複製欠損アデノウイルスＴＮＦベクター
【課題】構築と使用においてより大きな柔軟性を有し、かつ腫瘍又は癌の治療におけるより大きな効果を期待できる複製欠損ＴＮＦアデノウイルスベクターを提供する。
【解決手段】（ａ）アデノウイルスゲノムのＥ４領域１２において欠損しているアデノウイルスゲノム、（ｂ）ＴＮＦをコードする核酸配列１５、及び（ｃ）ＴＮＦをコードする核酸配列１５と作動可能に連結している放射線誘導性プロモーター１４、を含むアデノウイルスベクター。また、前記アデノウイルスゲノムにおいて、Ｅ４領域１２中の少なくとも１５塩基対のスペーサーエレメント１８、を含むアデノウイルスベクター。前記アデノウイルスベクターの製造方法、並びに、宿主の腫瘍又は癌の治療方法において、前記アデノウイルスベクターの抗癌又は抗腫瘍有効量を投与することを含む方法。
【解決手段】（ａ）アデノウイルスゲノムのＥ４領域１２において欠損しているアデノウイルスゲノム、（ｂ）ＴＮＦをコードする核酸配列１５、及び（ｃ）ＴＮＦをコードする核酸配列１５と作動可能に連結している放射線誘導性プロモーター１４、を含むアデノウイルスベクター。また、前記アデノウイルスゲノムにおいて、Ｅ４領域１２中の少なくとも１５塩基対のスペーサーエレメント１８、を含むアデノウイルスベクター。前記アデノウイルスベクターの製造方法、並びに、宿主の腫瘍又は癌の治療方法において、前記アデノウイルスベクターの抗癌又は抗腫瘍有効量を投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）をコードする核酸配列を含む複製欠損（replication deficient）アデノウイルスベクター、並びにこのようなベクターの構築及び使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、特に、ＴＮＦ−αは、その抗腫瘍効果及び放射線治療と相乗的に作用する能力について周知である。例えば、ＴＮＦ−α遺伝子を含むある複製欠損アデノウイルスベクターは、動物における腫瘍を治療するために放射線治療と組み合わせて使用されており、ある程度は成功している（例えば、Hallahan ら, Nat. Med., 1, 786-91 (1995)）。しかし、抗癌／抗腫瘍剤としてのＴＮＦの使用は、その重篤な全身的効果によって制限されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
構築と使用においてより大きな柔軟性を有し、かつ腫瘍又は癌の治療におけるより大きな成功を提供しうる複製欠損ＴＮＦアデノウイルスベクターが依然として必要性とされている。本発明は、このようなベクター、並びにこのようなベクターの構築方法、及びこのようなベクターの使用を含む治療方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の簡単な概要
本発明は、（ａ）アデノウイルスゲノムの初期増殖−４（Ｅ４）領域において欠損しているアデノウイルスゲノム、（ｂ）ＴＮＦをコードする核酸配列、及び（ｃ）ＴＮＦをコードする核酸配列と作動可能に連結している放射線誘導性プロモーター、を含むアデノウイルスベクターを提供する。本発明はまた、（ａ）アデノウイルスゲノムのＥ４領域において欠損しているアデノウイルスゲノム、（ｂ）ＴＮＦをコードする核酸配列、及び（ｃ）アデノウイルスゲノムのＥ４領域中の少なくとも１５塩基対のスペーサーエレメント、を含むアデノウイルスベクターを提供する。
【０００５】
アデノウイルスベクターの製造方法はまた、（ａ）アデノウイルスゲノムのＥ４領域において欠損しているアデノウイルスゲノムを提供すること、（ｂ）ＴＮＦをコードする核酸配列をアデノウイルスゲノムに挿入すること、及び（ｃ）ＴＮＦをコードする核酸配列に作動可能に連結するように、放射線誘導性プロモーターをアデノウイルスゲノムに挿入すること、を含む本発明によって提供される。本発明は更に、宿主の腫瘍又は癌の治療方法であって、本発明のアデノウイルスベクターの抗癌又は抗腫瘍有効量をその必要のある宿主に投与することを含む方法を提供する。
本発明は、付属の図面及び以下の好適な実施態様の詳細な説明を参照することにより最も良く理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１Ａは、改変していないアデノウイルスゲノムを含むベクターの模式図である。図１Ｂは、本発明の改変アデノウイルスゲノムと遺伝子エレメントを含むベクターの模式図である。
【図２】本発明のアデノウイルスベクターでの処置を含む、種々の方法で処置された腫瘍についての、時間に対する腫瘍容積のプロットである。
【図３】本発明のアデノウイルスベクターでの処置を含む、種々の方法で処置された腫瘍についての、時間に対する腫瘍容積の第２のプロットである。
【図４】本発明のアデノウイルスベクターでの処置を含む、種々の方法で処置された腫瘍についての、時間に対する腫瘍容積の第３のプロットである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
発明の詳細な説明
本発明は、（ａ）アデノウイルスゲノムのＥ４領域において欠損しているアデノウイルスゲノム、（ｂ）ＴＮＦをコードする核酸配列、及び（ｃ）ＴＮＦをコードする核酸配列と作動可能に連結している放射線誘導性プロモーター、を含むアデノウイルスベクターを提供する。本発明はまた、（ａ）アデノウイルスゲノムのＥ４領域において欠損しているアデノウイルスゲノム、（ｂ）ＴＮＦをコードする核酸配列、及び（ｃ）アデノウイルスゲノムのＥ４領域中の少なくとも１５塩基対のスペーサーエレメント、を含むアデノウイルスベクターを提供する。
【０００８】
アデノウイルスゲノム
任意のサブタイプ、サブタイプの混合物、又はキメラアデノウイルスが、本発明と関連したアデノウイルスベクターの製造のためのウイルスゲノムの源として使用できる。好ましくは、２型（Ａｄ２）又は５型（Ａｄ５）アデノウイルスゲノムなどのヒト血清型アデノウイルスのゲノムが使用される。任意の適切なアデノウイルスゲノムが本発明に関連して使用できるが、Ａｄ５アデノウイルスゲノムが最適であり、本発明は、Ａｄ５血清型に関して本明細書中で更に説明する。
【０００９】
本発明に関連して使用されるアデノウイルスゲノムは望ましくは、複製欠損である。本明細書で使用される場合、遺伝子、遺伝子機能、又は遺伝子若しくはゲノム領域の欠損とは、全体として又は部分的に核酸配列が欠失している遺伝子の機能を損ない又は消失させ、かつウイルスゲノムに対して外来である核酸配列の挿入のためにウイルスゲノムにスペース又は容量を提供するように、ウイルスゲノムの遺伝物質が十分に欠失していることとして定義される。このような欠損は、非補完性細胞宿主中でのアデノウイルスベクターの増殖に必須又は非必須の遺伝子又はゲノム領域に存在しうる。このような増殖に必須のアデノウイルスゲノム領域（例えば、初期領域１（Ｅ１）、初期領域２Ａ（Ｅ２Ａ）、初期領域２Ｂ（Ｅ２Ｂ）、初期領域４（Ｅ４）、後期領域１（Ｌ１）、後期領域２（Ｌ２）、後期領域３（Ｌ３）、後期領域４（Ｌ４）、及び後期領域５（Ｌ５））における欠損は、アデノウイルスゲノムベースのアデノウイルスベクターを複製欠損にする。
【００１０】
本発明のアデノウイルスベクターは望ましくは、多重複製欠損（multiply replication deficient）である。即ち、それは、非補完細胞宿主中でのウイルス増殖（即ち、インビトロでのウイルス複製）に必要な少なくとも２つのゲノム領域において欠損する。このような領域としては、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、又はＬ１〜Ｌ５領域が挙げられる。Ｅ１領域は、初期領域１Ａ（Ｅ１Ａ）及び初期領域１Ｂ（Ｅ１Ｂ）からなるとみなすことができるが、Ｅ１Ａ及び／又はＥ１Ｂ領域のいずれか一方又は両方の欠失は、本発明の文脈において単一の欠損とみなす。更に、このようなベクターは、ウイルス増殖に必要ではない１つ以上の領域において欠損しうる。例えば、ベクターは、初期領域３（Ｅ３）において更に欠損しうる。
【００１１】
本発明のアデノウイルスベクターは望ましくは、Ｅ１とＥ４領域において欠損があり、好ましくは、アデノウイルスベクターからＥ４領域のコード領域全体が欠失したものである。本発明の文脈において、コード領域とは、蛋白質産物をコードするゲノム領域の部分（単数又は複数）（例えば、Ｅ４領域のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ））をいう。即ち、アデノウイルスゲノムのＥ４領域のコード領域全体が欠失したベクターは、その領域の全てのＯＲＦを欠く。本発明のアデノウイルスベクターのＥ４領域は好ましくは、天然Ｅ４プロモーター、ポリアデニル化配列、及び／又は右側の逆末端反復（inverted terminal repeat: ＩＴＲ）を保持する。
【００１２】
本発明のアデノウイルスベクターはまた、ウイルス増殖に必要な１つ以上の更なる領域（特に、ウイルス複製に必要な他の初期領域（例えば、Ｅ２Ａ及び／又はＥ２Ｂ領域））において欠損しうる。より好ましくは、アデノウイルスゲノムのＥ３領域もまた除去される。このように、本発明のアデノウイルスベクターの好適な形状は、（ａ）Ｅ１-Ｅ４-、（ｂ）Ｅ１-Ｅ２Ａ-Ｅ４-、及び（ｃ）Ｅ２Ａ-Ｅ４-アデノウイルスベクターを含み、そのいずれもがまた、Ｅ３-でありうる。
【００１３】
図１Ａは、Ａｄ５ゲノムの模式図を提供する。図１Ｂは、例示的なアデノウイルスベクターの模式図である。この図は、図１Ａで表される改変されていないＡｄ５アデノウイルスゲノムと比較すると、（ｉ）Ｅ１領域（１０）が、放射線誘導性プロモーター（１４）、ＴＮＦをコードする核酸配列（１５）及びポリアデニル化配列（１６）で置換され、（ｉｉ）Ｅ３領域（１１）が欠失し（１７）、及び（ｉｉｉ）Ｅ４領域（１２）のコード領域がスペーサーエレメント（１８）によって置換され、Ｅ１、Ｅ３及びＥ４領域において欠損のあるベクターが作出されていることを示す。
【００１４】
本発明のアデノウイルスベクターがＥ２Ａ領域において欠損する場合、ベクターは好ましくは、Ｅ２Ａ欠損領域においてアデノウイルスゲノムのＥ２Ａ領域の一部（長さで約２３０塩基対未満）を更に含む。一般的に、アデノウイルスのＥ２Ａ領域は、ＤＮＡ複製に必要なポリペプチドであるＤＢＰ（ＤＮＡ結合蛋白質）をコードする。ＤＢＰは、ウイルス血清型に依存して、４７３〜５２９アミノ酸からなる。ＤＢＰは、伸長したＮｔドメインを有する球状Ｃｔからなる偏長の楕円体として存在する非対称蛋白質であると考えられている。研究により、Ｃｔドメインは、ＤＢＰが核酸と結合し、亜鉛と結合し、ＤＮＡ鎖伸張のレベルでＤＮＡ合成において機能する能力を担うということが示されている。しかし、Ｎｔドメインは、転写と転写後レベルの両方で後期遺伝子発現において機能すると考えられ、該蛋白質の効率的な核局在を担い、また、それ自身の発現の増大に関与しうる。アミノ酸２〜３８のＮｔドメインにおける欠失は、この領域がＤＢＰ機能に重要であることを示した（Brough ら, Virology, 196, 269-281 (1993)）。ＤＢＰのＣｔ領域をコードするＥ２Ａ領域における欠失は、ウイルス増殖に対する効果を有しないが、ＤＢＰのＮｔドメインのアミノ酸２〜３８をコードするＥ２Ａ領域における欠失は、ウイルス増殖を損なう。それ故、好ましくは、任意の多重複製欠損アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムのＥ２Ａ領域のこの部分を含む。
【００１５】
特に、例えば、保持されるべきＥ２Ａ領域の所望の部分は、Ｅ２Ａ領域の５’末端で規定されるアデノウイルスゲノムのＥ２Ａ領域のその部分、特に、血清型Ａｄ５のアデノウイルスゲノムのＥ２Ａ領域の位置Ａｄ５（２３８１６）〜Ａｄ５（２４０３２）である。アデノウイルスゲノムのこの部分は望ましくは、アデノウイルスベクターに含まれる。なぜなら、それは、現在のＥ２Ａ細胞株では補われず、その非存在下、ウイルス増殖とファイバー発現の必要なレベルは、補完性細胞株で得ることができないからである。
【００１６】
本発明は、ゲノムの初期領域においてのみ遺伝子機能に欠損のあるアデノウイルスベクターに限定されない。また、ゲノムの初期及び後期領域において欠損しているアデノウイルスベクター、並びに、本質的にゲノム全体が除去されたベクター（その場合、少なくとも、ウイルスＩＴＲ及びプロモーターの幾つか、又はウイルスＩＴＲ及びパッケージングシグナルがインタクトなままであるのが好ましい）も含まれる。除去されるアデノウイルスゲノムの領域が大きい程、ゲノム中に挿入できる外因性核酸配列の断片が大きいことを当業者は理解しよう。例えば、アデノウイルスゲノムが３６ｋｂであるならば、ウイルスＩＴＲ及び幾つかのプロモーターをインタクトのままにすると、アデノウイルスの収容能力は約３５ｋｂである。あるいは、ＩＴＲとパッケージングシグナルのみを含む多重欠損アデノウイルスベクターを製造できよう。次いで、これは、このベクターから３７〜３８ｋｂの外来核酸配列を発現させることを効率的に可能としうるであろう。勿論、欠損アデノウイルス領域のいずれか又は全てにスペーサーエレメントを含めると、スペーサーエレメント配列のサイズに応じて、サイズにおけるアデノウイルスベクターの収容能力が減少するであろう。
【００１７】
ＴＮＦをコードする核酸配列
好ましくは、ベクターは、ＴＮＦをコードする核酸配列を含む（contain）（即ち、含む（comprise））少なくとも１つの発現カセットを含む。ＴＮＦをコードする核酸配列は、ＴＮＦファミリーの蛋白質の任意のメンバーをコードする核酸配列を含む。本発明のアデノウイルスベクターは好ましくは、ＴＮＦ−αをコードする核酸配列を含む。ＴＮＦをコードする核酸配列は、米国特許第4,879,226号に詳細に記載されている。
【００１８】
ＴＮＦをコードする核酸配列は好ましくは、アデノウイルスゲノムのＥ１領域に存在する（例えば、Ｅ１領域を全体的又は部分的に、好ましくは全体的に置換する）。例えば、Ｅ１領域は、ＴＮＦをコードする核酸配列を含むプロモーター可変（promoter variable）発現カセットによって置換されうる。本明細書で使用する「発現カセット」という用語は、アデノウイルスゲノムに挿入されて、外来遺伝子産物を産生しうる任意の核酸配列をいう。例えば、図１Ａ及び１Ｂに示すように、Ｅ１領域（１０）は、放射線誘導性プロモーター（１４）、ＴＮＦをコードする核酸配列（１５）及びポリアデニル化配列（１６）を含む発現カセット（１３）により置換されうる。ＴＮＦをコードする核酸配列を含む発現カセットの他に、ベクターは、他の産物をコードする核酸配列を含む他の発現カセットを含み得る（そのカセットは、アデノウイルスゲノムの任意の欠失領域を置換しうる）。アデノウイルスゲノム（例えば、ゲノムのＥ１領域）中への発現カセットの挿入は、公知の方法によって、例えば、アデノウイルスゲノムの所定の位置に特有の制限部位を導入することによって、容易にされうる。
【００１９】
好ましくは、ＴＮＦをコードする核酸配列は、ＴＮＦをコードする領域の３’に存在するポリアデニル化配列などの転写終結領域を更に含む。合成最適化配列、並びにＢＧＨ（ウシ成長ホルモン）、ポリオーマウイルス、ＴＫ（チミジンキナーゼ）、ＥＢＶ（エプスタイン−バー・ウイルス）、及びヒトパピローマウイルスとＢＰＶ（ウシパピローマウイルス）を含むパピローマウイルスのポリアデニル化配列を含む任意の適切なポリアデニル化配列を使用できる。好適なポリアデニル化配列は、ＳＶ４０（ヒト肉腫ウイルス−４０）ポリアデニル化配列である。
【００２０】
好ましくは、ＴＮＦをコードする核酸配列は、１つ以上のプロモーター及び／又はエンハンサーエレメントに、例えば、プロモーター可変発現カセットの部分として作動可能に連結される（即ち、１つ以上のプロモーター及び／又はエンハンサーエレメントの転写制御下におかれる）。配列を作動可能に一緒に連結するための技術は、当該分野で周知である。任意の適切なプロモーター又はエンハンサー配列が、本発明に関連して使用できる。適切なプロモーター又はエンハンサー配列は一般的には当該分野で公知である。本発明の好適なベクターは、ＴＮＦをコードする核酸配列に作動可能に連結した放射線誘導性プロモーターを含む。放射線誘導性プロモーターの使用は、例えば、アデノウイルスベクターを含む細胞又は宿主への放射線の投与により、外来遺伝子産物の転写に対する制御を提供する。任意の適切な放射線誘導性プロモーターが、本発明に関連して使用できる。適切な放射線誘導性プロモーターは一般的に当該分野で公知である。本発明に関連する使用のための好適な放射線誘導性プロモーターは、初期増殖領域−１（Ｅｇｒ−１）プロモーター、特に、Ｅｇｒ−１プロモーターのＣＡｒＧドメインである。Ｅｇｒ−１プロモーターは、米国特許第5,206,152号及び国際特許出願WO 94/06916に詳細に記載されている。プロモーターは、当該分野で公知の方法によって、例えば、ゲノムの所定領域に特有の制限部位を導入することによって、外来ゲノム中に導入されうる。あるいは、プロモーターは、ＴＮＦをコードする核酸配列を含む発現カセットの部分として挿入されうる。
【００２１】
本発明のアデノウイルスベクターはまた、ＴＮＦをコードする核酸配列の他に、発現されるべき他の核酸配列を含みうる。更なる核酸配列は、ＴＮＦの発現を制御する同じプロモーター／エンハンサー配列の転写制御下にありうるか、又は、他のプロモーター／エンハンサー配列の転写制御下にありうる。本発明により使用できる他の核酸配列としては、他のサイトカイン、アポトーシス因子、細胞増殖抑制剤、及びＴＮＦと共に有利に発現されうる他の分子（例えば、ＴＮＦ存在下で相乗効果を有する分子）をコードする核酸配列が挙げられるが、それらに限定されない。このような他のサイトカイン、アポトーシス因子、細胞増殖抑制剤及びそれらをコードする核酸は当該分野で公知であり、それらとしては、例えば、ｐ５３、Ｆａｓ、Ｆａｓリガンド、デスドメインを有するＦａｓ関連蛋白質（ＦＡＤＤ）、カスパーゼ−３、カスパーゼ−８（ＦＬＩＣＥ）、カスパーゼ−１０、Ａｐｏ２Ｌ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−Ｒ１、ＩκＢ、ΔＩκＢ、デスドメインを有する、レセプター相互作用蛋白質（ＲＩＰ）関連ＩＣＨ−１／ＣＥＤ−３−相同蛋白質（ＲＡＩＤＤ）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＤＲ４、ＤＲ５、Ｎ末端欠失を含むＢｃｌ−２の細胞死誘導コード配列、Ｎ末端欠失を含むＢｃｌ−ｘの細胞死誘導コード配列、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｉｄ、Ｂａｄ、Ｂｉｋ、Ｂｉｆ−２、ｃ−ｍｙｃ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＰＣＫキナーゼ、ＡＫＴキナーゼ、Ａｋｔ／ＰＩ（３）−キナーゼ、PITSLRE、デス関連蛋白質(DAP)キナーゼ、RIP、JNK/SAPK、Daxx、NIK、MEKK1、ASK1、PKR、及びそれらの変異体 (例えば、それらのドミナントネガティブ変異体及びそれらのドミナントポジティブ変異体)、及びそれらのフラグメント（例えば、それらの活性ドメイン）、並びにそれらの組合せが挙げられる。アポトーシス、細胞毒性、及び細胞増殖抑制の転写因子は、本発明と関連して使用でき、それらとしては、例えば、Ｅ２Ｆ転写因子及びその合成細胞周期非依存性形態、ＡＰ１転写因子、ＡＰ２転写因子、ＳＰ転写因子（例えば、ＳＰ１転写因子）、ヘリックス−ループ−ヘリックス転写因子、ＤＰ転写因子（例えば、ＤＰ１、ＤＰ２及びＤＰ３）、及びそれらの変異体 (例えば、それらのドミナントネガティブ変異体及びそれらのドミナントポジティブ変異体)、及びそれらのフラグメント（例えば、それらの活性ドメイン）、並びにそれらの組合せが挙げられる。アポトーシス、細胞毒性、及び細胞増殖抑制のウイルス蛋白質としては、例えば、アデノウイルスＥ１Ａ産物、アデノウイルスＥ４／ＯＲＦ６／７産物、アデノウイルスＥ４／ＯＲＦ４産物、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）産物（例えば、ＣＭＶ−チミジンキナーゼ（ＣＭＶ−ＴＫ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）産物（例えば、ＨＳＶ−ＴＫ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）産物（例えば、ＨＰＶＸ）、及びそれらの変異体 (例えば、それらのドミナントネガティブ変異体及びそれらのドミナントポジティブ変異体)、及びそれらのフラグメント（例えば、それらの活性ドメイン）、並びにそれらの組合せが挙げられる。
【００２２】
スペーサーエレメント
本発明のアデノウイルスベクターは、多重複製欠損の場合、好ましくは、単一複製欠損アデノウイルスベクター、特に、単一複製欠損Ｅ１-アデノウイルスベクターによって達成されるウイルス増殖と同様の補完性細胞株でのウイルス増殖を提供するためにスペーサーエレメントを含む。スペーサーの非存在下、多重複製欠損アデノウイルスベクターのファイバー蛋白質の産生及び／又はウイルス増殖は、単一複製欠損アデノウイルスベクターのそれと比較して減少している。しかし、欠損アデノウイルス領域の少なくとも１つ、好ましくは、図１Ｂ（１８）に示されるＥ４領域にスペーサーを含めると、増殖及びファイバー発現におけるこの欠陥が中和される。
【００２３】
Ｌ５ファイバー領域が保持されている、本発明の好適なＥ４-アデノウイルスベクターにおいて、スペーサーは望ましくは、Ｌ５ファイバー領域と右側ＩＴＲの間に存在する。より好ましくは、このようなアデノウイルスベクターにおいて、Ｅ４ポリアデニル化配列は、単独で又は最も好ましくは別の配列との組合せにおいて、保持されたＬ５ファイバー領域が右側ＩＴＲから十分に分離されるようにＬ５ファイバー領域と右側ＩＴＲの間に存在し、その結果、このようなベクターのウイルス産生が、単一複製欠損アデノウイルスベクター、特に、単一複製欠損Ｅ１-アデノウイルスベクターのウイルス産生に近づく。アデノウイルスベクターにおけるスペーサーの使用は、米国特許第5,851,806号に記載されている。
【００２４】
ゲノムの複製欠損領域の機能は、補完性細胞株によって提供されうるので、スペーサーエレメントは欠損機能を提供する必要はなく、任意の配列でありうる。即ち、スペーサーエレメントは、ベクターが収容するインサートのサイズのみによって限定される。スペーサーエレメントは、任意の適切なサイズ、望ましくは、少なくとも約１５塩基対（例えば、約１５〜約１２，０００塩基対）、好ましくは、約１００〜約１０，０００塩基対、より好ましくは、約５００〜約８，０００塩基対、より一層好ましくは、約１，５００〜約６，０００塩基対、最も好ましくは、約２，０００〜約３，０００塩基対でありうる。
【００２５】
スペーサーエレメントは、所望の長さの任意の配列（単数又は複数）を含みうる。スペーサーエレメント配列は、コード又は非コードでありえ、また、アデノウイルスゲノムに関し天然又は非天然でありえるが、欠損領域に複製機能を回復させない。スペーサーエレメントはまた、プロモーター可変発現カセットを含みうる。より好ましくは、スペーサーエレメントは、更なるポリアデニル化配列及び／又は外来遺伝子を含む。好ましくは、Ｅ４を欠損する領域中に挿入されるスペーサーエレメントの場合、Ｅ４ポリアデニル化配列及びアデノウイルスゲノムのＥ４プロモーター又は任意の他の（細胞若しくはウイルス）プロモーターは、ベクター中にとどまる。このような実施態様において、スペーサーエレメントは、Ｅ４ポリアデニル化部位とＥ４プロモーターとの間に存在するか、あるいはＥ４プロモーターがベクターに存在しなければ、スペーサーエレメントは右側ＩＴＲに近位である。
【００２６】
スペーサーエレメントは、任意の適切なポリアデニル化配列を含みうる。適切なポリアデニル化配列の例としては、合成最適化配列、並びにＢＧＨ（ウシ成長ホルモン）、ポリオーマウイルス、ＴＫ（チミジンキナーゼ）、ＥＢＶ（エプスタイン−バー・ウイルス）、及びヒトパピローマウイルスとＢＰＶ（ウシパピローマウイルス）を含むパピローマウイルスのポリアデニル化配列が挙げられる。好ましくは、特に、Ｅ４欠損領域において、スペーサーエレメントは、ＳＶ４０（ヒト肉腫ウイルス−４０）ポリアデニル化配列を含む。ＳＶ４０ポリアデニル化配列は、多重複製欠損アデノウイルスベクターのより高いウイルス産生レベルを可能とする。
【００２７】
外来遺伝子（例えば、コード領域）はまた、アデノウイルスゲノムのＥ４欠損領域におけるスペーサーエレメントとして機能しうる。外来遺伝子は、ベクターが収容できるフラグメントのサイズによってのみ限定され、任意の適切な遺伝子でありうる。適切な外来遺伝子の例としては、ｐＧＵＳ、分泌性アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、Ｂ−ガラクトシダーゼ、及びヒト抗−トリプシンなどのマーカー遺伝子配列；治療遺伝子；Ｂ３−１９Ｋ、Ｅ３−１４．７、ＩＣＰ４７、ｆａｓリガンド遺伝子、及びＣＴＬＡ４遺伝子などの可能性ある免疫調節因子；生物不活性配列（例えば、産物を産生するようには転写されないであろう配列、又は欠陥のある若しくは生物学的に不活性な産物をコードする配列）、並びにグルクロニダーゼ遺伝子などの他の無害の配列が挙げられる。トランス活性化因子をコードする遺伝子も、Ｅ４領域におけるスペーサーエレメントとして使用できる。好ましくは、トランス作用因子をコードする遺伝子は、アデノウイルス由来ではない。アデノウイルス由来ではないトランス作用因子の例としては、pTP、HSV ICP0、CMV UL84、VZV-ORF61、PRV-EP0、CMV-IE1、CMV-IE2、CMV-IE86、HIV-tat、HTLV-tax、HBV-X、AAV-Rep 78、HSV ICP0のように機能する U20S骨肉腫細胞株由来の細胞性因子、並びに神経成長因子によって誘導されるPC12 細胞における細胞性因子が挙げられる。アデノウイルス由来ではない好適なトランス作用因子は、HSV ICP0である。トランス作用因子をコードする遺伝子としては好ましくは、アデノウイルスＥ４プロモーターが挙げられる。
【００２８】
ベクター構築
本発明は、（ａ）アデノウイルスゲノムのＥ４領域において欠損しているアデノウイルスゲノムを提供すること、（ｂ）ＴＮＦをコードする核酸配列をアデノウイルスゲノムに挿入すること、及び（ｃ）ＴＮＦをコードする核酸配列に作動可能に連結されるように、放射線誘導性プロモーターをアデノウイルスゲノムに挿入すること、を含むアデノウイルスベクターの製造方法を提供する。本発明はまた、（ａ）アデノウイルスゲノムのＥ４領域において欠損しているアデノウイルスゲノムを提供すること、（ｂ）ＴＮＦをコードする核酸配列をアデノウイルスゲノムに挿入すること、及び（ｃ）アデノウイルスゲノムのＥ４領域にスペーサーエレメントを挿入すること、を含むアデノウイルスベクターの製造方法を提供する。当業者が理解するように、本発明によって提供される方法は、アデノウイルスベクターを提供するために使用されるアデノウイルスゲノム中への他の核酸配列の挿入、又は該アデノウイルスゲノムからのこのような配列の欠失などの他の工程又は構成要素を含みうる。更に、本発明の方法の種々の局面（例えば、アデノウイルスゲノム、ＴＮＦをコードする核酸配列、放射線誘導性プロモーター、スペーサーエレメントなど）は、本発明のアデノウイルスベクターに関し本明細書で上記したとおりである。
【００２９】
アデノウイルスベクターの本発明の製造方法は、当業者に公知の技術を用いて行うことができる。一般的に、ウイルスベクター構築は、細胞内のアデノウイルス核酸配列間の高レベルの組換えに依存する。配列間で類似性を有する（又は重複する）領域を含み、かつゲノムの完全長を構成する２又は３の別々のアデノウイルス核酸配列（例えば、ＤＮＡフラグメント）を細胞にトランスフェクトする。宿主細胞の組換えマシーナリーは、上記配列の組換えを行なうことによって、完全長ウイルスベクターゲノムを構築する。種々の単一領域中に改変を含むウイルスの構築のための他の適切な方法は、以前に記載されており（Berkner ら, Nucleic Acids Res., 12, 925-941 (1984); Berkner ら, Nucleic Acids Res., 11, 6003-6020 (1983); Brough ら, Virol., 190, 624-634 (1992)）、そして多重欠損ウイルスを構築するために使用できる。更に他の適切な方法としては、例えば、インビトロ組換え及び連結、並びに米国特許第5,965,358号及び国際特許出願WO 98/56937, WO 99/15686, 及び WO 99/54441で開示される方法が挙げられる。
【００３０】
本発明のアデノウイルスベクターの好適な構築方法は、初めに、アデノウイルスゲノムの特定の領域の必要な欠失又は改変（欠失領域へのスペーサーエレメントの付加など）を構築することを含む。このような改変は、例えば、標準的分子生物学技術を用いて、プラスミドカセットで行うことができる。次いで、変更された核酸配列（欠失又は改変を含む）は、アデノウイルスゲノムの１／２までを含むずっと大きなプラスミドに移され、改変されたアデノウイルスゲノムを含むベースプラスミドが提供される。次の工程は、改変されたアデノウイルスゲノムの所望の領域内に発現カセットを挿入することである。発現カセットは、当該分野で公知の標準的方法によって、例えば、プラスミドからカセットを単離することによって、提供されうる。次いで、単離されたカセットは、プラスミドＤＮＡ（改変アデノウイルスゲノムを含む）と共にレシピエント細胞内にトランスフェクトされうる。プラスミドは必要に応じて、アデノウイルスゲノム内の所望の位置での発現カセットの挿入を容易にするために、トランスフェクション前に、適切な制限酵素による消化によって線状化される。適切な制限酵素の選択は、当業者の技術内に十分ある。ＤＮＡの２断片が組換えられ、改変アデノウイルスゲノムと発現カセットを含むプラスミドが形成される。プラスミドは宿主細胞から単離され、組換えられたウイルスゲノムの失われたウイルス機能を補うレシピエント細胞に導入され、改変ウイルスゲノムと発現カセットを含むアデノウイルスベクターが産生される。ベクターは、ＩＴＲ及び／又はパッケージングシグナルの変更によって更に改変されうる。
【００３１】
補完性細胞株
本発明の複製欠損アデノウイルスベクターの増殖又は成長のための補完性細胞株は、公知であり、米国特許第5,851,806号, WO 95/34671, 及びBrough ら, Virol., 70, 6497-6501 (1996)に詳細に記載されている。好適な細胞株は、アデノウイルスベクターから失われたウイルス複製に必須の遺伝子のうちの少なくとも１つの遺伝子機能、好ましくは、少なくとも２つの遺伝子機能（例えば、アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ２及びＥ４領域を含む遺伝子機能）を補うことにより特徴付けられる。他の細胞株としては、後期領域を含む遺伝子機能から少なくとも１つの遺伝子機能を欠損するアデノウイルスベクターを補うもの、初期及び後期遺伝子機能の組合せを補うもの、並びに全てのアデノウイルス機能を補うものが挙げられる。選択される細胞株は、問題の組換え複製欠損アデノウイルスベクターから失われた機能を特異的に補い、かつ標準的な分子生物学技術を用いて産生されるものであることを当業者は理解しよう。細胞株は更に、非重複様式で、補完性遺伝子（complementing gene）を含むことにより特徴付けられ、このことは、ベクターゲノムが細胞ＤＮＡと組換えする可能性を最小にし、かつ実質的に除去する。従って、複製能のあるアデノウイルスは、ベクターストックに存在せず、それ故、特定の治療の目的、特に、遺伝子治療の目的に適切である。これはまた、非補完性細胞でのアデノウイルスの複製を回避する。
【００３２】
補完性細胞株は、組換えアデノウイルスベクターの高力価ストックを作製するために、欠損アデノウイルス遺伝子機能の産物を、それらの産物について適切なレベルで発現できるものでなければならない。例えば、アデノウイルスＤＮＡ複製については、化学量論的レベルで、即ち、比較的高レベルで、Ｅ２Ａ産物であるＤＢＰを発現することが必要とされるが、アデノウイルスＤＮＡ複製については、Ｅ２Ｂ産物であるＡｄ ｐｏｌは、ほんの触媒レベルで、即ち、比較的低レベルで必要とされる。組換えアデノウイルスベクターの高力価ストックを確保するためには、産物のレベルが適切でなければならないのみでなく、産物の一時的発現が、細胞の通常のウイルス感染で見られるものと一致しなければならない。例えば、ウイルスＤＮＡ複製に必要な成分は、ビリオンアッセンブリー（virion
assembly）に必要な成分の前に発現されねばならない。ウイルス産物の高レベル発現にしばしば付随する細胞毒性を避けるために、並びに産物の一時的発現を制御するために、誘導性プロモーター系が使用される。例えば、ヒツジメタロチオナイン誘導性プロモーター系が、完全なＥ４領域、Ｅ４領域のオープン・リーディング・フレーム６、及びＥ２Ａ領域を発現させるために使用されうる。適切な誘導性プロモーター系の他の例としては、細菌ｌａｃオペロン、テトラサイクリンオペロン、Ｔ７ポリメラーゼ系、並びに真核生物及び原核生物の転写因子の組合せ及びキメラ構築物、リプレッサー、並びに他の成分が挙げられるが、それらに限定されない。発現されるウイルス産物が非常に毒性である場合、インデューサーがウイルスベクターに運ばれ、誘導産物が補完性細胞株のクロマチン内に運ばれるという２段階からなる誘導系を使用することが望ましい。テトラサイクリン発現系及びｌａｃ発現系などの抑制性／誘導性発現系もまた使用できる。
【００３３】
使用方法
本発明は、宿主の腫瘍又は癌の治療方法であって、本発明のアデノウイルスベクターの抗癌又は抗腫瘍有効量をその必要のある宿主に投与することを含む方法を提供する。
治療又は予防目的（例えば、遺伝子治療、ワクチン接種など）のために、動物に本発明の複製欠損アデノウイルスベクターを投与する適切な方法（例えば、Rosenfeld ら, Science, 252, 431-434 (1991), Jaffe ら, Clin. Res., 39(2), 302A (1991), Rosenfeld ら, Clin. Res., 39(2), 311A (1991), Berkner, BioTechniques, 6, 616-629 (1988)参照）が利用でき、そしてベクターを投与するために２以上の経路が使用できるが、別の経路よりも特定の経路がより迅速かつより効果的な反応を提供しうることを当業者は理解しよう。例えば、アデノウイルスベクターは、例えば、腫瘍内に又は腫瘍部位近傍に直接的に注射することによって、宿主の特定の組織に直接的に投与できる。あるいは、アデノウイルスベクターは、静脈投与などによって宿主に全身的に投与できる。
【００３４】
本発明は、本発明のアデノウイルスベクター、及び担体、特に、医薬として許容できる（例えば、生理的又は薬理的に許容できる）担体（例えば、賦形剤又は希釈剤）を含む医薬組成物を提供する。医薬として許容できる担体は、当業者周知であり、容易に利用できる。担体の選択は、部分的には、医薬組成物を投与するのに使用される特定の方法によって決定されよう。それ故、本発明の医薬組成物の種々の適切な製剤がある。以下の製剤及び方法は単に例示であって、決して限定的ではない。しかし、経口製剤、注射製剤及びエアロゾル製剤が好適である。
【００３５】
経口投与に適した製剤は、（ａ）水、生理食塩水、又はオレンジジュースなどの希釈剤に溶解した有効量の化合物などの液体溶液；（ｂ）カプセル、サッシェ又は錠剤（各々は、固体又は顆粒として所定量の活性成分を含む）；（ｃ）適当な液体中の懸濁液；及び（ｄ）適切なエマルション；からなりうる。錠剤形態は、ラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、結晶性セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド性二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、並びに他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、フレーバー剤、及び薬理的に適合性のある賦形剤のうちの１つ以上を含む。ロゼンジ形態は、フレーバー中に、通常は、スクロース及びアカシア又はトラガカント中に活性成分を含むことができ、そして香錠は、ゼラチンやグリセリン又はスクロースやアカシアなどの不活性基剤中に活性成分を含み、エマルジョン、ゲルなどは、活性成分の他に、当該分野で公知の賦形剤を含む。
【００３６】
本発明のベクターは、単独で又は他の適切な成分と組合せて、吸入により投与されるエアロゾル製剤に製造されうる。これらのエアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容できる噴射剤中に入れられうる。それらはまた、ネブライザー又はアトマイザーなどの非加圧製剤用の医薬として製剤化できる。
【００３７】
非経口投与に適した製剤は、水溶性及び非水溶性で等張性の滅菌注射溶液（該溶液は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び製剤を意図されたレシピエントの血液と等張にする溶質を含みうる）、並びに懸濁剤、溶解剤、増粘剤、安定化剤、及び保存剤を含みうる水溶性及び非水溶性の滅菌懸濁液を含む。製剤は、単位投与量又は複数回投与量の密封容器（例えば、アンプルやバイアル）で提出され得、そして使用直前に、注射用滅菌液体賦形剤（例えば、水）の添加のみを必要とする凍結乾燥（凍結乾燥）状態で保存できる。即時調合注射溶液及び懸濁剤は、滅菌粉末、顆粒、及び上記種類の錠剤から製造できる。適切な製剤は、例えば、ＷＯ 00/34444及び米国特許第6,225,289号に記載されている。
【００３８】
更に、本発明で使用されるベクターは、乳化基剤や水溶性基剤などの種々の基剤と混合することによって坐剤として製造されうる。膣投与に適した製剤は、活性成分の他に、適切であるということが当該分野で公知の担体などを含む、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム(foam)又はスプレー製剤として提供されうる。
【００３９】
本発明の文脈では、動物（特に、ヒト）に投与される投与量は、特定のアデノウイルスベクター、アデノウイルスベクターを含む組成物、投与方法、及び治療される特定の部位や生物に応じて変動しよう。投与量は、所望の時間枠内で、所望の応答（例えば、治療又は予防応答）を生じるのに十分であるべきである。典型的な投与量は、ベクターに関して、少なくとも約1×105粒子単位 (pu) (例えば、少なくとも約1×106 pu)、好ましくは少なくとも約1×107 pu (例えば、少なくとも約1×108 pu)を含むであろう。より大きい投与量も使用できる。例えば、少なくとも約1×109 pu（例えば、少なくとも約1×1010 pu）、又は少なくとも約1×1011 puさえも（例えば、少なくとも約1×1012 pu）、あるいは少なくとも約1×1013 pu（例えば、少なくとも約1×1014 pu）のような一層大きい投与量である。一般的に、投与量は、約1×105〜1×1014 pu (例えば、1×107〜1×1013 pu)、好ましくは 1×108〜1×1012 pu（例えば 1×109〜1×1011 pu）であろう。
【００４０】
宿主における腫瘍又は癌を治療する本発明の方法は、その有効性を改変（例えば、増大）するために、他の治療及び／又は薬剤の投与（即ち、前投与、共投与、及び／又は後投与）を更に含みうる。例えば、本発明のアデノウイルスベクター、特に、放射線誘導性プロモーターと作動可能に連結しているＴＮＦをコードする核酸配列を含むベクターは、放射線投与と一緒に投与されうる。放射線は、任意の適切な方法で、例えば、放射線（例えば、赤外線）の外部源に曝すことによって、又は放射線の内部源の使用によって（例えば、放射線源の化学的又は手術的投与によって）投与されうる。例えば、本発明のアデノウイルスベクターは、近接照射療法（放射線活性源を腫瘍内又は腫瘍近傍に配置（移植）し、局在化された高投与量の放射線を送達する）と一緒に使用できる。放射線は望ましくは、宿主で治療レベルのＴＮＦの産生を誘導するのに十分な投与量で投与される。
【００４１】
本発明の方法は、放射線投与に加えて又は放射線投与の代わりに、インビボでのＴＮＦ効果を局所的又は全身的に変化（即ち、減少又は増大）させる他の物質の投与を更に含みうる。例えば、宿主で発現する全身的毒性のレベルを制御するために、ＴＮＦの全身的効果を減少させる物質を使用できる。同様に、宿主で予防又は治療効果を生じさせるために必要なＴＮＦのレベルを減少させるために、ＴＮＦの局所効果を増大させる物質を使用できる。このような物質としては、ＴＮＦアンタゴニスト（例えば、可溶性ＴＮＦレセプター又は抗ＴＮＦ抗体）及びＴＮＦアゴニストが挙げられる。ＴＮＦの効果を変化させる他の適切なアンタゴニスト、アゴニスト、及び他の物質が利用でき、そして一般的に当該分野で公知である。
【００４２】
本発明の複製欠損アデノウイルスベクターはまた、インビトロで有用性を有する。例えば、それらは、アデノウイルス遺伝子機能及びアッセンブリー、ＴＮＦの産生、又は適切な標的細胞での他の外来核酸配列の発現を研究するために使用されうる。当業者は、アデノウイルスベクターをトランスフェクトし、それによって挿入されたアデノウイルス核酸配列相補物の発現が生じる細胞を選択することによって、適切な標的細胞を同定できる。好ましくは、細胞へのアデノウイルスの結合と侵入のためのレセプターを有する適切な標的細胞が選択される。このような細胞としては、任意の哺乳動物を起源として単離されたものを含むが、それに限定されない。一旦、適切な標的細胞が選択されると、標的細胞を本発明のアデノウイルスベクターと接触させることによって、それぞれトランスフェクション又は感染が起こる。次いで、標的細胞での発現、毒性、及びＴＮＦをコードする核酸配列又は他の外来核酸配列の挿入及び活性に関する他のパラメーターが、当該分野で周知の従来の方法を用いて測定される。例えば、本発明のアデノウイルスベクターは、他の細胞分子に対するＴＮＦの相互作用とターゲティングを研究するために使用されうる。このようにすることにより、研究者は、アデノウイルス感染に関する現象論、並びに種々の生物から外植され、かつ組織培養で研究される種々の細胞型において、アデノウイルスベクターによって導入される種々の外来核酸配列の発現の効力及び効果を学び、解明することができる。
【００４３】
更に、本発明の文脈において、遺伝子治療によって適切に治療される疾患を有する患者から外植された又は取り出された細胞は、インビトロで有用に操作される。例えば、このような個体由来のインビトロで培養された細胞は、トランスフェクションを生じる適切な条件下（当業者によって容易に決定される）、本発明のアデノウイルスベクターとの接触下に置かれる。このような接触により適切に、培養細胞へのベクターのトランスフェクションが生じ、トランスフェクトされた細胞は、適切なマーカー及び選択的培養条件を用いて選択される。このようにすることにより、細胞の生命力を試験し（即ち、毒性を測定し）、かつ本発明のベクターの外来核酸配列の遺伝子産物の存在を試験する（即ち、発現を測定する）標準的方法を用いて、個体の細胞は、本発明のベクターとの適合性、該ベクターでの発現、及び該ベクターの毒性について試験され、それによって、そのように試験されるベクター系による個体の治療の適切性及び効力に関する情報が提供される。このように外植かつトランスフェクトされた細胞はまた、所定の遺伝子治療レジメンの潜在的効力／毒性を試験するのに役立つことに加えて、個体体内のインビボ位置に戻されうる。個体にそのように戻されるこのような細胞は、そのインビトロトランスフェクションを除いて、未変化のありのまま戻され得るか、又は個体身体の他の組織及び細胞からそれらを分離させておくマトリックスに包まれ得るか、若しくは該マトリックス中に包埋され得る。このようなマトリックスは、コラーゲン、セルロースなどを含む任意の適切な生体適合性材料でありうる。勿論、あるいは又はさらに、好ましくは、インビトロ試験への陽性応答後、本明細書中で先に詳述された投与手段によって、トランスフェクションがインビボで実施されうる。
【００４４】
本発明の更なる局面
当業者が理解するように、本発明によって提供されるアデノウイルスベクター及びアデノウイルスベクターに関する方法は、本明細書記載のエレメントの組合せ又は置換を含みうる。このような好適な形状のエレメントを有するベクターは、図１Ｂによって模式的に表される。更に、このような形状のエレメントを有するベクターは、配列番号１の核酸配列を含むベクター、該核酸配列から本質的になるベクター、又は該核酸配列からなるベクターによって提供される。しかし、本発明では、例示的な核酸配列の多くの改変及びバリエーションが可能である。例えば、遺伝暗号の縮重は、コードされたポリペプチドのコード配列を変化させることなく、ポリペプチドコード領域にわたる、並びに翻訳停止シグナルでのヌクレオチドの置換を可能とする。このような置換可能な配列は、所定の遺伝子の公知のアミノ酸配列又は核酸配列から推定され得、そして通常の合成又は部位特異的変異誘発方法によって構築され得る。合成ＤＮＡ方法は、Itakuraら, Science, 198, 1056-1063 (1977年), 及びCreaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 5765-5769 (1978年)の方法に実質的に従って行われ得る。部位特異的変異誘発方法は、Maniatisら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (第２版, 1989年)に記載されている。それ故、本発明は、本明細書中で特に例示された核酸配列に決して限定されるものではない。例示されたベクターは腫瘍及び／又は癌の遺伝子治療用であり、それ故、ＴＮＦ遺伝子を含みかつ発現する。しかし、記載されたベクターはまた、他の同様の又は異なる疾患及び／又は病気を治療するために使用される遺伝子を含みうる。このような疾患及び／又は病気としては、他の慢性肺疾患（例えば、肺気腫、喘息、成人呼吸促進症候群、及び慢性気管支炎）、並びに冠動脈性心疾患、及び遺伝子治療、ワクチン接種などによって適切に治療又は予防される他の病気が挙げられるが、それらに限定されない。それ故、任意の遺伝子又は核酸配列が、アデノウイルスＴＮＦベクターに挿入されうる。
【００４５】
アデノウイルスベクターは、本発明の範囲及び思想を逸脱することなく他の様式に改変されうる。例えば、本発明のアデノウイルスベクターのコート蛋白質は、可能性ある宿主細胞上のウイルスレセプターに対するウイルスの結合特異性又は認識を変化させるように操作されうる。このような操作としては、ファイバー、ペントン又はヘキソンの領域の欠失、コート蛋白質部分への種々の天然又は非天然リガンドの挿入などを挙げることができる。コート蛋白質の操作は、ウイルスベクターが感染する細胞の範囲を拡張しうるか、又は特定の細胞型へのウイルスベクターのターゲティングを可能としうる。
【００４６】
例えば、ベクターは、好ましくは、アミノ末端又はカルボキシル末端での又はその近傍での、非天然アミノ酸配列の導入によって、野生型（即ち、天然）コート蛋白質とは異なるキメラコート蛋白質（例えば、ファイバー（カルボキシル末端、ＨＩループ、又は他のループ）、ヘキソン、ｐＩＸ、ｐＩＩＩａ、又はペントン蛋白質）を含みうる。好ましくは、非天然アミノ酸配列が、内部コート蛋白質配列中に、又は該配列の代わりに挿入される。結果として得られるキメラウイルスコート蛋白質は、好ましくは、キメラウイルスコート蛋白質ではなく野生型ウイルスコート蛋白質を含むことを除き同一であるアデノウイルスベクターの細胞内への侵入よりも効率的に、コート蛋白質を含むアデノウイルスベクターの細胞内への侵入を指向し得る。キメラウイルスコート蛋白質は望ましくは、細胞表面に存在する新規な内因性結合部位と結合する。侵入効率のこの増大は、アデノウイルスが、選択された細胞型（野生型コート蛋白質を含むウイルスが典型的には侵入できないか、又はほんの低効率でしか侵入できないもの）に結合し、かつ侵入し得るという結果につながる。
【００４７】
本発明の好適なベクターは、リジン及び／又はアルギニン残基からなる非天然ポリアミノ酸配列を含むファイバー蛋白質を含む。ポリアミノ酸配列は一般的には、３〜３０アミノ酸残基、好ましくは５〜２０アミノ酸残基、より好ましくは５〜１０アミノ酸残基を含む。より好ましくは、非天然ポリアミノ酸配列は、ファイバー蛋白質のＨＩループに、又はファイバー蛋白質のカルボキシル末端に存在する。ポリアミノ酸配列が、ファイバー蛋白質のカルボキシル末端に存在するとき、ファイバー蛋白質は更に、野生型ファイバー配列のカルボキシル末端に、少なくとも５アミノ酸（例えば、約５〜１５アミノ酸）、より好ましくは少なくとも約７アミノ酸（例えば、約７〜１０アミノ酸）のスペーサーエレメントを含むことが好ましい。典型的なスペーサーとしては、交互のグリシン及びセリン残基、リジン残基の繰り返し、又はそれらの混合物が挙げられる。
【００４８】
あるいは、本発明のアデノウイルスベクターは、真核細胞の特定型に選択的ではないキメラウイルスコート蛋白質を含みうる。このようなキメラコート蛋白質は、内部コート蛋白質配列中に又は該配列の代わりに、非天然アミノ酸配列が挿入されていることによって野生型コート蛋白質とは異なる。非選択的キメラコート蛋白質を含むベクターにおいて、ウイルスコートは、国際特許出願ＷＯ 97/20051に記載されるように、野生型ウイルスコートよりも広い範囲の真核細胞に効率的に結合する。
【００４９】
所定の細胞へのアデノウイルスの結合特異性もまた、米国特許第5,962,311号で考察されるように、短いシャフトのアデノウイルスファイバー遺伝子を含むアデノウイルスの使用によって調節されうる。短いシャフトのアデノウイルスファイバー遺伝子を含むアデノウイルスの使用は、アデノウイルスファイバーの細胞表面レセプターへのアデノウイルスファイバー結合のレベル又は効率を減少させ、かつアデノウイルスペントンベースの細胞表面レセプターへのアデノウイルスペントンベース結合を増大させ、それによって、所定の細胞へのアデノウイルスの結合特異性を増大させる。あるいは、短いシャフトのファイバーを含むアデノウイルスの使用は、ペントンベース又はファイバーノブへの非天然アミノ酸配列の導入によって、所望の細胞表面レセプターへのアデノウイルスのターゲティングを可能とする。
【００５０】
更に、ウイルスベクターが可能性ある宿主細胞を認識する能力は、コート蛋白質を遺伝子操作することなく調節されうる。例えば、ペントンベース結合ドメインと特定の細胞表面結合部位を選択的に結合するドメインとを含む２重特異的分子と、アデノウイルスを複合体化することにより、当業者による特定の細胞型へのベクターの標的化が可能となる。
【００５１】
ウイルスベクター、特にアデノウイルスベクターに対する多くの改変は、当該分野で公知である。アデノウイルスベクターについての適切な改変としては、米国特許第5,559,099号; 同第5,731,190号; 同第5,712,136号; 同第5,770,442号; 同第5,846,782号; 同第5,926,311号; 同第5,965,541号; 同第6,057,155号; 同第6,127,525号; 同第6,153,435号; 並びに国際特許出願WO 96/07734, WO 96/26281, WO 97/20051, WO 98/07865, WO 98/07877, WO 98/54346, 及びWO 00/15823に記載されている改変が挙げられる。
【００５２】
以下の実施例は、本発明を更に説明するが、勿論、その範囲を制限するものとは解釈すべきではない。実施例で言及される酵素は、異なるように記載していなければ、Bethesda Research Laboratories (BRL), Gaithersburg, Maryland, New England Biolabs Inc. (NEB), Beverly, Massachusetts, 又は Boehringer Mannheim Biochemicals (BMB), Indianapolis, Indianaから入手でき、製造業者の推奨に実質的に従って使用される。本明細書中で使用される技術の多くは、当業者周知である。分子生物学技術は、適切な実験室マニュアル、例えば、Maniatisら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (第２版, 1989年), 及びCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubelら（編）(1987年))に詳細に記載されている。
【実施例】
【００５３】
実施例１
以下の実施例は、本発明に従ってのアデノウイルスベクターの製造を示す。Ｅ１、Ｅ３及びＥ４領域に欠損を有する５型アデノウイルスゲノム（Ｅ３領域は完全欠失であり、Ｅ４領域はＳＶ４０ポリアデニル化配列を含んでいた）を含む第１プラスミド（ベースプラスミド）を製造した。ＴＮＦ−αをコードする核酸配列に作動可能に連結したＥｇｒ−１放射線誘導性プロモーターを有する発現カセットを含む第２プラスミド（ドナープラスミド）を製造した。ドナープラスミドを、Ｄｒｄ−Ｉ制限エンドヌクレアーゼで消化し、Ｅｇｒ−Ｉ／ＴＮＦ−α発現カセットを含む約６．５ｋｂｐの核酸セグメントをゲル電気泳動で単離した。ベースプラスミドを、Ｓｗａ−Ｉ制限エンドヌクレアーゼを用い消化し、線状化プラスミドを脱リン酸化した。６．５ｋｂｐ（約）ドナープラスミドフラグメント５０ｎｇと、線状化ベースプラスミド５０ｎｇで、コンピテントE.coli BJIq細胞を形質転換した。形質転換細胞を、カナマイシン５０μｇ／μｌとテトラサイクリン５０μｇ／μｌを含むルリア／ＳＯＣブロスプレートに播いた。得られたコロニーを組換え体につきスクリーニングし、陽性組換え体をルリアブロス／カナマイシンプレートで増殖させた。
【００５４】
形質転換されたE.coli BJIq細胞から、標準的技術によって、組換えプラスミドＤＮＡを単離した。標準的方法を用いて、単離したプラスミドＤＮＡを、Ｐａｃ−Ｉ制限エンドヌクレアーゼによる消化によって線状化し、線状化プラスミドＤＮＡを、２９３−ＯＲＦ６細胞（２９３ヒト胎児腎細胞由来）（Ｅ１及びＥ４欠損を補う）にトランスフェクトし、配列番号１の配列を有するアデノウイルスＥｇｒ−Ｉ／ＴＮＦ−αＥ１-，Ｅ３-，Ｅ４-ベクターを産生した。
【００５５】
実施例２
以下の実施例は、宿主における腫瘍の治療又は予防のための、本発明に従って製造されたアデノウイルスベクターの使用を示す。
放射線耐性ヒト扁平上皮（squameous）腫瘍細胞株（ＳＱ−２０Ｂ）異種移植腫瘍を有する８匹のヌードマウスを各々含む３つの治療群を確立した。第１治療群は、０、４、７、１１日目に、５つの部位（各腫瘍の周辺に注射を４回及び各腫瘍の中心に注射を１回）で腫瘍組織中に直接的に注射することによって、実施例１のアデノウイルス粒子を５×１０10粒子単位（ＰＵ）の投与量（ウイルス緩衝液を含めると総容積３２μｌ）で受けた。第２治療群は、０〜４、７〜９日目に、投与されたアデノウイルスベクターの同じ投与量を受けるとともに、腫瘍が赤外線５Ｇｙ（合計４０Ｇｙの放射線）に曝された。第３治療群は赤外線のみを受けた。
【００５６】
第１治療群では、顕著な腫瘍退縮が４日目までに観察されたが、第２治療群では、１１日まで退縮は観察されなかった。１１日目に、第１治療群の１匹の動物と、第２治療群の３匹の動物は目視可能な腫瘍を有さなかった。６２日後、第２治療群の８匹全てのマウスは治癒し（即ち、目視可能な腫瘍は存在しなかった）、一方、第１群の６匹のマウスは治癒し、第３群（ベクター無し）の１匹のみ治癒した。
本実施例の結果は、本発明のアデノウイルスベクターが、宿主の腫瘍を治療するために首尾良く使用されうることを示す。
【００５７】
実施例３
以下の実施例は、宿主における腫瘍の治療又は予防のための、本発明に従って製造されたアデノウイルスベクターの使用を示す。
ヌードマウスに、５×１０6のＳＱ−２０Ｂ細胞を皮下注射した。動物の腫瘍が平均容積４７８．２ｍｍ3に達したとき、動物を８〜１０匹の動物からなる６治療群に分け、群１〜６と命名した。治療群１〜６は各々、以下のように異なる治療を受けた。（１）緩衝液のみ、（２）放射線のみ、（３）実施例１のアデノウイルスベクター（本明細書中以降、「ベクター」という）4 x 108 pu、（４）4 x 108 puベクター＋放射線、（５）4 x 109 puベクター、及び（６）4 x 109 puベクター＋放射線。緩衝液又はベクターを、０、３、７、１０日目に腫瘍内に注射した。放射線治療は、合計放射線量５０Ｇｙとなるように、０〜４日目及び７〜１１日目に、腫瘍を担持する右後脚に５Ｇｙを照射することからなっていた。
各実験群のマウスは、無作為化後、研究剤の１回目の接種の前、及びその後は１週毎に体重を計測した。動物は、研究過程中に全く死亡せず、その後も何ら毒性の兆候を示さなかった。どの時点でも、動物の体重において群間で有意な差はなかった。
【００５８】
研究の間、血漿及び腫瘍中のＴＮＦレベルを評価するために、各治療群から３匹のマウスを屠殺した。ヌードマウス中で増殖しているＳＱ−２０Ｂ腫瘍にベクター又は緩衝液を単回腫瘍内投与した後、血漿中のＴＮＦの循環レベルを評価した。選択された群はまた、ベクター注射３時間後を起点として３日間に渡って与えられた１５Ｇｙの放射線を受けた。最後の放射線治療１日後に、ヒトＴＮＦの血漿レベルを酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で評価した（検出下限＜４．４ｐｇ／ｍｌ）。結果を表１に示す。血漿レベルは、放射線とベクター投与の両方で増加した。
【００５９】
【表１】
【００６０】
ＴＮＦ測定のために、血漿を集めた同じ時点に、マウスを安楽死させ、腫瘍を切除し、抽出した。次いで、ＥＬＩＳＡによって、抽出物におけるＴＮＦ発現を定量した。腫瘍で発現したＴＮＦ量を表２に示す。
【００６１】
【表２】
【００６２】
ベクターを注射しなかった腫瘍では、ごくわずかのＴＮＦが検出された。ＴＮＦは、投与量依存様式で、放射線無しのベクターの注射を受けた腫瘍で産生された。ベクターの接種後、３回の５Ｇｙフラクションの放射線を腫瘍に与えたとき、ベクターの両方の投与量群で、ＴＮＦ発現は２倍超であった。更に、ベクター4 x 108 puを注射した腫瘍と比べて、ベクター4 x 109 puを注射した腫瘍では、ＴＮＦ発現は１．７倍大きかった。
【００６３】
残りの動物を６０日間追跡し、次いで屠殺した。結果を図２に示す。図２では、菱形データ点は治療群１を表し、黒四角データ点は治療群２を表し、白三角データ点は治療群３を表し、黒三角データ点は群４を表し、白四角データ点は治療群５を表し、円データ点は治療群６を表す。治療に対する腫瘍応答を解析すると、他の全ての群と比較して、ベクター4 x 109 pu投与量＋放射線群で腫瘍容積がより大きく減少するという傾向が示された。この差異は、研究の終点（５０〜６０日目）で統計学的に有意であった。緩衝液対照群で、この研究で異常な出来事があった。６匹のマウスのうち２匹のマウスで、６０日目までに腫瘍が完全に退縮した。これは、おそらく、初期の大きな腫瘍容積及びこれらの腫瘍の嚢状性質によるものであったかもしれない。なぜなら、これらの腫瘍は、サイズが増大すると容易に破裂するからである。しかし、ベクター4 x 109 pu投与量＋放射線群における７匹のマウスのうち６匹のマウス（８６％）は、６０日目で腫瘍の形跡を有さなかった。
これらの結果は、腫瘍の治療のために、本発明のベクターを使用して、インビボでＴＮＦを発現させうることを示す。
【００６４】
実施例４
以下の実施例は、宿主における腫瘍の治療又は予防のための、本発明に従って製造されたアデノウイルスベクターの使用を示す。
患者サンプル由来の放射線耐性ヒト食道腫瘍細胞を、５×１０6細胞の単回投与量でヌードマウスの右後脚に注射し、マウスを４つの治療群に無作為に分けた。群１は、緩衝溶液（０日目と３日目に、腫瘍内への直接的な注射によって投与された）でのみ治療された。群２は、０、１、３、４日目に投与される放射線４Ｇｙ投与量からなる（合計ＩＲ投与量１６Ｇｙ）赤外線治療を受けた。群３は、実施例１のアデノウイルスベクター（４×１０8ＰＵ）（０日と３日目に、腫瘍内への直接的な注射によって投与された）で治療された。群４は、アデノウイルスベクター治療と赤外線治療を受けた。
【００６５】
腫瘍容積と動物の体重を４８日間に渡って測定した。腫瘍容積を時間に対しプロットし、図３で示される腫瘍容積曲線を得た。図３では、菱形データ点（υ）は群１のデータを表し、円形データ点（λ）は群２のデータを表し、三角データ点(σ)は群３のデータを表し、四角データ点（ν）は群４のデータを表す。全ての動物は健康のままであり、有害な効果は、研究中観察されなかった。しかし、群１と２の動物を、大きな腫瘍負荷（体重の１０％超）のために３６日目に屠殺した。
【００６６】
腫瘍容積曲線は、放射線のみ（群２）又はベクターのみ（群３）で治療された動物と比較して、ベクターと放射線（群４）で治療された動物において、実質的により小さな腫瘍増殖を示す。このデータは、本発明のアデノウイルスベクターが宿主における腫瘍の治療のために首尾よく使用されうることを示す。
【００６７】
実施例５
以下の実施例は、宿主における腫瘍の治療又は予防のための、本発明に従って製造されたアデノウイルスベクターの使用を示す。
患者サンプル由来の放射線耐性食道腫瘍細胞を、５×１０6細胞の単回投与量でヌードマウスの右後脚に注射し、マウスを４つの治療群に無作為に分けた。群１は、緩衝溶液（０、３、７、１０日目に、腫瘍内への直接的な注射によって投与された）でのみ治療された。群２は、０、１、３、４、７、８、１０、１１日目に投与される放射線３Ｇｙ投与量からなる（合計ＩＲ投与量２４Ｇｙ）赤外線治療を受けた。群３は、実施例１のアデノウイルスベクター（４×１０8ＰＵ）（０、３、７、１０日目に、腫瘍内への直接的な注射によって投与された）で治療された。群４は、アデノウイルスベクター治療と赤外線治療を受けた。
【００６８】
腫瘍容積と動物の体重を２２日間に渡って測定した。腫瘍容積を時間に対しプロットし、図４で示される腫瘍容積曲線を得た。図４では、菱形データ点（υ）は群１のデータを表し、円形データ点（λ）は群２のデータを表し、三角データ点(σ)は群３のデータを表し、四角データ点（ν）は群４のデータを表す。全ての動物は健康のままであり、有害な効果は観察されなかった。しかし、群１と２の動物を、大きな腫瘍負荷（体重の１０％超）のために１５日目に屠殺した。
【００６９】
腫瘍容積曲線は、放射線のみ（群２）又はベクターのみ（群３）で治療された動物と比較して、ベクターと放射線（群４）で治療された動物において実質的により小さな腫瘍増殖を示す。このデータは、本発明のアデノウイルスベクターが宿主における腫瘍の治療のために首尾よく使用されうることを示す。
【００７０】
特許、特許出願、及び刊行物を含む、本明細書で引用された全ての参考文献は、引用により内容の全てが本明細書に含まれるものとする。
好適な実施態様を強調して、本発明を記載したが、好適な実施態様のバリエーションを使用でき、そして本明細書で特に記載した以外にも本発明が実施できることが意図されていることは、当業者に明白であろう。それ故、本発明は、上記の特許請求の範囲により定められる本発明の思想と範囲内に包含される全ての改変を含む。
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）をコードする核酸配列を含む複製欠損（replication deficient）アデノウイルスベクター、並びにこのようなベクターの構築及び使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、特に、ＴＮＦ−αは、その抗腫瘍効果及び放射線治療と相乗的に作用する能力について周知である。例えば、ＴＮＦ−α遺伝子を含むある複製欠損アデノウイルスベクターは、動物における腫瘍を治療するために放射線治療と組み合わせて使用されており、ある程度は成功している（例えば、Hallahan ら, Nat. Med., 1, 786-91 (1995)）。しかし、抗癌／抗腫瘍剤としてのＴＮＦの使用は、その重篤な全身的効果によって制限されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
構築と使用においてより大きな柔軟性を有し、かつ腫瘍又は癌の治療におけるより大きな成功を提供しうる複製欠損ＴＮＦアデノウイルスベクターが依然として必要性とされている。本発明は、このようなベクター、並びにこのようなベクターの構築方法、及びこのようなベクターの使用を含む治療方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の簡単な概要
本発明は、（ａ）アデノウイルスゲノムの初期増殖−４（Ｅ４）領域において欠損しているアデノウイルスゲノム、（ｂ）ＴＮＦをコードする核酸配列、及び（ｃ）ＴＮＦをコードする核酸配列と作動可能に連結している放射線誘導性プロモーター、を含むアデノウイルスベクターを提供する。本発明はまた、（ａ）アデノウイルスゲノムのＥ４領域において欠損しているアデノウイルスゲノム、（ｂ）ＴＮＦをコードする核酸配列、及び（ｃ）アデノウイルスゲノムのＥ４領域中の少なくとも１５塩基対のスペーサーエレメント、を含むアデノウイルスベクターを提供する。
【０００５】
アデノウイルスベクターの製造方法はまた、（ａ）アデノウイルスゲノムのＥ４領域において欠損しているアデノウイルスゲノムを提供すること、（ｂ）ＴＮＦをコードする核酸配列をアデノウイルスゲノムに挿入すること、及び（ｃ）ＴＮＦをコードする核酸配列に作動可能に連結するように、放射線誘導性プロモーターをアデノウイルスゲノムに挿入すること、を含む本発明によって提供される。本発明は更に、宿主の腫瘍又は癌の治療方法であって、本発明のアデノウイルスベクターの抗癌又は抗腫瘍有効量をその必要のある宿主に投与することを含む方法を提供する。
本発明は、付属の図面及び以下の好適な実施態様の詳細な説明を参照することにより最も良く理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１Ａは、改変していないアデノウイルスゲノムを含むベクターの模式図である。図１Ｂは、本発明の改変アデノウイルスゲノムと遺伝子エレメントを含むベクターの模式図である。
【図２】本発明のアデノウイルスベクターでの処置を含む、種々の方法で処置された腫瘍についての、時間に対する腫瘍容積のプロットである。
【図３】本発明のアデノウイルスベクターでの処置を含む、種々の方法で処置された腫瘍についての、時間に対する腫瘍容積の第２のプロットである。
【図４】本発明のアデノウイルスベクターでの処置を含む、種々の方法で処置された腫瘍についての、時間に対する腫瘍容積の第３のプロットである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
発明の詳細な説明
本発明は、（ａ）アデノウイルスゲノムのＥ４領域において欠損しているアデノウイルスゲノム、（ｂ）ＴＮＦをコードする核酸配列、及び（ｃ）ＴＮＦをコードする核酸配列と作動可能に連結している放射線誘導性プロモーター、を含むアデノウイルスベクターを提供する。本発明はまた、（ａ）アデノウイルスゲノムのＥ４領域において欠損しているアデノウイルスゲノム、（ｂ）ＴＮＦをコードする核酸配列、及び（ｃ）アデノウイルスゲノムのＥ４領域中の少なくとも１５塩基対のスペーサーエレメント、を含むアデノウイルスベクターを提供する。
【０００８】
アデノウイルスゲノム
任意のサブタイプ、サブタイプの混合物、又はキメラアデノウイルスが、本発明と関連したアデノウイルスベクターの製造のためのウイルスゲノムの源として使用できる。好ましくは、２型（Ａｄ２）又は５型（Ａｄ５）アデノウイルスゲノムなどのヒト血清型アデノウイルスのゲノムが使用される。任意の適切なアデノウイルスゲノムが本発明に関連して使用できるが、Ａｄ５アデノウイルスゲノムが最適であり、本発明は、Ａｄ５血清型に関して本明細書中で更に説明する。
【０００９】
本発明に関連して使用されるアデノウイルスゲノムは望ましくは、複製欠損である。本明細書で使用される場合、遺伝子、遺伝子機能、又は遺伝子若しくはゲノム領域の欠損とは、全体として又は部分的に核酸配列が欠失している遺伝子の機能を損ない又は消失させ、かつウイルスゲノムに対して外来である核酸配列の挿入のためにウイルスゲノムにスペース又は容量を提供するように、ウイルスゲノムの遺伝物質が十分に欠失していることとして定義される。このような欠損は、非補完性細胞宿主中でのアデノウイルスベクターの増殖に必須又は非必須の遺伝子又はゲノム領域に存在しうる。このような増殖に必須のアデノウイルスゲノム領域（例えば、初期領域１（Ｅ１）、初期領域２Ａ（Ｅ２Ａ）、初期領域２Ｂ（Ｅ２Ｂ）、初期領域４（Ｅ４）、後期領域１（Ｌ１）、後期領域２（Ｌ２）、後期領域３（Ｌ３）、後期領域４（Ｌ４）、及び後期領域５（Ｌ５））における欠損は、アデノウイルスゲノムベースのアデノウイルスベクターを複製欠損にする。
【００１０】
本発明のアデノウイルスベクターは望ましくは、多重複製欠損（multiply replication deficient）である。即ち、それは、非補完細胞宿主中でのウイルス増殖（即ち、インビトロでのウイルス複製）に必要な少なくとも２つのゲノム領域において欠損する。このような領域としては、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、又はＬ１〜Ｌ５領域が挙げられる。Ｅ１領域は、初期領域１Ａ（Ｅ１Ａ）及び初期領域１Ｂ（Ｅ１Ｂ）からなるとみなすことができるが、Ｅ１Ａ及び／又はＥ１Ｂ領域のいずれか一方又は両方の欠失は、本発明の文脈において単一の欠損とみなす。更に、このようなベクターは、ウイルス増殖に必要ではない１つ以上の領域において欠損しうる。例えば、ベクターは、初期領域３（Ｅ３）において更に欠損しうる。
【００１１】
本発明のアデノウイルスベクターは望ましくは、Ｅ１とＥ４領域において欠損があり、好ましくは、アデノウイルスベクターからＥ４領域のコード領域全体が欠失したものである。本発明の文脈において、コード領域とは、蛋白質産物をコードするゲノム領域の部分（単数又は複数）（例えば、Ｅ４領域のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ））をいう。即ち、アデノウイルスゲノムのＥ４領域のコード領域全体が欠失したベクターは、その領域の全てのＯＲＦを欠く。本発明のアデノウイルスベクターのＥ４領域は好ましくは、天然Ｅ４プロモーター、ポリアデニル化配列、及び／又は右側の逆末端反復（inverted terminal repeat: ＩＴＲ）を保持する。
【００１２】
本発明のアデノウイルスベクターはまた、ウイルス増殖に必要な１つ以上の更なる領域（特に、ウイルス複製に必要な他の初期領域（例えば、Ｅ２Ａ及び／又はＥ２Ｂ領域））において欠損しうる。より好ましくは、アデノウイルスゲノムのＥ３領域もまた除去される。このように、本発明のアデノウイルスベクターの好適な形状は、（ａ）Ｅ１-Ｅ４-、（ｂ）Ｅ１-Ｅ２Ａ-Ｅ４-、及び（ｃ）Ｅ２Ａ-Ｅ４-アデノウイルスベクターを含み、そのいずれもがまた、Ｅ３-でありうる。
【００１３】
図１Ａは、Ａｄ５ゲノムの模式図を提供する。図１Ｂは、例示的なアデノウイルスベクターの模式図である。この図は、図１Ａで表される改変されていないＡｄ５アデノウイルスゲノムと比較すると、（ｉ）Ｅ１領域（１０）が、放射線誘導性プロモーター（１４）、ＴＮＦをコードする核酸配列（１５）及びポリアデニル化配列（１６）で置換され、（ｉｉ）Ｅ３領域（１１）が欠失し（１７）、及び（ｉｉｉ）Ｅ４領域（１２）のコード領域がスペーサーエレメント（１８）によって置換され、Ｅ１、Ｅ３及びＥ４領域において欠損のあるベクターが作出されていることを示す。
【００１４】
本発明のアデノウイルスベクターがＥ２Ａ領域において欠損する場合、ベクターは好ましくは、Ｅ２Ａ欠損領域においてアデノウイルスゲノムのＥ２Ａ領域の一部（長さで約２３０塩基対未満）を更に含む。一般的に、アデノウイルスのＥ２Ａ領域は、ＤＮＡ複製に必要なポリペプチドであるＤＢＰ（ＤＮＡ結合蛋白質）をコードする。ＤＢＰは、ウイルス血清型に依存して、４７３〜５２９アミノ酸からなる。ＤＢＰは、伸長したＮｔドメインを有する球状Ｃｔからなる偏長の楕円体として存在する非対称蛋白質であると考えられている。研究により、Ｃｔドメインは、ＤＢＰが核酸と結合し、亜鉛と結合し、ＤＮＡ鎖伸張のレベルでＤＮＡ合成において機能する能力を担うということが示されている。しかし、Ｎｔドメインは、転写と転写後レベルの両方で後期遺伝子発現において機能すると考えられ、該蛋白質の効率的な核局在を担い、また、それ自身の発現の増大に関与しうる。アミノ酸２〜３８のＮｔドメインにおける欠失は、この領域がＤＢＰ機能に重要であることを示した（Brough ら, Virology, 196, 269-281 (1993)）。ＤＢＰのＣｔ領域をコードするＥ２Ａ領域における欠失は、ウイルス増殖に対する効果を有しないが、ＤＢＰのＮｔドメインのアミノ酸２〜３８をコードするＥ２Ａ領域における欠失は、ウイルス増殖を損なう。それ故、好ましくは、任意の多重複製欠損アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムのＥ２Ａ領域のこの部分を含む。
【００１５】
特に、例えば、保持されるべきＥ２Ａ領域の所望の部分は、Ｅ２Ａ領域の５’末端で規定されるアデノウイルスゲノムのＥ２Ａ領域のその部分、特に、血清型Ａｄ５のアデノウイルスゲノムのＥ２Ａ領域の位置Ａｄ５（２３８１６）〜Ａｄ５（２４０３２）である。アデノウイルスゲノムのこの部分は望ましくは、アデノウイルスベクターに含まれる。なぜなら、それは、現在のＥ２Ａ細胞株では補われず、その非存在下、ウイルス増殖とファイバー発現の必要なレベルは、補完性細胞株で得ることができないからである。
【００１６】
本発明は、ゲノムの初期領域においてのみ遺伝子機能に欠損のあるアデノウイルスベクターに限定されない。また、ゲノムの初期及び後期領域において欠損しているアデノウイルスベクター、並びに、本質的にゲノム全体が除去されたベクター（その場合、少なくとも、ウイルスＩＴＲ及びプロモーターの幾つか、又はウイルスＩＴＲ及びパッケージングシグナルがインタクトなままであるのが好ましい）も含まれる。除去されるアデノウイルスゲノムの領域が大きい程、ゲノム中に挿入できる外因性核酸配列の断片が大きいことを当業者は理解しよう。例えば、アデノウイルスゲノムが３６ｋｂであるならば、ウイルスＩＴＲ及び幾つかのプロモーターをインタクトのままにすると、アデノウイルスの収容能力は約３５ｋｂである。あるいは、ＩＴＲとパッケージングシグナルのみを含む多重欠損アデノウイルスベクターを製造できよう。次いで、これは、このベクターから３７〜３８ｋｂの外来核酸配列を発現させることを効率的に可能としうるであろう。勿論、欠損アデノウイルス領域のいずれか又は全てにスペーサーエレメントを含めると、スペーサーエレメント配列のサイズに応じて、サイズにおけるアデノウイルスベクターの収容能力が減少するであろう。
【００１７】
ＴＮＦをコードする核酸配列
好ましくは、ベクターは、ＴＮＦをコードする核酸配列を含む（contain）（即ち、含む（comprise））少なくとも１つの発現カセットを含む。ＴＮＦをコードする核酸配列は、ＴＮＦファミリーの蛋白質の任意のメンバーをコードする核酸配列を含む。本発明のアデノウイルスベクターは好ましくは、ＴＮＦ−αをコードする核酸配列を含む。ＴＮＦをコードする核酸配列は、米国特許第4,879,226号に詳細に記載されている。
【００１８】
ＴＮＦをコードする核酸配列は好ましくは、アデノウイルスゲノムのＥ１領域に存在する（例えば、Ｅ１領域を全体的又は部分的に、好ましくは全体的に置換する）。例えば、Ｅ１領域は、ＴＮＦをコードする核酸配列を含むプロモーター可変（promoter variable）発現カセットによって置換されうる。本明細書で使用する「発現カセット」という用語は、アデノウイルスゲノムに挿入されて、外来遺伝子産物を産生しうる任意の核酸配列をいう。例えば、図１Ａ及び１Ｂに示すように、Ｅ１領域（１０）は、放射線誘導性プロモーター（１４）、ＴＮＦをコードする核酸配列（１５）及びポリアデニル化配列（１６）を含む発現カセット（１３）により置換されうる。ＴＮＦをコードする核酸配列を含む発現カセットの他に、ベクターは、他の産物をコードする核酸配列を含む他の発現カセットを含み得る（そのカセットは、アデノウイルスゲノムの任意の欠失領域を置換しうる）。アデノウイルスゲノム（例えば、ゲノムのＥ１領域）中への発現カセットの挿入は、公知の方法によって、例えば、アデノウイルスゲノムの所定の位置に特有の制限部位を導入することによって、容易にされうる。
【００１９】
好ましくは、ＴＮＦをコードする核酸配列は、ＴＮＦをコードする領域の３’に存在するポリアデニル化配列などの転写終結領域を更に含む。合成最適化配列、並びにＢＧＨ（ウシ成長ホルモン）、ポリオーマウイルス、ＴＫ（チミジンキナーゼ）、ＥＢＶ（エプスタイン−バー・ウイルス）、及びヒトパピローマウイルスとＢＰＶ（ウシパピローマウイルス）を含むパピローマウイルスのポリアデニル化配列を含む任意の適切なポリアデニル化配列を使用できる。好適なポリアデニル化配列は、ＳＶ４０（ヒト肉腫ウイルス−４０）ポリアデニル化配列である。
【００２０】
好ましくは、ＴＮＦをコードする核酸配列は、１つ以上のプロモーター及び／又はエンハンサーエレメントに、例えば、プロモーター可変発現カセットの部分として作動可能に連結される（即ち、１つ以上のプロモーター及び／又はエンハンサーエレメントの転写制御下におかれる）。配列を作動可能に一緒に連結するための技術は、当該分野で周知である。任意の適切なプロモーター又はエンハンサー配列が、本発明に関連して使用できる。適切なプロモーター又はエンハンサー配列は一般的には当該分野で公知である。本発明の好適なベクターは、ＴＮＦをコードする核酸配列に作動可能に連結した放射線誘導性プロモーターを含む。放射線誘導性プロモーターの使用は、例えば、アデノウイルスベクターを含む細胞又は宿主への放射線の投与により、外来遺伝子産物の転写に対する制御を提供する。任意の適切な放射線誘導性プロモーターが、本発明に関連して使用できる。適切な放射線誘導性プロモーターは一般的に当該分野で公知である。本発明に関連する使用のための好適な放射線誘導性プロモーターは、初期増殖領域−１（Ｅｇｒ−１）プロモーター、特に、Ｅｇｒ−１プロモーターのＣＡｒＧドメインである。Ｅｇｒ−１プロモーターは、米国特許第5,206,152号及び国際特許出願WO 94/06916に詳細に記載されている。プロモーターは、当該分野で公知の方法によって、例えば、ゲノムの所定領域に特有の制限部位を導入することによって、外来ゲノム中に導入されうる。あるいは、プロモーターは、ＴＮＦをコードする核酸配列を含む発現カセットの部分として挿入されうる。
【００２１】
本発明のアデノウイルスベクターはまた、ＴＮＦをコードする核酸配列の他に、発現されるべき他の核酸配列を含みうる。更なる核酸配列は、ＴＮＦの発現を制御する同じプロモーター／エンハンサー配列の転写制御下にありうるか、又は、他のプロモーター／エンハンサー配列の転写制御下にありうる。本発明により使用できる他の核酸配列としては、他のサイトカイン、アポトーシス因子、細胞増殖抑制剤、及びＴＮＦと共に有利に発現されうる他の分子（例えば、ＴＮＦ存在下で相乗効果を有する分子）をコードする核酸配列が挙げられるが、それらに限定されない。このような他のサイトカイン、アポトーシス因子、細胞増殖抑制剤及びそれらをコードする核酸は当該分野で公知であり、それらとしては、例えば、ｐ５３、Ｆａｓ、Ｆａｓリガンド、デスドメインを有するＦａｓ関連蛋白質（ＦＡＤＤ）、カスパーゼ−３、カスパーゼ−８（ＦＬＩＣＥ）、カスパーゼ−１０、Ａｐｏ２Ｌ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−Ｒ１、ＩκＢ、ΔＩκＢ、デスドメインを有する、レセプター相互作用蛋白質（ＲＩＰ）関連ＩＣＨ−１／ＣＥＤ−３−相同蛋白質（ＲＡＩＤＤ）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＤＲ４、ＤＲ５、Ｎ末端欠失を含むＢｃｌ−２の細胞死誘導コード配列、Ｎ末端欠失を含むＢｃｌ−ｘの細胞死誘導コード配列、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｉｄ、Ｂａｄ、Ｂｉｋ、Ｂｉｆ−２、ｃ−ｍｙｃ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＰＣＫキナーゼ、ＡＫＴキナーゼ、Ａｋｔ／ＰＩ（３）−キナーゼ、PITSLRE、デス関連蛋白質(DAP)キナーゼ、RIP、JNK/SAPK、Daxx、NIK、MEKK1、ASK1、PKR、及びそれらの変異体 (例えば、それらのドミナントネガティブ変異体及びそれらのドミナントポジティブ変異体)、及びそれらのフラグメント（例えば、それらの活性ドメイン）、並びにそれらの組合せが挙げられる。アポトーシス、細胞毒性、及び細胞増殖抑制の転写因子は、本発明と関連して使用でき、それらとしては、例えば、Ｅ２Ｆ転写因子及びその合成細胞周期非依存性形態、ＡＰ１転写因子、ＡＰ２転写因子、ＳＰ転写因子（例えば、ＳＰ１転写因子）、ヘリックス−ループ−ヘリックス転写因子、ＤＰ転写因子（例えば、ＤＰ１、ＤＰ２及びＤＰ３）、及びそれらの変異体 (例えば、それらのドミナントネガティブ変異体及びそれらのドミナントポジティブ変異体)、及びそれらのフラグメント（例えば、それらの活性ドメイン）、並びにそれらの組合せが挙げられる。アポトーシス、細胞毒性、及び細胞増殖抑制のウイルス蛋白質としては、例えば、アデノウイルスＥ１Ａ産物、アデノウイルスＥ４／ＯＲＦ６／７産物、アデノウイルスＥ４／ＯＲＦ４産物、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）産物（例えば、ＣＭＶ−チミジンキナーゼ（ＣＭＶ−ＴＫ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）産物（例えば、ＨＳＶ−ＴＫ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）産物（例えば、ＨＰＶＸ）、及びそれらの変異体 (例えば、それらのドミナントネガティブ変異体及びそれらのドミナントポジティブ変異体)、及びそれらのフラグメント（例えば、それらの活性ドメイン）、並びにそれらの組合せが挙げられる。
【００２２】
スペーサーエレメント
本発明のアデノウイルスベクターは、多重複製欠損の場合、好ましくは、単一複製欠損アデノウイルスベクター、特に、単一複製欠損Ｅ１-アデノウイルスベクターによって達成されるウイルス増殖と同様の補完性細胞株でのウイルス増殖を提供するためにスペーサーエレメントを含む。スペーサーの非存在下、多重複製欠損アデノウイルスベクターのファイバー蛋白質の産生及び／又はウイルス増殖は、単一複製欠損アデノウイルスベクターのそれと比較して減少している。しかし、欠損アデノウイルス領域の少なくとも１つ、好ましくは、図１Ｂ（１８）に示されるＥ４領域にスペーサーを含めると、増殖及びファイバー発現におけるこの欠陥が中和される。
【００２３】
Ｌ５ファイバー領域が保持されている、本発明の好適なＥ４-アデノウイルスベクターにおいて、スペーサーは望ましくは、Ｌ５ファイバー領域と右側ＩＴＲの間に存在する。より好ましくは、このようなアデノウイルスベクターにおいて、Ｅ４ポリアデニル化配列は、単独で又は最も好ましくは別の配列との組合せにおいて、保持されたＬ５ファイバー領域が右側ＩＴＲから十分に分離されるようにＬ５ファイバー領域と右側ＩＴＲの間に存在し、その結果、このようなベクターのウイルス産生が、単一複製欠損アデノウイルスベクター、特に、単一複製欠損Ｅ１-アデノウイルスベクターのウイルス産生に近づく。アデノウイルスベクターにおけるスペーサーの使用は、米国特許第5,851,806号に記載されている。
【００２４】
ゲノムの複製欠損領域の機能は、補完性細胞株によって提供されうるので、スペーサーエレメントは欠損機能を提供する必要はなく、任意の配列でありうる。即ち、スペーサーエレメントは、ベクターが収容するインサートのサイズのみによって限定される。スペーサーエレメントは、任意の適切なサイズ、望ましくは、少なくとも約１５塩基対（例えば、約１５〜約１２，０００塩基対）、好ましくは、約１００〜約１０，０００塩基対、より好ましくは、約５００〜約８，０００塩基対、より一層好ましくは、約１，５００〜約６，０００塩基対、最も好ましくは、約２，０００〜約３，０００塩基対でありうる。
【００２５】
スペーサーエレメントは、所望の長さの任意の配列（単数又は複数）を含みうる。スペーサーエレメント配列は、コード又は非コードでありえ、また、アデノウイルスゲノムに関し天然又は非天然でありえるが、欠損領域に複製機能を回復させない。スペーサーエレメントはまた、プロモーター可変発現カセットを含みうる。より好ましくは、スペーサーエレメントは、更なるポリアデニル化配列及び／又は外来遺伝子を含む。好ましくは、Ｅ４を欠損する領域中に挿入されるスペーサーエレメントの場合、Ｅ４ポリアデニル化配列及びアデノウイルスゲノムのＥ４プロモーター又は任意の他の（細胞若しくはウイルス）プロモーターは、ベクター中にとどまる。このような実施態様において、スペーサーエレメントは、Ｅ４ポリアデニル化部位とＥ４プロモーターとの間に存在するか、あるいはＥ４プロモーターがベクターに存在しなければ、スペーサーエレメントは右側ＩＴＲに近位である。
【００２６】
スペーサーエレメントは、任意の適切なポリアデニル化配列を含みうる。適切なポリアデニル化配列の例としては、合成最適化配列、並びにＢＧＨ（ウシ成長ホルモン）、ポリオーマウイルス、ＴＫ（チミジンキナーゼ）、ＥＢＶ（エプスタイン−バー・ウイルス）、及びヒトパピローマウイルスとＢＰＶ（ウシパピローマウイルス）を含むパピローマウイルスのポリアデニル化配列が挙げられる。好ましくは、特に、Ｅ４欠損領域において、スペーサーエレメントは、ＳＶ４０（ヒト肉腫ウイルス−４０）ポリアデニル化配列を含む。ＳＶ４０ポリアデニル化配列は、多重複製欠損アデノウイルスベクターのより高いウイルス産生レベルを可能とする。
【００２７】
外来遺伝子（例えば、コード領域）はまた、アデノウイルスゲノムのＥ４欠損領域におけるスペーサーエレメントとして機能しうる。外来遺伝子は、ベクターが収容できるフラグメントのサイズによってのみ限定され、任意の適切な遺伝子でありうる。適切な外来遺伝子の例としては、ｐＧＵＳ、分泌性アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、Ｂ−ガラクトシダーゼ、及びヒト抗−トリプシンなどのマーカー遺伝子配列；治療遺伝子；Ｂ３−１９Ｋ、Ｅ３−１４．７、ＩＣＰ４７、ｆａｓリガンド遺伝子、及びＣＴＬＡ４遺伝子などの可能性ある免疫調節因子；生物不活性配列（例えば、産物を産生するようには転写されないであろう配列、又は欠陥のある若しくは生物学的に不活性な産物をコードする配列）、並びにグルクロニダーゼ遺伝子などの他の無害の配列が挙げられる。トランス活性化因子をコードする遺伝子も、Ｅ４領域におけるスペーサーエレメントとして使用できる。好ましくは、トランス作用因子をコードする遺伝子は、アデノウイルス由来ではない。アデノウイルス由来ではないトランス作用因子の例としては、pTP、HSV ICP0、CMV UL84、VZV-ORF61、PRV-EP0、CMV-IE1、CMV-IE2、CMV-IE86、HIV-tat、HTLV-tax、HBV-X、AAV-Rep 78、HSV ICP0のように機能する U20S骨肉腫細胞株由来の細胞性因子、並びに神経成長因子によって誘導されるPC12 細胞における細胞性因子が挙げられる。アデノウイルス由来ではない好適なトランス作用因子は、HSV ICP0である。トランス作用因子をコードする遺伝子としては好ましくは、アデノウイルスＥ４プロモーターが挙げられる。
【００２８】
ベクター構築
本発明は、（ａ）アデノウイルスゲノムのＥ４領域において欠損しているアデノウイルスゲノムを提供すること、（ｂ）ＴＮＦをコードする核酸配列をアデノウイルスゲノムに挿入すること、及び（ｃ）ＴＮＦをコードする核酸配列に作動可能に連結されるように、放射線誘導性プロモーターをアデノウイルスゲノムに挿入すること、を含むアデノウイルスベクターの製造方法を提供する。本発明はまた、（ａ）アデノウイルスゲノムのＥ４領域において欠損しているアデノウイルスゲノムを提供すること、（ｂ）ＴＮＦをコードする核酸配列をアデノウイルスゲノムに挿入すること、及び（ｃ）アデノウイルスゲノムのＥ４領域にスペーサーエレメントを挿入すること、を含むアデノウイルスベクターの製造方法を提供する。当業者が理解するように、本発明によって提供される方法は、アデノウイルスベクターを提供するために使用されるアデノウイルスゲノム中への他の核酸配列の挿入、又は該アデノウイルスゲノムからのこのような配列の欠失などの他の工程又は構成要素を含みうる。更に、本発明の方法の種々の局面（例えば、アデノウイルスゲノム、ＴＮＦをコードする核酸配列、放射線誘導性プロモーター、スペーサーエレメントなど）は、本発明のアデノウイルスベクターに関し本明細書で上記したとおりである。
【００２９】
アデノウイルスベクターの本発明の製造方法は、当業者に公知の技術を用いて行うことができる。一般的に、ウイルスベクター構築は、細胞内のアデノウイルス核酸配列間の高レベルの組換えに依存する。配列間で類似性を有する（又は重複する）領域を含み、かつゲノムの完全長を構成する２又は３の別々のアデノウイルス核酸配列（例えば、ＤＮＡフラグメント）を細胞にトランスフェクトする。宿主細胞の組換えマシーナリーは、上記配列の組換えを行なうことによって、完全長ウイルスベクターゲノムを構築する。種々の単一領域中に改変を含むウイルスの構築のための他の適切な方法は、以前に記載されており（Berkner ら, Nucleic Acids Res., 12, 925-941 (1984); Berkner ら, Nucleic Acids Res., 11, 6003-6020 (1983); Brough ら, Virol., 190, 624-634 (1992)）、そして多重欠損ウイルスを構築するために使用できる。更に他の適切な方法としては、例えば、インビトロ組換え及び連結、並びに米国特許第5,965,358号及び国際特許出願WO 98/56937, WO 99/15686, 及び WO 99/54441で開示される方法が挙げられる。
【００３０】
本発明のアデノウイルスベクターの好適な構築方法は、初めに、アデノウイルスゲノムの特定の領域の必要な欠失又は改変（欠失領域へのスペーサーエレメントの付加など）を構築することを含む。このような改変は、例えば、標準的分子生物学技術を用いて、プラスミドカセットで行うことができる。次いで、変更された核酸配列（欠失又は改変を含む）は、アデノウイルスゲノムの１／２までを含むずっと大きなプラスミドに移され、改変されたアデノウイルスゲノムを含むベースプラスミドが提供される。次の工程は、改変されたアデノウイルスゲノムの所望の領域内に発現カセットを挿入することである。発現カセットは、当該分野で公知の標準的方法によって、例えば、プラスミドからカセットを単離することによって、提供されうる。次いで、単離されたカセットは、プラスミドＤＮＡ（改変アデノウイルスゲノムを含む）と共にレシピエント細胞内にトランスフェクトされうる。プラスミドは必要に応じて、アデノウイルスゲノム内の所望の位置での発現カセットの挿入を容易にするために、トランスフェクション前に、適切な制限酵素による消化によって線状化される。適切な制限酵素の選択は、当業者の技術内に十分ある。ＤＮＡの２断片が組換えられ、改変アデノウイルスゲノムと発現カセットを含むプラスミドが形成される。プラスミドは宿主細胞から単離され、組換えられたウイルスゲノムの失われたウイルス機能を補うレシピエント細胞に導入され、改変ウイルスゲノムと発現カセットを含むアデノウイルスベクターが産生される。ベクターは、ＩＴＲ及び／又はパッケージングシグナルの変更によって更に改変されうる。
【００３１】
補完性細胞株
本発明の複製欠損アデノウイルスベクターの増殖又は成長のための補完性細胞株は、公知であり、米国特許第5,851,806号, WO 95/34671, 及びBrough ら, Virol., 70, 6497-6501 (1996)に詳細に記載されている。好適な細胞株は、アデノウイルスベクターから失われたウイルス複製に必須の遺伝子のうちの少なくとも１つの遺伝子機能、好ましくは、少なくとも２つの遺伝子機能（例えば、アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ２及びＥ４領域を含む遺伝子機能）を補うことにより特徴付けられる。他の細胞株としては、後期領域を含む遺伝子機能から少なくとも１つの遺伝子機能を欠損するアデノウイルスベクターを補うもの、初期及び後期遺伝子機能の組合せを補うもの、並びに全てのアデノウイルス機能を補うものが挙げられる。選択される細胞株は、問題の組換え複製欠損アデノウイルスベクターから失われた機能を特異的に補い、かつ標準的な分子生物学技術を用いて産生されるものであることを当業者は理解しよう。細胞株は更に、非重複様式で、補完性遺伝子（complementing gene）を含むことにより特徴付けられ、このことは、ベクターゲノムが細胞ＤＮＡと組換えする可能性を最小にし、かつ実質的に除去する。従って、複製能のあるアデノウイルスは、ベクターストックに存在せず、それ故、特定の治療の目的、特に、遺伝子治療の目的に適切である。これはまた、非補完性細胞でのアデノウイルスの複製を回避する。
【００３２】
補完性細胞株は、組換えアデノウイルスベクターの高力価ストックを作製するために、欠損アデノウイルス遺伝子機能の産物を、それらの産物について適切なレベルで発現できるものでなければならない。例えば、アデノウイルスＤＮＡ複製については、化学量論的レベルで、即ち、比較的高レベルで、Ｅ２Ａ産物であるＤＢＰを発現することが必要とされるが、アデノウイルスＤＮＡ複製については、Ｅ２Ｂ産物であるＡｄ ｐｏｌは、ほんの触媒レベルで、即ち、比較的低レベルで必要とされる。組換えアデノウイルスベクターの高力価ストックを確保するためには、産物のレベルが適切でなければならないのみでなく、産物の一時的発現が、細胞の通常のウイルス感染で見られるものと一致しなければならない。例えば、ウイルスＤＮＡ複製に必要な成分は、ビリオンアッセンブリー（virion
assembly）に必要な成分の前に発現されねばならない。ウイルス産物の高レベル発現にしばしば付随する細胞毒性を避けるために、並びに産物の一時的発現を制御するために、誘導性プロモーター系が使用される。例えば、ヒツジメタロチオナイン誘導性プロモーター系が、完全なＥ４領域、Ｅ４領域のオープン・リーディング・フレーム６、及びＥ２Ａ領域を発現させるために使用されうる。適切な誘導性プロモーター系の他の例としては、細菌ｌａｃオペロン、テトラサイクリンオペロン、Ｔ７ポリメラーゼ系、並びに真核生物及び原核生物の転写因子の組合せ及びキメラ構築物、リプレッサー、並びに他の成分が挙げられるが、それらに限定されない。発現されるウイルス産物が非常に毒性である場合、インデューサーがウイルスベクターに運ばれ、誘導産物が補完性細胞株のクロマチン内に運ばれるという２段階からなる誘導系を使用することが望ましい。テトラサイクリン発現系及びｌａｃ発現系などの抑制性／誘導性発現系もまた使用できる。
【００３３】
使用方法
本発明は、宿主の腫瘍又は癌の治療方法であって、本発明のアデノウイルスベクターの抗癌又は抗腫瘍有効量をその必要のある宿主に投与することを含む方法を提供する。
治療又は予防目的（例えば、遺伝子治療、ワクチン接種など）のために、動物に本発明の複製欠損アデノウイルスベクターを投与する適切な方法（例えば、Rosenfeld ら, Science, 252, 431-434 (1991), Jaffe ら, Clin. Res., 39(2), 302A (1991), Rosenfeld ら, Clin. Res., 39(2), 311A (1991), Berkner, BioTechniques, 6, 616-629 (1988)参照）が利用でき、そしてベクターを投与するために２以上の経路が使用できるが、別の経路よりも特定の経路がより迅速かつより効果的な反応を提供しうることを当業者は理解しよう。例えば、アデノウイルスベクターは、例えば、腫瘍内に又は腫瘍部位近傍に直接的に注射することによって、宿主の特定の組織に直接的に投与できる。あるいは、アデノウイルスベクターは、静脈投与などによって宿主に全身的に投与できる。
【００３４】
本発明は、本発明のアデノウイルスベクター、及び担体、特に、医薬として許容できる（例えば、生理的又は薬理的に許容できる）担体（例えば、賦形剤又は希釈剤）を含む医薬組成物を提供する。医薬として許容できる担体は、当業者周知であり、容易に利用できる。担体の選択は、部分的には、医薬組成物を投与するのに使用される特定の方法によって決定されよう。それ故、本発明の医薬組成物の種々の適切な製剤がある。以下の製剤及び方法は単に例示であって、決して限定的ではない。しかし、経口製剤、注射製剤及びエアロゾル製剤が好適である。
【００３５】
経口投与に適した製剤は、（ａ）水、生理食塩水、又はオレンジジュースなどの希釈剤に溶解した有効量の化合物などの液体溶液；（ｂ）カプセル、サッシェ又は錠剤（各々は、固体又は顆粒として所定量の活性成分を含む）；（ｃ）適当な液体中の懸濁液；及び（ｄ）適切なエマルション；からなりうる。錠剤形態は、ラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、結晶性セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド性二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、並びに他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、フレーバー剤、及び薬理的に適合性のある賦形剤のうちの１つ以上を含む。ロゼンジ形態は、フレーバー中に、通常は、スクロース及びアカシア又はトラガカント中に活性成分を含むことができ、そして香錠は、ゼラチンやグリセリン又はスクロースやアカシアなどの不活性基剤中に活性成分を含み、エマルジョン、ゲルなどは、活性成分の他に、当該分野で公知の賦形剤を含む。
【００３６】
本発明のベクターは、単独で又は他の適切な成分と組合せて、吸入により投与されるエアロゾル製剤に製造されうる。これらのエアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容できる噴射剤中に入れられうる。それらはまた、ネブライザー又はアトマイザーなどの非加圧製剤用の医薬として製剤化できる。
【００３７】
非経口投与に適した製剤は、水溶性及び非水溶性で等張性の滅菌注射溶液（該溶液は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び製剤を意図されたレシピエントの血液と等張にする溶質を含みうる）、並びに懸濁剤、溶解剤、増粘剤、安定化剤、及び保存剤を含みうる水溶性及び非水溶性の滅菌懸濁液を含む。製剤は、単位投与量又は複数回投与量の密封容器（例えば、アンプルやバイアル）で提出され得、そして使用直前に、注射用滅菌液体賦形剤（例えば、水）の添加のみを必要とする凍結乾燥（凍結乾燥）状態で保存できる。即時調合注射溶液及び懸濁剤は、滅菌粉末、顆粒、及び上記種類の錠剤から製造できる。適切な製剤は、例えば、ＷＯ 00/34444及び米国特許第6,225,289号に記載されている。
【００３８】
更に、本発明で使用されるベクターは、乳化基剤や水溶性基剤などの種々の基剤と混合することによって坐剤として製造されうる。膣投与に適した製剤は、活性成分の他に、適切であるということが当該分野で公知の担体などを含む、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム(foam)又はスプレー製剤として提供されうる。
【００３９】
本発明の文脈では、動物（特に、ヒト）に投与される投与量は、特定のアデノウイルスベクター、アデノウイルスベクターを含む組成物、投与方法、及び治療される特定の部位や生物に応じて変動しよう。投与量は、所望の時間枠内で、所望の応答（例えば、治療又は予防応答）を生じるのに十分であるべきである。典型的な投与量は、ベクターに関して、少なくとも約1×105粒子単位 (pu) (例えば、少なくとも約1×106 pu)、好ましくは少なくとも約1×107 pu (例えば、少なくとも約1×108 pu)を含むであろう。より大きい投与量も使用できる。例えば、少なくとも約1×109 pu（例えば、少なくとも約1×1010 pu）、又は少なくとも約1×1011 puさえも（例えば、少なくとも約1×1012 pu）、あるいは少なくとも約1×1013 pu（例えば、少なくとも約1×1014 pu）のような一層大きい投与量である。一般的に、投与量は、約1×105〜1×1014 pu (例えば、1×107〜1×1013 pu)、好ましくは 1×108〜1×1012 pu（例えば 1×109〜1×1011 pu）であろう。
【００４０】
宿主における腫瘍又は癌を治療する本発明の方法は、その有効性を改変（例えば、増大）するために、他の治療及び／又は薬剤の投与（即ち、前投与、共投与、及び／又は後投与）を更に含みうる。例えば、本発明のアデノウイルスベクター、特に、放射線誘導性プロモーターと作動可能に連結しているＴＮＦをコードする核酸配列を含むベクターは、放射線投与と一緒に投与されうる。放射線は、任意の適切な方法で、例えば、放射線（例えば、赤外線）の外部源に曝すことによって、又は放射線の内部源の使用によって（例えば、放射線源の化学的又は手術的投与によって）投与されうる。例えば、本発明のアデノウイルスベクターは、近接照射療法（放射線活性源を腫瘍内又は腫瘍近傍に配置（移植）し、局在化された高投与量の放射線を送達する）と一緒に使用できる。放射線は望ましくは、宿主で治療レベルのＴＮＦの産生を誘導するのに十分な投与量で投与される。
【００４１】
本発明の方法は、放射線投与に加えて又は放射線投与の代わりに、インビボでのＴＮＦ効果を局所的又は全身的に変化（即ち、減少又は増大）させる他の物質の投与を更に含みうる。例えば、宿主で発現する全身的毒性のレベルを制御するために、ＴＮＦの全身的効果を減少させる物質を使用できる。同様に、宿主で予防又は治療効果を生じさせるために必要なＴＮＦのレベルを減少させるために、ＴＮＦの局所効果を増大させる物質を使用できる。このような物質としては、ＴＮＦアンタゴニスト（例えば、可溶性ＴＮＦレセプター又は抗ＴＮＦ抗体）及びＴＮＦアゴニストが挙げられる。ＴＮＦの効果を変化させる他の適切なアンタゴニスト、アゴニスト、及び他の物質が利用でき、そして一般的に当該分野で公知である。
【００４２】
本発明の複製欠損アデノウイルスベクターはまた、インビトロで有用性を有する。例えば、それらは、アデノウイルス遺伝子機能及びアッセンブリー、ＴＮＦの産生、又は適切な標的細胞での他の外来核酸配列の発現を研究するために使用されうる。当業者は、アデノウイルスベクターをトランスフェクトし、それによって挿入されたアデノウイルス核酸配列相補物の発現が生じる細胞を選択することによって、適切な標的細胞を同定できる。好ましくは、細胞へのアデノウイルスの結合と侵入のためのレセプターを有する適切な標的細胞が選択される。このような細胞としては、任意の哺乳動物を起源として単離されたものを含むが、それに限定されない。一旦、適切な標的細胞が選択されると、標的細胞を本発明のアデノウイルスベクターと接触させることによって、それぞれトランスフェクション又は感染が起こる。次いで、標的細胞での発現、毒性、及びＴＮＦをコードする核酸配列又は他の外来核酸配列の挿入及び活性に関する他のパラメーターが、当該分野で周知の従来の方法を用いて測定される。例えば、本発明のアデノウイルスベクターは、他の細胞分子に対するＴＮＦの相互作用とターゲティングを研究するために使用されうる。このようにすることにより、研究者は、アデノウイルス感染に関する現象論、並びに種々の生物から外植され、かつ組織培養で研究される種々の細胞型において、アデノウイルスベクターによって導入される種々の外来核酸配列の発現の効力及び効果を学び、解明することができる。
【００４３】
更に、本発明の文脈において、遺伝子治療によって適切に治療される疾患を有する患者から外植された又は取り出された細胞は、インビトロで有用に操作される。例えば、このような個体由来のインビトロで培養された細胞は、トランスフェクションを生じる適切な条件下（当業者によって容易に決定される）、本発明のアデノウイルスベクターとの接触下に置かれる。このような接触により適切に、培養細胞へのベクターのトランスフェクションが生じ、トランスフェクトされた細胞は、適切なマーカー及び選択的培養条件を用いて選択される。このようにすることにより、細胞の生命力を試験し（即ち、毒性を測定し）、かつ本発明のベクターの外来核酸配列の遺伝子産物の存在を試験する（即ち、発現を測定する）標準的方法を用いて、個体の細胞は、本発明のベクターとの適合性、該ベクターでの発現、及び該ベクターの毒性について試験され、それによって、そのように試験されるベクター系による個体の治療の適切性及び効力に関する情報が提供される。このように外植かつトランスフェクトされた細胞はまた、所定の遺伝子治療レジメンの潜在的効力／毒性を試験するのに役立つことに加えて、個体体内のインビボ位置に戻されうる。個体にそのように戻されるこのような細胞は、そのインビトロトランスフェクションを除いて、未変化のありのまま戻され得るか、又は個体身体の他の組織及び細胞からそれらを分離させておくマトリックスに包まれ得るか、若しくは該マトリックス中に包埋され得る。このようなマトリックスは、コラーゲン、セルロースなどを含む任意の適切な生体適合性材料でありうる。勿論、あるいは又はさらに、好ましくは、インビトロ試験への陽性応答後、本明細書中で先に詳述された投与手段によって、トランスフェクションがインビボで実施されうる。
【００４４】
本発明の更なる局面
当業者が理解するように、本発明によって提供されるアデノウイルスベクター及びアデノウイルスベクターに関する方法は、本明細書記載のエレメントの組合せ又は置換を含みうる。このような好適な形状のエレメントを有するベクターは、図１Ｂによって模式的に表される。更に、このような形状のエレメントを有するベクターは、配列番号１の核酸配列を含むベクター、該核酸配列から本質的になるベクター、又は該核酸配列からなるベクターによって提供される。しかし、本発明では、例示的な核酸配列の多くの改変及びバリエーションが可能である。例えば、遺伝暗号の縮重は、コードされたポリペプチドのコード配列を変化させることなく、ポリペプチドコード領域にわたる、並びに翻訳停止シグナルでのヌクレオチドの置換を可能とする。このような置換可能な配列は、所定の遺伝子の公知のアミノ酸配列又は核酸配列から推定され得、そして通常の合成又は部位特異的変異誘発方法によって構築され得る。合成ＤＮＡ方法は、Itakuraら, Science, 198, 1056-1063 (1977年), 及びCreaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 5765-5769 (1978年)の方法に実質的に従って行われ得る。部位特異的変異誘発方法は、Maniatisら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (第２版, 1989年)に記載されている。それ故、本発明は、本明細書中で特に例示された核酸配列に決して限定されるものではない。例示されたベクターは腫瘍及び／又は癌の遺伝子治療用であり、それ故、ＴＮＦ遺伝子を含みかつ発現する。しかし、記載されたベクターはまた、他の同様の又は異なる疾患及び／又は病気を治療するために使用される遺伝子を含みうる。このような疾患及び／又は病気としては、他の慢性肺疾患（例えば、肺気腫、喘息、成人呼吸促進症候群、及び慢性気管支炎）、並びに冠動脈性心疾患、及び遺伝子治療、ワクチン接種などによって適切に治療又は予防される他の病気が挙げられるが、それらに限定されない。それ故、任意の遺伝子又は核酸配列が、アデノウイルスＴＮＦベクターに挿入されうる。
【００４５】
アデノウイルスベクターは、本発明の範囲及び思想を逸脱することなく他の様式に改変されうる。例えば、本発明のアデノウイルスベクターのコート蛋白質は、可能性ある宿主細胞上のウイルスレセプターに対するウイルスの結合特異性又は認識を変化させるように操作されうる。このような操作としては、ファイバー、ペントン又はヘキソンの領域の欠失、コート蛋白質部分への種々の天然又は非天然リガンドの挿入などを挙げることができる。コート蛋白質の操作は、ウイルスベクターが感染する細胞の範囲を拡張しうるか、又は特定の細胞型へのウイルスベクターのターゲティングを可能としうる。
【００４６】
例えば、ベクターは、好ましくは、アミノ末端又はカルボキシル末端での又はその近傍での、非天然アミノ酸配列の導入によって、野生型（即ち、天然）コート蛋白質とは異なるキメラコート蛋白質（例えば、ファイバー（カルボキシル末端、ＨＩループ、又は他のループ）、ヘキソン、ｐＩＸ、ｐＩＩＩａ、又はペントン蛋白質）を含みうる。好ましくは、非天然アミノ酸配列が、内部コート蛋白質配列中に、又は該配列の代わりに挿入される。結果として得られるキメラウイルスコート蛋白質は、好ましくは、キメラウイルスコート蛋白質ではなく野生型ウイルスコート蛋白質を含むことを除き同一であるアデノウイルスベクターの細胞内への侵入よりも効率的に、コート蛋白質を含むアデノウイルスベクターの細胞内への侵入を指向し得る。キメラウイルスコート蛋白質は望ましくは、細胞表面に存在する新規な内因性結合部位と結合する。侵入効率のこの増大は、アデノウイルスが、選択された細胞型（野生型コート蛋白質を含むウイルスが典型的には侵入できないか、又はほんの低効率でしか侵入できないもの）に結合し、かつ侵入し得るという結果につながる。
【００４７】
本発明の好適なベクターは、リジン及び／又はアルギニン残基からなる非天然ポリアミノ酸配列を含むファイバー蛋白質を含む。ポリアミノ酸配列は一般的には、３〜３０アミノ酸残基、好ましくは５〜２０アミノ酸残基、より好ましくは５〜１０アミノ酸残基を含む。より好ましくは、非天然ポリアミノ酸配列は、ファイバー蛋白質のＨＩループに、又はファイバー蛋白質のカルボキシル末端に存在する。ポリアミノ酸配列が、ファイバー蛋白質のカルボキシル末端に存在するとき、ファイバー蛋白質は更に、野生型ファイバー配列のカルボキシル末端に、少なくとも５アミノ酸（例えば、約５〜１５アミノ酸）、より好ましくは少なくとも約７アミノ酸（例えば、約７〜１０アミノ酸）のスペーサーエレメントを含むことが好ましい。典型的なスペーサーとしては、交互のグリシン及びセリン残基、リジン残基の繰り返し、又はそれらの混合物が挙げられる。
【００４８】
あるいは、本発明のアデノウイルスベクターは、真核細胞の特定型に選択的ではないキメラウイルスコート蛋白質を含みうる。このようなキメラコート蛋白質は、内部コート蛋白質配列中に又は該配列の代わりに、非天然アミノ酸配列が挿入されていることによって野生型コート蛋白質とは異なる。非選択的キメラコート蛋白質を含むベクターにおいて、ウイルスコートは、国際特許出願ＷＯ 97/20051に記載されるように、野生型ウイルスコートよりも広い範囲の真核細胞に効率的に結合する。
【００４９】
所定の細胞へのアデノウイルスの結合特異性もまた、米国特許第5,962,311号で考察されるように、短いシャフトのアデノウイルスファイバー遺伝子を含むアデノウイルスの使用によって調節されうる。短いシャフトのアデノウイルスファイバー遺伝子を含むアデノウイルスの使用は、アデノウイルスファイバーの細胞表面レセプターへのアデノウイルスファイバー結合のレベル又は効率を減少させ、かつアデノウイルスペントンベースの細胞表面レセプターへのアデノウイルスペントンベース結合を増大させ、それによって、所定の細胞へのアデノウイルスの結合特異性を増大させる。あるいは、短いシャフトのファイバーを含むアデノウイルスの使用は、ペントンベース又はファイバーノブへの非天然アミノ酸配列の導入によって、所望の細胞表面レセプターへのアデノウイルスのターゲティングを可能とする。
【００５０】
更に、ウイルスベクターが可能性ある宿主細胞を認識する能力は、コート蛋白質を遺伝子操作することなく調節されうる。例えば、ペントンベース結合ドメインと特定の細胞表面結合部位を選択的に結合するドメインとを含む２重特異的分子と、アデノウイルスを複合体化することにより、当業者による特定の細胞型へのベクターの標的化が可能となる。
【００５１】
ウイルスベクター、特にアデノウイルスベクターに対する多くの改変は、当該分野で公知である。アデノウイルスベクターについての適切な改変としては、米国特許第5,559,099号; 同第5,731,190号; 同第5,712,136号; 同第5,770,442号; 同第5,846,782号; 同第5,926,311号; 同第5,965,541号; 同第6,057,155号; 同第6,127,525号; 同第6,153,435号; 並びに国際特許出願WO 96/07734, WO 96/26281, WO 97/20051, WO 98/07865, WO 98/07877, WO 98/54346, 及びWO 00/15823に記載されている改変が挙げられる。
【００５２】
以下の実施例は、本発明を更に説明するが、勿論、その範囲を制限するものとは解釈すべきではない。実施例で言及される酵素は、異なるように記載していなければ、Bethesda Research Laboratories (BRL), Gaithersburg, Maryland, New England Biolabs Inc. (NEB), Beverly, Massachusetts, 又は Boehringer Mannheim Biochemicals (BMB), Indianapolis, Indianaから入手でき、製造業者の推奨に実質的に従って使用される。本明細書中で使用される技術の多くは、当業者周知である。分子生物学技術は、適切な実験室マニュアル、例えば、Maniatisら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (第２版, 1989年), 及びCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubelら（編）(1987年))に詳細に記載されている。
【実施例】
【００５３】
実施例１
以下の実施例は、本発明に従ってのアデノウイルスベクターの製造を示す。Ｅ１、Ｅ３及びＥ４領域に欠損を有する５型アデノウイルスゲノム（Ｅ３領域は完全欠失であり、Ｅ４領域はＳＶ４０ポリアデニル化配列を含んでいた）を含む第１プラスミド（ベースプラスミド）を製造した。ＴＮＦ−αをコードする核酸配列に作動可能に連結したＥｇｒ−１放射線誘導性プロモーターを有する発現カセットを含む第２プラスミド（ドナープラスミド）を製造した。ドナープラスミドを、Ｄｒｄ−Ｉ制限エンドヌクレアーゼで消化し、Ｅｇｒ−Ｉ／ＴＮＦ−α発現カセットを含む約６．５ｋｂｐの核酸セグメントをゲル電気泳動で単離した。ベースプラスミドを、Ｓｗａ−Ｉ制限エンドヌクレアーゼを用い消化し、線状化プラスミドを脱リン酸化した。６．５ｋｂｐ（約）ドナープラスミドフラグメント５０ｎｇと、線状化ベースプラスミド５０ｎｇで、コンピテントE.coli BJIq細胞を形質転換した。形質転換細胞を、カナマイシン５０μｇ／μｌとテトラサイクリン５０μｇ／μｌを含むルリア／ＳＯＣブロスプレートに播いた。得られたコロニーを組換え体につきスクリーニングし、陽性組換え体をルリアブロス／カナマイシンプレートで増殖させた。
【００５４】
形質転換されたE.coli BJIq細胞から、標準的技術によって、組換えプラスミドＤＮＡを単離した。標準的方法を用いて、単離したプラスミドＤＮＡを、Ｐａｃ−Ｉ制限エンドヌクレアーゼによる消化によって線状化し、線状化プラスミドＤＮＡを、２９３−ＯＲＦ６細胞（２９３ヒト胎児腎細胞由来）（Ｅ１及びＥ４欠損を補う）にトランスフェクトし、配列番号１の配列を有するアデノウイルスＥｇｒ−Ｉ／ＴＮＦ−αＥ１-，Ｅ３-，Ｅ４-ベクターを産生した。
【００５５】
実施例２
以下の実施例は、宿主における腫瘍の治療又は予防のための、本発明に従って製造されたアデノウイルスベクターの使用を示す。
放射線耐性ヒト扁平上皮（squameous）腫瘍細胞株（ＳＱ−２０Ｂ）異種移植腫瘍を有する８匹のヌードマウスを各々含む３つの治療群を確立した。第１治療群は、０、４、７、１１日目に、５つの部位（各腫瘍の周辺に注射を４回及び各腫瘍の中心に注射を１回）で腫瘍組織中に直接的に注射することによって、実施例１のアデノウイルス粒子を５×１０10粒子単位（ＰＵ）の投与量（ウイルス緩衝液を含めると総容積３２μｌ）で受けた。第２治療群は、０〜４、７〜９日目に、投与されたアデノウイルスベクターの同じ投与量を受けるとともに、腫瘍が赤外線５Ｇｙ（合計４０Ｇｙの放射線）に曝された。第３治療群は赤外線のみを受けた。
【００５６】
第１治療群では、顕著な腫瘍退縮が４日目までに観察されたが、第２治療群では、１１日まで退縮は観察されなかった。１１日目に、第１治療群の１匹の動物と、第２治療群の３匹の動物は目視可能な腫瘍を有さなかった。６２日後、第２治療群の８匹全てのマウスは治癒し（即ち、目視可能な腫瘍は存在しなかった）、一方、第１群の６匹のマウスは治癒し、第３群（ベクター無し）の１匹のみ治癒した。
本実施例の結果は、本発明のアデノウイルスベクターが、宿主の腫瘍を治療するために首尾良く使用されうることを示す。
【００５７】
実施例３
以下の実施例は、宿主における腫瘍の治療又は予防のための、本発明に従って製造されたアデノウイルスベクターの使用を示す。
ヌードマウスに、５×１０6のＳＱ−２０Ｂ細胞を皮下注射した。動物の腫瘍が平均容積４７８．２ｍｍ3に達したとき、動物を８〜１０匹の動物からなる６治療群に分け、群１〜６と命名した。治療群１〜６は各々、以下のように異なる治療を受けた。（１）緩衝液のみ、（２）放射線のみ、（３）実施例１のアデノウイルスベクター（本明細書中以降、「ベクター」という）4 x 108 pu、（４）4 x 108 puベクター＋放射線、（５）4 x 109 puベクター、及び（６）4 x 109 puベクター＋放射線。緩衝液又はベクターを、０、３、７、１０日目に腫瘍内に注射した。放射線治療は、合計放射線量５０Ｇｙとなるように、０〜４日目及び７〜１１日目に、腫瘍を担持する右後脚に５Ｇｙを照射することからなっていた。
各実験群のマウスは、無作為化後、研究剤の１回目の接種の前、及びその後は１週毎に体重を計測した。動物は、研究過程中に全く死亡せず、その後も何ら毒性の兆候を示さなかった。どの時点でも、動物の体重において群間で有意な差はなかった。
【００５８】
研究の間、血漿及び腫瘍中のＴＮＦレベルを評価するために、各治療群から３匹のマウスを屠殺した。ヌードマウス中で増殖しているＳＱ−２０Ｂ腫瘍にベクター又は緩衝液を単回腫瘍内投与した後、血漿中のＴＮＦの循環レベルを評価した。選択された群はまた、ベクター注射３時間後を起点として３日間に渡って与えられた１５Ｇｙの放射線を受けた。最後の放射線治療１日後に、ヒトＴＮＦの血漿レベルを酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で評価した（検出下限＜４．４ｐｇ／ｍｌ）。結果を表１に示す。血漿レベルは、放射線とベクター投与の両方で増加した。
【００５９】
【表１】
【００６０】
ＴＮＦ測定のために、血漿を集めた同じ時点に、マウスを安楽死させ、腫瘍を切除し、抽出した。次いで、ＥＬＩＳＡによって、抽出物におけるＴＮＦ発現を定量した。腫瘍で発現したＴＮＦ量を表２に示す。
【００６１】
【表２】
【００６２】
ベクターを注射しなかった腫瘍では、ごくわずかのＴＮＦが検出された。ＴＮＦは、投与量依存様式で、放射線無しのベクターの注射を受けた腫瘍で産生された。ベクターの接種後、３回の５Ｇｙフラクションの放射線を腫瘍に与えたとき、ベクターの両方の投与量群で、ＴＮＦ発現は２倍超であった。更に、ベクター4 x 108 puを注射した腫瘍と比べて、ベクター4 x 109 puを注射した腫瘍では、ＴＮＦ発現は１．７倍大きかった。
【００６３】
残りの動物を６０日間追跡し、次いで屠殺した。結果を図２に示す。図２では、菱形データ点は治療群１を表し、黒四角データ点は治療群２を表し、白三角データ点は治療群３を表し、黒三角データ点は群４を表し、白四角データ点は治療群５を表し、円データ点は治療群６を表す。治療に対する腫瘍応答を解析すると、他の全ての群と比較して、ベクター4 x 109 pu投与量＋放射線群で腫瘍容積がより大きく減少するという傾向が示された。この差異は、研究の終点（５０〜６０日目）で統計学的に有意であった。緩衝液対照群で、この研究で異常な出来事があった。６匹のマウスのうち２匹のマウスで、６０日目までに腫瘍が完全に退縮した。これは、おそらく、初期の大きな腫瘍容積及びこれらの腫瘍の嚢状性質によるものであったかもしれない。なぜなら、これらの腫瘍は、サイズが増大すると容易に破裂するからである。しかし、ベクター4 x 109 pu投与量＋放射線群における７匹のマウスのうち６匹のマウス（８６％）は、６０日目で腫瘍の形跡を有さなかった。
これらの結果は、腫瘍の治療のために、本発明のベクターを使用して、インビボでＴＮＦを発現させうることを示す。
【００６４】
実施例４
以下の実施例は、宿主における腫瘍の治療又は予防のための、本発明に従って製造されたアデノウイルスベクターの使用を示す。
患者サンプル由来の放射線耐性ヒト食道腫瘍細胞を、５×１０6細胞の単回投与量でヌードマウスの右後脚に注射し、マウスを４つの治療群に無作為に分けた。群１は、緩衝溶液（０日目と３日目に、腫瘍内への直接的な注射によって投与された）でのみ治療された。群２は、０、１、３、４日目に投与される放射線４Ｇｙ投与量からなる（合計ＩＲ投与量１６Ｇｙ）赤外線治療を受けた。群３は、実施例１のアデノウイルスベクター（４×１０8ＰＵ）（０日と３日目に、腫瘍内への直接的な注射によって投与された）で治療された。群４は、アデノウイルスベクター治療と赤外線治療を受けた。
【００６５】
腫瘍容積と動物の体重を４８日間に渡って測定した。腫瘍容積を時間に対しプロットし、図３で示される腫瘍容積曲線を得た。図３では、菱形データ点（υ）は群１のデータを表し、円形データ点（λ）は群２のデータを表し、三角データ点(σ)は群３のデータを表し、四角データ点（ν）は群４のデータを表す。全ての動物は健康のままであり、有害な効果は、研究中観察されなかった。しかし、群１と２の動物を、大きな腫瘍負荷（体重の１０％超）のために３６日目に屠殺した。
【００６６】
腫瘍容積曲線は、放射線のみ（群２）又はベクターのみ（群３）で治療された動物と比較して、ベクターと放射線（群４）で治療された動物において、実質的により小さな腫瘍増殖を示す。このデータは、本発明のアデノウイルスベクターが宿主における腫瘍の治療のために首尾よく使用されうることを示す。
【００６７】
実施例５
以下の実施例は、宿主における腫瘍の治療又は予防のための、本発明に従って製造されたアデノウイルスベクターの使用を示す。
患者サンプル由来の放射線耐性食道腫瘍細胞を、５×１０6細胞の単回投与量でヌードマウスの右後脚に注射し、マウスを４つの治療群に無作為に分けた。群１は、緩衝溶液（０、３、７、１０日目に、腫瘍内への直接的な注射によって投与された）でのみ治療された。群２は、０、１、３、４、７、８、１０、１１日目に投与される放射線３Ｇｙ投与量からなる（合計ＩＲ投与量２４Ｇｙ）赤外線治療を受けた。群３は、実施例１のアデノウイルスベクター（４×１０8ＰＵ）（０、３、７、１０日目に、腫瘍内への直接的な注射によって投与された）で治療された。群４は、アデノウイルスベクター治療と赤外線治療を受けた。
【００６８】
腫瘍容積と動物の体重を２２日間に渡って測定した。腫瘍容積を時間に対しプロットし、図４で示される腫瘍容積曲線を得た。図４では、菱形データ点（υ）は群１のデータを表し、円形データ点（λ）は群２のデータを表し、三角データ点(σ)は群３のデータを表し、四角データ点（ν）は群４のデータを表す。全ての動物は健康のままであり、有害な効果は観察されなかった。しかし、群１と２の動物を、大きな腫瘍負荷（体重の１０％超）のために１５日目に屠殺した。
【００６９】
腫瘍容積曲線は、放射線のみ（群２）又はベクターのみ（群３）で治療された動物と比較して、ベクターと放射線（群４）で治療された動物において実質的により小さな腫瘍増殖を示す。このデータは、本発明のアデノウイルスベクターが宿主における腫瘍の治療のために首尾よく使用されうることを示す。
【００７０】
特許、特許出願、及び刊行物を含む、本明細書で引用された全ての参考文献は、引用により内容の全てが本明細書に含まれるものとする。
好適な実施態様を強調して、本発明を記載したが、好適な実施態様のバリエーションを使用でき、そして本明細書で特に記載した以外にも本発明が実施できることが意図されていることは、当業者に明白であろう。それ故、本発明は、上記の特許請求の範囲により定められる本発明の思想と範囲内に包含される全ての改変を含む。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、アデノウイルスベクター：
（ａ）アデノウイルスゲノムのＥ４領域において欠損しているアデノウイルスゲノム；
（ｂ）ＴＮＦをコードする核酸配列；及び
（ｃ）ＴＮＦをコードする核酸配列と作動可能に連結している放射線誘導性プロモーター。
【請求項２】
アデノウイルスゲノムがアデノウイルスゲノムのＥ１領域において欠損しているものである、請求項１記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３】
ＴＮＦをコードする核酸配列がアデノウイルスゲノムのＥ１領域に存在する、請求項２記載のアデノウイルスベクター。
【請求項４】
ＴＮＦがＴＮＦ−αである、請求項３記載のアデノウイルスベクター。
【請求項５】
ＴＮＦをコードする核酸配列が転写終結領域を更に含む、請求項３又は４記載のアデノウイルスベクター。
【請求項６】
放射線誘導性プロモーターがＥｇｒ−１である、請求項１〜５のいずれか１項記載のアデノウイルスベクター。
【請求項７】
アデノウイルスがアデノウイルスゲノムのＥ３領域において欠損している、請求項１〜３のいずれか１項記載のアデノウイルスベクター。
【請求項８】
アデノウイルスゲノムがＥ３領域全体を欠損している、請求項７記載のアデノウイルスベクター。
【請求項９】
アデノウイルスゲノムがＥ４領域のコード領域全体を欠損している、請求項１〜８のいずれか１項記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１０】
アデノウイルスゲノムのＥ４領域のコード領域が少なくとも１５塩基対を有するスペーサーエレメントで置換されている、請求項９記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１１】
スペーサーエレメントが転写不活性である、請求項１０記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１２】
スペーサーエレメントがアデノウイルスゲノムのＥ４領域に対して非天然であるポリアデニル化配列を含む、請求項１１記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１３】
スペーサーエレメントがＳＶ４０ポリアデニル化配列を含む、請求項１２記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１４】
アデノウイルスベクターのウイルス産生レベルが、スペーサーエレメントの無いアデノウイルスベクターのウイルス産生レベルよりも大きい、請求項１０〜１３のいずれか１項記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１５】
アデノウイルスゲノムが血清型５アデノウイルスゲノムである、請求項１〜１４のいずれか１項記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１６】
配列番号１の核酸配列を有する、請求項１〜１５のいずれか１項記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１７】
アデノウイルスベクターが３〜３０アミノ酸残基の非天然ポリアミノ酸配列を含むファイバー蛋白質を含み、アミノ酸残基がリジン、アルギニン又はそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１〜１５のいずれか１項記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項記載のアデノウイルスベクターの、複製能のあるアデノウイルスを含まないストック。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれか１項記載のアデノウイルスベクターを含む宿主細胞。
【請求項２０】
以下を含む、アデノウイルスベクター：
（ａ）アデノウイルスゲノムのＥ４領域において欠損しているアデノウイルスゲノム；
（ｂ）ＴＮＦをコードする核酸配列；及び
（ｃ）アデノウイルスゲノムのＥ４領域中の少なくとも１５塩基対のスペーサーエレメント。
【請求項２１】
アデノウイルスゲノムがアデノウイルスゲノムのＥ１領域において欠損している、請求項２０記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２２】
スペーサーエレメントが転写不活性である、請求項２０又は２１記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２３】
スペーサーエレメントがアデノウイルスゲノムのＥ４領域に対して非天然であるポリアデニル化配列を含む、請求項２２記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２４】
スペーサーエレメントがＳＶ４０ポリアデニル化配列を含む、請求項２３記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２５】
ＴＮＦをコードする核酸配列がアデノウイルスゲノムのＥ１領域に存在する、請求項２１〜２４のいずれか１項記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２６】
ＴＮＦがＴＮＦ−αである、請求項２５記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２７】
ＴＮＦをコードする核酸配列が転写終結領域を更に含む、請求項２４又は２５記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２８】
アデノウイルスベクターがアデノウイルスゲノムのＥ３領域において欠損している、請求項２０〜２７のいずれか１項記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２９】
アデノウイルスゲノムがＥ３領域全体を欠損している、請求項２８記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３０】
アデノウイルスゲノムがＥ４領域のコード領域全体を欠損している、請求項２０〜２９のいずれか１項記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３１】
アデノウイルスベクターのウイルス産生レベルが、スペーサーエレメントの無いアデノウイルスベクターのウイルス産生レベルよりも大きい、請求項２０〜３０のいずれか１項記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３２】
アデノウイルスゲノムが血清型５アデノウイルスゲノムである、請求項２０〜３１のいずれか１項記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３３】
アデノウイルスベクターが３〜３０アミノ酸残基の非天然ポリアミノ酸配列を含むファイバー蛋白質を含み、アミノ酸残基がリジン、アルギニン又はそれらの混合物からなる群から選択される、請求項２０〜３２のいずれか１項記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３４】
請求項２０〜３３のいずれか１項記載のアデノウイルスベクターの、複製能のあるアデノウイルスを含まないストック。
【請求項３５】
請求項２０〜３３のいずれか１項記載のアデノウイルスベクターを含む宿主細胞。
【請求項３６】
宿主の腫瘍又は癌の治療方法であって、請求項１〜１７又は２０〜３３のいずれか１項記載のアデノウイルスベクターの抗癌又は抗腫瘍有効量をその必要のある宿主に投与することを含む方法。
【請求項３７】
宿主に放射線を投与することを更に含む、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
放射線がＴＮＦをコードする核酸配列の発現を誘導し、宿主において治療レベルのＴＮＦを産生する、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
以下を含む、アデノウイルスベクターの製造方法：
（ａ）アデノウイルスゲノムのＥ４領域において欠損しているアデノウイルスゲノムを提供すること、
（ｂ）ＴＮＦをコードする核酸配列をアデノウイルスゲノムに挿入すること、
（ｃ）ＴＮＦをコードする核酸配列に作動可能に連結するように、放射線誘導性プロモーターをアデノウイルスゲノムに挿入すること。
【請求項４０】
アデノウイルスゲノムがアデノウイルスゲノムのＥ４領域において少なくとも１５塩基対を有するスペーサーエレメントを含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
放射線誘導性プロモーターがＥｇｒ−１である、請求項３９又は４０記載の方法。
【請求項４２】
アデノウイルスゲノムが３〜３０アミノ酸残基の非天然ポリアミノ酸配列を含むファイバー蛋白質を更に含み、アミノ酸残基がリジン、アルギニン又はそれらの混合物からなる群から選択される、請求項３９〜４１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１】
以下を含む、アデノウイルスベクター：
（ａ）アデノウイルスゲノムのＥ４領域において欠損しているアデノウイルスゲノム；
（ｂ）ＴＮＦをコードする核酸配列；及び
（ｃ）ＴＮＦをコードする核酸配列と作動可能に連結している放射線誘導性プロモーター。
【請求項２】
アデノウイルスゲノムがアデノウイルスゲノムのＥ１領域において欠損しているものである、請求項１記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３】
ＴＮＦをコードする核酸配列がアデノウイルスゲノムのＥ１領域に存在する、請求項２記載のアデノウイルスベクター。
【請求項４】
ＴＮＦがＴＮＦ−αである、請求項３記載のアデノウイルスベクター。
【請求項５】
ＴＮＦをコードする核酸配列が転写終結領域を更に含む、請求項３又は４記載のアデノウイルスベクター。
【請求項６】
放射線誘導性プロモーターがＥｇｒ−１である、請求項１〜５のいずれか１項記載のアデノウイルスベクター。
【請求項７】
アデノウイルスがアデノウイルスゲノムのＥ３領域において欠損している、請求項１〜３のいずれか１項記載のアデノウイルスベクター。
【請求項８】
アデノウイルスゲノムがＥ３領域全体を欠損している、請求項７記載のアデノウイルスベクター。
【請求項９】
アデノウイルスゲノムがＥ４領域のコード領域全体を欠損している、請求項１〜８のいずれか１項記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１０】
アデノウイルスゲノムのＥ４領域のコード領域が少なくとも１５塩基対を有するスペーサーエレメントで置換されている、請求項９記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１１】
スペーサーエレメントが転写不活性である、請求項１０記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１２】
スペーサーエレメントがアデノウイルスゲノムのＥ４領域に対して非天然であるポリアデニル化配列を含む、請求項１１記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１３】
スペーサーエレメントがＳＶ４０ポリアデニル化配列を含む、請求項１２記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１４】
アデノウイルスベクターのウイルス産生レベルが、スペーサーエレメントの無いアデノウイルスベクターのウイルス産生レベルよりも大きい、請求項１０〜１３のいずれか１項記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１５】
アデノウイルスゲノムが血清型５アデノウイルスゲノムである、請求項１〜１４のいずれか１項記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１６】
配列番号１の核酸配列を有する、請求項１〜１５のいずれか１項記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１７】
アデノウイルスベクターが３〜３０アミノ酸残基の非天然ポリアミノ酸配列を含むファイバー蛋白質を含み、アミノ酸残基がリジン、アルギニン又はそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１〜１５のいずれか１項記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項記載のアデノウイルスベクターの、複製能のあるアデノウイルスを含まないストック。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれか１項記載のアデノウイルスベクターを含む宿主細胞。
【請求項２０】
以下を含む、アデノウイルスベクター：
（ａ）アデノウイルスゲノムのＥ４領域において欠損しているアデノウイルスゲノム；
（ｂ）ＴＮＦをコードする核酸配列；及び
（ｃ）アデノウイルスゲノムのＥ４領域中の少なくとも１５塩基対のスペーサーエレメント。
【請求項２１】
アデノウイルスゲノムがアデノウイルスゲノムのＥ１領域において欠損している、請求項２０記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２２】
スペーサーエレメントが転写不活性である、請求項２０又は２１記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２３】
スペーサーエレメントがアデノウイルスゲノムのＥ４領域に対して非天然であるポリアデニル化配列を含む、請求項２２記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２４】
スペーサーエレメントがＳＶ４０ポリアデニル化配列を含む、請求項２３記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２５】
ＴＮＦをコードする核酸配列がアデノウイルスゲノムのＥ１領域に存在する、請求項２１〜２４のいずれか１項記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２６】
ＴＮＦがＴＮＦ−αである、請求項２５記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２７】
ＴＮＦをコードする核酸配列が転写終結領域を更に含む、請求項２４又は２５記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２８】
アデノウイルスベクターがアデノウイルスゲノムのＥ３領域において欠損している、請求項２０〜２７のいずれか１項記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２９】
アデノウイルスゲノムがＥ３領域全体を欠損している、請求項２８記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３０】
アデノウイルスゲノムがＥ４領域のコード領域全体を欠損している、請求項２０〜２９のいずれか１項記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３１】
アデノウイルスベクターのウイルス産生レベルが、スペーサーエレメントの無いアデノウイルスベクターのウイルス産生レベルよりも大きい、請求項２０〜３０のいずれか１項記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３２】
アデノウイルスゲノムが血清型５アデノウイルスゲノムである、請求項２０〜３１のいずれか１項記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３３】
アデノウイルスベクターが３〜３０アミノ酸残基の非天然ポリアミノ酸配列を含むファイバー蛋白質を含み、アミノ酸残基がリジン、アルギニン又はそれらの混合物からなる群から選択される、請求項２０〜３２のいずれか１項記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３４】
請求項２０〜３３のいずれか１項記載のアデノウイルスベクターの、複製能のあるアデノウイルスを含まないストック。
【請求項３５】
請求項２０〜３３のいずれか１項記載のアデノウイルスベクターを含む宿主細胞。
【請求項３６】
宿主の腫瘍又は癌の治療方法であって、請求項１〜１７又は２０〜３３のいずれか１項記載のアデノウイルスベクターの抗癌又は抗腫瘍有効量をその必要のある宿主に投与することを含む方法。
【請求項３７】
宿主に放射線を投与することを更に含む、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
放射線がＴＮＦをコードする核酸配列の発現を誘導し、宿主において治療レベルのＴＮＦを産生する、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
以下を含む、アデノウイルスベクターの製造方法：
（ａ）アデノウイルスゲノムのＥ４領域において欠損しているアデノウイルスゲノムを提供すること、
（ｂ）ＴＮＦをコードする核酸配列をアデノウイルスゲノムに挿入すること、
（ｃ）ＴＮＦをコードする核酸配列に作動可能に連結するように、放射線誘導性プロモーターをアデノウイルスゲノムに挿入すること。
【請求項４０】
アデノウイルスゲノムがアデノウイルスゲノムのＥ４領域において少なくとも１５塩基対を有するスペーサーエレメントを含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
放射線誘導性プロモーターがＥｇｒ−１である、請求項３９又は４０記載の方法。
【請求項４２】
アデノウイルスゲノムが３〜３０アミノ酸残基の非天然ポリアミノ酸配列を含むファイバー蛋白質を更に含み、アミノ酸残基がリジン、アルギニン又はそれらの混合物からなる群から選択される、請求項３９〜４１のいずれか１項記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１２−１３９２２０（Ｐ２０１２−１３９２２０Ａ）
【公開日】平成２４年７月２６日（２０１２．７．２６）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−２２５２９（Ｐ２０１２−２２５２９）
【出願日】平成２４年２月３日（２０１２．２．３）
【分割の表示】特願２００２−５０６２２１（Ｐ２００２−５０６２２１）の分割
【原出願日】平成１３年６月２７日（２００１．６．２７）
【出願人】（５００１２９０８５）ジェンベク、インコーポレイティッド (13)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年７月２６日（２０１２．７．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−２２５２９（Ｐ２０１２−２２５２９）
【出願日】平成２４年２月３日（２０１２．２．３）
【分割の表示】特願２００２−５０６２２１（Ｐ２００２−５０６２２１）の分割
【原出願日】平成１３年６月２７日（２００１．６．２７）
【出願人】（５００１２９０８５）ジェンベク、インコーポレイティッド (13)
【Ｆターム（参考）】
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