補体調節遺伝子における変異体が加齢性黄斑変性症を予測する
本明細書中には、ＡＭＤを発症する危険性がある対象を同定する方法が開示され、また、本方法を実施するために使用できるキットも開示されている。本発明の方法は、対象の遺伝子物質から、ＢＦ遺伝子、Ｃ２遺伝子、および／またはＣＦＨ遺伝子における多型性などの、特異的な防御型またはリスク型の多型または遺伝子型を同定することを含む。別の実施形態において、本発明はまた、これらの方法において使用されるマイクロアレイおよびキットも提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２００６年２月１３日に出願された、米国仮特許出願第６０／７７２，９８９号の利益を主張する。米国仮特許出願第６０／７７２，９８９号は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
分野
本出願は、加齢性黄斑変性症に対する各人の遺伝的感受性を予測する方法に関する。
【０００３】
政府支援に対する謝辞
本発明は、米国国立衛生研究所からの認可番号ＥＹ１３４３５（ＲＡ）およびＥＹ１１５１５（ＧＳＨ）による米国政府の支援により、また、米国国立衛生研究所国立癌研究所の契約番号ＮＯ１−ＣＯ−１２４０００による連邦政府補助金の援助を受けて、一部、米国政府機関によって為されたものである。米国連邦政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）は、黄斑、すなわち詳細な視覚像をもたらす、網膜の中心にある光受容体に富む領域に影響を与える変性性の眼疾患である。ＡＭＤは、通常、周辺視力を損なうことなく中心視力を突然悪化させる。ＡＭＤは、先進国における回復不可能な失明の最も一般的な形態である。この疾患は、一般的には、片方の眼の中心視力の低下を示し、その後数ヶ月から数年以内にもう一方の眼も同じように中心視力を失う。本疾患の臨床的兆候には、黄斑に沈着物（ドルーゼン）が現れることが含まれる。
【０００５】
主要な健康保険負担であるにもかかわらず、ＡＭＤの病因および発病機序は未だによく分かっていない。数多くの研究によって、ＡＭＤの病理生物学に炎症が関係するとされてきた（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、（２００２）Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１３４：４１１−３１；Ｈａｇｅｍａｎら、（２００１）Ｐｒｏｇ．Ｒｅｔｉｎ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．２０：７０５−３２；Ｍｕｌｌｉｎｓら、（２０００）Ｆａｓｅｂ Ｊ．１４：８３５−４６；Ｊｏｈｎｓｏｎら、（２００１）Ｅｘｐ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．７３：８８７−９６；Ｃｒａｂｂら、（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１４６８２−７；Ｂｏｋ，Ｄ．（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０２：７０５３−４）。補体経路の機能不全によって、黄斑部の細胞に重大なバイスタンダー損傷を引き起こし、その結果、他の補体介在性疾患過程で生じる損傷に類似した萎縮、変性、および脈絡膜新生血管膜の生成をもたらす可能性がある（Ｈａｇｅｍａｎら、（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０２：７２２７−３２；ＭｏｒｇａｎとＷａｌｐｏｒｔ（１９９１）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １２：３０１−６；Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ（１９９１）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １２：２９１−５；ＨｏｌｅｒｓとＴｈｕｒｍａｎ（２００４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：１４７−５２）。この疾患には、遺伝が強く関与している可能性がある。例えば、ＦＢＬＮ６、ＡＢＣＡ４、およびＡＰＯＥの各遺伝子の変異体がリスク因子に関係すると言われている。最近、第二補体経路の主要なインヒビターをコードしている補体Ｈ因子遺伝子（ＣＦＨ）の変異体が、ＡＭＤを発症するリスクの増加に関連していることが発見された（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。
【非特許文献１】Ｈａｉｎｅｓら、（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０８：４１９−２１
【非特許文献２】Ｋｌｅｉｎら、（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０８：３８５−９
【非特許文献３】Ｅｄｗａｒｄｓら、（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０８：４２１−４
【非特許文献４】Ｈａｇｅｍａｎら、（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０２：７２２７−３２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
この疾患の有病率と、利用できる治療法が限られているために、ＡＭＤを発症するリスクのある対象者を同定する方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
要旨
加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を防御する多型および遺伝子型が同定されている。ＡＭＤを発症するリスクが増大している対象を同定するための方法が提供されている。これらの方法は、対象のＢ因子（ＢＦ）および／または補体成分２（Ｃ２）の遺伝子を解析すること、ならびにその対象が、少なくとも１つの防御型多型をもつか否かを判定することを含むが、それらに限定されない。このような防御型多型の例には、（ａ）ＢＦ内のＲ３２Ｑ（ｒｓ６４１１５３）；（ｂ）ＢＦ内のＬ９Ｈ（ｒｓ４１５１６６７）；（ｃ）Ｃ２内のＩＶＳ１０（ｒｓ５４７１５４）；および（ｄ）Ｃ２内のＥ３１８Ｄ（ｒｓ９３３２７３９）などがある。あるいは、この方法は、対象の体内でタンパク質の変異体を検出することによって実施することができる。対象に、少なくとも１つの防御型多型がない場合には、その対象は、ＡＭＤを発症するリスクを増大させている。この態様の一つの実施形態では、さらに対象のＣＦＨ遺伝子の解析が行われる。いくつかの実施形態では、ＣＦＨ遺伝子座における対象の遺伝子型を解析して、その対象が少なくとも１つの防御遺伝子型を持っているか否かを判定することができる。一つの実施形態において、ＢＦ遺伝子座またはＣ２遺伝子座のどちらかとＣＦＨ遺伝子座における対象の遺伝子型を解析して、その対象が少なくとも１つの防御遺伝子型を持っているか否かを判定することができる。本明細書で後述するように、場合によっては、その多型性について対象がホモ接合であるかヘテロ接合であるかを知ることが参考になるであろう。
【０００８】
防御遺伝子型の例は、（ａ）ＢＦ内のＲ３２Ｑ（ｒｓ６４１１５３）多型についてヘテロ接合；（ｂ）ＢＦ内のＬ９Ｈ（ｒｓ４１５１６６７）多型についてヘテロ接合；（ｃ）Ｃ２内のＩＶＳ１０（ｒｓ５４７１５４）多型についてヘテロ接合；（ｄ）Ｃ２内のＥ３１８Ｄ（ｒｓ９３３２７３９）多型についてヘテロ接合；（ｅ）ＣＦＨのｄｅｌＴＴ多型についてホモ接合；（ｆ）ＢＦ内のＲ１５０Ｒ（ｒｓ１０４８７０９）多型についてホモ接合；および（ｇ）ＣＦＨ内のＹ４０２についてホモ接合などである。対象に、少なくとも１つの防御遺伝子型がない場合には、その対象は、ＡＭＤを発症するリスクを増大させている。
【０００９】
本発明は、ヒト対象における黄斑変性症またはその他の補体介在性疾患を発症するリスク、またはそれが進行している可能性を評価する方法を提供する。この方法の背景には、一定の遺伝的特徴を、補体関連疾患、今回の場合は加齢性黄斑変性症のリスク表現型または防御表現型に関連づける遺伝的関連研究によって為された発見である。本発明の方法は、ヒト対象から生体試料を得る工程、および、この試料を、当技術分野において既知の有効な技術によって解析して、その対象が以下の１つ以上を有するか否かを判定する工程を含む：
ＢＦ遺伝子のｒｓ６４１１５３においてＡまたはＧ：これは、ヒトＢＦタンパク質の３２位においてＲまたはＱに翻訳する；
ＢＦ遺伝子のｒｓ４１５１６６７においてＡまたはＴ：これは、ヒトＢＦタンパク質の９位においてＬまたはＨに翻訳する；
Ｃ２遺伝子のｒｓ５４７１５４においてＧまたはＴ：これはイントロン１０である；
Ｃ２遺伝子のｒｓ９３３２３７９においてＣまたはＧ：これは、ヒトＣ２タンパク質の３１８位においてＥまたはＤに翻訳する；
ＢＦ遺伝子のｒｓ１０４８７０９においてＡまたはＧ：これは、１５０位においてＲに翻訳する；
ＣＦＨ遺伝子におけるｄｅｌＴＴ；および
ＣＦＨ遺伝子のｒｓ１０６１１７０においてＣまたはＴ：これは、ヒトＣＦＨタンパク質の４０２位においてＹまたはＨに翻訳する。
【００１０】
一定の実施形態においては、試料を解析して、対象が以下の１つ以上を有するか否かを判定する：
ＢＦ遺伝子のｒｓ６４１１５３においてＡまたはＧ：これは、ヒトＢＦタンパク質の３２位においてＲまたはＱに翻訳する；
ＢＦ遺伝子のｒｓ４１５１６６７においてＡまたはＴ：これは、ヒトＢＦタンパク質の９位においてＬまたはＨに翻訳する；
Ｃ２遺伝子のｒｓ５４７１５４においてＧまたはＴ：これはイントロン１０である；および
Ｃ２遺伝子のｒｓ９３３２３７９においてＣまたはＧ：これは、ヒトＣ２タンパク質の３１８位においてＥまたはＤに翻訳する。
【００１１】
いくつかの実施形態において、試料は、血液もしくは血液成分、または尿など、利用しやすい体液である。評価をＤＮＡまたはｍＲＮＡのレベルで行う場合には、対象の細胞から遺伝子型を検出できるようにするために細胞材料が必要となる。
【００１２】
いくつかの実施形態において、対象は、ＡＭＤ、初期ＡＭＤ、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、または地図状萎縮（ＧＡ）などの症状と診断されていてもよい。一つの実施形態では、対象は、疾患の症状、例えば、ドルーゼンの発生など、初期の黄斑変性症の症状を示している。対象の中には、ドルーゼンの発生を示す者がいてもよい。対象は、黄斑変性症またはその他の補体関連疾患について無症状であってもよいが、その場合には、この解析は、集団全般について、またはリスクが高くなると考えられている何らかの部分集団、例えば、補体関連疾患の家族歴をもつ個人などについて行うことができるスクリーニング法を本質的には提供する。さらに別の対象は、ＡＭＤになるリスクが高いかもしれない。一つの実施形態では、対象はＹ４０２Ｈ ＳＮＰを有する。
【００１３】
したがって、別の態様において、本発明は、ヒト対象における黄斑変性症またはその他の補体介在性疾患を発症するリスク、またはそれが進行している可能性を評価するためのキットを提供する。本キットは、対象から採取した試料において、１つ以上、好ましくは２つ以上の上記多型または対立遺伝子変異体を検出するための一群の試薬を含む。本キットは、当技術分野において既知の方法をいくつか用いて変異体を検出するよう設計されたオリゴヌクレオチド、一般的には、標識されたオリゴヌクレオチドを含むことも可能である。本キットは、例えば、標的が多型である場合には、標的ポリヌクレオチドの配列を増幅するためのＰＣＲプライマー、または、例えば、モノクローナル抗体など、関連する遺伝子／プロテオミクス情報を試料から得るための基礎として標的タンパク質の対立遺伝子変異体を認識して、それに特異的に結合する特異的結合タンパク質を含むことができる。好適な実施形態では、本キットは、固体支持体に固定されたオリゴヌクレオチドを含む。
【００１４】
フォーマットに応じて、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を発症するリスクが高い対象を同定するためのキットの構成成分は、対象における少なくとも１つの防御型多型を検出するために１つ以上の試薬を含む。そのような試薬は、以下の少なくとも１つの防御型多型の検出を可能にする：（ａ）ＢＦ内のＲ３２Ｑ（ｒｓ６４１１５３）；（ｂ）ＢＦ内のＬ９Ｈ（ｒｓ４１５１６６７）；（ｃ）Ｃ２内のＩＶＳ１０（ｒｓ５４７１５４）；および（ｄ）Ｃ２内のＥ３１８Ｄ（ｒｓ９３３２７３９）。このようなキットにおける試薬は、防御型多型を検出する１つ以上のオリゴヌクレオチドを含むことが可能である。その他のキット構成成分は、標的配列が防御型多型の１つ以上を包含する場合には、その標的配列を増幅するための１つ以上の試薬を含むことも可能である。本キットのいくつかのバージョンでは、１つ以上のオリゴヌクレオチドが固体支持体に固定されている。
【００１５】
関連する態様において、本発明は、ＡＭＤを発症するリスクが高い対象を同定するためのマイクロアレイを提供する。さらなる態様において、本発明は、防御型多型を有する１つ以上の核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブを含むマイクロアレイを提供する。このような防御型多型の例には、（ａ）ＢＦ内のＲ３２Ｑ（ｒｓ６４１１５３）；（ｂ）ＢＦ内のＬ９Ｈ（ｒｓ４１５１６６７）；（ｃ）Ｃ２内のＩＶＳ１０（ｒｓ５４７１５４）；および（ｄ）Ｃ２内のＥ３１８Ｄ（ｒｓ９３３２７３９）などがある。このようなマイクロアレイは、さらに、例えば、以下の多型性を有する別の１つ以上の核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブを含むことができる：（ａ）ＣＦＨ内のｄｅｌＴＴ多型；（ｂ）ＢＦ内のＲ１５０Ｒ多型；および（ｃ）ＣＦＨ内のＹ４０２Ｈ多型。
【００１６】
上記した本開示の特徴および利点、ならびにその他の特徴および利点は、以下のいくつかの実施形態の詳細な説明からより明らかになるであろう。
【００１７】
配列
添付した配列表に列挙された核酸配列およびアミノ酸配列は、米国特許施行規則第１．８２２条に規定されているように、ヌクレオチド塩基については標準的な省略文字で、また、アミノ酸については３文字コードを用いて示されている。各核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、表示されている鎖に言及することによって、その相補鎖も含まれると解される。本明細書において参照されている配列データベースのアクセッション番号はすべて、指定された日付に利用することができたものであるから、そのアクセッション番号によって識別されているバージョンの配列を意味するものと理解される。
【００１８】
配列番号１は、２００６年１月３０日（２００６年１月５日修正）にＮＣＢＩを介して利用可能であったｒｅｆＳＮＰ ＩＤ：ｒｓ６４１１５３のＳＮＰに基づいている。このＳＮＰは、ＢＦ遺伝子の２２位のヌクレオチドがＡまたはＧで、Ｒ３２Ｑ変異体（３２位のアミノ酸がアルギニンではなくグルタミン）を生じさせる。Ｒ３２Ｑをもたらす配列は、ＣＣＡＣＴＣＣＡＴＧＧＴＣＴＴＴＧＧＣＣＣＲＧＣＣＣＣＡＧＧＧＡＴＣＣＴＧＣＴＣＴＣＴであるが、ただし、Ｒ＝ＡまたはＧである（配列番号１）。
【００１９】
配列番号２は、２００６年１月３０日（２００６年１月５日修正）にＮＣＢＩを介して利用可能であったｒｅｆＳＮＰ ＩＤ：ｒｓ４１５１６６７のＳＮＰを示している。このＳＮＰは、ＢＦ遺伝子の２６位のヌクレオチドがＡまたはＴで、Ｌ９Ｈ変異体（９位のアミノ酸がロイシンではなくヒスチジン）を生じさせる。ｒｓ４１５１６６７をもたらす配列は、ＡＴＧＧＧＧＡＧＣＡＡＴＣＴＣＡＧＣＣＣＣＣＡＡＣＲＣＴＧＣＣＴＧＡＴＧＣＣＣＴＴＴＡＴＣＴＴＧＧＧＣであるが、ただし、Ｒ＝ＡまたはＴである（配列番号２）。
【００２０】
配列番号３は、２００６年１月３０日（２００６年１月５日修正）にＮＣＢＩを介して利用可能であったｒｅｆＳＮＰ ＩＤ：ｒｓ５４７１５４のＳＮＰに基づいている。このＳＮＰは、Ｃ２遺伝子のイントロン１０の２３位のヌクレオチドがＧまたはＴになっている。ｒｓ５４７１５４をもたらす配列は、ＧＡＧＧＡＧＣＣＣＧＣＣＡＧＡＧＧＣＣＣＧＴＲＴＴＧＧＧＡＡＣＣＴＧＧＡＣＡＣＡＧＴＧＣＣＣであるが、ただし、ＲはＧまたはＴである（配列番号３）。
【００２１】
配列番号４は、２００６年１月３０日（２００６年１月５日修正）にＮＣＢＩを介して利用可能であったｒｅｆＳＮＰ ＩＤ：ｒｓ９３３２７３９のＳＮＰを示している。このＳＮＰは、Ｃ２遺伝子の２６位のヌクレオチドがＣまたはＧで、Ｅ３１８Ｄ変異体（３１８位のアミノ酸がグルタミン酸ではなくアスパラギン酸）を生じさせる。ｒｓ９３３２７３９をもたらす配列は、ＡＣＧＡＣＡＡＣＴＣＣＣＧＧＧＡＴＡＴＧＡＣＴＧＡＲＧＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＡＡＡＴＧＣＣＡであるが、ただし、ＲはＣまたはＧである（配列番号４）。
【００２２】
配列番号５は、２００６年１月３０日（２００６年１月５日修正）にＮＣＢＩを介して利用可能であったｒｅｆＳＮＰ ＩＤ：ｒｓ１０４８７０９のＳＮＰを示している。このＳＮＰは、ＢＦ遺伝子の２６位のヌクレオチドがＡまたはＧになっている。このＳＮＰは、１５０位のアミノ酸変異を生じさせない（Ｒ１５０Ｒ）。ｒｓ１０４８７０９をもたらす配列は、ＡＴＣＧＣＡＣＣＴＧＣＣＡＡＧＴＧＡＡＴＧＧＣＣＧＲＴＧＧＡＧＴＧＧＧＣＡＧＡＣＡＧＣＧＡＴＣＴＧＴＧであるが、ただし、ＲはＡまたはＧである（配列番号５）。
【００２３】
配列番号６および７は、ｄｅｌＴＴ多型配列を示している。ｄｅｌＴＴ多型は、２ｂｐの挿入／欠失多型である。この配列は以下の通りである。ＣＣＴＴＧＣＴＡＴＴＡＣＡＴＡＣＴＡＡＴＴＣＡＴＡＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＡＧＡＡＡＧＧＣＣＣＴＧＴＧＧＡＣＡ（配列番号６）およびＣＣＴＴＧＣＴＡＴＴＡＣＡＴＡＣＴＡＡＴＴＣＡＴＡＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＡＧＡＡＡＧＧＣＣＣＴＧＴＧＧＡＣＡ（配列番号７）。
【００２４】
配列番号８は、２００６年１月３０日（２００６年１月５日修正）にＮＣＢＩを介して利用可能であったｒｅｆＳＮＰ ＩＤ：ｒｓ１０６１１７０のＳＮＰを示している。このＳＮＰは、エキソン９の１２７７位のヌクレオチドがＣまたはＴで（以下の配列で２６位のヌクレオチド）、ＣＦＨ遺伝子のＹ４０２Ｈ変異体（４０２位のアミノ酸がチロシンではなくヒスチジン）を生じさせる。ｒｓ１０６１１７０をもたらす配列は、ＴＴＴＧＧＡＡＡＡＴＧＧＡＴＡＴＡＡＴＣＡＡＡＡＴＲＡＴＧＧＡＡＧＡＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＧＧＧＴＡＡであるが、ただし、ＲはＣまたはＴである（配列番号８）。
【００２５】
配列番号９は、９Ｈおよび３２Ｒである、ＢＦの全アミノ酸配列を示している：
【００２６】
【化１】
【００２７】
【化２】
【００２８】
【化３】
配列番号１３は、３２Ｑである、ＢＦの９個のアミノ酸配列を示している：ｗｓｌａｑｐｑｇｓ（配列番号１３）。
【００２９】
配列番号１４は、９Ｈである、ＢＦの９個のアミノ酸配列を示している：ｌｓｐｑｈｃｌｍｐ（配列番号１４）。
【００３０】
配列番号１５は、３１８Ｄである、Ｃ２の７個のアミノ酸配列を示している：ｄｍｔｄｖｉｓ（配列番号１５）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
発明の詳細な説明
本明細書では、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）に対して防御作用があることが見出された配列多型が提供される。これらの多型は、Ｂ因子（ＢＦ）遺伝子および補体成分２（Ｃ２）遺伝子内に見出されるものを含む。防御多型は、ＣＦＨ遺伝子内にあるｄｅｌＴＴ多型も含む。これらの多型を有する対象を、最近発見されたリスクハプロタイプ（補体Ｈ因子（ＣＦＨ）遺伝子内のＹ４０２Ｈ）を有する対象とともに同定することは、ＡＭＤの遺伝的リスクに直面している対象を診断するのに役立つであろう。
【００３２】
用語
以下の用語および方法について説明は、本開示をよりよく説明するため、また、本開示を実施する際に当業者の指針となるよう提供するものである。単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈によって明確に別様であることが示されない限り、１つまたは２つ以上を意味する。例えば、「１つの核酸を含む」という用語は、単数または複数の核酸を含み、「少なくとも１つの核酸を含む」という語句と同一であるとみなされる。「ｏｒ」という用語は、文脈によって明確に別様であることが示されない限り、明示された選択的要素のうちの単一の要素、または２つ以上の要素の組み合わせを意味する。本明細書において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」ことを意味する。したがって、「ＡまたはＢを含む」は、更なる要素を排除することなく、「Ａ、Ｂ、またはＡおよびＢを包含する」ことを意味する。例えば、「変異または多型」または「１つ以上の変異または多型」という語句は、１つの変異、１つの多型、またはこれらの組み合わせを意味するが、ただし、「１つ」は１つ以上を意味することもできる。
【００３３】
本明細書に記載されている方法および材料に類似または同等の方法および材料を、本開示を実施または試験する際に用いることができるが、適当な方法および材料を下記に記載する。これらの材料、方法、および例は例示的なものにすぎず、限定的なものではない。
【００３４】
別段の記載がない限り、技術用語は従来の用法に従って用いられる。分子生物学の一般的な用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｖ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓより発行，１９９４（ＩＳＢＮ ０−１９−８５４２８７−９）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．より発行，１９９４（ＩＳＢＮ ０−６３２−０２１８２−９）；およびＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．より発行，１９９５（ＩＳＢＮ １−５６０８１−５６９−８）に見出すことができる。
【００３５】
加齢性黄斑変性症：黄斑における光感知細胞が機能不全に陥り、やがて機能を停止する病状。黄斑変性症において、最終形態もしくは疾患は、視野の中央にある読み取り部の視覚の喪失または低下をもたらす。視野の外側の周辺部は損なわれない。ＡＭＤは、さらに、「乾燥」型すなわち非滲出型、および「湿潤」型すなわち滲出型に分けられる。８５から９０パーセントの症例が、ドルーゼンとして知られている脂肪組織が網膜の裏側にゆっくりと蓄積する「乾燥」型黄斑変性症に分類される。乾燥型黄斑変性症の古典的な病変は地図状の萎縮である。１０から１５パーセントの症例が、網膜下での異常な血管増殖を伴う。これらの症例は、眼球内に網膜の裏側から血液およびその他の液体が漏出するため、「湿潤」型黄斑変性症と呼ばれる。湿潤型黄斑変性症は、大抵、乾燥型として始まる。治療しないままでおくと、これは、通常、黄斑の構造および機能を完全に破壊する。脈絡膜新生血管は、網膜の網膜色素上皮（ＲＰＦ）層直下で異常血管が成長したものである。
【００３６】
湿潤型黄斑変性症には、薬物療法、光線力学療法、レーザー光凝固療法、およびレーザー療法を使用することができる。ＡＭＤの危険因子には、加齢、喫煙、家族歴、日光とりわけ青色光への曝露、高血圧、高コレステロールおよび肥満などの心血管系危険因子、高脂肪摂取、酸化的ストレス、ならびに人種などがある。
【００３７】
ＡＭＤは、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）、および大動脈瘤を発症する素因も含む、第二補体カスケードの調節異常を特徴とする疾患の例である。ＡＭＤ発症リスクの増加を検出するための、本明細書記載の方法は、第二補体カスケードの調節異常を特徴とするその他の疾患（例えば、ＭＰＧＮ）に対するリスクの増大を検出するために用いることもできる。
【００３８】
対立遺伝子：染色体上で所定の遺伝子座（位置）を占めている同じ遺伝子のいくつかある実行可能なＤＮＡ暗号の任意の１つ（時には、この用語は非遺伝子配列を意味することもある）。その遺伝子に関する個体の遺伝子型は、それが偶然持っている対立遺伝子のセットとなるはずである。その染色体各々のコピーを２つずつ持つ生物（２倍体生物）において、２つの対立遺伝子が個体の遺伝子型を構成する。２倍体生物において、遺伝子の２つのコピーが同一であれば、すなわち、同じ対立遺伝子を持つ場合は、その遺伝子についてホモ接合であるという。その遺伝子で２つの相異なる対立遺伝子を持つ２倍体生物をヘテロ接合であるという。
【００３９】
本明細書において、「対立遺伝子検出」する過程を、「対立遺伝子または多型を遺伝子型判定、決定、または同定する」、あるいは同じような言い回しで表すことができる。実際に検出された対立遺伝子は、対象のゲノムＤＮＡ内で明らかになるが、この領域から転写または翻訳されたＲＮＡ配列またはタンパク質配列からも検出することができるかもしれない。
【００４０】
増幅：試料中の核酸分子のコピー数を増やす技術を用いること。インビトロ増幅法の例は、試料中の核酸分子にオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせることができる条件下で、対象から得られた生体試料を一対のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させるポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）である。これらのプライマーを、適当な条件下で伸長させ、鋳型から分離し、そして、リアニール、伸長、および分離させて核酸分子のコピー数を増幅する。増幅した産物は、電気泳動、制限酵素切断パターン、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションまたはライゲーション、および／または核酸シーケンシングなどの技術によって特徴付けることができる。
【００４１】
増幅法のその他の例には、米国特許第５，７４４，３１１号に開示されている鎖置換増幅法；米国特許第６，０３３，８８１号に開示されている無転写等温増幅法；ＰＣＴ公開公報第ＷＯ９０／０１０６９に開示されている修復連鎖反応増幅法；ＥＰ−Ａ−３２０，３０８に開示されているリガーゼ連鎖反応増幅法；米国特許第５，４２７，９３０号に開示されているギャップ充填リガーゼ連鎖反応増幅法；および米国特許第６，０２５，１３４号に開示されている商標ＮＡＳＢＡ無ＲＮＡ転写増幅法などがある。増幅法は、例えば、追加的工程によるか、増幅法を別のプロトコルと結合させることによって改変することができる。
【００４２】
アレイ：分子、具体的には（ポリペプチドもしくは核酸などの）生体高分子、または細胞もしくは組織の試料を、基質上のアドレス可能な位置または基質中に並べたもの。「マイクロアレイ」は、小型化して、評価または解析するために顕微鏡検査を必要とするか、またはそれによって補助されるアレイである。これらのアレイはＤＮＡチップ、または一般的には、バイオチップと呼ばれることがあるが、より正式にはマイクロアレイと呼ばれ、個体の遺伝子パターンを検査する工程は、マイクロアレイプロファイリングと呼ばれることもある。ＤＮＡアレイの製造化学法および構造は多様であり、一般的には、それぞれが異なったヒト遺伝子に由来するＤＮＡを保持する、４００，０００の異なったフィーチャーからなるが、場合によっては、７８０，０００個もの個別のフィーチャーをパターン化するために固体化学を用いることもある。
【００４３】
分子のアレイ（「フィーチャー」）によって、ある試料について同時に非常に多数の解析を行うことが可能になる。一定のアレイの例では、例えば、内部標準を提供するために、１つ以上の分子（オリゴヌクレオチドプローブなど）が複数回（２回など）アレイ上に存在するであろう。アレイ上のアドレス可能な位置の数は、例えば、数個（３個など）から少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも２５０個、少なくとも３００個、少なくとも５００個、少なくとも６００個、少なくとも１０００個、少なくとも１０，０００個、またはそれ以上まで変えることができる。具体的な例において、アレイは、例えば、長さが少なくとも１５ヌクレオチドあるオリゴヌクレオチド配列、例えば、長さ約１５〜４０ヌクレオチド、例えば、長さが少なくとも１８ヌクレオチド、長さが少なくとも２１ヌクレオチド、あるいはさらに長さが少なくとも２５ヌクレオチドの核酸分子を含む。一例において、この分子はその５’末端または３’末端を介してアレイに付着したオリゴヌクレオチドを含む。
【００４４】
アレイ内部で、アレイに配置された試料はそれぞれ、アレイの少なくとも２次元以内で確実かつ一貫して決定することができるという点でアドレス可能である。アレイ上のフィーチャー適用部位は、さまざまな形をとることができる。例えば、アレイは規則的（均一な行および列に配置されている）であっても不規則であってもよい。すなわち、規則的なアレイ内では、各試料の位置は、それが適用された時点でその試料に割り当てられ、それぞれの位置を適当な標的部位またはフィーチャー部位と関連づけるためにキーが提供されるかもしれない。しばしば、規則的アレイは対称なグリッドパターン状に並べられるが、別のパターンで（例えば、放射線状、渦巻線状、または規則的クラスター状に）試料を並べることもできる。アドレス可能なアレイは、通常、コンピューターをプログラムして、アレイ上の特定のアドレスを、その位置にある試料に関する情報（例えば、シグナル強度など、ハイブリダイゼーションまたは結合のデータ）と関連づけることができるという点でコンピューター可読型である。コンピューター可読型フォーマットのいくつかの例では、アレイ内の個々のフィーチャーは、例えば、デカルト格子のパターンに規則的に並べられているため、コンピューターによってアドレス情報を関連づけることができる。
【００４５】
また、プローブ分子がタンパク質であるかタンパク質を含むか、または標的分子がタンパク質であるかタンパク質を含むタンパク質ベースのアレイ、およびタンパク質／ペプチドが結合している核酸を含むアレイまたはその逆のアレイも、本明細書において想定されている。
【００４６】
結合または安定型結合：２つの物質または分子の間における結合、例えば、１つの核酸分子と別の核酸分子（またはそれ自身）とのハイブリダイゼーション、および抗体とペプチドとの会合など。十分な量のオリゴヌクレオチド分子が塩基対を形成したり、その標的核酸分子とハイブリダイズしたりすれば、オリゴヌクレオチド分子は標的核酸分子に結合もしくは安定的に結合して、その結合を検出することが可能になる。当業者に周知の任意の手順によって、例えば、標的オリゴヌクレオチド複合体の物理的または機能的な特性などによって、結合を検出することができる。例えば、結合が、遺伝子の発現、ＤＮＡ複製、転写、翻訳などの生合成過程に観察可能な影響を及ぼしているかを判定することによって結合を機能的に検出することができる。
【００４７】
核酸分子の相補鎖の結合を検出する物理的方法には、ＤＮＡ分解酵素１または化学的フットプリント法、ゲルシフトアッセイ法およびアフィニティー切断アッセイ法、ノーザンブロット法、ドットブロット法、ならびに光吸収検出法などがあるが、これらに限定されない。例えば、一つの方法は、オリゴヌクレオチド（または類似体）および標的核酸を含む溶液の光吸収が、温度を徐々に上げると、２２０ｎｍから３００ｎｍで変化するのを観察することを含む。このオリゴヌクレオチドまたは類似体がその標的に結合した場合には、オリゴヌクレオチド（または類似体）と標的が互いに乖離するか、溶解するにつれて、特徴的な温度で吸収の急増が見られる。別の例において、この方法は、相補鎖の一方または両方の上に存在するシグナル、例えば、検出可能な標識を検出することを含む。
【００４８】
オリゴマーとその標的核酸との結合は、しばしば、オリゴマーの５０％がその標的から溶失する温度（Ｔｍ）で特徴づけられる。（Ｔｍ）が高いほど、より低い（Ｔｍ）の複合体と比較して、より強くまたはより安定的な複合体であることを意味する。
【００４９】
補体成分２（Ｃ２）：補体系の古典的経路の一部。活性化Ｃ１は、Ｃ２をＣ２ａおよびＣ２ｂに切断する。Ｃ２ａはＣ３の活性化をもたらす。Ｃ２の欠損が、全身性狼そうエリテマトーデス、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、または多発性筋炎など、一定の自己免疫疾患と関連していることが報告されている。Ｃ２はＥＣ３．４．２１．４３の一員である。これは、古典的補体経路Ｃ３／Ｃ５転換酵素としても知られている。
【００５０】
補体因子Ｈ：別名β−１Ｈとしても知られている。第二補体経路の機能を調節し、第Ｉ因子（Ｃ３ｂ不活性化因子）の補因子として働く血清糖タンパク質。これは、Ｃ４ｂ２ａなどのＣ３転換酵素の活性を調節する。
【００５１】
相補性および相補率：相補的核酸を有する分子は、鎖が、ワトソン−クリック型、フーグスティーン型、または逆フーグスティーン型の塩基対合を形成することによって、互いに結合（ハイブリダイズ）し合うと、安定した二重鎖または三重鎖を形成する。オリゴヌクレオチド分子が、所要の条件下で標的核酸配列に検出可能な形で結合した状態にあるときに、安定した結合が生じる。
【００５２】
相補性とは、１つの核酸鎖の中の塩基が、別の核酸鎖の塩基と塩基対合する程度のことである。相補性は百分率、すなわち、２本の鎖の間において、または２本の鎖の特定の領域もしくはドメインの内部において塩基対を形成するヌクレオチドの割合で便宜的に表記される。例えば、１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドのうちの１０ヌクレオチドが、ＤＮＡ分子の標的領域と塩基対を形成するならば、そのオリゴヌクレオチドは、標的とされたＤＮＡの領域と６６．６７％の相補性を有するということになる。
【００５３】
本開示において、「十分な相補性」とは、オリゴヌクレオチド分子と標的核酸配列（ＣＦＨ、ＢＦまたはＣ２の配列など）との間に十分な数の塩基対が存在するために検出可能な結合に達することを意味する。形成された塩基対の割合で表示または測定される場合、この目的を達成する相補率は、わずか約５０％の相補性から完全な（１００％の）相補性までの範囲に及びうる。一般的に、十分な相補性とは、少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約７５％の相補性、少なくとも約９０％の相補性、少なくとも約９５％の相補性、少なくとも約９８％の相補性、または更には少なくとも約１００％の相補性である。
【００５４】
当業者が、所望の条件下で使用するのに適したオリゴヌクレオチドを設計できるようにする結合条件を定めることに関係する定性的かつ定量的な条件の完全な処理法が、Ｂｅｌｔｚら（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １００：２６６−２８５；およびＳａｍｂｒｏｏｋら、（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載されている。
【００５５】
ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）：ほとんどの生物の遺伝物質（いくつかのウイルスはリボヌクレオチドであるＲＮＡを含む遺伝子を持っている）を含む長鎖重合体。ＤＮＡ高分子の繰り返し単位は４種類のヌクレオチドであり、それぞれが、リン酸基が付着しているデオキシリボース糖に結合している４種類の塩基（アデニン、グアニン、シトシン、およびチミン）のうちの１つを含む。ＤＮＡ分子内の、コドンと呼ばれるヌクレオチドのトリプレットが、ポリペプチドのアミノ酸をコードしている。コドンという用語は、ＤＮＡ配列が転写されるｍＲＮＡ内の３つのヌクレオチドの対応（および相補）配列にも用いられる。
【００５６】
ドルーゼン：ＲＰＥ基底層とブルッフ膜の内部膠質層との間に蓄積する沈着物（例えば、ｖａｎ ｄｅｒ Ｓｃｈａｆｔら（１９９２）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．９９：２７８−８６；Ｓｐｒａｕｌら（１９９７）Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１１５：２６７−７３；およびＭｕｌｌｉｎｓら、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｏｃｕｌａｒ“ｄｒｕｓｅｎ”ｉｎ ｍｏｎｋｅｙ ａｎｄ ｈｕｍａｎ，Ｉｎ Ｍ．ＬａＶａｉｌ，Ｊ．Ｈｏｌｌｙｆｉｅｌｄ，ａｎｄ Ｒ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ（Ｅｄｓ．），ｉｎ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｒｅｔｉｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ（ｐｐ．１−１０）．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９９７参照）。硬性ドルーゼンは、均質な好酸性物質を含む、小さな独特の沈着物であり、通常、円形または半球形で、傾斜した辺縁をもたない。軟性ドルーゼンはより大型で、通常は均質でなく、一般的には、介在物および球状の輪郭を含む。ドルーゼンには石灰化しているものもあるかもしれない。ブルッフ膜の内部膠質層と網膜色素上皮（ＲＰＥ）との間に層を形成する無定形の物質を描写するために「散在性ドルーゼン」または「基層線状沈着物」という用語を用いる。この物質は、盛り上がっていないこと以外は、組織学的に軟性ドルーゼンと類似して見えることがある。
【００５７】
Ｂ因子（ＢＦ）：第二補体活性化経路内の補体３の活性化因子前駆体。ｂ因子は、ｄ因子によってｃ３転換酵素に変えられる。ＢＦはＥＣ３．４．２１．４７の仲間である。Ｂ因子は、一本鎖ポリペプチドとして血液中を循環する。これは、第二経路が活性化されると、補体因子ｄによって切断されて、非触媒鎖Ｂａおよび触媒サブユニットＢｂになる。活性型サブユニットＢｂは、Ｃ３ｂと結びついて第二経路Ｃ３転換酵素を形成するセリンプロテアーゼである。ＢＦは第二補体経路Ｃ３／Ｃ５転換酵素としても知られている。
【００５８】
遺伝的素因またはリスク：遺伝性疾患、例えば、ＡＭＤなどに対する対象の感受性。ただし、この感受性は、病気を実際に発症させる結果となることもあれば、ならないこともある。
【００５９】
ハプロタイプ：個々の染色体の遺伝子構成。２倍体生物において、ハプロタイプは、各部位に関する対立遺伝子対の一方を含む。ハプロタイプは、１つの遺伝子座だけを意味したり、全ゲノムを意味したりすることがある。また、ハプロタイプは、単一の染色分体上で統計学的に関連していると認められた一組の一塩基多型（ＳＮＰ）も意味することがある。
【００６０】
ハイブリダイゼーション：オリゴヌクレオチドおよびその類似体は、相補的塩基の間で、ワトソン−クリック型、フーグスティーン型、または逆フーグスティーン型の水素結合など、水素結合によってハイブリダイズする。一般的に、核酸は、ピリミジン（シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）、およびチミン（Ｔ））またはプリン（アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ））のいずれかである窒素含有塩基からなる。これらの窒素含有塩基は、ピリミジンとプリンの間に水素結合を形成し、このピリミジンとプリンとの結合を「塩基対合」と呼ぶ。より具体的には、ＡはＴまたはＵと水素結合し、ＧはＣと結合するはずである。「相補」は、２つの別個の核酸配列間、または同一核酸配列の２つの別個の領域間に生じる塩基対合を意味する。
【００６１】
「特異的にハイブリダイズ可能」および「特異的に相補的」とは、オリゴヌクレオチド（またはその類似体）と、ＤＮＡまたはＲＮＡの標的との間に安定的で特異的な結合を生させるのに十分な程度の相補性を表す用語である。オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は、特異的にハイブリダイズ可能な、その標的配列と１００％相補的でなくともよい。オリゴヌクレオチドまたは類似体が、標的であるＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子に結合すると、その標的ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子の正常な機能を妨げ、かつ、そのオリゴヌクレオチドまたは類似体が、特異的な結合が望まれる条件下、例えば、インビボにおけるアッセイまたは系の場合には生理学的条件下で、標的以外の配列に非特異的に結合するのを回避できる程度の相補性があるときには、オリゴヌクレオチドまたは類似体は特異的にハイブリダイズ可能である。このような結合は、特異的ハイブリダイゼーションと呼ばれる。
【００６２】
特定の度合いのストリンジェンシーをもたらすハイブリダイゼーション条件は、選択されたハイブリダイゼーション法の性質、およびハイブリダイズする核酸配列の組成および長さに依存して変化する。一般的には、ハイブリダイゼーション温度およびハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度（特にＮａ＋および／またはＭｇ＋＋の濃度）によって、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが決定されるが、ただし、洗浄回数もストリンジェンシーに影響を及ぼす。特定の度合いのストリンジェンシーを達成するのに必要なハイブリダイゼーション条件に関する計算法が、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９，ｃｈａｐｔｅｒｓ ９ ａｎｄ １１；およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９によって検討されている。
【００６３】
本開示の目的では、「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイズする分子と標的配列との間に２５％よりも低いミスマッチが存在する場合にのみハイブリダイゼーションが起こる条件を含む。「ストリンジェントな条件」は、より正確に定義するために、特定のレベルのストリンジェンシーに分類してもよい。すなわち、本明細書において、「緩やかなストリンジェンシー」条件は、２５％よりも大きな配列ミスマッチのある分子がハイブリダイズしない条件であり、「中程度のストリンジェンシー」条件は、１５％よりも大きな配列ミスマッチのある分子がハイブリダイズしない条件であり、「高ストリンジェンシー」条件は、２０％よりも大きな配列ミスマッチのある分子がハイブリダイズしないものである。「極度な高ストリンジェンシー」条件は、１０％よりも大きな配列ミスマッチのある分子がハイブリダイズしない条件である。
【００６４】
以下は、一連のハイブリダイゼーション条件の例であって、限定的なものではない。
【００６５】
極度な高ストリンジェンシー（９０％の同一性を有する配列を検出する）
ハイブリダイゼーション：５×ＳＳＣ、６５℃にて１６時間
２回洗浄：２×ＳＳＣ、室温（ＲＴ）にて１５分間ずつ
２回洗浄：０．５×ＳＳＣ、６５℃にて２０分間ずつ
高ストリンジェンシー（８０％以上の同一性を有する配列を検出する）
ハイブリダイゼーション：５×〜６×ＳＳＣ、６５℃〜７０℃にて１６〜２０時間
２回洗浄：２×ＳＳＣ、ＲＴにて５〜２０分間ずつ
２回洗浄：１×ＳＳＣ、５５℃〜７０℃にて３０分間ずつ
低ストリンジェンシー（５０％以上の同一性を有する配列を検出する）
ハイブリダイゼーション：６×ＳＳＣ、ＲＴ〜５５℃にて１６〜２０時間
少なくとも２回洗浄：２×〜３×ＳＳＣ、ＲＴ〜５５℃にて２０〜３０分間ずつ
単離された：「単離された」生体成分（核酸分子、タンパク質、またはオルガネラなど）は、その成分が天然に存在する生物の細胞内にある他の生体成分、例えば、他の染色体および染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質、ならびにオルガネラから実質的に分離または精製されている。「単離された」核酸分子およびタンパク質には、標準的な精製法によって精製された核酸分子およびタンパク質が含まれる。また、この用語は、宿主細胞内で組み換え発現によって調製された核酸分子およびタンパク質、および化学的に合成された核酸分子およびタンパク質も含む。
【００６６】
連鎖不平衡（ＬＤ）：必ずしも同じ染色体上にはない２つ以上の遺伝子座における対立遺伝子のランダムでない関連性。ＬＤは、集団内で、対立遺伝子または遺伝子マーカーのいくつかの組み合わせが、それらの頻度に基づいて、対立遺伝子からハプロタイプがランダムに形成されるときに期待されるよりも高いかまたは低い頻度で存在している状態を表している。独立して遺伝する２つの対立遺伝子が存在する期待頻度は、第１の対立遺伝子の頻度に第２の対立遺伝子の頻度を乗じたものである。期待頻度で共存する対立遺伝子は、連鎖平衡しているという。
【００６７】
遺伝子座：染色体上の遺伝子（あるいは、他の重要な配列）の位置。
【００６８】
突然変異：遺伝子または染色体内部のＤＮＡ配列の変化。いくつかの例において、突然変異は、特性または形質（表現型）を変化させるが、必ずしもそうなるわけではない。突然変異の種類には、塩基置換点突然変異（例えば、トランジションまたはトランスバージョン）、欠失、および挿入などがある。ミスセンス変異は、コードされたタンパク質の配列の中に別のアミノ酸を導入する変異であり、ナンセンス変異は、新たな終止コドンを導入する変異である。挿入または欠失の場合、突然変異は、インフレーム（配列全体のフレームを変えない）の場合もあり、フレームシフト変異の場合もあるが、これは、多数のコドンの読み誤りを生じさせる可能性がある（また、別のフレーム内に終止コドンが存在するために、コードされた産物の異常終止をもたらすことがしばしばある）。
【００６９】
この用語は、具体的には、体細胞変異によって生じる変異、例えば、特定の個体において病気細胞のみに見られるが、体質的には見られない変異を含む。このような体細胞的に獲得された変異の例には、癌の発症に関与するさまざまな遺伝子の機能の変化をしばしばもたらす点変異が含まれる。また、この用語は、体質的に存在し、コードされたタンパク質の機能を容易に明らかにできる形で変更し、かつ、罹患した個体の子供に遺伝する可能性があるＤＮＡの変化も含む。この点で、この用語は下記に定義される「多型」と重複するが、一般的には、体質的な変化のサブセットを意味する。
【００７０】
核酸分子：重合体型のヌクレオチドであって、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ならびにこれらの合成型および混合型重合体のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、またはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾型を意味する。本明細書において「核酸分子」は「核酸」および「ポリヌクレオチド」と同義的である。核酸分子は、別段の記載がない限り、通常、長さが少なくとも１０塩基である。この用語は、一本鎖型および二本鎖型のＤＮＡを含む。ポリヌクレオチドは、天然型および／または非天然型のヌクレオチド結合によって結合している天然型および修飾型のヌクレオチドの一方または両方を含むことができる。
【００７１】
ヌクレオチド：ピリミジン、プリンもしくはそれらの合成類似体など、糖に結合した塩基、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）におけるように、アミノ酸に結合した塩基を含む単量体などであるが、これらに限定されない。ヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの中の１個の単量体である。ヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド中の塩基の配列を意味する。
【００７２】
オリゴヌクレオチド：一般に、長さ３００塩基以下からなる核酸分子。この用語は、しばしば、一本鎖デオキシリボヌクレオチドを意味するが、同様に、とりわけ、一本鎖または二本鎖のリボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、および二本鎖ＤＮＡも意味する。「オリゴヌクレオチド」という用語は、オリゴヌクレオシド（すなわち、リン酸を持たないオリゴヌクレオチド）およびその他の有機塩基重合体も含む。いくつかの例において、オリゴヌクレオチドは長さが約１０から約９０塩基、例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０塩基の長さである。その他のオリゴヌクレオチドは、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０塩基、約６５塩基、約７０塩基、約７５塩基、または約８０塩基の長さである。オリゴヌクレオチドは、例えば、プローブまたはプライマーとして用いるためには一本鎖であってもよく、例えば、突然変異遺伝子を構築する際に用いるには二本鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドは、センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれであってもよい。核酸分子に関して上述したように、オリゴヌクレオチドを修飾することができる。オリゴヌクレオチドは、既存の核酸由来源（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）から得ることができるが、合成（例えば、研究室またはインビトロでのオリゴヌクレオチド合成によって作出）することもできる。
【００７３】
多型：遺伝子配列における変異。多型は、個体間、または異なった民族の間、およびに地理的位置間に見られる変異（ＤＮＡ配列の差異）であって、異なった配列をもっていても、機能的に同等の遺伝子産物を産生する変異であってもよい。また、この用語は、機能的に同等でない遺伝子産物を生じうる配列の変異体も意味する。また、多型は、機能が変化しているかもしれない遺伝子産物を生じさせることができる対立遺伝子および／または変異として分類することができる変異も含む。また、多型は、遺伝子産物を生じさせないか、または不活性な遺伝子産物、または異常な割合で、もしくは不適切な組織の中で、もしくは不適切な刺激に応答して活性型遺伝子産物を産生する対立遺伝子および／または変異として分類することができる変異も含む。さらに、この用語は、必要に応じて、対立遺伝子と同義的に用いられる。
【００７４】
多型は、例えば、変異が存在するヌクレオチドの位置で、ヌクレオチドの変異によって生じたアミノ酸配列の変化で、または変異と連関した核酸分子もしくはタンパク質のその他何らかの特徴の変化で言及されることもある。
【００７５】
プローブおよびプライマー：プローブは、標的核酸配列を認識する、同定可能な、単離核酸を含む。プローブは、アドレス可能な位置、検出可能な標識、またはその他のレポーター分子に付着している核酸であって、標的配列とハイブリダイズする核酸を含む。一般的な標識には、放射性同位元素、酵素基質、補因子、リガンド、化学発光性もしくは蛍光性の薬剤、ハプテン、および酵素などがある。標識する方法、およびさまざまな目的に適した標識を選択する際の指針が、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９で論じられている。
【００７６】
プライマーは短い核酸分子、例えば、連続した相補的なヌクレオチドまたは増幅すべき配列にハイブリダイズする、例えば、長さ１０ヌクレオチド以上のＤＮＡオリゴヌクレオチドである。それより長いＤＮＡオリゴヌクレオチドは長さが約１５、２０、２５、３０または５０ヌクレオチド以上あってもよい。プライマーを、核酸ハイブリダイゼーションによって、相補的な標的ＤＮＡ鎖にアニールさせて、プライマーと標的ＤＮＡ鎖との間にハイブリッドを形成させ、その後、ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって標的ＤＮＡ鎖に沿ってプライマーを伸長させることができる。プライマー対は、後述するように、例えば、ＰＣＲ法または当技術分野において既知の核酸増幅法によって、核酸配列の増幅に用いることができる。
【００７７】
核酸のプローブおよびプライマーを調製して用いるための方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９；ＡｕｓｕｂｅｌらＳｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９；およびＩｎｎｉｓらＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０に記載されている。増幅プライマー対は、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ０．５，著作権１９９１，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）など、その目的のためのコンピュータプログラムを用いて、既知の配列から得ることができる。当業者は、特定のプローブまたはプライマーの特異性が、その長さが長くなるのにしたがって増加すると理解していよう。したがって、さらに大きい特異性を得るためには、標的ヌクレオチド配列の少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれ以上の連続したヌクレオチドを含むプローブまたはプライマーを選択することができる。
【００７８】
試料：ヒトまたは非ヒト哺乳類の対象から得られた試料。本明細書において、生体試料は、細胞、組織、および体液、例えば、血液；血液の誘導体および画分（血清または血漿など）；抽出胆汁；生検組織または手術摘出組織であって、例えば、固定されていない、凍結された、ホルマリン固定された、および／またはパラフィン抱埋された組織など；涙；乳；皮膚の切屑；表面洗浄物；尿；痰；脳脊髄液；前立腺液；膿；骨髄吸引液；ＢＡＬ；唾液；子宮頸部拭き取り検体；膣拭き取り検体；および口腔咽頭洗浄物など、対象内での遺伝子解析に有用なすべての試料を含むが、これらに限定されない。
【００７９】
一塩基多型すなわちＳＮＰ：同種の仲間でゲノム内の単一ヌクレオチド；アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）またはグアニン（Ｇ）が異なる場合に生じるＤＮＡ配列変異。本明細書において、「一塩基多型」（またはＳＮＰ）という用語は突然変異および多型を含む。ＳＮＰは、遺伝子のコード配列（ＣＤＳ）の内部、または遺伝子の間（遺伝子間領域）に含まれることがある。ＣＤＳ内部のＳＮＰは、コドンを変え、タンパク質配列内のアミノ酸を変えることもあれば、変えないこともある。前者は異なった対立遺伝子を構成する可能性がある。後者はサイレント変異と呼ばれ、一般的には、（ゆらぎ位置と呼ばれる）コドンの第３位に生じる。
【００８０】
対象：ヒトまたは非ヒト哺乳類（獣医学の対象など）。
ＡＭＤのリスクが増大している対象を同定する方法
加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を発症するリスクが増大している対象を同定するための方法を提供する。これらの方法は、対象のＢ因子（ＢＦ）および／または補体成分２（Ｃ２）の遺伝子を解析すること、および対象が少なくとも１つの防御型多型を持っているかどうかを判定することを含む。ただし、その防御型多型は、ａ）ＢＦ内のＲ３２Ｑ（ｒｓ６４１１５３）；ｂ）ＢＦ内のＬ９Ｈ（ｒｓ４１５１６６７）；ｃ）Ｃ２内のＩＶＳ１０（ｒｓ５４７１５４）；およびｄ）Ｃ２内のＥ３１８Ｄ（ｒｓ９３３２７３９）からなる群から選択される。対象が少なくとも１つの防御型多型を持っていなければ、その対象はＡＭＤを発症するリスクが増大している。この方法は、さらに、対象のＣＦＨ遺伝子、またはその他任意の所望の遺伝子を解析することを含みうる。本明細書に記載されているように、ＣＦＨ遺伝子内のｄｅｌＴＴ多型は、ＡＭＤについて防御的であることが同定されている。
【００８１】
また、この方法は、ＢＦまたはＣ２の遺伝子座のいずれか、およびＣＦＨ遺伝子座における対象の遺伝子型を解析すること、および対象が、ａ）ＢＦ内のＲ３２Ｑ（ｒｓ６４１１５３）多型についてヘテロ接合；ｂ）ＢＦ内のＬ９Ｈ（ｒｓ４１５１６６７）多型についてヘテロ接合；ｃ）Ｃ２内のＩＶＳ１０（ｒｓ５４７１５４）多型についてヘテロ接合；およびｄ）Ｃ２内のＥ３１８Ｄ（ｒｓ９３３２７３９）多型についてヘテロ接合；ｅ）ＣＦＨ内のｄｅｌＴＴ多型についてホモ接合；およびｆ）ＢＦ内のＲ１５０Ｒ（ｒｓ１０４８７０９）多型についてホモ接合かつＣＦＨ内のＹ４０２についてホモ接合からなる群から選択される少なくとも１つの防御的遺伝子型を持っているかを判定することも含む。ただし、対象が少なくとも１つの防御的遺伝子型を持っていなければ、対象のＡＭＤを発症するリスクは増大している。あるいは、この方法は、ＢＦおよびＣ２の遺伝子座、ならびにＣＦＨ遺伝子座における対象の遺伝子型を解析することを含んでもよい。また、本明細書で提供する方法は、対象が、上記に示した多型または遺伝子型の少なくとも１つを持つか否かを判定することによって、ＡＭＤを発症するリスクが低下している対象を同定するのにも有用である。
【００８２】
特定の多型の有無に関する対象の遺伝物質の解析は、対象由来の試料を得ることによって行われる。この試料は、ＤＮＡまたはＲＮＡを単離することができる、対象の身体のいずれの部位からのものであってもよい。試料から単離されたタンパク質に対して解析を行ってもよい。そのような試料の例については、より詳しく後述する。対象は、初期ＡＭＤ、脈絡膜血管新生、または地図状萎縮などのＡＭＤと診断されていてもよい。対象は、ＡＭＤの症状、例えば、ドルーゼン、色素変化、滲出性変化、例えば、出血、硬性白斑、もしくは網膜下／ＲＰＥ下／網膜内液、視力低下、かすみ目、乱視（変視症）、中心暗点、または色覚異常などをもっていてもよい。あるいは、対象は、ＡＭＤと診断されたことはないが、家族歴、年齢、人種、または生活様式の選択肢に基づくと高リスク群に入っているかもしれない。これらの生活様式の選択肢には、喫煙、日光への曝露（特に青色光）、高血圧、心血管系危険因子、例えば、高コレステロールおよび肥満、高脂肪摂取、ならびに酸化ストレスなどがあるが、これらに限定されない。また、ＡＭＤ発症の危険にさらされている対象には、ＣＦＨ遺伝子内のリスク型ハプロタイプＹ４０２Ｈについてヘテロ接合またはホモ接合である者も含まれる。
【００８３】
対象となる特定の多型または遺伝子型の有無を判定するための技術は、当技術分野においてよく知られている。これらの方法の例は後述するが、用いられた具体的な方法に限定しようとするものではない。さらに、本明細書に開示された特定の多型について、対象のＢＦ遺伝子、Ｃ２遺伝子、またはＣＦＨ遺伝子を解析することには、その多型で見られるアミノ酸変異をもたらす突然変異を検出することも含まれるものとする。例えば、ＢＦ内のＬ９Ｈ多型は、第９位のアミノ酸に対するヌクレオチドコドンをＣＴＣからＣＡＣに変えて、ロイシンの代わりにヒスチジンを生成する。この変異は、ＣＡＴヌクレオチドコドンがＣＡＴであることによっても特定することができる。Ｃ２内のＥ３１８Ｄ多型は、第３１８位のアミノ酸に対するヌクレオチドコドンをＧＡＧからＧＡＣに変えて、グルタミン酸の代わりにアスパラギン酸を生成する。この変異は、ヌクレオチドコドンがＧＡＴであることによっても特定することができる。ＢＦ内のＲ１５０Ｒ多型は、第１５０位のアミノ酸に対するヌクレオチドコドンをＣＧＧからＣＧＡに変える。この変異は、コードされているアミノ酸（アルギニン）を変えない。アルギニンは、ＣＧＴまたはＣＧＣによってもコードされうる。さらに、アルギニンは、ＡＧＡまたはＡＧＧによってもコードされうる。ＣＦＨ内のＹ４０２Ｈ多型は、第４０２位のアミノ酸に対するヌクレオチドコドンをＴＡＴからＣＡＴに変えて、チロシンの代わりにヒスチジンを生成する。この変異は、ヌクレオチドコドンがＣＡＣであることによっても特定することができる。これらのヌクレオチドコドンのいずれか、または当業者が同定することができるその他のヌクレオチドコドンも、対象内で検出することができる。
【００８４】
本発明の方法によって、ＡＭＤを発症する対象の少なくとも約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％を同定することができる。
ＡＭＤ予防療法
本開示は、ＡＭＤを発症する遺伝的素因を有すると判定された対象におけるＡＭＤの発生を回避または低下させる方法も提供する。例えば、前述の方法を用いる際に、前述の危険因子のいずれかに基づいてＡＭＤを発症するリスクのある対象において、ＢＦ遺伝子、Ｃ２遺伝子、および／またはＣＦＨ遺伝子に突然変異または防御性多型が同定されない場合、ＡＭＤの発生を回避または低下させるか、ＡＭＤの発症を遅らせたりするためには、生活様式の選択を対象に負わせることができる。例えば、対象は、禁煙したり；より少ない脂肪摂取を含むように食事を変えたり；ビタミンＣおよびＥ、β−カロテン、および亜鉛などの抗酸化物の摂取量を増加させたり；網膜血管新生の発症を遅らせる薬を予防量摂取したりしてもよい。このような個人に対する治療法は、一定の病原体に対するワクチン、または抗生物質、または抗ウイルス薬、または抗真菌薬を含むかもしれない。また、治療法は、抗炎症薬または補体阻害剤も含むかもしれない。いくつかの例において、選択される治療法は、対象の遺伝子プロフィールの解析に基づいて、その対象に特異的で個別に適合するようになっている。
既知の多型の検出法
既知の多型を検出する方法には、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）法、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）、マッピング法、核酸シーケンシング法、ハイブリダイゼーション法、蛍光インシトゥハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法、ＰＦＧＥ解析法、ＲＮＡ分解酵素保護アッセイ法、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）法、ドットブロット解析法、対立遺伝子特異的ＰＣＲ増幅（ＡＲＭＳ）法、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）法、およびＰＣＲ−ＳＳＣＰ法などがあるが、これらに限定されない。最近開発された質量分析法（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）法または飛行時間型ＭＡＬＤＩ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）法など）、および突然変異を検出するためのＤＮＡマイクロチップ技術も有用である。例えば、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２．Ｔｏｍ ＳｔｒａｃｈａｎおよびＡｎｄｒｅｗ編、Ｒｅａｄ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．，１９９９の第６章および１７章参照。
【００８５】
これらの技術は、解析の前に核酸を増幅することを含んでいてもよい。増幅技術は、当業者に周知であり後述する。
【００８６】
多型が、制限酵素の認識部位を作出するか破壊するヌクレオチド変異を生じさせると、その制限酵素を用いてその多型を同定することができる。多型部位全域をＰＣＲ増幅してから、関連する制限酵素でＰＣＲ産物を分解することによって、多型対立遺伝子を区別することができる。ゲル電気泳動法などのサイズ分画法を用いて、さまざまな産物を検出することができる。あるいは、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）法を用いることも可能である。多型が制限部位の違いをもたらさない場合には、増幅によって作られた制限部位ＰＣＲによって対立遺伝子間の違いを検出することができる。この方法では、制限部位の直近に隣接しているが、それを包含していない配列からプライマーを設計する。このプライマーは、両方の多型配列のハイブリダイゼーションおよび増幅を妨げない、重要でない位置に一塩基のミスマッチを有するように慎重に設計される。このヌクレオチドミスマッチが、多型部位の配列と一緒になって、対立遺伝子の一方に存在しない制限部位を作出する。
【００８７】
一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）マッピング法は、配列変化によって、一本鎖の分子内塩基対合に差異が引き起されたために示差的に移動するようになったバンドを検出する。たった１つの塩基が異なる一本鎖ＤＮＡ分子は、しばしば、非変性ゲル中で異なった電気泳動移動度を示す。正常型ＤＮＡと変異型ＤＮＡの移動度の差異は、標識プローブを用いるハイブリダイゼーションよって明らかになる。特に、ＤＮＡ断片のサイズが約５００ｂｐより大きい場合には、この方法によってすべての配列変化が検出できるわけではないが、ほとんどのＤＮＡ配列変異を検出すように最適化することはできる。検出感度が低いことが不都合ではあるが、ＳＳＣＰによって処理量の増加が可能になることから、この方法は、研究ベースでは、変異検出のための直接シーケンシング法に代わる魅力的な方法となっている。そこで、ＳＳＣＰゲル上で移動度を変えた断片をシーケンシングして、ＤＮＡ配列変異の正確な性質を測定する。
【００８８】
手動によるシーケンシングまたは自動蛍光シーケンシングのいずれかによる直接ＤＮＡシーケンシングによって、配列変異を検出することができる。
【００８９】
Ｔａｑポリメラーゼを用いて、特異的な対立遺伝子の検出を行うことができる（Ｈｏｌｌａｎｄら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：７２７６−８０；Ｌｅｅら（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８５：７３−８３）。これは、Ｔａｑポリメラーゼがプルーフリーディングする３’→５’エキソヌクレアーゼ活性をもたないが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性をもつという事実に基づいている。このアッセイ法は、標的配列に特異的である、２つの従来型ＰＣＲプライマー（順方向と逆方向）と、順方向プライマー結合部位の下流にある標的配列上の部位に特異的に結合するように設計されている第３のプライマーを用いることを含む。第３のプライマーは、通常、５’末端においてレポーター色素、また、３’末端において、レポーター色素とは異なる発光波長を有するクエンチャー色素という２種類のフルオロフォアで標識されている。また、第３のプライマーは、単独では新たなＤＮＡ合成を開始することができないように、３’末端のヌクレオチドに保護基も担持している。ＰＣＲ反応の過程で、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、順方向プライマーによって開始される新たなＤＮＡ鎖を合成し、この酵素が第３のプライマーに接近するにしたがって、その５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によって、第３のプライマーをその５’末端から次第に分解していく。その最終結果として、新生ＤＮＡ鎖が第３のプライマー結合部位を越えて伸長し、レポーター色素およびクエンチャー色素はもはや同じ分子に結合できなくなる。レポーター色素がクエンチャー色素の近くに存在しなくなると、レポーターの発光強度の増加がもたらされ、それを検出することができるようになる。
【００９０】
多型は、所望の遺伝子内にある特定の多型とハイブリダイズするように設計された１つ以上のハイブリダイゼーション用プローブを用いて同定することができる。ハイブリダイゼーション検出法に用いられるプローブを、ハイブリダイゼーションが成功したことを検出することができよう、何らかの方法で標識しなければならない。これは、放射標識されたヌクレオチドによってプローブ内のヌクレオチドを置換するニックトランスレーション法などのインビトロ法によるか、または、標識されたコピーを合成するための鋳型として非標識分子が働くランダムプライマー伸長法によって行うことができる。ハイブリダイゼーションを検出するためにプローブを標識する、その他の標準的方法が当業者に知られている。
【００９１】
長さが最大約２ｋｂまでのＤＮＡ断片については、変異体−正常体ヘテロ二本鎖内のミスマッチ塩基のところで化学的に切断することによって一塩基の変化を検出することができる。例えば、目的とする多型を含まないＤＮＡ鎖の片側の端を放射標識し、次に、対象ＤＮＡ鎖の一方の鎖とハイブリダイズさせる。得られたヘテロ二本鎖ＤＮＡをヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムで処理すると、それらは、対合しない一本鎖領域内のＣ、またはＣおよびＴをそれぞれ修飾し、修飾された骨格がピペリジンによって切断されやすくなる。目的とする多型を含まないＤＮＡと比較しながら、短くなった標識断片をゲル電気泳動法およびオートラジオグラフィーによって検出する。
【００９２】
ミスマッチとは、二本の鎖が１００％相補的ではない、ハイブリダイズした核酸二本鎖のことである。全体的な相同性の欠如は、欠失、挿入、逆位、または置換が原因である可能性がある。ミスマッチの検出を利用して、遺伝子内またはそのｍＲＮＡ産物内にある点変異を検出することができる。これらの手法はシーケンシング法よりも感度は低いが、多数の試料に対して実施しやすい。ミスマッチ切断手法の一例はＲＮＡ分解酵素保護法である。この方法は、検出中の多型（通常は、ＡＭＤからの防御とは関連性のない多型）の１つの変異に相補的な標識リボプローブの使用を伴う。このリボプローブと、被検者から単離したｍＲＮＡまたはＤＮＡのどちらかとを共にアニーリング（ハイブリダイズ）してから、二本鎖ＲＮＡ構造内のいくつかのミスマッチを検出することができる酵素であるＲＮＡ分解酵素Ａによって分解させる。ＲＮＡ分解酵素Ａによってミスマッチが検出されると、そのミスマッチ部位で切断される。したがって、アニーリングされたＲＮＡ調製物を電気泳動ゲルマトリックス上で分離すると、もし、ミスマッチがＲＮＡ分解酵素Ａによって検出されて切断されていれば、そのリボプローブに相当する全長二本鎖ＲＮＡ、およびｍＲＮＡまたはＤＮＡよりも短いＲＮＡ産物が見られるはずである。リボプローブは、ｍＲＮＡまたは遺伝子の全長である必要はなく、どちらかの分節であってもよい。あるいは、ミスマッチは、一致した二本鎖と比較して、ミスマッチ二本鎖の電気泳動移動度が変化することによって検出することができる。
【００９３】
ＰＣＲ法を用いて増幅されたＢＦ、Ｃ２またはＣＦＨの各遺伝子のＤＮＡ配列も、対立遺伝子特異的なプローブまたはオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を用いてスクリーニングすることができる。これらのプローブは核酸オリゴマーであって、そのひとつひとつが、既知の変異または多型をもつ遺伝子配列の領域を含んでいる。例えば、あるオリゴマーは、長さが約３０ヌクレオチドであって、ＢＦ遺伝子、Ｃ２遺伝子、またはＣＦＨ遺伝子の配列の一部に相当しているかもしれない。そのような対立遺伝子特異的プローブ一連のものを用いて、ＰＣＲ増幅産物をスクリーニングして、本明細書に記載されている１つ以上の多型の存在を同定することができる。対立遺伝子特異的プローブの、増幅したＢＦ、Ｃ２またはＣＦＨの配列へのハイブリダイゼーションは、例えば、ナイロンフィルター上で行うことができる。また、逆ドットブロット法を用いてもよい。例えば、１つ以上の多型性のスクリーニングは、各多型性対立遺伝子に特異的な一連のＡＳＯであって、標識されたＰＣＲ増幅被検ＤＮＡとハイブリダイズさせることになる単一膜上にスポットされた一連のＡＳＯを用いて行うことができる。これらのアッセイ法は、少数の手動でスポットされたアレイから、多数の多型を検出する可能性を秘めた「遺伝子チップ」上の非常に大きなＡＳＯアレイにまで及ぶ。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で特定のプローブにハイブリダイズすることは、対立遺伝子特異的プローブにある多型と同一の多型が組織中に存在することを示している。このような技術では、金のナノ粒子で標識されて、可視的な着色結果をもたらすプローブを利用することができる（Ｅｌｇｈａｎｉａｎら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：１０７８−８１）。
【００９４】
対立遺伝子特異的ＰＣＲ増幅法は、増幅不応性変異システム（ＡＲＭＳ）と呼ばれる方法に基づいている（Ｎｅｗｔｏｎら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：２５０３−１６）。この方法では、ミスマッチ３’−残基をもつオリゴヌクレオチドが、適当な条件下ではＰＣＲのプライマーとして機能しない。２種類のプライマー、すなわち一つは共通プライマーであり、他方は、２つのわずかに異なった形で存在する、各多型に特異的なプライマーを用いて、ペアードＰＣＲ反応を実施する。これらの対立遺伝子特異的プライマーは、変異体ヌクレオチドの前に位置し、変異体ヌクレオチド自体まで続き、その中で終わる領域にわたって、２つの対立遺伝子の配列と同一であるように設計されている。したがって、特定の多型または突然変異が存在しなければ、増幅産物は認められない。一般的には、別の対照用プライマーを用いて、無関係の配列を増幅する。共通プライマーの位置は、異なった多型について異なった大きさの産物を生成して、多重反応からのＰＣＲ産物がゲル上でラダーを形成するように設計することができる。多型特異的プライマーは、さまざまな蛍光標識またはその他の標識で標識することができ、あるいはさまざまな大きさの５’伸長物を付加してもよい。この方法は、リアルタイムＰＣＲに使用できるよう適合させることができる。
【００９５】
オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）では、２種類のオリゴヌクレオチドが、標的内で隣接配列にハイブリダイズするように設計されている。これらが結合する部位が多型部位である。これら２種類のオリゴヌクレオチドが完全にハイブリダイズしている場合に限り、ＤＮＡリガーゼが、この２つのオリゴヌクレオチドを連結させる（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：８９２３−７）。このアッセイは、ＥＬＩＳＡ解析法または蛍光シーケンチャーなど、さまざまなフォーマットを用いることができる。
【００９６】
マイクロチップ技術を用いる核酸解析技術を用いることもできる。この技術では、シリコンチップ上のアレイ内に、何千もの個別のオリゴヌクレオチドプローブを作成することが可能である。解析の対象となる核酸は蛍光標識されており、チップ上でこれらのプローブとハイブリダイズする。これらの核酸マイクロチップを用いて、核酸−タンパク質の相互作用を調べることも可能である。この技術を用いて、突然変異の存在を判定し、更には、解析中の核酸の配列決定をすることができ、あるいは、対象となる遺伝子の発現レベルを測定することができる。この方法は、同時に、何千であってもよい数多くのプローブを並列処理する方法であり、解析速度を飛躍的に増大させることができる。
【００９７】
当技術分野で知られている任意の技術によって、ＢＦ、Ｃ２、またはＣＦＨのｍＲＮＡ発現の変化を検出することができる。これらには、ノーザンブロット解析法、ＰＣＲ増幅法、およびＲＮＡ分解酵素保護法などがある。ｍＲＮＡ発現の減少は野生型遺伝子が変化したことを示している。特定の対立遺伝子がアミノ酸変異を有するタンパク質を産生する場合には、対立遺伝子検出法は、タンパク質に基づくことができる。例えば、アミノ酸変異に特異的なエピトープは、モノクローナル抗体によって検出することができる。あるいは、ＢＦ、Ｃ２、またはＣＦＨと免疫反応性のあるモノクローナル抗体を用いて、組織をスクリーニングすることができる。同種抗原が存在しなければ、突然変異があることが示されよう。また、変異対立遺伝子の産物に特異的な抗体を用いて、変異遺伝子の産物を検出することもできる。このような免疫アッセイは、当技術分野で知られている都合のよいフォーマットで行うこともできる。これらには、ウエスタンブロット法、免疫組織化学的アッセイ法、およびＥＬＩＳＡアッセイ法などがある。改変タンパク質を検出するための任意の手段を用いて、野生型のＢＦ遺伝子、Ｃ２遺伝子、またはＣＦＨ遺伝子の改変を検出することができる。機能分析法、例えば、タンパク質結合測定法などを用いることができる。さらに、ＢＦ、Ｃ２、またはＣＦＨの生化学的機能を検出するアッセイ法を用いることができる。変異型のＢＦ、Ｃ２、またはＣＦＨの遺伝子産物が見つかれば、野生型のＢＦ、Ｃ２またはＣＦＨの遺伝子が変更されたことが示される。
【００９８】
核酸分子の増幅
対象から得られた核酸試料は、検出前に臨床試料から増幅してもよい。一つの実施形態では、ＤＮＡ配列を増幅する。別の実施形態では、ＲＮＡ配列を増幅する。
【００９９】
任意の核酸増幅法を用いることができる。一つの具体的で非限定な例では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、ＡＭＤに関連する核酸配列を増幅する。その他の方法例には、ＲＴ−ＰＣＲ法および転写介在増幅（ＴＭＡ）法、クローニング法、対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＡＳＡ）法、リガーゼ連鎖反応法、ならびにネスティッドポリメラーゼ連鎖反応法があるが、これらに限定されない。
【０１００】
プライマー対は、増幅反応に利用することができる。一方または両方のプライマーを、例えば、検出可能な放射標識、フルオロフォア、またはビオチン分子で標識することができる。このプライマー対は、上流プライマー（下流プライマーの５’に結合する）および下流プライマー（上流プライマーの３’に結合する）を含むことができる。増幅反応に用いられるプライマー対は、ＡＭＤに関係する核酸を増幅することを可能にする選択プライマーであってもよい。
【０１０１】
別のプライマー対を内部対照として増幅反応の中に含ませることができる。例えば、これらのプライマーは、「ハウスキーピング」核酸分子を増幅するのに用いることができ、適正な増幅が行われたことを確認するのに役立つ。別の例では、プライマーハイブリダイゼーション部位を含む標的核酸分子を構築して、増幅反応器の中に入れることができる。当業者は、内部対照プライマーとして働くプライマー対を容易に同定することができよう。
【０１０２】
増幅産物は、サイズ分析、制限酵素消化後のサイズ分析、反応産物中の特異的標識オリゴヌクレオチドプライマー検出、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ハイブリダイゼーション、シーケンシング、ハイブリダイゼーションなどのさまざまな方法でアッセイすることができる。
【０１０３】
ＰＣＲ法に基づく検出アッセイ法は、複数の多型を同時に多重増幅することを含む。例えば、大きさが重複しないため、同時に解析することができるＰＣＲ産物を作成するためにＰＣＲプライマーを選択することが、当技術分野でよく知られている。あるいは、示差的に標識されているために、それぞれを検出することができるプライマーによって、さまざまな多型を増幅することが可能である。複数の多型性を多重解析できるようにする、その他の技術が当技術分野で知られている。遺伝子の断片を増幅してコピーをつくり、断片のコピーが特定の防御型の多型または遺伝子型を含むか否か判定することができる。
防御タンパク質の免疫検出法
本発明の一つの実施形態において、対象のＣ２遺伝子またはＢＦ遺伝子における多型を特徴づける、例えば、防御タンパク質を検出または同定するために、タンパク質アッセイ法を実施する。変異タンパク質を検出するために適合させることができる方法が当技術分野においてよく知られており、電気泳動法（キャピラリー電気泳動法および二次元電気泳動法を含む）などの分析生化学的方法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、超拡散クロマトグラフィー、質量分析法などのクロマトグラフ法、液体プレシピチン反応またはゲルプレシピチン反応、免疫拡散法（一次元および二次元）、免疫電気泳動法、放射免疫測定（ＲＩＡ）法、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）法、免疫蛍光アッセイ法、ウエスタンブロット法などの免疫学的方法がある。
【０１０４】
例えば、本発明を実施するのに適した、いくつかの確立した免疫学的結合アッセイフォーマットが知られている（例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．；Ｌａｎｅ，Ｄ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；１９８８；およびＡｕｓｕｂｅｌら、（２００４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ参照）。このアッセイ法は、例えば、競合的なものであっても、非競合的なものであってもよい。一般的には、免疫学的結合アッセイ法（すなわち免疫測定法）は、分析物と特異的に結合し、しばしば、それを固定するために「補足剤」を利用する。一つの実施形態において、補足剤は、変異型のＣ２またはＢＦのポリペプチドまたは部分列に特異的に結合する部分である。結合タンパク質は、例えば、検出可能に標識された抗Ｃ２／ＢＦ抗体を用いて検出することができる。一つの実施形態において、抗体の少なくとも１つは、変異体に特異的である（例えば、野生型のＣ２ポリペプチドまたはＢＦポリペプチドには結合しない）。
【０１０５】
このように、一の態様では、この方法は、対象から試料（例えば、血液、血清、血漿、または尿）を得ること、この試料を、防御型および非防御型のＣ２またはＢＦを識別する結合剤に接触させること、そして、結合剤と、もし存在するのであれば非防御型のＣ２またはＢＦとの間で複合体が形成されたことを検出することを含む。抗体パネルを用いて、患者の試料内にある防御タンパク質を検出できることが理解されよう。
【０１０６】
本発明は、防御型のＣ２タンパク質またはＤＦタンパク質には特異的に結合するが、野生型ポリペプチド（すなわち、防御と関係ないＣ２タンパク質またはＢＦタンパク質）には特異的に結合しない抗体も提供する。これらの抗体は、防御型にしか存在しないエピトープに結合する。例えば、ある抗体は、上記したように、野生型のＢＦ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号．ＮＭ＿００１７１０；ＡＡＢ６７９７７によってコードされている）またはＣ２（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号．ＮＭ＿００００６３；ＮＰ＿００００５４によってコードされている）には結合しないが、ＢＦまたはＣ２の変異体（すなわち、ＡＭＤに対して防御的であると本明細書に記載されている多型の１つを有するタンパク質）と結合する。例えば、この抗体は、第３２位にグルタミンを有するか、または第９位にヒスチジンを有するＢＦタンパク質、または第３１８位にアスパラギン酸を有するＣ２を認識することができる。
【０１０７】
この抗体は、ポリクローナルであってもモノクローナルであってもよく、標準的なプロトコルに従って作成される。抗体は、防御タンパク質またはその断片を適当な哺乳類に注射して作成することができる。標準的なプロトコルに従ってモノクローナル抗体をスクリーニングする（ＫｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ １９７５、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５；Ｄｏｗｅｒら、ＷＯ９１／１７２７１、およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＷＯ９２／０１０４７；およびＶａｕｇｈａｎら、１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：３０９；ならびに下記の参考文献）。モノクローナル抗体は、当技術分野において周知の方法を用いて、対応する野生型ポリペプチドではなく、防御型ポリペプチドを用いて、特異的免疫活性についてアッセイすることができる。抗体のスクリーニング法およびサブトラクション法など、方法に関しては、ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら、ｅｄｓ．，１９９９，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ２００５）；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（２ｄ ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８６）；Ｂｕｒｉｏｎｉら、１９９８，”Ａ ｎｅｗ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｒａｒｅ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｆｒｏｍ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ”Ｒｅｓ Ｖｉｒｏｌ．１４９（５）：３２７−３０；Ａｍｅｓら、１９９４，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉ−Ｃ５ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ Ｆａｂ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２（９）：４５７２−８１；Ｓｈｉｎｏｈａｒａら、２００２，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ ｒａｒｅ ａｎｄ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ｗａｌｌｓ ｂｙ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６４（１−２）：１８７−９４参照。免疫またはスクリーニングは、全長防御タンパク質に対するものであってもよいし、あるいは（しばしば、より簡便には）、変異型と野生型で異なることが知られているエピトープを含むペプチドまたはポリペプチド断片に対するものであってもよい。抗体は、２本の軽鎖および２本の重鎖を含む四量体として、別々の重鎖、軽鎖として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖとして、または重鎖および軽鎖の可変ドメインがスペーサーを介して連結している一本鎖抗体として発現させることができる。
【０１０８】
核酸分子の増幅
対象から得られた核酸試料は、検出前に臨床試料から増幅してもよい。一つの実施形態では、ＤＮＡ配列を増幅する。別の実施形態では、ＲＮＡ配列を増幅する。
【０１０９】
任意の核酸増幅法を用いることができる。一つの具体的で非限定な例では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、ＡＭＤに関連する核酸配列を増幅する。その他の方法例には、ＲＴ−ＰＣＲ法および転写介在増幅（ＴＭＡ）法、クローニング法、対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＡＳＡ）法、リガーゼ連鎖反応法、ならびにネスティッドポリメラーゼ連鎖反応法があるが、これらに限定されない。
【０１１０】
プライマー対は、増幅反応に利用することができる。一方または両方のプライマーを、例えば、検出可能な放射標識、フルオロフォア、またはビオチン分子で標識することができる。このプライマー対は、上流プライマー（下流プライマーの５’に結合する）および下流プライマー（上流プライマーの３’に結合する）を含むことができる。増幅反応に用いられるプライマー対は、ＡＭＤに関係する核酸を増幅することを可能にする選択プライマーであってもよい。
【０１１１】
別のプライマー対を内部対照として増幅反応の中に含ませることができる。例えば、これらのプライマーは、「ハウスキーピング」核酸分子を増幅するのに用いることができ、適正な増幅が行われたことを確認するのに役立つ。別の例では、プライマーハイブリダイゼーション部位を含む標的核酸分子を構築して、増幅反応器の中に入れることができる。当業者は、内部対照プライマーとして働くプライマー対を容易に同定することができよう。
【０１１２】
増幅産物は、サイズ分析、制限酵素消化後のサイズ分析、反応産物中の特異的標識オリゴヌクレオチドプライマー検出、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ハイブリダイゼーション、シーケンシング、ハイブリダイゼーションなどのさまざまな方法でアッセイすることができる。
【０１１３】
ＰＣＲ法に基づく検出アッセイ法は、複数の多型を同時に多重増幅することを含む。例えば、大きさが重複しないため、同時に解析することができるＰＣＲ産物を作成するためにＰＣＲプライマーを選択することが、当技術分野でよく知られている。あるいは、示差的に標識されているために、それぞれを検出することができるプライマーによって、さまざまな多型を増幅することが可能である。複数の多型性を多重解析できるようにする、その他の技術が当技術分野で知られている。遺伝子の断片を増幅してコピーをつくり、断片のコピーが特定の防御型の多型または遺伝子型を含むか否か判定することができる。
補体因子Ｈ（ＣＦＨ）
ＣＦＨ遺伝子は、家族ベースの研究では、Ｉｑ染色体上のＡＭＤに反復して結合している領域内に位置している。最近、３つの独立した研究によって、補体因子Ｈ遺伝子内でチロシンをヒスチジンに変える（Ｙ４０２Ｈ）、エキソン９内の１２７７位のヌクレオチドにおけるＴ→Ｃへの置換という多型が、ＡＭＤへの感受性に実質的に関与していることが明らかになった（Ｋｌｅｉｎら（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０８：３８５−３８９；Ｈａｉｎｅｓら（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ．３０８：４ｌ９−４２１；Ｅｄｗａｒｄｓら（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ．３０８：４２１−４２４）。これらの研究では、ＡＭＤのオッズ比が、Ｃ対立遺伝子の保因者について３．３〜４．６、ＣＣホモ接合体については３．３〜７．４であることが報告された。その後、２つの別の研究によって、この連関が確認された（Ｚａｒｅｐａｒｓｉら（２００５）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７７：１４９−１５３；Ｈａｇｅｍａｎら（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０２：７２２７−７２３２）。１つの研究では、７つの別の共通ＳＮＰが、Ｙ４０２Ｈ多型以外にもＡＭＤと関連していることが分かった（Ｈａｇｅｍａｎら（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０２：７２２７−７２３２）。
【０１１４】
対連鎖解析によって、前記７つの多型が連鎖不平衡にあり、これらの多型を一組もつ１つの共通リスク型ハプロタイプが、症例者の５０％対対照者の２９％で検出された［ＯＲ＝２．４６、９５％ＣＩ（１．９５〜３．１１）］。このハプロタイプのホモ接合体は、症例者の２４．２％および対照者の８．３％で見出された。また、２つの共通した防御型ハプロタイプが、対照者の３４％および症例者の１８％で見出された［ＯＲ＝０．４８、９５％ＣＩ（０．３３〜０．６９）］および［ＯＲ＝０．５４、９５％ＣＩ（０．３３〜０．６９）］。
【０１１５】
Ｂ因子および補体成分２
第二経路の活性化は、Ｃ３ｂに結合したＢ因子（ＢＦ）がＤ因子に触媒されて切断されることにより開始され、その結果、Ｃ３Ｂｂ複合体（Ｃ３転換酵素）が形成される。この複合体は、調節タンパク質のプロパージン（ｐｒｏｐｅｒｄｉｎ）によって安定化されるが、一方で、その解離が、ＣＦＨなどの調節タンパク質によって促進される。ＢＦおよびＣ２は、ヒト染色体６ｐ２１上でわずか５００ｂｐしか離れていない位置にあるパラロガス遺伝子である。Ｃ２は古典的補体経路内で機能する。これら２つの遺伝子は、補体成分４Ａ（Ｃ４Ａ）および４Ｂ（Ｃ４Ｂ）をコードする遺伝子とともに、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩＩ領域内にあるＨＬＡ−ＢとＨＬＡ−ＤＲ／ＤＱの間で約１００〜１２０ｋｂを占めている「コンプロタイプ（ｃｏｍｐｌｏｔｙｐｅ）」（補体ハプロタイプ）を含んでいる。
【０１１６】
臨床試料
対象のＡＭＤに罹りやすい遺伝的素因を測定する際に本開示とともに用いるのに適した臨床試料は、血液または血液分画（血清または血漿など）、含嗽液または口腔を掻きとったもの、絨毛膜生検試料、精液、ガスリーカード、眼内液、痰、リンパ液、尿、および組織を含む、従来の臨床試料であるが、これらに限定されない。最も簡単には、血液を採取し、血液の細胞からＤＮＡ（またはＲＮＡ）を抽出することができる。野生型のＢＦ、Ｃ２、および／またはＣＦＨの対立遺伝子の変化は、例えば、点変異であろうと欠失であろうと、本明細書に記載された手段のいずれによっても検出することができる。
【０１１７】
そのような試料を得るための技術は当技術分野において周知されている（血清試料の採集については、例えば、Ｓｃｈｌｕｇｅｒら（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１３２７−３３参照）。血清またはその他の血液分画は、従来の方法で調製することができる。例えば、約２００μＬの血清を用いて、増幅反応で使用するＤＮＡを抽出することができる。
【０１１８】
いったん試料が得られれば、この試料を直接用いるか、（例えば、遠心または濾過によって）濃縮するか、精製するか、または、これらを組み合わせることができ、そして、増幅反応を実施することができる。例えば、市販のキット（ｔｈｅ ＩｎｓｔａＧｅｎｅ Ｍａｔｒｉｘ，ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ；ｔｈｅ ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ，Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓなど）を用いて、迅速にＤＮＡ調製を行うことができる。一例では、このＤＮＡ調製法によって、核酸増幅に利用しやすく、これを容易に行うことができるヌクレオチド調製物が得られる。
【０１１９】
マイクロアレイ
特定の例において、ＢＦ遺伝子、Ｃ２遺伝子、および／またはＣＦＨ遺伝子における多型を検出する方法では、本明細書に開示されたアレイが用いられる。このようなアレイは核酸分子を含むことができる。一例では、このアレイは、本明細書に開示された多型のような多型性のＢＦ、Ｃ２、および／またはＣＦＨの遺伝子配列にハイブリダイズできる核酸オリゴヌクレオチドプローブを含む。このようなアレイの一定のものは（ならびに本明細書に開示された方法）、ＡＭＤを発症するリスクに関連するか、それからの防御に関連するその他の多型、および、１つ以上のハウスキーピング遺伝子を認識する１つ以上のプローブなど、その他の配列を含むことができる。
【０１２０】
本明細書において「ＡＭＤ検出アレイ」と名付けたアレイは、対象がＡＭＤを発症する遺伝的感受性を判定するために用いられる。一例では、一組のオリゴヌクレオチドプローブが、例えば、対象から得られた核酸配列を増幅した遺伝子である、ＢＦ遺伝子、Ｃ２遺伝子、および／またはＣＦＨ遺伝子における多型を検出するのに使用するための固体支持体の表面に付着している。さらには、増幅反応で内部対照用核酸配列が増幅されたならば（上記参照）、この増幅された核酸分子の存在を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブを加えることができる。
【０１２１】
アレイに結合しているヌクレオチドプローブは、増幅反応（高ストリンジェンシー条件下など）で増幅された配列に特異的に結合することができる。ＢＦ、Ｃ２、および／またはＣＦＨの各遺伝子の少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、またはそれ以上の連続したヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを用いることもできる。
【０１２２】
本開示に従った方法および装置は、適当な条件下ではオリゴヌクレオチドが、相補的塩基配列を有する核酸分子と塩基対合した二本鎖を形成するという事実を利用している。この二本鎖の安定性は、オリゴヌクレオチドの長さ、塩基組成、およびハイブリダイゼーションを生じさせる溶液の組成など、いくつかの因子に依存する。塩基組成の二本鎖の安定性に対する影響は、ハイブリダイゼーションを特定の溶液中、例えば、高濃度の三級または四級のアミンの存在下で行うことによって低下させることができる。
【０１２３】
二本鎖の熱安定性は、配列間の配列類似性の度合いにも依存する。標的配列と、アレイに結合しているオリゴヌクレオチドとの間で形成されることが予想される二本鎖のタイプについて予測されるＴｍに近い温度でハイブリダイゼーションを行うことによって、ミスマッチ二本鎖を形成する率を実質的に低下させることができる。
【０１２４】
アレイ内で用いられる各オリゴヌクレオチド配列の長さは、標的であるＢＦ、Ｃ２、および／またはＣＦＨの核酸配列の結合を最適化するように選択することができる。具体的なスクリーニング条件下において、特定のＢＦ、Ｃ２、および／またはＣＦＨの核酸配列と使用するのに最適な長さは、経験的に決定することができる。したがって、アレイに含まれているオリゴヌクレオチド配列のセットの各個別要素の長さを、スクリーニングするために最適化することができる。一例で、オリゴヌクレオチドプローブは、約２０ヌクレオチドから約３５ヌクレオチドの長さであるか、または約２５ヌクレオチドから約４０ヌクレオチドの長さである。
【０１２５】
アレイを形成しているオリゴヌクレオチドプローブの配列を、例えば、プローブの５’末端または３’末端を介して、支持体に直接結合させることができる。一例では、オリゴヌクレオチドは、５’末端によって固体支持体に結合されている。しかし、当業者は、オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端のどちらを使用することが、固体支持体に結合させるのに適しているかを決定することができる。一般的に、３’末端および５’末端の領域内におけるオリゴヌクレオチドプローブの内部相補性が、支持体への結合を決定する。あるいは、固体支持体に対してスペーサーまたはリンカーとして作用するオリゴヌクレオチドまたはその他の分子など、ＢＦ、Ｃ２、および／またはＣＦＨの配列以外の配列によって、オリゴヌクレオチドプローブを支持体に付着させることができる。
【０１２６】
別の例では、アレイはタンパク質配列を含むが、それらのタンパク質配列は、少なくとも１つのＢＦタンパク質、Ｃ２タンパク質、および／またはＣＦＨタンパク質（または記載された配列の１つを含む遺伝子、ｃＤＮＡ、もしくはその他のポリヌクレオチド分子、またはその断片）か、そのようなタンパク質の断片、またはそのようなタンパク質もしくはタンパク質断片に特異的な抗体を含む。アレイを形成するタンパク質または抗体は、支持体に直接連結することができる。あるいは、固体支持体に対するスペーサーまたはリンカーによって、タンパク質または抗体を支持体に付着させることができる。
【０１２７】
ＢＦタンパク質、Ｃ２タンパク質、および／またはＣＦＨタンパク質の異常は、場合によっては検出可能に標識されている、例えば、ＢＦタンパク質、Ｃ２タンパク質、および／またはＣＦＨタンパク質に特異的な結合剤を用いて検出することができる。したがって、一定の例においては、異常の検出は、対象由来の試料を、ＢＦタンパク質、Ｃ２タンパク質、および／またはＣＦＨタンパク質に特異的な結合剤と接触させること、そして、この結合剤に試料が結合したか否かを検出し、それによって、この試料に存在するＢＦタンパク質、Ｃ２タンパク質、および／またはＣＦＨタンパク質の量を測定することを含むが、ただし、この場合、ＡＭＤを発症する素因をもたない対象に由来する類似試料に存在するＢＦタンパク質、Ｃ２タンパク質、および／またはＣＦＨタンパク質の量、またはＡＭＤを発症する素因をもたない対象に由来する類似試料にあるＢＦタンパク質、Ｃ２タンパク質、および／またはＣＦＨタンパク質の標準的な量と較べて、その試料中のＢＦタンパク質、Ｃ２タンパク質、および／またはＣＦＨタンパク質の量が異なることが、そのＢＦ分子、Ｃ２分子、および／またはＣＦＨ分子の異常である。
【０１２８】
特定の例において、マイクロアレイの材料は、ガラス（二酸化ケイ素）から作られる。固体支持体用に適した二酸化ケイ素の種類は、ケイ酸アルミニウム、ホウケイ酸、シリカ、ソーダ石灰、亜鉛チタニア、および溶融シリカなどであるが、これらに限定されない（例えば、Ｓｃｈｅｎａ，Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，２００３参照）。当技術分野周知の方法、例えば、有機ポリマーを原料とする表面処理剤によって、核酸をガラスの表面に付着させることができる。具体的な例は、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリイソブチレン、ポリブタジエン、ポリイソプレン、ポリビニルピロリジン、ポリテトラフルロエチレン、二フッ化ポリビニリデン、ポリフルオロエチレン−プロピレン、ポリエチレンビニルアルコール、ポリメチルペンテン、ポリクロロトリフルオロエチレン、ポリスルホルン、ヒドロキシル化２軸配向ポリプロピレン、アミン化２軸配向ポリプロピレン、チオール化２軸配向ポリプロピレン、エチレンアクリル酸、メタクリル酸チレン、およびこれらの共重合体の混合物（米国特許第５，９８５，５６７号参照、これは参照されて本明細書に組み込まれる）、化学的に活性なアミン基またはアルデヒド基をもたらす有機シラン化合物、マイクロアレイのエポキシまたはポリリシン処理を含むが、これらに限定されない。固体支持体表面の別例は、ポリプロピレンである。
【０１２９】
一般的に、固体支持体表面を形成するために用いることができる物質に適した特性には以下のものが含まれる。すなわち、表面活性化されやすいため、活性化されると、支持体の表面がオリゴヌクレオチドなどの生体分子をそれに共有結合させることができること；生体分子の「インサイツ」合成に適していること；化学的に不活性であるため、オリゴヌクレオチドに占領されていない支持体上の領域において、非特異的結合を起こしにくいか、または非特異的結合が生じたときには、オリゴヌクレオチドを除去することなく、そのような物質を表面から容易に除去することができることなどである。
【０１３０】
一例では、表面処理剤は、アミン含有シラン誘導体である。核酸のアミン表面への付着は、ＤＮＡ骨格上の負に荷電したリン酸基と、正に荷電したアミノ基との相互作用を介して生じる（Ｓｃｈｅｎａ，Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，２００３、これは参照されて本明細書に組み込まれる）。別の例では、反応性アルデヒド基が表面処理剤として用いられる。アルデヒド表面への付着は、目的とするＤＮＡに５’−アミン基またはアミノリンカーを付加することによって行われる。アミンリンカー上の非結合電子対が、アルデヒド基の陽性炭素原子を攻撃する求核試薬として作用すると結合が生じる。
【０１３１】
本開示に従って多様なアレイフォーマットを用いることができる。一例には、当技術分野において通常ディップスティックと呼ばれる、直線配列のオリゴヌクレオチドバンドが含まれる。別の適当なフォーマットには、分離したセルになった二次元パターン（６４×６４アレイ内の４０９６個の四角形など）が含まれる。当業者が認めるように、スロット状（長方形）および円形のアレイなどであるがこれらに限定されない、その他のアレイフォーマットも等しく使用に適している（米国特許第５，９８１，１８５号参照。これは参照されて本明細書に組み込まれる）。一例では、糸状、膜状、またはフィルム状のポリマー媒体上にアレイが形成される。有機ポリマー媒体の例は、厚さが約１ｍｍ（０．００１インチ）から約２０ｍｍのポリプロピレンシートであるが、ただし、フィルムの厚さは重大な意味を持たず、かなり広範囲に変えることができる。２軸配向ポリプロピレン（ＢＯＰＰ）フィルムが、今回は、アレイを調製するために具体的に開示されている。ＢＯＰＰフィルムは、その耐久性に加えて、低バックグラウンド蛍光を示す。特定の例では、アレイは、固相型の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を用いる核酸アレイである。
【０１３２】
本開示のアレイフォーマットは、さまざまな異なった型のフォーマットに含めることができる。「フォーマット」は、固体支持体を固定することができる任意のフォーマット、例えば、マイクロタイタープレート、試験管、無機シート、ディップスティックなどを含む。例えば、固体支持体がポリプロピレン糸の場合、１本以上のポリプロピレン糸を、プラスチック製のディップスティック型装置に貼り付けることができ、ポリプロピレン膜は、スライドガラスに貼り付けることができる。具体的なフォーマットは、それ自体、重要ではない。必要なことは、固体支持体が、その固体支持体、またはそこに吸着する任意の生体高分子の機能的挙動に影響することなく貼り付けることができるということであり、また、フォーマット（ディップスティックまたはスライドガラスなど）が、装置が導入される任意の物質（臨床試料およびハイブリダイゼーション溶液など）に対して安定しているということである。
【０１３３】
本開示のアレイは、さまざまな方法によって調製することができる。一例では、オリゴヌクレオチドまたはタンパク質の配列を別々に合成してから、固体支持体に付着させる（米国特許第６，０１３，７８９号参照、これは参照されて本明細書に組み込まれる）。別の例では、固体支持体上で配列を直接合成して所望のアレイを提供する（米国特許第５，５５４，５０１号参照、これは参照されて本明細書に組み込まれる）。オリゴヌクレオチドおよびタンパク質を固体支持体と共有結合させるのに適した方法、および支持体上でオリゴヌクレオチドまたはタンパク質を直接合成するのに適した方法は当業者に周知されており、適当な方法の要約を、Ｍａｔｓｏｎら（１９９４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１７：３０６−１０に見出すことができる。一例において、固体支持体上でオリゴヌクレオチドを調製するための通常の化学的技術を用いて、支持体上でオリゴヌクレオチドを合成する（例えば、ＰＣＴ公開８５／０１０５１号および８９／１０９７７号、または米国特許第５，５５４，５０１号などを参照、これらはそれぞれ参照されて本明細書に組み込まれる）。
【０１３４】
適当なアレイは、アレイのセル内でオリゴヌクレオチドを合成する自動的手段を用いて、予め定められたパターンで４種類の塩基の前駆体を固着させることによって、作成することができる。要するに、多重チャネル型自動的化学物質送達系を用いて、基質全面に（送達系のチャネル数と同じ数の）平行な列にオリゴヌクレオチドプローブ集団を作出する。第１の方向にオリゴヌクレオチドの合成が完了した後、基質を９０度回転させて、第１の組に垂直な２組目の列の内部で合成を進行させることができる。このプロセスにより、交点に複数の分離したセルを生じさせる多重チャネル型アレイが作出される。
【０１３５】
特定の例において、アレイ上のオリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチドプローブ：標的配列のハイブリダイゼーション複合体の検出を可能にする、１つ以上の標識を含む。
【０１３６】
キット
本開示は、対象、例えば、その他の点では健康なヒト対象にＡＭＤの遺伝的素因があるか否かを判定するのに用いることができるキットを提供する。そのようなキットによって、対象が、ＢＦ、Ｃ２またはＣＦＨの遺伝子配列内に１つ以上の遺伝子の変異または多型をもっているかを判定できるようになる。
【０１３７】
これらのキットは、対象のＢＦ遺伝子、Ｃ２遺伝子、またはＣＦＨ遺伝子に少なくとも１つの多型が存在するかしないかを判定するのに役立つ試薬、例えば、本明細書中で同定されているＢＦ、Ｃ２またはＣＦＨの多型配列に選択的にハイブリダイズするプローブまたはプライマーなどを含む。このようなキットを本明細書に記載された方法とともに用いて、対象のＢＦ、Ｃ２、またはＣＦＨの遺伝子型またはハプロタイプを判定することができる。
【０１３８】
対象における特異的なＢＦ、Ｃ２、またはＣＦＨの配列、例えば、本明細書に記載されたＳＮＰまたはハプロタイプを検出するのに使用するキットの形にして、オリゴヌクレオチドプローブおよび／またはプライマーを供給することもできる。そのようなキットでは、適当な量の１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーが、１つ以上の容器に入れられて提供される。これらのオリゴヌクレオチドプライマーは、例えば、水溶液中に懸濁されるか、フリーズドライ粉末すなわち凍結乾燥粉末として提供することも可能である。オリゴヌクレオチドを供給する容器は、供給時の形状を保持できる任意の従来の容器、例えば、微量遠心用チューブ、アンプル、またはビンであってもよい。使用目的によっては、プライマー対を、一般的には使い捨てになっている別々のチューブ、またはそれと等価の容器の中に、予め一回量を測り入れて提供することもできる。このような準備をして、ＢＦ、Ｃ２、またはＣＦＨの多型が存在するかを検査する試料をそれぞれのチューブに加えて増幅を直接行うことができる。
【０１３９】
このキットで供給されるオリゴヌクレオチドプライマーそれぞれの量は、任意の適量であればよく、例えば、その製品が目指すマーケットに応じて決まる。例えば、このキットが、研究用または臨床用に合わせてある場合、提供される各ヌクレオチドプライマーの量は、数回のＰＣＲ増幅反応を開始させるのに十分な量となっているであろう。当業者は、一回の増幅反応に使用するのに適したオリゴヌクレオチドプライマー量を知っている。一般的な指針が、例えば、Ｉｎｎｉｓら（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０）、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）、およびＡｕｓｕｂｅｌら（Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ，ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９２）に記載されている。
【０１４０】
ＢＦ、Ｃ２またはＣＦＨをコードする配列、例えば、特異的な標的であるＢＦ、Ｃ２、もしくはＣＦＨの各遺伝子、またはその５’側または３’側の近傍領域をインビトロ増幅するのを容易にするために、キットは３種類以上のプライマーを含んでいてもよい。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、キットが、例えば、ＤＮＡ試料調製用試薬、適当な緩衝剤（例えば、ポリメラーゼ緩衝剤）、塩類（例えば、塩化マグネシウム）、およびデオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）など、ヌクレオチド増幅反応を行うのに必要な試薬も含んでいてもよい。
【０１４２】
さらに、キットは、ＢＦ、Ｃ２、またはＣＦＨの多型またはハプロタイプを検出するのに用いるための標識型または非標識型のオリゴヌクレオチドプローブを含むことができる。一定の実施形態において、これらのプローブは、増幅された標的配列に存在するかもしれない多型性部位の可能性がある部位に特異的であろう。そのようなプローブにとって適当な配列は、プローブの配列が、多型性部位およびその周囲のＢＦ、Ｃ２、またはＣＦＨの配列と相補的になるよう、同定された多型性部位の１つ以上を含む任意の配列であろう。一例として、そのようなプローブは長さが少なくとも６ヌクレオチドであり、多型性部位が、このプローブの長さの任意の位置に存在している。特異性を確保するためには、より長いプローブを用いることがしばしば有益である。そこで、いくつかの実施形態では、プローブは、少なくとも８ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１２ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、またはそれ以上である。
【０１４３】
このキットでは、増幅反応で使用するための１つ以上の対照用配列を提供することも有益であるかもしれない。適当な陽性対照用配列の設計は、適当な技術分野における当業者によく知られている。一例として、対照用配列は、本明細書に記載されているような１つ以上の標的ＳＮＰ部位に既知の配列をもつヒト（または非ヒト）のＢＦ、Ｃ２、またはＣＦＨの核酸分子を含んでもよい。対照は、非ＢＦ、非Ｃ２、または非ＣＦＨの核酸分子も含むことも可能である。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、キットは、インビトロ増幅反応でＲＴ−ＰＣＲ法を行うのに必要な試薬のうちのいくつかまたは全部、例えば、ＲＮＡ試料調製用試薬（例えば、ＲＮＡ分解酵素阻害剤など）、適当な緩衝液（例えば、ポリメラーゼ緩衝液）、塩類（例えば、塩化マグネシウム）、およびデオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）などを含むことができる。
【０１４５】
さらに、そのようなキットは、インビトロで増幅された標的配列の検出に使用するための標識オリゴヌクレオチドプローブまたは非標識オリゴヌクレオチドプローブを含むことができる。そのようなプローブに適した配列は、提供された２つのオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング部位の間にある任意の配列であって、プローブが相補的である配列をＰＣＲ反応の過程で増幅させるような配列であろう。特定の実施形態では、これらのプローブは、増幅された標的配列に存在しうる潜在的な多型に特異的である。
【０１４６】
ＲＴ−ＰＣＲ反応に用いる１つ以上の対照用配列をキットに入れて提供するのも有益であろう。適当な陽性対照用配列の設計は、適当な技術分野における当業者によく知られている。
【０１４７】
ＢＦ、Ｃ２、またはＣＦＨのタンパク質発現（例えば、過剰発現もしくは過少発現、または特定のアイソフォームの発現など）の検出または解析を行うためのキットも含まれる。そのようなキットは、少なくとも１つの標的タンパク質特異的結合剤（例えば、ＢＦタンパク質、Ｃ２タンパク質、またはＣＦＨタンパク質を特異的に認識するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体または抗体断片、またはＢＦタンパク質、Ｃ２タンパク質、またはＣＦＨタンパク質の特定の多型性形態）を含んでいてもよく、また、少なくとも１つの対照（所定量の標的ＢＦ、Ｃ２、もしくはＣＦＨタンパク質、または所定量のＢＦ、Ｃ２、またはＣＦＨタンパク質を含む試料など）を含んでもよい。前記のＢＦ、Ｃ２、またはＣＦＨタンパク質に特異的に結合する剤および対照は、別々の容器に入れることもできる。前記の抗体は、ＢＦタンパク質、ＣＤタンパク質、および／またはＣＦＨタンパク質の多型性形態を識別する能力をもつかもしれない。
【０１４８】
ＢＦタンパク質、Ｃ２タンパク質、もしくはＣＦＨタンパク質、またはアイソフォームの発現を検出するキットは、ＢＦ、Ｃ２、またはＣＦＨ：結合剤の複合体を含むことも可能であり、例えば、この結合剤は検出できるように標識付けされていてもよい。検出可能な結合剤が標識付けされていなければ、例えば、二次抗体またはプロテインＡによって検出することができるが、これらは、キットによっては、１つ以上の別の容器の中に入れて提供することもできる。このような技術は周知のものである。
【０１４９】
具体的なキットのさらなる構成要素には、アッセイを行うための説明書などがあろう。説明書によって、試験者がＢＦ、Ｃ２、またはＣＦＨの発現量を測定することが可能になる。キットには、反応用容器、および、色素原、緩衝液、酵素などの補助試薬も含まれるかもしれない。説明書には較正曲線または補正図が、決定値（例えば、実験的に測定された値）と比較するために提供されていることもある。
【０１５０】
本明細書に記載されたようなＢＦ遺伝子、Ｃ２遺伝子、またはＣＦＨ遺伝子の特異的ＳＮＰ（またはハプロタイプ）について、ホモ接合である個体とヘテロ接合である個体とを区別することを可能にするキットも提供される。このようなキットの例では、Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：８９２３−８９２７に記載されているように、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）を行うのに必要な材料が提供されている。具体的な実施形態において、これらのキットは、本明細書に記載されているように、対象のＢＦ、Ｃ２、またはＣＦＨの配列内における多型を検出するように設計された、１つ以上のマイクロタイタープレートアッセイを含む。これらのキットに入っている説明書によって、試験者は、特定のＢＦ、Ｃ２、またはＣＦＨの対立遺伝子が存在するか否か、また、それがホモ接合であるかヘテロ接合であるかを判定することができるようになる。このキットで、ＯＬＡ反応に用いる１つ以上の対照用配列を提供するのも有益であろう。適当な陽性対照配列の設計については適当な技術分野における当業者によく知られている。
【０１５１】
このキットは、フィルター、ビーズ、マイクロタイタープレートなどへの結合など、核酸結合を含む、いくつかのアッセイフォーマットの使用を含んでいてもよい。技術には、ドットブロット法、ＲＮＡブロット法、ＤＮＡブロット法、ＰＣＲ、ＲＦＬＰなどがある。
【０１５２】
マイクロアレイに基づくキットも提供される。これらのマイクロアレイキットは、遺伝子型判定解析において有用であるかもしれない。一般に、これらのキットは、基質上の、例えば、アドレス可能な部位に固定されて提供される、１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。このキットは、また、使用者がこのアレイを検索するのに役立つ、通常は書面になった指示も含む。このような説明書は、任意には、コンピューター可読型メディア上で提供することができる。
【０１５３】
キットは、さらに、提供されたアレイを解析する際に使用するための１つ以上の緩衝液を含むことができる。例えば、そのような緩衝液は、低ストリンジェンシー洗浄液、高ストリンジェンシー洗浄液、および／または剥離用溶液などであろう。これらの緩衝液はまとめて提供することができる。すなわち、各緩衝液容器が大きく、何回分かのプロービング処理または洗浄処理または剥離処理を行うのに十分な緩衝液を保持していてもよい。あるいは、緩衝液は、キットに含まれるアレイのサイズおよび形に合わせて、予め秤量された等量液にして提供することもできる。一定のキットは、内部でアレイ−プロービング反応を行うことができる、１つ以上の容器を提供するかもしれない。
【０１５４】
キットは、さらに、アレイ上で捕捉された生体分子を検出するために、抗体またはプローブ（または抗体の混合物、プローブの混合物、または抗体およびプローブの混合物）などの検出分子の容器を１つ以上含んでいてもよい。このキットは、また、標識処理もしくはアレイのプロービングのいずれか、またはその両方の内部試験を行うために、標識されているか、標識されていない対照用プローブ分子も含むことができる。対照用プローブ分子は、例えば、水溶液中に懸濁して、またはフリーズドライもしくは乾燥凍結された粉末として提供することができる。対照が入っている容器は、例えば、微量遠心用チューブ、アンプル、またはビンなど、供給された形態を保持することができる任意の従来の容器であってもよい。使用目的によっては、対照プローブを、個別の、一般的には使い捨てのチューブまたはそれと等価の容器に、予め秤量された一回使用量にして提供することができる。
【０１５５】
このキットにおいて供給される各対照用プローブの量は、例えば、その製品が目指すマーケットに応じて、任意の特定量にすることができる。例えば、このキットが、研究用または臨床用に合わせてある場合、アレイを何回か対照用解析するのに十分な対照用プローブが提供されることであろう。同様に、複数の対照プローブが１つのキットで提供される場合、提供される具体的なプローブは、マーケットおよび付随するキットに適合するように提供される。一定の実施形態において、複数の異なった対照用プローブが単一のキットで提供されるが、各対照プローブは、関連するアレイ上に存在する異なったタイプの検体に由来のものである（例えば、真核生物と原核生物両方の検体を提供するキットでは、原核生物特異的な対照用プローブと、それとは別の真核生物特異的な対照用プローブとを提供することができる）。
【０１５６】
本発明のいくつかの実施形態において、１つ以上のプローブ標識反応を行うのに必要な試薬も含むことも可能である。含まれる具体的な試薬は、プローブ分子の種類（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、および標識する方法（例えば、プローブ合成過程で取り込まれる放射標識、結合可能な蛍光タグなど）に応じて、エンドユーザーを満足させるよう選択されるはずである。
【０１５７】
本明細書で提供されているアレイをアッセイするのに用いるプローブ分子を標識するために、さらなるキットが提供される。そのようなキットは、任意で、そのように標識されたプローブ分子によってアッセイされることになるアレイを含むことができる。
【０１５８】
本開示は、以下の非限定的な実施例によって具体的に説明されている。
【実施例】
【０１５９】
実施例１
材料および方法
対象：本研究では、欧米人の子孫である６０歳を超えたＡＭＤ症例、および年齢が一致する対照のそれぞれ独立した２群を用いた。これらの群は、アイオワ大学から報告された３５０人の血縁関係のない臨床的にＡＭＤと確認された対象（平均年齢７９．５＋／−７．８歳）、および１１４人の血縁関係のない対照個体（平均年齢７８．４＋／−７．４歳；年齢および民族性が一致）、ならびにコロンビア大学から報告された５４８人の血縁関係のない臨床的にＡＭＤと確認された対象（平均年齢７１．３２＋／−８．９歳）、および２７５人の血縁関係のない、年齢と民族性が一致する対照（平均年齢６８．８４＋／−８．６歳）からなる。対象は、熟練した眼科医の検査を受けた。
【０１６０】
立体眼底写真を、Ｈａｇｅｍａｎ，２００５，前掲；Ｂｉｒｄら、（１９９５）Ｓｕｒｖ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．３９：３６７−７４；およびＫｌａｖｅｒら、（２００１）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４２：２２３７−４１に記載されているように標準化された分類システムに従って等級分けした。対照は、黄斑疾患に特徴的な徴候を示しておらず、ＡＭＤの家族歴があることが分かっている者はいなかった（病期０および１ａ）。ＡＭＤ対象を募集した時に、彼らの重症の方の眼の分類に基づいて表現型によるカテゴリーに細分した。ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて、末梢血白血球からゲノムＤＮＡを調製した。
【０１６１】
実験は、コロンビア大学およびアイオワ大学の施設内倫理委員会によって承認されたプロトコルに従って実施した。すべての実験対象者から事前にインフォームドコンセントを得ておいた。
【０１６２】
免疫組織化学法：Ａｎｄｅｒｓｏｎら（２００２）Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１３４：４１１−３１に記載されているとおりに、後極を処理して、切片にし、Ｂａ因子（Ｑｕｉｄｅｌ）に対する抗体で標識した。隣接した切片を二次抗体だけとインキュベートし、対照として用いた。既述されたように（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２００２、前掲）、いくつかの免疫標識された標本を調製して、共焦点レーザー走査顕微鏡によって観察した。
【０１６３】
変異のスクリーニングと解析：ＳＳＣＰ解析法、変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）、および直接配列決定法を用いて、ＢＦおよびＣ２のコード領域と隣接するイントロン領域を変異体について調べた。ＳＳＣＰ、ＤＨＰＬＣ，およびＤＮＡ配列決定による解析のためのプライマーは、各エキソンおよびそれに隣接したイントロン領域が増幅されるよう、Ｍａｃ Ｖｅｃｔｏｒソフトウェア（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて設計された。Ａｌｌｉｋｍｅｔｓら、（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：１８０５−１８０７、およびＨａｙａｓｈｉら、（２００４）Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｇｅｎｅｔ．２５：１１１−９に記載されているとおりに、ＰＣＲにより作成した単位複製配列を配列変異についてスクリーニングした。ＳＳＣＰおよびＤＨＰＬＣによって検出された変異はすべて、標準的なプロトコルに従って２方向の配列決定を行って確認した。
【０１６４】
遺伝子型判定：データマイニング（Ｅｎｓｅｍｂｌデータベース、ｄｂＳＮＰ；Ｃｅｌｅｒａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ）および配列決定によって一塩基多型（ＳＮＰ）が発見された。検定集団内で１０％よりも頻度の高い変異体のアッセイは、Ｖａｌｉｄａｔｅｄ，ＩｎｖｅｎｔｏｒｉｅｄＳＮＰ Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−ＤｅｍａｎｄとしてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入するか、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＡｓｓａｙｓ−Ｂｙ−Ｄｅｓｉｇｎ ｐｉｐｅｌｉｎｅに提出した。利用した技術は、Ｈａｇｅｍａｎら、２００５、前掲に記載されている技術と同じものであった。要するに、５ｎｇのＤＮＡをＡＢｌ ９７００ ３８４−ウェルのサーマルサイクラー上で５０サイクルの増幅を行い、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の７９００ ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍでプレートを読み取った。
【０１６５】
統計解析：Ｈａｇｅｍａｎら、２００５、前掲、およびＫｌａｖｅｒら、２００１、前掲に記載されているような分割表解析を行うために、遺伝子型をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌで一覧表にしてＳＰＳＳ（ＳＰＳＳ，Ｉｎｃ．）に提出した。ＳＡＳ／Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ）を用いて、ハーディー７−ワインベルグ平衡への適合度を確認したところ、症例および対照のどちらにおいても、すべてのＳＮＰが、ｐ＜０．０５のカットオフ値を切り抜けた。ハプロタイプを推定するために、本発明者らは、ケンブリッジ医学研究所のウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｅ．ｃｉｍｒ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌａｙｔｏｎ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／からダウンロードしたｓｎｐｈａｐ（Ｄａｖｉｄ Ｃｌａｙｔｏｎ著；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）、ＳＮＰＥＭ（Ｄｒ．Ｎｉｃｈｏｌａｓ ＳｃｈｏｒｋとＭ．Ｄａｎｉｅｌｅ Ｆａｌｌｉｎ著、そして、Ｄ． Ｆａｌｌｉｎから取得）、およびＰＨＡＳＥバージョン２．１１（Ｍａｔｔｈｅｗ Ｓｔｅｐｈｅｎｓ著；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ，そして、彼のウェブサイトであるｗｗｗ．ｓｔａｔ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｓｔｅｐｈｅｎｓ／ｓｏｆｔｗａｒｅ．ｈｔｍｌから利用可能）を用いた。用いたハプロタイプ解析法は、第一には、期待値最大化（ＥＭ）アルゴリズムまたはギブスサンプリングアルゴリズムを用いてハプロタイプの推定値を得るためのものであり、第二には、連鎖不平衡の領域内にある最小情報セットを表すｈｔＳＮＰを同定するためのものであり、第三には、これらが、ＡＭＤと有意な関連性があることを評価するためのものである。連鎖不平衡は、Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ＰＧＡのウェブサイト（ｗｗｗ．ｉｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｉｔｙ．ｎｅｔ）で利用できる画像ツールを用いて評価した（図示せず）。すべてのｐ値は両側検定されたものであり、Ｘ２値は、漸近有意確率として表示されている。全第Ｉ種過誤率（α）は、Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ＰＧＡのウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｉｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｉｔｙ．ｎｅｔ／ＩＩＰＧＡ２／Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｍｕｌｔｉｐｌｅｔｅｓｔｆｄｒｆｏｒｍ）で実施されている、ＢｅｎｊａｍｉｎｉとＨｏｃｈｂｅｒｇ（１９９５）Ｊ．Ｒ．Ｓｔａｔ．Ｓｏｃ．Ｓｅｒ．Ｂ５７：２８９−３００の方法を用いて遡及的に計算されたが、２×１０−３よりも小さかった。
【０１６６】
有意性のあるハプロタイプに、ＳＮＰＥＭとＰＨＡＳＥで並べ替え検定を行った。図２Ａに示された防御型ＳＮＰモデルをＥｘｅｍｐｌａｒ２．２（Ｓａｐｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅｓのウェブサイト上、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｐｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍで利用可能）に提示し、このソフトウェアによって、図２Ｂに示した３つのデータベース（アイオワ、コロンビア、および混合）に対する適合度について統計的な評価を行った。遺伝的アルゴリズム（ＧＡ）から導出されたモデル（図２Ｃに示されている）の作成は、Ｅｘｅｍｐｌａｒソフトウェアを含んでいた。ＧＡのオプション値は以下の通りに設定した。すなわち、モデルサイズが５以下（１６種類の遺伝子型が可能となる）の１５００ＡＮＤ／ＯＲモデルを各１５回反復した。さらに、遺伝的アルゴリズムの実行および有意性検定の詳細は実施例２に含まれている。
【０１６７】
適当なモジュールをもつＳＰＳＳバージョン１４．０統計用パッケージを用いて、マイナーな対立遺伝子を持つもの（＋）と持たないもの（−）に再コード化したコロンビア、アイオワ、および混合のデータに対して分類および回帰ツリー解析を行った。モデルは、ＣＦＨおよびＣ２／ＢＦの両遺伝子座を非独立の結果に対する寄与因子として取り込んだ３つのデータセットのそれぞれを用いて自動的に作成された。
【０１６８】
結果
コロンビア大学で確認されたコホートから得られた約９０人のＡＭＤ症例者および９０人の対照者において、まず変性ＨＰＬＣによって、全部で１８のＢＦエキソンを、５０〜８０ｂｐの隣接するイントロン領域も含めて解析した。８種類のミスセンス変異を含む１７種類の配列変異体を同定したところ、Ｌ９Ｈ（ｒｓ４１５１６６７）対立遺伝子とＲ３２Ｑ（ｒｓ６４１１５３）対立遺伝子は、症例者よりも対象者において頻度が高かった（表１）。ＢＦ内およびその隣接ホモログであるＣ２内のハプロタイプ−タギングＳＮＰ（ｈｔＳＮＰ）が同定され（図１）、５４８人のＡＭＤ症例者および２７５人の対照者からなるコロンビア大学コホートにおいて遺伝子型判定が行われた。これらの解析によって、ＡＭＤと有意に関連する４つの変異体が明らかになった。ＢＦにおけるＬ９Ｈ変異体は、Ｃ２（ｒｓ９３３２７３９）におけるＥ３１８Ｄ変異体とほぼ完全な連鎖不平衡（ＬＤ）にあったが、ＡＭＤに対して非常に防御的であった（Ｘ２＝１３．８ Ｐ＝０．０００２０，ＯＲ＝０．３７［９５％ＣＩ＝０．１８〜０．６０］）。ＢＦにおけるＲ３２Ｑ対立遺伝子は、Ｃ２のイントロン１０におけるｒｓ５４７１５４のＳＮＰとほぼ完全なＬＤにあり、これも非常に防御的であった（Ｘ２＝３３．７，Ｐ＝６．４３×１０−９，ＯＲ＝０．３２［９５％ＣＩ＝０．２１〜０．４８］）。
【０１６９】
アイオワ大学で得られた３５０人の症例者および１１４人の対照者からなる独立したコホートの遺伝子型判定によってこれらの知見が確認された。例えば、Ｃ２ Ｅ３１８Ｄ／ＢＦ Ｌ９ＨのＳＮＰ対は、このコホートにおいてＡＭＤと有意に関連していた（Ｘ２＝１０．６，Ｐ＝０．００１２，ＯＲ＝０．３４［９５％ＣＩ＝０．１８−０．６７］）。Ｃ２遺伝子座およびＢＦ遺伝子座にわたるハプロタイプを解析するために、この２つのコホートから得られたデータを一緒にした（表２）。共通のハプロタイプ（Ｈ１，図１）は、ＡＭＤに対する有意なリスクをもたらしていた（Ｘ２＝１０．３，Ｐ＝０．００１３，ＯＲ＝１．３２［９５％ＣＩ＝１．１〜１．６］）。ＢＦのＲ３２ＱのＳＮＰによってタグ付けされたハプロタイプ（Ｈ７）は、その他すべてのハプロタイプと比べると、ＡＭＤに対して非常に防御的であり（Ｘ２＝２６．９，Ｐ＝２．１×１０−７，ＯＲ＝０．４５［９５％ＣＩ＝０．３３〜０．６１］、また、Ｃ２のＥ３１８Ｄ／ＢＦのＬ９Ｈを含むハプロタイプ（Ｈ１０）も有意に防御的であった（Ｘ２＝２１．６，Ｐ＝３．４×１０−６，ＯＲ＝０．３６［９５％ＣＩ＝０．２３〜０．５６］）（図１）。Ｈ１ハプロタイプを参照用ハプロタイプとして使用すると、Ｈ７（Ｘ２＝２９．６，ＯＲ＝０．４２［０．３２〜０．５８］）およびＨ１０（Ｘ２＝２４．９，ＯＲ＝０．３３［０．２１〜０．５２］）に対して僅かに有意性の高い結果を生じさせた。ＳＮＰＥＭプログラムによる解析でも、同じハプロタイプが本疾患と有意に関連することが明らかとなり、Ｃ２遺伝子および／またはＢＦ遺伝子における対立遺伝子が、ＡＭＤに対するリスクを予測できるという仮説が裏付けられた。この２つの防御型ハプロタイプをもつ個体（Ｈ７、Ｈ１０についてホモ接合体であるか、または７／１０複合へテロ接合体である）が、対照者の３．４％に見られたが、症例者では僅か０．７７％にしか見られなかった（Ｘ２＝１２．２，Ｐ＝０．０００４８，ＯＲ＝０．２２［０．０８７〜０．５６］）。２つの防御型対立遺伝子をもつ対象のオッズ比は、１つの防御型対立遺伝子をもつ対象のオッズ比のほぼ半分であり、共優性モデルと整合した。
【０１７０】
観察された関連性は、全ＡＭＤ対象コホートを対照者と比較した場合、または、初期ＡＭＤ（ｅＡＭＤ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、および地図状萎縮（ＧＡ）など、主なＡＭＤサブタイプを別々に解析した場合に非常に有意性が高かった。ＧＡ群（２つのコホートから合計で１３３人の対象）は、場合によっては、ＣＦＨに関係した本発明者らの観察結果（Ｈａｇｅｍａｎら、２００５、前掲）と同じように、結果一般的な傾向から逸脱した。具体的には、Ｒ３２Ｑ対立遺伝子によってタグ付けされたハプロタイプが、本疾患に対してもっとも強い防御を示した。すなわち、ＧＡ群を対照者と比較するとＯＲが０．２２であるのに対し、残りのＡＭＤ試料を同じ解析にかけると０．４５であった。このずれは、本疾患にさまざまな病因論があるという点では有意であるかもしれないが、恐らくＧＡ症例者の数が少なかったために、統計的に有意であるというまでには至らなかった（信頼区間が重複した）。
【０１７１】
複合解析は、まず、対象をＣＦＨのＹ４０２Ｈ対立遺伝子の状態にしたがって階層化して実施した。Ｃ２／ＢＦによって付与される防御は、ＣＦＨの４０２Ｈホモ接合体で最も強く（ＯＲ＝０．２７）、４０２Ｈ／Ｙヘテロ接合体で中程度（ＯＲ＝０．３６）、そして、４０２Ｙホモ接合体で最も弱かった（ＯＲ＝０．４４）。しかし、これらの推定値のすべてで信頼区間が重複した。この結果は、主に、Ｃ２／ＢＦ防御型対立遺伝子の頻度が４０２Ｈホモ接合体（「リスク」遺伝子型）で最も高いという傾向にあるせいであった。対照コホートにおけるこれらの対象の４０％が少なくとも１つの防御型対立遺伝子を持っていた。これに対し、４０２Ｈ／Ｙまたは４０２Ｙである対照者では、Ｃ２／ＢＦ防御の頻度が次第に低下した（それぞれ３２％および２６％）。言い換えると、ＣＦＨ遺伝子型のために高リスクになっている個体は、ＡＭＤを発症せず、高頻度でＣ２／ＢＦ遺伝子座に防御型対立遺伝子を有する。
【０１７２】
個体ＳＮＰ分析によって示唆されたように、ＡＭＤに対して防御的なＣＦＨおよびＣ２／ＢＦのＳＮＰの組み合わせで可能なものを同定するために、利用可能なデータの解析を２つの方法、すなわち、まずは、経験的な手作りモデルによって、次に、Ｅｘｅｍｐｌａｒソフトウェアを用いた機械学習（ｍａｃｈｉｎｅ−ｌｅａｒｎｅｄ）モデルによって行った（図２）。最初のモデルは、データを経験的に検討することによって作り出されるような仮説（手作り）モデルであった（図２Ａ）。モデルについての説明がパネルＡとして示されており、ＡＭＤから防御する遺伝子型の組み合わせである可能性のある４つの組み合わせ（「真」であるモデルをもたらす組み合わせ）を提示していると解される。このモデルを試料に対して適用したところ、各コホート別と混合コホートについてパネルＢに示す分布が得られた（図２Ｂ）。症例におけるパーセンテージは、モデルが偽であるという症例者の割合であって、言い換えれば、彼らは、モデルによって表されるような防御を受けなかった者である。対照におけるパーセンテージは、モデルによって表された防御因子を持っていて、モデルが真であることを意味している対照者の割合である。これらの分布に対し、フィッシャーの正確確率検定による有意性検定を行い、ｐ値がそれぞれ、Ｐ＝０．００２３７、Ｐ＝４．２８×１０−８、およびＰ＝７．９０×１０−１０であることを証明した。この後、Ｅｘｅｍｐｌａｒソフトウェアを動かして、遺伝的アルゴリズムと呼ばれる機械学習法を用いて、データに対して「最適適合」した防御モデルを作成した。すなわち、本発明者らは、機械学習ソフトウェアが、手作りのモデルを凌ぐことができるという仮説をテストした。コロンビアのコホートについてモデルを学習させ、得られた最適合モデルを保持し、次に、独立したコホートに対する確認検定（外挿確認（ｏｕｔ−ｏｆ−ｓａｍｐｌｅ ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）としてアイオワコホートに適用した。最後に、これらのモデルを混合試料セットに適用した。得られた最良のモデルを図２Ｃに示す。このモデルは、ＡＭＤから防御すると思われる４種類の個別の（または組み合わされた）遺伝子型（すなわち、「真」であるモデルをもたらす組み合わせ）を表している。アイオワコホート、コロンビアコホート、および混合コホートのそれぞれに対する、このモデルの成績を図２Ｄに示す。これらの分布に対し、フィッシャーの正確確率検定による有意性検定を行い、ｐ値がそれぞれ、Ｐ＝７．４９×１０−５、Ｐ＝２．９７×１０−２２、およびＰ＝１．６９×１０−２３であることを証明した。症例者と対照者の指定を無作為化し、データセットの置換を３０００回行うことによって、この方法をさらに検証した。実際のデータは、これらの置換例のどれよりも有意性が高かった。
【０１７３】
要約すると、ＣＦＨに変異をもつこれらのハプロタイプをＥｘｅｍｐｌａｒソフトウェアによって複合解析したところ、５６％の健常対照者は、少なくとも１つの防御型ＣＦＨハプロタイプまたはＣ２／ＢＦハプロタイプを保有しているが、７４％のＡＭＤ対象は、これらの遺伝子座にいずれの防御型ハプロタイプも持っていないことが明らかになった。このデータを検討すると、症例者におけるリスク型の約６０％、および対照者の防御型の６５％は、ＣＦＨ遺伝子座の作用によるものであり、残り（それぞれ４０％および３５％）はＣ２／ＢＦ遺伝子座によるものであることが分かる。機械学習モデルは、手作りモデルよりも優れており、有意により正しく臨床結果を予測することが可能となった。分類および回帰ツリー（Ｃ＆ＲＴ）解析によって、遺伝的アルゴリズム解析と同様のツリーが作成され、ＡＭＤにおけるＣ２／ＢＦの役割を裏付ける結果がもたらされた。コロンビアのデータセットを単独で用いると、Ｃ２／ＢＦ対立遺伝子の存在によって、Ｃ＆ＲＴモデルが症例の３７％を占めるが、アイオワを用いると３６％を占め、混合解析では２７％という僅かに低い効果を示した。これらの推定値はすべて、遺伝的アルゴリズム解析から推定された３５〜４０％というＣ２／ＢＦ遺伝子座の寄与度と整合している。これらの方法の詳細と具体的な解析については、実施例２に記載されている。
【０１７４】
ＢＦおよびＣ２は、神経網膜、ＲＰＥ、および脈絡膜で発現している。ヒト提供者の眼で、ＡＭＤに罹っている眼（６７歳と９４歳の２人の提供者）とＡＭＤに罹っていない眼（６９歳と８２歳の２人の提供者）から、単離されたＲＰＥ、ＲＰＥ／脈絡膜複合体、および神経網膜から、ＢＦおよびＣ２の遺伝子産物に対する適当なサイズのＰＣＲ単位複製配列が検出された（データを示さず）。ＢＦタンパク質は、ブルッフ膜内部の眼のドルーゼン、およびあまり顕著ではないが脈絡膜実質の中に存在した（図３Ａ）。Ｂａ（ＢＦに由来するペプチド）の免疫反応性はあまり顕著ではなかったが、ＲＰＥ細胞に関連した斑点、およびブルッフ膜全体には明らかに存在していた（図３Ｂ）。ＢＦの分布は、Ｃ３の分布に類似しており（図３Ｃ）、それらはともに、ＣＦＨおよびＣ５ｂ−９の分布と本質的に同一である（Ｈａｇｅｍａｎら、２００５、前掲）。
【０１７５】
要約すると、これらのデータは、補体経路関連遺伝子Ｃ２およびＢＦの変異体が、ＡＭＤと有意に関連していることを示している。Ｃ２／ＢＦ遺伝子座における防御型ハプロタイプは、第二補体活性化経路の重要な活性化因子であるＢＦ遺伝子に非同義ＳＮＰを含む。利用可能なデータにより、ＡＭＤ表現型が、異常なＢＦ活性によって調節されうるという仮説が裏付けられた。実際、３２位にグルタミンを含むＢＦタンパク質（防御型ハプロタイプをタグ付けする２種類のＢＦ ＳＮＰの一方から得られた）は、より高頻度のアルギニン３２型と較べて溶血作用が低いことが明らかになっている（ＬｏｋｋｉとＫｏｓｋｉｍｉｅｓ（１９９１）ｌｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３４：２４２−６）。同じ研究で、Ｒ３２Ｗ変異体についての機能的作用は実証されていないが、今回の研究では、ＡＭＤとの関連性はなかった。これらのデータに基づいて、本発明者らは、酵素活性が低下している活性化因子によって、ドルーゼンの形成およびＡＭＤをもたらしうる慢性的な補体反応に対するリスクの低下がもたらされることを示唆する。この仮説は、ＣＦＨの変異による第二補体カスケードの阻害が不十分であると、網膜色素上皮／ブルッフ膜界面における慢性的損傷をもたらすという本発明者らの提示内容と適合する（Ｈａｇｅｍａｎら、２００５、前掲；Ａｎｄｅｒｓｏｎ、２００２、前掲；Ｈａｇｅｍａｎ、２００１、前掲）。別のＢＦのｈｔＳＮＰであるＬ９Ｈはシグナルペプチド内に位置する。この変異体の機能的結果は直接には明らかになっていないものの、この変異体はＢＦの分泌を調節する可能性がある。
【０１７６】
遺伝子および機能に関するデータは、ＢＦにおける変異が、観察されたＡＭＤとの関連性の原因である可能性が高いことを示唆している。これは、ＢＦにおける２つのハプロタイプをタグ付けする変異体が非保存的な変異体であり、この２つのうち１つが直接の機能的関連性（低下した溶血作用）をもつと実証されているのに対し、Ｃ２における変異体は保存的変異であってイントロンのＳＮＰであるという事実に基づいている。また、ＢＦは、ＣＦＨも関与する経路である第二経路に直接関与する。しかしながら、特に、Ｃ２およびＢＦが、ともにＣ３の産生を制御していることから、Ｃ２の直接的な役割を無視することもできない。Ｃ２およびＢＦは、そのカルボキシ末端にセリンプロテアーゼドメインがあり、そのアミノ末端に３つのＣＣＰモジュールをもつなど、ほぼ同一の分子構造をもつ。ＢＦがＡＭＤの発病に関与する遺伝子であることのさらなる根拠は、ドルーゼンの組成の研究から生まれている。第二経路に関与する大多数のタンパク質（ＣＦＨ、ＢＦなど）がドルーゼンに存在するのに対し、Ｃ２やＣ４など古典的な経路からはそれらのアナログが見られない（Ｍｕｌｌｉｎｓら（２０００）Ｆａｓｅｂ Ｊ．１４：８３５−４６；Ｃｒａｂｂら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１４６８２−７）。これらのデータは、さらに、Ｃ２遺伝子におけるＳＮＰが、ＢＦとの広範なＬＤのために、ＡＭＤに関連することを示唆している。
【０１７７】
Ｃ２とＢＦの両方における、いくつかの一般的な機能的変異体が説明されている（ＤａｖｉｓとＦｏｒｒｉｓｔａｌ（１９８０）Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．９６：６３３−９；Ｒａｕｍら（１９７９）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．３１：３５−４１；Ａｌｐｅｒら（２００３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：２９７−３０５）が、これらのほとんどは稀なものである。シアトルＳＮＰプロジェクトのウェブサイト（ｗｗｗ．ｐｇａ．ｍｂｔ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／）で利用可能な両遺伝子に関する再配列決定データから判断したところ、欧州集団において２％よりも高い頻度をもつミスセンス対立遺伝子のすべてが解析された。さらに、本発明者らのハプロタイプであるＨ２、Ｈ５、およびＨ７の例など、いくつかのＨＬＡハプロタイプの完全長配列決定の後、どちらの遺伝子においてもそれ以上の非同義変異体は見つかっていない（Ｓｔｅｗａｒｔら（２００４）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１４：１１７６−８７）。
【０１７８】
Ｃ２およびＢＦは、炎症に関係する他の多くの遺伝子とともにＨＬＡ遺伝子座に存在しているため、本研究で観察された関連性が隣接する遺伝子とのＬＤによるものである可能性を考慮する必要がある。（ＬａｒｓｅｎとＡｌｐｅｒ（２００４）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：６６０−７）。しかし、５種類の証拠が、Ｃ２／ＢＦ遺伝子座が観察された関連性に対する主要な寄与因子であることを示唆している。まず、ＨａｐＭａｐデータでは、Ｃ２／ＢＦと隣接するクラスＩＩＩ遺伝子座との間には中度のＬＤしか見られないことが挙げられる。次に、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子座、ならびにＢＦハプロタイプであるＨ７およびＨ１０は強いＬＤを示さないことが挙げられる。第三に、Ｋｌｅｉｎら（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０８：３８５−９によって行われた全ゲノムスキャンでは、ＭＨＣ遺伝子座は、ＡＭＤと統計的に有意な関連性を示さなかった。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｍａｐｐｉｎｇ １００Ｋ Ａｒｒａｙを用いた彼らの解析は、ＭＨＣ遺伝子座の全域で８０のＳＮＰを含んでいたが、本研究でタイプ分けされた８種類のＳＮＰのいずれも含んでいなかった（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍ／ａｎａｌｙｓｉｓ／ｎｅｔａｆｆｘ／ｉｎｄｅｘ．ａｆｆｘ）。第四に、ＨａｐＭａｐデータから推定された組換え率から、Ｃ２／ＢＦ遺伝子座の両側に高い組換え領域があることが示されていることである（Ｍｙｅｒｓら（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１０：３２１−３２４）。最後に、ＡＭＤにおけるＭＨＣに関する、公表された１つの研究では、クラスＩ遺伝子座のＢ＊４００１（Ｐ＝０．０２７）およびクラスＩＩ遺伝子座ＤＲＢ１＊１３０１（Ｐ＝０．００９）について中度の防御が示されている（Ｇｏｖｅｒｄｈａｎら（２００５）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４６：１７２６−３４）。本研究で同定された防御型対立遺伝子は、実質的により高い統計的有意度でＡＭＤに関連しているため、Ｃ２／ＢＦの関連性が、ＭＨＣのこれらの遺伝子座および／または別の遺伝子座とのＬＤによるものであるという可能性は非常に低い。
【０１７９】
表１．ＤＨＰＬＣスクリーニングによって検出されたＢＦ遺伝子における配列変異体
【０１８０】
【表１】
表２．混合コロンビア・アイオワコホートにおけるＣ２／ＢＦ変異体の関連性解析
【０１８１】
【表２】
実施例２．Ｅｘｅｍｐｌａｒ統計学法
Ｓａｐｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅは、ＮＣＩと共同して遺伝子型判定データを解析した。ＮＣＩが、全部で約１３６０の試料を、遺伝子型判定された１０の２対立遺伝子ＳＮＰとともに提供した。このデータは、対立遺伝子を数値表現したものとともにＳａｐｉｏに提示された。このデータを、対立遺伝子を遺伝子型の数値表現に変えることによって（ＡＡについては「１１」が「１」となり、ＡＢについては「１２」が「２」となり、ＢＢについては「２２」が「３」となり、「００」はノーコールであり、「０」に変換された）、Ｅｘｅｍｐｌａｒを行いやすいフォーマットに変換し、また試料の重複を排除するためにスクリプトを書いた。表現型は加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）であった。同定されたＡＭＤにはいくつかのサブクラスがあったが、本解析では、データを全体として用いて、さまざまなＡＭＤ表現型の基となる共通した遺伝子型があるか否かを判定した。
【０１８２】
Ｓａｐｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅは、Ｅｘｅｍｐｌａｒ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｕｉｔｅを利用して、供給されたデータを解析した。Ｅｘｅｍｐｌａｒは、症例−対照研究のためにいくつかの関連性に基づく解析を行う。この解析に用いられたモジュールは以下の通りである。
・遺伝的アルゴリズムモジュール（ＧＡモジュール）−このモジュールは、ＳＮＰ（モデル）に基づく実験の論理結合を発見するための機械学習法を行う。
・関連性実験モジュール（ＡＳモジュール）−このモジュールは、カイ二乗、イェーツ法、フィッシャーの正確確率検定、オッズ比、相対危険率、連鎖不平衡、Ｄ’、ｒ２、およびハプロタイプ推定のような多くの有用な統計値を計算する。
【０１８３】
Ｅｘｅｍｐｌａｒは、一般的には、表現型に相関するモデルを発見する。言い換えると、モデルによって、その表現型からの防御ではなく、その表現型を得るのに寄与する因子を予測するのであるが、このモデルから防御因子を推測することは可能である。例えば、あるモデルが、ＲＳ００１がＢＢであるか、またはＲＳ００１がＡＢである試料が、その表現型と相関することを示しているのであれば、ＲＳ００１がＡＡである試料は、その表現型から防御されると推測することができよう。
【０１８４】
Ｅｘｅｍｐｌａｒモデルは、ＳＮＰの論理結合である。このモデルは、仮説を検証するために手作りすることもできるし、遺伝的アルゴリズムを利用して、高い有用性をもつモデルを見つけるための試みを行うことも可能である。遺伝的アルゴリズムは、大きなデータ領域内でパターンを見つけるのを得意とする機械学習法である。ＧＡは、３分の２・３分の１妥当性確認法を利用している。これは、症例者および対照者の２／３を無作為に訓練セットに振り分けることによって行われる。そして、ＧＡは、この訓練セットに関するモデルを学習する。学習期を終わると、最も効率のよいモデルを試験セット（データの残り１／３）に適用する。試験および訓練を通じて最も効率のよいモデルがユーザに戻される。本研究では、少数のＳＮＰだけが調べられていたとしても、試料数が多いため、すべてのデータを通じて適用できるパターンを人間が効果的に区別することは困難であった。このため、より有用性が高い、より複雑なパターンを見つけるためにＧＡを利用した。伝統的な手法に対するこれらのタイプのモデルの有益性は、予測を行う際にゲノム全体から多数の遺伝子座を取り込むことができる点にある。これによって、１つのモデルで、何が、しばしば結果と相関する多型の複合的な相互作用となるかを同定することが可能になる。
【０１８５】
本研究は、ＡＭＤに対して防御的なモデルを発見することに注目したという点でユニークなものであった。これは、加法モデルを発見するという、通常のＥｘｅｍｐｌａｒ法から逸脱しているため、入力データに変更を加えなければならなかった。Ｅｘｅｍｐｌａｒに対し、症例者が対照者であり、その逆も同様であると指示するだけで、それは、ある試料がその表現型を獲得しなかった理由を明らかにするモデルを学習する。すなわち、防御を付与したＳＮＰの組み合わせを見つけようとしていた。
【０１８６】
研究グループ情報：データは、アイオワコホートおよびコロンビアコホートという、２つの別々のコホートから提供された。コロンビアのデータは、５６０人が症例者、および２７０人が対照者である、全部で約８３０人の試料をもつ大きなグループであった。アイオワコホートは、４１４人の症例者および１１５人の対照者による全部で約５２９人の試料を有していた。２つの試料グループがあったため、モデル構築を、一方のコホートにはＧＡモジュールを用いて行ない、得られたモデルのサンプル外（ｏｕｔ−ｏｆ−ｓａｍｐｌｅ）効率を他方のコホートで検定することが可能であった。
【０１８７】
研究結果：入力したデータセットの中で各ＳＮＰ／遺伝子型について多数の統計値が生成された。統計値は、２×２分割表を作成し、遺伝子型を適正にカウントすることによって作成された（これは対立遺伝子のカウントではなく、計算されていない２つの遺伝子型を１つの値に崩壊させた遺伝子型カウントであることに留意されたい）。２×２分割表の各セルの値は、症例（真）、症例（偽）、対照（真）、対照（偽）という見出しの下に表の中に記載されている。すべての統計値は両側計算値であった。
【０１８８】
表３から表６は、アイオワコホートとコロンビアコホートに関する統計値を並列して示している。注：「カテゴリー」欄は、１がＡＡに相当し、２がＡＢに、また３がＢＢに相当する遺伝子型である。表７は、混合コホートに関する統計値を示している。
【０１８９】
表３．コロンビアとアイオワを並列させたカイ二乗統計値
【０１９０】
【表３】
表４．コロンビアとアイオワを並列させたカイ二乗イェーツ統計値
【０１９１】
【表４】
表５．コロンビアとアイオワを並列させたフィッシャー正確確率統計値
【０１９２】
【表５】
表６．コロンビアとアイオワを並列させたオッズ比統計値
【０１９３】
【表６】
表７．混合コホートのカイ二乗統計値
【０１９４】
【表７】
表８．混合コホートのカイ二乗イェーツ統計値
【０１９５】
【表８】
表９．混合コホートのフィッシャー正確確率統計値
【０１９６】
【表９】
表１０．混合コホートのオッズ比統計値
【０１９７】
【表１０】
明らかに、これらのＳＮＰの多くは、両コホートにおいて非常に統計的に有意であった。これは、主に、本研究のための選択をもたらしたアプリオリな情報のせいであった。特に注意すべきは、フィッシャー値がｐ＜４．８１Ｅ−２０であって３（Ｔ／Ｔとして知られるＢＢ）であるＲＳ１０６１１７０であって、防御型の遺伝子型としての強力な可能性があることを示している。並列比較で、アイオワコホートとコロンビアコホートの間にはいくつかの違いがあることが明らかになった。
【０１９８】
どのＳＮＰ／遺伝子型が防御型または寄与型であるかをさらに測定するために、フィッシャー法を、遺伝子型浸透分散（ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ ｖａｒｉａｎｃｅ）の基礎として用いた。これを行うために、症例者および対照者の遺伝子型の割合を計算し、それらの差異の絶対値を計算した。表１１は、この情報を提供し、差異の頻度が高いものの順に並べられている。
【０１９９】
表１１．遺伝子型浸透分散
【０２００】
【表１１】
仮定された防御モデル：本研究では、予備実験で、ＡＭＤから防御すると可能性があると思われるＳＮＰの組み合わせが示された。この仮説を検定するために、ＮＣＩの詳細な説明について手作りモデルを構築した。モデル図を図２Ａに示す。このモデルは、仮定（ＩＦ）文として以下のように記載されうる：
ＲＳ５４７１５４がＧ／Ａであり、かつＲＳ１０６１１７０がＴ／Ｔであるか、または
ＲＳ５４７１５４がＧ／Ａであり、かつＲＳ１０６１１７０がＣ／Ｃであるか、または
ＲＳ４１５１６６７がＴ／Ａであり、かつＲＳ１０６１１７０がＣ／Ｔであるか、または
ＲＳ４１５１６６７がＴ／Ａであり、かつＲＳ１０６１１７０がＣ／Ｃである場合には、
この人物は、ＡＭＤから防御されている。
【０２０１】
したがって、このモデルは、ＡＭＤから防御する可能性がある遺伝子型の以下の４つの組み合わせ（モデルが「真」になる組み合わせ）を与える：
１．Ｇ／ＡであるＲＳ５４７１５４、およびＴ／ＴであるＲＳ１０６１１７０
対照者 ８．８２％、症例者 ５．４５％
２．Ｇ／ＡであるＲＳ５４７１５４、およびＣ／ＣであるＲＳ１０６１１７０
対照者 ７．２２％、症例者 １．９３％
３．Ｔ／ＡであるＲＳ４１５１６６７、およびＣ／ＴであるＲＳ１０６１１７０
対照者 ４．８％、症例者 ２．０２％
４．Ｔ／ＡであるＲＳ４１５１６６７、およびＣ／ＣであるＲＳ１０６１１７０
対照者 ３．４７％、症例者 ．７９％。
【０２０２】
このモデルを試料に対して適用すると、アイオワおよびコロンビアの混合コホートについて以下の結果が得られた：
・７９４人の症例者は、防御因子を持っていなかった（モデルは偽であった）．．．９０．１２％
・８８人の対照者は、防御因子を持っていた（モデルは真であった）．．．２３．５２％
・８７人の症例者は、防御因子を持っていた．．．９．８８％
・２８６人の対照者は、防御因子を持っていなかった．．．７６．４７
注：すべてのモデルに関する統計値は、モデルを混合コホートに対して適用し、その真陽性（ＴＰ）、偽陰性（ＦＮ）、偽陽性（ＦＰ）、および真陰性（ＴＮ）の割合を見た。そして、これらの数字を、すべての統計値が作成された２×２表に入れた。表１２は、各コホートに対する統計値を示している。
【０２０３】
表１２．ＮＣＩが仮定した防御モデル統計値
【表１２】
遺伝的アルゴリズム（ＧＡ）から得られたモデル：ＧＡモジュールがＳＮＰのより良好な組み合わせを見つけることができたか否かを見ようとして、ＧＡモジュールを作動させて、反転データに対するモデルを学習させた（防御型モデルを学習させるため）。以下のものを含む、さまざまなパラメータ設定値を利用した：
・モデルタイプ：該モデルが、「かつ（ＡＮＤ）」および「または（ＯＲ）」の組み合わせ、および「ＡＮＤ」だけ、または「ＯＲ」だけをもつか否かを示している。
・モデルサイズ：いくつのＳＮＰがモデルの中に存在しうるかについての上限値を示す。
・ＧＡ特異的パラメータ：例えば、世代、モデル数など。
【０２０４】
一般的に言えば、小規模のＡＮＤだけからなるモデルが好ましい。その理由は２つある。第一に、ＡＮＤだけからなるモデルでは、真であるべきモデルに対してそのＳＮＰのすべてが真であることを要求されるため、その解釈は一義的であるが、ＯＲをもつモデルでは、真であるべきモデルに対して全てのＳＮＰが存在することは要求されないため、一定レベルの不確定さが入り込むことである。第二に、測定すべきＳＮＰが少なくなるため、モデルが小さいほど解釈が楽になることである。
【０２０５】
Ｅｘｅｍｐｌａｒは、より一般的に適用可能な結果になるという所望の成果による入力データに対する過学習を避けるために、３分の２・３分の１妥当性確認法を用いている。
【０２０６】
さらに、２つの別々の実験グループがあったことから、コロンビアのデータだけに基づいたモデルを構築し、得られたモデルをアイオワコホートに対して検定することが可能であった。このモデルの成績が、２つのグループを通じて整合していれば、このモデルの一般的適用性が強く示されることとなる。これは、上記統計学の項において議論したような、この２つのグループ間における興味深い統計的差異を考えると、特に興味深い。このような変異を考えると、ＧＡによって、コロンビアのデータについては高い適合モデルを見つけることができるが、アイオワデータについては成績がよくないと思われる。
【０２０７】
ＧＡによって、コロンビア、アイオワ、および混合グループのデータセット全体について良好な成績を得たモデルが見つけられた。このモデルがコロンビアのデータに対して学習させられていたことから、予想通りコロンビアのデータに対するモデルの成績の方がアイオワデータよりも優れていた。それにもかかわらず、ＧＡがアイオワのデータについて事前の知識がなく、２つのコホート間で主なＳＮＰの間に有意な統計的差異があったことを考えると、このモデルの成績は特筆すべきものである。得られた最適なモデルは、混合コホートについて手作りで仮定されたモデルよりも成績がよかった（ＲＳ１０６１１７０）。まず、このモデルは、「ＩＮＤＥＬＴＴがホモ接合であり、かつ（ＡＮＤ）ＲＳ５４７１５４がＧＧである」という、もう一つのセクションを含んでいたが、さらに調べてみたところ、このセクションはモデル解釈とは無関係であると判定されたため、これを排除して、同一の成績をもつモデルを作成した。最終的なモデル図を、図２Ｃで見ることができる。
【０２０８】
このタスクのためのＧＡ特異的オプションは以下の通りであった：
モデル：１５００−これは、モデルの新しい世代を発展させるための基礎として、ＧＡが内部的に構築したモデルの数である；
反復：２５−これは、解を見つけるまでにモデルが検討された進化的反復（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｉｔｅｒａｔｉｏｎｓ）の回数である；
モデルサイズ：５−これは、モデルに、単一のモデルにおいて最大１６の遺伝子型を出現させることができるサイズである；
モデル型：ＡＮＤ／ＯＲ型−これは、ＧＡに、かつ型およびまたは型の両方を使用できるモデルを構築させる。
【０２０９】
このモデルは、仮定文で以下のように書き表すことができる：
ＲＳ１０４８７０９がＧ／Ｇであり、かつＲＳ１０６１１７０がＴ／Ｔであるか、または
ＲＳ５４７１５４がＧ／Ａであるか、または
ＲＳ４１５１６６７がＴ／Ａであるか、または
ＩＮＤＥＬＴＴが＋／＋であれば、
この人物は、ＡＭＤから防御されている。
【０２１０】
このモデルは、ＡＭＤから防御する以下の４つの個別の遺伝子型、または遺伝子型の組み合わせを与える（モデルが「真」となる組み合わせ）：
１．ＲＳ１０４８７０９がＧ／Ｇ、およびＲＳ１０６１１７０がＴ／Ｔ
・１４．２０％の症例者、３４．３１％の対照者で存在
２．ＲＳ５４７１５４がＧ／Ａ
・９．６％の症例者、１８．３２％の対照者で存在
３．ＲＳ４１５１６６７がＴ／Ａ
・４．２％の症例者、９．９２％の対照者で存在
４．ＩＮＤＥＬＴＴが＋／＋
・１．４５％の症例者、６．８６％の対照者で存在
このモデルを試料に対して適用すると、アイオワおよびコロンビアの混合コホートについて以下の結果となる：
・６８２人の症例者（７４．７８％）は防御因子をもたず、２３０人はもっていた。
【０２１１】
・２０４人の対照者（５５．７４％）は防御因子をもち、１６２人はもっていなかった。
【０２１２】
表１３は、各コホートについての統計値を示している。ＧＡは、ボード全体にわたって良好な成績を上げた。全体として、このモデルによって記述された防御因子をもつ者は、防御因子を持たないものよりも３．６５８１倍ＡＭＤになりにくかった。
【０２１３】
表１３．遺伝的アルゴリズムから得られたモデル統計値
【０２１４】
【表１３】
この２つのコホート間におけるいくつかの主要ＳＮＰには明確な統計学的差異があることを考えると、より正確に転帰／防御を予測する単一のモデルを発見することがヒトにとっても、機械学習にとっても同じように難問であった。手作りモデルは、立派な成績を上げ、興味深いことに、ＳＮＰをＯＲで同一にまとめるなど、ＧＡが同定したのと同じＳＮＰのヘテロ接合的組み合わせを同定した（ＡＢであるＲＳ５４７１５４、ＡＢであるＲＳ４１５１６６７）。
【０２１５】
このタスクが困難であるにもかかわらず、ＧＡは、外挿検定（ｏｕｔ ｏｆ ｓａｍｐｌｅ ｔｅｓｔ）について良好な成績を上げた（フィッシャー値アイオワｐ＜０．００００７４９）。ＧＡは、すべてのコホートについて、手作りモデルよりも優れていた。それにもかかわらず、手作りモデルは、非常に適正に結果を予測するジョブを行う。このモデルの他の改変モデルをテストしたが、その成績を上げることはできなかった。ＳＮＰ／遺伝子型／論理演算子の組み合わせには多くの可能性があることを考えると、これは予想されることであるから、適当な時間枠の中で何万ものモデル変動を検定することができる機械学習法の値となる。
【０２１６】
単一のＳＮＰの高い統計学的有意性（Ｔ／ＴであるＲＳ１０６１１７０：×２＝９７．２５）を考えて、それだけでＡＭＤのリスクを予測できると結論するかもしれない。単一のＳＮＰのモデルまたは複数遺伝子座のモデルが一般集団における防御を予測するのに適している可能性があるかをテストするために、データに対して並べ替え検定を行った。並べ替え検定によって、単一のＳＮＰでは、ＧＡによるモデル、または手作りモデルのいずれよりも、データのランダム混合による方が、３０００回の並べ替えに対してカイ二乗スコアが４．８１５３であるのに対して、ＧＡでは３．３１５７、および手作りモデルでは１．２２０７となって、統計学的に有意な結果を生じる可能性がずっと高いことが示された。オッズ比評価について、単一ＳＮＰでは、ＯＲ＞１．５で６２５の並べ替えがあるのに対し、ＧＡモデルでは１３３、また手作りモデルでは４６であった。この手作りモデルは、単に、どの試料でも稀にしか存在しない遺伝子型の組み合わせを表しているだけである。結局、ＧＡモデルが、もっとも正しい症例対照成績および並べ替えの結果を示した。
【０２１７】
モデル統計学、ＲＯＣプロット、および並べ替え検定を総合的に眺めると、転帰を予測するための多遺伝子座モデル法の方が、多様なグループにわたる単一の遺伝子座よりも優れていると思われる。
結論
結論として、本研究は、ＡＭＤの病理生物学における第二補体経路の役割を広く示すとともに精緻化し、また、感染および／または炎症が、この普遍的な疾患において主要な役割を果たすという提案モデルをさらに強化している（Ｈａｇｅｍａｎら、２００５、前掲；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２００２、前掲；Ｈａｇｅｍａｎら、２００１、前掲）。
【０２１８】
実施例３．ＡＭＤの発症を予防するための防御型ＢＦタンパク質またはＣ２タンパク質の投与
対象は、ドルーゼンを含む、ＡＭＤの兆候および／または症状を呈している。この対象は、防御型多型である、ＢＦにおけるＲ３２ＱおよびＬ９Ｈ、ならびにＣ２におけるＩＶＳ １０およびＥ３１８Ｄについては陰性と判定されている。この対象は、防御型ＢＦタンパク質（Ｒ３２Ｑ多型を有する）で治療することを推奨されている。この対象に、ＢＦの血清濃度が９から３１ｍｇ／ｄＬになるのに十分な量の防御型ＢＦを生理食塩水に入れて、６ヶ月間月に１回静脈に投与する。この時、ドルーゼン、ならびにＡＭＤの他の兆候および／または症状がないか、対象を観察する。ＡＭＤの兆候および／または症状が進行していなければ、指示された頻度で、しかし、少なくとも半年に１回の頻度で患者の臨床状態を観察しながら、防御型ＢＦの投与を月に１回ずつ無期限に継続する。
【０２１９】
別の臨床投薬計画では、防御型ＢＦタンパク質を１日に１回鼻腔内に投与して、より持続的にこのタンパク質の防御作用に暴露する。
【０２２０】
本明細書に記載されたすべての刊行物および特許出願は、本発明が属する技術分野における技術水準を示すものである。すべての刊行物および特許出願は、各刊行物および特許出願が具体的かつ個別に参照して本明細書に組み込まれると記載されているものとして、参照されて本明細書に組み込まれる。
【０２２１】
本発明の原理を利用することができる多くの可能な実施形態を考慮すると、例示された実施形態は、本発明の好適な実施例に過ぎないと認識されるべきであって、本発明の範囲を制限するものと考えるべきではない。むしろ、本発明の範囲は下記の請求項によって規定される。したがって、本発明者らは、本発明はすべて、それらの請求項の範囲と趣旨に含まれるものであると主張する。
【図面の簡単な説明】
【０２２２】
【図１】ＢＦおよびＣ２におけるＳＮＰの略図とハプロタイプ解析結果である。本研究で使用されたＳＮＰを、予測されたハプロタイプ、オッズ比（ＯＲ）Ｐ値（Ｐ）、および組み合わせた場合（ＣＡＳ）と対照（ＣＯＮ）の各頻度とともに示している。Ｈ７に対する９５％信頼区間は（０．３３−０．６１）であり、Ｈ１０に対しては（０．２３−０．５６）である。祖先（チンパンジー）のハプロタイプはＡｎｃと表されている。ハプロタイプＨ２（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＬ６６２８４９の２００６年２月８日に利用可能であったもの）、ハプロタイプＨ５（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＬ６４５９２２およびＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＧ＿００４６５８の２００６年２月８日に利用可能であったもの）、およびハプロタイプＨ７（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＧ＿００００１３の２００６年２月８日に利用可能であったもの）の各例が配列決定されており、Ｃ２遺伝子にもＢＦ遺伝子にも、これ以外に非同義変異体は存在しない（Ｓｔｅｗａｒｔら（２００４）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１４：１１７６−８７）。
【図２Ａ】組み合わせ相補遺伝子解析を示している。個別のＳＮＰ解析によって、個体をＡＭＤ発症から保護する、いくつかのＳＮＰの組み合わせが可能であることが明らかになった。これらをテストするために、まず経験的モデルを適用した。図２Ａは、ＡＭＤから防御する可能性のある４つの遺伝子型の組み合わせになると解釈される、モデル図を示している。それらは、（１）ｒｓ６４１１５３（Ｒ３２Ｑ）がＧ／Ａ、およびｒｓｌ０６１１７０（Ｙ４０２Ｈ）がＣ／Ｔ；（２）ｒｓ５４７１５４がＧ／Ａ、およびｒｓｌ０６１１７０がＣ／Ｃ；（３）ｒｓ４１５１６６７（Ｌ９Ｈ）がＴ／Ａ、およびｒｓｌ０６１１７０がＣ／Ｔ；（４）ｒｓ４１５１６６７がＴ／Ａ、およびｒｓｌ０６１１７０がＣ／Ｃ。これらのモデルを適用したところ、アイオワコホート、コロンビアコホート、および混合コホートのそれぞれについて、図２Ｂに示す分布が得られた。これらの分布に対して、フィッシャーの正確確率検定を行い、ｐ値がＰ＝０．００２３７、Ｐ＝４．２８×１０−８、およびＰ＝７．９０×１０−１０であることを証明した。比較のために、模範的なソフトウェアで、遺伝的アルゴリズムとして知られている機械学習法を用いて、データに対し「最良適合度」をもたらす防御モデルを作成した。その結果得られた最良のモデルを図２Ｃに示す。このモデルは、ＡＭＤから防御する以下の可能性のある４つの個別の遺伝子型または遺伝子型の組み合わせ、すなわち、モデルが「真」となる組み合わせを説明している。これらの遺伝子型は、（１）ｒｓ１０４８７０９（Ｒ１５０Ｒ）がＧ／Ｇ、およびｒｓ１０６１１７０がＣ／Ｃ；または（２）ｒｓ５４７１５４がＧ／Ａ；または（３）ｒｓ４１５１６６７がＴ／Ａ；または（４）ＣＦＨイントロン１変異体がｄｅｌＴＴ。モデルの成績を、アイオワコホート、コロンビアコホート、および混合コホートについて図２Ｄに示す。これらの分布によってｐ値がそれぞれＰ＝７．４９×１０−５、Ｐ＝２．９７×１０−２２、およびＰ＝１．６９×１０−２３であることが証明された。
【図２Ｂ】組み合わせ相補遺伝子解析を示している。個別のＳＮＰ解析によって、個体をＡＭＤ発症から保護する、いくつかのＳＮＰの組み合わせが可能であることが明らかになった。これらをテストするために、まず経験的モデルを適用した。図２Ａは、ＡＭＤから防御する可能性のある４つの遺伝子型の組み合わせになると解釈される、モデル図を示している。それらは、（１）ｒｓ６４１１５３（Ｒ３２Ｑ）がＧ／Ａ、およびｒｓｌ０６１１７０（Ｙ４０２Ｈ）がＣ／Ｔ；（２）ｒｓ５４７１５４がＧ／Ａ、およびｒｓｌ０６１１７０がＣ／Ｃ；（３）ｒｓ４１５１６６７（Ｌ９Ｈ）がＴ／Ａ、およびｒｓｌ０６１１７０がＣ／Ｔ；（４）ｒｓ４１５１６６７がＴ／Ａ、およびｒｓｌ０６１１７０がＣ／Ｃ。これらのモデルを適用したところ、アイオワコホート、コロンビアコホート、および混合コホートのそれぞれについて、図２Ｂに示す分布が得られた。これらの分布に対して、フィッシャーの正確確率検定を行い、ｐ値がＰ＝０．００２３７、Ｐ＝４．２８×１０−８、およびＰ＝７．９０×１０−１０であることを証明した。比較のために、模範的なソフトウェアで、遺伝的アルゴリズムとして知られている機械学習法を用いて、データに対し「最良適合度」をもたらす防御モデルを作成した。その結果得られた最良のモデルを図２Ｃに示す。このモデルは、ＡＭＤから防御する以下の可能性のある４つの個別の遺伝子型または遺伝子型の組み合わせ、すなわち、モデルが「真」となる組み合わせを説明している。これらの遺伝子型は、（１）ｒｓ１０４８７０９（Ｒ１５０Ｒ）がＧ／Ｇ、およびｒｓ１０６１１７０がＣ／Ｃ；または（２）ｒｓ５４７１５４がＧ／Ａ；または（３）ｒｓ４１５１６６７がＴ／Ａ；または（４）ＣＦＨイントロン１変異体がｄｅｌＴＴ。モデルの成績を、アイオワコホート、コロンビアコホート、および混合コホートについて図２Ｄに示す。これらの分布によってｐ値がそれぞれＰ＝７．４９×１０−５、Ｐ＝２．９７×１０−２２、およびＰ＝１．６９×１０−２３であることが証明された。
【図２Ｃ】組み合わせ相補遺伝子解析を示している。個別のＳＮＰ解析によって、個体をＡＭＤ発症から保護する、いくつかのＳＮＰの組み合わせが可能であることが明らかになった。これらをテストするために、まず経験的モデルを適用した。図２Ａは、ＡＭＤから防御する可能性のある４つの遺伝子型の組み合わせになると解釈される、モデル図を示している。それらは、（１）ｒｓ６４１１５３（Ｒ３２Ｑ）がＧ／Ａ、およびｒｓｌ０６１１７０（Ｙ４０２Ｈ）がＣ／Ｔ；（２）ｒｓ５４７１５４がＧ／Ａ、およびｒｓｌ０６１１７０がＣ／Ｃ；（３）ｒｓ４１５１６６７（Ｌ９Ｈ）がＴ／Ａ、およびｒｓｌ０６１１７０がＣ／Ｔ；（４）ｒｓ４１５１６６７がＴ／Ａ、およびｒｓｌ０６１１７０がＣ／Ｃ。これらのモデルを適用したところ、アイオワコホート、コロンビアコホート、および混合コホートのそれぞれについて、図２Ｂに示す分布が得られた。これらの分布に対して、フィッシャーの正確確率検定を行い、ｐ値がＰ＝０．００２３７、Ｐ＝４．２８×１０−８、およびＰ＝７．９０×１０−１０であることを証明した。比較のために、模範的なソフトウェアで、遺伝的アルゴリズムとして知られている機械学習法を用いて、データに対し「最良適合度」をもたらす防御モデルを作成した。その結果得られた最良のモデルを図２Ｃに示す。このモデルは、ＡＭＤから防御する以下の可能性のある４つの個別の遺伝子型または遺伝子型の組み合わせ、すなわち、モデルが「真」となる組み合わせを説明している。これらの遺伝子型は、（１）ｒｓ１０４８７０９（Ｒ１５０Ｒ）がＧ／Ｇ、およびｒｓ１０６１１７０がＣ／Ｃ；または（２）ｒｓ５４７１５４がＧ／Ａ；または（３）ｒｓ４１５１６６７がＴ／Ａ；または（４）ＣＦＨイントロン１変異体がｄｅｌＴＴ。モデルの成績を、アイオワコホート、コロンビアコホート、および混合コホートについて図２Ｄに示す。これらの分布によってｐ値がそれぞれＰ＝７．４９×１０−５、Ｐ＝２．９７×１０−２２、およびＰ＝１．６９×１０−２３であることが証明された。
【図２Ｄ】組み合わせ相補遺伝子解析を示している。個別のＳＮＰ解析によって、個体をＡＭＤ発症から保護する、いくつかのＳＮＰの組み合わせが可能であることが明らかになった。これらをテストするために、まず経験的モデルを適用した。図２Ａは、ＡＭＤから防御する可能性のある４つの遺伝子型の組み合わせになると解釈される、モデル図を示している。それらは、（１）ｒｓ６４１１５３（Ｒ３２Ｑ）がＧ／Ａ、およびｒｓｌ０６１１７０（Ｙ４０２Ｈ）がＣ／Ｔ；（２）ｒｓ５４７１５４がＧ／Ａ、およびｒｓｌ０６１１７０がＣ／Ｃ；（３）ｒｓ４１５１６６７（Ｌ９Ｈ）がＴ／Ａ、およびｒｓｌ０６１１７０がＣ／Ｔ；（４）ｒｓ４１５１６６７がＴ／Ａ、およびｒｓｌ０６１１７０がＣ／Ｃ。これらのモデルを適用したところ、アイオワコホート、コロンビアコホート、および混合コホートのそれぞれについて、図２Ｂに示す分布が得られた。これらの分布に対して、フィッシャーの正確確率検定を行い、ｐ値がＰ＝０．００２３７、Ｐ＝４．２８×１０−８、およびＰ＝７．９０×１０−１０であることを証明した。比較のために、模範的なソフトウェアで、遺伝的アルゴリズムとして知られている機械学習法を用いて、データに対し「最良適合度」をもたらす防御モデルを作成した。その結果得られた最良のモデルを図２Ｃに示す。このモデルは、ＡＭＤから防御する以下の可能性のある４つの個別の遺伝子型または遺伝子型の組み合わせ、すなわち、モデルが「真」となる組み合わせを説明している。これらの遺伝子型は、（１）ｒｓ１０４８７０９（Ｒ１５０Ｒ）がＧ／Ｇ、およびｒｓ１０６１１７０がＣ／Ｃ；または（２）ｒｓ５４７１５４がＧ／Ａ；または（３）ｒｓ４１５１６６７がＴ／Ａ；または（４）ＣＦＨイントロン１変異体がｄｅｌＴＴ。モデルの成績を、アイオワコホート、コロンビアコホート、および混合コホートについて図２Ｄに示す。これらの分布によってｐ値がそれぞれＰ＝７．４９×１０−５、Ｐ＝２．９７×１０−２２、およびＰ＝１．６９×１０−２３であることが証明された。
【図３】初期段階のＡＭＤに罹った７２歳の高齢者ドナーの固定されていない眼（ｕｎｆｉｘｅｄ ｅｙｅ）から得られた切片における、網膜色素上皮（ＲＰＥ）−脈絡膜（ＣＨ）複合体に沿ったＢＦ（図３Ａ）、Ｂａ（全長Ｂ因子の断片）（図３Ｂ）、およびＣ３（図３Ｃ）の免疫局在性を示している。抗ＢＦ抗体（Ｑｕｉｄｅｌ；反応産物は赤色）は、特にそれらの周縁に沿ってドルーゼン（Ｄ）を、また、ブルッフ膜および脈絡膜実質（ｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｓｔｒｏｍａ）を標識する。抗Ｂａ抗体（Ｑｕｉｄｅｌ；反応産物は紫色）は、ブルッフ膜およびＲＰＥ結合パッチ（ＲＰＥ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐａｔｃｈｅｓ）を標識する。ＢＦの分布は、Ｃ３の分布と同様であることに注意されたい。ＲＰＥの細胞質および脈絡膜における茶色の着色はメラニンによるものである。ブルッフ膜（ＢＭ）；網膜（Ｒ）。
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２００６年２月１３日に出願された、米国仮特許出願第６０／７７２，９８９号の利益を主張する。米国仮特許出願第６０／７７２，９８９号は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
分野
本出願は、加齢性黄斑変性症に対する各人の遺伝的感受性を予測する方法に関する。
【０００３】
政府支援に対する謝辞
本発明は、米国国立衛生研究所からの認可番号ＥＹ１３４３５（ＲＡ）およびＥＹ１１５１５（ＧＳＨ）による米国政府の支援により、また、米国国立衛生研究所国立癌研究所の契約番号ＮＯ１−ＣＯ−１２４０００による連邦政府補助金の援助を受けて、一部、米国政府機関によって為されたものである。米国連邦政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）は、黄斑、すなわち詳細な視覚像をもたらす、網膜の中心にある光受容体に富む領域に影響を与える変性性の眼疾患である。ＡＭＤは、通常、周辺視力を損なうことなく中心視力を突然悪化させる。ＡＭＤは、先進国における回復不可能な失明の最も一般的な形態である。この疾患は、一般的には、片方の眼の中心視力の低下を示し、その後数ヶ月から数年以内にもう一方の眼も同じように中心視力を失う。本疾患の臨床的兆候には、黄斑に沈着物（ドルーゼン）が現れることが含まれる。
【０００５】
主要な健康保険負担であるにもかかわらず、ＡＭＤの病因および発病機序は未だによく分かっていない。数多くの研究によって、ＡＭＤの病理生物学に炎症が関係するとされてきた（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、（２００２）Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１３４：４１１−３１；Ｈａｇｅｍａｎら、（２００１）Ｐｒｏｇ．Ｒｅｔｉｎ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．２０：７０５−３２；Ｍｕｌｌｉｎｓら、（２０００）Ｆａｓｅｂ Ｊ．１４：８３５−４６；Ｊｏｈｎｓｏｎら、（２００１）Ｅｘｐ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．７３：８８７−９６；Ｃｒａｂｂら、（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１４６８２−７；Ｂｏｋ，Ｄ．（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０２：７０５３−４）。補体経路の機能不全によって、黄斑部の細胞に重大なバイスタンダー損傷を引き起こし、その結果、他の補体介在性疾患過程で生じる損傷に類似した萎縮、変性、および脈絡膜新生血管膜の生成をもたらす可能性がある（Ｈａｇｅｍａｎら、（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０２：７２２７−３２；ＭｏｒｇａｎとＷａｌｐｏｒｔ（１９９１）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １２：３０１−６；Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ（１９９１）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １２：２９１−５；ＨｏｌｅｒｓとＴｈｕｒｍａｎ（２００４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：１４７−５２）。この疾患には、遺伝が強く関与している可能性がある。例えば、ＦＢＬＮ６、ＡＢＣＡ４、およびＡＰＯＥの各遺伝子の変異体がリスク因子に関係すると言われている。最近、第二補体経路の主要なインヒビターをコードしている補体Ｈ因子遺伝子（ＣＦＨ）の変異体が、ＡＭＤを発症するリスクの増加に関連していることが発見された（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。
【非特許文献１】Ｈａｉｎｅｓら、（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０８：４１９−２１
【非特許文献２】Ｋｌｅｉｎら、（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０８：３８５−９
【非特許文献３】Ｅｄｗａｒｄｓら、（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０８：４２１−４
【非特許文献４】Ｈａｇｅｍａｎら、（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０２：７２２７−３２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
この疾患の有病率と、利用できる治療法が限られているために、ＡＭＤを発症するリスクのある対象者を同定する方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
要旨
加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を防御する多型および遺伝子型が同定されている。ＡＭＤを発症するリスクが増大している対象を同定するための方法が提供されている。これらの方法は、対象のＢ因子（ＢＦ）および／または補体成分２（Ｃ２）の遺伝子を解析すること、ならびにその対象が、少なくとも１つの防御型多型をもつか否かを判定することを含むが、それらに限定されない。このような防御型多型の例には、（ａ）ＢＦ内のＲ３２Ｑ（ｒｓ６４１１５３）；（ｂ）ＢＦ内のＬ９Ｈ（ｒｓ４１５１６６７）；（ｃ）Ｃ２内のＩＶＳ１０（ｒｓ５４７１５４）；および（ｄ）Ｃ２内のＥ３１８Ｄ（ｒｓ９３３２７３９）などがある。あるいは、この方法は、対象の体内でタンパク質の変異体を検出することによって実施することができる。対象に、少なくとも１つの防御型多型がない場合には、その対象は、ＡＭＤを発症するリスクを増大させている。この態様の一つの実施形態では、さらに対象のＣＦＨ遺伝子の解析が行われる。いくつかの実施形態では、ＣＦＨ遺伝子座における対象の遺伝子型を解析して、その対象が少なくとも１つの防御遺伝子型を持っているか否かを判定することができる。一つの実施形態において、ＢＦ遺伝子座またはＣ２遺伝子座のどちらかとＣＦＨ遺伝子座における対象の遺伝子型を解析して、その対象が少なくとも１つの防御遺伝子型を持っているか否かを判定することができる。本明細書で後述するように、場合によっては、その多型性について対象がホモ接合であるかヘテロ接合であるかを知ることが参考になるであろう。
【０００８】
防御遺伝子型の例は、（ａ）ＢＦ内のＲ３２Ｑ（ｒｓ６４１１５３）多型についてヘテロ接合；（ｂ）ＢＦ内のＬ９Ｈ（ｒｓ４１５１６６７）多型についてヘテロ接合；（ｃ）Ｃ２内のＩＶＳ１０（ｒｓ５４７１５４）多型についてヘテロ接合；（ｄ）Ｃ２内のＥ３１８Ｄ（ｒｓ９３３２７３９）多型についてヘテロ接合；（ｅ）ＣＦＨのｄｅｌＴＴ多型についてホモ接合；（ｆ）ＢＦ内のＲ１５０Ｒ（ｒｓ１０４８７０９）多型についてホモ接合；および（ｇ）ＣＦＨ内のＹ４０２についてホモ接合などである。対象に、少なくとも１つの防御遺伝子型がない場合には、その対象は、ＡＭＤを発症するリスクを増大させている。
【０００９】
本発明は、ヒト対象における黄斑変性症またはその他の補体介在性疾患を発症するリスク、またはそれが進行している可能性を評価する方法を提供する。この方法の背景には、一定の遺伝的特徴を、補体関連疾患、今回の場合は加齢性黄斑変性症のリスク表現型または防御表現型に関連づける遺伝的関連研究によって為された発見である。本発明の方法は、ヒト対象から生体試料を得る工程、および、この試料を、当技術分野において既知の有効な技術によって解析して、その対象が以下の１つ以上を有するか否かを判定する工程を含む：
ＢＦ遺伝子のｒｓ６４１１５３においてＡまたはＧ：これは、ヒトＢＦタンパク質の３２位においてＲまたはＱに翻訳する；
ＢＦ遺伝子のｒｓ４１５１６６７においてＡまたはＴ：これは、ヒトＢＦタンパク質の９位においてＬまたはＨに翻訳する；
Ｃ２遺伝子のｒｓ５４７１５４においてＧまたはＴ：これはイントロン１０である；
Ｃ２遺伝子のｒｓ９３３２３７９においてＣまたはＧ：これは、ヒトＣ２タンパク質の３１８位においてＥまたはＤに翻訳する；
ＢＦ遺伝子のｒｓ１０４８７０９においてＡまたはＧ：これは、１５０位においてＲに翻訳する；
ＣＦＨ遺伝子におけるｄｅｌＴＴ；および
ＣＦＨ遺伝子のｒｓ１０６１１７０においてＣまたはＴ：これは、ヒトＣＦＨタンパク質の４０２位においてＹまたはＨに翻訳する。
【００１０】
一定の実施形態においては、試料を解析して、対象が以下の１つ以上を有するか否かを判定する：
ＢＦ遺伝子のｒｓ６４１１５３においてＡまたはＧ：これは、ヒトＢＦタンパク質の３２位においてＲまたはＱに翻訳する；
ＢＦ遺伝子のｒｓ４１５１６６７においてＡまたはＴ：これは、ヒトＢＦタンパク質の９位においてＬまたはＨに翻訳する；
Ｃ２遺伝子のｒｓ５４７１５４においてＧまたはＴ：これはイントロン１０である；および
Ｃ２遺伝子のｒｓ９３３２３７９においてＣまたはＧ：これは、ヒトＣ２タンパク質の３１８位においてＥまたはＤに翻訳する。
【００１１】
いくつかの実施形態において、試料は、血液もしくは血液成分、または尿など、利用しやすい体液である。評価をＤＮＡまたはｍＲＮＡのレベルで行う場合には、対象の細胞から遺伝子型を検出できるようにするために細胞材料が必要となる。
【００１２】
いくつかの実施形態において、対象は、ＡＭＤ、初期ＡＭＤ、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、または地図状萎縮（ＧＡ）などの症状と診断されていてもよい。一つの実施形態では、対象は、疾患の症状、例えば、ドルーゼンの発生など、初期の黄斑変性症の症状を示している。対象の中には、ドルーゼンの発生を示す者がいてもよい。対象は、黄斑変性症またはその他の補体関連疾患について無症状であってもよいが、その場合には、この解析は、集団全般について、またはリスクが高くなると考えられている何らかの部分集団、例えば、補体関連疾患の家族歴をもつ個人などについて行うことができるスクリーニング法を本質的には提供する。さらに別の対象は、ＡＭＤになるリスクが高いかもしれない。一つの実施形態では、対象はＹ４０２Ｈ ＳＮＰを有する。
【００１３】
したがって、別の態様において、本発明は、ヒト対象における黄斑変性症またはその他の補体介在性疾患を発症するリスク、またはそれが進行している可能性を評価するためのキットを提供する。本キットは、対象から採取した試料において、１つ以上、好ましくは２つ以上の上記多型または対立遺伝子変異体を検出するための一群の試薬を含む。本キットは、当技術分野において既知の方法をいくつか用いて変異体を検出するよう設計されたオリゴヌクレオチド、一般的には、標識されたオリゴヌクレオチドを含むことも可能である。本キットは、例えば、標的が多型である場合には、標的ポリヌクレオチドの配列を増幅するためのＰＣＲプライマー、または、例えば、モノクローナル抗体など、関連する遺伝子／プロテオミクス情報を試料から得るための基礎として標的タンパク質の対立遺伝子変異体を認識して、それに特異的に結合する特異的結合タンパク質を含むことができる。好適な実施形態では、本キットは、固体支持体に固定されたオリゴヌクレオチドを含む。
【００１４】
フォーマットに応じて、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を発症するリスクが高い対象を同定するためのキットの構成成分は、対象における少なくとも１つの防御型多型を検出するために１つ以上の試薬を含む。そのような試薬は、以下の少なくとも１つの防御型多型の検出を可能にする：（ａ）ＢＦ内のＲ３２Ｑ（ｒｓ６４１１５３）；（ｂ）ＢＦ内のＬ９Ｈ（ｒｓ４１５１６６７）；（ｃ）Ｃ２内のＩＶＳ１０（ｒｓ５４７１５４）；および（ｄ）Ｃ２内のＥ３１８Ｄ（ｒｓ９３３２７３９）。このようなキットにおける試薬は、防御型多型を検出する１つ以上のオリゴヌクレオチドを含むことが可能である。その他のキット構成成分は、標的配列が防御型多型の１つ以上を包含する場合には、その標的配列を増幅するための１つ以上の試薬を含むことも可能である。本キットのいくつかのバージョンでは、１つ以上のオリゴヌクレオチドが固体支持体に固定されている。
【００１５】
関連する態様において、本発明は、ＡＭＤを発症するリスクが高い対象を同定するためのマイクロアレイを提供する。さらなる態様において、本発明は、防御型多型を有する１つ以上の核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブを含むマイクロアレイを提供する。このような防御型多型の例には、（ａ）ＢＦ内のＲ３２Ｑ（ｒｓ６４１１５３）；（ｂ）ＢＦ内のＬ９Ｈ（ｒｓ４１５１６６７）；（ｃ）Ｃ２内のＩＶＳ１０（ｒｓ５４７１５４）；および（ｄ）Ｃ２内のＥ３１８Ｄ（ｒｓ９３３２７３９）などがある。このようなマイクロアレイは、さらに、例えば、以下の多型性を有する別の１つ以上の核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブを含むことができる：（ａ）ＣＦＨ内のｄｅｌＴＴ多型；（ｂ）ＢＦ内のＲ１５０Ｒ多型；および（ｃ）ＣＦＨ内のＹ４０２Ｈ多型。
【００１６】
上記した本開示の特徴および利点、ならびにその他の特徴および利点は、以下のいくつかの実施形態の詳細な説明からより明らかになるであろう。
【００１７】
配列
添付した配列表に列挙された核酸配列およびアミノ酸配列は、米国特許施行規則第１．８２２条に規定されているように、ヌクレオチド塩基については標準的な省略文字で、また、アミノ酸については３文字コードを用いて示されている。各核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、表示されている鎖に言及することによって、その相補鎖も含まれると解される。本明細書において参照されている配列データベースのアクセッション番号はすべて、指定された日付に利用することができたものであるから、そのアクセッション番号によって識別されているバージョンの配列を意味するものと理解される。
【００１８】
配列番号１は、２００６年１月３０日（２００６年１月５日修正）にＮＣＢＩを介して利用可能であったｒｅｆＳＮＰ ＩＤ：ｒｓ６４１１５３のＳＮＰに基づいている。このＳＮＰは、ＢＦ遺伝子の２２位のヌクレオチドがＡまたはＧで、Ｒ３２Ｑ変異体（３２位のアミノ酸がアルギニンではなくグルタミン）を生じさせる。Ｒ３２Ｑをもたらす配列は、ＣＣＡＣＴＣＣＡＴＧＧＴＣＴＴＴＧＧＣＣＣＲＧＣＣＣＣＡＧＧＧＡＴＣＣＴＧＣＴＣＴＣＴであるが、ただし、Ｒ＝ＡまたはＧである（配列番号１）。
【００１９】
配列番号２は、２００６年１月３０日（２００６年１月５日修正）にＮＣＢＩを介して利用可能であったｒｅｆＳＮＰ ＩＤ：ｒｓ４１５１６６７のＳＮＰを示している。このＳＮＰは、ＢＦ遺伝子の２６位のヌクレオチドがＡまたはＴで、Ｌ９Ｈ変異体（９位のアミノ酸がロイシンではなくヒスチジン）を生じさせる。ｒｓ４１５１６６７をもたらす配列は、ＡＴＧＧＧＧＡＧＣＡＡＴＣＴＣＡＧＣＣＣＣＣＡＡＣＲＣＴＧＣＣＴＧＡＴＧＣＣＣＴＴＴＡＴＣＴＴＧＧＧＣであるが、ただし、Ｒ＝ＡまたはＴである（配列番号２）。
【００２０】
配列番号３は、２００６年１月３０日（２００６年１月５日修正）にＮＣＢＩを介して利用可能であったｒｅｆＳＮＰ ＩＤ：ｒｓ５４７１５４のＳＮＰに基づいている。このＳＮＰは、Ｃ２遺伝子のイントロン１０の２３位のヌクレオチドがＧまたはＴになっている。ｒｓ５４７１５４をもたらす配列は、ＧＡＧＧＡＧＣＣＣＧＣＣＡＧＡＧＧＣＣＣＧＴＲＴＴＧＧＧＡＡＣＣＴＧＧＡＣＡＣＡＧＴＧＣＣＣであるが、ただし、ＲはＧまたはＴである（配列番号３）。
【００２１】
配列番号４は、２００６年１月３０日（２００６年１月５日修正）にＮＣＢＩを介して利用可能であったｒｅｆＳＮＰ ＩＤ：ｒｓ９３３２７３９のＳＮＰを示している。このＳＮＰは、Ｃ２遺伝子の２６位のヌクレオチドがＣまたはＧで、Ｅ３１８Ｄ変異体（３１８位のアミノ酸がグルタミン酸ではなくアスパラギン酸）を生じさせる。ｒｓ９３３２７３９をもたらす配列は、ＡＣＧＡＣＡＡＣＴＣＣＣＧＧＧＡＴＡＴＧＡＣＴＧＡＲＧＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＡＡＡＴＧＣＣＡであるが、ただし、ＲはＣまたはＧである（配列番号４）。
【００２２】
配列番号５は、２００６年１月３０日（２００６年１月５日修正）にＮＣＢＩを介して利用可能であったｒｅｆＳＮＰ ＩＤ：ｒｓ１０４８７０９のＳＮＰを示している。このＳＮＰは、ＢＦ遺伝子の２６位のヌクレオチドがＡまたはＧになっている。このＳＮＰは、１５０位のアミノ酸変異を生じさせない（Ｒ１５０Ｒ）。ｒｓ１０４８７０９をもたらす配列は、ＡＴＣＧＣＡＣＣＴＧＣＣＡＡＧＴＧＡＡＴＧＧＣＣＧＲＴＧＧＡＧＴＧＧＧＣＡＧＡＣＡＧＣＧＡＴＣＴＧＴＧであるが、ただし、ＲはＡまたはＧである（配列番号５）。
【００２３】
配列番号６および７は、ｄｅｌＴＴ多型配列を示している。ｄｅｌＴＴ多型は、２ｂｐの挿入／欠失多型である。この配列は以下の通りである。ＣＣＴＴＧＣＴＡＴＴＡＣＡＴＡＣＴＡＡＴＴＣＡＴＡＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＡＧＡＡＡＧＧＣＣＣＴＧＴＧＧＡＣＡ（配列番号６）およびＣＣＴＴＧＣＴＡＴＴＡＣＡＴＡＣＴＡＡＴＴＣＡＴＡＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＡＧＡＡＡＧＧＣＣＣＴＧＴＧＧＡＣＡ（配列番号７）。
【００２４】
配列番号８は、２００６年１月３０日（２００６年１月５日修正）にＮＣＢＩを介して利用可能であったｒｅｆＳＮＰ ＩＤ：ｒｓ１０６１１７０のＳＮＰを示している。このＳＮＰは、エキソン９の１２７７位のヌクレオチドがＣまたはＴで（以下の配列で２６位のヌクレオチド）、ＣＦＨ遺伝子のＹ４０２Ｈ変異体（４０２位のアミノ酸がチロシンではなくヒスチジン）を生じさせる。ｒｓ１０６１１７０をもたらす配列は、ＴＴＴＧＧＡＡＡＡＴＧＧＡＴＡＴＡＡＴＣＡＡＡＡＴＲＡＴＧＧＡＡＧＡＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＧＧＧＴＡＡであるが、ただし、ＲはＣまたはＴである（配列番号８）。
【００２５】
配列番号９は、９Ｈおよび３２Ｒである、ＢＦの全アミノ酸配列を示している：
【００２６】
【化１】
【００２７】
【化２】
【００２８】
【化３】
配列番号１３は、３２Ｑである、ＢＦの９個のアミノ酸配列を示している：ｗｓｌａｑｐｑｇｓ（配列番号１３）。
【００２９】
配列番号１４は、９Ｈである、ＢＦの９個のアミノ酸配列を示している：ｌｓｐｑｈｃｌｍｐ（配列番号１４）。
【００３０】
配列番号１５は、３１８Ｄである、Ｃ２の７個のアミノ酸配列を示している：ｄｍｔｄｖｉｓ（配列番号１５）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
発明の詳細な説明
本明細書では、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）に対して防御作用があることが見出された配列多型が提供される。これらの多型は、Ｂ因子（ＢＦ）遺伝子および補体成分２（Ｃ２）遺伝子内に見出されるものを含む。防御多型は、ＣＦＨ遺伝子内にあるｄｅｌＴＴ多型も含む。これらの多型を有する対象を、最近発見されたリスクハプロタイプ（補体Ｈ因子（ＣＦＨ）遺伝子内のＹ４０２Ｈ）を有する対象とともに同定することは、ＡＭＤの遺伝的リスクに直面している対象を診断するのに役立つであろう。
【００３２】
用語
以下の用語および方法について説明は、本開示をよりよく説明するため、また、本開示を実施する際に当業者の指針となるよう提供するものである。単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈によって明確に別様であることが示されない限り、１つまたは２つ以上を意味する。例えば、「１つの核酸を含む」という用語は、単数または複数の核酸を含み、「少なくとも１つの核酸を含む」という語句と同一であるとみなされる。「ｏｒ」という用語は、文脈によって明確に別様であることが示されない限り、明示された選択的要素のうちの単一の要素、または２つ以上の要素の組み合わせを意味する。本明細書において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」ことを意味する。したがって、「ＡまたはＢを含む」は、更なる要素を排除することなく、「Ａ、Ｂ、またはＡおよびＢを包含する」ことを意味する。例えば、「変異または多型」または「１つ以上の変異または多型」という語句は、１つの変異、１つの多型、またはこれらの組み合わせを意味するが、ただし、「１つ」は１つ以上を意味することもできる。
【００３３】
本明細書に記載されている方法および材料に類似または同等の方法および材料を、本開示を実施または試験する際に用いることができるが、適当な方法および材料を下記に記載する。これらの材料、方法、および例は例示的なものにすぎず、限定的なものではない。
【００３４】
別段の記載がない限り、技術用語は従来の用法に従って用いられる。分子生物学の一般的な用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｖ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓより発行，１９９４（ＩＳＢＮ ０−１９−８５４２８７−９）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．より発行，１９９４（ＩＳＢＮ ０−６３２−０２１８２−９）；およびＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．より発行，１９９５（ＩＳＢＮ １−５６０８１−５６９−８）に見出すことができる。
【００３５】
加齢性黄斑変性症：黄斑における光感知細胞が機能不全に陥り、やがて機能を停止する病状。黄斑変性症において、最終形態もしくは疾患は、視野の中央にある読み取り部の視覚の喪失または低下をもたらす。視野の外側の周辺部は損なわれない。ＡＭＤは、さらに、「乾燥」型すなわち非滲出型、および「湿潤」型すなわち滲出型に分けられる。８５から９０パーセントの症例が、ドルーゼンとして知られている脂肪組織が網膜の裏側にゆっくりと蓄積する「乾燥」型黄斑変性症に分類される。乾燥型黄斑変性症の古典的な病変は地図状の萎縮である。１０から１５パーセントの症例が、網膜下での異常な血管増殖を伴う。これらの症例は、眼球内に網膜の裏側から血液およびその他の液体が漏出するため、「湿潤」型黄斑変性症と呼ばれる。湿潤型黄斑変性症は、大抵、乾燥型として始まる。治療しないままでおくと、これは、通常、黄斑の構造および機能を完全に破壊する。脈絡膜新生血管は、網膜の網膜色素上皮（ＲＰＦ）層直下で異常血管が成長したものである。
【００３６】
湿潤型黄斑変性症には、薬物療法、光線力学療法、レーザー光凝固療法、およびレーザー療法を使用することができる。ＡＭＤの危険因子には、加齢、喫煙、家族歴、日光とりわけ青色光への曝露、高血圧、高コレステロールおよび肥満などの心血管系危険因子、高脂肪摂取、酸化的ストレス、ならびに人種などがある。
【００３７】
ＡＭＤは、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）、および大動脈瘤を発症する素因も含む、第二補体カスケードの調節異常を特徴とする疾患の例である。ＡＭＤ発症リスクの増加を検出するための、本明細書記載の方法は、第二補体カスケードの調節異常を特徴とするその他の疾患（例えば、ＭＰＧＮ）に対するリスクの増大を検出するために用いることもできる。
【００３８】
対立遺伝子：染色体上で所定の遺伝子座（位置）を占めている同じ遺伝子のいくつかある実行可能なＤＮＡ暗号の任意の１つ（時には、この用語は非遺伝子配列を意味することもある）。その遺伝子に関する個体の遺伝子型は、それが偶然持っている対立遺伝子のセットとなるはずである。その染色体各々のコピーを２つずつ持つ生物（２倍体生物）において、２つの対立遺伝子が個体の遺伝子型を構成する。２倍体生物において、遺伝子の２つのコピーが同一であれば、すなわち、同じ対立遺伝子を持つ場合は、その遺伝子についてホモ接合であるという。その遺伝子で２つの相異なる対立遺伝子を持つ２倍体生物をヘテロ接合であるという。
【００３９】
本明細書において、「対立遺伝子検出」する過程を、「対立遺伝子または多型を遺伝子型判定、決定、または同定する」、あるいは同じような言い回しで表すことができる。実際に検出された対立遺伝子は、対象のゲノムＤＮＡ内で明らかになるが、この領域から転写または翻訳されたＲＮＡ配列またはタンパク質配列からも検出することができるかもしれない。
【００４０】
増幅：試料中の核酸分子のコピー数を増やす技術を用いること。インビトロ増幅法の例は、試料中の核酸分子にオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせることができる条件下で、対象から得られた生体試料を一対のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させるポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）である。これらのプライマーを、適当な条件下で伸長させ、鋳型から分離し、そして、リアニール、伸長、および分離させて核酸分子のコピー数を増幅する。増幅した産物は、電気泳動、制限酵素切断パターン、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションまたはライゲーション、および／または核酸シーケンシングなどの技術によって特徴付けることができる。
【００４１】
増幅法のその他の例には、米国特許第５，７４４，３１１号に開示されている鎖置換増幅法；米国特許第６，０３３，８８１号に開示されている無転写等温増幅法；ＰＣＴ公開公報第ＷＯ９０／０１０６９に開示されている修復連鎖反応増幅法；ＥＰ−Ａ−３２０，３０８に開示されているリガーゼ連鎖反応増幅法；米国特許第５，４２７，９３０号に開示されているギャップ充填リガーゼ連鎖反応増幅法；および米国特許第６，０２５，１３４号に開示されている商標ＮＡＳＢＡ無ＲＮＡ転写増幅法などがある。増幅法は、例えば、追加的工程によるか、増幅法を別のプロトコルと結合させることによって改変することができる。
【００４２】
アレイ：分子、具体的には（ポリペプチドもしくは核酸などの）生体高分子、または細胞もしくは組織の試料を、基質上のアドレス可能な位置または基質中に並べたもの。「マイクロアレイ」は、小型化して、評価または解析するために顕微鏡検査を必要とするか、またはそれによって補助されるアレイである。これらのアレイはＤＮＡチップ、または一般的には、バイオチップと呼ばれることがあるが、より正式にはマイクロアレイと呼ばれ、個体の遺伝子パターンを検査する工程は、マイクロアレイプロファイリングと呼ばれることもある。ＤＮＡアレイの製造化学法および構造は多様であり、一般的には、それぞれが異なったヒト遺伝子に由来するＤＮＡを保持する、４００，０００の異なったフィーチャーからなるが、場合によっては、７８０，０００個もの個別のフィーチャーをパターン化するために固体化学を用いることもある。
【００４３】
分子のアレイ（「フィーチャー」）によって、ある試料について同時に非常に多数の解析を行うことが可能になる。一定のアレイの例では、例えば、内部標準を提供するために、１つ以上の分子（オリゴヌクレオチドプローブなど）が複数回（２回など）アレイ上に存在するであろう。アレイ上のアドレス可能な位置の数は、例えば、数個（３個など）から少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも２５０個、少なくとも３００個、少なくとも５００個、少なくとも６００個、少なくとも１０００個、少なくとも１０，０００個、またはそれ以上まで変えることができる。具体的な例において、アレイは、例えば、長さが少なくとも１５ヌクレオチドあるオリゴヌクレオチド配列、例えば、長さ約１５〜４０ヌクレオチド、例えば、長さが少なくとも１８ヌクレオチド、長さが少なくとも２１ヌクレオチド、あるいはさらに長さが少なくとも２５ヌクレオチドの核酸分子を含む。一例において、この分子はその５’末端または３’末端を介してアレイに付着したオリゴヌクレオチドを含む。
【００４４】
アレイ内部で、アレイに配置された試料はそれぞれ、アレイの少なくとも２次元以内で確実かつ一貫して決定することができるという点でアドレス可能である。アレイ上のフィーチャー適用部位は、さまざまな形をとることができる。例えば、アレイは規則的（均一な行および列に配置されている）であっても不規則であってもよい。すなわち、規則的なアレイ内では、各試料の位置は、それが適用された時点でその試料に割り当てられ、それぞれの位置を適当な標的部位またはフィーチャー部位と関連づけるためにキーが提供されるかもしれない。しばしば、規則的アレイは対称なグリッドパターン状に並べられるが、別のパターンで（例えば、放射線状、渦巻線状、または規則的クラスター状に）試料を並べることもできる。アドレス可能なアレイは、通常、コンピューターをプログラムして、アレイ上の特定のアドレスを、その位置にある試料に関する情報（例えば、シグナル強度など、ハイブリダイゼーションまたは結合のデータ）と関連づけることができるという点でコンピューター可読型である。コンピューター可読型フォーマットのいくつかの例では、アレイ内の個々のフィーチャーは、例えば、デカルト格子のパターンに規則的に並べられているため、コンピューターによってアドレス情報を関連づけることができる。
【００４５】
また、プローブ分子がタンパク質であるかタンパク質を含むか、または標的分子がタンパク質であるかタンパク質を含むタンパク質ベースのアレイ、およびタンパク質／ペプチドが結合している核酸を含むアレイまたはその逆のアレイも、本明細書において想定されている。
【００４６】
結合または安定型結合：２つの物質または分子の間における結合、例えば、１つの核酸分子と別の核酸分子（またはそれ自身）とのハイブリダイゼーション、および抗体とペプチドとの会合など。十分な量のオリゴヌクレオチド分子が塩基対を形成したり、その標的核酸分子とハイブリダイズしたりすれば、オリゴヌクレオチド分子は標的核酸分子に結合もしくは安定的に結合して、その結合を検出することが可能になる。当業者に周知の任意の手順によって、例えば、標的オリゴヌクレオチド複合体の物理的または機能的な特性などによって、結合を検出することができる。例えば、結合が、遺伝子の発現、ＤＮＡ複製、転写、翻訳などの生合成過程に観察可能な影響を及ぼしているかを判定することによって結合を機能的に検出することができる。
【００４７】
核酸分子の相補鎖の結合を検出する物理的方法には、ＤＮＡ分解酵素１または化学的フットプリント法、ゲルシフトアッセイ法およびアフィニティー切断アッセイ法、ノーザンブロット法、ドットブロット法、ならびに光吸収検出法などがあるが、これらに限定されない。例えば、一つの方法は、オリゴヌクレオチド（または類似体）および標的核酸を含む溶液の光吸収が、温度を徐々に上げると、２２０ｎｍから３００ｎｍで変化するのを観察することを含む。このオリゴヌクレオチドまたは類似体がその標的に結合した場合には、オリゴヌクレオチド（または類似体）と標的が互いに乖離するか、溶解するにつれて、特徴的な温度で吸収の急増が見られる。別の例において、この方法は、相補鎖の一方または両方の上に存在するシグナル、例えば、検出可能な標識を検出することを含む。
【００４８】
オリゴマーとその標的核酸との結合は、しばしば、オリゴマーの５０％がその標的から溶失する温度（Ｔｍ）で特徴づけられる。（Ｔｍ）が高いほど、より低い（Ｔｍ）の複合体と比較して、より強くまたはより安定的な複合体であることを意味する。
【００４９】
補体成分２（Ｃ２）：補体系の古典的経路の一部。活性化Ｃ１は、Ｃ２をＣ２ａおよびＣ２ｂに切断する。Ｃ２ａはＣ３の活性化をもたらす。Ｃ２の欠損が、全身性狼そうエリテマトーデス、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、または多発性筋炎など、一定の自己免疫疾患と関連していることが報告されている。Ｃ２はＥＣ３．４．２１．４３の一員である。これは、古典的補体経路Ｃ３／Ｃ５転換酵素としても知られている。
【００５０】
補体因子Ｈ：別名β−１Ｈとしても知られている。第二補体経路の機能を調節し、第Ｉ因子（Ｃ３ｂ不活性化因子）の補因子として働く血清糖タンパク質。これは、Ｃ４ｂ２ａなどのＣ３転換酵素の活性を調節する。
【００５１】
相補性および相補率：相補的核酸を有する分子は、鎖が、ワトソン−クリック型、フーグスティーン型、または逆フーグスティーン型の塩基対合を形成することによって、互いに結合（ハイブリダイズ）し合うと、安定した二重鎖または三重鎖を形成する。オリゴヌクレオチド分子が、所要の条件下で標的核酸配列に検出可能な形で結合した状態にあるときに、安定した結合が生じる。
【００５２】
相補性とは、１つの核酸鎖の中の塩基が、別の核酸鎖の塩基と塩基対合する程度のことである。相補性は百分率、すなわち、２本の鎖の間において、または２本の鎖の特定の領域もしくはドメインの内部において塩基対を形成するヌクレオチドの割合で便宜的に表記される。例えば、１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドのうちの１０ヌクレオチドが、ＤＮＡ分子の標的領域と塩基対を形成するならば、そのオリゴヌクレオチドは、標的とされたＤＮＡの領域と６６．６７％の相補性を有するということになる。
【００５３】
本開示において、「十分な相補性」とは、オリゴヌクレオチド分子と標的核酸配列（ＣＦＨ、ＢＦまたはＣ２の配列など）との間に十分な数の塩基対が存在するために検出可能な結合に達することを意味する。形成された塩基対の割合で表示または測定される場合、この目的を達成する相補率は、わずか約５０％の相補性から完全な（１００％の）相補性までの範囲に及びうる。一般的に、十分な相補性とは、少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約７５％の相補性、少なくとも約９０％の相補性、少なくとも約９５％の相補性、少なくとも約９８％の相補性、または更には少なくとも約１００％の相補性である。
【００５４】
当業者が、所望の条件下で使用するのに適したオリゴヌクレオチドを設計できるようにする結合条件を定めることに関係する定性的かつ定量的な条件の完全な処理法が、Ｂｅｌｔｚら（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １００：２６６−２８５；およびＳａｍｂｒｏｏｋら、（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載されている。
【００５５】
ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）：ほとんどの生物の遺伝物質（いくつかのウイルスはリボヌクレオチドであるＲＮＡを含む遺伝子を持っている）を含む長鎖重合体。ＤＮＡ高分子の繰り返し単位は４種類のヌクレオチドであり、それぞれが、リン酸基が付着しているデオキシリボース糖に結合している４種類の塩基（アデニン、グアニン、シトシン、およびチミン）のうちの１つを含む。ＤＮＡ分子内の、コドンと呼ばれるヌクレオチドのトリプレットが、ポリペプチドのアミノ酸をコードしている。コドンという用語は、ＤＮＡ配列が転写されるｍＲＮＡ内の３つのヌクレオチドの対応（および相補）配列にも用いられる。
【００５６】
ドルーゼン：ＲＰＥ基底層とブルッフ膜の内部膠質層との間に蓄積する沈着物（例えば、ｖａｎ ｄｅｒ Ｓｃｈａｆｔら（１９９２）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．９９：２７８−８６；Ｓｐｒａｕｌら（１９９７）Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１１５：２６７−７３；およびＭｕｌｌｉｎｓら、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｏｃｕｌａｒ“ｄｒｕｓｅｎ”ｉｎ ｍｏｎｋｅｙ ａｎｄ ｈｕｍａｎ，Ｉｎ Ｍ．ＬａＶａｉｌ，Ｊ．Ｈｏｌｌｙｆｉｅｌｄ，ａｎｄ Ｒ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ（Ｅｄｓ．），ｉｎ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｒｅｔｉｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ（ｐｐ．１−１０）．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９９７参照）。硬性ドルーゼンは、均質な好酸性物質を含む、小さな独特の沈着物であり、通常、円形または半球形で、傾斜した辺縁をもたない。軟性ドルーゼンはより大型で、通常は均質でなく、一般的には、介在物および球状の輪郭を含む。ドルーゼンには石灰化しているものもあるかもしれない。ブルッフ膜の内部膠質層と網膜色素上皮（ＲＰＥ）との間に層を形成する無定形の物質を描写するために「散在性ドルーゼン」または「基層線状沈着物」という用語を用いる。この物質は、盛り上がっていないこと以外は、組織学的に軟性ドルーゼンと類似して見えることがある。
【００５７】
Ｂ因子（ＢＦ）：第二補体活性化経路内の補体３の活性化因子前駆体。ｂ因子は、ｄ因子によってｃ３転換酵素に変えられる。ＢＦはＥＣ３．４．２１．４７の仲間である。Ｂ因子は、一本鎖ポリペプチドとして血液中を循環する。これは、第二経路が活性化されると、補体因子ｄによって切断されて、非触媒鎖Ｂａおよび触媒サブユニットＢｂになる。活性型サブユニットＢｂは、Ｃ３ｂと結びついて第二経路Ｃ３転換酵素を形成するセリンプロテアーゼである。ＢＦは第二補体経路Ｃ３／Ｃ５転換酵素としても知られている。
【００５８】
遺伝的素因またはリスク：遺伝性疾患、例えば、ＡＭＤなどに対する対象の感受性。ただし、この感受性は、病気を実際に発症させる結果となることもあれば、ならないこともある。
【００５９】
ハプロタイプ：個々の染色体の遺伝子構成。２倍体生物において、ハプロタイプは、各部位に関する対立遺伝子対の一方を含む。ハプロタイプは、１つの遺伝子座だけを意味したり、全ゲノムを意味したりすることがある。また、ハプロタイプは、単一の染色分体上で統計学的に関連していると認められた一組の一塩基多型（ＳＮＰ）も意味することがある。
【００６０】
ハイブリダイゼーション：オリゴヌクレオチドおよびその類似体は、相補的塩基の間で、ワトソン−クリック型、フーグスティーン型、または逆フーグスティーン型の水素結合など、水素結合によってハイブリダイズする。一般的に、核酸は、ピリミジン（シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）、およびチミン（Ｔ））またはプリン（アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ））のいずれかである窒素含有塩基からなる。これらの窒素含有塩基は、ピリミジンとプリンの間に水素結合を形成し、このピリミジンとプリンとの結合を「塩基対合」と呼ぶ。より具体的には、ＡはＴまたはＵと水素結合し、ＧはＣと結合するはずである。「相補」は、２つの別個の核酸配列間、または同一核酸配列の２つの別個の領域間に生じる塩基対合を意味する。
【００６１】
「特異的にハイブリダイズ可能」および「特異的に相補的」とは、オリゴヌクレオチド（またはその類似体）と、ＤＮＡまたはＲＮＡの標的との間に安定的で特異的な結合を生させるのに十分な程度の相補性を表す用語である。オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は、特異的にハイブリダイズ可能な、その標的配列と１００％相補的でなくともよい。オリゴヌクレオチドまたは類似体が、標的であるＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子に結合すると、その標的ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子の正常な機能を妨げ、かつ、そのオリゴヌクレオチドまたは類似体が、特異的な結合が望まれる条件下、例えば、インビボにおけるアッセイまたは系の場合には生理学的条件下で、標的以外の配列に非特異的に結合するのを回避できる程度の相補性があるときには、オリゴヌクレオチドまたは類似体は特異的にハイブリダイズ可能である。このような結合は、特異的ハイブリダイゼーションと呼ばれる。
【００６２】
特定の度合いのストリンジェンシーをもたらすハイブリダイゼーション条件は、選択されたハイブリダイゼーション法の性質、およびハイブリダイズする核酸配列の組成および長さに依存して変化する。一般的には、ハイブリダイゼーション温度およびハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度（特にＮａ＋および／またはＭｇ＋＋の濃度）によって、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが決定されるが、ただし、洗浄回数もストリンジェンシーに影響を及ぼす。特定の度合いのストリンジェンシーを達成するのに必要なハイブリダイゼーション条件に関する計算法が、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９，ｃｈａｐｔｅｒｓ ９ ａｎｄ １１；およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９によって検討されている。
【００６３】
本開示の目的では、「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイズする分子と標的配列との間に２５％よりも低いミスマッチが存在する場合にのみハイブリダイゼーションが起こる条件を含む。「ストリンジェントな条件」は、より正確に定義するために、特定のレベルのストリンジェンシーに分類してもよい。すなわち、本明細書において、「緩やかなストリンジェンシー」条件は、２５％よりも大きな配列ミスマッチのある分子がハイブリダイズしない条件であり、「中程度のストリンジェンシー」条件は、１５％よりも大きな配列ミスマッチのある分子がハイブリダイズしない条件であり、「高ストリンジェンシー」条件は、２０％よりも大きな配列ミスマッチのある分子がハイブリダイズしないものである。「極度な高ストリンジェンシー」条件は、１０％よりも大きな配列ミスマッチのある分子がハイブリダイズしない条件である。
【００６４】
以下は、一連のハイブリダイゼーション条件の例であって、限定的なものではない。
【００６５】
極度な高ストリンジェンシー（９０％の同一性を有する配列を検出する）
ハイブリダイゼーション：５×ＳＳＣ、６５℃にて１６時間
２回洗浄：２×ＳＳＣ、室温（ＲＴ）にて１５分間ずつ
２回洗浄：０．５×ＳＳＣ、６５℃にて２０分間ずつ
高ストリンジェンシー（８０％以上の同一性を有する配列を検出する）
ハイブリダイゼーション：５×〜６×ＳＳＣ、６５℃〜７０℃にて１６〜２０時間
２回洗浄：２×ＳＳＣ、ＲＴにて５〜２０分間ずつ
２回洗浄：１×ＳＳＣ、５５℃〜７０℃にて３０分間ずつ
低ストリンジェンシー（５０％以上の同一性を有する配列を検出する）
ハイブリダイゼーション：６×ＳＳＣ、ＲＴ〜５５℃にて１６〜２０時間
少なくとも２回洗浄：２×〜３×ＳＳＣ、ＲＴ〜５５℃にて２０〜３０分間ずつ
単離された：「単離された」生体成分（核酸分子、タンパク質、またはオルガネラなど）は、その成分が天然に存在する生物の細胞内にある他の生体成分、例えば、他の染色体および染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質、ならびにオルガネラから実質的に分離または精製されている。「単離された」核酸分子およびタンパク質には、標準的な精製法によって精製された核酸分子およびタンパク質が含まれる。また、この用語は、宿主細胞内で組み換え発現によって調製された核酸分子およびタンパク質、および化学的に合成された核酸分子およびタンパク質も含む。
【００６６】
連鎖不平衡（ＬＤ）：必ずしも同じ染色体上にはない２つ以上の遺伝子座における対立遺伝子のランダムでない関連性。ＬＤは、集団内で、対立遺伝子または遺伝子マーカーのいくつかの組み合わせが、それらの頻度に基づいて、対立遺伝子からハプロタイプがランダムに形成されるときに期待されるよりも高いかまたは低い頻度で存在している状態を表している。独立して遺伝する２つの対立遺伝子が存在する期待頻度は、第１の対立遺伝子の頻度に第２の対立遺伝子の頻度を乗じたものである。期待頻度で共存する対立遺伝子は、連鎖平衡しているという。
【００６７】
遺伝子座：染色体上の遺伝子（あるいは、他の重要な配列）の位置。
【００６８】
突然変異：遺伝子または染色体内部のＤＮＡ配列の変化。いくつかの例において、突然変異は、特性または形質（表現型）を変化させるが、必ずしもそうなるわけではない。突然変異の種類には、塩基置換点突然変異（例えば、トランジションまたはトランスバージョン）、欠失、および挿入などがある。ミスセンス変異は、コードされたタンパク質の配列の中に別のアミノ酸を導入する変異であり、ナンセンス変異は、新たな終止コドンを導入する変異である。挿入または欠失の場合、突然変異は、インフレーム（配列全体のフレームを変えない）の場合もあり、フレームシフト変異の場合もあるが、これは、多数のコドンの読み誤りを生じさせる可能性がある（また、別のフレーム内に終止コドンが存在するために、コードされた産物の異常終止をもたらすことがしばしばある）。
【００６９】
この用語は、具体的には、体細胞変異によって生じる変異、例えば、特定の個体において病気細胞のみに見られるが、体質的には見られない変異を含む。このような体細胞的に獲得された変異の例には、癌の発症に関与するさまざまな遺伝子の機能の変化をしばしばもたらす点変異が含まれる。また、この用語は、体質的に存在し、コードされたタンパク質の機能を容易に明らかにできる形で変更し、かつ、罹患した個体の子供に遺伝する可能性があるＤＮＡの変化も含む。この点で、この用語は下記に定義される「多型」と重複するが、一般的には、体質的な変化のサブセットを意味する。
【００７０】
核酸分子：重合体型のヌクレオチドであって、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ならびにこれらの合成型および混合型重合体のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、またはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾型を意味する。本明細書において「核酸分子」は「核酸」および「ポリヌクレオチド」と同義的である。核酸分子は、別段の記載がない限り、通常、長さが少なくとも１０塩基である。この用語は、一本鎖型および二本鎖型のＤＮＡを含む。ポリヌクレオチドは、天然型および／または非天然型のヌクレオチド結合によって結合している天然型および修飾型のヌクレオチドの一方または両方を含むことができる。
【００７１】
ヌクレオチド：ピリミジン、プリンもしくはそれらの合成類似体など、糖に結合した塩基、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）におけるように、アミノ酸に結合した塩基を含む単量体などであるが、これらに限定されない。ヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの中の１個の単量体である。ヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド中の塩基の配列を意味する。
【００７２】
オリゴヌクレオチド：一般に、長さ３００塩基以下からなる核酸分子。この用語は、しばしば、一本鎖デオキシリボヌクレオチドを意味するが、同様に、とりわけ、一本鎖または二本鎖のリボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、および二本鎖ＤＮＡも意味する。「オリゴヌクレオチド」という用語は、オリゴヌクレオシド（すなわち、リン酸を持たないオリゴヌクレオチド）およびその他の有機塩基重合体も含む。いくつかの例において、オリゴヌクレオチドは長さが約１０から約９０塩基、例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０塩基の長さである。その他のオリゴヌクレオチドは、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０塩基、約６５塩基、約７０塩基、約７５塩基、または約８０塩基の長さである。オリゴヌクレオチドは、例えば、プローブまたはプライマーとして用いるためには一本鎖であってもよく、例えば、突然変異遺伝子を構築する際に用いるには二本鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドは、センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれであってもよい。核酸分子に関して上述したように、オリゴヌクレオチドを修飾することができる。オリゴヌクレオチドは、既存の核酸由来源（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）から得ることができるが、合成（例えば、研究室またはインビトロでのオリゴヌクレオチド合成によって作出）することもできる。
【００７３】
多型：遺伝子配列における変異。多型は、個体間、または異なった民族の間、およびに地理的位置間に見られる変異（ＤＮＡ配列の差異）であって、異なった配列をもっていても、機能的に同等の遺伝子産物を産生する変異であってもよい。また、この用語は、機能的に同等でない遺伝子産物を生じうる配列の変異体も意味する。また、多型は、機能が変化しているかもしれない遺伝子産物を生じさせることができる対立遺伝子および／または変異として分類することができる変異も含む。また、多型は、遺伝子産物を生じさせないか、または不活性な遺伝子産物、または異常な割合で、もしくは不適切な組織の中で、もしくは不適切な刺激に応答して活性型遺伝子産物を産生する対立遺伝子および／または変異として分類することができる変異も含む。さらに、この用語は、必要に応じて、対立遺伝子と同義的に用いられる。
【００７４】
多型は、例えば、変異が存在するヌクレオチドの位置で、ヌクレオチドの変異によって生じたアミノ酸配列の変化で、または変異と連関した核酸分子もしくはタンパク質のその他何らかの特徴の変化で言及されることもある。
【００７５】
プローブおよびプライマー：プローブは、標的核酸配列を認識する、同定可能な、単離核酸を含む。プローブは、アドレス可能な位置、検出可能な標識、またはその他のレポーター分子に付着している核酸であって、標的配列とハイブリダイズする核酸を含む。一般的な標識には、放射性同位元素、酵素基質、補因子、リガンド、化学発光性もしくは蛍光性の薬剤、ハプテン、および酵素などがある。標識する方法、およびさまざまな目的に適した標識を選択する際の指針が、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９で論じられている。
【００７６】
プライマーは短い核酸分子、例えば、連続した相補的なヌクレオチドまたは増幅すべき配列にハイブリダイズする、例えば、長さ１０ヌクレオチド以上のＤＮＡオリゴヌクレオチドである。それより長いＤＮＡオリゴヌクレオチドは長さが約１５、２０、２５、３０または５０ヌクレオチド以上あってもよい。プライマーを、核酸ハイブリダイゼーションによって、相補的な標的ＤＮＡ鎖にアニールさせて、プライマーと標的ＤＮＡ鎖との間にハイブリッドを形成させ、その後、ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって標的ＤＮＡ鎖に沿ってプライマーを伸長させることができる。プライマー対は、後述するように、例えば、ＰＣＲ法または当技術分野において既知の核酸増幅法によって、核酸配列の増幅に用いることができる。
【００７７】
核酸のプローブおよびプライマーを調製して用いるための方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９；ＡｕｓｕｂｅｌらＳｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９；およびＩｎｎｉｓらＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０に記載されている。増幅プライマー対は、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ０．５，著作権１９９１，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）など、その目的のためのコンピュータプログラムを用いて、既知の配列から得ることができる。当業者は、特定のプローブまたはプライマーの特異性が、その長さが長くなるのにしたがって増加すると理解していよう。したがって、さらに大きい特異性を得るためには、標的ヌクレオチド配列の少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれ以上の連続したヌクレオチドを含むプローブまたはプライマーを選択することができる。
【００７８】
試料：ヒトまたは非ヒト哺乳類の対象から得られた試料。本明細書において、生体試料は、細胞、組織、および体液、例えば、血液；血液の誘導体および画分（血清または血漿など）；抽出胆汁；生検組織または手術摘出組織であって、例えば、固定されていない、凍結された、ホルマリン固定された、および／またはパラフィン抱埋された組織など；涙；乳；皮膚の切屑；表面洗浄物；尿；痰；脳脊髄液；前立腺液；膿；骨髄吸引液；ＢＡＬ；唾液；子宮頸部拭き取り検体；膣拭き取り検体；および口腔咽頭洗浄物など、対象内での遺伝子解析に有用なすべての試料を含むが、これらに限定されない。
【００７９】
一塩基多型すなわちＳＮＰ：同種の仲間でゲノム内の単一ヌクレオチド；アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）またはグアニン（Ｇ）が異なる場合に生じるＤＮＡ配列変異。本明細書において、「一塩基多型」（またはＳＮＰ）という用語は突然変異および多型を含む。ＳＮＰは、遺伝子のコード配列（ＣＤＳ）の内部、または遺伝子の間（遺伝子間領域）に含まれることがある。ＣＤＳ内部のＳＮＰは、コドンを変え、タンパク質配列内のアミノ酸を変えることもあれば、変えないこともある。前者は異なった対立遺伝子を構成する可能性がある。後者はサイレント変異と呼ばれ、一般的には、（ゆらぎ位置と呼ばれる）コドンの第３位に生じる。
【００８０】
対象：ヒトまたは非ヒト哺乳類（獣医学の対象など）。
ＡＭＤのリスクが増大している対象を同定する方法
加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を発症するリスクが増大している対象を同定するための方法を提供する。これらの方法は、対象のＢ因子（ＢＦ）および／または補体成分２（Ｃ２）の遺伝子を解析すること、および対象が少なくとも１つの防御型多型を持っているかどうかを判定することを含む。ただし、その防御型多型は、ａ）ＢＦ内のＲ３２Ｑ（ｒｓ６４１１５３）；ｂ）ＢＦ内のＬ９Ｈ（ｒｓ４１５１６６７）；ｃ）Ｃ２内のＩＶＳ１０（ｒｓ５４７１５４）；およびｄ）Ｃ２内のＥ３１８Ｄ（ｒｓ９３３２７３９）からなる群から選択される。対象が少なくとも１つの防御型多型を持っていなければ、その対象はＡＭＤを発症するリスクが増大している。この方法は、さらに、対象のＣＦＨ遺伝子、またはその他任意の所望の遺伝子を解析することを含みうる。本明細書に記載されているように、ＣＦＨ遺伝子内のｄｅｌＴＴ多型は、ＡＭＤについて防御的であることが同定されている。
【００８１】
また、この方法は、ＢＦまたはＣ２の遺伝子座のいずれか、およびＣＦＨ遺伝子座における対象の遺伝子型を解析すること、および対象が、ａ）ＢＦ内のＲ３２Ｑ（ｒｓ６４１１５３）多型についてヘテロ接合；ｂ）ＢＦ内のＬ９Ｈ（ｒｓ４１５１６６７）多型についてヘテロ接合；ｃ）Ｃ２内のＩＶＳ１０（ｒｓ５４７１５４）多型についてヘテロ接合；およびｄ）Ｃ２内のＥ３１８Ｄ（ｒｓ９３３２７３９）多型についてヘテロ接合；ｅ）ＣＦＨ内のｄｅｌＴＴ多型についてホモ接合；およびｆ）ＢＦ内のＲ１５０Ｒ（ｒｓ１０４８７０９）多型についてホモ接合かつＣＦＨ内のＹ４０２についてホモ接合からなる群から選択される少なくとも１つの防御的遺伝子型を持っているかを判定することも含む。ただし、対象が少なくとも１つの防御的遺伝子型を持っていなければ、対象のＡＭＤを発症するリスクは増大している。あるいは、この方法は、ＢＦおよびＣ２の遺伝子座、ならびにＣＦＨ遺伝子座における対象の遺伝子型を解析することを含んでもよい。また、本明細書で提供する方法は、対象が、上記に示した多型または遺伝子型の少なくとも１つを持つか否かを判定することによって、ＡＭＤを発症するリスクが低下している対象を同定するのにも有用である。
【００８２】
特定の多型の有無に関する対象の遺伝物質の解析は、対象由来の試料を得ることによって行われる。この試料は、ＤＮＡまたはＲＮＡを単離することができる、対象の身体のいずれの部位からのものであってもよい。試料から単離されたタンパク質に対して解析を行ってもよい。そのような試料の例については、より詳しく後述する。対象は、初期ＡＭＤ、脈絡膜血管新生、または地図状萎縮などのＡＭＤと診断されていてもよい。対象は、ＡＭＤの症状、例えば、ドルーゼン、色素変化、滲出性変化、例えば、出血、硬性白斑、もしくは網膜下／ＲＰＥ下／網膜内液、視力低下、かすみ目、乱視（変視症）、中心暗点、または色覚異常などをもっていてもよい。あるいは、対象は、ＡＭＤと診断されたことはないが、家族歴、年齢、人種、または生活様式の選択肢に基づくと高リスク群に入っているかもしれない。これらの生活様式の選択肢には、喫煙、日光への曝露（特に青色光）、高血圧、心血管系危険因子、例えば、高コレステロールおよび肥満、高脂肪摂取、ならびに酸化ストレスなどがあるが、これらに限定されない。また、ＡＭＤ発症の危険にさらされている対象には、ＣＦＨ遺伝子内のリスク型ハプロタイプＹ４０２Ｈについてヘテロ接合またはホモ接合である者も含まれる。
【００８３】
対象となる特定の多型または遺伝子型の有無を判定するための技術は、当技術分野においてよく知られている。これらの方法の例は後述するが、用いられた具体的な方法に限定しようとするものではない。さらに、本明細書に開示された特定の多型について、対象のＢＦ遺伝子、Ｃ２遺伝子、またはＣＦＨ遺伝子を解析することには、その多型で見られるアミノ酸変異をもたらす突然変異を検出することも含まれるものとする。例えば、ＢＦ内のＬ９Ｈ多型は、第９位のアミノ酸に対するヌクレオチドコドンをＣＴＣからＣＡＣに変えて、ロイシンの代わりにヒスチジンを生成する。この変異は、ＣＡＴヌクレオチドコドンがＣＡＴであることによっても特定することができる。Ｃ２内のＥ３１８Ｄ多型は、第３１８位のアミノ酸に対するヌクレオチドコドンをＧＡＧからＧＡＣに変えて、グルタミン酸の代わりにアスパラギン酸を生成する。この変異は、ヌクレオチドコドンがＧＡＴであることによっても特定することができる。ＢＦ内のＲ１５０Ｒ多型は、第１５０位のアミノ酸に対するヌクレオチドコドンをＣＧＧからＣＧＡに変える。この変異は、コードされているアミノ酸（アルギニン）を変えない。アルギニンは、ＣＧＴまたはＣＧＣによってもコードされうる。さらに、アルギニンは、ＡＧＡまたはＡＧＧによってもコードされうる。ＣＦＨ内のＹ４０２Ｈ多型は、第４０２位のアミノ酸に対するヌクレオチドコドンをＴＡＴからＣＡＴに変えて、チロシンの代わりにヒスチジンを生成する。この変異は、ヌクレオチドコドンがＣＡＣであることによっても特定することができる。これらのヌクレオチドコドンのいずれか、または当業者が同定することができるその他のヌクレオチドコドンも、対象内で検出することができる。
【００８４】
本発明の方法によって、ＡＭＤを発症する対象の少なくとも約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％を同定することができる。
ＡＭＤ予防療法
本開示は、ＡＭＤを発症する遺伝的素因を有すると判定された対象におけるＡＭＤの発生を回避または低下させる方法も提供する。例えば、前述の方法を用いる際に、前述の危険因子のいずれかに基づいてＡＭＤを発症するリスクのある対象において、ＢＦ遺伝子、Ｃ２遺伝子、および／またはＣＦＨ遺伝子に突然変異または防御性多型が同定されない場合、ＡＭＤの発生を回避または低下させるか、ＡＭＤの発症を遅らせたりするためには、生活様式の選択を対象に負わせることができる。例えば、対象は、禁煙したり；より少ない脂肪摂取を含むように食事を変えたり；ビタミンＣおよびＥ、β−カロテン、および亜鉛などの抗酸化物の摂取量を増加させたり；網膜血管新生の発症を遅らせる薬を予防量摂取したりしてもよい。このような個人に対する治療法は、一定の病原体に対するワクチン、または抗生物質、または抗ウイルス薬、または抗真菌薬を含むかもしれない。また、治療法は、抗炎症薬または補体阻害剤も含むかもしれない。いくつかの例において、選択される治療法は、対象の遺伝子プロフィールの解析に基づいて、その対象に特異的で個別に適合するようになっている。
既知の多型の検出法
既知の多型を検出する方法には、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）法、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）、マッピング法、核酸シーケンシング法、ハイブリダイゼーション法、蛍光インシトゥハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法、ＰＦＧＥ解析法、ＲＮＡ分解酵素保護アッセイ法、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）法、ドットブロット解析法、対立遺伝子特異的ＰＣＲ増幅（ＡＲＭＳ）法、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）法、およびＰＣＲ−ＳＳＣＰ法などがあるが、これらに限定されない。最近開発された質量分析法（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）法または飛行時間型ＭＡＬＤＩ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）法など）、および突然変異を検出するためのＤＮＡマイクロチップ技術も有用である。例えば、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２．Ｔｏｍ ＳｔｒａｃｈａｎおよびＡｎｄｒｅｗ編、Ｒｅａｄ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．，１９９９の第６章および１７章参照。
【００８５】
これらの技術は、解析の前に核酸を増幅することを含んでいてもよい。増幅技術は、当業者に周知であり後述する。
【００８６】
多型が、制限酵素の認識部位を作出するか破壊するヌクレオチド変異を生じさせると、その制限酵素を用いてその多型を同定することができる。多型部位全域をＰＣＲ増幅してから、関連する制限酵素でＰＣＲ産物を分解することによって、多型対立遺伝子を区別することができる。ゲル電気泳動法などのサイズ分画法を用いて、さまざまな産物を検出することができる。あるいは、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）法を用いることも可能である。多型が制限部位の違いをもたらさない場合には、増幅によって作られた制限部位ＰＣＲによって対立遺伝子間の違いを検出することができる。この方法では、制限部位の直近に隣接しているが、それを包含していない配列からプライマーを設計する。このプライマーは、両方の多型配列のハイブリダイゼーションおよび増幅を妨げない、重要でない位置に一塩基のミスマッチを有するように慎重に設計される。このヌクレオチドミスマッチが、多型部位の配列と一緒になって、対立遺伝子の一方に存在しない制限部位を作出する。
【００８７】
一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）マッピング法は、配列変化によって、一本鎖の分子内塩基対合に差異が引き起されたために示差的に移動するようになったバンドを検出する。たった１つの塩基が異なる一本鎖ＤＮＡ分子は、しばしば、非変性ゲル中で異なった電気泳動移動度を示す。正常型ＤＮＡと変異型ＤＮＡの移動度の差異は、標識プローブを用いるハイブリダイゼーションよって明らかになる。特に、ＤＮＡ断片のサイズが約５００ｂｐより大きい場合には、この方法によってすべての配列変化が検出できるわけではないが、ほとんどのＤＮＡ配列変異を検出すように最適化することはできる。検出感度が低いことが不都合ではあるが、ＳＳＣＰによって処理量の増加が可能になることから、この方法は、研究ベースでは、変異検出のための直接シーケンシング法に代わる魅力的な方法となっている。そこで、ＳＳＣＰゲル上で移動度を変えた断片をシーケンシングして、ＤＮＡ配列変異の正確な性質を測定する。
【００８８】
手動によるシーケンシングまたは自動蛍光シーケンシングのいずれかによる直接ＤＮＡシーケンシングによって、配列変異を検出することができる。
【００８９】
Ｔａｑポリメラーゼを用いて、特異的な対立遺伝子の検出を行うことができる（Ｈｏｌｌａｎｄら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：７２７６−８０；Ｌｅｅら（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８５：７３−８３）。これは、Ｔａｑポリメラーゼがプルーフリーディングする３’→５’エキソヌクレアーゼ活性をもたないが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性をもつという事実に基づいている。このアッセイ法は、標的配列に特異的である、２つの従来型ＰＣＲプライマー（順方向と逆方向）と、順方向プライマー結合部位の下流にある標的配列上の部位に特異的に結合するように設計されている第３のプライマーを用いることを含む。第３のプライマーは、通常、５’末端においてレポーター色素、また、３’末端において、レポーター色素とは異なる発光波長を有するクエンチャー色素という２種類のフルオロフォアで標識されている。また、第３のプライマーは、単独では新たなＤＮＡ合成を開始することができないように、３’末端のヌクレオチドに保護基も担持している。ＰＣＲ反応の過程で、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、順方向プライマーによって開始される新たなＤＮＡ鎖を合成し、この酵素が第３のプライマーに接近するにしたがって、その５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によって、第３のプライマーをその５’末端から次第に分解していく。その最終結果として、新生ＤＮＡ鎖が第３のプライマー結合部位を越えて伸長し、レポーター色素およびクエンチャー色素はもはや同じ分子に結合できなくなる。レポーター色素がクエンチャー色素の近くに存在しなくなると、レポーターの発光強度の増加がもたらされ、それを検出することができるようになる。
【００９０】
多型は、所望の遺伝子内にある特定の多型とハイブリダイズするように設計された１つ以上のハイブリダイゼーション用プローブを用いて同定することができる。ハイブリダイゼーション検出法に用いられるプローブを、ハイブリダイゼーションが成功したことを検出することができよう、何らかの方法で標識しなければならない。これは、放射標識されたヌクレオチドによってプローブ内のヌクレオチドを置換するニックトランスレーション法などのインビトロ法によるか、または、標識されたコピーを合成するための鋳型として非標識分子が働くランダムプライマー伸長法によって行うことができる。ハイブリダイゼーションを検出するためにプローブを標識する、その他の標準的方法が当業者に知られている。
【００９１】
長さが最大約２ｋｂまでのＤＮＡ断片については、変異体−正常体ヘテロ二本鎖内のミスマッチ塩基のところで化学的に切断することによって一塩基の変化を検出することができる。例えば、目的とする多型を含まないＤＮＡ鎖の片側の端を放射標識し、次に、対象ＤＮＡ鎖の一方の鎖とハイブリダイズさせる。得られたヘテロ二本鎖ＤＮＡをヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムで処理すると、それらは、対合しない一本鎖領域内のＣ、またはＣおよびＴをそれぞれ修飾し、修飾された骨格がピペリジンによって切断されやすくなる。目的とする多型を含まないＤＮＡと比較しながら、短くなった標識断片をゲル電気泳動法およびオートラジオグラフィーによって検出する。
【００９２】
ミスマッチとは、二本の鎖が１００％相補的ではない、ハイブリダイズした核酸二本鎖のことである。全体的な相同性の欠如は、欠失、挿入、逆位、または置換が原因である可能性がある。ミスマッチの検出を利用して、遺伝子内またはそのｍＲＮＡ産物内にある点変異を検出することができる。これらの手法はシーケンシング法よりも感度は低いが、多数の試料に対して実施しやすい。ミスマッチ切断手法の一例はＲＮＡ分解酵素保護法である。この方法は、検出中の多型（通常は、ＡＭＤからの防御とは関連性のない多型）の１つの変異に相補的な標識リボプローブの使用を伴う。このリボプローブと、被検者から単離したｍＲＮＡまたはＤＮＡのどちらかとを共にアニーリング（ハイブリダイズ）してから、二本鎖ＲＮＡ構造内のいくつかのミスマッチを検出することができる酵素であるＲＮＡ分解酵素Ａによって分解させる。ＲＮＡ分解酵素Ａによってミスマッチが検出されると、そのミスマッチ部位で切断される。したがって、アニーリングされたＲＮＡ調製物を電気泳動ゲルマトリックス上で分離すると、もし、ミスマッチがＲＮＡ分解酵素Ａによって検出されて切断されていれば、そのリボプローブに相当する全長二本鎖ＲＮＡ、およびｍＲＮＡまたはＤＮＡよりも短いＲＮＡ産物が見られるはずである。リボプローブは、ｍＲＮＡまたは遺伝子の全長である必要はなく、どちらかの分節であってもよい。あるいは、ミスマッチは、一致した二本鎖と比較して、ミスマッチ二本鎖の電気泳動移動度が変化することによって検出することができる。
【００９３】
ＰＣＲ法を用いて増幅されたＢＦ、Ｃ２またはＣＦＨの各遺伝子のＤＮＡ配列も、対立遺伝子特異的なプローブまたはオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を用いてスクリーニングすることができる。これらのプローブは核酸オリゴマーであって、そのひとつひとつが、既知の変異または多型をもつ遺伝子配列の領域を含んでいる。例えば、あるオリゴマーは、長さが約３０ヌクレオチドであって、ＢＦ遺伝子、Ｃ２遺伝子、またはＣＦＨ遺伝子の配列の一部に相当しているかもしれない。そのような対立遺伝子特異的プローブ一連のものを用いて、ＰＣＲ増幅産物をスクリーニングして、本明細書に記載されている１つ以上の多型の存在を同定することができる。対立遺伝子特異的プローブの、増幅したＢＦ、Ｃ２またはＣＦＨの配列へのハイブリダイゼーションは、例えば、ナイロンフィルター上で行うことができる。また、逆ドットブロット法を用いてもよい。例えば、１つ以上の多型性のスクリーニングは、各多型性対立遺伝子に特異的な一連のＡＳＯであって、標識されたＰＣＲ増幅被検ＤＮＡとハイブリダイズさせることになる単一膜上にスポットされた一連のＡＳＯを用いて行うことができる。これらのアッセイ法は、少数の手動でスポットされたアレイから、多数の多型を検出する可能性を秘めた「遺伝子チップ」上の非常に大きなＡＳＯアレイにまで及ぶ。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で特定のプローブにハイブリダイズすることは、対立遺伝子特異的プローブにある多型と同一の多型が組織中に存在することを示している。このような技術では、金のナノ粒子で標識されて、可視的な着色結果をもたらすプローブを利用することができる（Ｅｌｇｈａｎｉａｎら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：１０７８−８１）。
【００９４】
対立遺伝子特異的ＰＣＲ増幅法は、増幅不応性変異システム（ＡＲＭＳ）と呼ばれる方法に基づいている（Ｎｅｗｔｏｎら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：２５０３−１６）。この方法では、ミスマッチ３’−残基をもつオリゴヌクレオチドが、適当な条件下ではＰＣＲのプライマーとして機能しない。２種類のプライマー、すなわち一つは共通プライマーであり、他方は、２つのわずかに異なった形で存在する、各多型に特異的なプライマーを用いて、ペアードＰＣＲ反応を実施する。これらの対立遺伝子特異的プライマーは、変異体ヌクレオチドの前に位置し、変異体ヌクレオチド自体まで続き、その中で終わる領域にわたって、２つの対立遺伝子の配列と同一であるように設計されている。したがって、特定の多型または突然変異が存在しなければ、増幅産物は認められない。一般的には、別の対照用プライマーを用いて、無関係の配列を増幅する。共通プライマーの位置は、異なった多型について異なった大きさの産物を生成して、多重反応からのＰＣＲ産物がゲル上でラダーを形成するように設計することができる。多型特異的プライマーは、さまざまな蛍光標識またはその他の標識で標識することができ、あるいはさまざまな大きさの５’伸長物を付加してもよい。この方法は、リアルタイムＰＣＲに使用できるよう適合させることができる。
【００９５】
オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）では、２種類のオリゴヌクレオチドが、標的内で隣接配列にハイブリダイズするように設計されている。これらが結合する部位が多型部位である。これら２種類のオリゴヌクレオチドが完全にハイブリダイズしている場合に限り、ＤＮＡリガーゼが、この２つのオリゴヌクレオチドを連結させる（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：８９２３−７）。このアッセイは、ＥＬＩＳＡ解析法または蛍光シーケンチャーなど、さまざまなフォーマットを用いることができる。
【００９６】
マイクロチップ技術を用いる核酸解析技術を用いることもできる。この技術では、シリコンチップ上のアレイ内に、何千もの個別のオリゴヌクレオチドプローブを作成することが可能である。解析の対象となる核酸は蛍光標識されており、チップ上でこれらのプローブとハイブリダイズする。これらの核酸マイクロチップを用いて、核酸−タンパク質の相互作用を調べることも可能である。この技術を用いて、突然変異の存在を判定し、更には、解析中の核酸の配列決定をすることができ、あるいは、対象となる遺伝子の発現レベルを測定することができる。この方法は、同時に、何千であってもよい数多くのプローブを並列処理する方法であり、解析速度を飛躍的に増大させることができる。
【００９７】
当技術分野で知られている任意の技術によって、ＢＦ、Ｃ２、またはＣＦＨのｍＲＮＡ発現の変化を検出することができる。これらには、ノーザンブロット解析法、ＰＣＲ増幅法、およびＲＮＡ分解酵素保護法などがある。ｍＲＮＡ発現の減少は野生型遺伝子が変化したことを示している。特定の対立遺伝子がアミノ酸変異を有するタンパク質を産生する場合には、対立遺伝子検出法は、タンパク質に基づくことができる。例えば、アミノ酸変異に特異的なエピトープは、モノクローナル抗体によって検出することができる。あるいは、ＢＦ、Ｃ２、またはＣＦＨと免疫反応性のあるモノクローナル抗体を用いて、組織をスクリーニングすることができる。同種抗原が存在しなければ、突然変異があることが示されよう。また、変異対立遺伝子の産物に特異的な抗体を用いて、変異遺伝子の産物を検出することもできる。このような免疫アッセイは、当技術分野で知られている都合のよいフォーマットで行うこともできる。これらには、ウエスタンブロット法、免疫組織化学的アッセイ法、およびＥＬＩＳＡアッセイ法などがある。改変タンパク質を検出するための任意の手段を用いて、野生型のＢＦ遺伝子、Ｃ２遺伝子、またはＣＦＨ遺伝子の改変を検出することができる。機能分析法、例えば、タンパク質結合測定法などを用いることができる。さらに、ＢＦ、Ｃ２、またはＣＦＨの生化学的機能を検出するアッセイ法を用いることができる。変異型のＢＦ、Ｃ２、またはＣＦＨの遺伝子産物が見つかれば、野生型のＢＦ、Ｃ２またはＣＦＨの遺伝子が変更されたことが示される。
【００９８】
核酸分子の増幅
対象から得られた核酸試料は、検出前に臨床試料から増幅してもよい。一つの実施形態では、ＤＮＡ配列を増幅する。別の実施形態では、ＲＮＡ配列を増幅する。
【００９９】
任意の核酸増幅法を用いることができる。一つの具体的で非限定な例では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、ＡＭＤに関連する核酸配列を増幅する。その他の方法例には、ＲＴ−ＰＣＲ法および転写介在増幅（ＴＭＡ）法、クローニング法、対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＡＳＡ）法、リガーゼ連鎖反応法、ならびにネスティッドポリメラーゼ連鎖反応法があるが、これらに限定されない。
【０１００】
プライマー対は、増幅反応に利用することができる。一方または両方のプライマーを、例えば、検出可能な放射標識、フルオロフォア、またはビオチン分子で標識することができる。このプライマー対は、上流プライマー（下流プライマーの５’に結合する）および下流プライマー（上流プライマーの３’に結合する）を含むことができる。増幅反応に用いられるプライマー対は、ＡＭＤに関係する核酸を増幅することを可能にする選択プライマーであってもよい。
【０１０１】
別のプライマー対を内部対照として増幅反応の中に含ませることができる。例えば、これらのプライマーは、「ハウスキーピング」核酸分子を増幅するのに用いることができ、適正な増幅が行われたことを確認するのに役立つ。別の例では、プライマーハイブリダイゼーション部位を含む標的核酸分子を構築して、増幅反応器の中に入れることができる。当業者は、内部対照プライマーとして働くプライマー対を容易に同定することができよう。
【０１０２】
増幅産物は、サイズ分析、制限酵素消化後のサイズ分析、反応産物中の特異的標識オリゴヌクレオチドプライマー検出、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ハイブリダイゼーション、シーケンシング、ハイブリダイゼーションなどのさまざまな方法でアッセイすることができる。
【０１０３】
ＰＣＲ法に基づく検出アッセイ法は、複数の多型を同時に多重増幅することを含む。例えば、大きさが重複しないため、同時に解析することができるＰＣＲ産物を作成するためにＰＣＲプライマーを選択することが、当技術分野でよく知られている。あるいは、示差的に標識されているために、それぞれを検出することができるプライマーによって、さまざまな多型を増幅することが可能である。複数の多型性を多重解析できるようにする、その他の技術が当技術分野で知られている。遺伝子の断片を増幅してコピーをつくり、断片のコピーが特定の防御型の多型または遺伝子型を含むか否か判定することができる。
防御タンパク質の免疫検出法
本発明の一つの実施形態において、対象のＣ２遺伝子またはＢＦ遺伝子における多型を特徴づける、例えば、防御タンパク質を検出または同定するために、タンパク質アッセイ法を実施する。変異タンパク質を検出するために適合させることができる方法が当技術分野においてよく知られており、電気泳動法（キャピラリー電気泳動法および二次元電気泳動法を含む）などの分析生化学的方法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、超拡散クロマトグラフィー、質量分析法などのクロマトグラフ法、液体プレシピチン反応またはゲルプレシピチン反応、免疫拡散法（一次元および二次元）、免疫電気泳動法、放射免疫測定（ＲＩＡ）法、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）法、免疫蛍光アッセイ法、ウエスタンブロット法などの免疫学的方法がある。
【０１０４】
例えば、本発明を実施するのに適した、いくつかの確立した免疫学的結合アッセイフォーマットが知られている（例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．；Ｌａｎｅ，Ｄ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；１９８８；およびＡｕｓｕｂｅｌら、（２００４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ参照）。このアッセイ法は、例えば、競合的なものであっても、非競合的なものであってもよい。一般的には、免疫学的結合アッセイ法（すなわち免疫測定法）は、分析物と特異的に結合し、しばしば、それを固定するために「補足剤」を利用する。一つの実施形態において、補足剤は、変異型のＣ２またはＢＦのポリペプチドまたは部分列に特異的に結合する部分である。結合タンパク質は、例えば、検出可能に標識された抗Ｃ２／ＢＦ抗体を用いて検出することができる。一つの実施形態において、抗体の少なくとも１つは、変異体に特異的である（例えば、野生型のＣ２ポリペプチドまたはＢＦポリペプチドには結合しない）。
【０１０５】
このように、一の態様では、この方法は、対象から試料（例えば、血液、血清、血漿、または尿）を得ること、この試料を、防御型および非防御型のＣ２またはＢＦを識別する結合剤に接触させること、そして、結合剤と、もし存在するのであれば非防御型のＣ２またはＢＦとの間で複合体が形成されたことを検出することを含む。抗体パネルを用いて、患者の試料内にある防御タンパク質を検出できることが理解されよう。
【０１０６】
本発明は、防御型のＣ２タンパク質またはＤＦタンパク質には特異的に結合するが、野生型ポリペプチド（すなわち、防御と関係ないＣ２タンパク質またはＢＦタンパク質）には特異的に結合しない抗体も提供する。これらの抗体は、防御型にしか存在しないエピトープに結合する。例えば、ある抗体は、上記したように、野生型のＢＦ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号．ＮＭ＿００１７１０；ＡＡＢ６７９７７によってコードされている）またはＣ２（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号．ＮＭ＿００００６３；ＮＰ＿００００５４によってコードされている）には結合しないが、ＢＦまたはＣ２の変異体（すなわち、ＡＭＤに対して防御的であると本明細書に記載されている多型の１つを有するタンパク質）と結合する。例えば、この抗体は、第３２位にグルタミンを有するか、または第９位にヒスチジンを有するＢＦタンパク質、または第３１８位にアスパラギン酸を有するＣ２を認識することができる。
【０１０７】
この抗体は、ポリクローナルであってもモノクローナルであってもよく、標準的なプロトコルに従って作成される。抗体は、防御タンパク質またはその断片を適当な哺乳類に注射して作成することができる。標準的なプロトコルに従ってモノクローナル抗体をスクリーニングする（ＫｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ １９７５、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５；Ｄｏｗｅｒら、ＷＯ９１／１７２７１、およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＷＯ９２／０１０４７；およびＶａｕｇｈａｎら、１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：３０９；ならびに下記の参考文献）。モノクローナル抗体は、当技術分野において周知の方法を用いて、対応する野生型ポリペプチドではなく、防御型ポリペプチドを用いて、特異的免疫活性についてアッセイすることができる。抗体のスクリーニング法およびサブトラクション法など、方法に関しては、ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら、ｅｄｓ．，１９９９，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ２００５）；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（２ｄ ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８６）；Ｂｕｒｉｏｎｉら、１９９８，”Ａ ｎｅｗ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｒａｒｅ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｆｒｏｍ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ”Ｒｅｓ Ｖｉｒｏｌ．１４９（５）：３２７−３０；Ａｍｅｓら、１９９４，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉ−Ｃ５ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ Ｆａｂ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２（９）：４５７２−８１；Ｓｈｉｎｏｈａｒａら、２００２，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ ｒａｒｅ ａｎｄ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ｗａｌｌｓ ｂｙ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６４（１−２）：１８７−９４参照。免疫またはスクリーニングは、全長防御タンパク質に対するものであってもよいし、あるいは（しばしば、より簡便には）、変異型と野生型で異なることが知られているエピトープを含むペプチドまたはポリペプチド断片に対するものであってもよい。抗体は、２本の軽鎖および２本の重鎖を含む四量体として、別々の重鎖、軽鎖として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖとして、または重鎖および軽鎖の可変ドメインがスペーサーを介して連結している一本鎖抗体として発現させることができる。
【０１０８】
核酸分子の増幅
対象から得られた核酸試料は、検出前に臨床試料から増幅してもよい。一つの実施形態では、ＤＮＡ配列を増幅する。別の実施形態では、ＲＮＡ配列を増幅する。
【０１０９】
任意の核酸増幅法を用いることができる。一つの具体的で非限定な例では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、ＡＭＤに関連する核酸配列を増幅する。その他の方法例には、ＲＴ−ＰＣＲ法および転写介在増幅（ＴＭＡ）法、クローニング法、対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＡＳＡ）法、リガーゼ連鎖反応法、ならびにネスティッドポリメラーゼ連鎖反応法があるが、これらに限定されない。
【０１１０】
プライマー対は、増幅反応に利用することができる。一方または両方のプライマーを、例えば、検出可能な放射標識、フルオロフォア、またはビオチン分子で標識することができる。このプライマー対は、上流プライマー（下流プライマーの５’に結合する）および下流プライマー（上流プライマーの３’に結合する）を含むことができる。増幅反応に用いられるプライマー対は、ＡＭＤに関係する核酸を増幅することを可能にする選択プライマーであってもよい。
【０１１１】
別のプライマー対を内部対照として増幅反応の中に含ませることができる。例えば、これらのプライマーは、「ハウスキーピング」核酸分子を増幅するのに用いることができ、適正な増幅が行われたことを確認するのに役立つ。別の例では、プライマーハイブリダイゼーション部位を含む標的核酸分子を構築して、増幅反応器の中に入れることができる。当業者は、内部対照プライマーとして働くプライマー対を容易に同定することができよう。
【０１１２】
増幅産物は、サイズ分析、制限酵素消化後のサイズ分析、反応産物中の特異的標識オリゴヌクレオチドプライマー検出、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ハイブリダイゼーション、シーケンシング、ハイブリダイゼーションなどのさまざまな方法でアッセイすることができる。
【０１１３】
ＰＣＲ法に基づく検出アッセイ法は、複数の多型を同時に多重増幅することを含む。例えば、大きさが重複しないため、同時に解析することができるＰＣＲ産物を作成するためにＰＣＲプライマーを選択することが、当技術分野でよく知られている。あるいは、示差的に標識されているために、それぞれを検出することができるプライマーによって、さまざまな多型を増幅することが可能である。複数の多型性を多重解析できるようにする、その他の技術が当技術分野で知られている。遺伝子の断片を増幅してコピーをつくり、断片のコピーが特定の防御型の多型または遺伝子型を含むか否か判定することができる。
補体因子Ｈ（ＣＦＨ）
ＣＦＨ遺伝子は、家族ベースの研究では、Ｉｑ染色体上のＡＭＤに反復して結合している領域内に位置している。最近、３つの独立した研究によって、補体因子Ｈ遺伝子内でチロシンをヒスチジンに変える（Ｙ４０２Ｈ）、エキソン９内の１２７７位のヌクレオチドにおけるＴ→Ｃへの置換という多型が、ＡＭＤへの感受性に実質的に関与していることが明らかになった（Ｋｌｅｉｎら（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０８：３８５−３８９；Ｈａｉｎｅｓら（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ．３０８：４ｌ９−４２１；Ｅｄｗａｒｄｓら（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ．３０８：４２１−４２４）。これらの研究では、ＡＭＤのオッズ比が、Ｃ対立遺伝子の保因者について３．３〜４．６、ＣＣホモ接合体については３．３〜７．４であることが報告された。その後、２つの別の研究によって、この連関が確認された（Ｚａｒｅｐａｒｓｉら（２００５）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７７：１４９−１５３；Ｈａｇｅｍａｎら（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０２：７２２７−７２３２）。１つの研究では、７つの別の共通ＳＮＰが、Ｙ４０２Ｈ多型以外にもＡＭＤと関連していることが分かった（Ｈａｇｅｍａｎら（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０２：７２２７−７２３２）。
【０１１４】
対連鎖解析によって、前記７つの多型が連鎖不平衡にあり、これらの多型を一組もつ１つの共通リスク型ハプロタイプが、症例者の５０％対対照者の２９％で検出された［ＯＲ＝２．４６、９５％ＣＩ（１．９５〜３．１１）］。このハプロタイプのホモ接合体は、症例者の２４．２％および対照者の８．３％で見出された。また、２つの共通した防御型ハプロタイプが、対照者の３４％および症例者の１８％で見出された［ＯＲ＝０．４８、９５％ＣＩ（０．３３〜０．６９）］および［ＯＲ＝０．５４、９５％ＣＩ（０．３３〜０．６９）］。
【０１１５】
Ｂ因子および補体成分２
第二経路の活性化は、Ｃ３ｂに結合したＢ因子（ＢＦ）がＤ因子に触媒されて切断されることにより開始され、その結果、Ｃ３Ｂｂ複合体（Ｃ３転換酵素）が形成される。この複合体は、調節タンパク質のプロパージン（ｐｒｏｐｅｒｄｉｎ）によって安定化されるが、一方で、その解離が、ＣＦＨなどの調節タンパク質によって促進される。ＢＦおよびＣ２は、ヒト染色体６ｐ２１上でわずか５００ｂｐしか離れていない位置にあるパラロガス遺伝子である。Ｃ２は古典的補体経路内で機能する。これら２つの遺伝子は、補体成分４Ａ（Ｃ４Ａ）および４Ｂ（Ｃ４Ｂ）をコードする遺伝子とともに、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩＩ領域内にあるＨＬＡ−ＢとＨＬＡ−ＤＲ／ＤＱの間で約１００〜１２０ｋｂを占めている「コンプロタイプ（ｃｏｍｐｌｏｔｙｐｅ）」（補体ハプロタイプ）を含んでいる。
【０１１６】
臨床試料
対象のＡＭＤに罹りやすい遺伝的素因を測定する際に本開示とともに用いるのに適した臨床試料は、血液または血液分画（血清または血漿など）、含嗽液または口腔を掻きとったもの、絨毛膜生検試料、精液、ガスリーカード、眼内液、痰、リンパ液、尿、および組織を含む、従来の臨床試料であるが、これらに限定されない。最も簡単には、血液を採取し、血液の細胞からＤＮＡ（またはＲＮＡ）を抽出することができる。野生型のＢＦ、Ｃ２、および／またはＣＦＨの対立遺伝子の変化は、例えば、点変異であろうと欠失であろうと、本明細書に記載された手段のいずれによっても検出することができる。
【０１１７】
そのような試料を得るための技術は当技術分野において周知されている（血清試料の採集については、例えば、Ｓｃｈｌｕｇｅｒら（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１３２７−３３参照）。血清またはその他の血液分画は、従来の方法で調製することができる。例えば、約２００μＬの血清を用いて、増幅反応で使用するＤＮＡを抽出することができる。
【０１１８】
いったん試料が得られれば、この試料を直接用いるか、（例えば、遠心または濾過によって）濃縮するか、精製するか、または、これらを組み合わせることができ、そして、増幅反応を実施することができる。例えば、市販のキット（ｔｈｅ ＩｎｓｔａＧｅｎｅ Ｍａｔｒｉｘ，ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ；ｔｈｅ ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ，Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓなど）を用いて、迅速にＤＮＡ調製を行うことができる。一例では、このＤＮＡ調製法によって、核酸増幅に利用しやすく、これを容易に行うことができるヌクレオチド調製物が得られる。
【０１１９】
マイクロアレイ
特定の例において、ＢＦ遺伝子、Ｃ２遺伝子、および／またはＣＦＨ遺伝子における多型を検出する方法では、本明細書に開示されたアレイが用いられる。このようなアレイは核酸分子を含むことができる。一例では、このアレイは、本明細書に開示された多型のような多型性のＢＦ、Ｃ２、および／またはＣＦＨの遺伝子配列にハイブリダイズできる核酸オリゴヌクレオチドプローブを含む。このようなアレイの一定のものは（ならびに本明細書に開示された方法）、ＡＭＤを発症するリスクに関連するか、それからの防御に関連するその他の多型、および、１つ以上のハウスキーピング遺伝子を認識する１つ以上のプローブなど、その他の配列を含むことができる。
【０１２０】
本明細書において「ＡＭＤ検出アレイ」と名付けたアレイは、対象がＡＭＤを発症する遺伝的感受性を判定するために用いられる。一例では、一組のオリゴヌクレオチドプローブが、例えば、対象から得られた核酸配列を増幅した遺伝子である、ＢＦ遺伝子、Ｃ２遺伝子、および／またはＣＦＨ遺伝子における多型を検出するのに使用するための固体支持体の表面に付着している。さらには、増幅反応で内部対照用核酸配列が増幅されたならば（上記参照）、この増幅された核酸分子の存在を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブを加えることができる。
【０１２１】
アレイに結合しているヌクレオチドプローブは、増幅反応（高ストリンジェンシー条件下など）で増幅された配列に特異的に結合することができる。ＢＦ、Ｃ２、および／またはＣＦＨの各遺伝子の少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、またはそれ以上の連続したヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを用いることもできる。
【０１２２】
本開示に従った方法および装置は、適当な条件下ではオリゴヌクレオチドが、相補的塩基配列を有する核酸分子と塩基対合した二本鎖を形成するという事実を利用している。この二本鎖の安定性は、オリゴヌクレオチドの長さ、塩基組成、およびハイブリダイゼーションを生じさせる溶液の組成など、いくつかの因子に依存する。塩基組成の二本鎖の安定性に対する影響は、ハイブリダイゼーションを特定の溶液中、例えば、高濃度の三級または四級のアミンの存在下で行うことによって低下させることができる。
【０１２３】
二本鎖の熱安定性は、配列間の配列類似性の度合いにも依存する。標的配列と、アレイに結合しているオリゴヌクレオチドとの間で形成されることが予想される二本鎖のタイプについて予測されるＴｍに近い温度でハイブリダイゼーションを行うことによって、ミスマッチ二本鎖を形成する率を実質的に低下させることができる。
【０１２４】
アレイ内で用いられる各オリゴヌクレオチド配列の長さは、標的であるＢＦ、Ｃ２、および／またはＣＦＨの核酸配列の結合を最適化するように選択することができる。具体的なスクリーニング条件下において、特定のＢＦ、Ｃ２、および／またはＣＦＨの核酸配列と使用するのに最適な長さは、経験的に決定することができる。したがって、アレイに含まれているオリゴヌクレオチド配列のセットの各個別要素の長さを、スクリーニングするために最適化することができる。一例で、オリゴヌクレオチドプローブは、約２０ヌクレオチドから約３５ヌクレオチドの長さであるか、または約２５ヌクレオチドから約４０ヌクレオチドの長さである。
【０１２５】
アレイを形成しているオリゴヌクレオチドプローブの配列を、例えば、プローブの５’末端または３’末端を介して、支持体に直接結合させることができる。一例では、オリゴヌクレオチドは、５’末端によって固体支持体に結合されている。しかし、当業者は、オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端のどちらを使用することが、固体支持体に結合させるのに適しているかを決定することができる。一般的に、３’末端および５’末端の領域内におけるオリゴヌクレオチドプローブの内部相補性が、支持体への結合を決定する。あるいは、固体支持体に対してスペーサーまたはリンカーとして作用するオリゴヌクレオチドまたはその他の分子など、ＢＦ、Ｃ２、および／またはＣＦＨの配列以外の配列によって、オリゴヌクレオチドプローブを支持体に付着させることができる。
【０１２６】
別の例では、アレイはタンパク質配列を含むが、それらのタンパク質配列は、少なくとも１つのＢＦタンパク質、Ｃ２タンパク質、および／またはＣＦＨタンパク質（または記載された配列の１つを含む遺伝子、ｃＤＮＡ、もしくはその他のポリヌクレオチド分子、またはその断片）か、そのようなタンパク質の断片、またはそのようなタンパク質もしくはタンパク質断片に特異的な抗体を含む。アレイを形成するタンパク質または抗体は、支持体に直接連結することができる。あるいは、固体支持体に対するスペーサーまたはリンカーによって、タンパク質または抗体を支持体に付着させることができる。
【０１２７】
ＢＦタンパク質、Ｃ２タンパク質、および／またはＣＦＨタンパク質の異常は、場合によっては検出可能に標識されている、例えば、ＢＦタンパク質、Ｃ２タンパク質、および／またはＣＦＨタンパク質に特異的な結合剤を用いて検出することができる。したがって、一定の例においては、異常の検出は、対象由来の試料を、ＢＦタンパク質、Ｃ２タンパク質、および／またはＣＦＨタンパク質に特異的な結合剤と接触させること、そして、この結合剤に試料が結合したか否かを検出し、それによって、この試料に存在するＢＦタンパク質、Ｃ２タンパク質、および／またはＣＦＨタンパク質の量を測定することを含むが、ただし、この場合、ＡＭＤを発症する素因をもたない対象に由来する類似試料に存在するＢＦタンパク質、Ｃ２タンパク質、および／またはＣＦＨタンパク質の量、またはＡＭＤを発症する素因をもたない対象に由来する類似試料にあるＢＦタンパク質、Ｃ２タンパク質、および／またはＣＦＨタンパク質の標準的な量と較べて、その試料中のＢＦタンパク質、Ｃ２タンパク質、および／またはＣＦＨタンパク質の量が異なることが、そのＢＦ分子、Ｃ２分子、および／またはＣＦＨ分子の異常である。
【０１２８】
特定の例において、マイクロアレイの材料は、ガラス（二酸化ケイ素）から作られる。固体支持体用に適した二酸化ケイ素の種類は、ケイ酸アルミニウム、ホウケイ酸、シリカ、ソーダ石灰、亜鉛チタニア、および溶融シリカなどであるが、これらに限定されない（例えば、Ｓｃｈｅｎａ，Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，２００３参照）。当技術分野周知の方法、例えば、有機ポリマーを原料とする表面処理剤によって、核酸をガラスの表面に付着させることができる。具体的な例は、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリイソブチレン、ポリブタジエン、ポリイソプレン、ポリビニルピロリジン、ポリテトラフルロエチレン、二フッ化ポリビニリデン、ポリフルオロエチレン−プロピレン、ポリエチレンビニルアルコール、ポリメチルペンテン、ポリクロロトリフルオロエチレン、ポリスルホルン、ヒドロキシル化２軸配向ポリプロピレン、アミン化２軸配向ポリプロピレン、チオール化２軸配向ポリプロピレン、エチレンアクリル酸、メタクリル酸チレン、およびこれらの共重合体の混合物（米国特許第５，９８５，５６７号参照、これは参照されて本明細書に組み込まれる）、化学的に活性なアミン基またはアルデヒド基をもたらす有機シラン化合物、マイクロアレイのエポキシまたはポリリシン処理を含むが、これらに限定されない。固体支持体表面の別例は、ポリプロピレンである。
【０１２９】
一般的に、固体支持体表面を形成するために用いることができる物質に適した特性には以下のものが含まれる。すなわち、表面活性化されやすいため、活性化されると、支持体の表面がオリゴヌクレオチドなどの生体分子をそれに共有結合させることができること；生体分子の「インサイツ」合成に適していること；化学的に不活性であるため、オリゴヌクレオチドに占領されていない支持体上の領域において、非特異的結合を起こしにくいか、または非特異的結合が生じたときには、オリゴヌクレオチドを除去することなく、そのような物質を表面から容易に除去することができることなどである。
【０１３０】
一例では、表面処理剤は、アミン含有シラン誘導体である。核酸のアミン表面への付着は、ＤＮＡ骨格上の負に荷電したリン酸基と、正に荷電したアミノ基との相互作用を介して生じる（Ｓｃｈｅｎａ，Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，２００３、これは参照されて本明細書に組み込まれる）。別の例では、反応性アルデヒド基が表面処理剤として用いられる。アルデヒド表面への付着は、目的とするＤＮＡに５’−アミン基またはアミノリンカーを付加することによって行われる。アミンリンカー上の非結合電子対が、アルデヒド基の陽性炭素原子を攻撃する求核試薬として作用すると結合が生じる。
【０１３１】
本開示に従って多様なアレイフォーマットを用いることができる。一例には、当技術分野において通常ディップスティックと呼ばれる、直線配列のオリゴヌクレオチドバンドが含まれる。別の適当なフォーマットには、分離したセルになった二次元パターン（６４×６４アレイ内の４０９６個の四角形など）が含まれる。当業者が認めるように、スロット状（長方形）および円形のアレイなどであるがこれらに限定されない、その他のアレイフォーマットも等しく使用に適している（米国特許第５，９８１，１８５号参照。これは参照されて本明細書に組み込まれる）。一例では、糸状、膜状、またはフィルム状のポリマー媒体上にアレイが形成される。有機ポリマー媒体の例は、厚さが約１ｍｍ（０．００１インチ）から約２０ｍｍのポリプロピレンシートであるが、ただし、フィルムの厚さは重大な意味を持たず、かなり広範囲に変えることができる。２軸配向ポリプロピレン（ＢＯＰＰ）フィルムが、今回は、アレイを調製するために具体的に開示されている。ＢＯＰＰフィルムは、その耐久性に加えて、低バックグラウンド蛍光を示す。特定の例では、アレイは、固相型の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を用いる核酸アレイである。
【０１３２】
本開示のアレイフォーマットは、さまざまな異なった型のフォーマットに含めることができる。「フォーマット」は、固体支持体を固定することができる任意のフォーマット、例えば、マイクロタイタープレート、試験管、無機シート、ディップスティックなどを含む。例えば、固体支持体がポリプロピレン糸の場合、１本以上のポリプロピレン糸を、プラスチック製のディップスティック型装置に貼り付けることができ、ポリプロピレン膜は、スライドガラスに貼り付けることができる。具体的なフォーマットは、それ自体、重要ではない。必要なことは、固体支持体が、その固体支持体、またはそこに吸着する任意の生体高分子の機能的挙動に影響することなく貼り付けることができるということであり、また、フォーマット（ディップスティックまたはスライドガラスなど）が、装置が導入される任意の物質（臨床試料およびハイブリダイゼーション溶液など）に対して安定しているということである。
【０１３３】
本開示のアレイは、さまざまな方法によって調製することができる。一例では、オリゴヌクレオチドまたはタンパク質の配列を別々に合成してから、固体支持体に付着させる（米国特許第６，０１３，７８９号参照、これは参照されて本明細書に組み込まれる）。別の例では、固体支持体上で配列を直接合成して所望のアレイを提供する（米国特許第５，５５４，５０１号参照、これは参照されて本明細書に組み込まれる）。オリゴヌクレオチドおよびタンパク質を固体支持体と共有結合させるのに適した方法、および支持体上でオリゴヌクレオチドまたはタンパク質を直接合成するのに適した方法は当業者に周知されており、適当な方法の要約を、Ｍａｔｓｏｎら（１９９４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１７：３０６−１０に見出すことができる。一例において、固体支持体上でオリゴヌクレオチドを調製するための通常の化学的技術を用いて、支持体上でオリゴヌクレオチドを合成する（例えば、ＰＣＴ公開８５／０１０５１号および８９／１０９７７号、または米国特許第５，５５４，５０１号などを参照、これらはそれぞれ参照されて本明細書に組み込まれる）。
【０１３４】
適当なアレイは、アレイのセル内でオリゴヌクレオチドを合成する自動的手段を用いて、予め定められたパターンで４種類の塩基の前駆体を固着させることによって、作成することができる。要するに、多重チャネル型自動的化学物質送達系を用いて、基質全面に（送達系のチャネル数と同じ数の）平行な列にオリゴヌクレオチドプローブ集団を作出する。第１の方向にオリゴヌクレオチドの合成が完了した後、基質を９０度回転させて、第１の組に垂直な２組目の列の内部で合成を進行させることができる。このプロセスにより、交点に複数の分離したセルを生じさせる多重チャネル型アレイが作出される。
【０１３５】
特定の例において、アレイ上のオリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチドプローブ：標的配列のハイブリダイゼーション複合体の検出を可能にする、１つ以上の標識を含む。
【０１３６】
キット
本開示は、対象、例えば、その他の点では健康なヒト対象にＡＭＤの遺伝的素因があるか否かを判定するのに用いることができるキットを提供する。そのようなキットによって、対象が、ＢＦ、Ｃ２またはＣＦＨの遺伝子配列内に１つ以上の遺伝子の変異または多型をもっているかを判定できるようになる。
【０１３７】
これらのキットは、対象のＢＦ遺伝子、Ｃ２遺伝子、またはＣＦＨ遺伝子に少なくとも１つの多型が存在するかしないかを判定するのに役立つ試薬、例えば、本明細書中で同定されているＢＦ、Ｃ２またはＣＦＨの多型配列に選択的にハイブリダイズするプローブまたはプライマーなどを含む。このようなキットを本明細書に記載された方法とともに用いて、対象のＢＦ、Ｃ２、またはＣＦＨの遺伝子型またはハプロタイプを判定することができる。
【０１３８】
対象における特異的なＢＦ、Ｃ２、またはＣＦＨの配列、例えば、本明細書に記載されたＳＮＰまたはハプロタイプを検出するのに使用するキットの形にして、オリゴヌクレオチドプローブおよび／またはプライマーを供給することもできる。そのようなキットでは、適当な量の１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーが、１つ以上の容器に入れられて提供される。これらのオリゴヌクレオチドプライマーは、例えば、水溶液中に懸濁されるか、フリーズドライ粉末すなわち凍結乾燥粉末として提供することも可能である。オリゴヌクレオチドを供給する容器は、供給時の形状を保持できる任意の従来の容器、例えば、微量遠心用チューブ、アンプル、またはビンであってもよい。使用目的によっては、プライマー対を、一般的には使い捨てになっている別々のチューブ、またはそれと等価の容器の中に、予め一回量を測り入れて提供することもできる。このような準備をして、ＢＦ、Ｃ２、またはＣＦＨの多型が存在するかを検査する試料をそれぞれのチューブに加えて増幅を直接行うことができる。
【０１３９】
このキットで供給されるオリゴヌクレオチドプライマーそれぞれの量は、任意の適量であればよく、例えば、その製品が目指すマーケットに応じて決まる。例えば、このキットが、研究用または臨床用に合わせてある場合、提供される各ヌクレオチドプライマーの量は、数回のＰＣＲ増幅反応を開始させるのに十分な量となっているであろう。当業者は、一回の増幅反応に使用するのに適したオリゴヌクレオチドプライマー量を知っている。一般的な指針が、例えば、Ｉｎｎｉｓら（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０）、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）、およびＡｕｓｕｂｅｌら（Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ，ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９２）に記載されている。
【０１４０】
ＢＦ、Ｃ２またはＣＦＨをコードする配列、例えば、特異的な標的であるＢＦ、Ｃ２、もしくはＣＦＨの各遺伝子、またはその５’側または３’側の近傍領域をインビトロ増幅するのを容易にするために、キットは３種類以上のプライマーを含んでいてもよい。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、キットが、例えば、ＤＮＡ試料調製用試薬、適当な緩衝剤（例えば、ポリメラーゼ緩衝剤）、塩類（例えば、塩化マグネシウム）、およびデオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）など、ヌクレオチド増幅反応を行うのに必要な試薬も含んでいてもよい。
【０１４２】
さらに、キットは、ＢＦ、Ｃ２、またはＣＦＨの多型またはハプロタイプを検出するのに用いるための標識型または非標識型のオリゴヌクレオチドプローブを含むことができる。一定の実施形態において、これらのプローブは、増幅された標的配列に存在するかもしれない多型性部位の可能性がある部位に特異的であろう。そのようなプローブにとって適当な配列は、プローブの配列が、多型性部位およびその周囲のＢＦ、Ｃ２、またはＣＦＨの配列と相補的になるよう、同定された多型性部位の１つ以上を含む任意の配列であろう。一例として、そのようなプローブは長さが少なくとも６ヌクレオチドであり、多型性部位が、このプローブの長さの任意の位置に存在している。特異性を確保するためには、より長いプローブを用いることがしばしば有益である。そこで、いくつかの実施形態では、プローブは、少なくとも８ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１２ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、またはそれ以上である。
【０１４３】
このキットでは、増幅反応で使用するための１つ以上の対照用配列を提供することも有益であるかもしれない。適当な陽性対照用配列の設計は、適当な技術分野における当業者によく知られている。一例として、対照用配列は、本明細書に記載されているような１つ以上の標的ＳＮＰ部位に既知の配列をもつヒト（または非ヒト）のＢＦ、Ｃ２、またはＣＦＨの核酸分子を含んでもよい。対照は、非ＢＦ、非Ｃ２、または非ＣＦＨの核酸分子も含むことも可能である。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、キットは、インビトロ増幅反応でＲＴ−ＰＣＲ法を行うのに必要な試薬のうちのいくつかまたは全部、例えば、ＲＮＡ試料調製用試薬（例えば、ＲＮＡ分解酵素阻害剤など）、適当な緩衝液（例えば、ポリメラーゼ緩衝液）、塩類（例えば、塩化マグネシウム）、およびデオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）などを含むことができる。
【０１４５】
さらに、そのようなキットは、インビトロで増幅された標的配列の検出に使用するための標識オリゴヌクレオチドプローブまたは非標識オリゴヌクレオチドプローブを含むことができる。そのようなプローブに適した配列は、提供された２つのオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング部位の間にある任意の配列であって、プローブが相補的である配列をＰＣＲ反応の過程で増幅させるような配列であろう。特定の実施形態では、これらのプローブは、増幅された標的配列に存在しうる潜在的な多型に特異的である。
【０１４６】
ＲＴ−ＰＣＲ反応に用いる１つ以上の対照用配列をキットに入れて提供するのも有益であろう。適当な陽性対照用配列の設計は、適当な技術分野における当業者によく知られている。
【０１４７】
ＢＦ、Ｃ２、またはＣＦＨのタンパク質発現（例えば、過剰発現もしくは過少発現、または特定のアイソフォームの発現など）の検出または解析を行うためのキットも含まれる。そのようなキットは、少なくとも１つの標的タンパク質特異的結合剤（例えば、ＢＦタンパク質、Ｃ２タンパク質、またはＣＦＨタンパク質を特異的に認識するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体または抗体断片、またはＢＦタンパク質、Ｃ２タンパク質、またはＣＦＨタンパク質の特定の多型性形態）を含んでいてもよく、また、少なくとも１つの対照（所定量の標的ＢＦ、Ｃ２、もしくはＣＦＨタンパク質、または所定量のＢＦ、Ｃ２、またはＣＦＨタンパク質を含む試料など）を含んでもよい。前記のＢＦ、Ｃ２、またはＣＦＨタンパク質に特異的に結合する剤および対照は、別々の容器に入れることもできる。前記の抗体は、ＢＦタンパク質、ＣＤタンパク質、および／またはＣＦＨタンパク質の多型性形態を識別する能力をもつかもしれない。
【０１４８】
ＢＦタンパク質、Ｃ２タンパク質、もしくはＣＦＨタンパク質、またはアイソフォームの発現を検出するキットは、ＢＦ、Ｃ２、またはＣＦＨ：結合剤の複合体を含むことも可能であり、例えば、この結合剤は検出できるように標識付けされていてもよい。検出可能な結合剤が標識付けされていなければ、例えば、二次抗体またはプロテインＡによって検出することができるが、これらは、キットによっては、１つ以上の別の容器の中に入れて提供することもできる。このような技術は周知のものである。
【０１４９】
具体的なキットのさらなる構成要素には、アッセイを行うための説明書などがあろう。説明書によって、試験者がＢＦ、Ｃ２、またはＣＦＨの発現量を測定することが可能になる。キットには、反応用容器、および、色素原、緩衝液、酵素などの補助試薬も含まれるかもしれない。説明書には較正曲線または補正図が、決定値（例えば、実験的に測定された値）と比較するために提供されていることもある。
【０１５０】
本明細書に記載されたようなＢＦ遺伝子、Ｃ２遺伝子、またはＣＦＨ遺伝子の特異的ＳＮＰ（またはハプロタイプ）について、ホモ接合である個体とヘテロ接合である個体とを区別することを可能にするキットも提供される。このようなキットの例では、Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：８９２３−８９２７に記載されているように、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）を行うのに必要な材料が提供されている。具体的な実施形態において、これらのキットは、本明細書に記載されているように、対象のＢＦ、Ｃ２、またはＣＦＨの配列内における多型を検出するように設計された、１つ以上のマイクロタイタープレートアッセイを含む。これらのキットに入っている説明書によって、試験者は、特定のＢＦ、Ｃ２、またはＣＦＨの対立遺伝子が存在するか否か、また、それがホモ接合であるかヘテロ接合であるかを判定することができるようになる。このキットで、ＯＬＡ反応に用いる１つ以上の対照用配列を提供するのも有益であろう。適当な陽性対照配列の設計については適当な技術分野における当業者によく知られている。
【０１５１】
このキットは、フィルター、ビーズ、マイクロタイタープレートなどへの結合など、核酸結合を含む、いくつかのアッセイフォーマットの使用を含んでいてもよい。技術には、ドットブロット法、ＲＮＡブロット法、ＤＮＡブロット法、ＰＣＲ、ＲＦＬＰなどがある。
【０１５２】
マイクロアレイに基づくキットも提供される。これらのマイクロアレイキットは、遺伝子型判定解析において有用であるかもしれない。一般に、これらのキットは、基質上の、例えば、アドレス可能な部位に固定されて提供される、１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。このキットは、また、使用者がこのアレイを検索するのに役立つ、通常は書面になった指示も含む。このような説明書は、任意には、コンピューター可読型メディア上で提供することができる。
【０１５３】
キットは、さらに、提供されたアレイを解析する際に使用するための１つ以上の緩衝液を含むことができる。例えば、そのような緩衝液は、低ストリンジェンシー洗浄液、高ストリンジェンシー洗浄液、および／または剥離用溶液などであろう。これらの緩衝液はまとめて提供することができる。すなわち、各緩衝液容器が大きく、何回分かのプロービング処理または洗浄処理または剥離処理を行うのに十分な緩衝液を保持していてもよい。あるいは、緩衝液は、キットに含まれるアレイのサイズおよび形に合わせて、予め秤量された等量液にして提供することもできる。一定のキットは、内部でアレイ−プロービング反応を行うことができる、１つ以上の容器を提供するかもしれない。
【０１５４】
キットは、さらに、アレイ上で捕捉された生体分子を検出するために、抗体またはプローブ（または抗体の混合物、プローブの混合物、または抗体およびプローブの混合物）などの検出分子の容器を１つ以上含んでいてもよい。このキットは、また、標識処理もしくはアレイのプロービングのいずれか、またはその両方の内部試験を行うために、標識されているか、標識されていない対照用プローブ分子も含むことができる。対照用プローブ分子は、例えば、水溶液中に懸濁して、またはフリーズドライもしくは乾燥凍結された粉末として提供することができる。対照が入っている容器は、例えば、微量遠心用チューブ、アンプル、またはビンなど、供給された形態を保持することができる任意の従来の容器であってもよい。使用目的によっては、対照プローブを、個別の、一般的には使い捨てのチューブまたはそれと等価の容器に、予め秤量された一回使用量にして提供することができる。
【０１５５】
このキットにおいて供給される各対照用プローブの量は、例えば、その製品が目指すマーケットに応じて、任意の特定量にすることができる。例えば、このキットが、研究用または臨床用に合わせてある場合、アレイを何回か対照用解析するのに十分な対照用プローブが提供されることであろう。同様に、複数の対照プローブが１つのキットで提供される場合、提供される具体的なプローブは、マーケットおよび付随するキットに適合するように提供される。一定の実施形態において、複数の異なった対照用プローブが単一のキットで提供されるが、各対照プローブは、関連するアレイ上に存在する異なったタイプの検体に由来のものである（例えば、真核生物と原核生物両方の検体を提供するキットでは、原核生物特異的な対照用プローブと、それとは別の真核生物特異的な対照用プローブとを提供することができる）。
【０１５６】
本発明のいくつかの実施形態において、１つ以上のプローブ標識反応を行うのに必要な試薬も含むことも可能である。含まれる具体的な試薬は、プローブ分子の種類（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、および標識する方法（例えば、プローブ合成過程で取り込まれる放射標識、結合可能な蛍光タグなど）に応じて、エンドユーザーを満足させるよう選択されるはずである。
【０１５７】
本明細書で提供されているアレイをアッセイするのに用いるプローブ分子を標識するために、さらなるキットが提供される。そのようなキットは、任意で、そのように標識されたプローブ分子によってアッセイされることになるアレイを含むことができる。
【０１５８】
本開示は、以下の非限定的な実施例によって具体的に説明されている。
【実施例】
【０１５９】
実施例１
材料および方法
対象：本研究では、欧米人の子孫である６０歳を超えたＡＭＤ症例、および年齢が一致する対照のそれぞれ独立した２群を用いた。これらの群は、アイオワ大学から報告された３５０人の血縁関係のない臨床的にＡＭＤと確認された対象（平均年齢７９．５＋／−７．８歳）、および１１４人の血縁関係のない対照個体（平均年齢７８．４＋／−７．４歳；年齢および民族性が一致）、ならびにコロンビア大学から報告された５４８人の血縁関係のない臨床的にＡＭＤと確認された対象（平均年齢７１．３２＋／−８．９歳）、および２７５人の血縁関係のない、年齢と民族性が一致する対照（平均年齢６８．８４＋／−８．６歳）からなる。対象は、熟練した眼科医の検査を受けた。
【０１６０】
立体眼底写真を、Ｈａｇｅｍａｎ，２００５，前掲；Ｂｉｒｄら、（１９９５）Ｓｕｒｖ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．３９：３６７−７４；およびＫｌａｖｅｒら、（２００１）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４２：２２３７−４１に記載されているように標準化された分類システムに従って等級分けした。対照は、黄斑疾患に特徴的な徴候を示しておらず、ＡＭＤの家族歴があることが分かっている者はいなかった（病期０および１ａ）。ＡＭＤ対象を募集した時に、彼らの重症の方の眼の分類に基づいて表現型によるカテゴリーに細分した。ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて、末梢血白血球からゲノムＤＮＡを調製した。
【０１６１】
実験は、コロンビア大学およびアイオワ大学の施設内倫理委員会によって承認されたプロトコルに従って実施した。すべての実験対象者から事前にインフォームドコンセントを得ておいた。
【０１６２】
免疫組織化学法：Ａｎｄｅｒｓｏｎら（２００２）Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１３４：４１１−３１に記載されているとおりに、後極を処理して、切片にし、Ｂａ因子（Ｑｕｉｄｅｌ）に対する抗体で標識した。隣接した切片を二次抗体だけとインキュベートし、対照として用いた。既述されたように（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２００２、前掲）、いくつかの免疫標識された標本を調製して、共焦点レーザー走査顕微鏡によって観察した。
【０１６３】
変異のスクリーニングと解析：ＳＳＣＰ解析法、変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）、および直接配列決定法を用いて、ＢＦおよびＣ２のコード領域と隣接するイントロン領域を変異体について調べた。ＳＳＣＰ、ＤＨＰＬＣ，およびＤＮＡ配列決定による解析のためのプライマーは、各エキソンおよびそれに隣接したイントロン領域が増幅されるよう、Ｍａｃ Ｖｅｃｔｏｒソフトウェア（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて設計された。Ａｌｌｉｋｍｅｔｓら、（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：１８０５−１８０７、およびＨａｙａｓｈｉら、（２００４）Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｇｅｎｅｔ．２５：１１１−９に記載されているとおりに、ＰＣＲにより作成した単位複製配列を配列変異についてスクリーニングした。ＳＳＣＰおよびＤＨＰＬＣによって検出された変異はすべて、標準的なプロトコルに従って２方向の配列決定を行って確認した。
【０１６４】
遺伝子型判定：データマイニング（Ｅｎｓｅｍｂｌデータベース、ｄｂＳＮＰ；Ｃｅｌｅｒａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ）および配列決定によって一塩基多型（ＳＮＰ）が発見された。検定集団内で１０％よりも頻度の高い変異体のアッセイは、Ｖａｌｉｄａｔｅｄ，ＩｎｖｅｎｔｏｒｉｅｄＳＮＰ Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−ＤｅｍａｎｄとしてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入するか、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＡｓｓａｙｓ−Ｂｙ−Ｄｅｓｉｇｎ ｐｉｐｅｌｉｎｅに提出した。利用した技術は、Ｈａｇｅｍａｎら、２００５、前掲に記載されている技術と同じものであった。要するに、５ｎｇのＤＮＡをＡＢｌ ９７００ ３８４−ウェルのサーマルサイクラー上で５０サイクルの増幅を行い、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の７９００ ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍでプレートを読み取った。
【０１６５】
統計解析：Ｈａｇｅｍａｎら、２００５、前掲、およびＫｌａｖｅｒら、２００１、前掲に記載されているような分割表解析を行うために、遺伝子型をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌで一覧表にしてＳＰＳＳ（ＳＰＳＳ，Ｉｎｃ．）に提出した。ＳＡＳ／Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ）を用いて、ハーディー７−ワインベルグ平衡への適合度を確認したところ、症例および対照のどちらにおいても、すべてのＳＮＰが、ｐ＜０．０５のカットオフ値を切り抜けた。ハプロタイプを推定するために、本発明者らは、ケンブリッジ医学研究所のウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｅ．ｃｉｍｒ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌａｙｔｏｎ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／からダウンロードしたｓｎｐｈａｐ（Ｄａｖｉｄ Ｃｌａｙｔｏｎ著；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）、ＳＮＰＥＭ（Ｄｒ．Ｎｉｃｈｏｌａｓ ＳｃｈｏｒｋとＭ．Ｄａｎｉｅｌｅ Ｆａｌｌｉｎ著、そして、Ｄ． Ｆａｌｌｉｎから取得）、およびＰＨＡＳＥバージョン２．１１（Ｍａｔｔｈｅｗ Ｓｔｅｐｈｅｎｓ著；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ，そして、彼のウェブサイトであるｗｗｗ．ｓｔａｔ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｓｔｅｐｈｅｎｓ／ｓｏｆｔｗａｒｅ．ｈｔｍｌから利用可能）を用いた。用いたハプロタイプ解析法は、第一には、期待値最大化（ＥＭ）アルゴリズムまたはギブスサンプリングアルゴリズムを用いてハプロタイプの推定値を得るためのものであり、第二には、連鎖不平衡の領域内にある最小情報セットを表すｈｔＳＮＰを同定するためのものであり、第三には、これらが、ＡＭＤと有意な関連性があることを評価するためのものである。連鎖不平衡は、Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ＰＧＡのウェブサイト（ｗｗｗ．ｉｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｉｔｙ．ｎｅｔ）で利用できる画像ツールを用いて評価した（図示せず）。すべてのｐ値は両側検定されたものであり、Ｘ２値は、漸近有意確率として表示されている。全第Ｉ種過誤率（α）は、Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ＰＧＡのウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｉｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｉｔｙ．ｎｅｔ／ＩＩＰＧＡ２／Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｍｕｌｔｉｐｌｅｔｅｓｔｆｄｒｆｏｒｍ）で実施されている、ＢｅｎｊａｍｉｎｉとＨｏｃｈｂｅｒｇ（１９９５）Ｊ．Ｒ．Ｓｔａｔ．Ｓｏｃ．Ｓｅｒ．Ｂ５７：２８９−３００の方法を用いて遡及的に計算されたが、２×１０−３よりも小さかった。
【０１６６】
有意性のあるハプロタイプに、ＳＮＰＥＭとＰＨＡＳＥで並べ替え検定を行った。図２Ａに示された防御型ＳＮＰモデルをＥｘｅｍｐｌａｒ２．２（Ｓａｐｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅｓのウェブサイト上、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｐｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍで利用可能）に提示し、このソフトウェアによって、図２Ｂに示した３つのデータベース（アイオワ、コロンビア、および混合）に対する適合度について統計的な評価を行った。遺伝的アルゴリズム（ＧＡ）から導出されたモデル（図２Ｃに示されている）の作成は、Ｅｘｅｍｐｌａｒソフトウェアを含んでいた。ＧＡのオプション値は以下の通りに設定した。すなわち、モデルサイズが５以下（１６種類の遺伝子型が可能となる）の１５００ＡＮＤ／ＯＲモデルを各１５回反復した。さらに、遺伝的アルゴリズムの実行および有意性検定の詳細は実施例２に含まれている。
【０１６７】
適当なモジュールをもつＳＰＳＳバージョン１４．０統計用パッケージを用いて、マイナーな対立遺伝子を持つもの（＋）と持たないもの（−）に再コード化したコロンビア、アイオワ、および混合のデータに対して分類および回帰ツリー解析を行った。モデルは、ＣＦＨおよびＣ２／ＢＦの両遺伝子座を非独立の結果に対する寄与因子として取り込んだ３つのデータセットのそれぞれを用いて自動的に作成された。
【０１６８】
結果
コロンビア大学で確認されたコホートから得られた約９０人のＡＭＤ症例者および９０人の対照者において、まず変性ＨＰＬＣによって、全部で１８のＢＦエキソンを、５０〜８０ｂｐの隣接するイントロン領域も含めて解析した。８種類のミスセンス変異を含む１７種類の配列変異体を同定したところ、Ｌ９Ｈ（ｒｓ４１５１６６７）対立遺伝子とＲ３２Ｑ（ｒｓ６４１１５３）対立遺伝子は、症例者よりも対象者において頻度が高かった（表１）。ＢＦ内およびその隣接ホモログであるＣ２内のハプロタイプ−タギングＳＮＰ（ｈｔＳＮＰ）が同定され（図１）、５４８人のＡＭＤ症例者および２７５人の対照者からなるコロンビア大学コホートにおいて遺伝子型判定が行われた。これらの解析によって、ＡＭＤと有意に関連する４つの変異体が明らかになった。ＢＦにおけるＬ９Ｈ変異体は、Ｃ２（ｒｓ９３３２７３９）におけるＥ３１８Ｄ変異体とほぼ完全な連鎖不平衡（ＬＤ）にあったが、ＡＭＤに対して非常に防御的であった（Ｘ２＝１３．８ Ｐ＝０．０００２０，ＯＲ＝０．３７［９５％ＣＩ＝０．１８〜０．６０］）。ＢＦにおけるＲ３２Ｑ対立遺伝子は、Ｃ２のイントロン１０におけるｒｓ５４７１５４のＳＮＰとほぼ完全なＬＤにあり、これも非常に防御的であった（Ｘ２＝３３．７，Ｐ＝６．４３×１０−９，ＯＲ＝０．３２［９５％ＣＩ＝０．２１〜０．４８］）。
【０１６９】
アイオワ大学で得られた３５０人の症例者および１１４人の対照者からなる独立したコホートの遺伝子型判定によってこれらの知見が確認された。例えば、Ｃ２ Ｅ３１８Ｄ／ＢＦ Ｌ９ＨのＳＮＰ対は、このコホートにおいてＡＭＤと有意に関連していた（Ｘ２＝１０．６，Ｐ＝０．００１２，ＯＲ＝０．３４［９５％ＣＩ＝０．１８−０．６７］）。Ｃ２遺伝子座およびＢＦ遺伝子座にわたるハプロタイプを解析するために、この２つのコホートから得られたデータを一緒にした（表２）。共通のハプロタイプ（Ｈ１，図１）は、ＡＭＤに対する有意なリスクをもたらしていた（Ｘ２＝１０．３，Ｐ＝０．００１３，ＯＲ＝１．３２［９５％ＣＩ＝１．１〜１．６］）。ＢＦのＲ３２ＱのＳＮＰによってタグ付けされたハプロタイプ（Ｈ７）は、その他すべてのハプロタイプと比べると、ＡＭＤに対して非常に防御的であり（Ｘ２＝２６．９，Ｐ＝２．１×１０−７，ＯＲ＝０．４５［９５％ＣＩ＝０．３３〜０．６１］、また、Ｃ２のＥ３１８Ｄ／ＢＦのＬ９Ｈを含むハプロタイプ（Ｈ１０）も有意に防御的であった（Ｘ２＝２１．６，Ｐ＝３．４×１０−６，ＯＲ＝０．３６［９５％ＣＩ＝０．２３〜０．５６］）（図１）。Ｈ１ハプロタイプを参照用ハプロタイプとして使用すると、Ｈ７（Ｘ２＝２９．６，ＯＲ＝０．４２［０．３２〜０．５８］）およびＨ１０（Ｘ２＝２４．９，ＯＲ＝０．３３［０．２１〜０．５２］）に対して僅かに有意性の高い結果を生じさせた。ＳＮＰＥＭプログラムによる解析でも、同じハプロタイプが本疾患と有意に関連することが明らかとなり、Ｃ２遺伝子および／またはＢＦ遺伝子における対立遺伝子が、ＡＭＤに対するリスクを予測できるという仮説が裏付けられた。この２つの防御型ハプロタイプをもつ個体（Ｈ７、Ｈ１０についてホモ接合体であるか、または７／１０複合へテロ接合体である）が、対照者の３．４％に見られたが、症例者では僅か０．７７％にしか見られなかった（Ｘ２＝１２．２，Ｐ＝０．０００４８，ＯＲ＝０．２２［０．０８７〜０．５６］）。２つの防御型対立遺伝子をもつ対象のオッズ比は、１つの防御型対立遺伝子をもつ対象のオッズ比のほぼ半分であり、共優性モデルと整合した。
【０１７０】
観察された関連性は、全ＡＭＤ対象コホートを対照者と比較した場合、または、初期ＡＭＤ（ｅＡＭＤ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、および地図状萎縮（ＧＡ）など、主なＡＭＤサブタイプを別々に解析した場合に非常に有意性が高かった。ＧＡ群（２つのコホートから合計で１３３人の対象）は、場合によっては、ＣＦＨに関係した本発明者らの観察結果（Ｈａｇｅｍａｎら、２００５、前掲）と同じように、結果一般的な傾向から逸脱した。具体的には、Ｒ３２Ｑ対立遺伝子によってタグ付けされたハプロタイプが、本疾患に対してもっとも強い防御を示した。すなわち、ＧＡ群を対照者と比較するとＯＲが０．２２であるのに対し、残りのＡＭＤ試料を同じ解析にかけると０．４５であった。このずれは、本疾患にさまざまな病因論があるという点では有意であるかもしれないが、恐らくＧＡ症例者の数が少なかったために、統計的に有意であるというまでには至らなかった（信頼区間が重複した）。
【０１７１】
複合解析は、まず、対象をＣＦＨのＹ４０２Ｈ対立遺伝子の状態にしたがって階層化して実施した。Ｃ２／ＢＦによって付与される防御は、ＣＦＨの４０２Ｈホモ接合体で最も強く（ＯＲ＝０．２７）、４０２Ｈ／Ｙヘテロ接合体で中程度（ＯＲ＝０．３６）、そして、４０２Ｙホモ接合体で最も弱かった（ＯＲ＝０．４４）。しかし、これらの推定値のすべてで信頼区間が重複した。この結果は、主に、Ｃ２／ＢＦ防御型対立遺伝子の頻度が４０２Ｈホモ接合体（「リスク」遺伝子型）で最も高いという傾向にあるせいであった。対照コホートにおけるこれらの対象の４０％が少なくとも１つの防御型対立遺伝子を持っていた。これに対し、４０２Ｈ／Ｙまたは４０２Ｙである対照者では、Ｃ２／ＢＦ防御の頻度が次第に低下した（それぞれ３２％および２６％）。言い換えると、ＣＦＨ遺伝子型のために高リスクになっている個体は、ＡＭＤを発症せず、高頻度でＣ２／ＢＦ遺伝子座に防御型対立遺伝子を有する。
【０１７２】
個体ＳＮＰ分析によって示唆されたように、ＡＭＤに対して防御的なＣＦＨおよびＣ２／ＢＦのＳＮＰの組み合わせで可能なものを同定するために、利用可能なデータの解析を２つの方法、すなわち、まずは、経験的な手作りモデルによって、次に、Ｅｘｅｍｐｌａｒソフトウェアを用いた機械学習（ｍａｃｈｉｎｅ−ｌｅａｒｎｅｄ）モデルによって行った（図２）。最初のモデルは、データを経験的に検討することによって作り出されるような仮説（手作り）モデルであった（図２Ａ）。モデルについての説明がパネルＡとして示されており、ＡＭＤから防御する遺伝子型の組み合わせである可能性のある４つの組み合わせ（「真」であるモデルをもたらす組み合わせ）を提示していると解される。このモデルを試料に対して適用したところ、各コホート別と混合コホートについてパネルＢに示す分布が得られた（図２Ｂ）。症例におけるパーセンテージは、モデルが偽であるという症例者の割合であって、言い換えれば、彼らは、モデルによって表されるような防御を受けなかった者である。対照におけるパーセンテージは、モデルによって表された防御因子を持っていて、モデルが真であることを意味している対照者の割合である。これらの分布に対し、フィッシャーの正確確率検定による有意性検定を行い、ｐ値がそれぞれ、Ｐ＝０．００２３７、Ｐ＝４．２８×１０−８、およびＰ＝７．９０×１０−１０であることを証明した。この後、Ｅｘｅｍｐｌａｒソフトウェアを動かして、遺伝的アルゴリズムと呼ばれる機械学習法を用いて、データに対して「最適適合」した防御モデルを作成した。すなわち、本発明者らは、機械学習ソフトウェアが、手作りのモデルを凌ぐことができるという仮説をテストした。コロンビアのコホートについてモデルを学習させ、得られた最適合モデルを保持し、次に、独立したコホートに対する確認検定（外挿確認（ｏｕｔ−ｏｆ−ｓａｍｐｌｅ ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）としてアイオワコホートに適用した。最後に、これらのモデルを混合試料セットに適用した。得られた最良のモデルを図２Ｃに示す。このモデルは、ＡＭＤから防御すると思われる４種類の個別の（または組み合わされた）遺伝子型（すなわち、「真」であるモデルをもたらす組み合わせ）を表している。アイオワコホート、コロンビアコホート、および混合コホートのそれぞれに対する、このモデルの成績を図２Ｄに示す。これらの分布に対し、フィッシャーの正確確率検定による有意性検定を行い、ｐ値がそれぞれ、Ｐ＝７．４９×１０−５、Ｐ＝２．９７×１０−２２、およびＰ＝１．６９×１０−２３であることを証明した。症例者と対照者の指定を無作為化し、データセットの置換を３０００回行うことによって、この方法をさらに検証した。実際のデータは、これらの置換例のどれよりも有意性が高かった。
【０１７３】
要約すると、ＣＦＨに変異をもつこれらのハプロタイプをＥｘｅｍｐｌａｒソフトウェアによって複合解析したところ、５６％の健常対照者は、少なくとも１つの防御型ＣＦＨハプロタイプまたはＣ２／ＢＦハプロタイプを保有しているが、７４％のＡＭＤ対象は、これらの遺伝子座にいずれの防御型ハプロタイプも持っていないことが明らかになった。このデータを検討すると、症例者におけるリスク型の約６０％、および対照者の防御型の６５％は、ＣＦＨ遺伝子座の作用によるものであり、残り（それぞれ４０％および３５％）はＣ２／ＢＦ遺伝子座によるものであることが分かる。機械学習モデルは、手作りモデルよりも優れており、有意により正しく臨床結果を予測することが可能となった。分類および回帰ツリー（Ｃ＆ＲＴ）解析によって、遺伝的アルゴリズム解析と同様のツリーが作成され、ＡＭＤにおけるＣ２／ＢＦの役割を裏付ける結果がもたらされた。コロンビアのデータセットを単独で用いると、Ｃ２／ＢＦ対立遺伝子の存在によって、Ｃ＆ＲＴモデルが症例の３７％を占めるが、アイオワを用いると３６％を占め、混合解析では２７％という僅かに低い効果を示した。これらの推定値はすべて、遺伝的アルゴリズム解析から推定された３５〜４０％というＣ２／ＢＦ遺伝子座の寄与度と整合している。これらの方法の詳細と具体的な解析については、実施例２に記載されている。
【０１７４】
ＢＦおよびＣ２は、神経網膜、ＲＰＥ、および脈絡膜で発現している。ヒト提供者の眼で、ＡＭＤに罹っている眼（６７歳と９４歳の２人の提供者）とＡＭＤに罹っていない眼（６９歳と８２歳の２人の提供者）から、単離されたＲＰＥ、ＲＰＥ／脈絡膜複合体、および神経網膜から、ＢＦおよびＣ２の遺伝子産物に対する適当なサイズのＰＣＲ単位複製配列が検出された（データを示さず）。ＢＦタンパク質は、ブルッフ膜内部の眼のドルーゼン、およびあまり顕著ではないが脈絡膜実質の中に存在した（図３Ａ）。Ｂａ（ＢＦに由来するペプチド）の免疫反応性はあまり顕著ではなかったが、ＲＰＥ細胞に関連した斑点、およびブルッフ膜全体には明らかに存在していた（図３Ｂ）。ＢＦの分布は、Ｃ３の分布に類似しており（図３Ｃ）、それらはともに、ＣＦＨおよびＣ５ｂ−９の分布と本質的に同一である（Ｈａｇｅｍａｎら、２００５、前掲）。
【０１７５】
要約すると、これらのデータは、補体経路関連遺伝子Ｃ２およびＢＦの変異体が、ＡＭＤと有意に関連していることを示している。Ｃ２／ＢＦ遺伝子座における防御型ハプロタイプは、第二補体活性化経路の重要な活性化因子であるＢＦ遺伝子に非同義ＳＮＰを含む。利用可能なデータにより、ＡＭＤ表現型が、異常なＢＦ活性によって調節されうるという仮説が裏付けられた。実際、３２位にグルタミンを含むＢＦタンパク質（防御型ハプロタイプをタグ付けする２種類のＢＦ ＳＮＰの一方から得られた）は、より高頻度のアルギニン３２型と較べて溶血作用が低いことが明らかになっている（ＬｏｋｋｉとＫｏｓｋｉｍｉｅｓ（１９９１）ｌｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３４：２４２−６）。同じ研究で、Ｒ３２Ｗ変異体についての機能的作用は実証されていないが、今回の研究では、ＡＭＤとの関連性はなかった。これらのデータに基づいて、本発明者らは、酵素活性が低下している活性化因子によって、ドルーゼンの形成およびＡＭＤをもたらしうる慢性的な補体反応に対するリスクの低下がもたらされることを示唆する。この仮説は、ＣＦＨの変異による第二補体カスケードの阻害が不十分であると、網膜色素上皮／ブルッフ膜界面における慢性的損傷をもたらすという本発明者らの提示内容と適合する（Ｈａｇｅｍａｎら、２００５、前掲；Ａｎｄｅｒｓｏｎ、２００２、前掲；Ｈａｇｅｍａｎ、２００１、前掲）。別のＢＦのｈｔＳＮＰであるＬ９Ｈはシグナルペプチド内に位置する。この変異体の機能的結果は直接には明らかになっていないものの、この変異体はＢＦの分泌を調節する可能性がある。
【０１７６】
遺伝子および機能に関するデータは、ＢＦにおける変異が、観察されたＡＭＤとの関連性の原因である可能性が高いことを示唆している。これは、ＢＦにおける２つのハプロタイプをタグ付けする変異体が非保存的な変異体であり、この２つのうち１つが直接の機能的関連性（低下した溶血作用）をもつと実証されているのに対し、Ｃ２における変異体は保存的変異であってイントロンのＳＮＰであるという事実に基づいている。また、ＢＦは、ＣＦＨも関与する経路である第二経路に直接関与する。しかしながら、特に、Ｃ２およびＢＦが、ともにＣ３の産生を制御していることから、Ｃ２の直接的な役割を無視することもできない。Ｃ２およびＢＦは、そのカルボキシ末端にセリンプロテアーゼドメインがあり、そのアミノ末端に３つのＣＣＰモジュールをもつなど、ほぼ同一の分子構造をもつ。ＢＦがＡＭＤの発病に関与する遺伝子であることのさらなる根拠は、ドルーゼンの組成の研究から生まれている。第二経路に関与する大多数のタンパク質（ＣＦＨ、ＢＦなど）がドルーゼンに存在するのに対し、Ｃ２やＣ４など古典的な経路からはそれらのアナログが見られない（Ｍｕｌｌｉｎｓら（２０００）Ｆａｓｅｂ Ｊ．１４：８３５−４６；Ｃｒａｂｂら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１４６８２−７）。これらのデータは、さらに、Ｃ２遺伝子におけるＳＮＰが、ＢＦとの広範なＬＤのために、ＡＭＤに関連することを示唆している。
【０１７７】
Ｃ２とＢＦの両方における、いくつかの一般的な機能的変異体が説明されている（ＤａｖｉｓとＦｏｒｒｉｓｔａｌ（１９８０）Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．９６：６３３−９；Ｒａｕｍら（１９７９）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．３１：３５−４１；Ａｌｐｅｒら（２００３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：２９７−３０５）が、これらのほとんどは稀なものである。シアトルＳＮＰプロジェクトのウェブサイト（ｗｗｗ．ｐｇａ．ｍｂｔ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／）で利用可能な両遺伝子に関する再配列決定データから判断したところ、欧州集団において２％よりも高い頻度をもつミスセンス対立遺伝子のすべてが解析された。さらに、本発明者らのハプロタイプであるＨ２、Ｈ５、およびＨ７の例など、いくつかのＨＬＡハプロタイプの完全長配列決定の後、どちらの遺伝子においてもそれ以上の非同義変異体は見つかっていない（Ｓｔｅｗａｒｔら（２００４）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１４：１１７６−８７）。
【０１７８】
Ｃ２およびＢＦは、炎症に関係する他の多くの遺伝子とともにＨＬＡ遺伝子座に存在しているため、本研究で観察された関連性が隣接する遺伝子とのＬＤによるものである可能性を考慮する必要がある。（ＬａｒｓｅｎとＡｌｐｅｒ（２００４）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：６６０−７）。しかし、５種類の証拠が、Ｃ２／ＢＦ遺伝子座が観察された関連性に対する主要な寄与因子であることを示唆している。まず、ＨａｐＭａｐデータでは、Ｃ２／ＢＦと隣接するクラスＩＩＩ遺伝子座との間には中度のＬＤしか見られないことが挙げられる。次に、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子座、ならびにＢＦハプロタイプであるＨ７およびＨ１０は強いＬＤを示さないことが挙げられる。第三に、Ｋｌｅｉｎら（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０８：３８５−９によって行われた全ゲノムスキャンでは、ＭＨＣ遺伝子座は、ＡＭＤと統計的に有意な関連性を示さなかった。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｍａｐｐｉｎｇ １００Ｋ Ａｒｒａｙを用いた彼らの解析は、ＭＨＣ遺伝子座の全域で８０のＳＮＰを含んでいたが、本研究でタイプ分けされた８種類のＳＮＰのいずれも含んでいなかった（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍ／ａｎａｌｙｓｉｓ／ｎｅｔａｆｆｘ／ｉｎｄｅｘ．ａｆｆｘ）。第四に、ＨａｐＭａｐデータから推定された組換え率から、Ｃ２／ＢＦ遺伝子座の両側に高い組換え領域があることが示されていることである（Ｍｙｅｒｓら（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１０：３２１−３２４）。最後に、ＡＭＤにおけるＭＨＣに関する、公表された１つの研究では、クラスＩ遺伝子座のＢ＊４００１（Ｐ＝０．０２７）およびクラスＩＩ遺伝子座ＤＲＢ１＊１３０１（Ｐ＝０．００９）について中度の防御が示されている（Ｇｏｖｅｒｄｈａｎら（２００５）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４６：１７２６−３４）。本研究で同定された防御型対立遺伝子は、実質的により高い統計的有意度でＡＭＤに関連しているため、Ｃ２／ＢＦの関連性が、ＭＨＣのこれらの遺伝子座および／または別の遺伝子座とのＬＤによるものであるという可能性は非常に低い。
【０１７９】
表１．ＤＨＰＬＣスクリーニングによって検出されたＢＦ遺伝子における配列変異体
【０１８０】
【表１】
表２．混合コロンビア・アイオワコホートにおけるＣ２／ＢＦ変異体の関連性解析
【０１８１】
【表２】
実施例２．Ｅｘｅｍｐｌａｒ統計学法
Ｓａｐｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅは、ＮＣＩと共同して遺伝子型判定データを解析した。ＮＣＩが、全部で約１３６０の試料を、遺伝子型判定された１０の２対立遺伝子ＳＮＰとともに提供した。このデータは、対立遺伝子を数値表現したものとともにＳａｐｉｏに提示された。このデータを、対立遺伝子を遺伝子型の数値表現に変えることによって（ＡＡについては「１１」が「１」となり、ＡＢについては「１２」が「２」となり、ＢＢについては「２２」が「３」となり、「００」はノーコールであり、「０」に変換された）、Ｅｘｅｍｐｌａｒを行いやすいフォーマットに変換し、また試料の重複を排除するためにスクリプトを書いた。表現型は加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）であった。同定されたＡＭＤにはいくつかのサブクラスがあったが、本解析では、データを全体として用いて、さまざまなＡＭＤ表現型の基となる共通した遺伝子型があるか否かを判定した。
【０１８２】
Ｓａｐｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅは、Ｅｘｅｍｐｌａｒ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｕｉｔｅを利用して、供給されたデータを解析した。Ｅｘｅｍｐｌａｒは、症例−対照研究のためにいくつかの関連性に基づく解析を行う。この解析に用いられたモジュールは以下の通りである。
・遺伝的アルゴリズムモジュール（ＧＡモジュール）−このモジュールは、ＳＮＰ（モデル）に基づく実験の論理結合を発見するための機械学習法を行う。
・関連性実験モジュール（ＡＳモジュール）−このモジュールは、カイ二乗、イェーツ法、フィッシャーの正確確率検定、オッズ比、相対危険率、連鎖不平衡、Ｄ’、ｒ２、およびハプロタイプ推定のような多くの有用な統計値を計算する。
【０１８３】
Ｅｘｅｍｐｌａｒは、一般的には、表現型に相関するモデルを発見する。言い換えると、モデルによって、その表現型からの防御ではなく、その表現型を得るのに寄与する因子を予測するのであるが、このモデルから防御因子を推測することは可能である。例えば、あるモデルが、ＲＳ００１がＢＢであるか、またはＲＳ００１がＡＢである試料が、その表現型と相関することを示しているのであれば、ＲＳ００１がＡＡである試料は、その表現型から防御されると推測することができよう。
【０１８４】
Ｅｘｅｍｐｌａｒモデルは、ＳＮＰの論理結合である。このモデルは、仮説を検証するために手作りすることもできるし、遺伝的アルゴリズムを利用して、高い有用性をもつモデルを見つけるための試みを行うことも可能である。遺伝的アルゴリズムは、大きなデータ領域内でパターンを見つけるのを得意とする機械学習法である。ＧＡは、３分の２・３分の１妥当性確認法を利用している。これは、症例者および対照者の２／３を無作為に訓練セットに振り分けることによって行われる。そして、ＧＡは、この訓練セットに関するモデルを学習する。学習期を終わると、最も効率のよいモデルを試験セット（データの残り１／３）に適用する。試験および訓練を通じて最も効率のよいモデルがユーザに戻される。本研究では、少数のＳＮＰだけが調べられていたとしても、試料数が多いため、すべてのデータを通じて適用できるパターンを人間が効果的に区別することは困難であった。このため、より有用性が高い、より複雑なパターンを見つけるためにＧＡを利用した。伝統的な手法に対するこれらのタイプのモデルの有益性は、予測を行う際にゲノム全体から多数の遺伝子座を取り込むことができる点にある。これによって、１つのモデルで、何が、しばしば結果と相関する多型の複合的な相互作用となるかを同定することが可能になる。
【０１８５】
本研究は、ＡＭＤに対して防御的なモデルを発見することに注目したという点でユニークなものであった。これは、加法モデルを発見するという、通常のＥｘｅｍｐｌａｒ法から逸脱しているため、入力データに変更を加えなければならなかった。Ｅｘｅｍｐｌａｒに対し、症例者が対照者であり、その逆も同様であると指示するだけで、それは、ある試料がその表現型を獲得しなかった理由を明らかにするモデルを学習する。すなわち、防御を付与したＳＮＰの組み合わせを見つけようとしていた。
【０１８６】
研究グループ情報：データは、アイオワコホートおよびコロンビアコホートという、２つの別々のコホートから提供された。コロンビアのデータは、５６０人が症例者、および２７０人が対照者である、全部で約８３０人の試料をもつ大きなグループであった。アイオワコホートは、４１４人の症例者および１１５人の対照者による全部で約５２９人の試料を有していた。２つの試料グループがあったため、モデル構築を、一方のコホートにはＧＡモジュールを用いて行ない、得られたモデルのサンプル外（ｏｕｔ−ｏｆ−ｓａｍｐｌｅ）効率を他方のコホートで検定することが可能であった。
【０１８７】
研究結果：入力したデータセットの中で各ＳＮＰ／遺伝子型について多数の統計値が生成された。統計値は、２×２分割表を作成し、遺伝子型を適正にカウントすることによって作成された（これは対立遺伝子のカウントではなく、計算されていない２つの遺伝子型を１つの値に崩壊させた遺伝子型カウントであることに留意されたい）。２×２分割表の各セルの値は、症例（真）、症例（偽）、対照（真）、対照（偽）という見出しの下に表の中に記載されている。すべての統計値は両側計算値であった。
【０１８８】
表３から表６は、アイオワコホートとコロンビアコホートに関する統計値を並列して示している。注：「カテゴリー」欄は、１がＡＡに相当し、２がＡＢに、また３がＢＢに相当する遺伝子型である。表７は、混合コホートに関する統計値を示している。
【０１８９】
表３．コロンビアとアイオワを並列させたカイ二乗統計値
【０１９０】
【表３】
表４．コロンビアとアイオワを並列させたカイ二乗イェーツ統計値
【０１９１】
【表４】
表５．コロンビアとアイオワを並列させたフィッシャー正確確率統計値
【０１９２】
【表５】
表６．コロンビアとアイオワを並列させたオッズ比統計値
【０１９３】
【表６】
表７．混合コホートのカイ二乗統計値
【０１９４】
【表７】
表８．混合コホートのカイ二乗イェーツ統計値
【０１９５】
【表８】
表９．混合コホートのフィッシャー正確確率統計値
【０１９６】
【表９】
表１０．混合コホートのオッズ比統計値
【０１９７】
【表１０】
明らかに、これらのＳＮＰの多くは、両コホートにおいて非常に統計的に有意であった。これは、主に、本研究のための選択をもたらしたアプリオリな情報のせいであった。特に注意すべきは、フィッシャー値がｐ＜４．８１Ｅ−２０であって３（Ｔ／Ｔとして知られるＢＢ）であるＲＳ１０６１１７０であって、防御型の遺伝子型としての強力な可能性があることを示している。並列比較で、アイオワコホートとコロンビアコホートの間にはいくつかの違いがあることが明らかになった。
【０１９８】
どのＳＮＰ／遺伝子型が防御型または寄与型であるかをさらに測定するために、フィッシャー法を、遺伝子型浸透分散（ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ ｖａｒｉａｎｃｅ）の基礎として用いた。これを行うために、症例者および対照者の遺伝子型の割合を計算し、それらの差異の絶対値を計算した。表１１は、この情報を提供し、差異の頻度が高いものの順に並べられている。
【０１９９】
表１１．遺伝子型浸透分散
【０２００】
【表１１】
仮定された防御モデル：本研究では、予備実験で、ＡＭＤから防御すると可能性があると思われるＳＮＰの組み合わせが示された。この仮説を検定するために、ＮＣＩの詳細な説明について手作りモデルを構築した。モデル図を図２Ａに示す。このモデルは、仮定（ＩＦ）文として以下のように記載されうる：
ＲＳ５４７１５４がＧ／Ａであり、かつＲＳ１０６１１７０がＴ／Ｔであるか、または
ＲＳ５４７１５４がＧ／Ａであり、かつＲＳ１０６１１７０がＣ／Ｃであるか、または
ＲＳ４１５１６６７がＴ／Ａであり、かつＲＳ１０６１１７０がＣ／Ｔであるか、または
ＲＳ４１５１６６７がＴ／Ａであり、かつＲＳ１０６１１７０がＣ／Ｃである場合には、
この人物は、ＡＭＤから防御されている。
【０２０１】
したがって、このモデルは、ＡＭＤから防御する可能性がある遺伝子型の以下の４つの組み合わせ（モデルが「真」になる組み合わせ）を与える：
１．Ｇ／ＡであるＲＳ５４７１５４、およびＴ／ＴであるＲＳ１０６１１７０
対照者 ８．８２％、症例者 ５．４５％
２．Ｇ／ＡであるＲＳ５４７１５４、およびＣ／ＣであるＲＳ１０６１１７０
対照者 ７．２２％、症例者 １．９３％
３．Ｔ／ＡであるＲＳ４１５１６６７、およびＣ／ＴであるＲＳ１０６１１７０
対照者 ４．８％、症例者 ２．０２％
４．Ｔ／ＡであるＲＳ４１５１６６７、およびＣ／ＣであるＲＳ１０６１１７０
対照者 ３．４７％、症例者 ．７９％。
【０２０２】
このモデルを試料に対して適用すると、アイオワおよびコロンビアの混合コホートについて以下の結果が得られた：
・７９４人の症例者は、防御因子を持っていなかった（モデルは偽であった）．．．９０．１２％
・８８人の対照者は、防御因子を持っていた（モデルは真であった）．．．２３．５２％
・８７人の症例者は、防御因子を持っていた．．．９．８８％
・２８６人の対照者は、防御因子を持っていなかった．．．７６．４７
注：すべてのモデルに関する統計値は、モデルを混合コホートに対して適用し、その真陽性（ＴＰ）、偽陰性（ＦＮ）、偽陽性（ＦＰ）、および真陰性（ＴＮ）の割合を見た。そして、これらの数字を、すべての統計値が作成された２×２表に入れた。表１２は、各コホートに対する統計値を示している。
【０２０３】
表１２．ＮＣＩが仮定した防御モデル統計値
【表１２】
遺伝的アルゴリズム（ＧＡ）から得られたモデル：ＧＡモジュールがＳＮＰのより良好な組み合わせを見つけることができたか否かを見ようとして、ＧＡモジュールを作動させて、反転データに対するモデルを学習させた（防御型モデルを学習させるため）。以下のものを含む、さまざまなパラメータ設定値を利用した：
・モデルタイプ：該モデルが、「かつ（ＡＮＤ）」および「または（ＯＲ）」の組み合わせ、および「ＡＮＤ」だけ、または「ＯＲ」だけをもつか否かを示している。
・モデルサイズ：いくつのＳＮＰがモデルの中に存在しうるかについての上限値を示す。
・ＧＡ特異的パラメータ：例えば、世代、モデル数など。
【０２０４】
一般的に言えば、小規模のＡＮＤだけからなるモデルが好ましい。その理由は２つある。第一に、ＡＮＤだけからなるモデルでは、真であるべきモデルに対してそのＳＮＰのすべてが真であることを要求されるため、その解釈は一義的であるが、ＯＲをもつモデルでは、真であるべきモデルに対して全てのＳＮＰが存在することは要求されないため、一定レベルの不確定さが入り込むことである。第二に、測定すべきＳＮＰが少なくなるため、モデルが小さいほど解釈が楽になることである。
【０２０５】
Ｅｘｅｍｐｌａｒは、より一般的に適用可能な結果になるという所望の成果による入力データに対する過学習を避けるために、３分の２・３分の１妥当性確認法を用いている。
【０２０６】
さらに、２つの別々の実験グループがあったことから、コロンビアのデータだけに基づいたモデルを構築し、得られたモデルをアイオワコホートに対して検定することが可能であった。このモデルの成績が、２つのグループを通じて整合していれば、このモデルの一般的適用性が強く示されることとなる。これは、上記統計学の項において議論したような、この２つのグループ間における興味深い統計的差異を考えると、特に興味深い。このような変異を考えると、ＧＡによって、コロンビアのデータについては高い適合モデルを見つけることができるが、アイオワデータについては成績がよくないと思われる。
【０２０７】
ＧＡによって、コロンビア、アイオワ、および混合グループのデータセット全体について良好な成績を得たモデルが見つけられた。このモデルがコロンビアのデータに対して学習させられていたことから、予想通りコロンビアのデータに対するモデルの成績の方がアイオワデータよりも優れていた。それにもかかわらず、ＧＡがアイオワのデータについて事前の知識がなく、２つのコホート間で主なＳＮＰの間に有意な統計的差異があったことを考えると、このモデルの成績は特筆すべきものである。得られた最適なモデルは、混合コホートについて手作りで仮定されたモデルよりも成績がよかった（ＲＳ１０６１１７０）。まず、このモデルは、「ＩＮＤＥＬＴＴがホモ接合であり、かつ（ＡＮＤ）ＲＳ５４７１５４がＧＧである」という、もう一つのセクションを含んでいたが、さらに調べてみたところ、このセクションはモデル解釈とは無関係であると判定されたため、これを排除して、同一の成績をもつモデルを作成した。最終的なモデル図を、図２Ｃで見ることができる。
【０２０８】
このタスクのためのＧＡ特異的オプションは以下の通りであった：
モデル：１５００−これは、モデルの新しい世代を発展させるための基礎として、ＧＡが内部的に構築したモデルの数である；
反復：２５−これは、解を見つけるまでにモデルが検討された進化的反復（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｉｔｅｒａｔｉｏｎｓ）の回数である；
モデルサイズ：５−これは、モデルに、単一のモデルにおいて最大１６の遺伝子型を出現させることができるサイズである；
モデル型：ＡＮＤ／ＯＲ型−これは、ＧＡに、かつ型およびまたは型の両方を使用できるモデルを構築させる。
【０２０９】
このモデルは、仮定文で以下のように書き表すことができる：
ＲＳ１０４８７０９がＧ／Ｇであり、かつＲＳ１０６１１７０がＴ／Ｔであるか、または
ＲＳ５４７１５４がＧ／Ａであるか、または
ＲＳ４１５１６６７がＴ／Ａであるか、または
ＩＮＤＥＬＴＴが＋／＋であれば、
この人物は、ＡＭＤから防御されている。
【０２１０】
このモデルは、ＡＭＤから防御する以下の４つの個別の遺伝子型、または遺伝子型の組み合わせを与える（モデルが「真」となる組み合わせ）：
１．ＲＳ１０４８７０９がＧ／Ｇ、およびＲＳ１０６１１７０がＴ／Ｔ
・１４．２０％の症例者、３４．３１％の対照者で存在
２．ＲＳ５４７１５４がＧ／Ａ
・９．６％の症例者、１８．３２％の対照者で存在
３．ＲＳ４１５１６６７がＴ／Ａ
・４．２％の症例者、９．９２％の対照者で存在
４．ＩＮＤＥＬＴＴが＋／＋
・１．４５％の症例者、６．８６％の対照者で存在
このモデルを試料に対して適用すると、アイオワおよびコロンビアの混合コホートについて以下の結果となる：
・６８２人の症例者（７４．７８％）は防御因子をもたず、２３０人はもっていた。
【０２１１】
・２０４人の対照者（５５．７４％）は防御因子をもち、１６２人はもっていなかった。
【０２１２】
表１３は、各コホートについての統計値を示している。ＧＡは、ボード全体にわたって良好な成績を上げた。全体として、このモデルによって記述された防御因子をもつ者は、防御因子を持たないものよりも３．６５８１倍ＡＭＤになりにくかった。
【０２１３】
表１３．遺伝的アルゴリズムから得られたモデル統計値
【０２１４】
【表１３】
この２つのコホート間におけるいくつかの主要ＳＮＰには明確な統計学的差異があることを考えると、より正確に転帰／防御を予測する単一のモデルを発見することがヒトにとっても、機械学習にとっても同じように難問であった。手作りモデルは、立派な成績を上げ、興味深いことに、ＳＮＰをＯＲで同一にまとめるなど、ＧＡが同定したのと同じＳＮＰのヘテロ接合的組み合わせを同定した（ＡＢであるＲＳ５４７１５４、ＡＢであるＲＳ４１５１６６７）。
【０２１５】
このタスクが困難であるにもかかわらず、ＧＡは、外挿検定（ｏｕｔ ｏｆ ｓａｍｐｌｅ ｔｅｓｔ）について良好な成績を上げた（フィッシャー値アイオワｐ＜０．００００７４９）。ＧＡは、すべてのコホートについて、手作りモデルよりも優れていた。それにもかかわらず、手作りモデルは、非常に適正に結果を予測するジョブを行う。このモデルの他の改変モデルをテストしたが、その成績を上げることはできなかった。ＳＮＰ／遺伝子型／論理演算子の組み合わせには多くの可能性があることを考えると、これは予想されることであるから、適当な時間枠の中で何万ものモデル変動を検定することができる機械学習法の値となる。
【０２１６】
単一のＳＮＰの高い統計学的有意性（Ｔ／ＴであるＲＳ１０６１１７０：×２＝９７．２５）を考えて、それだけでＡＭＤのリスクを予測できると結論するかもしれない。単一のＳＮＰのモデルまたは複数遺伝子座のモデルが一般集団における防御を予測するのに適している可能性があるかをテストするために、データに対して並べ替え検定を行った。並べ替え検定によって、単一のＳＮＰでは、ＧＡによるモデル、または手作りモデルのいずれよりも、データのランダム混合による方が、３０００回の並べ替えに対してカイ二乗スコアが４．８１５３であるのに対して、ＧＡでは３．３１５７、および手作りモデルでは１．２２０７となって、統計学的に有意な結果を生じる可能性がずっと高いことが示された。オッズ比評価について、単一ＳＮＰでは、ＯＲ＞１．５で６２５の並べ替えがあるのに対し、ＧＡモデルでは１３３、また手作りモデルでは４６であった。この手作りモデルは、単に、どの試料でも稀にしか存在しない遺伝子型の組み合わせを表しているだけである。結局、ＧＡモデルが、もっとも正しい症例対照成績および並べ替えの結果を示した。
【０２１７】
モデル統計学、ＲＯＣプロット、および並べ替え検定を総合的に眺めると、転帰を予測するための多遺伝子座モデル法の方が、多様なグループにわたる単一の遺伝子座よりも優れていると思われる。
結論
結論として、本研究は、ＡＭＤの病理生物学における第二補体経路の役割を広く示すとともに精緻化し、また、感染および／または炎症が、この普遍的な疾患において主要な役割を果たすという提案モデルをさらに強化している（Ｈａｇｅｍａｎら、２００５、前掲；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２００２、前掲；Ｈａｇｅｍａｎら、２００１、前掲）。
【０２１８】
実施例３．ＡＭＤの発症を予防するための防御型ＢＦタンパク質またはＣ２タンパク質の投与
対象は、ドルーゼンを含む、ＡＭＤの兆候および／または症状を呈している。この対象は、防御型多型である、ＢＦにおけるＲ３２ＱおよびＬ９Ｈ、ならびにＣ２におけるＩＶＳ １０およびＥ３１８Ｄについては陰性と判定されている。この対象は、防御型ＢＦタンパク質（Ｒ３２Ｑ多型を有する）で治療することを推奨されている。この対象に、ＢＦの血清濃度が９から３１ｍｇ／ｄＬになるのに十分な量の防御型ＢＦを生理食塩水に入れて、６ヶ月間月に１回静脈に投与する。この時、ドルーゼン、ならびにＡＭＤの他の兆候および／または症状がないか、対象を観察する。ＡＭＤの兆候および／または症状が進行していなければ、指示された頻度で、しかし、少なくとも半年に１回の頻度で患者の臨床状態を観察しながら、防御型ＢＦの投与を月に１回ずつ無期限に継続する。
【０２１９】
別の臨床投薬計画では、防御型ＢＦタンパク質を１日に１回鼻腔内に投与して、より持続的にこのタンパク質の防御作用に暴露する。
【０２２０】
本明細書に記載されたすべての刊行物および特許出願は、本発明が属する技術分野における技術水準を示すものである。すべての刊行物および特許出願は、各刊行物および特許出願が具体的かつ個別に参照して本明細書に組み込まれると記載されているものとして、参照されて本明細書に組み込まれる。
【０２２１】
本発明の原理を利用することができる多くの可能な実施形態を考慮すると、例示された実施形態は、本発明の好適な実施例に過ぎないと認識されるべきであって、本発明の範囲を制限するものと考えるべきではない。むしろ、本発明の範囲は下記の請求項によって規定される。したがって、本発明者らは、本発明はすべて、それらの請求項の範囲と趣旨に含まれるものであると主張する。
【図面の簡単な説明】
【０２２２】
【図１】ＢＦおよびＣ２におけるＳＮＰの略図とハプロタイプ解析結果である。本研究で使用されたＳＮＰを、予測されたハプロタイプ、オッズ比（ＯＲ）Ｐ値（Ｐ）、および組み合わせた場合（ＣＡＳ）と対照（ＣＯＮ）の各頻度とともに示している。Ｈ７に対する９５％信頼区間は（０．３３−０．６１）であり、Ｈ１０に対しては（０．２３−０．５６）である。祖先（チンパンジー）のハプロタイプはＡｎｃと表されている。ハプロタイプＨ２（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＬ６６２８４９の２００６年２月８日に利用可能であったもの）、ハプロタイプＨ５（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＬ６４５９２２およびＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＧ＿００４６５８の２００６年２月８日に利用可能であったもの）、およびハプロタイプＨ７（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＧ＿００００１３の２００６年２月８日に利用可能であったもの）の各例が配列決定されており、Ｃ２遺伝子にもＢＦ遺伝子にも、これ以外に非同義変異体は存在しない（Ｓｔｅｗａｒｔら（２００４）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１４：１１７６−８７）。
【図２Ａ】組み合わせ相補遺伝子解析を示している。個別のＳＮＰ解析によって、個体をＡＭＤ発症から保護する、いくつかのＳＮＰの組み合わせが可能であることが明らかになった。これらをテストするために、まず経験的モデルを適用した。図２Ａは、ＡＭＤから防御する可能性のある４つの遺伝子型の組み合わせになると解釈される、モデル図を示している。それらは、（１）ｒｓ６４１１５３（Ｒ３２Ｑ）がＧ／Ａ、およびｒｓｌ０６１１７０（Ｙ４０２Ｈ）がＣ／Ｔ；（２）ｒｓ５４７１５４がＧ／Ａ、およびｒｓｌ０６１１７０がＣ／Ｃ；（３）ｒｓ４１５１６６７（Ｌ９Ｈ）がＴ／Ａ、およびｒｓｌ０６１１７０がＣ／Ｔ；（４）ｒｓ４１５１６６７がＴ／Ａ、およびｒｓｌ０６１１７０がＣ／Ｃ。これらのモデルを適用したところ、アイオワコホート、コロンビアコホート、および混合コホートのそれぞれについて、図２Ｂに示す分布が得られた。これらの分布に対して、フィッシャーの正確確率検定を行い、ｐ値がＰ＝０．００２３７、Ｐ＝４．２８×１０−８、およびＰ＝７．９０×１０−１０であることを証明した。比較のために、模範的なソフトウェアで、遺伝的アルゴリズムとして知られている機械学習法を用いて、データに対し「最良適合度」をもたらす防御モデルを作成した。その結果得られた最良のモデルを図２Ｃに示す。このモデルは、ＡＭＤから防御する以下の可能性のある４つの個別の遺伝子型または遺伝子型の組み合わせ、すなわち、モデルが「真」となる組み合わせを説明している。これらの遺伝子型は、（１）ｒｓ１０４８７０９（Ｒ１５０Ｒ）がＧ／Ｇ、およびｒｓ１０６１１７０がＣ／Ｃ；または（２）ｒｓ５４７１５４がＧ／Ａ；または（３）ｒｓ４１５１６６７がＴ／Ａ；または（４）ＣＦＨイントロン１変異体がｄｅｌＴＴ。モデルの成績を、アイオワコホート、コロンビアコホート、および混合コホートについて図２Ｄに示す。これらの分布によってｐ値がそれぞれＰ＝７．４９×１０−５、Ｐ＝２．９７×１０−２２、およびＰ＝１．６９×１０−２３であることが証明された。
【図２Ｂ】組み合わせ相補遺伝子解析を示している。個別のＳＮＰ解析によって、個体をＡＭＤ発症から保護する、いくつかのＳＮＰの組み合わせが可能であることが明らかになった。これらをテストするために、まず経験的モデルを適用した。図２Ａは、ＡＭＤから防御する可能性のある４つの遺伝子型の組み合わせになると解釈される、モデル図を示している。それらは、（１）ｒｓ６４１１５３（Ｒ３２Ｑ）がＧ／Ａ、およびｒｓｌ０６１１７０（Ｙ４０２Ｈ）がＣ／Ｔ；（２）ｒｓ５４７１５４がＧ／Ａ、およびｒｓｌ０６１１７０がＣ／Ｃ；（３）ｒｓ４１５１６６７（Ｌ９Ｈ）がＴ／Ａ、およびｒｓｌ０６１１７０がＣ／Ｔ；（４）ｒｓ４１５１６６７がＴ／Ａ、およびｒｓｌ０６１１７０がＣ／Ｃ。これらのモデルを適用したところ、アイオワコホート、コロンビアコホート、および混合コホートのそれぞれについて、図２Ｂに示す分布が得られた。これらの分布に対して、フィッシャーの正確確率検定を行い、ｐ値がＰ＝０．００２３７、Ｐ＝４．２８×１０−８、およびＰ＝７．９０×１０−１０であることを証明した。比較のために、模範的なソフトウェアで、遺伝的アルゴリズムとして知られている機械学習法を用いて、データに対し「最良適合度」をもたらす防御モデルを作成した。その結果得られた最良のモデルを図２Ｃに示す。このモデルは、ＡＭＤから防御する以下の可能性のある４つの個別の遺伝子型または遺伝子型の組み合わせ、すなわち、モデルが「真」となる組み合わせを説明している。これらの遺伝子型は、（１）ｒｓ１０４８７０９（Ｒ１５０Ｒ）がＧ／Ｇ、およびｒｓ１０６１１７０がＣ／Ｃ；または（２）ｒｓ５４７１５４がＧ／Ａ；または（３）ｒｓ４１５１６６７がＴ／Ａ；または（４）ＣＦＨイントロン１変異体がｄｅｌＴＴ。モデルの成績を、アイオワコホート、コロンビアコホート、および混合コホートについて図２Ｄに示す。これらの分布によってｐ値がそれぞれＰ＝７．４９×１０−５、Ｐ＝２．９７×１０−２２、およびＰ＝１．６９×１０−２３であることが証明された。
【図２Ｃ】組み合わせ相補遺伝子解析を示している。個別のＳＮＰ解析によって、個体をＡＭＤ発症から保護する、いくつかのＳＮＰの組み合わせが可能であることが明らかになった。これらをテストするために、まず経験的モデルを適用した。図２Ａは、ＡＭＤから防御する可能性のある４つの遺伝子型の組み合わせになると解釈される、モデル図を示している。それらは、（１）ｒｓ６４１１５３（Ｒ３２Ｑ）がＧ／Ａ、およびｒｓｌ０６１１７０（Ｙ４０２Ｈ）がＣ／Ｔ；（２）ｒｓ５４７１５４がＧ／Ａ、およびｒｓｌ０６１１７０がＣ／Ｃ；（３）ｒｓ４１５１６６７（Ｌ９Ｈ）がＴ／Ａ、およびｒｓｌ０６１１７０がＣ／Ｔ；（４）ｒｓ４１５１６６７がＴ／Ａ、およびｒｓｌ０６１１７０がＣ／Ｃ。これらのモデルを適用したところ、アイオワコホート、コロンビアコホート、および混合コホートのそれぞれについて、図２Ｂに示す分布が得られた。これらの分布に対して、フィッシャーの正確確率検定を行い、ｐ値がＰ＝０．００２３７、Ｐ＝４．２８×１０−８、およびＰ＝７．９０×１０−１０であることを証明した。比較のために、模範的なソフトウェアで、遺伝的アルゴリズムとして知られている機械学習法を用いて、データに対し「最良適合度」をもたらす防御モデルを作成した。その結果得られた最良のモデルを図２Ｃに示す。このモデルは、ＡＭＤから防御する以下の可能性のある４つの個別の遺伝子型または遺伝子型の組み合わせ、すなわち、モデルが「真」となる組み合わせを説明している。これらの遺伝子型は、（１）ｒｓ１０４８７０９（Ｒ１５０Ｒ）がＧ／Ｇ、およびｒｓ１０６１１７０がＣ／Ｃ；または（２）ｒｓ５４７１５４がＧ／Ａ；または（３）ｒｓ４１５１６６７がＴ／Ａ；または（４）ＣＦＨイントロン１変異体がｄｅｌＴＴ。モデルの成績を、アイオワコホート、コロンビアコホート、および混合コホートについて図２Ｄに示す。これらの分布によってｐ値がそれぞれＰ＝７．４９×１０−５、Ｐ＝２．９７×１０−２２、およびＰ＝１．６９×１０−２３であることが証明された。
【図２Ｄ】組み合わせ相補遺伝子解析を示している。個別のＳＮＰ解析によって、個体をＡＭＤ発症から保護する、いくつかのＳＮＰの組み合わせが可能であることが明らかになった。これらをテストするために、まず経験的モデルを適用した。図２Ａは、ＡＭＤから防御する可能性のある４つの遺伝子型の組み合わせになると解釈される、モデル図を示している。それらは、（１）ｒｓ６４１１５３（Ｒ３２Ｑ）がＧ／Ａ、およびｒｓｌ０６１１７０（Ｙ４０２Ｈ）がＣ／Ｔ；（２）ｒｓ５４７１５４がＧ／Ａ、およびｒｓｌ０６１１７０がＣ／Ｃ；（３）ｒｓ４１５１６６７（Ｌ９Ｈ）がＴ／Ａ、およびｒｓｌ０６１１７０がＣ／Ｔ；（４）ｒｓ４１５１６６７がＴ／Ａ、およびｒｓｌ０６１１７０がＣ／Ｃ。これらのモデルを適用したところ、アイオワコホート、コロンビアコホート、および混合コホートのそれぞれについて、図２Ｂに示す分布が得られた。これらの分布に対して、フィッシャーの正確確率検定を行い、ｐ値がＰ＝０．００２３７、Ｐ＝４．２８×１０−８、およびＰ＝７．９０×１０−１０であることを証明した。比較のために、模範的なソフトウェアで、遺伝的アルゴリズムとして知られている機械学習法を用いて、データに対し「最良適合度」をもたらす防御モデルを作成した。その結果得られた最良のモデルを図２Ｃに示す。このモデルは、ＡＭＤから防御する以下の可能性のある４つの個別の遺伝子型または遺伝子型の組み合わせ、すなわち、モデルが「真」となる組み合わせを説明している。これらの遺伝子型は、（１）ｒｓ１０４８７０９（Ｒ１５０Ｒ）がＧ／Ｇ、およびｒｓ１０６１１７０がＣ／Ｃ；または（２）ｒｓ５４７１５４がＧ／Ａ；または（３）ｒｓ４１５１６６７がＴ／Ａ；または（４）ＣＦＨイントロン１変異体がｄｅｌＴＴ。モデルの成績を、アイオワコホート、コロンビアコホート、および混合コホートについて図２Ｄに示す。これらの分布によってｐ値がそれぞれＰ＝７．４９×１０−５、Ｐ＝２．９７×１０−２２、およびＰ＝１．６９×１０−２３であることが証明された。
【図３】初期段階のＡＭＤに罹った７２歳の高齢者ドナーの固定されていない眼（ｕｎｆｉｘｅｄ ｅｙｅ）から得られた切片における、網膜色素上皮（ＲＰＥ）−脈絡膜（ＣＨ）複合体に沿ったＢＦ（図３Ａ）、Ｂａ（全長Ｂ因子の断片）（図３Ｂ）、およびＣ３（図３Ｃ）の免疫局在性を示している。抗ＢＦ抗体（Ｑｕｉｄｅｌ；反応産物は赤色）は、特にそれらの周縁に沿ってドルーゼン（Ｄ）を、また、ブルッフ膜および脈絡膜実質（ｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｓｔｒｏｍａ）を標識する。抗Ｂａ抗体（Ｑｕｉｄｅｌ；反応産物は紫色）は、ブルッフ膜およびＲＰＥ結合パッチ（ＲＰＥ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐａｔｃｈｅｓ）を標識する。ＢＦの分布は、Ｃ３の分布と同様であることに注意されたい。ＲＰＥの細胞質および脈絡膜における茶色の着色はメラニンによるものである。ブルッフ膜（ＢＭ）；網膜（Ｒ）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第二補体カスケードの調節異常を特徴とする、黄斑変性症などの疾患を発症するリスク、またはそれが進行している可能性をヒト対象において評価する方法であって、以下の工程を含む方法：
ｉ）ヒト対象から生体試料を得る工程；
ｉｉ）該試料を分析して、該対象が、以下のａ）〜ｄ）の１つ以上を有するか否かを判定する工程：
ａ）補体Ｂ因子（ＢＦ）遺伝子のｒｓ６４１１５３においてＡまたはＧ、または該ＢＦタンパク質の３２位においてＲまたはＱ；
ｂ）該ＢＦ遺伝子のｒｓ４１５１６６７においてＡまたはＴ、または該ＢＦタンパク質の９位においてＬまたはＨ；
ｃ）Ｃ２遺伝子のｒｓ５４７１５４においてＧまたはＴ；および
ｄ）該Ｃ２遺伝子のｒｓ９３３２３７９においてＣまたはＧ、または該Ｃ２タンパク質の３１８位においてＥまたはＤ。
【請求項２】
さらに、前記対象が、以下のａ）〜ｂ）の１つ以上を有するか否かを判定する工程を含む、請求項１記載の方法：
ａ）補体Ｈ因子（ＣＦＨ）遺伝子においてｄｅｌＴＴ；および
ｂ）ＣＦＨ遺伝子のｒｓ１０６１１７０においてＣまたはＴ、または該ＣＦＨタンパク質の４０２位においてＹまたはＨ。
【請求項３】
前記対象が黄斑変性症について無症状である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記対象が黄斑変性症の症状をもつ、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記試料が、利用可能な体液である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記対象の細胞から遺伝子型を検出することを含む、請求項１記載の方法
【請求項７】
前記対象におけるタンパク質変異体を検出することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記対象の細胞からｍＲＮＡを検出することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
さらに、前記対象が前記多型についてホモ接合であるかヘテロ接合であるかを判定することを含む、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
第二補体カスケードの調節異常を特徴とする、黄斑変性症を含む疾患を発症するリスク、または該疾患が進行している可能性をヒト対象において評価するキットであって、該対象由来の試料において以下の１つ以上の多型または１つ以上の対立遺伝子変異体を検出するための試薬を含むキット：
ａ）補体Ｂ因子（ＢＦ）遺伝子のｒｓ６４１１５３においてＡまたはＧ、または該ＢＦタンパク質の３２位においてＲまたはＱ；
ｂ）該ＢＦ遺伝子のｒｓ４１５１６６７においてＡまたはＴ、または該ＢＦタンパク質の９位においてＬまたはＨ；
ｃ）Ｃ２遺伝子のｒｓ５４７１５４においてＧまたはＴ；および
ｄ）該Ｃ２遺伝子のｒｓ９３３２３７９においてＣまたはＧ、または該Ｃ２タンパク質の３１８位においてＥまたはＤ。
【請求項１１】
前記対象から得た試料において以下の１つ以上の多型または１つ以上の対立遺伝子変異体を検出するための試薬を含む、請求項１０記載のキット：
ａ）補体Ｈ因子（ＣＦＨ）遺伝子においてｄｅｌＴＴ；および
ｂ）ＣＦＨ遺伝子のｒｓ１０６１１７０においてＣまたはＴ、または該ＣＦＨタンパク質の４０２位においてＹまたはＨ。
【請求項１２】
２つ以上の多型または２つ以上の対立遺伝子変異体を検出するための試薬を含む、請求項１０記載のキット。
【請求項１３】
前記多型を検出するオリゴヌクレオチドを含む、請求項１０記載のキット。
【請求項１４】
前記多型を含む標的ポリヌクレオチド配列を増幅するための試薬をさらに含む、請求項１０記載のキット。
【請求項１５】
固体支持体上に固定されたオリゴヌクレオチドを含む、請求項１０記載のキット。
【請求項１６】
前記対立遺伝子変異体を認識して特異的に結合する特異的結合タンパク質を含む、請求項１０記載のキット。
【請求項１７】
ストリンジェントな条件下で、以下のａ）〜ｄ）からなる群から選択される防御型多型をもつ１つ以上の核酸分子にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブを含むマイクロアレイ：
ａ）ＢＦ内のＲ３２Ｑ（ｒｓ６４１１５３）；
ｂ）ＢＦ内のＬ９Ｈ（ｒｓ４１５１６６７）；
ｃ）Ｃ２内のＩＶＳ １０（ｒｓ５４７１５４）；および
ｄ）Ｃ２内のＥ３１８Ｄ（ｒｓ９３３２７３９）。
【請求項１８】
ストリンジェントな条件下で、以下のａ）〜ｃ）からなる群から選択される多型をもつ１つ以上の核酸分子にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブをさらに含む、請求項１７記載のマイクロアレイ：
ａ）ＣＦＨ内のｄｅｌＴＴ多型；
ｂ）ＢＦ内のＲ１５０Ｒ多型；および
ｃ）ＣＦＨ内のＹ４０２Ｈ多型。
【請求項１】
第二補体カスケードの調節異常を特徴とする、黄斑変性症などの疾患を発症するリスク、またはそれが進行している可能性をヒト対象において評価する方法であって、以下の工程を含む方法：
ｉ）ヒト対象から生体試料を得る工程；
ｉｉ）該試料を分析して、該対象が、以下のａ）〜ｄ）の１つ以上を有するか否かを判定する工程：
ａ）補体Ｂ因子（ＢＦ）遺伝子のｒｓ６４１１５３においてＡまたはＧ、または該ＢＦタンパク質の３２位においてＲまたはＱ；
ｂ）該ＢＦ遺伝子のｒｓ４１５１６６７においてＡまたはＴ、または該ＢＦタンパク質の９位においてＬまたはＨ；
ｃ）Ｃ２遺伝子のｒｓ５４７１５４においてＧまたはＴ；および
ｄ）該Ｃ２遺伝子のｒｓ９３３２３７９においてＣまたはＧ、または該Ｃ２タンパク質の３１８位においてＥまたはＤ。
【請求項２】
さらに、前記対象が、以下のａ）〜ｂ）の１つ以上を有するか否かを判定する工程を含む、請求項１記載の方法：
ａ）補体Ｈ因子（ＣＦＨ）遺伝子においてｄｅｌＴＴ；および
ｂ）ＣＦＨ遺伝子のｒｓ１０６１１７０においてＣまたはＴ、または該ＣＦＨタンパク質の４０２位においてＹまたはＨ。
【請求項３】
前記対象が黄斑変性症について無症状である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記対象が黄斑変性症の症状をもつ、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記試料が、利用可能な体液である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記対象の細胞から遺伝子型を検出することを含む、請求項１記載の方法
【請求項７】
前記対象におけるタンパク質変異体を検出することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記対象の細胞からｍＲＮＡを検出することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
さらに、前記対象が前記多型についてホモ接合であるかヘテロ接合であるかを判定することを含む、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
第二補体カスケードの調節異常を特徴とする、黄斑変性症を含む疾患を発症するリスク、または該疾患が進行している可能性をヒト対象において評価するキットであって、該対象由来の試料において以下の１つ以上の多型または１つ以上の対立遺伝子変異体を検出するための試薬を含むキット：
ａ）補体Ｂ因子（ＢＦ）遺伝子のｒｓ６４１１５３においてＡまたはＧ、または該ＢＦタンパク質の３２位においてＲまたはＱ；
ｂ）該ＢＦ遺伝子のｒｓ４１５１６６７においてＡまたはＴ、または該ＢＦタンパク質の９位においてＬまたはＨ；
ｃ）Ｃ２遺伝子のｒｓ５４７１５４においてＧまたはＴ；および
ｄ）該Ｃ２遺伝子のｒｓ９３３２３７９においてＣまたはＧ、または該Ｃ２タンパク質の３１８位においてＥまたはＤ。
【請求項１１】
前記対象から得た試料において以下の１つ以上の多型または１つ以上の対立遺伝子変異体を検出するための試薬を含む、請求項１０記載のキット：
ａ）補体Ｈ因子（ＣＦＨ）遺伝子においてｄｅｌＴＴ；および
ｂ）ＣＦＨ遺伝子のｒｓ１０６１１７０においてＣまたはＴ、または該ＣＦＨタンパク質の４０２位においてＹまたはＨ。
【請求項１２】
２つ以上の多型または２つ以上の対立遺伝子変異体を検出するための試薬を含む、請求項１０記載のキット。
【請求項１３】
前記多型を検出するオリゴヌクレオチドを含む、請求項１０記載のキット。
【請求項１４】
前記多型を含む標的ポリヌクレオチド配列を増幅するための試薬をさらに含む、請求項１０記載のキット。
【請求項１５】
固体支持体上に固定されたオリゴヌクレオチドを含む、請求項１０記載のキット。
【請求項１６】
前記対立遺伝子変異体を認識して特異的に結合する特異的結合タンパク質を含む、請求項１０記載のキット。
【請求項１７】
ストリンジェントな条件下で、以下のａ）〜ｄ）からなる群から選択される防御型多型をもつ１つ以上の核酸分子にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブを含むマイクロアレイ：
ａ）ＢＦ内のＲ３２Ｑ（ｒｓ６４１１５３）；
ｂ）ＢＦ内のＬ９Ｈ（ｒｓ４１５１６６７）；
ｃ）Ｃ２内のＩＶＳ １０（ｒｓ５４７１５４）；および
ｄ）Ｃ２内のＥ３１８Ｄ（ｒｓ９３３２７３９）。
【請求項１８】
ストリンジェントな条件下で、以下のａ）〜ｃ）からなる群から選択される多型をもつ１つ以上の核酸分子にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブをさらに含む、請求項１７記載のマイクロアレイ：
ａ）ＣＦＨ内のｄｅｌＴＴ多型；
ｂ）ＢＦ内のＲ１５０Ｒ多型；および
ｃ）ＣＦＨ内のＹ４０２Ｈ多型。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【公表番号】特表２００９−５２６５２４（Ｐ２００９−５２６５２４Ａ）
【公表日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５４４１５（Ｐ２００８−５５４４１５）
【出願日】平成１９年２月１３日（２００７．２．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００３６９６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９５１８５
【国際公開日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【出願人】（５０７２７２７４０）ユニバーシティー オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション (2)
【出願人】（３０６０１８４５７）ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク (25)
【出願人】（５０８２４５２５３）ナショナル インスティテューツ オブ ヘルス (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月１３日（２００７．２．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００３６９６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９５１８５
【国際公開日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【出願人】（５０７２７２７４０）ユニバーシティー オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション (2)
【出願人】（３０６０１８４５７）ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク (25)
【出願人】（５０８２４５２５３）ナショナル インスティテューツ オブ ヘルス (2)
【Ｆターム（参考）】
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