検物質検出方法の第１の実施形態について説明する。図１Ａは、本実施形態の被検物質検出方法に用いる検出装置を示す概略断面図である。また、図１Ｂおよび図１Ｃはそれぞれ、本実施形態の被検物質検出方法に用いる検出チップＣ１を示す概略上面図、本実施形態の被検物質検出方法に用いる検出チップＣ１を示す概略断面図である。なお、本実施形態においては、特異的に結合する対の物質の具体例として抗原および抗体を用いて、被検物質を抗原、この被検物質と特異的に結合する物質を抗体として、蛍光標識を用いたサンドイッチ法によって分析する場合を例として説明する。
【００３０】
本実施形態の被検物質検出方法は、図２に示すように、流路１１と、流路１１に接続された、流路１１に液体試料を流入させるための流入口１４ａと、流路１１に接続された、流入口１４ａから流入した液体試料を流路１１に流入させるための空気口１４ｂとを有する流路基材１２、流路１１の所定領域に形成された検出部１５、および、検出部１５よりも上流側に乾燥配置された蛍光標識抗体ＢＦを備えた検出チップＣ１を用い、抗原Ａを含有する可能性がある全血試料Ｓを流路１１に流入させ、蛍光標識抗体ＢＦが乾燥配置された領域よりも上流側に設けられた超音波照射部２０によって、流路１１の長さ方向に垂直な方向から流路１１内の全血試料Ｓに対して、流路１１内に周波数の異なる定在波Ｕを周期的に生じせしめるように、周波数を周期的に変調しながら超音波を照射し、この定在波Ｕの腹の音響放射圧で全血試料Ｓ中の血球成分の細胞膜を破壊することで、流路１１の目詰まりなく全血試料Ｓを流路１１に流下せしめ、全血試料Ｓを蛍光標識抗体ＢＦと接触せしめるとともに抗原Ａを蛍光標識抗体ＢＦによって標識し、この抗原Ａおよび蛍光標識抗体ＢＦの複合体を検出部１５上の固定化抗体Ｂ１に固定し、図１Ａに示すように、測定光Ｌｅを照射して検出部１５上の上記複合体中の蛍光標識Ｆからの蛍光信号Ｌｆを光検出器２３で検出して、全血試料Ｓ中の抗原Ａの有無および／または量を検出することを特徴とするものである。
【００３１】
また、本発明の被検物質検出装置は、図１Ａに示すように、上記検出チップＣ１と、検出部よりも上流側に設けられた、流路の長さ方向に垂直な方向から流路内の液体試料に対して超音波を照射する超音波照射部２０と、流路内に定在波を生じせしめるように超音波照射部を制御する超音波制御部２１と、光源２２と、光検出器２３とを備えるものである。
【００３２】
上記の被検物質検出方法および装置に用いられる検出チップＣ１は、主として流路１１を有する流路基材１２および流路１１内の検出部１５から構成される。
【００３３】
流路基材１２は、コ文字型の溝が形成された流路部材１３とこの溝に蓋をする蓋部材１４とからなるものであり、樹脂から形成されたものが好ましく、この場合は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンを含む非晶性ポリオレフィン（ＡＰＯ）、ポリスチレン、およびゼオネックス（登録商標）等の樹脂を用いることがより好ましい。
【００３４】
流路１１は、流路部材１３上に形成されたコ文字型の溝に蓋をするように、蓋部材１４が流路部材１３に装着されることにより形成される。本明細書において、流路１１の幅および高さ（いずれも試料の進行方向と垂直な方向の長さ）は、特に限定されないが、幅１０ｍｍ以下、厚み２ｍｍ以下である場合、特に幅３ｍｍ以下、厚み５００μｍ以下である場合に流路１１の目詰まりが顕著に表れるため、このような範囲にある幅および厚みを有する流路を用いた検査に対して本発明は特に効果的である。本実施形態においては、具体的には幅２ｍｍおよび厚み３１４μｍの流路１１である。さらに、流路１１の両端には流入用或いは廃液用の液溜め１１ａおよび１１ｂが形成されている。
【００３５】
また、流路１１の所定領域には、検出部となる金属膜が形成されている。これにより、金属膜に生じるプラズモンによる増強場Ｅｗを利用した高感度の分析方法と組み合わせることができる。例えば、金属膜が金属材料のベタ膜である場合には、表面プラズモン共鳴法、表面プラズモン増強蛍光法やＳＰＣＥ（surface plasmon-coupled emission）法と組み合わせることができ、金属膜が配列された金属微粒子からなる層である場合には、局在表面プラズモン共鳴法と組み合わせることができる。金属膜の材料としては、特に制限されるものではなく、例えばプラズモンを効率よく誘起する観点から、Ａｕ，Ａｇ，Ｃｕ，Ｐｔ，Ｎｉ，Ｔｉ等が挙げられ、電場増強効果の高いＡｕ，Ａｇ等が特に好ましい。金属膜の厚みは、金属膜の材料と、測定光Ｌｅの波長により表面プラズモンが強く励起されるように適宜定めることが望ましい。例えば、測定光Ｌｅとして７８０ｎｍに中心波長を有するレーザ光を用い、金属膜として金（Ａｕ）膜を用いる場合、金属膜の厚みは５０ｎｍ±５ｎｍが好適である。
【００３６】
さらに、流路１１には超音波を効率よく反射させるための反射板１７が設けられている。反射板１７は、超音波をより効率的に反射させる（つまり、定在波Ｕをより効率的に生じせしめる）ため、後述する超音波照射部２０に対向するように設けられている層である。反射板１７は、超音波の反射率を上げるため、反射板１７および液体試料Ｓの音響インピーダンスの差が大きくなるような材料を用いることが好ましい。その材料としては、ガラス等の誘電材料、アルミニウム等の金属材料を挙げることができる。反射板１７は、図１Ｃに示すように流路１１の内壁（図では蓋部材１４）の一部となるように埋め込まれるように形成されてもよいし、流路１１の内壁面上に形成されてもよい。また、反射板１７は、液体試料と音響インピーダンスが異なっているという点では流路基材１２そのものでもよい、つまり流路基材１２が反射板としての機能を兼ねてもよい。しかしながら、音響インピーダンスの大小に基づく材料選択という観点から、流路基材１２とは異なる材料で反射板１７を別途設けることが好ましい。
【００３７】
蓋部材１４は、流路部材１３に装着することにより流路１１の上面を形成するためのものである。また、蓋部材１４は、流入用の液溜め１１ａに接続する試料等を流入するための流入口１４ａ、および廃液用の液溜め１１ｂに接続する空気等を抜くための空気口１４ｂを有している。蓋部材１４は、上記金属膜１６が形成されたあとに、超音波融着等により流路部材１３に装着される。
【００３８】
本実施形態における液体試料Ｓは、人から採決したままの全血試料であり、細胞性の非被検物質は全血中の血球成分となる。しかしながら、これに限られず希釈剤等によって希釈された血液でもよい。また、血液の他にも、液体試料として、例えば尿を採用することもできる。つまり、尿中の８−ＯＨｄＧ（酸化ストレスマーカー）を検出するときに、尿中に混じった赤血球などの細胞成分を除去する場合に本発明が適用できる。
【００３９】
また、流路１１の上流側には、蛍光標識抗体ＢＦが乾燥配置されている。蛍光標識抗体ＢＦは、抗体Ｂ２が修飾された蛍光標識Ｆである。本実施形態の場合には、具体的には、この蛍光標識抗体ＢＦは、抗原Ａ（被検物質）と特異的に結合する修飾化抗体Ｂ２（修飾化結合物質）と、この修飾化抗体Ｂ２（修飾化結合物質）が修飾された蛍光標識Ｆ（標識物質）とからなる。これにより、抗体Ｂ２が抗原Ａと特異的に結合することにより抗原Ａおよび蛍光標識抗体ＢＦの複合体が形成される。このように蛍光標識抗体ＢＦを流路１１内に乾燥配置することにより、別途抗原Ａを標識する作業を行う必要がない。蛍光標識Ｆ（標識物質）は特に制限されず蛍光色素、量子ドット等を用いることができる。特に蛍光標識Ｆ（標識物質）としては、蛍光検出の感度を稼ぐために、例えばポリスチレン粒子の内部に複数の蛍光色素、量子ドット等が包含された蛍光粒子（標識粒子）を用いることが好ましい。標識粒子の大きさは、後述する定在波の捕捉力が物質の体積に比例することや拡散速度の観点から、０．０５μｍ〜１０ｍｍ程度が好ましく、０．１μｍ〜１ｍｍがさらに好ましい。また、本実施形態では、試料を流路１１に供給したあとに流路１１内で標識を行っているが、抗原Ａを標識するタイミングは、特に制限されず、流路１１に供給する前に抗原Ａと標識とを反応させてもよい。
【００４０】
検出部１５は、抗原Ａを検出するための固定化抗体Ｂ１が固定されている金属膜１６を含む領域である。検出部１５は、１つであっても複数であっても構わない。異なる種類の固定化抗体Ｂ１が固定された検出部１５が複数ある場合には、複数の抗原を検出することができるため、いわゆる多項目アレイ分析測定が可能となる。固定化抗体Ｂ１は、抗原Ａに対して特異的に結合する抗体である。このような抗体は、特に制限されるものではなく、検出条件（特に抗原Ａ）に応じて適宜選択することができる。例えば、抗原ＡがｈＣＧ抗原（分子量３８０００ Ｄａ）の場合、この抗原Ａと特異的に結合するモノクロナール抗体等を用いることができる。固定化方法としては、金属膜１６に対して物理的に吸着させる方法、金属膜１６に表面修飾を施すことによってカルボキシル基、アミノ基、チオール基、などの官能基を導入し、そこに静電的にまたは化学結合を介して固定化する方法などが挙げられる。
【００４１】
超音波照射部２０は、検出部１５よりも上流側に設けられ、流路１１の長さ方向に垂直な方向（本実施形態では図１Ａ中の紙面内下方）から流路１１内の全血試料に対して、流路１１内に定在波を生じせしめるように、超音波を照射するものである。これにより、図１中の流路１１の上下の壁面間で定在波Ｕが生じる。超音波照射部２０は、例えば超音波振動子である。超音波振動子は、圧電セラミクス、またはフッ化ポリビニルピロリドンのような高分子フィルムのような圧電素子であり、例えばＰＺＴ−Ｐｂ（Ｚｒ・Ｔｉ）Ｏ３ 系 ・ソフト材Ｃ−８２（商品名、株式会社富士セラミックス）を用いることが好ましい。超音波照射部２０は、本実施形態では１つの超音波照射素子（例えば超音波振動子）によって構成されているが、後述するように２以上の超音波照射素子によって構成されてもよい。つまり、本実施形態では、１つの超音波照射素子を用いかつ周波数を変調することにより、時間的に分離された異なる周波数の超音波を照射している。超音波照射部２０は、流路１１内の液体試料Ｓに直接接するように流路１１の壁面を構成していても良いが、装置を繰り返し使う場合を考慮すると、超音波照射部２０は流路基材１２を介して流路１１に超音波を照射することが好ましい。超音波の周波数は、超音波を照射する方向に沿った流路１１の長さに応じて適宜設定できるが、１００ｋＨｚ〜１００ＭＨｚが好ましく、特に３ＭＨｚ程度が好ましい。超音波の周波数は、経時的に一定でもよいが、効率的に血球成分（細胞性の非被検物質）を破壊するために、経時的および／または周期的に変調すること、例えば連続的に掃引したり断続的に変化させたりすることが好ましい。
【００４２】
超音波制御部２１は、流路１１内に定在波Ｕが生じるように、超音波照射部２０を制御するものである。超音波制御部２１は、電源、超音波用の発振回路、変調回路および出力回路等を有する個別のユニットとすることもできる。また、超音波制御部２１は、必要に応じて超音波の波形を自由に加工し得る回路等、付加的な回路を設けることもできる。例えば、超音波制御部２１は、マルチファンクションジェネレータＷＦ１９７４（株式会社エヌエフ回路設計ブロック製）を用いることができる。駆動電圧の波形は正弦波、方形波、三角波、ランプ波など任意の波形を用いることができる。
【００４３】
光源２２は、例えばレーザ光源等でもよく、特に制限はないが、検出条件に応じて適宜選択することができる。また、光源２２は、前述のように、検出チップＣ１の流路基材１２と金属膜１６との界面で、測定光Ｌｅが全反射すると共に金属膜１６で表面プラズモン共鳴する共鳴角で入射するように配置されている。なお、測定光Ｌｅは、一般的には表面プラズモンを誘起するようにＰ偏向で界面に対して入射させることが好ましい。
【００４４】
光検出器２３は、蛍光標識Ｆからの蛍光Ｌｆを検出するものである。光検出器２３としては、ＣＣＤ、ＰＤ（フォトダイオード）、フォトマルチプライア、ｃ−ＭＯＳ等を適宜用いることができる。特に検出感度の観点から、冷却ＣＣＤを用いることが好ましい。
【００４５】
以下、上記検出チップＣ１を用いた本実施形態の被検物質検出方法によって、被検物質である抗原Ａを含む全血試料Ｓについて、サンドイッチ法によるアッセイを行う手順について図２を参照して詳細に説明する。
Ｓｔｅｐ１：まず、上記検査チップＣ１の流入口１４ａから検査対象である試料Ｓを流入する。
Ｓｔｅｐ２：試料Ｓを流入した後、超音波照射部２０によって流路１１の厚み方向に、周波数を周期的に変調しながら超音波を照射して、流路１１内に定在波Ｕを生じせしめる。
Ｓｔｅｐ３：試料Ｓが毛細管現象で流路１１に染み出す。この際、試料Ｓは定在波Ｕが生じている領域（定在波領域）を通過するが、この定在波Ｕの音響放射圧の力学的作用によって血球成分が破壊される一方で、抗原Ａは、血球成分に比して小さいので音響放射圧の影響をそれほど受けず、定在波領域をそのまま通過する。反応を早め、検出時間を短縮するために、空気口１４ｂにポンプを接続し、試料Ｓをポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。
Ｓｔｅｐ４：定在波領域を通過した試料Ｓと蛍光標識抗体ＢＦ（修飾化抗体Ｂ２が付与された蛍光粒子Ｆ）とが混ぜ合わされ、試料Ｓ中の抗原Ａが蛍光標識抗体ＢＦと結合しながら、流路１１をさらに流下していく。
Ｓｔｅｐ５：試料Ｓは流路１１に沿って空気口１４ｂ側へと徐々に流れ、蛍光標識抗体ＢＦと結合した抗原Ａが、検出部１５上に固定されている固定化抗体Ｂ１と結合し、抗原Ａが固定化抗体Ｂ１と蛍光標識抗体ＢＦで挟み込まれたいわゆるサンドイッチ構造が形成される。
Ｓｔｅｐ６：検出部１５に固定されなかった蛍光標識抗体ＢＦの一部が検出部１５上に残っている場合があっても、後続の試料Ｓが洗浄の役割を担い、流路１１中に浮遊或いは検出部１５上に非特異吸着している蛍光標識抗体ＢＦを洗い流す。検出部１５上を通過した試料Ｓは廃液溜め１１ｂに溜められる。
【００４６】
これらの工程の後、検出部１５に測定光Ｌｅを照射し、蛍光標識Ｆからの蛍光信号Ｌｆを検出することで、抗原Ａを検出することができる。
【００４７】
以下、本実施形態において、本発明の効果について詳細に説明する。
前述したように、微小な流路１１を備えた検出チップＣ１を用いて、被検物質および細胞性の非被検物質を含有する液体試料Ｓ（例えば全血）の検査を行う被検物質検出方法において、前処理を必要とせず、容易かつ迅速に上記の流路１１の目詰まりや免疫反応の阻害を防止できるとともに、検査間で溶血率のばらつきのない検査を可能とするために、本発明では超音波照射部２０によって流路１１内に定在波を生じせしめることを特徴とする。
【００４８】
例えば、流路１１の厚みが約３１４μｍである上記検出チップＣ１の流路１１に、超音波照射部２０によって２．５ＭＨｚと５．０ＭＨｚの周波数の超音波を周期的に照射した場合を考える。流路１１内は全血試料Ｓにより満たされているため、流路１１内の音速は１５７０ｍ／ｓである。この場合、それぞれ図３ａおよび図３ｂのような定在波Ｕ１およびＵ２が生じる。２．５ＭＨｚの周波数の超音波に起因して生じせしめられた定在波Ｕ１は、図３ａに示すように流路壁面上に腹および流路１１内に節を１つ有するものとなり、５．０ＭＨｚの周波数の超音波に起因して生じせしめられた定在波Ｕ２は、図３ｂに示すように流路壁面上に腹および流路１１内に節を２つ有するものとなる。つまり、定在波Ｕ１の腹から腹までの距離は３１４μｍであり、定在波Ｕ２の腹から腹までの距離は１５７μｍとなる。全血試料Ｓを流路１１の上流から流下させると血球成分はこの定在波領域を通過することになるが、定在波Ｕの場合には音響放射圧分布が空間的に固定されるため、腹の位置か節の位置かで破壊されやすさの違いはあるが、安定した溶血率を得ることができる。さらに、上記のように周波数を変調して腹の位置と節の位置を周期的に切り替えることにより、ある定在波の節の位置に濃縮させた血球成分を他の定在波の腹の音響放射圧で破壊でき効率的に溶血を行うことができる。これは、定在波の節近傍に位置する物質に節方向に働く捕捉力が働くためである。
【００４９】
この捕捉力は、直近の節の方向に働く力であり、その大きさＦ０は、下記式（１）に示すように物質Ｍの体積Ｖおよび音波周波数ｆ等に比例する。
式（１）：
【数１】
ここで、Ｆ０は捕捉力の大きさ、ｚは定在波Ｕ端部からの距離、ρ０は媒質の密度、ｃ０は媒質における音速、Ｖは物質Ｍの体積、Ｐ０は音圧、ｆは音波周波数、λは音波の波長を表す。或いは、捕捉力の大きさは、音響放射圧ポテンシャルの勾配に比例するともいえる。したがって、定在波Ｕの腹の位置に近い物質Ｍほど捕捉力Ｆ０は大きくなり、節の位置ではほとんど働かない。ここで、音響放射圧ポテンシャルとは、定在波音響場中の力学的なポテンシャルを意味する。
【００５０】
溶血されなかった血球成分は、免疫反応の阻害、或いは光学的測定における信号光の散乱および検出部への吸収等によって信号ノイズに大きな影響を与えて、検査の信頼性を低下させる。しかしながら、本実施形態のように、例えば周期的に周波数を切り替えながら定在波を生じせしめ、異なる周波数の定在波の節および腹を利用することにより、分布が一定かつ進行波の音響放射圧よりも高い音響放射圧（定在波の腹の振幅は進行波の２倍となる。）によって、従来の進行波を照射する場合よりも、検査間で溶血率が均一となりかつ高い溶血率を実現することが可能となる。
【００５１】
以上のように、本発明に係る被検物質検出方法は、微小な流路を備えた検出チップＣ１を用いた被検物質検出方法において、被検物質を含有する可能性があり細胞性の非被検物質を含有する液体試料を流路に供給し、検出部よりも上流側に設けられた超音波照射部によって、流路の長さ方向に垂直な方向から流路内の液体試料に対して、流路内に定在波を生じせしめるように超音波を照射するものである。したがって、超音波によって物理的に細胞性の非被検物質を破壊することができるため、前処理を必要とせず、容易かつ迅速に流路の目詰まりや免疫反応の阻害を防止することができる。一方、流路内に定在波を生じせしめているから、腹および節の位置が空間的に固定され音響放射圧分布が一定となり、検査間で溶血率のばらつきのない検査が可能となる。この結果、前処理を必要とせず、容易かつ迅速に上記の流路の目詰まりや免疫反応の阻害を防止できるとともに、検査間で溶血率のばらつきのない検査が可能となる。
【００５２】
さらに、本発明に係る被検物質検出方法は、通常の進行波よりも高い音響放射圧を有する定在波を利用しているため、細胞性の非被検物質の破壊を進行波によって実施するよりも容易に実施することが可能となる。
【００５３】
さらに、本実施形態では周期的に周波数を切り替えながら定在波を生じせしめるというように、超音波照射部によって、流路内に時間的に分離された２つ以上の定在波をそれぞれ生じせしめるように、異なる周波数の２つ以上の超音波を時間的に分離して照射しているから、ある定在波の節の位置に濃縮させた血球成分を他の定在波の腹の音響放射圧で破壊でき効率的に細胞性の非被検物質の破壊を実施することが可能となる。
（第１の実施形態の設計変更）
上記実施形態においては、抗原の標識として蛍光標識を用いたが、標識としてはその他の光応答性標識（例えば、燐光、散乱光などの標識）を用いてもよい。また、放射性同位体を用いた放射免疫測定(ＲＩＡ)、酵素を用いた酵素免疫測定(ＥＩＡ)、化学発光酵素免疫測定(ＣＬＥＩＡ)などの種々の免疫測定法と組み合わせても良い。
【００５４】
また、上記ではサンドイッチ法について説明したが、競合法を用いても構わない。この場合、蛍光標識抗体として、抗原（被検物質）と競合して固定化抗体（固定化結合物質）に特異的に結合する修飾化抗体（修飾化結合物質）と、この修飾化抗体（修飾化結合物質）が修飾された蛍光粒子とからなるものを用いることになる。
【００５５】
なお、本発明では、基本的には流路の設計厚みに基づいて超音波の周波数が決定されるが、実際には流路の厚みの設計からのずれや、超音波照射部と流路基材との接着のずれに起因して、共振周波数ずれが生じるので、超音波照射部へ印加する電圧の周波数を掃引して、最も効率的に血球を濃縮、溶血できるように調整する必要がある。
【００５６】
「第２の実施形態の被検物質検出方法」
次に、被検物質検出方法の第２の実施形態について説明する。図４は、本実施形態の被検物質検出方法に用いる検出チップＣ２を示す概略断面図である。なお、本実施形態においても、特異的に結合する対の物質の具体例として抗原および抗体を用いて、被検物質を抗原、この被検物質と特異的に結合する物質を抗体として、蛍光標識を用いたサンドイッチ法によって分析する場合を例として説明する。
【００５７】
本実施形態の被検物質検出方法は、超音波照射部として、２つの超音波照射素子２０ａおよび２０ｂを流路１１に沿って設け、これらから異なる周波数の超音波を照射して流路１１内に定在波Ｕ１およびＵ２を生じせしめる点で第１の実施形態と異なる。したがって、その他の同様の要素についての詳細な説明は特に必要のない限り省略する。
【００５８】
本実施形態の被検物質検出方法は、流路１１と、流路１１に接続された、流路１１に液体試料を流入させるための流入口１４ａと、流路１１に接続された、流入口１４ａから流入した液体試料を流路１１に流入させるための空気口１４ｂとを有する流路基材１２、流路１１の所定領域に形成された検出部１５、および検出部１５よりも上流側に乾燥配置された蛍光標識抗体ＢＦを備えた検出チップＣ２を用い、抗原Ａを含有する可能性がある全血試料Ｓを流路１１に流入させ、蛍光標識抗体ＢＦが乾燥配置された領域よりも上流側に設けられた超音波照射部を構成する２つの超音波照射素子２０ａおよび２０ｂによって、流路１１の長さ方向に垂直な方向から流路１１内の全血試料Ｓに対して、流路１１内に異なる周波数の定在波Ｕ３およびＵ４をそれぞれ生じせしめるように、異なる周波数の超音波をそれぞれ照射し、これらの定在波Ｕ３およびＵ４の腹の音響放射圧で全血試料Ｓ中の血球成分の細胞膜を破壊することで、流路１１の目詰まりなく全血試料Ｓを流路１１に流下せしめ、全血試料Ｓを蛍光標識抗体ＢＦと接触せしめるとともに抗原Ａを蛍光標識抗体ＢＦによって標識し、この抗原Ａおよび蛍光標識抗体ＢＦの複合体を検出部１５上の固定化抗体Ｂ１に固定し、測定光Ｌｅを照射して検出部１５上の上記複合体中の蛍光標識Ｆからの蛍光信号Ｌｆを光検出器２３で検出して、全血試料Ｓ中の抗原Ａの有無および／または量を検出することを特徴とするものである。
【００５９】
本実施形態の超音波照射部は、流路１１の長さ方向に沿って設けられた２つの超音波照射素子２０ａおよび２０ｂから構成される。つまり、本実施形態では、別個の超音波照射素子を用いることにより、空間的に分離された異なる周波数の超音波を照射している。本実施形態においては、周波数を変調しなくてもそれぞれの超音波照射素子から異なる周波数の超音波を生じせしめることはできるが、より効率よく溶血を行う観点から周波数を変調してもよい。
【００６０】
図５は、上記検出チップＣ２と上記超音波照射部を用いて定在波を生じせしめた様子を示す概略図である。図５に示すように、異なる周波数の超音波に起因して生じる定在波を、一方の定在波Ｕ４の腹の位置が、他の定在波Ｕ３の節の位置に流路１１の長さ方向に沿って対応させることにより、上流側の定在波Ｕ３の節に濃縮させた血球成分を下流側の定在波Ｕ４の腹の音響放射圧で破壊でき効率的に細胞性の非被検物質の破壊を実施することが可能となる。このような場合には、下流側の超音波照射素子に関して、溶血率を上げるために、例えばバイポーラ電源ＨＳＡ４１０１（株式会社エヌエフ回路設計ブロック製）を用いて、電圧を増幅してから印加してもよい。
【００６１】
本実施形態において、全血試料を流路１１の上流から流下させると血球成分はそれぞれの定在波領域を通過することになるが、第１の実施形態と同様に、定在波の場合には音響放射圧分布が空間的に固定されるため、安定した溶血率を得ることができる。さらに、上記のように２つの超音波照射素子２０ａおよび２０ｂを設け、腹の位置と節の位置を流路１１の長さ方向に沿って対応させることにより、上流側の定在波Ｕ３の節の位置に濃縮させた血球成分を下流側の定在波Ｕ４の腹の音響放射圧で破壊でき効率的に溶血を行うことができる。
【００６２】
以上のように、本発明に係る被検物質検出方法は、第１の実施形態と同様に、微小な流路を備えた検出チップを用いた被検物質検出方法において、被検物質を含有する可能性があり細胞性の非被検物質を含有する液体試料を流路に供給し、検出部よりも上流側に設けられた超音波照射部によって、流路の長さ方向に垂直な方向から流路内の液体試料に対して、流路内に定在波を生じせしめるように超音波を照射するものである。したがって、第１の実施形態と同様の効果を奏する。
【００６３】
さらに、本発明に係る被検物質検出方法は、第１の実施形態と同様に、通常の進行波よりも高い音響放射圧を有する定在波を利用しているため、したがって、第１の実施形態と同様の効果を奏する。
【００６４】
さらに、本実施形態では２以上の超音波照射素子を用いて定在波を生じせしめるというように、超音波照射部によって、流路内に時間的および／または空間的に分離された２つ以上の定在波をそれぞれ生じせしめるように、異なる周波数の２つ以上の超音波を時間的および／または空間的に分離して照射しているから、ある定在波の節の位置に濃縮させた血球成分を他の定在波の腹の音響放射圧で破壊でき効率的に細胞性の非被検物質の破壊を実施することが可能となる。
【００６５】
「第３の実施形態の被検物質検出方法」
次に、被検物質検出方法の第３の実施形態について説明する。図６は、本実施形態の被検物質検出方法に用いる検出チップＣ３を示す概略断面図である。なお、本実施形態においても、特異的に結合する対の物質の具体例として抗原および抗体を用いて、被検物質を抗原、この被検物質と特異的に結合する物質を抗体として、蛍光標識を用いたサンドイッチ法によって分析する場合を例として説明する。
【００６６】
本実施形態の被検物質検出方法は、超音波照射素子２０ａに対向するように流路の反対側に第１の音響整合層１８ａおよび第１の反射板１７ａが配置され、さらに超音波照射素子２０ｂに接するように流路部材１３に第２の音響整合層１８ｂが配置されかつこの第２の音響整合層１８ｂに対向するように流路の反対側の蓋部材１４に第２の反射板１７ｂが配置された点で第２の実施形態と異なる。したがって、その他の同様の要素についての詳細な説明は特に必要のない限り省略する。
【００６７】
本実施形態の被検物質検出方法は、流路１１と、流路１１に接続された、流路１１に液体試料を流入させるための流入口１４ａと、流路１１に接続された、流入口１４ａから流入した液体試料を流路１１に流入させるための空気口１４ｂとを有する流路基材１２、流路１１の所定領域に形成された検出部１５、検出部１５よりも上流側に乾燥配置された蛍光標識抗体ＢＦ、反射板１７ａおよび１７ｂ、並びに音響整合層１８ａおよび１８ｂを備えた検出チップＣ３を用い、抗原Ａを含有する可能性がある全血試料Ｓを流路１１に流入させ、蛍光標識抗体ＢＦが乾燥配置された領域よりも上流側に設けられた超音波照射部を構成する２つの超音波照射素子２０ａおよび２０ｂによって、流路１１の長さ方向に垂直な方向から流路１１内の全血試料Ｓに対して、流路１１内に異なる周波数の定在波Ｕ５およびＵ６をそれぞれ生じせしめるように、異なる周波数の超音波をそれぞれ照射し、これらの定在波Ｕ５およびＵ６の腹の音響放射圧で全血試料Ｓ中の血球成分の細胞膜を破壊することで、流路１１の目詰まりなく全血試料Ｓを流路１１に流下せしめ、全血試料Ｓを蛍光標識抗体ＢＦと接触せしめるとともに抗原Ａを蛍光標識抗体ＢＦによって標識し、この抗原Ａおよび蛍光標識抗体ＢＦの複合体を検出部１５上の固定化抗体Ｂ１に固定し、測定光Ｌｅを照射して検出部１５上の上記複合体中の蛍光標識Ｆからの蛍光信号Ｌｆを光検出器２３で検出して、全血試料Ｓ中の抗原Ａの有無および／または量を検出することを特徴とするものである。
【００６８】
本実施形態の超音波照射部は、第２の実施形態と同様に、流路１１の長さ方向に沿って設けられた２つの超音波照射素子２０ａおよび２０ｂから構成される。つまり、本実施形態では、別個の超音波照射素子を用いることにより、空間的に分離された異なる周波数の超音波を照射している。
【００６９】
本実施形態の検出チップＣ３は、超音波照射素子２０ａと接触する流路基材１２の部分に対向するように流路を挟んだ反対側の流路基材１２の部分に、第１の音響整合層１８ａおよび第１の反射板１７ａを備え、さらに、超音波照射素子２０ｂと接触する流路基材１２の部分に埋め込まれた第２の音響整合層１８ｂ、およびこの第２の音響整合層１８ｂに対向するように流路を挟んだ反対側に設けられた第２の反射板１７ｂを備えている。より具体的には、第１の音響整合層１８ａは、超音波照射素子２０ａが接触する流路部材１３の部分に対向するように流路を挟んだ反対側の蓋部材１４の部分に埋め込まれるように形成されており、第１の反射板１７ａは、この第１の音響整合層１８ａの流路と反対側の面に接するように形成されている。また、第２の音響整合層１８ｂは、超音波照射素子２０ｂが接触する流路部材１３の部分に埋め込まれるように形成されており、第２の反射板１７ｂは、この第２の音響整合層１８ｂに対向するように流路を挟んだ反対側の蓋部材１４の部分に埋め込まれるように形成されている。反射板１７ａおよび１７ｂについての詳細は第１の実施形態と同様である。
【００７０】
音響整合層１８ａおよび１８ｂは、流路１１に供給された液体試料Ｓとの音響インピーダンス（Ｚ：Ｚ＝ｃ（物質中の音速）×ρ（物質の密度））の整合を取る役割（音響整合機能）を担うための層であるため、供給される液体試料Ｓと同等の音響インピーダンスを有する材料からなる層である。音響整合層１８ａおよび１８ｂの材料としては特に限定されないが、一般的に生体物質の分析を行う場合の液体試料Ｓは水（Ｚ＝１．４８×１０６ Ｎ・ｓ・ｍ−３（室温））を溶媒とするため、ポリマー等の誘電体材料が挙げられ、軟質のポリエチレン（Ｚ＝１．７５×１０６ Ｎ・ｓ・ｍ−３（室温））やゴム材料が好ましく、ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）等のシリコーンゴム、天然ゴム（Ｚ＝１．５０×１０６ Ｎ・ｓ・ｍ−３（室温））、スチレン−ブタジエン−ゴム（Ｚ＝１．７６×１０６ Ｎ・ｓ・ｍ−３（室温））がより好ましく、特に形状の加工性や厚みの制御性の容易さの観点からＰＤＭＳ（Ｚ＝１．０６×１０６ Ｎ・ｓ・ｍ−３（室温））が好ましい。音響整合層を設けた場合、周波数を調整することにより、定在波の節が音響整合層と流路（もしくは液体試料）との界面（整合界面）に位置することが可能となる。音響整合層１８ａおよび１８ｂは、図６に示すように流路基材１２の内壁の一部となるように埋め込まれるように形成されてもよいし、流路基材１２の内壁面上に形成されてもよい。
【００７１】
本実施形態では上記のような音響整合層１８ａおよび１８ｂを設けているから、図７に示すように、定在波の節が整合界面上に位置することができる。したがって、上流側の超音波照射素子２０ａで形成した定在波Ｕ５の整合界面上の節と、下流側の超音波照射素子２０ｂで形成した定在波Ｕ６の整合界面上の腹が、流路の長さ方向に沿って対応するため、上流側の定在波Ｕ５の節の位置に濃縮させた血球成分を下流側の定在波Ｕ６の腹の音響放射圧で破壊でき効率的に溶血を行うことができる。
【００７２】
また、本実施形態では、下流側の超音波照射素子２０ｂで形成した定在波領域の流路壁面上であって流路長さ方向に沿って検出部１５に対応する位置（検出部１５と同一の流線上の壁面）に第２の音響整合層１８ｂを設けているから、検出部１５近傍へ続く流線上に、前述の捕捉力によって抗原を捕捉した蛍光標識抗体ＢＦを濃縮させることができるため、感度の高い検出を行うことができる。
【００７３】
以上のように、本発明に係る被検物質検出方法は、第１の実施形態と同様に、微小な流路を備えた検出チップを用いた被検物質検出方法において、被検物質を含有する可能性があり細胞性の非被検物質を含有する液体試料を流路に供給し、検出部よりも上流側に設けられた超音波照射部によって、流路の長さ方向に垂直な方向から流路内の液体試料に対して、流路内に定在波を生じせしめるように超音波を照射するものである。したがって、第１の実施形態と同様の効果を奏する。
【００７４】
さらに、本発明に係る被検物質検出方法は、第１の実施形態と同様に、通常の進行波よりも高い音響放射圧を有する定在波を利用しているため、したがって、第１の実施形態と同様の効果を奏する。
【００７５】
さらに、本実施形態では、２以上の超音波照射素子を用いて定在波を生じせしめるというように、超音波照射部によって、流路内に時間的および／または空間的に分離された２つ以上の定在波をそれぞれ生じせしめるように、異なる周波数の２つ以上の超音波を時間的および／または空間的に分離して照射しているから、第２の実施形態と同様の効果を奏する。
【００７６】
さらに、本実施形態では、流路長さ方向に沿って検出部に対応するように、定在波が生じうる領域の流路の壁面に音響整合層を設けているから、検出部近傍へ続く流線上に被検物質を濃縮させることができるため、感度の高い検出を行うことができる。
【００７７】
＜第３の実施形態の設計変更＞
上記の第３の実施形態では、異なる周波数の２つ以上の超音波を時間的および／または空間的に分離して照射するように、２つの超音波照射素子を駆動させた場合について説明したが、必ずしもこの実施形態に限られず、本実施形態の検査チップの構成では、常に同一の周波数を照射するようにしてもよい。例えば、音響整合層１８ａおよび１８ｂの厚みが等しい場合には、定在波Ｕ５およびＵ６は、図８に示すように上下反転した形状となり、同一の周波数を照射しても、１つの超音波に起因して生じせしめられた定在波の腹の位置が、他の超音波に起因して生じせしめられた定在波の節の位置に、流路の長さ方向に沿って対応するためである。
【符号の説明】
【００７８】
１ 検出装置
１１ 流路
１２ 流路基材
１３ 流路部材
１４ 蓋部材
１４ａ 流入口
１４ｂ 空気口
１５ 検出部
１６ 金属膜
１７、１７ａ、１７ｂ 反射板
１８ａ、１８ｂ 音響整合層
２０ 超音波照射部
２１ 超音波制御部
２２ 光源
２３ 光検出器
Ａ 被検物質
Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３ 検査チップ
Ｌｅ 測定光
Ｌｆ 蛍光信号
Ｓ 液体試料
Ｕ、Ｕ１〜６ 定在波
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流路と、該流路に接続された、前記流路に液体試料を流入させるための流入口と、前記流路に接続された、前記流入口から流入した液体試料を前記流路に流入させるための空気口とを有する流路基材、および、前記流路の所定領域に形成された検出部を備えた検出チップを用い、
被検物質を含有する可能性があり細胞性の非被検物質を含有する液体試料を前記流路に流入させ、
前記検出部よりも上流側に設けられた超音波照射部によって、前記流路の長さ方向に垂直な方向から該流路内の前記液体試料に対して、該流路内に定在波を生じせしめるように超音波を照射し、
前記被検物質を、前記検出部に固定された、前記被検物質と特異的に結合する固定化結合物質で検出することを特徴とする被検物質検出方法。
【請求項２】
前記超音波照射部によって、前記流路内に時間的および／または空間的に分離された２つ以上の定在波をそれぞれ生じせしめるように、異なる周波数の２つ以上の超音波を時間的および／または空間的に分離して照射することを特徴とする請求項１に記載の被検物質検出方法。
【請求項３】
１つの超音波照射素子のみからなる前記超音波照射部を用い、
前記超音波照射素子によって、周波数を時間的に変調しながら超音波を照射することにより、前記異なる周波数の２つ以上の超音波を時間的に分離して照射することを特徴とする請求項２に記載の被検物質検出方法。
【請求項４】
前記異なる周波数の２つ以上の超音波のうち１つの前記超音波に起因して生じせしめられた定在波の腹の位置が、他の前記超音波に起因して生じせしめられた定在波の節の位置となるように、前記周波数を変調することを特徴とする請求項３に記載の被検物質検出方法。
【請求項５】
前記流路の長さ方向に沿って設けられた２つ以上の超音波照射素子からなる前記超音波照射部を用い、
前記２つ以上の超音波素子によって、それぞれ異なる周波数の超音波を照射することにより前記異なる周波数の２つ以上の超音波を空間的に分離して照射することを特徴とする請求項２に記載の被検物質検出方法。
【請求項６】
前記異なる周波数の２つ以上の超音波のうち１つの前記超音波に起因して生じせしめられた定在波の腹の位置が、他の前記超音波に起因して生じせしめられた定在波の節の位置に、前記流路の長さ方向に沿って対応するように、前記周波数を異ならせることを特徴とする請求項５に記載の被検物質検出方法。
【請求項７】
前記異なる周波数の２つ以上の超音波のうち少なくとも１つの超音波の周波数を変調することを特徴とする請求項５または６に記載の被検物質検出方法。
【請求項８】
前記検出チップとして、前記定在波が生じうる領域の前記流路の壁面に音響整合層が設けられた検出チップを用いることを特徴とする請求項１から７いずれかに記載の被検物質検出方法。
【請求項９】
流路と、該流路に接続された、前記流路に液体試料を流入させるための流入口と、前記流路に接続された、前記流入口から流入した液体試料を前記流路に流入させるための空気口とを有する流路基材、および、前記流路の所定領域に形成された検出部を備えた検出チップと、
前記検出部よりも上流側に設けられた、前記流路の長さ方向に垂直な方向から該流路内の前記液体試料に対して超音波を照射する超音波照射部と、
前記流路内に定在波を生じせしめるように前記超音波照射部を制御する超音波制御部とを備えることを特徴とする被検物質検出装置。
【請求項１０】
前記超音波照射部が、１つの超音波照射素子のみからなるものであり、
前記超音波制御部が、周波数を時間的に変調することにより、前記異なる周波数の２つ以上の超音波を時間的に分離して照射するように、前記超音波照射素子を制御するものであることを特徴とする請求項９に記載の被検物質検出装置。
【請求項１１】
前記超音波照射部が、前記流路の長さ方向に沿って設けられた２つ以上の超音波照射素子からなるものであり、
前記超音波制御部が、それぞれ異なる周波数の超音波を照射することにより、前記異なる周波数の２つ以上の超音波を空間的に分離して照射するように、前記超音波照射素子を制御するものであることを特徴とする請求項９に記載の被検物質検出装置。
【請求項１】
流路と、該流路に接続された、前記流路に液体試料を流入させるための流入口と、前記流路に接続された、前記流入口から流入した液体試料を前記流路に流入させるための空気口とを有する流路基材、および、前記流路の所定領域に形成された検出部を備えた検出チップを用い、
被検物質を含有する可能性があり細胞性の非被検物質を含有する液体試料を前記流路に流入させ、
前記検出部よりも上流側に設けられた超音波照射部によって、前記流路の長さ方向に垂直な方向から該流路内の前記液体試料に対して、該流路内に定在波を生じせしめるように超音波を照射し、
前記被検物質を、前記検出部に固定された、前記被検物質と特異的に結合する固定化結合物質で検出することを特徴とする被検物質検出方法。
【請求項２】
前記超音波照射部によって、前記流路内に時間的および／または空間的に分離された２つ以上の定在波をそれぞれ生じせしめるように、異なる周波数の２つ以上の超音波を時間的および／または空間的に分離して照射することを特徴とする請求項１に記載の被検物質検出方法。
【請求項３】
１つの超音波照射素子のみからなる前記超音波照射部を用い、
前記超音波照射素子によって、周波数を時間的に変調しながら超音波を照射することにより、前記異なる周波数の２つ以上の超音波を時間的に分離して照射することを特徴とする請求項２に記載の被検物質検出方法。
【請求項４】
前記異なる周波数の２つ以上の超音波のうち１つの前記超音波に起因して生じせしめられた定在波の腹の位置が、他の前記超音波に起因して生じせしめられた定在波の節の位置となるように、前記周波数を変調することを特徴とする請求項３に記載の被検物質検出方法。
【請求項５】
前記流路の長さ方向に沿って設けられた２つ以上の超音波照射素子からなる前記超音波照射部を用い、
前記２つ以上の超音波素子によって、それぞれ異なる周波数の超音波を照射することにより前記異なる周波数の２つ以上の超音波を空間的に分離して照射することを特徴とする請求項２に記載の被検物質検出方法。
【請求項６】
前記異なる周波数の２つ以上の超音波のうち１つの前記超音波に起因して生じせしめられた定在波の腹の位置が、他の前記超音波に起因して生じせしめられた定在波の節の位置に、前記流路の長さ方向に沿って対応するように、前記周波数を異ならせることを特徴とする請求項５に記載の被検物質検出方法。
【請求項７】
前記異なる周波数の２つ以上の超音波のうち少なくとも１つの超音波の周波数を変調することを特徴とする請求項５または６に記載の被検物質検出方法。
【請求項８】
前記検出チップとして、前記定在波が生じうる領域の前記流路の壁面に音響整合層が設けられた検出チップを用いることを特徴とする請求項１から７いずれかに記載の被検物質検出方法。
【請求項９】
流路と、該流路に接続された、前記流路に液体試料を流入させるための流入口と、前記流路に接続された、前記流入口から流入した液体試料を前記流路に流入させるための空気口とを有する流路基材、および、前記流路の所定領域に形成された検出部を備えた検出チップと、
前記検出部よりも上流側に設けられた、前記流路の長さ方向に垂直な方向から該流路内の前記液体試料に対して超音波を照射する超音波照射部と、
前記流路内に定在波を生じせしめるように前記超音波照射部を制御する超音波制御部とを備えることを特徴とする被検物質検出装置。
【請求項１０】
前記超音波照射部が、１つの超音波照射素子のみからなるものであり、
前記超音波制御部が、周波数を時間的に変調することにより、前記異なる周波数の２つ以上の超音波を時間的に分離して照射するように、前記超音波照射素子を制御するものであることを特徴とする請求項９に記載の被検物質検出装置。
【請求項１１】
前記超音波照射部が、前記流路の長さ方向に沿って設けられた２つ以上の超音波照射素子からなるものであり、
前記超音波制御部が、それぞれ異なる周波数の超音波を照射することにより、前記異なる周波数の２つ以上の超音波を空間的に分離して照射するように、前記超音波照射素子を制御するものであることを特徴とする請求項９に記載の被検物質検出装置。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１１−２１４９９９（Ｐ２０１１−２１４９９９Ａ）
【公開日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−８３３５８（Ｐ２０１０−８３３５８）
【出願日】平成２２年３月３１日（２０１０．３．３１）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月３１日（２０１０．３．３１）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
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