被験試料による清涼感の評価方法
【課題】被験試料による清涼感を迅速かつ簡便な操作で評価することができる被験試料による清涼感の評価方法を提供すること。
【解決手段】被験試料を、ＴＲＰＭ８発現細胞およびＴＲＰＡ１発現細胞と接触させるか、またはＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞と接触させ、前記被験試料によりＴＲＰＭ８を介して引き起こされる生理学的事象および前記被験試料によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定する被験試料による清涼感の評価方法。
【解決手段】被験試料を、ＴＲＰＭ８発現細胞およびＴＲＰＡ１発現細胞と接触させるか、またはＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞と接触させ、前記被験試料によりＴＲＰＭ８を介して引き起こされる生理学的事象および前記被験試料によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定する被験試料による清涼感の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験試料による清涼感の評価方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、清涼化剤を含有する皮膚外用剤や頭髪外用剤など外用剤の開発、使用者に適した清涼感の強度を有する皮膚外用剤や頭髪外用剤などの外用剤の提供方法の開発などに有用な被験試料による清涼感の評価方法に関する。なお、本明細書において、被験試料とは、皮膚外用剤、頭髪外用剤などの外用剤に使用される成分であって、清涼感を調べる対象となる物質をいう。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの皮膚に用いられる化粧料などの皮膚外用剤や、ヒトの皮膚に接触することがある頭髪外用剤などには、必要により、爽快感や清涼感を付与するための清涼化剤が配合されている。前記清涼化剤としては、例えば、メントールやその誘導体などが挙げられる。
【０００３】
前記メントールやその誘導体は、ヒトの皮膚に接触したとき、その使用者に強い清涼感を与えることが知られている。ところが、使用者によっては、メントールやその誘導体が皮膚に接触したとき、痛みを感じることがある。
【０００４】
一方、近年、使用者の安全意識の高まりから、このような痛みを与えないか、または痛みが少ない外用剤が好まれる傾向にある。したがって、使用者に痛みを与えずに、清涼感を与える清涼化剤が求められている。
【０００５】
ところで、一過性受容体電位チャネル（以下、「ＴＲＰチャネル」という）は、痛みを惹起する因子を受容する受容体として機能することが知られている。例えば、ＴＲＰチャネルの１つであるＴＲＰＡ１を介した細胞内カルシウムイオン濃度の変化が、パラベン類やアルカリ剤が配合された皮膚外用剤を用いたときに引き起こされる不快な刺激と関連していることが、本発明者らによって見出されている。また、前記パラベン類やアルカリ剤による刺激と前記ＴＲＰＡ１を介した細胞内カルシウムイオン濃度の変化との関連性を利用して、パラベン類やアルカリ剤による刺激を抑制する物質を評価することが提案されている（例えば、特許文献１および２参照）。
【０００６】
しかしながら、本発明者らは、現時点では、メントールなどの清涼化剤による清涼感に伴う痛み刺激とＴＲＰＡ１との関連性や前記関連性を利用して、前記清涼化剤による清涼感を迅速かつ簡便な操作で評価する方法を具体的に記載した文献を発見していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−７９５２８号公報
【特許文献２】特開２００９−８２０５３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、被験試料による清涼感を迅速かつ簡便な操作で評価することができる被験試料による清涼感の評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち、本発明の要旨は、
（１） 被験試料を、ＴＲＰＭ８発現細胞およびＴＲＰＡ１発現細胞と接触させるか、またはＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞と接触させ、前記被験試料によりＴＲＰＭ８を介して引き起こされる生理学的事象および前記被験試料によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定することを特徴とする被験試料による清涼感の評価方法、
（２） 生理学的事象が、前記被験試料との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化である前記（１）に記載の評価方法、
（３） 前記被験試料との接触前後におけるＴＲＰＭ８を介して引き起こされる細胞内カルシウムイオン濃度の変化と、前記被験試料との接触前後におけるＴＲＰＡ１を介して引き起こされる細胞内カルシウムイオン濃度の変化との比を被験試料による清涼感の心地よさの指標として用い、前記被験試料によってヒトに与えられる清涼感の心地よさを評価する前記（１）または（２）に記載の評価方法、ならびに
（４） 前記被験試料との接触前後におけるＴＲＰＭ８を介して引き起こされる細胞内カルシウムイオン濃度の変化と、前記被験試料との接触前後におけるＴＲＰＡ１を介して引き起こされる細胞内カルシウムイオン濃度の変化との比を被験試料による清涼感の心地よさの指標として用い、前記被験試料による清涼感の心地よさごとに前記被験試料を分類する前記（１）または（２）に記載の評価方法
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の被験試料による清涼感の評価方法は、被験試料による清涼感を迅速かつ簡便な操作で評価することができるという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１において、試料とΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフである。
【図２】実施例１において、試料とΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフである。
【図３】実施例１において、試料と快適指標との関係を示すグラフである。
【図４】実施例２において、試料とΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフである。
【図５】実施例２において、試料とΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフである。
【図６】実施例２において、試料と快適指標との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の被験試料による清涼感の評価方法は、被験試料を、ＴＲＰＭ８発現細胞およびＴＲＰＡ１発現細胞と接触させるか、またはＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞と接触させ、前記被験試料によりＴＲＰＭ８を介して引き起こされる生理学的事象および前記被験試料によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定することを特徴とする。
【００１３】
本発明の被験試料による清涼感の評価方法には、被験試料によりＴＲＰＭ８を介して引き起こされる生理学的事象および被験試料によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定する点にも１つの大きな特徴がある。本発明の被験試料による清涼感の評価方法によれば、前記生理学的事象を測定するので、ヒト、実験動物などを用いる場合と比べて、迅速かつ簡便な操作で、被験試料によってヒトに与えられる清涼感を評価することができる。さらに、前記生理学的事象は、同一条件下に同時に何回も並行して測定することができるので、本発明の被験試料による清涼感の評価方法によれば、迅速かつ高い処理効率で多種類の被験試料による清涼感を評価することができる。
【００１４】
被験試料としては、清涼化剤、清涼化剤の候補物質、エッセンシャルオイルなどが挙げられる。
【００１５】
前記ＴＲＰＭ８発現細胞は、ＴＲＰＭ８の生理学的機能を発現する細胞である。前記ＴＲＰＭ８の生理学的機能としては、例えば、メントールによる化学刺激、冷覚刺激（例えば、８〜２８℃程度の刺激）などの刺激による細胞外から細胞内へのナトリウムイオン、カルシウムイオンなどの陽イオンの透過などが挙げられる。
【００１６】
前記ＴＲＰＭ８発現細胞としては、内因性ＴＲＰＭ８を発現している野生型の細胞、ＴＲＰＭ８をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞などが挙げられる。前記ＴＲＰＭ８発現細胞のなかでは、かかるＴＲＰＭ８を介して引き起こされる生理学的事象を簡便な操作で測定する観点から、ＴＲＰＭ８をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞（以下、「外因性ＴＲＰＭ８発現細胞」ともいう）が好ましい。
【００１７】
前記ＴＲＰＡ１発現細胞は、ＴＲＰＡ１の生理学的機能を発現する細胞である。前記ＴＲＰＡ１の生理学的機能としては、例えば、マスタード、シナモアルデヒド、アリルイソチオシアネート、カルバクロール、アリシンなどによる化学刺激、冷覚刺激（例えば、１７℃前後での刺激）、痛み刺激、機械刺激などの刺激による細胞外から細胞内へのナトリウムイオン、カルシウムイオンなどの陽イオンの透過などが挙げられる。
【００１８】
前記ＴＲＰＡ１発現細胞としては、内因性ＴＲＰＡ１を発現している野生型の細胞、ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞などが挙げられる。前記ＴＲＰＡ１発現細胞のなかでは、かかるＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を簡便な操作で測定する観点から、ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞（以下、「外因性ＴＲＰＡ１発現細胞」ともいう）が好ましい。
【００１９】
前記内因性ＴＲＰＭ８を発現している野生型の細胞としては、特に限定されないが、例えば、感覚神経の細胞、前立腺の細胞などが挙げられる。また、前記内因性ＴＲＰＡ１を発現している野生型の細胞としては、特に限定されないが、例えば、感覚神経の細胞、内耳の細胞などが挙げられる。
【００２０】
前記ＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞は、ＴＲＰＭ８をコードする核酸およびＴＲＰＡ１をコードする核酸がいずれも発現可能に宿主細胞に導入された細胞などが挙げられる。前記ＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞においては、ＴＲＰＭ８をコードする核酸およびＴＲＰＡ１をコードする核酸は、被験試料によりＴＲＰＭ８を介して引き起こされる生理学的事象および被験試料によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象をそれぞれ測定する観点から、それぞれ別々の発現プロモーターの制御下にあることが好ましい。発現プロモーターは、宿主細胞内でＴＲＰＭ８およびＴＲＰＡ１を発現させるのに適したプロモーターであればよい。発現プロモーターは、用いられる宿主細胞の種類に応じて適宜選択することができる。
【００２１】
前記外因性ＴＲＰＭ８発現細胞、外因性ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞は、染色体外要素として前記核酸が存在している細胞であってもよく、前記核酸が染色体に組み込まれている細胞であってもよい。
【００２２】
前記外因性ＴＲＰＭ８発現細胞は、ＴＲＰＭ８をコードする核酸を保持する組換えベクターにより宿主細胞を形質転換することによって得られる。また、前記外因性ＴＲＰＡ１発現細胞は、例えば、ＴＲＰＡ１をコードする核酸を保持する組換えベクターにより宿主細胞を形質転換することによって得られる。前記ＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞は、例えば、ＴＲＰＭ８をコードする核酸およびＴＲＰＡ１をコードする核酸を保持する組換えベクターにより宿主細胞を形質転換することによって得られる。
【００２３】
前記ＴＲＰＭ８をコードする核酸は、ヒトＴＲＰＭ８をコードする核酸であってもよく、他の動物のＴＲＰＭ８をコードする核酸であってもよい。また、前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、ヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸であってもよく、他の動物のＴＲＰＡ１をコードする核酸であってもよい。
【００２４】
前記ＴＲＰＭ８をコードする核酸は、ヒトに適用する被験試料を的確に評価する観点から、ヒトＴＲＰＭ８をコードする核酸であることが好ましい。前記ＴＲＰＭ８をコードする核酸としては、例えば、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸などが挙げられる。この配列番号：１に示される塩基配列は、アクセッション番号：ＮＭ＿０２４０８０．４としてＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒトＴＲＰＭ８をコードする核酸の塩基配列である。前記ＴＲＰＭ８をコードする核酸は、前記核酸によりコードされるポリペプチドが前記生理学的機能を発現するのであれば、ＴＲＰＭ８の構造遺伝子の塩基配列の内部または末端に、１または数個のヌクレオチド残基の置換、欠失または挿入を有する変異型核酸であってもよい。
【００２５】
また、前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、ヒトに適用する被験試料を的確に評価する観点から、ヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸であることが好ましい。前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸としては、例えば、配列番号：３に示される塩基配列からなる核酸などが挙げられる。この配列番号：３に示される塩基配列は、アクセッション番号：ＮＭ＿００７３３２としてＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸の塩基配列である。前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、前記核酸によりコードされるポリペプチドが前記生理学的機能を発現するのであれば、ＴＲＰＡ１の構造遺伝子の塩基配列の内部または末端に、１または数個のヌクレオチド残基の置換、欠失または挿入を有する変異型核酸であってもよい。
【００２６】
ＴＲＰＭ８をコードする核酸の変異型核酸としては、例えば、
（Ａ）配列番号：１に示される塩基配列に対して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ １１、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ １、ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ １１の条件でアライメントして算出される配列相同性の値が、それぞれの生理学的機能を十分に発揮させる観点から、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上である塩基配列からなり、かつコードされるポリペプチドが少なくとも前記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸、
（Ｂ）配列番号：２において、１個または数個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列をコードし、コードされるポリペプチドが少なくとも陽イオンを透過させる機能を発現するポリペプチドである核酸、
（Ｃ）ストリンジェントな条件下で、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸に対する相補鎖核酸とハイブリダイズし、コードされるポリペプチドが、陽イオンを透過させる機能を発現するポリペプチドである核酸
などが挙げられる。
【００２７】
また、ＴＲＰＡ１をコードする核酸の変異型核酸としては、例えば、
（ａ）配列番号：３に示される塩基配列に対して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ １１、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ １、ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ １１の条件でアライメントして算出される配列相同性の値が、それぞれの生理学的機能を十分に発揮させる観点から、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上である塩基配列からなり、かつコードされるポリペプチドが少なくとも前記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸、
（ｂ）配列番号：４において、１個または数個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列をコードし、コードされるポリペプチドが少なくとも前記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸、
（ｃ）ストリンジェントな条件下で、配列番号：３に示される塩基配列からなる核酸に対する相補鎖核酸とハイブリダイズし、コードされるポリペプチドが、前記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸
などが挙げられる。
【００２８】
なお、本明細書において、前記ストリンジェントな条件としては、例えば、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸または配列番号：３に示される塩基配列からなる核酸と前記核酸に対応するハイブリダイゼーション対象の核酸とを、ハイブリダイゼーション用溶液〔組成：６×ＳＳＣ（組成：０．９Ｍ塩化ナトリウム、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０に調整）、０．５質量％ドデシル硫酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、１００μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡ、５０体積％ホルムアミド〕中で、室温以上の温度、よりストリンジェントな条件として４２℃以上の温度、さらにストリンジェントな条件として６０℃以上の温度で１０時間インキュベーションし、つぎに、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントな条件として０．１×ＳＳＣのイオン強度条件下で、かつ室温以上の温度、よりストリンジェントな条件として４２℃以上の温度、さらにストリンジェントな条件として６０℃以上の温度で洗浄を行なう条件などが挙げられる。
【００２９】
前記ＴＲＰＭ８をコードする核酸は、例えば、配列番号：１に示される塩基配列に基づいて作成されたプローブを用いるハイブリダイゼーション法、配列番号：１に示される塩基配列に基づいて設計され、合成された２種類のオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマー対を用いる核酸増幅法などによって得られる。前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、例えば、配列番号：３に示される塩基配列に基づいて作成されたプローブを用いるハイブリダイゼーション法、配列番号：１に示される塩基配列に基づいて設計され、合成された２種類のオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマー対を用いる核酸増幅法などによって得られる。
【００３０】
前記宿主細胞としては、前記ＴＲＰＭ８をコードする核酸および／またはＴＲＰＡ１をコードする核酸が効率よく発現され、かつ培養が容易なものであればよく、特に限定されないが、例えば、動物細胞、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。これらのなかでは、ヒトにおけるＴＲＰＭ８および／またはＴＲＰＡ１の生理学的機能を十分に再現する観点から、動物細胞であることが好ましい。動物細胞としては、例えば、ヒト細胞、サル細胞、マウス細胞などが挙げられる。ヒト細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞などが挙げられる。サル細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＣＯＳ−７細胞などが挙げられる。マウス細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などが挙げられる。前記宿主細胞のなかでは、取扱いが容易である観点から、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞が好ましい。これらのなかでは、ＴＲＰチャネルがほとんど発現しておらず、外因性のＴＲＰＭ８および／またはＴＲＰＡ１の活性化を容易にかつ選択的に測定することができる観点から、ＨＥＫ２９３細胞が好ましい。
【００３１】
前記組換えベクターは、ＴＲＰＭ８をコードする核酸および／またはＴＲＰＡ１をコードする核酸と慣用のベクターとを連結させることによって得られるベクターである。前記ベクターは、その調製が容易であり、効率よく宿主細胞に導入することができ、かつ宿主細胞内でＴＲＰＭ８および／またはＴＲＰＡ１を効率よく発現させることができるベクターであればよい。前記ベクターは、形質転換後に、組換えベクターを保持する細胞を容易に選択する観点から、選択マーカー遺伝子を有するベクターであることが好ましい。ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターなどが挙げられる。これらのベクターは、用いられる宿主細胞に応じて適宜選択することができる。なお、前記外因性ＴＲＰＭ８発現細胞および外因性ＴＲＰＡ１発現細胞を作製するための組換えベクターに用いられるベクターは、発現プロモーターを有していてもよい。
【００３２】
前記組換えベクターを用いた形質転換は、用いられる宿主細胞の種類に応じて、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、トランスフェクション法、パーティクルガン法などの形質転換方法によって行なうことができる。これらの形質転換方法は、例えば、モレキュラー クローニング：ア ラボラトリー マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）〔ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、コールド スプリング ハーバー プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年発行〕などの記載に準じて行なうことができる。形質転換後の細胞からの外因性ＴＲＰＭ８発現細胞、外因性ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞の選択は、例えば、用いられた組換えベクターが選択マーカー遺伝子を有する場合、選択マーカー遺伝子に応じた選択培地で培養することなどによって行なうことができる。
【００３３】
得られた細胞が、ＴＲＰＭ８を発現している細胞であることの確認は、例えば、細胞を１ｍＭメントールと接触させ、後述の細胞内カルシウムイオン濃度の測定方法により、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を測定することによって行なうことができる。細胞がＴＲＰＭ８を発現している場合、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度は、メントールと接触させていない細胞の細胞内カルシウムイオン濃度よりも高くなる。得られた細胞が、ＴＲＰＡ１を発現している細胞であることの確認は、例えば、細胞を１〜１０ｍＭパラオキシ安息香酸メチルエステルと接触させ、後述の細胞内カルシウムイオン濃度の測定方法により、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を測定することによって行なうことができる。細胞がＴＲＰＡ１を発現している場合、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度は、パラオキシ安息香酸メチルエステルと接触させていない細胞の細胞内カルシウムイオン濃度よりも高くなる。
【００３４】
被験試料と、ＴＲＰＭ８発現細胞およびＴＲＰＡ１発現細胞またはＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞との接触は、例えば、各細胞の培養に適した培地中で、被験試料と、ＴＲＰＭ８発現細胞およびＴＲＰＡ１発現細胞またはＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞とをインキュベーションすること、被験試料と、ＴＲＰＭ８発現細胞およびＴＲＰＡ１発現細胞またはＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞との混合物をインキュベーションすることなどによって行なわれる。なお、ＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞を用いる場合、被験試料によりＴＲＰＭ８を介して引き起こされる生理学的事象および被験試料によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象それぞれを測定するタイミングに合わせて、ＴＲＰＭ８およびＴＲＰＡをそれぞれ別々に発現させるようにする。
【００３５】
前記培地としては、ＴＲＰＭ８発現細胞、ＴＲＰＡ１発現細胞またはＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞が生育するのに適した成分〔例えば、グルコース、アミノ酸、ペプトン、ビタミン、細胞増殖促進因子（例えば、細胞成長因子、ホルモン、結合タンパク質、細胞接着因子、脂質など）、血清（例えば、ウシ胎仔血清など）、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなど〕を含む培地であればよい。前記培地は、慣用の基本培地に前記成分を補った培地であってもよく、市販されている培地であってもよい。基本培地としては、特に限定されないが、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ １６４０培地などが挙げられる。かかる培地は、細胞の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、用いられる細胞がＨＥＫ２９３細胞から得られた細胞である場合、培地として、１０質量％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地などが用いられる。
【００３６】
被験試料に接触させるＴＲＰＭ８発現細胞、ＴＲＰＡ１発現細胞またはＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞の量は、試験データの信頼性の観点から、被験試料１００μＬあたり、それぞれ１×１０1細胞以上が好ましく、１×１０2細胞以上がより好ましく、細胞の間隔を確保し、細胞が密になりすぎないようにする観点から、３×１０２細胞以下が好ましく、２×１０２細胞以下がより好ましい。
【００３７】
前記ＴＲＰＭ８発現細胞、ＴＲＰＡ１発現細胞またはＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞にそれぞれ接触させる被験試料の量は、被験試料の種類によって異なるため、一概に決定することができないことから、被験試料の種類に応じて適宜設定することができる。
【００３８】
なお、ＴＲＰＭ８発現細胞、ＴＲＰＡ１発現細胞またはＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞は、それぞれ、前記生理学的事象を測定するのに適した状態に細胞を維持するために、必要に応じて、ＴＲＰＭ８発現細胞、ＴＲＰＡ１発現細胞またはＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞を、各細胞に適した条件下で、予めインキュベーションしておいてもよい。
【００３９】
前記インキュベーションは、用いられる細胞の種類に応じた方法によって行なうことができる。かかる方法としては、例えば、単層静置培養法、浮遊培養法、回転培養法、三次元担体培養法などが挙げられる。また、インキュベーション温度、インキュベーション時間、二酸化炭素濃度などの条件は、用いられる細胞に応じて適宜設定される。例えば、ＴＲＰＭ８発現細胞、ＴＲＰＡ１発現細胞またはＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞として、ＨＥＫ２９３細胞から得られた細胞を用いる場合、かかる細胞は、前記生理学的事象を測定するのに適した状態に細胞を維持する観点から、通常、５体積％二酸化炭素を含む雰囲気中で、３６〜３８℃、好ましくは３６．５〜３７．５℃でインキュベーションすればよい。
【００４０】
前記生理学的事象としては、被験試料との接触前後の一定電位下での電流の変化、被験試料との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化、これらの組み合わせなどが挙げられる。本発明においては、簡便な操作で、かつ高感度で測定することができる観点から、前記生理学的事象は、被験試料との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化であることが好ましい。
【００４１】
前記一定の電位での電流の測定方法としては、例えば、パッチクランプ法などが挙げられる。
【００４２】
細胞内カルシウムイオン濃度は、例えば、カルシウムキレート化剤に基づく蛍光試薬（以下、「蛍光カルシウム指示薬」ともいう）をＴＲＰＭ８発現細胞、ＴＲＰＡ１発現細胞またはＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞に導入し、細胞内のカルシウムイオンに前記蛍光カルシウム指示薬を結合させ、カルシウムイオンと結合した蛍光カルシウム指示薬の蛍光強度を調べる方法などを用いて算出することができる。この場合、被験試料との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化は、ＴＲＰＭ８のアゴニストまたはＴＲＰＡ１のアゴニストと接触させたときの細胞内カルシウムイオン濃度に対する被験試料と接触させたときの細胞内カルシウムイオン濃度の変化を求めることによって調べることができる。
【００４３】
ＴＲＰＭ８のアゴニストおよびＴＲＰＡ１のアゴニストは、同一の物質であってもよく、異なる物質であってもよい。前記ＴＲＰＭ８およびＴＲＰＡ１両方のアゴニストとして、例えば、メントールなどを用いることができる。
【００４４】
前記蛍光カルシウム指示薬としては、例えば、カルシウムイオンと結合した当該蛍光カルシウム指示薬の量によってその蛍光特性が変化する試薬であればよく、特に限定されないが、例えば、ＦＵＲＡ ２、ＦＵＲＡ ２−ＡＭ、Ｆｌｕｏ−３などが挙げられる。
【００４５】
なお、蛍光カルシウム指示薬が２種類の励起波長を有する場合、より精度を高める観点から、各励起波長における蛍光強度から蛍光強度比を算出することが好ましい。例えば、蛍光カルシウム指示薬であるＦＵＲＡ ２−ＡＭの励起波長は、３４０ｎｍおよび３８０ｎｍである。この場合、前記ＴＲＰＭ８のアゴニストまたはＴＲＰＡ１のアゴニストと接触させたときの細胞内カルシウムイオン濃度に対する被験試料と接触させたときの細胞内カルシウムイオン濃度の変化は、Δ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストを算出することにより調べることができる。
【００４６】
前記Δ蛍光強度比試料は、式（Ｉ）：
【００４７】
【数１】
【００４８】
に基づいて算出することができる。また、前記Δ蛍光強度比アゴニストは、式（ＩＩ）：
【００４９】
【数２】
に基づいて算出することができる。なお、本明細書において、「蛍光強度340nm」は励起波長３４０ｎｍにおける蛍光強度を示し、「蛍光強度380nm」は励起波長３８０ｎｍにおける蛍光強度を示す。
【００５０】
また、生理学的事象として被験試料との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化を用いる場合、被験試料による清涼感は、前記被験試料との接触前後におけるＴＲＰＭ８を介して引き起こされる細胞内カルシウムイオン濃度の変化と、前記被験試料との接触前後におけるＴＲＰＡ１を介して引き起こされる細胞内カルシウムイオン濃度の変化との比を指標（以下、「快適指標」という）として用いることにより評価することができる。前記快適指標は、例えば、式（ＩＩＩ）：
【００５１】
【数３】
【００５２】
に基づいて算出することができる。この場合、被験試料の快適指標が１よりも高い場合、当該被験試料による冷感が、アゴニストよりも痛みの少ない冷感であると考えられる。したがって、被験試料の快適指標が１よりも高い場合、前記被験試料による清涼感の心地よさがアゴニストと比べて高い可能性があるという判断をすることができる。一方、被験試料の快適指標が１以下である場合、当該被験試料による冷感がアゴニストによる冷感よりも小さく、かつ当該被験試料による痛み感覚がアゴニストによる痛み感覚と同等であるか、またはアゴニストによる痛み感覚よりも大きいと考えられる。したがって、被験試料の快適指標が１以下である場合、前記被験試料による清涼感の心地よさがアゴニストと同等以下である可能性があるという判断をすることができる。
【００５３】
以上説明したように、本発明の被験試料による清涼感の評価方法によれば、前記被験試料によりＴＲＰＭ８を介して引き起こされる生理学的事象および前記被験試料によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象により、ヒトの皮膚に対する清涼感を評価することができる。したがって、本発明の被験試料による清涼感の評価方法は、皮膚外用剤や頭髪外用剤などの外用剤に適した清涼化剤のスクリーニング、清涼化剤を含有する皮膚外用剤や頭髪外用剤などの外用剤の開発、使用者に適した清涼感の強度を有する皮膚外用剤や頭髪外用剤などの外用剤の提供方法の開発などに利用することができる。
【実施例】
【００５４】
つぎに、実施例によって本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。
【００５５】
（製造例１）
ヒトＴＲＰＭ８をコードするｃＤＮＡ〔配列番号：１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０２４０８０．４）に示される塩基配列の４１位〜３３５５位のポリヌクレオチド〕を、哺乳動物細胞用ベクター〔インビトロジェン社製、商品名：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）〕のクローニングサイトに挿入し、ヒトＴＲＰＭ８発現ベクターを得た。得られたヒトＴＲＰＭ８発現ベクター１μｇと、遺伝子導入用試薬〔インビトロジェン社製、商品名：ＰＬＵＳ Ｒｅａｇｅｎｔ（プラスリージェント）、カタログ番号：１１５１４−０１５〕６μｌとを混合し、混合物Ｉを得た。また、遺伝子導入用カチオン性脂質〔インビトロジェン社製、商品名：リポフェクタミン（登録商標）、カタログ番号：１８３２４−０１２〕４μｌと、血清使用量低減培地〔インビトロジェン社製、商品名：ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（カタログ番号：１１０５８０２１）２００μｌとを混合し、混合物ＩＩを得た。
【００５６】
また、５体積％二酸化炭素の雰囲気中、３７℃に維持された直径３５ｍｍのシャーレ上の１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中において、５×１０５細胞のＨＥＫ２９３細胞を７０％のコンフルエンシーになるまで培養した。
【００５７】
得られた細胞培養物に、前記混合物Ｉと混合物ＩＩとを添加することにより、ＨＥＫ２９３細胞に前記ヒトＴＲＰＭ８発現ベクターを導入し、ＴＲＰＭ８発現細胞を得た。
【００５８】
（製造例２）
製造例１において、ヒトＴＲＰＭ８をコードするｃＤＮＡの代わりにヒトＴＲＰＡ１をコードするｃＤＮＡ〔配列番号：１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００７３３２）に示される塩基配列の６３位〜３８８８位のポリヌクレオチド〕を用いたことを除き、製造例１と同様にしてＴＲＰＡ１発現細胞を得た。
（実験例１）
製造例２で得られたＴＲＰＡ１発現細胞を、細胞内カルシウムイオン測定用試薬であるＦＵＲＡ ２−ＡＭ（インビトロジェン社製）を最終濃度５μＭで含む１０質量％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地中、室温で６０分間インキュベーションすることにより、前記ＴＲＰＡ１発現細胞にＦＵＲＡ ２−ＡＭを導入し、ＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞を得た。
【００５９】
得られたＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞を循環定温チャンバー付蛍光測定装置〔浜松ホトニクス（株）製、商品名：ＡＲＧＵＳ−５０〕の各チャンバーに入れた。その後、チャンバー中のＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞を、溶媒Ａ〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭヘペス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）〕で洗浄した。
【００６０】
つぎに、洗浄後のＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞が入ったチャンバーに１ｍＭメントールを含有する溶媒Ａを入れ、ＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞と１ｍＭメントールを含有する溶媒Ａとを混合した。
【００６１】
その後、チャンバーにおいて、励起波長３４０ｎｍにおけるＴＲＰＡ１発現細胞に導入され、かつ細胞内のカルシウムイオンに結合したＦＵＲＡ ２−ＡＭに基づく蛍光の強度（以下、「蛍光強度340nm」という）および励起波長３８０ｎｍにおけるＴＲＰＡ１発現細胞に導入されたＦＵＲＡ ２−ＡＭに基づく蛍光の強度（以下、「蛍光強度380nm」という）を測定した。
【００６２】
測定された蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmから、蛍光強度比メントールを算出した。前記蛍光強度比メントールは、下記式（ＩＶ）：
【００６３】
【数４】
【００６４】
に基づいて算出した。
【００６５】
また、前記１ｍＭメントールを含有する溶媒Ａの代わりに溶媒Ａを用いたことを除き、前記被験試料を用いた場合と同様にして蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmを測定した。
【００６６】
測定された蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmから、蛍光強度比溶媒Ａを算出した。前記蛍光強度比溶媒Ａは、下記式（Ｖ）：
【００６７】
【数５】
【００６８】
に基づいて算出した。
【００６９】
その結果、蛍光強度比メントールは、１．８０であった。また、蛍光強度比溶媒Ａは、０．８７であった。これらの結果から、１ｍＭメントールを含有する溶媒Ａを用いた場合、溶媒Ａを用いた場合と比べて、ＴＲＰＡ１発現細胞の細胞内カルシウムイオン濃度が増加していることがわかる。
【００７０】
ＴＲＰＡ１の活性化は、パラベン類やアルコールによる痛み感覚と関連していると考えられている。したがって、以上の結果から、ＴＲＰＡ１がメントールによっても活性化されるので、メントールにより皮膚に与えられる感覚のうちの痛み感覚は、ＴＲＰＡ１の活性化によって引き起こされていることが示唆される。
【００７１】
（実施例１）
（１）ＴＲＰＭ８発現細胞による評価
製造例１で得られたＴＲＰＭ８発現細胞を、細胞内カルシウムイオン測定用試薬であるＦＵＲＡ ２−ＡＭ（インビトロジェン社製）を最終濃度５μＭで含む１０質量％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地中、室温で６０分間インキュベーションすることにより、前記ＴＲＰＭ８発現細胞にＦＵＲＡ ２−ＡＭを導入し、ＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＭ８発現細胞を得た。
【００７２】
得られたＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＭ８発現細胞を循環定温チャンバー付蛍光測定装置〔浜松ホトニクス（株）製、商品名：ＡＲＧＵＳ−５０〕の各チャンバーに入れた。その後、チャンバー中のＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞を、溶媒Ａ〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭヘペス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）〕で洗浄した。
【００７３】
つぎに、洗浄後のＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＭ８発現細胞が入ったチャンバーに被験試料を入れ、ＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＭ８発現細胞と被験試料とを混合した。なお、前記被験試料として、１ｍＭシネオールを含有する溶媒Ａ、１ｍＭカルボンを含有する溶媒Ａ、１ｍＭメントンを含有する溶媒Ａ、１ｍＭシトロネラールを含有する溶媒Ａ、１ｍＭシトラールを含有する溶媒Ａ、１ｍＭリナロールを含有する溶媒Ａ、１ｍＭテルピネオールを含有する溶媒Ａ、１ｍＭシメンを含有する溶媒Ａ、１ｍＭオイゲノールを含有する溶媒Ａ、１ｍＭリモネンを含有する溶媒Ａ、１ｍＭ（＋）−ピネンを含有する溶媒Ａ、１ｍＭ（−）−ピネンを含有する溶媒Ａまたは１ｍＭアネトールを含有する溶媒Ａを用いた。これらの被験試料は、一般的に清涼化剤またはアロマテラピーに用いられている香油に含まれる成分である。
【００７４】
その後、チャンバーにおいて、励起波長３４０ｎｍにおけるＴＲＰＡ１発現細胞に導入され、かつ細胞内のカルシウムイオンに結合したＦＵＲＡ ２−ＡＭに基づく蛍光の強度（以下、「蛍光強度340nm」という）および励起波長３８０ｎｍにおけるＴＲＰＭ８発現細胞に導入されたＦＵＲＡ ２−ＡＭに基づく蛍光の強度（以下、「蛍光強度380nm」という）を測定した。
【００７５】
測定された蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmから、Δ蛍光強度比試料を算出した。前記Δ蛍光強度比試料は、式（Ｉ）：
【００７６】
【数６】
【００７７】
に基づいて算出した。なお、前記対照は、溶媒Ａである。
【００７８】
また、前記被験試料の代わりにＴＲＰＭ８のアゴニストを用いたことを除き、前記被験試料を用いた場合と同様にして蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmを測定した。なお、前記アゴニストとして、１ｍＭメントールを含有する溶媒Ａを用いた。
【００７９】
測定された蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmから、Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。前記Δ蛍光強度比アゴニストは、式（ＩＩ）：
【００８０】
【数７】
【００８１】
に基づいて算出した。
【００８２】
算出されたΔ蛍光強度比試料とΔ蛍光強度比アゴニストとから、ＴＲＰＭ８発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。
【００８３】
実施例１において、試料とΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフを図１に示す。
【００８４】
図１において、試料番号１は１ｍＭシネオールを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号２は１ｍＭカルボンを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号３は１ｍＭメントンを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号４は１ｍＭシトロネラールを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号５は１ｍＭシトラールを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号６は１ｍＭリナロールを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号７は１ｍＭテルピネオールを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号８は１ｍＭシメンを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号９は１ｍＭオイゲノールを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号１０は１ｍＭリモネンを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号１１は１ｍＭ（＋）−ピネンを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号１２は１ｍＭ（−）−ピネンを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストおよび試料番号１３は１ｍＭアネトールを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストを示す。
【００８５】
図１に示された結果から、１ｍＭシネオールを含有する溶媒Ａ（試料番号１）、１ｍＭメントンを含有する溶媒Ａ（試料番号３）および１ｍＭオイゲノールを含有する溶媒Ａ（試料番号６）それぞれを用いた場合、Δ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストが０．３〜０．６であることがわかる。これらの結果から、シネオール、メントンおよびオイゲノールは、メントールよりもＴＲＰＭ８の活性化能が低いことがわかる。
【００８６】
また、前記結果から、１ｍＭシネオールを含有する溶媒Ａ（試料番号１）、１ｍＭメントンを含有する溶媒Ａ（試料番号３）および１ｍＭオイゲノールを含有する溶媒Ａ（試料番号６）それぞれを用いた場合、他の試料を用いた場合と比べてΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストが大きいことがわかる。したがって、これらの結果から、シネオール、メントンおよびオイゲノールは、カルボン、シトロネラール、シトラール、リナロール、テルピネオール、シメン、リモネン、（＋）−ピネン、（−）−ピネンおよびアネトールよりもＴＲＰＭ８の活性化能が高いことがわかる。
【００８７】
（２）ＴＲＰＡ１発現細胞による評価
前記（１）において、製造例１で得られたＴＲＰＭ８発現細胞の代わりに製造例２で得られたＴＲＰＡ１発現細胞を用いたことを除き、前記（１）と同様にして、ＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。
【００８８】
実施例１において、試料とΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフを図２に示す。
【００８９】
図２において、試料番号１は１ｍＭシネオールを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号２は１ｍＭカルボンを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号３は１ｍＭメントンを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号４は１ｍＭシトロネラールを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号５は１ｍＭシトラールを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号６は１ｍＭリナロールを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号７は１ｍＭテルピネオールを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号８は１ｍＭシメンを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号９は１ｍＭオイゲノールを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号１０は１ｍＭリモネンを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号１１は１ｍＭ（＋）−ピネンを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号１２は１ｍＭ（−）−ピネンを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストおよび試料番号１３は１ｍＭアネトールを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストを示す。
【００９０】
図２に示された結果から、１ｍＭシトラールを含有する溶媒Ａ（試料番号５）および１ｍＭオイゲノールを含有する溶媒Ａ（試料番号９）それぞれを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストが１を超えていることがわかる。したがって、前記結果から、シトラールおよびオイゲノールは、メントールよりもＴＲＰＡ１の活性化能が高いことが示唆される。
【００９１】
これに対して、図２に示された結果から、１ｍＭシネオールを含有する溶媒Ａ（試料番号１）、１ｍＭカルボンを含有する溶媒Ａ（試料番号２）、１ｍＭメントンを含有する溶媒Ａ（試料番号３）、１ｍＭシトロネラールを含有する溶媒Ａ（試料番号４）、１ｍＭリナロールを含有する溶媒Ａ（試料番号６）、１ｍＭテルピネオールを含有する溶媒Ａ（試料番号７）、１ｍＭシメンを含有する溶媒Ａ（試料番号８）、１ｍＭリモネンを含有する溶媒Ａ（試料番号１０）、１ｍＭ（＋）−ピネンを含有する溶媒Ａ（試料番号１１）、１ｍＭ（−）−ピネンを含有する溶媒Ａ（試料番号１２）および１ｍＭアネトールを含有する溶媒Ａ（試料番号１３）それぞれを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストが１未満であることがわかる。したがって、前記結果から、カルボン、メントン、シトロネラール、リナロール、テルピネオール、シメン、リモネン、（＋）−ピネン、（−）−ピネンおよびアネトールは、メントールよりもＴＲＰＡ１の活性化能が低いことが示唆される。
【００９２】
（３）被験試料によるＴＲＰＭ８およびＴＲＰＡ１それぞれの活性化能に基づく清涼感の心地よさの評価
実験例１の結果から、メントールによりＴＲＰＡ１が活性化されるので、メントールにより皮膚に与えられる感覚のうちの痛み感覚が、ＴＲＰＡ１の活性化によって引き起こされていることが示唆される。また、ＴＲＰＭ８は、メントールによって活性化される一方、８〜２８℃程度の冷刺激によっても活性化する。したがって、ＴＲＰＭ８は、メントールによってヒトの皮膚にもたらされる感覚のうち特に冷感と関連していると考えられる。
【００９３】
そこで、前記（１）で測定したＴＲＰＭ８発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料およびΔ蛍光強度比アゴニストと、前記（２）で測定したＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料およびΔ蛍光強度比アゴニストとに基づいて、被験試料による清涼感の心地よさの評価を行なった。
【００９４】
前記（１）で測定したＴＲＰＭ８発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料およびΔ蛍光強度比アゴニストと、前記（２）で測定したＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料およびΔ蛍光強度比アゴニストとから、被験試料によるＴＲＰＭ８の活性化能と被験試料によるＴＲＰＡ１の活性化能との比を算出した。以下、前記比を「快適指標」として用いた。かかる快適指標は、式（ＩＩＩ）：
【００９５】
【数８】
【００９６】
に基づいて算出した。
【００９７】
ここで、被験試料の快適指標が１よりも高い場合、当該被験試料による冷感がメントールによる冷感よりも痛みの少ない冷感であると考えられる。したがって、被験試料の快適指標が１よりも高い場合、前記被験試料による清涼感の心地よさがメントールと比べて高い可能性があるという判断をすることができる。
【００９８】
一方、被験試料の快適指標が１以下である場合、当該被験試料による冷感がメントールによる冷感よりも小さく、かつ当該被験試料による痛み感覚がメントールによる痛み感覚と同等であるか、またはメントールによる痛み感覚よりも大きいと考えられる。したがって、被験試料の快適指標が１以下である場合、前記被験試料による清涼感の心地よさがメントールと同等以下である可能性があるという判断をすることができる。
【００９９】
実施例１において、試料と快適指標との関係を示すグラフを図３に示す。なお、図中、快適指標＝１の破線は、メントールの快適指標を示す。
【０１００】
図３において、試料番号１は１ｍＭシネオールを含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標、試料番号２は１ｍＭカルボンを含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標、試料番号３は１ｍＭメントンを含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標、試料番号４は１ｍＭシトロネラールを含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標、試料番号５は１ｍＭシトラールを含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標、試料番号６は１ｍＭリナロールを含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標、試料番号７は１ｍＭテルピネオールを含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標、試料番号８は１ｍＭシメンを含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標、試料番号９は１ｍＭオイゲノールを含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標、試料番号１０は１ｍＭリモネンを含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標、試料番号１１は１ｍＭ（＋）−ピネンを含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標、試料番号１２は１ｍＭ（−）−ピネンを含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標および試料番号１３は１ｍＭアネトールを含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標を示す。
【０１０１】
図３に示された結果から、１ｍＭシネオールを含有する溶媒Ａ（試料番号５）を用いた場合の快適指標が１を超えていることがわかる。したがって、前記結果から、シネオールの清涼感の心地よさがメントールの清涼感の心地よさと比べて高い可能性があることが示唆される。
【０１０２】
これに対して、図３に示された結果から、１ｍＭメントンを含有する溶媒Ａ（試料番号３）および１ｍＭオイゲノールを含有する溶媒Ａ（試料番号９）それぞれを用いた場合の快適指標が１未満であることがわかる。したがって、前記結果から、メントンおよびオイゲノールそれぞれの清涼感の心地よさがメントールの清涼感の心地よさよりも低い可能性があることが示唆される。
【０１０３】
これらの結果から、ＴＲＰＭ８発現細胞およびＴＲＰＡ１発現細胞の両方を用いて、被験試料によりＴＲＰＭ８を介して引き起こされる生理学的事象と、被験試料によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象とを測定し、被験試料によるＴＲＰＭ８およびＴＲＰＡ１それぞれの活性化能を調べることにより、被験試料による清涼感の心地よさを評価することができることが示唆される。
【０１０４】
（実施例２）
（１）ＴＲＰＭ８発現細胞による評価
実施例１の（１）において、被験試料として、０．０１体積％ペパーミント油を含有する溶媒Ａ（試料番号１）、０．０１体積％スペアミント油を含有する溶媒Ａ（試料番号２）、０．０１体積％ユーカリ油〔（株）永廣堂本店製、ユーカリ油〕を含有する溶媒Ａ（試料番号３）、０．０１体積％タイム油を含有する溶媒Ａ（試料番号４）、０．０１体積％クローブ油を含有する溶媒Ａ（試料番号５）、０．０１体積％ラベンダー油を含有する溶媒Ａ（試料番号６）、０．０１体積％セージ油を含有する溶媒Ａ（試料番号７）、０．０１体積％ユーカリ油〔小川香料（株）製、ユーカリ油〕を含有する溶媒Ａ（試料番号８）または０．０１体積％ローマカミツレ油を含有する溶媒Ａ（試料番号９）を用いたことを除き、実施例１の（１）と同様にしてＴＲＰＭ８発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。なお、これらの被験試料は、香油の含有成分の水溶液である。
【０１０５】
実施例２において、試料とΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフを図４に示す。
【０１０６】
図４において、試料番号１は０．０１体積％ペパーミント油を含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号２は０．０１体積％スペアミント油を含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号３は０．０１体積％ユーカリ油〔（株）永廣堂本店製、ユーカリ油〕を含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号４は０．０１体積％タイム油を含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号５は０．０１体積％クローブ油を含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号６は０．０１体積％ラベンダー油を含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号７は０．０１体積％セージ油を含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号８は０．０１体積％ユーカリ油〔小川香料（株）製、ユーカリ油〕を含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストおよび試料番号９は０．０１体積％ローマカミツレ油を含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストを示す。
【０１０７】
図４に示された結果から、０．０１体積％ペパーミント油を含有する溶媒Ａ（試料番号１）、０．０１体積％タイム油を含有する溶媒Ａ（試料番号４）、０．０１体積％クローブ油を含有する溶媒Ａ（試料番号５）および０．０１体積％ユーカリ油〔小川香料（株）製、ユーカリ油〕を含有する溶媒Ａ（（試料番号８）それぞれを用いた場合、Δ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストが０．１以上１未満であることがわかる。これらの結果から、ペパーミント油、タイム油、クローブ油およびユーカリ油〔小川香料（株）製、ユーカリ油〕は、メントールよりもＴＲＰＭ８の活性化能が低いことがわかる。
【０１０８】
また、前記結果から、０．０１体積％ペパーミント油を含有する溶媒Ａ（試料番号１）、０．０１体積％タイム油を含有する溶媒Ａ（試料番号４）、０．０１体積％クローブ油を含有する溶媒Ａ（試料番号５）および０．０１体積％ユーカリ油〔小川香料（株）製、ユーカリ油〕を含有する溶媒Ａ（試料番号８）それぞれを用いた場合、他の試料を用いた場合と比べてΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストが大きいことがわかる。したがって、これらの結果から、ペパーミント油、タイム油、クローブ油およびユーカリ油〔小川香料（株）製、ユーカリ油〕は、スペアミント油を含有する溶媒Ａ、ユーカリ油〔（株）永廣堂本店製、ユーカリ油〕、ラベンダー油を含有する溶媒Ａ、セージ油を含有する溶媒Ａおよびローマカミツレ油を含有する溶媒ＡよりもＴＲＰＭ８の活性化能が高いことがわかる。
【０１０９】
（２）ＴＲＰＡ１発現細胞による評価
実施例１の（２）において、被験試料として、本実施例２の前記（１）で用いた被験試料を用いたことを除き、実施例１の（２）と同様にしてＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。
【０１１０】
実施例２において、試料とΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフを図５に示す。
【０１１１】
図５において、試料番号１は０．０１体積％ペパーミント油を含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号２は０．０１体積％スペアミント油を含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号３は０．０１体積％ユーカリ油〔（株）永廣堂本店製、ユーカリ油〕を含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号４は０．０１体積％タイム油を含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号５は０．０１体積％クローブ油を含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号６は０．０１体積％ラベンダー油を含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号７は０．０１体積％セージ油を含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号８は０．０１体積％ユーカリ油〔小川香料（株）製、ユーカリ油〕含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストおよび試料番号９は０．０１体積％ローマカミツレ油を含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストを示す。
【０１１２】
図５に示された結果から、０．０１体積％ペパーミント油を含有する溶媒Ａ（試料番号１）および０．０１体積％タイム油を含有する溶媒Ａ（試料番号４）それぞれを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストが１を超えていることがわかる。したがって、前記結果から、ペパーミント油およびタイム油は、メントールよりもＴＲＰＡ１の活性化能が高いことが示唆される。
【０１１３】
これに対して、図５に示された結果から、０．０１体積％スペアミント油を含有する溶媒Ａ（試料番号２）、０．０１体積％ユーカリ油〔（株）永廣堂本店製、ユーカリ油〕を含有する溶媒Ａ（試料番号３）、０．０１体積％クローブ油を含有する溶媒Ａ（試料番号５）、０．０１体積％ラベンダー油を含有する溶媒Ａ（試料番号６）、０．０１体積％セージ油を含有する溶媒Ａ（試料番号７）、０．０１体積％ユーカリ油〔小川香料（株）製、ユーカリ油〕を含有する溶媒Ａ（試料番号８）および０．０１体積％ローマカミツレ油を含有する溶媒Ａ（試料番号９）それぞれを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストが１未満であることがわかる。したがって、前記結果から、スペアミント油、ユーカリ油、クローブ油、ラベンダー油、セージ油、ユーカリ油およびローマカミツレ油は、メントールよりもＴＲＰＡ１の活性化能が高いことが示唆される。
【０１１４】
（３）快適指標による被験試料による清涼感の心地よさの評価
実施例１の（３）において、被験試料として、本実施例２の前記（１）で用いた被験試料を用いたことを除き、実施例１の（３）と同様にして快適指標を算出した。
【０１１５】
実施例２において、試料と快適指標との関係を示すグラフを図６に示す。なお、図中、快適指標＝１の破線は、メントールの快適指標を示す。
【０１１６】
図６において、試料番号１は０．０１体積％ペパーミント油を含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標、試料番号２は０．０１体積％スペアミント油を含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標、試料番号３は０．０１体積％ユーカリ油〔（株）永廣堂本店製、ユーカリ油〕を含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標、試料番号４は０．０１体積％タイム油を含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標、試料番号５は０．０１体積％クローブ油を含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標、試料番号６は０．０１体積％ラベンダー油を含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標、試料番号７は０．０１体積％セージ油を含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標、試料番号８は０．０１体積％ユーカリ油〔小川香料（株）製、ユーカリ油〕を含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標および試料番号９は０．０１体積％ローマカミツレ油を含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標を示す。
【０１１７】
図６に示された結果から、０．０１体積％ペパーミント油を含有する溶媒Ａ（試料番号１）および０．０１体積％ユーカリ油〔小川香料（株）製、ユーカリ油〕を含有する溶媒Ａ（試料番号８）それぞれを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストがほぼ１であることがわかる。したがって、前記結果から、ペパーミント油およびユーカリ油〔小川香料（株）製〕それぞれの清涼感の心地よさが、メントールの清涼感の心地よさと同等である可能性があることが示唆される。
【０１１８】
これに対して、図６に示された結果から、０．０１体積％クローブ油を含有する溶媒Ａ（試料番号５）を用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストが１未満であることがわかる。したがって、前記結果から、クローブ油の清涼感の心地よさがメントールの清涼感の心地よさよりも低い可能性があることが示唆される。
【０１１９】
（試験例１）
頸部の汚れを濡れタオルで除去した６名の被験者を室温２２℃、相対湿度５０％の試験室内で１０分間馴化させた。
【０１２０】
つぎに、ディスペンサー〔（株）吉野工業所製、商品名：Ｙ−１５０〕を用いて、被験者の左頸部にエチルアルコール含有１体積％メントール水溶液（エタノール濃度：４０体積％）または１体積％シネオール水溶液３００μＬを塗布した。また、前記ディスペンサーを用い、被験者の右頸部に対照精製水３００μＬを塗布した。塗布終了時から３分間経過後の感覚の比較を行なった。
【０１２１】
その結果、エチルアルコール含有１体積％メントール水溶液を塗布した場合、６名中６名が「冷感を感じるが痛みも感じる」と回答したのに対し、１体積％シネオール水溶液を塗布した場合、被験者６名中６名が「冷感のみを感じる（心地よい清涼感を感じる）」と回答した。
【０１２２】
以上の結果から、被験試料の快適指標と、被験者による被験試料による清涼感の心地よさの評価結果との間に相関性があることがわかる。
【０１２３】
以上説明したように、被検試料によりＴＲＰＭ８を介して引き起こされる生理学的事象と、被験試料によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象とを測定し、これらの生理学的事象に基づいて得られた被験試料の快適指標の大きさに基づいて、被験試料による清涼感の心地よさを評価することができることが示唆される。したがって、ＴＲＰＭ８発現細胞およびＴＲＰＡ１発現細胞の両方を用いて、被験試料によりＴＲＰＭ８を介して引き起こされる生理学的事象と、被験試料によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象とを測定することにより、被験試料による清涼感を評価することができることが示唆される。また、ＴＲＰＭ８発現細胞およびＴＲＰＡ１発現細胞の両方を用いるのに代えて、ＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞を用いた場合にも、ＴＲＰＭ８発現細胞およびＴＲＰＡ１発現細胞の両方を用いる場合と同様に、被験試料による清涼感を評価することができることが示唆される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験試料による清涼感の評価方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、清涼化剤を含有する皮膚外用剤や頭髪外用剤など外用剤の開発、使用者に適した清涼感の強度を有する皮膚外用剤や頭髪外用剤などの外用剤の提供方法の開発などに有用な被験試料による清涼感の評価方法に関する。なお、本明細書において、被験試料とは、皮膚外用剤、頭髪外用剤などの外用剤に使用される成分であって、清涼感を調べる対象となる物質をいう。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの皮膚に用いられる化粧料などの皮膚外用剤や、ヒトの皮膚に接触することがある頭髪外用剤などには、必要により、爽快感や清涼感を付与するための清涼化剤が配合されている。前記清涼化剤としては、例えば、メントールやその誘導体などが挙げられる。
【０００３】
前記メントールやその誘導体は、ヒトの皮膚に接触したとき、その使用者に強い清涼感を与えることが知られている。ところが、使用者によっては、メントールやその誘導体が皮膚に接触したとき、痛みを感じることがある。
【０００４】
一方、近年、使用者の安全意識の高まりから、このような痛みを与えないか、または痛みが少ない外用剤が好まれる傾向にある。したがって、使用者に痛みを与えずに、清涼感を与える清涼化剤が求められている。
【０００５】
ところで、一過性受容体電位チャネル（以下、「ＴＲＰチャネル」という）は、痛みを惹起する因子を受容する受容体として機能することが知られている。例えば、ＴＲＰチャネルの１つであるＴＲＰＡ１を介した細胞内カルシウムイオン濃度の変化が、パラベン類やアルカリ剤が配合された皮膚外用剤を用いたときに引き起こされる不快な刺激と関連していることが、本発明者らによって見出されている。また、前記パラベン類やアルカリ剤による刺激と前記ＴＲＰＡ１を介した細胞内カルシウムイオン濃度の変化との関連性を利用して、パラベン類やアルカリ剤による刺激を抑制する物質を評価することが提案されている（例えば、特許文献１および２参照）。
【０００６】
しかしながら、本発明者らは、現時点では、メントールなどの清涼化剤による清涼感に伴う痛み刺激とＴＲＰＡ１との関連性や前記関連性を利用して、前記清涼化剤による清涼感を迅速かつ簡便な操作で評価する方法を具体的に記載した文献を発見していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−７９５２８号公報
【特許文献２】特開２００９−８２０５３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、被験試料による清涼感を迅速かつ簡便な操作で評価することができる被験試料による清涼感の評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち、本発明の要旨は、
（１） 被験試料を、ＴＲＰＭ８発現細胞およびＴＲＰＡ１発現細胞と接触させるか、またはＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞と接触させ、前記被験試料によりＴＲＰＭ８を介して引き起こされる生理学的事象および前記被験試料によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定することを特徴とする被験試料による清涼感の評価方法、
（２） 生理学的事象が、前記被験試料との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化である前記（１）に記載の評価方法、
（３） 前記被験試料との接触前後におけるＴＲＰＭ８を介して引き起こされる細胞内カルシウムイオン濃度の変化と、前記被験試料との接触前後におけるＴＲＰＡ１を介して引き起こされる細胞内カルシウムイオン濃度の変化との比を被験試料による清涼感の心地よさの指標として用い、前記被験試料によってヒトに与えられる清涼感の心地よさを評価する前記（１）または（２）に記載の評価方法、ならびに
（４） 前記被験試料との接触前後におけるＴＲＰＭ８を介して引き起こされる細胞内カルシウムイオン濃度の変化と、前記被験試料との接触前後におけるＴＲＰＡ１を介して引き起こされる細胞内カルシウムイオン濃度の変化との比を被験試料による清涼感の心地よさの指標として用い、前記被験試料による清涼感の心地よさごとに前記被験試料を分類する前記（１）または（２）に記載の評価方法
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の被験試料による清涼感の評価方法は、被験試料による清涼感を迅速かつ簡便な操作で評価することができるという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１において、試料とΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフである。
【図２】実施例１において、試料とΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフである。
【図３】実施例１において、試料と快適指標との関係を示すグラフである。
【図４】実施例２において、試料とΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフである。
【図５】実施例２において、試料とΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフである。
【図６】実施例２において、試料と快適指標との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の被験試料による清涼感の評価方法は、被験試料を、ＴＲＰＭ８発現細胞およびＴＲＰＡ１発現細胞と接触させるか、またはＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞と接触させ、前記被験試料によりＴＲＰＭ８を介して引き起こされる生理学的事象および前記被験試料によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定することを特徴とする。
【００１３】
本発明の被験試料による清涼感の評価方法には、被験試料によりＴＲＰＭ８を介して引き起こされる生理学的事象および被験試料によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定する点にも１つの大きな特徴がある。本発明の被験試料による清涼感の評価方法によれば、前記生理学的事象を測定するので、ヒト、実験動物などを用いる場合と比べて、迅速かつ簡便な操作で、被験試料によってヒトに与えられる清涼感を評価することができる。さらに、前記生理学的事象は、同一条件下に同時に何回も並行して測定することができるので、本発明の被験試料による清涼感の評価方法によれば、迅速かつ高い処理効率で多種類の被験試料による清涼感を評価することができる。
【００１４】
被験試料としては、清涼化剤、清涼化剤の候補物質、エッセンシャルオイルなどが挙げられる。
【００１５】
前記ＴＲＰＭ８発現細胞は、ＴＲＰＭ８の生理学的機能を発現する細胞である。前記ＴＲＰＭ８の生理学的機能としては、例えば、メントールによる化学刺激、冷覚刺激（例えば、８〜２８℃程度の刺激）などの刺激による細胞外から細胞内へのナトリウムイオン、カルシウムイオンなどの陽イオンの透過などが挙げられる。
【００１６】
前記ＴＲＰＭ８発現細胞としては、内因性ＴＲＰＭ８を発現している野生型の細胞、ＴＲＰＭ８をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞などが挙げられる。前記ＴＲＰＭ８発現細胞のなかでは、かかるＴＲＰＭ８を介して引き起こされる生理学的事象を簡便な操作で測定する観点から、ＴＲＰＭ８をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞（以下、「外因性ＴＲＰＭ８発現細胞」ともいう）が好ましい。
【００１７】
前記ＴＲＰＡ１発現細胞は、ＴＲＰＡ１の生理学的機能を発現する細胞である。前記ＴＲＰＡ１の生理学的機能としては、例えば、マスタード、シナモアルデヒド、アリルイソチオシアネート、カルバクロール、アリシンなどによる化学刺激、冷覚刺激（例えば、１７℃前後での刺激）、痛み刺激、機械刺激などの刺激による細胞外から細胞内へのナトリウムイオン、カルシウムイオンなどの陽イオンの透過などが挙げられる。
【００１８】
前記ＴＲＰＡ１発現細胞としては、内因性ＴＲＰＡ１を発現している野生型の細胞、ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞などが挙げられる。前記ＴＲＰＡ１発現細胞のなかでは、かかるＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を簡便な操作で測定する観点から、ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞（以下、「外因性ＴＲＰＡ１発現細胞」ともいう）が好ましい。
【００１９】
前記内因性ＴＲＰＭ８を発現している野生型の細胞としては、特に限定されないが、例えば、感覚神経の細胞、前立腺の細胞などが挙げられる。また、前記内因性ＴＲＰＡ１を発現している野生型の細胞としては、特に限定されないが、例えば、感覚神経の細胞、内耳の細胞などが挙げられる。
【００２０】
前記ＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞は、ＴＲＰＭ８をコードする核酸およびＴＲＰＡ１をコードする核酸がいずれも発現可能に宿主細胞に導入された細胞などが挙げられる。前記ＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞においては、ＴＲＰＭ８をコードする核酸およびＴＲＰＡ１をコードする核酸は、被験試料によりＴＲＰＭ８を介して引き起こされる生理学的事象および被験試料によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象をそれぞれ測定する観点から、それぞれ別々の発現プロモーターの制御下にあることが好ましい。発現プロモーターは、宿主細胞内でＴＲＰＭ８およびＴＲＰＡ１を発現させるのに適したプロモーターであればよい。発現プロモーターは、用いられる宿主細胞の種類に応じて適宜選択することができる。
【００２１】
前記外因性ＴＲＰＭ８発現細胞、外因性ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞は、染色体外要素として前記核酸が存在している細胞であってもよく、前記核酸が染色体に組み込まれている細胞であってもよい。
【００２２】
前記外因性ＴＲＰＭ８発現細胞は、ＴＲＰＭ８をコードする核酸を保持する組換えベクターにより宿主細胞を形質転換することによって得られる。また、前記外因性ＴＲＰＡ１発現細胞は、例えば、ＴＲＰＡ１をコードする核酸を保持する組換えベクターにより宿主細胞を形質転換することによって得られる。前記ＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞は、例えば、ＴＲＰＭ８をコードする核酸およびＴＲＰＡ１をコードする核酸を保持する組換えベクターにより宿主細胞を形質転換することによって得られる。
【００２３】
前記ＴＲＰＭ８をコードする核酸は、ヒトＴＲＰＭ８をコードする核酸であってもよく、他の動物のＴＲＰＭ８をコードする核酸であってもよい。また、前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、ヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸であってもよく、他の動物のＴＲＰＡ１をコードする核酸であってもよい。
【００２４】
前記ＴＲＰＭ８をコードする核酸は、ヒトに適用する被験試料を的確に評価する観点から、ヒトＴＲＰＭ８をコードする核酸であることが好ましい。前記ＴＲＰＭ８をコードする核酸としては、例えば、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸などが挙げられる。この配列番号：１に示される塩基配列は、アクセッション番号：ＮＭ＿０２４０８０．４としてＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒトＴＲＰＭ８をコードする核酸の塩基配列である。前記ＴＲＰＭ８をコードする核酸は、前記核酸によりコードされるポリペプチドが前記生理学的機能を発現するのであれば、ＴＲＰＭ８の構造遺伝子の塩基配列の内部または末端に、１または数個のヌクレオチド残基の置換、欠失または挿入を有する変異型核酸であってもよい。
【００２５】
また、前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、ヒトに適用する被験試料を的確に評価する観点から、ヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸であることが好ましい。前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸としては、例えば、配列番号：３に示される塩基配列からなる核酸などが挙げられる。この配列番号：３に示される塩基配列は、アクセッション番号：ＮＭ＿００７３３２としてＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸の塩基配列である。前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、前記核酸によりコードされるポリペプチドが前記生理学的機能を発現するのであれば、ＴＲＰＡ１の構造遺伝子の塩基配列の内部または末端に、１または数個のヌクレオチド残基の置換、欠失または挿入を有する変異型核酸であってもよい。
【００２６】
ＴＲＰＭ８をコードする核酸の変異型核酸としては、例えば、
（Ａ）配列番号：１に示される塩基配列に対して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ １１、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ １、ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ １１の条件でアライメントして算出される配列相同性の値が、それぞれの生理学的機能を十分に発揮させる観点から、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上である塩基配列からなり、かつコードされるポリペプチドが少なくとも前記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸、
（Ｂ）配列番号：２において、１個または数個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列をコードし、コードされるポリペプチドが少なくとも陽イオンを透過させる機能を発現するポリペプチドである核酸、
（Ｃ）ストリンジェントな条件下で、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸に対する相補鎖核酸とハイブリダイズし、コードされるポリペプチドが、陽イオンを透過させる機能を発現するポリペプチドである核酸
などが挙げられる。
【００２７】
また、ＴＲＰＡ１をコードする核酸の変異型核酸としては、例えば、
（ａ）配列番号：３に示される塩基配列に対して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ １１、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ １、ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ １１の条件でアライメントして算出される配列相同性の値が、それぞれの生理学的機能を十分に発揮させる観点から、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上である塩基配列からなり、かつコードされるポリペプチドが少なくとも前記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸、
（ｂ）配列番号：４において、１個または数個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列をコードし、コードされるポリペプチドが少なくとも前記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸、
（ｃ）ストリンジェントな条件下で、配列番号：３に示される塩基配列からなる核酸に対する相補鎖核酸とハイブリダイズし、コードされるポリペプチドが、前記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸
などが挙げられる。
【００２８】
なお、本明細書において、前記ストリンジェントな条件としては、例えば、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸または配列番号：３に示される塩基配列からなる核酸と前記核酸に対応するハイブリダイゼーション対象の核酸とを、ハイブリダイゼーション用溶液〔組成：６×ＳＳＣ（組成：０．９Ｍ塩化ナトリウム、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０に調整）、０．５質量％ドデシル硫酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、１００μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡ、５０体積％ホルムアミド〕中で、室温以上の温度、よりストリンジェントな条件として４２℃以上の温度、さらにストリンジェントな条件として６０℃以上の温度で１０時間インキュベーションし、つぎに、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントな条件として０．１×ＳＳＣのイオン強度条件下で、かつ室温以上の温度、よりストリンジェントな条件として４２℃以上の温度、さらにストリンジェントな条件として６０℃以上の温度で洗浄を行なう条件などが挙げられる。
【００２９】
前記ＴＲＰＭ８をコードする核酸は、例えば、配列番号：１に示される塩基配列に基づいて作成されたプローブを用いるハイブリダイゼーション法、配列番号：１に示される塩基配列に基づいて設計され、合成された２種類のオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマー対を用いる核酸増幅法などによって得られる。前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、例えば、配列番号：３に示される塩基配列に基づいて作成されたプローブを用いるハイブリダイゼーション法、配列番号：１に示される塩基配列に基づいて設計され、合成された２種類のオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマー対を用いる核酸増幅法などによって得られる。
【００３０】
前記宿主細胞としては、前記ＴＲＰＭ８をコードする核酸および／またはＴＲＰＡ１をコードする核酸が効率よく発現され、かつ培養が容易なものであればよく、特に限定されないが、例えば、動物細胞、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。これらのなかでは、ヒトにおけるＴＲＰＭ８および／またはＴＲＰＡ１の生理学的機能を十分に再現する観点から、動物細胞であることが好ましい。動物細胞としては、例えば、ヒト細胞、サル細胞、マウス細胞などが挙げられる。ヒト細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞などが挙げられる。サル細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＣＯＳ−７細胞などが挙げられる。マウス細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などが挙げられる。前記宿主細胞のなかでは、取扱いが容易である観点から、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞が好ましい。これらのなかでは、ＴＲＰチャネルがほとんど発現しておらず、外因性のＴＲＰＭ８および／またはＴＲＰＡ１の活性化を容易にかつ選択的に測定することができる観点から、ＨＥＫ２９３細胞が好ましい。
【００３１】
前記組換えベクターは、ＴＲＰＭ８をコードする核酸および／またはＴＲＰＡ１をコードする核酸と慣用のベクターとを連結させることによって得られるベクターである。前記ベクターは、その調製が容易であり、効率よく宿主細胞に導入することができ、かつ宿主細胞内でＴＲＰＭ８および／またはＴＲＰＡ１を効率よく発現させることができるベクターであればよい。前記ベクターは、形質転換後に、組換えベクターを保持する細胞を容易に選択する観点から、選択マーカー遺伝子を有するベクターであることが好ましい。ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターなどが挙げられる。これらのベクターは、用いられる宿主細胞に応じて適宜選択することができる。なお、前記外因性ＴＲＰＭ８発現細胞および外因性ＴＲＰＡ１発現細胞を作製するための組換えベクターに用いられるベクターは、発現プロモーターを有していてもよい。
【００３２】
前記組換えベクターを用いた形質転換は、用いられる宿主細胞の種類に応じて、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、トランスフェクション法、パーティクルガン法などの形質転換方法によって行なうことができる。これらの形質転換方法は、例えば、モレキュラー クローニング：ア ラボラトリー マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）〔ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、コールド スプリング ハーバー プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年発行〕などの記載に準じて行なうことができる。形質転換後の細胞からの外因性ＴＲＰＭ８発現細胞、外因性ＴＲＰＡ１発現細胞およびＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞の選択は、例えば、用いられた組換えベクターが選択マーカー遺伝子を有する場合、選択マーカー遺伝子に応じた選択培地で培養することなどによって行なうことができる。
【００３３】
得られた細胞が、ＴＲＰＭ８を発現している細胞であることの確認は、例えば、細胞を１ｍＭメントールと接触させ、後述の細胞内カルシウムイオン濃度の測定方法により、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を測定することによって行なうことができる。細胞がＴＲＰＭ８を発現している場合、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度は、メントールと接触させていない細胞の細胞内カルシウムイオン濃度よりも高くなる。得られた細胞が、ＴＲＰＡ１を発現している細胞であることの確認は、例えば、細胞を１〜１０ｍＭパラオキシ安息香酸メチルエステルと接触させ、後述の細胞内カルシウムイオン濃度の測定方法により、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を測定することによって行なうことができる。細胞がＴＲＰＡ１を発現している場合、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度は、パラオキシ安息香酸メチルエステルと接触させていない細胞の細胞内カルシウムイオン濃度よりも高くなる。
【００３４】
被験試料と、ＴＲＰＭ８発現細胞およびＴＲＰＡ１発現細胞またはＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞との接触は、例えば、各細胞の培養に適した培地中で、被験試料と、ＴＲＰＭ８発現細胞およびＴＲＰＡ１発現細胞またはＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞とをインキュベーションすること、被験試料と、ＴＲＰＭ８発現細胞およびＴＲＰＡ１発現細胞またはＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞との混合物をインキュベーションすることなどによって行なわれる。なお、ＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞を用いる場合、被験試料によりＴＲＰＭ８を介して引き起こされる生理学的事象および被験試料によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象それぞれを測定するタイミングに合わせて、ＴＲＰＭ８およびＴＲＰＡをそれぞれ別々に発現させるようにする。
【００３５】
前記培地としては、ＴＲＰＭ８発現細胞、ＴＲＰＡ１発現細胞またはＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞が生育するのに適した成分〔例えば、グルコース、アミノ酸、ペプトン、ビタミン、細胞増殖促進因子（例えば、細胞成長因子、ホルモン、結合タンパク質、細胞接着因子、脂質など）、血清（例えば、ウシ胎仔血清など）、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなど〕を含む培地であればよい。前記培地は、慣用の基本培地に前記成分を補った培地であってもよく、市販されている培地であってもよい。基本培地としては、特に限定されないが、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ １６４０培地などが挙げられる。かかる培地は、細胞の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、用いられる細胞がＨＥＫ２９３細胞から得られた細胞である場合、培地として、１０質量％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地などが用いられる。
【００３６】
被験試料に接触させるＴＲＰＭ８発現細胞、ＴＲＰＡ１発現細胞またはＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞の量は、試験データの信頼性の観点から、被験試料１００μＬあたり、それぞれ１×１０1細胞以上が好ましく、１×１０2細胞以上がより好ましく、細胞の間隔を確保し、細胞が密になりすぎないようにする観点から、３×１０２細胞以下が好ましく、２×１０２細胞以下がより好ましい。
【００３７】
前記ＴＲＰＭ８発現細胞、ＴＲＰＡ１発現細胞またはＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞にそれぞれ接触させる被験試料の量は、被験試料の種類によって異なるため、一概に決定することができないことから、被験試料の種類に応じて適宜設定することができる。
【００３８】
なお、ＴＲＰＭ８発現細胞、ＴＲＰＡ１発現細胞またはＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞は、それぞれ、前記生理学的事象を測定するのに適した状態に細胞を維持するために、必要に応じて、ＴＲＰＭ８発現細胞、ＴＲＰＡ１発現細胞またはＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞を、各細胞に適した条件下で、予めインキュベーションしておいてもよい。
【００３９】
前記インキュベーションは、用いられる細胞の種類に応じた方法によって行なうことができる。かかる方法としては、例えば、単層静置培養法、浮遊培養法、回転培養法、三次元担体培養法などが挙げられる。また、インキュベーション温度、インキュベーション時間、二酸化炭素濃度などの条件は、用いられる細胞に応じて適宜設定される。例えば、ＴＲＰＭ８発現細胞、ＴＲＰＡ１発現細胞またはＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞として、ＨＥＫ２９３細胞から得られた細胞を用いる場合、かかる細胞は、前記生理学的事象を測定するのに適した状態に細胞を維持する観点から、通常、５体積％二酸化炭素を含む雰囲気中で、３６〜３８℃、好ましくは３６．５〜３７．５℃でインキュベーションすればよい。
【００４０】
前記生理学的事象としては、被験試料との接触前後の一定電位下での電流の変化、被験試料との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化、これらの組み合わせなどが挙げられる。本発明においては、簡便な操作で、かつ高感度で測定することができる観点から、前記生理学的事象は、被験試料との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化であることが好ましい。
【００４１】
前記一定の電位での電流の測定方法としては、例えば、パッチクランプ法などが挙げられる。
【００４２】
細胞内カルシウムイオン濃度は、例えば、カルシウムキレート化剤に基づく蛍光試薬（以下、「蛍光カルシウム指示薬」ともいう）をＴＲＰＭ８発現細胞、ＴＲＰＡ１発現細胞またはＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞に導入し、細胞内のカルシウムイオンに前記蛍光カルシウム指示薬を結合させ、カルシウムイオンと結合した蛍光カルシウム指示薬の蛍光強度を調べる方法などを用いて算出することができる。この場合、被験試料との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化は、ＴＲＰＭ８のアゴニストまたはＴＲＰＡ１のアゴニストと接触させたときの細胞内カルシウムイオン濃度に対する被験試料と接触させたときの細胞内カルシウムイオン濃度の変化を求めることによって調べることができる。
【００４３】
ＴＲＰＭ８のアゴニストおよびＴＲＰＡ１のアゴニストは、同一の物質であってもよく、異なる物質であってもよい。前記ＴＲＰＭ８およびＴＲＰＡ１両方のアゴニストとして、例えば、メントールなどを用いることができる。
【００４４】
前記蛍光カルシウム指示薬としては、例えば、カルシウムイオンと結合した当該蛍光カルシウム指示薬の量によってその蛍光特性が変化する試薬であればよく、特に限定されないが、例えば、ＦＵＲＡ ２、ＦＵＲＡ ２−ＡＭ、Ｆｌｕｏ−３などが挙げられる。
【００４５】
なお、蛍光カルシウム指示薬が２種類の励起波長を有する場合、より精度を高める観点から、各励起波長における蛍光強度から蛍光強度比を算出することが好ましい。例えば、蛍光カルシウム指示薬であるＦＵＲＡ ２−ＡＭの励起波長は、３４０ｎｍおよび３８０ｎｍである。この場合、前記ＴＲＰＭ８のアゴニストまたはＴＲＰＡ１のアゴニストと接触させたときの細胞内カルシウムイオン濃度に対する被験試料と接触させたときの細胞内カルシウムイオン濃度の変化は、Δ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストを算出することにより調べることができる。
【００４６】
前記Δ蛍光強度比試料は、式（Ｉ）：
【００４７】
【数１】
【００４８】
に基づいて算出することができる。また、前記Δ蛍光強度比アゴニストは、式（ＩＩ）：
【００４９】
【数２】
に基づいて算出することができる。なお、本明細書において、「蛍光強度340nm」は励起波長３４０ｎｍにおける蛍光強度を示し、「蛍光強度380nm」は励起波長３８０ｎｍにおける蛍光強度を示す。
【００５０】
また、生理学的事象として被験試料との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化を用いる場合、被験試料による清涼感は、前記被験試料との接触前後におけるＴＲＰＭ８を介して引き起こされる細胞内カルシウムイオン濃度の変化と、前記被験試料との接触前後におけるＴＲＰＡ１を介して引き起こされる細胞内カルシウムイオン濃度の変化との比を指標（以下、「快適指標」という）として用いることにより評価することができる。前記快適指標は、例えば、式（ＩＩＩ）：
【００５１】
【数３】
【００５２】
に基づいて算出することができる。この場合、被験試料の快適指標が１よりも高い場合、当該被験試料による冷感が、アゴニストよりも痛みの少ない冷感であると考えられる。したがって、被験試料の快適指標が１よりも高い場合、前記被験試料による清涼感の心地よさがアゴニストと比べて高い可能性があるという判断をすることができる。一方、被験試料の快適指標が１以下である場合、当該被験試料による冷感がアゴニストによる冷感よりも小さく、かつ当該被験試料による痛み感覚がアゴニストによる痛み感覚と同等であるか、またはアゴニストによる痛み感覚よりも大きいと考えられる。したがって、被験試料の快適指標が１以下である場合、前記被験試料による清涼感の心地よさがアゴニストと同等以下である可能性があるという判断をすることができる。
【００５３】
以上説明したように、本発明の被験試料による清涼感の評価方法によれば、前記被験試料によりＴＲＰＭ８を介して引き起こされる生理学的事象および前記被験試料によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象により、ヒトの皮膚に対する清涼感を評価することができる。したがって、本発明の被験試料による清涼感の評価方法は、皮膚外用剤や頭髪外用剤などの外用剤に適した清涼化剤のスクリーニング、清涼化剤を含有する皮膚外用剤や頭髪外用剤などの外用剤の開発、使用者に適した清涼感の強度を有する皮膚外用剤や頭髪外用剤などの外用剤の提供方法の開発などに利用することができる。
【実施例】
【００５４】
つぎに、実施例によって本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。
【００５５】
（製造例１）
ヒトＴＲＰＭ８をコードするｃＤＮＡ〔配列番号：１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０２４０８０．４）に示される塩基配列の４１位〜３３５５位のポリヌクレオチド〕を、哺乳動物細胞用ベクター〔インビトロジェン社製、商品名：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）〕のクローニングサイトに挿入し、ヒトＴＲＰＭ８発現ベクターを得た。得られたヒトＴＲＰＭ８発現ベクター１μｇと、遺伝子導入用試薬〔インビトロジェン社製、商品名：ＰＬＵＳ Ｒｅａｇｅｎｔ（プラスリージェント）、カタログ番号：１１５１４−０１５〕６μｌとを混合し、混合物Ｉを得た。また、遺伝子導入用カチオン性脂質〔インビトロジェン社製、商品名：リポフェクタミン（登録商標）、カタログ番号：１８３２４−０１２〕４μｌと、血清使用量低減培地〔インビトロジェン社製、商品名：ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（カタログ番号：１１０５８０２１）２００μｌとを混合し、混合物ＩＩを得た。
【００５６】
また、５体積％二酸化炭素の雰囲気中、３７℃に維持された直径３５ｍｍのシャーレ上の１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中において、５×１０５細胞のＨＥＫ２９３細胞を７０％のコンフルエンシーになるまで培養した。
【００５７】
得られた細胞培養物に、前記混合物Ｉと混合物ＩＩとを添加することにより、ＨＥＫ２９３細胞に前記ヒトＴＲＰＭ８発現ベクターを導入し、ＴＲＰＭ８発現細胞を得た。
【００５８】
（製造例２）
製造例１において、ヒトＴＲＰＭ８をコードするｃＤＮＡの代わりにヒトＴＲＰＡ１をコードするｃＤＮＡ〔配列番号：１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００７３３２）に示される塩基配列の６３位〜３８８８位のポリヌクレオチド〕を用いたことを除き、製造例１と同様にしてＴＲＰＡ１発現細胞を得た。
（実験例１）
製造例２で得られたＴＲＰＡ１発現細胞を、細胞内カルシウムイオン測定用試薬であるＦＵＲＡ ２−ＡＭ（インビトロジェン社製）を最終濃度５μＭで含む１０質量％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地中、室温で６０分間インキュベーションすることにより、前記ＴＲＰＡ１発現細胞にＦＵＲＡ ２−ＡＭを導入し、ＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞を得た。
【００５９】
得られたＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞を循環定温チャンバー付蛍光測定装置〔浜松ホトニクス（株）製、商品名：ＡＲＧＵＳ−５０〕の各チャンバーに入れた。その後、チャンバー中のＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞を、溶媒Ａ〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭヘペス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）〕で洗浄した。
【００６０】
つぎに、洗浄後のＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞が入ったチャンバーに１ｍＭメントールを含有する溶媒Ａを入れ、ＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞と１ｍＭメントールを含有する溶媒Ａとを混合した。
【００６１】
その後、チャンバーにおいて、励起波長３４０ｎｍにおけるＴＲＰＡ１発現細胞に導入され、かつ細胞内のカルシウムイオンに結合したＦＵＲＡ ２−ＡＭに基づく蛍光の強度（以下、「蛍光強度340nm」という）および励起波長３８０ｎｍにおけるＴＲＰＡ１発現細胞に導入されたＦＵＲＡ ２−ＡＭに基づく蛍光の強度（以下、「蛍光強度380nm」という）を測定した。
【００６２】
測定された蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmから、蛍光強度比メントールを算出した。前記蛍光強度比メントールは、下記式（ＩＶ）：
【００６３】
【数４】
【００６４】
に基づいて算出した。
【００６５】
また、前記１ｍＭメントールを含有する溶媒Ａの代わりに溶媒Ａを用いたことを除き、前記被験試料を用いた場合と同様にして蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmを測定した。
【００６６】
測定された蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmから、蛍光強度比溶媒Ａを算出した。前記蛍光強度比溶媒Ａは、下記式（Ｖ）：
【００６７】
【数５】
【００６８】
に基づいて算出した。
【００６９】
その結果、蛍光強度比メントールは、１．８０であった。また、蛍光強度比溶媒Ａは、０．８７であった。これらの結果から、１ｍＭメントールを含有する溶媒Ａを用いた場合、溶媒Ａを用いた場合と比べて、ＴＲＰＡ１発現細胞の細胞内カルシウムイオン濃度が増加していることがわかる。
【００７０】
ＴＲＰＡ１の活性化は、パラベン類やアルコールによる痛み感覚と関連していると考えられている。したがって、以上の結果から、ＴＲＰＡ１がメントールによっても活性化されるので、メントールにより皮膚に与えられる感覚のうちの痛み感覚は、ＴＲＰＡ１の活性化によって引き起こされていることが示唆される。
【００７１】
（実施例１）
（１）ＴＲＰＭ８発現細胞による評価
製造例１で得られたＴＲＰＭ８発現細胞を、細胞内カルシウムイオン測定用試薬であるＦＵＲＡ ２−ＡＭ（インビトロジェン社製）を最終濃度５μＭで含む１０質量％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地中、室温で６０分間インキュベーションすることにより、前記ＴＲＰＭ８発現細胞にＦＵＲＡ ２−ＡＭを導入し、ＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＭ８発現細胞を得た。
【００７２】
得られたＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＭ８発現細胞を循環定温チャンバー付蛍光測定装置〔浜松ホトニクス（株）製、商品名：ＡＲＧＵＳ−５０〕の各チャンバーに入れた。その後、チャンバー中のＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞を、溶媒Ａ〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭヘペス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）〕で洗浄した。
【００７３】
つぎに、洗浄後のＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＭ８発現細胞が入ったチャンバーに被験試料を入れ、ＦＵＲＡ ２−ＡＭ導入ＴＲＰＭ８発現細胞と被験試料とを混合した。なお、前記被験試料として、１ｍＭシネオールを含有する溶媒Ａ、１ｍＭカルボンを含有する溶媒Ａ、１ｍＭメントンを含有する溶媒Ａ、１ｍＭシトロネラールを含有する溶媒Ａ、１ｍＭシトラールを含有する溶媒Ａ、１ｍＭリナロールを含有する溶媒Ａ、１ｍＭテルピネオールを含有する溶媒Ａ、１ｍＭシメンを含有する溶媒Ａ、１ｍＭオイゲノールを含有する溶媒Ａ、１ｍＭリモネンを含有する溶媒Ａ、１ｍＭ（＋）−ピネンを含有する溶媒Ａ、１ｍＭ（−）−ピネンを含有する溶媒Ａまたは１ｍＭアネトールを含有する溶媒Ａを用いた。これらの被験試料は、一般的に清涼化剤またはアロマテラピーに用いられている香油に含まれる成分である。
【００７４】
その後、チャンバーにおいて、励起波長３４０ｎｍにおけるＴＲＰＡ１発現細胞に導入され、かつ細胞内のカルシウムイオンに結合したＦＵＲＡ ２−ＡＭに基づく蛍光の強度（以下、「蛍光強度340nm」という）および励起波長３８０ｎｍにおけるＴＲＰＭ８発現細胞に導入されたＦＵＲＡ ２−ＡＭに基づく蛍光の強度（以下、「蛍光強度380nm」という）を測定した。
【００７５】
測定された蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmから、Δ蛍光強度比試料を算出した。前記Δ蛍光強度比試料は、式（Ｉ）：
【００７６】
【数６】
【００７７】
に基づいて算出した。なお、前記対照は、溶媒Ａである。
【００７８】
また、前記被験試料の代わりにＴＲＰＭ８のアゴニストを用いたことを除き、前記被験試料を用いた場合と同様にして蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmを測定した。なお、前記アゴニストとして、１ｍＭメントールを含有する溶媒Ａを用いた。
【００７９】
測定された蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmから、Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。前記Δ蛍光強度比アゴニストは、式（ＩＩ）：
【００８０】
【数７】
【００８１】
に基づいて算出した。
【００８２】
算出されたΔ蛍光強度比試料とΔ蛍光強度比アゴニストとから、ＴＲＰＭ８発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。
【００８３】
実施例１において、試料とΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフを図１に示す。
【００８４】
図１において、試料番号１は１ｍＭシネオールを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号２は１ｍＭカルボンを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号３は１ｍＭメントンを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号４は１ｍＭシトロネラールを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号５は１ｍＭシトラールを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号６は１ｍＭリナロールを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号７は１ｍＭテルピネオールを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号８は１ｍＭシメンを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号９は１ｍＭオイゲノールを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号１０は１ｍＭリモネンを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号１１は１ｍＭ（＋）−ピネンを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号１２は１ｍＭ（−）−ピネンを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストおよび試料番号１３は１ｍＭアネトールを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストを示す。
【００８５】
図１に示された結果から、１ｍＭシネオールを含有する溶媒Ａ（試料番号１）、１ｍＭメントンを含有する溶媒Ａ（試料番号３）および１ｍＭオイゲノールを含有する溶媒Ａ（試料番号６）それぞれを用いた場合、Δ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストが０．３〜０．６であることがわかる。これらの結果から、シネオール、メントンおよびオイゲノールは、メントールよりもＴＲＰＭ８の活性化能が低いことがわかる。
【００８６】
また、前記結果から、１ｍＭシネオールを含有する溶媒Ａ（試料番号１）、１ｍＭメントンを含有する溶媒Ａ（試料番号３）および１ｍＭオイゲノールを含有する溶媒Ａ（試料番号６）それぞれを用いた場合、他の試料を用いた場合と比べてΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストが大きいことがわかる。したがって、これらの結果から、シネオール、メントンおよびオイゲノールは、カルボン、シトロネラール、シトラール、リナロール、テルピネオール、シメン、リモネン、（＋）−ピネン、（−）−ピネンおよびアネトールよりもＴＲＰＭ８の活性化能が高いことがわかる。
【００８７】
（２）ＴＲＰＡ１発現細胞による評価
前記（１）において、製造例１で得られたＴＲＰＭ８発現細胞の代わりに製造例２で得られたＴＲＰＡ１発現細胞を用いたことを除き、前記（１）と同様にして、ＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。
【００８８】
実施例１において、試料とΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフを図２に示す。
【００８９】
図２において、試料番号１は１ｍＭシネオールを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号２は１ｍＭカルボンを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号３は１ｍＭメントンを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号４は１ｍＭシトロネラールを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号５は１ｍＭシトラールを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号６は１ｍＭリナロールを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号７は１ｍＭテルピネオールを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号８は１ｍＭシメンを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号９は１ｍＭオイゲノールを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号１０は１ｍＭリモネンを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号１１は１ｍＭ（＋）−ピネンを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号１２は１ｍＭ（−）−ピネンを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストおよび試料番号１３は１ｍＭアネトールを含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストを示す。
【００９０】
図２に示された結果から、１ｍＭシトラールを含有する溶媒Ａ（試料番号５）および１ｍＭオイゲノールを含有する溶媒Ａ（試料番号９）それぞれを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストが１を超えていることがわかる。したがって、前記結果から、シトラールおよびオイゲノールは、メントールよりもＴＲＰＡ１の活性化能が高いことが示唆される。
【００９１】
これに対して、図２に示された結果から、１ｍＭシネオールを含有する溶媒Ａ（試料番号１）、１ｍＭカルボンを含有する溶媒Ａ（試料番号２）、１ｍＭメントンを含有する溶媒Ａ（試料番号３）、１ｍＭシトロネラールを含有する溶媒Ａ（試料番号４）、１ｍＭリナロールを含有する溶媒Ａ（試料番号６）、１ｍＭテルピネオールを含有する溶媒Ａ（試料番号７）、１ｍＭシメンを含有する溶媒Ａ（試料番号８）、１ｍＭリモネンを含有する溶媒Ａ（試料番号１０）、１ｍＭ（＋）−ピネンを含有する溶媒Ａ（試料番号１１）、１ｍＭ（−）−ピネンを含有する溶媒Ａ（試料番号１２）および１ｍＭアネトールを含有する溶媒Ａ（試料番号１３）それぞれを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストが１未満であることがわかる。したがって、前記結果から、カルボン、メントン、シトロネラール、リナロール、テルピネオール、シメン、リモネン、（＋）−ピネン、（−）−ピネンおよびアネトールは、メントールよりもＴＲＰＡ１の活性化能が低いことが示唆される。
【００９２】
（３）被験試料によるＴＲＰＭ８およびＴＲＰＡ１それぞれの活性化能に基づく清涼感の心地よさの評価
実験例１の結果から、メントールによりＴＲＰＡ１が活性化されるので、メントールにより皮膚に与えられる感覚のうちの痛み感覚が、ＴＲＰＡ１の活性化によって引き起こされていることが示唆される。また、ＴＲＰＭ８は、メントールによって活性化される一方、８〜２８℃程度の冷刺激によっても活性化する。したがって、ＴＲＰＭ８は、メントールによってヒトの皮膚にもたらされる感覚のうち特に冷感と関連していると考えられる。
【００９３】
そこで、前記（１）で測定したＴＲＰＭ８発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料およびΔ蛍光強度比アゴニストと、前記（２）で測定したＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料およびΔ蛍光強度比アゴニストとに基づいて、被験試料による清涼感の心地よさの評価を行なった。
【００９４】
前記（１）で測定したＴＲＰＭ８発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料およびΔ蛍光強度比アゴニストと、前記（２）で測定したＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料およびΔ蛍光強度比アゴニストとから、被験試料によるＴＲＰＭ８の活性化能と被験試料によるＴＲＰＡ１の活性化能との比を算出した。以下、前記比を「快適指標」として用いた。かかる快適指標は、式（ＩＩＩ）：
【００９５】
【数８】
【００９６】
に基づいて算出した。
【００９７】
ここで、被験試料の快適指標が１よりも高い場合、当該被験試料による冷感がメントールによる冷感よりも痛みの少ない冷感であると考えられる。したがって、被験試料の快適指標が１よりも高い場合、前記被験試料による清涼感の心地よさがメントールと比べて高い可能性があるという判断をすることができる。
【００９８】
一方、被験試料の快適指標が１以下である場合、当該被験試料による冷感がメントールによる冷感よりも小さく、かつ当該被験試料による痛み感覚がメントールによる痛み感覚と同等であるか、またはメントールによる痛み感覚よりも大きいと考えられる。したがって、被験試料の快適指標が１以下である場合、前記被験試料による清涼感の心地よさがメントールと同等以下である可能性があるという判断をすることができる。
【００９９】
実施例１において、試料と快適指標との関係を示すグラフを図３に示す。なお、図中、快適指標＝１の破線は、メントールの快適指標を示す。
【０１００】
図３において、試料番号１は１ｍＭシネオールを含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標、試料番号２は１ｍＭカルボンを含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標、試料番号３は１ｍＭメントンを含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標、試料番号４は１ｍＭシトロネラールを含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標、試料番号５は１ｍＭシトラールを含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標、試料番号６は１ｍＭリナロールを含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標、試料番号７は１ｍＭテルピネオールを含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標、試料番号８は１ｍＭシメンを含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標、試料番号９は１ｍＭオイゲノールを含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標、試料番号１０は１ｍＭリモネンを含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標、試料番号１１は１ｍＭ（＋）−ピネンを含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標、試料番号１２は１ｍＭ（−）−ピネンを含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標および試料番号１３は１ｍＭアネトールを含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標を示す。
【０１０１】
図３に示された結果から、１ｍＭシネオールを含有する溶媒Ａ（試料番号５）を用いた場合の快適指標が１を超えていることがわかる。したがって、前記結果から、シネオールの清涼感の心地よさがメントールの清涼感の心地よさと比べて高い可能性があることが示唆される。
【０１０２】
これに対して、図３に示された結果から、１ｍＭメントンを含有する溶媒Ａ（試料番号３）および１ｍＭオイゲノールを含有する溶媒Ａ（試料番号９）それぞれを用いた場合の快適指標が１未満であることがわかる。したがって、前記結果から、メントンおよびオイゲノールそれぞれの清涼感の心地よさがメントールの清涼感の心地よさよりも低い可能性があることが示唆される。
【０１０３】
これらの結果から、ＴＲＰＭ８発現細胞およびＴＲＰＡ１発現細胞の両方を用いて、被験試料によりＴＲＰＭ８を介して引き起こされる生理学的事象と、被験試料によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象とを測定し、被験試料によるＴＲＰＭ８およびＴＲＰＡ１それぞれの活性化能を調べることにより、被験試料による清涼感の心地よさを評価することができることが示唆される。
【０１０４】
（実施例２）
（１）ＴＲＰＭ８発現細胞による評価
実施例１の（１）において、被験試料として、０．０１体積％ペパーミント油を含有する溶媒Ａ（試料番号１）、０．０１体積％スペアミント油を含有する溶媒Ａ（試料番号２）、０．０１体積％ユーカリ油〔（株）永廣堂本店製、ユーカリ油〕を含有する溶媒Ａ（試料番号３）、０．０１体積％タイム油を含有する溶媒Ａ（試料番号４）、０．０１体積％クローブ油を含有する溶媒Ａ（試料番号５）、０．０１体積％ラベンダー油を含有する溶媒Ａ（試料番号６）、０．０１体積％セージ油を含有する溶媒Ａ（試料番号７）、０．０１体積％ユーカリ油〔小川香料（株）製、ユーカリ油〕を含有する溶媒Ａ（試料番号８）または０．０１体積％ローマカミツレ油を含有する溶媒Ａ（試料番号９）を用いたことを除き、実施例１の（１）と同様にしてＴＲＰＭ８発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。なお、これらの被験試料は、香油の含有成分の水溶液である。
【０１０５】
実施例２において、試料とΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフを図４に示す。
【０１０６】
図４において、試料番号１は０．０１体積％ペパーミント油を含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号２は０．０１体積％スペアミント油を含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号３は０．０１体積％ユーカリ油〔（株）永廣堂本店製、ユーカリ油〕を含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号４は０．０１体積％タイム油を含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号５は０．０１体積％クローブ油を含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号６は０．０１体積％ラベンダー油を含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号７は０．０１体積％セージ油を含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号８は０．０１体積％ユーカリ油〔小川香料（株）製、ユーカリ油〕を含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストおよび試料番号９は０．０１体積％ローマカミツレ油を含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストを示す。
【０１０７】
図４に示された結果から、０．０１体積％ペパーミント油を含有する溶媒Ａ（試料番号１）、０．０１体積％タイム油を含有する溶媒Ａ（試料番号４）、０．０１体積％クローブ油を含有する溶媒Ａ（試料番号５）および０．０１体積％ユーカリ油〔小川香料（株）製、ユーカリ油〕を含有する溶媒Ａ（（試料番号８）それぞれを用いた場合、Δ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストが０．１以上１未満であることがわかる。これらの結果から、ペパーミント油、タイム油、クローブ油およびユーカリ油〔小川香料（株）製、ユーカリ油〕は、メントールよりもＴＲＰＭ８の活性化能が低いことがわかる。
【０１０８】
また、前記結果から、０．０１体積％ペパーミント油を含有する溶媒Ａ（試料番号１）、０．０１体積％タイム油を含有する溶媒Ａ（試料番号４）、０．０１体積％クローブ油を含有する溶媒Ａ（試料番号５）および０．０１体積％ユーカリ油〔小川香料（株）製、ユーカリ油〕を含有する溶媒Ａ（試料番号８）それぞれを用いた場合、他の試料を用いた場合と比べてΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストが大きいことがわかる。したがって、これらの結果から、ペパーミント油、タイム油、クローブ油およびユーカリ油〔小川香料（株）製、ユーカリ油〕は、スペアミント油を含有する溶媒Ａ、ユーカリ油〔（株）永廣堂本店製、ユーカリ油〕、ラベンダー油を含有する溶媒Ａ、セージ油を含有する溶媒Ａおよびローマカミツレ油を含有する溶媒ＡよりもＴＲＰＭ８の活性化能が高いことがわかる。
【０１０９】
（２）ＴＲＰＡ１発現細胞による評価
実施例１の（２）において、被験試料として、本実施例２の前記（１）で用いた被験試料を用いたことを除き、実施例１の（２）と同様にしてＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。
【０１１０】
実施例２において、試料とΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストの値との関係を示すグラフを図５に示す。
【０１１１】
図５において、試料番号１は０．０１体積％ペパーミント油を含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号２は０．０１体積％スペアミント油を含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号３は０．０１体積％ユーカリ油〔（株）永廣堂本店製、ユーカリ油〕を含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号４は０．０１体積％タイム油を含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号５は０．０１体積％クローブ油を含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号６は０．０１体積％ラベンダー油を含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号７は０．０１体積％セージ油を含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニスト、試料番号８は０．０１体積％ユーカリ油〔小川香料（株）製、ユーカリ油〕含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストおよび試料番号９は０．０１体積％ローマカミツレ油を含有する溶媒Ａを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストを示す。
【０１１２】
図５に示された結果から、０．０１体積％ペパーミント油を含有する溶媒Ａ（試料番号１）および０．０１体積％タイム油を含有する溶媒Ａ（試料番号４）それぞれを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストが１を超えていることがわかる。したがって、前記結果から、ペパーミント油およびタイム油は、メントールよりもＴＲＰＡ１の活性化能が高いことが示唆される。
【０１１３】
これに対して、図５に示された結果から、０．０１体積％スペアミント油を含有する溶媒Ａ（試料番号２）、０．０１体積％ユーカリ油〔（株）永廣堂本店製、ユーカリ油〕を含有する溶媒Ａ（試料番号３）、０．０１体積％クローブ油を含有する溶媒Ａ（試料番号５）、０．０１体積％ラベンダー油を含有する溶媒Ａ（試料番号６）、０．０１体積％セージ油を含有する溶媒Ａ（試料番号７）、０．０１体積％ユーカリ油〔小川香料（株）製、ユーカリ油〕を含有する溶媒Ａ（試料番号８）および０．０１体積％ローマカミツレ油を含有する溶媒Ａ（試料番号９）それぞれを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストが１未満であることがわかる。したがって、前記結果から、スペアミント油、ユーカリ油、クローブ油、ラベンダー油、セージ油、ユーカリ油およびローマカミツレ油は、メントールよりもＴＲＰＡ１の活性化能が高いことが示唆される。
【０１１４】
（３）快適指標による被験試料による清涼感の心地よさの評価
実施例１の（３）において、被験試料として、本実施例２の前記（１）で用いた被験試料を用いたことを除き、実施例１の（３）と同様にして快適指標を算出した。
【０１１５】
実施例２において、試料と快適指標との関係を示すグラフを図６に示す。なお、図中、快適指標＝１の破線は、メントールの快適指標を示す。
【０１１６】
図６において、試料番号１は０．０１体積％ペパーミント油を含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標、試料番号２は０．０１体積％スペアミント油を含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標、試料番号３は０．０１体積％ユーカリ油〔（株）永廣堂本店製、ユーカリ油〕を含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標、試料番号４は０．０１体積％タイム油を含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標、試料番号５は０．０１体積％クローブ油を含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標、試料番号６は０．０１体積％ラベンダー油を含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標、試料番号７は０．０１体積％セージ油を含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標、試料番号８は０．０１体積％ユーカリ油〔小川香料（株）製、ユーカリ油〕を含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標および試料番号９は０．０１体積％ローマカミツレ油を含有する溶媒Ａを用いた場合の快適指標を示す。
【０１１７】
図６に示された結果から、０．０１体積％ペパーミント油を含有する溶媒Ａ（試料番号１）および０．０１体積％ユーカリ油〔小川香料（株）製、ユーカリ油〕を含有する溶媒Ａ（試料番号８）それぞれを用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストがほぼ１であることがわかる。したがって、前記結果から、ペパーミント油およびユーカリ油〔小川香料（株）製〕それぞれの清涼感の心地よさが、メントールの清涼感の心地よさと同等である可能性があることが示唆される。
【０１１８】
これに対して、図６に示された結果から、０．０１体積％クローブ油を含有する溶媒Ａ（試料番号５）を用いた場合のΔ蛍光強度比試料／Δ蛍光強度比アゴニストが１未満であることがわかる。したがって、前記結果から、クローブ油の清涼感の心地よさがメントールの清涼感の心地よさよりも低い可能性があることが示唆される。
【０１１９】
（試験例１）
頸部の汚れを濡れタオルで除去した６名の被験者を室温２２℃、相対湿度５０％の試験室内で１０分間馴化させた。
【０１２０】
つぎに、ディスペンサー〔（株）吉野工業所製、商品名：Ｙ−１５０〕を用いて、被験者の左頸部にエチルアルコール含有１体積％メントール水溶液（エタノール濃度：４０体積％）または１体積％シネオール水溶液３００μＬを塗布した。また、前記ディスペンサーを用い、被験者の右頸部に対照精製水３００μＬを塗布した。塗布終了時から３分間経過後の感覚の比較を行なった。
【０１２１】
その結果、エチルアルコール含有１体積％メントール水溶液を塗布した場合、６名中６名が「冷感を感じるが痛みも感じる」と回答したのに対し、１体積％シネオール水溶液を塗布した場合、被験者６名中６名が「冷感のみを感じる（心地よい清涼感を感じる）」と回答した。
【０１２２】
以上の結果から、被験試料の快適指標と、被験者による被験試料による清涼感の心地よさの評価結果との間に相関性があることがわかる。
【０１２３】
以上説明したように、被検試料によりＴＲＰＭ８を介して引き起こされる生理学的事象と、被験試料によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象とを測定し、これらの生理学的事象に基づいて得られた被験試料の快適指標の大きさに基づいて、被験試料による清涼感の心地よさを評価することができることが示唆される。したがって、ＴＲＰＭ８発現細胞およびＴＲＰＡ１発現細胞の両方を用いて、被験試料によりＴＲＰＭ８を介して引き起こされる生理学的事象と、被験試料によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象とを測定することにより、被験試料による清涼感を評価することができることが示唆される。また、ＴＲＰＭ８発現細胞およびＴＲＰＡ１発現細胞の両方を用いるのに代えて、ＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞を用いた場合にも、ＴＲＰＭ８発現細胞およびＴＲＰＡ１発現細胞の両方を用いる場合と同様に、被験試料による清涼感を評価することができることが示唆される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験試料を、ＴＲＰＭ８発現細胞およびＴＲＰＡ１発現細胞と接触させるか、またはＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞と接触させ、前記被験試料によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象および前記被験試料によりＴＲＰＭ８を介して引き起こされる生理学的事象を測定することを特徴とする被験試料による清涼感の評価方法。
【請求項２】
生理学的事象が、前記被験試料との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化である請求項１に記載の評価方法。
【請求項３】
前記被験試料との接触前後におけるＴＲＰＭ８を介して引き起こされる細胞内カルシウムイオン濃度の変化と、前記被験試料との接触前後におけるＴＲＰＡ１を介して引き起こされる細胞内カルシウムイオン濃度の変化との比を被験試料による清涼感の心地よさの指標として用い、前記被験試料によってヒトに与えられる清涼感の心地よさを評価する請求項１または２に記載の評価方法。
【請求項４】
前記被験試料との接触前後におけるＴＲＰＭ８を介して引き起こされる細胞内カルシウムイオン濃度の変化と、前記被験試料との接触前後におけるＴＲＰＭ８を介して引き起こされる細胞内カルシウムイオン濃度の変化との比を被験試料による清涼感の心地よさの指標として用い、前記被験試料による清涼感の心地よさごとに前記被験試料を分類する請求項１または２に記載の評価方法。
【請求項１】
被験試料を、ＴＲＰＭ８発現細胞およびＴＲＰＡ１発現細胞と接触させるか、またはＴＲＰＭ８−ＴＲＰＡ１共発現細胞と接触させ、前記被験試料によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象および前記被験試料によりＴＲＰＭ８を介して引き起こされる生理学的事象を測定することを特徴とする被験試料による清涼感の評価方法。
【請求項２】
生理学的事象が、前記被験試料との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化である請求項１に記載の評価方法。
【請求項３】
前記被験試料との接触前後におけるＴＲＰＭ８を介して引き起こされる細胞内カルシウムイオン濃度の変化と、前記被験試料との接触前後におけるＴＲＰＡ１を介して引き起こされる細胞内カルシウムイオン濃度の変化との比を被験試料による清涼感の心地よさの指標として用い、前記被験試料によってヒトに与えられる清涼感の心地よさを評価する請求項１または２に記載の評価方法。
【請求項４】
前記被験試料との接触前後におけるＴＲＰＭ８を介して引き起こされる細胞内カルシウムイオン濃度の変化と、前記被験試料との接触前後におけるＴＲＰＭ８を介して引き起こされる細胞内カルシウムイオン濃度の変化との比を被験試料による清涼感の心地よさの指標として用い、前記被験試料による清涼感の心地よさごとに前記被験試料を分類する請求項１または２に記載の評価方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１１−２０５９７７（Ｐ２０１１−２０５９７７Ａ）
【公開日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−７７３９７（Ｐ２０１０−７７３９７）
【出願日】平成２２年３月３０日（２０１０．３．３０）
【出願人】（３９００１１４４２）株式会社マンダム (305)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月３０日（２０１０．３．３０）
【出願人】（３９００１１４４２）株式会社マンダム (305)
【Ｆターム（参考）】
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