説明

補酵素結合型グルコース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチド

【課題】グルコースに対する基質認識性に優れ、マルトースに対する作用性が低い補酵素結合型グルコース脱水素酵素を大量生産するための手段を提供する。
【解決手段】電子受容体存在下でグルコースを脱水素する反応を触媒し、特定のアミノ酸配列に対して少なくとも60%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、特定の補酵素結合型グルコース脱水素酵素コンセンサス配列を有し、下記1)から4)の性質:1)フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)を補酵素とする、2)酸素を電子受容体としない、3)グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が5%以下である、および4)グルコースの1位の水酸基を酸化し、グルコースをグルコノ−δ−ラクトンに変換する反応を触媒する、を有する可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチド。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規な補酵素結合型グルコース脱水素酵素(以下「GLD」と記載することがある)、これをコードするポリヌクレオチド、その取得法、該GLDの製造方法、およびこのGLDの利用に関するものである。
【背景技術】
【0002】
血中グルコース量は糖尿病の重要なマーカーである。糖尿病の検査は、病院検査室等での臨床検査の他、診療スタッフ等による簡易検査や患者自身による自己検査といった簡易測定(Point−of−Care Testing:POCT)が実施されている。
この簡易測定は、グルコース診断キットやバイオセンサ等の測定装置(POCT装置)によって実施されているが、従来、これらのPOCT装置にはグルコース酸化酵素が用いられてきた。しかし、グルコース酸化酵素は溶存酸素濃度の影響を受け、計測値に誤差が生じるため、酸素の影響を受けないグルコース脱水素酵素の使用が推奨されている。
グルコース脱水素酵素には、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP)を補酵素とするNAD補酵素非結合型グルコース脱水素酵素と、ピロロキノリンキノン(PQQ)、フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)等を補酵素とする補酵素結合型グルコース脱水素酵素があるが、補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、NAD補酵素非結合型グルコース脱水素酵素に比べ夾雑成分の影響を受けにくいこと、測定感度が高いこと、更に原理上、POCT装置を安価に製造することが可能であるという利点を有している。
【0003】
しかしながら、従来のピロロキノリンキノン(PQQ)型グルコース脱水素酵素は安定性が低く、しかもマルトースやガラクトースにも反応してしまうという欠点を有している。マルトースは輸液に用いられる糖であり、PQQグルコース脱水素酵素がマルトースと反応すると血糖POCT装置は実際より高い血糖値を表示してしまう。このため、患者が不必要なインシュリン注射を行ってしまう結果、意識障害や昏睡状態に陥る等の低血糖事故が発生し、大きな問題となっている。
特に現在の血糖POCT装置の用途としては、単に簡易的に血糖を測る目的から、さらに患者の自己管理および治療の一手段としての重要性が高まっており、そのために使用される自己血糖測定装置(Self−Monitoring of Blood Glucose:SMBG)の家庭への普及は拡大の一途を辿っていることから、測定精度への要求性は非常に高いと考えられる。
現に、2005年2月には、日本において、厚生労働省よりマルトース輸液を投与中の患者に対して、補酵素としてPQQを利用している酵素を用いた血糖測定器の使用に関し、注意を喚起する通達が出されている(2005年2月7日;薬食安発第0207005号など)。
【0004】
一方、グルコースの脱水素反応を触媒し、FADを補酵素とする補酵素結合型グルコース脱水素酵素としては、Agrobacterium tumefaciens由来(J. Biol. Chem. (1967) 242 : 3665-3672)、Cytophaga marinoflava由来(Appl. Biochem. Biotechnol. (1996) 56 : 301-310)、Halomonas sp.α-15由来(Enzyme Microb. Technol. (1998) 22 : 269-274)、Agaricus bisporus由来(Arch. Microbiol.(1997)167:119-125、Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999)51:58-64)およびMacrolepiota rhacodes由来(Arch. Microbiol.(2001)176:178-186)の酵素が報告されているが、これらの酵素はグルコースの2位及び/または3位の水酸基を酸化し、いずれもマルトースに対する作用性が高く、グルコースに対する選択性が低い。また、同じくマルトースへの作用性が高い、ブルクホルデリア・セパシア(Burkhorderia cepacia)由来の補酵素結合型グルコース脱水素酵素も知られているが、これは本来の天然型の酵素がα、β、γの3種のサブユニットからなるヘテロオリゴマー酵素で、膜結合性酵素として知られている。したがって、酵素を得るには可溶化の処理が必要であったり、クローニングで十分な活性を発現させる為には、必要なサブユニットを同時にクローニングしなければならない等の課題があった。
【0005】
更に、日本生物工学会大会(2002年10月28日−30日)での発表によれば、基質特異性(対グルコース活性を100%とした場合の対マルトース活性、対ガラクトース活性)は、SM4株が40%、105%、JCM5506株が43%、132%、JCM550株が57%、123%、JCM2800株が83%、108%、JCM2801株が74%、117%、IFO14595株が38%、104%、IFO15124株が74%、148%であり、演者によれば、マルトースへの作用性が高いため、自己血糖測定器に使うには問題があり、今後配列を変えて基質特異性を改良したいとの発表内容だった。
【0006】
これに対して、本発明者らは、FADを補酵素とする、膜結合型ではない新規な可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素を発明し、特許出願している(特許文献1)。この特許文献1の補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、グルコースの1位の水酸基を酸化し、グルコースに対する基質認識性に優れ、溶存酸素の影響を受けず、しかもマルトースに対する作用性が低い(対グルコース活性を100%とした場合の対マルトース活性は5%以下、対ガラクトース活性も5%以下)というこれまでに無い優れた特性を有するものである。
【0007】
しかしながら、この特許文献1の補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、野生の微生物(例えばアスペルギルス属微生物など)の液体培養物から単離、抽出されたものであり、その生産量には限りがあった。また、酵素生産量が極微量である上に、糖が多量に酵素に結合し、通常の酵素に結合しているN型やO型糖鎖とは異なる種類の糖に覆われた‘糖包埋型酵素’とでも言うべき形態となっていることにより、その活性を検出しにくいこと(酵素活性が低い)、糖鎖を酵素的あるいは化学的に除去できないこと、その結果、電気泳動において、通常のタンパク質染色(Coomassie Brilliant Blue G−250等による)によりほとんど染色されず、遺伝子取得に必要な情報である酵素のアミノ末端や内部のアミノ酸配列を解読することも通常の精製酵素からでは難しく、これまで酵素遺伝子のクローニングに成功し、本酵素活性の発現を確認した事例は無かった。
【0008】
アスペルギルス・オリゼ由来の補酵素結合型グルコース脱水素酵素については1967年にその存在が示唆されたことがあったが(非特許文献1)、部分的に酵素学的性質が明らかにされたのみで、マルトースに作用しないという特性は示唆されていたにも関わらず、それ以降はアスペルギルス・オリゼ由来の補酵素結合型グルコース脱水素酵素に関する詳細な報告はもちろんその他微生物由来の補酵素結合型グルコース脱水素酵素についても、グルコースの1位の水酸基を酸化する酵素については続報が無く、補酵素結合型グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列や遺伝子に関する報告も全く知られていなかった。
また、グルコースデヒドロゲナーゼEC 1.1.99.10をグルコース測定に用いるアイデアは知られていたが(特許文献15参照)、補酵素結合型グルコース脱水素酵素が実用的なレベルで生産されたことはなく、実際にセンサに利用され実用化されるには至っていなかった。その理由は、本酵素の菌体内での活性は微弱であり、菌体外に分泌されてもその量は極僅かで、しかも多量の糖に覆われており活性が弱く、検出するのさえ困難であったために、遺伝子をクローニングできなかったためと推察される。
【0009】
また、グルコース酸化酵素を用いたセンサにおいて、酵素の糖鎖がグルコース測定時に影響を与え、糖鎖の多いカビ由来酵素のグルコースセンサへの利用は困難であることが知られていた(非特許文献2)が、アスペルギルス属微生物の固体培養において産生酵素の糖含量が液体培養時に比べて増加する(非特許文献3)など、一般的に、液体培養より固体培養の方が糖鎖がより多くなることが知られていた。このため、培養条件などを検討しても、カビ由来グルコース脱水素酵素の糖鎖を減らしてグルコースセンサへの利用を可能にすることは困難だったことも、これまでに補酵素結合型グルコース脱水素酵素が実用化されなかった理由であると推察される。
現に我々も、アスペルギルス・テレウス由来の補酵素結合型グルコース脱水素酵素を精製したが、その酵素は多量の糖に覆われ、‘アラビノガラクタン包埋型酵素’とでも言うべき形態となっていることにより、それを電極上に塗布、乾燥させて固定化酵素電極を作成する際には、乾燥性が悪いという問題が生じることに加え、糖がグルコースセンサとしての反応性を低下させる原因になっていることを見いだした。
【0010】
酵素等のタンパク質を大量に生産するためにはタンパク質をコードする遺伝子材料を用いた遺伝子工学的方法が知られているが、グルコース脱水素酵素の遺伝子工学的作成に関しては特許文献2〜14の従来技術が知られている。これらの従来技術は、主にPQQグルコース脱水素酵素の改変に関するものであり、基質特異性の低さや安定性の低さといった従来のPQQグルコース脱水素酵素の欠点を改良するための改変型PQQグルコース脱水素酵素と、それを遺伝子工学的に作成するための改変型遺伝子材料を提供している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0011】
【特許文献1】WO2004/058958号
【特許文献2】特開2000−312588号公報
【特許文献3】特開2000−350588号公報
【特許文献4】特開2000−354495号公報
【特許文献5】特開2001−197888号公報
【特許文献6】特開2001−346587号公報
【特許文献7】特開2001−37483号公報
【特許文献8】特開2004−173538号公報
【特許文献9】特開2004−313172号公報
【特許文献10】特開2004−313180号公報
【特許文献11】特開2004−344145号公報
【特許文献12】特開平10−243786号公報
【特許文献13】特表2004−512047号公報
【特許文献14】WO2002/072839号
【特許文献15】特開昭59−25700号公報
【非特許文献】
【0012】
【非特許文献1】Biochem.Biophys.Acta.,139,277-293,1967
【非特許文献2】Appl Environ Microbiol., 64(4), 1405-1411, 1998
【非特許文献3】Biosci. Biotechnol. Biochem., 62(10), 1938-1946, 1998
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
しかしながら、改変型遺伝子材料を用いて作成した改変型PQQグルコース脱水素酵素の場合には、依然としてグルコースに対する作用性を100%とした際のマルトースへの作用性が概ね10%以上と高かったり、あるいはマルトースへの反応性を低くさせた結果として、本来のグルコースへの反応性(比活性)までもが落ちてしまい、基質十分量の条件で電気化学的な測定法で活性を見るとグルコースセンサとしての機能は不充分で、POCT装置等への使用には至っていないのが実情である。
また、PQQグルコース脱水素酵素の活性発現に必要な補酵素PQQは、広く一般的に組換え宿主として用いられる大腸菌では作られず、PQQを生産する宿主微生物(シュードモナス等)に限定して組換え体を作らなければならないという問題もあった。
【0014】
本発明は、以上のとおりの従来技術における問題点に鑑みてなされたものであり、酵素に付加した多量の糖の問題を解決し、且つ、グルコースに対する反応性、熱安定性、基質認識性に優れ、しかもマルトースに対する作用性が低いという優れた特性を有する補酵素結合型グルコース脱水素酵素及びこれを大量にかつ簡単に製造する方法、該酵素をコードするポリヌクレオチド及びその取得法、該酵素を用いたグルコース測定方法、グルコース測定試薬組成物、グルコース測定用バイオセンサを提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【0015】
本発明者らは、補酵素結合型グルコース脱水素酵素を広く産業上利用するためには、酵素に付加した多量の糖鎖をグルコース測定に応用できるレベルにまで減らすことに加えて、実用的なコストで提供できる、マルトースに作用しないグルコース脱水素酵素の遺伝子クローニングによる大量生産が必要であると考えた。遺伝子クローニングを行うには、酵素のアミノ末端及び内部のアミノ酸の配列を解読し、遺伝子取得に必要な情報を得ることが不可欠であり、その為にはこれまで遺伝子クローニングの成功を妨げていた、通常のN型、O型糖鎖とは異なる、酵素を包埋している多量の糖を除去し、タンパク質の染色性を改善するとともにHPLCにより分析を可能にする必要があると考え、タンパク質の染色およびHPLCによる分析を困難にしていた原因である、酵素を包埋している糖を除去した精製酵素の取得に鋭意取り組んだ。その結果、固体培養を行うことにより、目的とする酵素を包埋している糖を低減し、そのアミノ酸配列を明らかにして遺伝子を取得できることを見いだした。
【0016】
本発明は、前記の課題を解決するものとして、電子受容体存在下で、グルコースを脱水素する反応を触媒し、グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が5%以下、好ましくは3%以下、より好ましくは2%以下であることを特徴とする可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素(GLD)をコードするポリヌクレオチド(以下、「GLDポリヌクレオチド」と記載することがある)を提供する。
【0017】
このポリヌクレオチドは、さらに具体的には、下記(1)〜(7)のポリヌクレオチドである。
(1) 電子受容体存在下で、グルコースを脱水素する反応を触媒し、配列番号2で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号8−12に記載の補酵素結合型グルコース脱水素酵素コンセンサス配列を有し、かつ下記1)から4)の性質:
1)フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)を補酵素とする、
2)酸素を電子受容体としない、
3)グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が5%以下である、および
4)グルコースの1位の水酸基を酸化し、グルコースをグルコノ−δ−ラクトンに変換する反応を触媒する、
を有する可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチド。
(2) 前記補酵素結合型グルコース脱水素酵素が、配列番号2で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる前記(1)に記載のポリヌクレオチド。
(3) 前記補酵素結合型グルコース脱水素酵素が、配列番号2で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる前記(1)に記載のポリヌクレオチド。
(4) 電子受容体存在下で、グルコースを脱水素する反応を触媒し、配列番号2の第20−592番目のアミノ酸配列と60%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号8−12に記載の補酵素結合型グルコース脱水素酵素コンセンサス配列を有し、かつ下記1)から4)の性質:
1)フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)を補酵素とする、
2)酸素を電子受容体としない、
3)グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が5%以下である、および
4)グルコースの1位の水酸基を酸化し、グルコースをグルコノ−δ−ラクトンに変換する反応を触媒する、
を有する可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素をコードする、ポリヌクレオチド。
(5) 前記補酵素結合型グルコース脱水素酵素が、配列番号2の第20−592番目のアミノ酸配列に対して少なくとも70%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる前記(4)に記載のポリヌクレオチド。
(6) 前記補酵素結合型グルコース脱水素酵素が、配列番号2の第20−592番目のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる前記(4)に記載のポリヌクレオチド。
(7)電子受容体存在下で、グルコースを脱水素する反応を触媒し、配列番号8−12に記載の補酵素結合型グルコース脱水素酵素コンセンサス配列を有し、かつ下記1)から4)の性質:
1)フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)を補酵素とする、
2)酸素を電子受容体としない、
3)グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が5%以下である、および
4)グルコースの1位の水酸基を酸化し、グルコースをグルコノ−δ−ラクトンに変換する反応を触媒する、
を有する可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素をコードし、かつ配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得るポリヌクレオチド。
【0018】
かかるGLDポリヌクレオチドは、具体的には、糸状菌、または担子菌、例えばアスペルギルス(Aspergillus)属、ペニシリウム(Penicillium)属、またはガノデルマ(Ganoderma)属の微生物、特に、アスペルギルス・テレウス(A.terreus)から単離されたポリヌクレオチドである。
【0019】
なお「配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相同性が60%以上の塩基配列」とは、配列番号1の塩基配列において、その全長にわたり、配列番号1の塩基配列に対して少なくとも60%の同一性を示し、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらにより好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上の同一性を有する塩基配列をいう。このような塩基配列の同一性パーセンテージは、基準配列(本発明では配列番号1)を照会配列として比較するアルゴリズムをもった公開または市販されているソフトウェアを用いて計算することができる。例として、BLAST、FASTA、またはGENETYX(ソフトウエア開発株式会社製)などを用いることができ、これらはデフォルトパラメーターで使用することができる。
【0020】
本発明はまた、配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ補酵素、特にFADと結合してグルコースを脱水素する作用を有するGLDをコードするポリヌクレオチドを提供する。
このヌクレオチド配列がコードするGLDのうち、最初のMetから19番目のアミノ酸Leuまではシグナルペプチドであり、この部分をコードするポリヌクレオチドは、生物種、又は、用いる宿主ベクター系により、それぞれ適切なものに置換するか、もしくは除去されたポリヌクレオチドであってもよい。
【0021】
本願明細書には、さらに具体的には、下記のポリヌクレオチドが開示されている。
(A)下記1)から4)の性質を有することを特徴とするGLDポリヌクレオチドである。
1)フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)を補酵素とする。
2)サブユニット構造がホモ2量体である。
3)酸素を電子受容体としない。
4)グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が5%以下、好ましくは3%以下、より好ましくは2%以下である。
また、(B)下記1)から3)の性質を有することを特徴とするGLDポリヌクレオチドである。
1)フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)を補酵素とする、
2)酸素を電子受容体としない、および
3)グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が5%以下、好ましくは3%以下、より好ましくは2%以下である、
また、(C)下記1)から4)の性質を有することを特徴とするGLDポリヌクレオチドである。
1)フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)を補酵素とする、
2)酸素を電子受容体としない、および
3)グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が5%以下、好ましくは3%以下、より好ましくは2%以下である、
4)含有する糖(ガラクトース、グルコース、マンノース、アラビノース)の含有量がタンパク質1 μgあたり合計で80 μg以下である、
また、(D)下記1)から4)の性質を有することを特徴とするGLDポリヌクレオチドである。
1)フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)を補酵素とする、
2)酸素を電子受容体としない、および
3)グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が5%以下、好ましくは3%以下、より好ましくは2%以下である、
4)含有する糖(ガラクトース、グルコース、マンノース、アラビノース)の含有量が酵素活性1 unitあたり合計で40 μg以下である、
また、(E)配列番号5〜7に記載の、補酵素結合型グルコース脱水素酵素をコードする塩基配列のコンセンサス配列から選ばれる1種又は2種以上の部分塩基配列を有し、かつ以下のa〜dの性質を有する補酵素結合型グルコース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドである。
a.サブユニット分子量:約63kDa
b.補酵素:FAD
c.グルコースの1位の水酸基を酸化し、グルコースをグルコノ−δ−ラクトンに変換する反応を触媒する
d.グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が5%以下である
ただし、性質aのサブユニット分子量とは、シグナルペプチド部分を含む、あるいは含まないGLDポリヌクレオチドを組み込んだ原核細胞由来の補酵素結合型グルコース脱水素酵素をポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)に供した際のサブユニット分子量であり、58kDaから63kDaを示す。また、同様に真核細胞由来の補酵素結合型グルコース脱水素酵素では、58kDaから150kDaを示す。
また、(F)配列番号8−12に記載の補酵素結合型グルコース脱水素酵素コンセンサス配列から選ばれる1種又は2種以上の部分アミノ酸配列を有し、かつ以下のa−dの性質を有する補酵素結合型グルコース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドである。
a.サブユニット分子量:約63kDa
b.補酵素:FAD
c.グルコースの1位の水酸基を酸化し、グルコースをグルコノ−δ−ラクトンに変換する反応を触媒する
d.グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が5%以下である
ただし、性質aのサブユニット分子量とは、シグナルペプチド部分を含む、あるいは含まないGLDポリヌクレオチドを組み込んだ原核細胞由来の補酵素結合型グルコース脱水素酵素をポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)に供した際のサブユニット分子量であり、58kDaから63kDaを示す。また、同様に真核細胞由来の補酵素結合型グルコース脱水素酵素では、58kDaから150kDaを示す。
【0022】
このGLDポリヌクレオチドによりコードされるGLDは、フラビン化合物(フラビンアデニンジヌクレオチド)を補酵素とし、電子受容体存在下でグルコースの1位の水酸基を酸化する反応を触媒するという理化学的性質を有する酵素である。またこのGLDはマルトースへの作用性が5%以下、好ましくは3%以下、より好ましくは2%以下であり、終濃度5mMの1,10−フェナントロリンで50%以上阻害され、好ましくは2mMの1,10−フェナントロリンで50%以上阻害され、より好ましくは1mMの1,10−フェナントロリンで50%以上阻害される。サブユニット構造はホモ2量体であるが、単量体でも活性型の場合がある。
【0023】
また、このGLDポリヌクレオチドによりコードされるGLDは、含有するガラクトース、グルコース、マンノース、アラビノースの合計含有量が、野生型とは異なり、タンパク質1 μgあたり合計80 μg以下、好ましくは10 μg以下、より好ましくは2 μg以下、さらにより好ましくは0.5 μg以下である。
さらにこのGLDポリヌクレオチドよりコードされるGLDは、含有するガラクトース、グルコース、マンノース、アラビノースの合計含有量が、野生型とは異なり、酵素活性1 unitあたり合計40 μg以下、好ましくは10 μg以下、より好ましくは2 μg以下、さらにより好ましくは0.5 μg以下である。
また、このGLDポリヌクレオチドによりコードされるGLDは、サブユニット分子量は約63kDaであり、補酵素はフラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)であり、グルコースの1位の水酸基を酸化し、グルコースをグルコノ−δ−ラクトンに変換する反応を触媒し、グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が5%以下である。
【0024】
当該GLDポリヌクレオチドの具体的な態様は、配列番号1の塩基配列、または配列番号1で表される塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ補酵素、特にFADと結合してグルコースを脱水素する作用を有するGLDをコードするポリヌクレオチドである。
【0025】
また、かかるポリヌクレオチドの取得法であって、GLD産生能を有する微生物を固体培養し、得られる酵素の情報をもとに遺伝子をクローニングするGLDをコードするポリヌクレオチドの取得法を提供する。用いる微生物は、アスペルギルス属に属する1以上の菌株であること、特にアスペルギルス・テレウス(A.terreus)であることが好ましい。
【0026】
さらに、本願明細書では、上記いずれかのポリヌクレオチド塩基配列によってコードされるGLDを提供する。当該GLDのより具体的な態様は、電子受容体存在下で、グルコースを脱水素する反応を触媒し、グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が5%以下である可溶性のGLDである。
また、下記1)から4)の性質を有する。
1)フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素とする。
2)サブユニット構造がホモ2量体である。
3)酸素を電子受容体としない。
4)グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が5%以下、好ましくは3%以下、より好ましくは2%以下である。
あるいは、下記1)から3)の性質を有する。
1)フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素とする。
2)酸素を電子受容体としない。
3)グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が5%以下、好ましくは3%以下、より好ましくは2%以下である。
あるいは、下記1)から4)の性質を有する。
1)フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)を補酵素とする、
2)酸素を電子受容体としない、
3)グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が5%以下である、および
4)含有するガラクトース、グルコース、マンノース、アラビノースの含有量がタンパク質1 μgあたり合計で80 μg以下である
あるいは、下記1)から4)の性質を有する。
1)フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)を補酵素とする、
2)酸素を電子受容体としない、
3)グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が5%以下である、および
4)含有するガラクトース、グルコース、マンノース、アラビノースの含有量が酵素活性1 unitあたり合計で40 μg以下である、
あるいは、下記の性質を有する。
a.サブユニット分子量:約63kDa
b.補酵素:FAD
c.グルコースの1位の水酸基を酸化し、グルコースをグルコノ−δ−ラクトンに変換する反応を触媒する
d.グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が5%以下である
かかるGLDは、糸状菌、好ましくはアスペルギルス属に属する1以上の菌株、特に好ましくはアスペルギルス・テレウスから単離されたものである。
【0027】
当該GLDのさらに具体的な態様は、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなり、かつ補酵素、特にFADと結合してグルコースを脱水素するGLDである。また、配列番号2で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつFADと結合してグルコースを脱水素する作用を有するGLDを提供する。
また、配列番号2で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ補酵素、特にFADと結合してグルコースを脱水素する作用を有するGLDを提供する。従来、ショウジョウバエの補酵素結合型グルコース脱水素酵素は公知であったが(Proc. Natl. Acad. Sci. 1983 October; 80: 6286-6288. "Biphasic expression and function of glucose dehydrogenase in Drosophila melanogaster.")、配列番号2で表されるアミノ酸配列との相同性は28〜29%であった。また、かかる昆虫由来の酵素は昆虫細胞以外では発現し難く、生産性が極めて悪いため、産業上利用することは困難であった。配列番号2で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%の配列相同性を有するアミノ酸配列からなる本発明の酵素は、大腸菌等での発現が可能であるため、容易に産業用酵素として用いることができる。
また、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるGLDをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【0028】
なお「配列番号2で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%の配列相同性を有するアミノ酸配列」とは、配列番号2のアミノ酸配列において、その全長にわたり、配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも60%の同一性を示し、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらにより好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上の同一性を有するアミノ酸配列をいう。このようなアミノ酸配列の同一性パーセンテージは、基準配列(本発明では配列番号2)を照会配列として比較するアルゴリズムをもった公開または市販されているソフトウェアを用いて計算することができる。例として、BLAST、FASTA、またはGENETYX(ソフトウエア開発株式会社製)などを用いることができ、これらはデフォルトパラメーターで使用することができる。
【0029】
また、小麦フスマまたはオートミールなどを培地成分に用いた固体培養物中に、上記いずれかのGLDを産生する微生物を存在せしめ、それにより該培養物中に当該GLDを産生させ、採取することを特徴とする当該GLDの製造方法および当該方法により製造されたGLDを提供する。
【0030】
本発明は、さらに、前記のように本発明によって提供されるポリヌクレオチドのうちいずれかのポリヌクレオチドを保有する組換えベクター、組換えベクターを用いることによって作成された形質転換細胞、形質転換細胞を培養し、培養物からグルコースを脱水素する作用を有するGLDを採取することを特徴とする当該GLDの製造方法、および当該方法によって得られたGLDを提供する。
【0031】
かかる方法により得られるGLDは、これに糖鎖が結合していないか、結合している場合でもそれは通常のN型、O型糖鎖であり、その結合量も野生型の糖結合量と比較して少なく、糖鎖の除去も容易で高い活性を示すものである。
また、配列番号2の第20−592番目のアミノ酸配列、またはこのアミノ酸配列と60%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、上記GLDと同等の機能を有し、かつペプチド合成法又は遺伝子組換え法によって得られるGLDを提供する。
【0032】
さらにまた、前記のように、提供されるGLDを使用することを特徴とするグルコースの測定方法、提供されるGLDを含有することを特徴とするグルコース測定試薬組成物、並びに提供されるGLDを使用することを特徴とするグルコース測定用のバイオセンサをそれぞれ提供する。これらの発明は、使用に際し、電子受容体、特にフェリシアン化物を終濃度2mM−500mMで用いることを好ましい態様としている。
【0033】
なお、本発明において、「ポリヌクレオチド」とは、プリンまたはピリミジンが糖にβ−N−グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル(ATP(アデノシン三リン酸)、GTP(グアノシン三リン酸)、CTP(シチジン三リン酸)、UTP(ウリジン三リン酸);またはdATP(デオキシアデノシン三リン酸)、dGTP(デオキシグアノシン三リン酸)、dCTP(デオキシシチジン三リン酸)、dTTP(デオキシチミジン三リン酸))が100個以上結合した分子を言い、具体的にはGLDをコードするゲノムDNA、ゲノムDNAから転写されたmRNA、mRNAから合成されたcDNA及び、それらを鋳型としてPCR増幅したポリヌクレオチドを含む。「オリゴヌクレオチド」とはヌクレオチドが2−99個連結した分子を言う。また「ポリペプチド」とは、アミド結合(ペプチド結合)または非天然の残基連結によって互いに結合した30個以上のアミノ酸残基から構成された分子を意味し、さらには、これらに糖鎖が付加したものや、人工的に化学的修飾がなされたもの等も含む。
この出願の各発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はSambrook and Maniatis, in Molecular Cloning−A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法またはそれらと実質的に同様な方法や改変法に基づき実施可能である。さらに、この発明における用語は基本的にはIUPAC−IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。
【発明の効果】
【0034】
本発明の酵素は、天然型酵素における多量の糖をグルコースセンサに利用できるレベルにまで減らし、グルコースに対する基質認識性に優れ、しかもマルトースに対する作用性が低いという優れた特性を有する補酵素結合型グルコース脱水素酵素(GLD)である。また、本発明の酵素の製造方法を用いれば、かかる酵素を均質かつ大量に生産することが可能となる。
また、このように人工生産されたGLDは、FADと結合してグルコースを脱水素する補酵素結合型グルコース脱水素酵素で問題となっていた糖の量を目的に応じてコントロールできるため、糖含量を減らした酵素を調製することで、血糖測定などにおいて、試料中の糖(グルコースなど)に対する作用性を変えることも可能である。
本発明におけるGLDは、血糖の測定において実質的にマルトースに作用しないことから、より高精度なSMBG装置にも利用することができ、糖尿病患者の自己管理・治療に大きく資する。
【図面の簡単な説明】
【0035】
【図1】酵素を糖鎖切断し、SDS−PAGEに供し、糖鎖染色した図である。
【図2】酵素を糖鎖切断し、SDS−PAGEに供し、CBB染色した図である。
【図3】酵素を糖鎖切断し、Native−PAGEによる電気泳動を行い、活性染色を行った図である。
【図4】電子受容体としてオスミウム錯体を使用し、酵素のセンサ特性(二分子反応速度定数)を測定した結果を示す。
【図5】電子受容体としてキノン化合物を使用し、酵素のセンサ特性(二分子反応速度定数)を測定した結果を示す。
【図6】酵素固定化電極を用い、D−グルコースを定量した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0036】
本発明のGLDポリヌクレオチド(遺伝子)は、電子受容体存在下で、グルコースを酸化する反応を触媒し、グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が5%以下、好ましくは3%以下、より好ましくは2%以下であることを特徴とする可溶性のGLDをコードするポリヌクレオチドである。このポリヌクレオチドは、さらに具体的には、上記(A)〜(F)のいずれかの性質を有することを特徴とするGLDポリヌクレオチドである。
本発明のGLDポリヌクレオチドの最も具体的な態様は、配列番号1のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。このポリヌクレオチドは糸状菌、例えばアスペルギルス属の、特にアスペルギルス・テレウス(FERM BP−08578)由来のGLDポリヌクレオチドであり、配列番号2のアミノ酸配列を有するGLDをコードしている。
このGLDポリヌクレオチドは、例えばアスペルギルス・テレウス(FERM BP−08578)からcDNAライブラリーを調製し、当該GLDのN末端及び内部配列のアミノ酸をエドマン法等によって決定し、このアミノ酸配列に基づいて作成した複数のオリゴヌクレオチドプローブを用いてcDNAライブラリーをスクリーニングすることによって取得することができる。
【0037】
なお、小麦フスマ、オートミール等を含有する固体培養物中に、本発明のGLDを産生し得る微生物、例えばアスペルギルス属に属するアスペルギルス・テレウス、アスペルギルス・ジャポニカス(A.japonicus)、アスペルギルス・オリゼー(A.oryzae)等1種以上の菌株を添加し、該培養物中からGLDを採取したものは、GLDに結合した糖鎖の量が少なく、容易に糖鎖を除去してGLDを精製できることから、GLDのN末端及び内部配列を決定するにあたって、固体培養して得られるGLDを用いることが好ましい。
小麦フスマを用いる場合、例えば、小麦フスマ40〜70質量%含有液を滅菌した後、種培養液0.5〜2質量%を添加して、室温付近で培養し、得られた培養菌体からGLD粗酵素を抽出すればよい。また、オートミールを用いる場合、例えば、オートミール40〜70質量%含有液を滅菌した後、種培養液0.5〜2質量%を添加して、室温付近で培養し、得られた培養菌体からGLD粗酵素を抽出すればよい。
またプローブの標識は、ラジオアイソトープ(RI)法または非RI法によって行うことができるが、非RI法を用いることが好ましい。非RI法としては、蛍光標識法、ビオチン標識法、化学発光法等が挙げられるが、蛍光標識法を用いることが好ましい。蛍光物質としては、オリゴヌクレオチドの塩基部分と結合できるものを適宜に選択して用いることができるが、シアニン色素(例えば、Cy DyeTMシリーズのCy3、Cy5等)、ローダミン6G試薬、N−アセトキシ−N−アセチルアミノフルオレン(AAF)、AAIF(AAFのヨウ素誘導体)などを使用することができる。
【0038】
あるいはまた、アスペルギルス・テレウス(FERM BP−08578)のcDNAライブラリーを鋳型とし、上記で作成したオリゴヌクレオチドプライマー(プローブ)のセットを用いたPCR法によって、もしくはアスペルギルス・テレウス(FERM BP−08578)から抽出した全RNAもしくはmRNAを鋳型とするRT−PCR法によっても目的のGLD遺伝子を得ることができる。また、配列番号1の5’側の1プライマーを用いた5’RACE法によってcDNAの上流を、配列番号1の3’側の1プライマーを用いた3’RACE法によってcDNAの下流部分をPCR増幅することもできる。なお、プライマーを設計する場合には、プライマーのサイズ(塩基数)は鋳型DNAとの間の特異的なアニーリングを満足させることを考慮し、15−40塩基、望ましくは15−30塩基である。ただし、LA(long and accurate)PCRを行う場合には、少なくとも30塩基が効率的である。センス鎖(5’末端側)とアンチセンス鎖(3’末端側)からなる一組あるいは一対(2本)のプライマーが互いにアニールしないよう、両プライマー間の相補的配列を避けるようにする。さらに、鋳型DNAとの安定な結合を確保するためGC含量を約50%にし、プライマー内においてGC−richあるいはAT−richが偏在しないようにする。アニーリング温度はTm(melting temperature)に依存するので、特異性の高いPCR産物を得るため、Tm値が55−65℃で互いに近似したプライマーを選定する。また、PCRにおけるプライマー使用の最終濃度が約0.1から約1μMになるよう調整する等を留意することも必要である。また、プライマー設計用の市販のソフトウエア、例えばOligoTM [National Bioscience Inc.(米国)製]、GENETYX(ソフトウエア開発株式会社製)等を用いることもできる。
【0039】
なお、前記のオリゴヌクレオチドプローブやオリゴヌクレオチドプライマーセットは、例えば前記GLD cDNAを適当な制限酵素で切断して作成することもでき、あるいは文献(例えばCarruthers(1982)Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411−418; Adams(1983)J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov(1997)Nucleic Acid Res. 25:3440−3444; Frenkel(1995)Free Radic. Biol. Med. 19:373−380; Blommers(1994)Biochemistry 33:7886−7896; Narang(1979)Meth. Enzymol. 68:90; Brown(1979)Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage(1981)Tetra. Lett. 22:1859; 米国特許第4,458,066号)に記載されているような周知の化学合成技術により、in vitroにおいて合成することができる。
【0040】
本発明のポリヌクレオチドはまた、配列番号1と60%以上の相同性を有する塩基配列からなり、上記補酵素、特にFADと結合してグルコースを脱水素する作用を有するGLDをコードするものであってもよい。
また、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号1における1または複数個の塩基が欠失、置換又は付加されており、かつ上記補酵素、特にFADと結合してグルコースを脱水素する作用を有するGLDをコードするものであってもよい。
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号1に示した塩基配列に相補的なDNA、配列番号1に示した塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNAにストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ上記補酵素、特にFADと結合してグルコースを脱水素する作用を有するGLDをコードするものであってもよい。
また、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号5〜7に記載の、補酵素結合型グルコース脱水素酵素をコードする塩基配列のコンセンサス配列から選ばれる1種又は2種以上の部分塩基配列を有するものであってもよい。また、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号8−12に記載の補酵素結合型グルコース脱水素酵素コンセンサス配列から選ばれる1種又は2種以上の部分アミノ酸配列を有する酵素をコードするものであってもよい。かかるコンセンサス配列(アミノ酸配列)を有する酵素は、本発明のGLDの活性を有する場合が多く、かかる部分が本発明酵素の活性中心を形成しているものと推測される。
なお、配列番号8の3つのXaaにおいて、一番左側のXaaはAla又はGlyを表し、左から2番目のXaaはAla又はValを表し、一番右側のXaaはIle又はValを表す。また、配列番号9の4つのXaaにおいて、一番左側のXaaはAla又はValを表し、左から2番目のXaaはIle又はLeuを表し、左から3番目のXaaはAla又はSerを表し、一番右側のXaaはGlu又はGlnを表す。また、配列番号10の3つのXaaにおいて、一番左側のXaaはAla又はLeuを表し、左から2番目のXaaはIle又はLeuを表し、一番右側のXaaはIle又はValを表す。また、配列番号12の3つのXaaにおいて、一番左側のXaaはAla又はSerを表し、左から2番目のXaaはAsn又はSerを表し、一番右側のXaaはIle又はValを表す。
【0041】
このようなGLD類似酵素をコードするポリヌクレオチドは、例えば、前記のアスペルギルス・テレウス由来のGLD cDNAを、公知のミューテーション導入法や変異導入PCR法等によって改変して作成することができる。あるいはまた、アスペルギルス・テレウス以外の微生物等のゲノムDNAやそのcDNAライブラリーから、配列番号1のヌクレオチド配列情報に基づいて作成したオリゴヌクレオチドを用いるプローブハイブリダイゼーション法によって取得することができる。ハイブリダイゼーションに際して、ストリンジェント条件を様々に変化させることによって、前記のとおりのGLD類似酵素をコードするポリヌクレオチドを取得することができる。ストリンジェント条件は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程における塩濃度、有機溶媒(ホルムアルデヒド等)の濃度、温度条件等によって規定され、例えば、米国特許No.6,100,037等に開示されているような、当業者らに周知の様々な条件を採用することができる。
より具体的なハイブリダイゼーションの条件としては、たとえば50%ホルムアミド、5×SSC(150mM 塩化ナトリウム、15mM クエン酸三ナトリウム、10mM リン酸ナトリウム、1mM エチレンジアミン四酢酸、pH7.2)、5×デンハート(Denhardt’s)溶液、0.1% SDS、10% デキストラン硫酸および100μg/mLの変性サケ精子DNAで42℃インキュベーションした後、ついでフィルターを0.2×SSC中42℃で洗浄するなどを例示することができる。
GLD類似酵素をコードするポリヌクレオチドを取得するための微生物等としては、微生物の種や属に限定されず、野生株または変異株のいずれの微生物でもあり得る。例えば、特許文献1に開示されている微生物等を例示することができる。
【0042】
本発明の組換えベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターであり、インサートとしてのポリヌクレオチドの種類や、その使用目的等に応じて適宜のものを使用する。例えば、cDNAまたはそのORF領域をインサートとしてGLDやその類似酵素を生産する場合には、in vitro転写用の発現ベクターや、大腸菌、枯草菌等の原核細胞、酵母、カビなどの糸状菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞のそれぞれに適した発現ベクターを使用することもできる。
本発明の形質転換細胞は、例えば、GLDやその類似酵素を大量製造する場合には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、カビ、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。これらの形質転換細胞は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法など公知の方法によって組換えベクターを細胞に導入することによって調製することができる。組換えベクターおよび形質転換細胞の具体例として、下記実施例に示した組換えベクターpCGLDと、このベクターによる形質転換大腸菌Escherichia coli JM109/pCGLD(FERM BP−10243)が挙げられる。
【0043】
本発明のGLDは、上記GLDポリヌクレオチドの塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。具体的には、電子受容体存在下で、グルコースを脱水素する反応を触媒し、グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が5%以下である可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素であり、さらに、上記(A)〜(F)のいずれかの性質を有することが好ましい。
【0044】
本発明のGLDのより具体的な態様は、含有する糖(ガラクトース、グルコース、マンノース、アラビノース)の含有量がタンパク質1μgあたり合計で80μg以下であるか、又は含有する糖(ガラクトース、グルコース、マンノース、アラビノース)の含有量が酵素活性1 unitあたり合計で40μg以下である。これらの糖は、縮重合して多糖類を形成し、酵素の周囲を被覆している。したがって、これら糖類の含有量がタンパク質1μgあたり合計で80μg以下であるか、又は酵素活性1 unitあたり合計で40μg以下であれば、高活性の酵素が得られるため好ましい。
また、本発明のGLDのより具体的な態様は、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる。さらに、本発明のGLDは、配列番号2と60%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ補酵素、特にFADと結合してグルコースを脱水素する作用を有するGLD類似酵素であってもよい。さらに、本発明のGLDは、配列番号2における1または数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列からなり、かつ補酵素、特にFADと結合してグルコースを脱水素する作用を有するGLD類似酵素であってもよい。さらに、本発明のGLDは、配列番号2の第20−592番目のアミノ酸配列、またはこのアミノ酸配列と60%以上の相同性を有し、上記のポリペプチドと同等の機能を有し、かつペプチド合成法又は遺伝子組換え法によって合成されたポリペプチドである。
【0045】
このようなGLDは、例えば配列番号2のアミノ酸配列またはその類似配列に基づいて、公知のペプチド合成法(Merrifield, R.B. J. Solid phase peptide synthesis I. The synthesis of tetrapeptide. J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149−2154, 1963; Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis. A Practical Approach. Chan, W.C. and White, P.D., Oxford University Press, 2000)によって作成することができる。また、これらのペプチドは天然のアミド結合以外の残基連結からなるものであってもよい。天然のアミド結合以外の残基連結は、例えばグルタルアルデヒド、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、2官能マレイミド、N,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、またはN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)等の化学結合またはカップリング手段を例示することができる。また、ペプチド結合の代替となり得る連結基は、例えばケトメチレン(例えば、−C(=O)−CH−に対する−C(=O)−NH−)、アミノメチレン(CH−NH)、エチレン、オレフィン(CH=CH)、エーテル(CH2−O)、チオエーテル(CH−S)、テトラゾール(CN−)、チアゾール、レトロアミド、チオアミド、またはエステルを含む(例えば、Spatola (1983) in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267−357, “Peptide Backbone Modifications,” Marcell Dekker, NYを参照)。
【0046】
また、GLDは、前記のGLDポリヌクレオチド(cDNAまたはその翻訳領域)を用いた組換えDNA技術によって取得できる。例えば前記のポリヌクレオチドを有するベクターからin vitro転写によってRNAを調製し、これを鋳型としてin vitro翻訳を行うことによりin vitroでGLDを作成することができる。またポリヌクレオチドを公知の方法により適当な発現ベクターに組換えれば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、カビ、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞で、ポリヌクレオチドがコードしているGLDを大量に発現させる事ができる。糖鎖の要、不要、その他のペプチド修飾の必要性に応じて、適宜宿主は選択することができる。
GLDをin vitro発現させて生産させる場合には、前記のポリヌクレオチドを、RNAポリメラーゼが結合できるプロモーターを有するベクターに挿入して組換えベクターを作成し、このベクターを、プロモーターに対応するRNAポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのin vitro翻訳系に添加すれば、GLDをin vitroで生産することができる。RNAポリメラーゼが結合できるプロモーターとしては、T3、T7、SP6などが例示できる。これらのプロモーターを含むベクターとしては、pKA1、pCDM8、pT3/T718、pT7/319、pBluescriptIIなどが例示できる。
【0047】
GLDを大腸菌などの微生物でDNAを発現させて生産させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、DNAクローニング部位、ターミネーター配列等を有する発現ベクターに前記のポリヌクレオチドを組換えた発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、GLDを微生物内で大量生産することができる。この際、任意の翻訳領域の前後に開始コドンと停止コドンを付加して発現させれば、任意の領域を含むGLD断片を得ることもできる。あるいは、他の蛋白質との融合蛋白質として発現させることもできる。この融合蛋白質を適当なプロテアーゼで切断することによっても目的とするGLDを取得することができる。大腸菌用発現ベクターとしては、pUC系、pBluescriptII、pET発現システム、pGEX発現システム、pCold発現システムなどが例示できる。
【0048】
GLDを、真核細胞で発現させて生産させる場合には、前記ポリヌクレオチドを、プロモーター、スプライシング領域、ポリ(A)付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作成し、真核細胞内に導入すれば、GLDを真核細胞内で生産することができる。プラスミドのような状態で細胞内に維持することもできるし、染色体中に組みこませて維持することもできる。発現ベクターとしては、pKA1、pCDM8、pSVK3、pSVL、pBK−CMV、pBK−RSV、EBVベクター、pRS、pYE82などが例示できる。また、pIND/V5−His、pFLAG−CMV−2、pEGFP−N1、pEGFP−C1などを発現ベクターとして用いれば、Hisタグ、FLAGタグ、GFPなど各種タグを付加した融合蛋白質としてFAD−GLDポリペプチドを発現させることもできる。真核細胞としては、サル腎臓細胞COS−7、チャイニーズハムスター卵巣細胞CHOなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カビ、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、GLDを発現できるものであれば、いかなる真核細胞でもよい。発現ベクターを真核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法など公知の方法を用いることができる。
【0049】
GLDを原核細胞や真核細胞で発現させた後、培養物(菌体、もしくは菌体外に分泌された酵素を含む培養液、培地組成物等)から目的蛋白質を単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、熱処理、pH処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、SDS−PAGE、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー(タグ配列を利用した方法およびUKC1に特異的なポリクローナル抗体、モノクローナル抗体を用いる方法も含む)、などが挙げられる。
【0050】
以上のとおりの方法によって作成された本発明のGLDは、以下の特性を有している。
(1)作用:国際生化学連合(IUB)の分類でEC 1.1.99.10に該当する酵素であり、電子受容体存在下でグルコースの1位の水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応(グルコース + 電子受容体 → グルコノ−δ−ラクトン + 還元型電子受容体)を触媒する。
なお、電子受容体として例えばフェナジンメトサルフェート、1−メトキシ−5−メチルフェナジウムメチルサルフェイト、2,6−ジクロロフェノールインドフェノール、フェリシアン化合物、オスミウム化合物、キノン化合物などが挙げられ利用できる。
(2)基質特異性:D−グルコースには強く作用し、D−マンノース、1,5−アンヒドロ−D−グルシトール、D−セロビオース、D−トレハロース、マルトース、D−ガラクトース、D−グルコース−6−リン酸、D−フルクトースには弱く作用する。また、L−アラビノース、ラクトース、D−ソルビトール、グルコン酸、スクロース、D−マンニトール、L−ソルボース、D−リボース、L−ラムノース、D−グルコース−1−リン酸、D−ラフィノース、エタノール、グリセロールにはほとんど作用しない。
(3)阻害剤:1,10−フェナントロリンで60%以上阻害される。
(4)補酵素:フラビンアデニンジヌクレオチド
(5)至適pH:7.0〜9.0
(6)安定pH:4.5〜8.5
(7)至適温度:55℃付近
(8)温度安定性:約50℃以下で安定
なお、上記分子量については、本酵素には元来糖鎖が付加している為、培養条件や精製条件により糖鎖の付き方が変われば分子量は異なるし、組換え体においてはその宿主、ベクター系の種類などによっても糖鎖や付加するアミノ酸が変わり分子量は異なってくる。
等電点についても同様に異なることを確認している。
【0051】
以上のとおりの本発明のGLDは、電子受容体存在下で、グルコースを脱水素する反応を触媒する酵素であるから、この反応による変化が利用できる用途であれば、特に制限されない。例えば、生体物質を含む試料中のグルコースの測定及び測定用試薬、消去用試薬へ使用するなどの医療分野、臨床分野への使用が可能であり、補酵素結合型グルコース脱水素酵素を使用した物質生産においても使用可能である。
本発明のバイオセンサは、酵素として本発明のGLDを含む反応層に使用し、試料液中のグルコース濃度を測定するグルコースセンサである。例えば、絶縁性基板上にスクリーン印刷などの方法を利用して作用極、その対極および参照極からなる電極系を形成し、この電極系上に接して親水性高分子と酸化還元酵素と電子受容体とを含む酵素反応層を形成することによって作製される。このバイオセンサの酵素反応層上に基質を含む試料液を滴下すると、酵素反応層が溶解して酵素と基質が反応し、これにともなって電子受容体が還元される。酵素反応終了後、還元された電子受容体を電気化学的に酸化させ、このとき、このバイオセンサは得られる酸化電流値から試料液中の基質濃度を測定することが可能である。また、この他に、発色強度或いはpH変化などを検知する方式のバイオセンサも構築可能である。
【0052】
バイオセンサの電子受容体としては、電子の授受能に優れた化学物質を用いることができる。電子の授受能に優れた化学物質とは、一般的に「電子伝達体」、「メディエータ」あるいは「酸化還元媒介剤」と呼ばれる化学物質であり、これらに該当する化学物質として、例えば、特表2002−526759に挙げられた電子伝達体や酸化還元媒介剤などを利用してもよい。具体的には、オスミウム化合物、キノン化合物、フェリシアン化合物等が上げられる。
バイオセンサは、安価なフェリシアン化カリウム(ヘキサシアノ鉄(III)酸カリウム)を電子受容体として用いることが多く、一般に終濃度1mM以下で用いられる。しかし本発明のGLDはフェリシアン化カリウムを2−500mM、より好ましくは30−100mMと高濃度で用いる事で、より感度良くD−グルコースを測定する事が可能である。本発明の測定方法、測定試薬、測定化合物、バイオセンサなどの好ましい態様は、それにかかる測定反応系にフェリシアン化カリウムを終濃度2−500mMで用いることである。
【0053】
本酵素の活性測定においては、該酵素を、好ましくは終濃度0.1〜1.0unit/mlになるように適宜希釈して用いる。なお、該酵素の酵素活性単位(unit)は1分間に1μmolのグルコースを酸化する酵素活性である。本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素の酵素活性は、次の方法で測定できる。
【0054】
(i) 酵素活性測定法−1
0.1M リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)1.0ml、1.0M D−グルコース1.0ml、3mM 2,6−ジクロロフェノールインドフェノール(以下DCIPという)0.1ml、3mM 1−メトキシ−5−メチルフェナジウムメチルサルフェイト0.2ml、水0.65mlを3ml石英セル(光路長1cm)に添加し、恒温セルホルダー付き分光光度計にセットして37℃で5分間インキュベート後、酵素溶液0.05mlを添加後、DCIPの600nmにおける吸光度変化(ΔABS/min)を測定する。DCIPのpH7.0におけるモル吸光係数を16.3×10cm−1−1とし、1分間に1μmolのDCIPが還元される酵素活性が実質的に該酵素活性1unitと等価であることから、吸光度変化より該酵素活性を次式に従って求めた。
【0055】
【数1】

【0056】
(ii) 酵素活性測定法−2
1.0M リン酸カリウム緩衝液(pH7.0) 3.4μl、1.0M D−グルコース0.1ml、20mM DCIP 86.6μlを37℃で5分間インキュベート後、酵素溶液0.01mlを添加して攪拌し、5分間反応後100℃で3分間インキュベートし反応を停止した。さらに100mM グリシン・ナトリウム緩衝液(pH13.0) 0.19ml、2.0N 水酸化カリウム0.01mlを添加し37℃で10分間インキュベートし、溶液中のD−グルコン酸をD−グルコノ−δ−ラクトンに変換した後、100mM トリス・塩酸緩衝液(pH7.5) 0.39ml、1.0N 塩酸0.01mlを添加し、pHを中性にした。溶液中のD−グルコン酸をD−グルコン酸/D−グルコノ−δ−ラクトン定量キット(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)により定量した。1分間に1μmolのD−グルコノ−δ−ラクトンを生成する酵素活性が実質的に該酵素活性1unitと等価であることから、D−グルコノ−δ−ラクトンの生成量から該酵素活性を同定した。
本酵素のタンパク濃度の測定においては、該酵素を、好ましくは終濃度0.2〜0.9 mg/ml になるように適宜希釈して用いる。本発明におけるタンパク濃度は、日本バイオ・ラッド(株)から購入できるタンパク濃度測定キットであるBio−Rad Protein Assayを用い、取扱説明書に従って、牛血清アルブミン(BSA,和光純薬工業(株)製,生化学用)を標準物質として作成した検量線から換算して求めることができる。
【0057】
以下、実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、本発明は以下の例によって限定されるものではない。
【実施例1】
【0058】
1−1(種培養)
グルコース1%(和光純薬工業社製)(W/V)、脱脂大豆2%(日本食販社製)(W/V)、コーンスティープリカー(サンエイ糖化社製)0.5%(W/V)、硫酸マグネシウム七水和物(ナカライテスク社製)0.1%(W/V)および水からなる液体培地をpH6.0に調整し、100mLを500mL容の坂口フラスコに入れ、綿栓をし、121℃、20分間オートクレーブした。冷却したこの液体培地に、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)FERM BP−08578株を接種し、28℃で48時間振とう培養したものを種培養液とした。
1−2(液体培養による粗酵素溶液の取得)
グルコース(和光純薬工業社製)1%(W/V)、脱脂大豆(日本食販社製)2%(W/V)、コーンスティープリカー(サンエイ糖化社製)0.5%(W/V)、硫酸マグネシウム七水和物(ナカライテスク社製)0.1%(W/V)、消泡剤、水からなる液体培地4LをpH6.0に調整し、5L容のジャーファーメンターに入れ、121℃で20分間オートクレーブ殺菌した。冷却したこの液体培地に、上記1−1(種培養)に記載した培養液40mLを接種し、41時間、通気撹拌の条件で菌体を培養した。培養液をろ過して得た培養上清を粗酵素溶液1として用いた。
1−3(固体培養(フスマ培養)による粗酵素溶液の取得)
小麦フスマ(陽和製粉株式会社製)300gと水道水240gを5L容の三角フラスコに入れ、良くかき混ぜてから、綿栓をし、121℃で25分間滅菌した。
上記1−1(種培養)に記載した種培養液を5mL接種し、26℃にて静置培養を行った。時々撹拌して通気しながら2週間の培養を行い、フスマに生育した培養菌体に対して5Lの20mM リン酸カリウム緩衝液(pH 7.5)を用いて抽出を行い、ろ過して得た上清を粗酵素溶液2として用いた。
1−4(固体培養(オートミール培養)による粗酵素溶液の取得)
オートミール(雪印乳業製)300gと水道水240gを5L容の三角フラスコに入れ、良くかき混ぜてから、綿栓をし、121℃で25分間滅菌した。
上記1−1(種培養)で調整した種培養液を5mL接種し、25℃にて時々撹拌して通気しながら4日間静置培養を行い、オートミールに生育した培養菌体に対して5Lの20mM リン酸カリウム緩衝液(pH 7.5)にて抽出を行い、ろ過して得た上清を粗酵素溶液3として用いた。
【0059】
1−5(酵素の精製)
上記の粗酵素溶液1ないし3について、以下のステップ(1)〜(5)により酵素精製を行い、補酵素結合型グルコース脱水素酵素を単離精製した。
(1)濃縮・脱塩
粗酵素溶液を分画分子量10000の限外濾過膜「ペリコン2モジュール」(ミリポア社製)で濃縮し、20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)に置換して、粗酵素濃縮液を得た。
(2)Butyl−TOYOPEARL650M(東ソー社製)による精製(第1回)
前記粗酵素濃縮液を、65%硫酸アンモニウム飽和(pH7.5)になるように調整後、遠心分離し上清を得た。65%飽和硫酸アンモニウムを含む20mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.5)で予め平衡化したButyl−TOYOPEARL650Mカラムに、この粗酵素液を通液して酵素を吸着させた。このカラムを同緩衝液で洗浄したのち、30%硫酸飽和アンモニウムを含む20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)で酵素を溶出させて活性画分を集めた。さらに、同緩衝液から20mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.5)へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて前記活性画分とあわせた。
(3)DEAE−セルロファインA−500(生化学工業社製)による精製
前記活性画分を分画分子量10000の限外濾過膜「ペリコン2モジュール」で濃縮し、脱塩後15mM トリス・塩酸緩衝液(pH8.5)で平衡化させた。同緩衝液で平衡化したDEAE−セルロファインA−500カラムにこの画分を通液し、活性画分を集めた。
(4)Butyl−TOYOPEARL650M(東ソー社製)による精製(第2回)
前記活性画分を、65%硫酸アンモニウム飽和(pH7.5)になるように調整後、遠心分離し上清を得た。65%飽和硫酸アンモニウムを含む20mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.5)で予め平衡化したButyl−TOYOPEARL650Mカラムに、この上清を通液して酵素を吸着させた。該カラムを同緩衝液で洗浄したのち、30%飽和硫酸アンモニウムを含む20mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.5)で酵素を溶出させて活性画分を集めた。
(5)TSKgel G3000SW(東ソー社製)による精製
前記活性画分を分画分子量13000のペンシル型膜濃縮モジュール「ACP−0013」(旭化成工業社製)で濃縮し、脱塩後0.2M 塩化ナトリウムを含む50mM リン酸カリウム緩衝液(pH5.5)と平衡化させた。前記緩衝液で平衡化したTSKgel G3000SW(直径2.15cm×高さ60cm)に、この画分を通液し、同緩衝液で酵素を溶出させ活性画分を分取した。活性画分をセントリプラス10(アミコン社製)で濃縮し、脱塩後50mM クエン酸・リン酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)に置換した。 粗酵素溶液1から得られた精製酵素(以下、精製酵素1とする)の比活性は約1,800 units/mgであり、粗酵素溶液2から得られた精製酵素(以下、精製酵素2とする)の比活性は約1,010units/mgであった。粗酵素溶液3から得られた酵素(以下、精製酵素3とする)についてもそれらと同等であり、いずれの酵素もその精製倍率は粗酵素溶液に対し100倍以上であった。
【実施例2】
【0060】
(インサートDNAを含むベクターの調製)
(1)全RNAの単離
実施例1の1−1(種培養)に記載の方法によって培養した湿菌体2gを液体窒素により凍結した後、EASYPrep RNA(タカラバイオ社製)を用いて1.5mgの全RNAを抽出した。
(2)cDNAライブラリーの調製
全RNAから、逆転写酵素およびアダプター配列付きオリゴdTプライマーを用いた逆転写反応によりcDNAライブラリーを調製した。反応試薬は、「3’−Full RACE Core Set」(タカラバイオ株式会社製)を使用し、反応条件は説明書記載のプロトコールに準じて行った。
(3)GLD遺伝子のクローニング
cDNAライブラリーを鋳型とし、GLD遺伝子をPCR増幅した。プライマーは、上記実施例1の1−3(固体培養(フスマ培養)による粗酵素溶液の取得)記載のフスマ培養由来の粗酵素溶液2を実施例1の1−5(酵素の精製)記載の方法によって精製して得た、包埋している糖を含まない精製酵素2のN末端および内部配列のアミノ酸をエドマン法によって決定し、このアミノ酸配列に基づいて複数のオリゴヌクレオチドを合成した。最終的にKpnF(配列番号3)、PstR(配列番号4)以下のプライマーセットを用いて目的のGLD遺伝子を取得した。
なお、PCRは、DNAポリメラーゼ、Pyrobest(タカラバイオ株式会社)を使用し、反応条件は[94℃/30秒→55℃/1分→72℃/2分]×25サイクルとした。
次いで、pColdIIIベクター(タカラバイオ株式会社)を制限酵素PstIとKpnIで開裂し、同制限酵素処理したPCR増幅断片をベクターにライゲーションし、大腸菌DH5α株に導入して形質転換した。得られた形質転換体のうち6クローンよりプラスミドDNAを調製し、PstIとKpnIで処理したところ全てのクローンで目的のサイズの断片が確認できた。そのうち4クローンについてプラスミドを調製してそのインサートの配列決定を行ったところ、全てのプラスミドにおいて目的の遺伝子が確認された。
【実施例3】
【0061】
(宿主の形質転換と酵素の精製)
実施例2で作成した組換えベクター(pCGLD)で宿主大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリンを含むLB寒天培地上で形質転換体を選択した。次いで50μg/mlアンピシリンを含むLB液体培地に形質転換体を植菌し、37℃で振とう培養した。培養液のOD600が約0.4〜0.5となった時点で培養液を15℃に冷却し、30分間放置後、IPTGを1mM添加し、さらに15℃で24時間振とう培養を行った。培養終了後、菌体を遠心により集め、10mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)に懸濁した。超音波破砕装置を用いて菌体を破砕後、遠心して無細胞抽出液を調製した。SDS−PAGEおよび活性測定で目的の発現を確認したところ、予想する分子量の酵素発現が確認された。また、培養液当たり、0.09U/mLの酵素活性の発現が確認された。
【0062】
さらに以下のステップ(1)〜(5)により補酵素結合型グルコース脱水素酵素を単離精製した。
(1)濃縮
上記無細胞抽出液を分画分子量10000の限外濾過膜「ペリコン2モジュール」(ミリポア社製)で濃縮し、20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)に置換し、粗酵素液を得た。
(2)Butyl−TOYOPEARL650M(東ソー社製)による精製(第1回)
前記粗酵素液を、65%飽和硫酸アンモニウム液(pH7.5)になるように調整後、遠心分離し上清を得た。65%硫酸アンモニウムを含む20mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.5)で予め平衡化したButyl−TOYOPEARL650Mカラムに、この粗酵素液を通液して酵素を吸着させた。このカラムを同緩衝液で洗浄したのち、30%硫酸アンモニウムを含む20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)で酵素を溶出させて活性画分を集めた。さらに、同緩衝液から20mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.5)へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて前記活性画分とあわせた。
(3)DEAE−セルロファインA−500(生化学工業社製)による精製
前記活性画分を分画分子量10000の限外濾過膜「ペリコン2モジュール」で濃縮し、脱塩後15mM トリス・塩酸緩衝液(pH8.5)と平衡化させた。同緩衝液で平衡化したDEAE−セルロファインA−500カラムにこの画分を通液し、溶出液を集めた。
(4)Butyl−TOYOPEARL650M(東ソー社製)による精製(第2回)
前記溶出液を、65%飽和硫酸アンモニウム液(pH7.5)になるように調整後、遠心分離し上清を得た。65%硫酸アンモニウムを含む20mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.5)で予め平衡化したButyl−TOYOPEARL650Mカラムに、この上清を通液して酵素を吸着させた。該カラムを同緩衝液で洗浄したのち、30%硫酸アンモニウムを含む20mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.5)で酵素を溶出させて活性画分を集めた。
(5)TSKgel G3000SW(東ソー社製)による精製
前記活性画分を分画分子量13000のペンシル型膜濃縮モジュール「ACP−0013」(旭化成工業社製)で濃縮し、脱塩後0.2M塩化ナトリウムを含む50mM リン酸カリウム緩衝液(pH5.5)と平衡化させた。前記緩衝液で平衡化したTSKgel G3000SW(直径2.15cm×高さ60cm)に、この画分を通液し、同緩衝液で酵素を溶出させ活性画分を分取した。活性画分をセントリプラス10(アミコン社製)で濃縮し、脱塩後50mMクエン酸・リン酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)に置換した。得られた酵素(以下、精製酵素4とする)は、比活性約2,450units/mgであり、その精製度は粗酵素液に対し約50倍であった。
【実施例4】
【0063】
(カビの形質転換と酵素の精製)
使用する宿主としては、A.oryzae NS4株を使用した。本菌株は、公知文献1(Biosci. Biotech. Biochem.,61(8),1367−1369,1997)にあるように、1997年(平成9年)に醸造試験所で育種され、転写因子の解析、各種酵素の高生産株の育種などに利用され、分譲されているものが入手可能である。
本菌株に対し、公知文献2(Aspergillus属の異種遺伝子発現系、峰時俊貴、化学と生物、38、12、P831−838、2000)に記載してある、A.oryzae 由来のアミラーゼ系の改良プロモーターを使用し、GLD遺伝子が発現可能なベクターを調製した。
形質転換は、基本的には公知文献2及び公知文献3(清酒用麹菌の遺伝子操作技術、五味勝也、醸協、P494−502,2000)に記載の方法に準じて実施した。形質転換・活性株の選別を繰り返し実施することで、GLD生産能を有するAspergillus oryzae を取得した。
本菌株について、ペプトン1%、ショ糖2%、リン酸水素ニカリウム0.5%、硫酸マグネシウム0.05%を含む培養液で、30℃、5日間振盪培養することで、GLD活性を有する培養液を取得した。
精製方法は、実施例3に記載の方法に準じて実施し、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動でほぼ単一の酵素標品を取得した。これを精製酵素5とする。
【実施例5】
【0064】
(酵母の形質転換と酵素の精製)
使用する宿主としては、高タンパク質生産酵母として知られている、Candida boidinii S2 AOU-1株を、公知文献4(遺伝子発現実験マニュアル−高発現システムによる有用タンパク質の生産、石田功・安東民衛編、講談社サイエンティフィク、P100−129、1994)の方法で、異種遺伝子導入用に改良した菌株を使用した。なお、S2 AOU-1株はCandida boidinii SAM1958と命名され、工業技術院生命工学技術研究所に、受託番号FERM BP−3766として1992年2月25日に寄託されている。
改良した菌株に対し、公知文献5(メタノール資化性酵母による異種遺伝子発現系、由里本博也・阪井康能、化学と生物、38、8、P533−540、2000)に記載してある、S2 AOU−1株由来のメタノール誘導性プロモーターを使用して、GLD遺伝子が発現可能なベクターを調製し、公知文献4,5の方法で形質転換・菌株の選定を行う事で、GLD生産能を有するCandida boidiniiを取得した。
本菌株について、ペプトン2%、酵母エキス1%、グリセロール2%、メタノール1%を含む培養液で、28℃、2日間振盪培養することで、GLD活性を有する培養液を取得した。
精製方法は、実施例3に記載の方法に準じて実施し、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動でほぼ単一の酵素標品を取得した。これを精製酵素6とする。
【実施例6】
【0065】
(酵素分解)
上記実施例1の1−2(液体培養による粗酵素溶液の取得)で調製した粗酵素溶液1を一部取り、スミチームPX、スミチームARSを0.1%(v/v)添加し、40℃で2時間反応させた。反応終了後、SDS−PAGEに供し、糖鎖染色キット(Gelcode Glycoprotein Staining Kit(PIERCE社製))を使用して所定の方法で糖鎖染色を実施したが、糖鎖の分解は確認できなかった。
(過ヨウ素酸による酸化、還元、酸加水分解)
アルミホイルで覆った1.5mL容のエッペンドルフチューブに、粗酵素溶液1をタンパク質量として20μgとなるように加え、8分の1量の0.8N メタ過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO)水溶液を添加し(最終濃度:0.1N)、25℃で24時間の酸化反応を行った。次に、この溶液に対して10分の1量の0.4N NaBH水溶液を添加し、室温で10時間還元反応させた。さらにこの溶液に対して10分の1量の1N 硫酸水溶液を添加し、25℃で24時間の加水分解を行った。本試料についても、上記(酵素分解)試験における確認試験と同様に、SDS−PAGEに供し、糖鎖染色キットを用いて糖鎖染色を実施したが、糖鎖の分解は確認できなかった。
【0066】
(電気泳動(糖鎖染色、クマシー・ブリリアント・ブルー(CBB)染色、活性染色))
実施例1ないし5で得られたそれぞれの酵素溶液(精製酵素1、2、4、5、および6)に対して、タンパク質0.1mgあたりグリコペプチダーゼF(和光純薬社製)1ユニットを添加し、37℃で15時間反応させ糖鎖切断処理を行った後、SDS−PAGEに供し、そのゲルを糖鎖染色することによって糖鎖の量および糖鎖が切断されているかどうかの確認を行った。糖鎖染色は糖鎖染色キット(Gelcode Glycoprotein Staining Kit(PIERCE社製))を使用して所定の方法で実施した(図1)。その結果、液体培養上清から精製した酵素である精製酵素1には多量の糖が確認され、糖鎖切断処理前後で差が見られず、グリコペプチダーゼFが作用していないと推察された。一方、固体培養から精製した酵素である精製酵素2、5及び6は糖鎖切断処理後に分子量が小さくなり、グリコペプチダーゼFにより糖鎖が一部切断されていた。
また、同様にSDS−PAGEを行い、クマシー・ブリリアント・ブルー(CBB)染色すると、精製酵素1はCBB染色されにくく、精製酵素2、4、5及び6は、CBBにより良く染色された(図2)。以上の結果から、液体培養により得られた精製酵素に比べて、固体培養又は遺伝子組換え法により得られた精製酵素は、結合している糖含量が減少しており、CBB染色もされやすいことが判明した。
また、Native−PAGE用の電気泳動ゲルNPU−7.5L(ATTO株式会社製)を用いて、Native−PAGEによる電気泳動分析を行い、活性染色を行った。結果を図3に示す。なお、レーン7は液体培養し、酵素活性を20mUに調整したときのものである。また、レーン8はフスマ培養し、酵素活性を20mUに調整したときのものであり、レーン9はオートミール培養し、酵素活性を20mUに調整したときのものである。レーン7は精製酵素1を表し、レーン8は精製酵素2を表し、レーン9は精製酵素3を表す。
液体培養上清から精製した精製酵素1に比べて、固体培養から精製した酵素である精製酵素2及び精製酵素3の泳動位置はいずれもより下方の位置に見られた。以上の結果から、液体培養から固体培養に変えることによって、得られる酵素の糖含量が少なくなり、CBB染色されやすくなったことが判明した。
上記実施例の結果より、精製酵素1とその他精製酵素は糖の含量および組成に違いがあるものと推測し、酵素の糖分析を行った。
【実施例7】
【0067】
(ABME標識−HPLC分析による糖組成の分析)
まず、試験管にp−アミノ安息香酸メチル(ABME)35mgと水素化シアノホウ素ナトリウム3.5mgをはかりとり、メタノール350μlと酢酸41μlを加えて撹拌し、調整した。
上記実施例1ないし5にて得られた各々の精製酵素溶液を、タンパク濃度として1.0mg/mL濃度となるよう調整した後、100μLをネジ口試験管にはかりとり、窒素気流下で乾固した後、4N TFA(トリフルオロ酢酸)溶液を0.2mL加えて100℃で4時間反応させた。反応後、チューブエバポレーターで減圧乾固し、さらに200μLのイオン交換水を加え、減圧乾固する操作を3回繰り返し、TFAを完全に除去した。ドラフト内で、メタノール200μLとピリジン20μLおよび無水酢酸20μLを加え、室温に2時間以上放置してN−アセチル化反応を行った。反応溶液を窒素気流下で乾固し、イオン交換水1mLに溶解し、あらかじめ洗浄したPRE−SEP C18カートリッジカラム(日本ウォーターズ株式会社製)にかけ、イオン交換水15mLで溶出させた。溶出液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、さらにネジ口試験管に移してチューブエバポレーターで減圧乾固した。残渣をイオン交換水20μLに溶解させABME試薬80μLを加えて、80℃で45分間反応させた。反応終了後の溶液を窒素気流下で乾固した後、イオン交換水2mLとジエチルエーテル2mLを加えて撹拌した。これを遠心分離し、未反応のABMEを含むエーテル層を除去した。このエーテル抽出を5回繰り返し、得られた水層はチューブエバポレーターで減圧乾固し、ABME誘導体化糖を得た。これを2mLの高純水に溶解してHPLC分析を行った。
HPLCの分析カラムとしてはWakosil 5C18−200(4.0×250mm;和光純薬工業株式会社製)を用い、カラム温度40℃、流速0.5mL/min、溶媒には5%アセトニトリル/0.1M 酢酸溶液(溶媒A)、15%アセトニトリル/0.1M 酢酸溶液(溶媒B)を用いた。溶出は、試料注入後から20分間A:B=100:0で溶出を行った後、80分でA:B=0:100になるような直線濃度勾配で行った。検出はUV304nmで行った。
【0068】
その結果、液体培養由来の精製酵素1については、ガラクトース、マンノース、アラビノース、ラムノース、N−アセチルグルコサミンが検出され、グルコースは検出できなかった。一方、フスマ培養由来の精製酵素2については、マンノースとN−アセチルグルコサミンが検出され、グルコース、ガラクトース、アラビノース、ラムノースは検出されなかった。その他、各精製酵素の糖含量は表1の通りであった。
【0069】
【表1】

【実施例8】
【0070】
(補酵素結合型グルコース脱水素酵素の性質試験)
上記の実施例1ないし5によって単離した精製酵素1ないし6について、作用性、基質特異性、阻害剤および補酵素を調べた。なお、酵素活性は、WO2004/058958の明細書36頁及び37頁の、酵素活性測定法−1、酵素活性測定法−2の記載に従って測定した。
1)作用性
各精製酵素を、8.66mM DCIP存在下で500mM D−グルコースと反応させ、反応産物をD−グルコン酸/D−グルコノ−δ−ラクトン定量キット(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)で定量した。その結果、いずれの精製酵素についてもD−グルコン酸の生成が確認され、これより本発明の精製酵素2ないし6は、精製酵素1と同様にD−グルコースの1位の水酸基を酸化する反応を触媒する酵素であることが明らかになった。
2)至適pH:
酵素活性測定法−2の緩衝液を、それぞれリン酸カリウム緩衝液(pH6.0〜7.0)、トリス・塩酸緩衝液(pH7.4〜8.0)もしくはグリシン・水酸化ナトリウム緩衝液(pH8.6〜9.1)(各緩衝液とも終濃度で17mM)に適宜置き換えて、酵素活性測定法−2と同様の方法で様々なpH域における該精製酵素の酵素活性を測定した。その結果、精製酵素4、5及び6の至適pHは、7.0〜9.0であった。
3)安定pH
該精製酵素を、それぞれ50mM濃度の緩衝液、すなわち酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液(pH3.6〜5.3)、リン酸カリウム緩衝液(pH6.0〜6.8)、トリス・塩酸緩衝液(pH7.7)およびグリシン・水酸化ナトリウム緩衝液(pH8.6〜10.0)に溶解し、40℃で60分間保持した後に、活性測定方法−1で酵素活性を測定し、酵素活性の残存率を分析した。精製酵素5の安定pHは、4.5〜8.5であった。
4)至適温度
補酵素結合型グルコース脱水素酵素を50mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に溶解し、上記の活性測定方法−1により30℃〜62℃までの範囲で酵素活性を測定した。その結果、精製酵素5の至適温度は、55℃付近であった。
5)温度安定性
補酵素結合型グルコース脱水素酵素を50mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に溶解し、0℃より55℃までのいくつかの温度で15分間保持したのち、活性測定方法1で酵素活性を測定し、酵素活性の残存率を分析した。ここで、酵素活性の残存率は、0℃で15分間保持した時の酵素活性値を100%として算出した。その結果、精製酵素5は、50℃においても89%の酵素活性が保持され、約50℃以下で安定であった。
6)サブユニット分子量:
12.5% ポリアクリルアミドゲルを使用しLaemmliらの方法(Nature (1970)227:680−685)に従い、該精製酵素をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)に掛けた。泳動後にクマシー・ブリリアント・ブルー(CBB)染色し、移動度を分子量マーカー(LMW Marker;アマシャムファルマシアバイオテク社製)のそれと比較した結果、各酵素のサブユニット分子量は、精製酵素2が約71kDa、精製酵素4が約58kDa、精製酵素5が約81kDa、精製酵素6が約128kDaであった。
7)基質特異性
活性測定方法−1における活性測定用反応液の基質を、D−グルコースおよび他の各基質(いずれも終濃度333mM、D−セロビオースは193mM、D−トレハロースおよびD−ラフィノースは121mM)を使用し、酵素活性測定法−1に則り精製酵素1ないし6の酵素活性を測定した。D−グルコースに対する活性値を100%として、各基質に対する活性値をそれに対する相対値として換算した。
また同様に、D−グルコースおよびマルトースについてそれぞれ終濃度550mMおよびl00mMの2種類を設定し、相対反応性(酵素活性)を測定した。結果はD−グルコースの値を基準に相対値として換算した。
これより、本発明の精製酵素2ないし6は、精製酵素1と同様に、D−グルコースには強く作用し、D−マンノース、1、5−アンヒドロ−D−グルシトール、D−セロビオース、D−トレハロース、マルトース、D−ガラクトース、D−グルコース−6−リン酸、D−フルクトースには弱く作用した。また、L−アラビノース、ラクトース、D−ソルビトール、グルコン酸、スクロース、D−マンニトール、L−ゾルボース、D−リボース、L−ラムノース、D−グルコース−1−リン酸、D−ラフィノース、エタノール、グリセロールにはほとんど作用しなかった。
8)阻害剤
活性測定方法−1の反応系において、それぞれ終濃度がlmM、5mM、10mM、 25mMおよび50mMになるようにメタノールに溶解した1,10−フェナントロリンをそれぞれ加え、精製酵素1ないし6の活性を活性測定方法−1に従い測定した。なお、反応系に対するメタノールはいずれも終濃度10%(v/v)であった。対照区は、活性測定方法−1に、終濃度が10%(v/v)になるようにメタノールを添加して測定を行った。その結果、1,10−フェナントロリンを最終濃度1mM以上に加えた場合の阻害率はいずれも60%以上と高かった。
9)補酵素
精製酵素1ないし6にD−グルコースを添加し、吸光分析を行ったところ、いずれも385nm及び465nmに認められた吸収極大が該添加により消失したことから、補酵素がFADであることが明らかとなった。なお、これらの吸収極大はFADに特有であり、FADのみ加えない対照反応系を構築した場合に観測されないものであった。
【実施例9】
【0071】
(センサ特性の比較)
実施例1において得られた精製酵素1、および実施例3ないし5において得られた精製酵素4ないし6を使用し、電気化学アナライザーCHI611A(ビー・エー・エス社製)で各々二分子反応速度定数を求めた。なお、補助電極には白金、作用電極にはカーボン、参照電極には銀/塩化銀を使用した。pH7.0のモップス緩衝液中に終濃度142mMグルコース及び精製酵素4を0.45μM、精製酵素5を0.76μM、精製酵素6を1.9μM、あるいは精製酵素1を1.1μMを添加し、終濃度0mMから0.57mMになるまでオスミウム錯体である[Os(4-Methyl-imidazole)2(4-dimethyl-bipyridine)2](PF6)2を順次添加し、各濃度(図4参照)でサイクリックボルタモグラムを測定した結果、精製酵素4の二分子反応速度定数は8.15×10−1−1、精製酵素5の二分子反応速度定数は7.36×10−1−1、また精製酵素6の二分子反応速度定数は9.38×10−1−1だった。精製酵素1は定常電流値が見られないほどに低く、二分子反応速度定数は算出できなかった(図4)。
また、同様にpH7.0のモップス緩衝液中に終濃度142mMグルコース及び精製酵素4を0.45μM、精製酵素5を0.76μM、精製酵素6を0.55μM、あるいは精製酵素1を1.1μMを添加し、終濃度0mMから0.22mMになるまでキノン化合物である2,3-dimethoxy-5-methyl-1,4-benzoquinoneを順次添加し、各濃度(図5参照)におけるサイクリックボルタモグラムを測定した結果、精製酵素4の二分子反応速度定数は1.14×10−1−1、精製酵素5の二分子反応速度定数は5.29×10−1−1、また精製酵素6の二分子反応速度定数は2.49×10−1−1だった。精製酵素1の二分子反応速度定数は5.69×10−1−1と低かった。
これらの結果から、遺伝子を組換えた細胞から得られた酵素は、野生株から得られた酵素より反応性が向上したことが分かった(図5)。
【0072】
実施例1で得られた精製酵素1および2を使用し、電気化学アナライザーCHI611A(ビー・エー・エス社製)で各々の二分子反応速度定数を求めた。なお、補助電極には白金、作用電極にはカーボン、参照電極には銀/塩化銀を使用した。pH7.0のモップス緩衝液中に終濃度142mMのグルコース及び精製酵素1を0.94μMまたは精製酵素2を3.3μM添加し、終濃度0mMから0.671mMになるまでフェリシアン化カリウムを順次添加し、各フェリシアン化カリウム濃度(0、0.019、0.048、0.095、0.142、0.188、0.234、0.280、0.325、0.370、0.414、0.458、0.501、0.544、0.587、0.629、0.671mM)でサイクリックボルタモグラムを測定した結果、精製酵素2の二分子反応速度定数は2.84×10−1−1だった。精製酵素1は定常電流値が見られないほどに低く、二分子反応速度定数は算出できなかった。精製酵素1は糖包埋型酵素のため反応性が弱いが、精製酵素2は包埋している糖のない、通常の糖鎖を持つ酵素であるため、反応性が改善されたと推察される。
【実施例10】
【0073】
(酵素固定化電極によるグルコースの測定)
精製酵素1、2、4、5、及び6を使用し、酵素固定化電極によるD−グルコースの測定を行った。各々の酵素1.0Uを固定化したグラッシーカーボン(GC)電極を用いて、グルコース濃度に対する応答電流値を測定した。電解セル中に、50mM リン酸ナトリウムバッファー(pH7.0)1.8mlおよび1M ヘキサシアノ鉄(III)酸カリウム(フェリシアン化カリウム)水溶液0.2mlを添加した。GC電極をポテンショスタットBAS100B/W(BAS製)に接続し、40℃で溶液を撹拌し、銀塩化銀参照電極に対して+500mVを印加した。これらの系に1M D−グルコース溶液を20μl添加し、定常状態の電流値を測定した。更に同量の1M D−グルコース溶液を添加し電流値を測定するという作業を、各々3回繰り返した。この電流値を既知のグルコース濃度(約10、20、30、40mM)に対してプロットしたところ、検量線が作成できた(図6)。これより本発明のGLDを使用した酵素固定化電極でグルコースの定量が可能であることが示された。
【実施例11】
【0074】
配列番号1より複数のオリゴヌクレオチドを合成し、最終的に配列番号13及び配列番号14のプライマーセットを用いて、FADを補酵素とする補酵素結合型グルコース脱水素酵素生産株であるアスペルギルス・ジャポニカス(Aspergillus japonicus)IFO4408、ペニシリウム・シアニウム(Penicillium cyaneum)IFO5337及びガノデルマ・アプラナツム(Ganoderma applanatum)IFO6498のDNAを鋳型とし、PCRを行った。なお、DNAは実施例1記載の条件で各株を培養し、得られた湿菌体を液体窒素により凍結後粉砕し、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(25:24:1)(ニッポンジーン社製)で抽出した。PCRは、TaKaRa LA Taq(タカラバイオ社製)を使用し、サーマルサイクラー(ストラタジーン社製)を用いて、[94℃/30秒→42℃/30秒→72℃/1.5分]×35サイクルの反応条件で行った。約1.6kbpの各増幅産物の配列を解析しイントロンを除いたcDNA配列と、配列番号1、あるいは公知のグルコース酸化酵素及びソルボース脱水素酵素の配列と比較したところ、FADを補酵素とする補酵素結合型グルコース脱水素酵素に特有の塩基配列(配列番号5−7)及び、アミノ酸配列(配列番号8−12)が明らかになった。特に配列番号8のアミノ酸配列はFADの結合サイトであり、活性中心の一部であると思われる。
【産業上の利用可能性】
【0075】
本発明は、糖尿病検査の分野で利用が可能である。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
電子受容体存在下で、グルコースを脱水素する反応を触媒し、配列番号2で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号8−12に記載の補酵素結合型グルコース脱水素酵素コンセンサス配列を有し、かつ下記1)から4)の性質:
1)フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)を補酵素とする、
2)酸素を電子受容体としない、
3)グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が5%以下である、および
4)グルコースの1位の水酸基を酸化し、グルコースをグルコノ−δ−ラクトンに変換する反応を触媒する、
を有する可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチド。
【請求項2】
前記補酵素結合型グルコース脱水素酵素が、配列番号2で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項3】
前記補酵素結合型グルコース脱水素酵素が、配列番号2で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項4】
電子受容体存在下で、グルコースを脱水素する反応を触媒し、配列番号2の第20−592番目のアミノ酸配列と60%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号8−12に記載の補酵素結合型グルコース脱水素酵素コンセンサス配列を有し、かつ下記1)から4)の性質:
1)フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)を補酵素とする、
2)酸素を電子受容体としない、
3)グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が5%以下である、および
4)グルコースの1位の水酸基を酸化し、グルコースをグルコノ−δ−ラクトンに変換する反応を触媒する、
を有する可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチド。
【請求項5】
前記補酵素結合型グルコース脱水素酵素が、配列番号2の第20−592番目のアミノ酸配列に対して少なくとも70%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる請求項4に記載のポリヌクレオチド。
【請求項6】
前記補酵素結合型グルコース脱水素酵素が、配列番号2の第20−592番目のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる請求項4に記載のポリヌクレオチド。
【請求項7】
電子受容体存在下で、グルコースを脱水素する反応を触媒し、配列番号8−12に記載の補酵素結合型グルコース脱水素酵素コンセンサス配列を有し、かつ下記1)から4)の性質:
1)フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)を補酵素とする、
2)酸素を電子受容体としない、
3)グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が5%以下である、および
4)グルコースの1位の水酸基を酸化し、グルコースをグルコノ−δ−ラクトンに変換する反応を触媒する、
を有する可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素をコードし、かつ配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得るポリヌクレオチド。
【請求項8】
アスペルギルス(Aspergillus)属の微生物から単離された請求項1〜7のいずれか1項記載のポリヌクレオチド。
【請求項9】
アスペルギルス・テレウス(A.terreus)から単離された請求項1〜8のいずれか1項記載のポリヌクレオチド。
【請求項10】
請求項1〜9のいずれか1項記載のポリヌクレオチドを保有する組換えベクター。
【請求項11】
請求項10記載の組換えベクターを用いることによって作成された形質転換細胞。
【請求項12】
請求項11記載の形質転換細胞を培養し、得られた培養物から、グルコースを脱水素する作用を有する補酵素結合型グルコース脱水素酵素を採取することを特徴とする補酵素結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。

【図4】
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【図5】
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【図6】
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【図1】
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【図2】
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【図3】
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【公開番号】特開2012−139230(P2012−139230A)
【公開日】平成24年7月26日(2012.7.26)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2012−53703(P2012−53703)
【出願日】平成24年3月9日(2012.3.9)
【分割の表示】特願2007−509374(P2007−509374)の分割
【原出願日】平成18年3月27日(2006.3.27)
【出願人】(000210067)池田食研株式会社 (35)
【Fターム(参考)】