複製欠損アデノウイルスベクターの製造のためのアデノウイルスアンプリコンおよびプロデューサー細胞、その製造方法および用途
本発明は、非構造および構造遺伝子の複数の欠失を含有するヘルパー非依存性アデノウイルスベクターの製造のための効率的プロデューサー細胞系の開発に使用しうるプラスミドに関する。より詳しくは、本発明は、多欠失アデノウイルスベクターを相補し高力価調製物を得るために使用しうる新規アデノウイルスアンプリコンを含むプロデューサー細胞を提供する。該アンプリコンは、左および右ＩＴＲの共有結合の形態の、Ａｄ５ Ｅ２ウイルス遺伝子（すなわち、ポリメラーゼ、プレ末端タンパク質およびＤＮＡ結合タンパク質）およびＥ４ ｏｒｆ６、ＥＢＶ潜在性複製起点（ＯｒｉＰ）ならびにアデノウイルス複製起点を発現するエピソームプラスミドである。このプラスミドはＡｄ５ Ｅ２遺伝子発現の誘導に際して自己複製可能である。本発明は更に、開示されているプロデューサー細胞の製造方法、および治療用途に十分な規模でウイルスベクターを製造するための、該細胞の使用を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学の分野に関し、特に、多欠失または完全欠失ヘルパー非依存性アデノウイルスベクターの高クローニング容量プロデューサー細胞系を製造するための、誘導可能な自己複製能を有するエピソームプラスミドの開発および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アデノウイルス（Ａｄ）は、多種多様な組織の休止細胞および増殖細胞の両方に感染しうる広範な指向性により特徴づけられる。一般に、野生型ヒトＡｄ５ウイルスによる許容細胞の感染は約１０４〜１０５個のウイルス粒子の産生を引き起こす。ウイルスゲノムの扱い易さと共に、高力価増殖能は、Ａｄベクターを、ワクチン接種および遺伝子治療のための並びに細胞培養内での遺伝子発現のための遺伝子導入ベクターとしての使用に魅力的なものにする。
【０００３】
安全性プロファイルの改善（例えば、ウイルス遺伝子発現から生じる毒性の最小化）および前世代のベクターのクローニング容量の増加を目的として、ヒトＡｄ５およびＡｄ２に基づく幾つかのベクター系が開発されている。代替ベクター系の開発のための方法は、典型的には、ベクターバックボーンからアデノウイルス遺伝子を欠失させることを含む。アデノウイルスゲノムは機能的には、非構造産物および構造産物をコードする遺伝子を含む、初期領域および後期領域に細分される。第１の領域は、ウイルスＤＮＡ複製の前に発現されるポリペプチドをコードする初期（Ｅ）遺伝子を含む。第２の領域は、ウイルス複製の後続段階で必要なポリペプチドをコードする後期（Ｌ）遺伝子を含む。アデノウイルスゲノムのＬ領域は本質的には、ウイルス粒子の集合に必要な構造タンパク質をコードする。
【０００４】
コンピテント細胞の感染後転写される第１の領域は、Ｅ遺伝子およびＬ遺伝子の両方のトランス活性化に関与するタンパク質をコードするＥ１ａ領域である。続いて転写されるＥ１ｂ領域は、ＲＮＡ合成を調節し、Ｅ１ａによるアポトーシス作用から宿主細胞を防御するポリペプチドをコードする。したがって、Ｅ１ａ／Ｅ１ｂの遺伝子／機能はウイルス複製に必須である。第１世代（ＦＧ）アデノウイルスベクターは、典型的に、アデノウイルスＥ１遺伝子内の欠失を含む。これらの欠失は、修飾転写単位のタンパク質産物がトランスで与えられない限り、アデノウイルスを複製欠損にする。一般に、ＦＧアデノウイルスベクターの最高容量は８ｋｂを超えない。ＦＧ Ａｄ５ベクターはＥ１領域の欠失または修飾により弱毒化されるが、一般に、いくつかの腫瘍細胞系内での複製能の維持および漏出遺伝子発現の両方の結果として、インビトロで細胞毒性が見られる。典型的に、ＦＧ Ａｄベクターでのインビボ形質導入は比較的短いトランスジーン発現をもたらす。
【０００５】
追加的なウイルス遺伝子の欠失に基づく第２および第３世代ベクター系はアデノウイルス遺伝子発現の更なる弱毒化およびベクター容量の増加をもたらす。より詳しくは、より新しい世代のベクターはウイルスＥ２、Ｅ３および／またはＥ４遺伝子内の追加的な欠失を含む。ΔＥ１／Ｅ３／Ｅ４ベクターのクローニング容量は約１１ｋｂに近い。Ｅ２領域は、ウイルスＤＮＡポリメラーゼ、プレ末端タンパク質およびウイルスＤＮＡに結合するタンパク質を含むウイルス複製に直接関与するタンパク質をコードする。Ｅ３領域は、ウイルス複製には要求されないが宿主免疫応答を制御するようインビボで機能するタンパク質をコードすることが公知である。Ｅ４領域遺伝子は、宿主細胞の遺伝子発現を低下させアデノウイルスゲノムのＥ２およびＬ領域の転写を増強するよう機能するポリペプチドをコードする。種々の組合せのＥ１、Ｅ２ａ／ｂ、Ｅ３および／またはＥ４欠失を有する多欠失ベクターの使用は、古典的なＦＧ（２−４，２３，２４，３３，４５，５２）ベクターほどはインビトロで細胞毒性ではなく、マウス肝臓において、より安定であることが認められている。しかし、より新しい世代のアデノウイルスベクターが有意に長い持続能を有するという決定的な証拠は存在しない。さらに、追加的な欠失の導入は、生じる力価を有意に低下させ、臨床応用のための該ベクターの大規模製造をより困難にする（３３，１８）。実際、ほとんど全ての場合に、パッケージング／プロデューサー細胞系内に安定に導入された相補遺伝子の発現は、複数の欠失を相補しなければならない場合非効率的である（５，５４）。
【０００６】
現在のところ、ヘルパー依存性（ＨＤ）完全欠失アデノウイルスベクター遺伝子が、インビボ遺伝子導入のための最も効率的で安全なベクターの１つとみなされている（５，１５，２８，３６，３９−４１，４３，５４）。完全欠失Ａｄベクターは、複製およびパッケージング（すなわち、包膜）に必要なシス要素のみを含有し、すべてのアデノウイルス遺伝子を欠く。伝統的には、必要なアデノウイルス遺伝子はヘルパーウイルスによりトランスで供与される。しかし、ＨＤベクターはいくつかの欠点により特徴づけられる。なかでも、該系は、トランスジーンを含有するＨＤベクターと必要なウイルスタンパク質をトランスで供与するヘルパーウイルスとによるパッケージング細胞系の共感染を要するため、３つの独立した成分の制御を要することが挙げられる。実際、医薬規模でのヘルパー依存性アデノウイルスベクターの生産は、克服するのが困難な問題を伴い、高すぎる生産コストを伴う。また、ヘルパーウイルスの使用はほとんど常に、ＨＤベクター製剤を汚染する。
【０００７】
Ｅ２遺伝子および／またはＥ４領域のいくつかを欠失させ異なる初期遺伝子の欠失を組合せることにより、多欠失ヘルパー非依存性Ａｄベクターも構築されている（２−４，２３，２４，３３，４５，５２）。典型的に、必要な相補遺伝子を並列で相補パッケージング細胞系内に安定的に導入する。しかし、この方法は低コピー数のウイルス遺伝子の染色体組み込みを要し、多数の欠失を相補しなければならない場合非効率的となりうる。Ａｎｄｒｅｗｓ Ｊ．Ｌ．ら（５）は、Ｅ１、Ｅ２ａ、Ｅ３およびＥ４領域が欠失したベクターは高い力価までは増殖し得ないことを示した。Ｚｈｏｕ Ｈ．ら（５４）は、第１世代アデノウイルスベクターにより通常達する力価に近い力価でＥ１／Ｅ２ａ欠失ベクターを効率的に増殖させるためにＤＢＰ遺伝子の複数の組込みコピーが必要であることを示した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
効率的なパッケージング／プロデューサー細胞系の開発は、ヘルパー非依存性アデノウイルスベクターの開発に関連した最も困難な課題の１つである。したがって、アデノウイルス由来ベクターの絶えざる開発および使用のための重要な要件は、多または完全欠失アデノウイルスベクターの高力価調製物の製造を促進するヘルパー非依存性プロデューサー細胞系の設計である。理想的な解決策は、完全欠失ヘルパー非依存性アデノウイルスベクターの高力価増殖に適したヘルパーまたはプロデューサー細胞系を使用するアデノウイルスベクター系の開発であろう。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
本発明は、哺乳類細胞の核内での誘導性自己複製能を有する、本明細書においてはアデノウイルスアンプリコンまたはレプリコンと称されるエピソームプラスミドを提供する。開示するアデノウイルスアンプリコンは以下の特性により特徴づけられる。（ｉ）これはＥＢＶ潜伏性複製起点（ｏｒｉＰ）およびヒトＡｄ５逆末端反復（ＩＴＲ）結合部を含有する。（ｉｉ）これは、全３個のアデノウイルス５型初期領域２（Ｅ２）遺伝子および初期領域４（Ｅ４）ＯＲＦ６を、Ｔｅｔ依存性プロモーターの制御下、誘導可能に発現する。本明細書中に示すとおり、Ｔｅｔ転写サイレンサー（ｔＴＳ）および逆Ｔｅｔトランスアクチベーター（ｒｔＴＡ２）を発現する２９３ＥＢＮＡ細胞を形質転換するために、開示するアンプリコンを使用した場合、得られた安定な細胞系（２Ｅ２）は、ドキシサイクリンの存在下、第１世代Ａｄベクターに感染した２９３細胞より高いレベルのポリメラーゼ、前駆体末端タンパク質（ｐＴＰ）およびＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）を産生した。本明細書に記載のデータは更に、本明細書中に開示するプロデューサー細胞系（すなわち、２Ｅ２）が、多欠失ΔＥ１，Ｅ２，Ｅ３，Ｅ４ Ａｄベクターの増殖のために使用しうることを証明している。したがって、開示するＡｄ／ＥＢＶアンプリコンは、多または完全欠失アデノウイルスベクターの高力価増殖に適した効率的なヘルパー細胞系の産生に対する重要な寄与をもたらす。
【００１０】
本発明の第１の態様は、（ａ）ＥＢＮＡ−１タンパク質を発現する分裂細胞の核内のアンプリコンの維持を促すＥＢＶ由来複製起点（Ｏｒｉ−Ｐ）、（ｂ）Ａｄに基づく様態での増幅を可能にするＡｄ５ウイルスＩＴＲ結合部の形態のＡｄ５複製起点、（ｃ）Ａｄ５由来ポリメラーゼおよびプレ末端タンパク質をコードする核酸配列よりなる第１転写単位、（ｄ）Ａｄ５ ＤＮＡ結合タンパク質およびＥ４ ＯＲＦ６をコードする核酸配列よりなる第２転写単位、ならびに（ｅ）選択マーカーを含んでなり、第１転写単位および第２転写単位が二方向性テトラサイクリン依存性プロモーターに融合している、アデノウイルスアンプリコンを提供する。特定の実施形態においては、本発明はＡｄ５ Ｅ２／Ｅ４ ＯＲＦ６アンプリコン，ｐＥ２を提供する。
【００１１】
もう１つの態様においては、本発明は更に、ブダペスト条約に基づき原寄託物としてＢｅｌｇｉａｎ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＢＣＣＭ／ＬＭＢＰ，Ｇｈｅｎｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｐａｒｋ ９２７，Ｂ−９０５２ Ｇｅｎｔ−Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに２００４年１０月１５日付けで寄託されたプラスミドのヌクレオチド配列を含んでなるエピソームプラスミドを提供する。該寄託物には受託番号ＬＭＢＰ ４９７２が付与された。この寄託物は、Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅに基づいて維持される。この寄託は単に当業者にとっての便宜としてなされたものであり、寄託が３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２に基づいて要求されることを自認するものではない。寄託された物質の公への入手可能性に対する全ての制限は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８０８（ｂ）に規定された要件の場合を除き、特許の付与に際して、変更不能に除かれる。
【００１２】
ＯｒｉＰ潜伏性複製起点と組合されたＥＢＶ核抗原−１（ＥＢＮＡ−１）の存在は、細胞周期当たり１回だけ複製する安定なコピー数での核内保持および自律的エピソーム性複製の機能をもたらす（４８）。Ｅ４ｏｒｆ６ならびにアデノウイルスＤＮＡ複製をもたらすＡｄ５ポリメラーゼ、ｐＴＰおよびＤＢＰのコード配列はＴｅｔプロモーターの制御下で２つのビ−シストロン転写単位内に配置されるため、Ａｄ／ＥＢＶエピソームが転写的にサイレントな場合には。それは潜伏性ウイルス要素として維持される。本明細書に示すとおり、開示されているアンプリコンはＥ２遺伝子発現の誘導に際して複製されて、コピー数の増加をもたらす。
【００１３】
もう１つの実施形態においては、本発明は、プロモーターに融合した関心のあるトランスジーンをコードする発現カセットを更に含むＡｄ５ Ｅ２／Ｅ４ＯＲＦ６アンプリコンを含む。関心のあるトランスジーンには、限定的なものではないが例えば免疫グロブリンまたは免疫グロブリンのフラグメント、一本鎖抗体、二重特異性抗体、エリスロポエチン、成長ホルモン、サイトカイン、例えばＩＬ−２およびＩＬ−１０関連サイトカイン（例えば、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２２、ＩＬ−２４，ＩＬ−２６、ＩＬ−２８およびＩＬ−２９遺伝子）のようなタンパク質をコードするヒト遺伝子；ＨＣＶのコア、Ｅ１、Ｅ２または非構造領域、ＨＩＶのＨＩＶ−１ ｇｐ４１、ＧＰ１２０、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｎｅｆ、ＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄ、ＨＰＶ Ｌｌ、Ｌ２、Ｅ６およびＥ７タンパク質、ＳＡＲＳ−ＣｏＶのスパイク（Ｓ）糖タンパク質、細胞膜タンパク質、例えばウイルス受容体、例えばＳＡＲＳ−ＣｏＶ ＡＣＥ２受容体、ＨＩＶ−１受容体ＣＤ４およびケモカインコレセプター、ＨＣＶ受容体ＣＤ８１、ＳＲＢ１、Ｌ−ＳＩＧＮおよび硫酸ヘパリンシンデカン、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、チロシンキナーゼ細胞表面受容体をコードするウイルス遺伝子が含まれる。
【００１４】
本発明の第２の態様は、本発明のアデノウイルスアンプリコンを含んでなるプロデューサー／ヘルパー細胞系を提供する。より詳しくは、本発明は、（ａ）Ａｄ５ Ｅ１タンパク質、（ｂ）ＥＢＶ由来ＥＢＮＡタンパク質、（ｃ）Ｔｅｔ転写サイレンサー、（ｄ）Ｔｅｔ逆トランスアクチベーター、（ｅ）アデノウイルスアンプリコン［該アデノウイルスアンプリコンは、第２転写単位（第２転写単位はＥＢＶ由来ＯｒｉＰ、アデノウイルスＩＴＲ結合部ならびにＡｄ５ Ｅ４ ＯＲＦ６およびＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸配列よりなる。）と組合された第１転写単位（第１転写単位はＡｄ５由来ポリメラーゼおよびプレ末端タンパク質をコードする核酸配列よりなる。）よりなり、第１転写単位および第２転写単位は二方向性テトラサイクリン依存性プロモーターに融合している。］、ならびに（ｆ）選択マーカーを発現するアデノウイルスパッケージング細胞系を提供する。
【００１５】
特定の実施形態において、本発明のこの態様は、本明細書においては、２９３ＥＢＮＡｔｅｔ細胞（Ｔｅｔ転写サイレンサーｔＴＳｋｉｄおよびｔｅｔ逆トランスアクチベーターｒｔＴＡ２を発現する２９３ＥＢＮＡ細胞として定義される。）をｐＥ２で形質転換して、ΔＥ１，Ｅ２，Ｅ３，Ｅ４ Ａｄベクターの増殖のためのプロデューサー細胞系としての使用に適した細胞系を得ることにより例示される。本明細書中に例示されているパッケージング細胞系は２Ｅ２と称される。開示されている系のＡｄ５ ΔＥ１，Ｅ２，Ｅ３，Ｅ４ Ａｄベクターは、１２．４Ｋｂまでのクローニング容量により、およびウイルス遺伝子発現の漏出の減少により特徴づけられる。本発明のプロデューサー細胞は、とりわけ、遺伝子治療およびワクチン接種のために設計された組換えアデノウイルスの製造に有用である。
【００１６】
本発明のもう１つの態様は、治療用の複製欠損アデノウイルスベクターの製造方法を提供する。例えば、特定の実施形態において、本発明は、感染因子／病原体により発現される抗原に対する免疫原性応答を誘発するためのワクチンとしての使用のための免疫原性組成物を提供する。もう１つの実施形態において、本発明は、腫瘍抗原に対する免疫応答を誘導するのに適したワクチンを提供する。本発明のこの態様は、本明細書中において、全ＨＣＶポリタンパク質を発現するΔＥ１−Ｅ４発現ベクターの構築、および免疫実験における該ベクターの利用により例示される。
【００１７】
１つの実施形態においては、本発明は、パッケージング細胞内に多欠失アデノウイルス発現ベクターを導入すること{前記パッケージング細胞は、ＥＢＶ由来ＥＢＮＡタンパク質；Ｔｅｔ転写サイレンサー；Ｔｅｔ逆トランスアクチベーター；アデノウイルス発現ベクター[前記アデノウイルス発現ベクターはＥＢＶ由来ｏｒｉＰ、アデノウイルスＩＴＲ結合部および第１転写単位（前記第１転写単位はＡｄ５ ＤＮＡ結合タンパク質およびＥ４ ＯＲＦ６をコードする核酸配列よりなる第２転写単位と組合されたＡｄ５ Ｅ２由来ポリメラーゼ、プレ末端タンパク質をコードする核酸配列よりなる。）よりなり、第１転写単位および第２転写単位は二方向性テトラサイクリン依存性プロモーターに融合している。]ならびにプロモーターに融合した関心のあるトランスジーンをコードする発現カセットを発現する。}、Ｅ２およびＥ４ＯＲＦ６コード配列の発現を誘導すること、および産生した複製欠損アデノウイルスを回収することを含んでなる、関心のあるトランスジーンを含む複製欠損アデノウイルスの製造方法を提供する。特定の実施形態においては、Ｅ２およびＥ４ＯＲＦ６コード配列の過剰発現により特徴づけられるｐＥ２アンプリコンの複製を誘発するドキシサイクリンと該パッケージング細胞とを接触させることにより、Ｅ２およびＥ４ＯＲＦ６コード配列の発現を誘導する。
【００１８】
代替的実施形態において、本発明の方法は、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４遺伝子を欠く多欠失ヒトＡｄ５アデノウイルスベクターのためのパッケージング細胞としての、ｔＴＳｋｉｄおよびｒｔＴＡ２を発現する２９３ＥＢＮＡ細胞の使用を含む。本発明は更に、本明細書に開示されており特許請求されている製造方法により回収され精製された組換え複製欠損アデノウイルス粒子を提供する。
【００１９】
本発明の他の特徴および利点は本明細書に記載の開示から明らかである。実施例（具体例）は、特許請求されている本発明の実施に有用な種々の成分および方法を例示する。該実施例は本発明を限定するものではないと解釈されると理解されるべきである。本開示に基づき、当業者は、本発明の実施のための他の成分および方法を特定し使用することが可能である。
【００２０】
図面の簡単な説明
図１Ａ〜１Ｂは、安定な２９３ＥＢＮＡＴｅｔクローンを得るために使用したプラスミドの概要図を示す。パネルＡはプラスミド成分の直線的表示を示す。以下の略語が使用されている：逆Ｔｅｔトランスアクチベーター（ｒｔＴＡ）；Ｔｅｔサイレンサー（ｔＴＳ）；ＥＣＭＶ内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）；イントロン配列（ｉｎｔＳ）；およびピューロマイシン耐性（ＰｕｒｏＲ）。
【００２１】
パネルＢはｐＥ２プラスミドの概要図を示す。ｐＦＧ１４０由来のＡｄ５逆末端反復配列の頭−尾結合体を該プラスミド内にクローニングした（ＩＴＲ、灰色矢じり）。Ａｄ５初期遺伝子が黒色矢印で示されている。ポリメラーゼ（Ｐｏｌ）、プレ末端タンパク質（ｐＴＰ）、ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）およびＥ４ｏｒｆ６を、Ｔｅｔ応答性要素（ＴＲＥ、白色太棒線）により駆動される２つのビシストロン発現カセット内に挿入した。ニワトリβグロビン絶縁（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）配列（ＨＳ４）に隣接するＥＢＶ潜在性複製起点（ＯｒｉＰ）が付点太棒線および灰色太棒線で示されている。
【００２２】
図２はＡｄＴｅｔＬｕｃ感染クローンにおけるルシフェラーゼ発現のグラフ表示を示す。２９３ＥＢＮＡ細胞および種々の２９３ＥＢＮＡ／Ｔｅｔクローンに、１μｇ／ｍｌ ドキシサイクリンの存在下（黒色棒線）または非存在下（白色棒線）、ＡｄＴｅｔＬｕｃを感染させた（ｍ．ｏ．ｉ １０）。細胞溶解物におけるルシフェラーゼ活性を感染の４８時間後に評価した。
【００２３】
図３は環状および直線形態のｐＥ２の概要図を示す。ｐＥ２の環状形態と直線形態との識別を可能にするＮｏｔＩ消化により得たＤＮＡ断片も示されている。
【００２４】
図４Ａ〜４Ｂ。パネルＡは、ドキシサイクリンによるＡｄ５ Ｅ２遺伝子発現の活性化の際のｐＥ２の複製を示すサザンブロット分析を示す。ＮｏｔＩで消化されたｐＥ２の１０８個のコピーを第１レーンにローディングした。ドキシサイクリンの非存在下／存在下のｐＥ２での形質移入の４８時間後に２９３ ＥＢＮＡ Ｔｅｔ細胞から抽出されＮｏｔＩおよびＤｐｎＩで消化されたエピソームＤＮＡをレーン２および３にローディングした。環状および直線状単量体形態を示す１２．６および４．４Ｋｂのバンドが黒色矢印で示されている。ＤＮＡマーカーのサイズが図の右側に示されている（Ｋｂ）。
【００２５】
パネルＢは、Ｅ２タンパク質のｔｅｔ誘導性発現を示すウエスタンブロット分析を示す。ドキシサイクリンの存在下（＋）（レーン３、６および９）または非存在下（−）（レーン２、５および８）でｐＥ２アンプリコンで形質移入された２９３ＥＢＮＡＴｅｔ細胞におけるＤＢＰ、ｐＴＰおよびポリメラーゼタンパク質のウエスタンブロット分析。陰性（非形質移入）対照がレーン１、４および７に示されている。特異的ウサギ抗血清（ポリメラーゼ、ｐＴＰ）またはマウスモノクローナル抗体（ＤＢＰ）でＥ２タンパク質を検出した。
【００２６】
図５Ａ〜５Ｂ。２Ｅ２クローンから抽出されたｐＥ２の構造およびＥ２タンパク質の発現。パネルＡは、クローン２９３ＥＢＮＡＴｅｔおよび２Ｅ２から抽出されたｐＥ２の構造を示すサザンブロット分析である。２９３ＥＢＮＡＴｅｔおよび２Ｅ２クローンから抽出されたＤＮＡのサザンブロット分析。Ｈｉｒｔ法により抽出されたＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、１％アガロースゲル上で分離し、ナイロンメンブレン上に移し、３２Ｐで標識されたｐＥ２ ＤＮＡでハイブリド形成させた。参照体として第１レーンにｐＥ２ベクターをローディングした。２９３ＥＢＮＡＴｅｔ細胞から（陰性対照）および２Ｅ２クローンから抽出されたＤＮＡをそれぞれ第２および第３レーンにローディングした。
【００２７】
パネルＢは、Ａｄ５ΔＥ１ベクターに感染した細胞におけるＥ２発現と比較した場合の２Ｅ２安定細胞系におけるＥ２タンパク質のｔｅｔ誘導性発現を示すウエスタンブロット分析である。２Ｅ２クローンによるＥ２ａおよびＥ２ｂタンパク質発現を、ドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）（レーン、２、３；５、６；８、９）の存在下（＋）（レーン３）および非存在下（−）（レーン２）、ウエスタンブロットにより評価し、５００のｍ．ｏ．ｉ．のＦＧ Ａｄ５ΔＥ１ベクターに感染した非誘導２Ｅ２細胞からのＥ２タンパク質の発現レベル（レーン１）と比較した。分子量マーカーの移動度（ｋＤａ）が図の左に示されている。
【００２８】
図６は、ＥＧＦＰを発現するＡｄ ΔＥ１−４ベクターをレスキューし増殖させるための２Ｅ２細胞の使用を示す一連の写真を示す。サイレンシングされた（‐ｄｏｘｙ）または活性化された（＋ｄｏｘｙ）Ｅ２／ｏｒｆ６遺伝子発現を伴う２Ｅ２クローンにおけるＡｄ５ΔＥ１−４ＥＧＦＰウイルス増殖。Ｐ０＝形質移入、Ｐ１およびＰ２は、前感染経過からの全粗溶解物の１／１０を細胞に感染させることにより得た。
【００２９】
図７Ａ〜７Ｂ。パネルＡはＡｄ５ウイルスの概要地図である。この図にはすべての欠失領域が示されている。Ｅ１、Ｅ２ａ、Ｅ３、および７個のＥ４ ｏｒｆのうちのｏｒｆ３を除く６個を、ベクターバックボーンから完全に欠失させた。ポリメラーゼおよびプレ末端タンパク質の欠失は部分的であるに過ぎない。Ｅ１領域は、ＭＣＭＶプロモーターにより駆動されるＨＣＶポリタンパク質発現カセットで置換される。ベクターゲノムの制限分析において使用するＨｉｎｄＩＩＩ制限部位が示されている（┃）。
【００３０】
パネルＢは、該多欠失ベクターのＥ１領域内に導入されたＨＣＶ（ＢＫ株）ポリタンパク質発現カセットの概要図を示す。ＨＣＶ ５’および３’ＵＴＲ配列が除去されており、最適化コザック配列が該ポリタンパク質の５’側に融合されている。発現はマウスＣＭＶプロモーター（ｍＣＭＶ）およびウシ成長ホルモンポリＡ（ＢＧＨポリＡ）により調節される。
【００３１】
図８はＡｄ ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋ＨＣＶの制限分析を示す。プラスミドＤＮＡおよびＣｓＣｌ精製ウイルス粒子から抽出されたウイルスＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、クレノウ酵素でのフィルイン反応により（３３Ｐ）ｄＡＴＰで末端標識した。精製されたＡｄ ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋ＨＣＶベクター（レーン４）のウイルスＤＮＡ制限パターンを元のプラスミド（レーン３）と比較した。ＨｉｎｄＩＩＩで制限処理されたＦＧ（ΔＥ１−Ｅ３）Ａｄ５（レーン１）およびＡｄ５ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋空ベクター（レーン２）バックボーンを該ゲル内に加えた。ａ、ｂ、ｃ、ｄは、欠失を含有する多欠失ベクターＤＮＡバンド、およびＦＧ（ΔＥ１−Ｅ３）Ａｄ５パターンにおける対応バンドを示す。
【００３２】
図９は、Ａｄ５ΔＥ１−４ＨＣＶ感染細胞におけるＨＣＶタンパク質の発現を示すウエスタンブロット分析を示す。ＨｅＬａ細胞にＡｄ５ΔＥ１−４ＨＣＶを１０のｍ．ｏ．ｉ．で感染させた。ＨＣＶ特異的抗体でのウエスタンブロット分析により細胞抽出物においてＨＣＶタンパク質を検出した。感染の４８時間後に調製した、ＨｅＬａ細胞からの溶解物をレーン３にローディングし、未感染対照細胞からの溶解物（レーン１）、およびｍＣＭＶ−ＨＣＶベクターＤＮＡで形質移入したＨｅＬａ細胞からの溶解物（レーン２）と比較した。特定のバンドが矢印で示されている。
【００３３】
図１０は、マウスにおけるＡｄ５ΔＥ１−４ＨＣＶウイルス免疫化に対するインビボＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を特徴づけるＦＡＣＳデータのグラフ表示を示す。Ａ２．１（ａ）およびＣＢ６Ｆ１（ｂ）。１０１０ｖｐで筋肉内に免疫化されたマウスの新鮮に単離された脾細胞を、３週間後のＩＦＮ−γに関する細胞内染色により、ＨＣＶ−ペプチドのプールに対するＣＤ８＋ Ｔ細胞応答に関して試験した。ｘ軸 抗ＩＮＦ−γ、ｙ軸 抗ＣＤ８。プールＣ（コア）、プールＦ−Ｇ（ＮＳ３）、プールＨ（ＮＳ４）、プールＩ−Ｌ−Ｍ（ＮＳ５ａ／ｂ）。
【００３４】
図１１は、本開示に記載されているポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列（すなわち、配列番号１〜２１）を示す。
【００３５】
図１２Ａ〜１２Ｃは、ＮＳ３ヘリカーゼ内のエピトープのマッピングに用いた方法を示す。Ａｄ５ΔＥ１−Ｅ４ＨＣＶで初回抗原刺激されｐＳｈ−Ａｄ５−ＨＣＶで追加抗原刺激された２匹のマウス（マウス４，黒塗り棒線、マウス５，付点棒線）から精製した脾細胞を、全ＮＳ３ヘリカーゼ領域に及ぶペプチド（Ｉ〜ＸＶＩＩＩ）の二次元サブセット上でγ−ＩＦＮ−Ｅｌｉｓｐｏｔにおいて試験した（図１２Ａ）。図１２Ｂに示されているデータは、免疫応答を特徴づけするために使用したパネルＡにおいて特定された陽性閾値を超える応答を惹起したペプチドプール間の交差点を要約したものである。パネル１２Ｃは、該応答をもたらすＮＳ３エピトープを特定するために行ったγ−ＩＦＮ−Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイの結果を要約したものである。
【００３６】
図１３は、ＶＶ−ＮＳチャレンジに対する防御の誘導における免疫化の効力を示す。灰色のドットは相乗平均力価（Ｎ＝５）を表す。アステリスクは対照に対するｐ＜０．０５を示す（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙランク）。
【００３７】
図１４Ａ〜Ｂは、Ａｄ５ΔＥ１−Ｅ４ＨＣＶ免疫化に応答してアカゲザルにおいて惹起された免疫応答を要約したものである。パネルＡは、Ａｄ５ΔＥ１−Ｅ４ＨＣＶの１回の投与に際してサル４０６１において惹起されγ−ＩＦＮ−Ｅｌｉｓｐｏｔにより分析された経時的免疫応答を表す。結果は１０６ＰＢＭＣ当たりのγ−ＩＦＮスポット形成細胞数（ＳＦＣ）として表されている。各棒グラフは、別々のペプチドプールに対する応答を表す。パネルＢは、Ａｄ５ΔＥ１−Ｅ４ＨＣＶの１回の投与により３頭の個々のサルにおいて誘導され注射の６週間後にγ−ＩＦＮ−Ｅｌｉｓｐｏｔにより分析された免疫応答を示す。結果は、１０６ＰＢＭＣ当たりのγ−ＩＦＮスポット形成細胞数（ＳＦＣ）として表されている。各棒グラフは、別々のペプチドプールに対する応答を表す。
【００３８】
発明の詳細な説明
個々の文の終わりに示されている数字の列挙は、本明細書の終わりに番号付きで示されている参考文献の一覧に対応する。本明細書中に引用されている参考文献は本発明の先行技術であると自認されるものではない。
【００３９】
本明細書中で用いるすべての科学技術用語は、特に定義されない限り、当業者に一般に理解されているものと同じ意義を有することに留意することが、本発明の理解に重要である。以下に幾つかの用語を説明する。あるいは、ある種の用語は、初めて用いられる際に本明細書中で定義されうる。
【００４０】
本明細書中で用いる「アンプリコン」なる語は、必須遺伝子機能が付与されると複製されうるエピソームまたは染色体外ＤＮＡ要素を意味する。一般に、アデノウイルスアンプリコンは、ウイルスＤＮＡの複製を支持する各末端反復配列の少なくとも一部分を含むと理解される。真核ウイルスアンプリコンは、好ましくは、完全なＩＴＲ配列の少なくとも約９０％を含む。したがって、「アデノウイルスアンプリコン」はＩＴＲ結合部および適切な複製起点のいずれかを含む。
【００４１】
本明細書中で用いる「形質移入」なる語は、細胞が生物学的に生存可能なままでＤＮＡを細胞の外部から細胞の内部へ導入する適切な方法のいずれかを意味する。本明細書中で用いるこの用語は、限定的なものではないがエピソームおよび他の環状または直鎖状ＤＮＡ形態の形質移入を含む任意の手段による宿主細胞内へのＤＮＡの導入を含む。この用語は、例えば本明細書に記載されているような遺伝子治療法を含む。本発明を実施するためには、限定的なものではないがリン酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーション、遺伝子銃形質移入、リポフェクションまたは他のカチオン脂質に基づく形質移入を含む適切な形質移入法のいずれも用いることが可能である。これらの技術は当業者によく知られている。
【００４２】
本明細書中で用いる用語は本発明を限定するものではない。例えば、「遺伝子」なる語は、遺伝子産物をコードするｃＤＮＡ、ＲＮＡまたは他のポリヌクレオチドを含む。「核酸」、「ＲＮＡ」、「ＤＮＡ」などの用語を用いる際には、特定の段階で用いられうる化学構造を限定するものではない。例えば、ＤＮＡの代わりにＲＮＡが一般に用いられうることは当業者によく知られており、したがって、「ＤＮＡ」なる語の使用はこの代用を含むと解釈されるべきである。また、種々の核酸類似体および誘導体も本発明の範囲内であることが公知である。遺伝子または核酸の「発現」は、細胞遺伝子発現だけでなく、クローニング系および任意の他のコンテクストにおける核酸の転写および翻訳をも含む。
【００４３】
自然感染からのアデノウイルスの大規模生産はウイルスＤＮＡ複製と主要後期プロモーター活性との協同作用の結果であると理解される。実際、この方法は、ビリオンをパッケージングするのに要する大きなプールを生成する効果を有する、高コピー数の転写活性鋳型の蓄積をもたらす。先行技術は、１以上のウイルスタンパク質が欠損したアデノウイルスベクターの産生のための１以上のウイルスタンパク質を発現するいくつかのヘルパー細胞系を含むが、自然感染を模倣した一連の協同事象（例えば、ウイルスＤＮＡ複製および必要な構造タンパク質の発現）により特徴づけられる生産系は未だ記載されていない。宿主細胞染色体内への相補遺伝子の組込みに基づく相補ヘルパー細胞系の製造を要する方法を用いる代わりに、宿主細胞内で自己複製可能なアデノウイルス複製に必要な非構造Ｅ２遺伝子のすべてを含有するエピソームプラスミドが得られた。
【００４４】
ヘルパーウイルス依存性生産系の使用に伴う、先行技術で認められている問題点に対処して、本発明は、多または完全欠失アデノウイルスベクターを相補しうるプロデューサー細胞系を作製するために使用されうる新規アデノウイルスアンプリコンを提供する。該アンプリコンは、ヘルパーウイルス非依存性ベクター産生の効率が最大となるよう自然アデノウイルス感染の段階を模倣する態様で機能するように設計されている。本明細書中に示すとおり、これは、ウイルス転写カスケードの開始に要するアデノウイルス初期遺伝子の発現を能動的に抑制し／遅延させることにより開示のエピソーム（すなわち、アデノウイルスアンプリコン）がパッケージング細胞系の核内の潜伏相において維持されるパッケージング細胞を操作することにより達成される。
【００４５】
潜伏性は、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）由来ＤＮＡ複製要素の核保持特性の利用および誘導性発現系（本明細書中ではテトラサイクリン調節発現系により例示される。）の使用により達成される。誘導により、複製に必要なアデノウイルスＥ２遺伝子（すなわち、ポリメラーゼ、プレ末端タンパク質およびＤＮＡ結合タンパク質）の発現を招くエピソーム配列の転写を引き起こす複製相の活性化がもたらされる。実際、潜伏相から複製相への移行により、トランスジーンを含む多または完全欠失アデノウイルスベクターを効率的にパッケージングするのに必要な大量の相補ウイルスタンパク質の蓄積が促される。したがって、典型的に自然感染の後期に高力価のビリオン産生をもたらす一連の事象を模倣する態様で該パッケージング細胞が機能するのを可能にするよう、該アンプリコンが設計される。したがって、開示されているアンプリコンおよびパッケージング細胞系は、ヘルパーウイルス非依存性医薬等級ベクターの効率的高力価製造方法を可能にする。
【００４６】
エピソームプラスミド（ｐＥ２）は以下の特徴により特徴づけられる：（ｉ）これは、該エピソームを自律複製可能にし核内保持の促進によりエピソームを多コピーで維持するＥＢＶプラスミド複製起点のような要素を含む、（ｉｉ）これは、直鎖形態でのＤＮＡ複製を可能にするＡｄ５逆末端反復（ＩＴＲ）結合部を含む、（ｉｉｉ）これは、アデノウイルスの複製に必要なＥ２アデノウイルス遺伝子、例えばポリメラーゼ、プレ末端タンパク質およびＤＮＡ結合タンパク質ならびに初期領域４（Ｅ４）ＯＲＦ６の誘導性発現をもたらす。
【００４７】
ウイルスＤＮＡ複製のためには、Ａｄ５ウイルスＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＢＫ０００４０８に開示されている。）の僅か２つの領域のみがシスで要求されることが公知であることを、当業者は認識する。これらは左逆転末端反復配列またはＩＴＲ（Ａｄ５のｂｐ１〜約１０３）および右ＩＴＲ（Ａｄ５のｂｐ３５８３３〜３５９３５）である。ＥＢＶ由来の複製起点系の存在は、アンプリコンが多コピーで核内に保持され染色体ＤＮＡと同時に複製されるのを可能にし、一方、アデノウイルスＩＴＲ結合部の存在は、Ｅ２領域によりコードされるタンパク質の存在下、アンプリコンが多コピー数で複製されるのを可能にする。該アンプリコン上での誘導性プロモーターの使用は、エピソームの複製に及びトランスジーンを含む多または完全欠失アデノウイルスベクターの増殖に要求されるアデノウイルス遺伝子を、厳密に調節応答性である誘導性プロモーターの制御下に配置する。一般には、誘導性プロモーターは、アクチベーターにより誘導されるプロモーターである。誘導性プロモーターに作用するインデューサーの非存在下では、エピソーム上に含有されるアデノウイルス遺伝子は発現されず、ウイルスタンパク質の産生は伴わず、ウイルスタンパク質誘導性細胞毒性のリスクは最小である。
【００４８】
実際、開示されているアンプリコン（例えば、エピソーム）は、前記特性の１以上を同時に達成するよう、宿主細胞内に存在する他の要素（例えば、活性化因子）と協同して働きうる要素を含みうる。例えば、同一要素（ＤＮＡ配列）が自己増殖能を付与し核内保持を促進しうる。代替的ウイルス複製系に由来するＤＮＡ配列も本発明の実施に使用されうると理解されるべきである。例えば、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）由来の複製起点および活性化因子（６０）またはＳＶ４０由来Ｔ抗原系に基づくベクターに由来する配列が、適切な代替物となる。
【００４９】
本明細書中の実施例は、ＥＢＮＡ−１を発現する宿主細胞の使用を記載しているが、所望により、アデノウイルス遺伝子を含有する同一エピソーム単位（アンプリコン）上もしくは複製可能な第２の遺伝単位上にコード配列を含めることにより又は宿主細胞ゲノム内への安定組込みにより他の活性化因子を導入することが可能であることは容易に理解される。例えば、本明細書に記載のとおりにＥＢＮＡ１抗原およびＥＢＶ複製起点を使用する代わりに、ＢＰＶ複製起点と共にウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）Ｅ１およびＥ２抗原を使用することが可能である。Ｅ１抗原は、複製の開始および伸長に必要なヘリカーゼであり、Ｅ２抗原は、複製起点へのＥ１抗原の結合を補助する転写因子である（６１）。総合すると、これらのウイルスタンパク質はまた、適当な形質移入に関してコンピテントである細胞におけるエピソームの核内保持を促進することが公知である。
【００５０】
霊長類細胞内において非組込み型自律的複製性エピソームベクターを安定に維持し及びプラスミドの安定な複製を支持する、ＥＢＶゲノムの確定された遺伝的要素が公知である。必要な遺伝的要素には、シス作用性プラスミド複製起点（ｏｒｉＰ）およびトランス作用性エプスタインバー核抗原（ＥＢＮＡ−１）タンパク質が含まれる。より詳しくは、ＥＢＶ由来要素、すなわちｏｒｉＰおよびＥＢＮＡ−１は、これらのベクターにより形質移入された哺乳類細胞内において１〜９０個の範囲の数で非組込み型染色体外分子として専ら存在する組換えエピソームの安定な複製を支持するために使用されている。
【００５１】
ＥＢＶゲノムの複製起点ｏｒｉＰを含有しＥＢＮＡ１ウイルスタンパク質（６４１アミノ酸）の発現を可能にするプラスミドは、形質移入されたヒト細胞内で安定なエピソーム様態で維持され、それらの複製は細胞分裂と同時に生じる。本明細書に示すとおり、活性化因子ＥＢＮＡ−１の存在下で使用するＥＢＶ複製起点（ＯｒｉＰ）は自己複製能を付与し、核内保持を促進する。理論により束縛されるものではないが、ＥＢＮＡ１タンパク質は複製開始のレベルで３０ｂｐの反復配列に結合し、Ｓ相の時点での細胞性因子のリクルートメント、およびｏｒｉＰ配列をシスで有するプラスミドの、細胞分裂との同期的複製を可能にすると考えられている。さらに、ＥＢＮＡ１は、おそらく染色体構造体および反復単位のレベルでの同時結合により、細胞分裂時のエピソームの分離および核内維持を可能にするのであろう。これらの要素は、それ自身で、複製時に、細胞当たり複数のコピーのプラスミドベクターのエピソーム維持および分離を可能にする。
【００５２】
本発明で使用するエピソームにおいて、適切なＥＢＶ複製起点ＤＮＡ配列のいずれも使用することができる。適切なＥＢＶ複製起点配列（ｏｒｉＰ）の一例はＧｅｎＢａｎｋ Ｖ０１５５５に開示されている。ｏｒｉＰ領域はこのＧｅｎＢａｎｋ配列のヌクレオチド７３３３からヌクレオチド９３１２までの配列に及んでいる。本明細書に記載のエピソームにおいて使用されるｏｒｉＰ配列は、６５ｂｐの逆転復配列単位により形成され３０ｂｐ単位の４個の不完全なコピーを含む複製起点から９６０ｂｐ離れた、３０ｂｐの２０単位の反復から構成されている。
【００５３】
エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）由来ｏｒｉＰは、ＥＢＮＡ−１結合配列の２つのクラスター（反復配列のファミリーおよび二回対称配列）から構成されている。どちらの要素もＥＢＮＡ−１への複数の結合部位を有し、ｏｒｉＰを含有するプラスミドの複製および核内保持に必須である。宿主細胞因子は、本明細書に開示するエピソームの複製および核内保持を補助すると考えられている。一般に、適当なｏｒｉＰ配列は、ｏｒｉＰ機能に必要なことが知られている反復配列のファミリーおよび二回対称の領域を含む。本発明において使用されうるＥＢＶ ｏｒｉＰ配列には、天然に存在する配列からの修飾を含有するもの、例えば、天然配列の欠失、挿入、置換および重複を含有するものが含まれる。そのような誘導体配列は、例えば、ｏｒｉＰ機能に必要な前記公知領域を維持させることにより入手できる。また、保存的置換はよく知られており、当業者に入手可能である。使用するｏｒｉＰ配列は、十分に多い量のＥＢＮＡ１タンパク質の存在下でｏｒｉＰ配列が存在するエピソームの複製を導くよう宿主細胞内で有効に機能するものである。
【００５４】
適切なＥＢＮＡ１タンパク質のいずれかをコードするＤＮＡが本発明のプロデューサー細胞により発現されうる。ＥＢＮＡ１をコードするＤＮＡはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから商業的に入手可能であり、そのＥＢＶ系列プラスミドのいくつかの中に含有される。さらに、ＥＢＮＡタンパク質をコードするＤＮＡは、発現されるタンパク質が宿主細胞におけるＥＢＶ ｏｒｉＰ含有エピソームの複製を支持する、天然に存在するＥＢＮＡ１アミノ酸配列の変異体、例えば、欠失、付加、挿入または置換を含有するものをコードすることが可能である。この変異体は、本明細書に記載の他の配列の場合と同様に、アミノ酸配列保存的変異体をコードする機能的に保存的な核酸配列、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムによる測定で９０％を超える、好ましくは９５％を超える同一性または相同性を有する配列、および高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする配列を含む。さらに、同一ＥＢＮＡ１タンパク質をコードする縮重ＤＮＡ配列を使用することが可能である。同一アミノ酸配列を発現しうる縮重ＤＮＡ配列は、そのようなＤＮＡ配列の構築および発現方法と同様、当技術分野でよく知られている。
【００５５】
ＥＢＮＡ１は、よく知られた技術を用いて任意の霊長類またはイヌ細胞内に安定に形質移入されることができ、組込み遺伝子コピーからＥＢＮＡ１を発現する得られた細胞系は、適当な生産細胞系を作製するために使用されうる。あるいは、ＥＢＮＡ１が発現される限り、感染性または欠損性ＥＢＶを既に含有する細胞系を使用することが可能である。これは、ＡＴＣＣから入手可能な多数のＥＢＶ形質転換リンパ芽球を含む。ＥＢＮＡ１を既に発現する細胞系の形質移入が非常に好都合である。なぜなら、そのような細胞はエピソーム構築物を安定に維持する能力は数桁増強されることが可能であり、僅か２〜３週間のうちに安定細胞系が作製されうるからである（６２）。しかし、これらの方法は、組込み遺伝子からＥＢＮＡ１を構成的に発現する細胞系を製造する追加的な工程を要する。
【００５６】
本明細書中に示すとおり、テトラサイクリンプロモーターは、テトラサイクリンまたはその一般的類似体の１つ（例えば、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ））に応答性であり、開示されているエピソーム単位（例えば、アンプリコンまたはレプリコン）における使用に適している。テトラサイクリンの類似体であるドキシサイクリンは、ヒトにおけるその安全な使用、細菌テトラサイクリンリプレッサー（ＴｅｔＴ）に対するその特異性のため、広く受け入れられている。簡潔に説明すると、テトラサイクリン依存性調節系（ｔｅｔ系）は、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６タンパク質のアクチベータードメインに融合した原核性ＴｅｔＲよりなるテトラサイクリントランスアクチベーター（ｔＴＡ）と、最小プロモーターに融合した原核性テトラサイクリンオペレーター部位（ｔｅｔＯ）のいくつかのコピーよりなるテトラサイクリン応答性要素（ＴＲＥ）との間の相互作用に基づく（６８）。テトラサイクリン（ｔｅｔ）の存在下、ｔＴＡは、ＴＲＥに結合するその能力を失い、発現が遮断される。逆トランスアクチベーター（ｒｔＴＡ）は突然変異誘発によりｔＴＡから誘導されている。ｔＴＡとは対照的に、ｒｔＴＡはｔｅｔの存在下でＴＲＥに結合するに過ぎない。
【００５７】
転写の基底レベルを減少させることにより遺伝子発現の緊縮調節を得るために、本発明者らは、最近記載された逆ｔｅｔトランスアクチベーターの新規改良形態（２９）とＴｅｔ転写サイレンサーｔＴＳｋｉｄ（１６）との組合せを利用するＴｅｔ調節系を使用した。ｔＴＳｋｉｄは、転写のリプレッサーとして機能することが公知の腎タンパク質Ｋｉｄ−１のＫＲＡＢドメインを含有する。ｔＴＳｋｉｄは、エフェクター薬の非存在下でＴｅｔプロモーターに結合して、転写の基底レベルを減少させる。逆Ｔｅｔトランスアクチベーターとの組合せは、ドキシサイクリン添加により調節される活性化／抑制系の構築を可能にする。この目的のために、図１Ａに記載のとおりにＥＭＣＶ ＩＲＥＳを使用することによりそれらの２つの遺伝子をビシストロン転写単位において組合せた。
【００５８】
真核細胞における誘導性遺伝子発現を導きうるいくつかのプロモーター系が入手可能である。これらには、重金属イオン（６３）、（６４）、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（６５）、ホルモン、例えばコルチコステロイド（６６）、プロゲステロンアンタゴニスト（６７）またはテトラサイクリン（６８）に応答して修飾される活性を有するプロモーターが含まれる。しかし、エクジソン、ラパマイシン、ＲＵ４８６、デキサメタゾンおよび重金属（すなわち、ＺｎまたはＣｄ）のようなアクチベーターに対して応答性である他のよく知られた誘導性調節要素も適している。代替的な調節要素を本発明での使用に応用することは当業者の能力の範囲内に十分に含まれる。本発明の目的には、十分なレベルまたは調節制御を保証するものであり、医薬用途に許容されるアクチベーターにより誘導可能なものである限り、調節要素のいずれも使用することが可能である。さらに、遺伝子発現の厳密な調節を促進するために、他の調節要素、例えばテトラサイクリン応答性トランスアクチベーターおよび／またはサイレンサー（ｒｔＴＡおよびｔＴｓ）に誘導性プロモーターを機能的に連結しうると理解されるべきである。
【００５９】
発現カセット（関心のあるトランスジーンと、本明細書中に開示されている哺乳類細胞内での発現を導くための必要な調節配列とを含むものとして定義される。）のすべては、腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＪ５１８３内での相同組換えによるｐＡｄ５ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋のＥ１領域における挿入が可能となるよう、ＣＭＶプロモーターおよびトランスジーン発現用ＢＧＨポリＡシグナルに加えてＡｄ５配列［ｎｔ］１−４５０（左）（配列番号１）および［ｎｔ］３５１１−５７９２（右）（配列番号２）を含有するＡｄ−シャトルベクターのコンテクストにおいて構築した。ＥＧＦＰ ｃＤＮＡはｐＥＧＦＰプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から得、ついでＡｄ−シャトルプラスミド内にクローニングしてｐＳｈＡｄ５ ＥＧＦＰを得た。
【００６０】
本明細書に記載の方法において、所望の配列をコードするエピソームにより成功裏に形質移入された細胞を選択するために、通常の選択マーカーを使用する。そのような選択は、通常、形質移入された細胞を抗生物質または関連選択過程を開始させる他の物質にさらすことを含む。本発明で使用するエピソームにおいて使用する選択マーカー遺伝子は、これらの遺伝子を含有する細胞が対応抗生物質または因子の存在下で成長するのを可能にする、特定の抗生物質および／または因子に対する耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子である。真核性選択マーカーの非限定的な例には、ヒグロマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｇａｉｔｈｅｓｂｏｒｏ，Ｍｄ．から商業的に入手可能なｈｙｇまたはｈｐｈ）、ネオマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｇａｉｔｈｅｓｂｏｒｏ，Ｍｄ．から商業的に入手可能なｎｅｏ）、ゼオシン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃａｌｉｆ．から商業的に入手可能なＳｈ Ｂｌｅ）、ピューロマイシン（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ Ｃａｌｉｆ．から入手可能なｐａｃ、ピューロマイシン−Ｎ−アセチル−トランスフェラーゼ）、ウアバイン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手可能なｏｕａ）およびブラスチシジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）に対する耐性を付与する抗生物質耐性遺伝子が含まれる。
【００６１】
多欠失ヒトＡｄ５ベクターバックボーンの概要図を図７Ａに示す。Ｅ１およびＥ３領域の古典的欠失（１１に概説されている）のほかに、本発明者らは、Ｌ４イントロンを含め、ｒ鎖においてコードされる他の機能に何ら影響を及ぼすことなくＤＮＡ結合タンパク質の全コード配列（［ｎｔ］２２２４５−２４０２９；（配列番号３）１７８４ｂｐ欠失）を除去した。三成分リーダー配列のイントロンおよび主要後期単位に対応するプレ末端タンパク質（Ａｄ５［ｎｔ］８９１９−９４６２（配列番号５）５４３ｂｐ欠失）遺伝子およびポリメラーゼ（［ｎｔ］７２７４−７８８３；（配列番号４）６０９ｂｐ欠失）の部分を欠失させてＥ２ｂ遺伝子発現をノックアウトした。さらに、ポリメラーゼのトランケート化非活性形態の産生を妨げるために、ＡＴＧ開始コドンをＣＴＧに突然変異させた。Ｅ４プロモーターに直接的に融合したｏｒｆ３を除き、Ｅ４領域を完全に欠失させた（［ｎｔ］３２８３０−３４３１６（配列番号６）および３４８９５−３５４４３；（配列番号７））。
【００６２】
全初期遺伝子の欠失を組合せることによりＡｄ５バックボーンにおいて生じた理論的空間は約１２．４Ｋｂである。該新規ベクター系の大きな容量を利用して、マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）プロモーターに融合した全ＨＣＶポリタンパク質遺伝子用の発現カセットを挿入した。該ＨＣＶポリタンパク質発現カセットは、５’および３’非翻訳領域を除去し、コアＡＴＧの上流に最適コザック配列を挿入し、ＮＳ５Ｂレプリカーゼの触媒ドメインを変異させて酵素活性を除去することにより構築した（３２）。トランスジーンの発現効率を増加させるために、ヒトＣＭＶプロモーターを、ＦＧアデノウイルスベクターにおいて４〜３０倍強力であると報告されているマウスＣＭＶプロモーター（１）で置換した。
【００６３】
図７Ｂは、多欠失ベクターのＥ１領域内に導入されたＨＣＶ（株ＢＫ）ポリタンパク質発現カセットの概要図を示す。ＨＣＶ ５’および３’ＵＴＲ配列を除去し、最適化コザック配列を該ポリタンパク質の５’側に融合させた。発現はマウスＣＭＶプロモーター（ｍＣＭＶ）およびウシ成長ホルモンポリＡ（ＢＧＨポリＡ）により調節される。
【００６４】
オープンリーディングフレーム３の維持は、内部ＣＭＶプロモーターにより調節されるトランスジーンのインビボおよびインビトロでの持続的発現に必要であることが公知である（１８，３４）。したがって、ΔＥ１Ｅ３ＦＧベクターの５７００ｂｐの欠失、およびそれによる、ｗｔ（６）の１０５％のゲノムサイズのパケーンジング容量に加えて、該新規Ａｄ５ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋ウイルスベクターは１２．４Ｋｂまでのトランスジーンを収容しうる。この目的には、本発明のアデノウイルスアンプリコンおよびプロデューサー細胞ならびに本発明の方法を用いて、関心のある多数のトランスジーンを含む欠損アデノウイルスベクターを得ることが可能であると予想される。
【００６５】
本明細書中に開示されている多欠失Ａｄ５ウイルスバックボーンにおける使用のための適当なトランスジーンには、特定の哺乳類種における発現に関してコドンが最適化された、免疫原をコードする核酸配列（すなわち、トランスジーン）が含まれるが、これに限定されるものではない。１つの実施形態においては、本発明は、感染因子により発現される抗原に対する免疫応答を誘導するための免疫原性組成物（例えば、ワクチン）を提供する。例えば、ヒトおよび／または非ヒト動物種に感染するウイルスに対する免疫応答を惹起することが望ましい。
【００６６】
多欠失Ａｄ５ベクターは、細菌、真菌、寄生生物を含む病原体により発現されるタンパク質に対するヒトまたは動物における免疫応答を刺激するのにも適していよう。スタフィロコッカス・アウレスス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトコッカス・ピロゲネス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ビブリオ・コレラ（ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、クロストリジウム・テタニ（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、ナイゼリア・メテンジチス（ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）、コリネバクテリウム・ジフテリアエ（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｅｒｉａｅ）、ミコバクテリウム・ツバクロシス（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびレプラエ（ｌｅｐｒａｅ）、リステリア・モノサイトジェネス（ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｆｉｌａ）は、望ましいであろう、免疫応答を惹起する対象となる細菌の具体例であるが、これらに限定されるものではない。真菌および寄生生物の具体例としては、カンジタ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・フミガツス（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、ヒストプラズマ・カプスラツム（ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、プラスモジウム・マラリアエ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、レイシュマニア・マジョール（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）、トリパノソマ・クルジ（ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅ ｃｒｕｚｉ）およびブルセイ（ｂｒｕｃｅｉ）、シストロソマ・ヘマトビウム（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ）、マナソニ（ｍａｎｓｏｎｉ）およびジャポニカム（ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）；エンタモエバ・ヒストリチカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、ヒトフィラリア症を引き起こすフィラリア（Ｆｉｌａｒｉａ）の種々の種が挙げられうる。
【００６７】
予防的および／または治療的免疫応答が望ましいであろうウイルス科の具体例には、アフトウイルス属、カルヂオウイルス属、エンテロウイルス属、ヘパトウイルス属、パレコウイルス属、ライノウイルス属のような６つの異なる属を含むピコルナウイルス科が含まれる。これらのすべては、脊椎動物に感染するウイルスを含有する。免疫応答が望ましいであろうピコルナウイルスの具体例としては、口蹄疫ウイルス、脳心筋炎ウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、ヒトＡ型肝炎ウイルス、ヒトパレコウイルス（ｐａｒｅｃｈｏｖｉｒｕｓｅｓ）、ライノウイルスが挙げられる。カリシウイルス科は、ノーウォーク群のウイルスにより引き起こされるヒトにおける流行性胃腸炎、およびウサギ出血性疾患ウイルスに関連したウサギにおける出血性疾患またはネコカリシウイルスにより引き起こされるネコにおける呼吸疾患のような動物における他の症候群に関連した種々の属を含む。もう１つの科は、ヒトおよび多数の異なる動物種から分離されたウイルスを含むアストロウイルス科である。ヒトアストロウイルスは胃腸炎および乳幼児の下痢に関連している。トガウイルス科はアルファウイルス属およびルビウイルス属の２つの属を含む。アルファウイルス属は、ヒトおよび獣医学的疾患、例えば関節炎（すなわち、チクングニヤウイルス、シンドビスウイルス）または脳炎（すなわち、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス）に関連している。風疹ウイルスは、発熱およびリンオアデノパシーに関連した軽度の発疹性疾患の突発を引き起こすルビウイルス属の唯一のメンバーである。風疹ウイルス感染は、妊娠初期に母親により獲得された場合には、胎児異常にも関連する。フラビウイルス科は、重要なヒトおよび動物病原体を含むフラビウイルス属、ペスチウイルス属およびヘパシウイルス属の３つの属よりなるもう１つのウイルス科である。フラビウイルス属のメンバーの多くは、発熱、脳炎および出血熱を含む種々の疾患を引き起こす節足動物媒介ヒト病原体である。デング熱ウイルス、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、西ナイル熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルスは、世界的または地域的（地域流行性）に懸念される主要な病原体である。ペスチウイルス属は、経済的に非常に重要な動物病原体、例えばウシウイルス性下痢ウイルス、古典的ブタコレラウイルス、ボーダー病ウイルスを含む。Ｃ型関連ウイルスは、急性および慢性肝炎を引き起こすヘパシウイルス属の唯一のメンバーである。組換えアデノウイルスにより発現されるＨＣＶタンパク質は、世界中で１億７０００万人を冒すウイルス感染の結果を抑制する防御用および治療用免疫応答を惹起しうる。
【００６８】
コロナウイルス科のメンバーに由来する抗原を組換えアデノウイルスベクターにより発現させて、感染に対する防御を得ることが可能である。重篤な急性呼吸症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ−Ｃｏウイルス）に対する防御は、限定的なものではないがヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質、ポリメラーゼ（Ｐ）タンパク質、膜（Ｍ）糖タンパク質、スパイク（Ｓ）糖タンパク質、小エンベロープ（Ｅ）タンパク質または該ウイルスにより発現される他のポリペプチドのいずれかを含むＳＡＲＳ−ＣｏＶタンパク質の組合せを発現する多欠失Ａｄ５ベクターで免疫することにより得られうる。狂犬病ウイルスを含むラブドウイルス科のメンバーは、ウイルスタンパク質を発現する組換えワクチンの標的となりうる。他の考えられうる標的には、いくつかの出血熱の突発を引き起こすエボラ様ウイルスおよびマールブルグ様ウイルス属を含むフィロウイルス科；麻疹、呼吸器合胞体、パラインフルエンザウイルスのようなヒトにおいて公知の最も一般的なウイルスおよびニューカッスル病および牛疫ウイルスのような獣医学的に関心の持たれるウイルスのいくつかを含むパラミクソウイルス科；インフルエンザＡ、Ｂ、Ｃウイルスを含むオルトミクソウイルス科；のようなリフトバレー熱、シン・ノンブレ（Ｓｉｎ Ｎｏｍｂｒｅ）、ハンタ、プーマラウイルスのような重要なヒト病原体を含む、主として節足動物により脊椎動物宿主に伝染するブニヤウイルス科；リンパ球性脈絡髄膜炎、ラッサ熱、アルゼンチン出血熱、ボリビア出血熱ウイルスを含むアレナウイルス科；主としてウマおよびヒツジにおける中枢神経系疾患を引き起こすウイルスを含むボルナウイルス（Ｂｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）科；世界的な乳児および幼児における重篤な下痢疾患の最も重要な原因であるロタウイルス、ヒトおよび他の哺乳動物の両方を冒しうるオルビウイルス（ブルータング、流行性出血熱ウイルス）を含むレオウイルス科が含まれる。
【００６９】
ウイルス抗原をコードする適切なトランスジーンは、重要なヒト病原体を含む大きなウイルス群であるレトロウイルス科のメンバー、例えばヒト免疫不全ウイルス１および２（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）ならびにヒトｔ細胞白血病ウイルス１および２型（ＨＴＬＶ１および２）ならびに非ヒトレンチウイルス、例えばヒツジおよびヤギを冒すマエディウイルス／ビスナウイルス、ウマを冒すウマ伝染性貧血ウイルス、ウシを冒すウシ免疫不全ウイルス、ネコを冒すネコ免疫不全ウイルス；ポリオーマウイルス科群小ＤＮＡ腫瘍原性ウイルス［原型ウイルスは、それぞれマウスおよびアカゲザルを冒すポリオーマウイルスおよびＳＶ４０である（ＳＶ４０に密接に関連しているＢＫおよびＪＣウイルスはヒト患者から分離された。）。］からも得ることが可能である。
【００７０】
パピローマウイルス科は、疣贅およびコンジロームを生成する、ヒトを含む高等脊椎動物を冒すＤＮＡウイルス群からなる。パピローマウイルスの感染はヒトおよび動物の両方における癌の発生に関連づけられた。ヒトパピローマウイルスは子宮頚癌、膣癌および皮膚癌に関連している。ヘルペスウイルス科は、ヒトおよび他の哺乳動物に対する多数の重要な病原体が分類される亜科を含む。他の抗原源には、単純ヘルペスウイルス１および２、水痘・帯状疱疹ウイルス、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス６Ａ。６Ｂおよび７、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスが含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに適した抗原源としては、ポックスウイルス科のメンバー、例えばサル痘ウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、痘瘡ウイルス；ヘパドナウイルス科の原型メンバーであるＢ型肝炎ウイルスならびに急性および／慢性肝炎を引き起こす他のウイルス、例えばデルタ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルスが挙げられる。
【００７１】
第２の実施形態において、本発明は、腫瘍抗原に対する免疫応答を誘導するための免疫原性組成物（例えば、ワクチン）を提供する。適切な組成物は、腫瘍抗原をコードする最適化核酸配列を含む組換えチンパンジーアデノウイルスと生理的に許容される担体とを含有するであろう。特定の実施形態において、該カセットのコード配列要素は、単一の免疫原、例えば病原因子由来の抗原、または自己抗原、例えば腫瘍関連抗原をコードしうる。他の実施形態において、該コード配列は２以上の免疫原をコードしうる。例えば、これは、Ｈｅｒ２ Ｎｅｕ、ＣＥＡ、Ｈｅｐｃａｍ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、テロメラーゼ（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ）、ｇｐ１００、メラン（Ｍｅｌａｎ）−Ａ／ＭＡＲＴ−１、Ｍｕｃ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、スルビビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、ストロメリシン（Ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ）３、チロシナーゼ（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）、ＭＡＧＥ３、ＣＭＬ６８、ＣＭＬ６６、ＯＹ−ＴＥＳ−１、 ＳＳＸ−２、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−２、ＳＡＲＴ−３、ＮＹ−ＣＯ−５８、ＮＹ−ＢＲ−６２、ｈＫＬＰ２、ＶＥＧＦ、５Ｔ４のような自己抗原の組合せをコードしうる。
【００７２】
トランスジーンの発現を導くために使用する転写プロモーターは、好ましくは、真核性ＲＮＡポリメラーゼにより認識される。好ましい実施形態においては、該プロモーターは「強力」または「効率的」プロモーター、例えば、本明細書に記載の実施例において使用するマウスＣＭＶプロモーター（ｍＣＭＶ）である。もう１つの強力プロモーターの一例は、好ましくはイントロン配列を伴わない、最初期ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（参照により本明細書に組み入れるＣｈａｐｍａｎら，１９９１ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９：３９７９−３９８６）である。したがって、本明細書中に開示されており特許請求されているエピソームにおける使用に適した１つの代替的プロモーターには、ヒトＣＭＶプロモーターが含まれる。当業者は、任意の多数の他の公知プロモーター、例えば強力な免疫グロブリンまたは他の初期もしくは後期ウイルスプロモーター、例えばＳＶ４０初期もしくは後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）初期プロモーター；真核細胞プロモーター、例えばβアクチンプロモーター（Ｎｇ，Ｓ．Ｙ．，Ｎｕｃ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１７：６０１−６１５，１９８９，Ｑｕｉｔｓｃｈｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：９５３９−９５４５，１９８９）、ＧＡＤＰＨプロモーター（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５０９２−５０９６，１９８８，Ｅｒｃｏｌａｎｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５３３５−１５３４１，１９８８）、メタロチオネインプロモーター（Ｋａｒｉｎら Ｃｅｌｌ ３６：３７１−３７９，１９８９；Ｒｉｃｈａｒｄｓら，Ｃｅｌｌ ３７：２６３−２７２，１９８４）ならびにコンカテネーション化応答要素プロモーター、例えばサイクリックＡＭＰ応答要素プロモーター（ｃｒｅ）、血清応答要素プロモーター（ｓｒｅ）、ホルボールエステルプロモーター（ＴＰＡ）および応答要素プロモーター（ｔｒｅ）（最小ＴＡＴＡボックス近傍のもの）を使用しうると理解する。
【００７３】
遺伝子発現カセット内に存在する好ましい転写終結配列は、ウシ成長ホルモンターミネーター／ポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐＡ）である。代替的転写終結／ポリアデニル化配列には、チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子に由来するもの又はＳＶ４０由来配列、例えばｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において見出されるものが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７４】
本発明の目的、利点、用途および方法について全般的に説明してきたが、本発明の種々の実施形態を詳細に説明するために、以下に非限定的な実施例を記載する。しかし、本明細書に記載の発明は、以下の実施例の詳細には限定されず、これらは、本発明の実施を望む者のための単なる指針として記載されているに過ぎないと理解されるべきである。本発明の範囲は、完全な開示および本明細書に添付されている特許請求の範囲に関して評価されるべきである。
【００７５】
材料および方法
本発明の実施は、特に示さない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学および生化学の通常の技術を用い、これらは当技術分野の通常の技術の範囲内である。このような技術は、例えば“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ＆ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，１９８７）；“Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ”（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ＆ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編，１９８７）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９８７）；および“ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”（Ｍｕｌｌｉｓら編，１９９４）のような参考文献に十分に説明されている。
【００７６】
配列決定は、標識プライマーもしくはターミネーターを使用する商業的に入手可能な自動シークエンサーまたは配列決定用のゲルに基づく方法を用いて行うことが可能である。また、配列分析は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子上でお互いに直に隣接してアニールするオリゴヌクレオチド配列の連結に基づく方法により行う（ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０−５６９（１９８９）；Ｌａｎｄｒｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：８９２３−８９２７（１９９０）；Ｂａｒａｎｙ，Ｆ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：１８９−１９３（１９９１））。図１１は、本開示に記載されているポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列（すなわち、配列番号１〜２１）を示す。
【００７７】
本開示の全体にわたって記載されている具体的な塩基対の番号に関する基準として、野生型アデノウイルス血清型５を使用する。野生型アデノウイルス血清型５の配列は公知であり、当技術分野において記載されている。参照により本明細書に組み入れるＣｈｒｏｂｏｃｚｅｋら，１９９２ Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８６：２８０を参照されたい。当業者は、アデノウイルス血清型５に関する塩基対により定められる領域に対する配列相同性により、他のアデノウイルス血清型（例えば、血清型２、４、６、１２、１６、１７、２４、３１、３３および４２）における前記領域を容易に特定することが可能である。したがって、ヒトアデノウイルス血清型５を使用する以下の実施例は限定的なものではないと理解されるべきである。当業者は、異なるアデノウイルス血清型（例えば、Ａｄ２）に関して、類似したプラスミド、ウイルスおよび技術を利用しうると認識するであろう。同様に、異なるヒトアデノウイルス、特にチンパンジーアデノウイルスに関して、類似したプラスミド、ウイルスおよび技術を利用しうるため、ヒトＡｄの使用は限定的なものではない。
【００７８】
プラスミドの構築
Ｔｅｔサイレンサーおよび逆Ｔｅｔトランスアクチベーター発現カセットを含有するｐＩＲＥＳＴの構築を図１Ａに記載する。該Ｔｅｔ系は、単一の発現ベクターにおいて、以下のとおりに構築した。Ｔｅｔサイレンサー（ｔＴＳ）を含有するＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩ ＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＨＳ６−１（Ｅ．Ｂｕｊａｒｄにより快く提供されたもの）から単離し、ベクターｐＩＲＥＳ−Ｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）内のＩＲＥＳ配列の下流に挿入してＮｅｏ遺伝子を置換した。その新たなベクターｐＩＲＥＳ−ｔＴＳを、ヒトサイトメガロウイルスＩＥプロモーターの下流の唯一のＥｃｏＲＶ制限部位内へのｒｔＴＡ２遺伝子（Ｅ．Ｂｕｊａｒｄにより快く提供されたｐＵＨＤ ５２−１に由来する。）の挿入により修飾して、ｐＩＲＥＳｔＴＳ／ｒｔＴＡを得た。図２は、ＡｄＴｅｔＬｕｃ感染クローンにおけるルシフェラーゼ発現のグラフ表示を示す。簡潔に説明すると、２９３ＥＢＮＡ細胞および種々の２９３ＥＢＮＡ／Ｔｅｔクローンに、１μｇ／ｍｌ ドキシサイクリンの存在下（黒色棒線）または非存在下（白色棒線）、ＡｄＴｅｔＬｕｃを感染させた（ｍ．ｏ．ｉ １０）。細胞溶解物におけるルシフェラーゼ活性を感染の４８時間後に評価した。
【００７９】
Ｔｅｔタンパク質を安定に発現する細胞クローンを単離するための選択ーマーカーを導入するために、ｐＰＵＲベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から得たピューロマイシン耐性発現カセットをｐＩＲＥＳｔＴＳ／ｒｔＴＡのＸｈｏＩ部位内に挿入してｐＩＲＥＳｔＴＳ／ｒｔＴＡｐｕｒｏを得た。ｐＥ２の構造を図１Ｂに記載する。
【００８０】
Ａｄ５ポリメラーゼｃＤＮＡを含むプラスミドｐＶａｃＰｏｌから得たＣｌａＩ／ＳｐｈＩ断片、およびＡｄ５−ｐＴＰ ｃＤＮＡを含有するｐＶＡＣｐＴＰからのＡｃｃ６５／ＥｃｏＲＶ断片を誘導性Ｔｅｔプロモーターの制御下のベクターｐＢＩ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）内に挿入することにより、Ａｄ５ポリメラーゼおよびプレ末端タンパク質を発現するビシストロン発現ベクターを構築した（ｐＶａｃＰｏｌおよびｐＶＡＣｐＴＰはＰ．Ｃ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｌｉｅｔにより快く提供されたものである。）。オリゴヌクレオチド：５’−ＴＴＡＴＡＣＧＣＧＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＴＡＣＧＴＣＣＧＧ−３’（配列番号９）および５’−ＴＴＡＴＧＣＴＡＧＣＧＣＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＴＣＣＡＣＧ−３’（配列番号１０）ならびにｐＦＧ１４０（１９）から得たＡｄ５ ＤＢＰ遺伝子（Ａｄ５［ｎｔ］２２４４３−２４０３２）（配列番号１１）を使用するＰＣＲにより得たＡｄ５ Ｅ４ ｏｒｆ６（Ａｄ５［ｎｔ］３３１９３−３４０７７）（配列番号８）を同じベクターｐＢＩ内に挿入することにより、第２の二方向性誘導性カセットを構築した。
【００８１】
ＨＳ４絶縁体（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）に隣接するｐＣＥＰ４に由来するＥＢＶ−ＯｒｉＰ（ＥＢＶ［ｎｔ］７３３３〜ヌクレオチド９３１２；ＧｅｎＢａｎｋ Ｖ０１５５５）（配列番号１２）領域をｐＪＣ１３−１（９）のＢａｍＨＩ部位内への直接的クローニングにより得た。オリゴヌクレオチド：５’−ＡＡＣＴＡＣＡＡＴＴＣＣＣＡＡＣＡＣＡＴＡＣ−３’（配列番号１３）および５’−ＣＡＣＡＴＣＣＧＴＣＧＣＴＴＡＣＡＴＧ−３’（配列番号１４）を使用するｐＦＧ１４０からのＰＣＲにより、Ａｄ５ ＩＴＲ結合部を増幅した。
【００８２】
最後に、ｔｋ−ヒグロマイシン−Ｂホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）カセットをｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から誘導した。ｐＥ２を構成するすべての要素をｐＢＩ−ｐｏｌ／ｐＴＰベクター内に順次導入して、最終的にｐＥ２を得た。
【００８３】
ｐＡｄ５ΔＥ１−４の構築
ｐＡｄＣＭＶ／ＬａｃＺ／ΔＰｏｌベクター（Ａ．Ａｍａｌｆｉｔａｎｏから快く提供されたもの（４））およびＡｄ５ｄｌ３０８ΔｐＴＰβ−ｇａｌ（Ｊ．Ｓｃｈａａｃｋから快く提供されたもの）（４５）からのそれぞれＡｄ５ポリメラーゼ（Ａｄ５［ｎｔ］７２７４−７８８３）（配列番号４）およびプレ末端タンパク質（Ａｄ５［ｎｔ］８９１５−９４６２）（配列番号５）の部分欠失をＭＲＫｐＡｄ５Ｅ３（５２）内に導入することにより、Ｅ２ｂ遺伝子が欠失したＡｄ５ΔＥ１−Ｅ３バックボーンを得た。また、ＡＴＧからＣＴＧへのポリメラーゼ開始コドンの部位特異的突然変異誘発も行って、最終的にｐＡｄ５ ΔＥ１，Ｅ３，Ｅ２Ｂベクターを得た。ＤＢＰ遺伝子を含むＤｒａＩ−ＭｓｃＩ断片（Ａｄ５［ｎｔ］２２４４５−２４０２９）が欠失したＡｄ５のＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ断片（［ｎｔ］２１５６３−２４７９７）を含有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳＩＩ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）はＲｏｃｃｏ Ｓａｖｉｎｏにより快く提供された。
【００８４】
＊＊＊ｐＡｄ−ΔＥ１−２ベクターは、ΔＤＢＰ断片およびＡｄΔＥ１，Ｅ３，Ｅ２Ｂベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂｊ５１８３内に同時形質転換する相同組換えにより得た。ｏｒｆ３を除く完全なＥ４単位（［ｎｔ］３２８３０−３４３１６および［ｎｔ］３４８９５−３５４４３）の欠失を、以下に記載するとおりに行った。ＡｖｒＩＩおよびＭｆｅＩ制限部位を末端に有するｏｒｆ３領域をＰＣＲ（ΔＥ４ｏｒｆ ｆｗ ＡｖｒＩＩ：５’− ＧＣＣＴＡＧＧＧＡＴＧＣＧＴＧＴＣＡＴＡＡＴＣＡＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣ−３’（配列番号１５）；ΔＥ４ｏｒｆ３ ｒｅｖ ＭｆｅＩ：５’−ＣＡＡＴＴＧＡＡＡＡＧＴＧＡＧＣＧＧＧＡＡＧＡＧＣＴＧＧＡＡＧＡＡＣＣＡＴＧ−３’（配列番号１６））により増幅し、同じ酵素で消化されたＥ４−シャトルベクター内にクローニングした。Ｅ４ｏｒｆ３はＥ４プロモーターおよびポリＡシグナルを維持する。ｐＡｄ５ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋ベクターを、そのようなＤＮＡをｐＡｄ５ΔＥ１−２ベクターと共に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＪ５１８３内に同時形質転換することにより得た。
【００８５】
すべての発現カセットは、トランスジーン発現用のＣＭＶプロモーターおよびＢＧＨポリＡシグナルに加えて、記載されている（５３）とおりに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＪ５１８３における相同組換えによりｐＡｄ５ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋のＥ１領域内の挿入を可能にするＡｄ５配列［ｎｔ］１−４５０（左）および［ｎｔ］３５１１−５７９２（右）を含有するＡｄ５−シャトルベクターのコンテクストにおいて構築した。ＥＧＦＰ ｃＤＮＡをｐＥＧＦＰプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）から得、ついでＡｄ−シャトルプラスミド内にクローニングしてｐＳｈＡｄ５ ＥＧＦＰを得た。５’および３’非翻訳末端反復配列（ＵＴＲ）が欠失したＨＣＶ−ＢＫ ｃＤＮＡ（ＨＣＶ ＢＫ［ｎｔ］３４２−９３７４（配列番号１７））をプラスミドｐＣＭＶ（１−９．４）（１４）から誘導した。
【００８６】
ＮＳ５Ｂ ＯＲＦは、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡ−ポリメラーゼの触媒三つ組み残基に対応する３つのアミノ酸位置において変異させて（Ｇ−２７３７をＡへ、Ｄ−２７３８をＡへ、およびＤ−２７３９をＧへ）、酵素活性を喪失させた（Ｎｉｃｏｓｉａら，未公開データ）。最適化コザック配列に融合したＨＣＶ ｃＤＮＡを、ＨＣＭＶプロモーターをＭＣＭＶプロモーターで置換することにより得たｐＡｄ５−シャトルの修飾形態内にクローニングして、最終的にｐＳｈＡｄ５ＨＣＶを構築した。ｐＡｄ５ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋のＥ１領域内へのすべての発現カセットの挿入を、記載されているとおりに（４３）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での相同組換えにより達成した。
【００８７】
細胞
２９３ＥＢＮＡ細胞系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、２ｍＭ グルタミンおよび２５０μｇ／ｍｌ Ｇ−４１８（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）内で培養した。０．５μｇ／ｍｌ ピューロマイシンを含有する同じ培地を使用することにより、２９３ＥＢＮＡＴｅｔ細胞を選択した。２Ｅ２細胞を選択することにより、９０μｇ／ｍｌのヒグロマイシンＢを、既に記載されている培地に加えた。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を該製造業者の説明に従い使用してプラスミドＤＮＡ形質移入を行った。逆ＴｅｔトランスアクチベーターおよびＴｅｔサイレンサータンパク質を発現する２９３ＥＢＮＡクローンを得るために、形質移入の１日前に、１×１０６個の２９３ＥＢＮＡ細胞を６ｃｍプレート内に播き、ＳａｐＩで線状化された５μｇのｐＩＲＥＳｔＴＳ／ｒｔＴＡｐｕｒｏで形質移入した。形質移入の４８時間後、細胞をトリプシン処理し、１５ｃｍプレート内のピューロマイシン含有ＤＭＥＭ内に播いた。耐性クローンを単離し、ついで、Ｔｅｔ−ルシフェラーゼカセットを含有する組換えＡｄ５でスクリーニングした。各クローンの５×１０５個の細胞を２４ウェルプレート内に三重に播き、該細胞にＡｄ５ Ｔｅｔ−ｌｕｃをドキシサイクリンの存在下および非存在下で１０の感染多重度（ｍｏｉ）で感染させた。感染の２４時間後、細胞を回収し、細胞溶解物においてルシフェラーゼ活性を測定した（ルシフェラーゼアッセイ系；Ｐｒｏｍｅｇａ）。遺伝子発現の誘導およびサイレンシングの両方を各クローンに関して、親２９３ＥＢＮＡ細胞において行った対照実験において得た相対光単位（ｒｌｕ）値に対する比として評価した。
【００８８】
２Ｅ２パッケージング細胞系を得るために、前記プロトコールに従い２９３ＥＢＮＡ Ｔｅｔ細胞をｐＥ２ベクターで形質移入した。９０μｇ／ｍｌのヒグロマイシンＢを含有するＤＭＥＭを使用して、安定なトランスフェクタントを選択した。耐性クローンを増殖させ、Ａｄ５ΔＥ１−２ＥＧＦＰ ＤＮＡの形質移入によりスクリーニングした。陽性クローンをＣＰＥの出現により特定し、Ａｄ５ΔＥ１−２ＥＧＦＰベクターの連続継代により確認した。１×１０６ ２Ｅ２細胞（ｎ＝３）からのエピソームコピー数を染色体外ＤＮＡ上で直接的に定量的リアルタイムＰＣＲにより評価した。プローブ（５’−ＦＡＭ−ＴＧＧＣＡＴＧＡＣＡＣＴＡＣＧＡＣＣＡＡＣＡＣＧＡＴＣＴ−３’−ＴＡＭＲＡ）（配列番号１８）ならびにプライマーＥ４−ｆｗ（５’−ＡＣＴＡＣＧＴＣＣＧＧＣＧＴＴＣＣＡＴ−３’）（配列番号１９）およびＥ４−ｒｗ（５’−ＧＧＡＧＴＧＣＧＣＣＧＡＧＡＣＡＡＣ−３’）（配列番号２０）。
【００８９】
ウイルスの増幅および力価測定
多欠失ウイルスの産生を２Ｅ２パッケージング細胞系において行った。アデノウイルスゲノムをＰａｃＩ消化によりそれぞれのプラスミドから遊離させ、１μｇ／ｍｌ ドキシサイクリンの存在下で２Ｅ２細胞内に形質移入した。形質移入の４〜６日後、細胞を３サイクルの凍結／解凍により細胞溶解し、該溶解物の５分の１を使用して、該ウイルスを連続継代により増幅した。２層細胞ファクトリー（ｆａｃｔｏｒｙ）（ＮＵＮＣ）内に播いた２Ｅ２細胞に感染させることにより、大規模増幅を行った。アデノウイルスベクターをＣｓＣｌ勾配により精製し、透析し、リアルタイムＰＣＲにより定量した。該ＣｓＣｌ精製ベクターの感染度を組織培養感染量５０％（ＴＩＣＤ５０）として２Ｅ２上で評価した（４３）。
【００９０】
サザンブロット分析
ｐＥ２複製をサザンブロット分析により評価した。２９３ＥＢＮＡＴｅｔ細胞を６ｃｍディッシュ内に播き、ドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により５μｇのｐＥ２ベクターで形質移入した。４８時間後、Ｈｉｒｔ法（２２）により染色体外ＤＮＡを単離した。ついでＤＮＡをＮｏｔＩおよびＤｐｎＩで消化し、３２Ｐ ＤＮＡプローブを使用する標準的な方法によるサザン分析に付した。Ｐｈｏｓｐｈｏｒ Ｉｍａｇｅｒ（商標）系（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用するオートラジオグラフィーによりシグナルを検出した。
【００９１】
安定なｐＥ２クローンからのエピソームＤＮＡをＨｉｒｔプロトコールに従い抽出し、ＢａｍＨＩで消化し、３２Ｐ標識ｐＥ２ ＤＮＡをプローブとして使用するサザンブロット法により分析した。
【００９２】
ウエスタンブロット分析
形質移入の４８時間後、以下のとおりにタンパク質発現の分析を行った。２Ｅ２歳棒をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、６ｃｍプレート当たり０．５ｍｌのＲＩＰＡバッファー（１×ＰＢＳ、１％ ＮＰ−４０、０．５％ デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、０．０５ｍＭ ＰＭＳＦ）を加えることにより細胞溶解した。プレートを氷上で１時間インキュベートし、ついで１０，０００×ｇ、４℃での遠心分離後、可溶性タンパク質を細胞溶解物から集めた。３０μｇのタンパク質上でウエスタンブロット分析を行った。サンプルを１０％ ＳＤＳ ＰＡＧＥ上で分離し、Ｐｒｏｔａｎニトロセルロースメンブレン（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよびＳｃｈｕｅｌｌ）上にブロッティングした。該メンブレンをポリメラーゼまたはｐＴＰに対するウサギ抗血清と共に、および抗ＤＢＰ ｍａｂ（Ｆ．Ｇｒａｈａｍ，Ｍｃ Ｍａｓｔｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｃａｎａｄａにより快く提供されたクローンＨ２−１９）と共にインキュベートした。ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体の存在下でのインキュベーション後、タンパク質をＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光基質（ＰＩＥＲＣＥ）により検出した。以下の試薬を使用することによりＨＣＶタンパク質発現を検出した：抗コアモノクローナル抗体（ｍａｂ）Ｂ１２．Ｆ８（Ｍ．Ｍｏｎｄｅｌｌｉ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐａｖｉａにより快く提供された）；抗Ｅ２、ｍａｂ １８５．Ｃ７；抗ＮＳ３ ｍａｂ １０Ｅ５／２４；抗ＮＳ５ａ、ウサギポリクローナル抗血清；抗ＮＳ５ｂ ｍａｂ ２０Ｂ６／１３。
【００９３】
免疫化プロトコールおよび免疫応答の分析
６〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６、Ａ２．１およびＣＢ６Ｆ１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、該ウイルスを両方の大腿四頭筋内に注射することにより免疫した。注射の３週間後に免疫応答を分析した。
【００９４】
該ウイルスを大腿四頭筋内に注射することにより、アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ）を免疫した。注射の４、６、８および１２週間（Ｗ）後に免疫応答を分析した。
【００９５】
Ｅ２タンパク質に対する抗体価を、Ｚｕｃｃｈｅｌｌｉ，Ｓ．ら（５５）に記載されているとおりにＥＬＩＳＡにより測定した。細胞性免疫応答を以下に記載のとおりに評価した。ＨＣＶコア、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａおよびＮＳ５ｂタンパク質の全配列を含む１５マーの重複ペプチドのプールを使用して、ＨＣＶ特異的ＩＦＮγ分泌細胞を明らかにした。いくつかの実験においては、ＣＤ８＋エピトープを含有する９マーペプチドを使用して免疫応答を評価した（ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質からのｐｅｐｌ４８０，ＧＡＶＱＮＥＶＴＬ（配列番号２１））。以下のとおりにＩＦＮγ酵素結合イムノスポットアッセイ（ＥＬＩｓｐｏｔ）によりＩＦＮγ分泌細胞を定量した。マルチスクリーン９６ウェル濾過プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を１００μｌの抗マウスＩＦＮγ Ｍａｂ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）でコートし、４℃で一晩インキュベートし、ついで１×ＰＢＳで洗浄し、ウェル当たり２００μｌのＲ１０培地で２時間ブロッキングした。脾細胞を免疫化マウスから調製し、Ｒ１０培地（１０％ ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０Ｕ／ｍｌ ペニシリン、５０μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０μＭ ２−メルカプトエタノールで補足されたＲＰＭＩ １６４０）内に再懸濁させ、ついで、２．５×１０５または５×１０５／ウェルの密度で抗ＩＦＮγ ｍａｂでコートされたマルチスクリーン９６ウェルプレート上でプレーティングした。ついで脾細胞を２００ｎｇ／ウェルのペプチドプールの存在下で２４時間インキュベートした。十分な洗浄（１×ＰＢＳ、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ）の後、ビオチン化ラット抗マウスＩＦＮγ抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を加え、室温で３時間インキュベートした。最後に、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（ＰｈａｒＭｉｇｅｎ）および１−Ｓｔｅｐ ＮＢＴ−ＢＣｌＰ現像液（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）を該ウェルに加えた。ＥＬＩｓｐｏｔリーダー（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を使用してスポットを計数した。
【００９６】
ＩＦＮγ細胞内染色およびＦＡＣＳ分析を以下のとおりに行った。Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイに関して記載されているとおりに調製した脾細胞を、タンパク質輸送を抑制するブレフェルジン（ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ，ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を含有するＲ１０培地内でペプチドプールと共に一晩インキュベートした。ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ ｗ／ｏ ＣａおよびＭｇ、１％ ＦＣＳ、０．０１％ ＮａＮ３）中、飽和量の精製抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２と共に細胞をインキュベートすることにより、細胞ブロッキングを行った。ＦＡＣＳバッファーでの洗浄の後、ＡＰＣ結合抗マウスＣＤ３ｅ、ＰＥ結合抗マウスＣＤ４およびＰｅｒＣＰ結合抗マウスＣＤ８ａ抗体を該細胞に加え、室温で３０分間インキュベートした。ついで、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ Ｐｌｕｓ（ＧｏｌｇｉＰｌｕｇを伴う）キットを使用して、細胞を４℃で２０分間にわたり透過性亢進させた。Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈでの洗浄の後、ＦＩＴＣ結合抗マウスＩＦＮγを加え、該細胞を室温で３０分間インキュベートした。該最終染色工程後、該細胞を洗浄し、１％ ホルムアルデヒド中で固定した。データを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｋｔｏｎ ＆ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して集め、Ｃｅｌｌ−Ｑｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。すべての抗体および二次試薬はＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。
【００９７】
Ａｃｃｕｓｐｉｎ Ｉｓｔｏｐａｑｕｅチューブ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ Ａ０５６１）を該製造業者の説明に従い使用して、サルＰＢＭＣをＥＤＴＡ処理末梢血から単離した。簡潔に説明すると、血液を、等容量のＨＢＳＳ（ハンクス平衡溶液Ｇｉｂｃｏ ｃａｔ １４１７５−０５３）を含有するＡｃｃｕｓｐｉｎチューブ内に移し、８００ｇ、室温で１５分間遠心分離した。ＰＢＭＣバンドを集め、ＨＢＳＳで１回、Ｒ１０で１回洗浄し、最後にＲ１０に再懸濁させた。各ウェル内でプレーティングする細胞の量が異なる以外は前記のとおりに（２×１０５および４×１０５／ウェル）、ｇ−ＩＦＮ−Ｅｌｉｓｐｏｔを行った。
【００９８】
ワクシニアウイルスチャレンジ
免疫化マウスに５×１０６ｐｆｕのＶＶ−ＮＳをｉ．ｐ．注射した。５日後に摘出した個々のマウスからの対（ペア）になった卵巣を均質化し、３回、凍結−解凍し、Ｈｕｌ４３ＴＫ−細胞の単層上で１０倍希釈物をプレーティングすることにより力価測定した。４８時間後、０．５％ クリスタルバイオレットでの染色により力価を読取った。
【００９９】
実施例
本発明の種々の特徴を更に例示するために、以下に実施例を記載する。該実施例は、特許請求されている発明の実施のための有用な方法をも例示するものである。該実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【０１００】
Ｔｅｔ−Ｓ／ｒｔＴＡ２を共発現する細胞系の開発
２９３ＥＢＮＡ細胞系におけるｐＩＲＥＳｔＴＳ／ｒｔＴＡｐｕｒｏ形質移入およびそれに続くピューロマイシン選択（「材料および方法」を参照されたい）により得た安定なクローンを、Ｔｅｔ誘導性ルシフェラーゼ発現カセットを含有する第１世代Ａｄベクター（Ａｄ Ｔｅｔ−ｌｕｃ）を使用することによりスクリーニングした。ピューロマイシン耐性クローンを２４ウェルプレート内に三重に播き、１０のｍｏｉで細胞にＡｄ Ｔｅｔ−ｌｕｃを感染させ、該細胞をドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）の存在下／非存在下で維持した。感染の２４時間後、該粗細胞溶解物においてルシフェラーゼの発現を測定した。２０倍を超えるルシフェラーゼ活性の誘導を示すクローンを選択し、増殖させた。図２に示すとおり、選択されたすべてのクローンにおいて、Ｔｅｔサイレンサーの共発現はルシフェラーゼの基底レベルを減少させた。ドキシサイクリンの存在下で基底発現に対して２５倍の減少を示し最良の誘導比（１００倍超）を伴うクローン１．１（２９３ＥＢＮＡＴｅｔと称される）を選択し、増殖させた。
【実施例２】
【０１０１】
Ｅ２／Ｅ４ ｏｒｆ６アデノウイルスアンプリコン（ｐＥ２）の構築
すべての初期遺伝子が欠失したＡｄベクターを機能的に相補するために、以下の要素を含有する、Ａｄ５に基づくアンプリコンを構築した：ｉ）ＥＢＮＡ−１タンパク質を発現する分裂細胞の核における安定な維持のためのＥＢＶの潜在性複製起点（Ｏｒｉ−Ｐ）（４８）；ｉｉ）ｔｋ−ヒグロマイシンＢ選択マーカー；ｉｉｉ）Ａｄに基づく様態でのプラスミド複製を可能にするｐＦＧ１４０（１９）由来のＡｄ５ウイルスＩＴＲ結合部；ｉｖ）二方向性テトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下の２つの分岐転写単位において配置されたＡｄ５ Ｅ２（ポリメラーゼ、プレ末端タンパク質およびＤＮＡ結合タンパク質）およびＥ４−ｏｒｆ６遺伝子。Ｅ２およびＥ４ ｏｒｆ６遠位プロモーター（１７）に対するＯｒｉＰのエンハンサー効果を減少させるために、ＯｒｉＰ要素に隣接する２つのニワトリβグロビンＨＳ４絶縁体（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）二量体（９）をも導入した。得られたプラスミド（ｐＥ２）の構造を図１Ｂに示す。
【０１０２】
ｐＥ２で形質移入された２９３ＥＢＮＡＴｅｔ細胞の培地におけるドキシサイクリンの添加の際のＥ２遺伝子発現の誘導をウエスタンブロットにより測定した。図４Ｂ（レーン２、５および８）に示すとおり、エフェクター薬の非存在下では形質移入の４８時間後にタンパク質発現は検出されなかったが、１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンを加えることにより転写を誘導した場合には、すべてのＥ２タンパク質の強力な発現が明らかであった（レーン３、６および９）。形質移入の４および６日後にも同様の結果が得られた（データ非表示）。
【０１０３】
Ａｄ複製に必要なシスおよびトランス作用性要素の両方が前記系内に存在するため、Ｅ２遺伝子発現の誘導が２９３ＥＢＮＡＴｅｔにより形質移入された細胞におけるｐＥ２ ＤＮＡ複製をも誘発するのかどうかを試験した。形質移入の４８時間後、全ＤＮＡ上のサザンブロットによりプラスミド複製を検出した。サンプルを、まず、ＤｐｎＩで消化して投入プラスミドＤＮＡを除去し、ついでＮｏｔＩで消化して、Ａｄ ＩＴＲを介して複製された直鎖状形態と天然環状プラスミド形態とを区別化した（図３）。図３に示すとおりにｐＥ２から誘導されたＤＮＡプローブとブロットとをハイブリド形成させたところ、該ブロットはｐＥ２の環状形態に関する１２．６Ｋｂのプラスミド由来のバンドを示した（図４Ａ、レーン１）。ｐＥ２で形質移入された細胞からの全ＤＮＡを分析したところ、複製されたアンプリコンの予想サイズのバンドは、ドキシサイクリンで細胞を誘導した場合にのみ、視認可能であった（図４Ａ、レーン２および３）。ＩＴＲ結合部が欠失したｐＥ２プラスミド誘導体の形質移入からはＤＮＡ複製の証拠は検出されなかった（データ非表示）。これらのデータは、ｔＴＳ／ｒｔＴＡサイレンシング／活性化系が、該プラスミドが一過性形質移入後に高コピー数で存在する場合であっても、ｐＥ２機能の完全な遮断を可能にするが、初期遺伝子発現のデオキシサイクリン誘導に際してはアデノウイルス特異的に該アンプリコンの効率的な複製を支持しうることを示した。それらは、初期遺伝子が欠失したアデノウイルスベクターのレスキューおよび増殖のための適当な系としての２９３ＥＢＮＡＴｅｔ細胞と組合されたｐＥ２アンプリコンを支持する確固たる証拠を提供した。
【実施例３】
【０１０４】
Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４相補細胞系の作製
Ｅ２遺伝子発現の誘導は、アデノウイルス複製装置の活性化を介して、直鎖状ＤＮＡとしてのｐＥ２の複製をもたらすことが観察された。ｐＥ２を使用して、Ｔｅｔ転写サイレンサー（ｔＴＳ）および逆Ｔｅｔトランスアクチベーター２（ｒｔＴＡ２）を発現する２９３ＥＢＮＡ細胞を形質転換して、２Ｅ２安定細胞系を得た。２Ｅ２細胞は、ドキシサイクリンを培地に加えた場合には、Ａｄ５第１世代（ＦＧ）ベクターに感染した２９３細胞より高いレベルのポリメラーゼ、前駆体末端タンパク質（ｐＴＰ）およびＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）を産生した。Ｅ２およびＥ４ＯＲＦ６遺伝子の発現は、誘導されると、第１世代（ＦＧ）アデノウイルスベクターと比較しうるレベルまでの、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４遺伝子を欠く多欠失Ａｄ５ベクターの増幅を効率的に支持した。
【０１０５】
簡潔に説明すると、ｐＥ２で形質移入された２９３ＥＢＮＡＴｅｔ細胞を、「材料および方法」に記載されているとおりに、ヒグロマイシンＢの存在下で選択した。個々のクローンを増殖させ、Ｅ２遺伝子欠失を含有するＡｄ５ベクターのレスキューおよび増殖を調べることによりスクリーニングした。６ウェルプレート内に播いた細胞をｄｏｘｙ存在下のＡｄ５ΔＥ１−２ベクターでの形質移入に付した。形質移入の７日後、細胞を凍結−解凍により細胞溶解し、５００μｌの細胞溶解物を使用して各対応クローンの新鮮単層に感染させた。継代１におけるＣＰＥの直接観察により陽性クローンの評価を行った。ついで該ベクターを該選択クローンにおいて連続継代し、リアルタイムＰＣＲにより増殖を評価した。２回の連続継代の後、ウイルスゲノムは細胞溶解物１ｍｌ当たり約１×１０１０ ゲノムのプラトー付近に達し、ついでこれを、感染ｍｏｉの上昇にもかかわらず維持された（データ非表示）。サザンブロット分析で染色体外ＤＮＡを評価することにより、未修飾無傷エピソーム要素としてｐＥ２を含有するいくつかのクローンを特定した。
【０１０６】
細胞系の特徴づけ及びΔＥ１，Ｅ２，Ｅ３，Ｅ４ベクターの増幅の後続工程のために、２Ｅ２と称されるクローン１１を選択した。まず、２Ｅ２細胞におけるｐＥ２のコピー数を、染色体外ＤＮＡ上のリアルタイムＰＣＲにより、１６コピー／細胞の平均として決定した（ｎ＝３）。継代にわたる２Ｅ２細胞におけるｐＥ２エピソームプラスミドの安定性を評価するために、１５継代後にＨｉｒｔ法（２２）によりエピソームＤＮＡを抽出し、ついでＢａｍＨＩで消化し、プラスミド全体をプローブとして使用するサザンブロットにより分析した。図５Ａには、元のプラスミドと比較した、細胞系から抽出されたエピソームの制限パターンが示されている。それらのパターンは同一であった。このことは、該エピソームが細胞核内で経時的に安定に維持されること、およびプラスミド構造内の再構成が生じなかったことを示している。エピソームＤＮＡの安定性は、ドキシサイクリンの非存在下で検出可能な発現を伴わない一過性形質移入実験で既に観察されているものに類似した細胞系の１５継代後にウエスタンブロットによりＥ２タンパク質の発現を分析することによっても証明された（図５Ｂ）。Ｅ２タンパク質発現レベルを比較するために、ＦＧウイルスに感染した未誘導２Ｅ２細胞から得た細胞抽出物を含めた。
【実施例４】
【０１０７】
ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋ Ａｄ５バックボーンの構築
該ベクター構築を促進するために、左ＩＴＲおよびパッケージングシグナル（Ａｄ５［ｎｔ］１−４５０）（配列番号１）ならびに発現カセットに隣接するｐＩＸ遺伝子（Ａｄ５［ｎｔ］３５１１−５７９２）（配列番号２）を含むＡｄ５断片を含有するシャトルベクターを構築した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＪ５１８３における相同組換えにより発現カセットをＡｄ５ Ｅ１領域内に組換えた。その新たなベクター系を評価するために、ｐＡｄ５ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋ＥＧＦＰを構築した。ｐＡｄ５ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋ＥＧＦＰベクターをＰａｃＩで線状化して感染性ウイルスＤＮＡをプラスミド配列から遊離させ、２Ｅ２細胞内に形質移入し、それをドキシサイクリンの存在下または非存在下でインキュベートした。２連続継代後に得た結果を図６に示す。ＥＧＦＰ形質導入ウイルス粒子およびＣＰＥは、培地へのドキシサイクリン添加によりＥ２およびｏｒｆ６遺伝子が誘導された場合にのみ生じた。ｏｒｆ３およびｏｒｆ６タンパク質の共発現は、Ｅ４単位が欠失したＡｄベクターの高力価増幅に寄与する（２５）。相補遺伝子誘導の非存在下ではウイルス粒子は生じなかった。ベクター産生のプラトーは、細胞の１００％がＥＧＦＰ陽性である場合に、２連続継代の直後に観察された（図６）。高力価への多欠失ベクターの増殖の支持における該新規細胞系の効率を評価するために、５つの２層細胞ファクトリー（Ｎｕｎｃ Ｉｎｃ．）内に播かれた約５×１０８個の２Ｅ２細胞を感染させることにより、大規模製造を試みた。該ウイルスをＣｓＣｌ勾配の２回通過により精製し、リアルタイムＰＣＲにより定量して、最終的に、約５０００ｖｐ／細胞の生産で２×１０１２ ｖｐ／ｍｌの力価を得た。ＥＧＦＰおよびＨＣＶを発現する多欠失ベクターとＦＧベクターとの間の比較を表１に示す。
【０１０８】
【表１】
【０１０９】
すべての初期遺伝子の欠失を組合せることによりＡｄ５バックボーン内に生じた理論的空間は約１２．４Ｋｂである。該新規ベクター系の大きな容量を利用して、マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）プロモーターに融合した全ＨＣＶポリタンパク質遺伝子用の発現カセットを挿入した。該ＨＣＶポリタンパク質発現カセットは、５’および３’非翻訳領域を除去し、コアＡＴＧの上流に最適コザック配列を挿入し、ＮＳ５Ｂレプリカーゼの触媒ドメインを突然変異させて酵素活性を除去することにより構築された（４４）。トランスジーンの発現効率を増加させるために、ヒトＣＭＶプロモーターを、ＦＧアデノウイルスベクターにおいて４〜３０倍強力であると報告されているマウスＣＭＶプロモーター（１）で置換した。
【０１１０】
Ａｄ５ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋ＨＣＶベクターは２Ｅ２細胞内の形質移入により成功裏にレスキューされた。培地にドキシサイクリンを１μｇ／ｍｌの最終濃度で加えることにより、形質移入の直後にＥ２遺伝子発現を誘導した。２Ｅ２細胞内での連続継代によりＡｄ５ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋ＨＣＶベクターを増幅した。「材料および方法」に記載されているとおりに、粗細胞溶解物内のウイルスゲノム濃度をリアルタイムＰＣＲにより評価した。大規模調製物を得るために、４回の連続増幅継代の後に得た粗溶解物を使用して、２．８×１０９個の２Ｅ２細胞に約１００ゲノム／細胞のｍｏｉで感染させた。感染の４８時間後、完全なＣＰＥが明らかに認められた時点で細胞を回収した。精製ウイルスの最終収量を表１に示す。２９３細胞内で増殖させたＥＧＦＰを発現するΔＥ１Ｅ３ＦＧベクターと異ならない約５０００粒子／細胞の生産を得た。
【０１１１】
ポリメラーゼおよびプレ末端タンパク質の欠失は、これらの２つの遺伝子の一部分のみを含むものであったため、ＡｄベクターとｐＥ２エピソームとの間の相同性の領域は、野生型遺伝子をウイルスゲノム内にレスキューして戻すのに理論的に十分なものである。連続継代に際してのＡｄ５ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋ＨＣＶベクターの構造的完全性を評価するために、および野生型初期遺伝子を含有するウイルスの再構成が２Ｅ２細胞内でのベクター増幅中に生じうるかどうかを試験するために、ＣｓＣｌ精製ベクターのＤＮＡ構造を決定した。５継代後にウイルス粒子から精製したＤＮＡから得たパターンとプレ−アデノプラスミドの放射能標識制限パターンとの比較を図８に示す。
【０１１２】
該野生型遺伝子を含有する断片のサイズを比較するために、ＦＧプラスミドベクターをゲル（レーン１）内に含めた。Ａｄ５ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋ＨＣＶベクターの制限パターンは親プラスミドのものと同一であるようであり、再構成または野生型Ｅ２−Ｅ４遺伝子を含有するベクター種の出現の証拠は認められなかった。
【０１１３】
種々のｍｏｉのベクターを使用する２９３およびＨｅＬａ細胞系のインビトロ感染により、ＨＣＶタンパク質の発現の効率を評価した。ＨＣＶコア、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａおよびＮＳ５Ｂに対する特異的モノクローナル抗体またはポリクローナル抗血清でのウエスタンブロット分析は該感染細胞におけるＨＣＶタンパク質の存在を示したが、このことはＨＣＶポリタンパク質の正しいプロセシングを示している（図９）。未プロセシング産物は検出されなかった。
【０１１４】
２Ｅ２細胞系は、ＦＧベクターに感染した２９３細胞より高いレベルのＥ２ａおよびＥ２ｂを発現することを、データが示していることに注目すべきである。理論により束縛されるものではないが、比較的高いレベルのＥ２ａおよびＥ２ｂの産生が細胞当たりの多欠失ベクター粒子の高収量につながったと考えられる。細胞当たりの多欠失粒子の収量は、ＦＧベクターから得られた収量と一貫して比較しうるものであった。さらに、ＰｏｌおよびｐＴＰ遺伝子がｐＥ２との相同組換えによりベクターバックボーンにおいてレスキューされうる理論的可能性にもかかわらず、Ａｄ５ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋ベクターは連続継代にわたり安定であることが示された。相補タンパク質の発現の、観察された高いレベルは、おそらく、多欠失ベクターに対するＥ２ｂ野生型ウイルスの選択的利点を低下させるであろう。
【実施例５】
【０１１５】
ＡｄΔＥ１−４ｏｒｆ３＋ＨＣＶベクターでの免疫化はマウスにおける強力なＣＭＩ応答を誘導する
ヒトおよびチンパンジーにおいて観察されたＨＣＶ感染の消散は、典型的には、複数のエイトープに対する強力なＴ細胞応答を伴っている（５６，５７）。感染対象において特定されたＨＬＡクラスＩ限定エピトープは、クラスタリングの証拠を伴うことなく、ゲノム全体に広がっている（５８に概説されている）。細胞性免疫応答を惹起するＨＣＶポリタンパク質を発現する多欠失Ａｄベクターの効力をマウス免疫実験において評価した。該ベクターは、感染細胞のウエスタンブロット分析により示されるとおり成熟産物へと正しくプロセシングされるポリタンパク質前駆体全体の合成を導く。また、種々の系統のマウスにおいてマッピングされたＨＣＶ−ＢＫ ＣＤ８＋エピトープを含有するオリゴペプチドを使用して、該免疫化を観察した。ＨＣＶエピトープに特異的なＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞を、コア、Ｅ２およびＮＳタンパク質の配列全体に及ぶ重複１５マーペプチドのプールを使用することにより、ＩＦＮ−γ Ｅｌｉｓｐｏｔおよび細胞内染色（ＩＣＳ）により決定した。
【０１１６】
ＣＢ６Ｆ１およびＨＬＡ Ａ２．１マウス系統を免疫することにより、複数のウイルス決定基に対する強力なＴ細胞免疫応答（全ＣＤ８＋細胞の０．２〜２．２５％）を測定した。免疫化マウスの脾細胞の分析は、低レベルのＣＤ４＋抗原特異的Ｔ細胞を伴うＣＤ８＋偏向免疫応答を示した。この免疫応答特性は、送達された抗原に伴われているというよりもワクチン接種方法に伴われたものである。Ｃａｓｉｍｉｒｏらにより、Ａｄ５ｇａｇワクチンで免疫されたアカゲザルにおいて、低い比のＣＤ４＋／ＣＤ８＋が観察され、ＣＤ８＋表現型の応答細胞の大部分は強力なＣＴＬ活性伴っていた（５９）。これに対して、筋肉内ＤＮＡ注射によるＨＣＶ抗原での遺伝的免疫化は、マウスおよび非ヒト霊長類の両方において、より釣りあったＣＤ４＋／ＣＤ８＋応答をもたらした（Ｎｉｃｏｓｉａ Ａ．未公開の結果）。
【０１１７】
種々の量のベクターにより誘導された細胞性免疫を、漸増量の筋肉内注射Ａｄ５ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋ＨＣＶ（１×１０７〜１×１０１１ ｖｐ／マウス）でＣ５７Ｂｌ６マウスを免疫することにより測定した。免疫化の３週間後、ＮＳ３タンパク質のヘリカーゼドメイン内にマッピングされたＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ（ＧＡＶＱＮＥＶＴＬ（配列番号２１）ａａ １６２９−１６３７ ＨＣＶ １ｂ）に対するＴ細胞応答に関してマウスを試験した。新鮮に単離された脾細胞を９マーペプチドと共に一晩インキュベートし、ついでＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより分析した。
【０１１８】
表２に示すとおり、誘導されたＴ細胞応答の大きさはＡｄ５ΔＥ１−４ＨＣＶの用量に依存し、最初の陽性結果は１×１０８ｖｐ／用量で観察された。この用量のベクターで、５匹中４匹のマウスがＮＳ３に対する免疫応答を引き起こし、特異的Ｔ細胞の度数は１×１０６脾細胞当たり１００〜１８０ ＣＤ８＋細胞であった。
【０１１９】
表２におけるデータは、５匹の免疫化マウスから得た１００万個の脾細胞当たりのＩＦＮγスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数を要約している。Ｃ５７Ｂｌ６マウスにおけるＢＫ ＮＳ３ヘリカーゼドメイン内にマッピングされたＣＤ８＋エピトープを含有する１４８０ノナマー（ＧＡＶＱＮＥＶＴＬ）（配列番号２１）と共に脾細胞をインキュベートした。１匹の動物から得た値および免疫化マウスの各群から計算した相乗平均が該表に示されている。抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の度数は、１０１１ ｖｐ／動物を注射することにより百万個の脾細胞当たり４００〜１０００のＳＦＣの範囲で５６８の相乗平均値まで用量と共に増加した。
【０１２０】
【表２】
【実施例６】
【０１２１】
ヒトＨＬＡ−Ａ２．１を発現するトランスジェニックマウスにおける多特異的ＣＭＩ応答の誘導
防御性ＨＣＶワクチンは、ヒトＭＨＣ対立遺伝子の及びウイルスの遺伝的多様性のため、一般的集団における広範な細胞性免疫応答を誘導する必要がある。Ａｄ５ΔＥ１−４ＨＣＶベクターでのマウスの免疫化は、ＨＣＶポリタンパク質の複数のエピトープに対する強力なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導した。より詳しくは、複数のＨＣＶエピトープに対する細胞性免疫応答を惹起するＡｄ５ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋ＨＣＶベクターの能力を測定した。免疫応答の拘束のため、ＣＢ６Ｆ１およびＨＬＡ Ａ２．１トランスジェニックマウスにおいて、ベクター免疫化により惹起されるＨＣＶ特異的Ｔ細胞応答を測定した。
【０１２２】
５匹／群の動物の大腿四頭筋にＡｄ５ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋ＨＣＶの１×１０１０ウイルス粒子を注射した。注射の３週間後、ワクチンにより誘導された抗ＨＣＶ免疫の強度および質をＩＣＳ法により評価することにより、マウスを分析した。脾細胞からの抗原特異的ＩＦＮγ分泌を、コア（ａａ １−１９０）およびＮＳ３〜ＮＳ５ｂタンパク質の非構造領域（ａａ １０２６−３００９）に及ぶ１０残基重複する１５マーから構成される７個のペプチドプールで刺激した。５匹のマウスのプールに関して脾細胞の分析を行った。
【０１２３】
図１０に示す結果は、Ａｄ５ΔＥ１−Ｅ４−ＨＣＶベクターが、ヒトＨＬＡ−Ａ２．１を発現するトランスジェニックマウスにおいて、強力かつ多特異的なＴ細胞応答を誘導することを示している。より詳しくは、該免疫化は該ペプチドプールのすべてに対するＴ細胞応答を引き起こした。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方の抗原特異的Ｔリンパ球が観察されたが、応答細胞の大部分はＣＤ８＋であった。抗原特異的ＣＤ８＋リンパ球の度数は、該コアに対するＣＤ８＋ Ｔ細胞の２．２％から、ＮＳ５ＢのＣ末端部分に応答するＣＤ８＋ Ｔの０．２％まで、抗原によって様々である。
【実施例７】
【０１２４】
Ａｄ５ΔＥ１−Ｅ４−ＨＣＶ免疫化はＡ２．１マウスにおいてＣＭＩ応答を惹起する
トランスジェニックＡ．２１マウスをＷ＝０およびＷ＝２に、１０１０ｐｐ／マウス／注射の用量のＡｄ５ΔＥ１−Ｅ４ＨＣＶまたは５０μｇ／マウス／注射の用量の対応Ａｄ５シャトルベクター（ｐＳｈＡｄ５ＨＣＶ）で免疫した。１）Ａｄ５ΔＥ１−Ｅ４−ＨＣＶで初回抗原刺激および追加抗原刺激し、ならびに２）ｐＳｈ−Ａｄ５−ＨＣＶで初回抗原刺激しＡｄ５ΔＥ１−Ｅ４−ＨＣＶで追加抗原刺激し、第４週に動物から得た精製脾細胞の免疫応答を、ＨＣＶポリタンパク質全体に及ぶペプチドプールを使用するγＩＦＮ−ＥｌｉｓｐｏｔおよびγＩＦＮ細胞内染色により分析した。
【０１２５】
ＮＳ３ヘリカーゼ領域全体に及ぶペプチド（Ｉ〜ＸＶＩＩＩ）のサブセットを使用する実験において、該応答の特異性を測定した。簡潔に説明すると、Ａｄ５ＤＥ１−Ｅ４ＨＣＶで初回抗原刺激しｐＳｈ−Ａｄ５−ＨＣＶで追加抗原刺激した２匹のマウスから脾細胞を単離した。図１２ＡにおけるＥｌｉｓｐｏｔの結果は、該マウスが、ＮＳ３領域に及ぶペプチドに対して強反応性である広範な免疫応答で応答したことを示している。該データは更に、Ａｄ５ΔＥ１−Ｅ４−ＨＣＶまたはｐＳｈ−Ａｄ５−ＨＣＶのいずれかで免疫されたマウスにおけるＨＣＶ特異的免疫応答の初回抗原刺激および追加抗原刺激の両方にＡｄ５ΔＥ１−Ｅ４−ＨＣＶを使用しうることを証明した。
【０１２６】
陽性閾値を超える応答を惹起するプール間の交差点は、考えられうる刺激性ペプチドを表す（ハイライト表示）（図１２Ｂ）。ついでこれらのペプチドをγＩＦＮ−Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにおいて個々に試験した。図１２Ｃに要約した結果は、ペプチド９５（ＬＡＡＫＬＳＧＬＧＩＮＡＶＡＹ）（ＮＳ３ ａａｌ４０３−１４１７）（配列番号２２）エピトープに対する特異性／反応性を示している。したがって、これらのマウスにおいて惹起された免疫応答は、ＨＣＶ患者において既に特定されているＮＳ３ヘリカーゼ領域におけるＣＤ８＋エピトープに対する特異性を含む特異性により特徴づけられる。
【実施例８】
【０１２７】
Ａｄ５ΔＥ１−Ｅ４−ＨＣＶでの免疫化はＶＶ−ＮＳでのチャレンジに対する防御をもたらす
この実験は、惹起された免疫応答が、ＨＣＶ非構造タンパク質を発現する組換えワクシニアウイルスでのチャレンジに対する防御をもたらしうることを証明している。Ａｄ５ΔＥ１−Ｅ４ＨＣＶでの免疫化により惹起された免疫応答が後続のウイルスチャレンジに対する防御をもたらすのかどうかを判定するために、実施例７に記載のプロトコールに従い免疫したマウスを第４週に、ＨＣＶ非構造領域（ＶＶ−ＮＳ）を発現する組換えワクチンウイルス（５×１０６ ｐｆｕの用量）でチャレンジした。実験対照として、Ｗ＝０およびＷ＝２にＡｄ５ΔＥ１−Ｅ４ＥＧＦＰの２回の注射で免疫したマウスを使用した。５日後、対（ペア）になった卵巣を摘出し、ＶＶを力価測定した。図１３に示す結果は、対照マウスと比較した場合の免疫化マウスのＶＶ力価における有意な減少を示している。灰色のドットは相乗平均力価（Ｎ＝５）を表す。＊ ＝ 対照に対するｐ＜０．０５（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙランク）。
【実施例９】
【０１２８】
Ａｄ５ΔＥ１−Ｅ４ＨＣＶでの免疫化はアカゲザルにおいてＨＣＶ特異的免疫応答を初回刺激する
アカゲザルの大腿四頭筋に１０１０ｐｐのＡｄ５ΔＥ１−Ｅ４−ＨＣＶを注射した。該免疫化の効力を注射後の種々の時点（Ｗ＝４、Ｗ＝６、Ｗ＝８、Ｗ＝１２）で末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に関するγＩＦＮ−Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより評価した。該注射により惹起された免疫応答は注射の６週間後にピークとなり、複数のＨＣＶエピトープに対するものであった。これらの３頭のサルのうちの１頭は、注射の１２週間後までの、長期にわたる応答を示した。これらのデータは、霊長類動物モデルにおいて免疫応答を惹起するためにＡｄ５ΔＥ１−Ｅ４−ＨＣＶを使用しうることを示している。
【０１２９】
図１４Ａは、Ａｄ５ＤＥ１−Ｅ４−ＨＣＶの１回の投与の後にサル４０６１において惹起された経時的応答を表す。結果は注射の４、６、８および１２週間後の１０６ＰＢＭＣ当たりのｇ−ＩＦＮスポット形成細胞数（ＳＦＣ）として表されている。各棒グラフは、別々のペプチドプールに対する応答を表す。
【０１３０】
図１４Ｂは、γＩＦＮ−Ｅｌｉｓｐｏｔ６アッセイにおいて評価された、Ａｄ５ＤＥ１−Ｅ４−ＨＣＶの注射の６週間後の３頭のサル（番号４０６１、９００３、７０２３）の免疫応答を示す。結果は、１０６ＰＢＭＣ当たりのｇ−ＩＦＮスポット形成細胞数（ＳＦＣ）として表されている。各棒グラフは、別々のペプチドプールに対する応答を表す。
【０１３１】
本発明は、特定の実施形態とみなされるものに関して説明されているが、本発明はそのような実施形態には限定されないと理解されるべきである。逆に、本発明は、添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれる種々の修飾および均等物を含むと意図される。
【０１３２】
本開示の全体にわたって引用されているすべての参考文献を、参照により明示的に本明細書に組み入れることとする。
【０１３３】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１Ａ】安定な２９３ＥＢＮＡＴｅｔクローンを得るために使用したプラスミドの概要図を示し、プラスミド成分の直線的表示を示す。
【図１Ｂ】安定な２９３ＥＢＮＡＴｅｔクローンを得るために使用したプラスミドの概要図をし、ｐＥ２プラスミドの概要図を示す。
【図２】図２はＡｄＴｅｔＬｕｃ感染クローンにおけるルシフェラーゼ発現のグラフ表示を示す。
【図３】図３は環状および直線形態のｐＥ２の概要図を示す。ｐＥ２の環状形態と直線形態との識別を可能にするＮｏｔＩ消化により得たＤＮＡ断片も示されている。
【図４Ａ】ドキシサイクリンによるＡｄ５ Ｅ２遺伝子発現の活性化の際のｐＥ２の複製を示すサザンブロット分析を示す。
【図４Ｂ】Ｅ２タンパク質のｔｅｔ誘導性発現を示すウエスタンブロット分析を示す。
【図５Ａ】２Ｅ２クローンから抽出されたｐＥ２の構造およびＥ２タンパク質の発現を示し、クローン２９３ＥＢＮＡＴｅｔおよび２Ｅ２から抽出されたｐＥ２の構造を示すサザンブロット分析である。
【図５Ｂ】Ａｄ５ΔＥ１ベクターに感染した細胞におけるＥ２発現と比較した場合の２Ｅ２安定細胞系におけるＥ２タンパク質のｔｅｔ誘導性発現を示すウエスタンブロット分析である。
【図６】図６は、ＥＧＦＰを発現するＡｄ ΔＥ１−４ベクターをレスキューし増殖させるための２Ｅ２細胞の使用を示す一連の写真を示す。
【図７Ａ】Ａｄ５ウイルスの概要地図である。この図にはすべての欠失領域が示されている。
【図７Ｂ】多欠失ベクターのＥ１領域内に導入されたＨＣＶ（ＢＫ株）ポリタンパク質発現カセットの概要図を示す。
【図８】図８はＡｄ ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋ＨＣＶの制限分析を示す。
【図９】図９は、Ａｄ５ΔＥ１−４ＨＣＶ感染細胞におけるＨＣＶタンパク質の発現を示すウエスタンブロット分析を示す。
【図１０Ａ】マウスにおけるＡｄ５ΔＥ１−４ＨＣＶウイルス免疫化に対するインビボＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を特徴づけるＦＡＣＳデータのグラフ表示を示す。
【図１０Ｂ】マウスにおけるＡｄ５ΔＥ１−４ＨＣＶウイルス免疫化に対するインビボＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を特徴づけるＦＡＣＳデータのグラフ表示を示す。
【図１１Ａ】図１１は、本開示に記載されているポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列（すなわち、配列番号１〜２１）を示す。
【図１１Ｂ】図１１は、本開示に記載されているポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列（すなわち、配列番号１〜２１）を示す。
【図１１Ｃ】図１１は、本開示に記載されているポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列（すなわち、配列番号１〜２１）を示す。
【図１１Ｄ】図１１は、本開示に記載されているポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列（すなわち、配列番号１〜２１）を示す。
【図１１Ｅ】図１１は、本開示に記載されているポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列（すなわち、配列番号１〜２１）を示す。
【図１１Ｆ】図１１は、本開示に記載されているポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列（すなわち、配列番号１〜２１）を示す。
【図１１Ｇ】図１１は、本開示に記載されているポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列（すなわち、配列番号１〜２１）を示す。
【図１１Ｈ】図１１は、本開示に記載されているポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列（すなわち、配列番号１〜２１）を示す。
【図１２Ａ】ＮＳ３ヘリカーゼ内のエピトープのマッピングに用いた方法を示す。Ａｄ５ΔＥ１−Ｅ４ＨＣＶで初回抗原刺激されｐＳｈ−Ａｄ５−ＨＣＶで追加抗原刺激された２匹のマウス（マウス４，黒塗り棒線、マウス５，付点棒線）から精製した脾細胞を、全ＮＳ３ヘリカーゼ領域に及ぶペプチド（Ｉ〜ＸＶＩＩＩ）の二次元サブセット上でγ−ＩＦＮ−Ｅｌｉｓｐｏｔにおいて試験した。
【図１２Ｂ】ＮＳ３ヘリカーゼ内のエピトープのマッピングに用いた方法を示す。図１２Ｂに示されているデータは、免疫応答を特徴づけするために使用したパネルＡにおいて特定された陽性閾値を超える応答を惹起したペプチドプール間の交差点を要約したものである。
【図１２Ｃ】ＮＳ３ヘリカーゼ内のエピトープのマッピングに用いた方法を示す。パネル１２Ｃは、該応答をもたらすＮＳ３エピトープを特定するために行ったγ−ＩＦＮ−Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイの結果を要約したものである。
【図１３】図１３は、ＶＶ−ＮＳチャレンジに対する防御の誘導における免疫化の効力を示す。灰色のドットは相乗平均力価（Ｎ＝５）を表す。アステリスクは対照に対するｐ＜０．０５を示す（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙランク）。
【図１４Ａ】Ａｄ５ΔＥ１−Ｅ４ＨＣＶ免疫化に応答してアカゲザルにおいて惹起された免疫応答を要約したものであり、Ａｄ５ΔＥ１−Ｅ４ＨＣＶの１回の投与に際してサル４０６１において惹起されγ−ＩＦＮ−Ｅｌｉｓｐｏｔにより分析された経時的免疫応答を表す。
【図１４Ｂ】Ａｄ５ΔＥ１−Ｅ４ＨＣＶ免疫化に応答してアカゲザルにおいて惹起された免疫応答を要約したものであり、Ａｄ５ΔＥ１−Ｅ４ＨＣＶの１回の投与により３頭の個々のサルにおいて誘導され注射の６週間後にγ−ＩＦＮ−Ｅｌｉｓｐｏｔにより分析された免疫応答を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学の分野に関し、特に、多欠失または完全欠失ヘルパー非依存性アデノウイルスベクターの高クローニング容量プロデューサー細胞系を製造するための、誘導可能な自己複製能を有するエピソームプラスミドの開発および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アデノウイルス（Ａｄ）は、多種多様な組織の休止細胞および増殖細胞の両方に感染しうる広範な指向性により特徴づけられる。一般に、野生型ヒトＡｄ５ウイルスによる許容細胞の感染は約１０４〜１０５個のウイルス粒子の産生を引き起こす。ウイルスゲノムの扱い易さと共に、高力価増殖能は、Ａｄベクターを、ワクチン接種および遺伝子治療のための並びに細胞培養内での遺伝子発現のための遺伝子導入ベクターとしての使用に魅力的なものにする。
【０００３】
安全性プロファイルの改善（例えば、ウイルス遺伝子発現から生じる毒性の最小化）および前世代のベクターのクローニング容量の増加を目的として、ヒトＡｄ５およびＡｄ２に基づく幾つかのベクター系が開発されている。代替ベクター系の開発のための方法は、典型的には、ベクターバックボーンからアデノウイルス遺伝子を欠失させることを含む。アデノウイルスゲノムは機能的には、非構造産物および構造産物をコードする遺伝子を含む、初期領域および後期領域に細分される。第１の領域は、ウイルスＤＮＡ複製の前に発現されるポリペプチドをコードする初期（Ｅ）遺伝子を含む。第２の領域は、ウイルス複製の後続段階で必要なポリペプチドをコードする後期（Ｌ）遺伝子を含む。アデノウイルスゲノムのＬ領域は本質的には、ウイルス粒子の集合に必要な構造タンパク質をコードする。
【０００４】
コンピテント細胞の感染後転写される第１の領域は、Ｅ遺伝子およびＬ遺伝子の両方のトランス活性化に関与するタンパク質をコードするＥ１ａ領域である。続いて転写されるＥ１ｂ領域は、ＲＮＡ合成を調節し、Ｅ１ａによるアポトーシス作用から宿主細胞を防御するポリペプチドをコードする。したがって、Ｅ１ａ／Ｅ１ｂの遺伝子／機能はウイルス複製に必須である。第１世代（ＦＧ）アデノウイルスベクターは、典型的に、アデノウイルスＥ１遺伝子内の欠失を含む。これらの欠失は、修飾転写単位のタンパク質産物がトランスで与えられない限り、アデノウイルスを複製欠損にする。一般に、ＦＧアデノウイルスベクターの最高容量は８ｋｂを超えない。ＦＧ Ａｄ５ベクターはＥ１領域の欠失または修飾により弱毒化されるが、一般に、いくつかの腫瘍細胞系内での複製能の維持および漏出遺伝子発現の両方の結果として、インビトロで細胞毒性が見られる。典型的に、ＦＧ Ａｄベクターでのインビボ形質導入は比較的短いトランスジーン発現をもたらす。
【０００５】
追加的なウイルス遺伝子の欠失に基づく第２および第３世代ベクター系はアデノウイルス遺伝子発現の更なる弱毒化およびベクター容量の増加をもたらす。より詳しくは、より新しい世代のベクターはウイルスＥ２、Ｅ３および／またはＥ４遺伝子内の追加的な欠失を含む。ΔＥ１／Ｅ３／Ｅ４ベクターのクローニング容量は約１１ｋｂに近い。Ｅ２領域は、ウイルスＤＮＡポリメラーゼ、プレ末端タンパク質およびウイルスＤＮＡに結合するタンパク質を含むウイルス複製に直接関与するタンパク質をコードする。Ｅ３領域は、ウイルス複製には要求されないが宿主免疫応答を制御するようインビボで機能するタンパク質をコードすることが公知である。Ｅ４領域遺伝子は、宿主細胞の遺伝子発現を低下させアデノウイルスゲノムのＥ２およびＬ領域の転写を増強するよう機能するポリペプチドをコードする。種々の組合せのＥ１、Ｅ２ａ／ｂ、Ｅ３および／またはＥ４欠失を有する多欠失ベクターの使用は、古典的なＦＧ（２−４，２３，２４，３３，４５，５２）ベクターほどはインビトロで細胞毒性ではなく、マウス肝臓において、より安定であることが認められている。しかし、より新しい世代のアデノウイルスベクターが有意に長い持続能を有するという決定的な証拠は存在しない。さらに、追加的な欠失の導入は、生じる力価を有意に低下させ、臨床応用のための該ベクターの大規模製造をより困難にする（３３，１８）。実際、ほとんど全ての場合に、パッケージング／プロデューサー細胞系内に安定に導入された相補遺伝子の発現は、複数の欠失を相補しなければならない場合非効率的である（５，５４）。
【０００６】
現在のところ、ヘルパー依存性（ＨＤ）完全欠失アデノウイルスベクター遺伝子が、インビボ遺伝子導入のための最も効率的で安全なベクターの１つとみなされている（５，１５，２８，３６，３９−４１，４３，５４）。完全欠失Ａｄベクターは、複製およびパッケージング（すなわち、包膜）に必要なシス要素のみを含有し、すべてのアデノウイルス遺伝子を欠く。伝統的には、必要なアデノウイルス遺伝子はヘルパーウイルスによりトランスで供与される。しかし、ＨＤベクターはいくつかの欠点により特徴づけられる。なかでも、該系は、トランスジーンを含有するＨＤベクターと必要なウイルスタンパク質をトランスで供与するヘルパーウイルスとによるパッケージング細胞系の共感染を要するため、３つの独立した成分の制御を要することが挙げられる。実際、医薬規模でのヘルパー依存性アデノウイルスベクターの生産は、克服するのが困難な問題を伴い、高すぎる生産コストを伴う。また、ヘルパーウイルスの使用はほとんど常に、ＨＤベクター製剤を汚染する。
【０００７】
Ｅ２遺伝子および／またはＥ４領域のいくつかを欠失させ異なる初期遺伝子の欠失を組合せることにより、多欠失ヘルパー非依存性Ａｄベクターも構築されている（２−４，２３，２４，３３，４５，５２）。典型的に、必要な相補遺伝子を並列で相補パッケージング細胞系内に安定的に導入する。しかし、この方法は低コピー数のウイルス遺伝子の染色体組み込みを要し、多数の欠失を相補しなければならない場合非効率的となりうる。Ａｎｄｒｅｗｓ Ｊ．Ｌ．ら（５）は、Ｅ１、Ｅ２ａ、Ｅ３およびＥ４領域が欠失したベクターは高い力価までは増殖し得ないことを示した。Ｚｈｏｕ Ｈ．ら（５４）は、第１世代アデノウイルスベクターにより通常達する力価に近い力価でＥ１／Ｅ２ａ欠失ベクターを効率的に増殖させるためにＤＢＰ遺伝子の複数の組込みコピーが必要であることを示した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
効率的なパッケージング／プロデューサー細胞系の開発は、ヘルパー非依存性アデノウイルスベクターの開発に関連した最も困難な課題の１つである。したがって、アデノウイルス由来ベクターの絶えざる開発および使用のための重要な要件は、多または完全欠失アデノウイルスベクターの高力価調製物の製造を促進するヘルパー非依存性プロデューサー細胞系の設計である。理想的な解決策は、完全欠失ヘルパー非依存性アデノウイルスベクターの高力価増殖に適したヘルパーまたはプロデューサー細胞系を使用するアデノウイルスベクター系の開発であろう。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
本発明は、哺乳類細胞の核内での誘導性自己複製能を有する、本明細書においてはアデノウイルスアンプリコンまたはレプリコンと称されるエピソームプラスミドを提供する。開示するアデノウイルスアンプリコンは以下の特性により特徴づけられる。（ｉ）これはＥＢＶ潜伏性複製起点（ｏｒｉＰ）およびヒトＡｄ５逆末端反復（ＩＴＲ）結合部を含有する。（ｉｉ）これは、全３個のアデノウイルス５型初期領域２（Ｅ２）遺伝子および初期領域４（Ｅ４）ＯＲＦ６を、Ｔｅｔ依存性プロモーターの制御下、誘導可能に発現する。本明細書中に示すとおり、Ｔｅｔ転写サイレンサー（ｔＴＳ）および逆Ｔｅｔトランスアクチベーター（ｒｔＴＡ２）を発現する２９３ＥＢＮＡ細胞を形質転換するために、開示するアンプリコンを使用した場合、得られた安定な細胞系（２Ｅ２）は、ドキシサイクリンの存在下、第１世代Ａｄベクターに感染した２９３細胞より高いレベルのポリメラーゼ、前駆体末端タンパク質（ｐＴＰ）およびＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）を産生した。本明細書に記載のデータは更に、本明細書中に開示するプロデューサー細胞系（すなわち、２Ｅ２）が、多欠失ΔＥ１，Ｅ２，Ｅ３，Ｅ４ Ａｄベクターの増殖のために使用しうることを証明している。したがって、開示するＡｄ／ＥＢＶアンプリコンは、多または完全欠失アデノウイルスベクターの高力価増殖に適した効率的なヘルパー細胞系の産生に対する重要な寄与をもたらす。
【００１０】
本発明の第１の態様は、（ａ）ＥＢＮＡ−１タンパク質を発現する分裂細胞の核内のアンプリコンの維持を促すＥＢＶ由来複製起点（Ｏｒｉ−Ｐ）、（ｂ）Ａｄに基づく様態での増幅を可能にするＡｄ５ウイルスＩＴＲ結合部の形態のＡｄ５複製起点、（ｃ）Ａｄ５由来ポリメラーゼおよびプレ末端タンパク質をコードする核酸配列よりなる第１転写単位、（ｄ）Ａｄ５ ＤＮＡ結合タンパク質およびＥ４ ＯＲＦ６をコードする核酸配列よりなる第２転写単位、ならびに（ｅ）選択マーカーを含んでなり、第１転写単位および第２転写単位が二方向性テトラサイクリン依存性プロモーターに融合している、アデノウイルスアンプリコンを提供する。特定の実施形態においては、本発明はＡｄ５ Ｅ２／Ｅ４ ＯＲＦ６アンプリコン，ｐＥ２を提供する。
【００１１】
もう１つの態様においては、本発明は更に、ブダペスト条約に基づき原寄託物としてＢｅｌｇｉａｎ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＢＣＣＭ／ＬＭＢＰ，Ｇｈｅｎｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｐａｒｋ ９２７，Ｂ−９０５２ Ｇｅｎｔ−Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに２００４年１０月１５日付けで寄託されたプラスミドのヌクレオチド配列を含んでなるエピソームプラスミドを提供する。該寄託物には受託番号ＬＭＢＰ ４９７２が付与された。この寄託物は、Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅに基づいて維持される。この寄託は単に当業者にとっての便宜としてなされたものであり、寄託が３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２に基づいて要求されることを自認するものではない。寄託された物質の公への入手可能性に対する全ての制限は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８０８（ｂ）に規定された要件の場合を除き、特許の付与に際して、変更不能に除かれる。
【００１２】
ＯｒｉＰ潜伏性複製起点と組合されたＥＢＶ核抗原−１（ＥＢＮＡ−１）の存在は、細胞周期当たり１回だけ複製する安定なコピー数での核内保持および自律的エピソーム性複製の機能をもたらす（４８）。Ｅ４ｏｒｆ６ならびにアデノウイルスＤＮＡ複製をもたらすＡｄ５ポリメラーゼ、ｐＴＰおよびＤＢＰのコード配列はＴｅｔプロモーターの制御下で２つのビ−シストロン転写単位内に配置されるため、Ａｄ／ＥＢＶエピソームが転写的にサイレントな場合には。それは潜伏性ウイルス要素として維持される。本明細書に示すとおり、開示されているアンプリコンはＥ２遺伝子発現の誘導に際して複製されて、コピー数の増加をもたらす。
【００１３】
もう１つの実施形態においては、本発明は、プロモーターに融合した関心のあるトランスジーンをコードする発現カセットを更に含むＡｄ５ Ｅ２／Ｅ４ＯＲＦ６アンプリコンを含む。関心のあるトランスジーンには、限定的なものではないが例えば免疫グロブリンまたは免疫グロブリンのフラグメント、一本鎖抗体、二重特異性抗体、エリスロポエチン、成長ホルモン、サイトカイン、例えばＩＬ−２およびＩＬ−１０関連サイトカイン（例えば、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２２、ＩＬ−２４，ＩＬ−２６、ＩＬ−２８およびＩＬ−２９遺伝子）のようなタンパク質をコードするヒト遺伝子；ＨＣＶのコア、Ｅ１、Ｅ２または非構造領域、ＨＩＶのＨＩＶ−１ ｇｐ４１、ＧＰ１２０、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｎｅｆ、ＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄ、ＨＰＶ Ｌｌ、Ｌ２、Ｅ６およびＥ７タンパク質、ＳＡＲＳ−ＣｏＶのスパイク（Ｓ）糖タンパク質、細胞膜タンパク質、例えばウイルス受容体、例えばＳＡＲＳ−ＣｏＶ ＡＣＥ２受容体、ＨＩＶ−１受容体ＣＤ４およびケモカインコレセプター、ＨＣＶ受容体ＣＤ８１、ＳＲＢ１、Ｌ−ＳＩＧＮおよび硫酸ヘパリンシンデカン、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、チロシンキナーゼ細胞表面受容体をコードするウイルス遺伝子が含まれる。
【００１４】
本発明の第２の態様は、本発明のアデノウイルスアンプリコンを含んでなるプロデューサー／ヘルパー細胞系を提供する。より詳しくは、本発明は、（ａ）Ａｄ５ Ｅ１タンパク質、（ｂ）ＥＢＶ由来ＥＢＮＡタンパク質、（ｃ）Ｔｅｔ転写サイレンサー、（ｄ）Ｔｅｔ逆トランスアクチベーター、（ｅ）アデノウイルスアンプリコン［該アデノウイルスアンプリコンは、第２転写単位（第２転写単位はＥＢＶ由来ＯｒｉＰ、アデノウイルスＩＴＲ結合部ならびにＡｄ５ Ｅ４ ＯＲＦ６およびＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸配列よりなる。）と組合された第１転写単位（第１転写単位はＡｄ５由来ポリメラーゼおよびプレ末端タンパク質をコードする核酸配列よりなる。）よりなり、第１転写単位および第２転写単位は二方向性テトラサイクリン依存性プロモーターに融合している。］、ならびに（ｆ）選択マーカーを発現するアデノウイルスパッケージング細胞系を提供する。
【００１５】
特定の実施形態において、本発明のこの態様は、本明細書においては、２９３ＥＢＮＡｔｅｔ細胞（Ｔｅｔ転写サイレンサーｔＴＳｋｉｄおよびｔｅｔ逆トランスアクチベーターｒｔＴＡ２を発現する２９３ＥＢＮＡ細胞として定義される。）をｐＥ２で形質転換して、ΔＥ１，Ｅ２，Ｅ３，Ｅ４ Ａｄベクターの増殖のためのプロデューサー細胞系としての使用に適した細胞系を得ることにより例示される。本明細書中に例示されているパッケージング細胞系は２Ｅ２と称される。開示されている系のＡｄ５ ΔＥ１，Ｅ２，Ｅ３，Ｅ４ Ａｄベクターは、１２．４Ｋｂまでのクローニング容量により、およびウイルス遺伝子発現の漏出の減少により特徴づけられる。本発明のプロデューサー細胞は、とりわけ、遺伝子治療およびワクチン接種のために設計された組換えアデノウイルスの製造に有用である。
【００１６】
本発明のもう１つの態様は、治療用の複製欠損アデノウイルスベクターの製造方法を提供する。例えば、特定の実施形態において、本発明は、感染因子／病原体により発現される抗原に対する免疫原性応答を誘発するためのワクチンとしての使用のための免疫原性組成物を提供する。もう１つの実施形態において、本発明は、腫瘍抗原に対する免疫応答を誘導するのに適したワクチンを提供する。本発明のこの態様は、本明細書中において、全ＨＣＶポリタンパク質を発現するΔＥ１−Ｅ４発現ベクターの構築、および免疫実験における該ベクターの利用により例示される。
【００１７】
１つの実施形態においては、本発明は、パッケージング細胞内に多欠失アデノウイルス発現ベクターを導入すること{前記パッケージング細胞は、ＥＢＶ由来ＥＢＮＡタンパク質；Ｔｅｔ転写サイレンサー；Ｔｅｔ逆トランスアクチベーター；アデノウイルス発現ベクター[前記アデノウイルス発現ベクターはＥＢＶ由来ｏｒｉＰ、アデノウイルスＩＴＲ結合部および第１転写単位（前記第１転写単位はＡｄ５ ＤＮＡ結合タンパク質およびＥ４ ＯＲＦ６をコードする核酸配列よりなる第２転写単位と組合されたＡｄ５ Ｅ２由来ポリメラーゼ、プレ末端タンパク質をコードする核酸配列よりなる。）よりなり、第１転写単位および第２転写単位は二方向性テトラサイクリン依存性プロモーターに融合している。]ならびにプロモーターに融合した関心のあるトランスジーンをコードする発現カセットを発現する。}、Ｅ２およびＥ４ＯＲＦ６コード配列の発現を誘導すること、および産生した複製欠損アデノウイルスを回収することを含んでなる、関心のあるトランスジーンを含む複製欠損アデノウイルスの製造方法を提供する。特定の実施形態においては、Ｅ２およびＥ４ＯＲＦ６コード配列の過剰発現により特徴づけられるｐＥ２アンプリコンの複製を誘発するドキシサイクリンと該パッケージング細胞とを接触させることにより、Ｅ２およびＥ４ＯＲＦ６コード配列の発現を誘導する。
【００１８】
代替的実施形態において、本発明の方法は、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４遺伝子を欠く多欠失ヒトＡｄ５アデノウイルスベクターのためのパッケージング細胞としての、ｔＴＳｋｉｄおよびｒｔＴＡ２を発現する２９３ＥＢＮＡ細胞の使用を含む。本発明は更に、本明細書に開示されており特許請求されている製造方法により回収され精製された組換え複製欠損アデノウイルス粒子を提供する。
【００１９】
本発明の他の特徴および利点は本明細書に記載の開示から明らかである。実施例（具体例）は、特許請求されている本発明の実施に有用な種々の成分および方法を例示する。該実施例は本発明を限定するものではないと解釈されると理解されるべきである。本開示に基づき、当業者は、本発明の実施のための他の成分および方法を特定し使用することが可能である。
【００２０】
図面の簡単な説明
図１Ａ〜１Ｂは、安定な２９３ＥＢＮＡＴｅｔクローンを得るために使用したプラスミドの概要図を示す。パネルＡはプラスミド成分の直線的表示を示す。以下の略語が使用されている：逆Ｔｅｔトランスアクチベーター（ｒｔＴＡ）；Ｔｅｔサイレンサー（ｔＴＳ）；ＥＣＭＶ内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）；イントロン配列（ｉｎｔＳ）；およびピューロマイシン耐性（ＰｕｒｏＲ）。
【００２１】
パネルＢはｐＥ２プラスミドの概要図を示す。ｐＦＧ１４０由来のＡｄ５逆末端反復配列の頭−尾結合体を該プラスミド内にクローニングした（ＩＴＲ、灰色矢じり）。Ａｄ５初期遺伝子が黒色矢印で示されている。ポリメラーゼ（Ｐｏｌ）、プレ末端タンパク質（ｐＴＰ）、ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）およびＥ４ｏｒｆ６を、Ｔｅｔ応答性要素（ＴＲＥ、白色太棒線）により駆動される２つのビシストロン発現カセット内に挿入した。ニワトリβグロビン絶縁（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）配列（ＨＳ４）に隣接するＥＢＶ潜在性複製起点（ＯｒｉＰ）が付点太棒線および灰色太棒線で示されている。
【００２２】
図２はＡｄＴｅｔＬｕｃ感染クローンにおけるルシフェラーゼ発現のグラフ表示を示す。２９３ＥＢＮＡ細胞および種々の２９３ＥＢＮＡ／Ｔｅｔクローンに、１μｇ／ｍｌ ドキシサイクリンの存在下（黒色棒線）または非存在下（白色棒線）、ＡｄＴｅｔＬｕｃを感染させた（ｍ．ｏ．ｉ １０）。細胞溶解物におけるルシフェラーゼ活性を感染の４８時間後に評価した。
【００２３】
図３は環状および直線形態のｐＥ２の概要図を示す。ｐＥ２の環状形態と直線形態との識別を可能にするＮｏｔＩ消化により得たＤＮＡ断片も示されている。
【００２４】
図４Ａ〜４Ｂ。パネルＡは、ドキシサイクリンによるＡｄ５ Ｅ２遺伝子発現の活性化の際のｐＥ２の複製を示すサザンブロット分析を示す。ＮｏｔＩで消化されたｐＥ２の１０８個のコピーを第１レーンにローディングした。ドキシサイクリンの非存在下／存在下のｐＥ２での形質移入の４８時間後に２９３ ＥＢＮＡ Ｔｅｔ細胞から抽出されＮｏｔＩおよびＤｐｎＩで消化されたエピソームＤＮＡをレーン２および３にローディングした。環状および直線状単量体形態を示す１２．６および４．４Ｋｂのバンドが黒色矢印で示されている。ＤＮＡマーカーのサイズが図の右側に示されている（Ｋｂ）。
【００２５】
パネルＢは、Ｅ２タンパク質のｔｅｔ誘導性発現を示すウエスタンブロット分析を示す。ドキシサイクリンの存在下（＋）（レーン３、６および９）または非存在下（−）（レーン２、５および８）でｐＥ２アンプリコンで形質移入された２９３ＥＢＮＡＴｅｔ細胞におけるＤＢＰ、ｐＴＰおよびポリメラーゼタンパク質のウエスタンブロット分析。陰性（非形質移入）対照がレーン１、４および７に示されている。特異的ウサギ抗血清（ポリメラーゼ、ｐＴＰ）またはマウスモノクローナル抗体（ＤＢＰ）でＥ２タンパク質を検出した。
【００２６】
図５Ａ〜５Ｂ。２Ｅ２クローンから抽出されたｐＥ２の構造およびＥ２タンパク質の発現。パネルＡは、クローン２９３ＥＢＮＡＴｅｔおよび２Ｅ２から抽出されたｐＥ２の構造を示すサザンブロット分析である。２９３ＥＢＮＡＴｅｔおよび２Ｅ２クローンから抽出されたＤＮＡのサザンブロット分析。Ｈｉｒｔ法により抽出されたＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、１％アガロースゲル上で分離し、ナイロンメンブレン上に移し、３２Ｐで標識されたｐＥ２ ＤＮＡでハイブリド形成させた。参照体として第１レーンにｐＥ２ベクターをローディングした。２９３ＥＢＮＡＴｅｔ細胞から（陰性対照）および２Ｅ２クローンから抽出されたＤＮＡをそれぞれ第２および第３レーンにローディングした。
【００２７】
パネルＢは、Ａｄ５ΔＥ１ベクターに感染した細胞におけるＥ２発現と比較した場合の２Ｅ２安定細胞系におけるＥ２タンパク質のｔｅｔ誘導性発現を示すウエスタンブロット分析である。２Ｅ２クローンによるＥ２ａおよびＥ２ｂタンパク質発現を、ドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）（レーン、２、３；５、６；８、９）の存在下（＋）（レーン３）および非存在下（−）（レーン２）、ウエスタンブロットにより評価し、５００のｍ．ｏ．ｉ．のＦＧ Ａｄ５ΔＥ１ベクターに感染した非誘導２Ｅ２細胞からのＥ２タンパク質の発現レベル（レーン１）と比較した。分子量マーカーの移動度（ｋＤａ）が図の左に示されている。
【００２８】
図６は、ＥＧＦＰを発現するＡｄ ΔＥ１−４ベクターをレスキューし増殖させるための２Ｅ２細胞の使用を示す一連の写真を示す。サイレンシングされた（‐ｄｏｘｙ）または活性化された（＋ｄｏｘｙ）Ｅ２／ｏｒｆ６遺伝子発現を伴う２Ｅ２クローンにおけるＡｄ５ΔＥ１−４ＥＧＦＰウイルス増殖。Ｐ０＝形質移入、Ｐ１およびＰ２は、前感染経過からの全粗溶解物の１／１０を細胞に感染させることにより得た。
【００２９】
図７Ａ〜７Ｂ。パネルＡはＡｄ５ウイルスの概要地図である。この図にはすべての欠失領域が示されている。Ｅ１、Ｅ２ａ、Ｅ３、および７個のＥ４ ｏｒｆのうちのｏｒｆ３を除く６個を、ベクターバックボーンから完全に欠失させた。ポリメラーゼおよびプレ末端タンパク質の欠失は部分的であるに過ぎない。Ｅ１領域は、ＭＣＭＶプロモーターにより駆動されるＨＣＶポリタンパク質発現カセットで置換される。ベクターゲノムの制限分析において使用するＨｉｎｄＩＩＩ制限部位が示されている（┃）。
【００３０】
パネルＢは、該多欠失ベクターのＥ１領域内に導入されたＨＣＶ（ＢＫ株）ポリタンパク質発現カセットの概要図を示す。ＨＣＶ ５’および３’ＵＴＲ配列が除去されており、最適化コザック配列が該ポリタンパク質の５’側に融合されている。発現はマウスＣＭＶプロモーター（ｍＣＭＶ）およびウシ成長ホルモンポリＡ（ＢＧＨポリＡ）により調節される。
【００３１】
図８はＡｄ ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋ＨＣＶの制限分析を示す。プラスミドＤＮＡおよびＣｓＣｌ精製ウイルス粒子から抽出されたウイルスＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、クレノウ酵素でのフィルイン反応により（３３Ｐ）ｄＡＴＰで末端標識した。精製されたＡｄ ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋ＨＣＶベクター（レーン４）のウイルスＤＮＡ制限パターンを元のプラスミド（レーン３）と比較した。ＨｉｎｄＩＩＩで制限処理されたＦＧ（ΔＥ１−Ｅ３）Ａｄ５（レーン１）およびＡｄ５ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋空ベクター（レーン２）バックボーンを該ゲル内に加えた。ａ、ｂ、ｃ、ｄは、欠失を含有する多欠失ベクターＤＮＡバンド、およびＦＧ（ΔＥ１−Ｅ３）Ａｄ５パターンにおける対応バンドを示す。
【００３２】
図９は、Ａｄ５ΔＥ１−４ＨＣＶ感染細胞におけるＨＣＶタンパク質の発現を示すウエスタンブロット分析を示す。ＨｅＬａ細胞にＡｄ５ΔＥ１−４ＨＣＶを１０のｍ．ｏ．ｉ．で感染させた。ＨＣＶ特異的抗体でのウエスタンブロット分析により細胞抽出物においてＨＣＶタンパク質を検出した。感染の４８時間後に調製した、ＨｅＬａ細胞からの溶解物をレーン３にローディングし、未感染対照細胞からの溶解物（レーン１）、およびｍＣＭＶ−ＨＣＶベクターＤＮＡで形質移入したＨｅＬａ細胞からの溶解物（レーン２）と比較した。特定のバンドが矢印で示されている。
【００３３】
図１０は、マウスにおけるＡｄ５ΔＥ１−４ＨＣＶウイルス免疫化に対するインビボＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を特徴づけるＦＡＣＳデータのグラフ表示を示す。Ａ２．１（ａ）およびＣＢ６Ｆ１（ｂ）。１０１０ｖｐで筋肉内に免疫化されたマウスの新鮮に単離された脾細胞を、３週間後のＩＦＮ−γに関する細胞内染色により、ＨＣＶ−ペプチドのプールに対するＣＤ８＋ Ｔ細胞応答に関して試験した。ｘ軸 抗ＩＮＦ−γ、ｙ軸 抗ＣＤ８。プールＣ（コア）、プールＦ−Ｇ（ＮＳ３）、プールＨ（ＮＳ４）、プールＩ−Ｌ−Ｍ（ＮＳ５ａ／ｂ）。
【００３４】
図１１は、本開示に記載されているポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列（すなわち、配列番号１〜２１）を示す。
【００３５】
図１２Ａ〜１２Ｃは、ＮＳ３ヘリカーゼ内のエピトープのマッピングに用いた方法を示す。Ａｄ５ΔＥ１−Ｅ４ＨＣＶで初回抗原刺激されｐＳｈ−Ａｄ５−ＨＣＶで追加抗原刺激された２匹のマウス（マウス４，黒塗り棒線、マウス５，付点棒線）から精製した脾細胞を、全ＮＳ３ヘリカーゼ領域に及ぶペプチド（Ｉ〜ＸＶＩＩＩ）の二次元サブセット上でγ−ＩＦＮ−Ｅｌｉｓｐｏｔにおいて試験した（図１２Ａ）。図１２Ｂに示されているデータは、免疫応答を特徴づけするために使用したパネルＡにおいて特定された陽性閾値を超える応答を惹起したペプチドプール間の交差点を要約したものである。パネル１２Ｃは、該応答をもたらすＮＳ３エピトープを特定するために行ったγ−ＩＦＮ−Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイの結果を要約したものである。
【００３６】
図１３は、ＶＶ−ＮＳチャレンジに対する防御の誘導における免疫化の効力を示す。灰色のドットは相乗平均力価（Ｎ＝５）を表す。アステリスクは対照に対するｐ＜０．０５を示す（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙランク）。
【００３７】
図１４Ａ〜Ｂは、Ａｄ５ΔＥ１−Ｅ４ＨＣＶ免疫化に応答してアカゲザルにおいて惹起された免疫応答を要約したものである。パネルＡは、Ａｄ５ΔＥ１−Ｅ４ＨＣＶの１回の投与に際してサル４０６１において惹起されγ−ＩＦＮ−Ｅｌｉｓｐｏｔにより分析された経時的免疫応答を表す。結果は１０６ＰＢＭＣ当たりのγ−ＩＦＮスポット形成細胞数（ＳＦＣ）として表されている。各棒グラフは、別々のペプチドプールに対する応答を表す。パネルＢは、Ａｄ５ΔＥ１−Ｅ４ＨＣＶの１回の投与により３頭の個々のサルにおいて誘導され注射の６週間後にγ−ＩＦＮ−Ｅｌｉｓｐｏｔにより分析された免疫応答を示す。結果は、１０６ＰＢＭＣ当たりのγ−ＩＦＮスポット形成細胞数（ＳＦＣ）として表されている。各棒グラフは、別々のペプチドプールに対する応答を表す。
【００３８】
発明の詳細な説明
個々の文の終わりに示されている数字の列挙は、本明細書の終わりに番号付きで示されている参考文献の一覧に対応する。本明細書中に引用されている参考文献は本発明の先行技術であると自認されるものではない。
【００３９】
本明細書中で用いるすべての科学技術用語は、特に定義されない限り、当業者に一般に理解されているものと同じ意義を有することに留意することが、本発明の理解に重要である。以下に幾つかの用語を説明する。あるいは、ある種の用語は、初めて用いられる際に本明細書中で定義されうる。
【００４０】
本明細書中で用いる「アンプリコン」なる語は、必須遺伝子機能が付与されると複製されうるエピソームまたは染色体外ＤＮＡ要素を意味する。一般に、アデノウイルスアンプリコンは、ウイルスＤＮＡの複製を支持する各末端反復配列の少なくとも一部分を含むと理解される。真核ウイルスアンプリコンは、好ましくは、完全なＩＴＲ配列の少なくとも約９０％を含む。したがって、「アデノウイルスアンプリコン」はＩＴＲ結合部および適切な複製起点のいずれかを含む。
【００４１】
本明細書中で用いる「形質移入」なる語は、細胞が生物学的に生存可能なままでＤＮＡを細胞の外部から細胞の内部へ導入する適切な方法のいずれかを意味する。本明細書中で用いるこの用語は、限定的なものではないがエピソームおよび他の環状または直鎖状ＤＮＡ形態の形質移入を含む任意の手段による宿主細胞内へのＤＮＡの導入を含む。この用語は、例えば本明細書に記載されているような遺伝子治療法を含む。本発明を実施するためには、限定的なものではないがリン酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーション、遺伝子銃形質移入、リポフェクションまたは他のカチオン脂質に基づく形質移入を含む適切な形質移入法のいずれも用いることが可能である。これらの技術は当業者によく知られている。
【００４２】
本明細書中で用いる用語は本発明を限定するものではない。例えば、「遺伝子」なる語は、遺伝子産物をコードするｃＤＮＡ、ＲＮＡまたは他のポリヌクレオチドを含む。「核酸」、「ＲＮＡ」、「ＤＮＡ」などの用語を用いる際には、特定の段階で用いられうる化学構造を限定するものではない。例えば、ＤＮＡの代わりにＲＮＡが一般に用いられうることは当業者によく知られており、したがって、「ＤＮＡ」なる語の使用はこの代用を含むと解釈されるべきである。また、種々の核酸類似体および誘導体も本発明の範囲内であることが公知である。遺伝子または核酸の「発現」は、細胞遺伝子発現だけでなく、クローニング系および任意の他のコンテクストにおける核酸の転写および翻訳をも含む。
【００４３】
自然感染からのアデノウイルスの大規模生産はウイルスＤＮＡ複製と主要後期プロモーター活性との協同作用の結果であると理解される。実際、この方法は、ビリオンをパッケージングするのに要する大きなプールを生成する効果を有する、高コピー数の転写活性鋳型の蓄積をもたらす。先行技術は、１以上のウイルスタンパク質が欠損したアデノウイルスベクターの産生のための１以上のウイルスタンパク質を発現するいくつかのヘルパー細胞系を含むが、自然感染を模倣した一連の協同事象（例えば、ウイルスＤＮＡ複製および必要な構造タンパク質の発現）により特徴づけられる生産系は未だ記載されていない。宿主細胞染色体内への相補遺伝子の組込みに基づく相補ヘルパー細胞系の製造を要する方法を用いる代わりに、宿主細胞内で自己複製可能なアデノウイルス複製に必要な非構造Ｅ２遺伝子のすべてを含有するエピソームプラスミドが得られた。
【００４４】
ヘルパーウイルス依存性生産系の使用に伴う、先行技術で認められている問題点に対処して、本発明は、多または完全欠失アデノウイルスベクターを相補しうるプロデューサー細胞系を作製するために使用されうる新規アデノウイルスアンプリコンを提供する。該アンプリコンは、ヘルパーウイルス非依存性ベクター産生の効率が最大となるよう自然アデノウイルス感染の段階を模倣する態様で機能するように設計されている。本明細書中に示すとおり、これは、ウイルス転写カスケードの開始に要するアデノウイルス初期遺伝子の発現を能動的に抑制し／遅延させることにより開示のエピソーム（すなわち、アデノウイルスアンプリコン）がパッケージング細胞系の核内の潜伏相において維持されるパッケージング細胞を操作することにより達成される。
【００４５】
潜伏性は、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）由来ＤＮＡ複製要素の核保持特性の利用および誘導性発現系（本明細書中ではテトラサイクリン調節発現系により例示される。）の使用により達成される。誘導により、複製に必要なアデノウイルスＥ２遺伝子（すなわち、ポリメラーゼ、プレ末端タンパク質およびＤＮＡ結合タンパク質）の発現を招くエピソーム配列の転写を引き起こす複製相の活性化がもたらされる。実際、潜伏相から複製相への移行により、トランスジーンを含む多または完全欠失アデノウイルスベクターを効率的にパッケージングするのに必要な大量の相補ウイルスタンパク質の蓄積が促される。したがって、典型的に自然感染の後期に高力価のビリオン産生をもたらす一連の事象を模倣する態様で該パッケージング細胞が機能するのを可能にするよう、該アンプリコンが設計される。したがって、開示されているアンプリコンおよびパッケージング細胞系は、ヘルパーウイルス非依存性医薬等級ベクターの効率的高力価製造方法を可能にする。
【００４６】
エピソームプラスミド（ｐＥ２）は以下の特徴により特徴づけられる：（ｉ）これは、該エピソームを自律複製可能にし核内保持の促進によりエピソームを多コピーで維持するＥＢＶプラスミド複製起点のような要素を含む、（ｉｉ）これは、直鎖形態でのＤＮＡ複製を可能にするＡｄ５逆末端反復（ＩＴＲ）結合部を含む、（ｉｉｉ）これは、アデノウイルスの複製に必要なＥ２アデノウイルス遺伝子、例えばポリメラーゼ、プレ末端タンパク質およびＤＮＡ結合タンパク質ならびに初期領域４（Ｅ４）ＯＲＦ６の誘導性発現をもたらす。
【００４７】
ウイルスＤＮＡ複製のためには、Ａｄ５ウイルスＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＢＫ０００４０８に開示されている。）の僅か２つの領域のみがシスで要求されることが公知であることを、当業者は認識する。これらは左逆転末端反復配列またはＩＴＲ（Ａｄ５のｂｐ１〜約１０３）および右ＩＴＲ（Ａｄ５のｂｐ３５８３３〜３５９３５）である。ＥＢＶ由来の複製起点系の存在は、アンプリコンが多コピーで核内に保持され染色体ＤＮＡと同時に複製されるのを可能にし、一方、アデノウイルスＩＴＲ結合部の存在は、Ｅ２領域によりコードされるタンパク質の存在下、アンプリコンが多コピー数で複製されるのを可能にする。該アンプリコン上での誘導性プロモーターの使用は、エピソームの複製に及びトランスジーンを含む多または完全欠失アデノウイルスベクターの増殖に要求されるアデノウイルス遺伝子を、厳密に調節応答性である誘導性プロモーターの制御下に配置する。一般には、誘導性プロモーターは、アクチベーターにより誘導されるプロモーターである。誘導性プロモーターに作用するインデューサーの非存在下では、エピソーム上に含有されるアデノウイルス遺伝子は発現されず、ウイルスタンパク質の産生は伴わず、ウイルスタンパク質誘導性細胞毒性のリスクは最小である。
【００４８】
実際、開示されているアンプリコン（例えば、エピソーム）は、前記特性の１以上を同時に達成するよう、宿主細胞内に存在する他の要素（例えば、活性化因子）と協同して働きうる要素を含みうる。例えば、同一要素（ＤＮＡ配列）が自己増殖能を付与し核内保持を促進しうる。代替的ウイルス複製系に由来するＤＮＡ配列も本発明の実施に使用されうると理解されるべきである。例えば、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）由来の複製起点および活性化因子（６０）またはＳＶ４０由来Ｔ抗原系に基づくベクターに由来する配列が、適切な代替物となる。
【００４９】
本明細書中の実施例は、ＥＢＮＡ−１を発現する宿主細胞の使用を記載しているが、所望により、アデノウイルス遺伝子を含有する同一エピソーム単位（アンプリコン）上もしくは複製可能な第２の遺伝単位上にコード配列を含めることにより又は宿主細胞ゲノム内への安定組込みにより他の活性化因子を導入することが可能であることは容易に理解される。例えば、本明細書に記載のとおりにＥＢＮＡ１抗原およびＥＢＶ複製起点を使用する代わりに、ＢＰＶ複製起点と共にウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）Ｅ１およびＥ２抗原を使用することが可能である。Ｅ１抗原は、複製の開始および伸長に必要なヘリカーゼであり、Ｅ２抗原は、複製起点へのＥ１抗原の結合を補助する転写因子である（６１）。総合すると、これらのウイルスタンパク質はまた、適当な形質移入に関してコンピテントである細胞におけるエピソームの核内保持を促進することが公知である。
【００５０】
霊長類細胞内において非組込み型自律的複製性エピソームベクターを安定に維持し及びプラスミドの安定な複製を支持する、ＥＢＶゲノムの確定された遺伝的要素が公知である。必要な遺伝的要素には、シス作用性プラスミド複製起点（ｏｒｉＰ）およびトランス作用性エプスタインバー核抗原（ＥＢＮＡ−１）タンパク質が含まれる。より詳しくは、ＥＢＶ由来要素、すなわちｏｒｉＰおよびＥＢＮＡ−１は、これらのベクターにより形質移入された哺乳類細胞内において１〜９０個の範囲の数で非組込み型染色体外分子として専ら存在する組換えエピソームの安定な複製を支持するために使用されている。
【００５１】
ＥＢＶゲノムの複製起点ｏｒｉＰを含有しＥＢＮＡ１ウイルスタンパク質（６４１アミノ酸）の発現を可能にするプラスミドは、形質移入されたヒト細胞内で安定なエピソーム様態で維持され、それらの複製は細胞分裂と同時に生じる。本明細書に示すとおり、活性化因子ＥＢＮＡ−１の存在下で使用するＥＢＶ複製起点（ＯｒｉＰ）は自己複製能を付与し、核内保持を促進する。理論により束縛されるものではないが、ＥＢＮＡ１タンパク質は複製開始のレベルで３０ｂｐの反復配列に結合し、Ｓ相の時点での細胞性因子のリクルートメント、およびｏｒｉＰ配列をシスで有するプラスミドの、細胞分裂との同期的複製を可能にすると考えられている。さらに、ＥＢＮＡ１は、おそらく染色体構造体および反復単位のレベルでの同時結合により、細胞分裂時のエピソームの分離および核内維持を可能にするのであろう。これらの要素は、それ自身で、複製時に、細胞当たり複数のコピーのプラスミドベクターのエピソーム維持および分離を可能にする。
【００５２】
本発明で使用するエピソームにおいて、適切なＥＢＶ複製起点ＤＮＡ配列のいずれも使用することができる。適切なＥＢＶ複製起点配列（ｏｒｉＰ）の一例はＧｅｎＢａｎｋ Ｖ０１５５５に開示されている。ｏｒｉＰ領域はこのＧｅｎＢａｎｋ配列のヌクレオチド７３３３からヌクレオチド９３１２までの配列に及んでいる。本明細書に記載のエピソームにおいて使用されるｏｒｉＰ配列は、６５ｂｐの逆転復配列単位により形成され３０ｂｐ単位の４個の不完全なコピーを含む複製起点から９６０ｂｐ離れた、３０ｂｐの２０単位の反復から構成されている。
【００５３】
エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）由来ｏｒｉＰは、ＥＢＮＡ−１結合配列の２つのクラスター（反復配列のファミリーおよび二回対称配列）から構成されている。どちらの要素もＥＢＮＡ−１への複数の結合部位を有し、ｏｒｉＰを含有するプラスミドの複製および核内保持に必須である。宿主細胞因子は、本明細書に開示するエピソームの複製および核内保持を補助すると考えられている。一般に、適当なｏｒｉＰ配列は、ｏｒｉＰ機能に必要なことが知られている反復配列のファミリーおよび二回対称の領域を含む。本発明において使用されうるＥＢＶ ｏｒｉＰ配列には、天然に存在する配列からの修飾を含有するもの、例えば、天然配列の欠失、挿入、置換および重複を含有するものが含まれる。そのような誘導体配列は、例えば、ｏｒｉＰ機能に必要な前記公知領域を維持させることにより入手できる。また、保存的置換はよく知られており、当業者に入手可能である。使用するｏｒｉＰ配列は、十分に多い量のＥＢＮＡ１タンパク質の存在下でｏｒｉＰ配列が存在するエピソームの複製を導くよう宿主細胞内で有効に機能するものである。
【００５４】
適切なＥＢＮＡ１タンパク質のいずれかをコードするＤＮＡが本発明のプロデューサー細胞により発現されうる。ＥＢＮＡ１をコードするＤＮＡはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから商業的に入手可能であり、そのＥＢＶ系列プラスミドのいくつかの中に含有される。さらに、ＥＢＮＡタンパク質をコードするＤＮＡは、発現されるタンパク質が宿主細胞におけるＥＢＶ ｏｒｉＰ含有エピソームの複製を支持する、天然に存在するＥＢＮＡ１アミノ酸配列の変異体、例えば、欠失、付加、挿入または置換を含有するものをコードすることが可能である。この変異体は、本明細書に記載の他の配列の場合と同様に、アミノ酸配列保存的変異体をコードする機能的に保存的な核酸配列、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムによる測定で９０％を超える、好ましくは９５％を超える同一性または相同性を有する配列、および高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする配列を含む。さらに、同一ＥＢＮＡ１タンパク質をコードする縮重ＤＮＡ配列を使用することが可能である。同一アミノ酸配列を発現しうる縮重ＤＮＡ配列は、そのようなＤＮＡ配列の構築および発現方法と同様、当技術分野でよく知られている。
【００５５】
ＥＢＮＡ１は、よく知られた技術を用いて任意の霊長類またはイヌ細胞内に安定に形質移入されることができ、組込み遺伝子コピーからＥＢＮＡ１を発現する得られた細胞系は、適当な生産細胞系を作製するために使用されうる。あるいは、ＥＢＮＡ１が発現される限り、感染性または欠損性ＥＢＶを既に含有する細胞系を使用することが可能である。これは、ＡＴＣＣから入手可能な多数のＥＢＶ形質転換リンパ芽球を含む。ＥＢＮＡ１を既に発現する細胞系の形質移入が非常に好都合である。なぜなら、そのような細胞はエピソーム構築物を安定に維持する能力は数桁増強されることが可能であり、僅か２〜３週間のうちに安定細胞系が作製されうるからである（６２）。しかし、これらの方法は、組込み遺伝子からＥＢＮＡ１を構成的に発現する細胞系を製造する追加的な工程を要する。
【００５６】
本明細書中に示すとおり、テトラサイクリンプロモーターは、テトラサイクリンまたはその一般的類似体の１つ（例えば、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ））に応答性であり、開示されているエピソーム単位（例えば、アンプリコンまたはレプリコン）における使用に適している。テトラサイクリンの類似体であるドキシサイクリンは、ヒトにおけるその安全な使用、細菌テトラサイクリンリプレッサー（ＴｅｔＴ）に対するその特異性のため、広く受け入れられている。簡潔に説明すると、テトラサイクリン依存性調節系（ｔｅｔ系）は、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６タンパク質のアクチベータードメインに融合した原核性ＴｅｔＲよりなるテトラサイクリントランスアクチベーター（ｔＴＡ）と、最小プロモーターに融合した原核性テトラサイクリンオペレーター部位（ｔｅｔＯ）のいくつかのコピーよりなるテトラサイクリン応答性要素（ＴＲＥ）との間の相互作用に基づく（６８）。テトラサイクリン（ｔｅｔ）の存在下、ｔＴＡは、ＴＲＥに結合するその能力を失い、発現が遮断される。逆トランスアクチベーター（ｒｔＴＡ）は突然変異誘発によりｔＴＡから誘導されている。ｔＴＡとは対照的に、ｒｔＴＡはｔｅｔの存在下でＴＲＥに結合するに過ぎない。
【００５７】
転写の基底レベルを減少させることにより遺伝子発現の緊縮調節を得るために、本発明者らは、最近記載された逆ｔｅｔトランスアクチベーターの新規改良形態（２９）とＴｅｔ転写サイレンサーｔＴＳｋｉｄ（１６）との組合せを利用するＴｅｔ調節系を使用した。ｔＴＳｋｉｄは、転写のリプレッサーとして機能することが公知の腎タンパク質Ｋｉｄ−１のＫＲＡＢドメインを含有する。ｔＴＳｋｉｄは、エフェクター薬の非存在下でＴｅｔプロモーターに結合して、転写の基底レベルを減少させる。逆Ｔｅｔトランスアクチベーターとの組合せは、ドキシサイクリン添加により調節される活性化／抑制系の構築を可能にする。この目的のために、図１Ａに記載のとおりにＥＭＣＶ ＩＲＥＳを使用することによりそれらの２つの遺伝子をビシストロン転写単位において組合せた。
【００５８】
真核細胞における誘導性遺伝子発現を導きうるいくつかのプロモーター系が入手可能である。これらには、重金属イオン（６３）、（６４）、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（６５）、ホルモン、例えばコルチコステロイド（６６）、プロゲステロンアンタゴニスト（６７）またはテトラサイクリン（６８）に応答して修飾される活性を有するプロモーターが含まれる。しかし、エクジソン、ラパマイシン、ＲＵ４８６、デキサメタゾンおよび重金属（すなわち、ＺｎまたはＣｄ）のようなアクチベーターに対して応答性である他のよく知られた誘導性調節要素も適している。代替的な調節要素を本発明での使用に応用することは当業者の能力の範囲内に十分に含まれる。本発明の目的には、十分なレベルまたは調節制御を保証するものであり、医薬用途に許容されるアクチベーターにより誘導可能なものである限り、調節要素のいずれも使用することが可能である。さらに、遺伝子発現の厳密な調節を促進するために、他の調節要素、例えばテトラサイクリン応答性トランスアクチベーターおよび／またはサイレンサー（ｒｔＴＡおよびｔＴｓ）に誘導性プロモーターを機能的に連結しうると理解されるべきである。
【００５９】
発現カセット（関心のあるトランスジーンと、本明細書中に開示されている哺乳類細胞内での発現を導くための必要な調節配列とを含むものとして定義される。）のすべては、腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＪ５１８３内での相同組換えによるｐＡｄ５ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋のＥ１領域における挿入が可能となるよう、ＣＭＶプロモーターおよびトランスジーン発現用ＢＧＨポリＡシグナルに加えてＡｄ５配列［ｎｔ］１−４５０（左）（配列番号１）および［ｎｔ］３５１１−５７９２（右）（配列番号２）を含有するＡｄ−シャトルベクターのコンテクストにおいて構築した。ＥＧＦＰ ｃＤＮＡはｐＥＧＦＰプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から得、ついでＡｄ−シャトルプラスミド内にクローニングしてｐＳｈＡｄ５ ＥＧＦＰを得た。
【００６０】
本明細書に記載の方法において、所望の配列をコードするエピソームにより成功裏に形質移入された細胞を選択するために、通常の選択マーカーを使用する。そのような選択は、通常、形質移入された細胞を抗生物質または関連選択過程を開始させる他の物質にさらすことを含む。本発明で使用するエピソームにおいて使用する選択マーカー遺伝子は、これらの遺伝子を含有する細胞が対応抗生物質または因子の存在下で成長するのを可能にする、特定の抗生物質および／または因子に対する耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子である。真核性選択マーカーの非限定的な例には、ヒグロマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｇａｉｔｈｅｓｂｏｒｏ，Ｍｄ．から商業的に入手可能なｈｙｇまたはｈｐｈ）、ネオマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｇａｉｔｈｅｓｂｏｒｏ，Ｍｄ．から商業的に入手可能なｎｅｏ）、ゼオシン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃａｌｉｆ．から商業的に入手可能なＳｈ Ｂｌｅ）、ピューロマイシン（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ Ｃａｌｉｆ．から入手可能なｐａｃ、ピューロマイシン−Ｎ−アセチル−トランスフェラーゼ）、ウアバイン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手可能なｏｕａ）およびブラスチシジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）に対する耐性を付与する抗生物質耐性遺伝子が含まれる。
【００６１】
多欠失ヒトＡｄ５ベクターバックボーンの概要図を図７Ａに示す。Ｅ１およびＥ３領域の古典的欠失（１１に概説されている）のほかに、本発明者らは、Ｌ４イントロンを含め、ｒ鎖においてコードされる他の機能に何ら影響を及ぼすことなくＤＮＡ結合タンパク質の全コード配列（［ｎｔ］２２２４５−２４０２９；（配列番号３）１７８４ｂｐ欠失）を除去した。三成分リーダー配列のイントロンおよび主要後期単位に対応するプレ末端タンパク質（Ａｄ５［ｎｔ］８９１９−９４６２（配列番号５）５４３ｂｐ欠失）遺伝子およびポリメラーゼ（［ｎｔ］７２７４−７８８３；（配列番号４）６０９ｂｐ欠失）の部分を欠失させてＥ２ｂ遺伝子発現をノックアウトした。さらに、ポリメラーゼのトランケート化非活性形態の産生を妨げるために、ＡＴＧ開始コドンをＣＴＧに突然変異させた。Ｅ４プロモーターに直接的に融合したｏｒｆ３を除き、Ｅ４領域を完全に欠失させた（［ｎｔ］３２８３０−３４３１６（配列番号６）および３４８９５−３５４４３；（配列番号７））。
【００６２】
全初期遺伝子の欠失を組合せることによりＡｄ５バックボーンにおいて生じた理論的空間は約１２．４Ｋｂである。該新規ベクター系の大きな容量を利用して、マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）プロモーターに融合した全ＨＣＶポリタンパク質遺伝子用の発現カセットを挿入した。該ＨＣＶポリタンパク質発現カセットは、５’および３’非翻訳領域を除去し、コアＡＴＧの上流に最適コザック配列を挿入し、ＮＳ５Ｂレプリカーゼの触媒ドメインを変異させて酵素活性を除去することにより構築した（３２）。トランスジーンの発現効率を増加させるために、ヒトＣＭＶプロモーターを、ＦＧアデノウイルスベクターにおいて４〜３０倍強力であると報告されているマウスＣＭＶプロモーター（１）で置換した。
【００６３】
図７Ｂは、多欠失ベクターのＥ１領域内に導入されたＨＣＶ（株ＢＫ）ポリタンパク質発現カセットの概要図を示す。ＨＣＶ ５’および３’ＵＴＲ配列を除去し、最適化コザック配列を該ポリタンパク質の５’側に融合させた。発現はマウスＣＭＶプロモーター（ｍＣＭＶ）およびウシ成長ホルモンポリＡ（ＢＧＨポリＡ）により調節される。
【００６４】
オープンリーディングフレーム３の維持は、内部ＣＭＶプロモーターにより調節されるトランスジーンのインビボおよびインビトロでの持続的発現に必要であることが公知である（１８，３４）。したがって、ΔＥ１Ｅ３ＦＧベクターの５７００ｂｐの欠失、およびそれによる、ｗｔ（６）の１０５％のゲノムサイズのパケーンジング容量に加えて、該新規Ａｄ５ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋ウイルスベクターは１２．４Ｋｂまでのトランスジーンを収容しうる。この目的には、本発明のアデノウイルスアンプリコンおよびプロデューサー細胞ならびに本発明の方法を用いて、関心のある多数のトランスジーンを含む欠損アデノウイルスベクターを得ることが可能であると予想される。
【００６５】
本明細書中に開示されている多欠失Ａｄ５ウイルスバックボーンにおける使用のための適当なトランスジーンには、特定の哺乳類種における発現に関してコドンが最適化された、免疫原をコードする核酸配列（すなわち、トランスジーン）が含まれるが、これに限定されるものではない。１つの実施形態においては、本発明は、感染因子により発現される抗原に対する免疫応答を誘導するための免疫原性組成物（例えば、ワクチン）を提供する。例えば、ヒトおよび／または非ヒト動物種に感染するウイルスに対する免疫応答を惹起することが望ましい。
【００６６】
多欠失Ａｄ５ベクターは、細菌、真菌、寄生生物を含む病原体により発現されるタンパク質に対するヒトまたは動物における免疫応答を刺激するのにも適していよう。スタフィロコッカス・アウレスス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトコッカス・ピロゲネス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ビブリオ・コレラ（ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、クロストリジウム・テタニ（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、ナイゼリア・メテンジチス（ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）、コリネバクテリウム・ジフテリアエ（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｅｒｉａｅ）、ミコバクテリウム・ツバクロシス（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびレプラエ（ｌｅｐｒａｅ）、リステリア・モノサイトジェネス（ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｆｉｌａ）は、望ましいであろう、免疫応答を惹起する対象となる細菌の具体例であるが、これらに限定されるものではない。真菌および寄生生物の具体例としては、カンジタ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・フミガツス（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、ヒストプラズマ・カプスラツム（ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、プラスモジウム・マラリアエ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、レイシュマニア・マジョール（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）、トリパノソマ・クルジ（ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅ ｃｒｕｚｉ）およびブルセイ（ｂｒｕｃｅｉ）、シストロソマ・ヘマトビウム（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ）、マナソニ（ｍａｎｓｏｎｉ）およびジャポニカム（ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）；エンタモエバ・ヒストリチカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、ヒトフィラリア症を引き起こすフィラリア（Ｆｉｌａｒｉａ）の種々の種が挙げられうる。
【００６７】
予防的および／または治療的免疫応答が望ましいであろうウイルス科の具体例には、アフトウイルス属、カルヂオウイルス属、エンテロウイルス属、ヘパトウイルス属、パレコウイルス属、ライノウイルス属のような６つの異なる属を含むピコルナウイルス科が含まれる。これらのすべては、脊椎動物に感染するウイルスを含有する。免疫応答が望ましいであろうピコルナウイルスの具体例としては、口蹄疫ウイルス、脳心筋炎ウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、ヒトＡ型肝炎ウイルス、ヒトパレコウイルス（ｐａｒｅｃｈｏｖｉｒｕｓｅｓ）、ライノウイルスが挙げられる。カリシウイルス科は、ノーウォーク群のウイルスにより引き起こされるヒトにおける流行性胃腸炎、およびウサギ出血性疾患ウイルスに関連したウサギにおける出血性疾患またはネコカリシウイルスにより引き起こされるネコにおける呼吸疾患のような動物における他の症候群に関連した種々の属を含む。もう１つの科は、ヒトおよび多数の異なる動物種から分離されたウイルスを含むアストロウイルス科である。ヒトアストロウイルスは胃腸炎および乳幼児の下痢に関連している。トガウイルス科はアルファウイルス属およびルビウイルス属の２つの属を含む。アルファウイルス属は、ヒトおよび獣医学的疾患、例えば関節炎（すなわち、チクングニヤウイルス、シンドビスウイルス）または脳炎（すなわち、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス）に関連している。風疹ウイルスは、発熱およびリンオアデノパシーに関連した軽度の発疹性疾患の突発を引き起こすルビウイルス属の唯一のメンバーである。風疹ウイルス感染は、妊娠初期に母親により獲得された場合には、胎児異常にも関連する。フラビウイルス科は、重要なヒトおよび動物病原体を含むフラビウイルス属、ペスチウイルス属およびヘパシウイルス属の３つの属よりなるもう１つのウイルス科である。フラビウイルス属のメンバーの多くは、発熱、脳炎および出血熱を含む種々の疾患を引き起こす節足動物媒介ヒト病原体である。デング熱ウイルス、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、西ナイル熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルスは、世界的または地域的（地域流行性）に懸念される主要な病原体である。ペスチウイルス属は、経済的に非常に重要な動物病原体、例えばウシウイルス性下痢ウイルス、古典的ブタコレラウイルス、ボーダー病ウイルスを含む。Ｃ型関連ウイルスは、急性および慢性肝炎を引き起こすヘパシウイルス属の唯一のメンバーである。組換えアデノウイルスにより発現されるＨＣＶタンパク質は、世界中で１億７０００万人を冒すウイルス感染の結果を抑制する防御用および治療用免疫応答を惹起しうる。
【００６８】
コロナウイルス科のメンバーに由来する抗原を組換えアデノウイルスベクターにより発現させて、感染に対する防御を得ることが可能である。重篤な急性呼吸症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ−Ｃｏウイルス）に対する防御は、限定的なものではないがヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質、ポリメラーゼ（Ｐ）タンパク質、膜（Ｍ）糖タンパク質、スパイク（Ｓ）糖タンパク質、小エンベロープ（Ｅ）タンパク質または該ウイルスにより発現される他のポリペプチドのいずれかを含むＳＡＲＳ−ＣｏＶタンパク質の組合せを発現する多欠失Ａｄ５ベクターで免疫することにより得られうる。狂犬病ウイルスを含むラブドウイルス科のメンバーは、ウイルスタンパク質を発現する組換えワクチンの標的となりうる。他の考えられうる標的には、いくつかの出血熱の突発を引き起こすエボラ様ウイルスおよびマールブルグ様ウイルス属を含むフィロウイルス科；麻疹、呼吸器合胞体、パラインフルエンザウイルスのようなヒトにおいて公知の最も一般的なウイルスおよびニューカッスル病および牛疫ウイルスのような獣医学的に関心の持たれるウイルスのいくつかを含むパラミクソウイルス科；インフルエンザＡ、Ｂ、Ｃウイルスを含むオルトミクソウイルス科；のようなリフトバレー熱、シン・ノンブレ（Ｓｉｎ Ｎｏｍｂｒｅ）、ハンタ、プーマラウイルスのような重要なヒト病原体を含む、主として節足動物により脊椎動物宿主に伝染するブニヤウイルス科；リンパ球性脈絡髄膜炎、ラッサ熱、アルゼンチン出血熱、ボリビア出血熱ウイルスを含むアレナウイルス科；主としてウマおよびヒツジにおける中枢神経系疾患を引き起こすウイルスを含むボルナウイルス（Ｂｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）科；世界的な乳児および幼児における重篤な下痢疾患の最も重要な原因であるロタウイルス、ヒトおよび他の哺乳動物の両方を冒しうるオルビウイルス（ブルータング、流行性出血熱ウイルス）を含むレオウイルス科が含まれる。
【００６９】
ウイルス抗原をコードする適切なトランスジーンは、重要なヒト病原体を含む大きなウイルス群であるレトロウイルス科のメンバー、例えばヒト免疫不全ウイルス１および２（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）ならびにヒトｔ細胞白血病ウイルス１および２型（ＨＴＬＶ１および２）ならびに非ヒトレンチウイルス、例えばヒツジおよびヤギを冒すマエディウイルス／ビスナウイルス、ウマを冒すウマ伝染性貧血ウイルス、ウシを冒すウシ免疫不全ウイルス、ネコを冒すネコ免疫不全ウイルス；ポリオーマウイルス科群小ＤＮＡ腫瘍原性ウイルス［原型ウイルスは、それぞれマウスおよびアカゲザルを冒すポリオーマウイルスおよびＳＶ４０である（ＳＶ４０に密接に関連しているＢＫおよびＪＣウイルスはヒト患者から分離された。）。］からも得ることが可能である。
【００７０】
パピローマウイルス科は、疣贅およびコンジロームを生成する、ヒトを含む高等脊椎動物を冒すＤＮＡウイルス群からなる。パピローマウイルスの感染はヒトおよび動物の両方における癌の発生に関連づけられた。ヒトパピローマウイルスは子宮頚癌、膣癌および皮膚癌に関連している。ヘルペスウイルス科は、ヒトおよび他の哺乳動物に対する多数の重要な病原体が分類される亜科を含む。他の抗原源には、単純ヘルペスウイルス１および２、水痘・帯状疱疹ウイルス、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス６Ａ。６Ｂおよび７、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスが含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに適した抗原源としては、ポックスウイルス科のメンバー、例えばサル痘ウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、痘瘡ウイルス；ヘパドナウイルス科の原型メンバーであるＢ型肝炎ウイルスならびに急性および／慢性肝炎を引き起こす他のウイルス、例えばデルタ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルスが挙げられる。
【００７１】
第２の実施形態において、本発明は、腫瘍抗原に対する免疫応答を誘導するための免疫原性組成物（例えば、ワクチン）を提供する。適切な組成物は、腫瘍抗原をコードする最適化核酸配列を含む組換えチンパンジーアデノウイルスと生理的に許容される担体とを含有するであろう。特定の実施形態において、該カセットのコード配列要素は、単一の免疫原、例えば病原因子由来の抗原、または自己抗原、例えば腫瘍関連抗原をコードしうる。他の実施形態において、該コード配列は２以上の免疫原をコードしうる。例えば、これは、Ｈｅｒ２ Ｎｅｕ、ＣＥＡ、Ｈｅｐｃａｍ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、テロメラーゼ（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ）、ｇｐ１００、メラン（Ｍｅｌａｎ）−Ａ／ＭＡＲＴ−１、Ｍｕｃ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、スルビビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、ストロメリシン（Ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ）３、チロシナーゼ（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）、ＭＡＧＥ３、ＣＭＬ６８、ＣＭＬ６６、ＯＹ−ＴＥＳ−１、 ＳＳＸ−２、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−２、ＳＡＲＴ−３、ＮＹ−ＣＯ−５８、ＮＹ−ＢＲ−６２、ｈＫＬＰ２、ＶＥＧＦ、５Ｔ４のような自己抗原の組合せをコードしうる。
【００７２】
トランスジーンの発現を導くために使用する転写プロモーターは、好ましくは、真核性ＲＮＡポリメラーゼにより認識される。好ましい実施形態においては、該プロモーターは「強力」または「効率的」プロモーター、例えば、本明細書に記載の実施例において使用するマウスＣＭＶプロモーター（ｍＣＭＶ）である。もう１つの強力プロモーターの一例は、好ましくはイントロン配列を伴わない、最初期ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（参照により本明細書に組み入れるＣｈａｐｍａｎら，１９９１ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９：３９７９−３９８６）である。したがって、本明細書中に開示されており特許請求されているエピソームにおける使用に適した１つの代替的プロモーターには、ヒトＣＭＶプロモーターが含まれる。当業者は、任意の多数の他の公知プロモーター、例えば強力な免疫グロブリンまたは他の初期もしくは後期ウイルスプロモーター、例えばＳＶ４０初期もしくは後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）初期プロモーター；真核細胞プロモーター、例えばβアクチンプロモーター（Ｎｇ，Ｓ．Ｙ．，Ｎｕｃ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１７：６０１−６１５，１９８９，Ｑｕｉｔｓｃｈｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：９５３９−９５４５，１９８９）、ＧＡＤＰＨプロモーター（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５０９２−５０９６，１９８８，Ｅｒｃｏｌａｎｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５３３５−１５３４１，１９８８）、メタロチオネインプロモーター（Ｋａｒｉｎら Ｃｅｌｌ ３６：３７１−３７９，１９８９；Ｒｉｃｈａｒｄｓら，Ｃｅｌｌ ３７：２６３−２７２，１９８４）ならびにコンカテネーション化応答要素プロモーター、例えばサイクリックＡＭＰ応答要素プロモーター（ｃｒｅ）、血清応答要素プロモーター（ｓｒｅ）、ホルボールエステルプロモーター（ＴＰＡ）および応答要素プロモーター（ｔｒｅ）（最小ＴＡＴＡボックス近傍のもの）を使用しうると理解する。
【００７３】
遺伝子発現カセット内に存在する好ましい転写終結配列は、ウシ成長ホルモンターミネーター／ポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐＡ）である。代替的転写終結／ポリアデニル化配列には、チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子に由来するもの又はＳＶ４０由来配列、例えばｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において見出されるものが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７４】
本発明の目的、利点、用途および方法について全般的に説明してきたが、本発明の種々の実施形態を詳細に説明するために、以下に非限定的な実施例を記載する。しかし、本明細書に記載の発明は、以下の実施例の詳細には限定されず、これらは、本発明の実施を望む者のための単なる指針として記載されているに過ぎないと理解されるべきである。本発明の範囲は、完全な開示および本明細書に添付されている特許請求の範囲に関して評価されるべきである。
【００７５】
材料および方法
本発明の実施は、特に示さない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学および生化学の通常の技術を用い、これらは当技術分野の通常の技術の範囲内である。このような技術は、例えば“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ＆ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，１９８７）；“Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ”（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ＆ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編，１９８７）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９８７）；および“ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”（Ｍｕｌｌｉｓら編，１９９４）のような参考文献に十分に説明されている。
【００７６】
配列決定は、標識プライマーもしくはターミネーターを使用する商業的に入手可能な自動シークエンサーまたは配列決定用のゲルに基づく方法を用いて行うことが可能である。また、配列分析は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子上でお互いに直に隣接してアニールするオリゴヌクレオチド配列の連結に基づく方法により行う（ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０−５６９（１９８９）；Ｌａｎｄｒｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：８９２３−８９２７（１９９０）；Ｂａｒａｎｙ，Ｆ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：１８９−１９３（１９９１））。図１１は、本開示に記載されているポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列（すなわち、配列番号１〜２１）を示す。
【００７７】
本開示の全体にわたって記載されている具体的な塩基対の番号に関する基準として、野生型アデノウイルス血清型５を使用する。野生型アデノウイルス血清型５の配列は公知であり、当技術分野において記載されている。参照により本明細書に組み入れるＣｈｒｏｂｏｃｚｅｋら，１９９２ Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８６：２８０を参照されたい。当業者は、アデノウイルス血清型５に関する塩基対により定められる領域に対する配列相同性により、他のアデノウイルス血清型（例えば、血清型２、４、６、１２、１６、１７、２４、３１、３３および４２）における前記領域を容易に特定することが可能である。したがって、ヒトアデノウイルス血清型５を使用する以下の実施例は限定的なものではないと理解されるべきである。当業者は、異なるアデノウイルス血清型（例えば、Ａｄ２）に関して、類似したプラスミド、ウイルスおよび技術を利用しうると認識するであろう。同様に、異なるヒトアデノウイルス、特にチンパンジーアデノウイルスに関して、類似したプラスミド、ウイルスおよび技術を利用しうるため、ヒトＡｄの使用は限定的なものではない。
【００７８】
プラスミドの構築
Ｔｅｔサイレンサーおよび逆Ｔｅｔトランスアクチベーター発現カセットを含有するｐＩＲＥＳＴの構築を図１Ａに記載する。該Ｔｅｔ系は、単一の発現ベクターにおいて、以下のとおりに構築した。Ｔｅｔサイレンサー（ｔＴＳ）を含有するＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩ ＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＨＳ６−１（Ｅ．Ｂｕｊａｒｄにより快く提供されたもの）から単離し、ベクターｐＩＲＥＳ−Ｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）内のＩＲＥＳ配列の下流に挿入してＮｅｏ遺伝子を置換した。その新たなベクターｐＩＲＥＳ−ｔＴＳを、ヒトサイトメガロウイルスＩＥプロモーターの下流の唯一のＥｃｏＲＶ制限部位内へのｒｔＴＡ２遺伝子（Ｅ．Ｂｕｊａｒｄにより快く提供されたｐＵＨＤ ５２−１に由来する。）の挿入により修飾して、ｐＩＲＥＳｔＴＳ／ｒｔＴＡを得た。図２は、ＡｄＴｅｔＬｕｃ感染クローンにおけるルシフェラーゼ発現のグラフ表示を示す。簡潔に説明すると、２９３ＥＢＮＡ細胞および種々の２９３ＥＢＮＡ／Ｔｅｔクローンに、１μｇ／ｍｌ ドキシサイクリンの存在下（黒色棒線）または非存在下（白色棒線）、ＡｄＴｅｔＬｕｃを感染させた（ｍ．ｏ．ｉ １０）。細胞溶解物におけるルシフェラーゼ活性を感染の４８時間後に評価した。
【００７９】
Ｔｅｔタンパク質を安定に発現する細胞クローンを単離するための選択ーマーカーを導入するために、ｐＰＵＲベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から得たピューロマイシン耐性発現カセットをｐＩＲＥＳｔＴＳ／ｒｔＴＡのＸｈｏＩ部位内に挿入してｐＩＲＥＳｔＴＳ／ｒｔＴＡｐｕｒｏを得た。ｐＥ２の構造を図１Ｂに記載する。
【００８０】
Ａｄ５ポリメラーゼｃＤＮＡを含むプラスミドｐＶａｃＰｏｌから得たＣｌａＩ／ＳｐｈＩ断片、およびＡｄ５−ｐＴＰ ｃＤＮＡを含有するｐＶＡＣｐＴＰからのＡｃｃ６５／ＥｃｏＲＶ断片を誘導性Ｔｅｔプロモーターの制御下のベクターｐＢＩ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）内に挿入することにより、Ａｄ５ポリメラーゼおよびプレ末端タンパク質を発現するビシストロン発現ベクターを構築した（ｐＶａｃＰｏｌおよびｐＶＡＣｐＴＰはＰ．Ｃ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｌｉｅｔにより快く提供されたものである。）。オリゴヌクレオチド：５’−ＴＴＡＴＡＣＧＣＧＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＴＡＣＧＴＣＣＧＧ−３’（配列番号９）および５’−ＴＴＡＴＧＣＴＡＧＣＧＣＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＴＣＣＡＣＧ−３’（配列番号１０）ならびにｐＦＧ１４０（１９）から得たＡｄ５ ＤＢＰ遺伝子（Ａｄ５［ｎｔ］２２４４３−２４０３２）（配列番号１１）を使用するＰＣＲにより得たＡｄ５ Ｅ４ ｏｒｆ６（Ａｄ５［ｎｔ］３３１９３−３４０７７）（配列番号８）を同じベクターｐＢＩ内に挿入することにより、第２の二方向性誘導性カセットを構築した。
【００８１】
ＨＳ４絶縁体（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）に隣接するｐＣＥＰ４に由来するＥＢＶ−ＯｒｉＰ（ＥＢＶ［ｎｔ］７３３３〜ヌクレオチド９３１２；ＧｅｎＢａｎｋ Ｖ０１５５５）（配列番号１２）領域をｐＪＣ１３−１（９）のＢａｍＨＩ部位内への直接的クローニングにより得た。オリゴヌクレオチド：５’−ＡＡＣＴＡＣＡＡＴＴＣＣＣＡＡＣＡＣＡＴＡＣ−３’（配列番号１３）および５’−ＣＡＣＡＴＣＣＧＴＣＧＣＴＴＡＣＡＴＧ−３’（配列番号１４）を使用するｐＦＧ１４０からのＰＣＲにより、Ａｄ５ ＩＴＲ結合部を増幅した。
【００８２】
最後に、ｔｋ−ヒグロマイシン−Ｂホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）カセットをｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から誘導した。ｐＥ２を構成するすべての要素をｐＢＩ−ｐｏｌ／ｐＴＰベクター内に順次導入して、最終的にｐＥ２を得た。
【００８３】
ｐＡｄ５ΔＥ１−４の構築
ｐＡｄＣＭＶ／ＬａｃＺ／ΔＰｏｌベクター（Ａ．Ａｍａｌｆｉｔａｎｏから快く提供されたもの（４））およびＡｄ５ｄｌ３０８ΔｐＴＰβ−ｇａｌ（Ｊ．Ｓｃｈａａｃｋから快く提供されたもの）（４５）からのそれぞれＡｄ５ポリメラーゼ（Ａｄ５［ｎｔ］７２７４−７８８３）（配列番号４）およびプレ末端タンパク質（Ａｄ５［ｎｔ］８９１５−９４６２）（配列番号５）の部分欠失をＭＲＫｐＡｄ５Ｅ３（５２）内に導入することにより、Ｅ２ｂ遺伝子が欠失したＡｄ５ΔＥ１−Ｅ３バックボーンを得た。また、ＡＴＧからＣＴＧへのポリメラーゼ開始コドンの部位特異的突然変異誘発も行って、最終的にｐＡｄ５ ΔＥ１，Ｅ３，Ｅ２Ｂベクターを得た。ＤＢＰ遺伝子を含むＤｒａＩ−ＭｓｃＩ断片（Ａｄ５［ｎｔ］２２４４５−２４０２９）が欠失したＡｄ５のＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ断片（［ｎｔ］２１５６３−２４７９７）を含有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳＩＩ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）はＲｏｃｃｏ Ｓａｖｉｎｏにより快く提供された。
【００８４】
＊＊＊ｐＡｄ−ΔＥ１−２ベクターは、ΔＤＢＰ断片およびＡｄΔＥ１，Ｅ３，Ｅ２Ｂベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂｊ５１８３内に同時形質転換する相同組換えにより得た。ｏｒｆ３を除く完全なＥ４単位（［ｎｔ］３２８３０−３４３１６および［ｎｔ］３４８９５−３５４４３）の欠失を、以下に記載するとおりに行った。ＡｖｒＩＩおよびＭｆｅＩ制限部位を末端に有するｏｒｆ３領域をＰＣＲ（ΔＥ４ｏｒｆ ｆｗ ＡｖｒＩＩ：５’− ＧＣＣＴＡＧＧＧＡＴＧＣＧＴＧＴＣＡＴＡＡＴＣＡＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣ−３’（配列番号１５）；ΔＥ４ｏｒｆ３ ｒｅｖ ＭｆｅＩ：５’−ＣＡＡＴＴＧＡＡＡＡＧＴＧＡＧＣＧＧＧＡＡＧＡＧＣＴＧＧＡＡＧＡＡＣＣＡＴＧ−３’（配列番号１６））により増幅し、同じ酵素で消化されたＥ４−シャトルベクター内にクローニングした。Ｅ４ｏｒｆ３はＥ４プロモーターおよびポリＡシグナルを維持する。ｐＡｄ５ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋ベクターを、そのようなＤＮＡをｐＡｄ５ΔＥ１−２ベクターと共に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＪ５１８３内に同時形質転換することにより得た。
【００８５】
すべての発現カセットは、トランスジーン発現用のＣＭＶプロモーターおよびＢＧＨポリＡシグナルに加えて、記載されている（５３）とおりに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＪ５１８３における相同組換えによりｐＡｄ５ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋のＥ１領域内の挿入を可能にするＡｄ５配列［ｎｔ］１−４５０（左）および［ｎｔ］３５１１−５７９２（右）を含有するＡｄ５−シャトルベクターのコンテクストにおいて構築した。ＥＧＦＰ ｃＤＮＡをｐＥＧＦＰプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）から得、ついでＡｄ−シャトルプラスミド内にクローニングしてｐＳｈＡｄ５ ＥＧＦＰを得た。５’および３’非翻訳末端反復配列（ＵＴＲ）が欠失したＨＣＶ−ＢＫ ｃＤＮＡ（ＨＣＶ ＢＫ［ｎｔ］３４２−９３７４（配列番号１７））をプラスミドｐＣＭＶ（１−９．４）（１４）から誘導した。
【００８６】
ＮＳ５Ｂ ＯＲＦは、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡ−ポリメラーゼの触媒三つ組み残基に対応する３つのアミノ酸位置において変異させて（Ｇ−２７３７をＡへ、Ｄ−２７３８をＡへ、およびＤ−２７３９をＧへ）、酵素活性を喪失させた（Ｎｉｃｏｓｉａら，未公開データ）。最適化コザック配列に融合したＨＣＶ ｃＤＮＡを、ＨＣＭＶプロモーターをＭＣＭＶプロモーターで置換することにより得たｐＡｄ５−シャトルの修飾形態内にクローニングして、最終的にｐＳｈＡｄ５ＨＣＶを構築した。ｐＡｄ５ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋のＥ１領域内へのすべての発現カセットの挿入を、記載されているとおりに（４３）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での相同組換えにより達成した。
【００８７】
細胞
２９３ＥＢＮＡ細胞系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、２ｍＭ グルタミンおよび２５０μｇ／ｍｌ Ｇ−４１８（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）内で培養した。０．５μｇ／ｍｌ ピューロマイシンを含有する同じ培地を使用することにより、２９３ＥＢＮＡＴｅｔ細胞を選択した。２Ｅ２細胞を選択することにより、９０μｇ／ｍｌのヒグロマイシンＢを、既に記載されている培地に加えた。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を該製造業者の説明に従い使用してプラスミドＤＮＡ形質移入を行った。逆ＴｅｔトランスアクチベーターおよびＴｅｔサイレンサータンパク質を発現する２９３ＥＢＮＡクローンを得るために、形質移入の１日前に、１×１０６個の２９３ＥＢＮＡ細胞を６ｃｍプレート内に播き、ＳａｐＩで線状化された５μｇのｐＩＲＥＳｔＴＳ／ｒｔＴＡｐｕｒｏで形質移入した。形質移入の４８時間後、細胞をトリプシン処理し、１５ｃｍプレート内のピューロマイシン含有ＤＭＥＭ内に播いた。耐性クローンを単離し、ついで、Ｔｅｔ−ルシフェラーゼカセットを含有する組換えＡｄ５でスクリーニングした。各クローンの５×１０５個の細胞を２４ウェルプレート内に三重に播き、該細胞にＡｄ５ Ｔｅｔ−ｌｕｃをドキシサイクリンの存在下および非存在下で１０の感染多重度（ｍｏｉ）で感染させた。感染の２４時間後、細胞を回収し、細胞溶解物においてルシフェラーゼ活性を測定した（ルシフェラーゼアッセイ系；Ｐｒｏｍｅｇａ）。遺伝子発現の誘導およびサイレンシングの両方を各クローンに関して、親２９３ＥＢＮＡ細胞において行った対照実験において得た相対光単位（ｒｌｕ）値に対する比として評価した。
【００８８】
２Ｅ２パッケージング細胞系を得るために、前記プロトコールに従い２９３ＥＢＮＡ Ｔｅｔ細胞をｐＥ２ベクターで形質移入した。９０μｇ／ｍｌのヒグロマイシンＢを含有するＤＭＥＭを使用して、安定なトランスフェクタントを選択した。耐性クローンを増殖させ、Ａｄ５ΔＥ１−２ＥＧＦＰ ＤＮＡの形質移入によりスクリーニングした。陽性クローンをＣＰＥの出現により特定し、Ａｄ５ΔＥ１−２ＥＧＦＰベクターの連続継代により確認した。１×１０６ ２Ｅ２細胞（ｎ＝３）からのエピソームコピー数を染色体外ＤＮＡ上で直接的に定量的リアルタイムＰＣＲにより評価した。プローブ（５’−ＦＡＭ−ＴＧＧＣＡＴＧＡＣＡＣＴＡＣＧＡＣＣＡＡＣＡＣＧＡＴＣＴ−３’−ＴＡＭＲＡ）（配列番号１８）ならびにプライマーＥ４−ｆｗ（５’−ＡＣＴＡＣＧＴＣＣＧＧＣＧＴＴＣＣＡＴ−３’）（配列番号１９）およびＥ４−ｒｗ（５’−ＧＧＡＧＴＧＣＧＣＣＧＡＧＡＣＡＡＣ−３’）（配列番号２０）。
【００８９】
ウイルスの増幅および力価測定
多欠失ウイルスの産生を２Ｅ２パッケージング細胞系において行った。アデノウイルスゲノムをＰａｃＩ消化によりそれぞれのプラスミドから遊離させ、１μｇ／ｍｌ ドキシサイクリンの存在下で２Ｅ２細胞内に形質移入した。形質移入の４〜６日後、細胞を３サイクルの凍結／解凍により細胞溶解し、該溶解物の５分の１を使用して、該ウイルスを連続継代により増幅した。２層細胞ファクトリー（ｆａｃｔｏｒｙ）（ＮＵＮＣ）内に播いた２Ｅ２細胞に感染させることにより、大規模増幅を行った。アデノウイルスベクターをＣｓＣｌ勾配により精製し、透析し、リアルタイムＰＣＲにより定量した。該ＣｓＣｌ精製ベクターの感染度を組織培養感染量５０％（ＴＩＣＤ５０）として２Ｅ２上で評価した（４３）。
【００９０】
サザンブロット分析
ｐＥ２複製をサザンブロット分析により評価した。２９３ＥＢＮＡＴｅｔ細胞を６ｃｍディッシュ内に播き、ドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により５μｇのｐＥ２ベクターで形質移入した。４８時間後、Ｈｉｒｔ法（２２）により染色体外ＤＮＡを単離した。ついでＤＮＡをＮｏｔＩおよびＤｐｎＩで消化し、３２Ｐ ＤＮＡプローブを使用する標準的な方法によるサザン分析に付した。Ｐｈｏｓｐｈｏｒ Ｉｍａｇｅｒ（商標）系（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用するオートラジオグラフィーによりシグナルを検出した。
【００９１】
安定なｐＥ２クローンからのエピソームＤＮＡをＨｉｒｔプロトコールに従い抽出し、ＢａｍＨＩで消化し、３２Ｐ標識ｐＥ２ ＤＮＡをプローブとして使用するサザンブロット法により分析した。
【００９２】
ウエスタンブロット分析
形質移入の４８時間後、以下のとおりにタンパク質発現の分析を行った。２Ｅ２歳棒をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、６ｃｍプレート当たり０．５ｍｌのＲＩＰＡバッファー（１×ＰＢＳ、１％ ＮＰ−４０、０．５％ デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、０．０５ｍＭ ＰＭＳＦ）を加えることにより細胞溶解した。プレートを氷上で１時間インキュベートし、ついで１０，０００×ｇ、４℃での遠心分離後、可溶性タンパク質を細胞溶解物から集めた。３０μｇのタンパク質上でウエスタンブロット分析を行った。サンプルを１０％ ＳＤＳ ＰＡＧＥ上で分離し、Ｐｒｏｔａｎニトロセルロースメンブレン（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよびＳｃｈｕｅｌｌ）上にブロッティングした。該メンブレンをポリメラーゼまたはｐＴＰに対するウサギ抗血清と共に、および抗ＤＢＰ ｍａｂ（Ｆ．Ｇｒａｈａｍ，Ｍｃ Ｍａｓｔｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｃａｎａｄａにより快く提供されたクローンＨ２−１９）と共にインキュベートした。ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体の存在下でのインキュベーション後、タンパク質をＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光基質（ＰＩＥＲＣＥ）により検出した。以下の試薬を使用することによりＨＣＶタンパク質発現を検出した：抗コアモノクローナル抗体（ｍａｂ）Ｂ１２．Ｆ８（Ｍ．Ｍｏｎｄｅｌｌｉ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐａｖｉａにより快く提供された）；抗Ｅ２、ｍａｂ １８５．Ｃ７；抗ＮＳ３ ｍａｂ １０Ｅ５／２４；抗ＮＳ５ａ、ウサギポリクローナル抗血清；抗ＮＳ５ｂ ｍａｂ ２０Ｂ６／１３。
【００９３】
免疫化プロトコールおよび免疫応答の分析
６〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６、Ａ２．１およびＣＢ６Ｆ１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、該ウイルスを両方の大腿四頭筋内に注射することにより免疫した。注射の３週間後に免疫応答を分析した。
【００９４】
該ウイルスを大腿四頭筋内に注射することにより、アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ）を免疫した。注射の４、６、８および１２週間（Ｗ）後に免疫応答を分析した。
【００９５】
Ｅ２タンパク質に対する抗体価を、Ｚｕｃｃｈｅｌｌｉ，Ｓ．ら（５５）に記載されているとおりにＥＬＩＳＡにより測定した。細胞性免疫応答を以下に記載のとおりに評価した。ＨＣＶコア、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａおよびＮＳ５ｂタンパク質の全配列を含む１５マーの重複ペプチドのプールを使用して、ＨＣＶ特異的ＩＦＮγ分泌細胞を明らかにした。いくつかの実験においては、ＣＤ８＋エピトープを含有する９マーペプチドを使用して免疫応答を評価した（ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質からのｐｅｐｌ４８０，ＧＡＶＱＮＥＶＴＬ（配列番号２１））。以下のとおりにＩＦＮγ酵素結合イムノスポットアッセイ（ＥＬＩｓｐｏｔ）によりＩＦＮγ分泌細胞を定量した。マルチスクリーン９６ウェル濾過プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を１００μｌの抗マウスＩＦＮγ Ｍａｂ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）でコートし、４℃で一晩インキュベートし、ついで１×ＰＢＳで洗浄し、ウェル当たり２００μｌのＲ１０培地で２時間ブロッキングした。脾細胞を免疫化マウスから調製し、Ｒ１０培地（１０％ ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０Ｕ／ｍｌ ペニシリン、５０μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０μＭ ２−メルカプトエタノールで補足されたＲＰＭＩ １６４０）内に再懸濁させ、ついで、２．５×１０５または５×１０５／ウェルの密度で抗ＩＦＮγ ｍａｂでコートされたマルチスクリーン９６ウェルプレート上でプレーティングした。ついで脾細胞を２００ｎｇ／ウェルのペプチドプールの存在下で２４時間インキュベートした。十分な洗浄（１×ＰＢＳ、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ）の後、ビオチン化ラット抗マウスＩＦＮγ抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を加え、室温で３時間インキュベートした。最後に、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（ＰｈａｒＭｉｇｅｎ）および１−Ｓｔｅｐ ＮＢＴ−ＢＣｌＰ現像液（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）を該ウェルに加えた。ＥＬＩｓｐｏｔリーダー（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を使用してスポットを計数した。
【００９６】
ＩＦＮγ細胞内染色およびＦＡＣＳ分析を以下のとおりに行った。Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイに関して記載されているとおりに調製した脾細胞を、タンパク質輸送を抑制するブレフェルジン（ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ，ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を含有するＲ１０培地内でペプチドプールと共に一晩インキュベートした。ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ ｗ／ｏ ＣａおよびＭｇ、１％ ＦＣＳ、０．０１％ ＮａＮ３）中、飽和量の精製抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２と共に細胞をインキュベートすることにより、細胞ブロッキングを行った。ＦＡＣＳバッファーでの洗浄の後、ＡＰＣ結合抗マウスＣＤ３ｅ、ＰＥ結合抗マウスＣＤ４およびＰｅｒＣＰ結合抗マウスＣＤ８ａ抗体を該細胞に加え、室温で３０分間インキュベートした。ついで、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ Ｐｌｕｓ（ＧｏｌｇｉＰｌｕｇを伴う）キットを使用して、細胞を４℃で２０分間にわたり透過性亢進させた。Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈでの洗浄の後、ＦＩＴＣ結合抗マウスＩＦＮγを加え、該細胞を室温で３０分間インキュベートした。該最終染色工程後、該細胞を洗浄し、１％ ホルムアルデヒド中で固定した。データを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｋｔｏｎ ＆ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して集め、Ｃｅｌｌ−Ｑｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。すべての抗体および二次試薬はＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。
【００９７】
Ａｃｃｕｓｐｉｎ Ｉｓｔｏｐａｑｕｅチューブ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ Ａ０５６１）を該製造業者の説明に従い使用して、サルＰＢＭＣをＥＤＴＡ処理末梢血から単離した。簡潔に説明すると、血液を、等容量のＨＢＳＳ（ハンクス平衡溶液Ｇｉｂｃｏ ｃａｔ １４１７５−０５３）を含有するＡｃｃｕｓｐｉｎチューブ内に移し、８００ｇ、室温で１５分間遠心分離した。ＰＢＭＣバンドを集め、ＨＢＳＳで１回、Ｒ１０で１回洗浄し、最後にＲ１０に再懸濁させた。各ウェル内でプレーティングする細胞の量が異なる以外は前記のとおりに（２×１０５および４×１０５／ウェル）、ｇ−ＩＦＮ−Ｅｌｉｓｐｏｔを行った。
【００９８】
ワクシニアウイルスチャレンジ
免疫化マウスに５×１０６ｐｆｕのＶＶ−ＮＳをｉ．ｐ．注射した。５日後に摘出した個々のマウスからの対（ペア）になった卵巣を均質化し、３回、凍結−解凍し、Ｈｕｌ４３ＴＫ−細胞の単層上で１０倍希釈物をプレーティングすることにより力価測定した。４８時間後、０．５％ クリスタルバイオレットでの染色により力価を読取った。
【００９９】
実施例
本発明の種々の特徴を更に例示するために、以下に実施例を記載する。該実施例は、特許請求されている発明の実施のための有用な方法をも例示するものである。該実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【０１００】
Ｔｅｔ−Ｓ／ｒｔＴＡ２を共発現する細胞系の開発
２９３ＥＢＮＡ細胞系におけるｐＩＲＥＳｔＴＳ／ｒｔＴＡｐｕｒｏ形質移入およびそれに続くピューロマイシン選択（「材料および方法」を参照されたい）により得た安定なクローンを、Ｔｅｔ誘導性ルシフェラーゼ発現カセットを含有する第１世代Ａｄベクター（Ａｄ Ｔｅｔ−ｌｕｃ）を使用することによりスクリーニングした。ピューロマイシン耐性クローンを２４ウェルプレート内に三重に播き、１０のｍｏｉで細胞にＡｄ Ｔｅｔ−ｌｕｃを感染させ、該細胞をドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）の存在下／非存在下で維持した。感染の２４時間後、該粗細胞溶解物においてルシフェラーゼの発現を測定した。２０倍を超えるルシフェラーゼ活性の誘導を示すクローンを選択し、増殖させた。図２に示すとおり、選択されたすべてのクローンにおいて、Ｔｅｔサイレンサーの共発現はルシフェラーゼの基底レベルを減少させた。ドキシサイクリンの存在下で基底発現に対して２５倍の減少を示し最良の誘導比（１００倍超）を伴うクローン１．１（２９３ＥＢＮＡＴｅｔと称される）を選択し、増殖させた。
【実施例２】
【０１０１】
Ｅ２／Ｅ４ ｏｒｆ６アデノウイルスアンプリコン（ｐＥ２）の構築
すべての初期遺伝子が欠失したＡｄベクターを機能的に相補するために、以下の要素を含有する、Ａｄ５に基づくアンプリコンを構築した：ｉ）ＥＢＮＡ−１タンパク質を発現する分裂細胞の核における安定な維持のためのＥＢＶの潜在性複製起点（Ｏｒｉ−Ｐ）（４８）；ｉｉ）ｔｋ−ヒグロマイシンＢ選択マーカー；ｉｉｉ）Ａｄに基づく様態でのプラスミド複製を可能にするｐＦＧ１４０（１９）由来のＡｄ５ウイルスＩＴＲ結合部；ｉｖ）二方向性テトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下の２つの分岐転写単位において配置されたＡｄ５ Ｅ２（ポリメラーゼ、プレ末端タンパク質およびＤＮＡ結合タンパク質）およびＥ４−ｏｒｆ６遺伝子。Ｅ２およびＥ４ ｏｒｆ６遠位プロモーター（１７）に対するＯｒｉＰのエンハンサー効果を減少させるために、ＯｒｉＰ要素に隣接する２つのニワトリβグロビンＨＳ４絶縁体（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）二量体（９）をも導入した。得られたプラスミド（ｐＥ２）の構造を図１Ｂに示す。
【０１０２】
ｐＥ２で形質移入された２９３ＥＢＮＡＴｅｔ細胞の培地におけるドキシサイクリンの添加の際のＥ２遺伝子発現の誘導をウエスタンブロットにより測定した。図４Ｂ（レーン２、５および８）に示すとおり、エフェクター薬の非存在下では形質移入の４８時間後にタンパク質発現は検出されなかったが、１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンを加えることにより転写を誘導した場合には、すべてのＥ２タンパク質の強力な発現が明らかであった（レーン３、６および９）。形質移入の４および６日後にも同様の結果が得られた（データ非表示）。
【０１０３】
Ａｄ複製に必要なシスおよびトランス作用性要素の両方が前記系内に存在するため、Ｅ２遺伝子発現の誘導が２９３ＥＢＮＡＴｅｔにより形質移入された細胞におけるｐＥ２ ＤＮＡ複製をも誘発するのかどうかを試験した。形質移入の４８時間後、全ＤＮＡ上のサザンブロットによりプラスミド複製を検出した。サンプルを、まず、ＤｐｎＩで消化して投入プラスミドＤＮＡを除去し、ついでＮｏｔＩで消化して、Ａｄ ＩＴＲを介して複製された直鎖状形態と天然環状プラスミド形態とを区別化した（図３）。図３に示すとおりにｐＥ２から誘導されたＤＮＡプローブとブロットとをハイブリド形成させたところ、該ブロットはｐＥ２の環状形態に関する１２．６Ｋｂのプラスミド由来のバンドを示した（図４Ａ、レーン１）。ｐＥ２で形質移入された細胞からの全ＤＮＡを分析したところ、複製されたアンプリコンの予想サイズのバンドは、ドキシサイクリンで細胞を誘導した場合にのみ、視認可能であった（図４Ａ、レーン２および３）。ＩＴＲ結合部が欠失したｐＥ２プラスミド誘導体の形質移入からはＤＮＡ複製の証拠は検出されなかった（データ非表示）。これらのデータは、ｔＴＳ／ｒｔＴＡサイレンシング／活性化系が、該プラスミドが一過性形質移入後に高コピー数で存在する場合であっても、ｐＥ２機能の完全な遮断を可能にするが、初期遺伝子発現のデオキシサイクリン誘導に際してはアデノウイルス特異的に該アンプリコンの効率的な複製を支持しうることを示した。それらは、初期遺伝子が欠失したアデノウイルスベクターのレスキューおよび増殖のための適当な系としての２９３ＥＢＮＡＴｅｔ細胞と組合されたｐＥ２アンプリコンを支持する確固たる証拠を提供した。
【実施例３】
【０１０４】
Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４相補細胞系の作製
Ｅ２遺伝子発現の誘導は、アデノウイルス複製装置の活性化を介して、直鎖状ＤＮＡとしてのｐＥ２の複製をもたらすことが観察された。ｐＥ２を使用して、Ｔｅｔ転写サイレンサー（ｔＴＳ）および逆Ｔｅｔトランスアクチベーター２（ｒｔＴＡ２）を発現する２９３ＥＢＮＡ細胞を形質転換して、２Ｅ２安定細胞系を得た。２Ｅ２細胞は、ドキシサイクリンを培地に加えた場合には、Ａｄ５第１世代（ＦＧ）ベクターに感染した２９３細胞より高いレベルのポリメラーゼ、前駆体末端タンパク質（ｐＴＰ）およびＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）を産生した。Ｅ２およびＥ４ＯＲＦ６遺伝子の発現は、誘導されると、第１世代（ＦＧ）アデノウイルスベクターと比較しうるレベルまでの、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４遺伝子を欠く多欠失Ａｄ５ベクターの増幅を効率的に支持した。
【０１０５】
簡潔に説明すると、ｐＥ２で形質移入された２９３ＥＢＮＡＴｅｔ細胞を、「材料および方法」に記載されているとおりに、ヒグロマイシンＢの存在下で選択した。個々のクローンを増殖させ、Ｅ２遺伝子欠失を含有するＡｄ５ベクターのレスキューおよび増殖を調べることによりスクリーニングした。６ウェルプレート内に播いた細胞をｄｏｘｙ存在下のＡｄ５ΔＥ１−２ベクターでの形質移入に付した。形質移入の７日後、細胞を凍結−解凍により細胞溶解し、５００μｌの細胞溶解物を使用して各対応クローンの新鮮単層に感染させた。継代１におけるＣＰＥの直接観察により陽性クローンの評価を行った。ついで該ベクターを該選択クローンにおいて連続継代し、リアルタイムＰＣＲにより増殖を評価した。２回の連続継代の後、ウイルスゲノムは細胞溶解物１ｍｌ当たり約１×１０１０ ゲノムのプラトー付近に達し、ついでこれを、感染ｍｏｉの上昇にもかかわらず維持された（データ非表示）。サザンブロット分析で染色体外ＤＮＡを評価することにより、未修飾無傷エピソーム要素としてｐＥ２を含有するいくつかのクローンを特定した。
【０１０６】
細胞系の特徴づけ及びΔＥ１，Ｅ２，Ｅ３，Ｅ４ベクターの増幅の後続工程のために、２Ｅ２と称されるクローン１１を選択した。まず、２Ｅ２細胞におけるｐＥ２のコピー数を、染色体外ＤＮＡ上のリアルタイムＰＣＲにより、１６コピー／細胞の平均として決定した（ｎ＝３）。継代にわたる２Ｅ２細胞におけるｐＥ２エピソームプラスミドの安定性を評価するために、１５継代後にＨｉｒｔ法（２２）によりエピソームＤＮＡを抽出し、ついでＢａｍＨＩで消化し、プラスミド全体をプローブとして使用するサザンブロットにより分析した。図５Ａには、元のプラスミドと比較した、細胞系から抽出されたエピソームの制限パターンが示されている。それらのパターンは同一であった。このことは、該エピソームが細胞核内で経時的に安定に維持されること、およびプラスミド構造内の再構成が生じなかったことを示している。エピソームＤＮＡの安定性は、ドキシサイクリンの非存在下で検出可能な発現を伴わない一過性形質移入実験で既に観察されているものに類似した細胞系の１５継代後にウエスタンブロットによりＥ２タンパク質の発現を分析することによっても証明された（図５Ｂ）。Ｅ２タンパク質発現レベルを比較するために、ＦＧウイルスに感染した未誘導２Ｅ２細胞から得た細胞抽出物を含めた。
【実施例４】
【０１０７】
ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋ Ａｄ５バックボーンの構築
該ベクター構築を促進するために、左ＩＴＲおよびパッケージングシグナル（Ａｄ５［ｎｔ］１−４５０）（配列番号１）ならびに発現カセットに隣接するｐＩＸ遺伝子（Ａｄ５［ｎｔ］３５１１−５７９２）（配列番号２）を含むＡｄ５断片を含有するシャトルベクターを構築した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＪ５１８３における相同組換えにより発現カセットをＡｄ５ Ｅ１領域内に組換えた。その新たなベクター系を評価するために、ｐＡｄ５ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋ＥＧＦＰを構築した。ｐＡｄ５ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋ＥＧＦＰベクターをＰａｃＩで線状化して感染性ウイルスＤＮＡをプラスミド配列から遊離させ、２Ｅ２細胞内に形質移入し、それをドキシサイクリンの存在下または非存在下でインキュベートした。２連続継代後に得た結果を図６に示す。ＥＧＦＰ形質導入ウイルス粒子およびＣＰＥは、培地へのドキシサイクリン添加によりＥ２およびｏｒｆ６遺伝子が誘導された場合にのみ生じた。ｏｒｆ３およびｏｒｆ６タンパク質の共発現は、Ｅ４単位が欠失したＡｄベクターの高力価増幅に寄与する（２５）。相補遺伝子誘導の非存在下ではウイルス粒子は生じなかった。ベクター産生のプラトーは、細胞の１００％がＥＧＦＰ陽性である場合に、２連続継代の直後に観察された（図６）。高力価への多欠失ベクターの増殖の支持における該新規細胞系の効率を評価するために、５つの２層細胞ファクトリー（Ｎｕｎｃ Ｉｎｃ．）内に播かれた約５×１０８個の２Ｅ２細胞を感染させることにより、大規模製造を試みた。該ウイルスをＣｓＣｌ勾配の２回通過により精製し、リアルタイムＰＣＲにより定量して、最終的に、約５０００ｖｐ／細胞の生産で２×１０１２ ｖｐ／ｍｌの力価を得た。ＥＧＦＰおよびＨＣＶを発現する多欠失ベクターとＦＧベクターとの間の比較を表１に示す。
【０１０８】
【表１】
【０１０９】
すべての初期遺伝子の欠失を組合せることによりＡｄ５バックボーン内に生じた理論的空間は約１２．４Ｋｂである。該新規ベクター系の大きな容量を利用して、マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）プロモーターに融合した全ＨＣＶポリタンパク質遺伝子用の発現カセットを挿入した。該ＨＣＶポリタンパク質発現カセットは、５’および３’非翻訳領域を除去し、コアＡＴＧの上流に最適コザック配列を挿入し、ＮＳ５Ｂレプリカーゼの触媒ドメインを突然変異させて酵素活性を除去することにより構築された（４４）。トランスジーンの発現効率を増加させるために、ヒトＣＭＶプロモーターを、ＦＧアデノウイルスベクターにおいて４〜３０倍強力であると報告されているマウスＣＭＶプロモーター（１）で置換した。
【０１１０】
Ａｄ５ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋ＨＣＶベクターは２Ｅ２細胞内の形質移入により成功裏にレスキューされた。培地にドキシサイクリンを１μｇ／ｍｌの最終濃度で加えることにより、形質移入の直後にＥ２遺伝子発現を誘導した。２Ｅ２細胞内での連続継代によりＡｄ５ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋ＨＣＶベクターを増幅した。「材料および方法」に記載されているとおりに、粗細胞溶解物内のウイルスゲノム濃度をリアルタイムＰＣＲにより評価した。大規模調製物を得るために、４回の連続増幅継代の後に得た粗溶解物を使用して、２．８×１０９個の２Ｅ２細胞に約１００ゲノム／細胞のｍｏｉで感染させた。感染の４８時間後、完全なＣＰＥが明らかに認められた時点で細胞を回収した。精製ウイルスの最終収量を表１に示す。２９３細胞内で増殖させたＥＧＦＰを発現するΔＥ１Ｅ３ＦＧベクターと異ならない約５０００粒子／細胞の生産を得た。
【０１１１】
ポリメラーゼおよびプレ末端タンパク質の欠失は、これらの２つの遺伝子の一部分のみを含むものであったため、ＡｄベクターとｐＥ２エピソームとの間の相同性の領域は、野生型遺伝子をウイルスゲノム内にレスキューして戻すのに理論的に十分なものである。連続継代に際してのＡｄ５ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋ＨＣＶベクターの構造的完全性を評価するために、および野生型初期遺伝子を含有するウイルスの再構成が２Ｅ２細胞内でのベクター増幅中に生じうるかどうかを試験するために、ＣｓＣｌ精製ベクターのＤＮＡ構造を決定した。５継代後にウイルス粒子から精製したＤＮＡから得たパターンとプレ−アデノプラスミドの放射能標識制限パターンとの比較を図８に示す。
【０１１２】
該野生型遺伝子を含有する断片のサイズを比較するために、ＦＧプラスミドベクターをゲル（レーン１）内に含めた。Ａｄ５ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋ＨＣＶベクターの制限パターンは親プラスミドのものと同一であるようであり、再構成または野生型Ｅ２−Ｅ４遺伝子を含有するベクター種の出現の証拠は認められなかった。
【０１１３】
種々のｍｏｉのベクターを使用する２９３およびＨｅＬａ細胞系のインビトロ感染により、ＨＣＶタンパク質の発現の効率を評価した。ＨＣＶコア、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａおよびＮＳ５Ｂに対する特異的モノクローナル抗体またはポリクローナル抗血清でのウエスタンブロット分析は該感染細胞におけるＨＣＶタンパク質の存在を示したが、このことはＨＣＶポリタンパク質の正しいプロセシングを示している（図９）。未プロセシング産物は検出されなかった。
【０１１４】
２Ｅ２細胞系は、ＦＧベクターに感染した２９３細胞より高いレベルのＥ２ａおよびＥ２ｂを発現することを、データが示していることに注目すべきである。理論により束縛されるものではないが、比較的高いレベルのＥ２ａおよびＥ２ｂの産生が細胞当たりの多欠失ベクター粒子の高収量につながったと考えられる。細胞当たりの多欠失粒子の収量は、ＦＧベクターから得られた収量と一貫して比較しうるものであった。さらに、ＰｏｌおよびｐＴＰ遺伝子がｐＥ２との相同組換えによりベクターバックボーンにおいてレスキューされうる理論的可能性にもかかわらず、Ａｄ５ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋ベクターは連続継代にわたり安定であることが示された。相補タンパク質の発現の、観察された高いレベルは、おそらく、多欠失ベクターに対するＥ２ｂ野生型ウイルスの選択的利点を低下させるであろう。
【実施例５】
【０１１５】
ＡｄΔＥ１−４ｏｒｆ３＋ＨＣＶベクターでの免疫化はマウスにおける強力なＣＭＩ応答を誘導する
ヒトおよびチンパンジーにおいて観察されたＨＣＶ感染の消散は、典型的には、複数のエイトープに対する強力なＴ細胞応答を伴っている（５６，５７）。感染対象において特定されたＨＬＡクラスＩ限定エピトープは、クラスタリングの証拠を伴うことなく、ゲノム全体に広がっている（５８に概説されている）。細胞性免疫応答を惹起するＨＣＶポリタンパク質を発現する多欠失Ａｄベクターの効力をマウス免疫実験において評価した。該ベクターは、感染細胞のウエスタンブロット分析により示されるとおり成熟産物へと正しくプロセシングされるポリタンパク質前駆体全体の合成を導く。また、種々の系統のマウスにおいてマッピングされたＨＣＶ−ＢＫ ＣＤ８＋エピトープを含有するオリゴペプチドを使用して、該免疫化を観察した。ＨＣＶエピトープに特異的なＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞を、コア、Ｅ２およびＮＳタンパク質の配列全体に及ぶ重複１５マーペプチドのプールを使用することにより、ＩＦＮ−γ Ｅｌｉｓｐｏｔおよび細胞内染色（ＩＣＳ）により決定した。
【０１１６】
ＣＢ６Ｆ１およびＨＬＡ Ａ２．１マウス系統を免疫することにより、複数のウイルス決定基に対する強力なＴ細胞免疫応答（全ＣＤ８＋細胞の０．２〜２．２５％）を測定した。免疫化マウスの脾細胞の分析は、低レベルのＣＤ４＋抗原特異的Ｔ細胞を伴うＣＤ８＋偏向免疫応答を示した。この免疫応答特性は、送達された抗原に伴われているというよりもワクチン接種方法に伴われたものである。Ｃａｓｉｍｉｒｏらにより、Ａｄ５ｇａｇワクチンで免疫されたアカゲザルにおいて、低い比のＣＤ４＋／ＣＤ８＋が観察され、ＣＤ８＋表現型の応答細胞の大部分は強力なＣＴＬ活性伴っていた（５９）。これに対して、筋肉内ＤＮＡ注射によるＨＣＶ抗原での遺伝的免疫化は、マウスおよび非ヒト霊長類の両方において、より釣りあったＣＤ４＋／ＣＤ８＋応答をもたらした（Ｎｉｃｏｓｉａ Ａ．未公開の結果）。
【０１１７】
種々の量のベクターにより誘導された細胞性免疫を、漸増量の筋肉内注射Ａｄ５ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋ＨＣＶ（１×１０７〜１×１０１１ ｖｐ／マウス）でＣ５７Ｂｌ６マウスを免疫することにより測定した。免疫化の３週間後、ＮＳ３タンパク質のヘリカーゼドメイン内にマッピングされたＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ（ＧＡＶＱＮＥＶＴＬ（配列番号２１）ａａ １６２９−１６３７ ＨＣＶ １ｂ）に対するＴ細胞応答に関してマウスを試験した。新鮮に単離された脾細胞を９マーペプチドと共に一晩インキュベートし、ついでＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより分析した。
【０１１８】
表２に示すとおり、誘導されたＴ細胞応答の大きさはＡｄ５ΔＥ１−４ＨＣＶの用量に依存し、最初の陽性結果は１×１０８ｖｐ／用量で観察された。この用量のベクターで、５匹中４匹のマウスがＮＳ３に対する免疫応答を引き起こし、特異的Ｔ細胞の度数は１×１０６脾細胞当たり１００〜１８０ ＣＤ８＋細胞であった。
【０１１９】
表２におけるデータは、５匹の免疫化マウスから得た１００万個の脾細胞当たりのＩＦＮγスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数を要約している。Ｃ５７Ｂｌ６マウスにおけるＢＫ ＮＳ３ヘリカーゼドメイン内にマッピングされたＣＤ８＋エピトープを含有する１４８０ノナマー（ＧＡＶＱＮＥＶＴＬ）（配列番号２１）と共に脾細胞をインキュベートした。１匹の動物から得た値および免疫化マウスの各群から計算した相乗平均が該表に示されている。抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の度数は、１０１１ ｖｐ／動物を注射することにより百万個の脾細胞当たり４００〜１０００のＳＦＣの範囲で５６８の相乗平均値まで用量と共に増加した。
【０１２０】
【表２】
【実施例６】
【０１２１】
ヒトＨＬＡ−Ａ２．１を発現するトランスジェニックマウスにおける多特異的ＣＭＩ応答の誘導
防御性ＨＣＶワクチンは、ヒトＭＨＣ対立遺伝子の及びウイルスの遺伝的多様性のため、一般的集団における広範な細胞性免疫応答を誘導する必要がある。Ａｄ５ΔＥ１−４ＨＣＶベクターでのマウスの免疫化は、ＨＣＶポリタンパク質の複数のエピトープに対する強力なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導した。より詳しくは、複数のＨＣＶエピトープに対する細胞性免疫応答を惹起するＡｄ５ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋ＨＣＶベクターの能力を測定した。免疫応答の拘束のため、ＣＢ６Ｆ１およびＨＬＡ Ａ２．１トランスジェニックマウスにおいて、ベクター免疫化により惹起されるＨＣＶ特異的Ｔ細胞応答を測定した。
【０１２２】
５匹／群の動物の大腿四頭筋にＡｄ５ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋ＨＣＶの１×１０１０ウイルス粒子を注射した。注射の３週間後、ワクチンにより誘導された抗ＨＣＶ免疫の強度および質をＩＣＳ法により評価することにより、マウスを分析した。脾細胞からの抗原特異的ＩＦＮγ分泌を、コア（ａａ １−１９０）およびＮＳ３〜ＮＳ５ｂタンパク質の非構造領域（ａａ １０２６−３００９）に及ぶ１０残基重複する１５マーから構成される７個のペプチドプールで刺激した。５匹のマウスのプールに関して脾細胞の分析を行った。
【０１２３】
図１０に示す結果は、Ａｄ５ΔＥ１−Ｅ４−ＨＣＶベクターが、ヒトＨＬＡ−Ａ２．１を発現するトランスジェニックマウスにおいて、強力かつ多特異的なＴ細胞応答を誘導することを示している。より詳しくは、該免疫化は該ペプチドプールのすべてに対するＴ細胞応答を引き起こした。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方の抗原特異的Ｔリンパ球が観察されたが、応答細胞の大部分はＣＤ８＋であった。抗原特異的ＣＤ８＋リンパ球の度数は、該コアに対するＣＤ８＋ Ｔ細胞の２．２％から、ＮＳ５ＢのＣ末端部分に応答するＣＤ８＋ Ｔの０．２％まで、抗原によって様々である。
【実施例７】
【０１２４】
Ａｄ５ΔＥ１−Ｅ４−ＨＣＶ免疫化はＡ２．１マウスにおいてＣＭＩ応答を惹起する
トランスジェニックＡ．２１マウスをＷ＝０およびＷ＝２に、１０１０ｐｐ／マウス／注射の用量のＡｄ５ΔＥ１−Ｅ４ＨＣＶまたは５０μｇ／マウス／注射の用量の対応Ａｄ５シャトルベクター（ｐＳｈＡｄ５ＨＣＶ）で免疫した。１）Ａｄ５ΔＥ１−Ｅ４−ＨＣＶで初回抗原刺激および追加抗原刺激し、ならびに２）ｐＳｈ−Ａｄ５−ＨＣＶで初回抗原刺激しＡｄ５ΔＥ１−Ｅ４−ＨＣＶで追加抗原刺激し、第４週に動物から得た精製脾細胞の免疫応答を、ＨＣＶポリタンパク質全体に及ぶペプチドプールを使用するγＩＦＮ−ＥｌｉｓｐｏｔおよびγＩＦＮ細胞内染色により分析した。
【０１２５】
ＮＳ３ヘリカーゼ領域全体に及ぶペプチド（Ｉ〜ＸＶＩＩＩ）のサブセットを使用する実験において、該応答の特異性を測定した。簡潔に説明すると、Ａｄ５ＤＥ１−Ｅ４ＨＣＶで初回抗原刺激しｐＳｈ−Ａｄ５−ＨＣＶで追加抗原刺激した２匹のマウスから脾細胞を単離した。図１２ＡにおけるＥｌｉｓｐｏｔの結果は、該マウスが、ＮＳ３領域に及ぶペプチドに対して強反応性である広範な免疫応答で応答したことを示している。該データは更に、Ａｄ５ΔＥ１−Ｅ４−ＨＣＶまたはｐＳｈ−Ａｄ５−ＨＣＶのいずれかで免疫されたマウスにおけるＨＣＶ特異的免疫応答の初回抗原刺激および追加抗原刺激の両方にＡｄ５ΔＥ１−Ｅ４−ＨＣＶを使用しうることを証明した。
【０１２６】
陽性閾値を超える応答を惹起するプール間の交差点は、考えられうる刺激性ペプチドを表す（ハイライト表示）（図１２Ｂ）。ついでこれらのペプチドをγＩＦＮ−Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにおいて個々に試験した。図１２Ｃに要約した結果は、ペプチド９５（ＬＡＡＫＬＳＧＬＧＩＮＡＶＡＹ）（ＮＳ３ ａａｌ４０３−１４１７）（配列番号２２）エピトープに対する特異性／反応性を示している。したがって、これらのマウスにおいて惹起された免疫応答は、ＨＣＶ患者において既に特定されているＮＳ３ヘリカーゼ領域におけるＣＤ８＋エピトープに対する特異性を含む特異性により特徴づけられる。
【実施例８】
【０１２７】
Ａｄ５ΔＥ１−Ｅ４−ＨＣＶでの免疫化はＶＶ−ＮＳでのチャレンジに対する防御をもたらす
この実験は、惹起された免疫応答が、ＨＣＶ非構造タンパク質を発現する組換えワクシニアウイルスでのチャレンジに対する防御をもたらしうることを証明している。Ａｄ５ΔＥ１−Ｅ４ＨＣＶでの免疫化により惹起された免疫応答が後続のウイルスチャレンジに対する防御をもたらすのかどうかを判定するために、実施例７に記載のプロトコールに従い免疫したマウスを第４週に、ＨＣＶ非構造領域（ＶＶ−ＮＳ）を発現する組換えワクチンウイルス（５×１０６ ｐｆｕの用量）でチャレンジした。実験対照として、Ｗ＝０およびＷ＝２にＡｄ５ΔＥ１−Ｅ４ＥＧＦＰの２回の注射で免疫したマウスを使用した。５日後、対（ペア）になった卵巣を摘出し、ＶＶを力価測定した。図１３に示す結果は、対照マウスと比較した場合の免疫化マウスのＶＶ力価における有意な減少を示している。灰色のドットは相乗平均力価（Ｎ＝５）を表す。＊ ＝ 対照に対するｐ＜０．０５（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙランク）。
【実施例９】
【０１２８】
Ａｄ５ΔＥ１−Ｅ４ＨＣＶでの免疫化はアカゲザルにおいてＨＣＶ特異的免疫応答を初回刺激する
アカゲザルの大腿四頭筋に１０１０ｐｐのＡｄ５ΔＥ１−Ｅ４−ＨＣＶを注射した。該免疫化の効力を注射後の種々の時点（Ｗ＝４、Ｗ＝６、Ｗ＝８、Ｗ＝１２）で末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に関するγＩＦＮ−Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより評価した。該注射により惹起された免疫応答は注射の６週間後にピークとなり、複数のＨＣＶエピトープに対するものであった。これらの３頭のサルのうちの１頭は、注射の１２週間後までの、長期にわたる応答を示した。これらのデータは、霊長類動物モデルにおいて免疫応答を惹起するためにＡｄ５ΔＥ１−Ｅ４−ＨＣＶを使用しうることを示している。
【０１２９】
図１４Ａは、Ａｄ５ＤＥ１−Ｅ４−ＨＣＶの１回の投与の後にサル４０６１において惹起された経時的応答を表す。結果は注射の４、６、８および１２週間後の１０６ＰＢＭＣ当たりのｇ−ＩＦＮスポット形成細胞数（ＳＦＣ）として表されている。各棒グラフは、別々のペプチドプールに対する応答を表す。
【０１３０】
図１４Ｂは、γＩＦＮ−Ｅｌｉｓｐｏｔ６アッセイにおいて評価された、Ａｄ５ＤＥ１−Ｅ４−ＨＣＶの注射の６週間後の３頭のサル（番号４０６１、９００３、７０２３）の免疫応答を示す。結果は、１０６ＰＢＭＣ当たりのｇ−ＩＦＮスポット形成細胞数（ＳＦＣ）として表されている。各棒グラフは、別々のペプチドプールに対する応答を表す。
【０１３１】
本発明は、特定の実施形態とみなされるものに関して説明されているが、本発明はそのような実施形態には限定されないと理解されるべきである。逆に、本発明は、添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれる種々の修飾および均等物を含むと意図される。
【０１３２】
本開示の全体にわたって引用されているすべての参考文献を、参照により明示的に本明細書に組み入れることとする。
【０１３３】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１Ａ】安定な２９３ＥＢＮＡＴｅｔクローンを得るために使用したプラスミドの概要図を示し、プラスミド成分の直線的表示を示す。
【図１Ｂ】安定な２９３ＥＢＮＡＴｅｔクローンを得るために使用したプラスミドの概要図をし、ｐＥ２プラスミドの概要図を示す。
【図２】図２はＡｄＴｅｔＬｕｃ感染クローンにおけるルシフェラーゼ発現のグラフ表示を示す。
【図３】図３は環状および直線形態のｐＥ２の概要図を示す。ｐＥ２の環状形態と直線形態との識別を可能にするＮｏｔＩ消化により得たＤＮＡ断片も示されている。
【図４Ａ】ドキシサイクリンによるＡｄ５ Ｅ２遺伝子発現の活性化の際のｐＥ２の複製を示すサザンブロット分析を示す。
【図４Ｂ】Ｅ２タンパク質のｔｅｔ誘導性発現を示すウエスタンブロット分析を示す。
【図５Ａ】２Ｅ２クローンから抽出されたｐＥ２の構造およびＥ２タンパク質の発現を示し、クローン２９３ＥＢＮＡＴｅｔおよび２Ｅ２から抽出されたｐＥ２の構造を示すサザンブロット分析である。
【図５Ｂ】Ａｄ５ΔＥ１ベクターに感染した細胞におけるＥ２発現と比較した場合の２Ｅ２安定細胞系におけるＥ２タンパク質のｔｅｔ誘導性発現を示すウエスタンブロット分析である。
【図６】図６は、ＥＧＦＰを発現するＡｄ ΔＥ１−４ベクターをレスキューし増殖させるための２Ｅ２細胞の使用を示す一連の写真を示す。
【図７Ａ】Ａｄ５ウイルスの概要地図である。この図にはすべての欠失領域が示されている。
【図７Ｂ】多欠失ベクターのＥ１領域内に導入されたＨＣＶ（ＢＫ株）ポリタンパク質発現カセットの概要図を示す。
【図８】図８はＡｄ ΔＥ１−４ｏｒｆ３＋ＨＣＶの制限分析を示す。
【図９】図９は、Ａｄ５ΔＥ１−４ＨＣＶ感染細胞におけるＨＣＶタンパク質の発現を示すウエスタンブロット分析を示す。
【図１０Ａ】マウスにおけるＡｄ５ΔＥ１−４ＨＣＶウイルス免疫化に対するインビボＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を特徴づけるＦＡＣＳデータのグラフ表示を示す。
【図１０Ｂ】マウスにおけるＡｄ５ΔＥ１−４ＨＣＶウイルス免疫化に対するインビボＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を特徴づけるＦＡＣＳデータのグラフ表示を示す。
【図１１Ａ】図１１は、本開示に記載されているポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列（すなわち、配列番号１〜２１）を示す。
【図１１Ｂ】図１１は、本開示に記載されているポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列（すなわち、配列番号１〜２１）を示す。
【図１１Ｃ】図１１は、本開示に記載されているポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列（すなわち、配列番号１〜２１）を示す。
【図１１Ｄ】図１１は、本開示に記載されているポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列（すなわち、配列番号１〜２１）を示す。
【図１１Ｅ】図１１は、本開示に記載されているポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列（すなわち、配列番号１〜２１）を示す。
【図１１Ｆ】図１１は、本開示に記載されているポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列（すなわち、配列番号１〜２１）を示す。
【図１１Ｇ】図１１は、本開示に記載されているポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列（すなわち、配列番号１〜２１）を示す。
【図１１Ｈ】図１１は、本開示に記載されているポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列（すなわち、配列番号１〜２１）を示す。
【図１２Ａ】ＮＳ３ヘリカーゼ内のエピトープのマッピングに用いた方法を示す。Ａｄ５ΔＥ１−Ｅ４ＨＣＶで初回抗原刺激されｐＳｈ−Ａｄ５−ＨＣＶで追加抗原刺激された２匹のマウス（マウス４，黒塗り棒線、マウス５，付点棒線）から精製した脾細胞を、全ＮＳ３ヘリカーゼ領域に及ぶペプチド（Ｉ〜ＸＶＩＩＩ）の二次元サブセット上でγ−ＩＦＮ−Ｅｌｉｓｐｏｔにおいて試験した。
【図１２Ｂ】ＮＳ３ヘリカーゼ内のエピトープのマッピングに用いた方法を示す。図１２Ｂに示されているデータは、免疫応答を特徴づけするために使用したパネルＡにおいて特定された陽性閾値を超える応答を惹起したペプチドプール間の交差点を要約したものである。
【図１２Ｃ】ＮＳ３ヘリカーゼ内のエピトープのマッピングに用いた方法を示す。パネル１２Ｃは、該応答をもたらすＮＳ３エピトープを特定するために行ったγ−ＩＦＮ−Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイの結果を要約したものである。
【図１３】図１３は、ＶＶ−ＮＳチャレンジに対する防御の誘導における免疫化の効力を示す。灰色のドットは相乗平均力価（Ｎ＝５）を表す。アステリスクは対照に対するｐ＜０．０５を示す（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙランク）。
【図１４Ａ】Ａｄ５ΔＥ１−Ｅ４ＨＣＶ免疫化に応答してアカゲザルにおいて惹起された免疫応答を要約したものであり、Ａｄ５ΔＥ１−Ｅ４ＨＣＶの１回の投与に際してサル４０６１において惹起されγ−ＩＦＮ−Ｅｌｉｓｐｏｔにより分析された経時的免疫応答を表す。
【図１４Ｂ】Ａｄ５ΔＥ１−Ｅ４ＨＣＶ免疫化に応答してアカゲザルにおいて惹起された免疫応答を要約したものであり、Ａｄ５ΔＥ１−Ｅ４ＨＣＶの１回の投与により３頭の個々のサルにおいて誘導され注射の６週間後にγ−ＩＦＮ−Ｅｌｉｓｐｏｔにより分析された免疫応答を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．ＥＢＶ由来複製起点（Ｏｒｉ−Ｐ）、
ｂ．Ａｄ５（ＩＴＲ結合部）、
ｃ．Ａｄ５由来ポリメラーゼおよびプレ末端タンパク質をコードする核酸配列よりなる第１転写単位、
ｄ．Ａｄ５ Ｅ４ ＯＲＦ６およびＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸配列よりなる第２転写単位、ならびに
ｅ．選択マーカー
を含んでなり、第１転写単位および第２転写単位が二方向性テトラサイクリン依存性プロモーターに融合している、アデノウイルスアンプリコン。
【請求項２】
該アンプリコンがｐＥ２のヌクレオチド配列を含む、請求項１記載のアデノウイルスアンプリコン。
【請求項３】
プラスミドＬＭＢＰ４９７２のヌクレオチド配列よりなるエピソームプラスミド。
【請求項４】
プロモーターに融合したトランスジーンをコードする発現カセットを更に含む、請求項１記載のアデノウイルスアンプリコン。
【請求項５】
ａ．ＥＢＶ由来ＥＢＮＡ１タンパク質、
ｂ．Ｔｅｔ転写サイレンサー、
ｃ．Ｔｅｔ逆トランスアクチベーター、
ｄ．アデノウイルスアンプリコン［該アデノウイルスアンプリコンは、第２転写単位（第２転写単位はＥＢＶ由来ＯｒｉＰ、アデノウイルスＩＴＲ結合部ならびにＡｄ５ Ｅ４ ＯＲＦ６およびＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸配列よりなる。）と組合された第１転写単位（第１転写単位はＡｄ５由来ポリメラーゼおよびプレ末端タンパク質をコードする核酸配列よりなる。）よりなり、第１転写単位および第２転写単位は二方向性テトラサイクリン依存性プロモーターに融合している。］、および
ｅ．選択マーカー
を発現するアデノウイルスプロデューサー細胞。
【請求項６】
該細胞が、ＥＢＮＡ１タンパク質を発現する霊長類由来細胞系である、請求項５記載のプロデューサー細胞。
【請求項７】
該細胞が２９３ＥＢＮＡである、請求項６記載のプロデューサー細胞系。
【請求項８】
Ｔｅｔ転写サイレンサーがｔＴＳｋｉｄである、請求項５記載のプロデューサー細胞。
【請求項９】
Ｔｅｔ逆トランスアクチベーターがｒｔＴＡ２である、請求項８記載のプロデューサー細胞系。
【請求項１０】
２Ｅ２（ｐＥ２で形質転換された２９３ＥＢＮＡ細胞）プロデューサー細胞。
【請求項１１】
ａ．プロデューサー細胞内に多欠失アデノウイルス発現ベクターを導入すること｛該プロデューサー細胞は、
ｉ．ＥＢＶ由来ＥＢＮＡタンパク質、
ｉｉ．Ｔｅｔ転写サイレンサー、
ｉｉｉ．Ｔｅｔ逆トランスアクチベーター、
ｉｖ．アデノウイルスアンプリコン［該アデノウイルスアンプリコンは、第２転写単位（第２転写単位はＥＢＶ由来ｏｒｉ−Ｐ、アデノウイルスＩＴＲ結合部ならびにＡｄ５ Ｅ４ ＯＲＦ６およびＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸配列よりなる。）と組合された第１転写単位（第１転写単位はＡｄ Ｅ２由来ポリメラーゼおよびプレ末端タンパク質をコードする核酸配列よりなる。）よりなり、第１転写単位および第２転写単位は二方向性テトラサイクリン依存性プロモーターに融合している。］、
を発現する。｝、
ｂ．Ｅ２およびＥ４ＯＲＦ６コード配列の発現を誘導すること、および
ｃ．産生された複製欠損アデノウイルスを回収すること
を含んでなる、関心のある遺伝子を含む複製欠損アデノウイルスの製造方法。
【請求項１２】
該プロデューサー細胞系が、アデノウイルスＥ１タンパク質、ＥＢＮＡ１および転写調節系を発現するヒト細胞系である、請求項１１記載の製造方法。
【請求項１３】
該プロデューサー細胞が、ｔＴｓｋｉｄとｒＥＴＡ２とを発現する２９３ＥＢＮＡ細胞である、請求項１２記載の製造方法。
【請求項１４】
多欠失アデノウイルスベクターがアデノウイルスＥ１、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４遺伝子を欠く、請求項１３記載の製造方法。
【請求項１５】
多欠失アデノウイルスベクターがヒトＡｄ５バックボーンよりなる、請求項１４記載の製造方法。
【請求項１６】
Ｅ２およびＥ４ＯＲＦ６コード配列の発現が、該プロデューサー細胞をドキシサイクリンと接触させることにより誘導される、請求項１１記載の製造方法。
【請求項１７】
ＥＢＮＡ１、Ｔｅｔ転写サイレンサーおよびＴｅｔ逆トランスアクチベーターを発現する哺乳類細胞内に請求項４記載のアデノウイルスアンプリコンを導入し、Ｅ２およびＥ４ＯＲＦ６コード配列の発現を誘導し、産生された複製欠損アデノウイルスを回収することを含んでなる、複製欠損アデノウイルス粒子の製造方法。
【請求項１８】
該プロデューサー細胞が、ｔＴＳｋｉｄとｒｔＴＡ２とを発現する２９３ＥＢＮＡ細胞である、請求項１７記載の製造方法。
【請求項１９】
Ｅ２およびＥ４ＯＲＦ６コード配列の発現が、該パッケージング細胞をドキシサイクリンと接触させることにより誘導される、請求項１７記載の製造方法。
【請求項２０】
請求項１７記載の製造方法により回収され精製された組換え複製欠損アデノウイルス粒子。
【請求項１】
ａ．ＥＢＶ由来複製起点（Ｏｒｉ−Ｐ）、
ｂ．Ａｄ５（ＩＴＲ結合部）、
ｃ．Ａｄ５由来ポリメラーゼおよびプレ末端タンパク質をコードする核酸配列よりなる第１転写単位、
ｄ．Ａｄ５ Ｅ４ ＯＲＦ６およびＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸配列よりなる第２転写単位、ならびに
ｅ．選択マーカー
を含んでなり、第１転写単位および第２転写単位が二方向性テトラサイクリン依存性プロモーターに融合している、アデノウイルスアンプリコン。
【請求項２】
該アンプリコンがｐＥ２のヌクレオチド配列を含む、請求項１記載のアデノウイルスアンプリコン。
【請求項３】
プラスミドＬＭＢＰ４９７２のヌクレオチド配列よりなるエピソームプラスミド。
【請求項４】
プロモーターに融合したトランスジーンをコードする発現カセットを更に含む、請求項１記載のアデノウイルスアンプリコン。
【請求項５】
ａ．ＥＢＶ由来ＥＢＮＡ１タンパク質、
ｂ．Ｔｅｔ転写サイレンサー、
ｃ．Ｔｅｔ逆トランスアクチベーター、
ｄ．アデノウイルスアンプリコン［該アデノウイルスアンプリコンは、第２転写単位（第２転写単位はＥＢＶ由来ＯｒｉＰ、アデノウイルスＩＴＲ結合部ならびにＡｄ５ Ｅ４ ＯＲＦ６およびＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸配列よりなる。）と組合された第１転写単位（第１転写単位はＡｄ５由来ポリメラーゼおよびプレ末端タンパク質をコードする核酸配列よりなる。）よりなり、第１転写単位および第２転写単位は二方向性テトラサイクリン依存性プロモーターに融合している。］、および
ｅ．選択マーカー
を発現するアデノウイルスプロデューサー細胞。
【請求項６】
該細胞が、ＥＢＮＡ１タンパク質を発現する霊長類由来細胞系である、請求項５記載のプロデューサー細胞。
【請求項７】
該細胞が２９３ＥＢＮＡである、請求項６記載のプロデューサー細胞系。
【請求項８】
Ｔｅｔ転写サイレンサーがｔＴＳｋｉｄである、請求項５記載のプロデューサー細胞。
【請求項９】
Ｔｅｔ逆トランスアクチベーターがｒｔＴＡ２である、請求項８記載のプロデューサー細胞系。
【請求項１０】
２Ｅ２（ｐＥ２で形質転換された２９３ＥＢＮＡ細胞）プロデューサー細胞。
【請求項１１】
ａ．プロデューサー細胞内に多欠失アデノウイルス発現ベクターを導入すること｛該プロデューサー細胞は、
ｉ．ＥＢＶ由来ＥＢＮＡタンパク質、
ｉｉ．Ｔｅｔ転写サイレンサー、
ｉｉｉ．Ｔｅｔ逆トランスアクチベーター、
ｉｖ．アデノウイルスアンプリコン［該アデノウイルスアンプリコンは、第２転写単位（第２転写単位はＥＢＶ由来ｏｒｉ−Ｐ、アデノウイルスＩＴＲ結合部ならびにＡｄ５ Ｅ４ ＯＲＦ６およびＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸配列よりなる。）と組合された第１転写単位（第１転写単位はＡｄ Ｅ２由来ポリメラーゼおよびプレ末端タンパク質をコードする核酸配列よりなる。）よりなり、第１転写単位および第２転写単位は二方向性テトラサイクリン依存性プロモーターに融合している。］、
を発現する。｝、
ｂ．Ｅ２およびＥ４ＯＲＦ６コード配列の発現を誘導すること、および
ｃ．産生された複製欠損アデノウイルスを回収すること
を含んでなる、関心のある遺伝子を含む複製欠損アデノウイルスの製造方法。
【請求項１２】
該プロデューサー細胞系が、アデノウイルスＥ１タンパク質、ＥＢＮＡ１および転写調節系を発現するヒト細胞系である、請求項１１記載の製造方法。
【請求項１３】
該プロデューサー細胞が、ｔＴｓｋｉｄとｒＥＴＡ２とを発現する２９３ＥＢＮＡ細胞である、請求項１２記載の製造方法。
【請求項１４】
多欠失アデノウイルスベクターがアデノウイルスＥ１、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４遺伝子を欠く、請求項１３記載の製造方法。
【請求項１５】
多欠失アデノウイルスベクターがヒトＡｄ５バックボーンよりなる、請求項１４記載の製造方法。
【請求項１６】
Ｅ２およびＥ４ＯＲＦ６コード配列の発現が、該プロデューサー細胞をドキシサイクリンと接触させることにより誘導される、請求項１１記載の製造方法。
【請求項１７】
ＥＢＮＡ１、Ｔｅｔ転写サイレンサーおよびＴｅｔ逆トランスアクチベーターを発現する哺乳類細胞内に請求項４記載のアデノウイルスアンプリコンを導入し、Ｅ２およびＥ４ＯＲＦ６コード配列の発現を誘導し、産生された複製欠損アデノウイルスを回収することを含んでなる、複製欠損アデノウイルス粒子の製造方法。
【請求項１８】
該プロデューサー細胞が、ｔＴＳｋｉｄとｒｔＴＡ２とを発現する２９３ＥＢＮＡ細胞である、請求項１７記載の製造方法。
【請求項１９】
Ｅ２およびＥ４ＯＲＦ６コード配列の発現が、該パッケージング細胞をドキシサイクリンと接触させることにより誘導される、請求項１７記載の製造方法。
【請求項２０】
請求項１７記載の製造方法により回収され精製された組換え複製欠損アデノウイルス粒子。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１１Ｅ】
【図１１Ｆ】
【図１１Ｇ】
【図１１Ｈ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１１Ｅ】
【図１１Ｆ】
【図１１Ｇ】
【図１１Ｈ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【公表番号】特表２００８−５１８５９１（Ｐ２００８−５１８５９１Ａ）
【公表日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３８３４９（Ｐ２００７−５３８３４９）
【出願日】平成１７年１０月２７日（２００５．１０．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１１６２９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４８２１５
【国際公開日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【出願人】（５０１２０９４２７）イステイチユート・デイ・リチエルケ・デイ・ビオロジア・モレコラーレ・ピ・アンジエレツテイ・エツセ・ピー・アー (90)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月２７日（２００５．１０．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１１６２９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４８２１５
【国際公開日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【出願人】（５０１２０９４２７）イステイチユート・デイ・リチエルケ・デイ・ビオロジア・モレコラーレ・ピ・アンジエレツテイ・エツセ・ピー・アー (90)
【Ｆターム（参考）】
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