被覆微粒子の製造方法
本発明は、コア微粒子が分散し、かつ被覆層の構成成分が溶解した極性有機溶媒を含む液（液Ａ）を調製する工程、液Ａと混合可能であり、極性有機溶媒を含まないまたは液Ａより低い割合で極性有機溶媒を含む液（液Ｂ）を調製する工程、および２つ以上の入口と、１つ以上の出口をもつインライン混合手段を備える被覆微粒子製造装置の少なくとも１つの入口から、液Ａを入れ、残る入口の少なくとも１つの入口から、液Ｂを入れて混合し、コア微粒子を被覆層で被覆する工程を含むコア微粒子が被覆層で被覆された被覆微粒子の製造方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被覆微粒子の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、医薬品、食品、農薬、動物用薬等において、被覆微粒子の製造方法に関して多くの技術の開示が行われている。微粒子（被覆される微粒子）の被覆層による被覆は、例えば外的因子から受ける影響を抑制するため、外的因子の影響を選択的に受け入れ、それをトリガーとして微粒子に変化を起こすため等、微粒子に機能を付与する目的で行われている。その１つとして、液体中で微粒子を脂質膜で被覆する方法が報告されている（特許文献１参照）。該方法においては、微粒子が分散し、かつ脂質が溶解した極性有機溶媒含有水溶液中の極性有機溶媒の割合を減少させることによって、微粒子が脂質膜で被覆されており、液体中において被覆が行われ、例えば静脈注射用微粒子等に好適な大きさの被覆微粒子が、すぐれた効率で製造されている。また、該特許文献１では、極性有機溶媒含有水溶液中の極性有機溶媒の割合を減少させる手段の１つとして、極性有機溶媒含有水溶液に、水を含有する液を混合する方法を示している。
【０００３】
一方、インライン混合手段は、２種以上の液体を混合する方法として工業的に用いられている手段である。また、インライン混合手段は、被覆によらない方法で製造されるポリマー複合体およびリポソームの製造方法において用いられている（特許文献２および特許文献３参照）。
【特許文献１】国際公開第０２／２８３６７号パンフレット
【特許文献２】特表２００２−５２２４６８号公報
【特許文献３】特表２００２−５２９２４０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、コア微粒子が被覆層で被覆された被覆微粒子の工業的製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は以下の（１）〜（１１）に関する。
（１）コア微粒子が被覆層で被覆された被覆微粒子の製造方法であって、
該コア微粒子が分散し、かつ該被覆層を構成する被覆層成分が溶解した極性有機溶媒を含む液（液Ａ）を調製する工程、
液Ａと混合可能であり、極性有機溶媒を含まないまたは液Ａより低い割合で極性有機溶媒を含む液（液Ｂ）を調製する工程、および
２つ以上の入口と、１つ以上の出口をもつインライン混合手段を備える被覆微粒子製造装置の少なくとも１つの入口から、液Ａを入れ、残る入口の少なくとも１つの入口から、液Ｂを入れて混合し、該コア微粒子を該被覆層で被覆する工程を含む製造方法。
（２）被覆微粒子製造装置が、ポンプ、流路および前記インライン混合手段を含む前記（１）記載の製造方法。
（３）被覆微粒子製造装置が、手動ポンプ、流路および前記インライン混合手段を含む前記（１）記載の製造方法。
（４）被覆層成分が、脂質、界面活性剤および高分子から選ばれる１つ以上の物質である前記（１）〜（３）のいずれかに記載の製造方法。
（５）被覆層が脂質膜である前記（１）〜（４）のいずれかに記載の製造方法。
（６）コア微粒子が薬物、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン微粒子、高分子、金属コロイドまたは微粒子製剤を構成成分とする微粒子である前記（１）〜（５）のいずれかに記載の製造方法。
（７）コア微粒子が薬物、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン微粒子、高分子、金属コロイドまたは微粒子製剤を２つ以上組み合わせた複合体を構成成分とする微粒子である前記（１）〜（５）のいずれかに記載の製造方法。
（８）コア微粒子が、薬物とリポソームの複合体を構成成分とする微粒子である前記（１）〜（５）のいずれかに記載の製造方法。
（９）極性有機溶媒がアルコール類、グリコール類およびポリアルキレングリコール類から選ばれる１つ以上である前記（１）〜（８）のいずれかに記載の製造方法。
（１０）極性有機溶媒がエタノールである前記（１）〜（８）のいずれかに記載の製造方法。
（１１）前記（１）〜（１０）のいずれかに記載の製造方法によって製造できる被覆微粒子。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、コア微粒子が被覆層で被覆された被覆微粒子の連続式で簡便な工業的製造方法が提供される。また、本発明によって、効率よくおよび／または堅固に薬物を含有させた被覆微粒子の製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本発明で用いられる基本的な被覆微粒子製造装置の模式図。
【図２】本発明で用いられる被覆微粒子製造装置の応用例（１）の模式図。
【図３】本発明で用いられる被覆微粒子製造装置の応用例（２）の模式図。
【図４】従来の被覆微粒子製造装置の模式図。
【符号の説明】
【０００８】
１ ２つの入口と、１つの出口をもつインライン混合手段
２，３，４ 流路
５，６ ポンプ
７ 液槽
８ ２つの入口と、１つの出口をもつインライン混合手段
９，１０ 流路
１１，１２ ポンプ
１３ ２つの入口と、１つの出口をもつインライン混合手段
１４，１５ 流路
１６ ポンプ
１７，１８ 液槽
１９ 流路
２０ ポンプ
【０００９】
液Ａ コア微粒子が分散し、かつ被覆層成分が溶解した極性有機溶媒を含む液
液Ｂ 液Ａと混合可能であり、極性有機溶媒を含まないまたは液Ａより低い割合で極性有機溶媒を含む液
液Ｃ 液Ａと液Ｂを混合して得られる懸濁液
液Ｄ コア微粒子が分散した極性有機溶媒を含む液
液Ｅ 液Ｄ中の極性有機溶媒と同一または異なった極性有機溶媒を含む溶媒に被覆層成分を溶解させた液
液Ｆ 極性有機溶媒以外の溶媒
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明におけるインライン混合手段を備える被覆微粒子製造装置は、２つ以上の入口と、１つ以上の出口をもつインライン混合手段を備える被覆微粒子製造装置であればいずれでもよく、該インライン混合手段は、複数のインライン混合手段が連結した場合を含む。また、該製造装置には、該インライン混合手段に接続された流路が備えられていてもよく、また該流路がインライン混合手段を兼ねていてもよい。また、該製造装置にはポンプが備えられていてもよく、該ポンプは前記インライン混合手段の入口および／または出口と、前記流路を通じて接続される。
【００１１】
本発明における被覆微粒子とは、少なくともコア微粒子と被覆層からなる微粒子のことであり、被覆層を構成する被覆層成分がコア微粒子の外側を被覆して形成される微粒子のことである。
【００１２】
本発明におけるコア微粒子とは、例えば、薬物、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン粒子、高分子、金属コロイド、微粒子製剤等を構成成分とする微粒子のことであり、好ましくは、少なくとも薬物を構成成分とする微粒子があげられる。また、本発明におけるコア微粒子は、薬物、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン粒子、高分子、金属コロイド、微粒子製剤等を２つ以上組み合わせた複合体を構成成分としていてもよく、薬物、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン粒子、高分子、金属コロイド、微粒子製剤等と他の化合物（例えば糖、脂質、無機化合物等）とを組み合わせた複合体を構成成分としていてもよく、好ましくは、薬物とリポソームの複合体を構成成分とする微粒子があげられる。
【００１３】
薬物は、液Ａにおける溶媒中で微粒子の形態をとる薬物、コア微粒子を構成する他の構成成分と複合体を形成して液Ａにおける溶媒中で微粒子の形態をとる薬物等を包含し、例えば蛋白質、ペプチド、核酸、低分子化合物、糖類、高分子化合物、脂質性化合物、金属化合物等のうち薬理学的活性を有する物質があげられ、好ましくは、核酸があげられ、より好ましくは、遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、プラスミドおよびｓｉＲＮＡから選ばれる１つ以上の物質があげられる。
【００１４】
蛋白質またはペプチドとしては、例えばブラジキニン、アンジオテンシン、オキシトシン、バソプレシン、アドレノコルチコトロピン、カルシトニン、インスリン、グルカゴン、コレシストキニン、β−エンドルフィン、メラノサイト阻害因子、メラノサイト刺激ホルモン、ガストリンアンタゴニスト、ニューロテンシン、ソマトスタチン、ブルシン、シクロスポリン、エンケファリン、トランスフェリン、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）ペプチド、甲状腺ホルモン、成長ホルモン、性腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、ウリカーゼ、カルボキシペプチダーゼ、グルタミナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼ、インターロイキン、インターフェロン、ムラミルジペプチド、サイモポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、トリプシンインヒビター、リゾチーム、表皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子、神経成長因子、血小板由来成長因子、形質転換成長因子、内皮細胞成長因子、フィブロブラスト（繊維芽細胞）成長因子、グリア細胞成長因子、サイモシン、特異抗体（例えば、抗ＥＧＦ受容体抗体等があげられる）等があげられる。
【００１５】
核酸としては、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、センスオリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオチド、遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、ｓｉＲＮＡ等があげられ、該核酸は、核酸の構造中のリン酸部、エステル部等に含まれる酸素原子等が、例えば硫黄原子等の他の原子に置換された誘導体を包含する。なお、ｓｉＲＮＡとは、短い二本鎖ＲＮＡのことである。
【００１６】
低分子化合物としては、例えばイプシロン−アミノカプロン酸、塩酸アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸カリウム、トラネキサム酸、硫酸ブレオマイシン、硫酸ビンクリスチン、セファゾリンナトリウム、セファロチンナトリウム、シチコリン、シタラビン、硫酸ゲンタマイシン、塩酸バンコマイシン、硫酸カナマイシン、硫酸アミカシン等があげられる。
【００１７】
糖類としては、例えばコンドロイチン硫酸ナトリウム、ヘパリンナトリウム、デキストランフルオレセイン等があげられる。
【００１８】
高分子化合物としては、例えばポリエチレンスルホン酸ナトリウム、ジビニルエーテル−無水マレイン酸共重合体（ＤＩＶＥＭＡ）、スチレン無水マレイン酸共重合体−ネオカルチノスタチン結合体（ＳＭＡＮＣＳ）等があげられる。
脂質性化合物としては、例えばビタミンＤ、ビタミンＥ等があげられる。
金属化合物としては、例えばシスプラチン等があげられる。
【００１９】
脂質集合体またはリポソームは、例えば脂質および／または界面活性剤等によって構成され、脂質としては、単純脂質、複合脂質または誘導脂質のいかなるものであってもよく、例えばリン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質、スフィンゴイド類、ステロール類等があげられ、好ましくは、リン脂質があげられる。また、脂質としては、例えば界面活性剤（後記の界面活性剤と同義）、高分子（後記の高分子と同義で、具体的にはデキストラン等）、ポリオキシエチレン誘導体（具体的にはポリエチレングリコール等）等の脂質誘導体もあげられ、好ましくは、ポリエチレングリコール化リン脂質があげられる。界面活性剤としては、例えば非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤等があげられる。
【００２０】
リン脂質としては、例えばホスファチジルコリン（具体的には大豆ホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン等）、ホスファチジルエタノールアミン（具体的にはジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン等）、グリセロリン脂質（具体的にはホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリン等）、スフィンゴリン脂質（具体的にはスフィンゴミエリン、セラミドホスホエタノールアミン、セラミドホスホグリセロール、セラミドホスホグリセロリン酸等）、グリセロホスホノ脂質、スフィンゴホスホノ脂質、天然レシチン（具体的には卵黄レシチン、大豆レシチン等）、水素添加リン脂質（具体的には水素添加ホスファチジルコリン等）等の天然または合成のリン脂質があげられる。
【００２１】
グリセロ糖脂質としては、例えばスルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド等があげられる。
スフィンゴ糖脂質としては、例えばガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド等があげられる。
スフィンゴイド類としては、例えばスフィンガン、イコサスフィンガン、スフィンゴシン、それらの誘導体等があげられる。誘導体としては、例えばスフィンガン、イコサスフィンガン、スフィンゴシン等の−ＮＨ２を−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｘＣＨ３（式中、ｘは０〜１８の整数を表し、中でも６、１２または１８が好ましい）に変換したもの等があげられる。
【００２２】
ステロール類としては、例えばコレステロール、ジヒドロコレステロール、ラノステロール、β−シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、エルゴカステロール、フコステロール、３β−［Ｎ−（Ｎ’Ｎ’−ジメチルアミノエチル）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）等があげられる。
【００２３】
その他、脂質としては、例えば、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルプロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロ酢酸（ＤＯＳＰＡ）、Ｎ−［１−（２，３−ジテトラデシルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチル臭化アンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチル臭化アンモニウム（ＤＯＲＩＥ）等の脂質もあげられる。
【００２４】
非イオン性界面活性剤としては、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（具体的にはポリソルベート８０等）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（具体的にはプルロニックＦ６８等）、ソルビタン脂肪酸（具体的にはソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート等）、ポリオキシエチレン誘導体（具体的にはポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、ポリオキシエチレンラウリルアルコール等）、グリセリン脂肪酸エステル等があげられる。
【００２５】
アニオン性界面活性剤としては、例えばアシルサルコシン、アルキル硫酸ナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸塩、炭素数７〜２２の脂肪酸ナトリウム等があげられる。具体的にはドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム等があげられる。
【００２６】
カチオン性界面活性剤としては、例えばアルキルアミン塩、アシルアミン塩、第四級アンモニウム塩、アミン誘導体等があげられる。具体的には塩化ベンザルコニウム、アシルアミノエチルジエチルアミン塩、Ｎ−アルキルポリアルキルポリアミン塩、脂肪酸ポリエチレンポリアミド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、アルキルポリオキシエチレンアミン、Ｎ−アルキルアミノプロピルアミン、脂肪酸トリエタノールアミンエステル等があげられる。
【００２７】
両性界面活性剤としては、例えば３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸、Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸等があげられる。
【００２８】
リポソームにおいては、これら脂質および界面活性剤は、単独でまたは組み合わせて用いられ、好ましくは、組み合わせて用いられる。組み合わせて用いる場合の組み合わせとしては、例えば水素添加大豆ホスファチジルコリン、ポリエチレングリコール化リン脂質およびコレステロールから選ばれる２成分以上の組み合わせ、ジステアロイルホスファチジルコリン、ポリエチレングリコール化リン脂質およびコレステロールから選ばれる２成分以上の組み合わせ、ＥＰＣとＤＯＴＡＰの組み合わせ、ＥＰＣ、ＤＯＴＡＰおよびポリエチレングリコール化リン脂質の組み合わせ、ＥＰＣ、ＤＯＴＡＰ、コレステロールおよびポリエチレングリコール化リン脂質の組み合わせ等があげられる。
【００２９】
また、リポソームは、必要に応じて、例えばコレステロール等のステロール類等の膜安定化剤、例えばトコフェロール等の抗酸化剤等を含有していてもよい。
【００３０】
脂質集合体としては、例えば球状ミセル、球状逆ミセル、ソーセージ状ミセル、ソーセージ状逆ミセル、板状ミセル、板状逆ミセル、ヘキサゴナルＩ、ヘキサゴナルＩＩおよび脂質２分子以上からなる会合体等があげられる。
【００３１】
エマルジョン粒子としては、例えば脂肪乳剤、非イオン性界面活性剤と大豆油からなるエマルジョン、リピッドエマルジョン、リピッドナノスフェアー等の水中油型（Ｏ／Ｗ）エマルジョンや水中油中水型（Ｗ／Ｏ／Ｗ）エマルジョン粒子等があげられる。
【００３２】
高分子としては、例えばアルブミン、デキストラン、キトサン、デキストラン硫酸、ＤＮＡ等の天然高分子、例えばポリ−Ｌ−リジン、ポリエチレンイミン、ポリアスパラギン酸、スチレンマレイン酸共重合体、イソプロピルアクリルアミド−アクリルピロリドン共重合体、ポリエチレングリコール修飾デンドリマー、ポリ乳酸、ポリ乳酸ポリグリコール酸、ポリエチレングリコール化ポリ乳酸等の合成高分子、およびそれらの塩等があげられる。
【００３３】
ここで、高分子における塩は、例えば金属塩、アンモニウム塩、酸付加塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等を包含する。金属塩としては、例えばリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等があげられ、アンモニウム塩としては、例えばアンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の塩があげられ、酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、および酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩等の有機酸塩があげられ、有機アミン付加塩としては、例えばモルホリン、ピペリジン等の付加塩があげられ、アミノ酸付加塩としては、例えばグリシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン等の付加塩があげられる。
【００３４】
金属コロイドとしては、例えば金、銀、白金、銅、ロジウム、シリカ、カルシウム、アルミニウム、鉄、インジウム、カドミウム、バリウム、鉛等を含む金属コロイドがあげられる。
【００３５】
微粒子製剤としては、例えばマイクロスフェアー、マイクロカプセル、ナノクリスタル、リピッドナノパーティクル、高分子ミセル等があげられる。
【００３６】
また、コア微粒子が薬物を含むコア微粒子である場合には、好ましくは、コア微粒子は、薬物と静電的に逆の電荷をもつ荷電物質を含有し、より好ましくは、薬物と静電的に逆の電荷をもつ脂質（後記のカチオン性脂質またはアニオン性脂質）を含有する。ここで、薬物と静電的に逆の電荷とは、薬物分子内の電荷、分子内分極等に対して静電的引力を生じる電荷、表面分極等を包含する。
【００３７】
コア微粒子に含有される荷電物質は、カチオン性を呈するカチオン性物質とアニオン性を呈するアニオン性物質とに分類されるが、カチオン性の基とアニオン性の基の両方をもつ両性の物質であっても、ｐＨや、他の物質との結合等により相対的な陰性度が変化するので、その時々に応じてカチオン性物質またはアニオン性物質に分類され得る。これら荷電物質は、前記コア微粒子の構成成分として用いても、該コア微粒子の構成成分に加えて用いても構わない。
【００３８】
カチオン性物質としては、例えば前記のコア微粒子の定義で例示したもののうちのカチオン性物質［具体的には、カチオン性脂質、カチオン性界面活性剤（前記と同義）、カチオン性高分子等］、等電点以下の値のｐＨで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチド等があげられる。
【００３９】
カチオン性脂質としては、例えばＤＯＴＡＰ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＳＰＡ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＲＩＥ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ等があげられる。
カチオン性高分子としては、例えばポリ−Ｌ−リジン、ポリエチレンイミン、ポリフェクト（ｐｏｌｙｆｅｃｔ）、キトサン等があげられる。
【００４０】
等電点以下の値のｐＨで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチドとしては、その物質の等電点以下の値のｐＨで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチドであれば、特に限定されない。例えば、アルブミン、オロソムコイド、グロブリン、フィブリノーゲン、ペプシン、リボヌクレアーゼＴ１等があげられる。
【００４１】
アニオン性物質としては、例えば前記のコア微粒子の定義で例示したもののうちのアニオン性物質［具体的には、アニオン性脂質、アニオン性界面活性剤（前記と同義）、アニオン性高分子等］、等電点以上の値のｐＨで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチド、核酸等があげられる。
【００４２】
アニオン性脂質としては、例えばホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸等があげられる。
アニオン性高分子としては、例えばポリアスパラギン酸、スチレンマレイン酸共重合体、イソプロピルアクリルアミド−アクリルピロリドン共重合体、ポリエチレングリコール修飾デンドリマー、ポリ乳酸、ポリ乳酸ポリグリコール酸、ポリエチレングリコール化ポリ乳酸、デキストラン硫酸、デキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸、コンドロイチン、デルタマン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケタラン硫酸、デキストランフルオレセインアニオニック等があげられる。
【００４３】
等電点以上の値のｐＨで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチドとしては、その物質の等電点以上の値のｐＨで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチドであれば、特に限定されない。例えば、アルブミン、オロソムコイド、グロブリン、フィブリノーゲン、ヒストン、プロタミン、リボヌクレアーゼ、リゾチーム等があげられる。
【００４４】
アニオン性物質としての核酸としては、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド等があげられ、生理活性を示さないものであれば、どのような長さ、配列のものであってもよい。
【００４５】
コア微粒子は、市販品として得られるか、または公知の方法またはそれに準じて製造することができる。例えば、コア微粒子の１つであるリポソームを構成成分とするコア微粒子の製造には、公知のリポソームの調製方法が適用できる。公知のリポソームの調製方法としては、例えばバンガム（Ｂａｎｇｈａｍ）らのリポソーム調製法［“ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）”，１９６５年，第１３巻，ｐ．２３８−２５２参照］、エタノール注入法［“ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．）”，１９７５年，第６６巻，ｐ．６２１−６３４参照］、フレンチプレス法［“エフイービーエス・レターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．）”，１９７９年，第９９巻，ｐ．２１０−２１４参照］、凍結融解法［“アーカイブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．）”，１９８１年，第２１２巻，ｐ．１８６−１９４参照］、逆相蒸発法［“プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）”，１９７８年，第７５巻，ｐ．４１９４−４１９８参照］、ｐＨ勾配法（例えば特許第２５７２５５４号公報、特許第２６５９１３６号公報等参照）等があげられる。リポソームの製造の際にリポソームを懸濁させる溶液としては、例えば水、酸、アルカリ、種々の緩衝液、生理的食塩液、アミノ酸輸液等を用いることができる。また、リポソームの製造の際には、例えばクエン酸、アスコルビン酸、システイン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等の抗酸化剤、例えばグリセリン、ブドウ糖、塩化ナトリウム等の等張化剤等の添加も可能である。また、脂質等を例えばエタノール等の有機溶媒に溶解し、溶媒留去した後、生理食塩水等を添加、振とう撹拌し、リポソームを形成させることによってもリポソームを製造することができる。
【００４６】
また、例えば非イオン性界面活性剤（前記と同義）、カチオン性界面活性剤（前記と同義）、アニオン性界面活性剤（前記と同義）、高分子、ポリオキシエチレン誘導体等によるリポソーム表面改質も任意に行うことができ、これらの表面改質リポソームも本発明におけるコア微粒子の構成成分として用いられる［ラジック（Ｄ．Ｄ．Ｌａｓｉｃ）、マーティン（Ｆ．Ｍａｒｔｉｎ）編，“ステルス・リポソームズ（Ｓｔｅａｌｔｈ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）”，（米国），シーアールシー・プレス・インク（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ），１９９５年，ｐ．９３−１０２参照］。高分子としては例えばデキストラン、プルラン、マンナン、アミロペクチン、ヒドロキシエチルデンプン等があげられる。ポリオキシエチレン誘導体としては、例えばポリソルベート８０、プルロニックＦ６８、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、ポリオキシエチレンラウリルアルコール、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）等があげられる。
【００４７】
リポソームの平均粒子径は、所望により自由に選択できる。平均粒子径を調節する方法としては、例えばエクストルージョン法、大きな多重膜リポソーム（ＭＬＶ）を機械的に粉砕（具体的にはマントンゴウリン、マイクロフルイダイザー等を使用）する方法［ミュラー（Ｒ．Ｈ．Ｍｕｌｌｅｒ）、ベニタ（Ｓ．Ｂｅｎｉｔａ）、ボーム（Ｂ．Ｂｏｈｍ）編著，“エマルジョン・アンド・ナノサスペンジョンズ・フォー・ザ・フォーミュレーション・オブ・ポアリー・ソラブル・ドラッグズ（Ｅｍｕｌｓｉｏｎ ａｎｄ Ｎａｎｏｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｏｒｌｙ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｄｒｕｇｓ）”，ドイツ，サイエンティフィック・パブリッシャーズ・スチュットガルト（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ），１９９８年，ｐ．２６７−２９４参照］等があげられる。
【００４８】
また、コア微粒子を構成する例えば薬物、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン粒子、高分子、金属コロイド、微粒子製剤等から選ばれる２つ以上を組み合わせた複合体（具体的には、例えばカチオン性脂質を含有するリポソームまたは脂質集合体と核酸との複合体、ポリ−Ｌ−リジン等のカチオン性高分子を含有する高分子と核酸との複合体、ホスファチジン酸等のアニオン性脂質を含有するリポソームまたは脂質集合体と蛋白質との複合体、スチレンマレイン酸等のアニオン性高分子を含有する高分子と蛋白質との複合体、カチオン性脂質を含有するリポソームまたは脂質集合体と蛋白質との複合体、ポリ−Ｌ−リジン等のカチオン性高分子を含有する高分子と蛋白質との複合体等があげられる）の製造方法は例えば水中で薬物と脂質集合体、リポソーム、高分子等とを混合するだけの製造方法でもよく、この際、必要であればさらに整粒工程や無菌化工程等を加えることもできる。また、複合体形成を例えばアセトン、エーテル等種々の溶媒中で行うことも可能である。例えば、核酸と脂質とをエタノール等の有機溶媒に溶解し、溶媒留去した後、生理食塩水等を添加、振とう撹拌し、核酸複合体を形成させることもできる。別の複合体の形成方法としては、例えば、水中でカチオン性物質とポリエチレングリコール化リン脂質（具体的にはポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミン（より具体的には１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）等）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、クレモフォアイーエル（ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ ＥＬ）等）等でリポソームを調製し、その後、例えば核酸を添加し、さらに例えばアニオン性高分子を添加して、多重複合体とすることも可能である。
【００４９】
コア微粒子の大きさは、平均粒子径が数ｎｍ〜数百μｍであるのが好ましく、１０ｎｍ〜５μｍであるのがより好ましく、５０ｎｍ〜３００ｎｍであるのがさらに好ましく、５０ｎｍ〜２００ｎｍであるのが最も好ましい。
【００５０】
被覆層成分としては、例えば前記コア微粒子の定義の中であげた脂質、界面活性剤、高分子等があげられ、好ましくは、前記コア微粒子の定義の中であげた脂質および界面活性剤から選ばれる１つ以上の物質があげられ、より好ましくは、被覆層が脂質膜となる脂質および界面活性剤から選ばれる１つ以上の物質があげられ、さらに好ましくは、リン脂質があげられる。
【００５１】
また、被覆層が脂質膜である場合に用いられる脂質として、例えば合成脂質等もあげられる。合成脂質としては、例えばフッ素添加ホスファチジルコリン、フッ素添加界面活性剤、臭化ジアルキルアンモニウム等があげられ、これらは単独でまたは他の脂質等と組み合わせて用いられてもよい。また、被覆層が脂質膜である場合には、被覆層成分の１つとして水溶性高分子誘導体も使用することが好ましい。水溶性高分子誘導体としては、例えばポリエチレングリコール化脂質［具体的にはポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミン（より具体的には１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）等）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、クレモフォアイーエル（ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ ＥＬ）等］、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル（具体的にはモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン等）、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリグリセリン化脂質（具体的にはポリグリセリン−ホスファチジルエタノールアミン等）、ポリグリセリン脂肪酸エステル等があげられ、好ましくは、ポリエチレングリコール化脂質があげられる。
【００５２】
本発明の被覆微粒子は、例えばコア微粒子が分散し、かつ被覆層成分が溶解した極性有機溶媒を含む液（液Ａ）を調製する工程、液Ａと混合可能であり、極性有機溶媒を含まないまたは液Ａより低い割合で極性有機溶媒を含む液（液Ｂ）を調製する工程、および、２つ以上の入口と、１つ以上の出口をもつインライン混合手段を備える被覆微粒子製造装置の、インライン混合手段の１つ以上の入口から、液Ａを入れ、残る入口の少なくとも１つの入口から、液Ｂを入れて混合し、コア微粒子を被覆層で被覆する工程を含む製造方法によって製造でき、この場合、該被覆微粒子は懸濁液（液Ｃ）の形態で得られる。また、液Ａにおける溶媒は、コア微粒子が溶解せず、被覆層成分が溶解する溶媒であるのが好ましく、液Ａと液Ｂを混合した液Ｃでは、コア微粒子は溶解せず、被覆層成分は溶解しないまたは集合している。液Ａは極性有機溶媒を含む液であり、液Ｂは極性有機溶媒以外の溶媒を含む液であるが、液Ａは極性有機溶媒以外の溶媒を液Ｂにおける極性有機溶媒の以外の溶媒の割合よりも低ければ含んでいてもよく、液Ｂも極性有機溶媒を液Ａにおける極性有機溶媒の割合よりも低ければ含んでいてもよい。
【００５３】
本発明において、コア微粒子が分散するとは、コア微粒子が懸濁、乳濁またはエマルジョン化、好ましくは、懸濁している状態のことであり、コア微粒子の大部分が分散して、残りの部分が溶解している状態または一部が沈殿している状態も包含するが、コア微粒子のほとんど全部または全部が分散していることが好ましい。また、被覆層成分が溶解するとは、被覆層成分の大部分が溶解して、残りの部分が分散している状態も包含するが、被覆層成分のほとんど全部または全部が溶解していることが好ましい。
【００５４】
前記液Ａおよび液Ｂにおける極性有機溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノール、ｎ−ブタノール、２−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール等のアルコール類、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコール類等があげられ、好ましくは、エタノールがあげられる。また、前記液Ａおよび液Ｂにおける極性有機溶媒以外の溶媒としては、例えば、水、液体二酸化炭素、液体炭化水素、ハロゲン化炭素、ハロゲン化炭化水素等があげられ、好ましくは、水があげられる。また、液Ａおよび液Ｂは、イオン、緩衝成分等を含んでいてもよい。
【００５５】
極性有機溶媒と極性有機溶媒以外の溶媒の組み合わせは、相互に混合可能である組み合わせであるのが好ましく、液Ａ〜Ｃ中の溶媒に対する、前記コア微粒子の溶解度、前記被覆層成分の溶解度等を考慮して選択できる。一方、前記コア微粒子については、液Ａ〜Ｃ中の溶媒のいずれに対しての溶解度も低いことが好ましく、また極性有機溶媒および極性有機溶媒以外の溶媒のいずれに対しての溶解度も低いことが好ましく、被覆層成分は、液Ｂおよび液Ｃ中の溶媒に対しての溶解度が低いことが好ましく、液Ａ中の溶媒に対しての溶解度が高いことが好ましく、また極性有機溶媒に対しての溶解度が高いことが好ましく、極性有機溶媒以外の溶媒に対しての溶解度が低いことが好ましい。
【００５６】
液Ａ中の溶媒における極性有機溶媒の割合は、前記コア微粒子が溶解せずに存在し、被覆層成分が溶解するという条件さえ満たしていれば特に限定されるものではなく、用いる溶媒やコア微粒子、被覆層成分の種類等により異なるが、好ましくは、３０ｖｏｌ％以上、より好ましくは、６０〜９０ｖｏｌ％である。また、液Ｃ中の溶媒における極性有機溶媒の割合は、前記コア微粒子が溶解していた被覆層成分で被覆されうる割合であれば特に限定されるものではないが、好ましくは、５０ｖｏｌ％以下、より好ましくは、３０〜５０ｖｏｌ％である。
【００５７】
液Ａを調製する工程としては、前記コア微粒子が溶解しなければ、前記極性有機溶媒、前記コア微粒子および前記被覆層成分、または前記極性有機溶媒、前記コア微粒子、前記被覆層成分および前記極性有機溶媒以外の溶媒をいかなる順に加えて液Ａを調製する工程でもかまわず、好ましくは、前記コア微粒子が分散した極性有機溶媒を含む液（液Ｄ）を調製し、液Ｄ中の極性有機溶媒と同一または異なった極性有機溶媒を含む溶媒に被覆層成分を溶解させた液（液Ｅ）を調製し、液Ｄと液Ｅを混合して調製する工程があげられる。また、液Ｄと液Ｅとの混合は、徐々に行うのが好ましい。液Ｄと液Ｅを混合して液Ａを調製する工程において、液Ａにおける極性有機溶媒の割合を調整するためには、液Ｄおよび液Ｅの液量とそれぞれにおける極性有機溶媒の割合を調節すればよい。液Ｄと液Ｅの混合は、前記インライン混合手段の入口から、流路を通じて接続された別のインライン混合手段または混合手段を備えた貯蔵室もしくは貯蔵槽によって行われてもよく、前記インライン混合手段の入口から、流路を通じて接続された別のインライン混合手段と接続される場合における被覆微粒子装置としては、それぞれ２つの入口と、１つの出口をもつ第１インライン混合手段と第２インライン混合手段を備え、第１インライン混合手段の出口と第２インライン混合手段の１つの入口が繋がっている被覆微粒子装置があげられる。液Ｄおよび液Ｅ中の溶媒における極性有機溶媒の各割合の差は２０ｖｏｌ％以内とすることが好ましく、０ｖｏｌ％とすることがより好ましい。また、液Ｄおよび液Ｅは、それぞれさらに別のインライン混合手段によって調製してもよい。
【００５８】
また、液Ｃにおいては、極性有機溶媒以外の溶媒（液Ｆ）を加えること、および／または、例えば蒸発留去、半透膜分離、分留等によって、選択的に極性有機溶媒を取り除くことで、極性有機溶媒の割合をさらに減少させることが好ましい。液Ｃと液Ｆの混合は、前記インライン混合装置の出口から流路を通じて接続された別のインライン混合手段または混合手段を備えた貯蔵室もしくは貯蔵槽によって行われてもよい。
【００５９】
本発明におけるコア微粒子と被覆層成分の組み合わせは、特に限定されないが、コア微粒子が薬物とリポソームの複合体を構成成分とする微粒子であって、被覆層成分が脂質および／または界面活性剤である組み合わせが好ましい。コア微粒子がリポソームまたは薬物とリポソームの複合体を構成成分とする微粒子であって、被覆層成分が脂質および／または界面活性剤であって、被覆層が脂質膜である被覆微粒子は、その構成から狭義のリポソームと分類され、コア微粒子がリポソームまたは薬物とリポソームの複合体を構成成分とする微粒子以外で、被覆層成分が脂質および／または界面活性剤であって、被覆層が脂質膜である被覆微粒子は、広義のリポソームと分類される。本発明において、被覆微粒子は狭義のリポソームであることがより好ましい。
【００６０】
本発明の被覆微粒子の製造方法において用いられるコア微粒子の液Ａおよび液Ｃに対する割合は、コア微粒子を被覆層成分で被覆できれば特に限定されるものではないが、１μｇ／ｍＬ〜１ｇ／ｍＬが好ましく、０．１〜５００ｍｇ／ｍＬがより好ましい。また、用いられる被覆層成分（例えば脂質等）の液Ａおよび液Ｃに対する割合は、前記コア微粒子を被覆できれば特に限定されるものではないが、１μｇ／ｍＬ〜１ｇ／ｍＬが好ましく、０．１〜４００ｍｇ／ｍＬがより好ましい。コア微粒子に対する被覆層成分の割合は、重量比で１：０．１〜１：１０００が好ましく、１：１〜１：１０がより好ましい。
【００６１】
また、本発明の被覆微粒子の製造方法によって製造できる被覆微粒子の大きさは、平均粒子径が３００ｎｍ以下であるのが好ましく、２００ｎｍ以下であるのがより好ましく、具体的には、例えば注射可能な大きさであるのが好ましい。
【００６２】
本発明の被覆微粒子の好ましい製造方法として、以下に脂質膜で被覆された被覆微粒子の製造方法を例にしてより具体的に説明する。なお、用いるコア微粒子の種類や、用いる被覆層成分の種類によらず、本発明の他の被覆微粒子も同様な方法で製造することができる。
（工程１）コア微粒子を極性有機溶媒を含む液、好ましくは、極性有機溶媒含有水溶液、さらに好ましくは、エタノール等のアルコール類を含有する水溶液に分散（懸濁）させる。
（工程２）脂質膜を構成する被覆層成分（例えば脂質膜となる脂質および／または界面活性剤）を極性有機溶媒を含む液（好ましくは、工程１の極性有機溶媒含有水溶液と同一または異なった極性有機溶媒含有水溶液、さらに好ましくは、同一の極性有機溶媒含有水溶液）に溶解する。
（工程３）工程１で得られた液と工程２で得られた液を混合する。
（工程４）引き続き、被覆微粒子製造装置のインライン混合手段の１つの入口から、工程３で得られた混合液を入れ、残る１つの入口から、工程３で得られた混合液と混合可能であり、極性有機溶媒を含まないまたは工程３で得られた混合液より低い割合で極性有機溶媒を含む液（好ましくは、水）を入れて混合し、該コア微粒子が脂質膜で被覆された被覆微粒子を、懸濁液の形態で得る。また、工程４で被覆微粒子の製造が完了した後、さらに水等を含有する液を混合する等して、極性有機溶媒の割合を下げることが好ましい。
【００６３】
以下に、図を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の製造方法はこれら図に示したものに限定されるものではない。
図１は、本発明で用いられる基本的な被覆微粒子製造装置を表しており、２つの入口と、１つの出口をもつインライン混合手段（１）を備え、（１）の入口に流路（２）および（３）を、（１）の出口に流路（４）を備え、（２）および（３）を介してそれぞれポンプ（５）および（６）を、（４）を介して液槽（７）を備える被覆微粒子製造装置を表している。前記液Ａは、（５）から（２）を経て（１）の入口の１つに流れ、前記液Ｂは、（６）から（３）を経て（１）の別の入口に流れ、液Ａおよび液Ｂは（１）で混合される。液Ａが液Ｂと混合されることでコア微粒子が被覆層で被覆されて被覆微粒子が分散した前記液Ｃとなり、液Ｃは（１）の出口から流路（４）を通じて液槽（７）に送られて蓄えられる。
【００６４】
図２は、前記液Ａが、前記液Ｄと前記液Ｅとからインライン混合手段を用いて調製される場合の被覆微粒子製造装置の応用例を表しており、図１におけるポンプ（５）に換えて、２つの入口と、１つの出口をもつインライン混合手段（８）を備え、（８）の出口は（２）に繋がっており、（８）の入口に、流路（９）および（１０）を備え、（９）および（１０）を介してそれぞれポンプ（１１）および（１２）を備える被覆微粒子製造装置を表している。
【００６５】
図３は、図１の基本的な被覆微粒子製造装置にさらに前記液Ｃに前記液Ｆを混合するためのインライン混合手段を備える場合の被覆微粒子製造装置の応用例を表している。図１における液槽（７）に換えて、２つの入口と、１つの出口をもつインライン混合手段（１３）を備え、（１３）の入口の１つは（４）に繋がっており、（１３）の別の入口および出口に、それぞれ流路（１４）および（１５）を備え、（１４）および（１５）を介してそれぞれポンプ（１６）および液槽（１７）を備える被覆微粒子製造装置を表している。
【００６６】
一方、図４は、従来技術（国際公開第０２／２８３６７号パンフレット参照）における被覆微粒子製造装置を表しており、液槽（１８）およびそれに繋がった流路（１９）を備え、（１９）を介してポンプ（２０）を備える被覆微粒子製造装置を表している。前記液Ａは（１８）に入れられ、液Ｂは（２０）に入れられ、（２０）から（１９）を経て（１８）中の液Ａに加えられる。
【００６７】
本発明におけるインライン混合手段としては、例えばＴ字管、Ｙ字管、三方継手、三方コック、インラインミキサー（例えばスタティックミキサー等）、インラインミキサーアセンブリ等があげられ、それぞれスタティックミキサーを接続または内蔵していることが好ましい。流路は例えば金属パイプ、樹脂製チューブ等のいかなる流路であってもよく、ポンプとしては例えばギアポンプ、チューブポンプ、シリンジポンプ、吸引ポンプ、加圧ポンプ、プランジャー式ポンプ等があげられ、ポンプが流路の機能を兼ねていてもよい。また、本発明で用いられる被覆微粒子製造装置内または流路を通じた外部に貯蔵室または貯蔵槽が備えられていてもよく、それぞれ混合手段を備えていてよい。ここで、貯蔵室または貯蔵槽を高位置に設置することによる高低差を利用した自然落下も、ポンプの一形態に含まれる。
【００６８】
本発明の製造方法において、本発明の被覆微粒子製造装置内または流路を通じた外部の貯蔵室または貯蔵槽に備えられる混合手段は、特に限定されるものではなく、例えばスタティック式ミキサー、プロペラ型ミキサー、ローター／ステーター式ミキサー、ダービン式ミキサー、のこぎり歯ブレード、コロイドミル、高圧ホモジナイザー等があげられ、好ましくは、スタティックミキサー、プロペラ型ミキサー、ローター／ステーター式ミキサーまたはダービン式ミキサーがあげられる。
【００６９】
図１〜３の被覆微粒子製造装置では、それぞれ液Ａと液Ｂの混合液がインライン混合手段（１）から流路（４）を流れるうちにコア微粒子が被覆され、途中の任意の時間に各ポンプを停止または稼働のまま、液槽（７）または（１７）を交換して求める被覆微粒子の懸濁液を連続して得ることができる。また、任意の時間に各ポンプを停止して、供給する各液を交換し、再度各ポンプを稼働させても、同じ組成の液を用いていれば、同じ被覆微粒子の懸濁液を引き続き得ることが簡便にできる。また、被覆微粒子製造装置の大きさによらず、液槽（７）または（１７）や、供給する各液を交換していくことによって、任意の量の被覆微粒子の懸濁液が製造可能であるので、工業的必要量の被覆微粒子を製造することも可能である。すなわち、本発明の被覆微粒子の製造方法では連続的にコア微粒子の被覆を行うことができ、被覆微粒子の大量生産が可能となる。これに対して、図４の被覆微粒子製造装置では、液槽（１８）の中でコア微粒子が被覆され、規定量の液Ｂを供給した後にしか液槽（８）中に求める被覆微粒子の懸濁液が得られない。また、工業的必要量の被覆微粒子を製造するには、巨大な大きさの被覆微粒子製造装置が必要となる。
【００７０】
また、小型の被覆微粒子製造装置が望まれる場合、上記のインライン混合手段を備える被覆微粒子製造装置を小型にしたものでよく、そのときのポンプは、自然落下を利用したポンプまたは人の手によって押し出すポンプ（例えばシリンジ、ピストン、スポイド等）であってもよい。このような小型の被覆微粒子製造装置を用いれば、用時に被覆微粒子を製造することも可能である。
【００７１】
本発明の被覆微粒子は、例えば血液成分等の生体成分、消化管液等に対する薬剤の安定化、副作用の低減、腫瘍等の標的臓器への薬剤集積性の増大、経口や経粘膜での薬剤の吸収の改善等を目的とする製剤として使用できる。本発明の被覆微粒子は、該目的において、生体成分中で薬物を長時間内包しうる堅固に薬物を含有した被覆微粒子であることが好ましい。
【００７２】
本発明の被覆微粒子を製剤として使用する場合、上述の方法により調製した被覆微粒子の懸濁液をそのまま例えば注射剤等の形態として用いることも可能であるが、該懸濁液から例えば濾過、遠心分離等によって溶媒を除去して使用することも、該懸濁液、または例えばマンニトール、ラクトース、トレハロース、マルトース、グリシン等の賦形剤を加えた該懸濁液を凍結乾燥して使用することもできる。
【００７３】
注射剤の場合、前記の被覆微粒子の懸濁液または前記の溶媒を除去または凍結乾燥した被覆微粒子に、例えば水、酸、アルカリ、種々の緩衝液、生理的食塩液、アミノ酸輸液等を混合して注射剤を調製することが好ましい。また、例えばクエン酸、アスコルビン酸、システイン、ＥＤＴＡ等の抗酸化剤、グリセリン、ブドウ糖、塩化ナトリウム等の等張化剤等を添加して注射剤を調製することも可能である。また、例えばグリセリン等の凍結保存剤を加えて凍結保存することもできる。
【００７４】
また、本発明の被覆微粒子は、適当な賦形剤等と共に造粒、乾燥する等して例えばカプセル剤、錠剤、顆粒剤等の経口用製剤に加工してもよい。
【００７５】
次に、実施例により、本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００７６】
下記の被覆微粒子製造装置、液Ａ、液Ｂおよび液Ｆを用い、液Ａを１０ｍＬ／ｈ、液Ｂを７．５ｍＬ／ｈで混合後の液Ｃ中のエタノール濃度がおよそ４０ｖｏｌ％になるようにそれぞれ送液し、液Ｆを混合後のエタノール濃度がおよそ１０ｖｏｌ％になるように調整して送液した。
得られた被覆微粒子の懸濁液から、超遠心（１時間、１１０，０００×ｇ，２５℃）によって上清を除去し、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸二水素カリウム水溶液を添加して再懸濁し、製剤を得た。
被覆微粒子製造装置；
図３に示した被覆微粒子製造装置を用いた。（１）および（１３）にＴ字状の接続部（テルフュージョン三方活栓Ｒ型、テルモ製）を用い、（５）、（６）および（１５）にシリンジポンプ（テルフュージョンシリンジポンプＳＴＣ−５２５、テルモ製）を用いた。
液Ａ；
卵黄レシチン（キューピー製）３．００ｇおよびＰＥＧ−ＤＳＰＥ［アバンチポーラルリピッズ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）社製；以下同様である］１．２０ｇに、エタノール２０ｍＬを室温下で加え溶解させた後、エタノールを留去し減圧乾燥し、次に水１００ｍＬを加え、ボルテックスミキサーで振とう撹拌した。得られた懸濁液を、室温で０．２０μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに２０回通した後、０．０５μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに１０回通した。別に、１．４ｍｇ／ｍＬ Ｇ−ＣＳＦ（協和発酵製、ナルトグラスチム、遺伝子組換ヒトＧ−ＣＳＦ変異型）水溶液３．５ｍＬに、７ｍｇ／ｍＬデキストラン硫酸ナトリウム（メルク製）１．４ｍＬを加えた。得られた液４．２ｍＬと、フィルターに通した卵黄レシチンとＰＥＧ−ＤＳＰＥの懸濁液０．２ｍＬを混合し、次に塩酸（関東化学製）を加えｐＨを４とし、コア微粒子の懸濁液を得た。得られたコア微粒子の懸濁液５００μＬにエタノール７８０μＬを加え、３０ｍｇ／ｍＬ卵黄ホスファチジルコリンおよび１２ｍｇ／ｍＬ ＰＥＧ−ＤＳＰＥを含むエタノール５３μＬを加えた。
液Ｂ；
蒸留水
液Ｆ；
５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸二水素カリウム水溶液
【実施例２】
【００７７】
実施例１と同じ被覆微粒子製造装置、液Ｂおよび液Ｆと、下記の液Ａを用い、液Ａを８ｍＬ／ｈ、液Ｂを４．２ｍＬ／ｈで混合後の液Ｃ中のエタノール濃度がおよそ４０ｖｏｌ％になるようにそれぞれ送液し、液Ｆを混合後のエタノール濃度がおよそ１０ｖｏｌ％になるように調整して送液した。得られた被覆微粒子の懸濁液を用いて、実施例１と同様に超遠心および再懸濁をして製剤を得た。
液Ａ；
実施例１と同様に調製されたコア微粒子の懸濁液５００μＬにエタノール６６６μＬを加え、３０ｍｇ／ｍＬ卵黄ホスファチジルコリンおよび１２ｍｇ／ｍＬ ＰＥＧ−ＤＳＰＥを含むエタノール１６７μＬを加えた。
【００７８】
＜比較例１＞
下記の被覆微粒子製造装置、液Ａおよび液Ｂを用い、液Ａを下記の（１８）に入れ、液Ｂを（２０）に入れ、液Ａに液Ｂ ７ｍＬを（１９）を通じて加え、エタノール濃度が１０ｖｏｌ％になるようにした。得られた被覆微粒子の懸濁液を用いて、実施例１と同様に超遠心および再懸濁をして製剤を得た。
被覆微粒子製造装置；
図４に示した被覆微粒子製造装置を用いた。（１８）にマグネチックスターラーを入れた三角フラスコを用い、（２０）にシリンジポンプ（テルフュージョンシリンジポンプＳＴＣ−５２５、テルモ製）を用いた。
液Ａ；
実施例１と同様に調製されたコア微粒子の懸濁液５００μＬにエタノール７８０μＬを加え、３０ｍｇ／ｍＬ卵黄ホスファチジルコリンおよび１２ｍｇ／ｍＬ ＰＥＧ−ＤＳＰＥを含むエタノール５３μＬを加えた。
液Ｂ；
蒸留水
【００７９】
＜試験例１＞
実施例１〜２および比較例１で得られた各製剤について動的光散乱（ＤＬＳ）測定装置（Ａ ｍｏｄｅｌ ＥＬＳ−８００、大塚電子、以下同様）で被覆微粒子の平均粒子径を測定した。結果を表１に示す。
【００８０】
【表１】
【００８１】
＜試験例２＞
実施例１〜２および比較例１で得られた各製剤について、被覆微粒子中におけるＧ−ＣＳＦの内包率を以下のように求めた。
各製剤をゲルろ過クロマトグラフィー（Φ１０ｍｍ×２０ｃｍのカラム中に、分子体積排除型の高分子（セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ−４Ｂ）を充填し、移動相にリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いた）にかけ、それぞれ被覆微粒子画分と遊離Ｇ−ＣＳＦ画分に分離した。それぞれの画分２０μＬに１０ｗ／ｖ％ラウリル硫酸ナトリウムを含むｐＨ９のホウ酸緩衝液２μＬ、ｐＨ９のホウ酸緩衝液７８μＬおよび２−プロパノール１００μＬを加えて攪拌し完全に被覆微粒子を破壊した後、高速液体クロマトグラフィー（下記条件）でＧ−ＣＳＦを定量し、被覆微粒子中におけるＧ−ＣＳＦの内包率を下記式（１）で算出した。結果を表２に示す。
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｃ８ Φ４．６ｍｍ×１５ｃｍ
移動相：Ｉ液（ｐＨ７、１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液−２−プロパノール混液（７５：２５））＋ＩＩ液（２−プロパノール）
ＩＩ液の割合を、分析開始後０〜３０分では０〜８６．７ｖｏｌ％に直線的に増加、３０〜４０分では８６．７ｖｏｌ％とした。
検出：励起波長２８０ｎｍ、蛍光波長３４０ｎｍ
【００８２】
【数１】
【００８３】
【表２】
【００８４】
表１からわかるように、実施例１〜２および比較例１で得られた各製剤における被覆微粒子は、それぞれ同様の平均粒子径を有している。一方、表２からわかるように、実施例１および２で得られた製剤では、被覆微粒子中におけるＧ−ＣＳＦの内包率が９０％以上であり、比較例１で得られた製剤では７０％程度であった。すなわち、本発明の被覆微粒子の製造方法では、連続式の簡便な製造方法であるにもかかわらず、従来法と同程度の大きさの被覆微粒子を製造可能であり、さらに薬物の内包率が高い効率の良い被覆微粒子の製造も可能であった。
【実施例３】
【００８５】
下記の被覆微粒子製造装置、液Ａおよび液Ｂを用い、液Ａを５．２ｍＬ／ｈ、液Ｂを１１．１ｍＬ／ｈで混合後の液Ｃ中のエタノール濃度がおよそ２０ｖｏｌ％になるようにそれぞれ送液した。（７）には予め蒸留水１８．８ｍＬを入れ、得られた被覆微粒子の懸濁液が滴下するようにした。シリンジポンプを作動させ、２３分後にシリンジポンプを停止した。（７）に蓋をして反転混合後、得られた混合液の超遠心分離（１時間、１１０，０００×ｇ、２５℃）を行った。超遠心分離後の沈殿物に希釈後の総脂質濃度が３０ｍｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を添加して再懸濁し、製剤を得た。
被覆微粒子製造装置；
図１に示した被覆微粒子製造装置を用いた。（１）にＨＰＬＣ配管用三方継手（島津製作所製）と２ｃｍのスタティックミキサー［長さ２０ｍｍ×内径１．５ｍｍのフッ素樹脂チューブに２ｍｇのガスクロマトグラフ用石英ウール（島津製作所製）を充填したもの］を用い、（５）および（６）に２０ｍＬシリンジ（テルモ製）を備えたシリンジポンプ（日機装製）を用いた。
液Ａ；
デキストランフルオレセインアニオニック（ＦＤ）（モレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）製；以下同様である）３０ｍｇ、ＤＯＴＡＰ（アバンチポーラルリピッズ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）社製；以下同様である）１８０ｍｇおよびＰＥＧ−ＤＳＰＥ７２ｍｇに蒸留水９ｍＬを加え、ボルテックスミキサーで振とう攪拌した。得られた懸濁液を室温で０．４μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに１０回および０．１μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに１０回通し、コア微粒子の懸濁液を得た。得られたコア微粒子の懸濁液７５０μＬとエタノール１ｍＬを混合し、ＥＰＣ４８０ｍｇおよびＰＥＧ−ＤＳＰＥ１００ｍｇにエタノール２ｍＬを加え攪拌して得た溶液２５０μＬを混合した。
液Ｂ；
蒸留水
【実施例４】
【００８６】
実施例３と同じ被覆微粒子製造装置、液Ａおよび液Ｂを用い、液Ａを５．２ｍＬ／ｈ、液Ｂを５．６ｍＬ／ｈで混合後の液Ｃ中のエタノール濃度がおよそ３０ｖｏｌ％になるようにそれぞれ送液した。（７）には予め蒸留水２０．９ｍＬを入れ、得られた被覆微粒子の懸濁液が滴下するようにした。シリンジポンプを作動させ、２３分後にシリンジポンプを停止し、実施例３と同様に、混合、超遠心および再懸濁をして製剤を得た。
【実施例５】
【００８７】
実施例３と同じ被覆微粒子製造装置、液Ａおよび液Ｂを用い、液Ａを５．２ｍＬ／ｈ、液Ｂを２．９ｍＬ／ｈで混合後の液Ｃ中のエタノール濃度がおよそ４０ｖｏｌ％になるようにそれぞれ送液した。（７）には予め蒸留水２１．９ｍＬを入れ、得られた被覆微粒子の懸濁液が滴下するようにした。シリンジポンプを作動させ、２３分後にシリンジポンプを停止し、実施例３と同様に、混合、超遠心および再懸濁をして製剤を得た。
【実施例６】
【００８８】
実施例３と同じ被覆微粒子製造装置、液Ａおよび液Ｂを用い、液Ａを５．２ｍＬ／ｈ、液Ｂを０．７ｍＬ／ｈで混合後の液Ｃ中のエタノール濃度がおよそ５５ｖｏｌ％になるようにそれぞれ送液した。（７）には予め蒸留水２２．７ｍＬを入れ、得られた被覆微粒子の懸濁液が滴下するようにした。シリンジポンプを作動させ、２３分後にシリンジポンプを停止し、実施例３と同様に、混合、超遠心および再懸濁をして製剤を得た。
【実施例７】
【００８９】
実施例３と同じ被覆微粒子製造装置、液Ａおよび液Ｂを用い、液Ａを２６．０ｍＬ／ｈ、液Ｂを２８．０ｍＬ／ｈで混合後の液Ｃ中のエタノール濃度がおよそ３０ｖｏｌ％になるようにそれぞれ送液した。（７）には予め蒸留水２０．９ｍＬを入れ、得られた被覆微粒子の懸濁液が滴下するようにした。シリンジポンプを作動させ、４．６分後にシリンジポンプを停止し、実施例３と同様に、混合、超遠心および再懸濁をして製剤を得た。
【実施例８】
【００９０】
実施例３と同じ被覆微粒子製造装置、液Ａおよび液Ｂを用い、液Ａを１．０ｍＬ／ｈ、液Ｂを１．１ｍＬ／ｈで混合後の液Ｃ中のエタノール濃度がおよそ３０ｖｏｌ％になるようにそれぞれ送液した。（７）には予め蒸留水２０．９ｍＬを入れ、得られた被覆微粒子の懸濁液が滴下するようにした。シリンジポンプを作動させ、１１５分後にシリンジポンプを停止し、実施例３と同様に、混合、超遠心および再懸濁をして製剤を得た。
【実施例９】
【００９１】
実施例３と同じ被覆微粒子製造装置からミキサーを除いた被覆微粒子製造装置と、実施例３と同じ液Ａおよび液Ｂを用い、液Ａを５．２ｍＬ／ｈ、液Ｂを５．６ｍＬ／ｈで混合後の液Ｃ中のエタノール濃度がおよそ３０ｖｏｌ％になるようにそれぞれ送液した。（７）には予め蒸留水２０．９ｍＬを入れ、得られた被覆微粒子の懸濁液が滴下するようにした。シリンジポンプを作動させ、２３分後にシリンジポンプを停止し、実施例３と同様に、混合、超遠心および再懸濁をして製剤を得た。
【実施例１０】
【００９２】
実施例３と同じ被覆微粒子製造装置で、２ｃｍのスタティックミキサーを０．４ｃｍのスタティックミキサー［長さ４ｍｍ×内径１．５ｍｍのフッ素樹脂チューブに０．４ｍｇのガスクロマトグラフ用石英ウール（島津製作所製）を充填したもの］に代えた被覆微粒子製造装置と、実施例３と同じ液Ａおよび液Ｂを用い、実施例９と同様に被覆微粒子の懸濁液を製造し、実施例３と同様に、混合、超遠心および再懸濁をして製剤を得た。
【実施例１１】
【００９３】
実施例３と同じ被覆微粒子製造装置で、２ｃｍのスタティックミキサーを１ｃｍのスタティックミキサー［長さ１０ｍｍ×内径１．５ｍｍのフッ素樹脂チューブに１ｍｇのガスクロマトグラフ用石英ウール（島津製作所製）を充填したもの］に代えた被覆微粒子製造装置と、実施例３と同じ液Ａおよび液Ｂを用い、実施例９と同様に被覆微粒子の懸濁液を製造し、実施例３と同様に、混合、超遠心および再懸濁をして製剤を得た。
【実施例１２】
【００９４】
実施例３と同じ被覆微粒子製造装置で、２ｃｍのスタティックミキサーを５本連続（計１０ｃｍ）繋いだ被覆微粒子製造装置と、実施例３と同じ液Ａおよび液Ｂを用い、実施例９と同様に被覆微粒子の懸濁液を製造し、実施例３と同様に、混合、超遠心および再懸濁をして製剤を得た。
【００９５】
＜比較例２＞
下記の被覆微粒子製造装置、液Ａおよび液Ｂを用い、液Ａを下記の（１８）に入れ、液Ｂを（２０）に入れ、液Ａに液Ｂ２３ｍＬを（１９）を通じて１ｍＬ／ｍｉｎで加えた。得られた被覆微粒子の懸濁液の超遠心分離（１時間、１１０，０００×ｇ、２５℃）を行った。超遠心分離後の沈殿物をＰＢＳで希釈し希釈後の総脂質濃度が３０ｍｇ／ｍＬとなるように調整し、製剤を得た。
被覆微粒子製造装置；
図４に示した被覆微粒子製造装置を用いた。（２０）にシリンジポンプ（テルフュージョンシリンジポンプＳＴＣ−５２５、テルモ製）を用い、（１８）に容積約３０ｍＬのガラス容器を用い、該ガラス容器には回転子を入れスターラーで攪拌した。
液Ａ；
ＦＤ３０ｍｇ、ＤＯＴＡＰ１８０ｍｇおよびＰＥＧ−ＤＳＰＥ７２ｍｇに蒸留水９ｍＬを加え、ボルテックスミキサーで振とう攪拌した。得られた懸濁液を室温で０．４μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに１０回および０．１μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに１０回通した。得られた懸濁液７５０μＬを約３０ｍＬのガラス容器に入れ、回転子を入れスターラーで攪拌しながらエタノール１ｍＬを混合し、コア微粒子の懸濁液を得た。得られたコア微粒子の懸濁液に、ＥＰＣ１２００ｍｇおよびＰＥＧ−ＤＳＰＥ２５０ｍｇにエタノール５ｍＬを加え攪拌して得た溶液２５０μＬを加え混合した。
液Ｂ；
蒸留水
【００９６】
＜比較例３＞
下記の被覆微粒子製造装置、液Ａおよび液Ｂを用い、液Ａを液Ｂに滴下した。滴下後に、実施例３と同様に、混合、超遠心および再懸濁をして製剤を得た。
被覆微粒子製造装置；
図１で示した被覆微粒子製造装置で、（５）に可変ピペット（エッペンドルフ製）を用い、（１）、（３）および（６）を除き、液槽（７）に液Ｂを入れた被覆微粒子製造装置を用いた。
液Ａ；
ＦＤ３０ｍｇ、ＤＯＴＡＰ１８０ｍｇおよびＰＥＧ−ＤＳＰＥ７２ｍｇに蒸留水９ｍＬを加え、ボルテックスミキサーで振とう攪拌した。得られた懸濁液を室温で０．４μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに１０回および０．１μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに１０回通し、コア微粒子の懸濁液を得た。得られたコア微粒子の懸濁液７５０μＬとエタノール１ｍＬを混合し、ＥＰＣ４８０ｍｇおよびＰＥＧ−ＤＳＰＥ１００ｍｇにエタノール２ｍＬを加え攪拌して得た溶液２５０μＬを混合した。
液Ｂ；
蒸留水２３．０ｍＬ
【００９７】
＜試験例３＞
実施例３〜１２および比較例２〜３で得られた各製剤について、ＤＬＳ測定装置で被覆微粒子の平均粒子径を測定した。結果を表３に示す。
【００９８】
【表３】
【００９９】
＜試験例４＞
実施例３〜１２および比較例２で得られた各製剤について、被覆微粒子中におけるＦＤの内包率を以下のように求めた。
各製剤３０μＬをとりそれぞれに精製水２９７０μＬを加え攪拌し超遠心分離して上清を取得した。上記各製剤および上記各上清を１０００倍希釈し、希釈後の各５０μＬに、１０ｗ／ｖ％トライトンエックス−１００（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）５０μＬおよびＰＢＳ４００μＬをそれぞれ加え、ボルテックスミキサーで攪拌した。その１００μＬを９６穴マイクロプレートにとり、蛍光プレートリーダー（ワラック（Ｗａｌｌａｃ）社製、アルボエスエックス−４（ＡＲＶＯｓｘ−４））を使用して励起波長４８５ｎｍおよび蛍光波長５３０ｎｍでの蛍光強度を測定した。一方、１、０．５および０．２５μｇ／ｍＬとなる各ＦＤ水溶液の蛍光強度を測定し、検量線を得た。検量線から各製剤中のＦＤ濃度、超遠心分離後の各上清中のＦＤ濃度を求め、被覆微粒子中におけるＦＤの内包率を下記式（２）で算出した。結果を表４に示す。
【０１００】
【数２】
【０１０１】
【表４】
【０１０２】
＜試験例５＞
実施例３〜１２および比較例２〜３で得られた各製剤における、ＦＤおよびＥＰＣの仕込み量に対する回収率を以下のように求めた。
各製剤を１０００倍希釈し、希釈後の各５０μＬに、１０ｗ／ｖ％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ５０μＬおよびＰＢＳ４００μＬをそれぞれ加え、ボルテックスミキサーで攪拌した。その１００μＬを９６穴マイクロプレートにとり、蛍光プレートリーダー（ワラック（Ｗａｌｌａｃ）社製、アルボエスエックス−４（ＡＲＶＯｓｘ−４））を使用して励起波長４８５ｎｍおよび蛍光波長５３０ｎｍでの蛍光強度を測定した。一方、１、０．５および０．２５μｇ／ｍＬとなる各ＦＤ水溶液の蛍光強度を測定し、検量線を得た。検量線から各製剤中のＦＤ濃度を求めた。一方、各製剤中のＥＰＣ濃度は、リン脂質Ｃ−テストワコー（和光純薬製）を用いて測定することにより求めた。各製剤におけるＦＤ回収率およびＥＰＣ回収率は、下記式（３）で算出した。結果を表５に示す。
【０１０３】
【数３】
【０１０４】
【表５】
【０１０５】
＜試験例６＞
実施例３〜１２および比較例２で得られた各製剤について、牛胎児血清（ＦＢＳ）中での安定性について検討を行った。
各製剤３０μＬにＦＢＳ２９７０μＬを加え混合した。混合直後および３７℃で３時間静置後に各５００μＬを取りゲルろ過クロマトグラフィー（Ｇｅｌ Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＧＰＣ）を行い、そのフラクション（１００滴，１０本）を回収した。各フラクションをボルテックスミキサーで振とう攪拌してサンプルとし、ＦＤを定量するため、各５０μＬに、１０ｗ／ｖ％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ５０μＬおよびＰＢＳ４００μＬをそれぞれ加え、ボルテックスミキサーで攪拌した。その１００μＬを９６穴マイクロプレートにとり、蛍光プレートリーダー（ワラック（Ｗａｌｌａｃ）社製、アルボエスエックス−４（ＡＲＶＯｓｘ−４））を使用して励起波長４８５ｎｍおよび蛍光波長５３０ｎｍでの蛍光強度を測定した。
０時間後および３時間後のＦＤ回収率を下記式（４）で算出した。結果を表６に示す。
【０１０６】
【数４】
【０１０７】
【表６】
【０１０８】
表３および表４からわかるように、実施例３〜１２および比較例２〜３で得られた各製剤における被覆微粒子では、平均粒子径も内包率も同様であり、外見上は同様の品質の被覆微粒子が得られた。一方、表５からわかるように、実施例３〜１２および比較例２で得られた各製剤では、ＦＤおよびＥＰＣの回収率が高く、比較例３で得られた製剤では低い。また、表６からわかるように、実施例３〜１２で得られた製剤は、比較例２で得られた製剤と比べて、ＰＢＳ中におけるＦＤの回収率が高く、ＰＢＳ中での安定性が良い。すなわち、本発明の被覆微粒子の製造方法では、連続式の簡便な製造方法であるにもかかわらず、従来法と同程度の大きさと薬物内包率の被覆微粒子を製造可能であり、さらに効率よくおよび／または堅固に薬物を含有させた被覆微粒子の製造も可能であった。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明により、コア微粒子が被覆層で被覆された被覆微粒子の連続式で簡便な工業的製造方法が提供される。また、本発明によって、効率よくおよび／または堅固に薬物を含有させた被覆微粒子の製造方法が提供される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被覆微粒子の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、医薬品、食品、農薬、動物用薬等において、被覆微粒子の製造方法に関して多くの技術の開示が行われている。微粒子（被覆される微粒子）の被覆層による被覆は、例えば外的因子から受ける影響を抑制するため、外的因子の影響を選択的に受け入れ、それをトリガーとして微粒子に変化を起こすため等、微粒子に機能を付与する目的で行われている。その１つとして、液体中で微粒子を脂質膜で被覆する方法が報告されている（特許文献１参照）。該方法においては、微粒子が分散し、かつ脂質が溶解した極性有機溶媒含有水溶液中の極性有機溶媒の割合を減少させることによって、微粒子が脂質膜で被覆されており、液体中において被覆が行われ、例えば静脈注射用微粒子等に好適な大きさの被覆微粒子が、すぐれた効率で製造されている。また、該特許文献１では、極性有機溶媒含有水溶液中の極性有機溶媒の割合を減少させる手段の１つとして、極性有機溶媒含有水溶液に、水を含有する液を混合する方法を示している。
【０００３】
一方、インライン混合手段は、２種以上の液体を混合する方法として工業的に用いられている手段である。また、インライン混合手段は、被覆によらない方法で製造されるポリマー複合体およびリポソームの製造方法において用いられている（特許文献２および特許文献３参照）。
【特許文献１】国際公開第０２／２８３６７号パンフレット
【特許文献２】特表２００２−５２２４６８号公報
【特許文献３】特表２００２−５２９２４０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、コア微粒子が被覆層で被覆された被覆微粒子の工業的製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は以下の（１）〜（１１）に関する。
（１）コア微粒子が被覆層で被覆された被覆微粒子の製造方法であって、
該コア微粒子が分散し、かつ該被覆層を構成する被覆層成分が溶解した極性有機溶媒を含む液（液Ａ）を調製する工程、
液Ａと混合可能であり、極性有機溶媒を含まないまたは液Ａより低い割合で極性有機溶媒を含む液（液Ｂ）を調製する工程、および
２つ以上の入口と、１つ以上の出口をもつインライン混合手段を備える被覆微粒子製造装置の少なくとも１つの入口から、液Ａを入れ、残る入口の少なくとも１つの入口から、液Ｂを入れて混合し、該コア微粒子を該被覆層で被覆する工程を含む製造方法。
（２）被覆微粒子製造装置が、ポンプ、流路および前記インライン混合手段を含む前記（１）記載の製造方法。
（３）被覆微粒子製造装置が、手動ポンプ、流路および前記インライン混合手段を含む前記（１）記載の製造方法。
（４）被覆層成分が、脂質、界面活性剤および高分子から選ばれる１つ以上の物質である前記（１）〜（３）のいずれかに記載の製造方法。
（５）被覆層が脂質膜である前記（１）〜（４）のいずれかに記載の製造方法。
（６）コア微粒子が薬物、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン微粒子、高分子、金属コロイドまたは微粒子製剤を構成成分とする微粒子である前記（１）〜（５）のいずれかに記載の製造方法。
（７）コア微粒子が薬物、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン微粒子、高分子、金属コロイドまたは微粒子製剤を２つ以上組み合わせた複合体を構成成分とする微粒子である前記（１）〜（５）のいずれかに記載の製造方法。
（８）コア微粒子が、薬物とリポソームの複合体を構成成分とする微粒子である前記（１）〜（５）のいずれかに記載の製造方法。
（９）極性有機溶媒がアルコール類、グリコール類およびポリアルキレングリコール類から選ばれる１つ以上である前記（１）〜（８）のいずれかに記載の製造方法。
（１０）極性有機溶媒がエタノールである前記（１）〜（８）のいずれかに記載の製造方法。
（１１）前記（１）〜（１０）のいずれかに記載の製造方法によって製造できる被覆微粒子。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、コア微粒子が被覆層で被覆された被覆微粒子の連続式で簡便な工業的製造方法が提供される。また、本発明によって、効率よくおよび／または堅固に薬物を含有させた被覆微粒子の製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本発明で用いられる基本的な被覆微粒子製造装置の模式図。
【図２】本発明で用いられる被覆微粒子製造装置の応用例（１）の模式図。
【図３】本発明で用いられる被覆微粒子製造装置の応用例（２）の模式図。
【図４】従来の被覆微粒子製造装置の模式図。
【符号の説明】
【０００８】
１ ２つの入口と、１つの出口をもつインライン混合手段
２，３，４ 流路
５，６ ポンプ
７ 液槽
８ ２つの入口と、１つの出口をもつインライン混合手段
９，１０ 流路
１１，１２ ポンプ
１３ ２つの入口と、１つの出口をもつインライン混合手段
１４，１５ 流路
１６ ポンプ
１７，１８ 液槽
１９ 流路
２０ ポンプ
【０００９】
液Ａ コア微粒子が分散し、かつ被覆層成分が溶解した極性有機溶媒を含む液
液Ｂ 液Ａと混合可能であり、極性有機溶媒を含まないまたは液Ａより低い割合で極性有機溶媒を含む液
液Ｃ 液Ａと液Ｂを混合して得られる懸濁液
液Ｄ コア微粒子が分散した極性有機溶媒を含む液
液Ｅ 液Ｄ中の極性有機溶媒と同一または異なった極性有機溶媒を含む溶媒に被覆層成分を溶解させた液
液Ｆ 極性有機溶媒以外の溶媒
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明におけるインライン混合手段を備える被覆微粒子製造装置は、２つ以上の入口と、１つ以上の出口をもつインライン混合手段を備える被覆微粒子製造装置であればいずれでもよく、該インライン混合手段は、複数のインライン混合手段が連結した場合を含む。また、該製造装置には、該インライン混合手段に接続された流路が備えられていてもよく、また該流路がインライン混合手段を兼ねていてもよい。また、該製造装置にはポンプが備えられていてもよく、該ポンプは前記インライン混合手段の入口および／または出口と、前記流路を通じて接続される。
【００１１】
本発明における被覆微粒子とは、少なくともコア微粒子と被覆層からなる微粒子のことであり、被覆層を構成する被覆層成分がコア微粒子の外側を被覆して形成される微粒子のことである。
【００１２】
本発明におけるコア微粒子とは、例えば、薬物、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン粒子、高分子、金属コロイド、微粒子製剤等を構成成分とする微粒子のことであり、好ましくは、少なくとも薬物を構成成分とする微粒子があげられる。また、本発明におけるコア微粒子は、薬物、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン粒子、高分子、金属コロイド、微粒子製剤等を２つ以上組み合わせた複合体を構成成分としていてもよく、薬物、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン粒子、高分子、金属コロイド、微粒子製剤等と他の化合物（例えば糖、脂質、無機化合物等）とを組み合わせた複合体を構成成分としていてもよく、好ましくは、薬物とリポソームの複合体を構成成分とする微粒子があげられる。
【００１３】
薬物は、液Ａにおける溶媒中で微粒子の形態をとる薬物、コア微粒子を構成する他の構成成分と複合体を形成して液Ａにおける溶媒中で微粒子の形態をとる薬物等を包含し、例えば蛋白質、ペプチド、核酸、低分子化合物、糖類、高分子化合物、脂質性化合物、金属化合物等のうち薬理学的活性を有する物質があげられ、好ましくは、核酸があげられ、より好ましくは、遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、プラスミドおよびｓｉＲＮＡから選ばれる１つ以上の物質があげられる。
【００１４】
蛋白質またはペプチドとしては、例えばブラジキニン、アンジオテンシン、オキシトシン、バソプレシン、アドレノコルチコトロピン、カルシトニン、インスリン、グルカゴン、コレシストキニン、β−エンドルフィン、メラノサイト阻害因子、メラノサイト刺激ホルモン、ガストリンアンタゴニスト、ニューロテンシン、ソマトスタチン、ブルシン、シクロスポリン、エンケファリン、トランスフェリン、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）ペプチド、甲状腺ホルモン、成長ホルモン、性腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、ウリカーゼ、カルボキシペプチダーゼ、グルタミナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼ、インターロイキン、インターフェロン、ムラミルジペプチド、サイモポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、トリプシンインヒビター、リゾチーム、表皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子、神経成長因子、血小板由来成長因子、形質転換成長因子、内皮細胞成長因子、フィブロブラスト（繊維芽細胞）成長因子、グリア細胞成長因子、サイモシン、特異抗体（例えば、抗ＥＧＦ受容体抗体等があげられる）等があげられる。
【００１５】
核酸としては、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、センスオリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオチド、遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、ｓｉＲＮＡ等があげられ、該核酸は、核酸の構造中のリン酸部、エステル部等に含まれる酸素原子等が、例えば硫黄原子等の他の原子に置換された誘導体を包含する。なお、ｓｉＲＮＡとは、短い二本鎖ＲＮＡのことである。
【００１６】
低分子化合物としては、例えばイプシロン−アミノカプロン酸、塩酸アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸カリウム、トラネキサム酸、硫酸ブレオマイシン、硫酸ビンクリスチン、セファゾリンナトリウム、セファロチンナトリウム、シチコリン、シタラビン、硫酸ゲンタマイシン、塩酸バンコマイシン、硫酸カナマイシン、硫酸アミカシン等があげられる。
【００１７】
糖類としては、例えばコンドロイチン硫酸ナトリウム、ヘパリンナトリウム、デキストランフルオレセイン等があげられる。
【００１８】
高分子化合物としては、例えばポリエチレンスルホン酸ナトリウム、ジビニルエーテル−無水マレイン酸共重合体（ＤＩＶＥＭＡ）、スチレン無水マレイン酸共重合体−ネオカルチノスタチン結合体（ＳＭＡＮＣＳ）等があげられる。
脂質性化合物としては、例えばビタミンＤ、ビタミンＥ等があげられる。
金属化合物としては、例えばシスプラチン等があげられる。
【００１９】
脂質集合体またはリポソームは、例えば脂質および／または界面活性剤等によって構成され、脂質としては、単純脂質、複合脂質または誘導脂質のいかなるものであってもよく、例えばリン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質、スフィンゴイド類、ステロール類等があげられ、好ましくは、リン脂質があげられる。また、脂質としては、例えば界面活性剤（後記の界面活性剤と同義）、高分子（後記の高分子と同義で、具体的にはデキストラン等）、ポリオキシエチレン誘導体（具体的にはポリエチレングリコール等）等の脂質誘導体もあげられ、好ましくは、ポリエチレングリコール化リン脂質があげられる。界面活性剤としては、例えば非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤等があげられる。
【００２０】
リン脂質としては、例えばホスファチジルコリン（具体的には大豆ホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン等）、ホスファチジルエタノールアミン（具体的にはジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン等）、グリセロリン脂質（具体的にはホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリン等）、スフィンゴリン脂質（具体的にはスフィンゴミエリン、セラミドホスホエタノールアミン、セラミドホスホグリセロール、セラミドホスホグリセロリン酸等）、グリセロホスホノ脂質、スフィンゴホスホノ脂質、天然レシチン（具体的には卵黄レシチン、大豆レシチン等）、水素添加リン脂質（具体的には水素添加ホスファチジルコリン等）等の天然または合成のリン脂質があげられる。
【００２１】
グリセロ糖脂質としては、例えばスルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド等があげられる。
スフィンゴ糖脂質としては、例えばガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド等があげられる。
スフィンゴイド類としては、例えばスフィンガン、イコサスフィンガン、スフィンゴシン、それらの誘導体等があげられる。誘導体としては、例えばスフィンガン、イコサスフィンガン、スフィンゴシン等の−ＮＨ２を−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｘＣＨ３（式中、ｘは０〜１８の整数を表し、中でも６、１２または１８が好ましい）に変換したもの等があげられる。
【００２２】
ステロール類としては、例えばコレステロール、ジヒドロコレステロール、ラノステロール、β−シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、エルゴカステロール、フコステロール、３β−［Ｎ−（Ｎ’Ｎ’−ジメチルアミノエチル）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）等があげられる。
【００２３】
その他、脂質としては、例えば、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルプロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロ酢酸（ＤＯＳＰＡ）、Ｎ−［１−（２，３−ジテトラデシルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチル臭化アンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチル臭化アンモニウム（ＤＯＲＩＥ）等の脂質もあげられる。
【００２４】
非イオン性界面活性剤としては、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（具体的にはポリソルベート８０等）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（具体的にはプルロニックＦ６８等）、ソルビタン脂肪酸（具体的にはソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート等）、ポリオキシエチレン誘導体（具体的にはポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、ポリオキシエチレンラウリルアルコール等）、グリセリン脂肪酸エステル等があげられる。
【００２５】
アニオン性界面活性剤としては、例えばアシルサルコシン、アルキル硫酸ナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸塩、炭素数７〜２２の脂肪酸ナトリウム等があげられる。具体的にはドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム等があげられる。
【００２６】
カチオン性界面活性剤としては、例えばアルキルアミン塩、アシルアミン塩、第四級アンモニウム塩、アミン誘導体等があげられる。具体的には塩化ベンザルコニウム、アシルアミノエチルジエチルアミン塩、Ｎ−アルキルポリアルキルポリアミン塩、脂肪酸ポリエチレンポリアミド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、アルキルポリオキシエチレンアミン、Ｎ−アルキルアミノプロピルアミン、脂肪酸トリエタノールアミンエステル等があげられる。
【００２７】
両性界面活性剤としては、例えば３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸、Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸等があげられる。
【００２８】
リポソームにおいては、これら脂質および界面活性剤は、単独でまたは組み合わせて用いられ、好ましくは、組み合わせて用いられる。組み合わせて用いる場合の組み合わせとしては、例えば水素添加大豆ホスファチジルコリン、ポリエチレングリコール化リン脂質およびコレステロールから選ばれる２成分以上の組み合わせ、ジステアロイルホスファチジルコリン、ポリエチレングリコール化リン脂質およびコレステロールから選ばれる２成分以上の組み合わせ、ＥＰＣとＤＯＴＡＰの組み合わせ、ＥＰＣ、ＤＯＴＡＰおよびポリエチレングリコール化リン脂質の組み合わせ、ＥＰＣ、ＤＯＴＡＰ、コレステロールおよびポリエチレングリコール化リン脂質の組み合わせ等があげられる。
【００２９】
また、リポソームは、必要に応じて、例えばコレステロール等のステロール類等の膜安定化剤、例えばトコフェロール等の抗酸化剤等を含有していてもよい。
【００３０】
脂質集合体としては、例えば球状ミセル、球状逆ミセル、ソーセージ状ミセル、ソーセージ状逆ミセル、板状ミセル、板状逆ミセル、ヘキサゴナルＩ、ヘキサゴナルＩＩおよび脂質２分子以上からなる会合体等があげられる。
【００３１】
エマルジョン粒子としては、例えば脂肪乳剤、非イオン性界面活性剤と大豆油からなるエマルジョン、リピッドエマルジョン、リピッドナノスフェアー等の水中油型（Ｏ／Ｗ）エマルジョンや水中油中水型（Ｗ／Ｏ／Ｗ）エマルジョン粒子等があげられる。
【００３２】
高分子としては、例えばアルブミン、デキストラン、キトサン、デキストラン硫酸、ＤＮＡ等の天然高分子、例えばポリ−Ｌ−リジン、ポリエチレンイミン、ポリアスパラギン酸、スチレンマレイン酸共重合体、イソプロピルアクリルアミド−アクリルピロリドン共重合体、ポリエチレングリコール修飾デンドリマー、ポリ乳酸、ポリ乳酸ポリグリコール酸、ポリエチレングリコール化ポリ乳酸等の合成高分子、およびそれらの塩等があげられる。
【００３３】
ここで、高分子における塩は、例えば金属塩、アンモニウム塩、酸付加塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等を包含する。金属塩としては、例えばリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等があげられ、アンモニウム塩としては、例えばアンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の塩があげられ、酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、および酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩等の有機酸塩があげられ、有機アミン付加塩としては、例えばモルホリン、ピペリジン等の付加塩があげられ、アミノ酸付加塩としては、例えばグリシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン等の付加塩があげられる。
【００３４】
金属コロイドとしては、例えば金、銀、白金、銅、ロジウム、シリカ、カルシウム、アルミニウム、鉄、インジウム、カドミウム、バリウム、鉛等を含む金属コロイドがあげられる。
【００３５】
微粒子製剤としては、例えばマイクロスフェアー、マイクロカプセル、ナノクリスタル、リピッドナノパーティクル、高分子ミセル等があげられる。
【００３６】
また、コア微粒子が薬物を含むコア微粒子である場合には、好ましくは、コア微粒子は、薬物と静電的に逆の電荷をもつ荷電物質を含有し、より好ましくは、薬物と静電的に逆の電荷をもつ脂質（後記のカチオン性脂質またはアニオン性脂質）を含有する。ここで、薬物と静電的に逆の電荷とは、薬物分子内の電荷、分子内分極等に対して静電的引力を生じる電荷、表面分極等を包含する。
【００３７】
コア微粒子に含有される荷電物質は、カチオン性を呈するカチオン性物質とアニオン性を呈するアニオン性物質とに分類されるが、カチオン性の基とアニオン性の基の両方をもつ両性の物質であっても、ｐＨや、他の物質との結合等により相対的な陰性度が変化するので、その時々に応じてカチオン性物質またはアニオン性物質に分類され得る。これら荷電物質は、前記コア微粒子の構成成分として用いても、該コア微粒子の構成成分に加えて用いても構わない。
【００３８】
カチオン性物質としては、例えば前記のコア微粒子の定義で例示したもののうちのカチオン性物質［具体的には、カチオン性脂質、カチオン性界面活性剤（前記と同義）、カチオン性高分子等］、等電点以下の値のｐＨで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチド等があげられる。
【００３９】
カチオン性脂質としては、例えばＤＯＴＡＰ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＳＰＡ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＲＩＥ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ等があげられる。
カチオン性高分子としては、例えばポリ−Ｌ−リジン、ポリエチレンイミン、ポリフェクト（ｐｏｌｙｆｅｃｔ）、キトサン等があげられる。
【００４０】
等電点以下の値のｐＨで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチドとしては、その物質の等電点以下の値のｐＨで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチドであれば、特に限定されない。例えば、アルブミン、オロソムコイド、グロブリン、フィブリノーゲン、ペプシン、リボヌクレアーゼＴ１等があげられる。
【００４１】
アニオン性物質としては、例えば前記のコア微粒子の定義で例示したもののうちのアニオン性物質［具体的には、アニオン性脂質、アニオン性界面活性剤（前記と同義）、アニオン性高分子等］、等電点以上の値のｐＨで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチド、核酸等があげられる。
【００４２】
アニオン性脂質としては、例えばホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸等があげられる。
アニオン性高分子としては、例えばポリアスパラギン酸、スチレンマレイン酸共重合体、イソプロピルアクリルアミド−アクリルピロリドン共重合体、ポリエチレングリコール修飾デンドリマー、ポリ乳酸、ポリ乳酸ポリグリコール酸、ポリエチレングリコール化ポリ乳酸、デキストラン硫酸、デキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸、コンドロイチン、デルタマン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケタラン硫酸、デキストランフルオレセインアニオニック等があげられる。
【００４３】
等電点以上の値のｐＨで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチドとしては、その物質の等電点以上の値のｐＨで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチドであれば、特に限定されない。例えば、アルブミン、オロソムコイド、グロブリン、フィブリノーゲン、ヒストン、プロタミン、リボヌクレアーゼ、リゾチーム等があげられる。
【００４４】
アニオン性物質としての核酸としては、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド等があげられ、生理活性を示さないものであれば、どのような長さ、配列のものであってもよい。
【００４５】
コア微粒子は、市販品として得られるか、または公知の方法またはそれに準じて製造することができる。例えば、コア微粒子の１つであるリポソームを構成成分とするコア微粒子の製造には、公知のリポソームの調製方法が適用できる。公知のリポソームの調製方法としては、例えばバンガム（Ｂａｎｇｈａｍ）らのリポソーム調製法［“ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）”，１９６５年，第１３巻，ｐ．２３８−２５２参照］、エタノール注入法［“ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．）”，１９７５年，第６６巻，ｐ．６２１−６３４参照］、フレンチプレス法［“エフイービーエス・レターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．）”，１９７９年，第９９巻，ｐ．２１０−２１４参照］、凍結融解法［“アーカイブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．）”，１９８１年，第２１２巻，ｐ．１８６−１９４参照］、逆相蒸発法［“プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）”，１９７８年，第７５巻，ｐ．４１９４−４１９８参照］、ｐＨ勾配法（例えば特許第２５７２５５４号公報、特許第２６５９１３６号公報等参照）等があげられる。リポソームの製造の際にリポソームを懸濁させる溶液としては、例えば水、酸、アルカリ、種々の緩衝液、生理的食塩液、アミノ酸輸液等を用いることができる。また、リポソームの製造の際には、例えばクエン酸、アスコルビン酸、システイン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等の抗酸化剤、例えばグリセリン、ブドウ糖、塩化ナトリウム等の等張化剤等の添加も可能である。また、脂質等を例えばエタノール等の有機溶媒に溶解し、溶媒留去した後、生理食塩水等を添加、振とう撹拌し、リポソームを形成させることによってもリポソームを製造することができる。
【００４６】
また、例えば非イオン性界面活性剤（前記と同義）、カチオン性界面活性剤（前記と同義）、アニオン性界面活性剤（前記と同義）、高分子、ポリオキシエチレン誘導体等によるリポソーム表面改質も任意に行うことができ、これらの表面改質リポソームも本発明におけるコア微粒子の構成成分として用いられる［ラジック（Ｄ．Ｄ．Ｌａｓｉｃ）、マーティン（Ｆ．Ｍａｒｔｉｎ）編，“ステルス・リポソームズ（Ｓｔｅａｌｔｈ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）”，（米国），シーアールシー・プレス・インク（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ），１９９５年，ｐ．９３−１０２参照］。高分子としては例えばデキストラン、プルラン、マンナン、アミロペクチン、ヒドロキシエチルデンプン等があげられる。ポリオキシエチレン誘導体としては、例えばポリソルベート８０、プルロニックＦ６８、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、ポリオキシエチレンラウリルアルコール、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）等があげられる。
【００４７】
リポソームの平均粒子径は、所望により自由に選択できる。平均粒子径を調節する方法としては、例えばエクストルージョン法、大きな多重膜リポソーム（ＭＬＶ）を機械的に粉砕（具体的にはマントンゴウリン、マイクロフルイダイザー等を使用）する方法［ミュラー（Ｒ．Ｈ．Ｍｕｌｌｅｒ）、ベニタ（Ｓ．Ｂｅｎｉｔａ）、ボーム（Ｂ．Ｂｏｈｍ）編著，“エマルジョン・アンド・ナノサスペンジョンズ・フォー・ザ・フォーミュレーション・オブ・ポアリー・ソラブル・ドラッグズ（Ｅｍｕｌｓｉｏｎ ａｎｄ Ｎａｎｏｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｏｒｌｙ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｄｒｕｇｓ）”，ドイツ，サイエンティフィック・パブリッシャーズ・スチュットガルト（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ），１９９８年，ｐ．２６７−２９４参照］等があげられる。
【００４８】
また、コア微粒子を構成する例えば薬物、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン粒子、高分子、金属コロイド、微粒子製剤等から選ばれる２つ以上を組み合わせた複合体（具体的には、例えばカチオン性脂質を含有するリポソームまたは脂質集合体と核酸との複合体、ポリ−Ｌ−リジン等のカチオン性高分子を含有する高分子と核酸との複合体、ホスファチジン酸等のアニオン性脂質を含有するリポソームまたは脂質集合体と蛋白質との複合体、スチレンマレイン酸等のアニオン性高分子を含有する高分子と蛋白質との複合体、カチオン性脂質を含有するリポソームまたは脂質集合体と蛋白質との複合体、ポリ−Ｌ−リジン等のカチオン性高分子を含有する高分子と蛋白質との複合体等があげられる）の製造方法は例えば水中で薬物と脂質集合体、リポソーム、高分子等とを混合するだけの製造方法でもよく、この際、必要であればさらに整粒工程や無菌化工程等を加えることもできる。また、複合体形成を例えばアセトン、エーテル等種々の溶媒中で行うことも可能である。例えば、核酸と脂質とをエタノール等の有機溶媒に溶解し、溶媒留去した後、生理食塩水等を添加、振とう撹拌し、核酸複合体を形成させることもできる。別の複合体の形成方法としては、例えば、水中でカチオン性物質とポリエチレングリコール化リン脂質（具体的にはポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミン（より具体的には１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）等）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、クレモフォアイーエル（ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ ＥＬ）等）等でリポソームを調製し、その後、例えば核酸を添加し、さらに例えばアニオン性高分子を添加して、多重複合体とすることも可能である。
【００４９】
コア微粒子の大きさは、平均粒子径が数ｎｍ〜数百μｍであるのが好ましく、１０ｎｍ〜５μｍであるのがより好ましく、５０ｎｍ〜３００ｎｍであるのがさらに好ましく、５０ｎｍ〜２００ｎｍであるのが最も好ましい。
【００５０】
被覆層成分としては、例えば前記コア微粒子の定義の中であげた脂質、界面活性剤、高分子等があげられ、好ましくは、前記コア微粒子の定義の中であげた脂質および界面活性剤から選ばれる１つ以上の物質があげられ、より好ましくは、被覆層が脂質膜となる脂質および界面活性剤から選ばれる１つ以上の物質があげられ、さらに好ましくは、リン脂質があげられる。
【００５１】
また、被覆層が脂質膜である場合に用いられる脂質として、例えば合成脂質等もあげられる。合成脂質としては、例えばフッ素添加ホスファチジルコリン、フッ素添加界面活性剤、臭化ジアルキルアンモニウム等があげられ、これらは単独でまたは他の脂質等と組み合わせて用いられてもよい。また、被覆層が脂質膜である場合には、被覆層成分の１つとして水溶性高分子誘導体も使用することが好ましい。水溶性高分子誘導体としては、例えばポリエチレングリコール化脂質［具体的にはポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミン（より具体的には１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）等）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、クレモフォアイーエル（ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ ＥＬ）等］、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル（具体的にはモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン等）、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリグリセリン化脂質（具体的にはポリグリセリン−ホスファチジルエタノールアミン等）、ポリグリセリン脂肪酸エステル等があげられ、好ましくは、ポリエチレングリコール化脂質があげられる。
【００５２】
本発明の被覆微粒子は、例えばコア微粒子が分散し、かつ被覆層成分が溶解した極性有機溶媒を含む液（液Ａ）を調製する工程、液Ａと混合可能であり、極性有機溶媒を含まないまたは液Ａより低い割合で極性有機溶媒を含む液（液Ｂ）を調製する工程、および、２つ以上の入口と、１つ以上の出口をもつインライン混合手段を備える被覆微粒子製造装置の、インライン混合手段の１つ以上の入口から、液Ａを入れ、残る入口の少なくとも１つの入口から、液Ｂを入れて混合し、コア微粒子を被覆層で被覆する工程を含む製造方法によって製造でき、この場合、該被覆微粒子は懸濁液（液Ｃ）の形態で得られる。また、液Ａにおける溶媒は、コア微粒子が溶解せず、被覆層成分が溶解する溶媒であるのが好ましく、液Ａと液Ｂを混合した液Ｃでは、コア微粒子は溶解せず、被覆層成分は溶解しないまたは集合している。液Ａは極性有機溶媒を含む液であり、液Ｂは極性有機溶媒以外の溶媒を含む液であるが、液Ａは極性有機溶媒以外の溶媒を液Ｂにおける極性有機溶媒の以外の溶媒の割合よりも低ければ含んでいてもよく、液Ｂも極性有機溶媒を液Ａにおける極性有機溶媒の割合よりも低ければ含んでいてもよい。
【００５３】
本発明において、コア微粒子が分散するとは、コア微粒子が懸濁、乳濁またはエマルジョン化、好ましくは、懸濁している状態のことであり、コア微粒子の大部分が分散して、残りの部分が溶解している状態または一部が沈殿している状態も包含するが、コア微粒子のほとんど全部または全部が分散していることが好ましい。また、被覆層成分が溶解するとは、被覆層成分の大部分が溶解して、残りの部分が分散している状態も包含するが、被覆層成分のほとんど全部または全部が溶解していることが好ましい。
【００５４】
前記液Ａおよび液Ｂにおける極性有機溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノール、ｎ−ブタノール、２−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール等のアルコール類、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコール類等があげられ、好ましくは、エタノールがあげられる。また、前記液Ａおよび液Ｂにおける極性有機溶媒以外の溶媒としては、例えば、水、液体二酸化炭素、液体炭化水素、ハロゲン化炭素、ハロゲン化炭化水素等があげられ、好ましくは、水があげられる。また、液Ａおよび液Ｂは、イオン、緩衝成分等を含んでいてもよい。
【００５５】
極性有機溶媒と極性有機溶媒以外の溶媒の組み合わせは、相互に混合可能である組み合わせであるのが好ましく、液Ａ〜Ｃ中の溶媒に対する、前記コア微粒子の溶解度、前記被覆層成分の溶解度等を考慮して選択できる。一方、前記コア微粒子については、液Ａ〜Ｃ中の溶媒のいずれに対しての溶解度も低いことが好ましく、また極性有機溶媒および極性有機溶媒以外の溶媒のいずれに対しての溶解度も低いことが好ましく、被覆層成分は、液Ｂおよび液Ｃ中の溶媒に対しての溶解度が低いことが好ましく、液Ａ中の溶媒に対しての溶解度が高いことが好ましく、また極性有機溶媒に対しての溶解度が高いことが好ましく、極性有機溶媒以外の溶媒に対しての溶解度が低いことが好ましい。
【００５６】
液Ａ中の溶媒における極性有機溶媒の割合は、前記コア微粒子が溶解せずに存在し、被覆層成分が溶解するという条件さえ満たしていれば特に限定されるものではなく、用いる溶媒やコア微粒子、被覆層成分の種類等により異なるが、好ましくは、３０ｖｏｌ％以上、より好ましくは、６０〜９０ｖｏｌ％である。また、液Ｃ中の溶媒における極性有機溶媒の割合は、前記コア微粒子が溶解していた被覆層成分で被覆されうる割合であれば特に限定されるものではないが、好ましくは、５０ｖｏｌ％以下、より好ましくは、３０〜５０ｖｏｌ％である。
【００５７】
液Ａを調製する工程としては、前記コア微粒子が溶解しなければ、前記極性有機溶媒、前記コア微粒子および前記被覆層成分、または前記極性有機溶媒、前記コア微粒子、前記被覆層成分および前記極性有機溶媒以外の溶媒をいかなる順に加えて液Ａを調製する工程でもかまわず、好ましくは、前記コア微粒子が分散した極性有機溶媒を含む液（液Ｄ）を調製し、液Ｄ中の極性有機溶媒と同一または異なった極性有機溶媒を含む溶媒に被覆層成分を溶解させた液（液Ｅ）を調製し、液Ｄと液Ｅを混合して調製する工程があげられる。また、液Ｄと液Ｅとの混合は、徐々に行うのが好ましい。液Ｄと液Ｅを混合して液Ａを調製する工程において、液Ａにおける極性有機溶媒の割合を調整するためには、液Ｄおよび液Ｅの液量とそれぞれにおける極性有機溶媒の割合を調節すればよい。液Ｄと液Ｅの混合は、前記インライン混合手段の入口から、流路を通じて接続された別のインライン混合手段または混合手段を備えた貯蔵室もしくは貯蔵槽によって行われてもよく、前記インライン混合手段の入口から、流路を通じて接続された別のインライン混合手段と接続される場合における被覆微粒子装置としては、それぞれ２つの入口と、１つの出口をもつ第１インライン混合手段と第２インライン混合手段を備え、第１インライン混合手段の出口と第２インライン混合手段の１つの入口が繋がっている被覆微粒子装置があげられる。液Ｄおよび液Ｅ中の溶媒における極性有機溶媒の各割合の差は２０ｖｏｌ％以内とすることが好ましく、０ｖｏｌ％とすることがより好ましい。また、液Ｄおよび液Ｅは、それぞれさらに別のインライン混合手段によって調製してもよい。
【００５８】
また、液Ｃにおいては、極性有機溶媒以外の溶媒（液Ｆ）を加えること、および／または、例えば蒸発留去、半透膜分離、分留等によって、選択的に極性有機溶媒を取り除くことで、極性有機溶媒の割合をさらに減少させることが好ましい。液Ｃと液Ｆの混合は、前記インライン混合装置の出口から流路を通じて接続された別のインライン混合手段または混合手段を備えた貯蔵室もしくは貯蔵槽によって行われてもよい。
【００５９】
本発明におけるコア微粒子と被覆層成分の組み合わせは、特に限定されないが、コア微粒子が薬物とリポソームの複合体を構成成分とする微粒子であって、被覆層成分が脂質および／または界面活性剤である組み合わせが好ましい。コア微粒子がリポソームまたは薬物とリポソームの複合体を構成成分とする微粒子であって、被覆層成分が脂質および／または界面活性剤であって、被覆層が脂質膜である被覆微粒子は、その構成から狭義のリポソームと分類され、コア微粒子がリポソームまたは薬物とリポソームの複合体を構成成分とする微粒子以外で、被覆層成分が脂質および／または界面活性剤であって、被覆層が脂質膜である被覆微粒子は、広義のリポソームと分類される。本発明において、被覆微粒子は狭義のリポソームであることがより好ましい。
【００６０】
本発明の被覆微粒子の製造方法において用いられるコア微粒子の液Ａおよび液Ｃに対する割合は、コア微粒子を被覆層成分で被覆できれば特に限定されるものではないが、１μｇ／ｍＬ〜１ｇ／ｍＬが好ましく、０．１〜５００ｍｇ／ｍＬがより好ましい。また、用いられる被覆層成分（例えば脂質等）の液Ａおよび液Ｃに対する割合は、前記コア微粒子を被覆できれば特に限定されるものではないが、１μｇ／ｍＬ〜１ｇ／ｍＬが好ましく、０．１〜４００ｍｇ／ｍＬがより好ましい。コア微粒子に対する被覆層成分の割合は、重量比で１：０．１〜１：１０００が好ましく、１：１〜１：１０がより好ましい。
【００６１】
また、本発明の被覆微粒子の製造方法によって製造できる被覆微粒子の大きさは、平均粒子径が３００ｎｍ以下であるのが好ましく、２００ｎｍ以下であるのがより好ましく、具体的には、例えば注射可能な大きさであるのが好ましい。
【００６２】
本発明の被覆微粒子の好ましい製造方法として、以下に脂質膜で被覆された被覆微粒子の製造方法を例にしてより具体的に説明する。なお、用いるコア微粒子の種類や、用いる被覆層成分の種類によらず、本発明の他の被覆微粒子も同様な方法で製造することができる。
（工程１）コア微粒子を極性有機溶媒を含む液、好ましくは、極性有機溶媒含有水溶液、さらに好ましくは、エタノール等のアルコール類を含有する水溶液に分散（懸濁）させる。
（工程２）脂質膜を構成する被覆層成分（例えば脂質膜となる脂質および／または界面活性剤）を極性有機溶媒を含む液（好ましくは、工程１の極性有機溶媒含有水溶液と同一または異なった極性有機溶媒含有水溶液、さらに好ましくは、同一の極性有機溶媒含有水溶液）に溶解する。
（工程３）工程１で得られた液と工程２で得られた液を混合する。
（工程４）引き続き、被覆微粒子製造装置のインライン混合手段の１つの入口から、工程３で得られた混合液を入れ、残る１つの入口から、工程３で得られた混合液と混合可能であり、極性有機溶媒を含まないまたは工程３で得られた混合液より低い割合で極性有機溶媒を含む液（好ましくは、水）を入れて混合し、該コア微粒子が脂質膜で被覆された被覆微粒子を、懸濁液の形態で得る。また、工程４で被覆微粒子の製造が完了した後、さらに水等を含有する液を混合する等して、極性有機溶媒の割合を下げることが好ましい。
【００６３】
以下に、図を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の製造方法はこれら図に示したものに限定されるものではない。
図１は、本発明で用いられる基本的な被覆微粒子製造装置を表しており、２つの入口と、１つの出口をもつインライン混合手段（１）を備え、（１）の入口に流路（２）および（３）を、（１）の出口に流路（４）を備え、（２）および（３）を介してそれぞれポンプ（５）および（６）を、（４）を介して液槽（７）を備える被覆微粒子製造装置を表している。前記液Ａは、（５）から（２）を経て（１）の入口の１つに流れ、前記液Ｂは、（６）から（３）を経て（１）の別の入口に流れ、液Ａおよび液Ｂは（１）で混合される。液Ａが液Ｂと混合されることでコア微粒子が被覆層で被覆されて被覆微粒子が分散した前記液Ｃとなり、液Ｃは（１）の出口から流路（４）を通じて液槽（７）に送られて蓄えられる。
【００６４】
図２は、前記液Ａが、前記液Ｄと前記液Ｅとからインライン混合手段を用いて調製される場合の被覆微粒子製造装置の応用例を表しており、図１におけるポンプ（５）に換えて、２つの入口と、１つの出口をもつインライン混合手段（８）を備え、（８）の出口は（２）に繋がっており、（８）の入口に、流路（９）および（１０）を備え、（９）および（１０）を介してそれぞれポンプ（１１）および（１２）を備える被覆微粒子製造装置を表している。
【００６５】
図３は、図１の基本的な被覆微粒子製造装置にさらに前記液Ｃに前記液Ｆを混合するためのインライン混合手段を備える場合の被覆微粒子製造装置の応用例を表している。図１における液槽（７）に換えて、２つの入口と、１つの出口をもつインライン混合手段（１３）を備え、（１３）の入口の１つは（４）に繋がっており、（１３）の別の入口および出口に、それぞれ流路（１４）および（１５）を備え、（１４）および（１５）を介してそれぞれポンプ（１６）および液槽（１７）を備える被覆微粒子製造装置を表している。
【００６６】
一方、図４は、従来技術（国際公開第０２／２８３６７号パンフレット参照）における被覆微粒子製造装置を表しており、液槽（１８）およびそれに繋がった流路（１９）を備え、（１９）を介してポンプ（２０）を備える被覆微粒子製造装置を表している。前記液Ａは（１８）に入れられ、液Ｂは（２０）に入れられ、（２０）から（１９）を経て（１８）中の液Ａに加えられる。
【００６７】
本発明におけるインライン混合手段としては、例えばＴ字管、Ｙ字管、三方継手、三方コック、インラインミキサー（例えばスタティックミキサー等）、インラインミキサーアセンブリ等があげられ、それぞれスタティックミキサーを接続または内蔵していることが好ましい。流路は例えば金属パイプ、樹脂製チューブ等のいかなる流路であってもよく、ポンプとしては例えばギアポンプ、チューブポンプ、シリンジポンプ、吸引ポンプ、加圧ポンプ、プランジャー式ポンプ等があげられ、ポンプが流路の機能を兼ねていてもよい。また、本発明で用いられる被覆微粒子製造装置内または流路を通じた外部に貯蔵室または貯蔵槽が備えられていてもよく、それぞれ混合手段を備えていてよい。ここで、貯蔵室または貯蔵槽を高位置に設置することによる高低差を利用した自然落下も、ポンプの一形態に含まれる。
【００６８】
本発明の製造方法において、本発明の被覆微粒子製造装置内または流路を通じた外部の貯蔵室または貯蔵槽に備えられる混合手段は、特に限定されるものではなく、例えばスタティック式ミキサー、プロペラ型ミキサー、ローター／ステーター式ミキサー、ダービン式ミキサー、のこぎり歯ブレード、コロイドミル、高圧ホモジナイザー等があげられ、好ましくは、スタティックミキサー、プロペラ型ミキサー、ローター／ステーター式ミキサーまたはダービン式ミキサーがあげられる。
【００６９】
図１〜３の被覆微粒子製造装置では、それぞれ液Ａと液Ｂの混合液がインライン混合手段（１）から流路（４）を流れるうちにコア微粒子が被覆され、途中の任意の時間に各ポンプを停止または稼働のまま、液槽（７）または（１７）を交換して求める被覆微粒子の懸濁液を連続して得ることができる。また、任意の時間に各ポンプを停止して、供給する各液を交換し、再度各ポンプを稼働させても、同じ組成の液を用いていれば、同じ被覆微粒子の懸濁液を引き続き得ることが簡便にできる。また、被覆微粒子製造装置の大きさによらず、液槽（７）または（１７）や、供給する各液を交換していくことによって、任意の量の被覆微粒子の懸濁液が製造可能であるので、工業的必要量の被覆微粒子を製造することも可能である。すなわち、本発明の被覆微粒子の製造方法では連続的にコア微粒子の被覆を行うことができ、被覆微粒子の大量生産が可能となる。これに対して、図４の被覆微粒子製造装置では、液槽（１８）の中でコア微粒子が被覆され、規定量の液Ｂを供給した後にしか液槽（８）中に求める被覆微粒子の懸濁液が得られない。また、工業的必要量の被覆微粒子を製造するには、巨大な大きさの被覆微粒子製造装置が必要となる。
【００７０】
また、小型の被覆微粒子製造装置が望まれる場合、上記のインライン混合手段を備える被覆微粒子製造装置を小型にしたものでよく、そのときのポンプは、自然落下を利用したポンプまたは人の手によって押し出すポンプ（例えばシリンジ、ピストン、スポイド等）であってもよい。このような小型の被覆微粒子製造装置を用いれば、用時に被覆微粒子を製造することも可能である。
【００７１】
本発明の被覆微粒子は、例えば血液成分等の生体成分、消化管液等に対する薬剤の安定化、副作用の低減、腫瘍等の標的臓器への薬剤集積性の増大、経口や経粘膜での薬剤の吸収の改善等を目的とする製剤として使用できる。本発明の被覆微粒子は、該目的において、生体成分中で薬物を長時間内包しうる堅固に薬物を含有した被覆微粒子であることが好ましい。
【００７２】
本発明の被覆微粒子を製剤として使用する場合、上述の方法により調製した被覆微粒子の懸濁液をそのまま例えば注射剤等の形態として用いることも可能であるが、該懸濁液から例えば濾過、遠心分離等によって溶媒を除去して使用することも、該懸濁液、または例えばマンニトール、ラクトース、トレハロース、マルトース、グリシン等の賦形剤を加えた該懸濁液を凍結乾燥して使用することもできる。
【００７３】
注射剤の場合、前記の被覆微粒子の懸濁液または前記の溶媒を除去または凍結乾燥した被覆微粒子に、例えば水、酸、アルカリ、種々の緩衝液、生理的食塩液、アミノ酸輸液等を混合して注射剤を調製することが好ましい。また、例えばクエン酸、アスコルビン酸、システイン、ＥＤＴＡ等の抗酸化剤、グリセリン、ブドウ糖、塩化ナトリウム等の等張化剤等を添加して注射剤を調製することも可能である。また、例えばグリセリン等の凍結保存剤を加えて凍結保存することもできる。
【００７４】
また、本発明の被覆微粒子は、適当な賦形剤等と共に造粒、乾燥する等して例えばカプセル剤、錠剤、顆粒剤等の経口用製剤に加工してもよい。
【００７５】
次に、実施例により、本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００７６】
下記の被覆微粒子製造装置、液Ａ、液Ｂおよび液Ｆを用い、液Ａを１０ｍＬ／ｈ、液Ｂを７．５ｍＬ／ｈで混合後の液Ｃ中のエタノール濃度がおよそ４０ｖｏｌ％になるようにそれぞれ送液し、液Ｆを混合後のエタノール濃度がおよそ１０ｖｏｌ％になるように調整して送液した。
得られた被覆微粒子の懸濁液から、超遠心（１時間、１１０，０００×ｇ，２５℃）によって上清を除去し、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸二水素カリウム水溶液を添加して再懸濁し、製剤を得た。
被覆微粒子製造装置；
図３に示した被覆微粒子製造装置を用いた。（１）および（１３）にＴ字状の接続部（テルフュージョン三方活栓Ｒ型、テルモ製）を用い、（５）、（６）および（１５）にシリンジポンプ（テルフュージョンシリンジポンプＳＴＣ−５２５、テルモ製）を用いた。
液Ａ；
卵黄レシチン（キューピー製）３．００ｇおよびＰＥＧ−ＤＳＰＥ［アバンチポーラルリピッズ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）社製；以下同様である］１．２０ｇに、エタノール２０ｍＬを室温下で加え溶解させた後、エタノールを留去し減圧乾燥し、次に水１００ｍＬを加え、ボルテックスミキサーで振とう撹拌した。得られた懸濁液を、室温で０．２０μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに２０回通した後、０．０５μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに１０回通した。別に、１．４ｍｇ／ｍＬ Ｇ−ＣＳＦ（協和発酵製、ナルトグラスチム、遺伝子組換ヒトＧ−ＣＳＦ変異型）水溶液３．５ｍＬに、７ｍｇ／ｍＬデキストラン硫酸ナトリウム（メルク製）１．４ｍＬを加えた。得られた液４．２ｍＬと、フィルターに通した卵黄レシチンとＰＥＧ−ＤＳＰＥの懸濁液０．２ｍＬを混合し、次に塩酸（関東化学製）を加えｐＨを４とし、コア微粒子の懸濁液を得た。得られたコア微粒子の懸濁液５００μＬにエタノール７８０μＬを加え、３０ｍｇ／ｍＬ卵黄ホスファチジルコリンおよび１２ｍｇ／ｍＬ ＰＥＧ−ＤＳＰＥを含むエタノール５３μＬを加えた。
液Ｂ；
蒸留水
液Ｆ；
５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸二水素カリウム水溶液
【実施例２】
【００７７】
実施例１と同じ被覆微粒子製造装置、液Ｂおよび液Ｆと、下記の液Ａを用い、液Ａを８ｍＬ／ｈ、液Ｂを４．２ｍＬ／ｈで混合後の液Ｃ中のエタノール濃度がおよそ４０ｖｏｌ％になるようにそれぞれ送液し、液Ｆを混合後のエタノール濃度がおよそ１０ｖｏｌ％になるように調整して送液した。得られた被覆微粒子の懸濁液を用いて、実施例１と同様に超遠心および再懸濁をして製剤を得た。
液Ａ；
実施例１と同様に調製されたコア微粒子の懸濁液５００μＬにエタノール６６６μＬを加え、３０ｍｇ／ｍＬ卵黄ホスファチジルコリンおよび１２ｍｇ／ｍＬ ＰＥＧ−ＤＳＰＥを含むエタノール１６７μＬを加えた。
【００７８】
＜比較例１＞
下記の被覆微粒子製造装置、液Ａおよび液Ｂを用い、液Ａを下記の（１８）に入れ、液Ｂを（２０）に入れ、液Ａに液Ｂ ７ｍＬを（１９）を通じて加え、エタノール濃度が１０ｖｏｌ％になるようにした。得られた被覆微粒子の懸濁液を用いて、実施例１と同様に超遠心および再懸濁をして製剤を得た。
被覆微粒子製造装置；
図４に示した被覆微粒子製造装置を用いた。（１８）にマグネチックスターラーを入れた三角フラスコを用い、（２０）にシリンジポンプ（テルフュージョンシリンジポンプＳＴＣ−５２５、テルモ製）を用いた。
液Ａ；
実施例１と同様に調製されたコア微粒子の懸濁液５００μＬにエタノール７８０μＬを加え、３０ｍｇ／ｍＬ卵黄ホスファチジルコリンおよび１２ｍｇ／ｍＬ ＰＥＧ−ＤＳＰＥを含むエタノール５３μＬを加えた。
液Ｂ；
蒸留水
【００７９】
＜試験例１＞
実施例１〜２および比較例１で得られた各製剤について動的光散乱（ＤＬＳ）測定装置（Ａ ｍｏｄｅｌ ＥＬＳ−８００、大塚電子、以下同様）で被覆微粒子の平均粒子径を測定した。結果を表１に示す。
【００８０】
【表１】
【００８１】
＜試験例２＞
実施例１〜２および比較例１で得られた各製剤について、被覆微粒子中におけるＧ−ＣＳＦの内包率を以下のように求めた。
各製剤をゲルろ過クロマトグラフィー（Φ１０ｍｍ×２０ｃｍのカラム中に、分子体積排除型の高分子（セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ−４Ｂ）を充填し、移動相にリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いた）にかけ、それぞれ被覆微粒子画分と遊離Ｇ−ＣＳＦ画分に分離した。それぞれの画分２０μＬに１０ｗ／ｖ％ラウリル硫酸ナトリウムを含むｐＨ９のホウ酸緩衝液２μＬ、ｐＨ９のホウ酸緩衝液７８μＬおよび２−プロパノール１００μＬを加えて攪拌し完全に被覆微粒子を破壊した後、高速液体クロマトグラフィー（下記条件）でＧ−ＣＳＦを定量し、被覆微粒子中におけるＧ−ＣＳＦの内包率を下記式（１）で算出した。結果を表２に示す。
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｃ８ Φ４．６ｍｍ×１５ｃｍ
移動相：Ｉ液（ｐＨ７、１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液−２−プロパノール混液（７５：２５））＋ＩＩ液（２−プロパノール）
ＩＩ液の割合を、分析開始後０〜３０分では０〜８６．７ｖｏｌ％に直線的に増加、３０〜４０分では８６．７ｖｏｌ％とした。
検出：励起波長２８０ｎｍ、蛍光波長３４０ｎｍ
【００８２】
【数１】
【００８３】
【表２】
【００８４】
表１からわかるように、実施例１〜２および比較例１で得られた各製剤における被覆微粒子は、それぞれ同様の平均粒子径を有している。一方、表２からわかるように、実施例１および２で得られた製剤では、被覆微粒子中におけるＧ−ＣＳＦの内包率が９０％以上であり、比較例１で得られた製剤では７０％程度であった。すなわち、本発明の被覆微粒子の製造方法では、連続式の簡便な製造方法であるにもかかわらず、従来法と同程度の大きさの被覆微粒子を製造可能であり、さらに薬物の内包率が高い効率の良い被覆微粒子の製造も可能であった。
【実施例３】
【００８５】
下記の被覆微粒子製造装置、液Ａおよび液Ｂを用い、液Ａを５．２ｍＬ／ｈ、液Ｂを１１．１ｍＬ／ｈで混合後の液Ｃ中のエタノール濃度がおよそ２０ｖｏｌ％になるようにそれぞれ送液した。（７）には予め蒸留水１８．８ｍＬを入れ、得られた被覆微粒子の懸濁液が滴下するようにした。シリンジポンプを作動させ、２３分後にシリンジポンプを停止した。（７）に蓋をして反転混合後、得られた混合液の超遠心分離（１時間、１１０，０００×ｇ、２５℃）を行った。超遠心分離後の沈殿物に希釈後の総脂質濃度が３０ｍｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を添加して再懸濁し、製剤を得た。
被覆微粒子製造装置；
図１に示した被覆微粒子製造装置を用いた。（１）にＨＰＬＣ配管用三方継手（島津製作所製）と２ｃｍのスタティックミキサー［長さ２０ｍｍ×内径１．５ｍｍのフッ素樹脂チューブに２ｍｇのガスクロマトグラフ用石英ウール（島津製作所製）を充填したもの］を用い、（５）および（６）に２０ｍＬシリンジ（テルモ製）を備えたシリンジポンプ（日機装製）を用いた。
液Ａ；
デキストランフルオレセインアニオニック（ＦＤ）（モレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）製；以下同様である）３０ｍｇ、ＤＯＴＡＰ（アバンチポーラルリピッズ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）社製；以下同様である）１８０ｍｇおよびＰＥＧ−ＤＳＰＥ７２ｍｇに蒸留水９ｍＬを加え、ボルテックスミキサーで振とう攪拌した。得られた懸濁液を室温で０．４μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに１０回および０．１μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに１０回通し、コア微粒子の懸濁液を得た。得られたコア微粒子の懸濁液７５０μＬとエタノール１ｍＬを混合し、ＥＰＣ４８０ｍｇおよびＰＥＧ−ＤＳＰＥ１００ｍｇにエタノール２ｍＬを加え攪拌して得た溶液２５０μＬを混合した。
液Ｂ；
蒸留水
【実施例４】
【００８６】
実施例３と同じ被覆微粒子製造装置、液Ａおよび液Ｂを用い、液Ａを５．２ｍＬ／ｈ、液Ｂを５．６ｍＬ／ｈで混合後の液Ｃ中のエタノール濃度がおよそ３０ｖｏｌ％になるようにそれぞれ送液した。（７）には予め蒸留水２０．９ｍＬを入れ、得られた被覆微粒子の懸濁液が滴下するようにした。シリンジポンプを作動させ、２３分後にシリンジポンプを停止し、実施例３と同様に、混合、超遠心および再懸濁をして製剤を得た。
【実施例５】
【００８７】
実施例３と同じ被覆微粒子製造装置、液Ａおよび液Ｂを用い、液Ａを５．２ｍＬ／ｈ、液Ｂを２．９ｍＬ／ｈで混合後の液Ｃ中のエタノール濃度がおよそ４０ｖｏｌ％になるようにそれぞれ送液した。（７）には予め蒸留水２１．９ｍＬを入れ、得られた被覆微粒子の懸濁液が滴下するようにした。シリンジポンプを作動させ、２３分後にシリンジポンプを停止し、実施例３と同様に、混合、超遠心および再懸濁をして製剤を得た。
【実施例６】
【００８８】
実施例３と同じ被覆微粒子製造装置、液Ａおよび液Ｂを用い、液Ａを５．２ｍＬ／ｈ、液Ｂを０．７ｍＬ／ｈで混合後の液Ｃ中のエタノール濃度がおよそ５５ｖｏｌ％になるようにそれぞれ送液した。（７）には予め蒸留水２２．７ｍＬを入れ、得られた被覆微粒子の懸濁液が滴下するようにした。シリンジポンプを作動させ、２３分後にシリンジポンプを停止し、実施例３と同様に、混合、超遠心および再懸濁をして製剤を得た。
【実施例７】
【００８９】
実施例３と同じ被覆微粒子製造装置、液Ａおよび液Ｂを用い、液Ａを２６．０ｍＬ／ｈ、液Ｂを２８．０ｍＬ／ｈで混合後の液Ｃ中のエタノール濃度がおよそ３０ｖｏｌ％になるようにそれぞれ送液した。（７）には予め蒸留水２０．９ｍＬを入れ、得られた被覆微粒子の懸濁液が滴下するようにした。シリンジポンプを作動させ、４．６分後にシリンジポンプを停止し、実施例３と同様に、混合、超遠心および再懸濁をして製剤を得た。
【実施例８】
【００９０】
実施例３と同じ被覆微粒子製造装置、液Ａおよび液Ｂを用い、液Ａを１．０ｍＬ／ｈ、液Ｂを１．１ｍＬ／ｈで混合後の液Ｃ中のエタノール濃度がおよそ３０ｖｏｌ％になるようにそれぞれ送液した。（７）には予め蒸留水２０．９ｍＬを入れ、得られた被覆微粒子の懸濁液が滴下するようにした。シリンジポンプを作動させ、１１５分後にシリンジポンプを停止し、実施例３と同様に、混合、超遠心および再懸濁をして製剤を得た。
【実施例９】
【００９１】
実施例３と同じ被覆微粒子製造装置からミキサーを除いた被覆微粒子製造装置と、実施例３と同じ液Ａおよび液Ｂを用い、液Ａを５．２ｍＬ／ｈ、液Ｂを５．６ｍＬ／ｈで混合後の液Ｃ中のエタノール濃度がおよそ３０ｖｏｌ％になるようにそれぞれ送液した。（７）には予め蒸留水２０．９ｍＬを入れ、得られた被覆微粒子の懸濁液が滴下するようにした。シリンジポンプを作動させ、２３分後にシリンジポンプを停止し、実施例３と同様に、混合、超遠心および再懸濁をして製剤を得た。
【実施例１０】
【００９２】
実施例３と同じ被覆微粒子製造装置で、２ｃｍのスタティックミキサーを０．４ｃｍのスタティックミキサー［長さ４ｍｍ×内径１．５ｍｍのフッ素樹脂チューブに０．４ｍｇのガスクロマトグラフ用石英ウール（島津製作所製）を充填したもの］に代えた被覆微粒子製造装置と、実施例３と同じ液Ａおよび液Ｂを用い、実施例９と同様に被覆微粒子の懸濁液を製造し、実施例３と同様に、混合、超遠心および再懸濁をして製剤を得た。
【実施例１１】
【００９３】
実施例３と同じ被覆微粒子製造装置で、２ｃｍのスタティックミキサーを１ｃｍのスタティックミキサー［長さ１０ｍｍ×内径１．５ｍｍのフッ素樹脂チューブに１ｍｇのガスクロマトグラフ用石英ウール（島津製作所製）を充填したもの］に代えた被覆微粒子製造装置と、実施例３と同じ液Ａおよび液Ｂを用い、実施例９と同様に被覆微粒子の懸濁液を製造し、実施例３と同様に、混合、超遠心および再懸濁をして製剤を得た。
【実施例１２】
【００９４】
実施例３と同じ被覆微粒子製造装置で、２ｃｍのスタティックミキサーを５本連続（計１０ｃｍ）繋いだ被覆微粒子製造装置と、実施例３と同じ液Ａおよび液Ｂを用い、実施例９と同様に被覆微粒子の懸濁液を製造し、実施例３と同様に、混合、超遠心および再懸濁をして製剤を得た。
【００９５】
＜比較例２＞
下記の被覆微粒子製造装置、液Ａおよび液Ｂを用い、液Ａを下記の（１８）に入れ、液Ｂを（２０）に入れ、液Ａに液Ｂ２３ｍＬを（１９）を通じて１ｍＬ／ｍｉｎで加えた。得られた被覆微粒子の懸濁液の超遠心分離（１時間、１１０，０００×ｇ、２５℃）を行った。超遠心分離後の沈殿物をＰＢＳで希釈し希釈後の総脂質濃度が３０ｍｇ／ｍＬとなるように調整し、製剤を得た。
被覆微粒子製造装置；
図４に示した被覆微粒子製造装置を用いた。（２０）にシリンジポンプ（テルフュージョンシリンジポンプＳＴＣ−５２５、テルモ製）を用い、（１８）に容積約３０ｍＬのガラス容器を用い、該ガラス容器には回転子を入れスターラーで攪拌した。
液Ａ；
ＦＤ３０ｍｇ、ＤＯＴＡＰ１８０ｍｇおよびＰＥＧ−ＤＳＰＥ７２ｍｇに蒸留水９ｍＬを加え、ボルテックスミキサーで振とう攪拌した。得られた懸濁液を室温で０．４μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに１０回および０．１μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに１０回通した。得られた懸濁液７５０μＬを約３０ｍＬのガラス容器に入れ、回転子を入れスターラーで攪拌しながらエタノール１ｍＬを混合し、コア微粒子の懸濁液を得た。得られたコア微粒子の懸濁液に、ＥＰＣ１２００ｍｇおよびＰＥＧ−ＤＳＰＥ２５０ｍｇにエタノール５ｍＬを加え攪拌して得た溶液２５０μＬを加え混合した。
液Ｂ；
蒸留水
【００９６】
＜比較例３＞
下記の被覆微粒子製造装置、液Ａおよび液Ｂを用い、液Ａを液Ｂに滴下した。滴下後に、実施例３と同様に、混合、超遠心および再懸濁をして製剤を得た。
被覆微粒子製造装置；
図１で示した被覆微粒子製造装置で、（５）に可変ピペット（エッペンドルフ製）を用い、（１）、（３）および（６）を除き、液槽（７）に液Ｂを入れた被覆微粒子製造装置を用いた。
液Ａ；
ＦＤ３０ｍｇ、ＤＯＴＡＰ１８０ｍｇおよびＰＥＧ−ＤＳＰＥ７２ｍｇに蒸留水９ｍＬを加え、ボルテックスミキサーで振とう攪拌した。得られた懸濁液を室温で０．４μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに１０回および０．１μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに１０回通し、コア微粒子の懸濁液を得た。得られたコア微粒子の懸濁液７５０μＬとエタノール１ｍＬを混合し、ＥＰＣ４８０ｍｇおよびＰＥＧ−ＤＳＰＥ１００ｍｇにエタノール２ｍＬを加え攪拌して得た溶液２５０μＬを混合した。
液Ｂ；
蒸留水２３．０ｍＬ
【００９７】
＜試験例３＞
実施例３〜１２および比較例２〜３で得られた各製剤について、ＤＬＳ測定装置で被覆微粒子の平均粒子径を測定した。結果を表３に示す。
【００９８】
【表３】
【００９９】
＜試験例４＞
実施例３〜１２および比較例２で得られた各製剤について、被覆微粒子中におけるＦＤの内包率を以下のように求めた。
各製剤３０μＬをとりそれぞれに精製水２９７０μＬを加え攪拌し超遠心分離して上清を取得した。上記各製剤および上記各上清を１０００倍希釈し、希釈後の各５０μＬに、１０ｗ／ｖ％トライトンエックス−１００（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）５０μＬおよびＰＢＳ４００μＬをそれぞれ加え、ボルテックスミキサーで攪拌した。その１００μＬを９６穴マイクロプレートにとり、蛍光プレートリーダー（ワラック（Ｗａｌｌａｃ）社製、アルボエスエックス−４（ＡＲＶＯｓｘ−４））を使用して励起波長４８５ｎｍおよび蛍光波長５３０ｎｍでの蛍光強度を測定した。一方、１、０．５および０．２５μｇ／ｍＬとなる各ＦＤ水溶液の蛍光強度を測定し、検量線を得た。検量線から各製剤中のＦＤ濃度、超遠心分離後の各上清中のＦＤ濃度を求め、被覆微粒子中におけるＦＤの内包率を下記式（２）で算出した。結果を表４に示す。
【０１００】
【数２】
【０１０１】
【表４】
【０１０２】
＜試験例５＞
実施例３〜１２および比較例２〜３で得られた各製剤における、ＦＤおよびＥＰＣの仕込み量に対する回収率を以下のように求めた。
各製剤を１０００倍希釈し、希釈後の各５０μＬに、１０ｗ／ｖ％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ５０μＬおよびＰＢＳ４００μＬをそれぞれ加え、ボルテックスミキサーで攪拌した。その１００μＬを９６穴マイクロプレートにとり、蛍光プレートリーダー（ワラック（Ｗａｌｌａｃ）社製、アルボエスエックス−４（ＡＲＶＯｓｘ−４））を使用して励起波長４８５ｎｍおよび蛍光波長５３０ｎｍでの蛍光強度を測定した。一方、１、０．５および０．２５μｇ／ｍＬとなる各ＦＤ水溶液の蛍光強度を測定し、検量線を得た。検量線から各製剤中のＦＤ濃度を求めた。一方、各製剤中のＥＰＣ濃度は、リン脂質Ｃ−テストワコー（和光純薬製）を用いて測定することにより求めた。各製剤におけるＦＤ回収率およびＥＰＣ回収率は、下記式（３）で算出した。結果を表５に示す。
【０１０３】
【数３】
【０１０４】
【表５】
【０１０５】
＜試験例６＞
実施例３〜１２および比較例２で得られた各製剤について、牛胎児血清（ＦＢＳ）中での安定性について検討を行った。
各製剤３０μＬにＦＢＳ２９７０μＬを加え混合した。混合直後および３７℃で３時間静置後に各５００μＬを取りゲルろ過クロマトグラフィー（Ｇｅｌ Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＧＰＣ）を行い、そのフラクション（１００滴，１０本）を回収した。各フラクションをボルテックスミキサーで振とう攪拌してサンプルとし、ＦＤを定量するため、各５０μＬに、１０ｗ／ｖ％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ５０μＬおよびＰＢＳ４００μＬをそれぞれ加え、ボルテックスミキサーで攪拌した。その１００μＬを９６穴マイクロプレートにとり、蛍光プレートリーダー（ワラック（Ｗａｌｌａｃ）社製、アルボエスエックス−４（ＡＲＶＯｓｘ−４））を使用して励起波長４８５ｎｍおよび蛍光波長５３０ｎｍでの蛍光強度を測定した。
０時間後および３時間後のＦＤ回収率を下記式（４）で算出した。結果を表６に示す。
【０１０６】
【数４】
【０１０７】
【表６】
【０１０８】
表３および表４からわかるように、実施例３〜１２および比較例２〜３で得られた各製剤における被覆微粒子では、平均粒子径も内包率も同様であり、外見上は同様の品質の被覆微粒子が得られた。一方、表５からわかるように、実施例３〜１２および比較例２で得られた各製剤では、ＦＤおよびＥＰＣの回収率が高く、比較例３で得られた製剤では低い。また、表６からわかるように、実施例３〜１２で得られた製剤は、比較例２で得られた製剤と比べて、ＰＢＳ中におけるＦＤの回収率が高く、ＰＢＳ中での安定性が良い。すなわち、本発明の被覆微粒子の製造方法では、連続式の簡便な製造方法であるにもかかわらず、従来法と同程度の大きさと薬物内包率の被覆微粒子を製造可能であり、さらに効率よくおよび／または堅固に薬物を含有させた被覆微粒子の製造も可能であった。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明により、コア微粒子が被覆層で被覆された被覆微粒子の連続式で簡便な工業的製造方法が提供される。また、本発明によって、効率よくおよび／または堅固に薬物を含有させた被覆微粒子の製造方法が提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コア微粒子が被覆層で被覆された被覆微粒子の製造方法であって、
該コア微粒子が分散し、かつ該被覆層を構成する被覆層成分が溶解した極性有機溶媒を含む液（液Ａ）を調製する工程、
液Ａと混合可能であり、極性有機溶媒を含まないまたは液Ａより低い割合で極性有機溶媒を含む液（液Ｂ）を調製する工程、および
２つ以上の入口と、１つ以上の出口をもつインライン混合手段を備える被覆微粒子製造装置の少なくとも１つの入口から、液Ａを入れ、残る入口の少なくとも１つの入口から、液Ｂを入れて混合し、該コア微粒子を該被覆層で被覆する工程を含む製造方法。
【請求項２】
被覆微粒子製造装置が、ポンプ、流路および前記インライン混合手段を含む請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
被覆微粒子製造装置が、手動ポンプ、流路および前記インライン混合手段を含む請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
被覆層成分が、脂質、界面活性剤および高分子から選ばれる１つ以上の物質である請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
被覆層が脂質膜である請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
コア微粒子が薬物、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン微粒子、高分子、金属コロイドまたは微粒子製剤を構成成分とする微粒子である請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
コア微粒子が薬物、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン微粒子、高分子、金属コロイドまたは微粒子製剤を２つ以上組み合わせた複合体を構成成分とする微粒子である請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
コア微粒子が、薬物とリポソームの複合体を構成成分とする微粒子である請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９】
極性有機溶媒がアルコール類、グリコール類およびポリアルキレングリコール類から選ばれる１つ以上である請求項１〜８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１０】
極性有機溶媒がエタノールである請求項１〜８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の製造方法によって製造できる被覆微粒子。
【請求項１】
コア微粒子が被覆層で被覆された被覆微粒子の製造方法であって、
該コア微粒子が分散し、かつ該被覆層を構成する被覆層成分が溶解した極性有機溶媒を含む液（液Ａ）を調製する工程、
液Ａと混合可能であり、極性有機溶媒を含まないまたは液Ａより低い割合で極性有機溶媒を含む液（液Ｂ）を調製する工程、および
２つ以上の入口と、１つ以上の出口をもつインライン混合手段を備える被覆微粒子製造装置の少なくとも１つの入口から、液Ａを入れ、残る入口の少なくとも１つの入口から、液Ｂを入れて混合し、該コア微粒子を該被覆層で被覆する工程を含む製造方法。
【請求項２】
被覆微粒子製造装置が、ポンプ、流路および前記インライン混合手段を含む請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
被覆微粒子製造装置が、手動ポンプ、流路および前記インライン混合手段を含む請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
被覆層成分が、脂質、界面活性剤および高分子から選ばれる１つ以上の物質である請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
被覆層が脂質膜である請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
コア微粒子が薬物、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン微粒子、高分子、金属コロイドまたは微粒子製剤を構成成分とする微粒子である請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
コア微粒子が薬物、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン微粒子、高分子、金属コロイドまたは微粒子製剤を２つ以上組み合わせた複合体を構成成分とする微粒子である請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
コア微粒子が、薬物とリポソームの複合体を構成成分とする微粒子である請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９】
極性有機溶媒がアルコール類、グリコール類およびポリアルキレングリコール類から選ばれる１つ以上である請求項１〜８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１０】
極性有機溶媒がエタノールである請求項１〜８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の製造方法によって製造できる被覆微粒子。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８９９２６
【国際公開日】平成１７年９月２９日（２００５．９．２９）
【発行日】平成１９年８月９日（２００７．８．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１１３０５（Ｐ２００６−５１１３０５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００５２５１
【国際出願日】平成１７年３月２３日（２００５．３．２３）
【出願人】（０００００１０２９）協和醗酵工業株式会社 (276)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年９月２９日（２００５．９．２９）
【発行日】平成１９年８月９日（２００７．８．９）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００５２５１
【国際出願日】平成１７年３月２３日（２００５．３．２３）
【出願人】（０００００１０２９）協和醗酵工業株式会社 (276)
【Ｆターム（参考）】
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