複合体、及びそれを用いた光イメージング用造影剤
【課題】内包したＩＣＧの漏出を抑制することができるゼラチンＩＣＧ複合体を提供すること。
【解決手段】リン脂質とゼラチンとが共有結合したゼラチン誘導体及びコレステロールとゼラチンとが共有結合したゼラチン誘導体のうち少なくとも一方と、インドシアニングリーンとを有することを特徴とする複合体。
【解決手段】リン脂質とゼラチンとが共有結合したゼラチン誘導体及びコレステロールとゼラチンとが共有結合したゼラチン誘導体のうち少なくとも一方と、インドシアニングリーンとを有することを特徴とする複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インドシアニングリーンとゼラチン誘導体からなる複合体、及びそれを用いた光イメージング用造影剤、及び前記複合体の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体内部の情報を可視化する装置の１つとして、光音響トモグラフィー（Ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、以下ＰＡＴと略すことがある）装置が知られている。ＰＡＴ装置を用いる測定においては、被測定体に光を照射したときに被測定体内部で光を吸収した物質（光吸収体）が発する光音響信号の強度と発生時刻を測定することにより、被測定体内部の物質分布を演算して層画像を得ることができる。
【０００３】
ここで、光吸収体としては、生体内で光を吸収して音響波を発するものであればいかなるものをも用いることができる。例えば人体内の血管や悪性腫瘍などを光吸収体とすることが可能である。その他にも、インドシアニングリーン（Ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ、以下ＩＣＧと略すことがある）などの分子プローブを体内に導入し、造影剤として利用することもできる。ＩＣＧは体内への摂取が認可されている安全な物質であり、また人体に照射した際の影響が少なくかつ生体での透過性が高い近赤外波長領域の光をよく吸収することから、ＰＡＴにおける造影剤として好適に用いることができる。
【０００４】
また、ＩＣＧは近赤外波長領域の光により励起され、蛍光を発するという特徴も有している。この特徴を利用して、ＩＣＧを蛍光イメージング用造影剤としても使用することもできる。
【０００５】
一方で、ＩＣＧは水と反応して分解しやすいという性質を持つため、造影剤として摂取する際に測定部位に集積させることが難しいという問題がある。
【０００６】
この問題を解決するための方法として、ＩＣＧを粒子の中に高濃度で封入する技術が開発されている。非特許文献１には、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を界面活性剤として用い、エマルジョン溶媒拡散法によって得た、ＩＣＧを含有する乳酸−グリコール酸共重合体（poly(lactide-co-glycolide）、以下ＰＬＧＡと略すことがある）粒子が開示されている。また、特許文献１には、ＩＣＧとゼラチンとを含有したリポソームが開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｂ：Ｂｉｏｌｏｇｙ，７４（２００４）２９−３８
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００９／０８７４７９号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、非特許文献１に開示されたＩＣＧ含有ＰＬＧＡ粒子及び特許文献１に開示されたリポソームのいずれも、実際の使用においては、モル吸光係数が経時的に減少し、吸光の安定性に欠けるという問題があった。
【００１０】
これは、非特許文献１のＩＣＧ含有ＰＬＧＡ粒子では、ＩＣＧは水溶性であるため、水中に分散した粒子内から周囲の水中にＩＣＧが漏出して粒子が褪色するために生じると考えられる。また、特許文献１のリポソームでは、リポソーム内の水に溶解したＩＣＧが非常に速く分解され、さらには、リポソームからＩＣＧが漏出してリポソームそのものが褪色するためであると考えられる。
【００１１】
本発明はこのような背景技術に鑑みてなされたものであり、内包したＩＣＧの漏出と粒子の褪色が抑制され、モル吸光係数の大きなゼラチンＩＣＧ複合体の提供が本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
第一の本発明に係る複合体は、リン脂質とゼラチンとが共有結合したゼラチン誘導体、コレステロールとゼラチンとが共有結合したゼラチン誘導体のうち、少なくともいずれか一方と、インドシアニングリーンとを有することを特徴とする。
第二の本発明に係る複合体の製造方法は、第二の本発明に係る複合体の製造方法は、リン脂質とゼラチンとが共有結合したゼラチン誘導体、コレステロールとゼラチンとが共有結合したゼラチン誘導体のうち、少なくともいずれか一方を用意する工程と、前記少なくともいずれか一方のゼラチン誘導体とインドシアニングリーンとを混合することにより複合体を得る工程を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のゼラチンＩＣＧ複合体は、ゼラチンに共有結合したリン脂質又はコレステロールとＩＣＧとの相互作用により、複合体からＩＣＧの漏出を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の実施形態に係るゼラチンＩＣＧ複合体及びそれを製造する工程を示す図である。
【図２】ゼラチンＩＣＧ複合体１、ゼラチンＩＣＧ複合体３、及びＩＣＧの吸収スペクトルを示すグラフである。
【図３】ゼラチンＩＣＧ複合体１、ゼラチンＩＣＧ複合体３、及びＩＣＧの７８０ｎｍにおける吸光度を比較したグラフである。
【図４】各種ゼラチン誘導体で形成したＩＣＧ複合体、及びＩＣＧの７８０ｎｍにおける吸光度を比較したグラフである。
【図５】ゼラチンＩＣＧ複合体１、ゼラチンＩＣＧ複合体２、混合物１、混合物２、及びＩＣＧの吸収スペクトルを示すグラフである。
【図６】ゼラチンＩＣＧ複合体１、ゼラチンＩＣＧ複合体３、及びＩＣＧの７８０ｎｍにおける光音響信号強度を比較したグラフである。
【図７】各種ゼラチン誘導体で形成したＩＣＧ複合体、及びＩＣＧの７８０ｎｍにおける光音響信号強度を比較したグラフである。
【図８】各種ゼラチン誘導体で形成したＩＣＧ複合体、及びＩＣＧの７８０ｎｍにおける吸光度と光音響信号強度の関係を示したグラフである。
【図９】（ａ）はＰＢＳ中におけるゼラチンＩＣＧ複合体１の吸収スペクトルの経時変化であり、（ｂ）はアルブミンを含むＰＢＳ中におけるゼラチンＩＣＧ複合体１の吸収スペクトルの経時変化である。
【図１０】（ａ）はＰＢＳ中におけるＩＣＧの吸収スペクトルの経時変化であり、（ｂ）はアルブミンを含むＰＢＳ中におけるＩＣＧの吸収スペクトルの経時変化である。
【図１１】（ａ）はＰＢＳ中におけるゼラチンＩＣＧ複合体２の吸収スペクトルの経時変化であり、（ｂ）はアルブミンを含むＰＢＳ中におけるゼラチンＩＣＧ複合体２の吸収スペクトルの経時変化である。
【図１２】ＰＢＳ中アルブミン添加有無の条件下におけるゼラチンＩＣＧ複合体１、ゼラチンＩＣＧ複合体２、及びＩＣＧの吸光度（λｍａｘ）の経時変化を比較したグラフである。
【図１３】（ａ）はＰＢＳ中におけるゼラチンＩＣＧ複合体３の吸収スペクトルの経時変化であり、（ｂ）はアルブミンを含むＰＢＳ中におけるゼラチンＩＣＧ複合体３の吸収スペクトルの経時変化である。
【図１４】（ａ）はＰＢＳ中におけるゼラチンＩＣＧ複合体４の吸収スペクトルの経時変化であり、（ｂ）アルブミンを含むＰＢＳ中におけるゼラチンＩＣＧ複合体４の吸収スペクトルの経時変化である。
【図１５】ＰＢＳ中アルブミン添加有無の条件下におけるゼラチンＩＣＧ複合体３、ゼラチンＩＣＧ複合体４、及びＩＣＧの吸光度（λｍａｘ）の経時変化を比較したグラフである。
【図１６】ゼラチンＩＣＧ複合体１、ゼラチンＩＣＧ複合体３、非特許文献１、及びＩＣＧ（特許文献１）の水中における吸光度（λｍａｘ）の経時変化を比較したグラフである。
【図１７（ａ）】ゼラチンＩＣＧ複合体１と担がんマウスを用いた蛍光イメージングの経時変化である。
【図１７（ｂ）】がん組織の蛍光強度の経時変化を示したグラフである。
【図１８】ゼラチンＩＣＧ複合体７と担がんマウスを用いた蛍光イメージングの経時変化である。
【図１９】ＩＣＧ、及び、ゼラチンとＩＣＧの混合物（ゼラチンＩＣＧ混合体）の吸収スペクトルを示した図である。
【図２０】ゼラチンＩＣＧ複合体（ゼラチン：ＤＳＰＥ＝１：１）の平均粒径とゼラチンの分子量の関係を示したグラフである。
【図２１】ゼラチンＩＣＧ複合体（ゼラチン：ＤＳＰＥ＝１：１.５）の平均粒径とゼラチンの分子量の関係を示したグラフである。
【図２２】ゼラチンＩＣＧ複合体と担がんマウスを用いた同位体トレーサー実験における各臓器の放射活性の経時変化を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施形態について説明する。
【００１６】
（複合体）
本実施形態に係る複合体は、ゼラチンにリン脂質又はコレステロールが共有結合したゼラチン誘導体と、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）とを有する。ＩＣＧは、ゼラチン誘導体の周辺、特にリン脂質又はコレステロールの周辺に存在する。また、ＩＣＧは、ゼラチン誘導体に覆われた状態で存在する場合もある。本実施形態に係る複合体は、具体的には、リン脂質又はコレステロールと、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）とが、非共有結合によって結合して、一体となったものである。ここで、非共有結合とは、疎水性相互作用、水素結合、分子間力、イオン結合などを含む。本実施形態に係る複合体は、ゼラチンが粒子表面に存在し、リン脂質又はコレステロール及びＩＣＧが粒子内部に存在した、粒子状であると考えられる。しかし、本実施形態に係る複合体は粒子状に限られず、平面状であってもよいし、線状であってもよい。本実施形態に係る複合体は、リン脂質とゼラチンとが共有結合したゼラチン誘導体と、コレステロールとゼラチンとが共有結合したゼラチン誘導体のうち、少なくともいずれか一方を有していればよく、これらを両方有していてもよい。本実施形態に係る複合体を、以下、ゼラチンＩＣＧ複合体と呼ぶことがある。
【００１７】
ゼラチンＩＣＧ複合体について図１を用いてより詳細に説明する。本実施形態において、ＩＣＧゼラチン複合体１０５は、リン脂質又はコレステロール１０２をゼラチン１０１に共有結合させることでゼラチン誘導体１０３を調製し、ゼラチン誘導体１０３とＩＣＧ１０４を混合することで調製できる。なお、１０６はゼラチン複合体１０５の断面図である。
【００１８】
ここで、リン脂質又はコレステロール１０２は疎水性の高い部位（アルキル基など）を有する。一方、ＩＣＧ１０４についても、スルホン酸基を除く部位は疎水性である。そのため、ＩＣＧ１０４と、リン脂質又はコレステロール１０２とは、疎水性相互作用等の非共有結合によって結合するため、図１の１０６で示すように、ＩＣＧ１０４はゼラチン誘導体１０３のリン脂質又はコレステロール１０２周辺に集まりやすい。そのため、ＩＣＧ１０４はゼラチンＩＣＧ複合体から離脱しにくいと考えられる。
【００１９】
また、本実施形態に係るゼラチンＩＣＧ複合体は、水中において、図１の１０５、１０６で示すように粒子状になっていると考えられる。すなわち、ゼラチン１０１は親水性であり、リン脂質又はコレステロール１０２は疎水性の高い部位（アルキル基など）を有するため、図１の１０６のように、表面部にゼラチン１０１が、内部にリン脂質又はコレステロール１０２が存在する、粒子状となっていると考えられる。前述のように、ＩＣＧ１０４はリン脂質又はコレステロール１０２と非共有結合していると考えられるため、図１の１０６のようにＩＣＧ１０４も粒子内部に存在し、ゼラチン１０１に覆われた状態となっていると考えられる。そのため、ＩＣＧ１０４は粒子状のゼラチンＩＣＧ複合体の内部から漏出しにくいと考えられる。なお、ＩＣＧ１０４の一部は、粒子の表面部に存在していてもよい。
このように、本実施形態に係るゼラチンＩＣＧ複合体は、ＩＣＧが漏出しにくいため、光イメージング用造影剤として好適に使用することができる。
また、本実施形態に係るゼラチンＩＣＧ複合体は、生体透過性の優れた６００ｎｍ以以上９００ｎｍ以下の近赤外波長領域の光に対して吸収を持つことが好ましい。
【００２０】
本実施形態においてゼラチン誘導体は、ゼラチンと、リン脂質またはコレステロールとが共有結合してできたものであり、結合する際にとれる原子は含まれない。例えば、リン脂質がカルボキシル基を有し、ゼラチンがアミノ基を有している場合、両者はアミド結合することでゼラチン誘導体となるが、アミド結合の際にとれるカルボキシル基のＯＨと、アミノ基のＨは、本実施形態におけるゼラチン誘導体には含まれない。他の結合についても同様である。
【００２１】
（粒径）
また、本実施形態に係るゼラチンＩＣＧ複合体は、目的とする用途に応じて平均粒径を制御することが可能であり、その平均粒径は１０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であることが好ましい。これは、この範囲の平均粒径を有する粒子であればＥＰＲ（Enhanced Permeation and Retention）効果があると考えられるからである。腫瘍組織では、正常組織に比べ血管透過性が高いため、粒子などが血管から流出しやすい。さらに、この流出した粒子は腫瘍組織に到達して蓄積する。腫瘍組織の持つこのような特性をＥＰＲ効果という。
【００２２】
なお、平均粒径を求める方法としては、動的光散乱法を用いて求める方法や、透過型電顕微鏡（Transmission Electron Microscope、以下ＴＥＭと略すことがある）の画像を取得して、その画像から粒径を測定することにより求める方法などがある。動的光散乱法によって平均粒径を求める方法として例えば、動的光散乱解析装置（大塚電子（株）製、ＤＬＳ−８０００）を用いる方法が挙げられる。
【００２３】
複合体を形成するためには、ゼラチン誘導体とＩＣＧとの混合比（重量比）は、(ゼラチン誘導体)：（ＩＣＧ）＝２０：１〜２：１の範囲であることが好ましい。
【００２４】
本実施形態に係るゼラチンＩＣＧ複合体は、ゼラチンに共有結合したリン脂質又はコレステロールとＩＣＧとの相互作用により、複合体からのＩＣＧの漏出と、漏出によってＩＣＧが水と反応することによるＩＣＧの褪色とを、抑制することができる。本実施形態において、相互作用とは、ＩＣＧがリン脂質又はコレステロールと疎水性相互作用若しくはイオン結合等の非共有結合していることを意味し、特に疎水性相互作用によりＩＣＧがリン脂質又はコレステロールに集まっていることを意味する。
【００２５】
本実施形態に係るゼラチンＩＣＧ複合体は、上記のように、表面部にゼラチンが、内部にリン脂質又はコレステロールが存在する粒子状の構造を有すると考えられるため、粒子内部には水が存在しにくく、ＩＣＧが粒子内部で水と反応して分解することを防ぐことができる。なお、このとき、疎水性のリン脂質又はコレステロールはすべてがゼラチンの内部に存在している必要はなく、その一部が粒子の外側に存在してもよい。
【００２６】
また、低分子物質であるリン脂質のみをＩＣＧと相互作用させ、ＩＣＧの溶解性を変化させる試みはあるが、この場合、ＩＣＧとリン脂質との間の相互作用が弱いため、両者の解離が生じるおそれがある。これに対して、本実施形態においては、ＩＣＧとリン脂質の相互作用の点は同じであるが、それに加えて、ゼラチン分子が存在していることから、ＩＣＧとリン脂質の解離の問題を解決することができる。
【００２７】
（ゼラチン）
本実施形態におけるゼラチンは、食品分野、医療分野で広く知られている水溶性のタンパク質である。ゼラチンの組成は、牛骨、牛皮、豚皮など、由来する物質によって異なるため一意的には決まらないが、全アミノ酸のうち、おおよそ、グリシンが三分の一、イミノ酸（プロリン、オキシプロリン）が九分の二を占める。また、アミノ酸配列において、グリシンは３個に１個の繰り返しで存在している。ゼラチンの平均分子量は好適には１０００以上１０００００以下であり、更に好適には３０００以上である。なお、ゼラチンはコラーゲンの熱変性物質であり、コラーゲンの部分構造を有する。また、ゼラチンはコラーゲンの加水分解によってできる。
【００２８】
本実施形態においては、ゼラチンの種類、採取する動物若しくは採取組織部位、コラーゲンからの変性処理法(アルカリ処理、酸処理、酵素処理など)によらず、いかなるゼラチンでも利用することができる。また、ヒト遺伝子組み換え型などのゼラチンも利用可能である。このようなゼラチンの例としては、等電点約５のアルカリ処理ゼラチン、等電点約９の酸処理ゼラチン等が挙げられる。
【００２９】
また、本実施形態におけるコラーゲンとしては、例えば、グリシン約３５％、プロリン及び４−ヒドロキシプロリン約２１％、アラニン約１１％を有するタンパク質を用いることができる。
【００３０】
ゼラチンは、以前より食用や医療用に使用されており、体内に摂取しても人体に害を与えることがない。また、ゼラチンは生体に吸収されやすく、生体内においてＩＣＧを安定的に保持するという役割を果たした後に、生体内で分散消失される性質をもつため、使用後に生体内から除去する必要がないという利点を有する。
【００３１】
（リン脂質）
本実施形態においてリン脂質とは、構造中にリン酸エステル部位をもつ脂質である。また、親水性の高い部位であるリン酸部位と疎水性の高い部位であるアルキル基などの部位をもつため、両親媒性である。本実施形態におけるリン脂質として、ゼラチンと容易に共有結合させることのできる、アミノ基、カルボキシル基、又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド基（以下、ＮＨＳ基と略すことがある）等を有するリン脂質であることが好ましい。特に、ＮＨＳ基を有するリン脂質は、アミノ基と結合しやすく、アミノ基を有するゼラチンに結合しやすいため好ましい。
【００３２】
また、本実施形態におけるリン脂質は、ホスファチジル系リン脂質であることが好ましい。
【００３３】
本実施形態におけるリン脂質として例えば、
1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine、1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine、1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine、1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine、1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine、1,2-Dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine、1,2-Dierucoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine、1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine、1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine、1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine、1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine、Dimyristoyl N-(Succinimidyloxy-glutaryl)-L-α-phosphatidylethanolamine、Dipalmitoyl N-(Succinimidyloxy-glutaryl)-L-α-phosphatidylethanolamine、Distearoyl N-(Succinimidyloxy-glutaryl)-L-α-phosphatidylethanolamine、1-Palmitoyl-2-oleoyl N-(Succinimidyloxy-glutaryl)-L-α-phosphatidylethanolamine、Dioleoyl N-(Succinimidyloxy-glutaryl)-L-α-phosphatidylethanolamine等を挙げることができる。これらのリン脂質は単独で使用してもよいし、又は複数を組み合わせて用いてもよい。
【００３４】
なお、上記のＮＨＳ基とは下記の化学式１で示される官能基を意味する。
【化１】
【００３５】
本実施形態におけるリン脂質としては、下記の化学式２で表される、ＮＨＳ基を有するＤＳＰＥ（Distearoyl N-(Succinimidyloxy-glutaryl)-L-α-phosphatidylethanolamine、以下ＤＳＰＥ−ＮＨＳと略すことがある）が好ましい。
【化２】
（ただし、化学式２においてＲ１及びＲ２はＣＨ３(ＣＨ２)１６−である）
【００３６】
（ＩＣＧ）
ＩＣＧ（インドシアニングリーン）は下記の化学式３で示される構造、及び、下記の構造において対イオンがＮａ＋の代わりにＨ＋あるいはＫ＋であるものを指す。
【化３】
【００３７】
（ゼラチンＩＣＧ誘導体の製造方法）
本実施形態におけるゼラチンＩＣＧ複合体の製造方法について説明する。
ゼラチンＩＣＧ複合体を製造する工程を図１に示す。具体的には、以下の（１）と（２）の工程を経てゼラチンＩＣＧ複合体１０５を得ることができる。
（１）ゼラチン１０１にリン脂質又はコレステロール１０２が共有結合したゼラチン誘導体１０３を得る工程。
（２）前記ゼラチン誘導体１０３とＩＣＧ１０４とを混合することによりゼラチンＩＣＧ複合体１０５を得る工程。
【００３８】
本実施形態において、ゼラチン１０１と、リン脂質又はコレステロール１０２を共有結合させてゼラチン誘導体１０３を得る工程と、前記ゼラチン誘導体１０３とＩＣＧ１０４とを混合することにより複合体１０５を得る工程を有することが好ましい。なぜなら、リン脂質又はコレステロール１０２とＩＣＧ１０４を混合した後に、リン脂質又はコレステロール１０２とゼラチン１０１とを共有結合させようとすると、ＩＣＧ１０４が、リン脂質又はコレステロール１０２とゼラチン１０１との結合を妨げるおそれがあるからである。
【００３９】
また、上記の（１）の工程は、リン脂質とゼラチンとが共有結合したゼラチン誘導体、コレステロールとゼラチンとが共有結合したゼラチン誘導体のうち、少なくともいずれか一方を用意する工程であればよく、両方を用意する工程であってもよい。リン脂質とゼラチンとが共有結合したゼラチン誘導体を用意する工程は、リン脂質とゼラチンとを共有結合させてゼラチン誘導体を得る工程でもよく、リン脂質とゼラチンとが共有結合した市販のゼラチン誘導体を用意する工程でもよい。コレステロールとゼラチンとが共有結合したゼラチン誘導体を用意する工程についても同様に、コレステロールとゼラチンとを共有結合させてゼラチン誘導体を得る工程でもよく、コレステロールとゼラチンとが共有結合した市販のゼラチン誘導体を用意する工程でもよい。
【００４０】
（ゼラチン誘導体）
ゼラチン誘導体の調製方法は特に限定されず、ゼラチンとリン脂質又はコレステロールとの間で共有結合が生じればよい。例えば、ゼラチンの脱水ジメチルスルホキシド溶液に、ＮＨＳ基を有するリン脂質又はヒドロキシル基を活性化したコレステロールを加えて室温下で１８時間反応させた後、反応溶液を水に対して透析し、水可溶化成分を凍結乾燥することにより、リン脂質又はコレステロールが共有結合したゼラチン誘導体を得ることができる。ここで、リン脂質のうち、ＮＨＳ基を有するリン脂質は、アミノ基と結合しやすく、アミノ基を有するゼラチンに結合しやすい。したがって、ＮＨＳ基を有するリン脂質を用いることで本実施形態に係る複合体の製造が容易となるため好ましい。特には、上記の化学式２で表される、ＤＳＰＥ−ＮＨＳを用いることが好ましい。
【００４１】
このようにして得たゼラチン誘導体とＩＣＧとを混合することにより、リン脂質又はコレステロールが有する高い疎水性を示す炭素鎖部位とＩＣＧとの間で相互作用が生じ、本実施形態に係るゼラチンＩＣＧ複合体を得ることができる。
【００４２】
＜光イメージング用造影剤＞
本実施形態に係る光イメージング用造影剤は、本実施形態に係る複合体と、前記複合体が分散された分散媒とを有する。本実施形態において光イメージングとは、光を照射することで、イメージング（画像化）することを意味する。すなわち、本実施形態に係る光イメージング用造影剤はＩＣＧを有するため、ＩＣＧに光が照射されることで、音響波や蛍光などを発する。発せられた音響波を検出することで光音響イメージングをすることができ、発せられた蛍光を検出することで蛍光イメージングをすることができる。なお、光音響イメージングは、光音響トモグラフィー（断層撮影法）を含む概念である。 上記の分散媒は、本実施形態に係る複合体を分散させるための液状の物質であり、例えば生理食塩水、注射用蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、以下ＰＢＳと略すことがある）などが挙げられる。また本実施形態に係る光イメージング用造影剤は、必要に応じて本実施形態に係る複合体の他に薬理上許容できる添加物を有していても良い。
【００４３】
本実施形態に係る光イメージング用造影剤は、上記本実施形態に係る粒子をこの分散媒に予め分散させておいてもよいし、本実施形態に係る粒子と分散媒とをキットにしておき、生体内に投与する前に粒子を分散媒に分散させて使用してもよい。
【００４４】
このように、本実施形態に係る光イメージング用造影剤は、光音響イメージング用造影剤や、蛍光イメージング用造影剤として利用することができる。
【００４５】
本実施形態に係るゼラチンＩＣＧ複合体は、ＥＰＲ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）効果を利用することで、生体内に投与したときに、生体内の正常部位に比べて腫瘍部位により多く集積させることができる。その結果、複合体を生体内に投与した後、生体に光を照射して、生体からの音響波や蛍光を検出するときに、腫瘍部位から発せられる音響波や蛍光を正常部位から発せられる音響波や蛍光よりも大きくすることができる。従って、本実施形態に係る複合体は腫瘍部位を特異的に検出する光イメージング用造影剤として用いることができる。
【００４６】
ここで、ゼラチンは化学修飾可能な化学官能基をもっているため、例えば、ゼラチンＩＣＧ複合体のゼラチン分子表面に腫瘍細胞認識リガンドを化学結合させることにより、複合体の腫瘍へのターゲティングが可能となる。リガンドとしては、細胞表面の構造を認識できる抗体、アプタマー、レクチン、トランスフェリン、及びレセプターに対するアゴニストあるいはアンタゴニストあるいは葉酸などの腫瘍細胞に特異的に取り込まれるような物質などが挙げられる。これらの物質は単独で使用してもよいし、あるいは複数を組み合わせて用いてもよい。
【００４７】
生体内に投与して利用することを考えると、本実施形態に係るゼラチンＩＣＧ複合体の吸収スペクトルのピークは近赤外波長領域にあることが好ましい。これは、近赤外波長領域の光が生体に照射したときに安全で、かつ、生体に対して比較的高い透過性をもつからである。本実施形態に係るゼラチンＩＣＧ複合体は特に、６００ｎｍから９００ｎｍの波長領域において高い吸光度を有する。
【００４８】
（造影方法）
生体内に投与された本実施形態に係る複合体を、ＰＡＴ装置を用いて検出する方法について説明する。本実施形態に係る複合体を検出する方法は以下の工程を有する。
（ａ）本実施形態に係る複合体を生体内に投与する工程。
（ｂ）生体に光を照射し、生体内に存在する本実施形態に係る複合体から発せられる光音響信号を検出する工程。
【００４９】
なお、上記（ａ）の工程において、本実施形態に係る複合体を生体内に投与する方法は特に限定されない。また、上記（ｂ）の工程において、生体に照射する光を発生させる装置、複合体から発せられる光音響信号を検出する装置は特に限定されない。例えば、生体に照射する光を発生させる装置として、レーザーパルス光を照射する装置を用いることができる。レーザーパルス光を照射する装置として例えば、チタンサファイアレーザー（ＬＴ−２２１１−ＰＣ、Ｌｏｔｉｓ社製））、ＯＰＯレーザー（ＬＴ−２２１４ ＯＰＯ、Ｌｏｔｉｓ社製）、アレキサンドライトレーザーなどが挙げられる。
【００５０】
次に、生体内に投与された本実施形態に係る複合体を、蛍光装置を用いて検出する方法について説明する。本実施形態に係る複合体を検出する方法は以下の工程を有する。
（ｃ）本実施形態に係る複合体を生体内に投与する工程。
（ｄ）生体に光を照射し、生体内に存在する本実施形態に係る複合体から発せられる蛍光を検出する工程。
【００５１】
なお、上記（ａ）の工程において、本実施形態に係る複合体を生体内に投与する方法は特に限定されない。また、上記（ｄ）の工程において、生体に照射する光を発生させる装置、複合体から発せられる蛍光を検出する装置は特に限定されない。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例を用いて更に詳細に本発明を説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではなく、材料、組成条件及び反応条件等は、同様の機能、効果を有する複合体が得られる範囲で変更することができる。
【００５３】
＜実施例１＞
（ゼラチンＩＣＧ複合体１）
牛骨由来、等電点５.０のゼラチン（１０００ｍｇ、分子量１００００、新田ゼラチン株式会社製）の脱水ジメチルスルホキシド（３０ｍｌ、ナカライテスク株式会社製）溶液に、上記の化学式２で示されるＤＳＰＥ−ＮＨＳ（日油株式会社製）１３３ｍｇを加え、モル比１：１.５で室温下１８時間反応させた。得られた反応溶液を水に対して透析し、水可溶化成分を凍結乾燥することにより、ゼラチンにＤＳＰＥが共有結合したゼラチン誘導体１を得た。ゼラチンへのＤＳＰＥの導入量は、フルオレスカミン法にて測定し、ゼラチンに対してＤＳＰＥが６７％導入されていることが確認された。
【００５４】
次に、ＩＣＧ（シグマ製）を溶解した水溶液（最終濃度：０.５ｍｇ／ｍｌ）とＤＳＰＥが共有結合したゼラチン誘導体１（最終濃度：４０ｍｇ／ｍｌ）とを混合して、ゼラチンＩＣＧ複合体１を得た。得られたゼラチンＩＣＧ複合体１の粒径を動的光散乱解析装置（大塚電子株式会社製）で分析したところ、ゼラチンＩＣＧ複合体１の平均粒径は５４０ｎｍであった。
【００５５】
分光光度計（ベックマンコールター社製）を用いて、得られたゼラチンＩＣＧ複合体１の吸収スペクトルを測定した。
【００５６】
ゼラチンＩＣＧ複合体１の吸収スペクトルと７８０ｎｍにおける吸光度をそれぞれ図２と図３に示した。比較例としてＩＣＧの吸収スペクトルと７８０ｎｍにおける吸光度をそれぞれ図２と図３に示した。
【００５７】
ＩＣＧの吸収スペクトルは２峰性であり、低波長側（７００ｎｍ）がＩＣＧの会合体による吸収、長波長側（７８０ｎｍ）が単量体による吸収を示すことが知られている。
【００５８】
図２から、最終濃度０.５ｍｇ／ｍｌのＩＣＧでは、会合体が多く形成されている為、長波長側の吸光度が低くなったと考えられる。一方、ゼラチンＩＣＧ複合体１では、長波長側の吸光度がＩＣＧ単独よりも高く、複合体中でＩＣＧの会合が抑制され、ＩＣＧとリン脂質とが相互作用していることが示唆された。
【００５９】
図３から、ゼラチンＩＣＧ複合体１は同じ濃度（０.５ｍｇ／ｍｌ）のＩＣＧと比べて、約３.３倍の吸光度を有することが確認された。
【００６０】
また、平均粒径と吸光度からモル吸光係数（７８０ｎｍ）を算出したところ、ゼラチンＩＣＧ複合体１のモル吸光係数は１.１×１０１１ Ｍ-1ｃｍ-1であり、従来から知られている金ナノロッドのモル吸光係数（８.６×１０９Ｍ-1ｃｍ-1）より極めて大きいことが確認された。
【００６１】
＜実施例２＞
（ゼラチンＩＣＧ複合体２）
ＤＳＰＥとゼラチンのモル比を１：１で反応させた以外は実施例１と同様の操作によって、ＤＳＰＥが共有結合したゼラチン誘導体２を得た。フルオレスカミン法による測定により、ゼラチンに対してＤＳＰＥが３０％導入されていることが確認された。
【００６２】
ＩＣＧを溶解した水溶液（最終濃度：０.５ｍｇ／ｍｌ）とＤＳＰＥが共有結合したゼラチン誘導体２（最終濃度：４０ｍｇ／ｍｌ）を混合して、ゼラチンＩＣＧ複合体２を得た。実施例１と同様に平均粒径及びモル吸光係数を求めたところ、ゼラチンＩＣＧ複合体２の平均粒径は５００ｎｍであった。また、ゼラチンＩＣＧ複合体２の７８０ｎｍにおけるモル吸光係数は５.２×１０１０ Ｍ-1ｃｍ-1であり、大きなモル吸光係数であることが確認された。
【００６３】
＜実施例３＞
（ゼラチンＩＣＧ複合体３）
コレステロール（３８．６ｍｇ、和光純薬工業製、特級）のピリジン(和光純薬工業製)溶液へ、縮合剤のN,N'-Disuccinimidyl Carbonate（７７ｍｇ、ナカライテスク製）、続いて反応触媒の4-Dimethylaminopyridine(ナカライテスク製)を加え、コレステロールのヒドロシル基を活性化した。
【００６４】
上記活性化コレステロールのピリジン溶液へゼラチン（１０００ｍｇ）の脱水ジメチルスルホキシド（３０ｍｌ）溶液を加え、モル比１：１で室温下１８時間反応させた。得られた反応溶液を水に対して透析し、水可溶化成分を凍結乾燥することにより、ゼラチンにコレステロールが共有結合したゼラチン誘導体３を得た。フルオレスカミン法による測定により、ゼラチンに対してコレステロールが４１％導入されていることが確認された。
【００６５】
次に、ＩＣＧを溶解した水溶液（最終濃度：０.５ｍｇ／ｍｌ）とコレステロールが共有結合したゼラチン誘導体３と（最終濃度：４０ｍｇ／ｍｌ）を混合して、ゼラチンＩＣＧ複合体３を得た。実施例１と同様に平均粒径を求めたところ、ゼラチンＩＣＧ複合体３の平均粒径は２００ｎｍであった。
【００６６】
実施例１と同様に求めたゼラチンＩＣＧ複合体３の吸収スペクトルと７８０ｎｍにおける吸光度をそれぞれ図２と図３に示す。
【００６７】
図２から、ゼラチンＩＣＧ複合体３はＩＣＧと比べて７００ｎｍ付近の会合体の吸収が減少し、７８０ｎｍ付近の単量体の吸収が増加していることが確認された。ただし、ＤＳＰＥが共有結合したゼラチン誘導体からなるゼラチンＩＣＧ複合体１よりも７００ｎｍ付近での吸光度が高く、７８０ｎｍ付近での吸光度が低かったため、複合体中での会合が抑制される度合いはゼラチン誘導体の種類に依存すると考えられた。
【００６８】
図３から、ゼラチンＩＣＧ複合体３は同じ濃度（０.５ｍｇ／ｍｌ）のＩＣＧと比べて、約１.５倍の吸光度を有することが確認された。
【００６９】
また、平均粒径と吸光度からモル吸光係数（７８０ｎｍ）を算出したところ、ゼラチンＩＣＧ複合体３のモル吸光係数は２.４×１０９ Ｍ-1ｃｍ-1であり、大きなモル吸光係数であることが確認された。
【００７０】
＜実施例４＞
（ゼラチンＩＣＧ複合体４）
ゼラチンとコレステロールのモル比を１：１.５で反応させた以外は実施例３と同様の操作によって、コレステロールが共有結合したゼラチン誘導体４を得た。フルオレスカミン法による測定により、ゼラチンに対してコレステロールが７１％導入されていることが確認された。
【００７１】
ＩＣＧを溶解した水溶液（最終濃度：０.５ｍｇ／ｍｌ）とコレステロールが共有結合したゼラチン誘導体４（最終濃度：４０ｍｇ／ｍｌ）を混合して、ゼラチンＩＣＧ複合体４を得た。実施例１と同様に平均粒径及びモル吸光係数を求めたところ、ゼラチンＩＣＧ複合体４の平均粒径は１５０ｎｍであった。また、ゼラチンＩＣＧ複合体４の７８０ｎｍにおけるモル吸光係数は１.７×１０９Ｍ-1ｃｍ-1であり、大きなモル吸光係数であることが確認された。
【００７２】
＜実施例５＞
（吸光度比較）
実施例１と同様の操作によって、ゼラチン（分子量５０００）にＤＳＰＥを７５％導入したゼラチン誘導体５を合成した。
【００７３】
実施例３と同様の操作によって、ゼラチン（分子量１００００）にコレステロールを８３％導入したゼラチン誘導体６を合成した。
【００７４】
ゼラチンＩＣＧ複合体１、３、４、５、６（最終濃度：４０、１００ｍｇ／ｍｌ）のそれぞれとＩＣＧ水溶液（最終濃度：０.５ｍｇ／ｍｌ）とを混合して、ゼラチンＩＣＧ複合体を得た。これらの複合体とＩＣＧの７８０ｎｍにおける吸光度を比較した結果を図４に示す。
【００７５】
図４から、ＩＣＧの同濃度の条件下においてゼラチンＩＣＧ複合体はいずれもＩＣＧに比べて吸光度が大きく、更に、コレステロールよりもＤＳＰＥが共有結合したゼラチンからなる複合体の方が吸光度の増加が大きいことが確認された。
【００７６】
＜実施例６＞
（ゼラチン誘導体の効果）
前記ゼラチンＩＣＧ複合体１、２と同じ組成量の混合物を混合物１、２とし、それぞれの吸収スペクトルを比較したグラフを図５に示した。
【００７７】
なお、複合体と混合物は、ＩＣＧとゼラチンの最終濃度がそれぞれ０.５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌとなるように調製した。
【００７８】
図５の混合物１、２とゼラチンＩＣＧ複合体１、２を比較すると、混合物１、２では７８０ｎｍ付近の長波長側の吸収が非常に低いことからゼラチンＩＣＧ複合体は殆ど形成されず、また、７００ｎｍ付近の短波長側の吸収が高いことからＩＣＧの会合体が数多く形成されていることが示唆された。
【００７９】
一方、同様にして前記ゼラチンＩＣＧ複合体３、４と同じ組成量の混合物の吸収スペクトルを求めようとしたが、コレステロールは水に対して不溶であり、ゼラチンＩＣＧ複合体３、４と同じ組成量の混合物を得ることはできなかった。
【００８０】
以上の検討結果から、ＤＳＰＥ又はコレステロールが共有結合したゼラチン誘導体でＩＣＧを複合化することが、モル吸光係数の大きな複合体を得る上で極めて有効であることを確認した。
【００８１】
＜実施例７＞
（光音響信号評価１）
光音響信号測定装置（試作品、照射波長：７８０ｎｍ、照射エネルギー：５０ｍＪ）を用いて、ゼラチンＩＣＧ複合体１、ゼラチンＩＣＧ複合体３、及びＩＣＧ（比較例）を用いて光音響信号を評価し、その結果を図６に示した。なお、図６は各サンプルの７８０ｎｍにおける光音響信号強度を比較したものである。
【００８２】
図６から、ゼラチンＩＣＧ複合体１は同濃度（０.５ｍｇ／ｍｌ）のＩＣＧと比べて、光音響信号強度が６桁程大きいことが確認された。
【００８３】
一方、ゼラチンＩＣＧ複合体３は同濃度（０.５ｍｇ／ｍｌ）のＩＣＧと比べて、光音響信号強度が５桁程大きいことが確認された。
【００８４】
以上から、ＩＣＧはゼラチン誘導体で複合体化することによって光音響信号が増強されることが確認された。
【００８５】
＜実施例８＞
（光音響信号評価２）
ゼラチンＩＣＧ複合体１（最終濃度：１０、４０、１００ｍｇ／ｍｌ）、ゼラチン誘導体３、６（最終濃度：４０、１００ｍｇ／ｍｌ）とＩＣＧ水溶液（最終濃度：０.１、０.５、１、５ｍｇ／ｍｌ）とをそれぞれ混合して得られたゼラチンＩＣＧ複合体、及びＩＣＧ（比較例）を用いて光音響信号を評価し、その結果を図７に示した。なお、図７は各サンプルの７８０ｎｍにおける光音響信号強度を比較したものである。
【００８６】
図７から、ゼラチンＩＣＧ複合体はいずれもＩＣＧ単独に比べて光音響信号が高く、ＩＣＧはゼラチン誘導体で複合体化することによって光音響信号が増強されることが確認された。
【００８７】
＜実施例９＞
（光音響信号評価３）
ゼラチンＩＣＧ複合体１、６（最終濃度：４０、１００ｍｇ／ｍｌ）とＩＣＧ水溶液（最終濃度：０.５ｍｇ／ｍｌ）とをそれぞれ混合して得られたゼラチンＩＣＧ複合体、及びＩＣＧ（比較例）を用いて光音響信号を評価し、７８０ｎｍにおける吸光度と光音響信号強度の関係を図８に示した。
【００８８】
図８から、吸光度と光音響信号強度には正の相関があることが確認された。
【００８９】
＜実施例１０＞
（ゼラチンＩＣＧ複合体１の安定性評価）
ゼラチンＩＣＧ複合体１の安定性を評価する為に、ゼラチンＩＣＧ複合体１をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）又はアルブミン（４０ｍｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳ中に３７℃で静置して、経時的に吸収スペクトルを測定した。
【００９０】
ゼラチンＩＣＧ複合体１のＰＢＳ中、及びアルブミンを含むＰＢＳ中での吸収スペクトルの経時変化をそれぞれ図９（ａ）と（ｂ）に示した。
【００９１】
また、比較例として、ＩＣＧのＰＢＳ中、及びアルブミンを含むＰＢＳ中での吸収スペクトルの経時変化を図１０（ａ）と（ｂ）に示した。
【００９２】
また、上記条件下のゼラチンＩＣＧ複合体１とＩＣＧの吸光度（λｍａｘ）の経時変化を比較したグラフを図１２に示した。
【００９３】
図９（ａ）と（ｂ）、及び図１２から、ゼラチンＩＣＧ複合体１はアルブミンの添加の有無に関わらず、吸光度の減少が抑制さていることが確認され、少なくとも1週間、吸収スペクトルが変化しなかった。これはゼラチン誘導体中のリン脂質とＩＣＧとが相互作用して、複合体からのＩＣＧの漏出と褪色が抑制された為と考えられ、複合体が安定であることを確認した。
【００９４】
一方、図１０（ａ）と図１２から、アルブミン無添加のＩＣＧでは吸収スペクトルの経時変化は非常に大きく、ＩＣＧが褪色していることが確認された。
【００９５】
また、図１０（ｂ）と図１２から、アルブミン添加のＩＣＧの吸収スペクトルはアルブミン無添加のＩＣＧより経時変化が抑制されてはいるが、アルブミン添加のゼラチンＩＣＧ複合体１と比較すると安定性に若干劣ることが確認された。
【００９６】
＜実施例１１＞
（ゼラチンＩＣＧ複合体２の安定性評価）
実施例１０と同様にして、ゼラチンＩＣＧ複合体２のＰＢＳ中、及びアルブミンを含むＰＢＳ中での吸収スペクトルの経時変化を測定し、その結果を図１１（ａ）と（ｂ）に示した。
【００９７】
また、上記条件下のゼラチンＩＣＧ複合体２とＩＣＧの吸光度（λｍａｘ）の経時変化を比較したグラフを図１２に示した。
【００９８】
図１１（ａ）と（ｂ）、及び図１２から、ゼラチンＩＣＧ複合体２はアルブミンの添加の有無に関わらず、吸光度の減少が抑制さていることが確認され、少なくとも1週間、吸収スペクトルが変化しなかった。これはゼラチン誘導体中のリン脂質とＩＣＧとが相互作用して、複合体からのＩＣＧの漏出と褪色が抑制された為と考えられ、複合体が安定であることを確認した。
【００９９】
＜実施例１２＞
（ゼラチンＩＣＧ複合体３の安定性評価）
実施例１０と同様にして、ゼラチンＩＣＧ複合体３のＰＢＳ中、及びアルブミンを含むＰＢＳ中での吸収スペクトルの経時変化を測定し、その結果を図１３（ａ）と（ｂ）に示した。
【０１００】
また、上記条件下のゼラチンＩＣＧ複合体３とＩＣＧの吸光度（λｍａｘ）の経時変化を比較したグラフを図１５に示した。
【０１０１】
図１３（ａ）と図１５から、アルブミン無添加のゼラチンＩＣＧ複合体３はアルブミン無添加のＩＣＧと比べて、吸光度の減少が抑制されていることが確認された。
【０１０２】
また、図１３（ｂ）と図１５から、アルブミン添加のゼラチンＩＣＧ複合体３は、吸光度の減少が更に抑制されることが確認された。
【０１０３】
＜実施例１３＞
（ゼラチンＩＣＧ複合体４の安定性評価）
実施例１０と同様にして、ゼラチンＩＣＧ複合体４のＰＢＳ中、及びアルブミンを含むＰＢＳ中での吸収スペクトルの経時変化を測定し、その結果を図１４（ａ）と（ｂ）に示した。
【０１０４】
また、上記条件下のゼラチンＩＣＧ複合体４とＩＣＧの吸光度（λｍａｘ）の経時変化を比較したグラフを図１５に示した。
【０１０５】
図１４（ａ）と（ｂ）、及び図１５から、アルブミンの添加の有無に関わらず、吸光度の減少が抑制さていることが確認された。
【０１０６】
＜実施例１４＞
（ゼラチンＩＣＧ複合体と先行技術の安定性比較）
ゼラチンＩＣＧ複合体１、ゼラチンＩＣＧ複合体３、非特許文献１、及びＩＣＧ（特許文献１）の水中における吸光度（λｍａｘ）の経時変化を比較したグラフを図１６に示した。
【０１０７】
図１６から、前記ゼラチンＩＣＧ複合体１、及びゼラチンＩＣＧ複合体３は、非特許文献１、及びＩＣＧ（特許文献１）と比べて、ＩＣＧの漏出による褪色が抑制されていることが確認された。
【０１０８】
非特許文献１のＩＣＧ含有ＰＬＧＡ粒子では、ＩＣＧの漏出による褪色が非常に速かった。また、ＩＣＧ水溶液（特許文献１）では、ＩＣＧは水中で分解し、褪色が極めて速かった。
【０１０９】
これは、非特許文献１のＩＣＧ含有ＰＬＧＡ粒子では、ＰＬＧＡとリン脂質（ゼラチンＩＣＧ複合体１）あるいはコレステロール（ゼラチンＩＣＧ複合体３）とでは、後者のほうが疎水性部位の疎水性が高いため、ＩＣＧと相互作用しやすいからと考えられる。また、特許文献１のリポソームでは、リポソーム内部の水中でＩＣＧが分解してしまい、また、リン脂質の二重膜中に存在するＩＣＧは粒子の外部に近い位置に存在するため、漏出しやすいためと考えられる。
【０１１０】
＜実施例１５＞
（ゼラチンＩＣＧ複合体の体内動態評価１）
左後肢にがん部位を有する担がんマウスの尾静脈よりゼラチンＩＣＧ複合体１を投与した後、蛍光イメージング装置（ＧＥヘルスケア社製）を用いて経時的に撮像し、ゼラチンＩＣＧ複合体１の体内動態を評価した。
【０１１１】
また、比較例として、同濃度（０.５ｍｇ／ｍｌ）のＩＣＧ単独を担がんマウスに静脈内投与して同様に評価した。蛍光イメージングの経時変化を図１７（ａ）に、がん組織の蛍光強度の経時変化を図１７（ｂ）に示した。
【０１１２】
図１７（ａ）と（ｂ）から、ＩＣＧ単独を投与した場合、一時的にがん組織へ分布するが、時間と共に消失する動態を示した。一方、ゼラチンＩＣＧ複合体１を投与した場合、ＩＣＧ単独の場合と同様にがん組織への一時的な分布が一度消失するものの、時間と共にがん組織へ再度高濃度で集積することが確認された。これは、ゼラチン誘導体による複合体化によりＩＣＧの血中安定性が向上され、いわゆるＥＰＲ効果によりがん組織へ集積したものと考えられる。
【０１１３】
＜実施例１６＞
（ゼラチンＩＣＧ複合体の体内動態評価２）
Ｃｙ５.５で蛍光標識したゼラチン誘導体７（ＤＳＰＥ６７％導入）とＩＣＧからなるゼラチンＩＣＧ複合体７を調製し、実施例１５と同様にして担がんマウスに投与してゼラチン誘導体７自身の体内動態を評価した。その蛍光イメージングの経時変化を図１８に示した。
【０１１４】
図１８から、Ｃｙ５.５で蛍光標識したゼラチン誘導体７もまたゼラチンＩＣＧ複合体１と同様の体内動態を示していることから、ゼラチンＩＣＧ複合体は解離することなくがん組織へ集積していることが確認された。
【０１１５】
＜参考例＞
（ゼラチンＩＣＧ）
ＩＣＧ水溶液（最終濃度：０.１ｍｇ／ｍｌ）とゼラチン（重量平均分子量：１００００、最終濃度：１００ｍｇ／ｍｌ）とを混合して、ゼラチンとＩＣＧの混合物（ゼラチンＩＣＧ混合体）を得た。分光光度計を用いて、得られたゼラチンＩＣＧ混合体の吸収スペクトルを測定した。その結果を図１９に示す。ゼラチンＩＣＧ混合体はＩＣＧ単独とほぼ同じ吸収スペクトルが得られた。このことから、ゼラチンに、リン脂質又はコレステロールが共有結合していない場合、ゼラチンとＩＣＧとは複合体を形成していないものと考えられる。
【０１１６】
＜実施例１７＞
（ゼラチンＩＣＧ複合体８乃至１３）
３種類のゼラチン（分子量５０００、１００００、２００００、いずれも新田ゼラチン株式会社製）にＤＳＰＥを仕込みモル比（ゼラチン：ＤＳＰＥ）１：１または１：１.５で導入したゼラチン誘導体をミリＱ水で８０ｍｇ／ｍｌに調製し、０.２２μｍのフィルターで処理した後、ＩＣＧ水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）と同体積で混合して、ゼラチンＩＣＧ複合体８乃至１３を調製した。このとき用いたＤＳＰＥは実施例１と同様、上記の化学式２で示されるＤＳＰＥ−ＮＨＳ（日油株式会社製）である。各複合体の平均粒径、モル吸光係数、および光音響信号強度を表１に示した。
【０１１７】
【表１】
【０１１８】
ゼラチンの分子量やＤＳＰＥの仕込みモル比を変えることによって、平均粒径が１６４から８５５ｎｍまでの種々のゼラチンＩＣＧ複合体を得ることができた。
また、ゼラチンＩＣＧ複合体１１では、平均粒径が２９３ｎｍで、１.６×１０１０ Ｍ-1ｃｍ-1の大きなモル吸光係数と２.９×１０１１ ＶＪ-1Ｍ-1の大きな光音響信号が確認された。
【０１１９】
＜実施例１８＞
（ゼラチンＩＣＧ複合体１４乃至１７）
ゼラチン（分子量１００００）にＤＳＰＥを４条件の仕込みモル比（１：０.５、１：１、１：１.５、１：３）で導入したゼラチン誘導体を実施例１７と同様にして、ゼラチンＩＣＧ複合体１４乃至１７を調製した。それらの平均粒径を表２に示した。
【０１２０】
【表２】
【０１２１】
ＤＳＰＥの仕込みモル比を変えることによって、平均粒径が１４７から２００ｎｍまでの種々のゼラチンＩＣＧ複合体を得ることができた。
【０１２２】
＜実施例１９＞
（ゼラチンＩＣＧ複合体の平均粒径とゼラチンの分子量の関係１）
４種類のゼラチン（分子量４０００、５０００、１００００、２００００）にＤＳＰＥを仕込みモル比１：１で導入したゼラチン誘導体を実施例１７と同様にして、ゼラチンＩＣＧ複合体を調製した。それらの平均粒径とゼラチンの分子量の関係を図２０に示した。図２０から、ゼラチンＩＣＧ複合体の平均粒径は、ゼラチンの分子量が５０００から１００００の間で最小値になることが示唆された。
【０１２３】
＜実施例２０＞
（ゼラチンＩＣＧ複合体の平均粒径とゼラチンの分子量の関係２）
３種類のゼラチン（分子量５０００、１００００、２００００）にＤＳＰＥを仕込みモル比１：１.５で導入したゼラチン誘導体を実施例１７と同様にして、ゼラチンＩＣＧ複合体を調製した。それらの平均粒径とゼラチンの分子量の関係を図２１に示した。
図２１から、ゼラチンＩＣＧ複合体の平均粒径は、ゼラチンの分子量が１００００あたりで、最小値になることが示唆された。
【０１２４】
＜実施例２１＞
（ゼラチンＩＣＧ複合体の体内動態評価３）
マウスの大腿部にｃｏｌｏｎ２６細胞（マウス 大腸がん）を植え付けた後、２０日間飼育することにより担がんマウスを作製した。
ＩＣＧはクロラミンＴ法により、125Ｉでラベル化した。125Ｉ−ＩＣＧ（０．５ｍｇ／ｍｌ）単独、もしくはＤＳＰＥを導入したゼラチン（ゼラチンの分子量１００００、仕込みモル比１：１、４０ｍｇ／ｍｌ）と125Ｉ−ＩＣＧからなるゼラチンＩＣＧ複合体１８を上記の担がんマウスに尾静脈投与し（１００μｌ）、一定時間ごとに眼窩採血を行った。また、投与１時間後と３時間後に各臓器を摘出し、放射活性を測定した。その結果を図２２に示した。
【０１２５】
図２２から、投与３時間後よりも１時間後の方が、がん組織への集積が高かった。また、投与１時間後のがん組織への集積に関して、ゼラチンＩＣＧ複合体１８の方がＩＣＧ単独よりも高いことが確認された。これは、ゼラチン誘導体による複合体化によりＩＣＧの血中安定性が向上され、ＥＰＲ効果によりがん組織へ集積したものと考えられる。
【符号の説明】
【０１２６】
１０１ ゼラチン
１０２ リン脂質又はコレステロール
１０３ ゼラチン誘導体
１０４ インドシアニングリーン（ＩＣＧ）
１０５ ゼラチン複合体
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インドシアニングリーンとゼラチン誘導体からなる複合体、及びそれを用いた光イメージング用造影剤、及び前記複合体の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体内部の情報を可視化する装置の１つとして、光音響トモグラフィー（Ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、以下ＰＡＴと略すことがある）装置が知られている。ＰＡＴ装置を用いる測定においては、被測定体に光を照射したときに被測定体内部で光を吸収した物質（光吸収体）が発する光音響信号の強度と発生時刻を測定することにより、被測定体内部の物質分布を演算して層画像を得ることができる。
【０００３】
ここで、光吸収体としては、生体内で光を吸収して音響波を発するものであればいかなるものをも用いることができる。例えば人体内の血管や悪性腫瘍などを光吸収体とすることが可能である。その他にも、インドシアニングリーン（Ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ、以下ＩＣＧと略すことがある）などの分子プローブを体内に導入し、造影剤として利用することもできる。ＩＣＧは体内への摂取が認可されている安全な物質であり、また人体に照射した際の影響が少なくかつ生体での透過性が高い近赤外波長領域の光をよく吸収することから、ＰＡＴにおける造影剤として好適に用いることができる。
【０００４】
また、ＩＣＧは近赤外波長領域の光により励起され、蛍光を発するという特徴も有している。この特徴を利用して、ＩＣＧを蛍光イメージング用造影剤としても使用することもできる。
【０００５】
一方で、ＩＣＧは水と反応して分解しやすいという性質を持つため、造影剤として摂取する際に測定部位に集積させることが難しいという問題がある。
【０００６】
この問題を解決するための方法として、ＩＣＧを粒子の中に高濃度で封入する技術が開発されている。非特許文献１には、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を界面活性剤として用い、エマルジョン溶媒拡散法によって得た、ＩＣＧを含有する乳酸−グリコール酸共重合体（poly(lactide-co-glycolide）、以下ＰＬＧＡと略すことがある）粒子が開示されている。また、特許文献１には、ＩＣＧとゼラチンとを含有したリポソームが開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｂ：Ｂｉｏｌｏｇｙ，７４（２００４）２９−３８
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００９／０８７４７９号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、非特許文献１に開示されたＩＣＧ含有ＰＬＧＡ粒子及び特許文献１に開示されたリポソームのいずれも、実際の使用においては、モル吸光係数が経時的に減少し、吸光の安定性に欠けるという問題があった。
【００１０】
これは、非特許文献１のＩＣＧ含有ＰＬＧＡ粒子では、ＩＣＧは水溶性であるため、水中に分散した粒子内から周囲の水中にＩＣＧが漏出して粒子が褪色するために生じると考えられる。また、特許文献１のリポソームでは、リポソーム内の水に溶解したＩＣＧが非常に速く分解され、さらには、リポソームからＩＣＧが漏出してリポソームそのものが褪色するためであると考えられる。
【００１１】
本発明はこのような背景技術に鑑みてなされたものであり、内包したＩＣＧの漏出と粒子の褪色が抑制され、モル吸光係数の大きなゼラチンＩＣＧ複合体の提供が本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
第一の本発明に係る複合体は、リン脂質とゼラチンとが共有結合したゼラチン誘導体、コレステロールとゼラチンとが共有結合したゼラチン誘導体のうち、少なくともいずれか一方と、インドシアニングリーンとを有することを特徴とする。
第二の本発明に係る複合体の製造方法は、第二の本発明に係る複合体の製造方法は、リン脂質とゼラチンとが共有結合したゼラチン誘導体、コレステロールとゼラチンとが共有結合したゼラチン誘導体のうち、少なくともいずれか一方を用意する工程と、前記少なくともいずれか一方のゼラチン誘導体とインドシアニングリーンとを混合することにより複合体を得る工程を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のゼラチンＩＣＧ複合体は、ゼラチンに共有結合したリン脂質又はコレステロールとＩＣＧとの相互作用により、複合体からＩＣＧの漏出を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の実施形態に係るゼラチンＩＣＧ複合体及びそれを製造する工程を示す図である。
【図２】ゼラチンＩＣＧ複合体１、ゼラチンＩＣＧ複合体３、及びＩＣＧの吸収スペクトルを示すグラフである。
【図３】ゼラチンＩＣＧ複合体１、ゼラチンＩＣＧ複合体３、及びＩＣＧの７８０ｎｍにおける吸光度を比較したグラフである。
【図４】各種ゼラチン誘導体で形成したＩＣＧ複合体、及びＩＣＧの７８０ｎｍにおける吸光度を比較したグラフである。
【図５】ゼラチンＩＣＧ複合体１、ゼラチンＩＣＧ複合体２、混合物１、混合物２、及びＩＣＧの吸収スペクトルを示すグラフである。
【図６】ゼラチンＩＣＧ複合体１、ゼラチンＩＣＧ複合体３、及びＩＣＧの７８０ｎｍにおける光音響信号強度を比較したグラフである。
【図７】各種ゼラチン誘導体で形成したＩＣＧ複合体、及びＩＣＧの７８０ｎｍにおける光音響信号強度を比較したグラフである。
【図８】各種ゼラチン誘導体で形成したＩＣＧ複合体、及びＩＣＧの７８０ｎｍにおける吸光度と光音響信号強度の関係を示したグラフである。
【図９】（ａ）はＰＢＳ中におけるゼラチンＩＣＧ複合体１の吸収スペクトルの経時変化であり、（ｂ）はアルブミンを含むＰＢＳ中におけるゼラチンＩＣＧ複合体１の吸収スペクトルの経時変化である。
【図１０】（ａ）はＰＢＳ中におけるＩＣＧの吸収スペクトルの経時変化であり、（ｂ）はアルブミンを含むＰＢＳ中におけるＩＣＧの吸収スペクトルの経時変化である。
【図１１】（ａ）はＰＢＳ中におけるゼラチンＩＣＧ複合体２の吸収スペクトルの経時変化であり、（ｂ）はアルブミンを含むＰＢＳ中におけるゼラチンＩＣＧ複合体２の吸収スペクトルの経時変化である。
【図１２】ＰＢＳ中アルブミン添加有無の条件下におけるゼラチンＩＣＧ複合体１、ゼラチンＩＣＧ複合体２、及びＩＣＧの吸光度（λｍａｘ）の経時変化を比較したグラフである。
【図１３】（ａ）はＰＢＳ中におけるゼラチンＩＣＧ複合体３の吸収スペクトルの経時変化であり、（ｂ）はアルブミンを含むＰＢＳ中におけるゼラチンＩＣＧ複合体３の吸収スペクトルの経時変化である。
【図１４】（ａ）はＰＢＳ中におけるゼラチンＩＣＧ複合体４の吸収スペクトルの経時変化であり、（ｂ）アルブミンを含むＰＢＳ中におけるゼラチンＩＣＧ複合体４の吸収スペクトルの経時変化である。
【図１５】ＰＢＳ中アルブミン添加有無の条件下におけるゼラチンＩＣＧ複合体３、ゼラチンＩＣＧ複合体４、及びＩＣＧの吸光度（λｍａｘ）の経時変化を比較したグラフである。
【図１６】ゼラチンＩＣＧ複合体１、ゼラチンＩＣＧ複合体３、非特許文献１、及びＩＣＧ（特許文献１）の水中における吸光度（λｍａｘ）の経時変化を比較したグラフである。
【図１７（ａ）】ゼラチンＩＣＧ複合体１と担がんマウスを用いた蛍光イメージングの経時変化である。
【図１７（ｂ）】がん組織の蛍光強度の経時変化を示したグラフである。
【図１８】ゼラチンＩＣＧ複合体７と担がんマウスを用いた蛍光イメージングの経時変化である。
【図１９】ＩＣＧ、及び、ゼラチンとＩＣＧの混合物（ゼラチンＩＣＧ混合体）の吸収スペクトルを示した図である。
【図２０】ゼラチンＩＣＧ複合体（ゼラチン：ＤＳＰＥ＝１：１）の平均粒径とゼラチンの分子量の関係を示したグラフである。
【図２１】ゼラチンＩＣＧ複合体（ゼラチン：ＤＳＰＥ＝１：１.５）の平均粒径とゼラチンの分子量の関係を示したグラフである。
【図２２】ゼラチンＩＣＧ複合体と担がんマウスを用いた同位体トレーサー実験における各臓器の放射活性の経時変化を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施形態について説明する。
【００１６】
（複合体）
本実施形態に係る複合体は、ゼラチンにリン脂質又はコレステロールが共有結合したゼラチン誘導体と、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）とを有する。ＩＣＧは、ゼラチン誘導体の周辺、特にリン脂質又はコレステロールの周辺に存在する。また、ＩＣＧは、ゼラチン誘導体に覆われた状態で存在する場合もある。本実施形態に係る複合体は、具体的には、リン脂質又はコレステロールと、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）とが、非共有結合によって結合して、一体となったものである。ここで、非共有結合とは、疎水性相互作用、水素結合、分子間力、イオン結合などを含む。本実施形態に係る複合体は、ゼラチンが粒子表面に存在し、リン脂質又はコレステロール及びＩＣＧが粒子内部に存在した、粒子状であると考えられる。しかし、本実施形態に係る複合体は粒子状に限られず、平面状であってもよいし、線状であってもよい。本実施形態に係る複合体は、リン脂質とゼラチンとが共有結合したゼラチン誘導体と、コレステロールとゼラチンとが共有結合したゼラチン誘導体のうち、少なくともいずれか一方を有していればよく、これらを両方有していてもよい。本実施形態に係る複合体を、以下、ゼラチンＩＣＧ複合体と呼ぶことがある。
【００１７】
ゼラチンＩＣＧ複合体について図１を用いてより詳細に説明する。本実施形態において、ＩＣＧゼラチン複合体１０５は、リン脂質又はコレステロール１０２をゼラチン１０１に共有結合させることでゼラチン誘導体１０３を調製し、ゼラチン誘導体１０３とＩＣＧ１０４を混合することで調製できる。なお、１０６はゼラチン複合体１０５の断面図である。
【００１８】
ここで、リン脂質又はコレステロール１０２は疎水性の高い部位（アルキル基など）を有する。一方、ＩＣＧ１０４についても、スルホン酸基を除く部位は疎水性である。そのため、ＩＣＧ１０４と、リン脂質又はコレステロール１０２とは、疎水性相互作用等の非共有結合によって結合するため、図１の１０６で示すように、ＩＣＧ１０４はゼラチン誘導体１０３のリン脂質又はコレステロール１０２周辺に集まりやすい。そのため、ＩＣＧ１０４はゼラチンＩＣＧ複合体から離脱しにくいと考えられる。
【００１９】
また、本実施形態に係るゼラチンＩＣＧ複合体は、水中において、図１の１０５、１０６で示すように粒子状になっていると考えられる。すなわち、ゼラチン１０１は親水性であり、リン脂質又はコレステロール１０２は疎水性の高い部位（アルキル基など）を有するため、図１の１０６のように、表面部にゼラチン１０１が、内部にリン脂質又はコレステロール１０２が存在する、粒子状となっていると考えられる。前述のように、ＩＣＧ１０４はリン脂質又はコレステロール１０２と非共有結合していると考えられるため、図１の１０６のようにＩＣＧ１０４も粒子内部に存在し、ゼラチン１０１に覆われた状態となっていると考えられる。そのため、ＩＣＧ１０４は粒子状のゼラチンＩＣＧ複合体の内部から漏出しにくいと考えられる。なお、ＩＣＧ１０４の一部は、粒子の表面部に存在していてもよい。
このように、本実施形態に係るゼラチンＩＣＧ複合体は、ＩＣＧが漏出しにくいため、光イメージング用造影剤として好適に使用することができる。
また、本実施形態に係るゼラチンＩＣＧ複合体は、生体透過性の優れた６００ｎｍ以以上９００ｎｍ以下の近赤外波長領域の光に対して吸収を持つことが好ましい。
【００２０】
本実施形態においてゼラチン誘導体は、ゼラチンと、リン脂質またはコレステロールとが共有結合してできたものであり、結合する際にとれる原子は含まれない。例えば、リン脂質がカルボキシル基を有し、ゼラチンがアミノ基を有している場合、両者はアミド結合することでゼラチン誘導体となるが、アミド結合の際にとれるカルボキシル基のＯＨと、アミノ基のＨは、本実施形態におけるゼラチン誘導体には含まれない。他の結合についても同様である。
【００２１】
（粒径）
また、本実施形態に係るゼラチンＩＣＧ複合体は、目的とする用途に応じて平均粒径を制御することが可能であり、その平均粒径は１０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であることが好ましい。これは、この範囲の平均粒径を有する粒子であればＥＰＲ（Enhanced Permeation and Retention）効果があると考えられるからである。腫瘍組織では、正常組織に比べ血管透過性が高いため、粒子などが血管から流出しやすい。さらに、この流出した粒子は腫瘍組織に到達して蓄積する。腫瘍組織の持つこのような特性をＥＰＲ効果という。
【００２２】
なお、平均粒径を求める方法としては、動的光散乱法を用いて求める方法や、透過型電顕微鏡（Transmission Electron Microscope、以下ＴＥＭと略すことがある）の画像を取得して、その画像から粒径を測定することにより求める方法などがある。動的光散乱法によって平均粒径を求める方法として例えば、動的光散乱解析装置（大塚電子（株）製、ＤＬＳ−８０００）を用いる方法が挙げられる。
【００２３】
複合体を形成するためには、ゼラチン誘導体とＩＣＧとの混合比（重量比）は、(ゼラチン誘導体)：（ＩＣＧ）＝２０：１〜２：１の範囲であることが好ましい。
【００２４】
本実施形態に係るゼラチンＩＣＧ複合体は、ゼラチンに共有結合したリン脂質又はコレステロールとＩＣＧとの相互作用により、複合体からのＩＣＧの漏出と、漏出によってＩＣＧが水と反応することによるＩＣＧの褪色とを、抑制することができる。本実施形態において、相互作用とは、ＩＣＧがリン脂質又はコレステロールと疎水性相互作用若しくはイオン結合等の非共有結合していることを意味し、特に疎水性相互作用によりＩＣＧがリン脂質又はコレステロールに集まっていることを意味する。
【００２５】
本実施形態に係るゼラチンＩＣＧ複合体は、上記のように、表面部にゼラチンが、内部にリン脂質又はコレステロールが存在する粒子状の構造を有すると考えられるため、粒子内部には水が存在しにくく、ＩＣＧが粒子内部で水と反応して分解することを防ぐことができる。なお、このとき、疎水性のリン脂質又はコレステロールはすべてがゼラチンの内部に存在している必要はなく、その一部が粒子の外側に存在してもよい。
【００２６】
また、低分子物質であるリン脂質のみをＩＣＧと相互作用させ、ＩＣＧの溶解性を変化させる試みはあるが、この場合、ＩＣＧとリン脂質との間の相互作用が弱いため、両者の解離が生じるおそれがある。これに対して、本実施形態においては、ＩＣＧとリン脂質の相互作用の点は同じであるが、それに加えて、ゼラチン分子が存在していることから、ＩＣＧとリン脂質の解離の問題を解決することができる。
【００２７】
（ゼラチン）
本実施形態におけるゼラチンは、食品分野、医療分野で広く知られている水溶性のタンパク質である。ゼラチンの組成は、牛骨、牛皮、豚皮など、由来する物質によって異なるため一意的には決まらないが、全アミノ酸のうち、おおよそ、グリシンが三分の一、イミノ酸（プロリン、オキシプロリン）が九分の二を占める。また、アミノ酸配列において、グリシンは３個に１個の繰り返しで存在している。ゼラチンの平均分子量は好適には１０００以上１０００００以下であり、更に好適には３０００以上である。なお、ゼラチンはコラーゲンの熱変性物質であり、コラーゲンの部分構造を有する。また、ゼラチンはコラーゲンの加水分解によってできる。
【００２８】
本実施形態においては、ゼラチンの種類、採取する動物若しくは採取組織部位、コラーゲンからの変性処理法(アルカリ処理、酸処理、酵素処理など)によらず、いかなるゼラチンでも利用することができる。また、ヒト遺伝子組み換え型などのゼラチンも利用可能である。このようなゼラチンの例としては、等電点約５のアルカリ処理ゼラチン、等電点約９の酸処理ゼラチン等が挙げられる。
【００２９】
また、本実施形態におけるコラーゲンとしては、例えば、グリシン約３５％、プロリン及び４−ヒドロキシプロリン約２１％、アラニン約１１％を有するタンパク質を用いることができる。
【００３０】
ゼラチンは、以前より食用や医療用に使用されており、体内に摂取しても人体に害を与えることがない。また、ゼラチンは生体に吸収されやすく、生体内においてＩＣＧを安定的に保持するという役割を果たした後に、生体内で分散消失される性質をもつため、使用後に生体内から除去する必要がないという利点を有する。
【００３１】
（リン脂質）
本実施形態においてリン脂質とは、構造中にリン酸エステル部位をもつ脂質である。また、親水性の高い部位であるリン酸部位と疎水性の高い部位であるアルキル基などの部位をもつため、両親媒性である。本実施形態におけるリン脂質として、ゼラチンと容易に共有結合させることのできる、アミノ基、カルボキシル基、又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド基（以下、ＮＨＳ基と略すことがある）等を有するリン脂質であることが好ましい。特に、ＮＨＳ基を有するリン脂質は、アミノ基と結合しやすく、アミノ基を有するゼラチンに結合しやすいため好ましい。
【００３２】
また、本実施形態におけるリン脂質は、ホスファチジル系リン脂質であることが好ましい。
【００３３】
本実施形態におけるリン脂質として例えば、
1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine、1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine、1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine、1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine、1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine、1,2-Dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine、1,2-Dierucoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine、1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine、1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine、1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine、1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine、Dimyristoyl N-(Succinimidyloxy-glutaryl)-L-α-phosphatidylethanolamine、Dipalmitoyl N-(Succinimidyloxy-glutaryl)-L-α-phosphatidylethanolamine、Distearoyl N-(Succinimidyloxy-glutaryl)-L-α-phosphatidylethanolamine、1-Palmitoyl-2-oleoyl N-(Succinimidyloxy-glutaryl)-L-α-phosphatidylethanolamine、Dioleoyl N-(Succinimidyloxy-glutaryl)-L-α-phosphatidylethanolamine等を挙げることができる。これらのリン脂質は単独で使用してもよいし、又は複数を組み合わせて用いてもよい。
【００３４】
なお、上記のＮＨＳ基とは下記の化学式１で示される官能基を意味する。
【化１】
【００３５】
本実施形態におけるリン脂質としては、下記の化学式２で表される、ＮＨＳ基を有するＤＳＰＥ（Distearoyl N-(Succinimidyloxy-glutaryl)-L-α-phosphatidylethanolamine、以下ＤＳＰＥ−ＮＨＳと略すことがある）が好ましい。
【化２】
（ただし、化学式２においてＲ１及びＲ２はＣＨ３(ＣＨ２)１６−である）
【００３６】
（ＩＣＧ）
ＩＣＧ（インドシアニングリーン）は下記の化学式３で示される構造、及び、下記の構造において対イオンがＮａ＋の代わりにＨ＋あるいはＫ＋であるものを指す。
【化３】
【００３７】
（ゼラチンＩＣＧ誘導体の製造方法）
本実施形態におけるゼラチンＩＣＧ複合体の製造方法について説明する。
ゼラチンＩＣＧ複合体を製造する工程を図１に示す。具体的には、以下の（１）と（２）の工程を経てゼラチンＩＣＧ複合体１０５を得ることができる。
（１）ゼラチン１０１にリン脂質又はコレステロール１０２が共有結合したゼラチン誘導体１０３を得る工程。
（２）前記ゼラチン誘導体１０３とＩＣＧ１０４とを混合することによりゼラチンＩＣＧ複合体１０５を得る工程。
【００３８】
本実施形態において、ゼラチン１０１と、リン脂質又はコレステロール１０２を共有結合させてゼラチン誘導体１０３を得る工程と、前記ゼラチン誘導体１０３とＩＣＧ１０４とを混合することにより複合体１０５を得る工程を有することが好ましい。なぜなら、リン脂質又はコレステロール１０２とＩＣＧ１０４を混合した後に、リン脂質又はコレステロール１０２とゼラチン１０１とを共有結合させようとすると、ＩＣＧ１０４が、リン脂質又はコレステロール１０２とゼラチン１０１との結合を妨げるおそれがあるからである。
【００３９】
また、上記の（１）の工程は、リン脂質とゼラチンとが共有結合したゼラチン誘導体、コレステロールとゼラチンとが共有結合したゼラチン誘導体のうち、少なくともいずれか一方を用意する工程であればよく、両方を用意する工程であってもよい。リン脂質とゼラチンとが共有結合したゼラチン誘導体を用意する工程は、リン脂質とゼラチンとを共有結合させてゼラチン誘導体を得る工程でもよく、リン脂質とゼラチンとが共有結合した市販のゼラチン誘導体を用意する工程でもよい。コレステロールとゼラチンとが共有結合したゼラチン誘導体を用意する工程についても同様に、コレステロールとゼラチンとを共有結合させてゼラチン誘導体を得る工程でもよく、コレステロールとゼラチンとが共有結合した市販のゼラチン誘導体を用意する工程でもよい。
【００４０】
（ゼラチン誘導体）
ゼラチン誘導体の調製方法は特に限定されず、ゼラチンとリン脂質又はコレステロールとの間で共有結合が生じればよい。例えば、ゼラチンの脱水ジメチルスルホキシド溶液に、ＮＨＳ基を有するリン脂質又はヒドロキシル基を活性化したコレステロールを加えて室温下で１８時間反応させた後、反応溶液を水に対して透析し、水可溶化成分を凍結乾燥することにより、リン脂質又はコレステロールが共有結合したゼラチン誘導体を得ることができる。ここで、リン脂質のうち、ＮＨＳ基を有するリン脂質は、アミノ基と結合しやすく、アミノ基を有するゼラチンに結合しやすい。したがって、ＮＨＳ基を有するリン脂質を用いることで本実施形態に係る複合体の製造が容易となるため好ましい。特には、上記の化学式２で表される、ＤＳＰＥ−ＮＨＳを用いることが好ましい。
【００４１】
このようにして得たゼラチン誘導体とＩＣＧとを混合することにより、リン脂質又はコレステロールが有する高い疎水性を示す炭素鎖部位とＩＣＧとの間で相互作用が生じ、本実施形態に係るゼラチンＩＣＧ複合体を得ることができる。
【００４２】
＜光イメージング用造影剤＞
本実施形態に係る光イメージング用造影剤は、本実施形態に係る複合体と、前記複合体が分散された分散媒とを有する。本実施形態において光イメージングとは、光を照射することで、イメージング（画像化）することを意味する。すなわち、本実施形態に係る光イメージング用造影剤はＩＣＧを有するため、ＩＣＧに光が照射されることで、音響波や蛍光などを発する。発せられた音響波を検出することで光音響イメージングをすることができ、発せられた蛍光を検出することで蛍光イメージングをすることができる。なお、光音響イメージングは、光音響トモグラフィー（断層撮影法）を含む概念である。 上記の分散媒は、本実施形態に係る複合体を分散させるための液状の物質であり、例えば生理食塩水、注射用蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、以下ＰＢＳと略すことがある）などが挙げられる。また本実施形態に係る光イメージング用造影剤は、必要に応じて本実施形態に係る複合体の他に薬理上許容できる添加物を有していても良い。
【００４３】
本実施形態に係る光イメージング用造影剤は、上記本実施形態に係る粒子をこの分散媒に予め分散させておいてもよいし、本実施形態に係る粒子と分散媒とをキットにしておき、生体内に投与する前に粒子を分散媒に分散させて使用してもよい。
【００４４】
このように、本実施形態に係る光イメージング用造影剤は、光音響イメージング用造影剤や、蛍光イメージング用造影剤として利用することができる。
【００４５】
本実施形態に係るゼラチンＩＣＧ複合体は、ＥＰＲ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）効果を利用することで、生体内に投与したときに、生体内の正常部位に比べて腫瘍部位により多く集積させることができる。その結果、複合体を生体内に投与した後、生体に光を照射して、生体からの音響波や蛍光を検出するときに、腫瘍部位から発せられる音響波や蛍光を正常部位から発せられる音響波や蛍光よりも大きくすることができる。従って、本実施形態に係る複合体は腫瘍部位を特異的に検出する光イメージング用造影剤として用いることができる。
【００４６】
ここで、ゼラチンは化学修飾可能な化学官能基をもっているため、例えば、ゼラチンＩＣＧ複合体のゼラチン分子表面に腫瘍細胞認識リガンドを化学結合させることにより、複合体の腫瘍へのターゲティングが可能となる。リガンドとしては、細胞表面の構造を認識できる抗体、アプタマー、レクチン、トランスフェリン、及びレセプターに対するアゴニストあるいはアンタゴニストあるいは葉酸などの腫瘍細胞に特異的に取り込まれるような物質などが挙げられる。これらの物質は単独で使用してもよいし、あるいは複数を組み合わせて用いてもよい。
【００４７】
生体内に投与して利用することを考えると、本実施形態に係るゼラチンＩＣＧ複合体の吸収スペクトルのピークは近赤外波長領域にあることが好ましい。これは、近赤外波長領域の光が生体に照射したときに安全で、かつ、生体に対して比較的高い透過性をもつからである。本実施形態に係るゼラチンＩＣＧ複合体は特に、６００ｎｍから９００ｎｍの波長領域において高い吸光度を有する。
【００４８】
（造影方法）
生体内に投与された本実施形態に係る複合体を、ＰＡＴ装置を用いて検出する方法について説明する。本実施形態に係る複合体を検出する方法は以下の工程を有する。
（ａ）本実施形態に係る複合体を生体内に投与する工程。
（ｂ）生体に光を照射し、生体内に存在する本実施形態に係る複合体から発せられる光音響信号を検出する工程。
【００４９】
なお、上記（ａ）の工程において、本実施形態に係る複合体を生体内に投与する方法は特に限定されない。また、上記（ｂ）の工程において、生体に照射する光を発生させる装置、複合体から発せられる光音響信号を検出する装置は特に限定されない。例えば、生体に照射する光を発生させる装置として、レーザーパルス光を照射する装置を用いることができる。レーザーパルス光を照射する装置として例えば、チタンサファイアレーザー（ＬＴ−２２１１−ＰＣ、Ｌｏｔｉｓ社製））、ＯＰＯレーザー（ＬＴ−２２１４ ＯＰＯ、Ｌｏｔｉｓ社製）、アレキサンドライトレーザーなどが挙げられる。
【００５０】
次に、生体内に投与された本実施形態に係る複合体を、蛍光装置を用いて検出する方法について説明する。本実施形態に係る複合体を検出する方法は以下の工程を有する。
（ｃ）本実施形態に係る複合体を生体内に投与する工程。
（ｄ）生体に光を照射し、生体内に存在する本実施形態に係る複合体から発せられる蛍光を検出する工程。
【００５１】
なお、上記（ａ）の工程において、本実施形態に係る複合体を生体内に投与する方法は特に限定されない。また、上記（ｄ）の工程において、生体に照射する光を発生させる装置、複合体から発せられる蛍光を検出する装置は特に限定されない。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例を用いて更に詳細に本発明を説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではなく、材料、組成条件及び反応条件等は、同様の機能、効果を有する複合体が得られる範囲で変更することができる。
【００５３】
＜実施例１＞
（ゼラチンＩＣＧ複合体１）
牛骨由来、等電点５.０のゼラチン（１０００ｍｇ、分子量１００００、新田ゼラチン株式会社製）の脱水ジメチルスルホキシド（３０ｍｌ、ナカライテスク株式会社製）溶液に、上記の化学式２で示されるＤＳＰＥ−ＮＨＳ（日油株式会社製）１３３ｍｇを加え、モル比１：１.５で室温下１８時間反応させた。得られた反応溶液を水に対して透析し、水可溶化成分を凍結乾燥することにより、ゼラチンにＤＳＰＥが共有結合したゼラチン誘導体１を得た。ゼラチンへのＤＳＰＥの導入量は、フルオレスカミン法にて測定し、ゼラチンに対してＤＳＰＥが６７％導入されていることが確認された。
【００５４】
次に、ＩＣＧ（シグマ製）を溶解した水溶液（最終濃度：０.５ｍｇ／ｍｌ）とＤＳＰＥが共有結合したゼラチン誘導体１（最終濃度：４０ｍｇ／ｍｌ）とを混合して、ゼラチンＩＣＧ複合体１を得た。得られたゼラチンＩＣＧ複合体１の粒径を動的光散乱解析装置（大塚電子株式会社製）で分析したところ、ゼラチンＩＣＧ複合体１の平均粒径は５４０ｎｍであった。
【００５５】
分光光度計（ベックマンコールター社製）を用いて、得られたゼラチンＩＣＧ複合体１の吸収スペクトルを測定した。
【００５６】
ゼラチンＩＣＧ複合体１の吸収スペクトルと７８０ｎｍにおける吸光度をそれぞれ図２と図３に示した。比較例としてＩＣＧの吸収スペクトルと７８０ｎｍにおける吸光度をそれぞれ図２と図３に示した。
【００５７】
ＩＣＧの吸収スペクトルは２峰性であり、低波長側（７００ｎｍ）がＩＣＧの会合体による吸収、長波長側（７８０ｎｍ）が単量体による吸収を示すことが知られている。
【００５８】
図２から、最終濃度０.５ｍｇ／ｍｌのＩＣＧでは、会合体が多く形成されている為、長波長側の吸光度が低くなったと考えられる。一方、ゼラチンＩＣＧ複合体１では、長波長側の吸光度がＩＣＧ単独よりも高く、複合体中でＩＣＧの会合が抑制され、ＩＣＧとリン脂質とが相互作用していることが示唆された。
【００５９】
図３から、ゼラチンＩＣＧ複合体１は同じ濃度（０.５ｍｇ／ｍｌ）のＩＣＧと比べて、約３.３倍の吸光度を有することが確認された。
【００６０】
また、平均粒径と吸光度からモル吸光係数（７８０ｎｍ）を算出したところ、ゼラチンＩＣＧ複合体１のモル吸光係数は１.１×１０１１ Ｍ-1ｃｍ-1であり、従来から知られている金ナノロッドのモル吸光係数（８.６×１０９Ｍ-1ｃｍ-1）より極めて大きいことが確認された。
【００６１】
＜実施例２＞
（ゼラチンＩＣＧ複合体２）
ＤＳＰＥとゼラチンのモル比を１：１で反応させた以外は実施例１と同様の操作によって、ＤＳＰＥが共有結合したゼラチン誘導体２を得た。フルオレスカミン法による測定により、ゼラチンに対してＤＳＰＥが３０％導入されていることが確認された。
【００６２】
ＩＣＧを溶解した水溶液（最終濃度：０.５ｍｇ／ｍｌ）とＤＳＰＥが共有結合したゼラチン誘導体２（最終濃度：４０ｍｇ／ｍｌ）を混合して、ゼラチンＩＣＧ複合体２を得た。実施例１と同様に平均粒径及びモル吸光係数を求めたところ、ゼラチンＩＣＧ複合体２の平均粒径は５００ｎｍであった。また、ゼラチンＩＣＧ複合体２の７８０ｎｍにおけるモル吸光係数は５.２×１０１０ Ｍ-1ｃｍ-1であり、大きなモル吸光係数であることが確認された。
【００６３】
＜実施例３＞
（ゼラチンＩＣＧ複合体３）
コレステロール（３８．６ｍｇ、和光純薬工業製、特級）のピリジン(和光純薬工業製)溶液へ、縮合剤のN,N'-Disuccinimidyl Carbonate（７７ｍｇ、ナカライテスク製）、続いて反応触媒の4-Dimethylaminopyridine(ナカライテスク製)を加え、コレステロールのヒドロシル基を活性化した。
【００６４】
上記活性化コレステロールのピリジン溶液へゼラチン（１０００ｍｇ）の脱水ジメチルスルホキシド（３０ｍｌ）溶液を加え、モル比１：１で室温下１８時間反応させた。得られた反応溶液を水に対して透析し、水可溶化成分を凍結乾燥することにより、ゼラチンにコレステロールが共有結合したゼラチン誘導体３を得た。フルオレスカミン法による測定により、ゼラチンに対してコレステロールが４１％導入されていることが確認された。
【００６５】
次に、ＩＣＧを溶解した水溶液（最終濃度：０.５ｍｇ／ｍｌ）とコレステロールが共有結合したゼラチン誘導体３と（最終濃度：４０ｍｇ／ｍｌ）を混合して、ゼラチンＩＣＧ複合体３を得た。実施例１と同様に平均粒径を求めたところ、ゼラチンＩＣＧ複合体３の平均粒径は２００ｎｍであった。
【００６６】
実施例１と同様に求めたゼラチンＩＣＧ複合体３の吸収スペクトルと７８０ｎｍにおける吸光度をそれぞれ図２と図３に示す。
【００６７】
図２から、ゼラチンＩＣＧ複合体３はＩＣＧと比べて７００ｎｍ付近の会合体の吸収が減少し、７８０ｎｍ付近の単量体の吸収が増加していることが確認された。ただし、ＤＳＰＥが共有結合したゼラチン誘導体からなるゼラチンＩＣＧ複合体１よりも７００ｎｍ付近での吸光度が高く、７８０ｎｍ付近での吸光度が低かったため、複合体中での会合が抑制される度合いはゼラチン誘導体の種類に依存すると考えられた。
【００６８】
図３から、ゼラチンＩＣＧ複合体３は同じ濃度（０.５ｍｇ／ｍｌ）のＩＣＧと比べて、約１.５倍の吸光度を有することが確認された。
【００６９】
また、平均粒径と吸光度からモル吸光係数（７８０ｎｍ）を算出したところ、ゼラチンＩＣＧ複合体３のモル吸光係数は２.４×１０９ Ｍ-1ｃｍ-1であり、大きなモル吸光係数であることが確認された。
【００７０】
＜実施例４＞
（ゼラチンＩＣＧ複合体４）
ゼラチンとコレステロールのモル比を１：１.５で反応させた以外は実施例３と同様の操作によって、コレステロールが共有結合したゼラチン誘導体４を得た。フルオレスカミン法による測定により、ゼラチンに対してコレステロールが７１％導入されていることが確認された。
【００７１】
ＩＣＧを溶解した水溶液（最終濃度：０.５ｍｇ／ｍｌ）とコレステロールが共有結合したゼラチン誘導体４（最終濃度：４０ｍｇ／ｍｌ）を混合して、ゼラチンＩＣＧ複合体４を得た。実施例１と同様に平均粒径及びモル吸光係数を求めたところ、ゼラチンＩＣＧ複合体４の平均粒径は１５０ｎｍであった。また、ゼラチンＩＣＧ複合体４の７８０ｎｍにおけるモル吸光係数は１.７×１０９Ｍ-1ｃｍ-1であり、大きなモル吸光係数であることが確認された。
【００７２】
＜実施例５＞
（吸光度比較）
実施例１と同様の操作によって、ゼラチン（分子量５０００）にＤＳＰＥを７５％導入したゼラチン誘導体５を合成した。
【００７３】
実施例３と同様の操作によって、ゼラチン（分子量１００００）にコレステロールを８３％導入したゼラチン誘導体６を合成した。
【００７４】
ゼラチンＩＣＧ複合体１、３、４、５、６（最終濃度：４０、１００ｍｇ／ｍｌ）のそれぞれとＩＣＧ水溶液（最終濃度：０.５ｍｇ／ｍｌ）とを混合して、ゼラチンＩＣＧ複合体を得た。これらの複合体とＩＣＧの７８０ｎｍにおける吸光度を比較した結果を図４に示す。
【００７５】
図４から、ＩＣＧの同濃度の条件下においてゼラチンＩＣＧ複合体はいずれもＩＣＧに比べて吸光度が大きく、更に、コレステロールよりもＤＳＰＥが共有結合したゼラチンからなる複合体の方が吸光度の増加が大きいことが確認された。
【００７６】
＜実施例６＞
（ゼラチン誘導体の効果）
前記ゼラチンＩＣＧ複合体１、２と同じ組成量の混合物を混合物１、２とし、それぞれの吸収スペクトルを比較したグラフを図５に示した。
【００７７】
なお、複合体と混合物は、ＩＣＧとゼラチンの最終濃度がそれぞれ０.５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌとなるように調製した。
【００７８】
図５の混合物１、２とゼラチンＩＣＧ複合体１、２を比較すると、混合物１、２では７８０ｎｍ付近の長波長側の吸収が非常に低いことからゼラチンＩＣＧ複合体は殆ど形成されず、また、７００ｎｍ付近の短波長側の吸収が高いことからＩＣＧの会合体が数多く形成されていることが示唆された。
【００７９】
一方、同様にして前記ゼラチンＩＣＧ複合体３、４と同じ組成量の混合物の吸収スペクトルを求めようとしたが、コレステロールは水に対して不溶であり、ゼラチンＩＣＧ複合体３、４と同じ組成量の混合物を得ることはできなかった。
【００８０】
以上の検討結果から、ＤＳＰＥ又はコレステロールが共有結合したゼラチン誘導体でＩＣＧを複合化することが、モル吸光係数の大きな複合体を得る上で極めて有効であることを確認した。
【００８１】
＜実施例７＞
（光音響信号評価１）
光音響信号測定装置（試作品、照射波長：７８０ｎｍ、照射エネルギー：５０ｍＪ）を用いて、ゼラチンＩＣＧ複合体１、ゼラチンＩＣＧ複合体３、及びＩＣＧ（比較例）を用いて光音響信号を評価し、その結果を図６に示した。なお、図６は各サンプルの７８０ｎｍにおける光音響信号強度を比較したものである。
【００８２】
図６から、ゼラチンＩＣＧ複合体１は同濃度（０.５ｍｇ／ｍｌ）のＩＣＧと比べて、光音響信号強度が６桁程大きいことが確認された。
【００８３】
一方、ゼラチンＩＣＧ複合体３は同濃度（０.５ｍｇ／ｍｌ）のＩＣＧと比べて、光音響信号強度が５桁程大きいことが確認された。
【００８４】
以上から、ＩＣＧはゼラチン誘導体で複合体化することによって光音響信号が増強されることが確認された。
【００８５】
＜実施例８＞
（光音響信号評価２）
ゼラチンＩＣＧ複合体１（最終濃度：１０、４０、１００ｍｇ／ｍｌ）、ゼラチン誘導体３、６（最終濃度：４０、１００ｍｇ／ｍｌ）とＩＣＧ水溶液（最終濃度：０.１、０.５、１、５ｍｇ／ｍｌ）とをそれぞれ混合して得られたゼラチンＩＣＧ複合体、及びＩＣＧ（比較例）を用いて光音響信号を評価し、その結果を図７に示した。なお、図７は各サンプルの７８０ｎｍにおける光音響信号強度を比較したものである。
【００８６】
図７から、ゼラチンＩＣＧ複合体はいずれもＩＣＧ単独に比べて光音響信号が高く、ＩＣＧはゼラチン誘導体で複合体化することによって光音響信号が増強されることが確認された。
【００８７】
＜実施例９＞
（光音響信号評価３）
ゼラチンＩＣＧ複合体１、６（最終濃度：４０、１００ｍｇ／ｍｌ）とＩＣＧ水溶液（最終濃度：０.５ｍｇ／ｍｌ）とをそれぞれ混合して得られたゼラチンＩＣＧ複合体、及びＩＣＧ（比較例）を用いて光音響信号を評価し、７８０ｎｍにおける吸光度と光音響信号強度の関係を図８に示した。
【００８８】
図８から、吸光度と光音響信号強度には正の相関があることが確認された。
【００８９】
＜実施例１０＞
（ゼラチンＩＣＧ複合体１の安定性評価）
ゼラチンＩＣＧ複合体１の安定性を評価する為に、ゼラチンＩＣＧ複合体１をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）又はアルブミン（４０ｍｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳ中に３７℃で静置して、経時的に吸収スペクトルを測定した。
【００９０】
ゼラチンＩＣＧ複合体１のＰＢＳ中、及びアルブミンを含むＰＢＳ中での吸収スペクトルの経時変化をそれぞれ図９（ａ）と（ｂ）に示した。
【００９１】
また、比較例として、ＩＣＧのＰＢＳ中、及びアルブミンを含むＰＢＳ中での吸収スペクトルの経時変化を図１０（ａ）と（ｂ）に示した。
【００９２】
また、上記条件下のゼラチンＩＣＧ複合体１とＩＣＧの吸光度（λｍａｘ）の経時変化を比較したグラフを図１２に示した。
【００９３】
図９（ａ）と（ｂ）、及び図１２から、ゼラチンＩＣＧ複合体１はアルブミンの添加の有無に関わらず、吸光度の減少が抑制さていることが確認され、少なくとも1週間、吸収スペクトルが変化しなかった。これはゼラチン誘導体中のリン脂質とＩＣＧとが相互作用して、複合体からのＩＣＧの漏出と褪色が抑制された為と考えられ、複合体が安定であることを確認した。
【００９４】
一方、図１０（ａ）と図１２から、アルブミン無添加のＩＣＧでは吸収スペクトルの経時変化は非常に大きく、ＩＣＧが褪色していることが確認された。
【００９５】
また、図１０（ｂ）と図１２から、アルブミン添加のＩＣＧの吸収スペクトルはアルブミン無添加のＩＣＧより経時変化が抑制されてはいるが、アルブミン添加のゼラチンＩＣＧ複合体１と比較すると安定性に若干劣ることが確認された。
【００９６】
＜実施例１１＞
（ゼラチンＩＣＧ複合体２の安定性評価）
実施例１０と同様にして、ゼラチンＩＣＧ複合体２のＰＢＳ中、及びアルブミンを含むＰＢＳ中での吸収スペクトルの経時変化を測定し、その結果を図１１（ａ）と（ｂ）に示した。
【００９７】
また、上記条件下のゼラチンＩＣＧ複合体２とＩＣＧの吸光度（λｍａｘ）の経時変化を比較したグラフを図１２に示した。
【００９８】
図１１（ａ）と（ｂ）、及び図１２から、ゼラチンＩＣＧ複合体２はアルブミンの添加の有無に関わらず、吸光度の減少が抑制さていることが確認され、少なくとも1週間、吸収スペクトルが変化しなかった。これはゼラチン誘導体中のリン脂質とＩＣＧとが相互作用して、複合体からのＩＣＧの漏出と褪色が抑制された為と考えられ、複合体が安定であることを確認した。
【００９９】
＜実施例１２＞
（ゼラチンＩＣＧ複合体３の安定性評価）
実施例１０と同様にして、ゼラチンＩＣＧ複合体３のＰＢＳ中、及びアルブミンを含むＰＢＳ中での吸収スペクトルの経時変化を測定し、その結果を図１３（ａ）と（ｂ）に示した。
【０１００】
また、上記条件下のゼラチンＩＣＧ複合体３とＩＣＧの吸光度（λｍａｘ）の経時変化を比較したグラフを図１５に示した。
【０１０１】
図１３（ａ）と図１５から、アルブミン無添加のゼラチンＩＣＧ複合体３はアルブミン無添加のＩＣＧと比べて、吸光度の減少が抑制されていることが確認された。
【０１０２】
また、図１３（ｂ）と図１５から、アルブミン添加のゼラチンＩＣＧ複合体３は、吸光度の減少が更に抑制されることが確認された。
【０１０３】
＜実施例１３＞
（ゼラチンＩＣＧ複合体４の安定性評価）
実施例１０と同様にして、ゼラチンＩＣＧ複合体４のＰＢＳ中、及びアルブミンを含むＰＢＳ中での吸収スペクトルの経時変化を測定し、その結果を図１４（ａ）と（ｂ）に示した。
【０１０４】
また、上記条件下のゼラチンＩＣＧ複合体４とＩＣＧの吸光度（λｍａｘ）の経時変化を比較したグラフを図１５に示した。
【０１０５】
図１４（ａ）と（ｂ）、及び図１５から、アルブミンの添加の有無に関わらず、吸光度の減少が抑制さていることが確認された。
【０１０６】
＜実施例１４＞
（ゼラチンＩＣＧ複合体と先行技術の安定性比較）
ゼラチンＩＣＧ複合体１、ゼラチンＩＣＧ複合体３、非特許文献１、及びＩＣＧ（特許文献１）の水中における吸光度（λｍａｘ）の経時変化を比較したグラフを図１６に示した。
【０１０７】
図１６から、前記ゼラチンＩＣＧ複合体１、及びゼラチンＩＣＧ複合体３は、非特許文献１、及びＩＣＧ（特許文献１）と比べて、ＩＣＧの漏出による褪色が抑制されていることが確認された。
【０１０８】
非特許文献１のＩＣＧ含有ＰＬＧＡ粒子では、ＩＣＧの漏出による褪色が非常に速かった。また、ＩＣＧ水溶液（特許文献１）では、ＩＣＧは水中で分解し、褪色が極めて速かった。
【０１０９】
これは、非特許文献１のＩＣＧ含有ＰＬＧＡ粒子では、ＰＬＧＡとリン脂質（ゼラチンＩＣＧ複合体１）あるいはコレステロール（ゼラチンＩＣＧ複合体３）とでは、後者のほうが疎水性部位の疎水性が高いため、ＩＣＧと相互作用しやすいからと考えられる。また、特許文献１のリポソームでは、リポソーム内部の水中でＩＣＧが分解してしまい、また、リン脂質の二重膜中に存在するＩＣＧは粒子の外部に近い位置に存在するため、漏出しやすいためと考えられる。
【０１１０】
＜実施例１５＞
（ゼラチンＩＣＧ複合体の体内動態評価１）
左後肢にがん部位を有する担がんマウスの尾静脈よりゼラチンＩＣＧ複合体１を投与した後、蛍光イメージング装置（ＧＥヘルスケア社製）を用いて経時的に撮像し、ゼラチンＩＣＧ複合体１の体内動態を評価した。
【０１１１】
また、比較例として、同濃度（０.５ｍｇ／ｍｌ）のＩＣＧ単独を担がんマウスに静脈内投与して同様に評価した。蛍光イメージングの経時変化を図１７（ａ）に、がん組織の蛍光強度の経時変化を図１７（ｂ）に示した。
【０１１２】
図１７（ａ）と（ｂ）から、ＩＣＧ単独を投与した場合、一時的にがん組織へ分布するが、時間と共に消失する動態を示した。一方、ゼラチンＩＣＧ複合体１を投与した場合、ＩＣＧ単独の場合と同様にがん組織への一時的な分布が一度消失するものの、時間と共にがん組織へ再度高濃度で集積することが確認された。これは、ゼラチン誘導体による複合体化によりＩＣＧの血中安定性が向上され、いわゆるＥＰＲ効果によりがん組織へ集積したものと考えられる。
【０１１３】
＜実施例１６＞
（ゼラチンＩＣＧ複合体の体内動態評価２）
Ｃｙ５.５で蛍光標識したゼラチン誘導体７（ＤＳＰＥ６７％導入）とＩＣＧからなるゼラチンＩＣＧ複合体７を調製し、実施例１５と同様にして担がんマウスに投与してゼラチン誘導体７自身の体内動態を評価した。その蛍光イメージングの経時変化を図１８に示した。
【０１１４】
図１８から、Ｃｙ５.５で蛍光標識したゼラチン誘導体７もまたゼラチンＩＣＧ複合体１と同様の体内動態を示していることから、ゼラチンＩＣＧ複合体は解離することなくがん組織へ集積していることが確認された。
【０１１５】
＜参考例＞
（ゼラチンＩＣＧ）
ＩＣＧ水溶液（最終濃度：０.１ｍｇ／ｍｌ）とゼラチン（重量平均分子量：１００００、最終濃度：１００ｍｇ／ｍｌ）とを混合して、ゼラチンとＩＣＧの混合物（ゼラチンＩＣＧ混合体）を得た。分光光度計を用いて、得られたゼラチンＩＣＧ混合体の吸収スペクトルを測定した。その結果を図１９に示す。ゼラチンＩＣＧ混合体はＩＣＧ単独とほぼ同じ吸収スペクトルが得られた。このことから、ゼラチンに、リン脂質又はコレステロールが共有結合していない場合、ゼラチンとＩＣＧとは複合体を形成していないものと考えられる。
【０１１６】
＜実施例１７＞
（ゼラチンＩＣＧ複合体８乃至１３）
３種類のゼラチン（分子量５０００、１００００、２００００、いずれも新田ゼラチン株式会社製）にＤＳＰＥを仕込みモル比（ゼラチン：ＤＳＰＥ）１：１または１：１.５で導入したゼラチン誘導体をミリＱ水で８０ｍｇ／ｍｌに調製し、０.２２μｍのフィルターで処理した後、ＩＣＧ水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）と同体積で混合して、ゼラチンＩＣＧ複合体８乃至１３を調製した。このとき用いたＤＳＰＥは実施例１と同様、上記の化学式２で示されるＤＳＰＥ−ＮＨＳ（日油株式会社製）である。各複合体の平均粒径、モル吸光係数、および光音響信号強度を表１に示した。
【０１１７】
【表１】
【０１１８】
ゼラチンの分子量やＤＳＰＥの仕込みモル比を変えることによって、平均粒径が１６４から８５５ｎｍまでの種々のゼラチンＩＣＧ複合体を得ることができた。
また、ゼラチンＩＣＧ複合体１１では、平均粒径が２９３ｎｍで、１.６×１０１０ Ｍ-1ｃｍ-1の大きなモル吸光係数と２.９×１０１１ ＶＪ-1Ｍ-1の大きな光音響信号が確認された。
【０１１９】
＜実施例１８＞
（ゼラチンＩＣＧ複合体１４乃至１７）
ゼラチン（分子量１００００）にＤＳＰＥを４条件の仕込みモル比（１：０.５、１：１、１：１.５、１：３）で導入したゼラチン誘導体を実施例１７と同様にして、ゼラチンＩＣＧ複合体１４乃至１７を調製した。それらの平均粒径を表２に示した。
【０１２０】
【表２】
【０１２１】
ＤＳＰＥの仕込みモル比を変えることによって、平均粒径が１４７から２００ｎｍまでの種々のゼラチンＩＣＧ複合体を得ることができた。
【０１２２】
＜実施例１９＞
（ゼラチンＩＣＧ複合体の平均粒径とゼラチンの分子量の関係１）
４種類のゼラチン（分子量４０００、５０００、１００００、２００００）にＤＳＰＥを仕込みモル比１：１で導入したゼラチン誘導体を実施例１７と同様にして、ゼラチンＩＣＧ複合体を調製した。それらの平均粒径とゼラチンの分子量の関係を図２０に示した。図２０から、ゼラチンＩＣＧ複合体の平均粒径は、ゼラチンの分子量が５０００から１００００の間で最小値になることが示唆された。
【０１２３】
＜実施例２０＞
（ゼラチンＩＣＧ複合体の平均粒径とゼラチンの分子量の関係２）
３種類のゼラチン（分子量５０００、１００００、２００００）にＤＳＰＥを仕込みモル比１：１.５で導入したゼラチン誘導体を実施例１７と同様にして、ゼラチンＩＣＧ複合体を調製した。それらの平均粒径とゼラチンの分子量の関係を図２１に示した。
図２１から、ゼラチンＩＣＧ複合体の平均粒径は、ゼラチンの分子量が１００００あたりで、最小値になることが示唆された。
【０１２４】
＜実施例２１＞
（ゼラチンＩＣＧ複合体の体内動態評価３）
マウスの大腿部にｃｏｌｏｎ２６細胞（マウス 大腸がん）を植え付けた後、２０日間飼育することにより担がんマウスを作製した。
ＩＣＧはクロラミンＴ法により、125Ｉでラベル化した。125Ｉ−ＩＣＧ（０．５ｍｇ／ｍｌ）単独、もしくはＤＳＰＥを導入したゼラチン（ゼラチンの分子量１００００、仕込みモル比１：１、４０ｍｇ／ｍｌ）と125Ｉ−ＩＣＧからなるゼラチンＩＣＧ複合体１８を上記の担がんマウスに尾静脈投与し（１００μｌ）、一定時間ごとに眼窩採血を行った。また、投与１時間後と３時間後に各臓器を摘出し、放射活性を測定した。その結果を図２２に示した。
【０１２５】
図２２から、投与３時間後よりも１時間後の方が、がん組織への集積が高かった。また、投与１時間後のがん組織への集積に関して、ゼラチンＩＣＧ複合体１８の方がＩＣＧ単独よりも高いことが確認された。これは、ゼラチン誘導体による複合体化によりＩＣＧの血中安定性が向上され、ＥＰＲ効果によりがん組織へ集積したものと考えられる。
【符号の説明】
【０１２６】
１０１ ゼラチン
１０２ リン脂質又はコレステロール
１０３ ゼラチン誘導体
１０４ インドシアニングリーン（ＩＣＧ）
１０５ ゼラチン複合体
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン脂質とゼラチンとが共有結合したゼラチン誘導体及びコレステロールとゼラチンとが共有結合したゼラチン誘導体のうち少なくとも一方と、インドシアニングリーンとを有することを特徴とする複合体。
【請求項２】
前記リン脂質がＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を有するリン脂質であることを特徴とする請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記リン脂質が下記の化学式２で表されるリン脂質であることを特徴とする請求項１に記載の複合体。
【化１】
（ただし、化学式２においてＲ１及びＲ２はＣＨ３(ＣＨ２)１６−である）
【請求項４】
前記複合体の平均粒径が１０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載の複合体。
【請求項５】
請求項１に記載の複合体と、前記複合体が分散された分散媒とを有することを特徴とする光イメージング用造影剤。
【請求項６】
リン脂質とゼラチンとが共有結合したゼラチン誘導体及びコレステロールとゼラチンとが共有結合したゼラチン誘導体のうち少なくとも一方を用意する工程と、前記少なくとも一方のゼラチン誘導体とインドシアニングリーンとを混合することにより複合体を得る工程を有することを特徴とする複合体の製造方法。
【請求項７】
前記リン脂質がＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を有するリン脂質であることを特徴とする請求項５に記載の複合体の製造方法。
【請求項８】
前記リン脂質が下記の化学式２で表されるリン脂質であることを特徴とする請求項５に記載の複合体の製造方法。
【化２】
（ただし、化学式２においてＲ１及びＲ２はＣＨ３(ＣＨ２)１６−である）
【請求項１】
リン脂質とゼラチンとが共有結合したゼラチン誘導体及びコレステロールとゼラチンとが共有結合したゼラチン誘導体のうち少なくとも一方と、インドシアニングリーンとを有することを特徴とする複合体。
【請求項２】
前記リン脂質がＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を有するリン脂質であることを特徴とする請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記リン脂質が下記の化学式２で表されるリン脂質であることを特徴とする請求項１に記載の複合体。
【化１】
（ただし、化学式２においてＲ１及びＲ２はＣＨ３(ＣＨ２)１６−である）
【請求項４】
前記複合体の平均粒径が１０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載の複合体。
【請求項５】
請求項１に記載の複合体と、前記複合体が分散された分散媒とを有することを特徴とする光イメージング用造影剤。
【請求項６】
リン脂質とゼラチンとが共有結合したゼラチン誘導体及びコレステロールとゼラチンとが共有結合したゼラチン誘導体のうち少なくとも一方を用意する工程と、前記少なくとも一方のゼラチン誘導体とインドシアニングリーンとを混合することにより複合体を得る工程を有することを特徴とする複合体の製造方法。
【請求項７】
前記リン脂質がＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を有するリン脂質であることを特徴とする請求項５に記載の複合体の製造方法。
【請求項８】
前記リン脂質が下記の化学式２で表されるリン脂質であることを特徴とする請求項５に記載の複合体の製造方法。
【化２】
（ただし、化学式２においてＲ１及びＲ２はＣＨ３(ＣＨ２)１６−である）
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１３】
【図１４】
【図１６】
【図１７（ｂ）】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図１】
【図１２】
【図１５】
【図１７（ａ）】
【図１８】
【図２２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１３】
【図１４】
【図１６】
【図１７（ｂ）】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図１】
【図１２】
【図１５】
【図１７（ａ）】
【図１８】
【図２２】
【公開番号】特開２０１２−６７２９５（Ｐ２０１２−６７２９５Ａ）
【公開日】平成２４年４月５日（２０１２．４．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１８２９６７（Ｐ２０１１−１８２９６７）
【出願日】平成２３年８月２４日（２０１１．８．２４）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１８年度、文部科学省、「先端融合領域イノベーション創出拠点の形成（高次生体イメージング先端テクノハブ）」に係わる委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００１００７）キヤノン株式会社 (59,756)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年４月５日（２０１２．４．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年８月２４日（２０１１．８．２４）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１８年度、文部科学省、「先端融合領域イノベーション創出拠点の形成（高次生体イメージング先端テクノハブ）」に係わる委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００１００７）キヤノン株式会社 (59,756)
【Ｆターム（参考）】
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