複合脂質画分、それから単離されたヒト型スフィンゴミエリンとプラズマローゲンならびにこれらを含む機能性食品素材、医薬品素材および化粧品素材
【課題】 安全な未利用供給源から、ヒト型スフィンゴ脂質やプラズマローゲン型グリセロリン脂質を簡便かつ大量生産可能な技術を開発し、それらを含む機能性食品素材を開発する。
【解決手段】 ニワトリ表皮を加熱処理して脱脂したのち、溶剤抽出することにより得られた、ヒト型スフィンゴミエリンおよびプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミンを含む複合脂質画分、該複合脂質画分から単離された、前記の各脂質成分、および該複合脂質画分を弱アルカリ処理してなる、ヒト型スフィンゴミエリンを主体とするスフィンゴ脂質、並びにこれらの少なくとも１種を含む機能性食品素材である。
【解決手段】 ニワトリ表皮を加熱処理して脱脂したのち、溶剤抽出することにより得られた、ヒト型スフィンゴミエリンおよびプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミンを含む複合脂質画分、該複合脂質画分から単離された、前記の各脂質成分、および該複合脂質画分を弱アルカリ処理してなる、ヒト型スフィンゴミエリンを主体とするスフィンゴ脂質、並びにこれらの少なくとも１種を含む機能性食品素材である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニワトリ表皮から得られ、ヒト型スフィンゴミエリンとプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミンを含む複合脂質画分、この複合脂質画分から単離されてなる前記各成分、前記複合脂質画分を弱アルカリ処理してなるヒト型スフィンゴミエリンを主体とするスフィンゴ脂質、およびこれらを含む機能性食品素材、医薬品素材、化粧品素材ならびに前記複合脂質画分およびヒト型スフィンゴミエリンを主体とするスフィンゴ脂質を、ニワトリ表皮を原料として、効率よく、工業的に有利に製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
脂質とは、分子中に長鎖脂肪酸または類似の炭化水素鎖をもち、生体内に存在するか、生物に由来する物質を指す。この脂質は、単純脂質と複合脂質に分類することができる。単純脂質は、Ｃ、ＨおよびＯより構成され、一般にアセトンに可溶で、単純脂質のトリアシルグリセロールは動物体では、脂肪組織にエネルギーの貯蔵体として存在する。一方、複合脂質は、リン酸のＰや塩基のＮなどを含む脂質群である。したがって、複合脂質は、疎水性部分（脂肪酸部分）と親水性部分（リン酸や塩基の部分）からなり、両親媒性を示し、一般的には、前記単純脂質がアセトンに可溶であるのに対し、複合脂質はアセトンに不溶である。このような複合脂質は生体膜の構成成分となっている。
【０００３】
前記複合脂質は、（１）グリセロリン脂質［ホスファチジルコリン（別名レシチン）、ホスファチジルエタノールアミンなどが属する。］、（２）スフィンゴリン脂質（スフィンゴミエリン、セラミドシリアチンなどが属する。）、（３）スフィンゴ糖脂質（セレブロシド、スルファチド、ガングリオシドなどが属する。）、および（４）グロセロ糖脂質（微生物や高等植物に存在するジアシルグリセロールに種々の糖が結合したものなどがある。）に大別することができる。なお、前記（２）スフィンゴリン脂質および（３）のスフィンゴ糖脂質を総称してスフィンゴ脂質と呼ばれる。
【０００４】
前記グリセロリン脂質は、グリセロリン酸を骨格にもつリン脂質の総称で、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファチジルエタノールアミン、ジホスフィチジルグリセロールなどがある。このグリセロリン脂質は、非極性部分が脂肪酸のエステルであるものが多いがビニルエーテル結合をもつプラズマローゲン型のものもある。
【０００５】
このグリセロリン脂質は、生体膜の構成成分として重要であるが、中でもプラズマローゲン型のグリセロリン脂質は、ビニルエーテル結合のラジカル感受性が高いため、抗酸化性を有するリン脂質として、近年注目されている。最近、プラズマローゲン型グリセロリン脂質が、細胞膜の抗酸化性分であるα−トコフェロール（ビタミンＥ）とは異なった機構により、コレステロールを含むリン脂質膜の酸化安定性に寄与していることが報告されており（例えば、非特許文献１参照。）、またプラズマローゲン型グリセロリン脂質は、細胞膜やリポタンパク質の抗酸化性に関与するだけでなく、細胞の情報伝達システムに重要な役割を有することが指摘されている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００６】
このようなプラズマローゲン型グリセロリン脂質は、痴呆症における脳の神経細胞死を防止する作用が期待されているが、安全で大量に入手可能な供給源は見当たらないのが実状である。
【０００７】
一方、スフィンゴ脂質は、スフィンゴシンなどの長鎖塩基をもつ脂質の総称で、前述したように主としてスフィンゴ糖脂質とスフィンゴリン脂質からなる。スフィンゴ糖脂質は、糖と長鎖脂肪酸の外に、長鎖塩基であるスフィンゴシンまたはフィトスフィンゴシン、その他を含むものである。最も単純なスフィンゴ糖脂質は、セレブロシドであるが、さらにそれに硫酸基のついたスルファチド、中性糖が数分子ついたセラミドオリゴヘキソシド、シアル酸のついたガングリオシドなどがある。これらの物質は、細胞表層に存在し、認識機構に関与するものと考えられている。
【０００８】
スフィンゴリン脂質は、セラミド１−リン酸の誘導体とセラミド１−ホスホン酸の誘導体に分けられ、前者ではスフィンゴミエリン、後者ではセラミドシリアチン（セラミドアミノエチルホスホン酸）がよく知られている。
【０００９】
これらのスフィンゴ脂質は、近年、その分解代謝物であるセラミド、スフィンゴシン、スフィンゴシン−１−リン酸などが細胞内の情報伝達に関与することが明らかにされ、注目されている。また、スフィンゴ脂質は、コレステロールなどとともに、「ラフト」と呼ばれる膜微小ドメインの形成に関与し、この微小ドメインが情報伝達の場として重要な役割を果たすことが明らかにされてきたことにより、ますます注目の度を増している。
【００１０】
このようなスフィンゴ脂質は、従来牛脳から抽出され、利用されていたが、安全性の問題から、現在穀物や酵母由来のものが利用されている。しかしながら、これらの穀物や酵母由来のスフィンゴ脂質を構成するスフィンゴイド塩基組成は、哺乳動物のものとは異なるため、ヒト型のスフィンゴ脂質と比べて生体利用性が低いという問題があった。
【００１１】
【非特許文献１】「Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．」、第４４巻、第１６４〜１７１頁（２００３年）
【非特許文献２】「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．」、第１６巻、２６３〜２７２頁；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ２７９〜２８４頁（２００１年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、このような事情のもとで、安全な未利用供給源から、ヒト型スフィンゴ脂質（スフィンゴミエリン）やプラズマローゲン型グリセロリン脂質を簡便に、かつ大量生産可能な技術を開発し、前記のヒト型スフィンゴ脂質（スフィンゴミエリン）やプラズマローゲン型グリセロリン脂質を含む機能性食品素材を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、前記目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、ニワトリ表皮中にヒト型スフィンゴミエリンおよびプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミンが、脱脂肪後の表皮に対して、それぞれ０．０７質量％程度含まれていること、そしてニワトリ表皮に特定の処理を施すことにより、それらを簡便にかつ大量生産し得ることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、
（１） ニワトリ表皮から得られ、ヒト型スフィンゴミエリンおよびプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミンを含むことを特徴とする複合脂質画分、
（２） 上記（１）項に記載の複合脂質画分から単離してなるヒト型スフィンゴミエリン、
（３） 上記（１）項に記載の複合脂質画分から単離してなるプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミン、
（４） 上記（１）項に記載の複合脂質画分を弱アルカリ処理してなる、ヒト型スフィンゴミエリンを主体とするスフィンゴ脂質、
（５） ニワトリ表皮を加熱処理して脱脂したのち、溶剤抽出することを特徴とする上記（１）項に記載の複合脂質画分の製造方法、
（６） ニワトリ表皮を加熱処理して脱脂したのち、溶剤抽出して複合脂質画分を得、次いで弱アルカリ処理することを特徴とする、ヒト型スフィンゴミエリンを主体とするスフィンゴ脂質の製造方法、
（７） 上記（１）項に記載の複合脂質画分、上記（２）項に記載のヒト型スフィンゴミエリン、上記（３）項に記載のプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミンおよび上記（４）項に記載のスフィンゴ脂質の中から選ばれる少なくとも１種を含むことを特徴とする機能性食品素材、
（８） 上記（１）項に記載の複合脂質画分、上記（２）項に記載のヒト型スフィンゴミエリン、上記（３）項に記載のプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミンおよび上記（４）項に記載のスフィンゴ脂質の中から選ばれる少なくとも１種を含むことを特徴とする医薬品素材、および
（９） 上記（１）項に記載の複合脂質画分、上記（２）項に記載のヒト型スフィンゴミエリン、上記（３）項に記載のプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミンおよび上記（４）項に記載のスフィンゴ脂質の中から選ばれる少なくとも１種を含むことを特徴とする化粧品素材、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、安全な未利用供給源としてニワトリ表皮を用い、ヒト型スフィンゴミエリンとプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミンを含む複合脂質画分、この複合脂質画分から単離してなるヒト型スフィンゴミエリンおよびプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミン、並びに該複合脂質画分を弱アルカリ処理してなるヒト型スフィンゴミエリンを主体とするスフィンゴ脂質を提供することができる。
【００１６】
また、本発明によれば、ニワトリ表皮から、前記の複合脂質画分およびヒト型スフィンゴミエリンを主体とするスフィンゴ脂質を、簡便にかつ大量生産することができる。
さらに、本発明によれば、前記のヒト型スフィンゴミエリンやプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミンを含む機能性食品素材、医薬品素材および化粧品素材を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の複合脂質画分は、ニワトリ表皮から得られ、ヒト型スフィンゴミエリンおよびプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミンを含む画分である。
本発明の複合脂質画分に含まれる脂質の種類およびその量比の１例を示すと、以下のとおりである。
質量比
スフィンゴミエリン ： １．０
ホスファチジルエタノールアミン： １．７
ホスファチジルコリン ： １．２
コレステリルグリコシド ： ０．２
【００１８】
スフィンゴミエリンは、セラミドの第一級アルコール性ヒドロキシル基とコリンリン酸がリン酸ジエステル結合したもので、下記の式（Ｉ）
【００１９】
【化１】
【００２０】
（式中、Ｒ−ＣＯは脂肪酸残基を示す。）
の構造を有し、通常動物体の脳組織のみならず、臓器組織にも広く存在する。
【００２１】
本発明におけるニワトリ表皮由来のスフィンゴミエリンを構成するスフィンゴイド塩基は、大部分が４−トランス−スフィンゲニン（スフィンゴシン）であることから、当該スフィンゴミエリンは、生体利用性の高いヒト型スフィンゴミエリンである。
【００２２】
スフィンゴミエリンは、その分解代謝物であるセラミド、スフィンゴシン、スフィンゴシン−１−リン酸などが脂肪内の情報伝達に関与することが明らかにされており、またコレステロールなどとともに、「ラフト」と呼ばれる膜微小ドメインの形成に関与し、この微小ドメインが情報伝達の場として重要な役割を果たすことが明らかにされている。さらに、スフィンゴミエリンは、皮膚の保湿効果や大腸がん予防効果などが期待されている。
【００２３】
一方、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）は、その約９４質量％がプラズマローゲン型であり、このように高濃度でプラズマローゲン型が含まれることは予想外であった。また、ホスファチジルコリン（ＰＣ）にも約１４質量％のプラズマローゲン型が含まれている。
【００２４】
下記の式（II）および式（III）に、それぞれジアシル型グリセロリン脂質およびプラズマローゲン型グリセロリン脂質の構造を示す。
【００２５】
【化２】
【００２６】
通常のグリセロリン脂質（レクチン）は、式（II）で示されるようにグリセロールのｓｎ−１（１位）に脂肪酸アシル基とのエステル結合をもつが、プラズマローゲン型は、式（III）で示されるようにグリセロールのｓｎ−１にアルケニル基をもつビニルエーテル結合を有している。
なお、Ｘがアミノエチル基である場合、ホスファチジルエタノールアミンであり、Ｘがトリメチルアミノエチル基である場合、ホスファチジルコリンである。
【００２７】
前記プラズマローゲン型グリセロリン脂質は、ビニルエーテル結合のラジカル感受性が高いため抗酸化性リン脂質として注目されており、コレステロールを含むリン脂質膜の酸化安定性に寄与していることが知られている。またプラズマローゲン型グリセロリン脂質は、細胞膜やリポタンパク質の抗酸化性に関与するだけでなく、細胞の情報伝達システムに重要な役割を有することが指摘されている。このようなプラズマローゲン型グリセロリン脂質は、痴呆症における脳の神経細胞死を防止する作用や、アテローム性動脈硬化症の発症予防効果などが期待されている。
【００２８】
前記コレステリルグリコシドは、脂質ではなくコレステロール配糖体であり、その約６０質量％がガラクトース型で、約４０質量％がグリコース型である。このコレステリルグリコシドは消化器潰瘍形成抑制効果が期待されている。
【００２９】
このように、ニワトリ表皮から得られた複合脂質画分は、人体に有効な生理活性を有する種々の成分が含まれており、また、供給源がニワトリ表皮であって安全であることから、機能性食品素材、医薬品素材および化粧品素材として有用である。
【００３０】
本発明はまた、前記の複合脂質画分を、公知の方法、例えば下記の方法などにより単離して得られたヒト型スフィンゴミエリンおよびプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミンをも提供する。
【００３１】
＜複合脂質画分より、各複合脂質の単離方法＞
（１） エタノール法
複合脂質画分にエタノールを加え、加熱溶解後、冷却し、生成した沈殿をろ過、乾燥して固体状の粗スフィンゴミエリンを得る。
一方、エタノールを蒸発乾固して粗ホスファチジルコリンとホスファチジルエタノールアミン混合物を得る。
（２） エーテル法
複合脂質画分をエチルエーテルで抽出を行い、エーテル相を蒸発乾固して、ホスファチジルコリンとホスファチジルエタノールアミンの混合物を得る。
一方、エーテル不溶部を乾固して粗スフィンゴミエリンを得る。
（３） 粗画分の精製
（イ）スフィンゴミエリン：弱アルカリ処理でリン脂質を除去し、純度を上げることができる。
（ロ）ホスファチジルエタノールアミン：ケイ酸カラムで分画する。
（ハ）ホスファチジルコリン：ケイ酸カラムで分画する。
これらの脂質は、機能性食品素材、化粧品素材、医薬品素材などとして有用である。
【００３２】
さらに、当該複合脂質画分を弱アルカリ処理してなる、ヒト型スフィンゴミエリンを主体とするスフィンゴ脂質をも提供する。複合脂質画分における各脂質の中で、スフィンゴミエリンは、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリンに比べて、アルカリに対する安定性が高い（加水分解されにくい。）ので、スフィンゴミエリンができるだけ加水分解されず、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリンが加水分解される条件でアルカリ処理することにより、ヒト型スフィンゴミエリンを主体とするスフィンゴ脂質を得ることができる。
【００３３】
このヒト型スフィンゴミエリンを主体とするスフィンゴ脂質は、機能性食品素材、化粧品素材、医薬品素材などとして有用である。
前記複合脂質画分は、以下に示す本発明の方法に従えば、簡便にかつ生産性よく製造することができる。
【００３４】
本発明の方法においては、まずニワトリ表皮を加熱処理して脱脂したのち、溶剤抽出することにより、複合脂質画分を製造する。
ニワトリ表皮の脱脂処理には、機械的方法、温水浸漬加熱方法、直接加熱方法などを採用することができるが、本発明の方法においては、効果および生産性などの面から、直接加熱し、脂肪分を除去する方法が用いられる。
【００３５】
この際の加熱処理条件としては、脂肪分を効果的に除去し、かつ複合脂質ができるだけ分解しない条件を選択することが肝要である。処理条件としては、例えば５００Ｗの電子レンジを用いて処理する場合、処理時間は３〜２０分程度、好ましくは５〜１０分である。この脱脂処理により、全脂質の３０〜６０質量％程度を除去することが好ましく、特に４０〜５０質量％除去することが好ましい。
【００３６】
次に、このようにして脱脂処理されたニワトリ表皮を溶剤抽出処理に付す。溶剤としては、食品衛生上安全であって、かつ抽出効率のよいものが用いられる。このような溶剤としては、特にエタノールが好適である。この抽出処理は、常法に従って行うことができる。
【００３７】
このようにして、複合脂質画分を含む抽出液が得られる。この抽出液は、適当な濃度に調整して、複合脂質含有溶液としてもよく、また溶剤を除去して、複合脂質混合物としてもよい。
【００３８】
また、前記のようにして得られた複合脂質画分を含む抽出液を、例えば０．１〜１モル／Ｌ程度、好ましくは０．３〜０．６モル／Ｌ濃度の水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウム、好ましくは水酸化カリウムを、混入リン脂質中のグリセライド結合に対し、３〜１０倍モル量用い、少量のエタノールの存在下に、通常０〜共沸温度、好ましくは２０〜６０℃の温度で３０〜３００分程度、好ましくは６０〜１２０分アルカリ処理することにより、ヒト型スフィンゴミエリンを主体とするスフィンゴ脂質を製造することができる。
【００３９】
アルカリ処理後、塩酸などの酸を用いて中和することにより、ヒト型スフィンゴミエリンを含む粗製のスフィンゴ脂質を含む溶液が得られる。
この溶液に、常法に従って精製処理を施すことにより、ヒト型スフィンゴミエリンを含む精製スフィンゴ脂質を得ることができる。
【００４０】
本発明はまた、前述の複合脂質画分、この画分から単離されたヒト型スフィンゴミエリンやプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミン、および前記複合脂質画分を弱アルカリ処理してなる、ヒト型スフィンゴミエリンを含むスフィンゴ脂質の中から選ばれる少なくとも１種を含む機能性食品素材をも提供する。
この機能性食品素材には、所望により、ビタミンＥなどの安定化剤や、各種の健康食品素材などを配合することができる。
【実施例】
【００４１】
次に、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの例によってなんら限定されるものではない。
実施例１ ニワトリ表皮部の脱油処理
（１）産卵成鶏表皮部の裁断およびその脂肪除去処理後の脂質成分の分析と定量
産卵成鶏の裁断表皮部とその脱脂処理（機械的脂肪除去と温水浸漬加熱）品の全脂質量および中性脂質と複合脂質の割合を表１に示す。なお、機械的脂肪除去は木製のへらで掻き取る方法で行い、温水浸漬加熱処理は、６０℃の温水中に９０分間浸漬することにより行った。
【００４２】
【表１】
【００４３】
表１から分かるように、中性脂質と複合脂質との割合は、機械的脂肪除去法が有効で、他に比べて１．５倍に向上する。
【００４４】
全脂質と複合脂質およびそのアルカリ処理生成脂質（アルカリ処理条件：０．５モル／Ｌの水酸化カリウムを用い、４０℃で１２０分加熱）に関するケイ酸薄層クロマトグラムを図１に示した。全脂質は殆ど中性脂質であるが、複合脂質画分にはスフィンゴミエリン（ＳＭ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）及びホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）が、このアルカル処理画分にはコレステロールグルコシド（ＣＧ）とセレブロシドが含まれていることが判明した（図１）。
【００４５】
（２）電子レンジによるブロイラー表皮部の脱脂処理法
（ａ）電子レンジ加熱処理によるブロイラー皮部から油脂分の除去
鶏肉専門店（帯広市）で購入したブロイラー（以下、「ニワトリ」ということがある。）の皮部をビーカーに入れて電子レンジ（シャープ（株）、ＲＥ８７−ＨＳＰ型 ５００Ｗ）で3分から20分加熱処理した皮部の融出油脂量と残存脂質量を表２に示す。皮部100g当たりの融出油脂量は13〜24ｇで、処理時間の長短による違いはなくまた、残存脂質量も13〜16gであった。
【００４６】
【表２】
【００４７】
5分および20分の加熱処理融出油脂成分をケイ酸TLCで分析した（図２ レーン4と6）が、いずれも実質的にトリアシルグリセロール（以下、「ＴＧ」ということがある。）のみで、複合脂質（Aの展開条件では原点物質）は見られなかった。また、加熱処理後の残存脂質成分からは、複合脂質群も検出されたが（レーン12と13）、この場合もＴＧが大部分を占めていた（レーン5と7）。なお、供試皮部中（レーン11）には主要複合脂質としてホスファチジルエタノールアミン（スポットA）、ホスファチジルコリン（スポットB）およびスフィンゴミエリン（スポットC）が確認された。
【００４８】
なお、図２において、各レーンは以下のとおりである。
１：ジアシルグリセロール（標準品）
２：老ニワトリ表皮からの全脂質
３と１１：ニワトリ皮部の全脂質
４：ニワトリ皮部の加熱処理（５分間）によって溶け出した油脂
５と１２：ニワトリ皮部の加熱処理（５分間）後に残っていた全脂質
６：ニワトリ皮部の加熱処理（２０分間）によって溶け出した油脂
７と１３：ニワトリ皮部の加熱処理（２０分間）後に残っていた全脂質
８：ホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルコリン（標準品）
９：セレブロシド（標準品）
１０：スフィンゴミエリン（標準品）
【００４９】
また、展開溶媒および検出試薬は、以下のとおりである。
展開溶媒：ヘキサン−ジエチルエーテル−酢酸（８０：３０：１,ｖ／ｖ）［Ａ］
クロロホルム−メタノール−水（６５：２５：４,ｖ／ｖ）［Ｂ］
検出試薬：５０％Ｈ２ＳＯ４
【００５０】
（ｂ）逆相HPLCによるブロイラー皮部の加熱処理融出油脂分と加熱処理後残存ＴＧの成分パターンの解析評価
図３に、供試ブロイラー皮部中のＴＧの逆相HPLCパターン（A ）と加熱処理融出油脂および加熱処理後の残存ＴＧの逆相HPLCパターンを示す。5分と20分の加熱処理による差は無く、融出ＴＧ種の各ピークの割合はB（5分処理）とD（20分処理）ではほぼ同じであった。また、融出ＴＧ（BとD）と残存ＴＧ（CとE）を比較すると、後者では図３中の領域（ロ）以降のピークの割合が前者よりも少し多い傾向が見られた。
この結果、皮部の当該処理によって有意な複合脂質量の混入はないことが判明し、当該処理が皮部の脱油に有効であることが実証された。
【００５１】
なお、図３において、各符号は次のとおりである。
Ａ：ニワトリ皮部のトリアシルグリセロール
Ｂ：電子レンジによる５分間の加熱によって溶け出したもの
Ｃ：５分間の加熱処理後に残っていたもの
Ｄ：電子レンジによる２０分間の加熱によって溶け出したもの
Ｅ：２０分間の加熱処理後に残っていたもの
【００５２】
（ｃ）加熱処理条件と皮部に残存する複合脂質成分の検定
加熱処理後の残存複合脂質画分のケイ酸TLCを図４に示す。5分間の電子レンジ処理後の残存複合脂質のケイ酸TLCのパターン（レーン3）は、未加熱状態からの抽出全脂質のそれ（図２のレーン11）と同様で、主要成分としてホスファチジルエタノールアミン（スポットA）、ホスファチジルコリン（スポットB）およびスフィンゴミエリン（スポットC）が検出された。
【００５３】
20分間加熱処理した皮部から抽出された全脂質中の複合脂質画分のパターン（レーン5）は5分処理の場合（レーン3）とは異なり、スポットGの割合が高く、逆にＰＥとＳＰＭに相当するスポットが相対的に減少した。これは、20分の加熱処理中に皮部中のＰＥが既に分解されていたことを示唆する。一方、ＰＣは、電子レンジ処理に対してＰＥよりも比較的安定で、ほとんど分解されないことが示唆された。
【００５４】
なお、図４において、各レーンは以下のとおりである。
１：ホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルジリコン（標準品）
２：スフィンゴミエリン（標準品）
３：ニワトリ皮部の電子レンジによる加熱処理（５分間）後に残っていた
複合脂質
４：３の弱アルカリ処理物
５：ニワトリ皮部の電子レンジによる加熱処理（２０分間）後に残っていた
複合脂質
６：５の弱アルカリ処理物
【００５５】
また、展開溶媒および検出試薬は、以下のとおりである。
展開溶媒：クロロホルム−メタノール−水（６５：２５：４,ｖ／ｖ）
検出試薬：５０％Ｈ２ＳＯ４
【００５６】
以上の結果、電子レンジ（５００Ｗ）加熱処理によるニワトリ皮部から複合脂質群を効率的に分離調製する条件は、２０分未満が好ましく、２０分では一部の複合脂質が分解することが判明した。
（ａ）および（ｂ）の結果から、家禽類の主要種のブロイラーと産卵成鶏の何れの表皮部にも、ＰＥ，ＰＣ及びＳＰＭが含まれており、これらの抽出原料となることが確認された。
【００５７】
実施例２ 脱油後の産卵成鶏表皮部から複合脂質画分の分離とその組成検定
電子レンジ加熱処理（５００Ｗ電子レンジで１５分間加熱）で油分を約1/2除去した表皮部からエタノール抽出により複合脂質画分を３質量％濃度で調製した。該画分の組成は、ホスファチジルエタノールアミン（PE）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびスフィンゴミエリン（SPM）並びにコレステリルグルコシド（ＣＧ）であった。
当該複合脂質画分は、それ自身又はビタミンＥ等の安定化剤を添加した組成物で、複合機能性食品因子として、又、化粧品素材や医薬品素材としても有用性が高い。
【００５８】
実施例３ ホスファチジルエタノールアミン（PE）、およびスフィンゴミエリン（SPM）の分離とその構造検定
（１）複合脂質のリン脂質群の検定とその定量
（ａ）ＳＰＭの定量
上記分離複合脂質画分をクロロホルム-メタノール（質量比2 : 1）に溶解し、光散乱検出器付順相HPLCに供してスフィンゴミエリンを定量した。HPLCの操作条件は、カラムにはＬｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ Ｓｉ６０（５μ×２００ｍｍ、メルク社製）、溶離液には溶媒Aとしてクロロホルムを、溶媒Bとしてメタノール-水（質量比95 : 5）を用い、A : B（質量比99 :1）を15分までに75 : 25の割合、25分までに10 : 90の割合、次いで35分までに5：95、次いで40分から45分までに99 : 1の割合とする、2液グラジュエントを行った。流速は1.0 ml/minとした。
【００５９】
産卵成鶏表皮部から調製した複合脂質画分およびその弱アルカリ処理物（処理条件：０．５モル／Ｌの水酸化カリウムを用い、４０℃で１２０分加熱）を順相HPLCに供した結果を図５に示す。標準の牛脳から分離したスフィンゴミエリンはHPLC上で2つのピークに分れたが、産卵成鶏表皮の複合脂質画分でもそれと同じ保持時間を有するピーク群（両ピークを合わせてピーク４と表示）が観察された。ピーク4は、弱アルカリ処理後にも検出されたことから、スフィンゴミエリンであると判断された。主要なピーク2と3は、2次元ケイ酸TLC分析の結果（図６）を考え合わせると、それぞれホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルコリンと推定される。また、弱アルカリ処理後に残存するピーク１群にはセレブロシド（スフィンゴミエリンのアルカリ加水分解生成物に相当）とコレステリルグルコシドが含まれる。
産卵成鶏表皮（脂肪除去試料）中のスフィンゴミエリン量は、検量線から算出すると、複合脂質の21質量％を占め、試料（脂肪除去したもの）1g当たりでは0.7mgであった。
【００６０】
なお、図５において、測定条件および各符号は以下のとおりである。
Ａ：産卵成鶏表皮の複合脂質
Ｂ：Ａのアルカリ処理物
Ｃ：標準スフィンゴミエリン
【００６１】
測定条件
カラム：ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ Ｓｉ６０
カラム温度：３５℃
溶離液：前出
【００６２】
また、図６における展開溶媒および検出試薬は以下のとおりである。
Ａ：展開溶媒
１次元目 クロロホルム−メタノール−酢酸（６５：２５：１０,ｖ／ｖ）
２次元目 クロロホルム−メタノール−蟻酸（６５：２５：１０,ｖ／ｖ）
検出試薬 Ｄｉｔｔｍｅｒ試薬
Ｂ：展開溶媒
１次元目 クロロホルム−メタノール−２５％アンモニア
（６５：３５：８,ｖ／ｖ）
２次元目 クロロホルム−アセトン−メタノール−酢酸−水
（５０：２０：１０：１０：５,ｖ／ｖ）
検出試薬 ５０％Ｈ２ＳＯ４
【００６３】
（ｂ）ＰＥ及びＰＣとＣＧの定量
同様にして、ホスファチジルエタノールアミン（PE）(含有率３５質量％)、及びホスファチジルコリン（PC）（含有率２５質量％）並びにＣＧ（含有率５質量％）が得られた。
【００６４】
実施例４
上記分離複合脂質画分０．５ｇを、分取用高性能液体クロマトグラフ装置に供してホスファチジルエタノールアミン（PE）１７０ｍｇ、ホスファチジルコリン（PC）２２０ｍｇおよびスフィンゴミエリン（SPM）１００ｍｇ並びにコレステロールグルコシド（ＣＧ）２０ｍｇ、各々相当する画分に分離した。
【００６５】
実施例５ ＰＥおよびＳＰＭの構造解析
（１）ＰＥの構造同定
（ａ）プラズマローゲン型の確認
分離複合脂質画分をメタノリシスし、そのヘキサン抽出物をGC分析した結果、少なくとも16種の脂肪酸メチルエステルと3種のジメチルアセタールのピークが検出された。脂肪酸メチルエステルとジメチルアセタールの量比は、極性脂質画分全体では（質量比、以下同様）89 : 11、PEでは54 : 46、またPCでは94 : 6であった（表 ３）。このことから、ジメチルアセタールの大部分はPEに由来することが明らかになった。仮にPEが1,2-ジアシル型と1-アルケニル、2-アシル型の2種から構成されていると仮定すると、1-アルケニル、2-アシル型（プラズマローゲン）が全体の94質量％を占め、残りの6質量％がジアシル型となる。一方、PCでは全体の14質量％がプラズマローゲンと判断される。
【００６６】
【表３】
【００６７】
（ｂ）ニワトリ表皮中のプラズマローゲンのアルケニル基由来のジメチルアセタールの組成解析とその同定
ニワトリ表皮の極性脂質画分、PEおよびPCをメタノール性5質量％HCl液とともに100℃で3時間メタノリシスして得られるジメチルアセタールの組成を表４に示す。いずれの脂質でも炭素数16と18の飽和型および炭素数18のモノエン型が認められた。そのうち、PEでは18:0が過半を占め、次いで16:0、18:1の順で多く含まれていた。一方、PCでは16:0が70質量％で、18:0は25質量％であった。
【００６８】
【表４】
【００６９】
（２）ＳＰＭの構造解析と同定
（ａ）スフィンゴ脂質構成分の同定
構成脂肪酸の分析では、複合脂質画分の弱アルカリ処理物をメタノール性質量5％HClとともに100℃で3時間、メタノリシスした。遊離した脂肪酸メチルエステルをヘキサンで抽出し、これをヘキサン-ジエチルエーテル（質量比85：15）によるケイ酸薄層クロマトグラフィー（TLC）に供してノルマル脂肪酸（非置換酸）メチルおよび2-ヒドロキシ脂肪酸メチルに分別し、前者はそのまま、後者はアセチル誘導体に転換してからGC-MS分析に供した。当該ヘキサン抽出物をケイ酸TLCに供した結果を図７に示す。主要な2つのスポット（1と2）が検出され、ヒドロキシ脂肪酸メチルエステルのスポット（3）は僅かであった。また、スポット4は、コレステロールグルコシドの構成ステロールに由来するものである。スポット1と2をそれぞれ分離してGCに供した結果を図８に示す。スポット1では、14:0から24:2までの脂肪酸メチルエステルのピークが検出され、その他に18:0のジメチルアセタール（DMA）のピークが僅かに見られた（図８-B）。スポット2では、16:0、18:0および18:1の3種のジメチルアセタールのピークが主として検出された（図８-C）。これらのことから、スポット1はスフィンゴ脂質の構成脂肪酸に由来する脂肪酸メチルエステルであり、スポット2はプラズマローゲンタイプのリン脂質に由来するジメチルアセタールであると判断される。また、スポット3を分取し、アセチル化してからGC分析したところ、炭素数18から26までの飽和の2-ヒドロキシ脂肪酸メチルエステルが検出された（図８-D）。なお、図８-Aはヘキサン抽出物全体のアセチル化物のガスクロマトグラムである。図７のケイ酸TLC分析の結果と符号して、スフィンゴ脂質の構成脂肪酸としては非置換酸（ノルマル酸）が大部分を占め、ヒドロキシ脂肪酸は微量成分であることが確認された。
【００７０】
なお、図８における各符号は以下のとおりである。
Ａ：全ヘキサン抽出物（アセチル誘導体化後にＧＣへ注入）
Ｂ：図１のスポット１
Ｃ：図１のスポット２（ジメチルアセタール，ＤＭＡと略記）
Ｄ：図１のスポット３のアセチル誘導体
【００７１】
構成スフィンゴイド塩基の分析では、アルカリ安定性の複合脂質画分を含水メタノール性1MHClとともに80℃で18時間、分解した。分解液をヘキサンで抽出後、残液をアルカリ性にしてからジエチルエーテルで遊離したスフィンゴイド塩基を抽出した。これをクロロホルム-メタノール-2N アンモニア水（80：20 : 2）によるケイ酸TLCに供してジヒドロキシ塩基とトリヒドロキシ塩基に分別してから、それぞれを過ヨウ素酸酸化して脂肪性アルデヒドに誘導した後、GC-MS分析を行った。GC-MSは島津製作所製QP-2010型ガスクロマトグラフ-質量分析計を用いて行った。各成分の分離には、極性キャピラリーカラム（CP-Sil 88）を使用した。
【００７２】
通常、スフィンゴ脂質の構成脂肪酸は飽和脂肪酸とモノエン脂肪酸であることから、24:2の脂肪酸ピークを確認するために質量スペクトルを解析した。図９には、比較のために24:0（リグノセリン酸）と24:1（ネルボン酸）の質量スペクトルも記載した。各スペクトルにおいて、分子イオンがm/z 382、380および378に検出され、それぞれ24:0、24:1および24:2の脂肪酸メチルであることが示された。また、不飽和タイプでは、メチルエステルに特徴的なM―32とM―74のイオンも観察された。
【００７３】
表５にニワトリ表皮から調製したスフィンゴ脂質画分のノルマル型とヒドロキシ型の構成脂肪酸の組成を示す。主要なノルマル脂肪酸はパルミチン酸（16:0）、ネルボン酸（24:1）およびステアリン酸（18:0）、特にパルミチンであった。一方、ヒドロキシ脂肪酸としては超長鎖型が多く、その中で２-ヒドロキシリグノセリン酸（24h:0）の割合が最も高かった。
【００７４】
【表５】
【００７５】
（ｂ）産卵成鶏表皮に含まれるスフィンゴ脂質の構成スフィンゴイド塩基の同定
該表皮のスフィンゴ脂質を構成するスフィンゴイド塩基画分をケイ酸TLCに供した結果を図１０に示す。図中のAの領域には、酸分解で生じたスフィンゴイド塩基の副産物である3-O-メチルスフィンゴイド塩基などが展開されることが知られている。主要スポットは4-トランス-スフィンゲニン（スフィンゴシン）とスフィンガニン（ジヒドロスフィンゴシン）に相当するBの領域（酸分解によって天然のエリスロ型と副産物のスレオ型が生成し、両者はダルマ状のスポットに分離される）に観察され、標準の4-ヒドロキシスフィンガニン（フィトスフィンゴシン）と同じRfの領域（C）には明瞭なニンヒドリン試薬陽性のスポットは観察されなかった。
【００７６】
図１０のBとCの領域を分取し、過ヨウ素酸酸化を行って脂肪性アルデヒドに誘導してからGC-MSに供した結果を図１１に示す。全イオンクロマトグラムからアルデヒドピークとして、図１０のB領域からはピーク1〜3の3種が、またCの領域からはわずかにピーク4が検出された。それらは保持時間と質量スペクトルから、スフィンガニンに由来する16:0アルデヒド（ピーク1）、4-トランス-スフィンゲニンに由来する16:1(2t)アルデヒド（ピーク2）、4-トランス-スフィンゲニンのC22同族体に由来する20:1(2t)アルデヒド（ピーク3）および4-ヒドロキシスフィンガニンに由来する15:0アルデヒド（ピーク4）と判定された。なお、図１０のC領域にはスポットが検出できなかったが、ピーク4の質量スペクトル（図１１）では15:0アルデヒドであることを示すM―18、M―44および M―46のイオンがそれぞれm/z 208、182および180に検出された。このことは、超微量の4-ヒドロキシスフィンガニンも存在することを意味している。なお、ニワトリの餌中に含まれると推測される植物性の4-トランス,8-トランス（およびシス）-スフィンガジエニンに由来する16:2アルデヒドに相当するピークは検出されなかった。
【００７７】
なお、図１０において、各レーンおよび展開溶媒、検出試薬は以下のとおりである。
レーン１：フィトスフィンゴシン（４−ヒドロキシスフィンガニン、標品）
レーン２：産卵成鶏表皮由来のスフィンゴイド塩基画分
レーン３：スフィンゴシン（４−トランス−スフィンゲニン、標品）
【００７８】
展開溶媒：クロロホルム−メタノール−２Ｎアンモニア水
（８０：２０：２，ｖ／ｖ）
検出試薬：ニンヒドリン
【００７９】
以上の結果から、ニワトリ表皮のスフィンゴ脂質の構成スフィンゴイド塩基は大部分が4-トランス-スフィンゲニン（スフィンゴシン）であることから、このスフィンゴミエリンは生体利用性の高いヒト型スフィンゴミエリンであることが確認された。
更に、リン脂質群において、ＰＥには、94%という驚くべき高濃度でプラズマローゲン型が、ＰＣにも14%のプラズマローゲン型が含まれている。
【００８０】
表皮中の脂質成分はほとんどトリアシルグリセロールであり、これを電子レンジ等で適宜に除去すれば、プラズマローゲンとスフィンゴミエリンを高濃度に含む機能性脂質素材が生産できることになる。
【００８１】
実施例６ ＳＰＭの機能性評価
（１）ＳＰＭの生体利用性
分化Ｃａｃｏ−２細胞を２１日間培養してモノレイヤーを形成させた後、5μmol/Lスフィンゴ塩基を添加した無血清ＤＭＥＭにインキュベートした。所定時間毎にスフィンゴイド塩基のＣａｃｏ−２細胞への取り込みを植物及び動物起源で比較した。その結果、図１２に示した様に、植物や真菌中のスフィンゴイド塩基は殆ど吸収されず生体利用性が極めて低いことが該モデル系実験で明らかにされた。図中、d18:24t,8cは4,8-Sphingadienine、
及びd18:24t,8tは4,8-Sphingadienieで光学異性体の植物由来、一方、d18:14は4-Sphingenine（Sphingosine）で動物由来である。
【００８２】
（２）スフィンゴミエリンの皮膚再生におよぼす効果
＜材料と方法＞
・対象動物：7〜9週齢ICR雄マウス
・顕微鏡的観察：クリオスタット標本のH・E染色とラット抗マウスCD68モノクロナール抗体を用いた免疫染色による真皮マクロファージの観察
【００８３】
（１）実験例１
マウス背側剃毛皮膚に中波紫外線UV-Bを50mJ / cm2照射すると、マウス表皮の２列立方上皮が３日後には重層扁平上皮が変化した。この皮膚を顕微鏡的に観察すると、マクロファージが表皮直下の真皮に多数集積していた。重層扁平上皮化した表皮細胞は照射５日後にはアポト−シスによって除去され、7〜10日間でマウス本来の２列立方上皮になった。
UV-B照射で重層扁平上皮化したマウス表皮がスフィンゴミエリンを種々の濃度（1、10、100mg）で塗布したところ、10mg及び100mg塗布で回復が加速される所見が得られ、同時に、マクロファージの消長などに関して組織学的ならびに免疫組織化学的に検索した結果もこれを裏づけた。
【００８４】
（２）実験例２
照射UV-Bを100mJ / cm2照射すると火傷が生じる。紫外線照射直後にスフィンゴミエリンを実験１と同様の濃度で塗布したところ、火傷皮膚の修復に対するスフィンゴミエリンの塗布効果が10mg及び100mg塗布で観察された。
【００８５】
実施例７ 食素材及び食品への応用；処方例
処方例１ 濃縮混合物の顆粒処方
実施例２で調製した複合脂質混合物0.5mg , ビタミンＥ0.1mgと、ショ糖脂肪酸エステル、還元麦芽糖、還元パラチノース、ビートオリゴ糖、デキストリン、リン酸三カルシウム、等の乳化剤・結合剤等賦形剤1000mgから、常法通り流動層造粒方式により顆粒を調製した。
【００８６】
処方例２ スフィンゴミエリンの顆粒処方
実施例４で調製したスフィンゴミエリン0.1mg、ビタミンＥ0.02mg、ショ糖脂肪酸エステル、還元麦芽糖、還元パラチノース、ビートオリゴ糖、デキストリン、リン酸三カルシウム、等の乳化剤・結合剤等賦形剤1000mgから、常法通り流動層造粒方式により顆粒を調製した。
【００８７】
処方例３ プラズマローゲン型エホスファチジルエタノールアミンの顆粒処方
実施例４で調製したプラズマローゲン型ホスファチジルエタノールアミン0.1mg、ビタミンＥ0.02mg、ショ糖脂肪酸エステル、還元麦芽糖、還元パラチノース、ビートオリゴ糖、デキストリン、リン酸三カルシウム、等の乳化剤・結合剤等賦形剤1000mgから、常法通り流動層造粒方式により顆粒を調製した。
【００８８】
実施例７ 医薬品及び化粧品への応用処方例
処方例１ 医薬品用錠剤；スフィンゴミエリン
実施例４で調製したスフィンゴミエリン10mg、ビタミンＥ2mg、ショ糖脂肪酸エステル、還元麦芽糖、還元パラチノース、ビートオリゴ糖、デキストリン、リン酸三カルシウム、等の乳化剤・結合剤等賦形剤988mgから、常法通り流動層造粒方式により顆粒を調製した。この顆粒に乳化剤を加えて充分に混合して常法により250mg錠に打錠する。
同様にしてプラズマローゲン型エホスファチジルエタノールアミンの顆粒から、250mgの錠剤を打錠した。
【００８９】
処方例２ 化粧品用乳液；スフィンゴミエリン
（油 相）
スクワラン 15.0%
ワセリン 7.0
ステアリルアルコール 3.0
ステアリン酸 3.0
グリセリンモノステアレート 3.0
ポリアクリル酸エチル 0.5
スフィンゴミエリン（実施例４で調製） 0.5
酸化防止剤 適量
防腐剤 適量
香料 適量
（水 相）
精製水 61.0
1,3 ブチレングリコール 7.0
油相部と水相部をそれぞれ70℃に加熱し溶解させる。水相部に油相部を加え、ホモジナイザーを用いて乳化する。乳化液を熱交換器を用いて冷却してO/Wの乳液を得た。
同様にして、実施例２で調製した複合脂質混合物を用いて、乳液を得た。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明によれば、安価な未利用資源であるニワトリ表皮から、食品分野、化粧分野、医薬品分野などにおいて有用なヒト型スフィンゴ脂質やプラズマローゲン型グリセロリン脂質などを、簡単にかつ大量生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】産卵成鶏表皮部中の脂質成分のケイ酸薄層クロマトグラムである。
【図２】ブロイラー表皮部の電子レンジ加熱によって溶け出した油脂および加熱処理後の皮部から抽出した脂質のケイ酸薄層クロマトグラムである。
【図３】ブロイラー表皮部中のトリアシルグリセロールの逆相ＨＰＬＣチャートである。
【図４】ニワトリ表皮部中の複合脂質成分の薄層クロマトグラムである。
【図５】産卵成鶏表皮部中の複合脂質およびそのアルカリ安定脂質のＨＰＬＣチャートである。
【図６】産卵成鶏表皮部から調製した複合脂質画分の２次元薄層クロマトグラムである。
【図７】産卵成鶏表皮部から調製した複合脂質画分の弱アルカリ処理物の構成脂肪酸を示すケイ酸薄層クロマトグラムである。
【図８】産卵成鶏表皮部中の弱アルカリ安定複合脂質画分のメタノリシス後のヘキサン抽出物のＧＣ−ＭＳチャートである。
【図９】産卵成鶏表皮部中のスフィンゴ脂質の構成脂肪酸を示すＧＣ−ＭＳチャートである。
【図１０】産卵成鶏表皮部中のスフィンゴ脂質を構成するスフィンゴイド塩基画分のケイ酸薄層クロマトグラムである。
【図１１】産卵成鶏表皮部中のスフィンゴ脂質を構成するスフィンゴイド塩基に由来するアルデヒドのＧＣ−ＭＳチャートである。
【図１２】分化Ｃａｃｏ−２細胞でのスフィンゴイド塩基の取り込みを、ニワトリ表皮由来のものと、植物起源および動物起源のものとを比較した結果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニワトリ表皮から得られ、ヒト型スフィンゴミエリンとプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミンを含む複合脂質画分、この複合脂質画分から単離されてなる前記各成分、前記複合脂質画分を弱アルカリ処理してなるヒト型スフィンゴミエリンを主体とするスフィンゴ脂質、およびこれらを含む機能性食品素材、医薬品素材、化粧品素材ならびに前記複合脂質画分およびヒト型スフィンゴミエリンを主体とするスフィンゴ脂質を、ニワトリ表皮を原料として、効率よく、工業的に有利に製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
脂質とは、分子中に長鎖脂肪酸または類似の炭化水素鎖をもち、生体内に存在するか、生物に由来する物質を指す。この脂質は、単純脂質と複合脂質に分類することができる。単純脂質は、Ｃ、ＨおよびＯより構成され、一般にアセトンに可溶で、単純脂質のトリアシルグリセロールは動物体では、脂肪組織にエネルギーの貯蔵体として存在する。一方、複合脂質は、リン酸のＰや塩基のＮなどを含む脂質群である。したがって、複合脂質は、疎水性部分（脂肪酸部分）と親水性部分（リン酸や塩基の部分）からなり、両親媒性を示し、一般的には、前記単純脂質がアセトンに可溶であるのに対し、複合脂質はアセトンに不溶である。このような複合脂質は生体膜の構成成分となっている。
【０００３】
前記複合脂質は、（１）グリセロリン脂質［ホスファチジルコリン（別名レシチン）、ホスファチジルエタノールアミンなどが属する。］、（２）スフィンゴリン脂質（スフィンゴミエリン、セラミドシリアチンなどが属する。）、（３）スフィンゴ糖脂質（セレブロシド、スルファチド、ガングリオシドなどが属する。）、および（４）グロセロ糖脂質（微生物や高等植物に存在するジアシルグリセロールに種々の糖が結合したものなどがある。）に大別することができる。なお、前記（２）スフィンゴリン脂質および（３）のスフィンゴ糖脂質を総称してスフィンゴ脂質と呼ばれる。
【０００４】
前記グリセロリン脂質は、グリセロリン酸を骨格にもつリン脂質の総称で、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファチジルエタノールアミン、ジホスフィチジルグリセロールなどがある。このグリセロリン脂質は、非極性部分が脂肪酸のエステルであるものが多いがビニルエーテル結合をもつプラズマローゲン型のものもある。
【０００５】
このグリセロリン脂質は、生体膜の構成成分として重要であるが、中でもプラズマローゲン型のグリセロリン脂質は、ビニルエーテル結合のラジカル感受性が高いため、抗酸化性を有するリン脂質として、近年注目されている。最近、プラズマローゲン型グリセロリン脂質が、細胞膜の抗酸化性分であるα−トコフェロール（ビタミンＥ）とは異なった機構により、コレステロールを含むリン脂質膜の酸化安定性に寄与していることが報告されており（例えば、非特許文献１参照。）、またプラズマローゲン型グリセロリン脂質は、細胞膜やリポタンパク質の抗酸化性に関与するだけでなく、細胞の情報伝達システムに重要な役割を有することが指摘されている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００６】
このようなプラズマローゲン型グリセロリン脂質は、痴呆症における脳の神経細胞死を防止する作用が期待されているが、安全で大量に入手可能な供給源は見当たらないのが実状である。
【０００７】
一方、スフィンゴ脂質は、スフィンゴシンなどの長鎖塩基をもつ脂質の総称で、前述したように主としてスフィンゴ糖脂質とスフィンゴリン脂質からなる。スフィンゴ糖脂質は、糖と長鎖脂肪酸の外に、長鎖塩基であるスフィンゴシンまたはフィトスフィンゴシン、その他を含むものである。最も単純なスフィンゴ糖脂質は、セレブロシドであるが、さらにそれに硫酸基のついたスルファチド、中性糖が数分子ついたセラミドオリゴヘキソシド、シアル酸のついたガングリオシドなどがある。これらの物質は、細胞表層に存在し、認識機構に関与するものと考えられている。
【０００８】
スフィンゴリン脂質は、セラミド１−リン酸の誘導体とセラミド１−ホスホン酸の誘導体に分けられ、前者ではスフィンゴミエリン、後者ではセラミドシリアチン（セラミドアミノエチルホスホン酸）がよく知られている。
【０００９】
これらのスフィンゴ脂質は、近年、その分解代謝物であるセラミド、スフィンゴシン、スフィンゴシン−１−リン酸などが細胞内の情報伝達に関与することが明らかにされ、注目されている。また、スフィンゴ脂質は、コレステロールなどとともに、「ラフト」と呼ばれる膜微小ドメインの形成に関与し、この微小ドメインが情報伝達の場として重要な役割を果たすことが明らかにされてきたことにより、ますます注目の度を増している。
【００１０】
このようなスフィンゴ脂質は、従来牛脳から抽出され、利用されていたが、安全性の問題から、現在穀物や酵母由来のものが利用されている。しかしながら、これらの穀物や酵母由来のスフィンゴ脂質を構成するスフィンゴイド塩基組成は、哺乳動物のものとは異なるため、ヒト型のスフィンゴ脂質と比べて生体利用性が低いという問題があった。
【００１１】
【非特許文献１】「Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．」、第４４巻、第１６４〜１７１頁（２００３年）
【非特許文献２】「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．」、第１６巻、２６３〜２７２頁；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ２７９〜２８４頁（２００１年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、このような事情のもとで、安全な未利用供給源から、ヒト型スフィンゴ脂質（スフィンゴミエリン）やプラズマローゲン型グリセロリン脂質を簡便に、かつ大量生産可能な技術を開発し、前記のヒト型スフィンゴ脂質（スフィンゴミエリン）やプラズマローゲン型グリセロリン脂質を含む機能性食品素材を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、前記目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、ニワトリ表皮中にヒト型スフィンゴミエリンおよびプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミンが、脱脂肪後の表皮に対して、それぞれ０．０７質量％程度含まれていること、そしてニワトリ表皮に特定の処理を施すことにより、それらを簡便にかつ大量生産し得ることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、
（１） ニワトリ表皮から得られ、ヒト型スフィンゴミエリンおよびプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミンを含むことを特徴とする複合脂質画分、
（２） 上記（１）項に記載の複合脂質画分から単離してなるヒト型スフィンゴミエリン、
（３） 上記（１）項に記載の複合脂質画分から単離してなるプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミン、
（４） 上記（１）項に記載の複合脂質画分を弱アルカリ処理してなる、ヒト型スフィンゴミエリンを主体とするスフィンゴ脂質、
（５） ニワトリ表皮を加熱処理して脱脂したのち、溶剤抽出することを特徴とする上記（１）項に記載の複合脂質画分の製造方法、
（６） ニワトリ表皮を加熱処理して脱脂したのち、溶剤抽出して複合脂質画分を得、次いで弱アルカリ処理することを特徴とする、ヒト型スフィンゴミエリンを主体とするスフィンゴ脂質の製造方法、
（７） 上記（１）項に記載の複合脂質画分、上記（２）項に記載のヒト型スフィンゴミエリン、上記（３）項に記載のプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミンおよび上記（４）項に記載のスフィンゴ脂質の中から選ばれる少なくとも１種を含むことを特徴とする機能性食品素材、
（８） 上記（１）項に記載の複合脂質画分、上記（２）項に記載のヒト型スフィンゴミエリン、上記（３）項に記載のプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミンおよび上記（４）項に記載のスフィンゴ脂質の中から選ばれる少なくとも１種を含むことを特徴とする医薬品素材、および
（９） 上記（１）項に記載の複合脂質画分、上記（２）項に記載のヒト型スフィンゴミエリン、上記（３）項に記載のプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミンおよび上記（４）項に記載のスフィンゴ脂質の中から選ばれる少なくとも１種を含むことを特徴とする化粧品素材、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、安全な未利用供給源としてニワトリ表皮を用い、ヒト型スフィンゴミエリンとプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミンを含む複合脂質画分、この複合脂質画分から単離してなるヒト型スフィンゴミエリンおよびプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミン、並びに該複合脂質画分を弱アルカリ処理してなるヒト型スフィンゴミエリンを主体とするスフィンゴ脂質を提供することができる。
【００１６】
また、本発明によれば、ニワトリ表皮から、前記の複合脂質画分およびヒト型スフィンゴミエリンを主体とするスフィンゴ脂質を、簡便にかつ大量生産することができる。
さらに、本発明によれば、前記のヒト型スフィンゴミエリンやプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミンを含む機能性食品素材、医薬品素材および化粧品素材を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の複合脂質画分は、ニワトリ表皮から得られ、ヒト型スフィンゴミエリンおよびプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミンを含む画分である。
本発明の複合脂質画分に含まれる脂質の種類およびその量比の１例を示すと、以下のとおりである。
質量比
スフィンゴミエリン ： １．０
ホスファチジルエタノールアミン： １．７
ホスファチジルコリン ： １．２
コレステリルグリコシド ： ０．２
【００１８】
スフィンゴミエリンは、セラミドの第一級アルコール性ヒドロキシル基とコリンリン酸がリン酸ジエステル結合したもので、下記の式（Ｉ）
【００１９】
【化１】
【００２０】
（式中、Ｒ−ＣＯは脂肪酸残基を示す。）
の構造を有し、通常動物体の脳組織のみならず、臓器組織にも広く存在する。
【００２１】
本発明におけるニワトリ表皮由来のスフィンゴミエリンを構成するスフィンゴイド塩基は、大部分が４−トランス−スフィンゲニン（スフィンゴシン）であることから、当該スフィンゴミエリンは、生体利用性の高いヒト型スフィンゴミエリンである。
【００２２】
スフィンゴミエリンは、その分解代謝物であるセラミド、スフィンゴシン、スフィンゴシン−１−リン酸などが脂肪内の情報伝達に関与することが明らかにされており、またコレステロールなどとともに、「ラフト」と呼ばれる膜微小ドメインの形成に関与し、この微小ドメインが情報伝達の場として重要な役割を果たすことが明らかにされている。さらに、スフィンゴミエリンは、皮膚の保湿効果や大腸がん予防効果などが期待されている。
【００２３】
一方、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）は、その約９４質量％がプラズマローゲン型であり、このように高濃度でプラズマローゲン型が含まれることは予想外であった。また、ホスファチジルコリン（ＰＣ）にも約１４質量％のプラズマローゲン型が含まれている。
【００２４】
下記の式（II）および式（III）に、それぞれジアシル型グリセロリン脂質およびプラズマローゲン型グリセロリン脂質の構造を示す。
【００２５】
【化２】
【００２６】
通常のグリセロリン脂質（レクチン）は、式（II）で示されるようにグリセロールのｓｎ−１（１位）に脂肪酸アシル基とのエステル結合をもつが、プラズマローゲン型は、式（III）で示されるようにグリセロールのｓｎ−１にアルケニル基をもつビニルエーテル結合を有している。
なお、Ｘがアミノエチル基である場合、ホスファチジルエタノールアミンであり、Ｘがトリメチルアミノエチル基である場合、ホスファチジルコリンである。
【００２７】
前記プラズマローゲン型グリセロリン脂質は、ビニルエーテル結合のラジカル感受性が高いため抗酸化性リン脂質として注目されており、コレステロールを含むリン脂質膜の酸化安定性に寄与していることが知られている。またプラズマローゲン型グリセロリン脂質は、細胞膜やリポタンパク質の抗酸化性に関与するだけでなく、細胞の情報伝達システムに重要な役割を有することが指摘されている。このようなプラズマローゲン型グリセロリン脂質は、痴呆症における脳の神経細胞死を防止する作用や、アテローム性動脈硬化症の発症予防効果などが期待されている。
【００２８】
前記コレステリルグリコシドは、脂質ではなくコレステロール配糖体であり、その約６０質量％がガラクトース型で、約４０質量％がグリコース型である。このコレステリルグリコシドは消化器潰瘍形成抑制効果が期待されている。
【００２９】
このように、ニワトリ表皮から得られた複合脂質画分は、人体に有効な生理活性を有する種々の成分が含まれており、また、供給源がニワトリ表皮であって安全であることから、機能性食品素材、医薬品素材および化粧品素材として有用である。
【００３０】
本発明はまた、前記の複合脂質画分を、公知の方法、例えば下記の方法などにより単離して得られたヒト型スフィンゴミエリンおよびプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミンをも提供する。
【００３１】
＜複合脂質画分より、各複合脂質の単離方法＞
（１） エタノール法
複合脂質画分にエタノールを加え、加熱溶解後、冷却し、生成した沈殿をろ過、乾燥して固体状の粗スフィンゴミエリンを得る。
一方、エタノールを蒸発乾固して粗ホスファチジルコリンとホスファチジルエタノールアミン混合物を得る。
（２） エーテル法
複合脂質画分をエチルエーテルで抽出を行い、エーテル相を蒸発乾固して、ホスファチジルコリンとホスファチジルエタノールアミンの混合物を得る。
一方、エーテル不溶部を乾固して粗スフィンゴミエリンを得る。
（３） 粗画分の精製
（イ）スフィンゴミエリン：弱アルカリ処理でリン脂質を除去し、純度を上げることができる。
（ロ）ホスファチジルエタノールアミン：ケイ酸カラムで分画する。
（ハ）ホスファチジルコリン：ケイ酸カラムで分画する。
これらの脂質は、機能性食品素材、化粧品素材、医薬品素材などとして有用である。
【００３２】
さらに、当該複合脂質画分を弱アルカリ処理してなる、ヒト型スフィンゴミエリンを主体とするスフィンゴ脂質をも提供する。複合脂質画分における各脂質の中で、スフィンゴミエリンは、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリンに比べて、アルカリに対する安定性が高い（加水分解されにくい。）ので、スフィンゴミエリンができるだけ加水分解されず、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリンが加水分解される条件でアルカリ処理することにより、ヒト型スフィンゴミエリンを主体とするスフィンゴ脂質を得ることができる。
【００３３】
このヒト型スフィンゴミエリンを主体とするスフィンゴ脂質は、機能性食品素材、化粧品素材、医薬品素材などとして有用である。
前記複合脂質画分は、以下に示す本発明の方法に従えば、簡便にかつ生産性よく製造することができる。
【００３４】
本発明の方法においては、まずニワトリ表皮を加熱処理して脱脂したのち、溶剤抽出することにより、複合脂質画分を製造する。
ニワトリ表皮の脱脂処理には、機械的方法、温水浸漬加熱方法、直接加熱方法などを採用することができるが、本発明の方法においては、効果および生産性などの面から、直接加熱し、脂肪分を除去する方法が用いられる。
【００３５】
この際の加熱処理条件としては、脂肪分を効果的に除去し、かつ複合脂質ができるだけ分解しない条件を選択することが肝要である。処理条件としては、例えば５００Ｗの電子レンジを用いて処理する場合、処理時間は３〜２０分程度、好ましくは５〜１０分である。この脱脂処理により、全脂質の３０〜６０質量％程度を除去することが好ましく、特に４０〜５０質量％除去することが好ましい。
【００３６】
次に、このようにして脱脂処理されたニワトリ表皮を溶剤抽出処理に付す。溶剤としては、食品衛生上安全であって、かつ抽出効率のよいものが用いられる。このような溶剤としては、特にエタノールが好適である。この抽出処理は、常法に従って行うことができる。
【００３７】
このようにして、複合脂質画分を含む抽出液が得られる。この抽出液は、適当な濃度に調整して、複合脂質含有溶液としてもよく、また溶剤を除去して、複合脂質混合物としてもよい。
【００３８】
また、前記のようにして得られた複合脂質画分を含む抽出液を、例えば０．１〜１モル／Ｌ程度、好ましくは０．３〜０．６モル／Ｌ濃度の水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウム、好ましくは水酸化カリウムを、混入リン脂質中のグリセライド結合に対し、３〜１０倍モル量用い、少量のエタノールの存在下に、通常０〜共沸温度、好ましくは２０〜６０℃の温度で３０〜３００分程度、好ましくは６０〜１２０分アルカリ処理することにより、ヒト型スフィンゴミエリンを主体とするスフィンゴ脂質を製造することができる。
【００３９】
アルカリ処理後、塩酸などの酸を用いて中和することにより、ヒト型スフィンゴミエリンを含む粗製のスフィンゴ脂質を含む溶液が得られる。
この溶液に、常法に従って精製処理を施すことにより、ヒト型スフィンゴミエリンを含む精製スフィンゴ脂質を得ることができる。
【００４０】
本発明はまた、前述の複合脂質画分、この画分から単離されたヒト型スフィンゴミエリンやプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミン、および前記複合脂質画分を弱アルカリ処理してなる、ヒト型スフィンゴミエリンを含むスフィンゴ脂質の中から選ばれる少なくとも１種を含む機能性食品素材をも提供する。
この機能性食品素材には、所望により、ビタミンＥなどの安定化剤や、各種の健康食品素材などを配合することができる。
【実施例】
【００４１】
次に、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの例によってなんら限定されるものではない。
実施例１ ニワトリ表皮部の脱油処理
（１）産卵成鶏表皮部の裁断およびその脂肪除去処理後の脂質成分の分析と定量
産卵成鶏の裁断表皮部とその脱脂処理（機械的脂肪除去と温水浸漬加熱）品の全脂質量および中性脂質と複合脂質の割合を表１に示す。なお、機械的脂肪除去は木製のへらで掻き取る方法で行い、温水浸漬加熱処理は、６０℃の温水中に９０分間浸漬することにより行った。
【００４２】
【表１】
【００４３】
表１から分かるように、中性脂質と複合脂質との割合は、機械的脂肪除去法が有効で、他に比べて１．５倍に向上する。
【００４４】
全脂質と複合脂質およびそのアルカリ処理生成脂質（アルカリ処理条件：０．５モル／Ｌの水酸化カリウムを用い、４０℃で１２０分加熱）に関するケイ酸薄層クロマトグラムを図１に示した。全脂質は殆ど中性脂質であるが、複合脂質画分にはスフィンゴミエリン（ＳＭ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）及びホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）が、このアルカル処理画分にはコレステロールグルコシド（ＣＧ）とセレブロシドが含まれていることが判明した（図１）。
【００４５】
（２）電子レンジによるブロイラー表皮部の脱脂処理法
（ａ）電子レンジ加熱処理によるブロイラー皮部から油脂分の除去
鶏肉専門店（帯広市）で購入したブロイラー（以下、「ニワトリ」ということがある。）の皮部をビーカーに入れて電子レンジ（シャープ（株）、ＲＥ８７−ＨＳＰ型 ５００Ｗ）で3分から20分加熱処理した皮部の融出油脂量と残存脂質量を表２に示す。皮部100g当たりの融出油脂量は13〜24ｇで、処理時間の長短による違いはなくまた、残存脂質量も13〜16gであった。
【００４６】
【表２】
【００４７】
5分および20分の加熱処理融出油脂成分をケイ酸TLCで分析した（図２ レーン4と6）が、いずれも実質的にトリアシルグリセロール（以下、「ＴＧ」ということがある。）のみで、複合脂質（Aの展開条件では原点物質）は見られなかった。また、加熱処理後の残存脂質成分からは、複合脂質群も検出されたが（レーン12と13）、この場合もＴＧが大部分を占めていた（レーン5と7）。なお、供試皮部中（レーン11）には主要複合脂質としてホスファチジルエタノールアミン（スポットA）、ホスファチジルコリン（スポットB）およびスフィンゴミエリン（スポットC）が確認された。
【００４８】
なお、図２において、各レーンは以下のとおりである。
１：ジアシルグリセロール（標準品）
２：老ニワトリ表皮からの全脂質
３と１１：ニワトリ皮部の全脂質
４：ニワトリ皮部の加熱処理（５分間）によって溶け出した油脂
５と１２：ニワトリ皮部の加熱処理（５分間）後に残っていた全脂質
６：ニワトリ皮部の加熱処理（２０分間）によって溶け出した油脂
７と１３：ニワトリ皮部の加熱処理（２０分間）後に残っていた全脂質
８：ホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルコリン（標準品）
９：セレブロシド（標準品）
１０：スフィンゴミエリン（標準品）
【００４９】
また、展開溶媒および検出試薬は、以下のとおりである。
展開溶媒：ヘキサン−ジエチルエーテル−酢酸（８０：３０：１,ｖ／ｖ）［Ａ］
クロロホルム−メタノール−水（６５：２５：４,ｖ／ｖ）［Ｂ］
検出試薬：５０％Ｈ２ＳＯ４
【００５０】
（ｂ）逆相HPLCによるブロイラー皮部の加熱処理融出油脂分と加熱処理後残存ＴＧの成分パターンの解析評価
図３に、供試ブロイラー皮部中のＴＧの逆相HPLCパターン（A ）と加熱処理融出油脂および加熱処理後の残存ＴＧの逆相HPLCパターンを示す。5分と20分の加熱処理による差は無く、融出ＴＧ種の各ピークの割合はB（5分処理）とD（20分処理）ではほぼ同じであった。また、融出ＴＧ（BとD）と残存ＴＧ（CとE）を比較すると、後者では図３中の領域（ロ）以降のピークの割合が前者よりも少し多い傾向が見られた。
この結果、皮部の当該処理によって有意な複合脂質量の混入はないことが判明し、当該処理が皮部の脱油に有効であることが実証された。
【００５１】
なお、図３において、各符号は次のとおりである。
Ａ：ニワトリ皮部のトリアシルグリセロール
Ｂ：電子レンジによる５分間の加熱によって溶け出したもの
Ｃ：５分間の加熱処理後に残っていたもの
Ｄ：電子レンジによる２０分間の加熱によって溶け出したもの
Ｅ：２０分間の加熱処理後に残っていたもの
【００５２】
（ｃ）加熱処理条件と皮部に残存する複合脂質成分の検定
加熱処理後の残存複合脂質画分のケイ酸TLCを図４に示す。5分間の電子レンジ処理後の残存複合脂質のケイ酸TLCのパターン（レーン3）は、未加熱状態からの抽出全脂質のそれ（図２のレーン11）と同様で、主要成分としてホスファチジルエタノールアミン（スポットA）、ホスファチジルコリン（スポットB）およびスフィンゴミエリン（スポットC）が検出された。
【００５３】
20分間加熱処理した皮部から抽出された全脂質中の複合脂質画分のパターン（レーン5）は5分処理の場合（レーン3）とは異なり、スポットGの割合が高く、逆にＰＥとＳＰＭに相当するスポットが相対的に減少した。これは、20分の加熱処理中に皮部中のＰＥが既に分解されていたことを示唆する。一方、ＰＣは、電子レンジ処理に対してＰＥよりも比較的安定で、ほとんど分解されないことが示唆された。
【００５４】
なお、図４において、各レーンは以下のとおりである。
１：ホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルジリコン（標準品）
２：スフィンゴミエリン（標準品）
３：ニワトリ皮部の電子レンジによる加熱処理（５分間）後に残っていた
複合脂質
４：３の弱アルカリ処理物
５：ニワトリ皮部の電子レンジによる加熱処理（２０分間）後に残っていた
複合脂質
６：５の弱アルカリ処理物
【００５５】
また、展開溶媒および検出試薬は、以下のとおりである。
展開溶媒：クロロホルム−メタノール−水（６５：２５：４,ｖ／ｖ）
検出試薬：５０％Ｈ２ＳＯ４
【００５６】
以上の結果、電子レンジ（５００Ｗ）加熱処理によるニワトリ皮部から複合脂質群を効率的に分離調製する条件は、２０分未満が好ましく、２０分では一部の複合脂質が分解することが判明した。
（ａ）および（ｂ）の結果から、家禽類の主要種のブロイラーと産卵成鶏の何れの表皮部にも、ＰＥ，ＰＣ及びＳＰＭが含まれており、これらの抽出原料となることが確認された。
【００５７】
実施例２ 脱油後の産卵成鶏表皮部から複合脂質画分の分離とその組成検定
電子レンジ加熱処理（５００Ｗ電子レンジで１５分間加熱）で油分を約1/2除去した表皮部からエタノール抽出により複合脂質画分を３質量％濃度で調製した。該画分の組成は、ホスファチジルエタノールアミン（PE）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびスフィンゴミエリン（SPM）並びにコレステリルグルコシド（ＣＧ）であった。
当該複合脂質画分は、それ自身又はビタミンＥ等の安定化剤を添加した組成物で、複合機能性食品因子として、又、化粧品素材や医薬品素材としても有用性が高い。
【００５８】
実施例３ ホスファチジルエタノールアミン（PE）、およびスフィンゴミエリン（SPM）の分離とその構造検定
（１）複合脂質のリン脂質群の検定とその定量
（ａ）ＳＰＭの定量
上記分離複合脂質画分をクロロホルム-メタノール（質量比2 : 1）に溶解し、光散乱検出器付順相HPLCに供してスフィンゴミエリンを定量した。HPLCの操作条件は、カラムにはＬｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ Ｓｉ６０（５μ×２００ｍｍ、メルク社製）、溶離液には溶媒Aとしてクロロホルムを、溶媒Bとしてメタノール-水（質量比95 : 5）を用い、A : B（質量比99 :1）を15分までに75 : 25の割合、25分までに10 : 90の割合、次いで35分までに5：95、次いで40分から45分までに99 : 1の割合とする、2液グラジュエントを行った。流速は1.0 ml/minとした。
【００５９】
産卵成鶏表皮部から調製した複合脂質画分およびその弱アルカリ処理物（処理条件：０．５モル／Ｌの水酸化カリウムを用い、４０℃で１２０分加熱）を順相HPLCに供した結果を図５に示す。標準の牛脳から分離したスフィンゴミエリンはHPLC上で2つのピークに分れたが、産卵成鶏表皮の複合脂質画分でもそれと同じ保持時間を有するピーク群（両ピークを合わせてピーク４と表示）が観察された。ピーク4は、弱アルカリ処理後にも検出されたことから、スフィンゴミエリンであると判断された。主要なピーク2と3は、2次元ケイ酸TLC分析の結果（図６）を考え合わせると、それぞれホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルコリンと推定される。また、弱アルカリ処理後に残存するピーク１群にはセレブロシド（スフィンゴミエリンのアルカリ加水分解生成物に相当）とコレステリルグルコシドが含まれる。
産卵成鶏表皮（脂肪除去試料）中のスフィンゴミエリン量は、検量線から算出すると、複合脂質の21質量％を占め、試料（脂肪除去したもの）1g当たりでは0.7mgであった。
【００６０】
なお、図５において、測定条件および各符号は以下のとおりである。
Ａ：産卵成鶏表皮の複合脂質
Ｂ：Ａのアルカリ処理物
Ｃ：標準スフィンゴミエリン
【００６１】
測定条件
カラム：ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ Ｓｉ６０
カラム温度：３５℃
溶離液：前出
【００６２】
また、図６における展開溶媒および検出試薬は以下のとおりである。
Ａ：展開溶媒
１次元目 クロロホルム−メタノール−酢酸（６５：２５：１０,ｖ／ｖ）
２次元目 クロロホルム−メタノール−蟻酸（６５：２５：１０,ｖ／ｖ）
検出試薬 Ｄｉｔｔｍｅｒ試薬
Ｂ：展開溶媒
１次元目 クロロホルム−メタノール−２５％アンモニア
（６５：３５：８,ｖ／ｖ）
２次元目 クロロホルム−アセトン−メタノール−酢酸−水
（５０：２０：１０：１０：５,ｖ／ｖ）
検出試薬 ５０％Ｈ２ＳＯ４
【００６３】
（ｂ）ＰＥ及びＰＣとＣＧの定量
同様にして、ホスファチジルエタノールアミン（PE）(含有率３５質量％)、及びホスファチジルコリン（PC）（含有率２５質量％）並びにＣＧ（含有率５質量％）が得られた。
【００６４】
実施例４
上記分離複合脂質画分０．５ｇを、分取用高性能液体クロマトグラフ装置に供してホスファチジルエタノールアミン（PE）１７０ｍｇ、ホスファチジルコリン（PC）２２０ｍｇおよびスフィンゴミエリン（SPM）１００ｍｇ並びにコレステロールグルコシド（ＣＧ）２０ｍｇ、各々相当する画分に分離した。
【００６５】
実施例５ ＰＥおよびＳＰＭの構造解析
（１）ＰＥの構造同定
（ａ）プラズマローゲン型の確認
分離複合脂質画分をメタノリシスし、そのヘキサン抽出物をGC分析した結果、少なくとも16種の脂肪酸メチルエステルと3種のジメチルアセタールのピークが検出された。脂肪酸メチルエステルとジメチルアセタールの量比は、極性脂質画分全体では（質量比、以下同様）89 : 11、PEでは54 : 46、またPCでは94 : 6であった（表 ３）。このことから、ジメチルアセタールの大部分はPEに由来することが明らかになった。仮にPEが1,2-ジアシル型と1-アルケニル、2-アシル型の2種から構成されていると仮定すると、1-アルケニル、2-アシル型（プラズマローゲン）が全体の94質量％を占め、残りの6質量％がジアシル型となる。一方、PCでは全体の14質量％がプラズマローゲンと判断される。
【００６６】
【表３】
【００６７】
（ｂ）ニワトリ表皮中のプラズマローゲンのアルケニル基由来のジメチルアセタールの組成解析とその同定
ニワトリ表皮の極性脂質画分、PEおよびPCをメタノール性5質量％HCl液とともに100℃で3時間メタノリシスして得られるジメチルアセタールの組成を表４に示す。いずれの脂質でも炭素数16と18の飽和型および炭素数18のモノエン型が認められた。そのうち、PEでは18:0が過半を占め、次いで16:0、18:1の順で多く含まれていた。一方、PCでは16:0が70質量％で、18:0は25質量％であった。
【００６８】
【表４】
【００６９】
（２）ＳＰＭの構造解析と同定
（ａ）スフィンゴ脂質構成分の同定
構成脂肪酸の分析では、複合脂質画分の弱アルカリ処理物をメタノール性質量5％HClとともに100℃で3時間、メタノリシスした。遊離した脂肪酸メチルエステルをヘキサンで抽出し、これをヘキサン-ジエチルエーテル（質量比85：15）によるケイ酸薄層クロマトグラフィー（TLC）に供してノルマル脂肪酸（非置換酸）メチルおよび2-ヒドロキシ脂肪酸メチルに分別し、前者はそのまま、後者はアセチル誘導体に転換してからGC-MS分析に供した。当該ヘキサン抽出物をケイ酸TLCに供した結果を図７に示す。主要な2つのスポット（1と2）が検出され、ヒドロキシ脂肪酸メチルエステルのスポット（3）は僅かであった。また、スポット4は、コレステロールグルコシドの構成ステロールに由来するものである。スポット1と2をそれぞれ分離してGCに供した結果を図８に示す。スポット1では、14:0から24:2までの脂肪酸メチルエステルのピークが検出され、その他に18:0のジメチルアセタール（DMA）のピークが僅かに見られた（図８-B）。スポット2では、16:0、18:0および18:1の3種のジメチルアセタールのピークが主として検出された（図８-C）。これらのことから、スポット1はスフィンゴ脂質の構成脂肪酸に由来する脂肪酸メチルエステルであり、スポット2はプラズマローゲンタイプのリン脂質に由来するジメチルアセタールであると判断される。また、スポット3を分取し、アセチル化してからGC分析したところ、炭素数18から26までの飽和の2-ヒドロキシ脂肪酸メチルエステルが検出された（図８-D）。なお、図８-Aはヘキサン抽出物全体のアセチル化物のガスクロマトグラムである。図７のケイ酸TLC分析の結果と符号して、スフィンゴ脂質の構成脂肪酸としては非置換酸（ノルマル酸）が大部分を占め、ヒドロキシ脂肪酸は微量成分であることが確認された。
【００７０】
なお、図８における各符号は以下のとおりである。
Ａ：全ヘキサン抽出物（アセチル誘導体化後にＧＣへ注入）
Ｂ：図１のスポット１
Ｃ：図１のスポット２（ジメチルアセタール，ＤＭＡと略記）
Ｄ：図１のスポット３のアセチル誘導体
【００７１】
構成スフィンゴイド塩基の分析では、アルカリ安定性の複合脂質画分を含水メタノール性1MHClとともに80℃で18時間、分解した。分解液をヘキサンで抽出後、残液をアルカリ性にしてからジエチルエーテルで遊離したスフィンゴイド塩基を抽出した。これをクロロホルム-メタノール-2N アンモニア水（80：20 : 2）によるケイ酸TLCに供してジヒドロキシ塩基とトリヒドロキシ塩基に分別してから、それぞれを過ヨウ素酸酸化して脂肪性アルデヒドに誘導した後、GC-MS分析を行った。GC-MSは島津製作所製QP-2010型ガスクロマトグラフ-質量分析計を用いて行った。各成分の分離には、極性キャピラリーカラム（CP-Sil 88）を使用した。
【００７２】
通常、スフィンゴ脂質の構成脂肪酸は飽和脂肪酸とモノエン脂肪酸であることから、24:2の脂肪酸ピークを確認するために質量スペクトルを解析した。図９には、比較のために24:0（リグノセリン酸）と24:1（ネルボン酸）の質量スペクトルも記載した。各スペクトルにおいて、分子イオンがm/z 382、380および378に検出され、それぞれ24:0、24:1および24:2の脂肪酸メチルであることが示された。また、不飽和タイプでは、メチルエステルに特徴的なM―32とM―74のイオンも観察された。
【００７３】
表５にニワトリ表皮から調製したスフィンゴ脂質画分のノルマル型とヒドロキシ型の構成脂肪酸の組成を示す。主要なノルマル脂肪酸はパルミチン酸（16:0）、ネルボン酸（24:1）およびステアリン酸（18:0）、特にパルミチンであった。一方、ヒドロキシ脂肪酸としては超長鎖型が多く、その中で２-ヒドロキシリグノセリン酸（24h:0）の割合が最も高かった。
【００７４】
【表５】
【００７５】
（ｂ）産卵成鶏表皮に含まれるスフィンゴ脂質の構成スフィンゴイド塩基の同定
該表皮のスフィンゴ脂質を構成するスフィンゴイド塩基画分をケイ酸TLCに供した結果を図１０に示す。図中のAの領域には、酸分解で生じたスフィンゴイド塩基の副産物である3-O-メチルスフィンゴイド塩基などが展開されることが知られている。主要スポットは4-トランス-スフィンゲニン（スフィンゴシン）とスフィンガニン（ジヒドロスフィンゴシン）に相当するBの領域（酸分解によって天然のエリスロ型と副産物のスレオ型が生成し、両者はダルマ状のスポットに分離される）に観察され、標準の4-ヒドロキシスフィンガニン（フィトスフィンゴシン）と同じRfの領域（C）には明瞭なニンヒドリン試薬陽性のスポットは観察されなかった。
【００７６】
図１０のBとCの領域を分取し、過ヨウ素酸酸化を行って脂肪性アルデヒドに誘導してからGC-MSに供した結果を図１１に示す。全イオンクロマトグラムからアルデヒドピークとして、図１０のB領域からはピーク1〜3の3種が、またCの領域からはわずかにピーク4が検出された。それらは保持時間と質量スペクトルから、スフィンガニンに由来する16:0アルデヒド（ピーク1）、4-トランス-スフィンゲニンに由来する16:1(2t)アルデヒド（ピーク2）、4-トランス-スフィンゲニンのC22同族体に由来する20:1(2t)アルデヒド（ピーク3）および4-ヒドロキシスフィンガニンに由来する15:0アルデヒド（ピーク4）と判定された。なお、図１０のC領域にはスポットが検出できなかったが、ピーク4の質量スペクトル（図１１）では15:0アルデヒドであることを示すM―18、M―44および M―46のイオンがそれぞれm/z 208、182および180に検出された。このことは、超微量の4-ヒドロキシスフィンガニンも存在することを意味している。なお、ニワトリの餌中に含まれると推測される植物性の4-トランス,8-トランス（およびシス）-スフィンガジエニンに由来する16:2アルデヒドに相当するピークは検出されなかった。
【００７７】
なお、図１０において、各レーンおよび展開溶媒、検出試薬は以下のとおりである。
レーン１：フィトスフィンゴシン（４−ヒドロキシスフィンガニン、標品）
レーン２：産卵成鶏表皮由来のスフィンゴイド塩基画分
レーン３：スフィンゴシン（４−トランス−スフィンゲニン、標品）
【００７８】
展開溶媒：クロロホルム−メタノール−２Ｎアンモニア水
（８０：２０：２，ｖ／ｖ）
検出試薬：ニンヒドリン
【００７９】
以上の結果から、ニワトリ表皮のスフィンゴ脂質の構成スフィンゴイド塩基は大部分が4-トランス-スフィンゲニン（スフィンゴシン）であることから、このスフィンゴミエリンは生体利用性の高いヒト型スフィンゴミエリンであることが確認された。
更に、リン脂質群において、ＰＥには、94%という驚くべき高濃度でプラズマローゲン型が、ＰＣにも14%のプラズマローゲン型が含まれている。
【００８０】
表皮中の脂質成分はほとんどトリアシルグリセロールであり、これを電子レンジ等で適宜に除去すれば、プラズマローゲンとスフィンゴミエリンを高濃度に含む機能性脂質素材が生産できることになる。
【００８１】
実施例６ ＳＰＭの機能性評価
（１）ＳＰＭの生体利用性
分化Ｃａｃｏ−２細胞を２１日間培養してモノレイヤーを形成させた後、5μmol/Lスフィンゴ塩基を添加した無血清ＤＭＥＭにインキュベートした。所定時間毎にスフィンゴイド塩基のＣａｃｏ−２細胞への取り込みを植物及び動物起源で比較した。その結果、図１２に示した様に、植物や真菌中のスフィンゴイド塩基は殆ど吸収されず生体利用性が極めて低いことが該モデル系実験で明らかにされた。図中、d18:24t,8cは4,8-Sphingadienine、
及びd18:24t,8tは4,8-Sphingadienieで光学異性体の植物由来、一方、d18:14は4-Sphingenine（Sphingosine）で動物由来である。
【００８２】
（２）スフィンゴミエリンの皮膚再生におよぼす効果
＜材料と方法＞
・対象動物：7〜9週齢ICR雄マウス
・顕微鏡的観察：クリオスタット標本のH・E染色とラット抗マウスCD68モノクロナール抗体を用いた免疫染色による真皮マクロファージの観察
【００８３】
（１）実験例１
マウス背側剃毛皮膚に中波紫外線UV-Bを50mJ / cm2照射すると、マウス表皮の２列立方上皮が３日後には重層扁平上皮が変化した。この皮膚を顕微鏡的に観察すると、マクロファージが表皮直下の真皮に多数集積していた。重層扁平上皮化した表皮細胞は照射５日後にはアポト−シスによって除去され、7〜10日間でマウス本来の２列立方上皮になった。
UV-B照射で重層扁平上皮化したマウス表皮がスフィンゴミエリンを種々の濃度（1、10、100mg）で塗布したところ、10mg及び100mg塗布で回復が加速される所見が得られ、同時に、マクロファージの消長などに関して組織学的ならびに免疫組織化学的に検索した結果もこれを裏づけた。
【００８４】
（２）実験例２
照射UV-Bを100mJ / cm2照射すると火傷が生じる。紫外線照射直後にスフィンゴミエリンを実験１と同様の濃度で塗布したところ、火傷皮膚の修復に対するスフィンゴミエリンの塗布効果が10mg及び100mg塗布で観察された。
【００８５】
実施例７ 食素材及び食品への応用；処方例
処方例１ 濃縮混合物の顆粒処方
実施例２で調製した複合脂質混合物0.5mg , ビタミンＥ0.1mgと、ショ糖脂肪酸エステル、還元麦芽糖、還元パラチノース、ビートオリゴ糖、デキストリン、リン酸三カルシウム、等の乳化剤・結合剤等賦形剤1000mgから、常法通り流動層造粒方式により顆粒を調製した。
【００８６】
処方例２ スフィンゴミエリンの顆粒処方
実施例４で調製したスフィンゴミエリン0.1mg、ビタミンＥ0.02mg、ショ糖脂肪酸エステル、還元麦芽糖、還元パラチノース、ビートオリゴ糖、デキストリン、リン酸三カルシウム、等の乳化剤・結合剤等賦形剤1000mgから、常法通り流動層造粒方式により顆粒を調製した。
【００８７】
処方例３ プラズマローゲン型エホスファチジルエタノールアミンの顆粒処方
実施例４で調製したプラズマローゲン型ホスファチジルエタノールアミン0.1mg、ビタミンＥ0.02mg、ショ糖脂肪酸エステル、還元麦芽糖、還元パラチノース、ビートオリゴ糖、デキストリン、リン酸三カルシウム、等の乳化剤・結合剤等賦形剤1000mgから、常法通り流動層造粒方式により顆粒を調製した。
【００８８】
実施例７ 医薬品及び化粧品への応用処方例
処方例１ 医薬品用錠剤；スフィンゴミエリン
実施例４で調製したスフィンゴミエリン10mg、ビタミンＥ2mg、ショ糖脂肪酸エステル、還元麦芽糖、還元パラチノース、ビートオリゴ糖、デキストリン、リン酸三カルシウム、等の乳化剤・結合剤等賦形剤988mgから、常法通り流動層造粒方式により顆粒を調製した。この顆粒に乳化剤を加えて充分に混合して常法により250mg錠に打錠する。
同様にしてプラズマローゲン型エホスファチジルエタノールアミンの顆粒から、250mgの錠剤を打錠した。
【００８９】
処方例２ 化粧品用乳液；スフィンゴミエリン
（油 相）
スクワラン 15.0%
ワセリン 7.0
ステアリルアルコール 3.0
ステアリン酸 3.0
グリセリンモノステアレート 3.0
ポリアクリル酸エチル 0.5
スフィンゴミエリン（実施例４で調製） 0.5
酸化防止剤 適量
防腐剤 適量
香料 適量
（水 相）
精製水 61.0
1,3 ブチレングリコール 7.0
油相部と水相部をそれぞれ70℃に加熱し溶解させる。水相部に油相部を加え、ホモジナイザーを用いて乳化する。乳化液を熱交換器を用いて冷却してO/Wの乳液を得た。
同様にして、実施例２で調製した複合脂質混合物を用いて、乳液を得た。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明によれば、安価な未利用資源であるニワトリ表皮から、食品分野、化粧分野、医薬品分野などにおいて有用なヒト型スフィンゴ脂質やプラズマローゲン型グリセロリン脂質などを、簡単にかつ大量生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】産卵成鶏表皮部中の脂質成分のケイ酸薄層クロマトグラムである。
【図２】ブロイラー表皮部の電子レンジ加熱によって溶け出した油脂および加熱処理後の皮部から抽出した脂質のケイ酸薄層クロマトグラムである。
【図３】ブロイラー表皮部中のトリアシルグリセロールの逆相ＨＰＬＣチャートである。
【図４】ニワトリ表皮部中の複合脂質成分の薄層クロマトグラムである。
【図５】産卵成鶏表皮部中の複合脂質およびそのアルカリ安定脂質のＨＰＬＣチャートである。
【図６】産卵成鶏表皮部から調製した複合脂質画分の２次元薄層クロマトグラムである。
【図７】産卵成鶏表皮部から調製した複合脂質画分の弱アルカリ処理物の構成脂肪酸を示すケイ酸薄層クロマトグラムである。
【図８】産卵成鶏表皮部中の弱アルカリ安定複合脂質画分のメタノリシス後のヘキサン抽出物のＧＣ−ＭＳチャートである。
【図９】産卵成鶏表皮部中のスフィンゴ脂質の構成脂肪酸を示すＧＣ−ＭＳチャートである。
【図１０】産卵成鶏表皮部中のスフィンゴ脂質を構成するスフィンゴイド塩基画分のケイ酸薄層クロマトグラムである。
【図１１】産卵成鶏表皮部中のスフィンゴ脂質を構成するスフィンゴイド塩基に由来するアルデヒドのＧＣ−ＭＳチャートである。
【図１２】分化Ｃａｃｏ−２細胞でのスフィンゴイド塩基の取り込みを、ニワトリ表皮由来のものと、植物起源および動物起源のものとを比較した結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニワトリ表皮から得られ、ヒト型スフィンゴミエリンおよびプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミンを含むことを特徴とする複合脂質画分。
【請求項２】
請求項１に記載の複合脂質画分から単離してなるヒト型スフィンゴミエリン。
【請求項３】
請求項１に記載の複合脂質画分から単離してなるプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミン。
【請求項４】
請求項１に記載の複合脂質画分を弱アルカリ処理してなる、ヒト型スフィンゴミエリンを主体とするスフィンゴ脂質。
【請求項５】
ニワトリ表皮を加熱処理して脱脂したのち、溶剤抽出することを特徴とする請求項１に記載の複合脂質画分の製造方法。
【請求項６】
ニワトリ表皮を加熱処理して脱脂したのち、溶剤抽出して複合脂質画分を得、次いで弱アルカリ処理することを特徴とする、ヒト型スフィンゴミエリンを主体とするスフィンゴ脂質の製造方法。
【請求項７】
請求項１に記載の複合脂質画分、請求項２に記載のヒト型スフィンゴミエリン、請求項３に記載のプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミンおよび請求項４に記載のスフィンゴ脂質の中から選ばれる少なくとも１種を含むことを特徴とする機能性食品素材。
【請求項８】
請求項１に記載の複合脂質画分、請求項２に記載のヒト型スフィンゴミエリン、請求項３に記載のプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミンおよび請求項４に記載のスフィンゴ脂質の中から選ばれる少なくとも１種を含むことを特徴とする医薬品素材。
【請求項９】
請求項１に記載の複合脂質画分、請求項２に記載のヒト型スフィンゴミエリン、請求項３に記載のプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミンおよび請求項４に記載のスフィンゴ脂質の中から選ばれる少なくとも１種を含むことを特徴とする化粧品素材。
【請求項１】
ニワトリ表皮から得られ、ヒト型スフィンゴミエリンおよびプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミンを含むことを特徴とする複合脂質画分。
【請求項２】
請求項１に記載の複合脂質画分から単離してなるヒト型スフィンゴミエリン。
【請求項３】
請求項１に記載の複合脂質画分から単離してなるプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミン。
【請求項４】
請求項１に記載の複合脂質画分を弱アルカリ処理してなる、ヒト型スフィンゴミエリンを主体とするスフィンゴ脂質。
【請求項５】
ニワトリ表皮を加熱処理して脱脂したのち、溶剤抽出することを特徴とする請求項１に記載の複合脂質画分の製造方法。
【請求項６】
ニワトリ表皮を加熱処理して脱脂したのち、溶剤抽出して複合脂質画分を得、次いで弱アルカリ処理することを特徴とする、ヒト型スフィンゴミエリンを主体とするスフィンゴ脂質の製造方法。
【請求項７】
請求項１に記載の複合脂質画分、請求項２に記載のヒト型スフィンゴミエリン、請求項３に記載のプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミンおよび請求項４に記載のスフィンゴ脂質の中から選ばれる少なくとも１種を含むことを特徴とする機能性食品素材。
【請求項８】
請求項１に記載の複合脂質画分、請求項２に記載のヒト型スフィンゴミエリン、請求項３に記載のプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミンおよび請求項４に記載のスフィンゴ脂質の中から選ばれる少なくとも１種を含むことを特徴とする医薬品素材。
【請求項９】
請求項１に記載の複合脂質画分、請求項２に記載のヒト型スフィンゴミエリン、請求項３に記載のプラズマローゲン型のホスファチジルエタノールアミンおよび請求項４に記載のスフィンゴ脂質の中から選ばれる少なくとも１種を含むことを特徴とする化粧品素材。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２００６−２３２９６７（Ｐ２００６−２３２９６７Ａ）
【公開日】平成１８年９月７日（２００６．９．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−４８６１５（Ｐ２００５−４８６１５）
【出願日】平成１７年２月２４日（２００５．２．２４）
【出願人】（５９９０４６２５４）有限会社梅田事務所 (11)
【出願人】（５０４３０００８８）国立大学法人帯広畜産大学 (96)
【出願人】（５９９０３５３３９）株式会社 レオロジー機能食品研究所 (16)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年９月７日（２００６．９．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月２４日（２００５．２．２４）
【出願人】（５９９０４６２５４）有限会社梅田事務所 (11)
【出願人】（５０４３０００８８）国立大学法人帯広畜産大学 (96)
【出願人】（５９９０３５３３９）株式会社 レオロジー機能食品研究所 (16)
【Ｆターム（参考）】
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