説明

補酵素A依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ経路によるポリヒドロキシアルカノエート産生

【課題】供給物中の3−ヒドロキシ酸のレベルを上昇させることを回避する、PHAポリマーを産生する方法を提供する。
【解決手段】補酵素A依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ経路によるPHAポリマー産生からなる。アシル−CoAトランスフェラーゼ、アシル−CoAシンテターゼ、β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−CoAレダクターゼおよび/またはPHAシンターゼのうちの1以上の酵素をコードする遺伝子を生物体中で発現させる工程であって、少なくとも1つの遺伝子は、異種遺伝子である工程、ならびに該生物体にアルコールを供給する工程を包含する方法である。この変換工程における少なくとも1工程は、補酵素A依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を含む。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
(関連出願の引用)
2002年9月16日に出願した米国仮出願第60/410,087号に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【0002】
(発明の背景)
本発明は、一般に、2−ヒドロキシ酸モノマーの作製方法、および得られるポリヒドロキシアルカノエートポリマーの分野に関する。
【0003】
多数の微生物は、PHAポリマーの細胞内貯蔵を蓄積する能力を有する。ポリ[(R)−3−ヒドロキシアルカノエート](PHA)は、再生可能資源から製造される生分解性熱可塑性材料であり、広範囲の産業応用および生物医学的応用を有する(WilliamsおよびPeoples,1996,CHEMTECH 26,38−44)。文献(SteinbuechelおよびValentin,1995,FEMS Microbiol.Lett.128;219−228)において報告されているところによれば、約100種の異なるモノマーが、PHAポリマー中に取り込まれており、そしてこれらの代謝の生物学および遺伝学が概説されている(HuismanおよびMadison,1998,Microbiology and Molecular Biology Reviews,63:21−53)。
【0004】
今日までに、PHAは、商業的利用性は制限されているようであり、コポリマーポリ(3−ヒドロキシブチレート−co−3−ヒドロキシバレレート)(PHBV)のみが開発量で入手可能である。このコポリマーは、細菌Ralstonia eutrophaの発酵によって産生されている。他のPHA型についての発酵および回収のプロセスもまた、Azotobacter、Alcaligenes latus、Comamonas testosteroneならびに遺伝子操作されたE.coliおよびKlebsiellaを含めたある範囲の細菌を用いて開発されており、近年概説されている(Brauneggら,1998,Journal of Biotechnology 65:127−161;ChoiおよびLee,1999,Appl.Microbiol.Biotechnol.51:13−21)。より伝統的なポリマー合成アプローチもまた調べられており、このアプローチとしては、対応するラクトンの直接縮重および開環重合が挙げられる(JesudasonおよびMarchessault,1994,Macromolecules 27:2595−2602)。
【0005】
モノマー4−ヒドロキシブチレート(PHB4HB)を含むPHAポリマー(Doi,Y.1995,Macromol.Symp.98,585−599)または4−ヒドロキシバレレートおよび4−ヒドロキシヘキサノエートを含むPHAポリエステルの合成が記載されている(Valentinら,1992,Appl.Microbiol.Biotechnol.36,507−514およびValentinら,1994,Appl.Microbiol.Biotechnol.40,710−716)。これらのポリエステルは、これらのモノマーをPHAポリエステル中に無理やり取り込ませるために、微生物に比較的高価な非炭水化物供給材料が供給される、PHBVについて元々記載された方法と類似の方法を用いて製造されている。このPHB4HBコポリマーは、ある範囲のモノマー組成を有して産生され得、これは、さらにある範囲のポリマーを提供する(Saito,Y,Nakamura,S.,Hiramitsu,M.およびDoi,Y.,1996,Polym.Int.39:169)。
【0006】
3−ヒドロキシバレレート(3HV)を含むPHAコポリマー(特に、ポリ−3−ヒドロキシブチレート−co−3−ヒドロキシバレレート(PHBV))は、商標名BiopolTMで市販されている。PHBVは、Ralstonia eutropha(以前はAlcaligenes eutrophus)を用いて、同時供給物(例えば、プロピオネート、イソブチレート(Holmesら,米国特許第4,477,654号)または奇数鎖長アルコールもしくは脂肪酸)と組み合わせた炭水化物供給材料(例えば、グルコース)から商業的に産生されている。多数の他の微生物およびプロセスが当業者に公知である(Brauneggら1998,Journal of Biotechnology 65:127−161)。3HV単位を含むPHAもまた、組換え微生物を用いて合成されている。R.eutrophaのPHA生合成遺伝子を保有するEscherichia coliは、グルコースと、プロピオネートまたはバレレートのいずれかとからPHBVを産生するために用いられている(Slaterら,1992,Appl.Environ.Microbiol.58:1089−1094)。R.eutrophaのPHA生合成遺伝子を保有するKlebsiella oxytocaは、グルコースおよびプロピオネートからPHBVを産生するために用いられている(Zhangら,1994,Appl.Environ.Microbiol.60:1198−1205)。Aeromonas caviaeのPHAシンターゼ遺伝子を保有するR.eutrophaは、炭素数が奇数のアルカン酸からポリ(3HV−co−3HB−co−3HHp)を産生するために用いられた(Fukuiら,1997,Biotechnol.Lett.19:1093−1097)。SkralyおよびPeoplesに対する米国特許第6,329,183号は、1,2−プロパンジオールから、3HV単位を含むPHAコポリマーを産生する方法を記載する。Huismanらに対するPCT WO 00/43523は、ブチレートまたはブタノールの同時供給物から3−ヒドロキシヘキサノエート(3HH)モノマー単位を含むPHAを産生する方法を記載する。これらの場合の各々において、アルコール同時供給物は、遊離酸に変換され、次いでこの遊離酸は、脂肪アシル−補酵素Aシンテターゼまたは脂肪アシル−CoAトランスフェラーゼの作用により、補酵素Aチオエステルへと活性化された。いくつかの場合には、この酵素活性は、宿主株にとって内在性であり、他の宿主株においてはこの活性は、遺伝子操作によって提供された。
【0007】
開示された発明を実施するために適切な組換えPHA産生株を開発するための遺伝子および技術は、一般に、当業者に公知である(MadisonおよびHuisman,1999,Microbiology and Molecular Biology Reviews,63:21−53;PCT WO 99/14313)。
【0008】
3HVコポリマーは、広範囲の適用において有用であることが証明されている。いくつかの場合には、約7〜12重量%のコモノマーの3HVレベルを有するPHBVコポリマーが適切である。他の場合には、15〜30重量%の3HVレベルがより有用である(EP LATEX)。より高レベルの3HVは、供給物中のプロピオン酸のレベルを上昇させることによって達成される。しかし、このストラテジーに関連した2つの負の結果が存在する。第1に、プロピオン酸は細胞にとって毒性であり、それゆえ、増殖速度およびポリマー産生を低下させ、産生コストの顕著な増加を表す。第2の影響は、プロピオン酸の一部が、他の代謝プロセスに用いられ得、それゆえ、ポリマー中に取り込まれないことである。プロピオン酸は供給成分のうちの最も高価であるので、このことは、産生コストの別の増加を表す。それゆえ、同時供給において高い生産性および良好な収率を有する3HVコポリマーを産生する微生物系を開発することが望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【特許文献1】米国特許第4,477,654号明細書
【特許文献2】米国特許第6,329,183号明細書
【特許文献3】国際公開第00/43523号
【特許文献4】国際公開第99/14313号
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】WilliamsおよびPeoples,1996,CHEMTECH 26,38−44
【非特許文献2】SteinbuechelおよびValentin,1995,FEMS Microbiol.Lett.128;219−228
【非特許文献3】HuismanおよびMadison,1998,Microbiology and Molecular Biology Reviews,63:21−53
【非特許文献4】Brauneggら,1998,Journal of Biotechnology 65:127−161
【非特許文献5】ChoiおよびLee,1999,Appl.Microbiol.Biotechnol.51:13−21
【非特許文献6】JesudasonおよびMarchessault,1994,Macromolecules 27:2595−2602
【非特許文献7】Doi,Y.1995,Macromol.Symp.98,585−599
【非特許文献8】Valentinら,1992,Appl.Microbiol.Biotechnol.36,507−514
【非特許文献9】Valentinら,1994,Appl.Microbiol.Biotechnol.40,710−716
【非特許文献10】Saito,Y,Nakamura,S.,Hiramitsu,M.およびDoi,Y.,1996,Polym.Int.39:169
【非特許文献11】Slaterら,1992,Appl.Environ.Microbiol.58:1089−1094
【非特許文献12】Zhangら,1994,Appl.Environ.Microbiol.60:1198−1205
【非特許文献13】Fukuiら,1997,Biotechnol.Lett.19:1093−1097
【非特許文献14】MadisonおよびHuisman,1999,Microbiology and Molecular Biology Reviews,63:21−53
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
それゆえ、本発明の目的は、供給物中の3−ヒドロキシ酸のレベルを上昇させることを回避する、PHAポリマーまたはPHAコポリマーを産生するために適切な方法および微生物株を提供することである。
【0012】
本発明のさらなる目的は、供給物中の3−プロピオン酸の使用を回避する、3HV単位を含むPHAポリマーの産生に適切な方法および微生物株を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0013】
(発明の要旨)
補酵素A依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アシル−CoAトランスフェラーゼ、アシル−CoAシンテターゼ、β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−CoAレダクターゼおよびPHAシンターゼのうちの1以上をコードする遺伝子を含む生物体が提供される。いくつかの場合には、これらの遺伝子のうちの1以上は宿主生物体にとってネイティブであり、残りの遺伝子は、異種遺伝子から、遺伝子操作によって提供される。これらの生物体は、ポリ(3−ヒドロキシアルカノエート)ホモポリマーまたは3−ヒドロキシ酪酸以外の3−ヒドロキシアルカノエートモノマーを含むコポリマーを産生し、ここで、これらの3−ヒドロキシアルカノエート単位は、アルコールから3−ヒドロキシアシル−CoAモノマーへの、酵素によって触媒された変換に由来し、そしてここでこの変換経路における少なくとも1つの工程は、補酵素A依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を含む。
【0014】
このPHAポリマーは、容易に回収され、そして物品(例えば、フィルム、ラテックス、コーティング、接着剤、繊維、結合剤、樹脂および種々の医療用デバイス)用のポリマーとして産業的に有用である。この医療用デバイスは、例えば、治療剤、予防剤または診断剤の制御放出、組織操作骨格、細胞カプセル化、標的化送達、生体適合性コーティング、生体適合性インプラント、組織再生誘導、創傷包帯、整形外科デバイス、プロテーゼ、骨セメントまたは診断剤のために用いられ得る。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】図1は、プロピレングリコールおよび1−プロパノールからプロピオニル−CoAの形成、ならびにブタノールからブチリル−CoAへの形成に至る経路を示す。
【図2】図2は、インヒビターの不存在下、インヒビターであるプロピオネートの存在下またはインヒビターである1−プロパノールの存在下でのE.coli株MBX1335の増殖速度を示す。
【発明を実施するための形態】
【0016】
(発明の詳細な説明)
(I.ポリヒドロキシアルカノエート(PHA)組成物)
本明細書中で用いられる場合、「PHA材料」は、以下の式I:
−OCR(CRCO−;
の1以上の単位(例えば、10と100,000との間、好ましくは100と30,000との間の単位)および以下の式II:
−OCR(CRCO−
の1以上の単位(例えば、1と100,000との間、好ましくは10と30,000との間の単位)を含む;
nは整数(例えば、1と15との間、好ましい実施形態では1と4との間)であり;
mは、整数(例えば、0と15との間、好ましい実施形態では0と4との間)であり;
そして
、R、R、およびRは独立して、水素または炭化水素ラジカル(長鎖炭化水素ラジカルが挙げられる);ハロ−およびヒドロキシ−置換ラジカル;ヒドロキシラジカル;ハロゲンラジカル;窒素置換ラジカル;ならびに/または酸素置換ラジカルであり得る。
【0017】
本明細書中で用いられる場合、式−(CR−または−(CR−は、以下の式を含むと定義される:
−CR−(ここでnまたはm=1);
−CRCR3’4’−(ここでnまたはm=2);および
−CRCR3’4’CR3”4”−(ここでnまたはm=3);
ここでR、R、R3’、R4’、R3”およびR4”は、独立して、炭化水素ラジカル(長鎖炭化水素ラジカルが挙げられる);ハロ−およびヒドロキシ−置換ラジカル;ヒドロキシラジカル;ハロゲンラジカル;窒素置換ラジカル;酸素置換ラジカル;ならびに/または水素原子であり得る。従って、式Iまたは式IIは、3−ヒドロキシ酸(nまたはm=1)、4−ヒドロキシ酸(nまたはm=2)、および5−ヒドロキシ酸(nまたはm=3)由来の単位を含む。式IIは、2−ヒドロキシ酸(m=0)(例えば、乳酸またはグリコール酸)由来の単位を含む。
【0018】
このポリマーは代表的に、300を超える分子量(例えば、300と10との間、好ましい実施形態では10,000〜10,000,000ダルトン)を有する。
【0019】
代表的な実施形態では、このPHAポリマーは、3HV単位を含むコポリマーである。別の実施形態では、このPHAポリマーは、3HH単位を含むコポリマーである。
【0020】
(II.2−ヒドロキシ酸モノマーを含むPHAの生合成のための方法)
((1)ポリヒドロキシアルカノエートの合成)
1980年代半ばの間、いくつかの研究グループが、PHA合成を担う遺伝子および遺伝子産物を活発に同定し単離した。これらの努力により、微生物および植物の両方におけるPHAの産生のためのトランスジェニック系の開発、ならびにPHA合成のための酵素的方法がもたらされた。このような経路は、利用可能なPHA型をさらに増大させ得る。これらの進歩は、WilliamsおよびPeoples,CHEMTECH,26:38−44(1996)ならびにWilliamsおよびPeoples,Chem.Br.33:29−32(1997)において概説されている。
【0021】
分解速度を改変するためのその後の改変に適切なPHAポリマーを産生するために用いられ得る方法は、例えば、以下に記載されている:Holmesらに対する米国特許第4,910,145号;Byrom,「Miscellaneous Biomaterials」,Biomaterials(Byrom編),333−59頁(MacMillan Publishers,London 1991);HockingおよびMarchessault,「Biopolyesters」,Chemistry and Technology of Biodegradable Polymer(Griffin編),48−96頁(ChapmanおよびHall,London 1994);Holmes,「Biologically Produced (R)−3−hydroxyalkanoate Polymers and Copolymers」,Developments in Crystalline Polymers(Bassett編),第2巻,1−65頁(Elsevier,London 1988);Laffertyら,「Microbial Production of Poly−b−hydroxybutyric acid」,Biotechnology(RehmおよびReed編)第66巻,135−76頁(Verlagsgesellschaft,Weinheim 1988);MullerおよびSeebach,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.32:477−502(1993);Steinbuechel,「Polyhydroxyalkanoic Acids」,Biomaterials(Byrom編),123−213頁(MacMillan Publishers,London 1991);WilliamsおよびPeoples,CHEMTECH,26:38−44,(1996);SteinbuechelおよびWiese,Appl.Microbiol.Biotechnol.,37:691−697(1992);米国特許第5,245,023号;同第5,250,430号;同第5,480,794号;同第5,512,669号;および同第5,534,432号;Agostiniら,Polym.Sci.,第A−1部,9:2775−87(1971);Grossら,Macromolecules,21:2657−68(1988);Duboisら,Macromolecules,26:4407−12(1993);LeBorgneおよびSpassky,Polymer,30:2312−19(1989);TanahashiおよびDoi,Macromolecules,24:5732−33(1991);Horiら,Macromolecules,26:4388−90(1993);Kemnitzerら,Macromolecules,26:1221−29(1993);Horiら,Macromolecules,26:5533−34(1993);Hockingら,Polym.Bull.,30:163−70(1993);Xieら,Macromolecules,30:6997−98(1997);Hubbsに対する米国特許第5,563,239号;Nodaらに対する米国特許第5,489,470号および同第5,520,116号。これらの方法に由来するPHAは、任意の形態(ラテックスまたは固体形態が挙げられる)であり得る。
【0022】
いくつかの微生物由来のPHAの生合成に関与する遺伝子の同定、クローニングおよび組換え生物体内でのこの遺伝子の発現は、ネイティブなPHA産生株ではない生物体内でのPHAの産生を可能にする。好ましい例は、E.coliおよび医療用途のPHAである。E.coliは、生物薬剤の産生についてよく認識されている宿主である。このような組換え生物体は、より大きな程度のPHA産生プロセス制御を提供する。なぜなら、これらは、望ましくないPHA前駆体の生合成またはPHA分解についてのバックグラウンドの酵素活性を有さないからである。さらに、組換え生物体の適切な選択は、産生されたPHAの精製を促進するかまたは産生されたPHAの生体適合性の増大を可能にする。
【0023】
組換え生物体中でのPHA合成についての最少の必要要件は、ヒドロキシアルカノイル−CoAおよび適切なPHAシンターゼの供給源である(GerngrossおよびMartin,Proc.Natl.Acad.Sci.92:6279−83(1995))。組換えPHA産生株は従って、ヒドロキシアルカノイル−CoAモノマーについての生合成経路および適切なPHAシンターゼを必要とする。ホモポリマーの産生は、この生物体がPHAシンターゼについて1つのみの適切な基質を産生することを必要とする。なぜなら、複数の基質の産生は、PHAコポリマーの形成をもたらすからである。
【0024】
((2)CoA依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼを介した3−ヒドロキシアシル−CoAの形成)
プロピオン酸は、3HV含有PHAの産生のために用いられる標準的同時供給物であった(Luzier,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:839−842)。この同時供給ストラテジーは、単一の発酵株を用いて1つのPHAポリマー型(通常、PHBV)を産生し得るという利点を有し、ここで、このポリマー中での3HV濃度は、同時供給のレベルを改変することによって直接的に制御され得る。しかし、プロピオン酸は、抗微生物であり、それゆえ、プロピオン酸同時供給のレベルを上昇させることは、発酵時間の大きな増大をもたらす。3HV含有PHAを産生するために用いられ得る代替的同時供給基質としては、トレオニン、奇数鎖脂肪酸(例えば、バレレート、ヘプタノエートなど)、および奇数鎖アルコールが挙げられる。
【0025】
PHA代謝の一部となるためには、プロピオン酸は、補酵素Aによって活性化されなければならない。それゆえ、活性なCoAトランスフェラーゼまたはCoAシンテターゼが細胞中に存在すべきである。E.coliでは、この機能は、ato系によって実施される。AtoDA複合体は、プロピオネートの取り込みおよびプロピオネートへのCoA輸送の両方を担うようである(JenkinsおよびNunn,1987,J.Bacteriol.169:42−52)。従って、プロピオネートをPHBV産生E.coliに供給する場合、ato系のポジティブレギュレーターであるatoC(JenkinsおよびNunn,1987,J.Bacteriol.169:2096−2102)を構成的に発現する株を用いることは有用である。プロピオニル−CoAは、アセチル−CoAと縮合して、3−ヒドロキシバレリル−CoAを生じる。3−ヒドロキシバレリル−CoAは、PHAシンターゼによって取り込まれるべき活性化モノマーである。
【0026】
他の同時供給物(例えば、1−プロパノールまたはプロピレングリコール)のプロピオン酸への変換もまた、CoAシンテターゼまたはCoAトランスフェラーゼを必要とする。これらの同時供給物は両方とも、プロピオンアルデヒドを介して代謝され、次いでこれは、遊離プロピオン酸へと変換され得る。
【0027】
CoA依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼは、プロピオンアルデヒドをプロピオニル−CoAへと直接的に変換することに作用し得、従って別のCoAシンテターゼまたはCoAトランスフェラーゼについての必要性を軽減し得、細胞質における遊離プロピオン酸の存在を回避し得る。次いで、プロピオニル−CoAは、β−ケトチオラーゼによってアセチル−CoAと縮合してβ−ケトアシル−CoAを形成し、これは次いでレダクターゼ酵素によって還元されてD−β−ヒドロキシアシル−CoAとなり、3HVを含むコポリマーの産生に必要な3HVモノマー単位を提供する。
【0028】
このストラテジーはまた、他のPHAコポリマーの産生に有用である。例えば、CoA依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼは、他のアルデヒドをそれらの対応するアシル−CoAへと(例えば、ブチルアルデヒドをブチリル−CoAへと)変換し得る。細胞への取り込みに続いて、このブタノールは、ブチレートへと変換され、ブチリル−CoAへと活性化され、そしてβ−ケトチオラーゼによってアセチル−CoAと縮合して、β−ケトヘキサノイルCoAを形成し、次いでこれは、レダクターゼ酵素によってD−β−ヒドロキシアシル−CoAへと還元され、そして最終的に重合される。図1は、プロピレングリコールおよび1−プロパノールからプロピオニル−CoAを、そしてブタノールからブチリル−CoAを作製するために用いられる経路をまとめる。
【0029】
補酵素A依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼは周知である。例えば、JonesおよびTurner は、1984年に、CoA依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼの検出および活性についての2つの研究を報告した(JonesおよびTurner,J.Gen.Microbial 130(第2部):299−308(1984);JonesおよびTurner,J.Gen.Microbiol 130(第4部):849−60(1984))。1つの実施形態では、CoA依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼは、E.coliのeutE遺伝子によってコードされる。多くの他の有用なCoA依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼは、例えば、Tothら,「The ald Gene,Encoding a Coenzyme A−Acylating Aldehyde Dehydrogenase,Distinguishes Clostridium beijerinckii and Two other Solvent−Producing Clostridia from Clostridium acetobutylicum」,Applied and Environmental Microbiology 65(11):4973−80(1999)に記載される他の種の遺伝子によってコードされる。
【0030】
E.coliによってコードされるこのCoA依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼのホモログは、他の生物体中に存在する。酵素アッセイによって決定され得る、配列相同性によって、同じ型の活性を有し得る候補酵素を見出し得る。このような遺伝子の例は、以下である:Salmonella typhimurium eutE(GenBank登録番号U18560)、Listeria innocua eutE(AL596167)、Clostridiumbeijerinckii補酵素A−アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ(AF157306)、Salmonella typhimurium pduP(AF026270)、Vibrio choleraeアルコールデヒドロゲナーゼ/アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ(AE004277)、E.coli adhEのアルデヒドデヒドロゲナーゼセグメント(M33504)、Yersiniapestisアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ(AJ414151)、鉄を含有するStreptococcus pneumoniae TIGR4アルコールデヒドロゲナーゼ(AE007491)、Clostridium kluyveri CoA依存性コハク酸半アルデヒドデヒドロゲナーゼ(L21902)およびLactococcus lactisアルコール−アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ(AJ001008)。多くの他の候補物は、アライメント技術およびデータベース(例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/におけるGenBank)を用いることによって見出され得る。
【0031】
プロピオンアルデヒドは、前駆体基質(例えば、1−プロパノールまたはプロピレングリコール)から作製され得、そしてブチルアルデヒドは、ブタノールから産生され得る。これらの変換を触媒し得る酵素の例は、Klebsiella pneumoniae、Citrobacter freundii、またはいくつかの他の生物体のうちの1つ由来の、ジオールオキシドレダクターゼ(JohnsonおよびLin,1987,J.Bacteriol.169:2050−2054;Danielら,1995,J.Bacteriol.177:2151−2156)およびグリセロールデヒドラターゼまたはジオールデヒドラターゼ(PoznanskayaおよびKorsova,1983,Biokhimiya 48:539−543;Tobimatsuら,1996,J.Biol.Chem.271:22352−22357)である。これらの酵素は、グリセロールを1,3−プロパンジオールへと変換し得る生物体中に見出されるが、ホモログは、配列決定された遺伝子およびゲノムのデータベースを検索することにより、他の生物体中に見出され得る。グリセロールまたはジオールデヒドラターゼは、補酵素B12依存性反応においてプロピレングリコールをプロピオンアルデヒドへと変換し得る;ジオールオキシドレダクターゼは、NAD依存性反応において1−プロパノールをプロピオンアルデヒドへと変換し得る。
【0032】
本明細書中に記載される方法において有用なCoA依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼのアナログは、アライメント技術およびデータベース(例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/におけるGenBank)を用いることによって同定され得る。一般に、有用なアナログは、CoA依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼに対して特定の程度の配列相同性(例えば、60%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、もしくは99%またはそれより高い相同性)を有する。種々の異なる種における既知のCoA依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼの配列は、例えば、データベース(例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/におけるGenBank)から入手可能である。
【0033】
本明細書中に提供される生物体は、以下のうちの1以上の酵素をコードする遺伝子を含む:補酵素A依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アシル−CoAトランスフェラーゼ、アシル−CoAシンテターゼ、β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−CoAレダクターゼおよびPHAシンターゼ。これらの生物体は、3−ヒドロキシブチレート以外の3−ヒドロキシアルカノエートモノマーを有する、ポリ(3−ヒドロキシアルカノエート)のホモポリマーまたはコポリマーを産生し、この3−ヒドロキシアルカノエート単位は、化学の酵素によって触媒された変換(例えば、アルコールの3−ヒドロキシアシル−CoAモノマーへの変換)由来であり、この変換工程における少なくとも1つの工程は、補酵素A依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を含む。
【0034】
この生物体は、CoA依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する野生型生物体であってもよく、またはCoA依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するための遺伝子変異によって改変されてもよく、またはCoA依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が発現される組換え生物体であってもよい。この生物体は、細菌、植物、酵母、および真菌のうちの1つであり得る。1つの実施形態では、この生物体は、細菌(例えば、E.coli)である。他の実施形態では、この生物体は植物である。
【0035】
1つの実施形態では、本明細書中に記載される方法は、種々のレベルの3HV単位を取り込んだPHBVコポリマーを産生するために用いられ得る。例えば、本明細書中に提供される方法は、約30mol%の3HV単位を有するPHAコポリマーを産生するために用いられ得る。
【0036】
(III.PHA組成物および医療用デバイスとしてのその使用)
本明細書中に記載されるポリマーは、種々のポリマー組成物を形成し得る。このポリマー組成物は、例えば、フィルム、ラテックス、コーティング、接着剤、繊維、結合剤、樹脂および生分解性医療用デバイスのために有用である。
【0037】
本明細書中に記載されるPHAコポリマーから調製されるデバイスは、広範囲の異なる医療用適用に用いられ得る。このような適用の例としては、治療剤、予防剤または診断剤の制御放出、薬物送達、組織操作骨格、細胞カプセル化;標的化送達、生体適合性コーティング、生体適合性インプラント、組織再生誘導、創傷包帯、整形外科デバイス、プロテーゼおよび骨セメント(接着剤および/または構造的フィラーが挙げられる)、ならびに診断剤が挙げられる。
【0038】
本明細書中に記載されるPHAコポリマーは、種々の治療剤、予防剤または診断剤のいずれかをカプセル化するため、これらのいずれかと混合するため、またはこれらのいずれかに対してイオン結合もしくは共有結合するために用いられ得る。広範囲の種々の生物学的に活性な材料は、ポリヒドロキシアルカノエートによってある部位への送達のため、またはこのポリマーに対して特性(例えば、生体接着、細胞付着、細胞増殖の増強、細菌増殖の阻害、および凝固痙性の予防)を付与するためのいずれかで、カプセル化され得るかまたは取り込まれ得る。
【0039】
適切な治療剤および予防剤の例としては、治療活性、予防活性または診断活性を有する、合成無機化合物および合成有機化合物、タンパク質およびペプチド、多糖および他の糖、脂質、ならびにDNA核酸配列およびRNA核酸配列が挙げられる。核酸配列としては、遺伝子、相補性DNAに結合して転写を阻害するアンチセンス分子、およびリボザイムが挙げられる。広範囲の分子量(例えば、1モルあたり100グラムと500,000グラムとの間またはより大きい)を有する化合物が、カプセル化され得る。特定の例としては、以下が挙げられる:タンパク質(例えば、レセプターリガンド、抗体、酵素、血液凝固因子、インヒビターまたは凝血溶解剤(例えば、ストレプトキナーゼおよび組織プラスミノーゲンアクチベーター);免疫のための抗原;ホルモンおよび増殖因子;ペプチド(えば、接着ペプチド))、多糖(例えば、ヘパリン);オリゴヌクレオチド(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムならびに遺伝子治療において使用するためのレトロウイルスベクター)。このポリマーもまた、細胞および組織をカプセル化するために用いられ得る。代表的診断剤は、X線、蛍光、磁気共鳴画像化、放射能、超音波、断層撮影(CT)および陽電子断層撮影(PET)によって検出可能な薬剤である。超音波診断剤は、代表的には、気体(例えば、空気またはペルフルオロカーボン)である。
【0040】
この化合物は、代表的には、0.1重量%と70重量%との間、より好ましくは5重量%と50重量%との間の充填率でPHA中に組み込まれる。これらのPHAは、ほぼ任意の物理的形態(例えば、粉末、フィルム、成型品、粒子、球、ラテックス、および結晶材料または非晶質材料)であり得る。これらは、さらなる非PHA材料(例えば、他のポリマー)と合わされ得る。これらは、ゆっくり分解する生体適合性の成型可能材料(例えば、医療用デバイス)を必要とする適用における使用に適切である。このポリマーから調製され得る医療用デバイスの例としては、ロッド、骨螺子、ピン、外科用縫合糸、ステント、組織操作デバイス、薬物送達デバイス、創傷包帯、およびパッチ(例えば、ヘルニアパッチおよび心膜パッチ)が挙げられる。
【0041】
本明細書中に記載されるPHAコポリマーを用いて製造され得る分解性インプラントは、広範囲の整形外科適用および血管適用、組織操作、組織再生誘導、ならびに他の熱可塑性エラストマーが現在用いられている適用において用いられ得る(McMillin,Rubber Chem.Technol.,67:417−46(1994))。このインプラントは、修復および治癒を刺激する他の因子を含み得る。好ましいデバイスは、体液の通過に適切なチューブである。これらのデバイスは、細胞付着因子、増殖因子、ペプチド、ならびに抗体およびそれらのフラグメントを用いて改変され得る。
【0042】
医療用デバイスを製造する好ましい方法としては、溶媒成型(solvent casting)、溶融加工(melt processing)、押出し成型、射出成型および圧縮成型、ならびに噴霧乾燥が挙げられる。粒子は好ましくは、当該分野で利用可能な方法を用いて、発酵ベースのプロセスから、または溶媒エバポレーション技術、二重エマルジョン技術もしくはマイクロフルイダイゼーションによって、直接的に調製され得る(Koosha,F.Ph.D.Dissertation,1989,Univ.Nottingham,UK.,Diss.Abstr.Int.B 51:1206(1990);Bruhn,B.W.and Mueeller,B.W.Proceed.Intern.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.18:668−69(1991);Conti,B.ら,J.Microencapsulation,9:153−166(1992);Ogawa,Y.ら,Chem.Pharm.Bull.,36:1095−103(1988);Mathiowitz,E.およびLanger,R.「Polyanhydride microspheres as drug delivery systems」,M.Donbrow編,「MicrocapsulesNanopart.Med Pharm.」,CRC,Boca Raton,Florida,1992,Ch.5,99−123頁)。
【0043】
本明細書中に記載されるPHAコポリマーは、創傷治癒において使用するためにデバイスに製造され得る。例えば、不織繊維材料は、当業者に公知の手順を用いて、最初にポリマー繊維を産生することによって、穿孔出口を通してポリマーを加圧することによって、このポリマーから調製され得る。次いで、この繊維を固体支持体上で広げ、そしてこれらを圧縮成型に供することにより、この繊維は、多孔質膜(布帛)に製造され得る。このデバイスの厚さは、好ましくは500μm未満である。この創傷治癒デバイスはまた、レーザーを用いてフィルムまたは膜に穿孔を空けて多孔性を達成すること、または浸出技術を用いて多孔質材料を調製することによって調製され得る。穴のサイズは、理想的には、細胞および他の組織質を閉じ込めるに十分に小さいべきである。創傷治癒デバイスは、組織を分離して組織再生を刺激するために、インビボで配置され得る。
【0044】
本明細書中に記載されるPHAコポリマーは、細胞をカプセル化するために用いられ得る。当業者に公知の手順を用いて、細胞は、最初に予備コーティングされ得る(Maysinger,Reviews in the Neurosciences,6:15−33(1995))。粒子カプセル化手順(例えば、二重エマルジョン技術)を用いて、次いで、これらの細胞は、PHAによってカプセル化され得る(Ogawaら,Chem.Pharm.Bull.,36:1095−103(1988))。次いで、カプセル化された細胞は、インビボで移植され得る。
【0045】
本明細書中に記載されるPHAポリマーは、広範囲のポリマー加工技術を用いて組織操作骨格に製造され得る。PHA組織操作骨格を製造する好ましい方法としては、溶媒成型、溶融加工、繊維加工/紡績/織り成型、押出し成型、射出成型および圧縮成型、積層、ならびに溶媒浸出/溶媒成型が挙げられる。このような方法は、当業者に公知である。
【0046】
本明細書中に記載されるPHAコポリマーを組織操作骨格に製造する1つの好ましい方法は、エクストルーダー(例えば、Brabenderエクストルーダー)を用いることを包含する。例えば、この技術は、ある範囲の長さおよびサイズでの移植に適切な、押出しされたチューブを調製するために用いられ得る。
【0047】
別の好ましい方法は、繊維から不織PHA骨格を調製することを包含する。繊維は、当業者に公知の方法を用いて、溶融物または溶液から製造され得、そして不織物へと加工され得る。不織物の特性は、例えば、PHA材料、繊維の直径、繊維の密度、材料の厚さ、繊維の配向、および繊維の加工法を変化させることによって調整され得る。多孔質膜は、所望の場合、さらに加工され得る。例えば、これらの膜は、中空のチューブに成形され得る。
【0048】
別の好ましい方法は、適切なPHAを適切な鋳型中に溶融加工または溶媒加工し、そしてレーザーまたは他の手段を用いてこの材料を穿孔して所望の多孔度を達成することを含む。また好ましいのは、圧縮成型PHAシートをループになるように巻き、そしてヒートシールすることを含む方法である。このPHAシートは、必要に応じて、別の材料(例えば、第2の生分解性ポリマー)とともに巻かれ得る。例えば、この後者の材料は、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、またはグリコール酸と乳酸とのコポリマーの不織物であり得る。このような手順は、新たな血管、管およびチューブの操作において使用するために適切な積層チューブを提供すべきである。このPHAはまた、他の組織操作骨格をコーティングするために用いられ得る。このような材料は、他の分解性ポリマー由来であり得る。コーティングは、例えば、溶媒ベースの溶液を用いて、または溶融技術によって、またはPHAラテックスを用いて、実施され得る。
【0049】
本明細書中で記載される組織操作デバイスには、移植前または移植後に細胞が播種され得る。これらの細胞は、ドナー組織の健常セクションから収集され得、細胞培養技術を用いてインビトロで増大され得、次いで移植前または移植後のいずれかで骨格(またはマトリックス)に播種され得る。あるいは、これらの細胞は、他のドナー組織から、または既存の細胞株から、入手され得る。
【0050】
本明細書中に記載されるPHAコポリマーは、他のデバイスおよび材料をコーティングするために用いられ得る。このようなコーティングは、医療用適用のためのそれらの特性を改善し得る(例えば、生体適合性、機械的特性を改善し得、そしてそれらの分解および制御放出プロフィールを調整し得る)。本明細書中で記載されるPHAコポリマーは、上記の製造手順を用いて他のデバイス上にコーティングされ得る。コーティングの厚さは、コーティングの重量または濃度を変化させることによって、ならびに/またはオーバーコーティングすることによって、特定の適用の必要に応じて調節され得る。
【0051】
本明細書中に記載されるPHAコポリマーは、広範囲のポリマー加工技術を用いてステントに製造され得る。PHAステントを製造する好ましい方法としては、溶媒成型、溶融成型、繊維加工/紡績、押出し、射出成型、および圧縮成型が挙げられる。このような方法は、当業者に公知である。
【0052】
移植前に、生体吸収可能なポリマー物品は、レシピエントの疾患および感染を予防するために滅菌されなければならない。滅菌は、ポリマーデバイスに細胞を播種する前に実施される。PHA含有物品の加熱滅菌はしばしば非実用的である。なぜなら、熱処理は、(特に、PHAが、加熱滅菌処理に必要とされる温度よりも低い溶融温度を有する場合)物品を変形させ得るからである。この問題は、冷エチレンオキシドガスを滅菌剤として用いて克服され得る。移植前のPHA含有物品のエチレンオキシド蒸気への曝露は、物品を滅菌して、これを移植に適切にする。冷エチレンオキシドガスを用いた滅菌の間に、このPHA含有物品は、その形状を保持する。この型の処理は理想的に、成型物品または形成前の物品の滅菌に適切であり、この物品の形状は、その適切な機能において重要な役割を果たす。
【0053】
本明細書中に記載されるデバイスは、全身的または局所的に、または特に細胞培養には、インビトロでさえも、投与され得る。デバイス(例えば、微粒子)を全身投与する好ましい方法は、注射、吸入、経口投与および移植によってである。デバイスを投与する他の適切な方法は、デバイスをローション、軟膏、パッチまたは包帯中に局所的に投与することを包含する。
【0054】
以下の実施例は、本明細書中に開示される方法およびコポリマーをさらに例示する。
【実施例】
【0055】
(実施例1.CoA依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼの単離および同定)
E.coliの多機能性アルコールデヒドロゲナーゼタンパク質(AdhE)のCoA依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ成分をコードする遺伝子へのその相同性に起因して、eutE遺伝子を、 以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてE.coliゲノムから増幅した:
5’−GGT GGT ACC TTA AGA GGA GGT TTT TAT GAA TCA ACA GGA TAT TGA ACA−3’(eutE5’Acc65I)
5’−GGT GCG GCC GCT TAA ACA ATG CGA AAC GCA TCG−3’(eutE 3’NotI)。
このPCR産物をAcc65IおよびNotIで消化し、そして同じ酵素で切断したpSE380(Invitrogen;La Jolla,CA)に連結した。eutE遺伝子をIPTG誘導性trcプロモーターの制御下に含む、得られたプラスミドを、pMS35と命名した。
【0056】
pMS35またはpTrcN(NotI制限部位が除去されていること以外はpTrc99a,Pharmacia;Uppsala,Swedenと同じ)のいずれかを増殖するE.coli DH5aを、2mLのLuria−Bertani(LB)ブロス(Difco;Detroit,Mich.)+100μg/mLアンピシリン中で37℃にて一晩、250rpmにて振盪しながら増殖させた。これらを、同じ培地の100mL培養物についての接種物として用い、これを、600nmでの光学密度がpTrcN含有細胞については0.55に到達するまで、そしてpMS35含有細胞については0.57に到達するまで、250mL三角フラスコ中で振盪しながら37℃にて増殖させた。次いで、1.3mM IPTGを添加し、そしてインキュベーションを2時間続けた。2000×gにて10分間の遠心分離によって細胞を培地から取り出し、50mMリン酸カリウム(pH7.0)中で1回洗浄し、再度遠心分離し、そして−20℃にて凍結した。細胞を、小さな体積の氷冷50mM AMPD(pH8.5)中での再懸濁によって、超音波処理のために調製した。超音波処理を、マイクロチップを用いて2分間実施した(0.7秒間オン、0.3秒間オフ)。粗製細胞抽出物を、この超音波処理した細胞を、Eppendorf 5415C微量遠心機(Brinkmann Instruments,Inc.;Westbury,N.Y.)において最大速度で4℃にて10分間スピンし、そして上清を収集することによって得た。最終的なアッセイ混合物は、AMPD(pH8.5、50mM)、ジチオトレイトール(5mM)、NAD(2mM)、補酵素A(0.5mM)、1〜5μL/mL粗製細胞抽出物、および15mMプロピオンアルデヒドを含んでいた。石英キュベット中で、このアルデヒド以外の全ての成分を合わせ、そして充分に混合した。340nmでの定常吸光度読取りを確立した後、プロピオンアルデヒドを添加し、そしてピペッティングによって混合した。吸光度の変化の初速度を用い、NADHについて6.22mM−1cm−1の吸光率と仮定して、酵素活性を計算した。あるいは、このアッセイを、補酵素Aなしで行った。1単位の酵素活性を、1分間当り1μmolのプロピオンアルデヒドを減少させるために必要な酵素の量として定義した。CoAを含めた場合、pTrcN抽出物は、活性を示さなかったが、pMS35抽出物は、10.5μgタンパク質/mLおよび52.5μgタンパク質/mLの両方を用いた場合、約13U/mg総タンパク質の活性を与えた。CoAなしでは、いずれも抽出物も活性ではなかった。従って、これは、eutEがCoA依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードすると結論付けられた。
【0057】
同じアッセイを、ブチルアルデヒドを基質として用いたこと以外は上記と同様にして作製した別々の抽出物対について行った。この抽出物は、再度E.coli DH5a由来であり、そして今回は、pMS35を、pMS31(これは、E.coli aldA遺伝子を含むこと以外はpMS35と類似である)に対して比較した。pMS31抽出物(170μgタンパク質/mLまで)は、補酵素Aをこのアッセイ混合物に添加しようと添加しまいと、活性を示さなかった。このpMS35抽出物は、7.5〜15.0μgタンパク質/mLを用いた場合、5.9U/mg総タンパク質の平均活性を与えた。しかし、CoAなしでは、同じ濃度のpMS35抽出物は、ほんの約0.1U/mg総タンパク質の平均を与えた。従って、EutEタンパク質はまた、CoA依存性様式でブチルアルデヒドに対して作用する。
【0058】
(実施例2.プロピオネートと1−プロパノールとの間での毒性の相違)
E.coli株MBX1335を、プロピオネートまたは1−プロパノールの存在下で増殖させて、これらの化合物による増殖速度の阻害を比較した。プロピオネート供給に対する代替物を見出すことに関する1つの重要な理由は、プロピオネートが増殖速度および発酵における代謝を遅延させることである。
【0059】
MBX1335を、25μg/mLクロラムフェニコールを補充したLB培地中で一晩増殖させた。この培養物を用いて、種々の濃度のプロピオネートまたは1−プロパノールを補充した最少培地の3mL培養物のいくつかを接種した。これらの3mL培養物中の基本培地は、1リットルあたり、以下を含んでいた:5gグルコース;1mmol MgSO;10mgチアミン;25.5mmol NaHPO;33.3mmol KHPO;27.2mmol KHPO;2.78mg FeSO・7HO;1.98mg MnCl・4HO;2.81mg CoSO・7HO;0.17mg CuCl・2HO;1.67mg CaCl・2HO;0.29mg ZnSO・7HO;0.1gカゼイン加水分解物;および25μgクロラムフェニコール。この培地はまた、プロピオン酸ナトリウム(pH7)もしくは1−プロパノールのいずれかを含んでいたか、または基質を何も添加しなかった。用いたプロピオネート濃度および1−プロパノール濃度は、2、5、および10g/Lであった。それぞれの場合の各々についての実験を、三連で行った。図2は、各々の場合について決定した増殖曲線を示す。明確には、プロピオネートは、増殖速度を1−プロパノールよりも実質的に大きく阻害する。
【0060】
培養物を増殖させ続けた場合、細胞はプロピオネートの存在下でよりゆっくり増殖するとはいえ、最終的にはこれらは、1−プロパノールの存在下よりも高い光学密度に到達することが注目されるべきである。これはおそらく、これらが、プロピオネートを増殖のための炭素源として用い得るからである。10g/Lプロピオネートを用いた培養物は、例えば、5.0の平均OD600に到達し、一方、10g/Lの1−プロパノールを用いた培養物は3.8に到達し、そしてインヒビターを含まない培養物は3.7に到達した。細胞が同時供給物について増殖することは望ましくない。なぜなら、これらは、より安価な一次供給物をこの目的で使用し得るからである。それゆえ、1−プロパノールは、PHBVへとより完全に変換され、他の細胞代謝によって利用されないというさらなる利点を提供し得る。
【0061】
(実施例3.野生型株およびアルコールデヒドロゲナーゼ調節解除株におけるグルコースおよび1−プロパノールからのPHBV産生)
Escherichia coli株DC675およびDC698は、ClarkおよびRod,J.Mol.Evol.25:151−158(1987)に記載されている。株DC698は、アルコールデヒドロゲナーゼ(adhE遺伝子の産物)を構成的に産生する調節変異体である。株DC675(これからDC698を誘導した)は、野生型E.coli株についてとほぼ同様に、アルコールデヒドロゲナーゼを嫌気性条件下でのみ産生する。これらの株を、染色体からPHB合成遺伝子を安定に発現するE.coli株MBX1335のバクテリオファージP1溶解産物で形質導入した。
【0062】
MBX1335のバクテリオファージP1溶解産物を以下の通りに作製した:MBX1335を、3mL Luriaブロス(LB)中で約0.2の光学密度(600nm)まで増殖させた。塩化カルシウムを10mMまで添加し、そして予め作製した30μLのP1溶解産物を添加した。この混合物を37℃にて4時間インキュベートした。インキュベーション後、50μLのクロロホルムを添加し、そして混合物を激しく攪拌した。最高速度にて微量遠心機中で3分間遠心分離し、そしてスクリューキャップガラスチューブ中にピペッティングすることにより、上清を収集した。30μLクロロホルムの添加を行い、そして得られた混合物を4℃で保存した。
【0063】
形質導入を、株DC675およびDC698について以下の通りに行った:各株を、2mLのLB培地中で定常期まで増殖させ、そして塩化カルシウムを10mMになるように添加した。微量遠心管中で、200μLの各培養物を、上記の100μLのP1溶解産物またはプレーンのLB培地と合わせた。これらの4本のチューブを、37℃にて15分間インキュベートし、次いで100μLの1Mクエン酸ナトリウムおよび500μL LBを各々に添加した。37℃にて30分間のさらなるインキュベーションの後、これらの細胞を、微量遠心機での最高速度での10秒間の遠心分離によって液体から取り出した。各ペレットを100μLの100mMクエン酸ナトリウム中に再懸濁し、そして各チューブの内容物を選択的寒天培地(25μg/mLクロラムフェニコールを補充したLB)上にプレーティングした。これらのプレートを37℃にて一晩インキュベートし、そして溶解産物で処理した培養物のみがコロニーを生じた。1つのコロニーを、これらの2つのプレートの各々から採取した。DC675形質導入体をMBX1579と示し、そしてDC698形質導入体をMBX1580と示した。
【0064】
株MBX1579およびMBX1580を、1リットルあたり以下を含む2mLの培地中で振盪しながら37℃にて一晩増殖させた:5gグルコース;1mmol MgSO;10mgチアミン;25.5mmol NaHPO;33.3mmol KHPO;27.2mmol KHPO;2.78mg FeSO・7HO;1.98mg MnCl・4HO;2.81mg CoSO・7HO;0.17mg CuCl・2HO;1.67mg CaCl・2HO;0.29mg ZnSO・7HO;および25μgクロラムフェニコール。次いで、これらの培養物を上記と同じ50mLの培地に添加し、そして15mLの2×YT培地(Difco;Detroit,Mich.)を各々に、合計体積が65mLになるように添加した。これらの培養物を、250mL三角フラスコ中で振盪しながら37℃にて16時間インキュベートした。この期間の最後に、細胞を、2000×gにて10分間の遠心分離によって培地から取り出した。次いで、これらを、1リットル当り以下を含む50mLの培地中に再懸濁した:5gグルコース;0または5gの1−プロパノール;7.75gの2×YT粉末;1mmol MgSO;10mgチアミン;25.5mmol NaHPO;33.3mmol KHPO;27.2mmol KHPO;2.78mg FeSO・7HO;1.98mg MnCl・4HO;2.81mg CoSO・7HO;0.17mg CuCl・2HO;1.67mg CaCl・2HO;0.29mg ZnSO・7HO;および25μgクロラムフェニコール。この期間の最後に、細胞を、上記の通りの遠心分離によって培地から取り出し、水で洗浄し、再度遠心分離し、そして凍結乾燥した。各フラスコからの約15mgの凍結乾燥細胞塊を、(体積で)90% 1−ブタノールおよび10%濃塩酸を含む2mLの混合物中での110℃にて3時間の同時抽出およびブタノール溶解(butanolysis)に供した(2mg/mL安息香酸を内部標準として添加した)。得られた混合物の水溶性成分を、3mL水での抽出によって除去した。有機相(2mL/分の全体流量において1:50の分割比で1μL)を、以下の温度プロフィールを用いて、SPB−1縮合シリカキャピラリーGCカラム(30m;0.32mm ID;0.25μmフィルム;Supelco;Bellefonte,Pa.)において分析した:80℃、2分間;250℃まで1分間当り10℃;250℃、2分間。用いた標準的は、PHBV(Aldrich Chemical Co.;Milwaukee,Wis.)であった。各培養物についてのポリマー含有量および組成を表1に示す。
【0065】
【表1】

1−プロパノールを提供した場合、MBX1579は、いくつかの3HV単位をポリマー中に取り込み得るが、MBX1580は、構成的アルコールデヒドロゲナーゼを用いて、3HV組成物に関してポリマーの重量百分率に基づいて約6倍多くを取り込み得る。MBX1579およびMBX1580は、大部分同じ遺伝子バックグラウンドを有し、従って、adhE遺伝子産物がこの増加を少なくとも部分的に担うようである。
【0066】
(実施例4.プラスミドに基づく株を用いた、グルコースおよび1−プロパノールから
のPHBV) プラスミドpMS72は、K.pneumoniae dhaT遺伝子およびE.coli eutE遺伝子の両方をIPTG誘導性プロモーターの制御下に含む。pMS72を、eutE遺伝子をpTC42(Skralyら,1998,Appl.Environ.Microbiol.64:98−105)中に挿入することによって構築した。このeutE遺伝子を、BglIIおよびSpeIでの消化によってpMS35から取り出した。このフラグメントを、BglIIおよびNheI(これは、NheIと適合性の粘着末端を共有する)で消化したpTC42中に連結した。
【0067】
E.coli株MBX1335を、pMS72で形質転換して、この構築物がグルコースおよび1−プロパノールをPHBVへと変換し得るか否かを評価した。pMS72を誘導したベクターであるpTrcNで形質転換したMBX1335をコントロールとして用いた。各株を、培養チューブ中で100μg/mLアンピシリンを補充した最少グルコース培地中で3mLの体積で、200rpmにて振盪しながら37℃にて一晩増殖させた。最少培地は、1リットルあたり以下を含んでいた:25.5mmol NaHPO;33.13mmol KHPO;27.2mmol KHPO;2.78mg FeSO・7HO;1.98mg MnCl・4HO;2.81mg CoSO・7HO;0.17mg CuCl・2HO;1.67mg CaCl・2HO;0.29mg ZnSO・7HO;1mmol MgSO;10mgチアミン;100mgアンピシリン;および5gグルコース。この培養物(0.1mL)を用いて、50mLの同じ培地を含む200mLの四角のガラス瓶を接種した。各培養物に添加したのは、15mLの2×YT培地(Difco;Detroit,Mich.)であった。これらの65mL培養物を、37℃にて200rpmにて振盪しながら6時間インキュベートした。この期間の最後に、この細胞を、2000×gにて10分間の遠心分離によって培地から取り出した。次いで、これらを、5g/L 1−プロパノール;0.5×YT;100μg/mLアンピシリン;および0、0.01または0.05mM IPTGを補充した上記の50mLの最少グルコース培地中に再懸濁した。30℃にて90時間のインキュベーション後、これらの細胞を上記の通りに遠心分離し、水で1回洗浄し、再度遠心分離し、そして凍結乾燥した。乾燥した細胞塊を、上記の通りのブタノール溶解に供し、そしてGCの結果は表2に列挙した通りである。
【0068】
【表2】

従って、pMS72は、MBX1335に、このプラスミドなしのものよりもずっと効率的にグルコースおよび1−プロパノールからPHBVを合成させ得る。
【0069】
(実施例5.プラスミドに基づく株を用いた、グルコースおよび1,2−プロパンジオールからのPHBV)
プラスミドpFS83(これは、Klebsiella pneumoniaeグリセロールデヒドラターゼ、すなわち、dhaB遺伝子およびE.coli eutEアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む)を含むEscherichia coli株MBX1335を、3mLの体積で、200rpmにて振盪しながら、培養チューブ中でLB培地中で37℃にて6時間増殖させた。この培養物(0.25mL)を用いて、1リットル当り以下を含む50mLの培地を含む250mL三角フラスコを接種した:25.5mmol NaHPO;33.3mmol KHPO;27.2mmol KHPO;2.78mg FeSO・7HO;1.98mg MnCl・4HO;2.81mg CoSO・7HO;0.17mg CuCl・2HO;1.67mg CaCl・2HO;0.29mg ZnSO・7HO;10gグルコース;1mmol MgSO;10mgチアミン;0.1gカゼイン加水分解物;0.01mmol イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG);100mgアンピシリン;0または20nmol補酵素B−12;および0、5、または10gの1,2−プロパンジオール。これらの50mL培養物を、200rpmで振盪しながら30℃にて24時間インキュベートした。この期間の最後に、細胞を、2000×gにて10分間の遠心分離によってこの培地から取り出した。これらを水で1回洗浄し、再度遠心分離し、そして凍結乾燥した。乾燥した細胞塊を上記の通りのブタノール溶解に供し、そしてGCの結果は、表3に列挙した通りである。
【0070】
【表3】

【0071】
PHBVは、補酵素B−12および1,2−プロパンジオールの両方の存在下でのみ形成され、このことは、補酵素B−12依存性グリセロールデヒドラターゼの作用が、プロピオンアルデヒドへの1,2−プロパンジオールの変換を担うことを強力に示唆する。プロピオンアルデヒドは、ポリマー中に3HVとして最終的に取り込まれる。
【0072】
このプラスミドpFS83を、eutE遺伝子をXbaI−HindIIIフラグメントとしてpMS35から得て、このフラグメントを、SpeIおよびHindIIIで切断したpFS44Bに連結することによって構築した。プラスミドpFS44Bを、dhaB遺伝子を含むpTC53(Skralyら,1998,Appl.Environ.Microbiol.64:98−105)のSalI−NheIフラグメントを、同じ制限酵素で消化したベクターpSE380(Invitrogen;Carlsbad,CA)に連結することによって構築した。
【0073】
(実施例6.組み込まれた株を用いた、グルコースおよび1−プロパノールからのPHBV)
いくつかのEscherichia coli株を、Tn10由来のtetA遺伝子とともにK.pneumoniae dhaTおよびE.coli eutE遺伝子の、MBX1335の染色体への組み込みによって構築した。組み込みは、pUTHg(Herreroら,1990,J.Bacteriol.172:6557−6567)の誘導体であるプラスミドpUT−eutE−dhaT−tetAを用いて達成した。pUT−eutE−dhaT−tetAを構築するために、最初のtetA遺伝子を、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてTn10からPCRによって増幅した:
5’−GGT CCT AGG TTA AGA GGA GGT TTT TAT GAA TAG TTC GAC AAA GAT CGC−3’(tetA 5’AvrII)
5’−GGT ACT AGT CTA AGC ACT TGT CTC CTG TTT AC−3’(tetA 3’SpeI)。
このtetA PCR産物を、AvrIIおよびSpeIで消化し、そしてAvrIIで消化したpUTHgに連結した(AvrIIおよびSpeIは、適合性の粘着性末端を生じる)。これにより、プラスミドpUT−tetAが得られた。eutE遺伝子およびdhaT遺伝子を、SalIおよびSpeIでの消化によってpMS72から得て、そしてSalIおよびXbaIで消化したpUC18Sfi(Herreroら,同書)に連結した。これによって、プラスミドpMS77が得られた。次いで、eutE−dhaTフラグメントを、AvrIIでの消化によってpMS77から得て、そしてこれをAvrIIで消化したpUT−tetAに連結して、pUT−eutE−dhaT−tetAを形成した。結合体化後、ドナー−レシピエント混合物を、15g/mLテトラサイクリンおよび25g/mLクロラムフェニコールを補充したLB中で、37℃にて連続的に培養することにより、約40世代にわたって直ちに増殖させた。この富化した集団を、同じ抗生物質を補充したLB寒天上にプレーティングした。
【0074】
いくつかのコロニーを、例えば、これをプレーティングすることから単離し、そしてそれらがグルコースおよび1−プロパノールからPHBVを合成する能力について試験した。MBX1335(これから誘導した)をコントロールとして用いた。各株を、培養チューブ中で、3mLの体積で、200rpmにて振盪しながら、25μg/mLクロラムフェニコール、50μg/mLカナマイシン、および10μg/mLテトラサイクリンを補充したLB培地中で37℃にて8時間増殖させた。この培養物(1mL)を用いて、1リットル当り以下を含む100mLの培地を含む500mL三角フラスコを接種した:25.5mmol NaHPO;33.3mmol KHPO;27.2mmol KHPO;2.78mg FeSO・7HO;1.98mg MnCl・4HO;2.81mg CoSO・7HO;0.17mg CuCl・2HO;1.67mg CaCl・2HO;0.29mg ZnSO・7HO;10gグルコース;5mmol MgSO;10mgチアミン;0.1gカゼイン加水分解物;25mgクロラムフェニコール;50mgカナマイシン;10mgテトラサイクリン;および7g/L 1−プロパノール。これらの100mL培養物を、30℃にて46時間、200rpmにて振盪しながらインキュベートした。この期間の最後に、細胞を、2000×gにて10分間の遠心分離によって培地から取り出した。これらを水で1回洗浄し、再度遠心分離し、そして凍結乾燥した。この乾燥した細胞塊を上記の通りのブタノール溶解に供した。そしてGCの結果は、表4に列挙する通りである。別の実験において、eutE遺伝子産物およびdhaT遺伝子産物の活性を測定した。7g/L 1−プロパノールの代わりに4g/L 1−プロパノールを用い、そして46時間の代わりに30℃で24時間インキュベートしたこと以外は、これらの細胞を上記の通りに増殖させた。株LS5218を培養して、37℃にて8時間、100mL LBにおいてバックグラウンドを確立した。インキュベーション後、50mLの各培養物を上記の通りに遠心分離し、次いで50mM HEPES(pH7.4)、2mMジチオトレイトール、および0.1mM MnClを含む25mLの緩衝液中で1回洗浄し、再度遠心分離し、そして2mLの同じ緩衝液中に再懸濁した。この懸濁物をマイクロチップを2分間(0.4秒間オン、0.4秒間オフ)用いて超音波処理し、そして酵素アッセイを、DhaTについてはJohnsonおよびLin,1987,J.Bacteriol.169:2050−4においての通りに、そしてEutEについてはYanおよびChen,1990,Appl.Environ.Microbiol.56:2591−9においての通りに実施した。結果を表4に示す。
【0075】
【表4】

異なる組み込み株は、1−プロパノールを供給した場合に3HVをポリマー中に組み込む異なる能力を有しており、そしてこれらの能力は、プロピオニル−CoAへの1−プロパノールの変換を担う2つの酵素であるEutEおよびDhaTの活性とほぼ対応した。
【0076】
(実施例7.組み込み株を用いた、グルコースおよび1,2−プロパンジオールからのPHBV)
Escherichia coli株MBX1648を、Tn10由来のtetA遺伝子と一緒でのK.pneumoniae dhaB遺伝子およびE.coli eutE遺伝子の、MBX1335染色体への組み込みによって構築した。組み込みを、pUTHg(Herreroら,1990,J.Bacteriol.172:6557−6567)の誘導体であるプラスミドpUT−dhaB−eutE−tetAを用いて達成した。pUT−dhaB−eutE−tetAを構築するために、最初のtetA遺伝子を、上記の実施例の通りにTn10からPCRによって増幅した。tetA PCR産物を、AvrIIおよびSpeIで消化し、そしてAvrIIで消化したpUTHgに連結した(AvrIIおよびSpeIは、適合性の粘着性末端を生じる)。これにより、プラスミドpUT−tetAが得られた。dhaB遺伝子およびeutE遺伝子を、SalIおよびSpeIでの消化によってpMS82(AvrIIで消化し、T4 DNAポリメラーゼによってフィルインし、そして自己連結させてAvrII部位を除去したpFS83)から得て、そしてSalIおよびXbaI(これは、SpeIと適合性の粘着性末端を共有する)で消化したpUC18Sfi(Herreroら,同書)に連結した。これによって、プラスミドpMS83が得られた。次いで、eutE−dhaBフラグメントを、AvrIIでの消化によってpMS83から得て、そしてこれをAvrIIで消化したpUT−tetAに連結して、pUT−dhaB−eutE−tetAを形成した。結合体化後、ドナー−レシピエント混合物を、15μg/mLテトラサイクリンおよび25μg/mLクロラムフェニコールを補充したLB中で、37℃にて連続的に培養することにより、約40世代にわたって直ちに増殖させた。この富化した集団を、同じ抗生物質を補充したLB寒天上にプレーティングした。MBX1648は、このプレーティングから単離された1つのコロニーであった。
【0077】
MBX1648を、グルコースおよび1,2−プロパンジオールからPHBVを合成する能力について試験した。MBX1335(これから誘導した)をコントロールとして用いた。各株を、培養チューブ中で、3mLの体積で、200rpmにて振盪しながら、25μg/mLクロラムフェニコールを補充したLB培地中で37℃にて8時間増殖させた。この培養物(0.1mL)を用いて、1リットル当り以下を含む50mLの培地を含む250mL三角フラスコを接種した:25.5mmol NaHPO;33.3mmol KHPO;27.2mmol KHPO;2.78mg FeSO・7HO;1.98mg MnCl・4HO;2.81mg CoSO・7HO;0.17mg CuCl・2HO;1.67mg CaCl・2HO;0.29mg ZnSO・7HO;10gグルコース;1mmol MgSO;10mgチアミン;0.1gカゼイン加水分解物;25mgクロラムフェニコール;ならびに以下の表5に示した通りの種々の量の補酵素B−12および1,2−プロパンジオール。これらの50mL培養物を、200rpmで振盪しながら30℃にて46時間インキュベートした。この期間の最後に、これらの細胞を、2000×gにて10分間の遠心分離によって培地から取り出した。これらを水で1回洗浄し、再度遠心分離し、そして凍結乾燥した。乾燥した細胞塊を上記の通りのブタノール溶解に供した。そしてGCの結果は、表5において列挙した通りである。
【0078】
【表5】

【0079】
従って、MBX1648は、種々の条件下で全体的なポリマー含量を維持しながら、顕著な3HV含有量を有するコポリマーを合成し得る。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
ポリヒドロキシアルカノエート(PHA)ポリマーを産生する方法であって、該ポリマーは、3−ヒドロキシプロピオネート、3−ヒドロキシバレレート、4−ヒドロキシブチレート、4−ヒドロキシバレレート、5−ヒドロキシバレレート、および3−ヒドロキシヘキサノエートからなる群より選択される少なくとも1つのモノマーを含み、該方法は、ポリヒドロキシアルカノエート(PHA)シンターゼおよびCoA依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を生物体中で発現させる工程であって、ここで少なくとも1つの遺伝子は、異種遺伝子である、工程、ならびに該生物体にアルコールを供給する工程を包含する、方法。
【請求項2】
前記PHAポリマーが、3−ヒドロキシブチレートをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
前記PHAポリマーが、ポリ−3−ヒドロキシブチレート−co−3−ヒドロキシバレレート、ポリ−3−ヒドロキシブチレート−co−3−ヒドロキシプロピオネート、ポリ−3−ヒドロキシブチレート−co−4−ヒドロキシブチレート、ポリ−3−ヒドロキシブチレート−co−3−ヒドロキシヘキサノエートからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項4】
前記アルコールが、1−プロパノール、1,2−プロパンジオール、および1−ブタノールからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項5】
前記遺伝子が、アシル−CoAトランスフェラーゼ、アシル−CoAシンテターゼ、β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−CoAレダクターゼからなる群より選択される酵素をさらにコードする、請求項1に記載の方法。
【請求項6】
前記生物体が、酵母、細菌、真菌、および植物からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項7】
前記PHAシンターゼが、ポリ(3−ヒドロキシアルカノエート)シンターゼである、請求項1に記載の方法。
【請求項8】
前記PHAシンターゼが、ポリ(4−ヒドロキシアルカノエート)シンターゼである、請求項1に記載の方法。
【請求項9】
前記PHAシンターゼが、ポリ(4−ヒドロキシブチレート)シンターゼである、請求項8に記載の方法。
【請求項10】
前記生物体が、細菌である、請求項1に記載の方法。
【請求項11】
前記生物体が、E.coliである、請求項10に記載の方法。
【請求項12】
前記生物体が、E.coli eutE遺伝子を発現するE.coliである、請求項1に記載の方法。
【請求項13】
請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法によって形成された、ポリマー。
【請求項14】
請求項13に記載のポリマーから形成された物品であって、フィルム、ラテックス、コーティング、接着剤、繊維、結合剤、樹脂および医療用デバイスからなる群より選択される、物品。
【請求項15】
前記物品が、治療剤、予防剤または診断剤の制御放出、薬物送達、組織操作骨格、細胞カプセル化;標的化送達、生体適合性コーティング、生体適合性インプラント、組織再生誘導、創傷包帯、整形外科デバイス、プロテーゼおよび骨セメント、ならびに診断剤からなる群より選択されるデバイスである、請求項14に記載の物品。
【請求項16】
細菌、酵母、真菌および植物からなる群より選択される組換え生物体であって、CoA依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする異種遺伝子を含む、組換え生物体。
【請求項17】
PHAシンターゼをコードする遺伝子をさらに含む、請求項16に記載の組換え生物体。
【請求項18】
アシル−CoAトランスフェラーゼ、アシル−CoAシンテターゼ、β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−CoAレダクターゼからなる群より選択される酵素をコードする遺伝子をさらに含む、請求項17に記載の組換え生物体。
【請求項19】
前記遺伝子の1以上が、前記組換え生物体に対して内因性である、請求項18に記載の組換え生物体。
【請求項20】
前記アシル−CoAトランスフェラーゼ、アシル−CoAシンテターゼ、β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−CoAレダクターゼからなる群より選択される酵素をコードする遺伝子のうちの1以上が、前記組換え生物体に対して異種である、請求項18に記載の組換え生物体。
【請求項21】
前記遺伝子が、E.coliのeutEである、請求項16に記載の組換え生物体。
【請求項22】
細菌である、請求項16に記載の組換え生物体。
【請求項23】
植物である、請求項16に記載の組換え生物体。
【請求項24】
ポリヒドロキシアルカノエート(PHA)ポリマーを産生する方法であって、該ポリマーは、3−ヒドロキシプロピオネート、3−ヒドロキシアレレート、4−ヒドロキシブチレート、4−ヒドロキシバレレート、5−ヒドロキシバレレート、および3−ヒドロキシヘキサノエートからなる群より選択される少なくとも1つのモノマーを含み、該方法は、CoA依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼおよびPHAシンターゼを発現するように遺伝子操作された細菌、酵母、真菌および植物からなる群より選択される生物体を選択する工程、ならびに該生物体にアルコールを供給する工程を包含する、方法。
【請求項25】
前記PHAポリマーが、3−ヒドロキシブチレートをさらに含む、請求項24に記載の方法。
【請求項26】
前記PHAポリマーが、ポリ−3−ヒドロキシブチレート−co−3−ヒドロキシバレレート、ポリ−3−ヒドロキシブチレート−co−3−ヒドロキシプロピオネート、ポリ−3−ヒドロキシブチレート−co−4−ヒドロキシブチレート、ポリ−3−ヒドロキシブチレート−co−3−ヒドロキシヘキサノエートからなる群より選択される、請求項24に記載の方法。
【請求項27】
前記アルコールが、1−プロパノール、1,2−プロパンジオール、および1−ブタノールからなる群より選択される、請求項24に記載の方法。
【請求項28】
前記生物体が、アシル−CoAトランスフェラーゼ、アシル−CoAシンテターゼ、β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−CoAレダクターゼからなる群より選択される酵素をコードする遺伝子を含む、請求項24に記載の方法。
【請求項29】
前記生物体が、細菌および植物からなる群より選択される、請求項24に記載の方法。
【請求項30】
前記PHAシンターゼが、ポリ(3−ヒドロキシアルカノエート)シンターゼである、請求項24に記載の方法。
【請求項31】
前記PHAシンターゼが、ポリ(4−ヒドロキシアルカノエート)シンターゼである、請求項24に記載の方法。
【請求項32】
前記PHAシンターゼが、ポリ(4−ヒドロキシブチレート)シンターゼである、請求項31に記載の方法。
【請求項33】
前記生物体が、細菌である、請求項24に記載の方法。
【請求項34】
前記生物体が、E.coliである、請求項33に記載の方法。
【請求項35】
前記生物体が、E.coli eutE遺伝子を発現するE.coliである、請求項24に記載の方法。
【請求項36】
請求項24〜35のいずれか1項に記載の方法によって形成された、ポリマー。
【請求項37】
請求項36に記載のポリマーから形成された物品であって、該物品が、フィルム、ラテックス、コーティング、接着剤、繊維、結合剤、樹脂および医療用デバイスからなる群より選択される、物品。
【請求項38】
前記物品が、治療剤、予防剤または診断剤の制御放出、薬物送達、組織操作骨格、細胞カプセル化;標的化送達、生体適合性コーティング、生体適合性インプラント、組織再生誘導、創傷包帯、整形外科デバイス、プロテーゼおよび骨セメント、ならびに診断剤からなる群より選択される医療用デバイスである、請求項37に記載の物品。

【図1】
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【図2】
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【公開番号】特開2010−268797(P2010−268797A)
【公開日】平成22年12月2日(2010.12.2)
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願2010−137010(P2010−137010)
【出願日】平成22年6月16日(2010.6.16)
【分割の表示】特願2004−536287(P2004−536287)の分割
【原出願日】平成15年9月12日(2003.9.12)
【出願人】(398055233)メタボリックス,インコーポレイテッド (18)
【Fターム(参考)】